NO304469B1 - Genomisk DNA-molekyl, mikroorganisme inneholdende molekylet samt fremgangsmÕte for fremstilling av human erytropoietin - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et genomisk DNA-molekyl som koder humanerytropoietin.

Oppfinnelsen angår videre en mikroorganisme eller en cellelinje som inneholder dette DNA-molekyl og oppfinnelsen angår til slutt en fremgangsmåte for fremstilling av human-erytropoietin.

Erytropoietin, herefter kalt EPO, er et sirkulerende glykoprotein som stimulerer erytrocytdannelsen i høyere organismer, se Carnot et al, "Compt. Rend.", 143:384 (1906). Som sådant kalles EPO noen ganger en erytropoiese-stimu-lerende faktor.

Levetiden til humanerytrocyter er ca. 120 dager. Således ødelegges ca. 1/120 av de totale erytrocyter daglig i det reticulo-endoteliale system. Samtidig blir et relativt konstant antall erytrocyter fremstilt daglig for å opprett-holde nivået av erytrocyter til enhver tid (Guyton, "Textbook of Medical Physiology", s 56-60, W.B- Saunders Co., Philadelpha (1976).

Erytrocyter fremstilles ved maturering og differensiering av erytroblasme i benmargen og EPO er en faktor som virker på mindre differensierte celler og induserer deres differensiering til erytrocyter (Guyton, nedenfor).

EPO er et lovende terapeutisk middel for klinisk behandling

av anemi eller spesielt renal anemi. Uheldigvis er bruken av EPO ennu ikke vanlig i praktisk terapi på grunn av den lave tilgjengelighet.

Mens således EPO er et ønskelig terapeutisk middel er konvensjonelle isolasjons- og renseteknikker, benyttet med naturlige tilførselskilder, utilstrekkelige for massefremstilling av denne forbindelse.

Sugimoto et al. beskriver i US 4.377.513 en metode for massefremstilling av EPO som omfatter in vivo multiplisering av humanlymfoblastoidceller inkludert Namalwa, BALL-1, NALL-1 TALL-1 og JBL.

Den angitte produksjon av andre EPO ved bruk av genetiske konstruksjonsteknikker har opptrådt i litteraturen. Imidler-tid har det ennu ikke vært publisert noen brukbar beskrivelse eller en kjemisk art av produktet. Tvert imot tilveiebringer foreliggende søknad en brukbar beskrivelse for massefremstilling av proteiner som oppviser de biologiske egenskaper til proteiner som viser de biologiske egenskaper til human EPO. Det er også mulig ved slike teknikker å fremstille proteiner som kjemisk kan være forskjellige fra autentiske human EPO men allikevel viser tilsvarende (og i enkelte tilfeller forbedrede) egenskaper. For hensiktsmessighetens skyld vil alle slike proteiner som viser de biologiske egenskaper til human EPO herefter kalles EPO uansett om de er kjemisk identisk eller ikke.

Som nevnt innledningsvis er foreliggende oppfinnelse rettet mot et genomisk DNA-molekyl som koder humanerytropoietin og molekylet karakteriseres ved at det omfatter nukleotid-sekvensen som angitt i tabell 4 fra ATG-sekvensen som koder den initiale Met gjennom AGA som koder den terminale Arg.

I en foretrukken utførelsesform omfatter det nukleotid-sekvensen som angitt i tabell 3 nukleotid-sekvensen som angitt i tabell 3 fra GCC-kodonet som koder en Ala gjennom AGA-kodonet som koder 166 Arg.

Som nevnt ovenfor angår oppfinnelsen også en mikroorganisme eller en cellelinje som karakteriseres ved at den inneholder DNA-molekylet som beskrevet ovenfor, operativt bundet til en ekspresjonskontroll-sekvens i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA, hvorpå DNA-molekylet uttrykkes i nevnte mikroorganisme eller cellelinje.

Oppfinnelsen angår, som nevnt innledningsvis, også en fremgangsmåte for fremstilling av human erytropoietin og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at den omfatter dyrking, i et egnet medium, av en mammal vertscelle inneholdende en DNA-sekvens som beskrevet ovenfor, operativt forbundet til en ekspresjonskontroll-sekvens i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA-sekvens, og separering av det således fremstilte erytropoietin fra cellene og medium.

Som beskrevet i større detalj nedenfor, ble EPO oppnådd i partielt renset form og ble ytterligere renset til homogenitet og brutt ned med trypsin for å danne spesifikke fragmenter. Disse fragmenter ble renset og sekvensert. EPO-oligo-nukleotider ble konstruert basert på disse sekvenser og syntetisert. Disse oligoer ble benyttet for å søke et humangenomforråd hvorfra det ble isolert et EPO-gen.

Dette EPO-gen ble verifisert på basis av sin DNA-sekvens som passet til mange av de sekvenserte tryptiske proteinfrag-menter. Et stykke av den genomiske klon ble så benyttet for ved hybridisering å demonstrere at EPO mRNA kunne detekteres i human føtal ( 20 uker gammel) mRNA. Et humant føtal lever cDNA-forråd ble preparert og bedømt. Tre EPO cDNA-kloner ble oppnådd (efter søking over mer enn 750.000 rekombinanter). To av disse kloner ble bestemt å være full-lengde, bedømt ved totale kodingssekvens og vesentlig 5'- og 3'- ikke-translaterte sekvenser. Disse cDNAer var eksprimert i både SV-40 virus transformerte apeceller (COS-1 cellelinje; Gluzman, "Cell" 23:175-182 (1981)) og kinesiske hamster ovarieceller (CHO cellelinjen; Urlaub, G. og Chasin, L.A. "Proe. Nati. Acad. Sei" USA 77:4216-4280 (1980)). EPO fremstilt fra COS celler er biologisk aktive EPO in vitro og in vivo. EPO fremstilt fra CHO celler er også biologisk aktive in vitro og in vivo.

EPO cDNA-klonen har en interessant åpen leseramme på 14-15 aminosyrer (aa) med initiator- og terminator fra 20 til 30 nukleotider (nt) oppstrøms kodingsområdet. En representativ prøve av E. coli transfektert med det klonede EPO-gen er deponert ved ATCC, Rockville, Maryland, og er tilgjengelig under nummeret ATCC 40153.

