CN115594770A - 一种针对人TNFα分子的类风湿关节炎治疗性疫苗的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种针对人肿瘤坏死因子α(TNFα)的类风湿关节炎治疗性疫苗的构建。具体地,本发明通过异型双功能试剂4‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷‑1‑羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo‑SMCC)和N‑琥珀酰亚胺S‑乙酰硫代丙酸盐(SATP)交联抗原hTNFα与载体蛋白重组CRM197,构建hTNF‑CRM197偶联物,偶联物纯化后,制备得到hTNF‑CRM197结合疫苗。该结合疫苗与佐剂联用,可诱导表达人TNFα的转基因小鼠产生高滴度的hTNFα中和抗体,并能显著缓解转基因小鼠的关节炎症状,可用于治疗类风湿关节炎。
Description
技术领域
本发明属于生物和医药领域,具体地涉及一种针对人肿瘤坏死因子α (TNFα)的类风湿关节炎治疗性质疫苗的构建方法和用途。
背景技术
类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种严重的慢性全身性自身免疫性疾病,主要侵犯全身各处关节,呈多发性和对称性慢性增生性滑膜炎,由此引起关节软骨和关节囊的破坏,最后导致关节强直畸形,是继心血管疾病和癌症后的一种常见性慢性疾病。
该病在我国发病率高达0.36%,致残率15%,我国约有500万人患类风湿关节炎患者,还在呈上升趋势,并呈现年龄多层次、病种多样化趋势,因其发病率高、致残率高,对人类的健康危害极大,被喻为“不死的癌症”。RA作为一种自身免疫性疾病,其发病机制尚未完全明确,研究结果显示该病的发病机制与多种因素相关,包括遗传因素、环境因素及体内免疫状态等。研究发现RA的发生发展过程中机体免疫系统中的炎性细胞因子也发挥了重要的作用,如TNFα、IL-1、IL-15、IL-6等。抑制炎性细胞因子的产生或阻断其作用,有望改善RA发生发展过程中的炎性反应,进而延缓RA的疾病进展。
在诸多RA相关的炎性细胞因子中,肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factoralpha, TNFα)是最重要的炎性细胞因子之一。阻断TNFα作用已成为RA治疗领域的重要治疗手段。
目前已有三种TNFα拮抗剂成功上市,分别为Adalimumab(商品名Humira)、Infliximab(商品名Remicade)和Etanercept(商品名Enbrel),多项临床研究均已证实,这三种TNFα拮抗剂均可减轻RA关节的炎症反应,并可改善关节功能以及延缓病情的进展。这三种已上市的TNFα拮抗剂中,Adalimumab已经多年蝉联全球药物销售冠军,2019年销售额接近200亿美元,Infliximab与Etanercept也常年占据销售榜前20的位置。这些数据从另一个侧面反映了以TNFα为靶点的治疗策略具有巨大的市场及对RA具有良好的疗效。
然而,尽管TNFα拮抗剂治疗RA已取得了令人瞩目的成果,但昂贵的治疗费用和长期使用,对患者及其家庭造成了严重的经济负担,相当多的患者最终因不能支付高昂费用而停止治疗。针对目前RA的治疗现状,研发一种新型的、长效的并能拮抗TNFα炎性因子的RA治疗性疫苗可能是解决这一问题的有效方法。该RA治疗性疫苗能诱导机体不断产生相应抗体,中和RA发生、发展中分泌的炎性细胞因子,延缓RA患者的病情进展,进而改善其临床症状。针对TNFα靶点开发一种新型的疫苗研发思路已成为RA治疗领域的研究热点。NEOVACS公司研究开发的TNFα-kinoid是一种以TNFα为靶点的RA治疗性疫苗。TNFα-kinoid是重组人肿瘤坏死因子与血蓝蛋白载体(Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH)结合形成的复合物。但在该公司开展的II期临床试验中,接受疫苗治疗的患者与对照组的临床疗效未出现显著性差异,患者未能诱导产生针对hTNFα的中和抗体。因此,如何提高疫苗的免疫原性,突破人体对TNFα的免疫耐受,是以TNFα为靶点的RA治疗性疫苗继续解决的问题。
因此,本领域迫切需要开发出一种具有高免疫原性,并且能够突破人体对TNFα的免疫耐受的RA治疗性疫苗。
发明内容
本发明的目的就是提供一种具有高免疫原性,并且能够突破人体对TNFα的免疫耐受的类风湿关节炎(RA)治疗性疫苗,所述的针对人TNFα分子的类风湿关节炎治疗性疫苗具体为人TNFα抗原与载体蛋白重组CRM197通过化学偶联剂交联制得的hTNF-CRM197结合疫苗。
本发明的另一目的就是提供一种生产针对人肿瘤坏死因子α (TNFα)的治疗性疫苗的制备方法。
在本发明的第一方面,提供了一种针对人肿瘤坏死因子α (TNFα)-载体蛋白偶联物,所述偶联物具有如式I所示的结构:
(TNFα)n-L-C (式I)
其中,
TNFα是肿瘤坏死因子α;
C是载体蛋白;
L是连接TNFα和载体蛋白的接头,所述接头是4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)与N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代丙酸盐(SATP)形成的共价键;
n为偶联于所述载体蛋白的TNFα的平均偶联数量,且n为3-10之间的整数或非整数;和
“-”为键。
在另一优选例中,n为5-7之间的整数或非整数。
在另一优选例中,n为6±0.5的整数或非整数。
在另一优选例中,n为6±0.2的整数或非整数。
在另一优选例中,所述载体蛋白是白喉毒素。
在另一优选例中,所述载体蛋白是白喉毒素突变体CRM197。
在另一优选例中,所述载体蛋白(或CRM197)由大肠杆菌表达系统重组表达。
在另一优选例中,所述TNFα是人TNFα (hTNFα)。
在另一优选例中,所述TNFα是人TNFα (hTNFα)的全长序列。
在另一优选例中,所述的TNFα抗原由大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、哺乳动物表达系统,或昆虫杆状病毒表达系统重组表达。
在本发明的第二方面,提供了一种制备如本发明第一方面所述的偶联物的方法,包括步骤:
(a) 用N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代丙酸盐(SATP)化学修饰TNFα抗原,再经脱酰基步骤添加羟胺酸脱去SATP上的酰基形成游离巯基;反应完成后,分离获得TNFα抗原中间体;
(b) 用双功能偶联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)修饰载体蛋白,使得所述载体蛋白带有马来酰亚胺基团;反应完成后,添加氨基酸终止反应,并分离获得载体蛋白中间体;和
