MXPA04010415A - Composiciones oligonucleotdias y su uso para la modulacion de respuestas inmunes. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones de secuencia de polinucleotido 3??-OH, 5??-OH y metodos para activar una respuesta inmune en un individuo, y mas preferiblemente para activar celulas que presentan antigeno en el individuo, En una incorporacion, la celula que presenta antigeno es una celula dendritica. La presente invencion tambien incluye composiciones y metodos para activar celulas dendriticas in Vitro. Estas celulas dendriticas pueden entonces ser administradas a un individuo. Las secuencias de polinucleotido 3??-OH, 5??-OH preferidas comprenden seis bases en donde por lo menos 50% de las bases son guanina y la base 5?? es guanina. Las composiciones pueden comprender una columna de fosfodiester o de fosforotioato.

Description

COMPOSICIONES OLI60NUCLEÓTIDAS Y SU USO PARA LA MODULACIÓN DE RESPUESTAS INMUNES Campo de la Invención La presente invención se relaciona con las composiciones que comprenden polinucleótidos de fosfodiéster y de fosforotioato 3' -OH, 5 ' -OH y su uso para modular respuestas inmunes .

Antecedentes de la Invención Las células dendriticas (DC) son células que presentan antigeno (APC) involucradas en la iniciación de respuestas inmunes primarias. Sus funciones varían con la madurez. Las células dendriticas inmaduras son muy efectivas en procesar antígenos de proteína nativa pero les faltan suficientes moléculas co-estimulatorias y de superficie de célula MHC clase II para la presentación de antígeno. Las células dendriticas maduras son menos capaces de capturar nuevas proteínas para la presentación pero son más eficientes en la estimulación de linfocitos CD4 y CD8 T que descansan. Las células dendriticas morfológicamente, maduras aumentan en tamaño de célula y granulosidad. Las células dendriticas maduras tienen niveles incrementados de moléculas de célula de superficie MHC II, CD-40, CD83 y de moléculas co-estimulatorias CD80 y CD86. La activación de células dendriticas maduras en la síntesis de altos niveles de IL-12 que mejoran ambas la inmunidad innata y adquirida.

Los oligonucleótidos sintéticos son secuencias polianiónicas . Los oligonucleótidos sintéticos son reportados que selectivamente se unen a ácidos nucleicos, a proteínas celulares específicas, a proteínas nucleares específicas o a receptores de superficie de célula específicos. Los oligonucleótidos de fosforotioato sintéticos de 8 a 100 bases que contienen por lo menos un dinucleótido CpG desmetilatado han mostrado que estimulan el sistema inmune (patente de los Estados Unidos de América No. 6,239,116). En particular, los oligonucleótidos de fosforotioato sintéticos que contienen un motivo CpG ( 5 ' purina-purina-Citosina-Guanina-pirimidina-pirimidina3 ' ) se han encontrado que estimulan la síntesis de citoquinas tales como el IL-6, el IL-12, la IFN-gamma, la TNF-alfa, y el GM-CSF, la actividad lítica de células asesinas naturales y la proliferación de linfocitos B (Krieg, Annu. Rev. Immunol. 2002, 20:709-760). Los oligonucleótidos de fosforotioato sintéticos incluyen un motivo CpG en donde el número de bases es mayor a 14 han sido reportados que provocan la madurez y la activación de células dendríticas : aumentan en tamaño de célula y de granulosidad; la síntesis de IL-12; aumentan en endocitosis ; y, en promover la regulación de moléculas de superficie de células MHC II, de CD40, de CD80, de CD83 y de CD86 (Sparwasser y otros. Eur. J. Immunol. 1998, 28:2045-205; Hartman y otros. Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos de América 1999, 96:9305-9310; Askew y otros. J. Immunol. 2000, 165-6889-6895). Los oligonucleótidos de fosfodiéster sintéticos que incluyen un motivo CpG en donde el número de bases es de 30 han sido reportados que estimulan la síntesis de IFN y promueven la regulación de expresión de CD80 y de CD86 en los precursores de células dendríticas (Kadowaski y otros. J. Immunol. 2001 166:2291-2295) .

Previamente nosotros hemos descrito una composición que comprende un oligonucleótido sintético 3' -OH, 5 ' -OH de base 2 a 20 seleccionado del grupo que consiste de (GxTy)n, (TyGx)n, a(TyGx)n/ (GxTy)nb, (TyGx)nb, a(GxTy)nb, y a(TyGx)nb, en donde X y Y es un integro entre 1 y 7, n es un integro entre 1 y 12, a y b son uno o más As, Cs, Gs ó Ts, en donde el oligonucleótido está entre 2 y 20 bases. Estas composiciones inducen una respuesta seleccionada del grupo que consiste de la inducción de paro de ciclo de la célula, la inhibición de la proliferación, inducción de la activación caspasa, inducción de apoptosis y la estimulación de síntesis de citoquina mediante monocitos y células mononucleares de sangre periférica (ver la publicación PCT No. O 01/444656).

Lo que se necesita son nuevas composiciones oligonucleótidas y los métodos para usar estas composiciones para modular la función de células inmunes, que incluyen las células dendríticas.

Síntesis de la Invención La presente invención satisface esta necesidad mediante proporcionar una composición oligonucleótida que comprende polinucleótido 3 '-0H, 5 '-OH de base 6. En una incorporación, la columna vertebral de fosfato del polinucleótido es una columna vertebral de fosfodiéster . En otra incorporación, la columna vertebral de fosfato del polinucleótido es una columna vertebral de fosforotioato . Preferiblemente, los polinucleótidos 3 '-OH, 5 '-OH son sintéticos y más preferiblemente, los polinucleótidos 3 '-OH, 5 '-OH son seleccionados del grupo que consiste de 5 ' GTGTGT3 ' (SEQ ID NO:l), 5 ' GGTGGG3 ' (SEQ ID NO:2), 5 ' GGGTGG3 ' (SEQ ID NO:3), 5'GGGCGG3' (SEQ ID NO: 4), 5 ' GGGAGG3 ' ( SEQ ID NO: 5), 5'GGGGGG3' (SEQ ID NO:6) y 5 ' GGCCGG3 ' (SEQ ID NO:7). Los polinucleótidos 3 '-0H, 5 '-OH estimulan una respuesta inmune cuando son administrados a un humano o a un animal. La respuesta inmune puede ser sistemática o local. En una incorporación, los polinucleótidos 3 '-OH, 5 '-OH estimulan una célula que presenta antigeno en el humano o en el animal al cual los polinucleótidos fueron administrados. Los polinucleótidos 3 '-OH, 5 '-OH también pueden ser administrados directamente a células que presentan antigeno in vitro para la estimulación de las células que presentan antigeno, las células que presentan antigeno estimuladas pueden entonces ser administradas a un humano o a un animal para la activación de una respuesta inmune en el humano o en el animal.

Cuando son administrados a una célula dendrítica, los polinucleótidos 3 '-0H, 5 '-0H de la presente invención estimulan la célula dendrítica mediante inducir una respuesta seleccionada del grupo que consiste de un incremento en la producción de IL-lbeta, de IL-12 ó de IFN-gamma, un incremento en el tamaño de la célula y de la granulosidad, un incremento en la endocitosis, un incremento en la producción de CD80, de CD83, de CD86 ó HC II en la superficie de la célula, y una disminución en la expresión de OX-2 en la superficie de la célula.

La presente invención además proporciona un método para administrar una composición que comprende un polinucleótido 3 '-0H, 5 '-0H y un transportador farmacéuticamente aceptable a un animal o a un humano en una cantidad efectiva para inducir la estimulación de una respuesta inmune en el animal o en el humano, y más preferiblemente, la estimulación de una o más células que presentan antígeno en el animal o en el humano. Una célula que presenta antígeno preferida es una célula dendrítica. En otra incorporación, un antígeno es administrado al animal o al humano en adición a la composición de polinucleótido 3 '-OH, 5 '-OH, y que resulta en una respuesta inmune específica de antígeno en el animal o en el humano. Los antígenos preferidos son antígenos de tumor y de antígeno de superficie de hepatitis. En algunas incorporaciones, la estimulación de una o más células que presentan antígeno resulta en una respuesta inmune sistemática en el animal o en el humano. En otras incorporaciones, la respuesta inmune es local. La presente invención también incluye los métodos de administrar una composición que comprende un polinucleótido 3'-0H,5'-0H y un agente inmunomodulatorio, o de modalidad, a un animal o a un humano en una cantidad efectiva para inducir la estimulación de una respuesta inmune en el animal o en el humano .

La presente invención también proporciona un método que comprende la administración in vitro de una composición que comprende un polinucleótido 3 '-OH, 5' OH y un transportador farmacéuticamente aceptable a las células que presentan antigeno, y más preferiblemente, a células dendriticas, que contienen antigenos, que incluyen los antigenos de tumor, en donde tal administración resulta en la estimulación de las células que presentan antigeno. El método puede además incluir la introducción del células que presentan antigeno estimulado en un animal o en un humano para la estimulación de una respuesta inmune en el animal o en el humano. La inesperada y sorprendente habilidad de los polinucleótidos 3' -OH, 5 '-0H de base 6 para estimular las células que presentan antigeno tales como las células dendriticas proporcionan un importante beneficio para los animales y los humanos.

