JPH02101017A

JPH02101017A - 疾患治療用医薬組成物

Info

Publication number: JPH02101017A
Application number: JP63249944A
Authority: JP
Inventors: Nobuya Kitaguchi; 暢哉北口; Yasuyuki Takahashi; 保之高橋
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1988-10-05
Filing date: 1988-10-05
Publication date: 1990-04-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、疾患治療用医薬組成物に関する。詳しくは、
優れた抗トリプシン作用、抗キモトリプシン作用、抗活
性型血液凝固Ｘ因子作用（以下、活性型血液凝固Ｘ因子
をファクターＸａと記す）、抗カリクレイン作用を有す
るペプチドを、少なくともその一部に含む化合物を有効
成分として含有する、上記医薬組成分に関する。

更に、上記化合物を有効成分として含有する、膵炎治療
薬及び汎発生血管内血液凝固症（以下、ＤＩＣと略す）
の治療・薬として有効な医薬組成物に関する。

（従来の技術）蛋白分解酵素阻害作用をもつ蛋白性の象、性膵炎治療薬
として、アプロチニン（ウシ膵臓トリプシンインヒビタ
ー）が広く用いられている。アプロチニンは分子量６５
００の抗トリプシン、抗カリクレイン作用物質であり、
とくに栄、性膵炎発症直後の大量投与が有効とされてい
る。しかしアプロチニンは、ウシ由来の蛋白であるため
反復投与によりショックを引きおこすことがある〔日本
臨床４４巻　秋季臨時増刊号　７６６〜７６７゜（１９
８Ｂ））。さらにアプロチニンは、血液凝固系の酵素で
あるファクターＸａやトロンビンに対する阻害が弱く、
重症急性膵炎においてしばしば併発するＤＩＣの治療に
は適さない。

（発明が解決しようとする問題点）本発明者らは、急性膵炎の治療薬及び重症急性膵炎時に
併発するＤＩＣｌさらには種々の基礎疾患により生じる
ＤＩＣ等の治療薬で、ショック等を惹起しない医薬組成
物を得るために、鋭意検討した結果本発明を完成するに
至った。

本発明の主たる目的とするところは、抗トリプシン活性
、抗キモトリプシン活性を有し、かつ血液凝固系酵素で
ある抗ファクターＸａ活性、抗カリクレイン活性を有し
、さらにはショックを惹起しにくい蛋白分解酵素阻害剤
を有効成分として含む疾患治療用医薬組成物を提供する
ことにある。

（問題点を解決するための手段）本発明は、」二速の目的を達成すべく本発明者らが鋭意
研究を重ねた結果、下達する知見を得、該知見に基づい
て本発明者らによる更なる研究の結果、完成に至ったも
のである。

すなわち本発明者らは、蛋白分解酵素阻害活性を有する
新規な老人斑アミロイド前駆体蛋白を発見し、その１−
リプシン阻害活性を確認した（Ｎ。

Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　
　３３１　、５３０−５３２（１９８Ｂ））。そして本
発明者らは、そのトリプシン阻害活性は、下記の一般式
（１）で表わされるペプチドの存在が必須であることを
見出した（既に特願昭６３−２０１９９８号として出願
済み）。

一般式（Ｉ）：Ｖａｌ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒ。

Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｈａ−Ｍｅｔ、　Ｉ　Ｉｅ−５ｅｒ
−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ八ｓへ−Ｖａｌ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒ
ｏ−ＰｈｅＰｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−＾ｓｎ八５へ−Ｐｈ
ｅ−＾ｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ
−Ｍｅｔ−八ＩａＶａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−３ｅｔ−Ａ
ｌａ（但し式中、Ａｌａ　；アラニン、Ａｒｇ　；アル
ギニン、Ａｓｎ　；　アスパラギン、＾Ｓｐ；　アスパ
ラギン酸、Ｃｙｓ　；　システィン、Ｇｌｎ　；　グル
タミン、Ｇｌｕ　；グルタミン酸、ｃｔｙ　、グリシン
、Ｈｉｓ　；　ヒスチジン、Ｉｃｅ　；　イソロイシン
、Ｌｅｕ　；　ロイシン、Ｌｙｓ　；　リジン、Ｍｅｔ
　；　メチオニン、Ｐｈｅ　；　フェニルアラニン、Ｐ
ｒＯ；　プロリン、Ｓｅｒ；　セリン、Ｔｈｒ　ｉ　ス
レオニン、Ｔｒｐ；）リプトファン、Ｔｙｒ　；チロシ
ン、　Ｖａｌ　；バリン残基を各々示す）。

一般式（１）で表わされるペプチドはアプロチニン等の
クニック（Ｋｕｎｉｔｚ）型塩基性トリプシンインヒビ
ター類と高い相同性を有する。クニック型塩基性トリプ
シンインヒビター類は、トリプシンなどのセリンプロテ
アーゼを阻害するといわれているが、トリプシン以外の
セリプロテアーゼに対する活性は一般には強くない。ま
た、一般式（１）で表わされるペプチドは、酸性アミノ
酸残基数の方が塩基性アミノ酸残基数よりも多く、一般
式（１）の範囲に限れば酸性のトリプシンインヒビター
となり、その阻害活性は他のクニック型塩基性トリプシ
ンインヒビターとは異なる可能性があることを本発明者
らは予測した。

急性膵炎では、膵臓及びそこから逸脱したトリプシンに
より種々のカリクレインやエラスターゼ等の蛋白分解酵
素や、ホスホリパーゼＡ２が活性化され、それら活性化
酵素により、また膵臓から逸脱した膵カリクレインにも
よって、膵臓や他臓器の消化がずずむので、強い抗トリ
プシン作用及び抗カリクレイン活性をもつことは膵炎の
治療薬として重要である。また、重症急性膵炎に併発す
るＤＩＣや、その他の基礎疾患によるＤＩＣにおいては
、トロンビン、血漿カリクレイン、ファクターＸａ等の
セリンプロテアーゼが、血液凝固や血栓の形成を惹起す
るのでこれらの酵素を阻害することが重要である。とく
にファクターＸａについては、プロトロンビンからトロ
ンビンが生しる経路を触媒し、１分子のファクターＸａ
から１０５分子（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、、上５　、６
１７−６２９　　（１９７９）］（１１０２分との記述
もある〔山崎博男、臨床検査ＭＯＯＫ　　Ｎｏ、３０．
１−１５　　（１９７９）））のトロンビンが生成する
といわれており、トロンビンを阻害するよりもファクタ
ーＸａを阻害する方がはるかに効率がよいと考えられる
。

またＤＩＣの亢進時、凝固因子がもはや欠乏して全身に
出血傾向がでることが多い。この場合はプラスミンを阻
害する活性が必要で、ＤＩＣ治療薬としては強い抗凝固
活性とともに、抗プラスミン活性をもつことが重要であ
る。

本発明者らは、一般式（１）で表わされるペプチドをそ
の一部に含む種々の化合物を作成し、その蛋白分解酵素
阻害活性を測定したところ、抗トリプシン活性の他に強
い抗キモトリプシン活性及び抗圧カリクレイン活性、抗
血漿カリクレイン活性、抗ファクターＸａ活性、さらに
抗白血球エラスターゼ活性、さらにまた抗プラスミン活
性を有することを見出し本発明を完成した。とくに抗フ
ァクターＸａ活性は、アプロチニンに比べ１０３倍Ｋｉ
が小さく、阻害活性はアプロチニンに比し著しくすくれ
ており、抗凝固剤として望ましい性質を有している。