(c) 将步骤(a)和步骤(b)中分别获得的TNFα抗原中间体与载体蛋白中间体混合,进行偶联反应,从而获得所述的偶联物;反应完成后,添加氨基酸终止反应;其中,所述TNFα抗原中间体与载体蛋白中间体混合的比例为摩尔比3:1至9:1,较佳地为5:1至7:1,更佳地为6:1。
在另一优选例中,在步骤(a)之前,还包括步骤:表达和纯化分离所述TNFα抗原。
在另一优选例中,所述TNFα抗原的表达是由大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、哺乳动物表达系统,或昆虫杆状病毒表达系统重组表达的。
在另一优选例中,在步骤(a)中,所述的TNFα抗原与SATP反应时的添加比例为摩尔比1:20至1:200(较佳地为1:40至1:60,更佳地为1:50),反应体系为pH 7.0-8.0(较佳地pH7.0-7.5,更佳地pH 7.2)的磷酸盐缓冲液,反应温度为20-28℃(较佳地为25-28℃),反应时间为20-120 min(较佳地为30-90 min,更佳地为60 min)。
在另一优选例中,在步骤(a)中,在TNFα抗原与SATP反应20-120 min(较佳地为30-90 min,更佳地为60 min)后,向反应体系中添加脱酰基试剂,脱酰基反应时间为1-6小时(较佳地为1-4小时,更佳地为2小时)。
在另一优选例中,所述脱酰基试剂的体积为反应体系的体积的1/9至1/11(较佳地为1/10)。
在另一优选例中,所述脱酰基试剂中包括100 mM PBS、100 mM羟胺酸、1 mM EDTA,pH 7.2。
在另一优选例中,在步骤(a)中,hTNFα抗原与SATP反应时的添加比例为1:20至1:100(摩尔比),反应体系为pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲液,反应温度为20-28℃,反应时间为20-120 min,然后向体系中添加终浓度10 mM的羟胺酸,反应温度为20-28℃,反应时间为1-4小时。
在另一优选例中,在步骤(a)中,所述TNFα抗原与SATP反应时的添加比例为1:50(摩尔比),反应体系为pH 7.2的磷酸盐缓冲液,反应温度为25±3℃,反应时间为1小时,然后向体系中添加终浓度10 mM的羟胺酸,反应温度为25±3℃,反应时间为2小时。
在另一优选例中,在步骤(a)中,反应完成后所述的分离包括色谱分离或超滤分离。
在另一优选例中,在步骤(a)中,反应完成后所述的分离为:使用体积排阻色谱柱(优选地为G25脱盐柱)将游离未反应的SATP去除。
在另一优选例中,在步骤(a)中,还包括步骤:收集获得的TNFα抗原中间体并进行定量。
在另一优选例中,所述TNFα是人TNFα (hTNFα)。
在另一优选例中,步骤(a)中所获得的TNFα抗原中间体是TNFα-SATP。
在另一优选例中,在步骤(b)之前,还包括步骤:表达和纯化分离所述载体蛋白。
在另一优选例中,所述载体蛋白的表达是由大肠杆菌表达系统重组表达的。
在另一优选例中,在步骤(b)中,所述的载体蛋白与sulfo-SMCC反应时的添加比例为摩尔比1:20至1:200(较佳地为1:20至1:40,更佳地为1:35),反应体系为pH 7.0-8.0(较佳地pH 7.0-7.5,更佳地pH 7.2)的磷酸盐缓冲液,反应温度为20-28℃(较佳地为25-28℃),反应时间为1-6小时(较佳地为1-4小时,更佳地为2小时)。
在另一优选例中,在步骤(b)中,所述载体蛋白与sulfo-SMCC结合的优选条件为,载体蛋白重组CRM197与sulfo-SMCC反应时的添加比例为1:35(摩尔比),反应体系为pH 7.2的磷酸盐缓冲液,反应温度为25±3℃,反应时间为2小时。
在另一优选例中,在步骤(b)中,反应完成后所添加的氨基酸可以是除半胱氨酸、胱氨酸和甲硫氨酸外的任意天然氨基酸。
在另一优选例中,在步骤(b)中,反应完成后所添加的氨基酸是甘氨酸,添加浓度为1-1000 mM(优选地为100 mM)。
在另一优选例中,在步骤(b)中,反应完成后所述的分离包括色谱分离或超滤分离。
在另一优选例中,在步骤(b)中,反应完成后所述的分离为:使用分子排阻色谱柱(优选地为G25脱盐柱)将游离未反应的sulfo-SMCC去除。
在另一优选例中,在步骤(b)中,还包括步骤:收集获得的载体蛋白中间体并进行定量。
在另一优选例中,所述载体蛋白是白喉毒素。
在另一优选例中,所述载体蛋白是白喉毒素突变体CRM197。
在另一优选例中,步骤(b)中所获得的载体蛋白中间体是CRM197-SMCC。
在另一优选例中,在步骤(c)中,所述偶联反应的条件为:0-30℃(较佳地为2-8℃,更佳地为4℃)反应12-16小时。
在另一优选例中,在步骤(c)中,反应完成后所添加的氨基酸选自下组:半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸,或其组合。
在另一优选例中,在步骤(c)中,反应完成后所添加的氨基酸是半胱氨酸,添加浓度为1~1000 mM(优选地为10 mM)。
在另一优选例中,所述方法还包括步骤:(d) 将所述偶联物与游离的TNFα抗原中间体与载体蛋白中间体分离,从而获得纯化的所述偶联物。
在另一优选例中,在步骤(d)中,所述的分离包括色谱分离或超滤分离。
本发明的第三方面,提供了一种药物组合物,所述药物组合物包含本发明第一方面所述的偶联物以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述药学上可接受的载体含有液体,较佳地为水、盐水或缓冲液。
在另一优选例中,所述载体还含有辅助性的物质,较佳地为填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
在另一优选例中,所述载体中还含有细胞转染试剂。
在另一优选例中,所述药物组合物为疫苗组合物。
在另一优选例中,所述疫苗组合物包含本发明第一方面所述的偶联物以及药学上可接受的载体,所述药学上可接受的载体优选为疫苗上可接受的载体。
在另一优选例中,所述疫苗组合物可以为二联疫苗或多联疫苗。
在另一优选例中,所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中,所述佐剂包括:颗粒型和非颗粒型佐剂。
在另一优选例中,所述颗粒型佐剂选自下组:铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、纳米颗粒、微小颗粒、脂质体、免疫刺激复合物,或其组合;
在另一优选例中,所述非颗粒型佐剂选自下组:胞壁酰二肽及其衍生物、皂苷、脂质A、细胞因子、衍生多糖、细菌毒素,微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、蜂胶,或其组合。
