RU1801118C - Способ получени человеческого эритропоэтина - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к генетической инженерии и касаетс  получени  рекомби- нантных плазмидных ДНК, содержащих гены эритропоэтина, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии указанных генов , и получени  in vitro активного человеческого эритропоэтина. Целью изобретени   вл етс  повышение активности эритропоэтина . Способ состоит в том, что осуществл ют получение геномного ДНК клона эритропоэтина человека гибридацией с зондами и его выделение, конструирование ре- комбинантных плазмидных ДНК, кодирующих ЭПО человека, с последующей трансформацией полученными ДНК штаммов клеток млекопитающих (например cos I), выделением и очисткой целевого продукта.

Description

ел

С

Изобретение относитс  к генетической инженерии и касаетс  получени  рекомби- нантных плазмидных ДНК, содержащих гены эритропоэтина человека, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии указанных генов и получени  in vitro активного человеческого эритропоэтина.

Целью изобретени   вл етс  повышение активности эритропоэтина.

Способ, описанный в данной за вке, раскрывает массовое производство белков, про вл ющих биологическую активность человеческого ЭПО. При этом возможно получать белки, которые химически отличаютс  от аутентичного человеческого ЭПО, но про вл ют свойства характерные дл  него и в некоторых случа х даже улучшенные,

Насто щее изобретение касаетс  кло- нировани  гена, кодирующего ЭПО, и его

экспрессии in vitro. Описаны пригодные векторы экспрессии клетки, трансформированные рекомбинантными плазмидными ДНК, кодирующими ЭПО. а также схема очистки ЭПО.

Способ состоит в том, что предварительно ЭПО подвергают очистке до гомогенности и переваривают трипсином. Эти фрагменты очищают и определ ют нуклео- тидную последовательность ЭПО. Синтезируют олигонуклеотиды. зна  эти последовательности. Олигонуклеотиды используют дл  скрининга человеческой ге- номной библиотеки, из которой ген выдел ют ген ЭПО.

Получают кДНК-библиотеку печени плода человека и подвергают ее скринингу. Получают три клона кДНК ЭПО (после скрининга 750000 рекомбинантов). Два из этих

00

о

00

ICO

трех клонов имеют полную длину. Эти кДНК клонируют в вектор экспрессии, трансформируют ими клетки вируса SV-40 обезь ны (клеточна  лини  COS-1), а также клетки  ичника китайского хом чка (клеточна  лини  СНО). ЭПО, полученный из клеток COS,  вл етс  биологическими активными ЭПО in vitro и in vivo. ЭПО, полученный из клеток СНО, также биологически активен in vitro и in vivo.

кДНК-клон ЭПО имеет открытую рамку считывани  из 14-15 аминокислот(аа) с инициатором и терминатором из 20-30 нуклео- тидов (ht) вверх по направлению кодирующей области. Образец E.coli, транс- формированный клонированным геном ЭПО, депонирован в American Type Culture Collection, Rock ville, Maryland, под номером ATCC40153.

Основные этапы способа состо т в еле- дующем. Выделение геномного клона человеческого ЭПО.

1. Человеческий ЭПО очищают до гомогенности из мочи пациентов, страдающих апластической анемией. Полное перевари- вание этого очищенного ЭПО трипсином протеазы дало фрагменты, которые раздел ют высокоэффективной жидкостной хро- матографией с обращенной фазой, подвергаютсеквенированию(см.табл.2 иЗ). Две из аминокислотных последовательностей Val-Ash-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lyy и Val-Tyr- Ser-Asn-Phe-Leu-Arg, выбирают дл  конструировани  олигонуклеотидных зондов .

Олигонуклеотиды используют дл  скри- нинга человеческой геномной ДНК-библиотеки в векторе Ch4A.

Фаг, гибридизирующий к 17 мег, отбирают распредел ют на малые группы и гиб- ридизуют с 14 мег и 18 мег пулами. Фаг, гибридизирующий к 17 мег, 18 мег и 14 мег пулам, очищают от п тен, а фрагменты суб- клонируют в векторы М13 дл  секвенирова- ни  путем дидезокси-метода, и получают два клона Я-HPOI и Я -НЕРО 2.

2. Выделение клонов кДНК ЭПО.

Northern анализ сыворотки плода теленка (возраст 20 недель) печеночной мРНК осуществл ют с использованием 95 nt одно- нитиевого зонда, полученного из клона М13, содержащего участок 87 Ьр экзона, описанного в табл,1. Далее мРНК ЭПО идентифицируют с использованием того же зонда дл  скрининга Я -кДНК библиотеки бактерио- фага мРНК сыворотки плода теленка. Несколько гибридизирующих клонов получают с частотой приблизительно 1 положительный на 250000 подвергнутых скринингу рекомбинантов . Полна  нуклеотидна  и аминокислотна  последовательности дл  этих клонов ( Я-HEPOF L13 и Я -HEPOF L8) представлены в табл.5 и 6.

3. Структура и последовательность гена ЭПО человека. Гибридизационный анализ этих клонированных ДНК при помощи олигонуклеотидных зондов и различных зондов позволил определить положение гена ЭПО внутри приблизительно 3,3 кб области. Полный анализ секвенировани  этой области и сравнение с клонами кДНК привод т к получению карты интронной и экзонной структуры гена ЭПО. Ген ЭПО имеет 5 экзонов. Часть экзона I, полные экзоны II, III и IV, а также экзон V содержат кодирующую белок информацию. Оставшиес  части экзонов I и V кодируют 5- и З -нетранслируемые последовательности .

4. Неустойчива  экспресси  ЭПО в клетках COS.

Вектор р9 1023/В/ содержит основной поздний промотор аденовируса, последовательность полиаденелировани  SV40, SV40 - начало репликации, ген-усилитель SV40 и ген VA аденовируса. Вставку кДНК из Я - HEPOF L13 встраивают в вектор р91023 и получают рекомбинантную плазмидную ДНК pPTF - L13. Полученной ДНК трасфек- тируют штамм Мб клеток , клетки промывают, перенос т в среды, не содержащие сыворотку, клетки собирают через 48 ч. С использованием количественного радиоиммунного анализа исследуют уровень экс- прессии ЭПО в культуральную надосадочную жидкость. Вектор, содержащий кДНК ЭПО из Я -HEPOF L13, транс- фектируют в клетки COS-1. Наличие ЭПО в культуральной среде определ ют с помощью Н-тримидин и CFU-E методом или любым из двух анализов in vivo, а именно гипоксическа  мышь и голодающа  крыса, Эти результаты показывают, что биологически активный ЭПО продуцируетс  в клетках COS-1. Было установлено, что ЭПО, продуцируемый клетками COS, имеет подвижность на SDS-полиакриламидном геле, котора  идентична подвижности нативного ЭПО, полученного из человеческой мочи.

Различные векторы, содержащие другие промоторы, также могут быть использованы в клетках COS или в других млекопитающих или эукариотических клетках . Примеры этих иных промоторов, которые могут быть использованы в за вленном способе, включают ранние и поздние промоторы SV40, генный промотор металлоте- оннина мыши, промотор, обнаруживаемый в длинных концевых повторах ретровирусов

птиц или млекопитающих, полиэдральный генный промотор бакуловируса и другие. Примерами штаммов - реципиентов, которые могут использоватьс  в за вленном способе,  вл ютс  Е.соМ, дрожжи клетки млекопитающих, такие как СНО ( ичник китайского хом чка), С127 (эпителий обезь ны ), ЗТЗ (мышиный фибробласт), CV-1 (почка африканской зеленой мартышки) и клетки насекомых такие, как клетки от Spodoptera trugiperda и Drosophila metanogaster. Эти промоторы и типы клеток могут обеспечить возможность регулировани  уровн  экспрессии ЭПО.

Вирус  дерного полиэдроза имеет геном двунитевой кольцевой ДНК размером 128 кб. Нуклеокапсид вируса имеет палоч- ковидную форму и находитс  упакованным в двух формах. Эти вирусы могут быть обычным путем размножены в культуре клеток насекомых. Среды дл  культивировани  этих клеток - это обычно питательный солевой раствор и 10%-  фетальна  тел чь  сыворотка . In vitro, вирусный рост инициируетс , когда неокклюдированный вирус (НОВ) входит в клетку и продвигаетс  к  дру, где он реплицируетс . Репликаци   вл етс   дерной. В течение начальной фазы (8-18 ч постинфекции) вирусной аппликации нуклеокапсиды собираютс  в  дре и впоследствии проход т через плазменную мембрану распростран   инфекцию по культуре клеток. Кроме того, некоторые нуклеокапсиды впоследствии (еще 18ч постинфекции ) остаютс  в  дре и закупориваютс  в белковой матрице, известной как полиэдральное внутриклеточное включение (ПВВ). Эта форма не  вл етс  инфекционной в культуре клеток. Матрица состоит из белка, известного как полиэдрин, молекул рный вес 33 кд. Каждое ПВВ имеет приблизительно 1 мм в диаметре и в  дре могут быть до 100 ПВВ. Ясно, что большое количество по- лиэдрина продуцируетс  позже в цикле заражени  и оно составл ет до 25% общего количества клеточного белка.

