PL157926B1 - Sposób wytwarzania erytropoetyny PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania erytropoetyny, znamienny tym, ze hoduje sie w odpowiednim podlozu kom órki gospodarza zawierajace sekwencje D N A zasadniczo taka, jak pokazana na fig. 3B, funkcyjnie polaczona z sekwencja kontroli ekspresji i wyodrebnia sie tak wytworzona erytropoetyne z kom órek i podloza. 2. Sposób wytwarzania erytropoetyny, znamienny tym, ze hoduje sie w odpowiednim podlozu eukariotyczne kom órki gospodarza zawierajace sekwencje DNA zasadniczo taka, jak pokazana na fig. 4C, funkcyjnie polaczona z sekwencja kontroli ekspresji i w yodrebnia sie tak wytworzona erytropoetyne z kom órek i podloza. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania erytropoetyny.

Erytropoetyna, określana w dalszej części niniejszego opisu skrótem EPO, jest glikoproteiną, która stymuluje wytwarzanie erytrocytów w organizmach wyższych. Patrz: Carnot i wsp., Compt. Rend., 143, 384 (1906). EPO czasami określa się jako czynnik stymulujący erytropoezę.

Czas życia ludzkich erytrocytów wynosi około 120 dni. Tak więc, około 1/120 część całkowitej ilości erytrocytów ulega codziennie zniszczeniu w układzie siateczkowo-śródbłonkowym. Jednocześnie, codziennie tworzona jest względnie stała ilość erytrocytów dla utrzymania przez cały czas względnie stałego ich poziomu [Guyton, Textbook of Medical Physiology, str. 56-60, W. B. Saunders Co., Philadelphia (1976)].

Erytrocyty tworzą się na drodze dojrzewania i różnicowania się erytroblastów w szpiku kostnym, a EPO jest czynnikiem, który działa na komórki mniej zróżnicowane i indukuje ich różnicowanie się do erytrocytów (Guyton, wyżej).

EPO jest obiecującym czynnikiem terapeutycznym do klinicznego leczenia niedokrwistości, a w szczególności niedokrwistości pochodzenia nerkowego. Niestety, wykorzystanie EPO nie jest jeszcze częste w praktyce klinicznej, z powodu jej małej dostępności.

Zmierzając do zastosowania EPO jako czynnika terapeutycznego należy brać pod uwagę możliwość zaistnienia problemów związanych z antygenowością i wobec tego jest rzeczą korzystną otrzymywanie EPO z surowego materiału pochodzenia ludzkiego. I tak np., można wykorzystać krew lub mocz ludzki od pacjentów z niedokrwistością aplastyczną, lub cierpiących na podobne choroby, wydzielających duże ilości EPO. Dostępność takich surowych materiałów jest jednak ograniczona [patrz np.: White i wsp., Rec. Progr. Horm. Res., 16, 219 (1960), Espada i wsp., Biochem. Med., 3,475 (1970), Fisher, Pharmacol. Rev., 24,459 (1972) i Gordon. Vitam. Horm. (N. Y.), 31, 105 (1973)].

157 926

Otrzymywanie produktów o charakterze EPO odbywa się na ogół za pomocą zatężania i oczyszczania moczu od pacjentów wykazujących wysoki poziom EPO, takich jak pacjenci z niedokrwistością aplastyczną i podobnymi chorobami. (Patrz np. opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 4 397 840, 4 303650 i 3 865 801). Ograniczona dostępność moczu tego rodzaju stanowi przeszkodę w praktycznym użyciu EPO i z tego powodu jest wysoce pożądane otrzymywanie produktów o charakterze EPO z moczu ludzi zdrowych, jednakże przy zastosowaniu takiego moczu problemem jest niski poziom EPO w porównaniu z moczem od pacjentów z niedokrwistością. Oprócz tego, mocz od osobników zdrowych zawiera różne czynniki hamujące, działające przeciwnie do erytropoetyny, przy czym czynniki te wykazują wystarczająco wysokie stężenie, tak, że zadawalający efekt terapeutyczny można byłoby uzyskać, w przypadku zastosowania EPO otrzymanego z moczu ludzi zdrowych, dopiero po jego daleko idącym oczyszczeniu.

EPO można także otrzymać z osocza krwi baraniej i przez wydzielenie EPO z tego osocza otrzymano preparaty wystarczająco skuteczne, stabilne i rozpuszczalne w wodzie [patrz: Goldwasser, Control Cellular Dif. Develop., cz. A, str. 487-494, Alan R. Lies, Inc. N. Y. (1981)]. Można jednak oczekiwać, że baranie EPO będzie wykazywać w organiźmie ludzkim antygenowość.

Tak więc, podczas gdy EPO jest pożądanym czynnikiem terapeutycznym, ' to z drugiej strony zwykłe metody wyodrębniania i oczyszczania, stosowane w przypadku naturalnych materiałów stanowiących źródło EPO, nie są odpowiednie do masowej produkcji tego związku.

Sugimoto i wsp. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4377 513 opisują sposób wytwarzania dużych ilości EPO obejmujący namnażanie in vivo ludzkich komórek limfoblastoidalnych, w tym Namalwa, BALL-1, NaLL-1, TALL-1 i JBL.

W piśmiennictwie fachowym pojawiły się doniesienia, że do wytwarzania EPO zastosowano metody inżynierii genetycznej. Jednakże nie opublikowano ujawnienia umożliwiającego wytwarzanie, ani też danych dotyczących chemicznego charakteru produktu. W przeciwieństwie do tego, niniejsze zgłoszenie przedstawia ujawnienie umożliwiające masową produkcję białek wykazujących właściwości biologiczne ludzkiej EPO. Sposobem według wynalazku można także wytwarzać białka, które pod względem chemicznym mogą się różnić od autentycznej ludzkiej EPO, tym niemniej jednak wykazują podobne, a w niektórych przypadkach polepszone właściwości. Dla wygody, wszystkie te białka wykazujące właściwości biologiczne ludzkiej EPO określa się w dalszej części opisu jako EPO, niezależnie od tego, czy są one, czy też nie są chemicznie identyczne z EPO.

Jak to opisano bardziej szczegółowo w dalszej części opisu, otrzymano EPO w postaci częściowo oczyszczonej, po czym oczyszczano ją dalej aż do uzyskania homogeniczności i trawiono trypsyną w celu wytworzenia specyficznych fragmentów. Fragmenty te oczyszczono i poddano sekwencjonowaniu. Na podstawie tych sekwencji zaprojektowano pulę sond oligenukleotydowych, dokonano ich syntezy i użyto do skriningu ludzkiego zbioru genomowego, z którego wyodrębniono gen EPO.

Gen EPO zweryfikowano na podstawie jego sekwencji DNA, którą skojarzono z wieloma fragmentami trypsynowymi uzyskanymi z sekwencjonowania. Następnie fragmentu klonu genomowego użyto do wykazania za pomocą hybrydyzacji, że można wykryć mRNA EPO w płodzie ludzkim (20-tygodniowym). Otrzymano i poddano skriningowi zbiór cDNA z wątroby płodu ludzkiego. Po skriningu ponad 750000 rekombinatów otrzymano trzy klony cDNA EPO. Stwierdzono, że dwa z tych klonów mają pełną długość, o czym można było sądzić na podstawie całkowitej sekwencji kodującej i zasadniczej sekwencji 5' i 3' nie podlegającej translacji. Doprowadzono do ekspresji tych DNA zarówno w komórkach małpich transformowanych wirusem SV-40 [linia komórkowa COS-1, Glusman, Celi, 23,175-182 (1981)], jak i w komórkach jajnika chomika chińskiego [linia komórkowa CHÓ, G. Urlaub i L. A. Chasin, Proc. Natl. Aend. Sci. USA, 77, 4216-4280 (1980)]. EPO tworzona w komórkach COS stanowi EPO biologicznie aktywną in vitro i in vivo. EPO tworzona w komórka CHO jest biologicznie aktywna in vitro. In vivo nie była ona badana.

Klon cDNA EPO ma interesującą otwartą ramę odczytu 14-15 aminokwasów (aa) oraz inicjator i terminator z 20 do 30 nukleotydów (nt) za regionem kodującym. Reprezentatywną próbkę E. celi transfekowanej klonowanym genem EPO zdeponowano w American Type Culture Collection, RockviIIe, Maryland, gdzie jest dostępna pod numerem rejestracyjnym ATCC 40153.

Figura 1 przedstawia sekwencję 87 par zasad egzonu ludzkiego genu EPO. Figura 2 - wykrycie mRNA EPO w mRNA wątroby płodu ludzkiego. Fig. 3A - sekwencję aminokwasów białka EPO wydedukowaną z sekwencji nukleotydów A-HEPOFL43. Fig. 3B - sekwencję nukleotydów w

157 926 cDNA EPO w ^-HEPOFL13 i wydedukowaną z tego sekwencję aminokwasów, co schematycznie przedstawiono na fig. 3C. Fig. 4A - względną pozycję insertów DNA czterech niezależnych ludzkich genomowych klonów EPO. Fig. 4B - mapę rzeczywistej struktury intronowej i egzonowej ludzkiego genu EPO. Fig. 4C - sekwencję DNA genu EPO przedstawionego na fig. 4B. Fig. 5A, 5B i 5C przedstawiają konstrukcję wektora 91023(B). Fig. 6 przedstawia analizę w żelu poliakryloamidowym EPO wytworzonej w komórkach COS-1 w porównaniu z natywną EPO. Fig. 7 -sekwencję nukleotydów i aminokwasów klonu EPO, Λ-HEPOFLó. Fig. 8 - sekwencję nukleotydów i aminokwasów klonu EPO, A-HEPOFL8. Fig. 9 - sekwencję nukleotydów i aminokwasów klonu EPO, ^-HEPOFL13. Fig. 10 - schematycznie plazmid pRKl-4, oraz Fig. 11 przedstawia schematycznie plazmid pdBPV-MMTneo (342-12).

Wynalazek dotyczy wytwarzania EPO in vitro na drodze ekspresji tych genów.

Piśmiennictwo patentowe i naukowe obfituje w doniesienia o procesach użytecznych w wytwarzaniu produktów rekombinantowych. Ogólnie, techniki te obejmują wyodrębnianie lub syntezę sekwencji żądanego genu i ekspresję tej sekwencji w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych, z zastosowaniem metod zwykle dostępnych fachowcom w tej dziedzinie wiedzy. Gdy dany gen zostanie wyodrębniony, oczyszczony i wprowadzony do odpowiedniego wektora przenoszącego (to jest klonowany), zapewniona zostaje też jego dostępność w dużych ilościach. Wektor, wraz z klonowanym w nim genem, zostaje wprowadzony do odpowiedniego drobnoustroju lub linii komórkowej, np. bakterii, drożdży, komórek ssaków, takich jak COS-1 (nerka małpy), CHO (jajnik chomika chińskiego) oraz linii komórek owadzich itp., w których wektor ulega replikacji w miarę namnażania się dorbnoustroju lub komórek z linii komórkowej. Z komórek tych wektor można wyodrębnić zwykłymi sposobami. Tak więc zostaje zapewnione ciągle odnawiające się źródło genu do dalszych manipulacji, modyfikacji i przenoszenia do innych wektorów lub innych loci w tym samym wektorze.

Do ekspresji często można doprowadzić za pomocą przeniesienia klonowanego genu, w odpowiedniej orientacji w ramie odczytu, do stosownego miejsca w wektorze przenoszącym, tak że translacyjne odczytanie prokariotycznego lub eukariotycznego genu daje w wyniku syntezę prekursora białkowego zawierającego sekwencję aminokwasów kodowaną przez klonowany gen związaną z Met, lub aminokońcową sekwencją zależną od genu prokariotycznego lub eukariotycznego. W innych przypadkach, sygnały inicjacji transkrypcji i translacji może zapewnić odpowiedni fragment genomowy klonowanego genu. W celu rozszczepienia prekursora białkowego, jeżeli taki jest wytwarzany, w żądanym miejscu, można użyć różnorodnych metod specyficznego rozszczepiania białek, tak, że zostaje uwolniona żądana sekwencja aminokwasów, którą można oczyszczać zwykłymi środkami. W niektórych przypadkach, białko zawierające żądaną sekwencję aminokwasów zostaje wytworzone bez potrzeby zastosowania metod specyficznego rozszczepiania i daje się również wydzielić z komórek do zewnątrzkomórkowego podłoża wzrostowego.

Wyodrębnianie genomowego klonu ludzkiej EPO.

Ludzką EPO oczyszczono do homogeniczności z moczu pacjentów dotkniętych niedokrwistością aplastyczną, jak to opisano w dalszej części opisu. Całkowite strawienie tej oczyszczonej EPO proteazą-trypsyną dostarczyło fragmentów, które rozdzielono za pomocą cieczowej chromatografii ciśnieniowej z odwróconymi fazami, odzyskano z frakcji gradientowych i poddano analizie mikrosekwencyjnej. Sekwencje fragmentów trypsynowych podkreślono na fig. 3 i bardziej szczegółowo przedyskutowano w poniższej części opisu. Dwie sekwencje aminokwasów, Val-Asn-PheTyr-Ala-Trp-Lys i Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg, wybrano do zaprojektowania sond oligonukleotydowych, z czego wynikła pula oligonukleotydów o długości 17 nt i 32-krotnie zdegenerowana i pula oligonukleotydów o długości 18 nt i 128-krotnie zdegenerowana, które odpowiadały pierwszemu fragmentowi trypsynowemu, oraz dwie pule o długości 14 nt, z których każda była 48-krotnie zdegenerowana i które odpowiadały dalszemu fragmentowi trypsynowemu. 17członowej 32-krotnie zdegenerowanej puli użyto do skriningu zbioru ludzkiego genomowego DNA w wektorze Ch4A, przy zastosowaniu modyfikacji metody amplifikacji in situ Woo i O'Malley'a do otrzymywania filtrów do skriningu.