在另一优选例中,所述佐剂选自下组:Montanide ISA 51 VG、Montanide ISA 720VG、磷酸铝佐剂、MF59、AS02、AS04,或其组合。
在另一优选例中,所述疫苗组合物每剂量中的偶联物的量为0.1-5 mg。
在另一优选例中,所述的疫苗组合物为注射剂型。
在本发明的第四方面,提供了如本发明第一方面所述的偶联物或本发明第三方面所述的药物组合物的用途,其特征在于,用于制备预防和/或治疗类风湿关节炎的药物。
在本发明的第五方面,提供了一种预防和/或治疗类风湿关节炎的方法,包括步骤:给有所需要的对象施用如本发明第一方面所述的偶联物或本发明第三方面所述的药物组合物。
在本发明的第六方面,提供了一种针对人TNFα分子的类风湿关节炎治疗性疫苗免疫接种的方法,包括步骤:
(i) 将本发明第一方面所述的偶联物与佐剂混合后乳化,得到乳化后的针对人TNFα分子的类风湿关节炎治疗性疫苗;
(ii) 将所述乳化后的针对人TNFα分子的类风湿关节炎治疗性疫苗接种于待接种对象。
在另一优选例中,所述佐剂为液体佐剂。
在另一优选例中,所述液体佐剂为Montanide ISA 51 VG。
在另一优选例中,所述“偶联物与佐剂混合后乳化”具体是将偶联物与MontanideISA 51 VG按1:1的体积比,利用两个注射器通过接头连接混合,先慢速来回推动10-30次,再快速来回推动30-60次。
在另一优选例中,所述接种的方式为:按0.05-2 mg/kg的剂量,每周免疫1次,共免疫4次。
在另一优选例中,所述液体佐剂为磷酸铝佐剂,偶联物与磷酸铝佐剂按1:(0.2-5)的体积比混合乳化。
在另一优选例中,所述液体佐剂为MF59,偶联物与MF59佐剂按1:(0.2-5)的体积比混合乳化。
在另一优选例中,所述液体佐剂为AS04,偶联物与AS04佐剂按1:(0.2-5)的体积比混合乳化。
在另一优选例中,所述待接种对象为人或非人类哺乳动物。
在另一优选例中,所述非人类哺乳动物选自下组:小鼠、大鼠、家兔、恒河猴。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了hTNFα-CRM197疫苗免疫TTG小鼠的抗体滴度。
图2显示了hTNFα-CRM197疫苗免疫小鼠后血清可以中和TNFα活性,阻止其杀伤L929,且效果显著优于其他组。
图3显示了hTNFα-CRM197疫苗免疫TTG转基因小鼠后,体重(图3B)及关节炎病症评分(图3A)结果。
图4显示了不同结合摩尔比的hTNFα-CRM197抗原分子量分布。
图5显示了不同结合摩尔比的hTNFα-CRM197疫苗免疫TTG小鼠后的抗体滴度。
图6显示了终止/不终止结合反应的hTNFα-CRM197抗原分子量分布检测。
图7显示了不同交联工艺制备的hTNFα-CRM197疫苗免疫TTG小鼠的抗体滴度。
图8显示了不同交联工艺制备的hTNFα-CRM197疫苗免疫TTG小鼠后血清中和TNFα的能力。
具体实施方式
本发明经过广泛而深入的研究,发现采用化学交联法,将重组人肿瘤坏死因子rhTNFα与载体蛋白CRM197进行偶联,可以有效激发小鼠产生针对人TNFα中和抗体,从而提供了一种新型类风湿关节炎治疗性疫苗。相比目前已报道的以rhTNFα偶联载体蛋白作为抗原的治疗性疫苗,通常使用戊二醛作为交联剂,本方法首次使用异型双功能试剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)和N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代丙酸盐(SATP)作为交联剂,并对交联过程进行优化,提高了工艺稳定性,制备的hTNF-CRM197结合疫苗具有高免疫原性和显著的关节炎治疗效果。在此基础上完成了本发明。
术语
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义,本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前,应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件,因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案,并且不意图是限制性的,本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用,在提到具体列举的数值中使用时,术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用,术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂,包含本发明的针对风湿性关节炎的药物组合物(优选地针对风湿性关节炎的疫苗),所述患者具有一种或多种疾病症状,而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常,以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用,术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如,“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有,可以是1个、2个或3个。
如本文所用,术语“偶联”、“交联”可互换使用,均指使用各种结合工艺(例如通过异型双功能交联剂sulfo-SMCC和SATP,或通过戊二醛交联剂等)来将hTNFα与载体蛋白重组CRM197两种组分桥联,以形成偶联物的过程及方法。
肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor alpha,TNFα)
TNFα,又称为cachexin、cachectin,主要由活化的单核巨噬细胞分泌产生。
在诸多类风湿关节炎相关的炎性细胞因子中,TNFα是最重要的炎性细胞因子之一。TNFα的主要作用是参与免疫细胞的免疫调节,能够引发发热、细胞凋亡、恶病质、炎症反应,并能抑制肿瘤发生、病毒复制。人体内的TNFα失调被认为与多种疾病的发生密切相关,包括类风湿性关节、强直性脊柱炎、银屑病、炎性肠病等。
在类风湿关节炎发病过程中,TNFα能够刺激滑膜增生、激活原位软骨细胞,进而产生胶原酶和蛋白分解酶,最终破坏局部软骨组织。阻断TNFα作用已成为RA治疗领域的重要治疗手段。
由于TNFα单独作为抗原免疫原性很弱,不能有效激活机体抗体免疫反应,诱导免疫记忆。通过将TNFα与载体蛋白交联,能增强机体对交联抗原的免疫强度、改变对机体免疫系统对抗原的免疫反应类型,诱导免疫记忆,因此选择高效的载体蛋白是目前提高疫苗免疫原性的主要手段。