Tahell 1 er basissekvensen for et 87 baseparekson av et human EPO-gen; figur 1 illustrerer detektering av EPO mRNA i humanføtallever mRNA;

tabell 2 viser aminosyresekvensen for et et EPO-protein redusert fra nukleotidsekvensen av X-HEP0FL13;

tabell 3 viser nukleotidsekvensen for EPO cDNA i X-HEP0FL13 (vist skjematisk i fig.2) og aminosyresekvensen redusert derfra;

figur 3 viser de relative posisjoner av DNA-innskudd for fire uavhengige human EPO-genomkloner;

figur 4 viser kartet av en tilsynelatende intron- og eksonstruktur for human EPO-genet;

tabell 5 viser en DNA-sekvens av EPO-genet vist i figur 4B; figurene 5A, 5B og 5C viser konstruksjonen av vektoren 91023(B);

figur 6 viser SDS polyakrylamid-gelanalysen av EPO fremstilt i COS-1 celler sammenlignet med nativ EPO;

tabell 5 viser nuklotid- og aminosyresekvensen av EPO-klonet, X-HEP0FL6;

tabell 6 viser nukleotid- og aminosyresekvensen for EPO-klonet, X-HEP0FL8;

tabell 7 viser nukleotid- og aminosyresekvensen av EPO-klonet X-HEP0FL13;

figur 7 viser skjematisk plasmidet pRKl-4; og figur 8 er en skjematisk illustrasjon av plasmidet pdBPV-MMTneo(342-12 ).

Foreliggende oppfinnelse er som nevnt rettet mot kloning av EPO-gener og produksjon av EPO ved in vitro eksprimering av disse gener.

Patent- og den videnskapelig litteratur er rik på prosesser som angis brukbare for fremstilling av rekombinante pro-dukter. Generelt involverer disse teknikker isolering eller syntese av en ønsket genesekvens, og eksprimeringen av sekvensen enten i en prokaryotisk eller eukaryotisk celle ved bruk av teknikker som generelt er tilgjengelige for fagmannen. Med en gang et gitt gen er isolert, renset og skutt inn i en overføringsvektor (det vil si klonet), er dens tilgjengelighet i vesentlige mengder sikret. Vektoren med sitt klonede gen overføres til en egnet mikroorganisme eller en cellelinje, som bakterier, gjær, pattedyrceller, for eksempel COS-1 (apenyre), CHO (kinesisk hamsterovarie), insekt-cellelinjer o.l., der vektoren reflekteres efterhvert som mikroorganismen eller cellelinjen prolifereres og hvorfra vektoren kan isoleres ved konvensjonelle midler. Det tilveiebringes således en kontinuerlig fornybar kilde for genet for ytterligere manipuleringer, modifiseringer og overføringer til andre vektorer eller andre loci innen den samme vektor.

Eksprimering kan ofte oppnås ved å overføre det klonede gen i egnet retning og leseramme, til et egnet sete i en over-føringsvektor slik at translasjonen gjennomlesning fra et prokaryotisk eller eukaryotisk gen resulterer i syntese av en proteinforløper som omfatter aminosyresekvensen kodet av det kodede gen bundet til Met eller en aminoterminalsekvens fra de prokaryotiske eller eukaryotiske gen. I andre tilfeller kan signalene for transkripsjons- og translasjons-initiering oppnås ved et egnet genomisk fragment av det klonede gen. En varietet av spesifikke proteinspaltings-teknikker kan benyttes for å spalte proteinforløperen, hvis fremstilt, på det ønskede punkt for å frigjøre den ønskede aminosyresekvens som så kan renses ved konvensjonelle midler. I enkelte tilfeller kan proteinet inneholdende den ønskede aminosyresekvens fremmstilles uten behovet for spesifikke spaltingsteknikker og kan også frigjøres fra cellene til det ekstra cellulære vektsmedlum.

Human EPO ble renset til homogenitet fra urin fra pasienter smittet med aplastisk anemi som beskrevet nedenfor. Total nedbrytning av dette rensede EPO med proteasetrypsin ga fragmenter som ble separert ved reversfase høyydelses-væskekromatografi, gjenvunnet fra gradientfraksjoner og underkastet mikrosekvensanalyse. Sekvensene av de tryptiske fragmenter er understreket i tabellene 2 og 3 og diskutert i større detalj nedenfor. To av aminosyresekvensene, Val-Asn-Phe-TyrAla-Trp-Lys og Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg, ble valgt for konstruksjon av oligonnukleotidprober (noe som resulterte i en olegonnukleotidmasse 17nt lang og 32 ganger degenerat, og en olegonnukleotidmasse 18nt lang og 128 ganger degenerat, fra det tidligere tryptiske fragment, såvel som to masser 14nt lange, begge 48 ganger degeneratet, fra det sistnevnte tryptiske fragment). Den 32 ganger degenerate 17mer-masse ble benyttet for å screene et humangenom DNA-forråd i en Ch4A vektor (22) ved bruk av en modifikasjon av Woo og 0'Malley/s in situ forsterkningsprosedyre 47 for å fremstille filtrene for screening.

Som her benyttet henviser arabiske tall i parentes, 1 til 61, til publikasjoner som er anført i kronologisk rekkefølge i slutten av beskrivelsen.

Faghybridiserlng av 17mer ble plukket ut, samlet i de små grupper og probet med 14mer- og 18mer massene. Faghybridi-sering til 17mer-, 18mer- og 14mer massene ble plaquerenset og fragmenter ble subklonet inn i M13 vektorer for sekvensering ved dideoksykjedetermineringsmetoden til Sanger and Coulson, (23) (1977).

Sekvensen av regionhybridiseringen til den 32 ganger degenerate 17mer i en av klonene er vist i tabell 1. Denne DNA sekvens inneholder i en åpen leseramme nukleotidene som nøyaktig kunne kode for det tryptiske element som ble benyttet for å redusere 17mer massen av olegonnukleotider. Videre indikererte analyse av DNA-sekvensen at 17mer-hybridi-seringsområde var inneholdt i en 87bp ekson, bundet av potensielle spleiseakseptor- og donorseter.

