HRP20010188A2 - Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity - Google Patents
Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20010188A2 HRP20010188A2 HR20010188A HRP20010188A HRP20010188A2 HR P20010188 A2 HRP20010188 A2 HR P20010188A2 HR 20010188 A HR20010188 A HR 20010188A HR P20010188 A HRP20010188 A HR P20010188A HR P20010188 A2 HRP20010188 A2 HR P20010188A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- opgl
- polypeptide
- cell
- nucleic acid
- epitope
- Prior art date
Links
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 title claims abstract description 320
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 title claims abstract description 320
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 103
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 37
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 title abstract 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 78
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 69
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 60
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 47
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 47
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims abstract description 29
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 94
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 68
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 59
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 50
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 49
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 45
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 37
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 36
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 35
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 29
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 claims description 23
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 claims description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 19
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 18
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 18
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 18
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 17
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 16
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 9
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 9
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 7
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 claims description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 101000830603 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000053529 human TNFSF11 Human genes 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 5
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 5
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 5
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 claims description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 4
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 claims description 4
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 claims description 3
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 3
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims description 2
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 claims description 2
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 108010036652 HSC70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027421 Heat shock cognate 71 kDa protein Human genes 0.000 claims description 2
- 101710113864 Heat shock protein 90 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000004030 farnesyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 claims description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 2
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 claims 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims 2
- OJISWRZIEWCUBN-QIRCYJPOSA-N (E,E,E)-geranylgeraniol Chemical group CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CO OJISWRZIEWCUBN-QIRCYJPOSA-N 0.000 claims 1
- 102100039328 Endoplasmin Human genes 0.000 claims 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 108010017007 glucose-regulated proteins Proteins 0.000 claims 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 33
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 abstract description 21
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000009877 rendering Methods 0.000 abstract 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 52
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 24
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 24
- 108010035042 Osteoprotegerin Proteins 0.000 description 23
- 102000008108 Osteoprotegerin Human genes 0.000 description 23
- XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N octadec-7-ynoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC#CCCCCCC(O)=O XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 21
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- HYZDOKBFNBVDPA-UHFFFAOYSA-N 2-(aminomethyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydrochloride Chemical compound Cl.NCC(CO)(CO)CO HYZDOKBFNBVDPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 6
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 6
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 4
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 4
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 4
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 4
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 4
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000924577 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- -1 dextran can be used Chemical class 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 3
- 208000002865 osteopetrosis Diseases 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 3
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 3
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 2
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 2
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 2
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZCJOXAIQXPLNS-UHFFFAOYSA-N 1,1,2,2,3,3,4,4,4a,5,5,6,6,7,7,8,8,8a-octadecafluoronaphthalene 4-(2-aminoethyl)benzene-1,2-diol Chemical compound NCCc1ccc(O)c(O)c1.FC1(F)C(F)(F)C(F)(F)C2(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C2(F)C1(F)F QZCJOXAIQXPLNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTJGVAJYTOXFJH-UHFFFAOYSA-N 3-aminonaphthalene-1,5-disulfonic acid Chemical compound C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=CC(N)=CC(S(O)(=O)=O)=C21 MTJGVAJYTOXFJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102100032919 Chromobox protein homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- XWNOCINUJAJTTH-UHFFFAOYSA-N DL-Glyceraldehyde 2-Phosphate Chemical compound OCC(C=O)OP(O)(O)=O XWNOCINUJAJTTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- 244000182067 Fraxinus ornus Species 0.000 description 1
- 235000002917 Fraxinus ornus Nutrition 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101710165610 Heat-stable 19 kDa antigen Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical class OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 206010020100 Hip fracture Diseases 0.000 description 1
- 101000797584 Homo sapiens Chromobox protein homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001120082 Homo sapiens P2Y purinoceptor 13 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101710089743 Mating factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 description 1
- 102100026168 P2Y purinoceptor 13 Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241001092473 Quillaja Species 0.000 description 1
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000219287 Saponaria Species 0.000 description 1
- 206010061363 Skeletal injury Diseases 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 108091005956 Type II transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000005475 Vascular calcification Diseases 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 206010048049 Wrist fracture Diseases 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 235000011116 calcium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012255 calcium oxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000007819 coupling partner Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N cyclandelate Chemical compound C1C(C)(C)CC(C)CC1OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M dimethyl(dioctadecyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- XWBDWHCCBGMXKG-UHFFFAOYSA-N ethanamine;hydron;chloride Chemical compound Cl.CCN XWBDWHCCBGMXKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000121 hypercalcemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 235000014413 iron hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L iron(ii) hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Fe+2] NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009806 oophorectomy Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical group [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229940024231 poxvirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000033753 regulation of osteoclast development Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 231100001055 skeletal defect Toxicity 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N tetrafluoromethane Chemical compound FC(F)(F)F TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910000391 tricalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019731 tricalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002395 vitreous cell Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000707 wrist Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/03—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Ovaj izum odnosi se na poboljšanje terapije i prevenciju od osteporoze i ostalih bolesti karakteriziranih kontinuiranim gubitkom tkiva kosti. Specifičnije, ovaj izum prikazuje metodu smanjivanja aktivnosti liganda osteoprotegerina (OPGL) onemogućavanjem produkcije antitijela OPGL u osobama koje su u opasnosti da pate od osteoporoze. Izum također prikazuje metodu priprave modificiranog OPGL korisnog u ovoj metodi kao i samu modifikaciju. Ovim izumom su također obuhvaćeni fragmenti nukleinskih kiselina koje kodiraju modificirani OPGL kao i vektori koji sadrže te fragmente nukleinskih kiselina, te stanice domaćina i time transformirane stanične linije. Izum također prikazuje metodu za identifikaciju analoga OPGL koji su korisni u metodi iz ovo izuma, kao i u pripravcima koji sadrže modificirani OPGL ili sarži nukleinske kiseline koje kodiraju analoge OPGL
Područje izuma
Osteoporoza je važan i rastući problem širom svijeta. Procijenjeno je da pogađa oko 75 miliona ljudi u Sjedinjenim Američkim Državama, Europi i Japanu. Stoga, to je najučestaliji sistemski poremećaj kosti u industrijskom dijelu svijeta.
Osteoporoza pogađa jednu od četiriju žena nakon menopauze, te uglavnom starije osobe uključujući značajan broj muškaraca. Cijena osteoporoze u USA, a s 15 miliona ljudi pogođenih njome, je 1984. procijenjena na 3.8 milijardi USD godišnje. Ekstrapolacijom na cijeli svijet dobiva se svota od najmanje 20 milijardi USD.
Osteoporoza je sistemska bolest skeleta karakterizirana gubljenjem koštane mase i mikroarhitekturalnim gubitkom tkiva kostiju, s posljedicom povećanja lomljivosti kostiju i sklonosti lomu. Mada su sve kosti pogođene, tipični i uobičajeni su lomovi kralježnice, ručnog zgloba i kuka. Rizik razvijanja osteoporoze povećava se godinama i zastupljeniji je kod žena nego muškaraca. Izgleda da je uzrokovan u osnovi mehanizmom koji ubrzava normalan gubitka koštane mase, nakon menopauze u žena, te se u svim pojedincima pojačava godinama.
Najveća masa kostiju dostiže se oko 35. godine. Nakon dostignuća najveće mase, masa kostiju se smanjuje zbog disbalasna remodeliranja Kosti gube minerale i organsku matricu, ali zadržavaju osnovnu organizaciju.
Kosti se sastoje od minerazlizranog ekstracelularnog matriksa koji se sastoji od raznih proteina i proteglikana, a glavna komponenta je tip l kolagena. Mineral koji inkrustira ekstraceleuarnimatriks je hidroksiapatit (Ca3(PO4)2·Ca(OH)2). Kosti se kontinuirano modeliraju tijekom rasta i razvitka i mijenjaju tijekom života, a kao odgovor na fizičke i kemijske signale.
Rast, razvitak i održavanje kostiju je visoko reguirani proces koji na staničnoj razini obuhvaća koordiniranu regulaciju stanica koje tvore kosti (osteoblasti) i stanica koje resorbiraju kosti (osteoklasti). Razinu mase kostiju određuje balns između nastajanja kostiju u resorpcije.
Osteoblasti nastaju iz stanica mezenhima i tvore koštani matriks tijekom razvitka, nakon ozljede kostiju i tijekom normalnog remodeliranja kostiju koje se zbiva tijekom života. Osteoklasti se diferenciraju iz hematopoietskih prekursora porijeklom od monocitnog makrofaga i resorbiraju matriks kostiju.
Disbalans funkcija osteoblasta i osteoklasta može dovesti da abnormalnosti skeleta karakterizirane povećavanjem mase kostiju (osteopertoza) ili smanjivanjem mase kostiju (osteoporoza).
Istraživanja osteopertroze u mutiranim miševima pokazuju da genetski nedostatak u razvitku, sazrijevanju i/ili aktivaciji osteoklasta vodi smanjivanju resorpcije kostiju i rezultat je ozbiljna osteoporoza (Marks, 1989). Ipak se do sada relativno malo zna o faktorima koji djeluju fiziološki u regulaciji razvitka osteoklasta.
Nedavno su međutim opisana i karakterizirana dva proteina koji imaju ulogu u toj reguaciji (Simonet et a/., 1997; Lacey et ai, 1998). Ta dva proteina su osteoprotegerin i ligand osteoprotegerina.
Osteoprotegerin je novi sekrecijski član obitelji faktora tomorske nekroze. In vitro, osteoprogerin blokira osteoklastogenezu na način koji ovisi o dozi. Transgenični miševi koji eksprimiraju osteoprotegerin pokazuju općenito povećanje gustoće kostiju (osteopertoza) koja je povezana sa smanjivanjem osteoklasta. Davanje rekombinantnog osteoprotegerina daje sličan učinak u normalnim miševima, te štiti od gubitka kostiju povezanih s ovariektomijom u štakorima (Simon et a/., 1997). Nadalje, miševi s manjkom osteoprotegerina još u normalnom razdoblju pri rođenju pokazuju rani početak osteoporoze i kalcifikacije arterija (Bucay et al. 1998). Ova opažanja snažno ukazuju na mogućnost da osteoprotegerin blokira diferencijaciju osteoklasta, glavnog ako ne jedinog tipa stanica koje resorbiraju kosti, ukazujući da može djelovati kao humoralni regulator resropcije kostiju. Osteoprotegerin je predmet WO 97/23614.
Pretpostavljeno je da osteoprotegerin može djelovati vezivanjem na faktor koji stimulira razvitak osteoklasta i neutralizacijom faktora koji stilulira razvitak osteoklasta, pa stoga inihibira sazrijevanje osteoklasta (Simonet et a/., 1997).
Ligand osteoprotegerina (OPGL) je novi član obitelji citokina koji je faktor tumorske nekroze, a koji postoji u obliku vezanom na membranu i u topljivom obliku. OPGL se vezuje na osteoprotegerin s aktivnošću vezivanja od 4 nM. In
vitro, OPGL aktivira zrele osteoklaste i modulira stvaranje osteoklasta iz prekursora koštane srži u prisutnosti CSF-1. Također j'e pokazano da se OPGL vezuje na površinu izvornika osteoklasta u koštanoj srži na koji je djelovano s CSF-1. Receptor OPGL na tim hematopoeitskim progenitorskim stanicama je, međutim nepoznat. Rekombinantni topljivi OPGL je mogući induktor resrpcije kosti in vivo (Lacey et a/., 1998).
Opis OPGL
OPGL je sintetiziran kao tip II transmembranskog proteina koji se sastoji od 317 aminokiselinskih ostataka (humani, vidi SEQ ID br. 2) ili 316 aminokiselinskih ostataka (lod aboratorijski glodavaca, vidi SEQ ID br. 4 i 6). Uspoređivanje dvaju sekvencija aminokiselina pokazalo je 87% identičnosti homolignih položaja.
Sekvencija OPGL aminokiselina sadrži kratku citoplazmatsku domenu na N-terminlnom kraju za kojom slijedi pretpostavljena transmembranska regija između aminokiselina 49 i 69. Na osnovu homolognosti s alfa faktorom tumorske nekroze, pretpostavljeno je da ekstracelularni dio OPGL ima dvije domene, regiju poput stabljike od aminokiseline 70 do 157, te aktivni dio koji je ligand od aminokiseline 158 do C-terminlanog kraja.
Najsličniji protein OPGL je apoptoza uključujući citokin TRAIL s manje od 25% identičnih aminokiseina. OPGL je također nedavno kloniran za druge svrhe i nazvan je TRANCE (Won, etal., 1997, J. Biol. Chem. 272: 25190-25194), odnosno RANKL (Anerson et a/., 1997, Nature 390: 175-179). Protein je također poznat kao diferencijski faktor osteoklasta (ODF).
Nekoliko N-terminalnih dellecija OPGL laboratorijskih glodavaca su eksprimirani u E coli i pročišćeni su. Te varijante se sastoje od aminokiselinskih ostataka 75-316, 128-326 i 158-316. Tri najkraća dijela imaju sličnu strukturu β-ploči, a određenu metodom cirkularnog dikroizma, a svi su se mogli vezati na osteoprotegerin. Još je važnije da su te tri varijante aktivne u in vitro testovima (Lacey et al, 1998).
Najkraća varijante je dalje istraživana. Kao i alfa faktor tumorske nekroze, taj dio OPGL postoji kao trimer i otopini i tvori 3:3 kompleks nakon inkubiranja s osteoprotegerinom. Nađeno je da je afinitet vezivanja 4 nM. Ta varijanta inducira u miševima in vivo značajno povećanje ioniziranog kalcija u krvi (hiperkalcemija). Istovremeno davanje osteoprotegerina značajno smanjuje hiperkalcemični učinak OPGL
Najduji dio (aminokiselinski ostaci 75-316) OPGL se ne vezuje na osteoprotegerin i nema biološku aktivnost.
U vrijeme konstrukcije varijante nastale N-terminanom delecijom, prirodno mjesto cijepanja OPGL nije bilo poznato. Ekspresijom OPGL pune duljine u 293 humanim fibroblastima nastaje topljivi OPGL koji počinje kod aminokiselinskog ostatka 139 u proteinu glodavca ili kod homolognog aminokisleinskog ostatka 140 u humanom proteinu. Ova istraživanja ekspresije također pokazuju da su OPGL nastali ekspresijom humanih stanica glikolizirani. To nije iznenađujuće jer je humani OPGL i onaj od laboratorijskih glodavaca sadrže tri potencijalna mjesta za glikoizaciju u C-terminlanoj domeni liganda.
Koncentracija osteoprotegerina u krvi i tkivu nije poznata, ali protein ima značajnu biološku aktivnosti pri koncentraciji od 1 ng/mL
Biološka aktivnost OPGL
OPGL je diferencijski faktor osteoklasta, a kada je u kombinaciji s CSF-1. Ni jedan od ovih spojeva sami ne mogu inducirati diferencijaciju osteoklasta iz progenitor stanica.
OPGL je aktivator zrelog osteoklasta. Sam za sebe OPGL aktivira zrele osteklaste da resorbiraju kost. U tim eksperimentima nije zamijećeno da OPGL djeluje kao faktor rasta osteoklasta ili faktor preživljavanja osteoklasta.
Djelovanje OPGL ne izgeda da je ograničeno vrstom jer OPGL laboratorijskih glodavaca također inducira stvaranje osteoklasta u kulturama humanih perifernih mononuklearnih stanica krvi.
Predmet izuma
Predmet ovog izuma je da prikaze nove terapije stanja karakteriziranih povećanjem resrpcije kosti kao što je osteoporoza. Daljnji predmet je da se razvije autovakcija za OPGL , a da se dobije novi tretman osteoporoze i za druge patooške poremećaje u kojima dolazi do suviška resprcije kosti.
Cilj izuma
Cilj ovog izuma je prikaz novih terapija stanja karakteriziranih povećanom resorpcijom kostiju, kao što je osteoporoza. Daljnji cilj je razvitak autovakcine na OPGL, a da se dobije novi tretman osteoporoze i za druge parološke poremećaje koji obuhvaćaju povećanu resorpciju kostiju.
Sažetak izuma
Naši smo da gore navedeni podaci pokazuju patofiziološku uogu OPGL. In vivo dokaz je indirektan, ali je po našem mišljenju uvjerljiv, posebice u kombinaciji s direktnim dokazom.
Opažanje da injektiranje rekombinantne C-terminlne domene OPGL rezultira ozbiljnom hiperkalcemijom po našem mišljenju izravno upućuje na patofiziološku ulogu.
Indirektni dokaz dolazi od miševa s manjkom osteoprotegerina ("knock out" miševi) koji mada normalni pri rođenju razvijaju rani početak osteoporoze. To pokazuje da uklanjanje proteina koji veže OPGL i neutralizacija tih efekata vodi osteoporozi. Mi zaključujemo da je najvjerojatniji razlog za to povećano sazrijevanja osteoklasta i aktivacija uzrokovana OPGL.
Dva druga indirektna dokaza su to što se u transgenični miševima za osteoprotegerin i u miševima u koje je injektiran rekombinantrni osteoprotegerin razvija se osteopetroza. To pokazuje da neprirodno visoke razine proteina na koje se veže OPGL i neutralizira njegov učinak vodi osteopetrozi. Mi ovdje zaključujemo da je za to razlog smanjivanje sazrijevanja osteoklasta i aktivacija uzrokovana neutralizacijom OPGL.
Mi stoga predlažemo model u kojem je OPGL i osteoprotegerin djeuju kao pozitivni i negativni regulatori razvitka osteoklasta. Drugim riječima, OPGL potiče resorpciju, dok osteoprotegerin inhibira resorpciju kostiju.
Stoga, u odnosu na osteoporozu, OPGL se može smatrati kao "patogeno sredstvo" koje potiče resorpciju kosti koja vodi osteoporozi. Na sličan način, osteoprotegerin se može smatrati "terapijsko sredstvo" čiji je suprotni učinak od "patogenog sredstva" sadržan u neutralizaciji njegovog efekta.
Mi stoga predlažemo smanjivanje diferencijacije/sazrijevanja/stvaranja osteoklasta aktivacijom putem in vivo produkcije antitijela koja mogu neutralizirati OPGL, pa stoga omogućiti siguran i učinkovit način tretmana/poboljšanja i/ili prevencije osteoporoze i ostalih bolesti karateriziranih većom brzinom resorpcije kosti od brzine stvaranja kosti.
Zato se u najširem i najopćenitijem obujmu, ovaj izum odnosi se na in vivo metodu smanjivanja aktivnosti liganda osteoprotegerina (OPGL) u životinjama uključujući ljude, a metoda sadrži djelovanje na životinjski imuni sustav s imunološki učinkovitom količinom najmanje jednog polipeptidnog OPGL ili njegove podsekvencije koja je formulirana tako da imunizacijom životinje s polipeptidnim OPGL ili njegovom podsekvencijom izazove produkciju antitijela na poifpeptidni OPGL, i/ili najmanje jedna analoga OPGL koji je uveden modifikacijom u polipeptidnog OPGL čiji je rezultat da imunizacija životinje s analogom izaziva produkciju antitijela na polipeptidni OPGL.