在本发明中,所述的TNFα优选为人TNFα (hTNFα);更优选地为人TNFα (hTNFα)的全长序列(158aa),其序列信息已公开在公共数据库NCBI上,ACCESSION: 6X81_A;VERSION:6X81_A;pdb: molecule 6X81, chain A, release Jan 27, 2021(2021年1月27日),网页信息参见NCBI:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/6X81_A。
载体蛋白
白喉毒素(diphtheria toxin, DT)是感染了beta噬菌体的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)产生的一种外毒素,存在于临床使用的百白破疫苗成份中。其安全性得到多年临床使用的验证,罕见严重不良反应,目前尚无由白喉成份引起过敏反应的报道。
白喉毒素分子由535个氨基酸残基构成,空间上相对独立的催化结构域(1-193AAs)、跨膜结构域(205-378 AAs)和受体结合域(386-535 AAs)组成;跨膜结构域和受体结合域本身无毒性,其功能是通过细胞表面受体结合,将催化结构域转导进入细胞内。
CRM197是从白喉杆菌毒性基因突变株的菌株中获得的一种白喉毒素突变体,具有536个氨基酸的长度,其丧失了天然白喉毒素的细胞毒作用,但其抗原性与免疫原性仍基本保持一致。CRM197的具体序列参见中国专利申请公开号CN10999548B,其在CN10999548B的序列表中是序号为1的序列,并且在CN10999548B的说明书中第[0010]-[0069]段和第[0229]-[0287]段记载了上述CRM197的具体序列。
CRM197作为一种安全及高效的载体蛋白,在多种传染性疾病的预防性疫苗中得到了较广泛的应用,包括:B型流感嗜血杆菌疫苗、A、C、W135、Y型四价脑膜炎球菌多糖疫苗、C型奈瑟菌脑膜炎疫苗、7价肺炎球菌结合疫苗、13价肺炎球菌结合疫苗等。
本发明TNFα-CRM197之间的连接方式
本发明采用化学交联法,将重组人肿瘤坏死因子rhTNFα与载体蛋白CRM197进行偶联,从而提供了一种新型类风湿关节炎治疗性疫苗。
相比常用的双功能试剂如戊二醛、碳二亚胺等,本方法使用异型双功能试剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)和N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代丙酸盐(SATP),使用异型双功能试剂可以避免抗原或载体蛋白的自身交联或多聚物的产生,致使偶联效率降低。sulfo-SMCC通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯与载体蛋白重组CRM197上的伯氨基团(主要由赖氨酸残基提供)偶联,SMCC另一头的马来酰亚胺基团则可以与游离巯基发生反应进行共价交联。SATP同样通过NHS与TNFα抗原上伯氨基团(主要由赖氨酸残基提供)偶联,SATP另一头的硫代乙酰基经活化后产生游离巯基,最终与sulfo-SMCC-CRM197进行交联,制备得到的结合疫苗。
使用上述方法连接所得的TNFα-CRM197抗原,在体内免疫后可激发机体产生高滴度抗TNFα抗体,从而中和体内炎性因子TNFα,达到缓解或治愈关节炎效果,并可用于其他通过阻断TNFα获益的疾病的治疗,如银屑病、炎症性肠炎、强直性脊柱炎等。
药物组合物和施用方法
本发明还提供了一种药物组合物,它含有:(1) 本发明的人TNFα分子与重组CRM197化学偶联产物hTNFα-CRM197,以及(2) 药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂等。
本发明中,术语“含有”、“包括”、“包含”可互换使用,表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的药物组合物中。因此,术语“主要由……组成”和“由……组成”包含在术语“含有”中。
本发明的药物组合物包括疫苗组合物。
本发明的药物组合物可制备成各种常规剂型,其中包括(但并不限于):注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。
本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明hTNFα-CRM197。
本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量,或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度,以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此,预先指定准确的有效量是没用的。然而,对于某给定的状况而言,可以用常规实验来确定该有效量。
为了本发明的目的,有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至10毫克/千克,较佳地约0.003毫克/千克至0.1毫克/千克体重。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的hTNFα-CRM197)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体:它们本身不诱导产生对接受该药物组合物的个体有害的抗体,且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子,如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N. J. 1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
药物组合物中药学上可接受的载体可包括液体,如水、盐水、甘油和乙醇。另外,这些载体中还可能存在辅助性的物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常,可将药物组合物制成可注射剂,例如液体溶液或悬液;还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
典型地,本发明的药物组合物为疫苗组合物。
本发明的疫苗组合物包含免疫性抗原(包括本发明hTNFα-CRM197),并且通常与“药学上可接受的载体”(优选地“疫苗上可接受的载体”)组合,这些载体包括本身不诱导产生对接受该疫苗组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子,如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外,这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。