Positiv bekreftelse på at disse to kloner (heri kalt X-EEP01 og X-HEP02) er EPO genomiske kloner, er oppnådd ved sekvensering av ytterligere eksoner inneholdende andre tryptiske fragmentkodende informasjon.

Northern Analysis (56) av human føtal (20 uker gammel) lever mRNA ble gjennomført ved bruk av en 95nt enkelt-strenget probe fremstilt fra en M13 klon inneholdende en porsjon 87bp ekson beskrevet i tabell 1. Som illustrert i figur 1, kan et sterkt signal detekteres i føtallever mRNA. Den nøyaktige identifisering av dette bånd som EPO mRNA ble oppnådd ved bruk av den samme probe for å screene et bakteriofag X cDNA forråd av føtallever mRNA (25). Flere hybridiserende kloner ble oppnådd i en frekvens på ca. 1 positiv pr. 250.000 screenede rekombinanter. Det komplette nukleotid og reduserte aminosyresekvenser for disse kloner (X-HEP0FL13 og X-HEP0FL8) er vist i tabellene 5 og 6. Den EPO-kodende informasjon er inneholdt i 594nt i 5'-halvparten av DNA, inkludert en meget hydrofob 27 aminosyre-leder og det 166 aminosyre mature protein.

Identifiseringen av N-terminus for det mature protein var basert på den N-terminale sekvens av proteinet utskilt i urinet fra personer med aplastisk anemi som her vist (tabell 1) og som publisert av Goldwasser (26), Sue and Sytkowski

(27), og av Yangawa (21). Hvorvidt denne N-terminus (Ala-Pro-Pro-AQG) representerer den virkelige N-terminus funnet på EPO i sirkulasjon eller hvorvidt noen spalting inntrer i nyren eller urinen er ikke fastslått idag.

Aminosyresekvensene som er understreket i tabellene 2 og 3 indikerer de tryptiske fragmenter eller deler av N-terminus for hvilke proteinsekvensinformasjon ble oppnådd. De reduserte aminosyresekvenser stemmer nøyaktig overens med de tryptiske fragmenter som er sekvensert og bekrefter at det isolere gen koder human EPO.

De relative posisjoner for DNA innskuddene for fire uavhengige human EPO genomiske kloner er vist i figur 3. Hybridiseringsanalyse av disse klonede DNAer med olegonukleo-tidprober og med forskjellige prober fremstilt fra de to klasser EPO cDNA-kloner posisjonert i EPO-genet innen det omtrentlige 3,3 kb området er vist ved den svertede linje i fig. 3. Total sekvensanalyse av dette område, se eks. 4, og sammenligning med cDNA-klonene, resulterte i kartet av intron- og eksonstrukturen for EPO-genet vist i fig. 4. EPO-genet er delt i 5 eksoner. Del av ekson 1, hele ekson II, III og IV, samt endel av ekson V inneholder den proteinkodende informasjon. Resten av eksonene I og V koder de 5'- og 3'-ikke-translaterte sekvenser.

For å vise at biologisk aktiv EPO kunne eksprimeres i et in vitro cellekultursystem ble det gjennomført COS-celle eksprimeringsstudier (58). Den benyttede vektor for tran-sientstudiene, p91023(B), er beskrevet i eksempel 5. Denne vektor inneholder adenovirus-"major late"-promoteren, en SV40-polyadenyleringssekvens, en SV40-opprinnelse for replikering, SV40-forbedrer og adenovirus VA-genet. cDNA innskuddet i X-HEP0FL13 (se tabell 6) ble skutt inn i p91023(B) vektoren, nedstrøms adenovirus"major late"promoteren. Denne nye vektor er identifisert som pPTFL13.

24 timer efter transfektering av dette konstruksjonselement

inn i M6-stammen av COS-l-cellene (Horowitz et al, "J.Moi. Appl. Genet." 2:147-149 (1983)), ble cellene vasket, overført til serumfrie media og cellene ble høstet 48 timer senere. Frigjøringsnivået for EPO til kultursupernatanten ble så

undersøkt ved bruk av en kvantitativ radioimmunanalyse for EPO (55). Som vist i tabell 8, (eksempel 6) ble immunologisk reaktiv EPO eksprimert. Den biologiske aktivitet for EPO produsert fra COS-1 celler ble også undersøkt. I et separat forsøk ble vektoren inneholdende EPO cDNA fra X-HEP0FL13 transfektert til COS-1 celler og media høstet som beskrevet ovenfor. EPO i disse media ble så kvantifisert ved hver av to in vitro biologiske analyser,<3>H-trymidin og CFU-E (12, 29), og ved hver av to in vivo analyser, hypoksisk mus og sultet rotte (30, 31) (se tabell 9, eksempel 7). Disse resultater viser at biologisk aktiv EPO produseres i COS-l-cellene. Ved Western flekking, ved bruk av et polyklon anti-EPO-stoff hadde EPO fremstilt av COS-celler en mobilitet på SDS-polyakrylamidgeler som er identisk med den til nativ EPO fremstilt fra human urin (eksempel 8). Således kan graden av glykosylering av COS-1 fremstilt EPO være lik den til nativ

EPO.

Forskjellige vektorer inneholdende andre promotere kan også benyttes i COS-celler eller i andre pattedyr- eller eukaryotiske celler. Eksempler på slike andre promotere som er brukbare ved gjennomføring av oppfinnelsen inkluderer tidlige og sene SV40-promotere, musemetallotionein genepromoteren, promoteren funnet i lange terminalgjentagelser av fjærfe-eller pattedyr-retroviruser, bacculovirus polyhedron genepromoteren og andre. Eksempler på andre celletyper som kan benyttes ved gjennomføring av oppfinnelsen omfatter E. coli, gjær, pattedyrceller som CHO (kinesisk hamsterovarie) C127 (apeefitel), 3T3 (musefibroblaster) CV-1 (afrikansk grønnapenyre), og insektceller som de fra Spodotera frugiperda og Drosophila metanogaster. Disse forskjellige promotere og/eller celletyper kan muliggjøre regulering av tidsbestemmelsen eller nivået for EPO-eksprimering, produsere en cellespesifikk type EPO, eller veksten av store mengder EPO produserende celler under mindre kostbare og lettere kontrollerte betingelser.