Так как ПВВ не играет роли в цикле репликации in vitro, полиэдриновый ген может быть убран из вирусной хромосомы без какого бы .то ни было вли ни  на жизнеспособность in vitro. При использовании вируса в качестве вектора экспрессии замен ют область, кодирующую полиэдриновый ген, чужеродной ДНК и помещают ее под контроль полиэдринового промотора. Это приводит к вирусному фенотипу, не образующему ПВВ.

Описаны рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие ген ЭПО под контролем промотора вируса  дерного полиэдроза. В результате генетической рекомбинации происходит замещение области полиэд- риновогогена AsN РУС дезоксирибонуклеиновой кислотой из плаз- миды.

Рекомбинантный ЭПО, полученный в

0 клетках СНО, очищают традиционными методами колоночной хроматографии.

Биологическую активность очищенного рекомбинантного ЭПО in vitro определ ют известными методами (биопроба на проли5 ферацию клеток селезенки).

Удельна  активность in vitro полученного и очищенного рекомбинантного ЭПО составила 200000 ед./мг белка. Среднее значение находитс  в интервале 2750000 300000 ед./мл белка. Наблюдались значени  выше чем 300000. Отношени  активности in vivo к активности in vitro, исследуемые дл  рекомбинантного ЭПО. равны 0,7-1,3.

5Изобретение иллюстрируетс  следующими примерами.

П р и м е р 1. ЭПО очищают от мочи пациентов, страдающих апластической анемией , известным методом за исключением

0 того, что опускают фенольную обработку и замен ют термообработкой при 80°С в течение 5 мин дл  инактивации нейраминидазы. Конечную стадию очистки провод т путем фракционировани  на колонке С-4 VyLac

5 высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием от Q до 95% ацето- нитрильного градиента с 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФК) в течение 100 мин. Положение ЭПО в градиенте опре0 дел ют электрофорезом в геле и анализом N-концевой последовательностью основных пиков. ЭПО элюируют при 53% ацето- нитрила и обнаруживают приблизительно 40% белка, подвергаемого высокоэффек5 тивной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Фракции, содержащие ЭПО, выпаривают до 100 мкл. довод т до рН 7 бикарбоната аммони  и обрабатывают 2%- ым ТРСК-обработанным трипсином в тече0 ние 18 ч при 37°С. Полученные фрагменты подвергают ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано выше. Хорошо отделенные пики выпаривают почти до сухости и подвергают непосредственно анализу N-концевой ами5 нокислотной последовательности, использу  газофазный секвениатор модели 480А. Определ ют последовательность, приведенную в табл. 2 и 3. Два фрагмента, полученные в результате обработки трипсином, отбирают дл  синтеза олигонуклеотидных

зондов. Из последовательности Val-Asn- Phe-Tyr-Ala-TrP-Lys получают 17 мег со следующейнуклеотидной последовательностью.

А А А TTCCANGCGTAGAAGTT

и 18 мег со следующей нуклеотидной последовательностью

А А А CCANGCGTAGAAGTTNAC.

Из последовательности, Val-Tyr-Ser-Asn- Phe-Leu-Arg получают два пула 14-меров.

TTGNTTTTGNTT ТАСАСТААСТТССТ и ТАСАСТААСТТСТТ

оо

Олигонуклеотиды мет т в 5-конце Р, использу  полинуклеотидную киназу и гамма Р-АТР. Удельна  активность олигонуклео- тидов варьирует между 1000 и 3000 дюйм3/ммол олигонуклеотида. Геномную ДНК-библиотеку человека в бактериофаге л мбда подвергают скринингу. Приблизительно 3,5 х 10 фага высевают с плотностью 6000 фага на 150 мм чашку Петри со средой NZCYM и инкубируют при 37°С до тех пор, пока п тна не станут видными, однако маленькими (приблизительно 0,5 мм). После охлаждени  при 4°С в течение 1 ч дупликат- ные реплики перенос т на найлоновые мембраны и инкубируют в течение ночи при 37°С на чашках со свежими средами NZCYM. Затем фильтры денатурируют и нейтрализуют в течение 10 мин каждого на тонкой пленке 0,5Н NaOH-1M NaCI и 0,5М Tris (рН 8) - Ш NaCI соответственно. Вслед за вакуумной сушкой при 80°С в течение 2 ч фильтры промывают в 5 х SSC, 0,5% SDS в течение 1 ч и клеточные остатки на поверхности фильтров удал ют путем осторожного соскоба сухой тканью. Это соскабливание снижает фоновое св зывание зонда с фильтрами . Фильтры затем промывают водой и предварительно гибридизируют от 4 до 8 ч при 48°С в ЗМ растворе тетраметиламмо- нийхлорида, 10 мМ NaPCM (рН 6,8), 5 х Denhardt s,0,5% SDS и ЮмМЭДТК. 17 мег, меченый 32Р, затем прибавл ют при концентрации 0,1 пмол/мл и гибридизацию осуществл ют при 48°С в течение 72 ч. Вслед за гибридизацией фильтры промывают экстенсивно в 2 х SSC (0,3 М NaC - 0,03M цитрат натри , рН 7) при комнатной температуре и затем в течение 1 ч в ЗМ ТМАСР-10 мМ №РСм (рН 6,8) при комнатной температуре и от 5 до 15 мин при температуре гибридизации . Приблизительно 120 сильных дупли- катных сигналов обнаруживают вслед за 2-х дневной авторадиографией усиливающим экраном. Положительные сигналы отбирают , группируют в пулы из 8, пересевают и вновь подвергают скринингу с использованием 1/2 14 мег пула на каждом из двух фильтров и 127 мег на третьем фильтре. Услови  высева и гибридизации при этом те

же, но гибридизацию осуществл ют при 37°С. Вслед за авторадиографией зонд с фильтра перенос т в 50%-ом формамиде в течение 20 мин при комнатной температуре и фильтр повторно гибридизируют при 52 С

18 мег зондом. Два независимых фага гибридизируют со всеми трем  зондами. ДНК из одного из этих фагов обозначают здесь A-HEPOI. Переваривают рестриктазой ЗаиЗА и субконируют в М13 дл  анализа

ДНК-последовательности.

Пример 2. 5 мкг мРНК человеческой печени эмбриона и мРНК печени взрослого человека подвергают электрофорезу в 0,8%- ом агарозном формальдегидном геле и перенос т на нитроцеллюлозу. Однонитевый зонд получают, из матрицы М13, содержащей вставку, показанную в табл.1. Прайме- ром  вл етс  20 мег, происход щий из того же фрагмента, что и первоначальный 17 мег

зонд. Получают зонд за исключением того, что вслед за расщеплением Smal малый фрагмент очищают от М13 хроматографией на колонке с Сефарозой С14В и 0,1 N NaOH - 0,2М NaCI. Фильтр гибридизируют приблизительно до 5 х 10 отсчетов в минуту с этим зондом в течение 12 ч при 68°С, промывают в 2 x-SSC при 68°С.

П р и м е р 3. Зонд, идентичный описанному в примере 2, получают и используют

дл  скрининга библиотеки кДНК печени эмбриона , полученной в векторе A -Ch21A, использу  стандартные методики скрининга бл шек. Три самосто тельных положительных клона - обозначены здесь

A-HEPOF L6 (1350 пар оснований), А - HEPOFL8(700n.o.)n A-HEPOF 113(1400 п.о.) выдел ют вслед за скринингом 1 х 10б бл шек. Полную вставку A -HEPOF L13 и A -HEPOF L6 секвенируютс  вслед

за субклонированием в М13 (табл. 7 и 5 соответственно). Только часть вставки A -HEPOF L8 секвени,руют. Остальные фрагменты считают идентичными двум другим клонам (табл.7). 5- и 3 нетранслируемые последовательности представлены строчными буквами. Кодирующа  область представлена прописными буквами.

В отношении табл.2 и 3 следует упом нуть , что определенна  аминокислотна  последовательность, показанна  ниже нуклеотидной последовательности, пронумерована начина  с цифры 1 дл  пер- вой аминокислоты созревшего белка, Остатки цистеина в созревшем белке дополнительно указаны SH, и потенциальные N-сайты гликолизировани  обозначены звездочкой. кДНК-клоны A -HEPOF L6, Я - HEPOF L8 и A -HEPOF L13 задепонирова- ны в AmericanType Culture Collektion, Pockville, Maryland под номерами АТСС 40156, АТСС 40152 и АТСС 40153 соответственно .

П р и м е р 4. Геномные клоны A -HE- POL А -НЕР02, А -НЕРОЗ и А -НЕР06 депонированы в AmericanType Culture Collection, Pockville, Maryland под номерами АТСС 40154, АТСС 40155, АТСС 40150 и АТСС 40151 соответственно.