增强免疫组合物(免疫性抗原/免疫原性组合物)效果的优选佐剂包括但不限于:(1) 铝盐(alum),如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等;(2) 水包油型乳剂配方,例如:(a)Montanide ISA 51 VG,(b) Montanide ISA 720 VG;(C) MF59;(3) 皂素佐剂;(4) Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA);(5) 细胞因子,如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等;(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体;以及(7) 作为免疫刺激剂来增强疫苗组合物/免疫组合物效果的其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如,可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂),通常含有稀释剂,如水、盐水、甘油、乙醇等。另外,辅助性物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。更具体地,包括免疫原性组合物在内的疫苗,包含免疫学有效量的免疫原性组合物,以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内,可通过常规实验来确定。
通常,可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂,例如液体溶液或悬液;还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中,以增强佐剂效果。
给药途径和剂量
一旦配制成本发明的药物组合物,可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物,尤其是人。
当用作疫苗时,可用已知的方法将本发明的疫苗组合物直接施用于个体,通常采用与常规疫苗相同的施用途径。给予本发明药物组合物(优选地疫苗组合物)的途径包括(但并不限于):皮下、皮内、肌内或其它肠胃外给药途径。如果需要,可以组合给药途径,或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予,且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。应以“有效量”给予疫苗组合物,即疫苗组合物的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答,能有效改善疾病症状。
代表性的疾病包括(但并不限于):类风湿关节炎、银屑病、炎症性肠炎、强直性脊柱炎等。
在各疫苗剂份中所选用的药物组合物的量,是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常,各剂的疫苗足以含有约0.1 mg-10 mg,较佳地为比0.4 mg-1.6mg。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后,可能需要选用增强剂量免疫接种。施用药物组合物(优选地疫苗组合物)就可提高对本发明的免疫应答。
此外,本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予,或者与其他治疗剂一起给予。
本发明的主要优点包括:
1) 本发明中采用异型双功能试剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)和N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代丙酸盐(SATP)分别交联载体蛋白CRM197与抗原hTNFα,并在两个反应步骤中采用氨基酸终止反应,在偶联物比例、分子量分布的批间重复性、稳定性方面优于其他常用的双功能交联剂如戊二醛、EDC。
2) 本发明的方法中,sulfo-SMCC较优地与CRM197进行结合,而与SATP的交联为rhTNF提供了更多参与结合的游离巯基位点。
3) 本发明中的偶联物与佐剂配伍使用可进一步提高免疫原性,表现出良好的免疫原性,可诱导转基因小鼠机内产生长期有效的TNFα中和抗体,并显著改善小鼠关节炎疾病模型的关节炎症状。
4) 本发明的药物组合物(优选地疫苗组合物)能在接受免疫的受试者体内诱导产生高滴度的中和性抗体,免疫效果好,中和保护作用佳。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人, 分子克隆:实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1:hTNFα表达菌株构建
根据hTNFα的cDNA序列(Genbank编号为AB451492.1;ACCESSION: AB451492;VERSION: AB451492.1),委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因序列并连接至pBV220载体中,hTNFα基因前后分别为EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶酶切位点,得到pBV220-TNFα质粒。
取pBV220-TNFα质粒1 μl (1 ng),热激法转入E.coli DH5α感受态细胞:取出-80℃冰箱中的E.coli DH5α感受态细胞,放于冰上10 min,感受态细胞融化;加入待转化的pBV220-TNFα质粒1 μl (1 ng),放于冰上30 min;将感受态细胞放入42℃水浴锅中,90 s;迅速移入冰浴中,2 min;用1 ml 37℃ LB培养基重悬感受态,放于37℃摇床,摇菌1 h;3000r/min,离心5 min,0.1 ml LB培养基重悬菌体后涂板,使用50 μg/ml的Amp LB平板。
涂好的平板置于37℃温箱中16 h,挑取阳性克隆子进行PCR测序、表达鉴定。挑选hTNFα插入序列匹配正确且正确表达hTNFα的单克隆,保种构建hTNFα表达菌株。
实施例2:hTNFα的蛋白表达和纯化
2.1 hTNFα表达菌株发酵
取1.0 ml hTNFα表达菌株种子接种于500 ml LB培养基中,37℃培养6小时后加入发酵罐。采用20 L发酵体积,M9培养基,发酵参数为:培养温度37℃、搅拌转速500 rpm、溶氧控制30%、pH控制7.0。当发酵进行12小时后,提高培养温度至42℃,hTNFα开始诱导表达,继续诱导6小时,停止发酵,离心收集发酵菌体。