Fagi hybrydyzujące z 17-członową pulą pobrano, połączono w małe grupy i sondowano pulami: 14-członową i 18-członową. Fagi hybrydyzujące z pulami: 17-członową, 18-członową i 14-członową oczyszczono za pomocą tworzenia łysinek i fragmenty subklonowano do wektorów M13 w celu analizy sekwencji metodą didezoksy-zakończenia łańcucha Saugęra i Coulsona (1977).

157 926

Sekwencję regionu w jednym z klonów, hybrydyzującego z 32-krotnie zdegenerowaną 17-cztonową pulą, pokazano na fig. 1. Ta sekwencja DNA zawiera w otwartej ramie odczytu nukleotydy, które mogły dokładnie kodować fragment trypsynowy użyty do zaprojektowania 17-członowej puli oligonukleotydów. Dalej, analiza sekwencji DNA wykazała, że 17-członowy region hybrydyzujący zawarty był w egzonie o 87 parach zasad, związanym z potencjalnymi miejscami akceptora i donora cięcia i składania.

Pozytywne potwierdzenie tego, że te dwa klony (oznaczone w opisie jako A-HEPO1 i AHEPO2) są genomowymi klonami EPO, otrzymano za pomocą poddania analizie sekwencji dodatkowych egzonów zawierających informację dotyczącą kodowania innych fragmentów trypsynowych.

Wyodrębianie klonów cDNA EPO.

Analizę metodą Northerna (56) mRNA wątroby ludzkiego płodu (20 tygodni) prowadzono stosując jednoniciową sondę o 95 nt otrzymaną z kolnu M13 zawierającego część egzonu o 87 parach zasad opisanego na fig. 1. Jak objaśniono na fig. 2, w mRNA wątroby płodu można było wykryć silny sygnał. Dokładnej identyfikacji tego pasma jako mRNA EPO dokonano za pomocą zastosowania tej samej sondy do skriningu zbioru cDNA z bakteriofagu A, który to cDNA odpowiadał mRNA wątroby płodu (25). Otrzymano kilka hybrydyzujących klonów z częstością odpowiadającą mniej więcej jednemu pozytywnemu na 250000 rekombinantów poddanych skriningowi. Całkowitą sekwencję nukleotydów i wydedukowaną sekwencję aminokwasów dla tych klonów (A-HEPOFL13 i A-HEPOFL8) przedstawiono na fig. 7 i 8. Informacja dotycząca kodowania EPO jest zawarta w połowie cDNA 5' o 594 nt, obejmując w wysokim stopniu hydrofobowy lider o 27 aminokwasach i dojrzałe białko o 166 aminokwasach.

Identyfikację N-końca dojrzałego białka oparto na N-końcowej sekwencji białka wydzielanego w moczu osób z niedokrwistością aplastyczną, jak przedstawiono w niniejszym opisie (fig. 1), oraz jak to opublikowali: Goldwasser, Sue i Sytkowski i Yanagawa. Nie jest obecnie wiadome, czy ten N-koniec (Ala-Pro-Pro-Arg—) reprezentuje rzeczywisty N-koniec znajdowany w EPO występującej w krążeniu, czy też w nerce lub moczu następuje rozszczepienie w pewnym stopniu.

Sekwencje aminokwasów podkreślone na fig. 3 wskazują te fragmenty trypsynowe lub część N-końca, z których otrzymano informację dotyczącą sekwencji białkowej. Wydedukowana sekwencja aminokwasów zgadza się dokładnie z fragmentami trypsynowymi, które analizowano, potwierdzając, że wyodrębniony gen koduje ludzką EPO.

Struktura i sekwencja genu ludzkiej EPO.

Względne pozycje insertów DNA i czterech niezależnych genomowych klonów ludzkiej EPO pokazanona fig. 4A. Analiza hybrydyzacji tych klonowanych DNA z sondami oligonukleotydowymi i z różnymi sondami otrzymanymi z tych dwu klas klonów cDNA EPO pozwala na umiejscowienie genu EPO w regionie o około 3,3 kilozasady pokazanym przyciemnioną linią na fig. 4A. Całkowita analiza sekwencji tego regionu (patrz przykład IV) i porównanie z klonami cDNA dało w wyniku mapę struktury intronowej i egzonowej genu EPO, pokazaną na fig. 4B. Gen EPO jest podzielony na 5 egzonów. Część egzonu I, wszystkie egzony II, III i IV oraz część egzonu V zawierają informację dotyczącą kodowania białka. Pozostałe części egzonów I i V kodują, odpowiednio, sekwencje 5' i 3' nie ulegające translacji.

Tymczasowa ekspresja EPO w komórkach COS.

W celu wykazania, że można oczekiwać ekspresji biologicznej aktywnej EPO w układzie hodowli komórkowej in vitro, przeprowadzono badania ekspresji w komórkach COS. · Wektor stosowany do tymaczasowych badań, p91023(B), opisano w przykładzie V. Wektor zawiera główny promotor późny adenowirusa, sekwencję poliadenylacji SV40, początek replikacji SV40, wzmacniacz SV40 i gen VA adenowirusa. Insert cDNA w A-HEPOFL13 (patrz fig. 8) wprowadzono do wektora p91023(B), w dół od głównego promotora późnego adenowirusa. Ten nowy wektor zidentyfikowano jako pPTFL13.

Po upływie 24 godzin od wprowadzenia tej konstrukcji do szczepu M6 komórek COS-1 na drodze transfekcji [Horowitz i wsp., J. Mol. Appl. Genet.,2,147-149(1983)], komórki te przemyto, przeniesiono do podłoża bez surowicy. 48 godzin później komórki zebrano. Następnie badano poziom uwalniania EPO do supernatantu hodowli stosując ilościowy test radioimmunologiczny dla EPO. Jak pokazano w tabeli 1 (przykład VI) nastąpiła ekspresja immunologicznie reaktywnej EPO. Badano również całkowitą aktywność biologiczną EPO tworzonej · przez komórki COS-1. W oddzielnym eksperymencie, komórki COS-1 transfekowane wektorem zawierającym cDNA EPO z A-HEPOFL13. Podłoża zebrano jak opisano powyżej. EPO w podłożach badano ilościowo

157 926 zarówno w dwóch testach biologicznych in vitro (³H-tymidyna i CFU-E/12, 29), jak i w dwóch testach in vivo (niedotleniona mysz i głodzony szczur) (patrz tabela 2, przykład VII). Badania te wykazały, że w komórkach COS-1 jest tworzona biologicznie aktywna EPO. Za pomocą nakroplenia metodą Westerna, stosując poliklonalne przeciwciało przeciw EPO. wykazano, że EPO wytworzona w komórkach COS ma tę samą ruchliwość elektroforetyczną w żelach SDS-poliakryloamidowych, co natywna EPO otrzymana z moczu ludzkiego (przykład VIII). Tak więc, rozmiary glikozylacji EPO wytworzonej przez COS-1 mogą być podobne do wykazywanego przez natywną EPO.

Można także użyć w zastosowaniu do komórek COS albo innych komórek ssaków lub komórek eukariotycznych różnych wektorów zawierających inne promotory. Przykłady tych innych promotorów użytecznych w praktycznym zastosowaniu sposobu według wynalazku obejmują wczesne i późne promotory SV40, promotor genu mysiej metalotioneiny, promotor znajdowany w długich terminalnych powtórkach retrowirusów ptaków i ssaków, promotor genu polihedryny bacculowirusa i inne. Przykłady innych typów komórek użyteczynych w praktycznym zastosowaniu sposobu według wynalazku obejmują E. coli, drożdże, komórki ssaków, takie jak CHO (jajnik chomika chińskiego), C127 (nabłonek małpi) 3T3 (fibroblasty mysie), CV-1 (nerka afrykańskiej małpy zielonej) oraz komórki owadów takich jak Spodoptera frugiperda i Drosophila metanogaster. Te alternatywne typy promotorów i/lub komórek mogą umożliwić regulację czasu pojawiania się lub regulację poziomu ekspresji EPO, wytwarzanie komórkowo - specyficznego typu EPO, lub wzrost komórek tworzących EPO w dużych ilościach, w warunkach łatwiejszy do skontrolowania i pociągających za sobą niższe koszty.

Układ ekspresyjny, który zachowuje dodatnie cechy ekspresji u ssaków, ale wymaga mniej _ czasu do wytworzenia wysoko ekspresyjnej linii komórkowej, jest złożony z linii komórek owadzich i wirusa DNA, który reprodukuje się w tej linii komórkowej. Wirus jest wirusem jądrowej polihedrozy. Ma on dwuniciowy kolisty genom DNA o 128 kilozasadach. Nukleokapsyd jest pałeczkowaty i stwierdzono, że może być upakowany w dwóch formach, niezamkniętej jako wirus otoczony błoną oraz w formie zamkniętej w krysztale białkowym w jądrze zakażonej komórki. Te wirusy mogą być rutynowo namnażane w hodowli komórek owadzich in vitro i można ich używać przy wszystkich rutynowych metodach stosowanych do wirusów zwierzęcych. Płynem do hodowli komórek jest typowo roztwór soli odżywczych z płodową surowicą cielęcą w ilości 10%.

In vitro wzrost wirusa jest inicjowany gdy niezamknięty wirus (NOV) wnika do komórki i przechodzi do jądra, gdzie jest replikowany. Replikacja jest jądrowa. Podczas fazy wstępnej (8-18 godzin po zakażeniu) zastosowania wirusa, w jądrze zostają zmontowane nukleokapsydy i następnie BUD przenika przez błonę plazmatyczną jak NOV, rozsiewając zakażenie w hodowli komórek. Oprócz tego, niektóre z nukleokapsydów w dalszym ciągu (18+ godzin po zakażeniu) pozostają w jądrze i zostają zamknięte w materiale białkowym. Znane są jako wielościenne ciałka wtrętowe (FIB). Ta forma nie jest zakaźna w hodowli komórkowej. Powyższy materiał jest złożony z białka znanego jako polihedryna, o masie cząsteczkowej 33 kilodaltonów. Każdy PIB ma około 1 mm średnicy i może być ich tak wiele, jak nawet 100000 PIB na jedno jądro. Tak więc, polihedryna jest tworzona późno w cyklu infekcyjnym w wyraźnie dużej ilości, tak dużej, że wynosi to nawet 25% całkowitego białka komórkowego.

Ponieważ PIB nie gra roli w cyklu replikacji in vitro, gen polihedryny można usunąć z chromosomu wirusa bez wpływu na żywotność in vitro. Przy użyciu tego wirusa jako wektora ekspresyjnego, twórcy wynalazku zastąpili region zawierający gen kodujący polihedrynę obcym DNA, który ma ulegać ekspresji, umieszczając go pod kontrolą promotora polihedryny. Daje to w wyniku fenotyp wirusa nie tworzącego PIB.

Układ ten wykorzystywało kilku badaczy. Najwybitniejszymi z nich są Pennock i wsp., oraz Smith i wsp. Pennock i wsp. (Gregory D. Pennock, Charles Shoezaker i Lois K. Miller, Molecular and Celi Biology, 3:84, str. 399-406) donieśli o wysokim poziomie ekspresji białka bakteryjnego, /5-galaktozydazy, znajdującej się pod kontrolą promotora polihedryny.

Inny wektor ekspresyjny pochodzący z wirusa polihedrozy jądrowej przedstawili Smith i wsp. [Gale E. Smith, Mas. D. Summers i M. J. Fraser, Molecular and Celi Biology, 16 maja, str, 2156-2165 (1983)]. Wykazali oni skuteczność tego wektora w ekspresji ludzkiego J-interferonu. Stwierdzono, że syntetyzowany produkt był glikosylowany i wydzielany z komórek owadzich, jak można było tego oczekiwać. W przykładzie XIV opisano modyfikacje plazmidu zawierającego gen

157 926 polihedryny z wirusa polihedrozy jądrowej Autographa californica (AcHPV), które pozwalają na łatwe wprowadzenie genu EPO do plazmidu, tak, aby znalazł się on pod kontrolą transkrypcyjną promotora polihedryny. Utworzonym DNA kotransfekuje się komórki owadzie stosując go łącznie z nienaruszonym chromosomowym DNA z dzikiego typu AcHPV. W przypadku rekombinacji genetycznej zachodzi zastąpienie regionu genu polihedryny AcHPVC przez DNA z plazmidu. Powstały wirus rekombinantowy można zidentyfikować wśród potomstwa wirusa na podstawie posiadania sekwencji DNA genu EPO. Oczekuje się, że ten wirus rekombinantowy będzie wytwarzał EPO po reinfekcji komórek owadzich.

Przykłady ekspresji w komórkach CHO, C127 i 3T3 i owadzich podano w przykładach X i XI (CHO), XIII (C127 i 3T3), oraz XIV (komórki owadzie).

Biologicznie aktywnej EPO wytworzonej za pomocą prokariotycznej lub eukariotycznej ekspresji genów EPO klonowanych sposobem według wynalazku, można użyć in vivo do leczenia ssaków różnych gatunków, przez lekarzy i/lub weterynarzy. Ilość składnika czynnego będzie oczywiście zależeć od ciężkości schorzenia osobnika leczonego, wybranej drogi podawania i aktywności właściwej EPO, a ostatecznie będzie o tym decydować prowadzący kurację lekarz lub weterynarz. Tę ilość aktywnej EPO określoną przez leczącego lekarza przytacza się w niniejszym opisie jako ilość EPO „terapeutycznie skuteczną. I tak np., w leczeniu indukowanej niedokrwistości hipoproliferatywnej towarzyszczącej przewlekłej niewydolności nerek u owcy, skuteczna dawka dzienna EPO wynosi, jak stwierdzono, lOjed/kg w ciągu 15 do 40 dni. Patrz: Eschbach i wsp., J. Clin. Invest., 74, 434 (1984).

Aktywną EPO można podawać każdą drogą odpowiednią do stanu leczonego. Korzystnie EPO wstrzykuje się do krwi leczonego ssaka. Fachowcy łatwo zdadzą sobie sprawę z tego, że korzystna droga podawania będzie się różnić w.zależności od stanu leczonego.