Et eksprimeringssystem som bibeholder fordelene ved patte-dyreksprimeringen men som krever mindre tid for å produsere en høynivåeksprimeringscellelinje settes sammen av en insektcellelinje og en DNA-virus som reproduserer i denne cellelinje. Denne virus er en nukleær polyhedrosevirus. Den har en dobbeltstrenget cellulær DNA-genom på 128 kb. Nukleokapsiden er stavformet og funnet pakket i to former, den ikke okkulerte form, en membran "budded" virus og en okkludert form, pakket i et proteinkrystall i den infiserte cellekjerne. Disse viruser kan rutinemessig propageres i in vitro insektcellekultur og er tilpassbare til alle rutine-animalvirologiske metoder. Cellekulturmedium er karakte-ristisk eller næringssaltoppløsning og 1056 føtal kalveserum.

In vitro blir virusvekst initiert når en ikke-okkludert viru (NOV) kommer inn i en celle og beveger seg til kjernen der den replikerer. Replikeringen er nukleær. Under initialfasen (8-18 timer post-infeksjon) av viralapplikering blir nukleokapsider samlet i nukleus og derefter BUD gjennom plasmamembranet som NOVer, og sprer infeksjonen gjennom cellekulturen. I tillegg forblir noen av nukleotidkapsidene derefter (18+ timer post-infeksjon) i nukleus og okkluderes i en proteinmatriks, kjent som det polyhedrale inklusjons-legemet (PIB). Denne form er ikke infeksiøs i cellekulturen. Matriksen består av et protein kjent som polyhedrin, MW 33 kd. Hver PIB er ca. 1 mm i diameter og det kan være opp til 100 PIBer pr. kjerne. Det er tydelig en stor del polyhedrin som fremstilles sent i infeksjonscyklen, helt opp til 25$ av det totale cellulære protein. Fordi PIB ikke spiller noen rolle ved in vitro replikeringscyklusen kan polyhedringenet utelukkes fra virus kromosomet uten virkning på in vitro levedyktigheten. Ved bruk av virus som eksprimeringsvektor har søkeren erstattet polyhedrin-genekodingsområdet med det fremmede DNA som skal eksprimeres, ved å bringe det under kontroll av polyhedrin-promoteren. Dette resulterer i en ikke-PIB dannende virusfenotype.

Dette system har vært benyttet av flere forskere hvorav de mest bemerkede er Pennock et al. og Smith et al. Pennock et al. (Gregory D. Pennock, Charles Shoemaker, og Lois K. Miller, "Molecular and Cell Biology" 3:84. p. 399-406) har beskrevet høynivå eksprimering av et bakterielt protein, B-galaktosidase, når dette ble bragt under kontroll av polyhedrinpromoter.

En annen nukleær polyhedrose-virusavledet eksprimeringsvektor

er presentert av Smith et al. (Gale E. Smith, Max D. Summers and M.J. Fraser, "Molecular and Cell Biology", mai 16, 1983,

s. 2156-2165). De har vist effektiviteten for sin vektor ved eksprimering av human B-interferon. Det syntetiserte produkt ble funnet å bli glykosylert og skilt ut fra insektceller slik man skulle anta. I eksempel 14 beskrives modifiseringer av plasmidet inneholdende Autographa californica kjerne-polyhedrosevirus (AcNPV) polyhedron gen som tillater lett innskyting av EPO-gen i plasmidet slik at det kan være under transkripsjonen kontroll av polyhedrinpromoteren. Det resulterende DNA kotransfekteres med intakt kromosom DNA fra villtype-AcNPV til insektceller. En genetisk rekombinasjons-hendelse resulterer i erstatning av AcNPVC polyhedrin geneområdet med DNA fra plasmidet. Den resulterende rekombinante virus kan identifiseres blant det virale avkom men på grunn av at det har DNA-sekvenser av EPO-genet. Dette rekomblnante virus er forventet å fremstille EPO ved reinfisering av insektceller.

Eksempler på EPO-eksprimering i CHO, C127 og 3T3, og insektceller er gitt i eksemplene 10 og 11 (CHO), 13 (C127 og 3T3) og 14 (insektceller).

Rekombinant EPO fremstilt i CHO-celler som i eksempel 11 ble renset ved konvensjonelle kolonnekromatografiske metoder. De relative mengder av sukkeret tilstede i glykoproteinet ble analysert ved to uavhengige metoder [(i)Reinhold, "Methods in Enzymol." 50:244-249 (Methanolysis) og (ii) Takemoto, H. et al., "Anal. Biochem." 145:245 (1985) (pyridylanimerlng, sammen med uavhengig sialsyredeterminering)§. Resultatene som ble oppnådd ved hver av disse metoder var i fullstendig over-ensstemmelse. Flere bestemmelser ble så gjennomført og man oppnådde følgende midlere verdier der N-acetylglykosamin for sammenligningsformål er gitt verdien 1:

Det er verdt å merke seg at signifikante nivåer av fukose og N-acetylgalaktosamin reproduserbart ble observert ved bruk av begge uavhengige metoder for sukkeranalyse. Nærværet av en acetylgalaktosamin indikerer nærværet av O-bundet glykosylering på proteinet. Nærværet av O-bundet glykosylering ble ytterligere antydet av SDS-PAGE analyse og av glykoproteinet efter nedbrytning av glykoproteinet med forskjellige kombinasjoner av glykosidiske enzymer. Spesielt efter enzymatisk fjerning av alt N-bundet karbohydrat på glyko-proteinene ved bruk av enzymet peptid endo FN-glykosidase, ble molekylvekten for proteinet ytterligere redusert ved efterfølgende nedbrytning med neuraminidase, bestemt ved SDS-PAGE analyse.