本発明にかかる化合物とは、一般式（１）で表わされる
アミノ酸配列を有するペプチドを、少なくともその一部
に含む化合物である。例えば、本発明者らがすでに発見
し出願した（特願昭６３２０１９９８号）新規な老人斑
アミロイド前駆体の一部である以下の一般式（ＩＩ）及
び一般式（ＩＩ［）で表わされるアミノ酸配列を含むペ
プチド等が挙げられる。

一般式（■）：Ｇｌｕ−（１）　−Ｉｃｅ（但し式中、（１）は一般式（１）と同じアミノ酸配列
を有するペプチド。）一般式（■）：Ｇｌｕ−（１）　−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＬｙｓＴｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−＾１ａ−八ｒｇへ＾５ｐ−Ｐｒ。

Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（但し式中、（１）は一般式（１）と同じアミノ酸配列
を有するペプチド。）また、これらのペプチドのＮ末端又はＣ末端等にシステ
ィン−ＭＢＳ（メタマレイミド安息香酸（Ｎ−ヒドロキ
シサクシニイミド）エステル〕等のいわゆるスペーサー
を介して又は介さないで、別のペプチドを結合したもの
も本発明にかかる化合物に含まれる。また、一般式（１
）で表わされるアミノ酸配列とは１〜数アミノ酸異なり
、尚かつ蛋白分解酵素阻害活性を有する変異体も、本発
明にかかる化合物に含まれる。

本発明で用いるペプチドは、そのアミノ酸配列をコード
するＤＮＡを適当なプロモーターの下流に接続し、適当
な宿主へ形質転換し、形質転換体を培養することにより
産生せしめることができる。

また、本発明で用いるペプチドは、アミノ酸を出発原料
として有機合成により製造することもできる。その場合
の方法としては、例えば、生化学実験講座第１巻、タン
パク質の化学■（日本生化学会編、東京化学同人）に詳
しく記されている方法を用いることができる。また別に
、ペプチド合成機を用いる固相合成法により製造するこ
ともできる。ただし、アミノ酸残基数が多いので、収率
は一般にあまり高くない場合が多い。

本発明にかかる化合物の蛋白分解酵素阻害活性発現には
、一般式（１）のペプチドの６個のシスティンが正しく
Ｓ−３結合をつくり、正しい形にフォールディング（お
りたたみ）されることが望ましい。動物細胞で発現させ
た場合はこの点の問題はないが、微生物宿主とくに大腸
菌で発現させた場合及び有機化学合成を行なった場合は
、グアニジン塩酸でいったん水素結合を切り、かつメル
カプトエタノールやジチオスレイトール等でＳＳ結合を
いったん還元後、自然酸化で正しいフォルディングをさ
せて、蛋白分解酵素阻害活性を発現させることが多い。

このようにして、形質転換体からの産生、有機合成、Ｄ
ＮＡ組換え技術等によって得られた来光明にかかる化合
物は、蛋白又はペプチドの精製方法として知られる各種
の方法を組合わせることによって精製することができる
。そのような方法としては例えば、高速液体クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、硫
安沈澱などの塩析等を用いることができる。

とくに、本発明にかかる化合物は、蛋白分解酵素阻害活
性を有するため、蛋白分解酵素を結合した担体を用いた
、アフィニティー精製法が有用である。例えば、トリプ
シン又はキモトリプシンを結合したアガロース又はポリ
アクリルアミドなどである。このアフィニティー精製法
は、比較的短いペプチドを含む本発明にかかる化合物を
精製する場合にとくに有用である。あまり長いペプチド
は、担体に結合した蛋白分解酵素により分解されてしま
う可能性がある。

本発明の医薬組成物は、本発明にかかる化合物を単独で
又は薬剤的に可能な担体と複合して投与される。その組
成は、化合物の溶解度、化学的性質、投与経路、投与計
画等によって決定される。

たとえば、化合物を非経口的に筋肉内注射、静脈内注射
、皮下注射で投与する場合、溶液を等張にするために食
塩あるいはグルコース等の他の溶質を添加した無菌溶液
として使用される。また、でんぷんや乳糖等の適当な賦
形剤を含む錠剤、カプセル剤、顆粒剤や、溶液の状態で
経口投与も可能である。ただし本発明にかかる化合物は
、ペプチドを含む分子量の比較的大きな薬剤なので、腸
管吸収性の点から非経口投与が望ましい。経口投与の場
合は、消化管内に存在している蛋白分解酵素を阻害する
作用が主になる。非経口投与では薬効が早くあられれる
点で、静脈内注射や点滴静注などが好ましい。

本発明の医薬組成物の投与量は投与法、化合物の種類、
患者の状態等を勘案して医師によって決定される。

（発明の効果）本発明の医薬組成物によれば急性膵炎の治療及び重症急
性膵炎に併発するＤＩＣや種々の基礎疾患から惹起され
るＤＩＣ等の有効な治療が可能となり、従って本発明の
組成物は疾患治療用医薬組成物として有用である。

（実施例）以下に実施例により本発明を詳述するが、本発明は該実
施例によって限定されるものではない。

尚、実施例中に実験書として記載されている文献は下記
の底置を示す。

マニアティスら著モレキュラー・クローニング・ア・ラ
ボラトリ−・マニュアル、コールド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ−出版、１９８２年（Ｔ、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇＡ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　　（１９８２）　）実施例に記載の略称及全略
号で、本文中には記載のないものは以下の通りのもので
ある。

リガーゼ緩衝液７０．０５Ｍ　）リス（ｐＨ７，４）１
０．０１Ｍ　ＭｇＣＲｗ／　０．０１　Ｍジチオスレイ
トール／１ｍＭスペルミジン／１ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清
アルブミン、ＰＢＳ　（−）：ダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（Ｃ
ａ２Ｚ　”ｇ”不合）、Ｌ培地：バクトトリブトン１０ｇ／イーストエキストラ
クト５ｇ／塩化ナトリウム５ｇを水１１に？８解したも
の。

ＰＢＳ　：ダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液Ｔ　Ｂ　Ｓ
　：　０．０５　Ｍ　トＩＪ　、ｌ、−塩酸（ｐＨ７，
５）　／　０．９ｗ／ｖ％ＮａＣｌ！。

ＦＣ３ｎ牛脂児血清ＤＭＳＯニジメチルスルホキシドＢＳＡ：ウシ血清アルブミン〔蛋白分解酵素阻害活性ペプチドとヒト腫瘍壊死因子（
ＴＮＦ）融合タンパクの大腸菌での発現〕工程上皿上〔蛋白分解酵素阻害活性領域のサブクローニング〕第２図（Ａ）　（［Ｎａｔｕｒｅ　３３１．５３０　（
１９８０）］に示されたＡＰ７７０のｃＤＮＡを含むプ
ラスミドｐＡＰＰ７７０の配列の一部を第１図に示す。

この塩基番号８６６番から１０９０番に相当する部分を
第２図（Ａ）中で黒く塗りつぶした）に示したストラテ
ジイに従ってプラスミドを構築した。

即ち、ｐＡＰＰ７７０の３μｇをＡｃｃＩとＸｈｏｌで
消化し、１％低融点アガロースゲル電気泳動により約９
００ｂｐの断片を切出し、精製した。次にこのＡｃｃ　
Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片をＸｈｏＩＩで３７°Ｃ１，５時
間消化し、そののち反応緩衝液をＴａｑＩ用に調製して
から、Ｔａｑｌで６５°Ｃ１時間消化した。この反応液
をフェノール抽出後、マニアティスの実験書記載の方法
に準じた急速ゲル濾過法で緩衝液交換を行ったのち、１
％低融点アガロースゲル電気泳動により、約２３０ｂｐ
のＴａｑ　Ｉ　−ＸｈｏＩ［断片を切出し精製した。