Aczkolwiek możliwe jest podawanie aktywnej EPO jako związku czystego lub zasadniczo czystego, korzystnie podaje się ją w postaci środka lub preparatu farmaceutycznego.

Środki, zarówno do użytku weterynaryjnego, jak i dlaludzi, zawierają aktywne białko EPO, jak wyżej opisano, łącznie z jednym, lub więcej niż jednym farmaceutycznie dozwolonym jej nośnikiem, oraz, ewentualnie, z innymi dodatkami leczniczymi. Nośnik (nośniki) musi być „dozwolony w tym sensie, że jest zgodny z innymi składnikami środka i nie jest szkodliwy dla pacjenta. Jest pożądane, aby środek nie zawierał czynników utleniających i innych substancji, z którymi peptydy są, jak wiadomo, niezgodne. Dogodnie, środki można formułować w postaci dawek jednostkowych, dowolną z metod dobrze znanych w dziedzinie farmacji. Wszystkie metody obejmują stadium doprowadzania do połączenia składnika czynnego z nośnikiem, który stanowi jeden, lub więcej niż jeden składnik dodatkowy. Ogólnie, środki wytwarza się za pomocą doprowadzenia do jednolitego i dokładnego połączenia składnika czynnego z nośnikami płynnymi lub subtelnie rozdrobnionymi nośnikami stałymi, względnie i z tymi i z tymi, a następnie, jeżeli jest to niezbędne, nadania otrzymanemu produktowi postaci żądanego środka.

Dogodnie, środki odpowiednie do podawania pozajelitowego zawierają jałowe roztwory wodne składnika czynnego z roztworami, korzystnie izotonicznymi z krwią pacjenta. Tego rodzaju środki dogodnie otrzymuje się za pomocą rozpuszczenia stałego czynnika czynnego w wodzie, w celu wytworzenia roztworu wodnego i po wyjałowieniu roztwór ten można formułować w pojemnikach jednostkowych lub wielodawkowych, takich jak zamknięte ampułki lub fiolki.

Określenie EPO/cDNA, używane w opisie, obejmuje dojrzały gen EPO/cDNA poprzedzony kodonem ATG, oraz EPO/cDNA kodujący alleliczne wariacje białka EPO. Jeden z alleli objaśniają fig. 3A i 3B. Białko EPO obejmuje 1-metioninową pochodną białka EPO (Met-EPO) i alleliczne wariacje białka EPO. Dojrzałe białko EPO, o sekwencji przedstawionej na fig. 3A, zaczyna się sekwencją Ala.Pro.Pro.Arg..., której początek jest przedstawiony nr „1“ na fig. 3A. Met-EPO zaczynałaby się sekwencją Met.Ala.Pro.Pro.Arg....

Następujące przykłady zamieszczono w celu zrozumienia sposobu według wynalazku, którego rzeczywisty zakres wynika z załączonych zastrzeżeń. Należy rozumieć, że można dokonać modyfikacji podanych sposobów postępowania, bez odchodzenia od ducha wynalazku. Wszystkie wartości temperatury wyrażono w stopniach Celsjusza, przy czym nie są one korygowane. Symbolem mikrona lub mikro, w takich jednostkach jak mikrolitry, mikromole, jest ,,μ“, np. μϊ, pm itd.

157 926

Przykład I. Wyodręnianie genomowego klonu EPO.

EPO oczyszcza się z moczu pacjentów z niedokrwistością aplastyczną zasadniczo tak, jak to uprzednio opisano [Miyske i wsp., J. Biol. Chem., 252, 5558/1977], z tą różnicą, że eliminuje się działanie fenolem i zastępuje je działaniem ciepłym w temperaturze 80°C w ciągu 5 minut, w celu zinaktywowania neuraminidazy. Końcowym stadium oczyszczania jest frakcjonowanie na kolumnie HPLC C-4 Vydac (The Separations Group) przy zastosowaniu gradientu 0-95% acetonitrylu z 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA) w ciągu 100 minut. Usytuowanie EPO w gradiencie określa się za pomocą elektroforezy w żelu i analizy N-końcowej sekwencji (21, 26, 27) głównych pików. EPO eluuje się przy około 53% acetonitrylu i stanowi około 40% białka poddanego HPLC z odwróconymi fazami. Frakcje zawierające EPO odparowuje się do 100//1, doprowadza pH do wartości 7,0 za pomocą wodorowęglanu amonowego i trawi całkowicie 2% trypsyną potraktowaną TPCK (Worthington) w ciągu 18 godzin w temperaturze 37°C. Mieszaninę po trawieniu trypsyną poddaje się HPLC z odwróconymi fazami, jak wyżej opisano. Rejestruje się gęstość optyczną zarówno przy 280 nm jak i przy 214nm. Dobrze rozdzielone piki odparowuje się niemal do sucha i poddaje bezpośrednio analizie sekwencji N-końcowym aminokwasów stosując analizator sekwencji w fazie gazowej Applied Riosystems Model 480A. Otrzymane sekwencje są na fig. 3 podkreślone. Jak to opisano w powyższej część niniejszego opisu, dwa z tych fragmentów trypsynowych wybiera się do sond oligonukleotydowych. Na podstawie sekwencji Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (aminokwasy 46 do 52 na fig. 3) otrzymuje się 17-członową 32 zdegenerowaną:

A A A

TTCCANGCGTAGAAGTT i 18-członową 128-krotnie zdegenerowaną:

ΑΛΑ

CCANGCGTAGAAGTTNAC

Na podstawie sekwencji Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (aminokwasy 144 do 150 na fig. 3) otrzymuje się dwie pule 14-członowe, z których każda jest 32-krotnie zdegenerowaną:

TTGN T T TTGN T T

TACACCTAACTTCCT i TACACCTAACTTCTT które różnią się przy pierwszej pozycji kodonu leucyny. Oligonukleotydy znakuje się p przy końcu 5' za pomocą kinazy polinukleotydowej (New England Biolabs) oraz ³²P-ATP (New England Nuclear). Aktywność właściwa oligonukleotydów wahała się w zakresie od 1000 do 3000 Ci/mmol oligonukleotydu. Zbiór ludzkiego genomowego DNA w bakteriofagu (Lawn i wsp., 22) poddaje się skaningowi stosując modyfikację metody amplifikacji in situ Woo i wsp. (47) (1978). Około 3,5· 10⁵ fagów nanosi się przy gęstości 6000 fagów na 150 mm płytkę Petri'ego (podłoża NZCYM) i inkubuje się w temperaturze 37°C, aż łysinki staną się widoczne, chociaż mało (około 0,5 mm). Po ochłodzeniu do temperatury 4°C w ciągu godziny, podwójne repliki układu łysinek przenosi się na nylonowe membrany (New England Nuclear) i inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C na świeżych płytkach NZCYM.

Następnie filtry poddaje się denaturacji i zobojętnieniu za pomocą położenia ich każdorazowo na 10 minut na cienkiej warstwie, odpowiednio, 0,5 N NaOH - IM NaCl i 0,5 M Tris (pH 8) - 1 M NaCI. Następnie poddaje się działaniu ciepła w temperaturze 80°C w ciągu 2 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem, przemywa się filtry 5 X SSC, 0,5% SDS w ciągu godziny i komórkowy debris usuwa się z powierzchni filtra za pomocą łagodnego zdrapowania wilgotną tkaniną. To zdrapywanie zmniejsza podstawowe wiązanie sondy z filtrami. Następnie filtry spłukuje się wodą i poddaje

157 926 prehybrydyzacji w ciągu 4 do 8 godzin w temperaturze 48°C w 3 M tetrametyloamoniowym, 10 mM Na3PO4 (pH 6,8), 5 X roztworze Denhardt'a, 0,52% SDS i 10 mM EDTA. Następnie dodaje się znakowaną 32p 17-członową pulę w stężeniu 0,1 pmola/ml i prowadzi się hybrydyzację w temperaturze 48°C w ciągu 72 godzin. Po hybrydyzacji filtry dokładnie przemywa się w 2 X SSC (0,3 M NaCl - 0,03 cytrynian sodowy, pH 7) w temperaturze pokojowej, a następnie w ciągu godziny w 3 M TMAC1- 10 mM Na3PC>4 (pH 6,8) w temperaturze pokojowej i wciągu 5-15 minut w temperaturze hybrydyzacji. Wykrywa się w przybliżeniu 120 silnych podwójnych sygnałów po upływie 2 dni autoradiografii z zastosowaniem ekranu wzmacniającego. Pobiera się materiały pozytywne, grupuje w pule po 8, ponownie przenosi na płytki i poddaje skriningowi, czyniąc to trzy razy, z zastosowaniem połowy 14-członowej puli na każdy z dwóch filtrów i 17-członowej na filtr trzeci. Warunki przenoszenia na płytki i hybrydyzacji oraz 17-członowa pula były takie, jak opisano w powyższej części opisu, z tą różnicą, że hybrydyzację prowadzi się w temperaturze 37°C. Po autoradiografii, sondę usuwa się z filtra z 17-członową pulą w 50% formamidzie w ciągu 20 minut w temperaturze pokojowej i filtry poddaje się powtórnej hybrydyzacji w temperaturze 52°C z sondą 18-czlonową. Dwa niezależne fagi hybrydyzują ze wszystkimi trzema sondami. DNA z jednego z tych fagów (oznaczonego w opisie Λ-ΗΕΡΟ1) trawi się całkowicie San3A i subklonuje do M13 w celu analizy sekwencji z zastosowaniem metody didezoksy-zakończenia łańcucha metodą Sangera i Couleona (1977).

W opisie przedstawiona jest sekwencja nukleotydów, oraz wydedukowana sekwencja aminokwasów otwartej ramy odczytu, kodująca fragment trypsynowy (region podkreślony). Sekwencje intronowe podane są małymi literami, sekwencje egzonowe (87 nt) podane są dużymi literami. Sekwencje odpowiadające zgodnym miejscom akceptora (a) i donora (d) cięcia i składania są podkreślone (patrz: fig. 4a).

Przykład II. Analiza mRNA wątroby ludzkiego płodu metodą Notherna.

5pg mRNA wątroby ludzkiego płodu otrzymanego z wątroby płodu 20-tygodniowego i mRNA wątroby dorosłego osobnika poddaje się elektroforezie w 0,8% agarozowym żelu formaldehydowym i przenosi na nitrocelulozę stosując metodę Dermana i wsp., Celi, 23, 731 (1981). Następnie przygotowuje się jednoniciową sondę z matrycy M13 zawierającej insert przedstawiony na fig. 1. Primer jest 20-członowy, otrzymany na podstawie tego samego fragmentu trypsynowego co oryginalna sonda 17-członowa. Sondę otrzymuje się, jak uprzednio opisali Anderson i wsp., PNAS (50) (1984), z -tą różnicą, że po trawieniu Smal (przy użyciu, którego wytwarza się żądaną sondę o długości 95 nt, zawierającą sekwencję kodującą o 74 nt), mały fragment oczyszcza się z matrycy Μ13 za pomocą chromatografii na kolumnie Sepharose CI4B w 0,1 N NaOH - 0,2 M NaCl. Filtry poddaje się hybrydyzacji z tą sondą (do około 5 · 10⁶ zliczeń/min.) w ciągu 12 godzin, w temperaturze 68°C, przemywa w 2XSSC w temperaturze 68°C i eksponuje w ciągu 6 dni z zastosowaniem ekranu wzmacniającego. Pojednyczy marker stanowiący mRNA o 1200 nt (wskazany strzałką) poddaje się elektroforezie na sąsiedniej ścieżce (fig. 2).

Przykład III. cDNA otrzymany z wątroby płodu.

Otrzymuje się sondę identyczną z sondą opisaną w przykładzie II i stosuje ją do skriningu zbioru cDNA otrzymanego z wątroby płodu, przygotowanego w wektorze 3-Oh21 A [Toole i wsp., Naturę (25)(1984)] z zastosowaniem standardowego skirningu łysinek [Benton Davis, Science (54) (1978)]. Na podstawie 1 X 10⁶ łysinek wyodrębnia się 3 niezależne pozytywne klony [oznaczone w op^e 3-^HE^POFL6 (¹³⁵° par zasa^dX 3-^hepofl8 (700 par zasa^d) i 3-^HEPOFL13 (¹⁴⁰⁰ par zasad)]. Nienaruszony insert z 3-HEPOFL13 i -HEPOFL6 poddaje się analizie sekwencji po subklonowaniu do M13 (fig., odpowiednio, 9 i 7). Analizie sekwencji poddaje się jedynie część y-HEPOFL8 i zakłada się, że pozostałość jest identyczna z innymi dwoma klonami (fig. 8). Nie ulegające translacji sekwencje 5' i 3' przedstawione są małymi literami. Region kodujący przedstawiony jest dużymi literami. .

W odniesieniu do fig. 3A i 3B, wydedukowana sekwencja aminokwasów pokazana przed sekwencją nukleotydów, numerowana jest zaczynając od 1 dla pierwszego aminokwasu dojrzałego białka. Przypuszczalny peptyd liderowy jest wskazany wszystkimi „czapeczkami*’ oznaczeń aminokwasów. Reszty cysteiny w dojrzałym białku są dodatkowo wskazane przez SH, a potencjalne miejsca N-glikozylacji są wskazane przy pomocy gwiazdki. Aminokwasy podkreślone wskazują reszty zidentyfikowane na podstawie analizy sekwencji N-końca białka, albo analizy sekwencji fragmentów EPO, jak opisano w przykładzie I. Częściowe podkreślenie wskazuje te reszty w

157 926 sekwencji aminokwasów pewnych fragmentów trypsynowych, które nie mogły być określone w sposób jednoznaczny. Klony cDNA Λ-HEPOFLó, A-HEPOFL8 i A-HEPOFŁ13 zostały zdeponowane i są dostępne w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerami rejestracyjnymi, odpowiednio, ATCC 40156, ATCC 40152 i ATCC 40153.

Przykład IV. Genomowa struktura genu EPO.