In vitro biologisk aktivitetet for det rensede rekombinante EPO ble analysert ved metoden til G. Krystal, "Exp. Hematol." 11:649 (1983) (mildcelle proliferering bioanalyse) med proteinbestemmelser kalkulert, beregnet på aminosyresammen-setningsdata. Ved flere bestemmelser ble den spesifikke in vitro aktivitet for det rensede rekombinante EPO beregnet til å være større enn 200.000 enheter/mg protein. Den midlere verdi lå i området ca. 275 til 300.000 enheter/mg protein. Videre er verdier over 300.000 også observert. In vivo (polycytemisk museanalyse, Kazal and Erslev, "Am. Clinical Lab. Sei.", Vol. B, s. 91 (1975))/in vitro aktivitetsfor-holdene som ble observert for det rekombinante materialet lå innen området 0,7 til 1,3.

Det er interessant å sammenligne den glykoproteinkarakteri-sering som presenteres ovenfor med karakteriseringene for et rekombinant CHO-produsert EPO-materiale som tidligere er angitt i den internasjonale søknad WO 85/02610 (publisert 20. juni 1985). Den tilsvarende sammenlignende sukkeranalyse som beskrives på side 65 i søknaden anga en verdi på null for fukose og for N-acetyllgalaktosamin og et heksoser:N-acetylgalaktosamin forhold på 15,09:1. Fraværet av N-acetylgalaktoseamin indikerer fravær av O-bundet glykosy-lerlng i det tidligere angitte glykoprotein. I motsetning til dette materiale inneholder det her beskrevne, rekombinante CHO-produserte EPO og som karakteriseres ovenfor, signifikante og reproduserbart observerbare mengder av både fukose og N-acetylgalaktosamin, inneholder mindre enn en tiendedel av den relative mengde heksoser og karakteriseres ved nærværet av 0-bundet glykosylering. Videre kan den høyt spesifikke aktivitet for det ovenfor beskrevne CHO-avledede, her beskrevne rekombinante EPO direkte forbindes med sitt krakteristiske glykosyleringsmønster.

Det biologisk aktive EPO som produseres ved prokaryotisk eller eukaryotisk eksprimering av de klonede EPO gener ifølge oppfinnelsen kan benyttes for in vivo behandling av patte-dyrarter ved leger og/eller veterinærer. Mengden aktiv bestanddel vil selvfølgelig avhenge av hvor alvorlig den tilstand er som behandles, administreringsveien som velges og den spesifikke aktivitet for de aktive EPO, og vil til slutt bestemmes av den utførende lege eller veterinær. Slike mengder aktiv EPO som bestemmes av den utførende lege kalles også her "EPO-behandlingseffektiv" mengde. Ved behandling av induserte hypoproliferative anemi forbundet med kroniske renal fiasko hos sauer, er for eksempel en effektiv daglig mengde EP10 funnet å være 10 enheter/kg i fra 15 til 40 dager. Se Eschbach et al., "J. Clin. Invest.", 74:434 (1984).

Det aktive EPO kan administreres på en hvilken som helst egnet vei for den tilstand som behandles. Fortrinnsvis blir EPO injisert i blodstrømmen til pattedyret som behandles. Det vil være lett å forstå for fagmannen at den foretrukne vei vil variere med de betingelser som behandles.

Mens det er mulig for aktiv EPO å administreres som ren eller i det vesentlige ren forbindelse, er det foretrukket å presentere EPO som farmasøytisk formulering eller preparat.

Formuleringene ifølge oppfinnelsen, både for veterinær- og humanbruk, omfatter et aktivt EPO protein som beskrevet ovenfor sammen med en eller flere formasøytiske akseptable bærere og/eller eventuelt andre terapeutiske bestanddeler. Bæreren eller bærerne må være "aksepterbare" i den forstand at de er kompatible med de andre bestanddeler i formuleringen og ikke skadelig for mottageren. Det er ønskelig at formuleringen ikke inneholder oksydasjonsmidler eller andre stoffer som er kjent å være inkompative med peptider. Formuleringen kan hensiktsmessig presenteres i enhetsdose form og kan fremstilles på en hvilken som helst av de i denne farmasøytiske teknikk kjente metode. Alle metoder inkluderer å bringe den aktive bestanddel i forbindelse med bæreren som utgjør en eller flere ytterligere bestanddeler. Generelt fremstilles formuleringene ved enhetlig og grundig å bringe i forbindelse den aktive bestanddel med flytende bærere eller findelte faste bærere eller begge deler og så, hvis nødvendig, å forme produktet til den ønskede formulering.

formuleringer som er egnet for parenteral administreringDmfatter hensiktsmessig sterile vandige oppløsninger av aktiv aestanddel med oppløsninger som fortrinnsvis er isotoniske ned mottagerens blod. Slike formuleringer kan hensiktsmessig fremstilles ved oppløsing av fast aktiv bestanddel i vann for ierved å gi en vandig oppløsning, og å gjøre oppløsningen steril hvorved den kan presenteres i enhets- eller multi-dosebeholdere, for eksempel forseglede ampuller eller lignende.

EPO/cDNA slik uttrykket heri benyttes inkluderer det mature EPO/cDNA gen som foregås av et ATG kodon og EPO/cDNA som koder for alleliske variasjoner av EPO-protein. Et allel er illustrert i tabellene 2 og 3. EPO-proteinet inkluderer 1-metioninderivat av EPO-protein (Met-EPO) og alleliske variasjoner av EPO protein. Det mature EPO protein som illustreres ved sekvensen i tabell 2 begynner med sekvensen Ala.Pro.Pro.Arg....begynnelsen hvilken angis av tallene "1" i tabell 2. Met-EPO ville begynne med sekvensen Met.-ala.Pro.-Pro.Arg...

De følgende eksempler gis for å understøtte forståelsen av oppfinnelsen hvis virkelige ramme er angitt i de ledsagende krav. Det skal være klart at modifikasjoner kan gjennomføres i de prosedyrer som er angitt uten å gå utenfor oppfinnelsens ånd. Alle temperaturer er gitt i grader Celsius og er ukorrigerte. Symbolet for mikron eller mikro, for eksempel mikroliter, mikromol og så videre, er "jj", for eksempel jjI , um og så videre.

EKSEMPLER

Eksempel I: Isolering av en genomisk klon av EPO.