Najatraktivniji aspekt tog pristupa je da se npr. osteoporoza može kontrolirati periodičnom a ne prečestom imunizacijom, nasuprot terapijskom pristupu koji obuhvaća često (dnevno) davanje osteoprotegerina ili molekula koje imaju aktivnost vezanja OPGL analoga na njih. Očekuje se da će 1-4 godišnje injekcije imunogenog pripravka biti dovoljne da se dobije željeni učinak, dok davanje osteoprotegerina ili ostalih inhibitora OPGL aktivnosti zahtjeva dnevno davanje.
Izum se također odnosi na analoge OPGL kao i fragmenata nukleinskih kiselina koji kodiraju podgrupu tih. Također su imunogenski pripravci koji sadrže analoge ili fragmente nukleinskih kiselina dio ovog izuma.
Izum se također odnosi na metodu identifikaciju analoga OPGL kao i metodu priprave pripravka koji sadrže analoge OPGL
Konačno, izum se odnosi na metodu tretmana osteoporoze i ostalih bolesti karakteriziranih velikom resorpcijom kosti u kojoj se daje molekulu koja nije OPGL (tipično kao anti-tijelo) koji blokira interakciju između OPGL i njegovog receptora na stanicama osteoklasta.
Detaljni opis izuma
Definicije
U sljedećem dijelu bit će definirani i u detalje objašnjeni brojni termini korišteni u ovom izumu i zahtjevima, a da se raščiste otkrića i područja izuma.
Termin "T-limfocit" i T-stanica" će se koristiti alternativno za limfocite porijeklom iz timusa koji su odgovorni za različite stanice koje su posredovane imunim odgovorima kao i za aktivnost pomoćnih stanica u humoralnom imunom odgovoru. Slično, termin "B-limfocit" i B-stanica" će se koristiti limfocite koji produciraju anti-tijela.
"polipeptidni OPGL" ovdje označuje polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvenciju gore navedenih proteinskih OPGL koji se dobivaju od ljudi ili miševa (ili njihove dijelove koji imaju značajnu količinu epitopa B-stanica s nedirnutim OPGL), ali su terminom obuhvaćeni također polipeptidi koji imaju aminokiselinske sekvencije identične analozima tog proteina izoliranih iz drugih vrsta. Također su u značenje termina uključeni neglikolizirani oblici OPGL koji su pripravljeni u prokariotskim sustavima, kao i oblici koji imaju različite oblike glikolizacije uzrokovane npr. kvasnim gljivicama ili ostalim eukariotskim ekspresijskim sustavima koji nisu sisavci. Treba međutim naznačiti da kada se koristi termin "polipeptdni OPGL" namjera je da taj polipeptid nije imunogen kada je ispoljen u životinji koja će biti tretirana. Drugim riječima, polipeptidni OPGL je vlastiti protein ili odgovarajući analog kao što je vlastiti protein koji neće normalno povećavati imuni odgovor na OPGL u životinjama.
"OPGL analog" je polipeptidni OPGL kojem je promijenjena njegova priprarna struktura. Takve promjene mogu npr. biti u obliku vezivanja polipeptidnog OPGL na pogodan partner za spajanje (tj. promjena primarne strukture koja isključivo obuhvaća C- i/ili N-terminlanu adiciju aminokiselinskih ostataka) i/ili može biti u obliku insercije i/ili delecije i/ili supstitucije polipeptidne aminokiselinske sekvencije OPGL Također su terminom obuhvaćene molekule koje su derivati OPGL, vidi rasprava niže o modifikacijama OPGL.
Valja napomenuti da se može zamisliti da korištenje kseno-analoga vakcine humanog OPGL u ljudima (npr. pseći ili svinjski analozi) producira željenu imunost na OPGL. Takvo korištenje kseno-analoga za imunizaciju je također razmatrano u izumu.
Namjera je da termin "polipeptid" je u ovom kontekstu označuje kratke peptide od 2 do 10 aminokiselina, oligopeptide od 11 do 100 aminokiselina i polipeptide s više od 100 aminoksileina. Nadalje, termin također uključuje proteine, tj. funkcionalne bimolekule koje sadrže najmanje jedan polipeptid; kada sadrže najmanje dva polipeptida mogu biti nekovalentno vezani. Polipeptid(i) u proteinu se mogu glikolizirati i/ili lipidirati i/ili sadržati prostetične skupine.
Termin "podsekvencija" označuje dio od najmanje 3 aminokseline ili, kada je to važno, najmanje 3 nukeotida izvedenih izravno od prirodne aminokiselinske sekvencije OPGL ili sekvencije nukleinske kiseline.
Termin "životinja" u ovom kontekstu općenito označuje životinjske vrste (preferirano sisavce) kao što su Homo sapiens, Canis domesticus, itd. a ne samo jednu životinju. Međutim, termin također označuje populaciju takvih životinjskih vrsta jer je važno da jedinke imunizirane prema metodi iz izuma sve sadrže uglavnom isti OPGL koji dopušta da imunizaciju životinja s istim imunogenom (imunogenima). Ako primjerice genetske varijanta OPGL postoji u različitoj humanoj populaciji može biti neophodno da se koriste različiti imunogeni u tim različitim populacijama, a da bi se mogla razbiti autotolerancija prema OPGL u svakoj populaciji. Bit će jasno stručnjacima da životinja u ovom kontekstu je živo biće koje ima imuni sustav. Preferirano je da životinja spada u vertebrate, kao što su sisavci.
Termin "in vivo smanjivanje aktivnosti OPGL" ovdje označuje smanjivanje u živom organizmu broj interakcija između OPGL i njegovog (nepoznatog) receptora (ili između OPGL i ostalih mogućih biološki važnih partnera za vezivanje za tu mmolekulu). Smanjivanje se može dobiti putem različitih mehanizama: od kojih je jednostavna interakcija s aktivnim mjestom OPGL vezivanjem antitijela najjednostavnija. Međutim, također unutar obujma izuma je što je rezultat vezanja antitijela uklanjanje OPGL "skavangerskih" stanica (kao što su makrofagi i ostale fagocitne stanice).
Izraz "ispoljavanje... koji utječe na imuni sustav" označuje da je imuni sustav životinje podvrgnut imnunogenskom izazovu na kontroliran način. Kao što će biti jasno iz donjeg prikaza, takav izazov imunog sustava se može izvesti na brojne načine od kojih je najvažniji vakcinacija polipeptidom koji sadrži "farmakcine" (tj. vakcina koja je dana za tretman ili poboljšanje postojeće bolesti) ili vakcinacija "farmakcinom" koji je nukeinska kiselina. Važan rezultat koji treba postići je da se imuna komponenta stanica u životinji kontrolira antigenom na imunološki učinkovit način, pri čemu je precizan način postizanja tog rezultata je manje važan od inventivne ideje koju prikazuje ovaj izum.
Termin "imunogenski učinkovita količina" ima svoje uobičajeno značenje, tj. količina imunogena koja može inducirati inumi odgovor koji značajno zadržava patogena sredstva koja dijele imunološke karakteristike s imunogenom.
Kada se koristi izraz da je OPGL "modificiran" ovdje označuje kemijsku modifikaciju polipeptida koji čini skelet OPGL Takva modifikacija može npr. biti izvedena (npr alkiliranje) na nekm aminokiselinskim ostacima u sekvenciji OPGL, ali će prema ovom izumu preferirana modifikacija sadržavati promjene primarne strukture animokiselinske sekvencije OPGL
Kada se diskutira "autotolernacija na OPGL", a s obziran da je OPGL vlastiti protein u populaciji koja se vakcinira, podrazumijeva se da normalni pojedinci u populaciji neće povećavati imuni odgovor prema OPGL; ne može se isključiti da će ponekad pojedinci u životinjskoj populaciji moći tvoriti antitijela na prirodni OPGL, npr. kao dio autoimuni poremećaja. Pri bilo kojoj brzini životinja će normalno biti autotolerantna samo na OPGL ali se ne može isključiti da će analozi OPGL izvedeni iz ostalih životinjskih vrsta iz populacije koja ima različit fenotip OPGL također biti tolerirani od rečenih životinja.
"Strani epitop T-stanice" (ili "strani epitop T-limfocita") je peptid koji je u stanju vezati se na molkulu MHC i koji stimulira T-stanice u životinjama. Preferirani strani epitop T-stanice u ovom izumu su epitopi reaksirane specifičnosti, tj. epitopi koji se vežu na veliki udio neke klase MHC molekua u životinjskim vrstama u populaciji. Samo vrlo ograničeni broj takvih promiscous epitopa T-stanica je poznat, i ti će dolje biti detaljno prikazani. Valja napomenuti da bi imunogeni koji se koriste u ovom izumu bili učinkoviti u velikom dijelu životinjske populacije što je moguće, može biti neophodno da se 1) insertira nekoliko stranih epitopa T-stanica u istom analogu OPGL ili da se 2) pripravi nekoliko analoga OPGL koji imaju umetnuti epitop različite relaksirane specifičnosti. Valja naznačiti da je koncept stranih epitopa T-stanica, tj. epitopi koji se izvode iz vlastitih proteina u koji samo pokazuju imunogeno ponašanje, a kad postoje u izoliranom obiku bez početnog dijela vlastitih proteina.
"Strani epitop pomoćnih limfocita" (strani etitop th) je strani epitop T stanice koji se vezuje na MHC klase II molekula i može biti prisutan na površini stanice s antigenom (APC) vezanom na MHC klasu II molukulu.
"Funkcionalni dio" (bio)molekule u ovom kontekstu označuje dio molekule koja je odgovorna za najmanje jedan biokemijski ili fiziološki efekt pod utjecajem molekule. Dobro je poznato u struci da mnogi enzimi ili ostale molekule imaju aktivno mjesto koje je odgovorno za efekte koje se izpoljuju zbog tih molekula. Ostali dijelovi molekule mogu služiti u svrhu stabilizacije ili mogu povećavati topljivost i mogu stoga biti izostavljeni ako ove svrhe nisu važne u kontekstu nekih cjelina ovo izuma. Primjerice, moguće je da se koriste neki citokini kao modificirani ostaci OPGL (vidi detaljnu diskusiju dolje) i u takvom slučaju pitanje stabilnosti može biti nevažno jer je vezanje za OPGL dovodi do željene stabilnosti.
Termin "adjuvans" ima svoje uobičajeno značenje u tehnologiji vakcina, tj. tvar ili pripravak koji 1) za sebe nije u mogućnsti izazvati specifičan imuni odgovor vakcine, ali koji je 2) ipak u stanju povećati imuni odgovor na imunogen. Drugim riječima vakcinacija adjuvansom ne dovodi do imunog odovora na imungoen, vakcinacija s imunogenom može ili ne mora povećavati imuni odgovor na imungoen, ali kombinirana vakcinacija s imunogenom i adjuvansom izaziva imuni odgovor na imunogen koji je jači od onog induciraneg samim imunogenom.
"Usmjeravanje" molekule u kontekstu ovo izuma označuje situaciju u kojoj će nakon uvođenja molekule u životinju preferirati neko tkivo(a) ili će preferirano biti povezana s nekim tipom stanice ili stanicama. Efekt može biti dobiven na brojne načine, uključujući formulaciju molekule u pripravku koja olakšava usmjeravanje uvođenjem u molekulu skupina koje olakšavaju usmjeravanje. Ova tkiva će biti dolje detaljno diskutirana.
"Stimulacija imunog sustava" znači da tvar ili pripravak općenito pokazuje nespecifičan imunostimulirajući učinak. Brojni adjuvansi i oni za koje se pretpostavlja da su adjuvansi (kao neki citokini) dijele sposobnost stimuacije imunog sustava. Rezultat korištenja imunostimulacijskog sredstva je povećanje "pripravnosti" imunog sustava znači da istovremena ili kasnija imunizacija s imunogenom inducira značajno učinkovitiji imuni odgovor u usporedbi kad se koristi samo imunogen.
Preferirane cjeline smanjivanja OPGL aktivnosti
Preferirano je da su polipeptidni OPGL korišteni kao imunogeni u metodi iz ovog izuma modificirane molekule u kojima je najmanje jedna promjena prisutna u OPGL aminokiselinskoj sekvenciji, jer je vjerojatnost za dobivanje vrlo važnog učinka uništavanja autotolerancije prema OPGL uveliko povećana na taj način. Valja napomenuti da ta doza ne isključuje mogućnost korištenja modificiranog OPGL u formulacijama koje nadalje olakšavaju uništavanje autotolerancije na OPGL, npr. formulacije koje sadrže adjuvanse.
Pokazano je (u Dalum I et al., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804) da potencijalni samoreaktivni B-limfociti prepoznavajući vlastite proteine su fiziološki prisutni u normalnim pojedincima. Međutim, da bi se induciralo da ti B-limfociti stvarno proizvode antitijela koja reagiraju s relevantnim vlastitim proteinima, potrebna je asistencija iz citokina da proizvode T-pomoćne imfocite (TH-stanice ili TH-limfociti). Normalno ta pomoć nije osigurana jer T-limfociti općenito ne prepoznaju epitope T-stanica izvedene iz vlastitih proteina, a kada su predstavljeni od stanice koje prezentiraju antigen (APC). Međutim, postojanjem elemenata različitosti u vlastitom proteinu (tj. uvođenjem imunološki značajne modifikacije), T-stanice koje prepoznaju strani element su aktivirane nakon prepoznavanjem stranog epitopa na APC (kao što je inicijalno mononuklearna stanica). Poliklonalni B-limfociti (koji su također APC), sposobni prepoznati vlastite epitope na modificiranim vastitim proteinima, također uvlače u sebe antigen i zatim predstavljaju odgovarajući strani epitop (epitope) T-stanica, a aktivirani T-imfociti zatim osiguravaju pomoć citokina tih samoreaktivnih poliklonalnih B-limfocita. Kako su antitijela producirana tim poliklonalnim B-imfocitima reaktivna s različitim epitopima na modificiranim polipeptidima, uključujući one koji su također prisutni u prirodnim polipeptidima, inducira se antitijelo koje je reaktivno s nemodificiranim vlastitim proteinima. U zaključku, T-limfociti mogu djelovati ako je populacije poliklonalnih B-limfocita prepoznala cijeli prethodni antigen, pri čemu zapravo samo insertirani epitop(i) je/su domaćinu stran. Na taj način se induciraju antitijela koja podliježu ukrštenoj reakciji s nemodificiranim vlastitim antigenima.
U struci je poznato nekoliko načina modifikacije vlastitog poipeptdinog antigena, a da bi se uništila autotolerancija. Prema ovom izumu, modifikacija može uključivati
- uvođenje najmanje jednog stranog epitopa T-stanice i/ili
- da je uveden barem jedan prvi segment čiji je učinak usmjeravanje modificirane molekule na stanicu s antienom (APC) ili B-limfocitom, i/ili
- da je uveden barem jedan drugi segment koji stimulira imuni sustav, i/ili
- da je uveden barem jedan treći segment koji optimizira ispoljavenje modificiranog polipeptidnog OPGL u imunom sustavu.
Međutim, sve ove modifikacije se moraju izvesti uz zadržavanje značajnog dijela originalnog epitoa B-limfocita u OPGL jer je time ubrzano prepoznavanje prirodne molekule B-limfocitom.
U jednoj preferiranoj cjelini bočne skupine (u obliku stranog epitopa T-stanica ili gore spomenutog prvog, drugog ili trećeg segmenta) su uvedene kovalentno ili nekovalentno. To znači da je lanac aminokiselina izveden iz OPGL preveden u derivate bez mijenjanja primarne sekvencije, ili barem bez uvođenja promjena u peptidne veze između pojedinih aminokiselina u lancu.
Alternativna i preferirana cjelina koristi aminokiselinsku supstituciju i/ili križanje i/ili umetanje i/ili adiciju (koja se može dobiti rekombinantno ili peptidnom sintezom; modifikacija koja obuhvaća dulje lance aminokiselina povećava vezivanje u polipeptide). Posebno preferirana verzija ove cjeline je tehnika opisana u WO 95/05849, koja prikazuje metodu smanjivanja aktivnosti vlastitih proteina imunizacijom s analozima vlastitih proteina u kojima je broj aminokiselinske sekvencije(a) supstituiran s odgovarajućom sekvencijom (ama) aminokiselina od kojih svaka sadrži početni imunodominantni epitop T-stanice, dok je u isto vrijeme održavana cjelokupna tercijarna struktura vlastitog proteina u analogu. Za svrhe ovog izuma dozvoljeno je, međutim, da modifikacijom (koja može biti insercijom, adicijom, delecijom ili supstitucijom) poveća strani epitop T-stanice, a pri čemu se istovremeno zadržava najveći dio epitopa B-stanice OPGL Međutim, da bi se dobio maksimalna učinkovitost induciranog imunog odgovora, preferirano je da se ukupna tercijarna struktura OPGL održava u modificranoj molekuli.
Sljedeća formula opisuje građevne jedinice OPGL koji su općenito pokriveni izumom:
(MOD1)s1 (OPGLe1)n1 (MOD2)s2 (OPGLe2n2 …. .(MODx)Sx (OPGLex) (I)
- u kojoj OPGLe1-OPGLex jesu epitopi x B-stanica u kojima slijedi OPGL koji je neovisno identičan ili nije identičan i koji može sadržavati druge bočne skupine, x je cijeli broj ≥3, n1-nx jesu x cijeli brojevi ≥0 (najmanje jedna je ≥1), MOD-1-MODX su x modifikacija uvedenih između sačuvanih epitopa B-stanica, s1-sx jesu x cijeli brojevi ≥0 (najmanje jedna je ≥1 ako nije uvedena ni jedna bočna skupina u OPGLe sekvencijama). Stoga prema općem funkcionalnom ograničenju r na imunogenost građevnih dijelova, izum dozvojava za sve vrste permutacija originalne OPGL sekvencije sve veste modifikacija u njoj. Stoga, u izum su uključeni modificirani OPGL dobiveni ispuštanjem dijelova sekvencije OPGL koja npr. pokazuje štetan učinak in vivolli ispuštanjem dijelova koji su normalno unutar stanice i stoga povećavaju neželjene imunološke reakcije.
Održavanje velikog dijela epitopa B-stanice, ili čak cijele tercijarne strukture proteina koji je podvrgnut modifikaciji kao što je opisano ovdje, može se postići na nekoliko načina. Jedan način je jednostavna priprava poliklonalnog antiseruma na OPGL (npr. antiserum pripravljen u zecu) i zatim korištenje tog antiseruma kao reagensa (npr. u kompetitivnom ELISA) na modificirane proteine koji se proizvode. Modificirane verzije (analozi) koji reagiraju do iste mjere s antiserumom kao doza OPGL mora se smatrati da ima istu ukupnu tercijarnu strukturi OPGL pri čemu analozi pokazuju ograničenu (ali još uvijek značajnu i specifičnu) neaktivnost s takvim antiserumom koji se smatra da ima održanu značajnu frakciju originalnih epitopa B-stanice.