一方、ＢＲＬ社の、ＳＰ６プロモーター及びＴ７プロモ
ーターを含むプラスミドｐＳＰ６／Ｔ７１９の２μｇを
ＡｃｃｌとＢａｍＨＩで消化後、１％低融点アガロース
ゲル電気泳動により、目的とするベクター断片を切出し
精製した。

こうして得たＴａｑＩ−ＸｈｏＩＩ断片と、ＡｃｃＩ。

ＢａｍＨＩ切断ヘクター断片とをリガーゼ緩衝液中、Ａ
ＴＰの存在下でＴ４リガーゼを用いて１５°Ｃ２時間反
応させることにより連結した。この反応液を、マニアテ
ィスの実験書の記述に従い、大腸菌ＭＣ１０６１に処理
することにより、アンピシリン耐性のコロニーを得た。

これらのコロニーから１２個を任意に選び、簡便法でプ
ラスミドを単離し、５ｃａｌで消化し、アガロースゲル
電気泳動を行ったところ、３クローンが、約１．５　ｋ
　ｂ　ｐと１゜７ｋｂｐの断片を与え、目的とするクロ
ーンであることがわかった。こうして得たプラスミドを
ｐＳＰＧＰ２ＴＸとした。

本プラスミドは、Ｔ７プロモーター下流に、ＡＰＰ７７
０ｃＤＮＡにコードされた蛋白分解酵素阻害活性領域（
以下この領域をＰＩと略す）をコードする塩基配列を有
している。

工■土二）［ｔ　ｒｐプロモーター発現用プラスミドの構築］下記
に示す手順に従ってｔｒｐプロモーター制御下でヒト腫
瘍壊死因子（以下ＴＮＦと略す）を発現するプラスミド
ｐ　ＨＮ　ｔｒｐ５３５を構築した。

具体的にはプラスミドｐ　ＨＮ　ｔａｃ４　（Ｓｈｉｒ
ａｉ、Ｔ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１３．８０３−８０
６．　（１９８５）　）をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｃＩＩ
で二重切断し、ｔａｃプロモーターの一部を含む約２２
０ｂｐのＤＮＡ断片を切出し精製した。この断片と以下
のような配列を有する４本の合成りＮＡ、ＴＲＰ−１，
ＴＲＰ２、ＴＲＩ”３．ＴＲＰ−４ＴＲＰ−１：５’−ＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧ＾
八ＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴ−３′へＲＰ−２：５′−＾Ｇ
ＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡ
ＴＣＧ−３′ＴＲＰ−３：５’−ＧＡＴＣＣＧＡＴＡＣ
ＣＣＴＴＴＴＴＡＣＧＴＧＡＡＣＴＴＧ−３’ＴＲＰ−
４：５’−ＣＧＴＡＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴＡＧＴＴＣＧ
ＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＧＴＣ−３′を混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結した。

次いで、反応物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで二重切断し
、約２７０ｂｐのｔｒｐプロモーター断片を切出し精製
した。

一方、ｐＨＮｔａｃ４をＸｈｏＩ［とＨｉｎｄｌ［Ｉで
切断し、ヒ）ＴＮＦ遺伝子を含む約６００ｂｌ）の断片
を切出し精製し、上記で得たプロモーター断片及びＥｃ
ｏＲＩとＨｉｎｄＩ［［切断したプラスミドｐＢＲ３２
７（Ｓｏｂｅｒｏｎ、　Ｘ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎ
ｅ＋　９＋　２８７２９６　（１９８０））を混合し、
Ｔ４リガーゼにより連結せしめた。反応物を大腸菌ＭＣ
１０６１（ファルマシア社）に形質転換し、プラスミド
を解析した結果、ｔｒｐプロモーター下流にヒ）ＴＮＦ
遺伝子を持つ発現プラスミドｐＨＮｔｒｐ５３５を得た
。

千■上二１（ＰＩ発現用プラスミドの構築）第２図（Ｂ）に示される手順に従って、ｔｒｐプロモー
ター下流に開始コドンＡＴＧを介してＰＩ領領域組込ん
だプラスミド、ｐＰＩｔｒｐ３１４を構築した。

まず、発現ベクターｐＴＧＦβｔｒｐを構築した。

具体的にはプラスミドｐＵ０１Ｂ（宝酒造）をＨ４ｎｄ
　ＩＩＩ及びＥｃｏＲ，Ｉで切断し、約２．７ｋｂのＨ
ｉｎｄ　ｍＥｃｏＲＩ断片を得た。一方、工程１−２で
得たｐＨＮｔｒｐ５３５をＨｉｎｄｌｌ＋及びＢａｍＨ
Ｉで切断し、ｔｒｐプロモーターを含む約２５０ｂｐの
Ｈｉｎｄ　ＴＭＢａｍＨＩ断片を得た。さらに、Ｅｐｉ
ｄｅｒｍｏｉｄ　ｃａｒｃｉｎｏｍａであるＫＢ細胞（
ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ　１７）より調製ししたｐｏｌｙ
（Ａ）”　ＲＮＡを基質として合成したｃＤＮＡライブ
ラリーよりプリンクらの報告（Ｄｅｒｙｎｃｋ、Ｒ，、
ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、３１６　、７０１７０
５（１９８５）　：ｌに従って単離したヒト腫瘍細胞増
殖因子（ＴＧＦ−β）ｃＤＮＡ中、成熟ＴＧＦβコーテ
ィング領域５°末端にＢａｍＨ１部位及び翻訳開始コド
ンＡＴＧを、さらに３゛末端にＨｉｎｄｌ［１部位をそ
れぞれ人為的に付加した約０．７　ｋ　ｂ断片を得た。

上記で得られた断片を連結せしめ、発現プラスミドｐＴ
ＧＦβｔｒｐを得た。

本プラスミドｐＴＧＦβｔｒｐを、制限酵素Ｎｃ。

Ｉで切断後、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメン
トで平滑末端とし、さらにＥｃｏＲＩで切断した。ゲル
切出しにより、ｔｒｐプロモーターを含むベクター切断
を単離精製した。一方工程１−１で得たｐＳＰＧＰ２Ｔ
Ｘを制限酵素Ｔａｑｌで切断後、ＤＮＡポリメラーゼＩ
クレノウフラグメント（宝酒造）を用いて平滑末端とし
、さらにＥｃｏＲＩで切断した。１％低融点アガロース
ゲル電気泳動後、Ｐｌをコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｗ
４域を含む約２４０ｂＰの断片を回収した。これら２断
片をＴ４リガーゼにより連結し、大腸菌ＪＭ１０５に導
入せしめ、目的とするプラスミドｐＰＩｔｒｐ３１４を
得た。

Ｍ１３シークエンシングキット（宝酒造）を用いて、本
プラスミドｐＰＩｔｒｐ３１４の一部の塩基配列を決定
した結果、ｔｒｐプロモーター下流に翻訳開始コドンＡ
ＴＧ、更にＡｒｇをコードするコドンを介してＰＩ領領
域同じ読み枠で連結されていることが確認された。