Los métodos descritos aquí pueden ser usados para tratar enfermedades tal como el cáncer, para tratar alergias, para vacunar animarles o humanos en contra de varios patógenos, para tratar enfermedades autoinmunes y para prevenir el rechazo de trasplantes. En algunas incorporaciones, la presente invención logra el tratamiento de enfermedades autoinmunes y la prevención del rechazo de trasplantes mediante incrementar la síntesis IL-12. La síntesis de IL-12 puede inhibir enfermedades autoinmunes, el rechazo de trasplantes y la enfermedad injerto versus anfitrión (GVHD) , y las alergias (ver por ejemplo, Bagenstose y otros, J. Immunol . 1998; 160:1612 (Regulación baja de producción de anticuerpos en autoinmunidad por IL-12) ; Vogel y otros, Eur. J. Immunol., 1996; 26:219 (Inhibición de subjuego de linfocito B implicado en el desarrollo de la autoinmunidad, por IL-12); Dey y otros, Sangre, 1998; 91:3315 (Inhibición de la enfermedad injerto versus anfitrión (GVHD) mediante IL-12); Smits y otros, Int. Arch Allergy Immunol., 2001; 126-102 (Modificación del perfil inmune Th2 patogénico hacia un perfil Thl mediante IL-12 en el tratamiento de alergias) ) . En otras incorporaciones, la presente invención logra el tratamiento de enfermedades autoinmunes y la prevención del rechazo de trasplantes a través de la vacunación (ver por ejemplo, Zang y otros, J. Mol. Med. 1996; 74-653 (Vacunación en contra de linfocitos B ó T autoreactivos responsables para las enfermedades autoreactivas ) ; Vignes y otros, Eur. J. Immunol., 2000 ; 30 : 2460 (Vacunación en contra de linfocitos T aloreactivos responsables del rechazo del injerto); Liu y otros, J. Exp. Med., 2002 ; 196-1013 (Inducción de tolerancia inmune mediante el suministro de células que se mueren a la células dendriticas in situ) ) .

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención el proporcionar una composición y un método efectivos para tratar una enfermedad en un animal, que incluye a un humano .

Otro objeto de la presente invención es la de proporcionar una composición y un método efectivos para vacunar un animal o un humano.

Aún otro objeto de la presente invención es la de proporcionar una composición y un método efectivos para tratar cáncer en un animal o en un humano .

Todavía otro de la presente invención es la de proporcionar una composición y un método efectivos para estimular una respuesta inmune en un animal o en un humano.

Un objeto adicional de la presente invención es la de proporcionar una composición y un método efectivos para inducir la madurez y/o la activación de células que presentan antígeno, y preferiblemente, de células dendriticas, en un animal o en un humano . 3 Otro objeto de la presente invención es la de proporcionar una composición y un método efectivos para inducir la estimulación in vitro de células que presentan antxgeno que contienen un antigeno para la administración de las células que presentan antigeno estimuladas a un animal o a un humano.

Aún otro objeto de la presente invención es la de proporcionar una composición y un método para aumentar la producción de IL-lbeta, de IL-12 y/o IFN gamma mediante células dendriticas .

Todavía otro objeto de la presente invención es la de proporcionar una composición y un método efectivos para aumentar el tamaño de la cédula y/o la granulosidad de las células dendriticas.

Un objeto adicional de la presente invención es la de proporcionar una composición y un método efectivo para aumentar la endocitosis mediante las células dendriticas.

Otro objeto de la presente invención es la de proporcionar una composición y un método efectivos para aumentar el nivel de CD40, de CD80, de CD86 y/o MHC II en la superficie de la célula de células dendriticas.

Otro objeto de la presente invención es la de proporcionar una composición y un método efectivos para disminuir el nivel de OX-2 en la superficie de la célula de células dendriticas .

Aún otro objeto de la presente invención que es la de proporcionar una composición y un método que potencialice el efecto de otros agentes terapéuticos o inmunomodulatorios .

Todavía otro objeto de la presente invención es la de proporcionar una composición y un método que potencialice el efecto de una o más citoquinas en células que presentan antigeno y preferiblemente, en células dendriticas.

Un objeto adicional de la presente invención es la de proporcionar una composición y un método que potencialice el efecto de GM-CSF en las células dendriticas.

Estos y otros objetos, características y ventajas de la presente invención podrán volverse evidentes después de una revisión de la siguiente descripción detallada de la incorporación descrita y de las reivindicaciones anexas.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona un composición que comprende una secuencia polinucleótida 3 '-0H, 5 '-OH aislada, que comprende 6 bases, en donde por lo menos el 50% de las bases son guanina, la base 5' es guanina, en donde la composición estimula una respuesta inmune en un animal o en un humano al cual es administrada la composición. La presente invención también proporciona un método que incluye la administración de una composición que comprende un polinucleótido 3'-OH-5'-OH y un transportador farmacéuticamente aceptable a un animal o a un humano en una cantidad efectiva para estimular una o más células que presentan antigeno (APC) , o preferiblemente una o más células dendriticas, en el animal o en el humano. La estimulación de una o más células que presentan antigeno en el animal o en el humano puede resultar en una respuesta inmune sistemática o una respuesta inmune local. La presente invención también proporciona un método que incluye la administración in vitro de una composición que comprende un polinucleótido 3 ' -OH, 5 ' -OH a una célula que presenta antigeno que contiene un antigeno en una cantidad efectiva para estimular la célula que presenta antigeno. Estas células que presentan antigeno pueden entonces ser administradas a un animal o a un humano con un transportador farmacéuticamente aceptable para la estimulación de una respuesta inmune. Los agentes inmunomodulatorios, "los excipientes, los diluyentes, y/o los transportadores pueden ser agregados a cualquiera de estas composiciones administradas a un animal o a un humano. La presente invención también incluye el uso de los polinucleótidos 3 '-0H, 5 '-OH en la fabricación de un medicamento útil para estimular una respuesta inmune en un animal o en un humano y para la estimulación de una célula que presentada antigeno in vitro. La inesperada y sorprendente habilidad del fosfodiéster sintético 3' -OH, 5 '-OH, de bases 6 y de los oligonucleótidos de fosforotioato para inducir la estimulación de las células que presentan antigeno tales como las células dendriticas proporciona un importante beneficio para los animales y los humanos .

Como es usado aquí el término "polinucleótido 3'-0H,5'-0H" se refiere a un polinucleótido que tiene mitades de hidroxilo en ambos de sus extremos 3' y 5'. Más particularmente, los polinucleótidos 3 '-OH, 5' -OH de la presente invención comprenden una mitad de hidroxilo en el carbono 31 del azúcar en el extremo 31 del polinucleótido y comprende una mitad de hidroxilo en el carbono 5' del azúcar en el extremo 5' del polinucleótido. En una incorporación de la presente invención, el polinucleótido 3 '-OH, 5 '-OH consiste de bases de 6 nucleótidos. Preferiblemente, el polinucleótido 3'-OH,5'-OH comprender bases de 6 nucleótidos en donde por lo menos 50% de esas bases nucleótidas son guanina (G) y en donde la base nucleótida 5' es G. En una incorporación más preferida, el polinucleótido 3 '-OH, 5 '-OH comprende o consiste de una secuencia 5 ' GGNNGG3 ' (SEQ ID NO: 8) o una secuencia 5 ' GGGNGG3 ' (SEQ ID NO:9) en donde N es G, C, ? ó T. el polinucleótido 3 '-OH, 5 '-OH puede específicamente comprender o consistir de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de 5 ' GTGTGT3 ' (SEQ ID NO:l), 5 ' GGTGGG3 ' ( SEQ ID NO:2), 5 ' GGGTGG3 ' (SEQ ID NO: 3), 5 ' GGCCGG3 ' ( SEQ ID NO: ), 5'GGGGGG3' (SEQ ID NO:5), 5 ' GGGAGG3 ' (SEQ ID NO:6) y 5 ' GGGCGG3 ' (SEQ ID NO: 7). En una incorporación, los polinucleótidos 3 '-OH, 5' -OH son administrados a unas células que presentan antigeno, a células dendriticas, a un humano, o a un animal en un vector.

Estos polinucleótidos 3 '-0H, 5 '-OH pueden contener una columna vertebral de fosfodiéster o una columna vertebral de fosfato modificado tal como una columna vertebral de fosforotioato . Los polinucleótidos 3 '-0H, 5 '-0H que contienen una columna vertebral de fosfodiéster corresponde a los números de secuencias descritos anteriormente son designados de aqui en adelante como sigue: 5 ' GTGTGT3 ' ( SEQ ID NO: 1) (NIA), 5 ' GGTGGG3 ' (SEQ ID NO:2) (N2A), 5 ' GGGTGG3 ' ( SEQ ID NO:3) (N3A), 5 ' GGCCGG3 ' (SEQ ID NO:4) (N4A), 5 ' GGGGGG3 ' ( SEQ ID NO:5) (N5A), 5 ' GGGAGG3 ' (SEQ ID NO: ß) (N6A) y 5 ' GGGCGG3 ' (SEQ ID NO : 7 ) (N7A) . En estas incorporaciones, cada nucleótido en la cadena del polinucleótido es un nucleótido de fosfodiéster. Los polinucleótidos 3 '-OH, 5 '-OH que contienen una columna vertebral de fosforotioato que corresponden a los números de secuencias descritos anteriormente son designados de aqui en adelante como sigue: 5 ' GTGTGT3 ' ( SEQ ID N0:1) (N1B), 5 ' GGTGGG3 ' (SEQ ID NO:2) (N2B), 5 ' GGGTGG3 ' (SEQ ID NO:3) (N3B), 5 ' GGCCGG3 ' (SEQ ID NO:4) (N4B), 5 ' GGGGGG3 ' ( SEQ ID NO:5) (N5B), 51 GGGAGG3 ' (SEQ ID NO:6) (N6B) y 5 ' GGGCGG3 ' ( SEQ ID NO:7) (N7B). En estas incorporaciones, cada nucleótido en la cadena del polinucleótido es un nucleótido de fosforotioato . La presente invención también abarca polinucleótidos 3'- OH, 5 '-OH que incluyen uno o más nucleótidos de fosfodiéster y uno o más nucleótidos de fosforotioato . Preferiblemente, los polinucleótidos 3 '-OH, 5 '-0H son NIA, N2B, N3A ó N5B, y más preferiblemente, N3B ó N5B.