Используют вектор pALD26 SA рА(3), эта плазмида содержит кДНК-ген дигидрофо- л тредуктазы мыши (DFHP), который находитс  под контролем позднего промотора аденовируса 2 (Ad2), 5-частьаденовирусной ДНК и 3 -часть гена иммуноглобулина, между поздним промотором аденовируса 2 и DFHP-кодирующей последовательностью,

pALD26 pA(3) превращают в плазмиду PCVSVL12. pALD26VS рА(3) превращают в плазмиду pALD26-SVpA(3) (L) делецией одного из двух сайтов Pst 1 в плазмиде pALD26 SVpA (3) путем частичного переваривани  Pst 1 и получают субпопул цию плазмид, в которой только один сайт Pst 1 расщеплен, затем осуществл ют обработку и лигирова- ние ферментом Кленова.

Плазмиду pALD26SVpA (3) (L) расщепл ют Pvu 11. Плазмиду plAW43 переваривают Xhol, обрабатывают фрагментом Кленова, переваривают Pvu 11 и выдел ют электрофорезом в акриламидном геле фрагмент размером 140 п.о. Фрагмент 140 п.о. лиги- руют с плазмидой pALD26SV pA (3), обрабо- тайной с рестриктазой Pvull. Продукт лигировани  используют дл  трансформации Ё.соИ, колонии подвергают скринингу с помощью зонда, меченого Р, комплементарного к фрагменту из 140 п.о. ДНК получа- ют из положительно гибридизирующихс  колоний.

Фрагмент Ava11D вируса SV40, содержащего последовательность энхансера SV40, получают путем обработки ДНК SV40 ферментом Aval 1, фрагментом Кленова Pot 1 с последующей лигацией Xho 1-линкеров, Xhol-фрагментом и выделением фрагмента электрофорезом в геле. Этот фрагмент затем лигируют обработанной рестриктазой Xhol плазмидой pTPL и получают плазмиду pCYSYL 2-TPL. Ориентаци  фрагмента DSY40 в pCYSYL 2-TPL такова, что поздний промотор вируса SV40 находитс  в такой же ориентации, что и основной поздний промотор аденовируса.

Дл  интродуцировани  генов VA в pCYSYL 2-TPL вначале конструируют плазмиду pBR322, котора  содержит в Hindlll- сайте фрагмент В аденовируса типа 2. ДНК аденовируса типа 2 переваривают Hindlll и фрагмент В выдел ют электрофорезом в геле . Этот фрагмент встраивают в плазмиду pBR322, котора  предварительно была обработана Hindlll. После трансформации E.coli отбирают-рекомбинанты и ориентировку встроенных фрагментов определ ют путем обработки рестриктазами. pBR322 - AL Hindlll В содержит фрагмент В Hindlll аденовируса типа 2. Плазмиду pBR322 - AL Hindlll В обрабатывают Нра I, добавл ют линкеры EcoRI и гидролизуют EcoRI. Фрагмент , имеющий липкие концы EcoRI, встраивают в EcoRI-сайт плазмиду PTL, гидролизованной EcoRI. После трансформации штамма E.coli HB101 отбирают колонии , устойчивые к тетрациклину, далее на фильтрах колонии подвергают скринингу посредством гибридизации. ДНК получают из положительно гибридизирующих клонов и гидролизуют рестриктазами. Полученную плазмиду обозначают р91023. Плазмиду р91023 гидролизуют рёстрактазой EcoRI и получают два фрагмента, один около 7 кВ и другой около 1,3 кВ. Последний фрагмент содержит гены VA. Концы обоих фрагментов заполн ют с использованием фрагмента Кленова Potl и два фрагмента затем лигируют один к другому. Плазмиду р91023/А/, содержащую гены VA,  вл ющуюс  аналогичной плазмиде р91023, однако потер вшую два сайта EcoRI. идентифицируют посредством скрининга фрагментом гена VA.

Один Pst l-сайт в плазмиде р91023/А/ замен ют на EcoRI-сайт. р91023/А/ гидролизуют рестриктазой Pst I и обрабатывают фрагментом Кленова Potl дл  восстановлени  концов. EcoRI-линкеры лигируют с тупым сайтом Pstl плазмиды р91043/А/. Линейную плазмиду р91023/А/ с EcoRI- линкерами. присоединенными к тупым сайтам Pstl. отдел ют от несшившихс  линкеров и гидролизуют EcoRI рестриктазами , после чего повторно лигируют. Идентифицируют плазмиду р91023/В/. котора  аналогична р91023/А/, но вместо прежнего сайта Pstl в ней содержитс  сайт EcoRI. Плазмида р91023/В/ депонирована и доступна из American Type Culture Collection, под номером АТСС 39754.

П р и м е р 5. кДНК-клоны ( A-EPOF L6 и A -EPOF L13) встраивают в плазмиду р91023/В/, получают плазмиды pPTF L6 и pFTF L13, 8 мгк каждой из очищенных ДНК затем используют дл  трансфекции 5 х 106 клеток COS, использу  DEAE-декстран-ме- тод (ниже). Через 12 ч клетки промывают и обрабатывают Хлорохином (0,1 мМ) в течение 2 ч, промывают вновь и выдерживают в течение 24 ч в 10 мл средах, содержащих 10%-ную эмбриональную тел чью сыворотку . Среду замен ют на 4 мл среды, свободной от сыворотки, и собирают через 48 ч.

Иммунологически активный ЭПО определ ют количественно радиоиммунным анализом, Йодированный изотопный индикатор получают из гомогенного ЗПО. Чувствительность пробы составл ет приблизительно 1 нг/мл. Результаты приведены ниже в табл.8.

П ри мер 6. кДНКЭПО( A-HEFOL13) вставл ют в плазмиду р91023/В/, транс- фекцируют в клетки COS-1 и собирают, как описано выше. Однако хлорохинную обработку опускают.

Биологическую активность ЭПО in vitro измер ют с использованием либо колонне- образующей пробы с клетками фетальной печени мыши в качестве источника CFV-E, либо пробы поглощени  с Н-тимидином, использу  клетки селезенки от мышей, инъ- екцированных фенилгидразином. Чувствительность этих анализов составл ет приблизительно 25 мединиц/мл. Кроме того , биологическую активность ЭПО in vivo измер ют с использованием либо метода гипоксической мыши, либо метода голодающей крысы. Чувствительность этих анализов составл ет приблизительно 100 единиц/мл. Никакой активности не обнаружено ни в одной из этих опытов с имитированной средой. Данные об активности ЭПО, экспрессированного клоном EPOF L13, показаны в табл.9, где приведенные активности выражены в единицах/мл, с использованием торгового ЭПО (Toyobo, Inc.) в качестве стандарта.

Пример. Гель-анализ полиакрила- мида SDS ЭПО из клеток COS.

180 нг ЭПО, выделенный.из среды клеток COS, трансфекцированных кДНК ЭПО ( A-HEPOF L13) в векторе 91023(В), подвергают электрофорезу: на 10%-ом полиакри- ламидном геле. НПО обнаруживают с антителом анти ЭПО и белком А 1-стаф. Фильтр авторадиографируют в течение двух дней. Гомогенный ЭПО подвергают электрофорезу перед или после йодировани . Используемые маркеры включают метионин, меченый 35S, сывороточный альбумин (68 000 д) и  ичный альбумин (45 000 д).

П р и м е р 8. Фрагмент BamHI-Pvull из

плазмиды Psv 2DHFR, содержащий ранний промотор SV40, смежный с геном дигидро- фол тредуктазы мыши (D HFR), энхансер SV40, малый интрон t и последовательность полиаденилировани  SV40 выдел ют (фраг0 мент А). Оставшиес  фрагменты получают из вектора р91023/А/ (выше) следующим образом, р91023/А/ гидролизуют Pst I в единственном сайте Pst I около промотора аденовируса дл  линеаризации плазмиды, и

5 либо лигируют с синтетическими линкерами Pst l-EcoRI и обрабатывают с помощью ДНК лигазы или обрабатывают большим фрагментом ДНК-полимеразы 1 дл  разрушени  сайтов Pst I и сшивают с синтетическим

0 EcoRI-линкером и замыкают плазмиду. Каждую из двух полученных плазмид 91023/В/ и 91023/В /, Обрабатывают ХЬа и EcoRI дл  получени  двух фрагментов (F и G). Путем соединени  фрагмента G из плазмиды

5 р91023/В/ и фрагмента F из плазмиды р91023/В /, а также фрагмента G из плазмиды р91023/В/ и фрагмента F из плазмиды р91023/В / создают две новые плазмиды, которые содержат либо сайт EcoRI-Pstl, ли0 бо сайт Pstl-EcoRI.