工程上ニ↓ （ＰＩとヒト’ｒＮＦ融合タンパク発現プラスミドの構
築〕第２図（Ｃ）に示される塩基配列を有する合成リンカ−
（Ｘａ　１ｉｎｋ　　ＡＳ）を調製した。該リンカ−は
、両端にＡｖａｌおよび５ｓｔＩ部位を有し、さらに血
液凝固関連プロテアーゼであるファクターＸａの認識、
切断アミノ酸配列（Ｎａｇａｉ、　Ｋ。

Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ、Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ、　３０９．８
１０−８１２　（１９８４）］を持つように設計した。

該図中の手順に従い、工程１−３で得たプラスミドｐＰ
Ｉｔｒｐ３１４を、制限酵素Ａｖａｌおよび５ｓｔＩで
二重切断し、ゲル切出しにより断片単離後、上記合成リ
ンカ−と連結し、ｐ　Ｐ　Ｉ　Ｘ　ａ３１４２を構築し
た。

次に工程１−２で得たｐＨＮｔｒｐ５３５を第２図（Ｄ
）の手順に従い断片化した。即ち、５ｓｔＩ及びＰｓｔ
ｌで切断した約３ｋｂ断片およびＰｓｔｌ及びＨｉｎｄ
ｌ［［で切断した約０．９　ｋ　ｂ断片を各々切出し精
製した。

これらの断片と、上記で得たｐＰＩＸａ３１４２のＨ４
ｎｄｌｌｌ、　　５ｓｔＩ切断による生じる約０．５ｋ
ｂの断片を切出し精製したものを連結せしめ、大腸菌Ｍ
Ｃ１０６１に形質転換し、目的とするプラスミドｐｌＸ
Ｔｔｒｐ７２６を得た。本プラスミドはｔｒｐプロモー
ター下流にＡＴＣさらにＡｒｇをコードするコドンを介
して、ＰＩ域を含む７１アミノ酸−Ｘ’ａ認識配列−ｈ
、ＴＮＦ融合タンパクを大腸菌内で発現しうる構造を持
っている。

工程よ二重〔融合タンパクの大腸菌内での発現〕工程１−４で得たｐｌＸＴｔｒｐ７２６及びコントロー
ルとしてｐＢＲ３２７を大腸菌Ｙ１０８９に形質転換せ
しめ、それぞれの菌体を５０μｇ／ｍ！のアンピシリン
及び５μｇ　／　ｍＲのテトラサイクリンを含むＩ、培
地で３７゛Ｃにて一晩培養した。かかる培養液各１　ｍ
ｌｌを、上記濃度のアンピシリン及びテトラサイクリン
を含む、１％カザミノ酸、０．２％グルコース含有Ｍ９
培地５０ｍ１に加え、３７°Ｃにて２４時間培養せしめ
た。

遠心分離により各培養液２　ｍｌより集菌し、２０ｍＭ
）リス塩酸（ｐＨ７，５）に再懸濁した。オーフケ・ソ
ニケーター（大岳製作所）を用いて菌体を超音波破壊し
、遠心分離後上清を得た。該上清中に含まれるＴＮＦ活
性を、ルフらの方法（Ｒｕｆｆ。

Ｍ、Ｒ，、Ｇｉｆｆｏｒｄ、　　Ｇ、Ｅ、、　　Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１２６１２７９　（１９８１）　
）に従い、マウスＬ細胞障害効果により測定した。その
結果、対照としたｐＢＲ３２７保持菌では顕著なし細胞
障害活性は認められなかったのに対し、ｐｌＸＴｔｒｐ
７２６保持菌破壊上清中にはｍ！当たり３３８単位のし
細胞障害活性が検出された。

また上記で得た培養菌体の一部を、レムリーの方法（Ｌ
ａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７
６８０−６８５（１９７０）　）に従って、５ＤＳ−サ
ンプルバッファー中で煮沸後、１５％アクリルアミドゲ
ルを用いて５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
供した。泳動後、バイオランド社製トランス・プロトコ
ールを用い、付属のプロトコールに従って、ニトロセル
ロースフィルターに転写シタ。該フィルターを、ＢＲＬ
社のマニュアル（Ｉ　ｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｇｕｉｄｅ）に従って処理し
、抗ｈＴＮＦウサギ抗血清によるＴＮＦ分子のイミュノ
ディテクションを行なった。その結果、目的とするＰＩ
−Ｘａ認識配列−ｈＴＮＦ融合タンパクと推定される２
８キロダルトンのバンドが発色し、目的融合タンパクの
大腸菌内での発現が確認された。

工丘土二■ 〔融合タンパクの精製〕工程１−５で得たｐｌＸＴｔｒｐ７２６を有する大腸菌
Ｙ１０８９を、工程５記載の培地２Ｉ！、を用い、３７
°Ｃで２４時間培養せしめた。

遠心分離により菌体を集め、１ｍＭのＰＭＳ　Ｆ（Ｐ　
ｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　Ｆ　Ｉｕ
ｏｒｉｄｅ）を含む２０ｍＭ１−リス塩酸（ｐＨ７，５
）２００ｍｌ！に再懸濁した。かかる菌体をマントン・
ゴーリンを用いて破壊し、遠心分離後、上清を回収した
。

得られた上滑を、セファロース４Ｂ（ファルマシア社）
に固定化した抗り、ＴＮＦモノクローナル抗体カラム（
１ｃｍＸ　１０ｃ＋＋＋）に２　ｒｔｄｌ　／　ｈの流
速で吸着させた。カラムを４０戚のＰＢＳ　（−）で４
回洗浄し、次いでＩＭＫＳＣＮを含むＰ　Ｂ　Ｓ　（−
）２０ｒｄで溶出させた。

溶出液をセントリコン１０＠アミコン社）を用いて脱塩
・濃縮し、最終的には２０ｍＭｌ−リス塩酸（ｐＨ７，
５）１ａ＋１の溶液とした。

得られた精製融合タンパクのトリプシン・インヒビター
活性及びＬ細胞障害活性を測定した結果、アプロチニン
１１０６ｎ／Ｍ１に相当するトリプシン・インヒビター
活性及び３２８ｕｎｉｔｓ／ｄのＬ細胞障害ＴＮＦ活性
が存在していた。

１貫１−７ＣＰＩ高発現プラスミドの構築〕工程１−４で得たｐｌＸＴｔｒｐ７２６を制限酵素５ｔ
ｕｌで切断後、ＸｂａＩリンカ−ＤＮＡ　（５’ＣＴＣ
ＴＡＧＡＧ−３’　）をＴ４リガーゼにより連結し、次
いでＸｂａ　Ｉ　、　ＥｃｏＲＩにより二重切断した。

生じた約０．５Ｋｂｐの断片を切出し精製し、Ｘｂａ　
Ｉ　、　ＥｃｏＲＩで切断したｐＵｃ１９に挿入した。

大腸菌ＭＣ１０６１に形質転換し、目的とするプラスミ
ドｐＰＩｔｒｐ７５−１を得た。本プラスミドは第２図
（Ｅ）に示されるようにｔｒｐプロモーター下流に、翻
訳開始コドン及びＡｒｇコドンを介して、ＰＩ領領域含
む７１アミノ酸、以下Ａｒｇ−Ｌｅｕ−停止コトンをコ
ードする塩基配列を有している。