También como es usado aquí, los términos "estimular" y "estimula" se refieren a la activación o madurez de una célula dendrítica, u otra célula que presenta antígeno, o la activación o el aumento de una respuesta inmune, dependiendo en el contexto del uso de los términos. La estimulación de una célula dendrítica puede ser evidenciada mediante un incremento en el tamaño de la célula y/o granulosidad, y un incremento en la producción de IL-lbeta, IL-12 y/o IFN-gamma; un incremento en la endocitosis ; o el incremento en la expresión de la superficie de la célula de CD80, CD83, CD86, MHC II, o cualquier combinación de los mismos; una disminución en la expresión de la superficie de la célula de OX-2; o cualquier combinación de los mismos. Por lo tanto, una "respuesta de la célula dendrítica" incluye, pero no está limitada a, un incremento en el tamaño de la célula y/o granulosidad; un incremento en la producción de IL-12 ó IFN-gamma; un incremento en la endocitosis; un incremento de la expresión de la superficie de la célula de CD80, CD83, CD86, ó MHC II; una disminución en la expresión de la superficie de la célula de OX-2; o cualquier combinación de los mismos. Los términos "célula dendríticas" y "DC" incluyen, pero no están limitados a la célula dendrítica intersticial, la célula dendritica derivada de la célula Langheran, la célula dendritica plasmacitoide y cualesquier progenitores de las células anteriormente mencionadas. Como es usado aquí, el término "producción" se refiere a la síntesis y/o secreción de una molécula. En una incorporación preferida, la célula dendritica es una célula dendritica intersticial.

Se cree que los polinucleótidos 3 '-0H, 5 '-0H descritos aqui no solamente son capaces de estimular la célula dendritica, pero también son capaces de estimular otras células que presentan antigeno que incluyen las células que presentan antigeno profesionales tales como, pero no limitadas a las células monocitas, las células Langer ans, los linfocitos B, los linfocitos T, las células Kuppfer, la microglia, las células Sch ann y las células endoteliales ; y las células que presentan antigeno no profesionales tales como, pero no limitadas a las células epiteliales, los fibroblastos, los melanocitos, las células neurales, las células musculares suaves, los miocitos, los hepatocitos, los astrocitos y los queratinocitos . Por lo tanto, la presente invención incluye las composiciones y los métodos para la activación de una célula que presenta antigeno.

Cuando se refiere a una respuesta inmune, el término "estimular" se refiere a una activación generalmente del sistema inmune o a una activación de componentes del sistema inmune en una manera no especifica de antigeno a menos que se indique. La estimulación de una respuesta inmune en un individuo puede ser evidenciada mediante, pero no está limitada a la proliferación celular, la expansión clonal, la síntesis de nuevas proteínas, la diferenciación en células efectoras, la diferenciación en células de memoria, un incremento en el nivel o en la cantidad de un tipo de anticuerpo, un cambio en la clase de anticuerpo, la hipermutacion somática en anticuerpos que producen linfocitos B, un incremento en el nivel o en la cantidad de un tipo de célula inmune, el reclutamiento (motilidad y migración) de células inmunes en una ubicación particular, un incremento en el nivel o en la cantidad de una citoquina en un individuo, y un incremento en el nivel o en la cantidad de una quemoquina en un individuo, la presentación aumentada de antígeno, la endocitosis aumentada, un incremento o adquisición de moléculas, co-estimulatorias (moléculas accesorias) , un incremento o adquisición de moléculas de adhesión, un incremento o adquisición de receptores de citoquina, un incremento o adquisición de receptores de quemoquina, un incremento en la citoxicidad mediata de la célula, cambios morfológicos, el establecimiento de memoria de células inmunes, un incremento en el nivel o en la cantidad de intermediarios de oxígeno reactivos y, un incremento en el nivel o en la cantidad de óxido nítrico y, un incremento en el nivel o en la cantidad de moléculas neuroendocrinas (por ejemplo, las hormonas, los neurotransmisores , etc.) y una rotura de tolerancia inmune o de supresión. Las células inmunes incluyen, pero no están limitadas a los linfocitos tales como las células B, las células T, que incluyen las células CD4+ y CD8+, y las células NK; los fagocitos mononucleares; los granulocitos tales como los de neutrófilos, los eosinófilos y los basófilos; las células dendriticas como son descritas aquí; y cualesquier progenitores de las células anteriormente mencionadas. Los tipos de anticuerpos incluyen el IgC, el IgA, el IgM, el IgD, el IgE y el IgY.

Es una incorporación, la respuesta inmune es una respuesta inmune sistemática. El término "respuesta inmune sistemática" se refiere aquí a una respuesta inmune que no está restringida a un área particular del cuerpo. Un ejemplo de una respuesta inmune sistemática es un aumento en el nivel de un anticuerpo que circula en el sistema linfático o circulatorio en un individuo seguido de la administración de un antígeno y de una molécula inmunoestimulatoria al individuo. Otro ejemplo es un aumento en el nivel de una citoquinina y/o una quemoquina en el sistema linfático o circulatorio en un individuo seguido de la administración de una molécula inmunoestimulatoria al individuo. Otro ejemplo es la presencia de células efectoras inmunes sensibilizadas tales como las células T, las células B o las células de plasma capaces de responder al reto con antígeno sensibilizador de la circulación linfática o de la sangre o en órganos del sistema inmunológico tales como el bazo, los ganglios linfáticos o el hígado. En otras incorporaciones, la respuesta inmune es una respuesta inmune local. El término "respuesta inmune local" se refiere a una respuesta inmune que está principalmente, pero no necesariamente completamente, restringida a un área particular del cuerpo. Una respuesta inmune local puede ser evidenciada mediante la irritación o el hinchado localizado y/o el reclutamiento (motilidad y migración) de células inmunes a un área particular del cuerpo. Por ejemplo, la respuesta inmune mucosa puede ocurrir seguida de la administración mucosa de una antígeno y/o una molécula inmunoestimulatoria tal como un polinucleótido 3 '-0H, 5' -OH descrito aqui . Una respuesta mucosa puede incluir, pero no está limitada a un incremento en el nivel o en la cantidad de un tipo de anticuerpo, un incremento en el nivel o en la cantidad de anticuerpo IgA, la activación de linfocitos T gamma/delta-positivos, la inducción de tolerancia inmune local y la inducción de la tolerancia inmune sistemática .

En varias incorporaciones de la presente invención, los polinucleótidos 3 '-0H, 5 '-OH son administrados a un individuo (por ejemplo, un animal o un humano) para el tratamiento o la prevención de una enfermedad. Como es usado aqui, el término "enfermedad" se refiere a una condición en donde la salud corporal está deteriorada e incluye, pero no está limitada a, un cáncer; una infección por un patógeno que incluye un virus, una bacteria o un parásito; una alergia; una enfermedad autoinmune; y una respuesta autoinmune a un órgano trasplantado. En algunas incorporaciones, la enfermedad está asociada con un mal funcionamiento de las células dendriticas, pero no está limitado a el síndrome Sezary (los pacientes tienen un profundo defecto en circular células dendríticas) (Wysocka y otros, Sangre 2002, 100:3287); el síndrome de Down (pacientes que tienen una atrofia dendrítica) (Takashima y otros, J. Intellect. Disabil. Res. 1994, 38:265); las enfermedades autoinmunes que involucran la activación inadecuada de células dendríticas (por ejemplo, la presentación prolongada de auto antígeno mediante células dendríticas) (Erikson y otros, J. Exp. Med. 2003 197:323 y Ludewig y otros, Curr . Opin. Immunol . 2001, 13:657); daño en la médula espinal (pacientes que tienen una atrofia dendrítica) (Iversen y otros, Sangre 2000, 96:2081); y la enfermedad de Graves (células dendríticas tiroidales están implicadas en la enfermedad) (Quadbeck y otros, Scand. J. Immunol. 2002, 55:612) . El término "tratamiento" se refiere a la liberación de un síntoma de la enfermedad y no requiere el curado de la enfermedad. También como es usado aquí, el término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un polinucleótido 3' -OH, 5' -OH efectiva para inducir una respuesta inmune. La efectividad terapéutica de un polinucleótido 3 '-OH, 5 '-OH BBC aumentada mediante los métodos que incluyen, pero no están limitados a químicamente modificar la base, el azúcar o la columna vertebral de fosfato, químicamente suplementar o biotecnológicamente amplificar las secuencias que usan plásmidos bacteriales que contienen las secuencias apropiadas, el complejo de las secuencias para transportadores químicos o biológicos o para acoplar las secuencias a anticuerpos o a eslabones dirigidos de tipo célula.

Los polinucleótidos 3 '-OH, 5 '-OH de la presente invención pueden ser combinados con transportadores farmacéuticamente aceptables y administrados a una célula como composiciones, preferiblemente una célula que presenta antigeno, y más preferiblemente a una célula dendritica, in vitro o in vivo. En una incorporación de la presente invención, una composición que comprende un polinucleótido 3' -OH, 5 '-OH es administrado a una célula dendritica in vivo en una cantidad efectiva para estimular la célula dendritica. La célula dendritica es entonces administrada a un animal o a un humano con un transportador farmacéuticamente aceptable para la estimulación de una respuesta inmune en el animal o en el humano. En un incorporación preferida, la célula dendritica es una célula dendritica inmadura que tiene una característica que incluye, pero no está limitada a lo siguiente: un nivel intracelular superior de MHC II; actividad endocítica superior; o altos niveles de receptores de quemoquinina de CCRl, CCR2, CCR3, CCR5, CCR6 y CXRC1 específicos; un nivel bajo de CCR7; altos niveles moléculas de CD36, de CD68, de CD47, y de CD91; niveles bajos de moléculas co-estimulatorias CD40, CD54, CD58, CD80 y CD83; la ausencia de DC-LAMP (LAMP; proteína de membrana asociada a lisosoma) ; la presencia de DCIR (DC inmunoreceptora) , CLEC-1 (receptor C-lectina) , DC-ASGPR (DC-asialoglicoproteína) , MN (receptor de mannosa) , TLR-2 y -3 (receptor Toll similar) , FCyR, FcsR, integrina a?ßd y a?ß3 en la superficie de la célula. La célula dendritica inmadura puede ser encontrada en la sangre periférica. En una incorporación preferida adicional, la célula dendritica inmadura contiene, hoy está expuesta a, un antigeno antes de la administración del polinucleó.tido 3 '-0H, 5 '-0H a la célula dendritica. Los métodos no limitantes de obtener células dendriticas que contienen antígeno incluyen el antigeno de pulso y el uso de células dendriticas genéticamente modificadas y que expresan uno o varios ' antigenos .