Вектор р91023/С/ гидролизуют и полученную с липкими концами затупл ют путем заполнени  концов с фрагментом E.coli ДНК-полимеразы 1. К этой ДНК лигируют с

5 фрагментом Hindlll-EcoRI размером 340 п.о., содержащим энхансер SV40, полученный следующим образом:

Фрагмент Hindlll-Pvull из вируса SV40, который содержит основу SV40, а также эн0 хансер вставл ют в плазмиду с lac пролго- ром. Вектор с lac получают гидролизом ДНК с BamHI эндонуклеазой, заполнением липкого конца с помощью фрагмента ДНК-полимеразы 1 и обработкой ДНК Hindlll. В

5 полученной плазмиде восстанавливают BamHI-сайт путем лигировани  с Pvu и II линкером. Фрагмент EcoRI-Hindlll получают из SV HP Cac и сшивают с фрагментом EcoRI-Hindlll Psv Od, который содержит

0 плазмидную основу репликации, и отбирают полученную плазмиду PsvHPOd. Затем получают фрагмент EcoRI-Hindlll размером 340 п.о. плазмиды PsvHPOd. содержащий SV40/3HxaHcep, затупл ют с обоих концов

5 при помощи большого фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и сшивают с вектором р91023/С/,гидролизованным Xhol/p91023/C//Xho/ и EcoRI/Hindlll SV40 энхансер/, в которой ориентаци  фрагмента Hindlll-EcoRI такова, что BamHI-сайт

внутри фрагмента  вл етс  близлежащим к гену VA, называют pES105. Плазмиду PES105 обрабатывают BamHI и Pvull, а также Pvull, и выдел ют фрагмент BamHI- Pvull, содержащий основной поздний промотор аденовируса (фрагмент В), и фрагмент Pvull с геном устойчивости к тетрациклину , а также другие последовательности (фрагмент С). Фрагменты А, В и С лигируют и полученную плазмиду выдел ют и обозначают RKI-4, Плазмида RKI-4 депонирована American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, где под номером АТСС 39940,

П р и м е р 9. ДНК (20 мкг) из плазмиды pPTF L13, гидролизуют рестрикционной эн- донуклеазой Cta I и лигируют с обработанной Cta ДНК из плазмиды pALD265SVp/A/ 1 /2 мкг/, котора  содержит интактный ген- дигидрофол тредуктазы (DHF R), под контролем основного позднего промотора аденовируса. Эту ДНК используют дл  трансфекции DHFR-CHO и после двухдневного выращивани  клетки, которые содержат по крайней мере один ген DHF R, отбирают в альфа-средах, не имеющих нук- леотиды, и пополн ют 10%-ой диализиро- ванной фетальной эмбриональной бычьей сывороткой. Извлекают колонии из первоначальных чашек, объедин ют по группам из 10-100 колоний на пул, повторно высевают и выращивают до сли ни  в альфа-средах , не имеющих нуклеотиды. Отсто вшиес  среды из этих пулов провер ют на ЭПО посредством радиоиммуноана- лиза (RIA). .Пулы, которые экспрессируют ЭПО выращивают в присутствии метатрек- сата (0,02 мкМ) и затем субклонируют и ана- лизируют повторно. Cta 4 4,04-7 экспрессируют 460 мг/мл ЭПО. Он депонирован в American Type Culture Collection под номером АТСС CPI 8695. Этот клон подвергают поэтапному отбору при возрастающих концентраци х МТХ.

Ступенчатую селекцию с метотрексатом (МТХ) достигают повторными циклами культивировани  клеток в присутствии возрастающих концентраций метотраксата и селекции дл  выживших микроорганизмов. При каждом цикле ЭПО наличие ЭПО определ ют в надосадочном слое культуры посредством RIA и определ ют биологическую активность in vitro. Уровень используемого метотрексата в каждой ступенчатой амплификации составл ет 0,04, 0,1 и 0,5 мкМ. Как показано в табл. 10, после первого цикла селекции при 0,02 мкМ МТХ в культураль- ные среды высвобождаютс  значительные уровни ЭПО.

П рим е р 10. ДНК из клона Я -HEPOF L13 гидролизуют EcoRI и малый фрагмент

RI, содержащий ген ЭПО, субклонируют в EcoRI-сайт плазмиды RKI-4. Эту ДНК (RKF L13) затем используют дл  трансфекции DHF R-отрицательных клеток СНО, а селекцию и амплификацию осуществл ют, как описано в примере 9 выше.

ДНК RKF L13 также трансформируют в клетки СНО путем сли ни  протопластов и микроинъекции. Плазмида PKF L13 депонирована в American Type Culture Collection Rockville, Maryland под номером АТСС 39989.

Предпочтительный клон депонирован в American Type Culture Collection Rockville,

Maryland под номером АТСС СРГ 8695.

ПримерП.ДНКиз pS VOD обрабатывают эндонуклеазой Hindlll и затупл ют с помощью большого фрагмента ДНК-пол- имеразы 1. Клон ЭПО из фага Я-НЕРОЗ,

гидролизуют EcoRI и Hindlll. выдел ют фрагмент, размером 4,0 кВ, содержащий ген ЭПО, делают тупыми концы. Фрагмент гена ЭПО вставл ют в плазмидный фрагмент psVOd. Плазмида CZ 2-1 имеет ген

ЭПО в ориентации а (т.е. с 5- концом ЭПО, который ближе к SV40) и плазмида CZ1-3 находитс  в противоположной ориентации (ориентаци  Ь).

Плазмиды CZ1-3 и CZ2-1 трэнсфекцируют в клетки COS-1, и среды собирают и анализируют на иммунологически реактивный ЭПО.

П р и м е р 12. Плазмиду, содержащую кДНК-последовательность ЭПО под контролем металлотеонинового промотора мыши-и св занную с полной ДНК вируса бычьей па- пилломы, получают следующим образом . pEP049f

Эту плазмиду гидролизуют EcoRI. и

фрагмент EcoRI длиной 1340 п.о. из Я -НЕ- POF L13 встраивают в нее с помощью ДНК- лигазы. Полученную плазмиду. в которой 5

-конец гена ЭПО  вл етс  ближайшим к промотору SP6, обозначают pEP049F. В этой ориентации сайт BamHI в полилинкере PS P6/5 непосредственно примыкает к 5

-концу гена ЭПО.

Плазмиду pMMTneo BPV обрабатывают BamHI. Получают два фрагмента - большой фрагмент размером 8 кб, содержащий геном ВРУ, и меньший фрагмент размером 6,5 кб. содержащий начало репликации и ген устойчивости к ампициллину, металло- теиониновый промотор, ген устойчивости и неомицину и сигнала полиаденилировани  SV40 из плазмиды рН 42 ДНК обрабатывают ДНК-лигазой, и плазмиды. которые содержат фрагмент размером 6,8 кб. Одну такую плазмиду обозначают pMMTheo ВРУ.

рЕР015а

pMMTheoBPY гидролизуют Bgfll. рЕ- P049f обрабатывают BamHI и Bgtll, и выде- л ют фрагмент размером 700 п.о., содержащий целую область, кодирующую ЭПО. Плазмиду pMMTheo BP гидролизуют рестриктазой Bgtll и выдел ют фрагмент BamHI/Bg ll ЭПО размером 700 п.о., лиги- руют и полученные плазмиды, содержащие кДНК ЭПО, идентифицируют гибридизацией при помощи олигонуклеотидного d (GGTCATCTGTCCCCTGTCC) зонда. Отбирают плазмиду рЕР015а, котора  содержит кДНК ЭПО, при этом 5 -конец кДНК ЭПО  вл етс  близлежащим к металлотеоиново- му промотору.

рВРУ-ЭПО

Плазмиду рЕР015А гидролизуют BamHI дл  линеаризации плазмиды. Плазмиду pdBPy-MMTheo (342-12) обрабатывают эн- донуклеазой ВатШ, получают два фрагмента размером 6,5 и 8 кб. Первый фрагмент содержит целый геном вируса бычьей па- пилломы, pEPOl5a/BamHI и фрагмент BamHI размером 8 кб лигируют друг с другом , и плазмиду (рВРУ-ЭПО), содержащую фрагмент ВПУ, идентифицируют гибридизацией с использованием олигонуклеотидного зонда d(P-CCACACCCGGTACACA-OH). Гидролиз ДНК плазмиды.рВРУ-ЭПО эндо- нуклеазой подтверждает, что Hindlll транскрипции генома ВРУ  вл етс  таким же, как и направление транскрипции металлотео нинового промотора (как в pdBPy-MMTneo 1342/12. Плазмида pdBPy-MMTneo/342- 12/ в American Type Culture Collection Rockville, Margland под номером АТСС 37224.

Пример13. Получают ДНК плазмиду рВРУ-ЭПО и приблизительно 25 мкг используют дл  трансфекции 1хЮ6 клеток С127, СНО. Через 5 ч после трансфекции транс- фекционные среды удал ют, клетки обраба- тывают глицерином, промывают и прибавл ют свежую «-среду, содержащую 10%-ную сыворотку плода коровы. Через 48 ч клетки трипсинизируют и расщепл ют в отношении 1:10 в ОМЕ среде, содержащей 500 мкг/мл G 418, и клетки выращивают в течение двух-трех недель. G418 - устойчивые колонии выдел ют индивидуально в микротитровальную лунку и выращивают до сублизировани  в присутствии G418. Клетки затем промывают, прибавл ют свежие среды , содержащие 10%-ную сыворотку плода коровы, и среды собирают через 24 ч.