Względne wielkości i pozycje czterech niezależnych klonów genomowych (Λ-ΗΕΡΟ 1,2,3 i 6) ze zbioru Haelll/Alul przedstawione są zachodzącymi na siebie liniami na fig. 4A. Linie pogrubiane wskazują pozycję genu EPO. Wskazana jest skala (w kilozasadach) i pozycje znanych miejsc rozpoznawania endonukleaz restrykcyjnych. Region zawierający gen EPO /.ostał całkowicie zanalizowany pod względem sekwencji obydwu nici przy zastosowaniu ukierunkowanych, wytworzonych przez endonukleazę III serii delecji w tym regionie. Schematyczna reprezentacja pięciu egzonów mRNA kodujących EPO jest przedstawiona na fig. 4B. Dokładna granica egzonu I po stronie 5' nie jest obecnie znana. Części egzonów kodujące białko są zaciemnione. Całkowita sekwencja regionu jest pokazana na fig. 4C. Znane granice każdego regionu są nakreślone grubymi, pionowymi kreskami. Genomowe klony Λ-ΗΕΡΟ1, Λ-ΗΕΡΟ2, Λ-ΗΕΡΟ3 i Λ-ΗΕΡΟ6 zostały zdeponowane i są dostępne w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerami rejestracyjnymi, odpowiednio, ATCC 40154, ATCC 40155, ATCC 40150 i ATCC 40151.

Przykład V. Konstrukcja wektora p91023(B).

Wektor transformacyjny pAdD26SVpA(3) jest opisany przez Kaufmana i wsp., Mol. Celi. BioL.2, 1304(1982). Struktura tego wektora jest pokazana na fig. 5A. Mówiąc krótko, plazmid ten zawiera cDNA genu mysiej reduktazy dihydrofolianowej (DFHR), który znajduje się pod transkrypcją kontrolną głównego promotora późnego adenowirusa 2 (Ad2). Miejsce rozszczepienia 5'jest wskazane w adenowirusowym DNA, a miejsce rozszczepienia 3' pochodzące z genu immunoglobuliny jest obecne między głównym promotorem Ad2 i sekwencją kodującą DFHR. Wczesne miejsce poliadenylacji SV40 występuje przed sekwencją kodującą DHFR. Część pAdD26SVpA(3) pochodzenia prokariotycznego otrzymana jest z pSVOd [Mellon i wsp., Celi, 27,279 (1981)] i nie zawiera sekwencji pBR322 znanych z hamowania replikacji w komórkach ssaków [Lusky i wsp., Naturę, 293, 79(1981)].

pAdD26SVpA(3) przeprowadza się w plazmid pCVSVL2 jak przedstawiono na fig. 5A. pAdD26S VpA(3) przeprowadza się w plazmid pAdD26SVpA(3)(d) przez delecję jednego z dwóch miejsc Pstl w pAdD26SVpA(3). Dokonuje się tego na drodze częściowego trawienia przy użyciu Pstl przy deficycie enzymu, tak, aby uzyskać subpopulację plazmidów liniowych, w których rozszczepione zostaje tylko jedno miejsce Pstl. Następnie działa się fragmentem Klenowa, liguje w celu przeprowadzenia ponownie w postać kolistą i dokonuje skriningu pod względem delecji miejsca Pstl zlokalizowanego przy końcu 3' w stosunku do sekwencji poliadenylacji SV40.

Trójczłonowy lider adenowirusa i wirusowe geny towarzyszące (VA) włączone są do pAdD26SVpA(3) (d) jak pokazano na fig. 5A. Najpierw pAdD26SVpA(3) (d) rozszczepia się PvuII w celu otwarcia liniowej cząsteczki w części 3' trzech elementów obejmujących trójczłonowy lider. Następnie, pJAW43 [Zain i wsp., Celi, 16, 851 (1979)], trawi się Xhol, poddaje działaniu fragmentu Klenowa, trawi PvuII, po czym wyodrębnia fragment o 140 parach zasad, zawierający drugą część trzeciego lidera, na drodze elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (6% w buforze Tris-boran, Maniatis i wsp., wyżej). Następnie fragment o 140 parach zasad liguje się do pAdD26SVpA(3) (d) trawionego PvuII. Produktu ligacji używa się do transformowania E. coli w celu nadania oporności na tetracyklinę i poddaje się następnie kolonie skriningowi sposobem Grunsteina-Hognessa z zastosowaniem sondy znakowanej ³²p hybrydyzującej z fragmentem o 140 parach zasad. Z pozytywnie hybrydyzujących kolonii otrzymuje się DNA w celu sprawdzenia, czy zrekonstruowane miejsce PvuII jest 5' czy 3' we włączonym DNA i 140 parach zasad, specyficznym dla drugiego i trzeciego z późnych liderów adenowirusa. Prawidłową orientacją dla miejsca PuvII jest strona 5' insertu o 140 parach zasad. Plazmid ten jest na fig. 5A oznaczony jako pTPL.

Fragment D AvaII z SV40 zawierający sekwencję wzmacniacza SV40 otrzymuje się przez trawienie DNA SV40 przy użyciu Avall, przeprowadzenie końców w tępe przy użyciu fragmentu

Klenowa poliemrazy I, ligowanie do fragmentów łączników Xhol, trawienie Xhol w celu otworzenia miejsca Xohl i wyodrębnienie czwartego największego (D) na drodze elektroforezy w żelu.

Fragment ten liguje się następnie do pTPL przeciętego Xhol, w wyniku czego otrzymuje się

157 926 11 plazmid pCVSVL2-TPL. Orientacja fragmentu D SV40 w pCVSVL2-TPL jest taka, że późny promotor SV40 ma tę samą orientację, co główny promotor późny adenowirusa.

W celu wprowadzenia wirusowych genów towarzyszących (VA) do pCVSVL2-TPL, najpierw konstruuje się plazmid pBR322, który zawiera fragment B Hindlll adenowirusa typu 2. DNA adenowirusa typu 2 trawi się Hindlll i wyodrębnia fragment D za pomocą elektroforezy w żelu. Fragment ten wprowadza się do pBR322 trawionego uprzednio Hindlll. Po transformacji E. coli do oporności na ampicylinę, rekombinanty poddaje się skriningowi pod względem insercji fragmentu B Hindlll i jego orientację określa się za pomocą trawienia enzymem restrykcyjnym. pBR322 - Ad Hindlll B zawiera fragment B Hindlll adenowirusa typu 2 w orientacji przedstawionej na fig. 5B.

Jak to objaśnia fig. 5B, geny VA dogodnie otrzymuje się z plazmidu pBR322 - Ad Hindll¹ B za pomocą trawienia Hpal, dodania łączników EcoRI i trawienia EcoRI, a następnie odzyskania fragmentu p 1,4 kilozasady. Fragment mający lepkie końce EcoRI liguje się następnie do miejsca EcoRI w PTL uprzednio trawionego EcoRI. Po transformacji E. coli HB101 i selekcji pod względem oporności na ampicylinę kolonie poddaje się skriningowi na drodze hybrydyzacji.na filtrze DNA specyficznym dla genów VA. Z pozytywnie hybrydyzujących klonów otrzymuje się DNA i charakteryzuje za pomocą trawienia endonukleazą restrykcyjną. Powstały plazmid oznaczony jest jako p91023.

Jak to objaśnia fig. 5C, dwa miejsca EcoRI w p91023 zostały usunięte za pomocą przecięcia (całkowicie), przy użyciu EcoRI, z utworzeniem dwóch fragmentów DNA, jedengo o około 7 kilozasadach, a drugiego około 1,3 kilozasady. Ten ostatni fragment zawiera geny VA. Końce obu . fragmentów uzupełnia się za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy I i następnie łączy się te dwa fragmenty. Plazmid p91023(A), zawierający geny VA i podobny do p91023, ale z usuniętymi dwoma miejscami EcoRI identyfikuje się za pomocą skriningu metodą Grunsteina-Hognessa z fragmentem VA i za pomocą konwencjonalnej analizy miejsc restrykcyjnych.

Pojedyncze miejsce Pstl w p91023(A) usuwa się i zastępuje miejscem EcoRI. p91023(A) przecina się (całkowicie) Pstl i poddaje działaniu fragmentu Klenowa polimerazy I w celu wytworzenia zrównanych końców. Łączniki EcoRI liguje się do miejsca Pstl przeprowadzonego w tępe w p91023(A). Liniowy p91023(A), z łącznikami EcoRI przyłączonymi przy miejscu Pstl przeprowadzonym w tępe, oddziela się od nie przyłączonych łączników i trawi całkowicie EcoRI, oraz ponownie liguje. Plazmid, p91023(B) jak przedstawiony na fig. 5C, odzyskuje się i identyfikuje jako wykazujący strukturę podobną do p91023(A), ale z miejscem EcoRI zamiast poprzedniego miejsca Pstl. Plazmid p91023(B) został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 39754.

Przykład VI. Klony cDNA (>-HPOFL6 i ^-HPOFL13, przykład III) wprowadza się do plazmidu p91023(B) z utworzeniem, odpowiednio, pPTFLó i pPTFL 13,8 pg każdego z oczyszczonych DNA używa się następnie do transfekcji 5· 106 komórek COS z zastosowaniem metody DEAE-dekstran (poniżej). Po upływie 12 godzin komórki przemywa się i poddaje działaniu 0,1 mM Chloroąuin w ciągu 2 godzin, po czym znów przemywa i przenosi na okres 24 godzin do 10 ml porcji podłoża zawierającego płodową surowicę cielęcą w stężeniu 10%. Podłoża zmienia się na 4 ml porcje bez surowicy i zbiera po upływie 48 godzin.

Poziom wytwarzanej immunologicznie aktywnej EPO oznacza się ilościowo w teście radioimmunologicznym, jak to opisali Sherwood i Goldwasser. Przeciwciało otrzymano od dr Judith Sherwood. Jodowany wskaźnik izotopowy otrzymuje się z homogenicznej EPO opisanej w przykładzie I. Czułość testu wynosi w przybliżeniu 1 mg/ml. Wyniki są przedstawione w tabeli 1.

Tabela 1

Wektor Poziom EPO uwalnianej do podłoży (ng/ml) pPTFL13 pPTFLó

330

157 926

PTFL13 został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville,

Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCc 399.

Przykład VII. cDN A EPO (A-HEPOFL13) wprowadza się do wektora p91023 (B), stosując do transfekcji komórek COS-1, i zbiera w sposób opisany w powyższej części opisu (przykład Vl), z tą różnicą, że pomija się działanie Chloroquin.

In vitro biologicznie aktywną EPO oznacza się z zastosowaniem albo testu tworzenia kolonii z komórkami wątroby płodu mysiego jako źródłem CFU-E, albo testu pobierania ³H-tymidyny, z zastosowaniem komórek śledziony myszy, której wstrzyknięto fenylohydrazynę. Czułość tych testów wynosi w przybliżeniu 25mjedn/ml. In vivo biologicznie aktywną EPO oznacza się z zastosowaniem albo testu: niedotleniona mysz, albo testu: głodzony szczur. Czułość tych testów wynosi w przybliżeniu lOOmjedn/mE Nie wykrywa się aktywności w obydwu tych testach przy zastosowaniu podłoża z warunków naśladujących właściwą hodowlę. Wyniki oznaczenia EPO wytworzonej w rezultacie ekspresji klonu HPOFL13 są przedstawione w poniższej tabeli 2, w której aktywność podana jest w jedn/ml, przy użyciu, jako standardu, handlowej, ilościowo oznaczonej EPO (Toyobo, Inc.).

Tabela 2

EPO wydzielona przez komórki COS transfekowane cDNA EPO typu I
Test	Aktywność
RIA	lO0njg/ml
CFU-E	2^0,5jedn/ml
3H-Thy	3,1^1,8jedn/ml
Niedotleniona mysz	1 jedn/ml
Głodzony szczur	2jedn/ml

Przykład VIII. Analiza EPO z komórek COS metodą elektroforezy w żelu SDS-poliakryloamidowym.

100 ng EPO wydzielonej do podłoża przez komórki COS transfekowane cDNA (ΛHEPOFL13) w wektorze 91023(B) (powyżej) poddaje się elektroforezie w 10% żelu SDSpoliakryloamidowy (Laemlli) i przenosi z zastosowaniem prądu elektrycznego na bibułę nitrocelulozową [Towbin i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,4350, (1979)]. Filtr sonduje się przy użyciu przeciwciała przeciw EPO, jak opisano w tabeli 1, przemywa i ponownie sonduje białkiem A gronkowców znakowanych 1²⁵J. Filtr poddaje się autoradiografii wciągu 2 dni. Natywną homogeniczną EPO, taką jak opisana w powyższym przykładzie I, poddaje się, albo przed jodowaniem (ścieżka B), albo po jodowaniu (ścieżka C), elektroforezie (patrz Fig. 6). Do zastosowanych ^marker^ów nak^żą: S-mebonina (znakowana^ atoumina surowsza (^{68000 d}alton^ów) ⁱ owoatou mina (45000 daltonów).

Przykład IX. Konstrukcja RK1-4.

Wyodrębnia się fragment BamHI-PvuII z plazmidu PSV2DHFR [Subramani i wsp., Mol. Celi. Biol., 1, 854-864 (1981)] zawierającego region wczesnego promotora SV40 sąsiadujący z genem mysiej reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), wzmacniacz SV40, intron małego antygenu t i sekwencję poliadenylacji SV40 (fragment A). Pozostałe fragmenty otrzymuje się z wektora p91023(A) (powyżej) jak następuje. p91023(A) trawi się Pstl w pojedynczym miejscu Pstl blisko promotora adenowirusowego w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową i albo liguje się z syntetycznymi konwertora mi Pstl do EcoRI, a następnie przeprowadza ponownie w postać kolistą [z tworzeniem miejsca PstO-EcoRI-Petl w pierwotnym miejscu Pstl, 91023(B')], albo poddaje działaniu dużego fragmentu polimerazy DNA I w celu zniszczenia miejsc Pstl, a następnie liguje się z syntetycznym łącznikiem EcoRI i przeprowadza ponownie w postać kolistą [z tworzeniem miejsca EcoRI w pierwotnym miejscu Pstl, 91023(B)]. Każdy z tych dwóch otrzymanych plazmidów, 91023(B) oraz 91023(B'), trawi się Xba i EcoRI w celu wytworzenia dwóch fragmentów (F i G). Za pomocą połączenia fragmentu F z p91023(B) z fragmentem G z p91023(B'), oraz fragmentu G z p91023(B) z fragmentem F z p91023(B') tworzy się dwa nowe plazmidy, które zawierają albo miejsce EcoRI-Pstl albo miejsce Pstl-EcoRI w pierwotnym miejscu Pstl. Plazmid zawierający

157 926 13 miejsce Pstl-EcoRI, w którym miejsce Pstl jest najbliżej głównego promotora późnego adenowirusa, został nazwany p91023(C).