工■土二■ （ＰＩとヒトＴＮＦ融合タンパクの動物細胞での分泌用
プラスミドの構築）工程１−４で得た該融合タンパクを動物細胞により発現
させ、かつ培地中に分泌させるためマウスメタロチオネ
インｍＭＴプロモーター制御下で、ヒト組織型プラスミ
ノーゲンアクチベータ−（以下ｔＰＡと略す）を発現す
るプラスミドｐＳＶＭＴ−ｔＰＡを構築した。本プラス
ミドは以下の２本のＤＮＡ断片より構築されている。

■　ｍＭＴプロモーター、ＳＶ４０複製オリジン、アン
ピシリン耐性遺伝子、ｐＢＲ３２２の複製オリジン、及
びＳＶ４０転写終結配列を含むＢｇｌＩＩＨ４ｎｄｎ１
部位約３．７　ｋ　ｂ断片。

■　ペニカらの報告（Ｐｅｎｎｉｃａ、　Ｄ、、　ｅｔ
　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、　３０１．２１４〜２２１．　（１９８
３）　）に従って単離したヒトｔ　ＰＡ　ｃＤＮＡ中約
２．２　ｋ　ｂの領域の両端に、ＢａｍＨＩ切断部位及
びＨｉｎｄＩ［Ｉ切断部値をそれぞれ人為的に付加した
断片。

本プラスミドｐｓＶＭＴ−１ＰＡを、ＢｇｌＩＩ及びＨ
ｉｎｄＩ［ｌで切断し、生じた約３．７　ｋ　ｂの断片
を切出し精製した。一方工程１−４で得たプラスミドｐ
ｌＸＴｔｒｐ７２６を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
Ｉ［Ｉで二重切断し、生じた約０．８　ｋ　ｂ断片を切
出し精製した。

上記で得た２断片を第２図（Ｆ）で示されるごとく連結
し、大腸菌ＭＣ１０６１に形質転換せしめ、目的とする
プラスミドル　ＳＶＭＴ−Ｐ　Ｉ　ＸＴを得た。本プラ
スミドは、ｍＭＴプロモーター下流に、ｔ−ＰＡのシグ
ナル配列を介してＰＩ領域Ｘａ認識配列−ｈ−ＴＮＦ融
合タンパクをコードする領域が同−読み枠で翻訳される
ように構築されている。

工１０と１１（分泌型ＰＩの動物細胞での発現と大量調製（ｃｏｓ−
ｉ細胞）〕ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄｌ［ｌで切断し、生じた約２４
０ｂｐの断片を単離し、工程１−８で用いたｐＳＶＭＴ
−ｔＰＡをＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩ［Ｉ切断して得ら
れるヘクタ一部分に挿入、連結した。本混合物を大腸菌
ＭＣ１０６１に形質転換し、目的とするプラスミドｐ　
ＳＶＭＴ−ＡＰＰ　Ｉを得た〔第２図（Ｇ）〕。

本プラスミドはｍＭＴプロモーター下流に、第２図（Ｈ
）に示されるｔＰＡシグナル配列に続いてＰＩを含む１
１１アミノ酸をコードするＤＮＡを有する構造を持つ。

■　’　　ＰＩのＣＯ３−１での ■で得られたプラスミドｐｓＶＭＴ−ＡＰＰ１２０μｇ
を、サル由来のＣＯ３−１細胞、４×１０６個に導入し
た。導入はバイオランド社製シーンパルサーを用い、２
回電気パルス（コンデンサ容量３μＦ、電圧４００Ｖ）
を２７２ｍＭスクロース、７ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ
７，４，１ｍＭＭｇＣｆｆ１．中で与えることによった
。導入後の細胞を、１０％ＦＣ３を含むダルベツコ変法
最小基本培地中で３７°Ｃ１５％ＣＯ□の条件下で２４
時間培養後、ＰＢＳ　（−）で洗浄し、血清を除いたの
ち、血清を含まない培地に交換し、４８時間培養後、培
地を交換し、以後２日おきに培地交換を行い計４回の培
養上清を回収し、各上滑に含まれるトリプシン阻害活性
を測定した。

トリプシン阻害活性は次のような方法で行った。

５０μ！の培養上清を、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミ
ン　シグマ社製）を含むＰＢＳで、９６穴プレート上で
倍々希釈し、×２〜Ｘ１０２４倍希釈したサンプル液各
５０μ！を調製した。これに１、２５　ｕｎｉｔ／　ｄ
、の濃度のトリプシン液（シグマ社製）５０μｌを加え
室温で１０分放置後、９％ＤＭ、ＳＯに溶解した１、８
■／＃ｌｌ！のＢＡＰＮＡ　（ＮαＢｅｎｚｏｙｌ−Ｄ
　Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｐ　−Ｎ１ｔｒｏａｎｉｌｉ
ｄｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、　シグマ社製）１０
０μｆを加えて３７°Ｃで一晩放置後、４０５ｎｍの吸
光度を測定した。測定はＴ　ｉ　ｔｅｒｔｅｃｈ社製マ
ルチスキャンを用いた。測定値をタテ軸゛に、希釈率を
横軸にとりグラフを書き、バックグラウンドをさし引い
た最大実吸光度の半分の値を与える希釈率ＩＣ５０を求
め、同時に測定した４　００　ｎｇ／ｍｌの濃度のＢＰ
ＴＩの希釈率吸光度曲線と比較し、ＢＰＴＩに相当する
トリプシン・インヒビター活性を次式にしたがって求め
た。

式：　（ＩＣｓｏ（Ｓａｍｐｌｅ）／ＩＣ５ｏ（ＢＰＴ
Ｉ））Ｘ４００・）　ｎｇ／ＩＩｄｌ各培養上清の活性
はそれぞれ戚あたり、アプロチニン８４４，８４４，８
８０，５１１ｎｇに相当するインヒビター活性が発現さ
れていることが確認された。

さらに得られた培養上清の一部をセントリコン１０■を
用いて分画したところ、インヒビター活性は、分子量１
０キロダルトン以上の両分に濃縮された。この両分を５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後クマシー染色
をした結果、対照としたｐＳＶＭＴ−ｔＰＡ導入細胞の
培養上清と比較して、１５〜１９キロダルトンの位置に
分泌されたＰＩと考えられる特異的バンドが検出された
。

この分泌されたＰＩを以後ＳＰＩと略す。分泌後のｓＰ
Ｉの推定分子量は約８キロダルトンであることから、Ｃ
０８−１細胞でｓＰＩは糖鎖付加されていることが示唆
された。さらに上記画分を５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動後ＰＡＳ染色（ｐｅｒｉｏｄｉｃ　ａｃｉ
ｄ−５ｃｈｉｆｆ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｆｏｒ　ｄｅｔ
ｅｃ−Ｌｉｏｎ　ａ　ｓｕｇａｒ　ｃｈａｉｎ）　した
結果、ｓＰＩは強く発色し、糖鎖が付加されていること
が確認された。

■　（ンへ　　ＰＩ　　の　　　　８　１前項■記載の
方法でプラスミドｐ　Ｓ　ＶＭＴ−ＡＰＰＩをＣ０８−
１細胞に導入した。導入工程を４０回行ない、さらに２
日おきに培地交換を３回繰り返すことにより、計１．２
１の培養上清を得た。