Клетки С127 и ЗТЗ трансфецируют 25 мкг рВРУ-ЭПО и 2 мкг pSV2neo.

-

Клетки С127 трансфецируют 30 мкг рВРУ-ЭПО. Вслед за трансфекцией, свежие среды мен ют каждые три дн . Приблизительно через 2 недели собирают ВРУ транс- формирование клетки в микротитровальные лунки, выращивают и анализируют на активность ЭПО.

Пример14. Плазмидный вектор pIVEY депонирован в American Type Culture Collection, Rockville, Maruland под номером АТСС 3991. Вектор модифицируют следующим образом:

I

обрабатывают EcoRI дл  линеа- ризации плазмиды, затупл ют с использованиембольшего фрагмента ДНК-полимеразы I. и лигируют одиночным линкером Not I

GGCGGCCGCC CCGCCGGCGC

Полученную плазмиду обозначают I.

гидролизуют Smal дл  линеаризации плазмиды, и сшивают с линкером

30

35

40

GGGCCCCAGGGGCCC CCCGGGGTCCCCGGG

Полученную плазмиду обозначают р УЕУ31. р1УУЕУ5 Вд КрПлазмиду р УЕУ51 гидролизуют Kpnl дл  линеаризации плазмиды, и фрагменты размером от 0 до 100 п.о. отщепл ют от каждого конца путем обработки эн- донуклеазой Ва131. Полученные концы затупл ют с использованием большого фрагмента ДНК-полимеразы 1 и сшивают полилинкером.

XhpIXbol

i1 Г ч

i ЈcoiRl

I

CBoI

Kpnl

I ll I I I

AGATCTCGAGAATTCTAGATCGATGGTACC

TCTAG AG CT CTT А А С AT CTAG СТА С С ATGG

Полилинкер встраивают в.обеих ориентаци-  х. Плазмиду, в которой полилинкер ориентирован таким образом, что сайт Bglll внутри полилинкера  вл етс  близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют IBgKp. Плазмиду, в которой сайт Крп I внутри полилинкера  вл етс 

близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют р УЕУ51КрВд. pIVEVSIBgKp депонирована в American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, под номером АТСС 39988. plEySIBgKpNl

Nl переваривают эндонуклеаза- ми Kpnl и Pstl. Получают больший фрагмент, который содержит начало репликации и 3

-конец полиэдрального гена. plYEVSIBgKp гидролизуют эндонуклеазами Pstl и Крп дл  получени  двух фрагментов. Причем меньший фрагмент содержит полиэдральный промотор и полилинкер (фрагмент В). Фрагменты А и В объедин ют ДНК-лигазой и получают плазмиду plYEVSIBgKp Nt.

plYEPO

SI BGKp Nl гидролизуют рестрик- тазой EcoRI дл  линеаризации плазмиды, и вставл ют фрагмент EcoRI размером 1340 п.о. из A-HEPOF L13. Плазмиды, содержа- щие 5 -конец гена ЭПО в непосредственной близости к полиэдральному промотору и 3

-концу полиэдрального гена, идентифицируют путем переваривани  Bgtll. Одну из этих плазмид в ориентации, описанной вы- ше, обозначают как plYEPO.

Экспресси  ЭПО в клетках насекомых

Плазмидную ДНК выдел ют из E.coli M101-tgtn подвергают дальнейшей очистке CSCI-центрифугированием. ДНК щтамма L- 1 вируса полиэдроза Autographa californica дикого типа (AcN РУ) получают фенольной экстракцией вирусных частиц и последующей очисткой вирусной ДНК.

Эти две ДНК контрасфецируют в клетки IPI B-SF-21 Spodoptero frugiperda, использу  методику трансфекции с фосфатом кальци . Дл  каждой чашки контрасфецируемых клеток используют ДНК AcNPY дикого типа и 10 мкг pIVEPO. Чашки инкубируют при 27°С в течение 5 дней. Затем собирают над- осадочную жидкость, экспрессию ЭПО в надосадочном слое подтверждают радиоиммунным анализом и биологической пробой in vitro.

П р и м е р 15. Среды клеток COS (121) с концентраци ми ЭПО до 200 мкг/л концентрируют до 600 мл с использованием ульт- рафильтрационных мембран с молекул рным весом 10000. Концентриро- ванные и диафильтрованные кондиционированные среды содержит 2,5 мг ЭПО в 380 мг общего белка. Раствор ЭПО дополнительно концентрируют до 186 мл, и осажденныебелки извлекают центрифугированием при 110000д в течение 30 мин.

Надосадочный слой, который содержит ЭПО (2 мг), довод т до рН 5.5 50%-ой уксус

ной кислотой, перемешивают при 4°С в течение 30 мин, осадок извлекают центрифугированием при 13000д в течение 30 мин.

Хроматографи  на карбонилметильной сефарозе.

Отсто вшийс  слой, содержащий 200 мкг (24 мг общего белка), помещают колонку , с СМ-Сефарозой (20 мл), уравновешенную в 10 мМ ацетатом натри , рН 5,5, промывают 40 мл того же буферного раствора . ЭПО, св занный с СМ-Сефарозой, элюи- руют 100 мл градиента Nav (0-1) в 10 мМ растворе фосфата натри , рН 5,5. Фракции, содержащие ЭПО (общее количество 50 мкг в 2 мг общих белков), объедин ют по группам и концентрируют до 2 мл с использованием ультрафильтрационной мембраны.

ВЭЖХ с обращенной фазой.

Концентрированные фракции,содержащие ЭПО, подвергают дальнейшей очистке ВЭЖХ с обращенной фазой, использу  колонку Vydac C-4. ЭПО подают на колонку, уравновешенную в 10%-ом растворителе В (Растворитель А представл ет собой 0,1% СРзСОаН в воде; растворитель В представл ет собой 0,1 % СРзС02Н вСРзСИ), с низкой степенью подачи 1 мл/мин. Колонку промывают 10% в в течение 10 мин и ЭПО элюиру- ют линейным градиентом В (10-70% в течение 60 мин), Фракции, содержащие ЭПО, объедин ют по группам ( 40 мкг ЭПО в 120 мкг общих белков) и лиофилизируют. Лиофилизованный ЭПО повторно структурируют в 0,1М растворе Tris-HCI при рН 7,5, содержащем 0,15М NaCI, и повторно хрома- тографируют ВЭЖХ с обращенной фазой. Фракции, содержащие ЭПО. объедин ют по группам и анализируют электрофорезом в SDS-полиакриламидном (10%) геле. Объединенные фракции ЭПО содержат 15,5 мкг ЭПО в 25 мкг общего протеина.

Claims (2)

1.Способ получени  человеческого эритропоэтина, предусматривающий культивирование штаммов эукариатических клеток , выделение и очистку целевого продукта путем концентрировани , осаждени , центрифугировани  и афинной хроматографии, отличающийс  тем. что. с целью повышени  активности эритропоэтина. предварительно конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК. обеспечивающие синтез эритропоэтина, путем клонировани  фрагмента ДНК. кодирующего эритропоэтин

в вектор р91023, или pALD 265 SVp, или RR1-4, или pdBPV-MMTneo, или pIVEVSBGKpNI, трансформацию полученными ДНК штаммов клеток млекопитающих и насекомых, после афинной хроматогра- фии провод т обращенно фазовую хромаI

ccctgcacag. .ccgccccccc ctccag(ccc CC23ЈSCCSC ccccgcnccg ccaaacttcc cgsgaCЈossScccecS8CgC

-27

MET CLY VAL HIS CLU CVS

HE CLY VAL HIS I.LU -ii

gStcacccgg cgccccccng gtcgctgagg goccccggcc agscacsgog Л7С CCG СТО САС СЛЛ ICT

A

ALA TR LEU TRP LEU ,j LEU SER LEU LEU SER LEU PRO LEU CLY LEU PRO VAL LEU CLY CCC ICC CTC TCG CTT cxc СТО ICC CTC CIG TCC CTC CCT CIG GCC CTC CCA CTC CIC CCC