Deberá de ser entendido que uno o más polinucleótidos 3 '-OH, 5 '-OH pueden ser administrados a una célula dendritica in vitro ya sea sola o en combinación con otros agentes inmunomodulatorios que afectan las células dendriticas que contienen antigenos, que incluyen los antigenos de tumor, en una cantidad efectiva para inducir la estimulación de las células dendriticas diseñadas para ser vueltas a inyectar a un animal o a uno humano, para la estimulación de la respuesta inmune. Los agentes inmunomodulatorios incluyen, pero no están limitados a los siguientes: al hidróxido de aluminio; al fosfato de aluminio; el fosfato de calcio; a los polímeros; a los copolimeros tales como los copolimeros de polioxietileno-polioxipropileno, que incluyen los copolimeros de bloque; al polímero P1005; al adyuvante completo de Freund (para animales) ; al adyuvante incompleto de Freund; al monooleato de sorbitán; al escualeno; al adyuvante CRL-8300; al QS21; a las saponinas al ISCOM; al dipéptido de muramxlo; al dipéptido de glucosaminilmuramilo; a la trehalosa; a los extractos bacteriales, que incluyen los extractos micobacteriales ; las células completas bacteriales, que incluyen las células completas micobacteriales; las endotoxinas desintoxicadas; los lipidos de membrana; el ADN solatado de organismos procarióticos , los oligonucleótidos sintéticos CpG; los oligonucleótidos sintéticos no CpG; los apatámeros; las moléculas inmunoestimulatorias de plásmidos; las moléculas poli(I:C) las citoquinas; las citoquinas; las quemoquinas; la quitosana y los derivados; el ácido hialurónico y los derivados; la toxina del cólera; la toxina de pertussis; yr la hemocianina de lapa de cerradura, o la combinación de los mismos. El polinucleótido 3 '-OH, 5' -OH ó el polinucleótido 3'-OH, 51 -OH más el agente inrnunomodulatorio puede ser agregado a la célula dendritica en un tratamiento sencillo o en múltiples tratamientos, opcionalmente a diferentes concentraciones, y sobre un periodo de tiempo apropiado para la estimulación de las células dendriticas. El polinucleótido 3 '-OH, 5 '-OH puede ser agregado o antes, al mismo tiempo, o después de la administración de los agentes inmunomodulatorios . Más aún, el polinucleótido 3 '-OH, 5 '-OH puede ser agregado antes, al mismo tiempo, o después de la administración de él (los) antigeno (s).

La presente invención también incluyen los métodos administración de un polinucleótido 3 '-OH, 5 '-OH y de un antigeno no contenido dentro de una célula dendritica a un animal o a un rumano en donde tal administración resulta en una respuesta inmune en el animal o en el humano, y más preferiblemente, una respuesta inmune a un antigeno especifico. El antigeno puede ser administrado al animal o al humano antes de, al mismo tiempo o seguido de la administración del polinucleótido 3'-OH,5'-OH. En un incorporación preferida, el antigeno es administrado al mismo tiempo como el polinucleótido 3 ' -OH, 5 ' -OH.

Los antigenos descritos aqui no están limitados a cualquier antigeno o tipo de antigeno particular. En una incorporación, el antigeno es un antigeno de tumor, tal como una antigeno de tumor derivado de un lisato de célula de tumor. En otra incorporación, el antigeno es un antigeno derivado de un patógeno, y más preferiblemente un antigeno expresado en la superficie del patógeno. Un ejemplo de un antigeno de superficie derivado de patógeno es el antigeno de superficie de hepatitis. Cuando el antigeno es administrado al animal o al humano no contenido dentro de una célula dendritica, el antigeno puede ser administrado como una proteina, un péptido o un polipéptido, o puede ser administrado un polinucleótido que codifica el antigeno. El polinucleótido que codifica el antigeno puede estar contenido dentro de un vector que comprende otros elementos que podrán permitir para la expresión del polipéptido de antigeno en el animal o en el humano . En una incorporación, el antigeno y el polinucleótido 3 '-0H, 5 '-0H están contenidos dentro de diferentes vectores.

La administración de una célula dendritica estimulada de polinucleótido 3' -OH, 5' -OH que contiene una antigeno, o la administración de un polinucleótido 3'-OH,5'-OH y de un antigeno a un animal o a un humano resulta en la estimulación de una respuesta inmune en el animal o en el humano. En incorporaciones preferidas, tales administraciones resultan en la estimulación del sistema inmunológico en conjunto con una respuesta inmune del antigeno especifico en el animal o en el humano. El término "respuesta inmune de la antigeno especifico" se refiere a una respuesta inmune que está predominantemente dirigida hacia el antigeno. Una respuesta inmune del antigeno especifico incluye o consiste de un incremento en la cantidad de un anticuerpo (titulo del anticuerpo) , un cambio en la clase de anticuerpo, la hipermutación somática en los linfocitos B que producen anticuerpos, el establecimiento de la memoria de célula inmune, el incremento en la cantidad de células que llevan un receptor de célula B especifico o receptor de célula T para el antigeno en el humano o en el animal al cual el antígeno es administrado. Un anticuerpo es "especifico para" una antigeno particular cuando el anticuerpo se une al antigeno con suficiente afinidad y avidez para resultar en la producción de un complejo anticuerpo-antigeno.

Las formas de administración incluyen, pero no están limitadas a las inyecciones, las soluciones, las cremas, los geles, los implantes, las bombas, los ungüentos, las emulsiones, las suspensiones, las microesferas, las partículas, las micropartículas , las nanopartículas , los liposomas, las pastas, los parches, las tabletas, los dispositivos de suministro transdermal, los rociadores, los aerosoles, u otros medios familiares a uno de habilidad ordinaria en el arte. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser preparadas mediante procedimientos conocidos en el arte que usan ingredientes fácilmente disponibles y muy conocidos. Por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con excipientes comunes, diluyentes, o transportadores, y formados en tabletas, cápsulas, suspensiones, polvos, y .los similares. Los ejemplos de excipientes, de diluyentes, y de transportadores que son apropiados para tales formulaciones incluyen los siguientes: los rellenadores y los extendedores (por ejemplo, el almidón, los azúcares, el mannitol, y los derivados silícicos); los agentes aglomerantes (por ejemplo, la celulosa de carboximetilo y otros derivados de celulosa, los alginatos, la gelatina, y la polivinil-pirrolidona) ; los agentes humectantes (por ejemplo, el glicerol) ; los agentes que se desintegran (por ejemplo, el carbonato de calcio y el bicarbonato de sodio) ; los agentes para retardar la disolución (por ejemplo, la parafina) ; los aceleradores de reabsorción (por ejemplo, los compuestos de amonio cuaternario) ; los agentes activos de superficie (por ejemplo, el alcohol de cetilo, el monoestearato de glicerol) ; los transportadores de absorción (por ejemplo, el caolín y la bentonita) ; los emulsificadores ; los preservativos; los endulzantes; los estabilizadores; los agentes colorantes; los agentes que perfuman; los agentes saborxzantes; los lubricantes (por ejemplo, el talco, el calcio, el estearato de magnesio) ; los glicoles de polimetilo sólidos; y las mezclas de los mismos .

Las formulaciones también pueden ser así constituidas que ellas liberan el ingrediente activo solamente o preferiblemente en una ubicación particular, posiblemente sobre un periodo de tiempo (por ejemplo, una formulación de liberación sostenida) . Tales combinaciones proporcionan aún un mecanismo adicional para controlar la cinética de liberación. Los revestimientos, los sobres, y las matrices protectoras pueden ser hechos, por ejemplo, de ceras o de substancias poliméricas .

Las composiciones que comprenden uno o más polinucleótidos 3' -OH, 5' -OH y un transportador farmacéuticamente aceptable son preparados mediante uniformemente e íntimamente traer en asociación el polinucleótido 3 '-OH, 5' -OH y el transportador farmacéuticamente aceptable. Los transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen los transportadores líquidos, los transportadores sólidos o ambos. Los transportadores líquidos son transportadores acuosos, los transportadores no acuosos o ambos, e incluyen, pero no están limitados a las suspensiones acuosas, las emulsiones de aceite, las emulsiones de agua en aceite, las emulsiones de agua en aceite en agua, las emulsiones de sitio especifico, las emulsiones de larga residencia, las emulsiones pegajosas, las microemulsiones y las nanoemulsiones . Los transportadores sólidos son transportadores biológicos, transportadores químicos o ambos que incluyen, pero no están limitados a los sistemas de vector virales, las partículas, las micropartículas, las nanoparticulas , las microesferas , las nanoesferas, las minibombas, los extractos de pared de células bacteriales y los polímeros sintéticos o naturales no biodegradables o biodegradables que permiten para la liberación sostenida de composiciones oligonucleótidas . Las emulsiones, las minibombas y los polímeros pueden ser implantados en la vecindad de donde el suministro es requerido (Brem y otros, J.Neurosurg. 74:441, 1991). Los métodos usados para polinucleótidos 3 '-0H, 5 '-0H complejos a un transportador sólido incluyen, pero no están limitados a la absorción directa a la superficie del transportador sólido, el acoplamiento covalente a las superficie del transportador sólido, ya sea directamente o por medio de una mitad de eslabón, un acoplamiento covalente al polímero usado para hacer el transportador sólido. · Opcionalmente, una(s) secuencia (s) puede (n) ser estabilizada ( s ) mediante la adición de polímeros iónicos o no iónicos tales como los monooleatos de polioxietilen sorbitán (TWEEN) o de ácido hialurónico.