2.2 菌体破碎
取菌体按1g:10ml的比例,重悬于破菌缓冲液(20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA,pH 8.0)中,采用高压匀浆破碎法破碎大肠杆菌,压力为800 PSI,破菌三个循环后,离心收集上清。
2.3 疏水层析纯化
上清液含有可溶表达的hTNFα蛋白质,向上清液中按150 g/L添加硫酸铵,然后将上清液上样至Phenyl HP Sepharose疏水层析柱,Phenyl HP Sepharose疏水层析柱预先用平衡液(20 mM Tris-HCl, 150 g/L (NH4)2SO4, pH 8.0)平衡,上样完成后使用洗脱液(20mM Tris-HCl,pH 8.0)进行一步洗脱,根据紫外检测器信号收集洗脱峰,富集hTNFα蛋白质。
2.4 阴离子交换层析纯化
经疏水层析纯化的hTNFα蛋白质,使用阴离子交换平衡液(20 mM Tris-HCl,pH8.0)稀释至电导低于3 ms/cm,然后上样DEAE Sepharose阴离子层析柱,DEAE Sepharose阴离子层析柱预先使用阴离子交换平衡液平衡,上样完成后使用阴离子洗脱液(20 mMTris-HCl, 1M NaCl, pH 8.0)进行线性梯度洗脱,根据紫外检测器信号收集洗脱峰,对收集液进行SDS-PAGE分析,确定目的蛋白hTNFα,收集该洗脱峰即为纯化后的hTNFα蛋白质。
2.5 hTNFα蛋白纯度和浓度鉴定
取纯化后的hTNFα蛋白质30 µl加入10 µL 4Í还原上样缓冲液,充分混匀后沸水浴5 min。将上述处理后样本进行SDS-PAGE电泳检测,上样10 µl,分离胶浓度17.5%,200V电泳50 min,蛋白胶的制备及变性还原缓冲液配制参考Bio-Rad标准配方。考马斯亮蓝染色后用凝胶成像系统内置软件分析蛋白纯度。蛋白浓度鉴定使用BCA定量法。
实施例3:hTNFα生物活性的鉴定
在本实施例中,用L929细胞检测了上述制备的hTNFα的生物活性。
小鼠成纤维细胞L929购自中国科学院细胞库(目录号:GNM28),采用添加10%胎牛血清的DMEM培养基于5% CO2、37℃恒温培养箱中培养。取培养至对数生长期的L929细胞,用完全培养液(DMEM培养液添加10% FBS(V/V))配成1.5×105 IU/ml的细胞悬液,接种于96孔细胞培养板中,每孔100 µl。37℃、5% CO2条件下培养18-24 h(镜检细胞布满孔面积80%以上)。
用完全培养基2(DMEM培养液添加3%FBS(V/V)、0.7 µg/ml放线菌素D)将标准品溶液稀释至400 IU/ml。根据情况用完全培养基2将待检样品溶液稀释至50 ng/ml,按以上预稀释程序制备的溶液称为样本溶液。于96孔板中,在第一列每孔加入200 µl的样品溶液,第2-12列各孔加入150 µl的完全培养液,自第1列取50 µl至第2列,4倍稀释,每孔留150 µl余液。
取铺有L929细胞的96孔板,弃去各孔上清,先加入50µl的完全培养基2,再根据板布局设置,加入50 µl不同浓度梯度的样品。每孔总体积100 µl。37℃、5% CO2条件下培养18-24 h,然后将96孔板中的培养上清弃去,每孔加入100 μl完全培养基2,再向每孔加入10μl的完全培养基3(完全培养基2中加入10%的CCK-8),将96孔板在培养箱内孵育2 h。
用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。结果计算:实验数据采用四参数回归计算法进行处理,并按下式计算结果。
式中Pr为标准品效价;
Ds为供试品预稀释倍数;
Dr为标准品预稀释倍数;
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数;
Er为标准品半效量的稀释倍数。
经计算所得的结果表明:制备hTNFα比活性达到了1Í106 IU/mg。
实施例4:hTNFα-CRM197抗原制备
4.1 重组CRM197的制备
在本实施例中,根据CN100999548A中所提供的方法,进行了重组CRM197的制备。其中,如本领域技术人员所知,重组CRM197是一种载体蛋白,为白喉毒素的一种丧失了毒性的突变体。
4.2 hTNFα-CRM197抗原制备
hTNFα和重组CRM197使用10 kDa超滤离心管进行浓度调节,4000Íg离心浓缩蛋白质,然后加入结合缓冲液(100 mM PBS,pH 7.2)稀释,重复操作数次使得hTNFα和重组CRM197的pH调节至7.2,且蛋白质浓度为2 mg/ml以上。
重组CRM197按摩尔比1:35,与sulfo-SMCC进行混合反应,sulfo-SMCC预先溶解于不超过1 ml的纯化水中。25-28℃反应2小时后,添加终浓度为100 mM的甘氨酸进行反应终止。使用G25脱盐柱去除游离未反应的sulfo-SMCC,收集蛋白洗脱峰并进行蛋白质定量。
hTNFα按摩尔比1:50,与SATP进行混合反应,SATP预先溶解于不超过150 μl的DMSO中。25-28℃反应60 min后,加入1/10体积的脱酰基试剂(100 mM PBS, 100 mM盐酸羟胺, 1mM EDTA, pH 7.2),继续反应2小时脱去SATP上的酰基使其活化,然后使用G25脱盐柱去除游离未反应的SATP,收集蛋白洗脱峰并进行蛋白质定量。
将定量后的hTNFα-SATP与CRM197-SMCC按摩尔比6:1进行混合,4℃反应过夜,次日添加终浓度为10 mM的半胱氨酸进行反应终止,即得hTNFα-CRM197抗原。
4.3 hTNFα-CRM197抗原纯化
将反应过夜的hTNFα-CRM197抗原采用超滤离心法进行纯化,使用截流量为100kDa的超滤离心管,浓缩hTNFα-CRM197抗原,并用制剂缓冲液(20 mM PBS, pH 8.0)稀释,重复该步骤几次直至hTNFα-CRM197抗原pH调节至8.0。
实施例5:hTNFα-CRM197疫苗抗体滴度检测
5.1 动物免疫
选取TTG小鼠为动物模型,TTG转基因小鼠的基因组中随机整合有人肿瘤坏死因子hTNFα的表达构件,体内表达hTNFα,因此具有针对hTNFα的免疫耐受,且由于过表达hTNFα,TTG转基因小鼠自发关节炎疾病:9周即表现出轻微的关节炎症状,小鼠前爪、后爪小关节灵活性丧失,四肢关节轻微肿胀;至14周表现出中度关节炎症状,小鼠前爪、后爪扭曲畸形,四肢关节中度肿胀;至20周表现出重度关节炎症状,小鼠前爪、后爪、四肢关节均有畸形;20周TTG转基因小鼠四肢关节病理切片,可见重度关节损伤。
雌性6-8周龄的SPF级TTG小鼠,并按照AAALAC指南要求进行饲养。免疫前,用生理盐水将hTNFα-CRM197稀释至200 μg/ml,再与Montanide ISA 51 VG佐剂按体积比1:1进行乳化,乳化后的抗原终浓度为100 μg/ml。按相同的蛋白质浓度,配制hTNFα对照组与CRM197对照组。