該培養上清に対して、アセトンを終濃度４０％となるよ
うに加え、−２０°にて１時間放置後、５０００ｒｐｍ
、−１０°Ｃで２０分間遠心分離し、上清を回収した。

回収上清に、さらに終濃度８０％となるようにアセトン
を加え、−２０°Ｃにて１時間放置後、遠心分離し、沈
澱を回収した。得られた沈澱を５０ｍ１の２０ｍＭ）リ
ス塩酸（ｐＨ７，５）に懸濁し、５０００ｒｐｍ、４°
Ｃにて１０分間遠心分離し、上清を回収した。

次いでこの上清５０ｍ２に対し、ＴＰＣＫ処理済みのト
リプシン固定化アガロースビーズ（シグマ社）１５０単
位を加え、３７°Ｃで１０分間振とうせしめ、インヒビ
ターを吸着させた。かかる懸濁液を、５′プライム→３
′プライム社のセレクトＳ■空カラムに充てんし、アガ
ロースビーズを回収した。以下、アガロースビーズとバ
ッファーとの分離は、１０１０００ｒｐ分間の遠心操作
により行なった。回収したビーズを、０．３　ＭＮａＣ
ｌ、１０ｍＭｃａｃＩｚ、ｌＯｍＭＨｃｌ　　（ｐＨ２
）から成る液６　ｍｆｌで熔出した。？守山は計３回行
ない、各溶出液を５ＮＮａＯＨを用いて中和した。得ら
れた溶出液計１８ｍ１をセントリコン１０を用いて脱塩
濃縮し、最終的には１　ｍｌのＰＢＳ　（−）バッファ
ー溶液とした。

各ステップにおける５ＰＩｉ液中のトリプシンインヒビ
ター活性を測定した結果を以下の表にまとめた。

ブロードながら単一バンドであった。また別に泳動した
ゲルを、ザカリウスらの方法（Ｚ　ａｃｈａｒｉｕｓ。

Ｒ，Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｃ
ｍ、、　３０１４８−１５２（１９６９）　）に従って
糖染色（ＰＡＳ染色）を行なった結果、得られたｓＰＩ
は糖鎖を有していることが判明した。

また本精製物のアミノ酸配列を、アプライド・バイオシ
ステム社気相プロティン・シークエンサー・モデル４７
０Ａを用い、付属のプロトコールに従って決定した。１
９サイクルまでのアミノ酸を決定した結果、該ｓＰＩ標
品には、以下の配列を有する２種類のペプチド■、■力
月：２の比率で混合していることが判明した。

前項■で得られた精製ＰＩ溶液の一部をＳＤＳポリアク
リルアミドゲルで電気泳動し、クマシー染色した結果、
分子量１５〜１９キロダルトンのを示す。

：下線部はＰＩ領領域示す。

この結果よりｓＰＩはＣＯ３−１細胞で発現された後に
、ｔＰＡシグナル配列が２カ所で切断されているものの
、トリプシン・インヒビター活性領域は保持されている
ことが判明した。

工ｌ〔プロテアーゼの阻害スペクトル（Ｉ　Ｃ３゜）〕工程
１−９で得られた蛋白分解酵素阻害活性を有する分泌型
ＰＩ（ｓＰｒ）の、種々の酵素に対する阻害活性を測定
した。

使用した酵素は、下記の通りである。

は７−アミド−４−メチルクマリンを示す。

測定に用いた緩衝液等は下記の通りである。

バッフｙ　　：５０ｍＭＴｒｉｓ、１ＩＣＩ（ｐＨ８，
０）／］００ｍＭＮａＣｌ／　１０ｎ＋　Ｍ　ＣａＣＩ
ｚ基質熔液：０．２ｍＭ基質／１％ＤＭＳＯ含有バッフ
ァー（最終測定時の濃度はＯ，ｉｎ＋Ｍ）これらを用い
測定を行なった。即ち、バッファーと、種々の濃度のｓ
ＰＩとを混合し、それに酵素溶液を添加し、室温下５分
間インキユヘートした。

各々の酵素濃度は基質をほぼ同じ反応速度で分解解する
ようそろえた。これに基質溶液を加え、３６５ｎｍの励
起光下で４５０ｎｍのケイ光強度を経時的に測定して反
応速度を求めた。ｓＰＩを入れない時の反応速度を１０
０とし、種々のｓＰＩ１度で各酵素の活性がどうかわる
かをまとめて第３図に示した。

対照薬としてアプロチニンを（ＢＰＴＩ）を用いて全く
同様の測定を行った。各酵素の活性を５０％阻害するｓ
ＰＩ及びＢＰＴＩの濃度（ＩＣ３゜）を下表に示す。

Ｎ、Ｄ、　：測定範囲内では阻害活性が見られなかった
。

：未測定。

丁１〔阻害定数Ｋｉの測定〕。

ｓＰＩ及び対照薬としてのＢＰＴＩのＫｉを下記のよう
にして測定した。大略をまず述べる。はじめに０．１〜
１ｍＭ程度の基質濃度で酵素濃度を種々に設定し、酵素
活性を測定して反応時間に対し酵素活性が直線性を示す
酵素濃度を選択した。

次に、この酵素濃度で、基質濃度をかえて酵素活性を測
定することにより、ミバエリス・メンテン定数（Ｋｍ）
を取得した。次いで、０．１〜Ｉ　Ｋｍ程度の基質濃度
で、インヒビター濃度を大きくかえて、どの程度のイン
ヒビター濃度で阻害がかかるかを調べ、これらの情報を
もとにＫｉを測定した。

Ｋｉの測定は、Ｋｉのやや大きなもの（大略１０−９Ｍ
以上のもの）と予想されたものについては、Ｄｉｘｏｎ
−ｐｌｏｔ　（Ｍ、　Ｄｉｘｏｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｊ、　５５＋１７０−１７１　（１９５３））　、Ｋ
　ｉが小さいと予想されたものについては、Ｇｒｅｅｎ
　＆　　Ｗｏｒｋ　　ｐｌｏｔ　　（Ｎ、　Ｍ。

Ｇｒｅｅｎ　＆　Ｅ、Ｗｏｒｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、
　５Ａ、３４７３５６　（１９５３））により各々解析
した。

本実施例における酵素活性は、以下に述べる９６六マイ
クロプレートを用いたケイ光アッセイ法により測定した
。また、対照薬としてはアプロチニン（ＢＰＴＩ）を用
いた。

測定に用いた主な緩衝液は次の通りである。

バッファーＡ：　　０．２Ｍ＋−リス−塩酸ｐＨｓ、。

Ｏ，０２Ｍ　ＣａＣｌ　ｚ。

０．００５％トリトンＸ−１００バッファーＢ：　０．２Ｍトリス−塩酸ＰＨ８，５０、
０２Ｍ　ＣａＣｊ２２０．００５％トリトンｘ−ｉｏ。

また、酵素活性測定反応液の最終ＤＭＳＯ濃度は、つね
に１％となるよう８周整した。

■トリプシンに　　るＫｉの工程２に示したトリプシンを、９．３２　Ｘ　１０−８
ｇ／ｍｌ　（４Ｘ　１０−９Ｍ）となるようバッファー
Ａに溶解・希釈し、酵素液とした。工程２に示したトリ
プシン用の基質をＤＭＳＯで溶解し、さらにバッファー
Ａで２ｍＭになるよう希釈して基質液とした。このとき
ＤＭＳＯ濃度が２％になるよう調整した。