Aternativno se monofclonalnia antitijela koji su reaktivni s određenim epitopima OPGL mogu pripraviti i koristiti za testiranje. Ovaj pristup je povoljan jer dozvoljava: 1) mapiranje epitopa OPGL i 2) mapiranje epitopa koji se održava u pripravljenim analozima.
Naravno, treći pristup bi bio da se riješi trodimenzijska struktura OPGL ili biološki aktivnog fragmenta (vidi gore) i usporedba toga s riješenom trodimenzijskom strukturom pripravljenh analoga. Trodimenzijska struktura se može riješiti difrakcijom X-zraka i NMR spektroskopijom. Daljnje informacije koje se odnose na tercijarnu strukturu se do neke mjere mogu dobiti cirkularnim dikroizmom kojima je prednost da samo zahtijevaju polipeptid u čistom obliku (dok difrakcija X-zraka zahtjeva kristalizirani polipeptid a NMR zahtjeva izotopno obilježene polipeptide), a da se dobiju korisne informacije o tercijarnoj strukturi molekule. Međutim, na kraju su difrakcija X-zraka i/ili NMR neophodni da se dobiju konkluzivni podaci jer cirkularni dikroizam može samo dati indirektni dokaz o ispravnoj trodimenzijskoj strukturi, a informacijom o sekundarnoj strukturi elemenata.
Jedna preferirana cjelina izuma koristi višestruko ispoljavanje epitopa B-limfocita OPGL (tj. formula l u kojoj je najmanje jedan epitop B-stanice prisutan u dva položaja). Taj efekt se može postići na različite načine, npr. pripravom fuzioniranih polipeptida koji sadrže strukturu (OPGL)m, gdje m jeste cijeli broj ≥2, a zatim uvođenjem ovdje diskutirane modifikacije u najmanje jednu sekvenciju OPGL. Preferirano je da uvedena modifikacija uključuje najmanje jednu duplikaciju epitopa B-imfocita i/ili uvođenje haptena.
Kako što je gore spomenuto, uvođenje stranog epitopa T-stanice se može izvesti insrecijom, delecijom ili supstitucijom najmanje jedne arninokiseline.
Naravno, normalna situacija bi bila uvođenje više od jedne promjene u aminokiselinskoj sekvenciji (npr. insercijna ili supstitucija komplenog epitopa T-stanice) ali je važno postići da se analogom OPGL pri procesiranju, koje ispoljavaju antigen u stanici (APC), poveća strani imunodominantni epitop T-stanice koji je prisutan u MCH klasi II molekule na površini APC. Zato, ako je aminokiselinska sekvencija u OPGL u odgovarajućem položaju sadrži broj aminokiselinskih ostataka koji se također mogu naći u stranim TH epitopima, tada se uvođenje stranog TH epitopa može završiti time da se ostale aminokiseline insertiraju u strani epitop, adiraju, deletiraju ili supstituiraju. Drugim riječima, nije neophodno da se uvede kompletan TH epitop insercijom ili supstitucijom, a da bi se zadovoljila svrha ovo izuma.
Preferirano je da se broj aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija ili adicija najmanje 2, kao stoje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 i 25 insercija, adicija, supstitucija ili delecija. Nadalje je preferirano da je broj aminokiselinskih insercija, adicija, supstitucija ili delecija nije veći od 150, tako da je uglavnom 100, uglavnom 90, uglavnom 80 i uglavnom 70. Posebno je preferirano ako je broj aminokiselinskih insercija, adicija, supstitucija ili delecija ne prelazi 60, a određen je da ne prelazi 50 ili čak 40. Najpreferiraniji broj nije veći od 30. Što se tiče adicije aminokiselina valja napomenuti da ona, a kada je nastala struktura u obliku fuzioniranog polipeptida, često znatno veća od 150.
Preferirane cjeline izuma uključuju modifikacije uvođenjem najmanje jednog stranog imunodominantog epitopa T-stanice. Podrazumijevat će se da pitanje dominacije epitopa T-stanice ovisi u vrsti životinje. Po tome kako se ovdje koristi, termin "imunodominacija" odnosi se na epitope koji u vakciniranom pojedincu/populaciji značajno povećavaju imuni odgovor, ali je dobro poznata činjenica da epitop T-stanica koji je imunodominantan u pojedincu/populaciji nije sigurno dominantan u drugom pojedincu iste vrste, mada može biti sposoban vezati se na MHC-II molekule u potonjima. Zato, za svrhe ovog izuma, imuno-dominantni epitop T-stanice je epitop T-stanice koji će biti učinkovit osiguravanjem pomoći T-stanica, a kada su prisutni u antigenu. Tipično, imunodominantni epitopi T-stanice imaju unutarnje svojstvo da će skoro uvijek biti prisutni vezani na MHC klasi II molekule, neovisno u polipeptidu u kojem se pojavljuju.
Sljedeći važni aspekt je pitanje restrikcije MHC epitopa T-stanice. Općenito prirodni epitopi T-stanica su ograničeni na MHC, tj. neki peptidi koji sadrže epitop T-stanica će se vezati učinkovito na podskupinu MHC klase II molekula. To s druge strane ima učinak da će upotreba jednog specifičnog epitopa T-stanice u komponenti vakcine rezultirati time da je ona učinkovita samo u dijelu populacije, a ovisno o veličini tog dijela, može biti neophodno da se uključi više epitopa T-stanice u istu molekulu, ili da se alternativno pripravi višekomponentna vakcina u kojoj su komponente varijante OPGL koje se mogu razlikovati jedna od druge uvođenjem prirodnog epitopa T-stanice.
Ako je restrikcija korištenih T-stanica potpuno nepoznata (primjerice u situaciji u kojoj vakcinirana životinja ima slabo definirani sastav MHC), udio populacije koja je pokrivena specifičnim sastavom vakcine se može odrediti sljedećom formulom
[image]
- u kojoj pi, jeste frekvencija onih koji daju odgovor u populaciji na i epitopa T-stanice prisutnih u pripravku vakcine, a n je ukupni broj stranih epitopa T-stanice prisutnih u sastavu vakcine. Stoga, pripravak vakcine koji sadrži 3 strana epitopa T-stanice i ima frekvenciju odgovora u populaciji od 0.8, 0.7 i 0.6, dat će
1 -0.2x0.3x0.4 = 0.976
tj. 97.6 posto populacije će statistički povećavati odgovor na vakcinu posredovan MHC-II.
Gornja formula se ne odnosi na situaciju u kojoj je poznat više ili manje precizni restrikcijski obrazac korištenih peptida. Ako se, primjerice, neki peptidi vežu samo na humane MHC-II molekule kodirane HLA-DR aleli DR1, DR2, DR3, DR5 i DR7, tada je korištenje tih peptida skupa s drugim peptidom koj se veže na preostale MHC-II molekule kodiran s HLA-DR alelom će upotpuniti 100% pokrivenosti populacije koja je u pitanju. Slično, ako se drugi peptid veže samo DR3 i DR5, dodatni peptid uopće neće povećati pokrivenost. Ako se račun zasniva na populacijskom odgovoru samo na MHC restrikciju epitopa T-stanica u vakcini, udio pokrivene populacije specifičnim pripravkom vakcine se može odrediti pomoću sljedeće formule:
[image]
u kojoj Φj je suma frekvencija u populaciji aleičnog haplotipa koji kodiraju MHC molekule koje vežu bilo koji epitop T-stanice u vakcini i koji pripadaju j-tom od 3 poznata mjesta HLA (DP, DR i DQ); u praksi je prvo određeno koje će MHC molekule prepoznavati svaki epitop T-stanice u vakcini koje su zatim navedene po tipu (DP, DR i DQ) - a zatim su pojedine frekvencije različitih navedenih aleičnih haplotipa zbrojene za svaki tip pri čemu su dobiveni Φ1, Φ2 i Φ3.
Može se desiti da vrijednost p/ u formuli II prelazi odgovarajući teorijsku vrijednost Πi
[image]
- u kojo je vj suma frekvencija u populaciji kojom alelični haplotip kodira MHC molekule koje se vežu na i-ti epitop T-stanice u vakcini i koja pripada j-tom od 3 poznata mjesta HLA (DP, DR i DQ). To znači da je 1- Πi, -tom dijelu populacije
frekvencija odgovora f ostatak-i = (pi- Πi j )/(1-Πi). Stoga se formula III može podesiti tako da se dobije formula V
[image]
- u kojoj termin 1-fostatak-i je određen kao 0 ako je negativan. Valja napomenuti da formula V zahtjeva da svi epitopi imaju haplotip mapiran na identičan set haplotipa.
Zato, kada se biraju epitopi T-stanica koji će se uvesti u analog OPGL, važno je da se se uključe sva znanja o epitopima koji su na raspolaganju: 1) frekvencija onih koji daju odgovor u populaciji na svaki epitop, 2) podaci o restrikciji MHC i 3) frekvencija relevantnih haplotipa u populaciji.
Postoje brojni prirodni epitopi T-stanice "relaksirane specifičnosti" koji su aktivni u velikom udjelu pojedinaca životinjskih vrsta ili životinjske populacije i oni se preferirano uvode u vakcinu, što smanjuje potrebu za vrlo velikim brojem analoga OPGL u istoj vakcini.
Epitop relaksirane specifičnosti može prema ovom izumu biti prirodni etpitop T-stanice kao što su epitopi iz toksoidnog tetanusa (npr. P2 i P30 epitopi), toksoid difterije, virus influencije hemagluttinin (HA), i antigen P. falciparun CS.
Tijekom godina su identificirani brojni epitopi T-stanice relaksirane specifičnosti na. Posebno peptidi sposobni za da vežu na veliki dio HLA-DR molekula kodiranih različitim HLA-DR alelima su identificirani i svi oni su potencijalni epitopi T-stanice koji se mogu uvesti u analoge OPGL koji će se koristiti u ovom izumu. Vidi također su epitopi diskutiram" u sljedećim refenrcijama koji su svi ovdje ugrađeni citatom jesu: WO 98/23635 (Frazer IH etal., iz University od Oueensland); Southwood S etal. 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F etal. 1988, Nature 336: 778-780; Chicz RM etal. 1993, J. Exp. Med. 178: 27-47; Hammer J et al. 1993, Cell 74: 197-203; te Falk K et al. 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Zadnja referencija se također odnosi na HLA-DO i -DP ligande. Svi prikazani epitopi za korištenjem u ovom izumu su epitopi koji dijele zajednički motiv s ovima.
Alternativno se epitop može biti sintetski epitop T-stanice koji se može vezati na veliki dio MHC klase II molekula. U tom kontekstu pan Dr epitop peptida ("PARADE") opisan u WO 95/07707 i u odgovarajućem radu Alexander J et al. 1994, Innunity 1: 751-671 (oba ovdje ugrađena citatom) su prema ovom izumu interesantni kandidati za korištenje kao epitope. Valja napomenuti da najučinkovitiji PADRE peptidi opisani u ovim radovima nose D-aminokiseline na C- i N-terminalnom kraju., a da se poboljša stabilnost pri davanju. Međutim, ideja ovog izuma je prvenstveno u ugrađivanju važnih epitopa kao dijela modificiranog OPGL koji treba zatim biti enzimatski pocijepan unutar lizosomalnog dijela APC, a da se dozvoli ispoljavanje u sadržaju MHC-II molekule, pa stoga nije pogodno da se ugradi D-aminokiselina u epitope korištenih u ovom izumu.
Jedan posebno preferirani PADRE peptid ima aminokiselinsku sekvenciju AKFVAAWTLKAA ili imunološki učinak kao njegovu posljedicu. Ti i ostali epitopi koji nemaju ograničenje MHC su preferirani epitopi T-stanica koje treba koristiti u ovim analozima OPGL po ovoj metodi. Takvi epitopi vrlo relaksirane specifičnosti će činiti najjednostavniju cjelinu izuma u kojem je samo jedan modificirani OPGL prisutan u vakciniranom životinjskom imunom sustavu.
Kao što je gore spomenuto, modifikacija OPGL može također uključivati uvođenje prvog segmenta koji usmjeravaju modificirani OPGL u APC ili B-limfocit. Primjerice, prvi segment može biti specifično vezujući partner za specifični površinski antigen B-limfocita ili specifični površinski antigen APC. Poznati su mnogi takvi specifični površinski antigeni. Primjerice, segment može biti ugljikohidrat za koji postoji receptor na B-limfocitu ili APC (npr. manan ili manoza). Alternativno, drugi segment može biti hapten. Također kao fragment antitijela koji specifično prepoznaju površinu molekule APC ili limfocitima se mogu koristiti kao prvi segment (površinska molekule može npr. biti FCγ receptor makrofaga ili monocita, kao što je FCYRI ili alternativno bilo koji druga specifičnna oznaka površine kao što je CD40 ili CTLA-4). Valja napomenuti da se svi ti primjeri usmjeravanja molekule mogu koristiti kao dio adjuvansa, vidi dolje.
Kao alternativa ili suplement usmjeravanju modificiranog polipeptidnog OPGL u neke tipove stanica da bi se postigao povećani imuni odgovor, je moguće povećanje razine odgovora imunog susatava uključuvanjem gore spomenutog segmenta koji stimulira imuni sustav. Tipični primjeri takvih drugih segmenata su citokini i proteini podvrgnuti topinskom šoku ili molelukski šaperoni kao i njihovi učinkoviti dijelovi.
Pogodni citokini koji se mogu koristiti u ovom izumu su oni koji će normalno djelovati kao adjuvansi u pripravku vakcine t.j. primejrice interferon y (IFN-y), interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15), te stimulirajući faktor kolonije granulacitnog makrofaga (GM-CSF); alternativno funkcionalni dio molekule citokinona može biti pogodan kao drugi segment, vidi diskusiju dolje.
Prema izumu, pogodni proteini podvrgnuti topinskom šoku ili molekulski šaperoni koji se se koriste za drugi segment mogu biti HSP70, HSP90, HSC70, GPR94 (također poznat kao gp96, vidi VVearsch PA et al. 1998, Biochemistry 37: 5709-19) i CRT (kalretikulin).
Alternativno drugi segment može biti toksin kao što je listeiolicin (LOO), lipid A i termolabilan enterotoksin. Također su interesantne mogućnosti brojni mikrobakterijski derivati kao što je MDP (muramil dipeptid), CFA (kompletni Freudov adjuvans) i dister tetraloze TDM i TDE.
Također je važna cjelina uvođenje trećeg segmenta koji ubrzava ispojavanje modificiranog OPGL na imuni sustav. U struci je poznato nekoliko primjera tog principa. Primjerice, poznato je da se sidrenje lipidacije pamitoila u Borrelia burgdorferi proteinu OspA može koristiti tako da se dobije polipeptidi koji je autoadjuvans (vidi npr. WO 96/40718) izgleda da lipidirani proteini tvore strukture poput micela čija srž sadrži dijelove za sidrenje lipidacije polipeptida i ostali dijelovi molekule koje se pružaju od njih, rezultirajući višestrukom prezentacijom antigenske determinante. Zato, korištenje ovog i sličnih pristupa koristeći različita sidrišta lipidacije (npr. miristilna skupina farnezilna skupina i N-aciln digliceridna skupina) su preferirane cjeline iz izuma, posebice jer je ograničenje takve lipidacije u rekombinatno nastalom proteinu jednostavno i samo zahtjeva korištenje npr. prirodnih signalnih sekvencija kao partnere za modificirane polipeptidine OPGL. Daljnja mogućnost je korištenje C3d fragmenta komplementarnog faktora C3 ili samo C3 (vidi Dempsey etal. 1996, Science 271, 348-350 i Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).
Alternativna cjelina izuma koja također rezultira preferiranim ispoljavanjem višestrukih (npr. barem 2) kopija važnih epitopalnoh regija OPGL u imunom sustavu je kovalentno vezivanje OPGL, podsekvenciji ili njegovim varijantama s određenim molekulama. Primjerice, mogu se koristiti polimeri npr. ugljikohidrati kao što je dektran, vidi Lees A et al. 1995, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A et al. 1990, J. Immunol. 145: 3594-3600, ali također manoza i mana su korisne alternative. Integralni membranski proteini iz nor, e. coli i ostalih bakterija su također korisni konjigacijski partneri. Tradicionalni nosač molekula kao što je hemocianin (KLH), toksoidtetanusa, toksoid difeteria i goveđi serum albumin (BSA) su također preferirani i korisni partneri za konjugaciju.
Izgleda da su neke regije prirodnog OPGL najpogodnije za izvođenje modifikacije. Zbog strukturnih odnosa s TNF-a i ostalim članovima obitelji faktora tumorne nekroze, predviđeno je da uvođenjem epitopa T-stanice ili ostalih modifkacija u područja definirana kao 170-192, 198-218. 221-246. 256-261 ili 285-316 (numeriranje aminokiselina u SEQ ID br. 4,6 i 12) će najvjerojatnije pokazivati željene rezultate. Ti položaji se odnose na OPGL laboratorijskih glodavaca - odgovarajuće pozicije humanih molekula jesu 171-193, 199-219. 222-247, 257-262, te 286-317 (numeriranje aminokiselina u SEQ ID br. 2).
Razlozi koji ističu ove izabrane dijelove su: a) zadržavanje poznatih i predviđenih epitopa B-stanice, b) zadržavanje tercijarne strukture itd. Pri bilo kojoj brzini, kao što je gore diskutirano, jednostavno je snimiti set modificiranih molekula OPGL u koje su uvedeni epitopi T-stanice na različita mjesta.
Kako najpreferiranija cjelina ovog izuma obuhvaća smanjivanje aktivnosti humanog OPGL, zato je preferirano da je gore diskutirani polipeptidni OPGL humanog porijekla. U toj cjelini je specijalno preferirano da su humani polipeptidni OPGL modificirani supstitucijom najmanje jedne aminokiselinske sekvencije u SEQ ID br 2 (ili u polipeptidu u kojem Cys-221 u SEQ ID br 2 supstituiran serinom) s najmanje jednom aminokiselinksom sekvencijom čija je duljina jednaka ili različita i sadrži strani TH epitop. Supstituirani aminokiselinski ostaci su odabrani od ostataka 257-262, 289-303 i 222-243 u SEQ ID br 2. Razlog ovakvih konstrukcija je diskutiran detaljno u primjerima.
Formulacije OPGL i modificiranog poipeptdino OPGL
Utjecanje na ispoljavanje polipeptidnog OPGL ili modificiranih polipeptidnih OPGL na životinjski imuni sustav davanjem životinjama formulaciju polipeptida je u skladu s općim znanjem struke.