EPO ble renset fra urin fra pasienter med aplastisk anemi i det vesentlige som beskrevet tidligere (Miyake, et al., "J.Biol. Chem.", 252:5558 (1977) bortsett fra at fenol-behandlingen ble utelatt og erstattet ved varmebehandling ved 80° C i 5 min. for å inaktivere neuraminidase. Sluttrinnet i rensingen var fraksjonering på en C-4 Vydac HPLC kolonne (separas j onsgruppen) ved bruk av 0 til 95$ acetonitril-gradient med 0,1$ trifluoreddiksyre (TFA) i 100 min. Posisjonen av EPO i gradienten ble bestemt ved gelelektroforese og N-terminalsekvensanalyse (21, 26, 27) for de vesentlige topper. EPO ble eluert ved ca. 53$ acetonitril og representerte ca. 40$ av proteinet som ble underkastet reversfase - HPLC. Fraksjoner inneholdende EPO ble fordampet til 100, >j1, justert til pH 7,0 med ammoniumbikarbonat, nedbrutt fullstendig med 2$ TPCK-behandlet trypsin (Worthington) i 18 dager ved 37°C. Det nedbrutte produkt ble så underkastet reversfase HPLC som beskrevet ovenfor. Den optiske densitet både ved 280 og 214 nm ble overvåket. Godt adskilte topper ble fordampet til nær tilstand og underkastet direkte en N-terminal aminosyre sekvensanalyse (59) ved bruk av en "Applied Biosystems Model 480A" gassfase sekvensator. De oppnådde sekvenser er understreket i tabellene 2 og 3. Som beskrevet ovenfor ble to av disse tryptiske fragmenter valgt for syntese av oligonukleotidprober. Fra sekvensen, Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (aminsyrer 46 til 52 i tabellene 2 og 3), et 17mer av 32 gangers generat

og en 18mer av 128 gangers degenerat ble fremstilt. Fra sekvensen Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (aminosyrene 144 til 150 i tabellene 2 og 3), ble det preparert to masser av 14merer, hvert 32 gangers generat

som adskiller seg ved den første posisjon i leucinkodonet. 01ifonukletidene ble merket ved 5-prime-enden med<32>P ved bruk av polynukleotidkinase (New England Biolabs) og 7-<32p_>ATP (New England Nuclear). Den spesifikke aktivitet for oligonukleotidene varierte mellom 1000 og 3000 Ci/mmol oligonukleotid. Et humangenom DNA-forråd i bakteriofag X (Lawn et al., 22) ble screenet ved bruk av en modifikasjon av in situ forsterkningsprosedyren som opprinnelig beskrevet

av Woo et al., (47) (1978). Ca. 3,5 x IO<5>fager ble platert ved en densitet på 6000 fager pr. 150 mm petrlskål (NZCYM media) og Inkubert ved 37" C inntil plaquene var små men synlige (ca. 0,5 mm). Efter avkjøling til 4°C i 1 time ble duplikatreplikan av plaque-mønsteret overført til nylonmem-braner (New England Nuclear) og inkubert over natten ved 37°C på friske NZCYM-plater. Filtrene ble så denaturert og nøytralisert ved flotering i 10 min. hver på en tynn film av 0,5N NaOH - IM NaCl henholdsvis 0,5M Tris (pH 8) -IMNaCI. Efter vakuumbehandling ved 80°C i 2 timer ble filtrene vasket i 5 x SSC, 0,5$ SDS i en time og cellerestene på filter-overflaten ble fjernet ved forsiktig skraping med en våt duk. Denne behandling reduserte bakgrunnsbindingen av proben til filtrene. Filtrene ble så skyllet med HgO og prehybridisert i fra 4 til 8 timer ved 48°C i 3M tetrametylammoniumklorid, 10 mM NaP04(pH 6,8), 5 x Denhardfs, 0,5$ SDS og lOmM EDTA. Den<32>P-merkede 17mer ble så tilsatt ved en konsentrasjon av 0,1 pmol/ml og hybridiseringen ble gjennomført ved 48° C i 72 timer. Efter hybridisering ble filtrene vasket godt i 2 x SSC (0,3M NaCl - 0,03M Na citrat, pH 7) ved romtemperatur og så i 1 t. i 3M TMAC1 - lOmM NaP104(pH 6,8) ved romtemperatur og fra 5 til 15 min. ved hybridiseringstemperaturen. Ca. 120 sterke duplikatsignaler ble detektert efter 2 dagers autoradiografi med en intensiveringsskjerm. De positive ble samlet opp, gruppert i masser på 8, platert igjen og screenet om igjen i triplikat ved bruk av en halvpart av 14mer-massen på hver av to filtre og 127meren på det tredje filter. Betingelsene og 17meren for platering og hybridisering var som beskrevet ovenfor bortsett fra at hybridiseringen for 14meren var ved 37°C. Efter autoradiografien ble proben fjernet fra 17mer filteret i 50$ formamid i 20 min. ved romtemperatur og filteret ble rehybridisert ved 52 °C med 18mer-proben. To uavhengige fager hybridiserte til alle tre prober. DNA fra en av disse fager (her kalt X-HEP01) ble brutt ned fullstendig med Sau3A og subklonet inn i M13 for DNA sekvensanalyse ved bruk av dideoksykjede terminerings-metoden til Sanger and Coulson, (23) (1977). Nukleotid- sekvensen og den deduserte aminosyresekvens for den åpne leseramme som kodet for det EPO tryptiske fragment (under-strekt område) er beskrevet heri. Intronsekvenser gis i bokstaver i det nedre tilfelle, eksonsekvenser (87nt) gis i det øvre tilfelle. Sekvenser som stemmer med konsensus-spleiseakseptoren(a) og donor (d) seter er understreket (se tabell 4).