ｓＰＩの高濃度（３，５Ｘ１０−’Ｍ）ＰＢＳ（−）溶
液をバッファーＡで希釈して、（０，５，１０゜１５、
２０．２５．３０．３５．４０．４５．５０．５５．６
０．６５）ＸＩＯ−ｅＭの濃度になるよう調整し、これ
らの溶液ラインヒビター液とした。ダイナチック（Ｄ　
ｙｎａ　ｔｅｃｈ）社製９６六マイクロフルオロＢプレ
ート（Ｍｉｃｒｏ　　ＦＬＵＯＲＴＭ”Ｂ”ＰＬＡＴＥ
）の各ウェルに、酵素液５０μｌと各濃度のインヒビタ
ー液５０μｌを添加し、（いずれも２連で行った）、プ
レートミキサーで軽（混和後、室温（約２５°Ｃ）で６
０分間静置した。次いで、基質液を各ウェルに　１００
μ！ずつ添加しプレトミキサーで軽く混和後、バクスタ
ー社製９６穴ケイ光リーダー（Ｐ　ａｎｄｅｘ　Ｆ　１
ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　　
Ａｎａｌｙｚｅｒ　、以下、ＦＣＡと略す）を用い、３
０°Ｃの環境で励起光３６５ｎｍ、発光４５０ｎｍで、
各ウェルのケイ光強度を１０分おきに６〜１２回測定し
、１分間あたりの蛍光強度増加量を酵素活性とした。得
られたデ夕をＧ　ｒｅｅｎ　ｇｔ　Ｗｏｒｋプロットで
解析し、ｓＰＩのトリプシンに対するＫｉを得た。この
Ｋｉ値は、本工程３の最後の表中に記載しである。

ｓＰＩのかわりにＢＰＴＩを用いた他は全く同様にして
、ＢＰＴＩのトリプシンに対するＫｉを得た。

■キモトリプシンに　するＫｉの工程２に示したキモトリプシンと基質を用いた。酵素液
の濃度は２．５３　Ｘ　１０−’ｍｇ／　ｍ１ｌ（Ｉ　
Ｘ　１０−９Ｍ）　、基質液の濃度は２ｍＭ、インヒビ
ター液の濃度は、ｓＰＩでは（０，２゜３．４，５．１
０．１５．２０．２５．３０．３５．４０．　）ｘｌＯ
−”Ｍ、　Ｂ　Ｐ　Ｔ　Ｉでは、（０，５，１０，１５
゜２０、２５．３０．３５．４０．４５．５０．５５．
６０．６５）　Ｘ１０−ＢＭとした。酵素活性の測定は
酵素−インヒビター混合液の静置時間を２０分とした以
外は、■のトリプシンの場合と全く同様に行い、得られ
たデータをＧｒｅｅｎ　＆Ｗｏｒｋプロットで解析しＫ
ｉを得た。結果は、表にまとめた。

■ファクターＸａに　　るＫｉのダイアグノウスティック・リエイジエント社（Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｌｔｄ、、）のファ
クタＸａと、工程２に示したファクターＸａ用の基質を
用いた。酵素液としては、購入液をバ・ソファ−Ａで５
０倍希釈して用いた。基質液の濃度は２００　ｎＭ、１
６０ｎＭの２水準を設定した。インヒビター液の濃度は
、ｓＰＩでは、（０，０，４，１，２，２，０，２，８
，４，０）　Ｘｌ０−６Ｍ、ＢＰＴＩでは、（０，０，
３，０，４，１，０，２，０゜３．０．４．０）　Ｘ　
１０−３Ｍとした。酵素活性の測定は、■のキモトリプ
シンの場合と同様に行った。

この測定と同時に、同一プレート内で同じ酵素液を用い
て基質濃度を種々かえて、最大速度Ｖ　ｍａｘを求めた
。得られたデータをＤｉｘｏｎプロットで解析しＫｉを
得た。結果は表にまとめた。

■　　　カリクレインに対するＫｉの工程２に示した尿由来カリクレインと基質とを用いた。

酵素液の濃度は０．５６■／Ｉｄ、基質液の濃度は２０
ｎＭと１１００ｎの２水準を設定した。インヒビター液
は、ｓＰＩでは、〔００，４，１，６，３，２，４，１
６，２８，４０）　Ｘ　１０−７Ｍ、ＢＰＴＩでは、（
０，０，２，０，４，１，２，２，８゜４、１２）　Ｘ
　１０−６Ｍとした。酵素活性の測定は■のキモトリプ
シンの場合と全く同様に行った。

この測定と同時に同一プレート内で同じ酵素液を用いて
最大速度Ｖ　ｍａｘを求めた。得られたブタ−をＤｉｘ
ｏｎプロットで解析しＫｉを得た。

結果は表にまとめた。

■血路　　カリクレインに　するＫｉの工程２に示した
血漿由来カリクレインと基質とを用いた。酵素液の濃度
は５．５７μｇ／ｍｌ、基質液の濃度は４００ｎＭと１
１００ｎの２水準を設定した。インヒビター液は■と同
じ濃度のものを用いた。酵素活性及びＶ　ｍａｘを■の
尿由来カリクレインと全く同様に求め、データをＤｉｘ
ｏｎプロットで解析しＫｉを得た。結果は表にまとめた
。

酵素液の濃度は２２．５μｇ　／　ｔｎｌ、基質液の濃
度は２００ｎＭと１１００ｎの２水準を設定した。

インヒビター液（ｓＰＩ）濃度は、（０，０，４゜０．
８．１．６，２．４．３．２．４．０）　Ｘ　１０−７
Ｍとした。酵素活性及びＶ　ｍａｘを■のファクターＸ
ａと同様に求め、得られたデータをＤｉｘｏｎプロット
で解析しＫｉを得た。結果は表にまとめた。

■プラスミンに対するＫｉの　　　ＢＰＴＩ工程２に示
したプラスミンと基質とを用いた。

酵素液の濃度は２２．５μｇ／戚、基質液の濃度は２０
０　ｎＭ、インヒビター液（ＢＰＴＩ）濃度は（０，０
，５，１，１，５，２，２，５，３，３，５゜４．４．
５．５，５．５，６，６．５）ＸＩ　０−１１Ｍとした
。酵素活性を■のキモトリプシンと同様に求め、得られ
たデータをＧｒｅｅｎ　＆　Ｗｏｒｋプロットで解析し
Ｋｉを得た。結果は表にまとめた。

■エラスターゼに　するＫｉのヒト白血球由来のエラスターゼ（シグマ社）を用い、基
質としてはＭｅＯ−３ｕｃ　Ａｌａ　　ＡｌａＰｒｏ−
Ｖａｌ　　ＡＭＣ（シグマ社）を用いた。

バッファーとしては、■〜■のバッファーＡのかわりに
バッファーＢを用いた。酵素液の濃度は１．２ＸＩＣＶ
７ｇ／ｒｄ、基質液の濃度は１ｍＭと０．６ｍＭの２水
準を設定した。インヒビタ液の濃度は、ｓＰＩでは、（
０，０，４，１，２゜２．０，２．８，４．０）ＸＩＯ
−６Ｍ、ＢＰＴ　Ｉでは、（０，０，２，０，４，０，
８，１，２，１，６，２，０）ＸＩＯ−６Ｍであった。

酵素活性及びＶｍａｘを求め、得られたデータをＤｉｘ
ｏｎプロットで解析しＫｉを得た。結果は表にまとめた
。

■　■〜■で得られたＫｉ値を以下の表にまとめる。

以下余白〔注射用無菌溶液］下記の表に示す成分を混合して溶液とし、濾過滅菌して
静脈内注射用溶液を調整した。ｓＰＩは工程１−９の■
に述べた方法□をくりかえし大量に取得した。