Wektor p91023(C) trawi się Xhol (całkowicie) i powstający liniowy DNA z lepkimi końcami przeprowadza się w DNA z tępymi końcami za pomocą wypełniania w reakcji z dużym fragmentem polimerazy DNA I E. coli. Z tym fragmentem DNA liguje fragment Hindlll-EcoRI o 340 parach zasad, zawierający wzmacniacz SV40 otrzymany w sposób następujący.

Fragment HindIII-PvuII z SV40 zawierający początek replikacji SV40 i wzmacniacz wprowadza się do plazmidu c lac [Little i wsp., Mol. Biol. Med., 1,473-488 (1983)]. Wektor cląc otrzymuje się za pomocą trawienia DNA c lac przy użyciu BamHI, wypełnienia lepkich końców z zastosowaniem dużego fragmentu polumerazy DNA I i trawienia DNA za pomocą Hindlll. W powstającym plazmidzie (c SVHPlac) regeneruje się miejsce BamHI za pomocą ligowania z tępym końcem PuvII. Fragment EcoRI-HindIII otrzymuje się z c SVHPlac i liguje z fragmentem EcoRI-Hindlll PSVOd (Mellon i wsp., powyżej), który zawiera plazmidowy początek replikacji, po czym selekcjonuje się powstający plazmid pSVHPOd. Następnie otrzymuje się fragment EcoRI-Hindlll o 340 parach zasad z PSVHPOd, zawierający początek replikacji/wzmacniacz SV40, obydwa końce przeprowadza się w tępe za pomocą fragmentu polimerazy DNA I i liguje z wektorem p91023(c) powyżej opisanym, trawionym Xhol i z końcami przeprowadzonymi w tępe. Powstający plazmid (p91023(C)/Xho) tępe plus EcoRI(HindIII/ tępe początek SV40 plus wzmacniacz), w którym orientacja fragmentu Hindlll-EcoRI jest taka, że miejsce BamHI w tym fragmencie jest najbliższe genu VA, została nazwany pES105. Plazmid pESI trawi się BamHI i PvuII, a również samą PvuII i wyodrębnia się fragment BamHI-PvuII zawierający główny promotor późny adenowirusa (fragment B) i fragment PvuII zawierający plazmid, w którym znajduje się gen oporności (oporności na tetracyklinę) oraz inne sekwencje (fragment C). Fragmenty A, B i C liguje się i utworzony plazmid, pokazany na fig. 10, wyodrębnia się. Nazwany jest on RK1-4. Plazmid RK1-4 został zdeponowany w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, gdzie jest dostępny pod numerem rejestracyjnym ATCC 39940.

Przykład X. Ekspresja EPO w komórkach CHO - Metoda I.

20pg DNA z plazmidu pPTFL13 opisanego powyżej (przykład VI) trawi się endonukleazę restrykcyjną Ciał w celu przeprowadzenia go w postać liniową i liguje z 2//g DNA trawionego Ciał z plazmidu pAdD26SVp(A)l, który zawiera nienaruszony gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) poprzedzany przez główny promotor późny adenowirusa [Kaufman i Sharp, Mol. and Celi Biol., 2, 1304-1319 (1982)]. Tego ligowanego DNA używa się do transfekcji komórek CHO DHFR-ujemnych [DUKX-BI1, L. A. Chasin i G. Urlaub, PNAS, 77, 4216-4220 (1980)]. Po 2-dniowym wzroście selekcjonuje się komórki, do których został włączony chociaż jeden gen DHFR, w podłożach alfa bez nukleozydów, uzupełnionych dializowaną płodową surowicą bydlęcą w stężenieu 10%. Po wzorście w ciągu 2 tygodni w wybiórczych podłożach, kolonie pobiera się z oryginalnych płytek, łączy w grupy po 10-100 kolonii na pulę, ponownie przenosi na płytki i hoduje do zlewania się na podłożach alfa bez nukleozydów. Supernatanty podłoży z pul hodowanych przed selekcją z użyciem metotreksatu, bada się pod względem EPO przy wykorzystaniu RI A. Pule, które okazują się dodatnie pod względem wytwarzania EPO hoduje się w obecności 0,02 uM metotreksatu, subklonuje i ponownie bada. EPO Cla 4 4,02-7, pojednyczy subklon z puli EPO Cla 4 4,02 wydziela 460ng/ml EPO do podłoży zawierających 0,02 uM ΜΤΧ (Tabela 3). EPO ,Cla 4 4,02-7 jest linią komórkową z wyboru do wytwarzania EPO i została zdeponowana w Amercian Type Culture Collection (numer rejestracyjny ATCC CRL8695). Obecnie klon ten poddaje się stopniowej, selekcji we wzrastających stężeniach ΜΤΧ i prawdopodobnie otrzyma się komórki, które będą wytwarzać EPO nawet na wyższym poziomie. Odnośnie pul, które były negatywne w RIA, kolonie oporne na metotreksat otrzymane z hodowli duplikatowych, prowadzonych w obecności 0,02 uM metotreksatu, ponownie bada się w pulach pod względem EPO za pomocą RIA. Te hodowle, które nie są pozytywne, ponownie subklonuje się i dalej hoduje w ciągle wzrastających stężeniach metotreksatu.

Stopniowej selekcji z użyciem metotreksatu dokonuje się przez powtarzane cykle hodowania komórek w obecności wzrastających stężeń metotreksatu z selekcją komórek przeżywających. Przy każdym nawrocie EPO oznacza się w supernatancie hodowli za pomocą RIA i testów aktywności

157 926 biologicznej in vitro. Poziomy metotreksatu stosowane w każdym stopniowym wzmocnieniu wynoszą 0,02 uM, 0,1 uM i 0,5 uM. Jak pokazano w poniższej tabeli 3 po 1 nawrocie selekcji w 0,02 uM metotreksacie, do podłoży hodowlanych zostają uwolnione znaczne ilości EPO.

Tabela 3

Poziom EPO wydzielanej do podłoży

Próbka	Test	Uzysk w podłożu alfa	Uzysk w podłożu alfa z 0,02 uM metotreksatem
Pula 4 4	RIA	17 ng/ml	50 ng/ml
Pojednycza kolonia 4 4
Klon (0,02-7)	RIA	—	460 ng/ml

Przykład XI. Ekspresja EPO w komórkacj CHO - Metoda II.

DNA z klonu .A-HEPOFL13 trawi się EcoRI i subklonuje się mały fragment RI zawierający gen EPO do miejsca EcoRI w plazmidzie RK-1 (patrz przykład X). Następnie DNA (RKFL13) używa się bezpośrednio (bez trawienia) do transfekcji komórek CHO DHRF-negatywnych, a selekcję i amplifikację prowadzi się jak w przykładzie X.

DNA RKFL13 wprowadza się do komórek CHO za pomocą fuzji protoplastów i mikroiniekcji. Plazmid RFKL13 został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockwille, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 39989.

Tabela 4

Poziom EPO wydzielanej do podłoży

Próbka	Test	Uzysk w podłożu alfa	Uzysk w podłożu alfa z 0,02 uM metotreksatem
Pula kolonii A	RIA	3 ng/ml	42 ng/ml (pula) 150 ng/ml (klon)
	3H-Thy	—	l,5jedn/ml
Klon pojedynczej kolonii	RIA	—	90 ng/ml
(0.02C-Z)	3H-Thy	—	5,9jedn/ml
Pula po mikroiniekcji	RIA	60 ng/ml	160 ng/ml
(DEPO-1)	3H-Thy	l,8jedn/ml	—

Korzystny klon pojednyczej kolonii został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC CRL8695.

Przykład XII. Ekspresja genomowego klonu EPO w komórkach COS-1.

Wektorem używanym do ekspresji genomowego klonu EPO jest pSVOd (Mellon i wsp., powyżej). DNA z pSVOd trawi się całkowicie Hindlll i końce przeprowadza się w tępe za pomocą dużego fragmentu polimerazy DNA I. Genomowy klon EPO - HEPO3 trawi się całkowicie EcoRI i Hindlll, wyodrębnia się fragment o 4,0 kilozasady zawierający gen EPO i jego końce przeprowadza się w tępe sposobem opisanym w powyższej części opisu. Sekwencję nukleotydów tego fragmentu od miejsca Hindlll do regionu będącego już za sygnałem poliadenylacji pokazano na fig.4. Fragment genu EPO wprowadza się do fragmentu plazmidu pSVod i prawidłowo skonsturowane rekombinanty w obydwu orientacjach wyodrębnia się i weryfikuje. Plazmid CZ2-1 ma gen EPO w orientacji „a“ (to jest koniec 5'jest najbliższy początkowi replikacji SV40), a plazmid CZ1-3 jest w odwrotnej orientacji (orientacja ,,b“).

Plazmidami CZ1-3 i CZ1-2 transfekuje się komórki COS-1 jak opisano w przykładzie VII.

Podłoża zbiera się i bada pod względem immunologicznie reaktywnej EPO. Około 31 ng/ml EPO wykrywa się w supernatancie hodowli CZ2-1 i 16-31 ng/ml w supernatancie hodowli CZ1-3.

Genomowe klony HEPO1, HEPO2 i HEPO6 można wprowadzić do komórek COS w celu ekspresji w podobny sposób.

157 926

Plazmidy zawierające gen EPO w takiej orientacji, że koniec 5' genu EPO znajduje się najbliżej promotora polihedryny i końca 3 genu polihedryny, identyfikuje się za pomocą trawienia Bg 1II. Jeden z tych plazmidów, o orientacji powyżej opisanej został oznaczony pIVEPO.

Ekspresja EPO w komórkach owadzich. Duże ilości plazmidu pIVEPO wytwarza się za pomocą transformowania E. coli szczep JMlOl-tgl. Plazmidowy DNA wyodrębnia się metodą klarownych lizatów (Maniatis and Fritsch, Cold Spring Harber Manuał) i dalej oczyszcza za pomocą wirowania w CsCl. DNA wirusa polihedryny Autographa californica (AcHPV) szczep L-l otrzymuje się za pomocą ekstrakcji fenolem cząstek wirusa z następującym po tym oczyszczaniem wirusowego DNA przy użyciu CsCl.

Tymi dwoma DNA kotransfekuje się komórki Spedoptera frugiperda IPLE-SP-21 [Vaughn i wsp., In Vitro, tom B, str. 213-217 (1977)] stosując metodę transfekcji z użyciem fosforanu wapnia (Petter i Miller, 1977). Na każdą płytkę z komórkami, które mają być transfekowane , używa się 1 ug DNA AcNPV typu dzikiego i 10 ug pIVEPO. Płytki inkubuje się w temperaturze 27°C w ciągu 5 dni. Następnie zbiera się supernatanty i potwierdza ekspresję EPO na drodze badania jej obecności w supernatantach za pomocą testu radioimmunologicznego oraz z wykorzystaniem badania biologicznego in vitro.

Przykład XV. Oczyszczanie EPO.

Podłoża kondycjonowane z zastosowaniem kmórek COS (121), z EPO w stężeniu do 200 ug/litr, zatęża się do objętości 600 ml, stosując membrany do ultrafiltracji z przerywaniem przy masie cząsteczkowej 10000, takie jak Millipore Pellican wyposażone w membrany o powierzchni 46,45 dcm². Badania przeprowadza się z zastosowaniem RIA, jak to opisano w przykładzie VI. Płyn retencyjny po ultrafiltracji difiltruje się wobec 4 ml 10 mM fosforanu sodu buforowanego przy wartości pH 7,0. Zatężone i diafiltrowane podłoża kondycjonowane zawierają 2,5 mg EPO w 380 mg białka całkowitego. Roztwór EPO zatęża się dalej do 186 ml i wytrącone białka usuwa się za pomocą wirowania przy 110000 Xg w ciągu 30 minut.

Supernatant, który zawiera 2,0 mg EPO doprowadza się do pH 5 przy użyciu 50% kwasu octowego, miesza w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C i usuwa osad za pomocą wirowania przy 13000Xg w ciągu 30 minut.

Chromatografia na Carbonylomethyl Sepharose. 20 ml supernatantu po wirowaniu, zawierającego 2000 ug EPO (24 mg białka całkowitego) nanosi się na kolumnę z 20 ml CM-Sepharose, zrównoważoną 10 mM octanem sodu, przemytą 40 ml tego samego buforu. EPO, która związała się z CM-Sepharose, eluuje się 100 ml gradientu NaU(0-l)w 10 mM fosforanie sodu o pH 5,5. Frakcje zawierające EPO (w całości 50 ug w 2 mg białka całkowitego) łączy się i zatęża do 2 ml stosując membranę Amicon YM10 do ultrafiltracji.