Eksempel 2: Northern analyse av humanføtal lever mRNA

5jjg humanføtallever mRNA (fremstilt fra en 20 uker gammel føtallever) og voksen lever mRNA ble underkastet elektroforese i en 0,8$ agarose formaldehydgel og overført til nitrocellulose ved bruk av metoden til Derman et al., "Cell", 23:731 (1981). En enkelt-strenget probe ble så fremstilt fra en M13 sjablon inneholdende innskuddet vist i tabell 1. Primeren var en 20mer avledet fra det samme tryptiske fragment som den opprinnelige 17mer-probe. Proben ble preparert som tidligere beskrevet av Anderson et al., "PNAS", (50) (1984) bortsett fra, efter nedbrytning med Smal (som ga

den ønskede probe på 95nt lengde inneholdende 74nt kodingssekvens), det lille fragment ble renset fra M13 templatet ved kromatografi på en sefarose C14B-kolonne i 0, IN NaOH - 0,2M MaCl. Filteret ble hybridisert til ca. 5 x IO<6>cpm av denne probe i 12 t. ved 68° C, vasket i 2 x SSC ved 68° C og eksponert i 6 dager med en intensiveringsskjerm. En enkelt markør-mRNA på 1200 nt (antydet ved pilen) ble kjørt i et nabospor (fig. 1).

>

Eksempel 3: Føtal lever cDNA

En probe identisk med den beskrevet i eksempel 2 ble preparert og benyttet for å screene et føtal lever cDNA-forråd fremstilt I vektoren X-Ch21A (Toole et al., "Nature", (25) (1984) ved bruk av standard plaque screening (Bentson Davis, "Science", (54) (1978) prosedyrer. Tre uavhengige positive kloner (her kalt X-HEP0FL6 (1350bp), X-HEP0FL8 (700bp) og X-HEP0FL13 (1400bp) ble isolert efter screening av 1 x IO<6>plaquer. Hele innskuddet av X-HEP0FL13 og X-HEP0FL6 ble sekvensert efter subkloning inn i M13 (tabellene 7 henholdsvis 5). Kun andeler av X-HEP0FL8 ble sekvensert og resten ble antatt å være identisk med de to andre kloner (tabell 6). 5'- og 3'- ikke-translaterte sekvenser er representert ved de nedre bokstaver. Kodingsområdet er representert ved de øvre bokstaver.

Under henvisning til tabellene 3 og 3 er den deduserte aminosyresekvens som vises under nukleotidsekvensene nummerert begynnende med 1 for den første aminosyre av det mature protein. Det putative lederpeptid er antydet ved alle hetter for aminosyredesigneringer. Cysteinrester i det mature protein er i tillegg antydet ved SH og potensielle N-bundede glykosyleringsseter ved en apostrof. Aminosyrene som er understreket antyder de rester som er identifisert ved en terminal proteinsekvensering eller ved sekvensering av tryptiske fragmenter av EPO som beskrevet i eksempel 1. Partiell understreking antyder rester i aminosyresekvensen av visse tryptiske fragmenter som ikke kunne bestemmes ut-vetydig. cDNA klonene X-HEP0FL6, X-HEP0FL8 og X-HEP0FL13 er deponert og tilgjengelige fra ATCC, under numrene 40156, 40152 og 40153.

Eksempel 4: Genomisk struktur av EPO genet

De relative størrelse og posisjonerfor fire uavhengige genomiske kloner (X-HEP01, 2, 3 og 6) fra Haelll/Alul forrådet er illustrert ved de overlappende linjer i fig. 3. Den fortykkede linje antyder posisjonen for EPO-genet. En skala (i Kb) og posisjonen for kjente restriksjonsendo-nukleasespaltingsseter er vist. Området som inneholder EPO-genet ble totalt sekvensert fra begge strenger ved bruk av rettede eksonuklease III-genererte serier av utelukkelse gjennom dette området. En skjematisk representasjon av fem eksoner som koder for EPO mRNAer er vist i fig. 4. Den nøyaktige 5'-grense for ekson 1 er ennu ukjent. Protein-kodingsdelen av eksonene er gjort mørke. Den totale nukleo-tidsekvens for området er vist i tabell 4. De kjente grenser for hvert ekson er deliniert ved faste vertikale stolper. Genomiske kloner X-HEP01, X-HEP02, X-HEP03 og X-HEP06 er deponert og er tilgjengelige fra ATCC under numrene ATCC 40154, ATCC 40155, ATCC 40150 og ATCC 40151.

Eksempel 5: Konstruksjon av vektor p91023( b)

Transformeringsvektoren var pAdD26SVpA(3), beskrevet av Kaufman et al., "Mol. Cell Biol.", 2:1304 (1982). Strukturen for denne vektor er vist i fig. 5A. Kort sagt inneholder dette plasmid et musedihydrofolat reduktase (DFHR) cDNA-gen som er under transkripsjonen kontroll av adenovirus 2 (Ad2) sene hovedpromoter. Et 5'-spleisesete er antydet i dette adenovirus DNA og et 3-prime spleisesete, avledet fra et immunglobulingen, er tilstede mellom den Ad2 sene hovedpromoter og den DFHR kodende sekvens. Det SV40 tidlige polyadenyleringssete er tilstede nedstrøms DHFR-kodings-sekvensen. Den prokaryotavledede seksjon av pAdD26SVpA(3) er fra pSVOd (Mellon et al., "Cell", 27: 279 (1981 )) og inneholder ikke de pBR322-sekvenser som er kjente for å inhibere replikering i pattedyrceller (Lusky et al., "Nature", 293: 79

(1981)).

pAdD26SVpA(3) ble omdannet til plasmid pCVSVL2 som vist i fig. 5A. pAdD26SV(3) ble omdannet til plasmid pAdD26SVpA(3) (d) ved utelukkelse av en av de to Pstl-seter i pAdD26SVpA(3). Dette ble gjennomført ved en partiell nedbryting med Pstl ved bruk av et underskudd av enzym slik at det oppnås en subpopulering av lineariserte plasmider hvori kun et Pstl-sete ble spaltet, fulgt av behandling med Klenow, ligering for å resirkularisere og screening for utelukkelse av den Pstl-sete lokaliserte 3'- til SV40-polyadeny1eringssekvensen.