Prirava vakcina koje sadrže peptidne sekvencije kao aktivne komponente je općenito dobro poznata, kao što je prikazano u U.S. Patentima 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; te 4,578,770, svi ovdje ugrađeni citatom. Tipično se takve vakcine pripravljaju kao tekuće otopine ili suspenzije koje se mogu injektirati; kruti oblici pogodni za otopine ili suspenzije , te tekućina koja se također može pripraviti prije injektiranja. Pripravak također može biti emulgiran. Aktivni imunogenčni sastojak se često miješa s ekcipijentom koji je farmaceutski prihvatljiv i kompatibilan s aktivnim sastojkom. Pogodni ekscipijensi su primjerice voda, fiziološka otopina, dektroza, glicerol, etanol ili slično te njihova kombinacija. Nadalje, po želji vakcina može sadržavati malu količinu dodatnih tvari kao što su klizna sredstva ili emugatori, sredstva za puferiranje pH, adjuvansi koji povećavaju učinkovitost vakcine; niže vidi detaljnu diskusiju o adjuvansima.
Vakcine se uobičajeno daju parenteralnom injekcijom, primjerice subkutalno, intrakutalno, intradermano, subdermano ili intramuskuarno. Nadalje, formulacije koje su pogodne za ostale načine davanja uključuju supozitorije, te u nekim slučajevima oralne, bukalne, sublingvalne, intraperitonalne, intravaginalne, analne, epiduralne, spinalne i intrakrainalne formulacije. Za supozitorije tradicionalna veziva i nosači mogu uključivati primjerice polialkalen, glikole ili trigliceride; takvi supozitoriji mogu se tvoriti od smjese koja sadrži aktivni sastojak i rasponu od 0.5% do 0%, preferirano 1-2%. Oralne formulacije uključuju normalno korištene ekcipijente kao što je primjerice manitol farmacetuskog stupnja čistoće, laktoza, škrob, magnezijev strearat, natrijev saharin, celuloza, magnezijev karbonat i slično. Ti pripravci mogu tvoriti otopine, suspenzije, tablete, pilule, kapsule, formulacije s odgođenim djelovanjem ili praške koji sadrže 10-95% aktivnog sastojka, preferira-no 25-70%. Za oralne formulacije je toksin kolere interesantni formulacijski partner (a također i konjugacijski partner).
Polipeptidi se mogu formulirati u vakcine u neutralnom obliku ili obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju soli nastale adicijom (nastale sa slobodnom aminoskupinom peptida) anorganskih kiselina kao što je primjerice klorovodična kiselina ili fosforna kiselina, ili s takvih organskih kiselina kao što je octena, oksalna, vinska, bademova i slične. Soli nastale sa slobodnim karboksilnoim skupinama mogu također biti izvedene iz anorganskih baza kao što je primjerice natrij, kalij, amonij, kalcij ili željezo hidroksid, te iz takvnih orgnaskih baza kao što je izopropilamin, trimetilamin, 2-etilaminoetanol, histidin, prokain i slično.
Vakcine se daju na način koji je kompatibilan s formulacijom doze, i u takvoj količini koja će biti terapijski učinkovita i imunogena. Količina za davanje ovisi o osobi koja je pod tretmanom, uključujući npr. kapacitet imunog sustava pojedinca da podigne imuni odgovor i željenog stupanj zaštite. Pogodni rasponi doze kreću se do razlike nekoliko stotina mikrograma aktivnog sastojka po vakcini s preferiranim rasponom od oko 0.1 µg 2000 µg (čak su razmatrane i veće količine u rasponu od 1-10 mg) kao što je raspon od oko 0.5 µg do 1000 µg, preferirano u rasponu od 1 µg do 500 µg, a posebno preferirano u rasponu od oko 10 µg do 100 µg. Pogodan režim za početak davanja i ponovljena imunizacija su također primjenjljivi ali su tipizirani početnim davanjem koje slijedi inokulaciju ili druga davanja.
Način primjene može široko varirati. Primjenljiva je bilo koja konvencionalna metoda davanja vakcine. To uključuje oralnu primjenu na krutoj fiziološki prihvatljivoj osnovi ili fiziološki prihvatljivu disperziju, parenteralno davanje injekcijom ili slično. Doza vakcine će ovisiti o načinu davanja i prilagoditi će se starosti osobe koja će biti vakciniranai i vrsti formulacije antigena.
Neki polipeptidi vakcine su dovoljno imunogeni u vakcini, ali će za neke druge imune odgovore biti bolje ako vakcina daljnje sadrži adjuvanse.
Poznate su razičite metode postizanja učinka adjuvansa za vakcine. Opći principi i metode su opisane detaljno u "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (izd.), John Wiley & Sins Ltd, ISBN 0-471-95170-6, i također u "Vaccines: New Generation Immunologica Adjuvants", 1995, reoriadis . etal. (izd.) Plenum Press, New York, ISBN 0-306-4583-9, a oba su ovdje ugrađeni citatom.
Posebno je preferirano korištenje adjuvansa koji mogu olakšavati uništavanje autotolerancije na autoantigene, a to je suštinski važno u sučaju kad se koristi nemodificiran OPGL kao aktivni sastojak u autovakcini. Neograničavajući primjeri pogodnih adjuvansa su odabrani iz skupine koja se sastoji od imunousmje-ravajućih adjuvansa, imunomoduirajućih adjuvansa kao što je toksin, citokin i mikobakterijski derivati, formulacije ulja, polimera, adjuvansa koji tvore micele, saponina, matriksi imunostimulirajuće kompleksa (ISCOM matrica) čestica, DDa, aluminijskog adjuvansa, DNA adjuvansa, γ-inulina i adjuvansa koji se može kapsulirati. Općenito, bit će naznačeno da se gornji prikaz odnosi na sredstva korisna kao prvi, drugi i treći segment u analozima se također odnose mutatis mutandis na njihovo korištenje kao adjuvansa vakcine iz izuma.
Primjena adjuvansa uključuje upotrebu sredstva kao što je aluminijev hidroksid ili fosfat (alum), koji se obično koristi kao 0.05 do 01 postotna otopina u puferiranoj fiziološkoj otopini u smjesi sa sintetskim šećernim polimerima (npr. Carbopo® korišten kao 0.25 postotna otopina, agregacija proteina u vakcini djelovanjem toplinom u rasponu tepmerature između 70 °C do 101 °C u periodu od 30 sekundi do 2 minute, a također je moguće postići agregaciju pomoću sredstva za umrežavanje. Mogu se također koristiti agregacija reaktiviranjem s antitijelima koji su tretirani pepsinom (Fab fragmenti) u albumin, smjesa bakterijskih stanica kao što je C. pravum ili endotoksini ili lipopolisaharidne komponente ili gram-negativnih bakterija, emulzija u fiziološki prihvatljivom uljnom vehikulu kao što je manidni monooleat (Aracel A) ili emulzija s 20 postotnom otopinom perfluorugljika (Fluosol-DA) korištena kao blok supstitut. Također je preferirano je miješanje s uljem kao što je skvalen i IFA.
Prema izumu DDA (dimetildioktadecilamonijev bromid) je interesantan kandidat da adjuvans kao i DNA i γ-inulin, ali također su Freudov kompletan i nekompletan adjuvans kao i quillaja saponons kao što su i OuiIA i QS21 interesantni kao RIBI. daljnje mogućnosti su monofosforil-lipidi a (MPL), gore spomenuti C3, C3d i muramil dipeptidi (MDP).
Formulacije liposoma također prenose učinak adjuvansa, pa su stoga liposomski adjuvansi preferirana u ovom izumu.
Također je adjuvans tipa imunostimulirajuće matrice (ISCOM® matrica) preferiran izbor prema izumu, posebice jer je pokazano da takav tip adjuvansa može povećati ekspresiju MHC klase II pomoću APC. ISCOM® matrica se sastoji od (može biti frakcionirana) saponina (tritepenoidi) iz Ouillaja saponaria, kolesterola i fosfolipida. Kada se miješa s imunogenim proteinom, nastale formulacija je ono što je poznato kao ISKOM šestica u kojoj saponin čini 60-70% w/w, kolesterol i fosfolipid 10-15% w/w, a protein 1-15% w/w.
Detalji koji se odnose na sastav i korištenje imunostimulirajućih kompleksa mogu npr. biti nađeni u gore spomenutim udžbenicima koji prikazuju adjuvanse, ali također u i Morein B etal. 1995 Clin, Immunother. 3: 461-475 kao i Barr IG i Mitchell GF, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 (oba ovdje ugrađena citatom) prikazuju korisne upute za pripravu kompletnih imunostimulirajućih kompleksa.
Još jedna interesantne (pa stoga preferirana) mogućnost postizanja učinka adjuvansa je uporaba tehnike opisane od Gosselin et ai, 1992 (koji je ovdje ugrađen citatom). Ukratko, ispoljavanje relevantnih antigena kao što je antigen u ovom izumu se može povećati konjugiranjem antigena s antitijelima (ili fragmentima antitijela koja vežu antigen) na Fcy receptore na monocitima/makro-fagima. Posebno su konjugati između antigena i anti-FcyRI pokazali da povećavaju imunogeničnost za svrhe vakciniranja.
Ostale mogućnosti korištenja usmjeravajućih i imunomodulirajućih tvari (i.a. citokini) koji su gore spomenuti kao kandidati za prvi i drugi segment u modificiranoj verziji OPGL. S tim u vezi mogući su i citokini koji sintetski induciraju citokine kao što je poli I:C.
Pogodni bakterijski derivati su odabrani od skupine koja se sastoji od muramilnog dipeptida, kompleta Freudovog adjuvansa, RIBI i diestera trehaloze kao što je TDM i TDE.
Pogodni imunousmjeravajući adjuvansi su odabrani od skupine koja se sastoji od CD40 liganda i CD40 antitijela ili njihovih specifično vezanih fragmenata (vidi gornju diskusiju), manoze, Fab fragmenta i CTLA-4.
Pogodni polimerni adjuvansi su odabrani od skupine koja se sastoji od ugljikohidrata kao što je dekstran, PEG, škrob, manan i manoza; plastičnih polimera kao što je lateks u obliku lateksnih zrna.
Sljedeći interesantan macin moduliranja imunog odgovora je uključivanje imunogena OPGL (može zajedno s adjuvoansom i farmaceutski prihvatljivim nosačima i vehikulima) u "virtualni limfni čvor" (VLN) (odgovarajuća medicinska naprava razvijena je od lmmunoTherapy, Inc. 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (tanka tubularna naprava) imitira strukturu i funkciju limfnog čvora. Umetanje VLN ispod kože stvara mjesto sterilne upale s porastom citokina i kemokina. T- i B- stanice kao i APC brzo odgovaraju na signal opasnosti koji je na mjestu upale i akumuliraju se unutar porozne matrice VLN. Pokazano je da je neophodna doza antigena potrebna za postizanje
imunog odgovora na antigen smanjena kada se koristi VLN i da imuna zaštita pri vakcinaciji koja koristi VLN prelazi konvencionalnu imunizaciju koristeći Ribi kao adjuvans. Tehnologija je i.a. opisana ukratko u Gelber C et al. 1998 "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts od Inmmunegens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Mode" u "From the Laboratory to the Clinic, Book od Abstracts, October 12th - 15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California".
Očekuje se da bi vakcina dana 1-6 puta godišnje, kao stoje 1,2,3,4,5 ili 6 puta godišnje osobi koja za tim ima potrebu. Prethodno je pokazano da pamćenje inducirane imunosti korištenjem preferiranih autovakcina prema izumu nije stalno, pa zato imuni sustav ima potrebu za periodičnim izazovom s OPGL ili modificiranim polipeptidnim OPGL
Zbog genetskih varijacija, različiti pojedinci mogu reagirati na isti polipeptid s imunim odgovorom različite jakosti. Zato vakcina prema ovom izumu može sadržavati nekoliko različitih polipeptida da bi se povećao imuni odgovor, vidi također gornju diskusiju koja se tiče izbora uvođenja stranog epitopa T-stanice. Vakcine mogu sadržavati dva ili više polipeptida, pri čemu su svi polipeptidi kao što su gore definirani.
Vakcine mogu sadržavati 3-20 različitih modificiranih ili nemodificiranih polipeptida, kao što je 3-10 različitih polipeptida.
Vakciniranje nukleinsom kiselinom
Kao alternativa klasičnom davanju vakcine zasnovane na peptidu, tekhnologija vakcinacije nukleinskom kiselinom (također poznata kao "imunizacija nukleinskom kiselinom", "genetska imunizacija" i "imunizacija genom") nudi brojne atraktivne karakteristike.
Prvo, nasuprot tradicionalnom pristupu vakcini, vakcinacija nukleinskom kiselinom ne zahtjeva produkciju konzumiranog resursa u velikim količinama imunogeničnog sredstva (npr. fermentacije mikroorganizama koji produciraju modificirani OPGL na industrijskoj skali). Nadalje, nema potrebe za napravom za pročišćavanje i restruktuiranje shemi imunogena. Konačno, kako se vakcinacija nukleinske kiseline oslanja na biokemiju vakciniranog pojedinca, a da se producira produkt ekspresije uvedene nukleinske kiseline, očekuje se da dođe do optimuma post-translacijskog procesiranja produkta ekspresije; to je posebice važno u slučaju autovakcinacije jer, kao što je gore spomenuto, značajni dio originalnih OPGL epitopa B-stanice se može sačuvati u modificiranoj molekuli i kako se epitopi B-stanice u načeku mogu sastojati od dijelova bilo koje (bio)molekule (npr. ugljikohidrat, lipid, protein itd.). Zato, prirodni način glikozilacije i lipidacije imunogena može biti vrlo značajan dio ukupne imunogenost, a to se najbolje osigurava domaćinom koji proizvodi imunogen.
Zato preferirana cjelina sadrži učinkovito ispoljavenje modificiranog OPGL u imunom sustavu uvođenjem nukleinske kiselina (kiselina) koja kodira modificirani OPGL u životinjske stanice i iz toga se dobiva in vivo ekspresija u stanicama u koje je uvedena nukleinska kiselina (kiselina).
O ovoj cjelini, uvedena nukleinska kiselina je preferirano DNA koja može biti u obliku same DNA, DNA formulirane s nabijenim ili nenabijenim lipidima, DNA formulirane u liposomima, DNA uključene u virusni vektor, DNA formulirane s proteinom ili polipeptidom koji olakšava transfekciju, DNA vezan na internu molekulu koja je nosač, DNA kapsulirane u hitin ili hitosan, te DNA formulirane s adjuvansom. U ovom kontekstu primijećeno je da su gotovo sve tradicionalne fromulacije vakcine koriste za formulaciu DNA vakcine. Zato sve prikazano ovdje koje se odnosi na korištenje adjuvansa u kontekstu vakcina baziranih na polipeptidima se primjenjuju mutatis mutandis na njihovu upotrerbu u tehnologiji vakcijancije nukleinskom kiselinom.
Načini davanja i sheme davanja vakcina baziranih na polipeptidima koji su gore detaljno prikazani, mogu se primijeniti za vakcine nukleinske kiseline iz izuma i sve gornje diskusije koje se odnose na načine davanja i sheme davanja polipeptida primjenjuju se mutatis mutandis na nukleinske kiseline. Tome treba dodati da vakcine nukleinske kiseline mogu biti pogodne za intravenozno davanje. Nadalje, dobro je poznato u struci da se vakcine nukleinske kiseline mogu davati korištenje tzv. genskog pištolja, te zato taj i ekvivalentan način davanja je dio ovog izuma. Konačno, također je prikazano da upotreba VLN pri davanju nukleinskih kiselina daje dobre rezultate i stoga je taj određeni način davanja posebno preferiran.
Nadalje, nukleinska kiselina (kiseline) korištena kao sredstva za imunizaciju može sadržavati regije koje kodiraju prvi, drugi i/ili treći segment, npr. u obliku imunomodulirajućih tvari koje su opisane gore, kao što je citokin koji je diskutiran kao adjuvans. Preferirana verziji ove cjeline obuhvaća postojanje regije kodiranja za nalog i regije kodiranja za imunomodulator u različitim čitajućim okvirima ili barem da su kontrolirani različitim promotorima. Tako je izbjegnuto da se analog epitopa stvara kao partner za fuziju imunomodulatora. Alternativno se mogu koristiti dva različita nukleotidna fragmenta, ali je to manje preferirano jer je prednost osiguravanja koekspresije kada su uključene obje regije kodiranja u istu molekulu.
Prema tome, izum se također odnosi na pripravke za izazivanje produkcije antitijela na OPGL, a pripravak sadrži
- fragment nukleinske kiseline ili vektor iz izuma (vidi dolje diskusiju o vektorima), te
- farmaceutski i imunološki prihvatljiv vehikul i/ili nosač i/ili adjuvans, kao što je gore diskutirano.
Pod normalnim uvjetima, OPGL varijanta koja kodira nukleinsku kiselinu je uvedena pod kontrolom virusnog promotora. Za detaljnu diskusiju vektora prema ovom izumu, vidi donju diskusiju. Također postoji detaljni prikaz koji se odnosi na formulacije i korištenje nukleinske kiseline za vakcine, vidi Donnelly JJ etal. 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 i Donnelly JJ etal. 1997, Life Sciences 60:163-172. Oba su ovdje ugrađena citatom.
Žive vakcine
Treća alternativa za učinkovitu ispoljavanje modificiranog OPGL na imuni sustav je korištenje tehnologije žive vakcine. Živom vakcinacijom djelovanje na imuni sustav je izvedeno davanjem životinji nepatogenih mikroorganizama koji su transformirani fragmentom nukleinske kiseline koja kodira modificirani OPGL ili s vektorom koji sadrži takav fragment nukeinske kiseline. Pogodan nepatogeni mikroorganziam može biti bilo koja pogodna oslabljena bakterijska vrsta (oslabljena pasažom ili uklanjanjem patogenog produkta ekspresije tehnologijom rekombinantne DNA) npr. Mycobacterium bovis BOG., nepatogen Streptococcus spp., E. coli, Samonella spp., Vibrio Cholerae, Shigea itd. Pregledni radovi koji obrađuju prirpavu živih vakcina prema dosadašnjim spoznajama mogu biti nađeni u Saliou P, 11995 Rev. Prat. 45: 1492-1496 i Waker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990, ova ovdje ugrađena citatom. Za detalje o fragmentima nukleinskih kiselina i ovdje korištenih vektora u takvim živim vakcinama vidi donju diskusiju.
Kako alternativa živim bakterijskim vakcinama, fragmenti nukleinske kiseline mogu biti ugrađeni u neživu vakcinu s virusnim vektorom kao što je vrsta vakcine od bilo kojeg pogodnog pox virusa.
Normalno se nepatogeni mikroorganizam ili virus daje samo jedanput životinji, ali u nekim slučajevima može biti neophodno da se mikroorganizam da više od jedno puta u životu, a da se održi zaštitna imunost. Čak je razmatrano da će
imunizacijske sheme koje su detaljno prikazane gore za vakcinaciju polipeptidom biti korisne kad se koristi živa ili virusna vakcina.