Los transportadores acuosos preferidos incluyen, pero no están limitados al agua, la salina y los amortiguadores farmacéuticamente aceptables. Los transportadores no acuosos preferidos incluyen, pero no están limitados a un aceite mineral o a un aceite neutral que incluye, pero no está limitado a un diclicerido, un triglicerido, un fosfolipido, un lipido, un aceite y las mezclas de los mismos, en donde el aceite contiene una mezcla apropiada de ácidos grasos saturados y poliinsaturados . Los ejemplos incluyen, pero no están limitados al aceite de semilla de soya, el aceite de cañóla, el aceite de palma, el aceite de oliva y el migliol, en donde los ácidos grasos pueden ser saturados y o sin saturar. Opcionalmente, los excipientes pueden ser incluidos a pesar del transportador farmacéuticamente aceptable usado para presentar las composiciones de polinucleótido 3 '-OH, 5 '-OH a las células. Estos se excipientes incluyen, pero no están limitados a los antioxidantes, los amortiguadores, y los bacteriostatos, y pueden incluir los agentes dispersos y los agentes espesantes.

Uno o más polinucleótidos 3 '-OH, 5 '-OH pueden ser administrados a un humano o a un animal solos, o en combinación con otras modalidades inmunomodulatorias que incluyen, pero no están limitadas a los siguientes: el hidróxido de aluminio; el fosfato de aluminio; el fosfato de calcio; los polímeros; los copolímeros tales como los copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, que incluyen los copolímeros de bloque; el polímero P1005; el adyuvante completo Freund (para animales) ; el adyuvante incompleto Freund; el monooleato de sorbitán; el escualeno; el adyuvante CRL-8300; el Q3 21; las saponinas; el ISCOM; el dipéptido de muramilo; el dipéptido de glucosaminilmuramilo; los extractos bacteriales, que incluyen los extractos micobacteriales ; las células bacteriales completas, que incluyen las células micobacteriales completas; las endotixinas desintoxicadas; los lipidos de membrana; el ADN aislado de organismos procarióticos, los oligonucleótidos sintéticos CpG; los oligonucleótidos sintéticos de no CpG; los apatámeros; los plásmidos; las moléculas inmunoestimulatorias que codifican plásmidos; las moléculas poli(I:C); las citoquinas; las quemoquinas y los derivados; el ácido hialurónico y los derivados; -la toxina del cólera; la toxina pertussis y la hemocianina de limpeto de cerradura o las combinaciones de los mismos.

También, uno o más polinucleótidos 3! -OH, 5' -OH pueden ser administrados solos, o en combinación con otras modalidades terapéuticas que incluyen, pero no están limitadas a los agentes quimoterapéuticos , los agentes antimicrobiales, o los agentes antivirales. Los agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no están limitados a los antimetabolitos , el daño de ADN, el microtúbulo desestabilizador, el microtúbulo estabilizador, la actina despolimizante, la inhibición del crecimiento, la inhibición de topoisomerasa, la inhibición HMG-CoA, la inhibición de purina, la inhibición de pirimidina, la inhibición de metaloproteinasa, la inhibición de CDK, la inhibición de angiogénesis y los itiejoradores de diferenciación. Las dosis y los métodos de administración de estas y de otras modalidades terapéuticas son conocidas por uno de habilidad ordinaria en el arte.

Los métodos de administración de los polinucleótidos 3 '-OH, 5 '-OH de la presente invención, las células que presentan antigenos o las células dendriticas que contienen los polinucleótidos 3 '-OH, 5' -OH, con las composiciones que comprenden polinucleótidos 3 '-OH, 5 '-OH y. otros materiales tales como los transportadores de la presente invención que son particularmente apropiados para varias formas que incluyen, pero no están limitados a los siguientes tipos de administración la oral (por ejemplo, bucal o sublingual) , la anal, la rectal, tal como un supositorio, la tópica, la parenteral, la nasal, el aerosol, la inhalación, la subcutánea, la intramuscular, la intratejido (por ejemplo, tejido o glándula) , la intrauterina, la vaginal, en una cavidad del cuerpo, la administración quirúrgica en la ubicación de un tumor o de una herida interna, directamente en los tumores, en el lumen o en la parenquima de un órgano, en la médula ósea y en cualquier superficie mucosa del sistema gastrointestinal, reproductivo, urinario y el genitouterino . En una incorporación preferida, los polinucleótidos 3 '-OH, 5 '-OH de la presente invención son administrados a una superficie mucosa del grupo que consiste de la superficie intravesical (vejiga interior) , la ocular, la oral, la nasal, la rectal y la vaginal. Las técnicas útiles en las varias formas de administraciones anteriormente mencionadas incluyen pero no están limitadas a la aplicación tópica, la ingestión, la administración quirúrgica, las inyecciones, los rociadores, los dispositivos de suministro transdermal, las bombas osmóticas, electrodepositar directamente en un sitio deseado, u otros medios familiares a uno de habilidad ordinaria en el arte. Los sitios de aplicación pueden ser externos, tales como en la epidermis, o la interna, por ejemplo una úlcera gástrica, un campo quirúrgico, o en cualquier otro lado.

Las composiciones de la presente invención pueden ser aplicadas en la forma de cremas, geles, solución es, suspensiones, liposomas, partículas, u otros medios conocidos por uno de habilidad ordinaria en el arte de formulación y suministro de las composiciones. Los tamaños de partículas ultrafinas pueden ser usados para el suministro de inhalación de terapéuticos. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para la administración subcutánea incluyen, pero no están limitadas a los implantes, el depósito, las agujas, las cápsulas, y las bombas osmóticas. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para la administración vaginal incluyen pero no están limitadas a las cremas y los anillos. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para la administración oral incluyen pero no están limitadas a: las pildoras, los líquidos, los jarabes, y las suspensiones. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para la administración transdermal incluyen pero no están limitadas a los geles, las cremas, las pastas, los parches, los rociadores, y los geles. Algunos ejemplos de mecanismos de suministro apropiado para la administración subcutánea incluyen, pero no están limitados a los implantes, los depósitos, las agujas, las cápsulas y las bombas osmóticas. Las formulaciones apropiadas para la administración parenteral incluyen, pero no están limitadas a las soluciones de inyección estéril acuosas y no acuosas las cuales pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostatos y solutos los cuales rinden la formulación isotónica con la sangre del recipiente en intención, y las suspensiones estériles acuosas y no acuosas las cuales pueden incluir a los agentes dispersos y los agentes espesantes. Las soluciones y las suspensiones de inyección extemporáneas pueden ser preparadas de polvos estériles, gránulos y tabletas comúnmente usados por uno de habilidad ordinaria en el arte.

Las incorporaciones en las cuales las composiciones de la invención son combinadas con, por ejemplo, uno o más excipientes o transportadores farmacéuticamente aceptables pueden convenientemente ser presentados en dosis de unidad de y pueden ser preparados mediante técnicas farmacéuticamente convencionales. Tales técnicas incluyen el paso de traer en asociación las composiciones que contienen el ingrediente activo y el (los) excipiente (s ) o el (los) transportador (es ) farmacéutico ( s ) . En general, las formulaciones son preparadas mediante uniformemente e intimamente traer en asociación el ingrediente activo con transportadores líquidos. Las formulaciones de dosis de unidad preferidas son aquellas que contienen una dosis o unidad, o una fracción apropiada del mismo, del ingrediente administrado. Deberá de ser entendido que la adición de los ingredientes particularmente anteriormente mencionados, las formulaciones que comprenden las composiciones de la presente invención pueden incluir otros agentes comúnmente usados por uno de habilidad ordinaria en el arte.

El volumen de administración podrá variar dependiendo en la ruta de administración. Tales volúmenes son conocidos por uno de habilidad ordinaria en el arte de administrar composiciones a animales o a humanos. Dependiendo en la ruta de administración, el volumen por dosis es preferiblemente alrededor de 0.001 a 100 mililitros por dosis, más preferiblemente alrededor de 0.01 a 50 mililitros por dosis y más preferiblemente alrededor de 0.1 a 30 mililitros por dosis. Por ejemplo, las inyecciones intramusculares pueden estar en el rango en volumen desde alrededor de 0.1 a 1.0 mililitros. Las composiciones oligonucleótidas administradas solas, o junto con otro(s) agente (s) terapéutico (s ) , pueden ser administrados en un tratamiento de dosis sencilla, en tratamientos de dosis múltiples, o continuamente infundidas en un horario y sobre un periodo de tiempo apropiado a la enfermedad es tratada, la condición del recipiente y la ruta de administración. Más aún, el otro agente terapéutico puede ser administrado antes, al mismo tiempo como, o después de la administración de las composiciones oligonucleótidas .

Preferiblemente, la cantidad de polinucleótido 3 '-0H, 5 '-0H administrado por dosis es desde alrededor de 0.0001 a 100 miligramos por kilogramo por peso corporal, más preferiblemente desde alrededor de 0.001 a 10 miligramos por kilogramo por peso corporal y más preferiblemente desde alrededor de 0.01 a 5 miligramos por kilogramo por peso corporal. Más particularmente el polinucleótido 3 '-OH, 5 '-OH y el agente terapéutico particular administrado, la cantidad por dosis, el horario de la dosis y la ruta de administración deberá de ser decidida por el practicante que usa a los métodos conocidos por aquellos con habilidad en el arte y podrá depender en el tipo de enfermedad, la severidad de la enfermedad, la ubicación de la enfermedad y otros factores clínico y s tales como el tamaño, el peso y la condición física del recipiente. Adicionalmente, los ensayos in vitro pueden opcionalmente ser empleados para ayudar a identificarlos rangos óptimo para la secuencia y para la administración del agente terapéutico más la secuencia.