20只小鼠,随机分为4组,每组5只,分别接种生理盐水、hTNFα对照组、CRM197对照组与疫苗组。接种方法和剂量为:小鼠背部皮下注射100 μl/次,每周免疫一次,共4次,在第四次免疫后不同时间段,从各小鼠眼眶取血,室温血液自凝30分钟,1000 g/min,离心15分钟,弃沉淀并取上部血清,立即检测或分装冻存于-80℃。
5.2 免疫原性检测(ELISA方法)
检测步骤如下:
包被:用Na2CO3-NaHCO3缓冲液将hTNFα稀释为1 µg/ml,每孔加100 µl,4℃过夜包被。
洗涤:每孔200 µl PBST,清洗3遍,拍干。
封闭:每孔200 µl封闭液,37℃,孵育1 h。
反应:1:4000稀释血清,稀释液为PBS,每孔100 μl,平行做3个复孔,37℃,孵育1h。
洗涤:每孔200 µl PBST,清洗3遍,拍干。
加入酶标抗体:用封闭液将HRP酶标抗体稀释为1:5000,每孔加HRP酶标抗体100 µl,37℃,孵育1 h。
洗涤:PBST,每孔200 µl,清洗5遍,拍干。
显色:每孔加入100 µl TMB,室温避光孵育15 min。
终止:每孔加入100 µl 1 mol/L盐酸。
读数:450 nm读数。
结果分析:于450 nm处测定光吸收值,供试品血清样品OD值/生理盐水对照组样品OD值≥2.1时,该孔血清稀释度即为抗体滴度。
结果如图1所示。从结果可知,hTNFα-CRM197疫苗免疫TTG小鼠后,能诱导TTG小鼠产生hTNFα特异性抗体,且可持续较长时间,而单独的hTNFα与重组CRM197添加佐剂后无法诱导TTG小鼠产生hTNFα特异性抗体,说明该疫苗能显著增强hTNFα抗原的免疫原性。
实施例6:hTNFα-CRM197疫苗诱导的抗血清抑制TNFα的L929杀伤实验
将hTNFα-CRM197疫苗免疫C57BL/6J小鼠后获得的抗血清(四免一周)按不同比例与hTNFα混合后,孵育L929细胞,计算L929细胞死亡率以证实抗血清对hTNFα的中和作用。
结果如图2所示。结果表明,hTNFα-CRM197疫苗免疫动物后会在动物体内产生针对TNFα的中和抗体,使用免疫疫苗的动物的血清可以中和TNFα,从而阻止其杀伤L929细胞;而对照组及重组CRM197组血清无法抑制TNFα对L929细胞的杀伤作用;由于免疫的动物为野生型小鼠,不具备对hTNFα的免疫耐受,因此hTNFα组血清也具有一定的TNFα中和能力,但显著低于疫苗组。
并且,hTNFα-CRM197疫苗组的动物血清在高稀释倍数下(约5000倍)依然能发挥较好的中和作用效果,表明hTNFα-CRM197疫苗组在免疫动物体内诱导产生的中和抗体效价高,中和效果和免疫效果佳,能很好地抑制TNFα对L929细胞的杀伤作用。
实施例7:hTNFα-CRM197疫苗治疗类风湿关节炎的体内药效学研究
给8周龄TTG转基因小鼠免疫hTNFα-CRM197疫苗,单周免疫,免疫四次。
将小鼠分为3组:1) 注射生理盐水组(对照组);2) 免疫hTNFα-CRM197+MontanideISA 51 VG乳化组(疫苗组);3) 免疫rhTNFα+Montanide ISA 51 VG乳化组(TNF组)。
自TTG转基因小鼠8周龄开始给药,给药结束后1周开始测量小鼠体重,记录小鼠四肢关节炎症状评分,观察hTNFα-CRM197治疗性疫苗对TTG转基因小鼠自发关节炎症状的缓解、治愈情况。
结果如图3所示。图3B的结果表明,TTG转基因小鼠免疫hTNFα-CRM197疫苗后,疫苗组小鼠体重均显著高于对照组小鼠及TNF组小鼠(P<0.01);图3A的结果表明,疫苗组小鼠关节炎病症评分均显著低于对照组小鼠及TNF组小鼠(P<0.01),而对照组小鼠和TNF组小鼠病症评分无差异(P>0.05)。该结果证明hTNFα-CRM197治疗性疫苗具有明显的针对hTNFα的类风湿关节炎治疗效果。
综上所述,本发明所述的hTNFα-CRM197疫苗,具有较强的免疫原性,可打破转基因小鼠对hTNFα的免疫耐受,诱导产生hTNFα中和抗体,并显著改善转基因小鼠的关节炎症状。
实施例8:hTNFα-CRM197的制备中hTNFα和CRM197摩尔比的优化
在本实施例中,重复上述实施例1-3(包括hTNFα-CRM197抗原制备、hTNFα-CRM197抗原纯化)的步骤;其中,不同点在于:hTNFα-CRM197抗原制备过程(对应于实施例4)中,将定量后的hTNFα-SATP与CRM197-SMCC按摩尔比hTNFα-SATP:CRM197-SMCC=3:1或9:1进行混合。
在本实施例中,对上述不同摩尔比的hTNFα-CRM197抗原进行了分子量鉴定和免疫原性的检测和分析。结果表明,不同结合摩尔比的hTNFα-CRM197抗原,其分子量分布与免疫原性不同。
图4的结果显示:结合摩尔比为3:1的hTNFα-CRM197抗原分子量分布显示其含有较多的大分子组分,而较大的分子量不利于hTNFα-CRM197抗原的稳定性。
图5的结果显示:不同结合摩尔比的hTNFα-CRM197抗原分子量在免疫原性上也存在区别。结合摩尔比为3:1的hTNFα-CRM197抗原免疫小鼠后,产生的抗体滴度较低。结合摩尔比为6:1及9:1的hTNFα-CRM197抗原免疫原性接近。但考虑到采用9:1结合,有较多的游离hTNFα未发生结合,导致目的产物收率降低,因此最优的结合摩尔比为6:1。
实施例9:hTNFα-CRM197抗原制备条件对比
本实施例中,对载体蛋白重组CRM197与sulfo-SMCC结合步骤中,以及CRM197-SMCC与hTNFα-SATP结合步骤中是否需要进行添加氨基酸终止反应的步骤,进行了测试和优化。
在本实施例中,重复上述实施例1-3(包括hTNFα-CRM197抗原制备、hTNFα-CRM197抗原纯化)的步骤;其中,不同点在于:(1) 载体蛋白重组CRM197与sulfo-SMCC结合过程中,不添加氨基酸进行反应终止;(2) 定量后的hTNFα-SATP与CRM197-SMCC按摩尔比hTNFα-SATP:CRM197-SMCC=6:1进行混合,4℃反应过夜后不添加氨基酸进行终止反应。
结果表明,在载体蛋白重组CRM197与sulfo-SMCC结合过程及CRM197-SMCC与hTNFα-SATP结合后添加氨基酸进行终止,可以有效控制hTNFα-CRM197抗原的分子量分布,显著提高批次之间的稳定性。
图6的结果显示:采用氨基酸终止后,重复6个批次hTNFα-CRM197抗原制备,其分子量分布重复性良好;而未采用氨基酸终止,交联过程中活性基团的数量不可完全控制,导致重复3个批次hTNFα-CRM197抗原分子量分布差异较大。
对比例1:本发明的hTNFα-CRM197疫苗与hTNFα-CRM197戊二醛偶联疫苗对比