1

SIC

Ala Pro Pro ЛТЕ. Inn He Суз Asp Scr

CCC CCA CCA CCC CIC ЛТС Тсг СЛС ЛСС

CIu Aln Cl САС CCC GAC

SU

.Азп.ПЈ-71гг 7 Г1 . а

АЛТЛТС АССдЛ сС

д

10 20

Лгг.ValLeuCluЛгдТ тLeuLeu.-CluAlalys

ССЛCTCCIGСЛСЛССTAGCTCTIG СЛС CCCAAC

30SH АО

AlaGiuBioCyaScrLeuAsnClu AOQ lieThr

CCTСЛЛG C7CCЛССTICАЛТСАС Л/iT АТСACT

Val Acp . CIC CCA СЛС

Val Clu Val СТА САД CIC

Tlir Lye vnl Ann Г:-,е Туг ЛСС АЛЛ Ctt ЛЛТ TIC T/J

50

Trp Cln ciy Lou Aln Leu ТСС СЛС CCC CIC CCC CIO

60

Aln 7rn Lyon. Лг  let Clu ValCly Cln Cln Ala

CCC ICC ЛАС ЛСС ЛТС СЛС. CTCCCG CAG CAG CCC

.j7080

Lau Ser Ciu Ala Val Leu ArgCly.CJn Aln Lnu

СТО ТСС СЛЛ CCT CIC CTC CCGCCC CAG CCC CTC

Leu V.il Л5П TTG CTC ЛАС

.SciySfftvgiV Pro Trn Clii TCT ICCicAC CCC ТСС СЛС

90

Pro I.OH (Пп сч

100

Vul Asr.T.YE. /Ua Val Scr CCC СТО CAG CIG СЛ7 GIG CAT ЛЛА CCC CTC ACT

Cly Leu Arc CCC CTT CCC

Sor Leu ThrThr ton Leu ACC CTC лес ACT CIG СП

ПО

Лгр. Л1о Leu Cly Ala Cln Lye Clu Aln Tie

Pro . Pro Asp Aln Ala Ser Ala Pro

CCC CC7 CTC CCA CCCСЛС. AAC CAA CCC ЛТС

130 . ... .. . ....„.Lei: ..A-.-.. I ir Tie 7hrAla Asa 7hr The Ar

120 Ser

TCC- 140

CCI ССЛ CAT CCC CCC ТСЛ CCT CCT. CCA CTC CCA ЛСЛ ЛТС ACT CCT GAC ACT TIC CCC AAA

тографию и элюцию 10-70% градиентом 0,1% CF3C02H вСРзС.

2. Способ по п.1, отличающийс  тем, что фрагмент ДНК, кодирующий эрит- ропоэтин клонируют в вектор р91023, а трансформации подвергают клетки cos 1.

CLY VAL HIS CLU CVS

CLY VAL HIS I.LU -ii

CCG СТО САС СЛЛ ICT

A

РДО ССГ

60

120 Ser

TCC- 140

211801118 22

ggttcggggtggagtCgggaagctagacactgccccccCacataagaataagtcCgscSЈccccaaaccatacct 1500 ggaaac aggcaaggagcaaagccagcagaccctacgcct:gtgЈccagi;gccagagcctccsgg2accctcgacc

,

ccccfiggctgtgtgcattCcaeACCGCCTCTGCTCAACACrrC CCTTCMTCAC/JiTATC/iCTCTCCCACACAC 1650

ГЬгС1уС7БЛ1аС1иН1ЈС7б5егьешипС1иАБа11еТЬгУа1 гоАзрТН

CAMGTTA/vTTTCTATCCCTCGAAGAGGATGGAGgtgagttcctCtCtCtCtCCCtttccCCtcCCttggagaet rLysVaiA6nPheTyrAla7rpLysArgMetClu ctcatttgcgagcccgatttcggatgaaagggacaatgaccgagggaaasgtaaaatggagcagcagagatgagg 1800

ctgcctgggcgcagaggctcacgtctataatcccagsctgagaEggccgagatgggagaattgctCsagccctgg

r .

agtctcagaccaacctaggcagcatagtgagatcccccatctctacaaacatttaaaaaaattagtcaggCgaag 1950 tggtgcatggtggtagtcccagatfltttggaaggctgaggcgggaggaccgctcguscccaggaatttgaggctg

cagtgagctgteatcacaccaccgcactrccasccCcagtgacfisastsaggccctjCccccaaaaagiuaagaaa .2100

aaagaaaaotantgagggccgtatggaatacgctear tatCcautcactcacCcac cactcaCteat teattee CtcattcaacaagtcttattgcatacctcctgcttBCtcagcctgscgcttggggctgctgagggscaggagega 2250

gaggsCЈ;acacccctC3gctgactcccagagtccacCccctgtagCTCCCGCAGCACCCCCTAC/u CTCTGGCAG

ValGlyClnClnAIaVnlCiiiValTrpGln

pCCCTGGCCCTCCTCTCCGAACCTGTCCTCCCCGGCCAGGCCCTCTTGCTCAACTCTTCCCAGCCGTCGGACCCC 2400 GlyLcuAlaLcuLeuScrCluAlaValLeuArcGlyGinAlal-euLeuVal/vDnScrSerGlnProTrpGluPro CTGCAGCTCCATGTCCATAAACCCCTCAGTGCCCTTCGCACCCTCACCACTCTCCTTCGCCCTCTCCGAGCCCAG LeuClnLeuHisValAspLysAlaVolSerGiyLcuArcScrLeuThrThrLeuLcuAr AIaLeuClyAlaClo

gtgageaBgagcgsacacttctgcttgccctCtctgЈangaaЈg2Sa&aaЈSStcCt3cCaaЈЈ°8tacafi3aac 2550

tgtccgtattccttcccttCctgtggcactgcagcgacctccCgtCttctccctggcagAACCA/iGCCATCTCCC

LysGly/JallcSerP

:CTCCACATGCCGCCTCACCTGCTCCACTCCCAACAATCACTCC7CACACTTTCCCC/uUCrCTTCCGACTC7ACT 2700 ro roAspAlaAlaScrAia/kla roLcuArgn;rIleThrAIa/ iSpThr heAraLyGLeu hc/ircVaITyrS CC/u TT7CCTCCGGGGAAAGCTCAACCTG7ACACAGGGGACGCCTGCAGGACAGGGGACAGATCACCACGTCTGT

erAsnPhcLeuArgGIyLysLeuLyeLeuTyrThrGIyGluAlaCysArgThrGlyAspArg

.

ICCACCTCGGCATATCCACCACCTCCCTqACCAACATTGCTTGTCCCACACCCTCCCCCCCCACTCCTCAACCCCC 2850

TCCACGGGCTCTCAGCTCAGCGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCCACrCCCAGCAATGACATCTCACGGGCCACA

. .GCAACTCTCCACAGAGCAACTCTGAGATCTAAGGATCTCACAGGGCCAACTTGAGGGCCCACACCACCAAGCATT 3000

CAGAGAGCACCTT7A,UCTCAGGGACAGACCCATCCTGGCAAU CGCCTGACCTCACTCGCCACCCTCCAAAATT

rCATGCCAGGACACCCTTTGGACGCGATTTACCTGTTTTCCCACCTACCATCAGGGACAGGATGACCTCGAGAAC 3150

«

TTAGGTGGCAAGCTGTGACTTCTCCAGG7C7CACCGGCATCGGCACTCCCTTGGTGGC/u GACCCCCCTTCACAC

CGGGGTGGTGGGMCCATGAAGACAGGATGGGGCCTGGCCTC7GGCrC7CA7CGGGTCC UCrrTTTGTC7AT7CT 3300 .... ,

TCMCCTCATTGACAAGAACTGAAi kCCACCaatatgactcctggcttcCctgttCCctgggaacctccaAaCCCC ctggctctgtcccactcctggcagea3400

50

2318°1118 24

---------- . - Таблица gatcctacgcctgtg-gccagggccagagccttcagg g acccttgactCGCcgggctgtgtgcatttcag;

а

ACG GGC TGT GOT GAA САС TGC AGO TTG AAT GAG AAT АТС Thr Gly Cys Ala Giu His Cys Se Leu Asn Glu Asn He

ACT GTC CCA GAG ACC ЛАА GTT AAT TTC TAT GCC TGG AAG Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys

AGG ATG GAGgtgagUcctttttttttttttttcctttcttttggagaatctcatUgcgagcctg

Arg MET Glu d- . . .

attUggatgaaagggagaatgatc

НЕТ GLY YAL HIS GLU CYS PRO ALA TRP LEU TRP. LEU LEU LEU SEP. LEU LEU SER LEU PROLEU GLY LEU PRO VAL LEU -GLY

i . 10 . .20

Ala Pro Pro Arg Leu tie CYS Asp Sor ЛГЕГ Vni Leu CluArg Туг Leu Leu Clu Ala Lys . SH

30. . , 50

Clu Ala Glu Asn lie hr Thr Gly Cys Ale Glu Kis CysSOP Leu- Asn Glu ЛЕП lie Thr

- ----;--- - SH . .

. so . : . -co

Pro Asp Thr Lys Vnl Asn 1 he Tyr Aln Trp ьуз ArgMe Giu Val .- Gly Gin Gin /.la

. -i ...:

70 .