Los siguientes ejemplos podrán servir para adicionalmente ilustrar la presente invención sin, al mismo tiempo, sin embargo, constituir cualquier limitación a la misma. Por el contrario, deberá de ser claramente entendido que el recurso puede ser obtenido de varias otras incorporaciones, modificaciones, y equivalentes a las mismas y las cuales, después de leer la descripción aquí, pueden sugerirse así mismas a otros de habilidad en el arte sin apartarse del espíritu y del alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Preparación de polinucleótidos 3' -OH, 5' -OH Las secuencias de polinucleótidos 3 '-0H, 5 '-0H fueron preparadas por Sigma-Genosys (Woodlands, Texas) que usan la Tecnología de Síntesis Segmentada Abacus . A menos que se indique de otra manera, las secuencias fueron dispersadas en agua deionizada autoclave o en un amortiguador farmacéuticamente aceptable tal como, pero no limitado a la salina inmediatamente antes de su uso. Las siguientes secuencias fueron usadas; NIA, N1B, N2A, N2B, N3A, N3B, N4A, N4B, N5A, N5B, N6A, N6B, N7A y N7B.

EJEMPLO 2 Células dendriticas Las células dendriticas humanas fueron obtenidas de Clonetics (San Diego, California, Estados Unidos de América) y fueron cultivadas en el medio recomendado por Clonetics. Las células dendríticas fueron obtenidas de tres diferentes individuos (ver Tabla 1) . La clasificación de histocompatibilidad mayor fue efectuada en cada uno de estos individuos y están mostrados varios de los tipos de HLA (antigenos de leucocitos humanos) .

Tabla 1 Características de Células Dendríticas EJEMPLO 3 Incremento en el tamaño de la célula y granulosidad de células dendríticas cultivadas con polinucleótidos 3'-OH, 5' -OH Las células dendríticas fueron plantadas en 1.0 mililitros a 1.0 X 105 células por mililitro en platos de cultivo de tejido de fondo plano de pozo 6 por 48 horas con 100 µg de polinucleótidos NIA, N1B, N2A, N2B, N3A, N3B, N4A, N4B, N5A, N5B, N6A, N6B, N7A ó N7B de base. El tamaño 'de la célula (FCS: esparcido lateral delantero) y la granulosidad (SSC: esparcido ligero lateral) fueron determinados mediante las citometría de flujo usando un Calibrador FACS y analizados usando el programa de cómputo CELLQuest Pro (ambos de Becton- Dickinson, San Diego, California, Estados Unidos de América) . El porcentaje de células dendríticas que muestran una esparcido lateral delantero > 500 unidades y un esparcido ligero lateral > 400 unidades han sido determinados después del tratamiento con polinucleótidos 3 '-0H, 5 '-OH para las células dendriticas aisladas de los tres diferentes individuos.

Tabla 2 Porcentaje de células dendriticas que muestran un esparcido lateral delantero > 500 unidades y un esparcido ligero lateral > 400 unidades después del tratamiento con polinucleótidos 3 '-OH, 5 '-OH. El porcentaje está basado sobre la población total de cada grupo de células dendriticas como se determina por el FACS Como se muestra en la Tabla 2, un número de secuencias indujeron la estimulación/madurez y de las células dendriticas como se determina por su incremento en el tamaño de célula (esparcido lateral delantero) y la granulosidad (esparcido ligero lateral) .

EJEMPLO 4 Inducción de la producción IL-lbeta Las células dendríticas fueron plantadas en 1.0 mililitros a 1.0 X 105 células por mililitro en platos de cultivo de tejido de fondo plano de pozo 6 por 48 horas con 100 de polinucleótidos NIA, N1B, N2A, N2B, N3A, N3B, N4A, N4B, N5A, N5B, N6A, N6B, N7A ó N7B de base 6. La producción de IL- lbeta fue determinada en 100 1 de supernadante de cultivo que usa un ELISA comercial (BioSource, Camarillo, California, Estados Unidos de América) después de 48 horas de incubación. Los resultados están expresados como el incremento de "pliegue" (x) en la producción IL-lbeta en células dendríticas tratadas comparadas con las células de control.

Tabla 3 Producción de IL-lbeta mediante células dendríticas (incremento de pliegue coir.parado con células dendríticas sin tratar) Como se muestra en la Tabla 3, el polinucleótido N3B y el polinucleótido N5B indujeron la producción de IL-lbeta pinceladas de los tres individuos analizados.

EJEMPLO 5 Inducción de producción IL-12 Las células dendríticas fueron sembradas en 1.0 mililitros a 1.0 X 105 células por mililitro en platos de cultivo de tejido de fondo plano de pozo 6 por 48 horas con 100 µg de polinucleótidos NIA, N1B, N2A, N2B, N3A, N3B, N4A, N4B, N5A, N5B, N6A, N6B, ?7? ó N7B de base 6. La producción de IL-12 fue determinada en 100 1 de supernadante de cultivo que usa un ELISA comercial (BioSource) después de 48 horas de incubación. Los resultados están expresados como el incremento que "pliegue" (x) en la producción de IL-12 mediante las células dendriticas tratadas comparadas con las células de control.

Tabla 4 Producción de IL-12 mediante células dendríticas (incremento de pliegue comparado con células dendríticas sin tratar) Como se muestra en la Tablea 4, un número secuencias indujeron la producción de IL-12.

EJEMPLO 6 Inducción de producción IFN-gamma Las células dendríticas fueron plantadas en 1.0 mililitros a 1.0 X 105 células por mililitro en platos de cultivo de tejido de fondo plano de pozo 6 por 48 horas con 100 µg de polinucleótidos NIA, N1B, N2A, N2B, N3A, N3B, N4A, N4B, N5A, N5Bf N6A, ?ß?, N7A ó N7B de base 6. La producción de IFN- gamma fue determinada en 100 µ? de supernadante de cultivo que usa un ELISA comercial (BioSource) después de 48 horas de incubación. Los resultados están expresados como el incremento de "pliegue" (x) de la producción de IFN-gamma mediante las células dendriticas tratadas comparadas con las células de control .

Tabla 5 Producción de IFN-gamma mediante células dendriticas (incremento de pliegue comparado con células dendriticas sin tratar) Como se muestra en la Tabla 5, el polinucleótido N3B y el polinucleótido N5B indujeron la producción de IFN- gamma en células de los tres individuos analizados.

EJEMPLO 7 Inducción de IL-12 mediante secuencias GM-CSF plus Las células dendriticas del individuo B fueron sembradas en 1.0 mililitros a 1.0 X 105 células por mililitro en platos de cultivo de tejido de fondo plano de pozo 6 por 48 horas con 500 unidades de recombinante humano GM-CSF (Clonetics) y 100 µg de polinucleótido NIA ó de polinucleótido N7A de base 6. La producción de IL-12 fue determinada en 100 µ? de supernadante de cultivo que usa un ELISA comercial (BioSource) después de 48 horas de incubación. Los resultados están expresados como el incremento de "pliegue" (x) en la producción de IL-12 mediante células dendriticas tratadas comparadas con las células de control en ausencia o en la presencia del recombinante GM-CSF.

Tabla 6 Producción de IL-12 mediante células dendriticas del individuo B en la presencia de GM-CSF (incremento de pliegue comparado con células dendriticas sin tratar) Como se muestra en la Tabla 6, la sinerg observada entre el GM-CSF y el polinucleótido NIA ó polinucleótido ?7? para la producción de IL-12 mediante célul dendriticas .

EJEMPLO 8 Incremento de niveles de CD40 en la superficie de las células de células dendríticas Las células dendríticas de los individuos B y C fueron sembradas en 1.0 mililitros a 1.0 X 105 células por mililitro en platos de cultivo de tejido de fondo plano de pozo 6 por 48 horas con 100 µg de polinucleótidos NIA, N1B, N2A, N2B, N3A, N3B, N4A, N4B, N5A, N5B, N6A, N6B, N7A ó N7B de base 6. El nivel de CD40 en la superficie de la célula fue determinado después de 48 horas de incubación mediante la citometria de flujo (sistema de Calibre FACS) que usa una anticuerpo monoclonal FITC-conjugado dirigido a CD40 y analizado por el CELLQuest Pro (todos de Becton Dickinson) . Los resultados están expresados como el porcentaje de CD40alto de células dendríticas seguido del tratamiento. El término "CD40alto" se refiere a una población de células identificadas mediante la citometria de flujo como que tiene una base más alta que la expresión de línea base a de CD40.

Tabla 7 El porcentaje de CD40 ° de células dendríticas seguido del tratamiento Como se muestra en la Tabla 7, un número de secuencias que tienen la habilidad de significativamente regular la expresión de CD40 en la superficie de la célula de las células dendríticas . **p<0.001 Kolmogorov-Smirnov (D>0.20).

EJEMPLO 9 Incremento de niveles de CD80 de la superficie en la superficie de la célula de células dendríticas Las células dendríticas de los individuos B y C fueron sembradas en 1.0 mililitros a 1.0 X 105 células por mililitro en platos de cultivo de tejido de fondo plano de pozo 6 por 48 horas con 100 µq de polinucleótidos NIA, N1B, N2A, N2B, N3A, N3B, N4A, N4B, N5A, N5B, N6A, N6B, . N7A ó N7B de base 6. El nivel de CD80 en la superficie de la célula fue determinado después de 48 horas de incubación mediante la citometria de flujo que usa un anticuerpo monoclonal FITC- conjugado dirigido al CD80 (Serotec, Oxford, Reino Unido) y analizado mediante el CELLQuest. Los resultados están expresados como el porcentaje de CD80alto de células dendriticas seguido del tratamiento.

Tabla 8 Porcentaje de CD80alto de células dendriticas seguido del tratamiento Como se muestra en la Tabla 8, un número de secuencias significativamente regularon la expresión de CD80 en la superficie de la célula de las células dendriticas . **p<0.001 Kolmogorov-Smirnov (D>0.20).

EJEMPLO 10 Incremento de niveles de CD86 de la superficie de la célula células dendriticas Las células dendriticas ce los individuos B y C fueron sembradas en 1.0 mililitros a 1.0 X 105 células por mililitro en platos de cultivo de tejido de fondo plano de pozo 6 por 48 horas con 100 µg de polinucleótidos NIA, N1B, N2A, N2B, N3A, N3B, N4A, N4B, N5A, N5B, N6A, N6B, N7A ó N7B de base 6. El nivel de CD86 en la superficie de la célula fue determinado después de 48 horas de incubación mediante la citometria de flujo que usa un anticuerpo monoclonal PE- conjugado dirigido al CD86 (Serotec) y analizado por el CELLQuest Pro. Los resultados están expresados como el porcentaje de CD86alto de células dendriticas seguido del tratamiento .