Alternativno je živa ili virusna vakcinacija kombinirana s prethodnom ili sljedećom vakcinacijom polipeptidom i/ili nukleinskom kiselinom. Primjerice, moguće je da se izazove primarna imunizacija sa živom ili virusnom vakcinom koju slijedi ponovljena imunizacija korištenjem polipeptida ili nukleinska kiseline.
Mikroorganziam ili virus se može transformirati nukleinskom kiselinom (kiselinama) koja sadrži regiju koja kodira prvi, drugi i/ili treći segment, npr. u obliku imunomodulirajućih tvari koje su opisane gore, kao što je citokin koji je diskutiran kao koristan adjuvans. Preferirana verziji ove cjeline obuhvaća postojanje regije kodiranja za nalog i regiju kodiranja za imunomodulator u različitim otvorenim čitajućim okvirima ili barem da su kontrolirani različitim promotorima. Tako je izbjegnuto da se analog epitopa stvara kao partner za fuziju imunomodulatora. Alternativno se mogu koristiti dva različita nukleotidna fragmenta kao sredstva za transformiranja. Naravno, (postojanje drugog i/ili trećeg segmenta u istim čitajućim okvirima može omogućiti ekpresiju produkta, analoga iz izuma i takva cjelina je posebno preferirana prema ovom izumu.
Korištenje metode iz izuma u tretmanu bolesti
Bit će razumljivo iz gornje diskusije da uvjeti metode iz izuma dozvoljavaju kontrolu bolesti karakterizira velikim gubitkom mase kosti. U tom kontekstu bolest osteoporoza je ključni cilj za inventivnu metodu, ali je također gubitak kosti povezan s kompliciranim lomovima kostiju mogući cilj za tretman/poboljšanje. Zato je važna cjelina metode iz izuma za smanjivanje aktivnosti OPGL sadrži tretman i/ili prevenciju i/ili poboljšanje osteoporoze ili ostalih stanja karakteriziranih povećanom resorpcijom kosti, a metoda sadrži smanjivanje aktivnosti OPGL prema metodi iz izuma do one mjere da brzina resorpcije kosti bude značajno smanjena.
U ovom kontekstu takvo značajno smanjivanje resorpcije kosti je najmanje 3% u usporedbi s patološkom brzinom, ali veći postoci su razmatrani, kao najmanje 5%, najmanje 7%, najmanje 9%, najmanje 11%, najmanje 13%, najmanje 15%, najmanje 17%, čak i veći očekivani postoci, kao što je najmanje 20% ili čak najmanje 30%. Posebice je preferirano da smanjivanje resorpcije kosti rezultira u inverziji balansa između tvorbe kosti i resorpcije, tj. da je brzina tvorbe kosti dovedena da bude veća od brzine resorpcije. Naravno, taj disbalans ne treba održavati (jer će rezultat biti osteopetroza), ali pažljivom kontrolom broja imunološkog impakta od imunizacije u pojedinca koji ima potrebu, moguće je dobiti balans tijekom vremena čiji je rezultat održavanjem mase kosti. Alternativno, ako u pojedincu metoda iz izuma ne može zaustaviti gubitak kosti, metoda iz ovog izuma se može (u kombinaciji s drugim poznatim metodama za smanjivanje gubitak kosti u pacijenata koji imaju osteoporozu) koristiti da se dobije značajno smanjivanje gubitka kosti, pa stoga produljiti vrijeme dok je dovoljna koštana masa prisutna u pojedincu.
Metode za mjerenje brzine resoprcije i stvaranja kosti su poznate u struci. Moguće je biokemijskim testom mjeriti brzinu resporacije mjerenjem koncentracije nekih fragmenata kolagena tipa 1 u krvi (vidi WO 93/15107 i WO 94/148844). Alternativno, brzina gubitka kosti se može mjeriti fizičkim načinima; prikazi koji predstavljaju metode za procjenjivanje mase kosti neinvazivnim fizikalnim metodama mogu se naći u WO 88/06862, WO 94/12855, WO 95/14431 i WO 98/00643.
Peptidi. polipeptidi i pripravci od njih u ovom izumu
Bit će očito iz gore izloženog da je ovaj izum zasnovan na konceptu imunizacije pojedinaca na antigen OPGL da bi se indirektno dobila smanjena aktinvost osteoklasta. Preferirani način dobivanja takve imunizacije je korištenje modificiranih verzija OPGL, dakle molekula koje nisu bile prethodno poznate.
Vjeruje se da je modificirana molekula OPGL ovdje diskutirana nova sama po sebi, pa je stoga važan dio izuma koji se tiče analoga OPGL koji je izveden iz životinjskog OPGL u koji je uvedena modifikacija koja ima rezultat imunizacije životinje s analogom koji izaziva stvaranje antitijela koji specifično reagiraju s nemodificiranim polipeptidnim OPGL Peferirano, priroda modifikacije odgovara cjelinama metoda iz izuma u kojima se koristi modificirani OPGL. Zatom je ovdje uključen bilo koji prikaz koji se tiče analoga OPGL iz izuma i bilo koji prikazi koji se odnosi na mutatis mutandis opis tih analoga.
Valja napomenuti da preferirane molekule OPGL sadrže modifikacije koje kao rezultat u polipeptidu imaju sekvencijsku identičnost najmanje 70% s OPGL ili kao posljedica toga duljinu od najmanje 10 aminokiselina. Preferirane su veće identične sekvencije, npr. najmanje 75% ili najmanje 80, 85, 90 ili 95%. Identičnost sekvencija proteina i nukleinskih kiselina se može računati kao (Nref-Nraz)·100 Nref, pri čemu je Nraz ukupni broj neidentičnih ostataka u dvjema uspoređenim sekvencijama, a Nref je broj aminokiselinskih ostataka u jednoj od sekvencija. Tako će DNA sekvencija AGTCAGTC imati identičnost od 75% sekvenciji AATCAATC (Nraz=2 i Nref=8).
Izum se također tiče pripravaka korisnih u primjeni metode iz izuma. Zato se izum također odnosi na imunogene pripravke koji sadrže imunogeno učinkovitu količinu polipeptidnog OPGL koji je formuliran skupa s imunološki prihvatljivim adjuvansom, tako da se razbije autiotolerrancija životinje prema polipeptidnom OPGL, a prirpavak nadalje sadrži farmacetuski i imunološki prihvatljivi razrjeđivač i/ili vehikul i/ili nosač i/ili ekcipijent. Drugim riječima, ovaj dio izuma opdnosi se na formulacije prirodnih polipeptidnih OPGL koji su opisani u vezi s cjelinom koja je metoda u ovom izumu.
Izum se također odnosi na imunogeni pripravak koji sadrži imunogeno učinkovitu količinu gore definiranog analoga OPGL, a rečeni pripravak nadalje sadrži farmaceutski i imunološki prihvatljivi razrjeđivač i/ili vehikul i/ili nosač i/ili ekcipijent i/ili adjuvans. Drugim riječima, ovaj dio izuma tiče se formulacija s modificiranim OPGL, u suštini kao što je ovdje opisano.
Izbor adjuvansa, nosača i vehikula je prema ovom je na liniji koja je gore diskutirana kada se pozivalo na formulaciju modificiranog i nemodificiranog OPGL za upotrebu u metodi izuma za smanjivanje aktivnosti OPGL.
Polipeptidi se pripravljaju prema metodama koje su dobro poznate u struci. Dulji polipeptidi se normalno pripravljaju tehnologijom rekombinanacije gena uključujući uvođenje sekvencije nukleinske kiseline koja kodira analog OPGL u pogodnom vektoru, transformacijom pogodne stanice domaćina s vektorom, ekspresijom sekvnecije nukleinske kiseline, izolacijom produkta ekspresije iz stanice domaćina ili iz supernatanta njene kulture, te potom čišćenja i moguće daljnje modifikacije, npr. restrukturiranjem ili prevođenjem u derivate.
Kraći peptidi se preferirano pripravljaju prema dobro poznatim tehnikama sinteze peptida na krutoj ili tekućoj fazi. Međutim, nedanvi napredak u toj tehnologiji vraća mogućnost priprave polipeptida pune duljine i proteina tim načinom, pa je stoga također unutar obujma ovog izuma u pripravi dugih građevnih jedinica sintetskom metodom.
Fragmenti nukleinskih kiselina i vektori u izumu
Bit će razumljivo iz gornjeg prikaza da se modificirani polipeptidni OPGL mogu pripraviti tehnologijom rekombinantnog gena, ali također i kemijskom sintezom ili semisintezom; zadnje dvije mogućnosti su posebno važne kada se modifikacija sastoji od vezivanja na protein nosača (kao što je KHL, toksoid difterije, toksoid tetanusa i BSA) i neproteinske molekule kao što su polimeri ugljikovodika i naravno također kada modifikacija sadrži adiciju bočnog lanca ili bočne skupine na polipeptidni derivirano peptidni lanac OPGL.
Za svrhe tehnologije rekombinantnog gena, i naravno također za svrhe imunizacije nukleinskom kiselinom, fragmenti nukleinske kiseline koje kodiraju modificirani OPGL su važni kemijski produkti. Zato se važan dio izuma odnosi na fragment nukleinske kiseline koji kodira analog OPGL, tj. polipeptid izveden od OPGL koji sadrži neutralnu OPGL sekvenciju kojoj je dodan i umetnut partenr za fuziju, ili preferirano sadrži polipeptid izveden od OPGL u koji je uvedena stani epitop T-stanice načinom insercije i/ili adicije, preferirano metodom supstitucije i/ili uklanjanja. Fragmenti nukleinske kiseline iz izuma su DNA ili RNA fragmenti.
Fragmenti nukleinskih kiselina iz izuma će normalno biti insertirani u pogodne vektore za tvorbu vektora za kloniranje ili ekspresiju koji nose fragmente nukleinske kiseline iz izuma; takvi novi vektori su također dio izuma. Detalji koji se tiču konstrukcije tih vektora iz izuma će biti diskutiram' dolje u kontekstu transformiranih stanica i mikroorganizama. Vektor može, ovisno o svrsi i tipu aplikacije biti u obliku plazmida, faga, kosmida, mini-kromosoma ili virusa, ali također sam DNA koji je sam eksprimiran povremeno u nekom stanicama je važan vektor. Preferirano su vektori za kloniranje i ekspresiju iz izuma sposobni na autonomnu replikaciju, zato omogućavaju veliki broj kopija za svrhe velike razine ekspresije ili velike razine replikacije za sljedeće kloniranje.
Opće okvir vektora iz izuma sadrže sljedeće karakteristike u 5&-3& smjeru i vezama: promotor ekspresije fragmenta nukleinske kiseline iz izuma, koja može biti sekvencija nukleinske kiseline koja kodira vodeći peptid omogućavanjem sekrecije (u ekstracelularnu fazu ili gdje je primjenljivo u periplazmu) ili integracijom u membranu polipeptidnog fragmenta, fragment nukleinske kiseline iz izuma a nukleinska kiselina može kodirati terminator. Kada se operira s ekpresijskim vektorima u produkciji vrsta ili staničnih linija to je za svrhu genetske stabilnosti transformiranih stanica preferirano je da je vektor pri uvođenju u stanicu domaćina integriran u genom stanice. Nasuprot tome, kada se radi s vektorima koji će se koristiti za djelovanje in vivo ekspresije u životinji (tj. kada se koristi vektor DNA vakcine), zbog razloga sigurnosti preferirano je da vektor ne može biti integriran u genom domaćina; tipično se koristi sama DNA ili neintegrirani virusni vektori, a izbor je dobro poznat stručnjacima.
Vektori iz izuma se koriste da transformiraju stanicu domaćina da se producira modificirani polipeptidni OPGL iz izuma. Takve transformirane stanice, koje su također dio izuma mogu biti kultivirane ili stanične linije korištene za propagaciju fragmenata nukleinskih kiselina i vektora iz izuma, ili se koriste za rekombinantnu produkciju modificiranih polipeptidnih OPGL iz izuma. Alternativno, transformirane stanice mogu biti pogodne za žive vakcine u kojima je fragment nukleinske kiseline (jedna ili više kopija) insertirana tako da utječe na sekreciju ili interakciju u bakterijsku membranu ili stanični zid modificiranog OPGL
Preferirane transformirane stanice iz izuma su mikroorganizmi kao što je bakterija (kao što su vrste Escherichia [npr. E. coli], Bacillus [npr. Bacius subtilis], Samonela ili Micobacterium [preferirano nepatogene npr. M bovis BC]), gljivice (kao što je Saccharomyces cerevisiae) i protozonas. Alternativno, transformirane stanice se izvode iz multicelularnih organizama kao što je kvasac, stanice insekta, stanice biljke ili stanice sisavca. Najpreferiranije su stanice dobivene od ljudi, vidi donju diskusiju o staničnim linijama i vektorima. Nedavni rezultati s pokazali veliku mogućnost upotrebe komercijalno pristupačne Drosophila melanogaster stanične linije (Schneider 2 (S2)stanična linija i vektorski sustav od Invitrogen) za rekombinantnu produkciju polipeptida u laboratoriju prijavitelja i stoga je taj ekspresijski sustav posebno preferiran.
Za svrhe kloniranja i/ili optimiziranja ekspresije preferirano je da su transformirane stanice sposobne za replikaciju fragmenta nukleinske kiseline iz izuma. Stanice koje eksprimiraju fragmente nukleinske kiseline su preferirana cjelina u ovom izumu i one mogu biti korištene za produkciju na malo i veliko modificiranog OPGL ili u slučaju nepatogenih bakterije, kao sastavni dio žive vakcine.
Kada se pripravlja modificirani OPGL iz izuma transformiranjem stanica, pogodno je, mada nije suštinski, da je ekspresijski produkt eksportiran u medij kulture ili je nađen na površini transformirane stanice.
Kada je identificirana stanica koja je učinkovit proizvođač, preferirano je da se na toj osnovi utvrdi stanična linija koja nosi vektor iz izuma u koja eksprimira fragment nukleinske kiseline koji kodira modificirani OPGL. Preferirano, ta stabilna stanična linija izlučuje ili nosi analog OPGL iz izuma, pa stoga olakšava njegovo pročišćavanje.
Općenito, vektori plazmida koji sadrže replikon i kontrolnu sekvenciju koji se izvodi iz vrsta kompatibilnim sa stanicama domaćina se koriste u vezi s domaćinima. Vektor obično sadrži mjesto replikacije kao i markirajuću sekvenciju koja je sposobna omogućiti fenotipsku selekciju u transformiranim stanicama. Primjerice, E coli je tipično transformirana korištenjem pBR322 plazmida izvedenog iz vrste E. coli (vidi npr. Bolivar et al. 1977). Plazmid pBR322 sadrži gene za rezistenciju na ampicilin i tetraciklin i stoga je moguće lako identificiranje rasformiranih stanica. Plazmid pBR ili drugi plazmid ili fag mikroorganizma mora također sadržati ili biti modificiran da sadrži promotore koji se mogu koristiti prokariotski mikroorganizmi za ekspresiju.
Ti promotori se najuobičajenije koriste pri konstrukciji rekombinantne DNA koja sadrži B-laktamazu (penicilinaza) i promotorni sustav laktoze (Chang et a/., 1978, ITakura et al. 1977; Goeddel et al 1979) i sustav promotora triptofana (trp) (Goeddel etal. 1979; EP-A-0 036 776). Dok se navedeni najviše koriste, pronađeni su i korišteni drugi promotori iz mikroorganizama, a detalji koji se tiču njihovih nukleotidnih sekvencija su publicirani, omogućujući stručnjacima da izvedu funkcionalnu ligaciju s plazmidnim vektorom (Siebvvenlist et al 1980). Neki geni prokariota se mogu eksprimirati učinkovito u E. coli iz njihove vlastite promotorske sekvencije, a time otklanjaju potrebu za dodatnim ili drugim promotorom dobivenim na umjetni način.
Uz prokariote se također mogu koristiti eukatiotski mikroorgnanizmi, kao što su kulture kvasca, a tamo promotor mora imati sposobnost izvođenja ekspresije. Sacchatomyces cerevisiase ili obični pekarski kvasac se najčešće koriste među eukariotskom mikroorganizmima, mada stoje na raspolaganju brojne ostale vrste. Za ekspresiju Sacchatomyces se primjerice obično koristi plazmid YRp7 (Stinchcomb etal. 1979; Kingsman et al. 1979; Tschemper et al. 1980). Taj plazmid već sadrži trpi gen koji omogućuje odabir markera za mutantnu vrstu kvasca kojoj nedostaje mogućnost rasta triptofana primjerice ATCC br 44076 ili PEP4-1 (Jones, 1977). Prisutnost trpi lezije, kao karakteristike stanice domaćina kvasnog genoma, omogućuje zatim učinkovit okoliš za detekciju transformacije pri rastu u nedostatku triptofana.
Pogodne sekvencije za promociju i vektorima kvasca uključuju promotore za 3-fosfoglicerat kinaze (Hitzman etal. 19080) ili ostale glikoitičke enzime (Hess et al. 1968; Holland et al. 1978) kao što je enolaza, gliceraIdhid-2-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, gukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerrat mutaza, piruvat kinaza, triozafosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i gukokinaza. U konstrukciji pogodnih ekspresijskih plazmida, terminacijska sekvencija povezana s tim genima je također podvrgnuta ligaciji u ekspresijski vektor 3' sekvencije koja se želi eksprimirati, a da se dobije poliadenilacija mRNA i terminacija.
Ostali promotori koji imaju dodatnu prednost da su transkripcijski kontrolirani uvjetima rasta jesu regija koja promovira akohol dehidrogenazu 2, izocitokrom C kiselu fosfatazu, degradativnie enzime povezane s metabolizmom dušika, te prije spomenutu gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu i enzime odgovorne za upotrebu maltoze i galaktoze. Pogodan je bilo koji plazmidni vektor koji sadrži promotor koji je kompatibilan s kvascem, a koji potječe od replikacijskih i terminacijskih sekvencija.
Uz mikroorganizme, kulture stanica izvedene od višestaničnih organizama mogu također biti domaćini. U načelu, bilo koja takva stanična kultura se može koristiti, bilo iz kultura vertebrata ili evertebrata. Međutim, najveći je interes pokazan prema stanicama vertabrata, a progagacija vertebrata u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinski postupak zadnjih godina (Tissue Culture 1973). Primjeri takvih korisnih staničnih linija domaćina su VERO i HeLa stanice, stanične linije ovajrija kineskog zamorca (CHO), te W138, BHK, COS-7 293, Spodoptera frugiperda (SF) stanice (komercijalno pristupačne kao ekspresijski sustav od /.a. Protein Science, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, USA i iz Invitrogen), te MDCK stanične linije. U ovom izumu, posebne su preferirane stanične linije 82 od Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Hroninen, Nizozemska.