HPLC z odwróconymi fazami. Zatężone frakcje z CM-Sepharose zawierające EPO poddaje się dalszemu oczyszczaniu za pomocą HPLC z odwróconymi fazami, stosując kolumnę Vydac C-4. EPO nanosi się na kolumnę zrównoważoną 10 ml rozpuszczalnika B (rozpuszczalnikiem A jest 0,1% wodny roztwór CF3COOH, rozpuszczalnikiem B jest 0,1% roztwór CF3COOH w CF3CN) przy szybkości przepływu 1 ml/min. Kolumnę przemywa się 10% B w ciągu 10 minut i eluuje, liniowym gradientem B, EPO (10- w ciągu 60 minut). Frakcje zawierające EPO łączy się (40 ug EPO w 120 ug białka całkowitego) i liofilizuje. Liofilizowaną EPO rekonstytuuje się w 0,1 M Tris-HCl o pH 7,5 zawierającym 0,15 M NaCl i poddaje powtórnej chromatografii HPLC z odwróconymi fazami. Frakcje zawierające EPO łączy się i analizuje za pomocą elektroforezy w 10% żelu SDS-poliakryloamidowym (U.K. Lameli, Naturę). Połączone frakcje EPO zawierają 15,5 ug EPO w 25 ug całkowitego białka.

157 926

Przykład XIII. Ekspresja w komórkach C127 i CHO. Konstrukcja pBPVEPO.

Plazmid zawierający sekwencję cDNA EPO pod transkrypcyjną kontrolą promotora mysiej metalotioneiny związany z całkowitym DNA bydlęcego papillomawirusa otrzymuje się w następujący sposób.

pEPO49f. Plazmid SP6/5 otrzymuje się z Promega Biotec. Plazmid ten trawi się całkowicie EcoRI i fragment EcoRI o 1340 parach zasad z >HEPOFL13 wprowadza się za pomocą ligazy DNA. Powstający plazmid, w którym koniec 5' genu EPO znajduje się najbliżej do promotora SP6 (jak stwierdzono za pomocą trawienia Bgll i · Hindlll) został nazwany pEPO49f. W tej orientacji, miejsce Bamll w poliłączniku PSP6/5 bezpośrednio przylega do końca 5' genu EPO.

pMMTneoABPV. Plazmid pdBPV-MMTneo (342-12) [Law i wsp., Mol. and Celi Biol., 3, 2110-2115 (1983)], przedstawiony na fig. 11 trawi się całkowicie BamHI w celu wytworzenia dwóch fragmentów: dużego fragmentu o długości ~8 kilozasad zawierającego genom BPV i mniejszego fragmentu o długości ~6,5 kilozasady, zawierającego początek replikacji pML2 i gen oporności na ampicylinę, promotor metalotioneiny, gen oporności na neomycynę i sygnał poliadenylacji SAV40. Trawiony DNA przeprowadza się w postać kolistą za pomocą ligazy DNA i plazmidy, które zawierają tylko fragment o 6,8 kilozasady identyfikuje się za pomocą trawienia endonukleazami restrykcyjnymi EcoRI i BamHI. Jeden z tych plazmidów nazwano pMNTneoABPV.

pEPO15a. ρΜΜΤηεοΔΒΡν trawi się całkowicie Bglll. pEPO49f trawi się całkowicie za pomocą BamHI i Bglll i wyodrębnia na drodze elektroforezy w żelu fragment o około 700 parach zasad, zawierający nienaruszony region kodujący EPO.

ρΜΜΤηεοΔΒΡν strawiony Bglll i fragment BamHI/Bg 1 Il EPO łączy się i powstające plazmidy zawierające cDNA EPO identyfikuje się za pomocą hybrydyzacji kolonii z sondą oligonukleotydową d/GGTCATCTGTCCCCTGTcC), która jest specyficzna dla genu EPO. Z plazmidów, które są pozytywne w analizie hybrydyzacji, jeden (pEPO15a) zawierający cDNA EPO w takiej orientacji, że koniec 5' cDNA EPO znajduje się najbliżej promotora metalotioneiny, identyfikuje się za pomocą trawienia przy użyciu EcoRI i KpnI.

pBPV-EPO. Plazmid pEPO15a trawi się całkowicie BamHI w celu przeprowadzenia go w postać liniową. Plazmid pdBPV-MMTneo(342-12) również trawi całkowicie BamHI z utworzeniem dwóch fragmentów o około 6,5 i 8 kilozasadach. Fragment o około 8 kilozasadach zawierających nienaruszony genom bydlęcego papillomawirusa, wyodrębnia się za pomocą elektroforezy w żelu. pEPO15a/BamHI i fragment BamHI o około 8 kilozasadach liguje się i identyfikuje się plazmid (pBPV-EPO), zawierający fragment BPV za pomocą hybrydyzacji kolonii z zastosowaniem sondy oligonukleotydowej d/P-CCACACCCGGTACACAOH), która jest specyficzna dla genomu BPV. Trawienie DNA pBPV-EPO przy użyciu Hindlll wskazuje, że kierunek transkrypcji w genomie BPV jest taki sam, jak kierunek transkrypcji promotora metalotioneiny (jak w pdBPVMMTneo/342-12), patrz fig. 11. Plazmid pdBPV-MMTneo/342-12) jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 37224.

Ekspresja. Do ekspresji EPO użyto następujących metod.

Metoda I. Otrzymuje się DNA pBPV-EPO i około 25 ug używa się do transfekcji 1 · 10⁶ komórek 0127 [Łowy i wsp., J. of Virol., 26, 291-298 (1978)] lub CHO, stosując standardową metodę wytrącania fosforanem wapnia [Grahm i wsp., Virology, 52,456-467 (1973)]. Po upływie 6 godzin od transfekcji usuwa się podłoża transfekycjne, komórki poddaje się wstrząsowi glicerynowemu, przemywa i dodaje świeże podłoże alfa zawierające płodową surowicę bydlęcą w stężeniu 10%. Po upływie 48 godzin komórki trypsynizuje się i rozdziela w stosunku 1:10 w podłożu DME zawierającym 500iig/ml G418 [Southern i wsp., Mol. Appl. Genet., 1. 327-341 (1982)]. Komórki inkubuje się w ciągu 2-3 tygodni. Następnie kolonie oporne na G418 izoluje się indywidualnie w dołkach do mikromiareczkowania i hoduje prawie do zlewania się w obecności G418. Następnie komórki przemywa się, dodaje świeżych podłoży zawierających płodową surowicę bydlęcą w stężeniu 10% i zbiera porcje podłoża po upływie 24 godzin. Bada się kondycjonowanie podłoża i wykazuje, że są pozytywne pod względem EPO za pomocą testu radioimmunologicznego i testu biologicznego in vitro.

Metoda II. Komórki C127 lub CHO kontransfekuje się przy użyciu 25ug pBPV-EPO i 2ug pSYTneo (Southern i wsp., powyżej) jak opisano w Metodzie I. Jest to w przybliżeniu 10-krotny

157 926 nadmiar molowy pBPV-EPO. Po transfekcji, sposób postępowania jest taki sam, jak opisano w Metodzie I.

Metoda III. Komórki C127 transfekuje się przy użyciu 30ug pBPV-EPO sposobem opisanym w powyższej Metodzie I. Po transfekcji i rozdzieleniu (1:10) podłoża wymienia się na świeże każdorazowo co 3 dni. Po upływie mniej więcej 2 tygodni uwidaczniają się ogniska komórek transformowanych BPV. Poszczególne ogniska pobiera się oddzielnie do 1 cm dołków w płytce do mikromiareczkowania, prowadzi hodowlę prawie do zlewania się pojednyczej warstwy i bada się kondycjonowanie podłoża pod względem aktywności EPO lub antygenowości.

Przykład XIV. Ekspersja w komórkach owadzich. Konstrukcja pIVEV EPOFL13.

Plazmidowy wektor pIVEV został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 39991. Wektor ten modyfikuje się w sposób następujący.

pIVEVNI. pIVEV trawi się EcoRI w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową, przeprowadza końce w tępe przy użyciu dużego fragmentu polimerazy DNA I i pojedynczy łącznik Notl

GGCGGCCGCC

CCGCCGGCGG wprowadza się na drodze ligowania tępych końców. Powstający plazmid został nazwany pIVEVNI.

pIVEVSI. pIVEV trawi się Smal w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową i pojedynczy łącznik Sfil.

GGGCCCCAGGGGCCC

CCCGGGGTCCCCGGG wprowadza się za pomocą ligowania tępych końców. Powstający plazmid został nazwany pIVEVSI.

pIVEVSIBgKp. Plazmid pIVEVSI trawi się KpnI w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową i z każdego końca usuwa się w przybliżeniu 0 do 100 par zasad za pomocą trawienia przy użyciu egzonukleazy Bal 31, dostosowanej do substratu dwuniciowego. Wszelkie powstające końce, które nie są zupełnie tępe, przeprowadza się w tępe stosowaniem dużego fragmentu polimerazy DNA I następnie wprowadza się poliłacznik

Xhol Xbal

BglUI EcoRI Cal KpnI AGATCTCGAGAATTCTAGATCGATGGTACC

TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG przez ligowanie tępych końców. Poliłącznik zostaje włączony w obydwu orientacjach. Plazmid, w którym poliłącznik zorientowany jest w ten sposób, że miejsce BgUI w poliłączniku jest najbliżej promotora genu polihedryny, nazwany jest pIVEVSIBgKp. Plazmid, w którym miejsce KpnI w poliłączniku jest najbliżej promotora genu polihedryny jest nazwany pIVEVSIKpBg. Ilości par zasad, które zostały usunięte między oryginalnym miejscem KpnI w pIVEVSI a promotorem polihedryny nie została określona. pIEIVSIBgKp został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 39988.

. pIVEVSIBgKpN. pIVEVNI trawi się całkowicie KpnI i Pstl z wytworzeniem dwóch fragmentów. Większy fragment, który zawiera plazmidowy początek replikacji i koniec 3' genu polihedryny, otrzymuje się za pomocą wyodrębnienia z żelu (fragment A). pIVEVSIBgKp trawi się całkowicie za pomocą Pstl i Kpn z utworzeniem dwóch fragmentów oraz fragmentu mniejszego, zawierającego promotor genu polihedryny i poliłącznik i który otrzymuje się za pomocą wyodrębnienia z żelu (fragment B). Fragmenty A i B łączy się następnie przy użyciu ligazy DNA z utworzeniem nowego plazmidu pIVEVSIBgKpNl, który zawiera gen polihedryny z częściową delecją i do którego włączono poliłącznik, przy czym zawiera on również miejsce Notl (zastępujące zniszczone miejsce EcoRI) oraz miejsce Sfil flankujące region genu polihedryny.

pIVEPO. pIVEVSIBgKpNI trawi się całkowicie EcoRI w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową i wprowadza się do niego fragment EcoRI o 1340 parach zasad z A-HEPOFL13.

157 926

157 926

FIG. 11

SV 40 początek/wz mac n iacz Ad MLP

CDNA

SV 40 Pol i A

INTRON

DHFR

DHFR

SV 40 PoliA geny VA Barn HI

FIG 10

SV 40 wczesny promotor

157 926 cccggagcc ggaccggggc caccgcgccc gccctgccccg acaccgcgcc ccctggacog ccgccctctc ctccaggccc

8tggggctgg ccctgcaccg ccgegctccc cgggacgaggg ceeccggtgc

-27
HET	CLY	VAL	HIS	CLU	CYS	PRO
ggtcacccgg cgcgccccag gccgctgagg gaccccggcc eggegeggag ATC	CCC	CTC	CAC	CAA JL	TCT	CCT

AU

TRP

LEU

TOP

LEU

LEU

LEU

SER

I.EU

LEU

SER

LEU

PRO

LEU

CLY

LEU

PRO

VAL

LEU

CLY

CCC

TCC

CTC

TCC

CTT

CTC

CTC

TCC

CTC

CTC

TCC

CTC

CCT

CTC

CCC

CTC

CCA

CTC

CTC

CCC

Ala

Pro

Pro

Arg

Lcu

Ilo

SH Cys

Aop

Scr

10 *r?

Val

Leu

Clu

Arg

Tyr

Lcu

Leu

Clu

Ala

20 Lys

CCC

CCA

CCA

CCC

CTC

ATC

TCT

CAC

ACC

CCA

CTC

CTC

CAC

ACC

TAC

CTC

TTC

CAC

CCC

AAC

a

Sil

JO

SH

a

40

Clu

Ala

Clu

Asn

Ile

Thr

_ Tłu

-£1y.

- Cys

Ala

Clu

llls

Cys

Scr

Leu

Asn

Clu

Asn

Ile

Thr

CAC

CCC

CAC

AAT

ATC

ACC

aacc

CCC

TCT

CCT

CAA

CAC

TCC

ACC

TTC

AAT

CAC

AAT

ATC

ACT

50

60

Val

Pro

Asp

Thr

Lys

Val

Asn

Phc

JŻ£

Ala

-Łis.

Arg

Mec

Clu

Val

Cly

Cln

Cln

Ala

CTC

CCA

CAC

ACC

AAA

CTT

AAT

TTC

TAT

CCC

TCC

AAC

ACC

ATC

GAC a Δ

CTC k

CCC

CAC

CAC

CCC

70

80

Val

Clu

Val

Trp

Gin

Cly

Lcu

Ala

Lcu

Lcu

Ser

Clu

Ala

Val

Leu

Arg

ciy

Cln

Ala

Lcu

CTA

CAA

CTC

TCC

CAC

ccc

crc

CCC

CTC

CTC

TCC

CAA

CCT

CTC

CTC

CCC

ccc

CAC

CCC

CTC

Λ

90

100

Lcu

Val

Λ?η

Scr

Ser

Clu

Pro

Trp

Glu

Pro

Leu

Clu

Leu

llls

Val

Asp

Lys

Ala

Val

Scr

TTC

CTC

AAC

TCT

TCC

CAC

CCC

TCC

CAC

CCC

CTC

CAC

CTC

CAT

CTC

CAT

AAA

ccc

CTC

ACT

110

120

Cly

Lcu

Arg

Ser

Lcu

Thr

Thr

Lcu

Lcu

Arg.