Val Glu Val Trp Cln Gly Lou Ala Leu Leu Scr Glu AlaVal Lou Are Cly flln Ala Leu

so . . - . . : wo

Leu ,Val Ae n Ser Ser Cln Pro Trp Olu Pro ьеи Gin LeuHis Val Asp Lys Ala Val Ser

110 - 120

Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr. tou Leu Are Ala Leu GlyAla Gin Lys Glu Ala He Sor

130 . К

Pro Pro Asp Aid Aln Ser Alo Aln Pro Leu Arg Thr lloThr Ala Asp Thr Phc Arg Ly

ISO - 16 Leu The Arff Val Tyr Ser Asn Pho Leu Ar°- Gly Lys Lou Lys Leu Туг Thr Gly Clu ЛЬ

JBG Cvs Лгр Thr Gly Asp ArgТаблица 2

ТаблицаЗ cccggagcc figaccggggc caccgcgccc gccccjjctccg acaccgcgcc

ccctggacag . ccgccccctc ctccaggccc gtggggetgg ccccgcaccg ccgagcttcc cgggacgaggg cccccggtgt

-27

HEX CLV VAL HIS CLU CYS PRO ggtcacccgg cgcgccccag gtcgctgagg gaccccggcc ogbCSCgfiag ATG GGG GTG CAC CAA XGX CCT

Д

(

ALA TR LEU TRP -LEU LEU LEU SEE LEU LEU БЕЛ LEU PRO LEU GLY LEU PRO VAL LEU CLY ю GCC XGG CTG XCG CXX CXC CXG TCC CXG CXC ТСС СТО CCX CTG GCC CXC CCA GXC CXG GGC m

СТА GAA GTC TGG CAG . GGC CTG GCC CTG CTG TCG СЛЛ CCT CTC CTG CGG CGC СЛС . GCC CTG

N ,

90 .1QO

.Lcu..Val Asn .Spr .... Sor Gln.Pro ,Trp...GX „.Lov.Т 1оУд1AspT.vr,AlaValSer

TTG GTC AAC XCT XCC CAG CCG IGG GAG CCG CTG CAG CIG CATGTGCATAMGCCCTCACT

110120

Cly Leu Arg Leu Leu Lou ArnAloLeuGlyAlaGin LyeCIuAlalieSer

CCC CTX CCC AGC CTC ACC ACT CTG .CXX CCGCC7CXGCCAGCCCAG. AAGCAACCCАТСТСС

130 Pro Pro Asp Ala Ala Aln Pro Leu Лгг. Thr

Продолжение табл.3 UO

.Л1а.Лар Thr. Phe Arg Lys

Таблица agcttctgggcEtccagacccagctactCtgcggaactcagcaacccaggcatctctgagtctccgcccaagacc

. ,

gggatgccccccaggaggtgtccgggagcccagcctttcccagatagcagctccgccagtcccaagsgtgcscaa 150

..

ccggctgcactcccctcccgcgacccagggcccgggagcagcccccatgacccacacgcacgtctgcagcagccc

9

cgtcag cccggagcctcancccaggcgtcccgcccctgcuctgaceccgggtggcccclracccctggcsacccc 300 tcacgcacacagcctctcccccacccccacccgcgcacgcacacatgcagataacagccccgacccccggccaga

gccgcagagcCCCtgggccacCCCCCCCCCTCGCTGCCCTGCGCCCCACCCCCCTGTCCTCCCCGAGCCCCACCG 450ю

CD

GGGCCACCCCCCCCCCTCTCCTCCCACACCGCGCCCCCTCCACAGCCCCCCTCTCCTCCACGCCCGTCGCGCTGG

.

CCCTGCACCGCCCACCTTCCCGGGATGACGGCCCCCCGTGTGGTCACCCGGCGCGCCCCAGGTCGCTGAGGGACC 600

CCGGCCAGGCGCGGAGATGGGGGTGCACGgtgagCactcgcgggctgggcgctcccgcccgcccgggtcccCgtt

MctGlyValHlsG. . tgagcggggatttagcgccccggctattggccaggaggtggctgggttcaaggaccggcgacttgtcaaggaccc 750

cggaagggggnccBggBtGgggcagcctccacgtigccagcgSijaactCgggggasCccttggggatggcaaaaac

о ctgacctgtgaagg ggacacagtttgggggttgaggggaagaaggtttggggggCCctectgtgccaEtggagag 900 ; 01 2

gaagctgataagctgataacctgggcgctggagccaccactCatcCgccagaggggaogcctcCgtcacaccagg°° fittgaagCtCggccggagaagtggatgctGgtngcctggggfitBgggCgCecacacggcagcaggatCgaaCgaa 1050

ggccagggaggcagcacctgagcgcttccatggttggggacagganggacgngctggggcagagacgtggggatg aaggaagctgtccttccacagccacccCtctccctccccgccCgactcCcagcctg ctatcCgtcctagMTGT 1200

- ItiCva CCTGCCTCGCTGTGnCTTCTCCTGTCCCTGCTGTCGCTCCCTCTGCCCCTCCCAGTCCTGGCCCCCCCli vCCACGC

ProAlaTrpLcuTrtjLauI.cuLeuScrLcuLcuScrLcu r.oLcuGiyLGu roVaILcuGIyAIcPro roArg

CTCATCTGTGACAGCCUAGTCCTGCAGAGCTACCTCTTGGACCCCAACCAGGCCGAGAATATCACGatgagaccc 1350со LeuIlcCyaAspScrArcVaiLcuGluArgTyrLeuLcuGIuAIaLysGIu/daGIuAsnliaTl r ° cttccccagcncattccacagaactcacgctcagBgcttcagggaactcctcccflgacccnBaaaccCggcactt

Продолжение табл. 4 gSttcggsstBSagtCGKSaagctagacacUBecccccCacaCanaaaCacgtcC. jgtSEccccuaaccatacct 1500

ggaaactaggcaaggagcaaagccagcagatcctacccccgtgsccaggsceagagccttceagsacccttgact

ccccgggctgtgtgcatttcagACGGCCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGMTCAGAATATCACTGTCCCAGACAC 1650

ThrGlyCyoAlaCIullieC/oSerLeuAGnGluAcnlleThi-ValProAspTh

CAAAGTTMTrTCTATGCCTCGAAGAGCATGGAGgtgagttccttttttCCtCtttttccCtCcttttggagaat

. rLyoVaiAsnPhcTyrAlaTrpLysArgHctGlu . ы ctcatttgcgagcccgatCttggatgaaagBgacaatgaCcgnggijaaaggtaaaatggagcascagagaCgaBg 1800

cCgcctgggcgcagaggctcacgCctataatcccaggctaagaCcsccgngatficgagaaitgcCtgagccctgg

. - ,

astntcagaccaacctaggcagcatagtgagatcccccatctctflcaaacatttaaaaaaaCtngtcasgCgaas 1950 tSStgcatggcggCagCcccagatatttggaaggctgaggcgggaggaCcgcCCgagcccagsnBCttgaggctg . .

caetgagclgteatcacaccaccgcactccagcctcagcgacusagtsaggccccgccccaaaaaagaaaagaaa 2100 ел aaagaaaaacaacgagggctgtatggaatacgt teat tat teat tcacCcacCcacЈcacl:cacCca,t teat teaо

СЛ ... . (ji -

ttcattcaacaagtcctattgcataccccccgcctgcccagcctggcgcctggggccgctgaggggcaggaggga 2250

Продолжение табл.4

gagggCgncatccctcaectgactcccagagcccactcccCgtagGTCGGCCAGCAGGCCCTACA/.GTCTCGCAG

- ValGlyGlnGlnAlaVaiCiuVaiTrpGln

jGC CCTGGCCCTCCTGICGGAACCTGTCC7GCCGGGCCAGGCCCTGTTCGTC/i/iCTCrrCCCAGCCGTGGGACCCC 2400

. GlyLeuAlaLcuLeuScrGluAlaValLcuArgGlyGlnAlaLeuLeuValABnScrSerGlnProTrpGluPro

CTGCAGCTGCATCTGGATAMGCCGTCAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTCGGAGCCCAG

LeuGlnLeuilleValAspLysAlaValSerGlyLcuArgSerLeuTlirTlirLeuLeuArgAIaLeuGiyAleGln

gtgagtaagagcggacacttctgctCgccctttctgtaagaaggggaGaacgctctUsctaogsaaCacaggaac 2550

CO

tgtccgtattccttccctttctgtggcactgcagcgacctccCettttctccttggcagAAGCMGCCATCTCCC

LysGlyAlalleSerP , ,

ICTCCAGATGCGGCCTCACCTGCTCCACTCCGAACMTCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTCCGAGTCTACT 2700 roProAspAlaAlaScrAlaAlnProLeuArgTlirIleThrAlnAGp7hrPheArGLyGLGu heArgValTyrS CCA/vTTTCCTCCGGGGAA/iGCTGAAGCTGTACACAGCGCAGGCCTGCAGGACAGGGGACAGATCACCAGGTGTGT . . . erAsriPheLeuArgGIyLysLcuLysLcuTyrThrGlyGluAlaCysArgThrGIyAspArg

CCACCTGCGCATATCCACCACCTCCCTCACCAACATTGCTTGTGCCACACCCfcCCCCGCCACTCCTGAACCCCG 2850

TCGAGGGGCTCTCAGCTCAGCGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCCACTGCCAGCAATGACATCTCACGGGCCAGAS ....- о

.GGMCTGTCCAGAGACCAACTCrGAGATCTAAGGATGTCACAGGGCCAACTTGAGGGCCCAGAGCAGGAACCATT 3000 ±

CAGAGAGCACCTTTAAACTCAGGGACAGACCCATGGTGGCAAGACGCCTGACCTCACTCGCCACCCTGCAAAATT°° TGATGCCAGGACACCCTTTGGAGGCGATTTACCTGTTTTCGCACCXACCATCAGGGACAGGATGACCTGCAGAAC 3150