Ekspresijski vektori za takve stanice obično uključuju (ako je potrebno) porijeklo replikacije, promotor smješten u prednjem dijelu gena koji će biti eksprimiran, skupa s bilo kojim neophodnim mjestom vezivanja ribosoma, R NA na mjestu izrezivanja introna, polidentilacijsko mjesto i sekvenciju transkripcijskog terminatora.
Za upotrebu u stanicama sisavaca, kontrolna funkcija ekspresijskih vektora često potječe od virusnog materijala. Primjerice, obično korišteni promotori se izvode od polioma, Adenovirusa 2, a najčešće Simian Virusa 40 (SC40). Rani i kasni promotori SV40 virusa su izuzetno korisni jer se oba dobivaju lako iz virusa kao fragment koji također sadrži replikaciju SV40 virusnog porijekla (Fiers etal. 1978). Manji ili veći SV40 fragmenti se također mogu koristiti s tim da je uključeno približno 250 bp sekvencija koja se proteže od HindIII mjesta prema Bg/I mjestu smještenom u replikatoru virusnog porijekla. Nadalje, također je moguće, a često je poželjno, koristiti promotor ili kontrolnu sekvenciju koja je normalno povezana s željenom genonskom sekvencijom, s tim da je takva kontrolna sekvencija kompatibilna sa sustavima stanice domaćina.
Do replikacije može doći zbog konstrukcijskog vektora koji je egzogenog porijekla, a takav se može izvesti iz SV40 ili ostalih virusa (npr. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) ili može nastati replikacijskim mehanizmom kromosomske stanice. Ako je vektor ugrađen u kromosom stanice domaćina, potonji je često dovoljan.
Identifikacija korisnih analoga OPGL
Bit će jasno stručnjacima da nemaju sve moguće varijante ili modifikacije prirodnog OPGL sposobnost izdvojiti antitijela u životinjama koji su reaktivni s prirodnim oblikom. Međutim, teško je postaviti učinkovit standard za pronalaženje modificiranih molekula OPGL koje zadovoljavaju minimalne zahtjeve za imunološkoj reaktivnosti koja je ovdje diskutirana. Zato se još jedan dio izuma tiče metode identifikacije modificiranog polipeptdinog OPGL koji je sposoban uključiti antitijela na nemodificirani OPGL u životinjskim vrstama u kojima je nemodificirani polipeptidni OPGL (neimunogeni) vlastiti protein, a metoda sadrži:
- pripravu načinom peptidne sinteze ili tehnikom genetskog inženjerstva, skupine višestruko različitih modificiranih polipeptidnih OPGL u kojima aminokiseline koje su uvedene adicijom, insercijom, uklonjene delecijom ili uvedene supstitucijom u aminokiselinsku sekvenciju polipeptidnog OPGL životinjskih vrsta, čime raste sekvencija aminokiselina u skupini koja sadrži epitope T-stanice, koji su strani životinjskoj vrsti, ili pripravu skupine nukleinskih fragmenata koji kodiraju skupinu višestruko različitih modificiranih polipeptidnih OPGL,
- testiranje članova skupine modificiranih polipeptidnih OPGL ili fragmenata nukleinske kiseline na njihovu sposobnost indukcije produkcije antitijela u životinjskim vrstama na nemodificirani OPGL, te
- identifikacija i moguća izolacija člana (članova) iz skupine modificiranih polipeptidnih OPGL koji značajno produkciju antitijela na nemodificirani OPGL u vrstama, ili identifikacija i moguća izolacija polipeptidnih ekspresijskih produkata koji kodiraju članove skupine fragmenata nukleinske kiseline što značajno inducira produkciju antitijela na nemodificirani OPGL u životinjskim vrstama.
U tom kontekstu, "skupina višestruko modificiranih polipeptidnih OPGL" koji su npr. odabrani na osnovi gore diskutiranog kriterija (npr. u kombinaciji sa rezultatima cirkularnog dikroizma, NMR spektara i/ili difrakcije X-zraka). Skupina se može sastojati od samo nekoliko članova, ali se razmatra da skupina može sadržavati nekoliko stotina članova.
Testirani članovi skupine se na kraju mogu ispoljiti u in vitro testovima primjenom koja sužuje broj modificiranih molekula koje mogu služiti za svrhu izuma.
Kako je cilj uvođenje stranih epitopa T-stanice da pojačaju odgovor B-stanice pomoću T-stanice, uvjet je da je proliferacija inducirana modificiranim OPGL. Proliferacija T-stanice se može testirati standardiziranim in vitro testom proliferacije. Ukratko, uzorak obogaćen T-stanicama je dobiven od osoba i održavan je u kulturi. Kultivirane T-stanice su zaražene APC od osobe kojoj je prethodno modificirana molekula i procesirana da ispolji njegove epitope T-stanice. Proliferacija T-stanica je praćena i uspoređena s pogodnom kontrolom (npr. T-stanice u kulturi zaražene APC koji su procesirale nedirnuti prirodni OPGL). Alternativno, proliferacija se može mjeriti određivanjem koncentracije važnih citokina koji se oslobađaju iz T-stanica kao odgovor na njihovo prepoznavanje stalnih T-stanica.
Čini se vrlo vjerojatno da je najmanje jedan modificirani OPGL svakog tipa u stanju inducirati proizvodnju antitijela na OPGL, pa je moguće pripraviti imunogeni pripravak koji sadrži najmanje jedan modificirani polipeptidni OPGL koje je sposoban inducirati proizvodnju antitijela na OPGL pri čemu je modificirani polipeptidni OPGL vlastiti protein, a metoda sadrži miješanje člana (članova) skupine koja značajno inducira produkciju antitijela u životinjskim vrstama koje su reaktivne s OPGL s farmaceutski i imunološki prihvatljivim nosačem i/ili vehikulom i/ili razrjeđivačem i/ili ekcipijentom, a može u kombinaciji s najmanje jednim farmaceutski i imunološki prihvatljivim adjuvansom.
Gornji aspekti izuma tiču se testiranja skupina polipeptida koji se uobičajeno izvode pripremom brojnih višestruko različitih sekvencija nukleinskih kiselina ili vektora iz izuma, transformiranjem pogodnih stanica domaćina vektorima i ekspresijom sekvencija nukleinskih kiseline iz izuma. Ti koraci se mogu pratiti izolacijom ekspresijskih produkata. Preferirano je da se sekvencije nukleinske kiseline i/ili vektori, priprave metodama koje sadrže provođenje tehnike molekulske amplifikacije kao što je PCR ili sintezom nukleinskih kiselina.
Sjedeći dio izuma tiče se metode za tretman, profilaksu ili poboljšanje bolesti karakteriziranih povećanom resorpcijom kosti u životinji, uključujući ljude, a metoda sadrži davanje životinji učinkovite količine najmanje jedne tvari koja nije osteoprotegerin koji blokira stimulatorni efekt OPGL na aktivnost osteoklasta. Sada se vjeruje da takav pristup nije nikada preložen u struci.
Preferirana cjelina ovog dijela izuma obuhvaća korištenje specifičnih OPGL antitijela (poli- ili monoklonalna) ili specifično vezujućih njihovih varijanata kao tvari za blokiranje stimulatornog efekta OPGL. Preferirano je da je antitijelo IgG ili IgM molekula, ili njena specifično vezivajuća varijanta izvedena od IgG ili IgM. Specifično vezujuća varijanta antitijela konvencijalno može biti Fab fragment, F(ab')2 fragment, humanizirano monoklonalno antitijelo ili njegov fragment ili di-ili mutimerni fragment antitijela (bispecifčni i dimerni sintetska molekula koja je izvedena iz antitijela koju proizvodi Cambridge Antibody Thechnology).
PRIMJER
Odlučeno je da se kloniraju ili sintetiziraju cDNA koje kodiraju humani OPGL i OPGL od eksperimentalnih laboratorijskih glodavaca u skraćenoj verziji koja sadrži aminokiselinske ostatke 158-316 i slučaju glodavaca i ostatke 159-317 u slučaju ljudi (broj odgovara numeriranju SEQ ID br, 2 i 4). Kako ove skraćene verzije pokazuju biološku aktivnost, obično su anutoantitijela usmjerena na dio OPGL. Nadalje, to čini proteine manjim i stoga lakšim za rukovanje.
Sintetske cDNA koja kodira OPGL ostatke laboratorijskih glodavaca 158-316 je sintetizirana uklanjanjem suboptimalnih kodona Eschereicia coli i Pichia pastoris e iz publicirane sekvencije. Nadalje, N-terminalna histirinska oznaka, koja je dio mjesta cijepanja signalne sekvencije faktora alfa sparivanja iz Sachatomyces cerevisiae i pogodni restrikcijski enzimi ugrađeni su u otvoreni čitajući okvir (vidi SEQ ID br 7).
Ta cDNA koja kodira OPGL laboratorijskih glodavaca divljeg tipa je klonirana u standardnom ekspresijskom vektoru Eschericia coli (pTrc99a) korištenjem BspHI i HindIII restrikcijskih enzima i standardni vektor za kloniranje (pBuescript KS+) korištenjem SacI i KpnI restrikcijskog enzima (vodeća SEQ ID br 9).
Rezultat ekspresije u stanicama Eschereicia coli je približno 30% rekombinant-nog OPGL od ukupnog proteina Eschereicia coli. Protein je restrukturiran sljedećim postupkom:
1. Stanice su sakupljene centrifugiranjem
2. Stanice su ponovo suspendirane u fosfornom puferu fiziološke otopine (PBS) i ponovo centrifugirane.
3. Supernatant je odbačen i stanice su ponovo suspendirane u tri volumena (100 mM Tris[hidroksimetil]aminoetan hidroklorid, 5 mM ditiotreitol (DDT), 0.5 M NaCI, pH 8.0).
4. Stanicama je dodano 8 μL 50 mM PMSF i 80 μL lizozima (10 mg/mL) po gramu stanica i inkubirano je pri sobnoj temperaturi 20 minuta.
5. Za svaki gram staničnog materijala dodano je 4 mg deoksiklorične kiseline i suspenzija je inkubirana 20 minuta pri sobnoj temperaturi dok nije postala viskozna.
6. Dodano je 20 μL DNaze (1 mg/mL) po svakom gramu stanica i MgCl2 do 5 mM, te je suspenzija inkubirana pri sobnoj temperaturi 30 minuta.
7. Suspenzija je sonificirana na ledu dok nije postala viskozna.
8. Nakon centrifugiranja (20000 x g kroz 30 minuta) materijal je ponovo suspendiran u 3 m L 1 M uree po gramu stanica.
9. Nakon centrifugiranja (20000 x g kroz 30 minuta) materijal je ponovo suspendiran u 1 M gvanidin hidrokloridu, 100 mM Tris[hidroksimetil]-amino-etan hidroklorid, pH 7.5.
10. Nakon centrifugiranja (20000 x g kroz 30 minuta) materijal je ponovo suspendiran u 6 M gvanidin hidroklorid, 20 mM Trisfhidroksimetil]-aminoetan hidroklorid, 5% etanol, 1% beta-merkaptoetanol, pH 8.0 i miješano je preko noći pri 4 °C.
11. Nakon centrifugiranja (40000 x g kroz 1-4 sata) supernatant je filtriran i čuvan pri -20 °C.
12. Solubilizirana inkluzijska tijela su odvojena filtracijom na gel kromatorafijom korištenjem Superdex 200 materijal (Pharmacia).
13. Frakcije koje sadrže rekombinantni OPGL su sakupljene i razrijeđene u 0.1 mg/m s 1.5 M gvanidin hidroklorid, 20 mM Trisfhidroksimetil]-aminoetan hidroklorid, 51 mM DTT, pH 7.5.
14. Materijal je dializiran preko noći pri 4 °C u 10 volumena 1.5 M gvanidin hidroklorid, 20 mM Tris[hidroksimetil]aminoetan hidroklorid, 1 mM DTT, pH 7.5.
15. Materijal je dializiran preko noći pri 4 °C u 10 volumena 1.0 M gvanidin hidroklorid, 20 m M Tris[hidroksimetil]aminoetan hidroklorid, 1 mM DTT, pH 7.5.
16. Materijal je dializiran preko noći pri 4 °C u 10 volumena 0.5 M gvanidin hidroklorid, 20 m M Tris[hidroksimetil]aminoetan hidroklorid, 1 m M DTT, pH 7.5.
17. Materijal je dializiran preko noći pri 4 °C u 10 volumena 20 mM Trisfhidroksimetil]aminoetan hidroklorid, 150 mM arginin, 1 mM DTT, pH 7.5.
18. Materijal je dializiran preko noći pri 4 °C u 10 volumena 20 mM Tris[hidroksimetil]aminoetan hidroklorid, 150 mM arginin, pH 7.5.
19. Restruktuiran materijal je liofiliziran i čuvan pri -20 °C.
Učinkovitost restrukturiranja prema ovom postupku je oko 40%, a čistoća je prelazi 65%. Postupak pročišćavanja i restrukturiranja su još dio daljnjih poboljšavanja, (mobilizirano restrukturiranje se istražuje, enzimsko uklanjanje histidinske oznake će se izvesti u suštini kao stoje opisano od Pedersen et a/., 1999. Pripoda rekombinantnog proteina je karakterizirana i verificirana korištenjem SDS-PAGE, N-terminalnog sekvenciranja, analizom aminokiseline i masenom spektroskopijom.
Mutant cisteinske supstitucije iz divjeg tipa OPGL laboratorijskih glodavaca je pod konstrukcijom (u kojem cistein odgovara aminokiselinskoj sekvneciji SEQ ID br. 4 je supstituiran serinom, vidi SEQ ID br, 11 i 12). To je napravljeno da se eliminira potencijalni problem stabilnosti s pročišćenim rekombinantnim proteinom. Taj mutiram" skraćeni OPGL će služiti kao baza za sastojak vakcine na potpuno isti način kao što je dolje opisano pri čemu je odabrana DNA koja ima SEQ ID br. 9. Nadalje, odgovarajući Cys-Ser mutant (u kojem je Cys-221 supstituiran) humanog OPGL će se također pripraviti za iste svrhe.
Molekule vakcine su početno konstruirane insercijom ili supstitucijom P2 ili P30 epitopa od toksoida tetanusa na odabranom položaju. Ostali pogodni imunomodulirani epitopi T-stanice se mogu koristiti u kasnijem stupnju.
Odabrani položaji za uvođenje varijacija su odabrane na osnovu znanja postojećih ili očekivanih epitopa B-stanice i očekivanih elemenata sekundarne i tercijarne strukture prirodne molekule, kao i za uspoređivanje s postojećim trodimenzijskim strukturama TNFa (1a8m.pdb) i CD40 liganda (laly.pdb) za modeliranje sekundarne i tercijarne strukture vanstaničnog dijela OPGL. Uvođenje molekule od glodavca će se dogoditi u dijelovima koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 170-192, 198-218, 221-246, 256-261, te 285-316 (vidi numeriranje aminokiselina u SEQ ID br. 4), pri čemu će do uvođenja u humanu molekulu doći na mjestima koje odgovaraju aminokiselinskim ostacima 171-193, 199-219, 222-247, 257-262, te 286-317.
Četiri varijante OPGL laboratorijskih glodavca su do sada konstruirane i eksprimirane rekombinantno u Escheriacia col:
DNA koja kodira mOPGL[158-316]_P30[256-261 ] s N-rerminalnom histidinskom oznakom (SEQ ID br. 13):
PCR od SEQ ID br. 9 je izveden korištenjem SEQ ID br. 22 i 25 kao primjera. Nastali PCR fragment je razgrađen restrikcijskim enzimima sa SacII i KpnI i zatim pročišćen na agaroznom gelu. Drugi PCR koji koristi SEQ ID br 9 kao templat je izveden uz primjer SEQ ID br. 26 i vektor specifičnog primjera. Nastali PCR fragment je razgrađen restrikcijskim enzimima KpnI i HindIII S oba fragmenta je zatim izvedena ligacija u SEQ ID br. 9 u pBluescript KS+ razgrađeni restrikcijskim enzimima SacII i HindIII. Da se ispravi mutacija jedne baze u ovoj građevnoj jedinici, PCR koji koristi građevnu jedinicu kao tempalt je izveden s primjerom SEQ ID br. 33 i 29. Nastali PCR fragment je razgrađen restrikcijskim enzimima s PsfI + EcoRI, pročišćen na gelu i zatim je provedena ligacija u pogrešnu građevnu jedinicu razgrađen restrikcijskim enzimima s PsfI + EcoRI. Verificirana građevna jedinica (SEQ ID br. 13) je zatim prenesena u pTrc99a korištenjem BspHI i HindIII restrikcijskih enzima.
DNA koja kodira mOPGL[158-316]_P2[256-261] s N-rerminalnom histidinskom oznakom (SEQ ID br. 15):
PCR od SEQ ID br. 9 je izveden korištenjem SEQ ID br. 27 i 28 bez tempata. Nastali PCR fragment je razgrađen restrikcijskim enzimima s Pst\ i EcoRI, a zatim je pročišćen na agaroznog gelu. Na nastalom fragemntu je zatim izvedena ligacija u SEQ ID br. 9 u pBluescript KS+ razgrađen restrikcijskim enzimima SacII i HindIII. Verificirana građevna jedinica (SEQ ID br. 15) je zatim prenesena u pTrc99a korištenjem BspHI i HindIII\ restrikcijskih enzima.
DNA koja kodira mOPGL[158-316]_P2[288-302] s N-rerminalnom histidinskom oznakom (SEQ ID br. 17):
PCR od SEQ ID br. 9 je izveden korištenjem SEQ ID br. 22 i 29 kao primjera. Nastali PCR fragment je razgrađen restrikcijskim enzimima sa PstI i BstBI, a zatim pročišćen na agaroznom gelu. Drugi PCR koji koristi SEQ IS br. 9 kao templat je izveden korištenjem primjera SEQ ID br. 30 i vektora specifičnog primjera. Nastali PCR fragmenti su razgrađen restrikcijskim enzimima BstBI i KpnI, a zatim je pročišćen na gelu. S oba fragmenta je zatim izvedena ligacija u SEQ ID br. 9 u pBluescript KS+ razgrađen restrikcijskim enzimima PstI i KpnI Verificirana građevna jedinica (SEQ ID br. 17) j'e zatim prenesen u pTrc99a korištenjem BspHI i HindIII restrikcijskih enzima.