Ala

Lu u

cly

Ala

Cln

Lys

Clu

Ala

He

Scr

CCC

CTT

CCC

ACC

CTC

ACC

act

CTC

CTT

CCC

CCT

CTC

CCA

ccc

AAC

CAA

CCC

ATC

TCC

FIG. 9

Pro Pro Asp	Ala Ala Ser	Aln Ala Pro	130 Leu Arg Thr	Ile Thr Ala	Asp Thr Phc	140 ..Arg Lys
CCT CCA CAT	CCC CCC TCA	CCT CCT CCA	CTC CCA ACA	ATC ACT CCT	CAC ACT TTC	CCC AAA
LcU Pite Atr	Val Tyr Ser	Asn Phc Lcu	15U Arg \ Cly Lya	Leu Lys Leu	Tyr Thr Cly	160 Clu Ala
ctc nc cca	CTC TAC TCC	AAT TTC CTC	CCC CCA AAC	CTC AAC CTC	TAC ACA CCC	CAC CCC
SH Cys Arg Thr Tc(! ACC ACA	166 Cly Asp Arg CCC CAC ACA	TCA ccaggtg	tgtccacctg	ggcatacccs	ccacctcccc	caccaacatt
gcttgtgcca	caccctcccc	cgccactcct	gaaccccgtc	gaggggctct	cagctcagcg	ccagcctgtc
ccaeppacac	tccagtgcca	gcaacgncat	ctcaggggcc	agaggaactg	tccagagagc	aactctgaga
tctu.-igg.ccg	ccacagggcc	oocccguggg	cccagogcag	gaagcattca	gagagcAgct	tcaaactcag
Rgacagagcc	atgctgggaa	gacgcctgag	ctcactcggc	accctgcaaa	ateegatgee	aggacacgcc
-gsaggcea	cccacctgtt	ctcgcaccCA	ccatcaggga	caggatgacc	tggagaoctt	aggtggcaag
ctgtpactcc	tccaggtctc-	acgggcatgg	gcoctccctt	ggcggcaaga	gcccccttga	cscćggggtg
CCgggaacca	cgnagncagg	atggGggctg	gcctctggct	ctcotggggt	ccaagttttg	tgtattcttc
uucctcatcg	acaagaactg	auaccaccaa	aaaoaaoaaaoa

FIG. 9 /ciąg dalszy/'

157 926

CCC&gCCg ctcgctgcgc ccctggacag ggccacccgg tgcgccgcac ccgccctctc cgcgccccag

cgcgctgtcc	tcccggagcc	ggaccggggc
ctccaggccc	gtggggctgg	ccctgcaccg
gtcgctgagg	gaccecggec	aggcgcggag

caccgcgccc gctctgctccg acaccgcgcc

Val	Pro	Asp	Thr	Lya
CTC	CCA	CAC	ACC	AAA

Val	Clu	Val	Trp	Cln
CTA	CAA	CTC	TCC	CAC

ALA TRP LEU TRP LEU

CCC TCC CTC TCC CTT .

Ala Pro Pio Arg Leu

CCC CCA CCA CCC CTC *

Clu Ala Clu Aan Ile CAC CCC CAC AAT ATC

LEU CTC	LEU CTC	SER TCC	LEU CTC	LEU CTC	SER TCC	LEU CTC	PRO CCT
Ile	SH Cya	Asp	Ser	10 Arg	Va^	Leu	Clu
ATC	TCT	CAC	ACC	CCA	CTC	CTC	CAC
Thr	Thr	Cly	SH Cys	30 Ala	Clu	Hle	SH Cya
ACC	ACC	CCC	TCT	CCT	CAA	CAC	TCC
Val	Aso	Phe	Tyr	50 Ala	Trp	Lya	Arg
CTT	AAT	TTC	ΓΑΓ	CCC	TCC	AAC	ACC
Cly	Leu	Ala	Leu	70 Leu	Ser	Clu	Ala
CCC	CTC	CCC	CTC	CTC	TCC	CAA	CCT

ccgagctccc cgggatgaggg cccccggtge

HET	CLY	VAL	HIS	CLU	CYS	PRO
ATC	CCC	CTC	CAC	CAA	TCT	CCT
LEU	CLY	LEU	PRO	VAL	LEU	CLY
CTC	CCC	CTC	CCA	CTC	CTC	CCC
						20
Arg	Tyr	Leu	Leu	Clu	Ala	Lye
ACC	TAC	CTC	TTC	CAC	CCC	AAC
				a		40
Ser	Leu	Asn	Clu	Asn	Ile	Thr
ACC	TTC	AAT	CAC	AAT	ATC	ACT
						60
Het	Clu	Val	Cly	Cln	Cln	Ala
ATC	CAC	CTC	CCC	CAC	CAC	CCC
						BO
Val	Leu	Arg	ciy	Cln	Ala	Leu
CTC	CTC	CCC	CCC	CAC	CCC	CTC

FIG. 8

100

Leu TTC

Val CTC

Asn AAC

Ser TCT

Ser TCC

Cln CAC

Pro CCC

Trp TCC

Clu CAC

Pro CCC

Leu CTC

Cln CAC

Leu CTC

Hle CAT

Val CTC

Asp CAT

Lya AAA

Ala CCC

Val CTC

Ser ACT

Cly

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Thr

Leu

Leu

110 Arg

Ma

Leu

ciy

Ma

Cln

Lya

Clu

Ma

Ile

120 Ser

CCC

CTT

CCC

ACC

CTC

ACC

ACT

CTC

CTT

CCC

CCT

CTC

CCA

CCC

CAC

AAC

CAA

CCC

ATC

TCC

Pro

Pro

Asp

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

Pro

130 Leu

Arg

Thr

Ile

Thr

Ma

Asp

Thr

Phe

Arg

140 Lye

CCT

CCA

CAT

CCC

CCC

TCA

CCC

CCT

CCA

CTC

CCA

ACA

ATC

ACT

CCT

CAC

ACT

TTC

CCC

AAA

Leu

Phe

Arg

Val

Tyr

Sor

Asn

Phe

Leu

ISO Arg

ciy

Lya

Leu

Lya

Leu

Tyr

Thr

Cly

Clu

CTC

TTC

CCA

CTC

TAC

TCC

AAT

TTC

CTC

CCC

CCa

AAC

CTC

AAC

CTC

TAC

ACA

CCC

CAC

FIG. 8 /ciąg dałaay/

	gacaggaag	gacgagctgj	t gacagagacg	tggggatgaa
ggaogctgcc ctcccacagc cacccctccc	cctccccgcc cgaccctcag	LU cctggccatc tgtcctagAA	CYS TCT	PRO CCT
ALA TRP LEU TRP LEU LEU LEU SER	LEU LEU SER LEU PRO	LEU CLY	LEU PRO VAL	LEU	CLY
'ccc TGC CTC TCC CTT CTC CTC TCC	CTC CTC TCC CTC CCT	CTC CCC	CTC CCA CTC	CTC	CCC
1 SU Ala Pro Pro Arg Lcu Ile Cy9 Asp	10 Ser Arg Val ' Leu Clu	Arg Tyr	Leu Leu Clu	20 Ala Lys
CCC CCA CCA CCC CTC ATC TCT CAC	ACC CCA CTC CTC CAC	ACC TAC	CTC TTC CAC	CCC	AAC
P Clu Ala Clu Asn Ile Tlir Thr Cly	SH 30 Sil Cya Ala Clu llle Cys	Ser Leu	* Aan Clu Asn	40 Ile Thr
CAC CCC CAC AAT ATC ACC ACC CCC	TCT CCT CAA CAC TCC	ACC TTC	AAT CAC AAT	ATC	ACT
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe	50 Tyr Ala Trp Lys Arg	Het Clu	Val Cly Cln	60 Cln Ala
CTC CCA CAC ACC AAA CTT AAT TTC	TAT CCC TCC AAC ACC	ATC CAC	CTC CCC CAC	CAC	CCC
Val Clu Val Trp Cln Cly Leu Ala	70 Leu Leu Ser Clu Ala	Val Leu	Arg Cly Cln	80 Ala Leu
CTA CAA CTC TCC CAC CCC CTC CCC	CTC CTC TCC CAA CCT	CTC CTC	CCC CCC CAC	CCC	CTC
a Leu Val Asn Ser Ser Cln Pro Trp	90 Clu Pro Lcu Cln Leu	His Val	Asp Lys Ala	100 Val Ser
TTC CTC AAC TCT TCC CAC CCC TCC	CAC CCC CTC CAC CTC	CAT CTC	CAT AAA CCC	CTC	ACT
Cly Leu Arg Ser Lcu Thr Thr Lcu	110 Leu Arg Ala Leu Cly	Ala Cln	Lys Clu Ala	120 Ile Ser
CCC CTT CCC ACC CTC ACC ACT CTC	CTT CCC CCT CTC CCA	CCC CAC	AAC CAA CCC	ATC	TCC
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala	130 Pro Lcu Arg Tlir Ile	Thr Ala	Asp Thr Phe	140 Arg Lys
CCT CCA CAT CCC CCC TCA CCT CCT	CCA CTC CCA ACA ATC	ACT CCT	CAC ACT TTC	CCC	AAA

FIG. 7

150 160

Leu Phe Arg CTC TTC CCA	Vel Tyr Ser CTC TAC TCC	Aan Phe Leu AAT TTC CTC	Arg Cly Lys CCC CCA AAC	Leu Lys Leu CTC AAC CTC	Tyr Thr Cly TAC ACA CCC	Clu Ala CAC CCC
SU Cys Arg Thr TGC ACC ACA	166 Cly Asp Arg CCC CAC ACA	TCA ccaggtg	tgtccacctg	ggcatatcca	ccacccccct	ceccaacact
gcttgtgcca	caccccccce	cgccactcct	gaaccccgtc	gaggggctct	eagctcagcg	ccagcctgtc
ccatggacac	tccagtgeca	geaatgacat	ctcaggggcc	agaggaactg	tccagagagc	aactctgaga
tctaaggatg	tcacagggcc	aacttgaggg	cccagageag	gaagcattca	gagageaget	ttuactcag
ggacagagcc	atgctgggaa	gacgcctgag	cccactcggc	acectgcaaa	atttgatgee	aggacacgct
ctggaggcga	tctacctgtt	ttcgcaccta	ccatcaggga	caggatgacc	tggagaactt	aggtggcaag
ctgtgaetcc	tccaggtctc	acgggcatgg	gcactccctt	ggtggeaaga	gcccccttga	caccggggtg
gtgggaacca	tgaagacagg	atgggggctg	gcctctggct	ctcatggggt	cc&igttttg	tgtattcttc
aacctcettg	acaagaactg	aaaccaccaa	aaaaaaaaaaaa

FIG. Ί /ciąg dalezy/

68000d

45000d

p 91023

I Trawienie EcoRI /fragment Kle nowa/ I Ugacja p 91^^:3(A)

Pstl/fragment Klenowa/EcoRl łącznik trawienie EcoRI/ligacja

Xhol ___Geny VA ^XhoIv©^^SS^/7° . PwiII// wzmacniacz

UO^zlorow^Gtow/ny ^pO2n^{y p}fomotor ' a^denowirusa \ ³’miejsce składania ^TETR -p 91023IB)

7.9 KB

OHFR poli A

Se 40

Hind III •Barn HI

FIG. 5C pCVSVL2-TPL

pBR322-Ad HindDIB S.trawienie Hpal ' ².EcoRI tącznik/EcoRI trawienie/ 3.odzyskanie fragmentu 1,4 KB ligacja

-BamHI ^XhQl EcoRI

PvuII trójcztonowy..

lider JF Gtćrwny późny promotor

FIG.5B’

FIG. 5B

Xhol

EcoRI

Hind III

Bam Η I

Sal I ° (j. f l.częscicwc trawienie

B³™ i 2 fragment Ktenowa

E^c°RI l³-^ligacJ^a

Hind III Bam HI Sali

Xhol

Ρνυ Π

Bam Η I FIG. 5A ggtttg(^aBt6B^a8ttEe8^aae^cta8^acact8^cccCB^<:tacacaagaatae8tcteg^(^gccccaaaccatacct ggaaactaggcaaggagcaaagccagcagatcctacgcctgtggccagggccagagccIttMgggacccttgact . a · · · · ccccgggctgtgtgcat t CcagACaCCCTCT«rrCAACACTGCACCTTCAATCACAATATCACTCTCCCAGACAC ThrClyCyaAlaCluHieCyeSarIaiuAanC].uAaniaeThraal.ProAapTh α^AACπΛTTATCTATCCTτCCAAGACAATC^AACgt8agttccCtCCttt^ct^ttet^ttcctttctt^ttggagaat rLyaraAanlhaTyrAlaTrpLy6ArgMetClu ctcattCgcgcgccC^aaι:tCC^agct^aagajglgaaaatgatcgacga^aa^g8gta^aaa^cgg^c8C^c8caga^gaCga^cg gt_eegtg^ccc^cca^gaggctcacgcctataatcccaggctgaga^tccccga^g^tgg^g>^aaattgc^ttg^agccc^tc,^g a^ttcagaccaaccta^cagcatagtgaggtcccccatctctacaaacatttaaaaaMttagtcaggtga^ tg^gtgcatg^gtg^gtagtccca^gatet ttggagggcgagggciŁggaggatcgcttgagcccaggaaC^gaMC^ cagtgagctgtgatcacaccactgcactccagcctcegtgacagagtgaggccctgtctcaaaaaagaaaagaaa aaagaaaaaoaatgcaggccgtctggactacatccatt^attcattcactcacccacteactcattcattcattca ttcattcaaaacgtcctact:gtataccŁtctgtCtc¢Ccagccc^gct^gcctggggct^gcC^gag^gg^gcgggαggga gaccccgaaatccctcagctgactcccac^agtc¢actcaccτta^gCτCCCCCACC/C:CCCCTACAΛTCCTC<C:AC r^lClyClnGInALamCluralTrpCln pCCCTCCCCCTCCrCTCCGi^(^<^CTCCrCCCG^<^{C^C^^cCCCrTiTł^^^^C^(^<^i^Ak£C:CCT^CACCCC

ClyLauAlaLeuIauSarCluAlayal lAańSerSarClnProTrpClulro

CTCCACCTCCATCTCCATAAACCC^TCA^C^^^CC^J^t^t^tC^i^j^i^C^j^i^^C^^CTrCCCGICrCr^^CACCCCAC LauAlπLautlHaralT&pLysAlarβlSarClyLeuTrcSerLauChrThΓLauLeuAr^gAlaLeuClyAlaCln