在本对比例中,参考已公开的其他针对hTNFα开发的治疗性疫苗,1、TNFα突变蛋白和载体蛋白CRM197化学偶联的产物及其制备方法(CN 108126193 A);2、用于制备包含TNFα和载体蛋白质的抗原杂络物的稳定的免疫原产品的方法(WO2007/022813),制备hTNFα-CRM197戊二醛偶联疫苗,并与本发明中设计的hTNFα-CRM197疫苗的比较在TTG转基因小鼠中的免疫原性,免疫原性的强弱代表了该类治疗性疫苗的治疗效果。
参考已公开内容,hTNFα-CRM197戊二醛偶联疫苗的制备过程为:hTNFα由抗原hTNFα与载体蛋白重组CRM197按摩尔比6:1混匀加入终浓度0.25%的戊二醛,室温反应时间45分钟,反应结束后透析(PBS)除去过量的戊二醛,透析过夜后向透析溶液中加入2%终浓度的甲醛进行灭活,灭活48小时后加入甘氨酸终止灭活,最终再经过一步透析除去甘氨酸后制备得到hTNFα-CRM197戊二醛偶联疫苗。
将制备的hTNFα-CRM197戊二醛交联疫苗与本发明中的hTNFα-CRM197异型交联疫苗按相同剂量,参照实施例5免疫TTG转基因小鼠并检测抗体滴度。
如图7所示,发现虽然两种不同结合工艺制备的hTNFα-CRM197疫苗,其通过ELISA方法检测出的平均hTNFα抗体滴度水平未达到显著性差异,但可以明显观察到本发明的hTNFα-CRM197异型交联疫苗的hTNFα抗体平均效价(滴度)高于hTNFα-CRM197戊二醛交联疫苗。
并且,本发明的hTNFα-CRM197异型交联疫苗诱导的最大抗体效价高达约2048,而hTNFα-CRM197戊二醛交联疫苗诱导的最大抗体效价仅为约512,前者效价高达后者的约4倍。
进一步的,将采集得到的血清参照实施例6检测并比较血清的hTNFα实际中和能力,将接受hTNFα-CRM197异型交联疫苗免疫的小鼠其免疫血清的hTNFα中和能力,记为hTNFα中和能力(异型交联);将接受hTNFα-CRM197戊二醛交联疫苗免疫的小鼠其免疫血清的hTNFα中和能力,记为hTNFα中和能力(戊二醛交联)。
如图8所示,可以发现:
(1) 最大hTNFα中和能力(异型交联)高于最大hTNFα中和能力(戊二醛交联)。
(2) 在更高的血清稀释度时,仍有较强的hTNFα中和能力(异型交联),依然能较好地抑制TNFα杀伤L929细胞;而hTNFα中和能力(戊二醛交联)较弱,对TNFα杀伤L929细胞的抑制作用较小。
更具体地,当血清稀释度达到约1000及更高时,此时的hTNFα中和能力(戊二醛交联)已经下降到最大hTNFα中和能力(戊二醛交联)的约1/4。对比同稀释度(约1000)下的异型交联疫苗的小鼠免疫血清,此时的hTNFα中和能力(异型交联)与最大hTNFα中和能力(异型交联)相差不大,并且此时的hTNFα中和能力(异型交联)可达到同稀释度(约1000)下hTNFα中和能力(戊二醛交联)的约3.5倍。
以上结果说明了使用本发明中的hTNFα-CRM197异型交联疫苗能诱导出更多的具备hTNFα中和活力的抗体,因此对于TNFα拮抗疗法也具有更好的疗效。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种针对人肿瘤坏死因子α (TNFα)-载体蛋白偶联物,其特征在于,所述偶联物具有如式I所示的结构:
(TNFα)n-L-C (式I)
其中,
TNFα是肿瘤坏死因子α;
C是载体蛋白;
L是连接TNFα和载体蛋白的接头,所述接头是4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)与N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代丙酸盐(SATP)形成的共价键;
n为偶联于所述载体蛋白的TNFα的平均偶联数量,且n为3-10之间的整数或非整数;和
“-”为键。
2.如权利要求1所述的偶联物,其特征在于,所述载体蛋白是白喉毒素突变体CRM197。
3.如权利要求1所述的偶联物,其特征在于,所述TNFα是人TNFα的全长序列。
4.一种制备如权利要求1所述的偶联物的方法,其特征在于,包括步骤:
(a) 用N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代丙酸盐(SATP)化学修饰TNFα抗原,再经脱酰基步骤添加羟胺酸脱去SATP上的酰基形成游离巯基;反应完成后,分离获得TNFα抗原中间体;
(b) 用双功能偶联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)修饰载体蛋白,使得所述载体蛋白带有马来酰亚胺基团;反应完成后,添加氨基酸终止反应,并分离获得载体蛋白中间体;和
(c) 将步骤(a)和步骤(b)中分别获得的TNFα抗原中间体与载体蛋白中间体混合,进行偶联反应,从而获得所述的偶联物;反应完成后,添加氨基酸终止反应;其中,所述TNFα抗原中间体与载体蛋白中间体混合的比例为摩尔比3:1至9:1,较佳地为5:1至7:1,更佳地为6:1。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,在步骤(a)中,在TNFα抗原与SATP开始反应20-120 min(较佳地为30-90 min,更佳地为60 min)后,向反应体系中添加脱酰基试剂,脱酰基反应时间为1-6小时(较佳地为1-4小时,更佳地为2小时)。
6.如权利要求4所述的方法,其特征在于,在步骤(c)中,所述偶联反应的条件为:0-30℃(较佳地为2-8℃,更佳地为4℃)反应12-16小时。
7.如权利要求4所述的方法,其特征在于,在步骤(b)中,反应完成后所添加的氨基酸是甘氨酸,添加浓度为1-1000 mM(优选地为100 mM)。
8.如权利要求4所述的方法,其特征在于,在步骤(c)中,反应完成后所添加的氨基酸是半胱氨酸,添加浓度为1-1000 mM(优选地为10 mM)。
9.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物中含有如权利要求1所述的偶联物,以及药学上可接受的载体。
10.如权利要求1所述的偶联物或权利要求9所述的药物组合物的用途,其特征在于,用于制备预防和/或治疗类风湿关节炎的药物。
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LI ZHANG: "A Rationally Designed TNF-α EpitopeScaffold Immunogen Induces Sustained Antibody Response and Alleviates CollagenInduced Arthritisin Mice", 《PLOS ONE》 * |
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