DNA koja kodira mOPGL[158-316]_P30[221-241] s N-rerminalnom histidinskom oznakom (SEQ ID br. 19):
PCR od SEQ ID br. 9 je izveden korištenjem SEQ ID br. 22 i 23 kao primjera. Nastali PCR fragment je razgrađen restrikcijskim enzimima sa SacII i KpnII, a zatim pročišćen iz agaroznog gela. Drugi PCR koji koristi SEQ ID br. 9 kao templat je izveden korištenjem SEQ ID br. 24 i 31. Nastali PCR fragment su razgrađen restrikcijskim enzimima Kpn\ i EcoRI, a zatim je pročišćen na gelu. S oba fragmenta je zatim izvedena ligacija u SEQ ID br. 9 u pBluescript KS+ razgrađen restrikcijskim enzimima SacII i EcoRI. Verificirana građevna jedinica (SEQ ID br. 19) je zatim prenesen u pTrc99a korištenjem BspHI i HindIII restrikcijskih enzima.
Ekspresija tih skraćenih varijanata OPGL je izvedena u E coli dajući preko 20% ukupnog proteina za sve varijante. Daljnji razvitak gore opisanog pročišćavanja i postupka restruktuiranja divljeg tipa proteina služi kao osnova za razvitak optimalnih postupaka za svaku varijantu, (mobilizirani restruktuirani proteini koji koriste histidin za oznaku je još jedan pristup koji je slijeđen.
Alternativno, varijante se mogu direktno prenijeti u ekspresijski vektor Pichia pastoris koristeći restrikcijske enzime ili ostale ekspresijske sustave kvasca koristeći PCR ako je poželjna glikolizacija. Valja napomenuti da glikolizacija nije potrebna za biološku aktivnost OPGL in vivo. Također je moguće eksprimirati skraćeni OPGL u humanom 293 fibrobastu kao što je prikazano u Lacey et al. Ekspresija u stanicama insekta će također biti razmatrana (npr. Schneider 2 (S2) stanične linije i vektorski sustav ili Spodoptera frugiperda (SF) stanice i sustavi vektora, oba se mogu nabaviti od Invitrogena.
Pročišćene varijante će se koristiti za produkciju antitijela u zečevima za kasniju upotrebu kao alata za detekciju jer ne postoje komercijalno pristupačna antitijela. Nadalje, taj materijal će biti vrijedan alat u biološkim testovima koji trebaju procijeniti pogodne kandidate za autovakcinu. Priprava antitijela će se izvesti korištenjem standardnih metoda poznatih u struci.
Odabir najboljih kandidata za autovakcinu je zasnovan na procjenjivanju inhibitorske aktivnosti in vivo u životinjskim modelima za osteoporozu. Korisni sustavi testa i modela je opisan u literaturi (npr. u Lacey et al. Fuller et al.. te Simonet et al.).
Aktivnost rekombinantnih proteina će biti analizirana intravenoznom 100 μL injekcijom u neanestezirane mužjake Balb-C miševa (0, 0.1 i 1.0 mg proteina po kg miša) i jedan sat nakon 125 μL uzimanja krvi iz glavne očne vene korištenjem kapilara presvučenih s kalcijem zasićenim heparinom. Razina kalcija je mjerena korištenjem ICA2 (Radiometer, Danska). Pročišćen i restrukturiran rekombinantni OPGL laboratorijskog glodavca (SEQ ID br. 9) je reaktivan u ovom testu i povećava razinu cirkulirajućeg ioniziranog kalcija do 10%.
Kandidati za autovakcinu će npr. biti procijenjena korištenjem autovakcinacije i zatim praćenja njihove inhibicije oslobađanja ioniziranog kalcija i perifernu krv po injekciji rekombinantnog mOPGL u miša (kao što je opisano od Burgess et al.)
Valja napomenuti da će kao alternativa modificiranom OPGL, antiidiotipska antitijela usmjerena na idiotipe antitijela anti-OPGL također služiti kao korisni imunogeni unutar obujma ovog izuma. Slično, korištenje mimotipičnih polipeptida koji se mogu izolirati u npr. fagu pokazuju korištenje anti-OPGL ili osteoprotegerin kao proba za hvatanje, koji su također razmatrani kao imunogene tvari iz izuma.
POPIS LITERATURE
1. Bucay, N. et al. (1998), Genes Dev. 12, 1260-1268.
2. Lacey, D. L. et al. (1998),Cell 93, 165-176.
3. Marks, S. C. Jr. (1989), Am. J. Med. Genet. 34, 43-53.
4. Simonet, W. S. et al. (1997), Cell 89, 309-319.
5. Fuller, K. et al. (1998), J. Exp. Med. 188, 997-1001.
6. Burgess, T. L et al. (1999), J. Call Biol. 145, 527-538.
7. Pedersen J. et al. (1999), Protein Expr. Purif. 15, 389-400.
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
Claims (56)
1. Metoda za in vivo smanjivanja aktivnosti liganda osteoprotegerina (OPGL) u životinjama uključujući ljude, naznačeno time da metoda sadrži djelotvorno ispoljavanje na životinjski imuni sustav imunološki učinkovite količine
- najmanje jednog polipeptidnog OPGL ili njegove podsekvencije koja je formulirana tako da imunizacijom životinje s polipeptidnim OPGL ili njegovom podsekvencijom izazove produkciju antitijela na polipeptidni OPGL, i/ili
- najmanje jednog analoga OPGL koji je uveden najmanje jednom modifikacijom u aminokiselinske sekvencije OPGL čiji je rezultat da imunizacija životinje s analogom izaziva produkciju antitijela na polipeptidni OPGL,
pri čemu je životinjskom vlastitom OPGL aktivnost smanjena zbog njegovog vezivanja na antitijela, OPGL je protein koji djeluje kao diferencijalni faktor osteoklasta i koji ima aminokiselinsku sekvenciju kao što je prikazano u SEQ ID br. 2 za humani OPGL, te u SEQ ID br. 4 i 6 za OPGL laboratorijskog glodavca.
2. Metoda prema patentnom zahtjevu 1, naznačeno time da je prikazani analog OPGL s najmanje jednom modifikacijom aminokiselinske sekvencije.
3. Metoda prema patentnom zahtjevu 2, naznačeno time da modifikacija ima rezultat da je znatan udio epitopa B-stanice OPGL sačuvan, te da je
- uveden najmanje jedan epitop limfocira T pomoćnih stanica (TH epitop)
- da je uveden barem jedan prvi segment čiji je učinak usmjeravanje modificirane molekule na stanicu s antienom (APC) ili B-limfocitom, i/ili
- da je uveden barem jedan drugi segment koji stimulira imuni sustav, i/ili
- da je uveden barem jedan treći segment koji optimizira ispoljavanje modificiranog polipeptidnog OPGL u imunom sustavu.
4. Metoda prema patentnom zahtjevu 3, naznačeno time da modifikacija uključuje uvođenje bočne skupine koja je vezana kovalentno ili nekovalentno na pogodne kemijske skupine u OPGL ili na njegove podsekvencije, stranog TH epitopa i/ili prvi i/ili drugi i/ili treći segment.
5. Metoda prema patentnom zahtjevu 3 ili 4, naznačeno time da modifikacija uključuje aminokiselinsku supstituciju i/ili deleciju i/ili inserciju i/ili adiciju.
6. Metoda prema patentnim zahtjevima 5 ili 6, naznačeno time da je rezultat modifikacije stvaranje fuzijskog polipeptida.
7. Metoda prema patentnom zahtjevu 5 ili 6, naznačeno time da uvođenje aminokiselinske supstitucije i/ili delecije i/ili insercije i/ili adicije ima rezultat zadržavanje ukupne tercijarne strukture OPGL u velikoj mjeri.
8. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 2-7, naznačeno time da modifikacija uključuje udvostručenje najmanje jednog OPGL epitopa B-stanice i/ili uvođenje haptena.
9. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 3-8, naznačeno time da je epitop strane T stanice imunodominantan u životinji.
10. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 3-9, naznačeno time da je epitop strane T stanice sposoban vezati se na veliki dio MHC razreda II molekule.
11. Metoda prema patentnom zahtjevu 10, naznačeno time da je najmanje jedan epitop strane T-stanice odabran od prirodnog epitopa T-stanice, te od umjetne peptidne sekvencije koja se vezuje na MHC-II.
12. Metoda prema patentnom zahtjevu 11, naznačeno time da je epitop prirodne T-stanice odabran od sljedećih: epitop toksoida tetanusa kao što je P2 ili P30, epitop toksoida difterije, hemaglutininski epitopa virusa influencije, te CS epitop P. faciparum..
13. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 3-12, naznačeno time da je prvi segment specifičan partner za vezivanje na antigen B-limfocira specifične površine ili antigen APC specifične površine kao što je hapten ili ugljikovodik za koji postoji receptor na B-limfocitu ili APC.
14. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 3-13, naznačeno time da je drugi segment odabran od sljedećih: citokin, hormon, te protein podvrgnut toplinskom šoku.
15. Metoda prema patentnom zahtjevu 6, naznačeno time da je citokin odabran ili je učinkoviti dio od sljedećih: interferon γ (IFN- γ), FltSL, interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (lL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15), te stimulirajući faktor kolonije granulacitnog makrofaga (GM-CSF) te da je protein podvrgnut toplinskom šoku odabran ili je učinkovit dio sljedećih: HSP70, HSP90, HSC70, GRP94, te kalretikulin (CRT).
16. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 3-15, naznačeno time da je treći segment lipidne prirode, kao što je palmitoilna skupina, miristilna skupina, farnezilna skupina, geranil-geraniolna skupina, GPI-sidro, te N-acil-digliceridna skupina, segment odbran od sljedećih: citokin, hormon, te protein podvrgnut toplinskom šoku.
17. Metoda prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da su polipeptidni OPGL ili njegova podsekvencija modificirani u bilo kojem položaju od 170-192, u bilo kojem položaju od 198-218, u bilo kojem položaju od 221-246, u bilo kojem položaju od 256-261, ili u bilo kojem položaju od 285-316, s tim da se numeriranje aminokiselina poklapa sa SEQ ID br. 4,6, te 12, ili je polipeptidni OPGL modificiran u bilo kojem položaju od 171-193, u bilo kojem položaju od 199-219, u bilo kojem položaju od 222-247, u bilo kojem položaju od 2576-262, ili u bilo kojem položaju od 286-317, tim da se numeriranje aminokiselina poklapa sa SEQ ID br. 2.
18. Metoda prema patentnom zahtjevu 17, naznačeno time da modifikacija sadrži supstituciju najmanje jedne aminokiselinske sekvencije u položajima definiranom u zahtjevu 17 s aminokiselinskom sekvencijom iste ili različite duljine koja sadrži epitop strane TH stanice.
19. Metoda prema patentnom zahtjevu 17, naznačeno time da su u aminokiselinskoj sekvencija koja sadrži epitop strane TH stanice supstituirane aminokiseline: 256261 i/ili 288-302 i/ili 221-241 koje su nađene u SEQ ID br. 4 ili aminokiseline 257-262 i/ili 289-303 i/ili 222-243 u SEQ ID br. 2 ili u polipeptidu u kojem je cistein koji odgovara Cys-221 supstituiran sa Ser.
20. Metoda prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je ispoljavanje na imuni sustav postignuto postojanjem barem dvije kopije polipeptidnog OPGL, njegove podsekvencije ili modificiranog polipeptidnog OPGL koji je kovalentno ili nekovalentno vezan na molekulu nosača koja je sposobna utjecati na ispoljavanje višestrukih kopija antigenskih determinanata.
21. Metoda prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da su polipeptidni OPGL, njegova podsekvenciju ili modificirani polipeptidni OPGL formulirani s adjuvansom koji olakšava uništavanje autotolerancije na autoantigen.
22. Metoda prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da j'e učinkovita količina polipeptidnog OPGL, ili njegove podsekvencije dana životinji na način koji je odabran od sljedećih: parenteralnim putem, kao što je intradermalno, subdermalno, intrakutalno, subkutalno, intramuskularnim putem, peritonalnim putem, oralnim putem, buklalnim putem, sublingvalnim putem, epiduralnim putem, spinalnim putem, analnim putem, te intrakardinalnim putem.
23. Metoda prema patentnom zahtjevu 22, naznačeno time da učinkovita količina iznosi između 0.5 μg i 2000 μg polipeptidnog OPGL ili njegove podsekvencije ili njegovog analoga.
24. Metoda prema patentnom zahtjevu 22 ili 23, naznačeno time da je polipeptidni OPGL ili njegov analog sadržan u napravi koja je virtualni limfni čvor (VLN).
25. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-21, naznačeno time da na ispoljavanje modificiranog OPGL na imuni sustav utječe uvođenje nukleinske kiseline (kiselina) koja kodira modificirani OPGL u životinjskim stanicama i stoga dobivanje in vivo ekspresije u stanicama u koje je uvedena nukleinska kiselina (kiseline).
26. Metoda prema patentnom zahtjevu 25, naznačeno time da je uvedena nukleinska kiselina (kiseline) odabrana od sljedećih: sama DNA, DNA formulirana s nabijenim ili nenabijenim lipidima, DNA formulirana u liposomima, DNA uključena u virusni vektor, DNA formulirana s proteinom ili polipeptidom koji olakšavju transfekciju, DNA formulirana s ciljnim proteinom ili polipeptidom, DNA formulirana sa sredstvom koje taloži kalcij, DNA vezana na inertnu molekulu koja je nosač, DNA kapsuliranu hitinu ili hitosanu, te DNA formuliranu s adjuvansom.
27. Metoda prema patentnom zahtjevu 27, naznačeno time da nukleinska kiselina (kiseline) sadržana u napravi koja je virtualni limfni čvor.
28. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 22-27, naznačeno time da uključuje najmanje jedno davanje/uvođenje godišnje, kao što je najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, te najmanje 12 davanja/u vođenja.
29. Metoda tretmana i/ili prevencije i/ili poboljšanja osteoporoze ili ostalih stanja karakterizirani suviškom resorpcije kosti, naznačeno time da metoda sadrži smanjivanje aktivnosti OPGL prema metodi iz bio kojeg patentnog zahtjeva od 1-28 do te mjere da je brzina resorpcije kosti značajno smanjena, kao što je smanjivanje najmanje 3%, najmanje 7%, najmanje 9%, najmanje 11%, najmanje 13%, najmanje 15%, najmanje 17%, najmanje 20%, te najmanje 30%.
30. Analog OPGL koji je izveden iz životinjskog polipeptidnog OPGL, naznačeno time da uvedena modifikacija koja ima rezultat imunizacije životinje s analogom koji izaziva stvaranje antitijela na polipeptidni OPGL, a pri čemu je modifikacija definirana u bilo kojem patentnom zahtjevu od 17-19, te pri čemu je znatni udio epitopa B-stanice životinjskog OPGL sačuvan.
31. Analog OPGL prema patentnom zahtjevu 30, naznačeno time da je modifikacija ista kao stoje definirano u zahtjevu 19.
32. Imunogeni pripravak, naznačeno time da sadrži
- imunogeno učinkovitu količinu polipeptidnog OPGL koji je formuliran skupa s imunološki prihvatljivim adjuvansom, tako da se uništi autotolerancija životinje prema polipeptidnom OPGL, a pripravak nadalje sadrži farmaceutski i imunološki prihvatljivi nosač i/ili vehikul
- imunogeno učinkovitu količinu analoga OPGL prema zahtjevima 30 i 31, s tim da pripravak nadalje sadrži farmacetuski i imunološki prihvatljivi nosač i/ili vehikul, a moguće i adjuvans.
33. Fragment nukleinske kiseline, naznačeno time da kodira analog OPGL prema patentnom zahtjevu 30 ili 31.
34. Vektor, naznačeno time da nosi fragment nukleinske kiseline prema patentnom zahtjevu 33.
35. Vektor prema patentnom zahtjevu 34, naznačeno time da je sposoban za autonomnu replikaciju.
36. Vektor prema patentnom zahtjevu 34 ili 35, naznačeno time da je odabran iz sljedeće skupine: plazmid, fag, kosmid, mini-kromosom, te virus.
37. Vektor prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 34-36, naznačeno time da u 5'-3' smjeru i u djelatnom mjestu vezivanja sadrži promotor za upravljanje ekspresijom: fragmenta nukleinske kiseline prema patentnom zahtjevu 33, može sekvencije nukleinske kiseline koja kodira vodeći peptid omogućujući izlučivanje ili interakciju u membranu polipeptidnog fragmenta nukleinske kiseline prema zahtjevu 33, a može i terminatora.
38. Vektor prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 34-37, naznačeno time pri uvođenju u stanicu domaćina može ili ne mora biti integriran u genom stanice domaćina.
39. Vektor prema patentnom zahtjevu 37 ili 38, naznačeno time da promotor upravlja ekspresijom u stanici eukariota i/ili u stanici prokariota.
40. Transformirana stanica, naznačeno time da nosi vektor iz bilo kojeg od zahtjeva 34-39.
41. Transformirana stanica prema patentnom zahtjevu 40, naznačeno time da je sposobna replicirati fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 33.
42. Transformirana stanica prema patentnom zahtjevu 41, naznačeno time da je mikroorganizam odabran od sljedećih: bakterija, kvasna gljivica, protozoan ili stanica izvedena iz višestaničnog organizma koji je odabran od sljedećih: gljivice, stanica insekta kao što je S2 ili SF stanica, stanica biljke i stanica sisavca.
43. Transformirana stanica prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 40-42, naznačeno time da eksprimira fragment nukleinske kiseline prema patentnom zahtjevu 33.
44. Transformirana stanica prema patentnom zahtjevu 43, naznačeno time da izlučuje ili nosi na svoji površinu analog OPGL prema patentnom zahtjevu 30 ili 31.
45. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-19, naznačeno time da se na ispoljavanje imunog sustava utječe davanjem nepatogenih mikroorganizama ili virusa koji nose fragment nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira polipeptidni OPGL ili analog.
46. Pripravak za indukciju produkcije antitijela na OPGL, naznačeno time da pripravak sadrži:
- fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 33 ili vektor prema bilo kojem od zahtjeva od 34-39, te
- farmaceutsko i imunološko prihvatljiv nosač i/ili vehikul i/ili adjuvans.
47. Stabilna stanična linija, naznačeno time da nosi vektor prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 34-39, a koji eksprimira fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 33, a koji može izlučiti ili na svojoj površini nositi analog OPGL prema zahtjevu 30 ili 31.
48. Metoda za pripravu stanica prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 40-44, naznačeno time da metoda sadrži transformiranje stanice domaćina s fragmentom nukleinske kiseline prema patentnom zahtjevu 33 ili s vektorom prema bio kojem od zahtjeva 34-39.