Tabla 9 porcentaje de CD86 0 de células dendrítica seguido del tratamiento Como se muestra en la Tabla 9, un número de secuencias significativamente regularon la expresión de CD86 en la superficie de la célula de las células dendriticas . **p<0.001 Kolmogorov-Smírnov (D>0.20).

EJEMPLO 11 Incremento de niveles de MHC-II en la superficie de la célula de las células dendriticas Las células dendriticas del individuo B fueron sembradas en 1.0 mililitros a 1.0 X 105 células por mililitro en platos de cultivo de tejido de fondo plano de pozo 6 por 48 horas con 100 µ? de polinucleótidos NIA, N1B, N2A, N2J3, N3A, N3B, N4A, N4B, N5A, N5B, ?6?, N6B, N7A ó N7B de base 6. El nivel de MHC-II en la superficie de la célula fue determinado después de 48 horas de incubación mediante la citometria de flujo que usa un anticuerpo monoclonal FITC-conjugado dirigido al MHC-II (Serotec) y analizado por el CELQuest Pro. Los resultados están expresados como el porcentaje de que MHC-IIalto de células dendriticas seguido del tratamiento.

Tabla 10 El porcentaje de MHC-IIalt0 de células dendríticas seguido del tratamiento Como se muestra en la Tabla 10, los polinucleotidos NIA, N2A y N7B significativamente regularon la expresión de MHC-II en la superficie de la célula de las células dendriticas. **p<0.001 Kolmogorov-Smirnov (D>0.20).

EJEMPLO 12 Disminución de niveles de OX-2 en la superficie de la célula de las células dendríticas Las células dendriticas del individuo A fueron sembradas en 1.0 mililitros a 1.0 X 105 células por mililitro en platos de cultivo de tejido de fondo plano de pozo 6 por 48 horas con 1, 10 ó 100 µg de polinucleotidos N3A ó N6A de bases 6,1 el nivel de OX-2 en la superficie de la célula fue determinado después de 48 horas de incubación mediante la citometría de flujo que usa un anticuerpo monoclonal FITC- conjugado dirigido al OX-2 (BioSPARK, Greenwich, Connecticut, Estados Unidos de América) y analizado por el CELLQuest Pro. El OX-2, un antigeno de superficie de célula dendrítica, se ha encontrado que inhibe la estimulación de la producción de citoquina Thl y para proporcionar una señal de tolerancia a las células humanas (Gorczynski y otros, J.Immunol. 1999, 162:774- 781) . Los resultados están expresados como el porcentaje de 0X- 2alt0 de células dendrítica seguido del tratamiento.

Tabla 11 Porcentaje de 0X-2alt0 de células dendríticas seguido del tratamiento Como se muestra en la Tabla 11, el polinucleótido N3A significativamente reguló la expresión de OX-2 de la superficie de la célula de las células dendríticas . **p<0.001 Kolmogorov-Smirnov (D>0.20).

EJEMPLO 13 Incremento de endocitosis mediante células dendríticas Las células dendríticas del individuo B fueron sembradas en 1.0 mililitros a 1.0 X 105 células por mililitro en platos de cultivo de tejido de fondo plano de pozo 6 por 48 horas con 1 miligramo de FITC-dextrano (20 kDa, Sigma-Aldrich) en la ausencia en la presencia de 100 µg de polinucleótidos N2A, N2B, N3A, N3B, N5A, N5B, y N6B de base 6 a 4°C (aglomerante de superficie que célula de control de FITC-dextrano) a 37°C (para evaluar la endocitosis) . Las células fueron lavadas tres veces con salina amortiguada de fosfato helada y analizada por la citometría de. flujo que usa el CELLQuest Pro. Los resultados están expresados como la tasa endocítica relativa (normalizada ? Valor de Fluorescencia Media (AMFV) ) . AMFV = MFV de células dendríticas expuestas al FITC-dextrano a 37 °C - MFV de células dendríticas expuestas al FITC-dextrano a 4°C. AMFV = (AMFV secuencia/AMFV control) x 100.

Tabla 12 endocítica relativa de células dendríticas seguido del tratamiento Como se muestra en la Tabla 12, los polinucleótidos N2A, N2B, N3A, N5A y N5B aumentaron tasa endocítica de las células dendríticas.

EJEMPLO 14 Vacunación de cáncer con células dendríticas de antígeno-pulsadas Las células dendríticas aisladas del ratón C57B/6 fueron cargadas in vitro con lisato de célula de tumor de células de melanoma B-16. Los polinucleótidos NIA, N1B, N2A, N2B, N3A, N3B, N4A, N4B, N5A, N5B, N6A, 6B, N7A ó N7B están incluidos durante la pulsación de antígeno. Setenta y cinco ratones C57B/6 fueron simultáneamente inyectados con .alrededor de 2 x 106 células de melanoma B-16.

Siete días después de la inoculación del tumor, los ratones fueron divididos en grupos de 15 de 5 ratones cada uno. El Grupo 1 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16; el Grupo 2 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 µq de polinucleótido NIA; el Grupo 3 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 g de polinucleótido N1B; el Grupo 4 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato + 100 µ9 de polinucleótido N1B; el Grupo 4 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 µg de polinucleótido N2A; el Grupo 5 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 µg de polinucleótido N2B; el Grupo 6 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 de polinucleótido N3A; el Grupo 7 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 µg de polinucleótido N3B; el Grupo 8 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 xq de polinucleótido N4A; el Grupo 9 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 µg de polinucleótido N4B; el Grupo 10 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 µg de polinucleotido N5A; el Grupo 11 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 iq de polinucleotido N5B; el Grupo 12 de ratones son vacunados con ¿ x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 µg de polinucleotido N6A; el Grupo 13 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 de polj nucleótido N6B; el Grupo 14 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 g de polinucleotido N7A; y el Grupo 15 de ratones son vacunados con 2 x 104 de células dendriticas pulsadas de lisato de tumor B-16 + 100 ? de polinucleotido N7B.

Una semana después las vacunaciones previamente descritas son repetidas. Después de 2 semanas, el volumen y el peso de los tumores fueron analizados. Los Grupos 2 a 15 de ratones tenían menos masa de tumor que el Grupo 1 de ratones. Los linfocitos T citotóxicos específicos (CTL) dirigidos a los antigenos B-16 son analizados mediante el ELISPOT IFN-gamma que usan células mononucleares de sangre periférica derivadas de los ratones antes y después de la inyección de las células dendriticas pulsadas de lisato de tumor. La frecuencia de linfocitos T citotóxicos dirigidos a B-16 es superior en los Grupos 2 a 15 de los ratones que en el Grupo 1 de los ratones.

EJEMPLO 15 Vacunación con células dendríticas pulsadas de Bordatella pertussis Las células dendríticas de los ratones C57BL/6 son cargadas in vitro con 107 Bordatella pertussis calentadas muertas. Los polinucleótidos NIA, NlB, N2A, N2b, N3A, N3B, N4A, N4B, N5A, N5B, N6A, N6B, N7A ó N7B están incluidos durante la pulsación de antigeno. Setenta ratones C57BL/6 son divididos en 15 grupos de 5 ratones . El Grupo 1 de ratones son vacunados con 107 células dendríticas pulsadas de Bordatella pertussis calentadas muertas; el Grupo 2 de ratones son vacunados con 107 células dendríticas pulsadas Bordatella pertussis calentadas muertas + 100 g de polinucleotido NIA; el Grupo 3 de ratones son vacunados con 107 células dendríticas pulsadas Bordatella pertussis calentadas muertas + 100 µg de polinucleotido NlB; el Grupo 4 de ratones son vacunados con 107 células dendríticas pulsadas Bordatella pertussis calentadas muertas + 100 µg de polinucleotido N2A; el Grupo 5 de ratones son vacunados con 107 células dendríticas pulsadas de Bordatella pertussis calentasa muertas + 100 µg de polinucleotido N2B; el Grupo 6 de ratones son vacunados con 107 células dendríticas pulsadas de Bordatella pertussis calentasa muertas + 100 µg de polinucleotido N3A; el Grupo 7 de ratones son vacunados con 107 células dendríticas pulsadas de Bordatella pertussis calentasa muertas + 100 µg de polinucleótido N3B; el Grupo 8 de ratones son vacunados con 107 células dendriticas pulsadas de Bordatella pertussis calentadas muertas + 100 µg de polinucleótido N4A; el Grupo 9 de ratones son vacunados con 107 células dendriticas pulsadas de Bordatella pertussis calentadas muertas + 100 µ? de polinucleótido N4B; el Grupo 10 de ratones son vacunados con 107 células dendriticas pulsadas de Bordatella pertussis calentadas muertas + 100 g de polinucleótido N5A; el Grupo 11 de ratones son vacunados con 107 células dendriticas pulsadas de Bordatella pertussis calentadas muertas + 100 µg de polinucleótido N5B; el Grupo 12 de ratones son vacunados con 107 células dendriticas pulsadas de Bordatella pertussis calentadas muertas + 100 µg de polinucleótido N6A; el Grupo 13 de ratones son vacunados con 107 células dendriticas pulsadas de Bordatella pertussis calentadas muertas + 100 µg de polinucleótido N6B; el Grupo 14 de ratones son vacunados con 107 células dendriticas pulsadas de Bordatella pertussis calentadas muertas + 100 µg de polinucleótido N7A; y el Grupo 15 de ratones son vacunados con 107 células dendriticas pulsadas de Bordatella pertussis calentadas muertas + 100 µg de polinucleótidos N7B.