以下余白（ｐ　Ｓ　ＶＭＴ−Ａ　Ｐ　Ｐ　ＩのＡＰＰＩ領域から
１７アミノ酸に相当する部分の欠失プラスミドの作成〕
実施例１工程１−９で得たプラスミドｐＳＶＭＴ−ＡＰ
ＰＩを、５ｓｔｌとＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、生じる２
断片のうち小さい分子量の断片をゲル切出し後、精製し
た。この断片を、５ｓｔｌとＨ４ｎｄｎｌで消化したＭ
ｌ　３ｍｐ　１８ヘクターにＴ４リガゼを用いて連結し
、大腸菌ＪＭ１０５ヘトランスフェクトした。白色プラ
ークから４個を選び、そのプラスミドを解析したところ
、４個ともが目的とするＤＮＡを含んでいた。この形質
転換体から一重鎖ＤＮＡを常法により調整し、５ｓＤＮ
Ａ１とする。欠失反応は、自弁らの方法（Ｔ、５ｈｉｒ
ａｉｅｔ　ａｌ、、　　Ｇｅｎｅ　　５７．　、１１−
１９　（１９８７））に順して行った。以下に詳しく述
べる。

まず、下記の配列を有する２６ｍｅｒのプラークＤＪＩ
を、アプライド社のＤＮＡ合成機により合成し、精製し
て得た。

ＤＪ　１　：　５’−ＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＣ；
ＧＣＧＣＴＧＣＣＡＣＡＣ−３’ これは第２図（Ｈ）の塩基番号２８３番のＡから、３３
３番のＣまでを欠失させるために設計したものである。

このプリーターＤＪＩ約３００ｎｇとユニバーサルプラ
イマー５５ｎｇを、Ｔ４カイネースでカイネションを行
い、次いで６５°ＣＩＯ分間処理ののち、５ｓＤＮＡ１
約６００ｎｇを添加し、９５°Ｃ５分間処理ののち、室
温までゆっくり冷却してアニリングを行った。次いで、
デオキシリボ核酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＴＴＰ）の混合物を加え、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノ
ウ断片とＴ４リガーゼで、相補鎖伸長反応を行った。得
られた２本鎖ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０５にトランスフェ
クトして、１枚のプレートあたり約３００個のプラーク
を得た。このプラークを、ニトロセルロースフィルター
に転写し、ＤＪＩをプローブとしてプラークハイブリダ
イゼーションを行い、１２個のポジティブプラークを得
た。このプラクからプラスミドを抽出し、ＥｃｏＲＴと
ＨｉｎｄＩ［［で消化し、目的とするプラスミドを選択
しこれをｐＤＪｌとした。このＰＤＪＩの欠失させた領
域の塩基配列は、アマージャム社Ｍ１３シークエンシン
グキットを用いてシーフェンシングし、目的とする欠失
が正しくおこなわれていたことを確認した。

このｐＤＪｌを、５ａｃｌとＨｉｎｄｌｌｌで消化後、
分子量の小さい断片をゲル切り出し精製し、ｐＳＶＭＴ
−ＡＰＰＩをＳａｃ　Ｉ　−Ｈ４ｎｄｎｌ消化したベク
ターに連結し、これを用いて大腸菌ＪＭ１０５を形質転
換した。得られたコロニー３個のプラスミドを５ｓｔｌ
とＨｉｍｄＤＩで消化して、目的とするプラスミドをも
つクローンを選択した。そのうちの１つのプラスミドを
ｐＳＶＭＴ−ＡＰＰ　Ｉ−ｄｅｌＪとした。これはｓＰ
Ｉより１７アミノ酸短い５ＰＩＤを分泌させる構造をも
つ。

工払え（ｓＰＩＤのＣＯ３−１細胞での発現〕工程１で得たプ
ラスミドｐＳＶＭＴ−ＡＰＰ　１ｄｅｌ　Ｊを大量に調
整し、実施例１工程１−９の■及び■に記載と同様の方
法でｃｏｓ−ｉ細胞にトランスフェクトし、その培養上
清を実施例１工程１−９の■及び■に記載の方法で精製
し、ｓＰＩより１７アミノ酸短い（第２図（Ｈ）の塩基
番号２８３のＡ１塩基番号２８４のＴ１塩基番号２８５
のＧがコードするメチオニンから、塩基番号３３１の０
１塩基番号３３２のＴ１塩基番号３３３のＣがコードす
るロイシンまでが欠失している）ｓＰＩＤを得た。５Ｐ
ＩＤの蛋白分解酵素阻害活性はｓＰＩに類似していた。

工程主〔注射用無菌溶液〕下記の表に示す成分を混合して溶液とし、濾過滅菌して
静脈内注射用溶液を調整した。

表

【図面の簡単な説明】

第１図は（Ｎａｔｕｒｅ　３３し、　５３０−５３２　
（１９８Ｂ））に記載されたＡＰＰ７７０のｃＤＮＡ配
列中、蛋白分解酵素阻害活性を有する部分の塩基配列及
びそれに対応するアミノ酸配列を示す。第２図（Ａ）は、ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡから、Ｐ１部分
をサブクローニングする手順を示す模式第２図（Ｂ）は
、ＰＩの大腸菌用発現プラスミドの構築手順を示す模式
図である。第２図（Ｃ）は、１１とＸａ認識配列の融合蛋白の大腸
菌用発現プラスミドの構築手順を示す模式図である。第２図（Ｄ）は、ＰＩ−Ｘａ認識配列−ヒトＴＮＦ融合
蛋白の大腸菌用発現プラスミドの構築手順を示す模式図
である。第２図（Ｅ）は、ＰＩの大腸菌用高発現プラスミドの構
築手順を示す模式図である。第２図（Ｆ）は、ＰＩと−ヒトＴＮＦ融合蛋白の動物細
胞での分泌用プラスミドの構築手順を示す模式図である
。第２図（Ｇ）は、ＰＩの動物細胞での分泌用プラスミド
の構築手順を示す模式図である。第２図（Ｈ）は、シグナルペプチド部分のついた状態の
ｓＰＩの塩基配列を示す。第３図は、種々のプロテアーゼに対するｓＰＩの阻害ス
ペクトルを現すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】一般式（ I ）で表わされるアミノ酸配列を有するペプ
チドを、少なくともその一部に含む化合物を有効成分と
して含有してなる、疾患治療用医薬組成物。一般式（ I ）：【アミノ酸配列があります】（但し式中、Ａｌａ；アラニン、Ａｒｇ；アルギニン、
Ａｓｎ；アスパラギン、Ａｓｐ；アスパラギン酸、Ｃｙ
ｓ；システイン、Ｇｌｎ；グルタミン、Ｇｌｕ；グルタ
ミン酸、Ｇｌｙ；グリシン、Ｈｉｓ；ヒスチジン、Ｉｌ
ｅ；イソロイシン、Ｌｅｕ；ロイシン、Ｌｙｓ；リジン
、Ｍｅｔ；メチオニン、Ｐｈｅ；フェニルアラニン、Ｐ
ｒｏ；プロリン、Ｓｅｒ；セリン、Ｔｈｒ；スレオニン
、Ｔｒｐ；トリプトファン、Ｔｙｒ；チロシン、Ｖａｌ
；バリン残基を各々示す）。