49. Metoda za identifikaciju modificiranog polipeptidnog OPGL koji je sposoban inducirati antitijela na nemodificirani OPGL u životinjskim vrstama u kojima je nemodificirani polipeptidni OPGL vlastiti protein, naznačeno time da metoda sadrži:
- pripravu načinom peptidne sinteze ili tehnikom genetskog inženjerstva, skupine višestruko različitih modificiranih polipeptidnih OPGL u kojima su aminokiseline uvedene adicijom, ihsercijom, uklonjene delecijom ili uvedene supstitucijom u aminokiselinsku sekvenciju polipeptidnog OPGL životinjskih vrsta, čime raste sekvencija aminokiselina u skupini koja sadrži epitope T-stanice koji su strani životinjskoj vrsti, ili pripravu skupine nukleinskih fragmenata koji kodiraju skupinu višestruko različitih modificiranih polipeptidnih OPGL,
- testiranje članova skupine modificiranih polipeptidnih OPGL ili fragmenata nukleinske kiseline na njihovu sposobnost indukcije produkcije antitijela u životinjskim vrstama na nemodificirani OPGL, te identifikaciju i moguću izolaciju člana (članova) iz skupine modificiranih polipeptidnih OPGL koji imaju znatnu produkciju antitijela na nemodificirani OPGL u vrstama, ili
- identifikaciju i moguću izolaciju polipeptidnih ekspresijskih produkata koji kodiraju članove skupine fragmenata nukleinskih kiselina što značajno inducira produkciju antitijela na nemodificirani OPGL u životinjskim vrstama.
50. Metoda za pripravu imunogenih pripravaka, naznačeno time da sadrže barem jedna modificirani polipeptidni OPGL koji je sposoban inducirati antitijela na nemodificirani OPGL u životinjskim vrstama u kojima je nemodificirani polipeptidni OPGL je vlastiti protein, a metoda sadrži:
- pripravu načinom peptidne sinteze ili tehnikom genetskog inženjerstva, skupine višestruko različitih modificiranih polipeptidnih OPGL u kojima aminokiseline koje su uvedene adicijom, insercijom, uklonjene delecijom ili uvedene supstitucijom u aminokiselinsku sekvenciju polipeptidnog OPGL životinjskih vrsta, čime raste sekvencija aminokiselina u skupini koja sadrži epitope T-stanice koji su strani životinjskoj vrsti,
- testiranje članova skupine na njihovu sposobnost indukcije produkcije antitijela u životinjskim vrstama na nemodificirani OPGL, te
- miješanje člana (članova) skupine, koji značajno induciraju produkciju antitijela u životinjskim vrstama koji reagiraju s OPGL, s farmaceutski i imunološki prihvatljivim nosačem i/ili vehikulom, a može biti u kombinaciji s najmanje jednim farmaceutski i imunološki prihvatljivim adjuvansom.
51. Metoda prema patentnom zahtjevu 49 ili 50, naznačeno time da priprava članova skupine sadrži pripravu višestruko različitih sekvencija nukleinskih kiselina, a svaka sekvencija predstavlja sekvenciju nukleinske kiseline prema zahtjevu 33, inserciju sekvencije nukleinske kiseline u odgovarajuće ekspresijske vektore, te ekspresiju sekvencije nukleinske kiseline, nakon čega može slijediti izolacije produkata ekspresije.
52. Metoda prema patentnom zahtjevu 51, naznačeno time da je priprava sekvencije nukleinske kiseline i/ili vektora postignuta pomoću metoda molekulske amplifikacijske tehnike kao što je PCR ili pomoći sinteze nukleinske kiseline.
53. Korištenje OPGL ili njegove podsekvencije za pripravu imunogenog pripravka, naznačeno time da sadrži adjuvans za smanjivanje aktivnosti OPGL u životinji.
54. Korištenje OPGL ili njegove podsekvencije za pripravu imunogenog pripravka, naznačeno time da sadrži adjuvans za tretman, profilaksu ili poboljšanje osteoporoze ili ostalih stanja karakterizirani povećanom apsorpocjom kosti.
55. Korištenje analoga OPGL prema patentnom zahtjevu 30 ili 31, naznačeno time da je za pripravu imunogenog pripravaka koji može sadržavati adjuvans za smanjivanje aktivnosti OPGL u životinji.
56. Korištenje analoga OPGL prema patentnom zahtjevu 30 ili 31, naznačeno time daje za pripravu imunogenog pripravaka koji može sadržavati adjuvans za tretman, profilaksu ili poboljšanje osteoporoze ili ostalih stanja karakteriziranih povećanom apsorpocjom kosti.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA199801164 | 1998-09-15 | ||
US10289698P | 1998-10-02 | 1998-10-02 | |
PCT/DK1999/000481 WO2000015807A1 (en) | 1998-09-15 | 1999-09-13 | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HRP20010188A2 true HRP20010188A2 (en) | 2002-04-30 |
Family
ID=26065320
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HR20010188A HRP20010188A2 (en) | 1998-09-15 | 2001-03-14 | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6645500B1 (hr) |
EP (1) | EP1114166B1 (hr) |
JP (1) | JP2002525060A (hr) |
KR (1) | KR100671036B1 (hr) |
CN (1) | CN1318105A (hr) |
AT (1) | ATE291628T1 (hr) |
AU (1) | AU754971B2 (hr) |
CA (1) | CA2343654A1 (hr) |
CZ (1) | CZ2001789A3 (hr) |
DE (1) | DE69924392T2 (hr) |
EE (1) | EE200100149A (hr) |
ES (1) | ES2239457T3 (hr) |
HK (1) | HK1040261A1 (hr) |
HR (1) | HRP20010188A2 (hr) |
HU (1) | HUP0103578A3 (hr) |
ID (1) | ID28386A (hr) |
IL (2) | IL141588A0 (hr) |
NO (1) | NO20011304L (hr) |
NZ (1) | NZ510508A (hr) |
PL (1) | PL196790B1 (hr) |
PT (1) | PT1114166E (hr) |
SK (1) | SK3062001A3 (hr) |
TR (1) | TR200100737T2 (hr) |
WO (1) | WO2000015807A1 (hr) |
Families Citing this family (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6316408B1 (en) * | 1997-04-16 | 2001-11-13 | Amgen Inc. | Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors |
SK288559B6 (sk) * | 1997-04-16 | 2018-05-02 | Amgen, Inc. | Nukleová kyselina, polypeptid, expresný vektor a hostiteľská bunka; proteín viažuci osteoprotegerín a spôsob jeho prípravy, protilátka a liečivo na prevenciu alebo liečenie chorôb kostí |
ID28386A (id) * | 1998-09-15 | 2001-05-17 | M & E Biotech As | Metode penurunan aktivitas ligan osteoprotegerin |
GB9908263D0 (en) * | 1999-04-13 | 1999-06-02 | Binding Site The Limited | Eliciting improved immune responses |
WO2000067777A1 (en) * | 1999-05-07 | 2000-11-16 | Biofan Pty Ltd | A method of prophylaxis and treatment and agents useful therefor |
US6673771B1 (en) | 1999-07-28 | 2004-01-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of inhibiting osteoclast activity |
AU778190B2 (en) * | 1999-07-28 | 2004-11-18 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | Methods of inhibiting osteoclast activity |
WO2001023559A1 (en) * | 1999-09-27 | 2001-04-05 | Eli Lilly And Company | Osteoclast differentiation factor regulatory region |
AUPQ314799A0 (en) * | 1999-09-29 | 1999-10-21 | University Of Western Australia, The | Bone cell factor |
MXPA02007796A (es) * | 2000-02-21 | 2003-12-08 | Pharmexa As | Metodo novedoso para la disminucion de cuerpos amiloides. |
EP1259251B1 (en) * | 2000-02-21 | 2005-10-19 | Pharmexa A/S | Novel method for down-regulation of amyloid |
DK2105449T3 (da) * | 2000-02-23 | 2019-10-07 | Amgen Inc | Antagonistiske selektive bindemidler af osteoprotegerinbindende protein |
US20030103978A1 (en) * | 2000-02-23 | 2003-06-05 | Amgen Inc. | Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein |
US20030215450A1 (en) * | 2000-05-26 | 2003-11-20 | Blake Simon M | Anti-rank ligand monoclonal antibodies useful in treatment of rank ligand mediated disorders |
EP1458411A4 (en) * | 2000-08-21 | 2004-09-22 | Smithkline Beecham Corp | ANTI-RANK LIGAND MONOCLONAL ANTIBODIES SUITABLE FOR THE TREATMENT OF RANK LIGAND RELATED DISORDERS |
WO2002024228A1 (fr) * | 2000-09-21 | 2002-03-28 | Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. | Méthode de régulation de la formation d'ostéoclastes |
MXPA03002443A (es) | 2000-09-22 | 2004-12-06 | Immunex Corp | Ensayos de clasificacion para agonistas o antagonistas del activador receptor de nf-kb. |
US7128911B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
EP1385532A4 (en) * | 2001-03-22 | 2004-12-15 | Barnes Jewish Hospital | STIMULATION OF THE OSTEOGENESIS WITH RANG-LIGAND FUSION PROTEINS |
AU2002253133B2 (en) | 2001-04-03 | 2008-02-28 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Osteoprotegerin in milk |
EP2087908B1 (en) | 2001-06-26 | 2018-05-30 | Amgen Inc. | Antibodies to opgl |
MY144532A (en) * | 2001-08-20 | 2011-09-30 | Lundbeck & Co As H | Novel method for down-regulation of amyloid |
US20030109444A1 (en) * | 2001-10-12 | 2003-06-12 | Jonathan Lam | Bone anti-resorptive compounds |
JP4336467B2 (ja) * | 2001-10-15 | 2009-09-30 | 株式会社林原生物化学研究所 | 破骨細胞形成抑制因子の産生を調節し得る物質のスクリーニング方法 |
JP2005530482A (ja) | 2002-01-04 | 2005-10-13 | ゼンコー・インコーポレイテッド | ドミナントネガティブタンパク質およびそれらの用法 |
AU2003217174A1 (en) * | 2002-01-04 | 2003-07-30 | Xencor | Novel variants of rankl protein |
US7381792B2 (en) | 2002-01-04 | 2008-06-03 | Xencor, Inc. | Variants of RANKL protein |
WO2003086289A2 (en) * | 2002-04-05 | 2003-10-23 | Amgen Inc. | Human anti-opgl neutralizing antibodies as selective opgl pathway inhibitors |
US6921538B2 (en) * | 2002-05-10 | 2005-07-26 | Allergan, Inc. | Therapeutic treatments for neuropsychiatric disorders |
WO2004052233A2 (en) | 2002-12-10 | 2004-06-24 | Schering-Plough Ltd. | Canine rankl and methods for preparing and using the same |
CN1960752A (zh) * | 2004-06-02 | 2007-05-09 | 赛托斯生物技术公司 | 非人类tnf-肽的载体偶联物的医药用途 |
US20080107597A1 (en) * | 2006-01-12 | 2008-05-08 | Anaptys Biosciences, Inc. | Isolation of antibodies that cross-react and neutralize rankl originating from multiple species |
WO2008088594A2 (en) * | 2007-01-12 | 2008-07-24 | Anaptysbio, Inc. | Isolation of antibodies that cross-react and neutralize rankl orginating from multiple species |
CN101434656B (zh) * | 2007-11-16 | 2011-12-14 | 首都医科大学 | Opg-hsp70融合蛋白的制备方法及用途 |
EP3029061B1 (en) * | 2008-06-18 | 2017-09-13 | The Texas A&M University System | Mesenchymal stem cells, compositions, and methods for treatment of cardiac tissue damage |
WO2011128892A2 (en) * | 2010-04-12 | 2011-10-20 | Protea Vaccine Technologies Ltd. | Modified forms of pneumococcal surface immunogenic protein b (psipb) |
CN107286245B (zh) * | 2016-04-11 | 2021-10-08 | 北京普纳生物科技有限公司 | Pd-l1和pd-l2重组蛋白及其用途 |
CN107286244B (zh) * | 2016-04-11 | 2021-10-08 | 北京普纳生物科技有限公司 | 抗免疫检查点pd-l1和pd-l2肿瘤疫苗 |
CN108498786A (zh) * | 2018-02-13 | 2018-09-07 | 南昌大学第二附属医院 | 载骨保护素的缓释纳米粒及其制备方法和应用 |
KR102154637B1 (ko) * | 2018-11-12 | 2020-09-10 | 조선대학교산학협력단 | Rankl의 돌연변이체, 및 이를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
WO2024054566A1 (en) * | 2022-09-07 | 2024-03-14 | The Regents Of The University Of California | Treatment of cancer by blockade of osteoprotegerin |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1237764B (it) * | 1989-11-10 | 1993-06-17 | Eniricerche Spa | Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici. |
DK96493D0 (da) * | 1993-08-26 | 1993-08-26 | Mouritsen Og Elsner Aps | Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden |
WO1995005879A1 (en) | 1993-08-27 | 1995-03-02 | The Dow Chemical Company | Process for the separation of enantiomers |
EP0755444A4 (en) * | 1994-04-01 | 1998-01-14 | Univ Utah | MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION OF AN INDUCTIBLE PROTEASOME ACTIVATOR BY INTERFERON GAMMA |
US6340459B1 (en) * | 1995-12-01 | 2002-01-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients |
US6369027B1 (en) * | 1995-12-22 | 2002-04-09 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
AU5697098A (en) * | 1996-12-13 | 1998-07-03 | Schering Corporation | Mammalian cell surface antigens; related reagents |
DE69740107D1 (de) * | 1996-12-23 | 2011-03-10 | Immunex Corp | Rezeptor aktivator von nf-kappa b, rezeptor is mitglied der tnf rezeptor superfamilie |
US5843678A (en) * | 1997-04-16 | 1998-12-01 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin binding proteins |
SK288559B6 (sk) * | 1997-04-16 | 2018-05-02 | Amgen, Inc. | Nukleová kyselina, polypeptid, expresný vektor a hostiteľská bunka; proteín viažuci osteoprotegerín a spôsob jeho prípravy, protilátka a liečivo na prevenciu alebo liečenie chorôb kostí |
ID28386A (id) * | 1998-09-15 | 2001-05-17 | M & E Biotech As | Metode penurunan aktivitas ligan osteoprotegerin |
-
1999
- 1999-09-13 ID IDW20010822A patent/ID28386A/id unknown
- 1999-09-13 CZ CZ2001789A patent/CZ2001789A3/cs unknown
- 1999-09-13 PL PL346698A patent/PL196790B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-09-13 AU AU56173/99A patent/AU754971B2/en not_active Ceased
- 1999-09-13 IL IL14158899A patent/IL141588A0/xx unknown
- 1999-09-13 ES ES99942778T patent/ES2239457T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-13 TR TR2001/00737T patent/TR200100737T2/xx unknown
- 1999-09-13 HU HU0103578A patent/HUP0103578A3/hu unknown
- 1999-09-13 DE DE69924392T patent/DE69924392T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1999-09-13 WO PCT/DK1999/000481 patent/WO2000015807A1/en active IP Right Grant
- 1999-09-13 CA CA002343654A patent/CA2343654A1/en not_active Abandoned
- 1999-09-13 EE EEP200100149A patent/EE200100149A/xx unknown
- 1999-09-13 KR KR1020017003379A patent/KR100671036B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-09-13 EP EP99942778A patent/EP1114166B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-13 JP JP2000570334A patent/JP2002525060A/ja active Pending
- 1999-09-13 NZ NZ510508A patent/NZ510508A/en unknown
- 1999-09-13 CN CN99810872A patent/CN1318105A/zh active Pending
- 1999-09-13 PT PT99942778T patent/PT1114166E/pt unknown
- 1999-09-13 SK SK306-2001A patent/SK3062001A3/sk not_active Application Discontinuation
- 1999-09-13 AT AT99942778T patent/ATE291628T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-09-15 US US09/396,937 patent/US6645500B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-02-22 IL IL141588A patent/IL141588A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-03-14 HR HR20010188A patent/HRP20010188A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2001-03-14 NO NO20011304A patent/NO20011304L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-01-08 HK HK02100128.3A patent/HK1040261A1/zh unknown
-
2003
- 2003-09-17 US US10/664,801 patent/US20040115199A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HUP0103578A3 (en) | 2005-11-28 |
KR20010085807A (ko) | 2001-09-07 |
PL196790B1 (pl) | 2008-01-31 |
DE69924392D1 (de) | 2005-04-28 |
NO20011304D0 (no) | 2001-03-14 |
AU5617399A (en) | 2000-04-03 |
EE200100149A (et) | 2002-08-15 |
US20040115199A1 (en) | 2004-06-17 |
EP1114166A1 (en) | 2001-07-11 |
PT1114166E (pt) | 2005-08-31 |
ID28386A (id) | 2001-05-17 |
DE69924392T2 (de) | 2006-03-09 |
CZ2001789A3 (cs) | 2001-08-15 |
PL346698A1 (en) | 2002-02-25 |
HUP0103578A2 (hu) | 2002-01-28 |
US6645500B1 (en) | 2003-11-11 |
CN1318105A (zh) | 2001-10-17 |
NZ510508A (en) | 2005-05-27 |
HK1040261A1 (zh) | 2002-05-31 |
AU754971B2 (en) | 2002-11-28 |
TR200100737T2 (tr) | 2001-07-23 |
NO20011304L (no) | 2001-05-15 |
KR100671036B1 (ko) | 2007-01-18 |
WO2000015807A1 (en) | 2000-03-23 |
ATE291628T1 (de) | 2005-04-15 |
IL141588A0 (en) | 2002-03-10 |
EP1114166B1 (en) | 2005-03-23 |
IL141588A (en) | 2008-07-08 |
CA2343654A1 (en) | 2000-03-23 |
SK3062001A3 (en) | 2002-02-05 |
ES2239457T3 (es) | 2005-09-16 |
JP2002525060A (ja) | 2002-08-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HRP20010188A2 (en) | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity | |
US7070784B1 (en) | Method for down-regulating GDF-8 activity using immunogenic GDF-8 analogues | |
EP0975668B1 (en) | MODIFIED TNFalpha MOLECULES, DNA ENCODING SUCH MODIFIED TNFalpha MOLECULES AND VACCINES COMPRISING SUCH MODIFIED TNFalpha MOLECULES AND DNA | |
AU2006312847A1 (en) | Therapeutic vaccines targeting HMGB1 | |
US20070184023A1 (en) | Method for down-regulation of vegf | |
HRP20010824A2 (en) | Method for down-regulating il5 activity | |
US20020172673A1 (en) | Method for down-regulating IgE | |
US20050063952A1 (en) | Immunogenic CEA | |
JP2005518194A (ja) | 乱交雑t細胞エピトープ挿入物を有するマルチマータンパク質の免疫原性擬態物 | |
ZA200403686B (en) | Immunogenic mimetics of multimer proteins with promiscuous T cell epitope inserts | |
JP2007523605A (ja) | 細胞毒性が低減された免疫原性ヒトTNFαアナログおよびそれらの製造方法 | |
EP1541587A2 (en) | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity | |
ZA200102131B (en) | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity. | |
HALKIER et al. | Sommaire du brevet 2343654 | |
HALKIER et al. | Patent 2343654 Summary | |
KR20050052499A (ko) | 자가 그렐린에 대한 면역화 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A1OB | Publication of a patent application | ||
ARAI | Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application | ||
ODRP | Renewal fee for the maintenance of a patent |
Payment date: 20070906 Year of fee payment: 9 |
|
OBST | Application withdrawn |