CtcagtaccagcggacacttctccttgccctttcCgtaagaaggcgagaagggtctt^gctaaggagtacaggaac tgtcc^gtatεccttcccttcctgta^gcactcccacc^acccccT^gttttcccctcτ^grτCTITTTCACAT'CCCCX . LyaClyAlalleSerP ^TCCACATCCCCCCTCACCTGCTCCCLCrCCCCACAATTACTTCCCCCACTTTCCCCAAAATCTTCCCACrCTACT ^roAspAlaAlaSerAlaAlaProLauA^ThrllehhrAlaAapThrfheArgLysI.eiilhaAi^yalT^S CCTTCTΓCCTCCGCAGTTACTCTCATCCGTTCTCATTGGTCCCATTCΛCCACACCCCΛCACATCTAAΛCCTACCT arAanlhaLeuArgClyLy8LeuLyβl.ΛaUcrrT^ΓClyCluA^aTy8AΓgThιrTlyTβpTrg * ^{TAATACACCCTCACCCTTTTTTTTT}TCTTTTT^^CTTCTCTCCÓATCTCCCCCAAACAACTACATTAATCACCC

CCGACGGCACACATTCCCATCCCCTGCCCCCAATTTGCTATACCTAACACAATTTTCATTTTATCTAGGTTATGA ····..·

CCAACTCTCCACACACCMCTCTGACATCTAACCATCTCACACCCCCiAMCrrCACCCCCCAGACCACCAAGCATT

ATATCAAC^CCCτCTTTTCCTCACACTGTC(:ATT^T^:AGCTTA;TTTTCTCGT.TGTT(TTTTACCCTTAT'CAATTTTTC

TTTCGATTATACCttmTTATGCCTTτCACτTCTCCCTTATTCACTT:ICT.CTGA.ATGCA.CTTACCAGTGTTT ·····» _a

TCTATCGCCTTACCGCGTCCCCCCCTCCCTCCTTAGCCATACCTTA'CCCtCCCTCCCACAAATCCTTATCCAATTT

AACTATCTCCACΛΛC(TTCAr.CACTTTATCTCACATCCC(TXCACTT'CCT(TCΪCACCΪCTCTATΠCCC(T^lΛTTTC ·····««

CAAACACCAπCTCTACTT<TΓ¢TATCCTATaaτrτgactctCggcttcccCgCtCtct^gcggaactcciutf tccc ctggctctgtcccactccgggcagca

1500

1650

1800

1950

2100

2250

2400

2550

2700

2850

3000

3150

3300

3400

FIG. 4C agctl^^tgjgi^ct t<^<^i^j^;^cccagctactt tgcggaacc<^i^(^<^a^^cccaggcaCctcl^8aBl^ctcc(^<^<^^e^aBacc gggatgccccccaggaggtgtccgcgagcccagcccttcccagotflgcagctccgccagtcccnncggtgcgcaa ISO ccggctgcactcccctcccgcgacccagggcccgggagcagcccccatgacccacacgcacgCccgcageagccc • · · · · · · agCcagcaacccaccccaaacaaacccgtcaCgecccCgcacCgcacccgggcggcccctacccctgcacaccca 300 taacg^acacagcaecacccccacccccacccgcg^aagcaaacatgeagagaaaagccecgacccccggaaaca gcagcaacgaaccCaaaccacCCCCCCCCCTC(CTCCCCTCCCα;:CCΛCCGCCCTCTCCTCCCCCACCCαACCC 450 CCCCCACCCCCCCCCCTCTCCTCCCACACCCCGCCCCCTCCACAGCCCCCCTCTCCTCCACCCCCCTCCCCCTCG CCCTCCACCCCCGACCTTCCCCCCATCACCCaCCCCacrCTCCTCACCCCCCCCCCCCCACCTCCCTCACCCACC 600 ccc<cxACCxccccACATCCGccτGCΛCCctgogtacacgcgacacggacgctcccgcccgacaaacccca:tgct . MetGlyVelllioG . .

t^cagagggg^aatt^acc^gcaacggctattggaaacca8^gεg^gctCC^gttcaagC^aaaCC^agacttgtaaaIU^{aeca 7S0} cggaacggggcacccccCgCCgcagcctcaaaacgccaacaggggcCtggggggaCccCtggccaCggcaaaaaa ctcacatgCgaaggccacacagcttgcgggttgacg^ggaaggaacCCtggggcgCtcCcaεgtgccagtggβcac 900 gaaCctcaCaagctgatαacct:ggcacatggagacaccacI:talCcCaaaagaggggaacaaecag(:cacaacagc attgαagtttgaaccgagaactggatgctg^gtαgccCgggggtg^gc^gt^gt^gcac^acgcaacc^aggattgaatcag 1050 CgccagggngcccacaacaacaCgcatgcaCggtCggggacaggaacgaagaccCgccgcacagacgtcgccatg aaggaagcagtccttccaaacccaccctεatccatcccccaatgaatcacagcctcgctatccgttctagAATCr 1200 ggtcggtcggtgtgg.gttgtggtgtccctggtctcggtcgctctcgccgtgggactcctgcggggggcaggAc£ć ProAlarrpI.currpLcul.cuLcuSerLeuLcuSerlj5uProLL!uCGytL>uProVaai.euClyAlaProProArg CrCΛrCrCrCACΛCCCCACTCCTCCACΛACCrCCTrCrCCΛCCCCAACCACCCCCACJCTATCACCctggaccca 1350 LeuIleCy8AspScΓArcValLeuCluΛrgTyΓIIBuLLaUGuUlBg.LsCluAlaCGuJAaIlerhr c^tccccacancattccacacaacccacgatcaggccttcagggaoctaaccaaaga^aaacganccŁcgcactt

FIG. 4C

FIG.4A

FIG 4 B zasad

27aa

Lider

166aa

Produkt dojrzaty 400 600 800 1000

3'

-AAAAAAA

I I

1200 1400

Par zasad

FIG. 3C

5'

200

cccggagcc	ggaccggggc	caccgcgccc	gccctgccccg	ocaccgcgcc
ccctggaceg ccgccccccc ctccaggccc gtggggctgg	ccccgcaccg	ccgagcttcc	cgggatgaggg	cccccggcgc

-27 HET CLY

VAL

HIS

CLU

CYS

PRO

ggccacccgg cgegccccag

gccgccgagg

gaccccggcc

aggcgcggag

AtC

CCC

CTC

CAC

CAA ▲

ICI

CCT

ALA

TRP LEU

TRP

LEU

LEU

LEU

SEB

LEU

LEU

SEB

LEU

PRO

LEU

CLY

LEU

PRO

VAL

LEU

CLY

ccc

icc ctc

icc

at

ctc

cre

tcc

CTC

CTC

TCC

CTC

CCT

CTC

CCC

CTC

CCA

CTĆ

CTC

CCC

SH 10 20

Ala

- Pro.

Ara

Leu

Ile

Cys

Asp

Ser

Arg

Val

Leu

Clu

Arg

Tyr

Leu

Leu

Clu

Ala

Lya

CCC

CCA

CCA

CCC

CTC

ATC

TCT

CAC

AGC

CCA

CTC

CTC

CAC

ACC

TAC

CTC

TTC

CAC

CCC

AAC

a

SU

30

SH

a

40

Clu

Ala

Cltf

„Ast.

Jle

Thr

T hiL Clx.

Cya

Ale

Clu

Hla

Cya

Ser

Leu

Asn

Clu

Aan

Ila

Thr

CAC

CCC

CAC

AAT

ATC

ACC. ACC

CCC

TCT

CCT

CAA

CAC

TCC

ACC

TTC

AAT

CAC

AAT

ATC

ACT

50

60

Val

Pro

Aep

Thr

Lya

VaV.

Asn

Phe

.Tyr

Ala

JĘEŁ.

Lya

Arg

Het

Clu

Val

Cly

Cln

Cln

Ala

CIC

CCA

CAC

ACC

AAA

CTT

AAT

TTC

TAI

CCC

TCC

AAC

ACC

ATC

CAC^

CTC

CCC

CAC

CAC

CCC

70

60

Val

Clu

Val

Trp

Cln

Cly

Leu

Ala

Leu

Leu

Ser

Clu

Ala

Val

Leu

Arg

-£łX.

-Cln

Ala.

Leu.

CIA

CAA

CTC

TCC

CAC

CCC

CTC

CCC

CTC

ao

TCC

CAA

CCT

CCC

CTC

CCC

CCC

CAC

CCC

CTC

a

90

100

Leu

V«1

Λ5ί>_

•SfJL

SPL

Clq

Pro

Trp.

jEsa

Lsu

Cln

Leu

oo

Aga,

LtŁ

Ala

Val

Sar

TTC

CTC

AAC

TCT

TCC

CAC

CCC

TCC

CAC

ccc

CTC

CAC

CTC

CAT

CTC

CAT

AAA

CCC

CTC

ACT

110

120

Cly

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Thr

Leu

Leu

ΛγΚ

Ala

Leu

Cly

Ala

Cln

Lya

Clu

Ala

Ile

Sar

CCC

CTT

CCC

ACC

CTC

ACC

ACT

CTC

CTT

CCC

CCT

CTC

CCA

CCC

CAT.

AAC

CAA

CCC

ATC

TCC

FIG

. 30

A

Pro Pro Aso	Ala Ala Ser	Ala Ala Pro	130 Leu Arg Thr	Ile Thr Ala	Aap Thr Phe CAC ACT TTC	140 Ar-g Lya CCC AAA
CCT CCA CAT	CCC CCC TCA	CCT CCT CCA	CTC CCA ACA	ATC ACT CCT
Leu Phc Ara	Val Tyr Ser	Asn Phe Leu	150 - Arg Cly Lya	Leu Lya Leu	Tyr Thr Cly	160 Clu Ala
CTC TTC CCA	CTC TAC TCC	AAT TTC CTC	CCC CCA AAC	CTC AAC CTC	TAC ACA CCC	CAC CCC
SH Cvs Ara Thr TCC ACC ACA	166 Cly Asp Arg CCC CAC ACA	TCA cceggtg	cgtccacctg	ggcacaccca	ccacctcccc	caccaecacc
gcttgcgcca	ceccctcccc	cgccaccccc	gaaccccgtc	gaggggcccc	cagcccagcg	ccagcctgcc
ccacggacac	tccagtgcca	gceacgacat	ctceggggcc	egaggaactg	tccagagagc	eactctgaga
cctaaggatg	tcacagggcc	aacttgaggg	cccagagcag	gaagcactca	gagogeaget	ttaaactcag
ggacagagcc	atgctgggaa	gacgcctgag	ctcactcggc	eccctgcaaa	atttgatgee	aggacacgct
ttggaggcga	ttcacctgtt	tccgcaccta	ccatcaggga	caggacgacc	tggagaacct	aggcggcaag
ctgtgacctc	cccaggtccc	acgggcatgg	gcactcccct	ggtggcaaga	gcccccctga	caccggggtg
gcgggaacca	tgaagacagg	atgggggctg	gcctctggct	cccacggggt	ccaagtcttg	tgtattcttc
aacctcactg	ocaagaactg	aoaccaccaa	aaaaaaaaaaaa

FIG. 3B /ciąg dalezy/ ο

cc

α.

>C9

ΙΑ

O > w

SH s<

JS

O ►* O V

W ca « ·* W ° δ *=· >» *4 «Π ° Z? ** <

co >· o

co

X o

cc £X.

>» o

0} ►

U to b

<

O uł <

Q tfl <

J3 o

KlCMŁU I X b

O co o

oc

a.

to to b

<

>»

«X

FIG. 3A /Ciąg dalszy/

Wątroba osoby dorostej Wątroba ptodowa

-o

FIG.2 gatcctacgcctgtggccagggccagagccttcagggacccttgactccccgggctgtgtgcatttcag a

ACG

GGC

TGT

GCT

GAA

CAC

TGC

AGC

TTG

AAT

GAG

AAT

ATC

Thr

Gly

Cys

Ala

Glu

His

Cys

Ser

Łeu

Asn

Glu

Asn

Ile

ACT

GTC

CCA

GAC

ACC

ΛΑΑ

GTT

AAT

TTC

TAT

GCC

TGG

AAG

Thr

Vał

Pro

Asp

Thr

Lys

Val

Asn

Phe

Tyr

Ala

Trp

Lys

AGG ATG GAGgtgagttcctttttttttttttttcctttcttttggagaatctcatttgcgagcctg Arg MET Glu d attttggatgaaagggagaatgatc fig. i

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 5000 zł.

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania erytropoetyny, znamienny tym, że hoduje się w odpowiednim podłożu komórki gospodarza zawierające sekwencję DNA zasadniczo taką, jak pokazana na fig. 3B, funkcyjnie połączoną z sekwencją kontroli ekspresji i wyodrębnia się tak wytworzoną erytropoetynę z komórek i podłoża.
2. 2. Sposób wytwarzania erytropoetyny, znamienny tym, że hoduje się w odpowiednim podłożu eukariotyczne komórki gospodarza zawierające sekwencję DNA zasadniczo taką, jak pokazana na fig. 4C, funkcyjnie połączoną z sekwencją kontroli ekspresji i wyodrębnia się tak wytworzoną erytropoetynę z komórek i podłoża.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórki gospodarza stosuje się komórki ssaków.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako komórki ssaków stosuje się komórki 3T3.
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako komórki ssaków stosuje się komórki jajnika chomika chińskiego (CHO).
6. 6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wspomniana sekwencja DNA zawarta jest w wektorze zawierającym także DNA bydlęcego papillomawirusa.
7. 7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako komórki gospodarza stosuje się komórki ssaków.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako komórki ssaków stosuje się komórki 3T3.
9. 9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako komórki ssaków stosuje się komórki jajnika chomika chińskiego (CHO).
10. 10. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wspomniana sekwencja DNA zawarta jest w wektorze zawierającym także DNA bydlęcego papillomawirusa.