,

TTAGCTGCCAACCTCTGACTTCTCCAGCTCTCACGGCCATCCGCACTCCCTTCGTGCCAACAGCCCCCTTCACAC

CGGGG7GGTGGGMCGATGMGACAGGATGGGGCCTGCCCTCTCCCTCTCATGGGGTCQU.CT1TTGTGTATTCT 3300

. c

TCAACCTCATTGACAAGAACTGAAACCACCaatatgacCcttgecttttCteCtCtctggBaacctccaaacccc

ctggctctctcccactcctggcagca3400 ы

л

СО и

«

со

ч

«

а

и

п

Ю

ьа

00

4J

и

со

«

00

и

а с 

э j

S

N3 09 u и

4J IJ

ЬО

4

4J О

СО ел

4J

а а

JU

Н

О

о3

ейО

&,и

Э CJ

ы н

н4 О

о

J О

о и

эо

ын

JU

сз

СЗ и и и и и а ео

и и

60

и и и и и и и

о. н

« CJ

ги и

о

ЮН

.JО

QJСЭ

ыо

с Н

эсз

ын

JU

э сз

ы н

J О

и

СИО

ыи

ЈЛН

SS

J U

эо

ын

JU

§Й

J О

а,сэ

ИО

нн

эсэ

и:н

JО

ft.О

OSО

нн

о (J и

Продолжение табл.5

150. 160

Leu Phe Arg Val Туг Ser Asn Phe Leu ArgGlyLysLeuLyaLeuТугThrGlyGluAla

CTC TTC CGA GTC TAG TCC AAT TTC CIC CGGGGAAAGCTGAAGCTGTAGАСАGGGGAGGCC

SH166

CysArgThrGlyAspArg

TGGAGGАСАGGGGAGAGA TGA ccaggtg tgtccacctg ggcatatcca ccacctccct caccaacatt

gcttgtgccacaccctcccccgccactcctgaaccccgtcgaggggctctcagctcagcgccagcctgtc

ccatggacactccagtgccagcaatgacatctcaggggccagaggaactgtccagagagcaactctgaga

tctaaggatgtcacagggccaacttgagggcccagagcaggaagcattcagagagcagctttaaactcag

ggacagagccatgctgggaagacgcctgagctcactcggcaccctgcaaaatttgatgccaggacacgct

ttggaggcga tttacctgtt ctcgcaccta ccatcaggga caggatgacc tggagaactu aggcggcaag

oo о

ctgtgacttc cccaggtctc acgggcatgg gcactccctt ggtggcaaga gcccccttga caccggggtg

gtgggaacca tgaagacagg atgggggctg gcctctggct ctcatggggt ccaagttttg tgtattcttc

aacctcattg acaagaaccg aaaccaccaa aaaaaaaaaaaa

ctcgctgcgc ccctggacag

tgcgccgcac ccgccctctc

ggtcacccgg cgcgccccag gtcgctgagg gaccccggac aggcgcggag

ALA TRP LEU TUPLEU LEU LEU SERLEULEUSERLEUPROLEUGLYLEUPROVALLEU GLY

GCC TCG CTG TGGCTT . CIC CTG TCCCTGGTGTCGCTCCCTCTGGGGCTCССЛGTCCTGCGC

1. . SH1020

Ala Pro Pro . ArgLeu He Cys AspSerArgValLeuGluArgTyrLeuLeuCluAlaLys

GCC CCA ССЛ CGCCTC АТС TGT GACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTAGCTCTTGGAGGCCAAG

SH30SH 40

Glu Ala Glu Asnlie Thr Thr GlyCysAlaGluKIsCysSerLeuAsnGluAsnHeThr

GAG GCC GAG AATАТС ACG ACG GGCTGTGCTGAA CACTGCAGCTTGЛАТGAGЛАТАТСACT

5060

Val Pro Asp ThrLys Val Asn PheTyrAla7rpLysArgKec.GluValGlyGinGinAla

CTC CCA GAC ACCAAA GTT AAT TTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAGGCC

7080

Val Glu Val TrpGin Gly Leu AlaLeuLeuSerGluAlaValLeuArgGlyGinAlaLeu

СТА GAA GTC TGGCAG GGC CTG GCCCTGCTGTCGGAAGCTGTC-CTGCGGGGCCAGCCCCTG

Таблицаб cccggccg

cgcgctgtcc ctccaggccc

tcccggagcc gtggggctgg

.ggaccggggc ccctgcaccg

caccgcgccc gctctgctccg acaccgcgcc cgggatgaggg cccccggtgc

gtcgctgagg gaccccggac aggcgcggag

ccgagcttcc

-it

MET GLY VAL HIS GLU

АТС GGG GTG СЛС GAA

CYS PRO

TGT CCT

CO CO

Продолжение табл.6

i 90l°°

Leu Val Asn Ser -Ser Gin Pro Trp Ciu ProLeuGin LeuHisValAspLysAlaValScr

TTG GTC AAC TCT TCC CAG CCG TGG GAG CCCCTGCAG CTGCATGTGGATААЛGCCGTCACT

110120

Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu ArgAlaLeu t GlyAlaGinLy&GluAlalieSer

GGC CTT CGC ACC CTC ACC ACT CTG CTT CGGGCTCTG GGAGCCCAG-AAGGAAGCCАТСТСС

130

Pro Pro, Asp Ala Ala Scr Ala Ala Pro LeuArg Thrlie Thr Ala Asp Thr Phe Arg

CCT CCA GAT GCG GCC ТСЛ GCT GCT ССЛ CTCCGA АСААТС ACT GCT GAG ACT TTC CGC

150.

Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu ArgGly LyoLeu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu

CTC TTC CGA GTC TAG TCC AAT TTC CTC CGGCGA AAGCTG AAG CTG TAG АСА GGG GAG.

01 ел

ел о

$

140 Lyo AAA

4k

о

со

01

со о

to ел

ю о

00

о

л

ел

Таблица

cccggagcc ecaccggggc caccgcgccc gctctgctccg ncaccgcgcc ccccggacag ccgccctctc ctccaggccc gtggggctgg . ccctgcaccg ccgagctccc cgggatgaggg cccccggtgt

-27

MET CLY VAL HIS GLU CYS PRO ggtcncccgg cgcgccccag gtcgctgagg gaccccggcc aggcgcggag ATG CGG GTG СЛС СЛЛ TGT CCT

AЈ

ALA TRP LEU TR LEU LEU LEU SKR LEU LEU SER LEU PRO LEU GLY LEUPRO VAL LEUGLY

GCC TCG CTG TGG CTT CTC CTG TCC CTG CTG TCG CTC CCT CTG GCC CTCCCA GTC CTGGGC

I

1 SII 1020 j

Ala Pro Pro Arg Leu По Cys Asp Scr Arg Val Leu. Glu Arg Tyr LeuLeu Glu AlaLys

GCC CCA CCA CGC CTC АТС TGT GAG AGC CGA GTC CTG GAG AGG TAG CTCTIC GAG GCCЛЛС Ј

°

. . SH 30 5

Clu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gl Cys Ala Glu His Cys Ser Leu AsmGlu Asn lieThr °°

GAG GCC GAG ЛАТ АТС ЛССдЛСС CGC TGT GCT GAA СЛС TGC AGC - TTG АЛТGAG ЛАТ АТСACT

4k

50 -60

Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala jTrp LysT Arg Нес Glu ValGly . Gin GinAla

GTC CCA GAG ACC АЛЛ GTT ЛЛТ TTC . TAT GCC TGC ЛЛС AGG ATG GAG A GTCGCG GAG CAGGCC

A

70 . BO

Val Glu Val Trp Gin Cly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu ArgGly Gin ; AlaLeu

СТА СЛА GTC TGC CAG GGC CTG GCC CTG CTG TCG GAA GCT GTC CTG CGGGGC CAG GCCCTG

-90100Leu Val Asn., Scr Ser OIn Pro Pro Leu Gin Leu . His Val AspLys Ala ValScr

TTG GTC AAC TCT TCC CAG CCG TGG CAG CCC CTG CAG CTG CAT GTG GATАЛА GCC GTCACT.

110120

Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arp, Ala Leu Gly Ala Gin LysClu Ala HeSor

CCC СТГ CGC ACC CTC ACC ACT CTG CTT CGG CCI CTG ; GGA GCC СЛСДЛЛССАА CCC АТСТСС

ЭПО, выделенный из клеток COS, трансфекциро- ванных кДНК ЭПО, тип 1

Уровень высвобождаемого в среды ЭПО

Уровень высвобождаемого в среды ЭПО

Таблица 8

Таблица 9

Таблица 10

Таблица 71