Las vacunas anteriormente descritas son repetidas dos veces a intervalos semanales. Dos semanas después de la última administración de celadas en criticas, los ratones son retados con 5 x 106 Bordatella pertussis (administración intranasal) . Los animales son muertos después del reto y analizados por niveles de IgG específicos de Bordatella pertussis en el suero, la carga bacteria al en los pulmones, y las células que secretan anticuerpos específicos de Bordatella pertussis en los pulmones. Los Grupos 2 a 15 de ratones muestran un nivel superior de IgG específico de Bordatella pertussis que en el Grupo 1 de ratones. Los Grupos 2 a 15 mostraron menos Bordatella pertussis en el pulmón que el Grupo 1 de ratones. Los Grupos 2 a 15 de ratones mostraron que niveles superiores de células que secretan anticuerpos específicos de Bordatella pertussis en el pulmón.

EJEMPLO 16 Vacunación con Antigeno de Superficie de Hepatitis La inmunización con antígeno de superficie de hepatitis B recombinante (HbsAg; Cortex Bioquímico, San Leandro, California, Estados Unidos de América) combinado con hidróxido de aluminio (Alum; SuperFos de Biosector, Vedback, Dinamarca) y/o con polinucleótidos N3A, N6A ó N6B, fue conducida en ratones BALB/C hembras de 6 a 8 semanas de edad (Charles River, St-Constant, Quebec, Canadá) . Cada ratón (5 ratones por grupo) recibió una inyección intramuscular sencilla en el músculo tibial de una solución que contiene: Salina (Grupo 1), HbsAg 1 µg (Grupo 2), HbsAg 1 µg + Alum 10 µg (Grupo 3), HbsAg 1 ? + Alum 10 µg + N3A 10 µg (Grupo 4), HbsAg 1 + Alum 10 µg + N3A 100 µg (Grupo 5), HbsAg 1 µg + Alum 10 µg + N3B 10 µg (Grupo 6) , HbsAg 1 µg + Alum 10 µg + N3B 100 g (Grupo 7), HbsAg 1 + Alum 10 µg + N6A 10 µg (Grupo 8), HbsAg 1 µg + Alum 10 µg + N6A 100 µg (Grupo 9) , HbsAg 1 µg + Alum 10 µg + N6B 10 µg (Grupo 10) y HbsAg 1 µq + Alum 10 µg + N6B 100 µg (Grupo 11) en un volumen total de 50 1 en el día 0 y en el día 21. El plasma fue recuperado en el día 31.

Los anticuerpos específicos para HbsAg fueron detectados y cuantificados mediante el ensayo de dilución de punto final ELISA. Brevemente, una fase sólida de proteína HbsAg (0.1 g por pozo, durante la noche a 4°C) fue usada para capturar anti-HbsAg en el plasma (1 hora a 37 °C) , la cual fue entonces detectada con anti-ratón de cabra conjugada de peroxidasa de rábano IgC (total) , IgGl y IgG2a siguiendo las instrucciones del fabricante (Clonetyping System, de Southern Biotechnology Inc. de Birmingham, Alabama, E.U.A.) . Las concentraciones de punto de extreme fueron definidas como la dilución de plasma más alta que resultó en un valor de absorbencia (OD 450) dos veces mayor que aquella del control (Grupo 1) . Los datos están expresados en la labia 13, el medio ±SD de 5 ratones por grupo.

Tabla 13. Concentraciones de punto de extremo para ratones inmunizados con HbsAg Como se mostró en la tabla 13, N3A (Grupo 4: HgsAg 1 pg+ Alum 10 pg +N3A 10 g y Grupo 5: HbsAg 1 pg + Alum 10 pg +N3A 100 pg) y N6A (Grupo 9: HbsAg 1 ]iq + Alum 10 pg + N6A 100 g) tienen la capacidad de estimular significativamente la respuesta inmune en contra de HbsAg por aumentar la concentración de IgG, IgGl y IgG2a en contra de HbsAg.

EJEMPLO 17 Vacunación Oral con Antígeno de Superficie Hepatitis La inmunización con un antigeno de superficie B de hepatitis recombinante combinado con un polinucléotido N6A o N6B fue conducida sobre ratones BALB/C hembras de 6 a 8 semanas de edad (Charles Ri er, St-Constant , Québec, Canadá) . Cada ratón (5 ratones por grupo) había recibido oralmente una solución conteniendo: Agua salada (grupo 1), HbsAg 10 pg (Grupo 2), HbsAg 10 pg + N6A 1 pg (Grupo 3), HbsA 10 pg + N6A 10 pg (Grupo 4), HbsAg 10 pg + N6A 100 pg (Grupo 5), HbsAg 10 pg + N6B 1 pG (Grupo 6), HbsAg 10 pg + N6B 10 pg (Grupo 7), y HbsAg 10 pg + N6B 100 pg (Grupo 8) en un volumen total de 50 pl el dia 0, el día 7 y el día 14. Los lavados de Plasma y de los intestinos fueron recuperados en el día 21. Los lavados de Intestinos (para la determinación IgA) fueron obtenidos mediante el medir con pipeta suavemente 0.2 mi de inhibidores de proteasa conteniendo PBS conteniendo (10 pg de pepstatín, 10 pg de leupeptina, 10 pg de antipaina y 50 pg de benzamidina) .

Los anticuerpos específicos para HbsAg fueron detectados y cuantificados por ELISA. Brevemente, una fase sólida de proteína HbsAg (1.0 pg por pozo, durante la noche a 4°C) se usó para capturar el anti-HbsAg en el plasma o en los lavados de intestinos (1 hora a 37 °C) los cuales fueron entonces detectados con IgA antiratón de cabra conjugados con peroxidasa raíz fuerte (para lavados de intestinos) y IgG total antiratón cabra (para plasma) siguiendo las instrucciones del fabricante (Clonetyping System, Southern Biotechnology Inc.). Los datos son expresados en la tabla 14 en OD (450 nm) como el medio + SD de 5 ratones por grupo. El ODs para IgA son obtenidos siguiendo la dilución de lavados de intestinos 1.2 mientras que el IgG son obtenidos siguiendo la dilución de suero 1:16.

Tabla 14. OD (450 nm) para ratones inmunizados oralmente con HbsAg Como se mostró en la tabla 14, ?6? (Grupo 3: HbsAg 10 g + N6A 1 pg: Grupo 4:HbsAg 10 g + N6a 10 ]ig y Grupo 5: HbsAg 10 g + N6A 100 g) y N6B (Grupo 8: HbsAg 10 µ? + N6b 100 µ?) estimularon significativamente la respuesta inmune en contra de HbsAg después de la administración oral.

Todas las patentes, publicaciones y extractos citados anteriormente son incorporados aqui por referencia en su totalidad. Deberá entenderse que lo anterior se refiere solo a incorporaciones preferidas de la presente invención y que pueden hacerse numerosas modificaciones o alteraciones ahí sin departir del espíritu y alcance de la presente invención como se define en las siguientes reivindicaciones .

Claims (17)

R E I V I D I C A C I O N E S

1. Una composición que comprende una secuencia de polinucléotido 3' -OH, 5 'OH aislada que comprende seis bases, en donde a) por lo menos 50% de las bases son guanina; b) la base 5' es guanina; y c) la composición estimula una respuesta inmune en un animal o humano al cual es administrada la composición o la composición estimula una celda que presenta antigeno a la cual la composición es administrada in Vitro.

2. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque la secuencia de polinucléotido comprende 5' GGNNGG3' en donde N es G, C, A o T.

3. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque la secuencia de polinucléotido comprende 5' GGGNGG3' en donde N es G, C, A o T.

4. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque la secuencia de polinucléotido es 5 ' GTGTGT3 ' , 5 ' GGTGGG3 ' , 5' GGGTGG3' , 5' GGGCGG3' , 5 ' GGGAGG3 ' o 5' GGGGGG3' .

5. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque la secuencia de polinucléotido es 5' GGGTGG3' , 5' GGGAGG3' .

6. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque la secuencia de polinucléotido comprende una columna de fosfodiéster .

7. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque la secuencia de polinucléotido comprende una columna de fósforo tioato.

8. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque la composición estimula una o más células que presentan antigeno en el animal o el humano.

9. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1 u 8, caracterizada porque la célula que presenta antigeno es una célula dendritica.

10. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque la estimulación de la respuesta inmune comprende una o más respuestas de células dendritrica seleccionada del grupo que consiste de un aumento en el tamaño de célula y/o granularidad, un aumento en la producción IL-lbeta, y IL-12 0 IFN gamma, un aumento en la expresión de superficie de célula CD40, CD80, CD86 O HC II, una disminución en la expresión de superficie de celda OX-2 y aumento en endocitosis.

11. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque la respuesta inmune es una respuesta inmune sistémica o una respuesta inmune mucosal.

12. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque además comprende un polipéptido antigeno.

13. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque además comprende un polinucléotido que codifica a un antigeno.

14. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque además comprende un agente inmuno modulatorio.

15. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque la composición estimula una célula que presenta antigeno a la cual la composición es administrada y en donde la célula que presenta antigeno estimulada es administrada a un animal o a un humano.

16. El uso de la composición de cualquiera de las cláusulas precedentes en la fabricación de un medicamento útil para la estimulación de una respuesta inhume en un animal o en humano .

17. El uso de la composición de cualquiera de las cláusulas 1-15 para la estimulación de una célula que presenta antigeno in vitro. R E S U E La presente invención se refiere a composiciones de secuencia de polinucléotido 3' -OH, 5' -OH y métodos para activar una respuesta inmune en un individuo, y más preferiblemente para activar células que presentan antigeno en el individuo. En una incorporación, la célula que presenta antigeno es una célula dendritrica. La presente invención también incluye composiciones y métodos para activar células dendritricas in Vitro. Estas células dendrítricas pueden entonces ser administradas a un individuo. Las secuencias de polinucléotido 3' -OH, 5 '-0H preferidas comprenden seis bases en donde por lo menos 50% de las bases son guanina y la base 5' es guanina. Las composiciones pueden comprender una columna de fosfodiéster o de fosforotioato .