De adenovirus tripartit leder- og virus forbundne gener (VA gener) ble skutt inn i pAdD26SVpA( 3) (d) som vist i fig. 5A. Først ble pAdD26SVpA( 3) (d) spaltet med PvuII for å gjøre et lineært molekyl åpent 1 3'-delen av de tre elementer som omfatter tripartitlederen. Så ble pJAW 43 (Zain et al.," "Cell", 16: 851 (1979) brutt ned med Xho 1, behandletmed Klenow, brutt ned med PvuII, og 140bp-fragmentet som inneholdt den andre del av den tredje leder ble isolert ved elektroforese på en akrylamidgel (6$ i trisboratbuffer; Maniatis et al., ovenfor). 140bp-fragmentet ble så ligert til PvuII-nedbrutt pAdD26SVpA(3)(d). Legeringsproduktet ble benyttet for å transformere E. coli til tetracyklinresistens og kolonier ble screenet ved bruk av Grunstein-Hogness-prosedyren ved bruk av en<32>p merket probe som hybridiserte til 140bp fragmentet. DNA ble fremstilt fra positivt hybridiserende kolonier for å prøve hvorvidt PvuII setet som rekonstruert var 5'- eller 3'- av det innskutte 140bp DNA spesifikt til de andre og tredjeadenovirus sene ledere. Den korrekte orientering for PvuII-setet er på 5'-delen av 140bp innskuddet. Dette plasmid er kalt tTPL i fig. 5A.

AvalID-fragmentet av SV40 inneholdende SV40 forbedrers-ekvensen ble oppnådd ved å bryte ned SV40 DNA med Ava II, avstumpe endene med Klenowfragment av Poll, ligering av Xho 1 forbindere til fragmentene, nedbrytning med Xho 1 for å åpne Xho 1 setet, og isolering av den fjerde største (D) fråg- mentet ved gelelektroforese. Dette fragment ble så ligert til Xho 1 kuttet pTPL, noe som ga plasmidet pCVSVL2-TPL. Orienteringen av SV40 D-fragmentet i pCVSVL2-TPL var slik at den SV40 sene promoter var i samme orientering som den adenovirus sene hovedpromoter.

For å innføre adenovirusforbundne (VA) gener til pCVSVL2-TPL, ble det først konstruert et plasmid pBR322 som inneholdt adenovirus type 2 Hind III B-fragmentet. Adenovirustype 2 DNA ble brutt ned med Hind III og B-fragmentet ble isolert ved gelelektroforese. Dette fragment ble skutt inn i pBR322 som på forhånd var brutt ned med Hind III. Efter transformering av E. coli til ampicillinresistens, ble rekombinant screenet for innskudd av Hind III B-fragmentet og den innskutte orientering ble bestemt ved restriksjonsenzymnedbrytning. pBR322-AdHindlllC inneholder adenovirustype 2 Hind III B-fragment i den orientering som er vist i fig. 5B.

Som vist i fig. 5B oppnås Va genene hensiktsmessig fra plasmid pBR322 - Ad Hind III B ved nedbrytning med Hpa I, tilsetning av EcoTl forbindere og nedbrytning med EcoRl, fulgt av gjenvinning av 1,4kb-fragmentet. Fragmentet med EcoRl-klebrige ender ligeres så inn i EcoRl-setet av PTL, på forhånd brutt ned med EcoRl. Efter transformering av E. coli HB101 og selektering for tetracyklinresistens, ble kolonier screenet ved filterhybridisering for DNA spesifikk for VA-genene. DNA ble fremstilt fra positivt hybridiserende kloner og karakteriseres ved restriksjonsendonukleasenedbrytning. Det resulterende plasmid kalles p91023.

Som vist i fig. 5C ble de to EcoRl seter i p91023 fjernet ved fullstendig kutting av p91023 med EcoRl, og danner to DNA-fragmenter, et ca. 7kb og det andre ca.l,3kb. Det sistnevnte fragment inneholdt VA-gener. Endene av begge fragmenter ble fylt ved bruk av Klenow-fragmentet av Poll og de to fragmenter ble så ligert sammen. Et plasmid p91023(A), inneholdende VA-genene og tilsvarende p91023, men uten de to EcoRl-seter, ble identifisert ved Grunstein-Hogness-screening med VA-genefragmentet og ved konvensjonell restriksjonssete-analyse.

Det enkelte Pstl setet i p91023(A) ble fjernet og erstattet med et EcoRl-sete. p91023 ble kuttet fullstendig med Pstl og behandlet med Klenow fragmentet av Poll for å danne "flush"-ender. EcoRl-forbindere ble ligert til de stumpgjorte Pstl-seter av p91023(A). Det lineære p91023(A) med EcoRl-forbindere bundet til de stumpe Pstl-seter ble separert fra ikke-ligerte forbindere og brutt fullstendig ned med EcoRl og religert. Et plasmid, p91023(B) som angitt i fig. 5C ble gjenvunnet og identifisert til å ha en struktur tilsvarende p91023(A), men med et EcoRl-sete istedet for det tidligere Pstl-sete. Plasmid p91023(B) er deponert og tilgjengelig fra ATCC under betegnelsen ATCC 39754.

Eksempel 6:

cDNA-klonene (X-EP0FL6 og X-EP0FL13; eksempel 3) ble skutt inn i plasmid p91023(B) for å danne pPTFL6 henholdsvis pPTFL13. 8 ug av hver av de rensede DNAer ble så benyttet for å transfektere 5 x IO<6>COS-celler ved bruk av DEAE-dekstral-metoden (infra). Efter 12 timer ble cellene vasket og behandlet med O.lmM kloroquin i 2 t., vasket igjen og eksponert til ml media inneholdende 10$ føtalkalveserum i 24 t. Disse media ble endret til 4 ml serumfrie media og høstet 48 timer senere.

Produksjon av immunologisk aktiv EPO ble kvantifisert ved en radioimmunoanalyse som beskrevet av Sherwood og Goldwasser (55). Antistoffet ble tilveiebragt av dr. Judith Sherwood. Den joderte tracer ble fremstilt fra det homogene EPO som beskrevet i eksempel 1. Sensitiviteten for analysen er ca. Ing/ml. Resultatene er vist i tabell 8.

PTFL13 er deponert og tilgjengelig fra ATCC under nummeret

39990.

Eksempel 7

EPO cDNA (X-HEP0FL13) ble skutt inn i p91023(B) vektoren og tranfektert til COS-l-celler og høstet som beskrevet ovenfor i eksempel 6 bortsett fra at kloroquinebehandlingen var utelatt.

i In vitro biologisk aktivt EPO ble målt ved bruk av enten en kolonidannende analyse med museføtal leverceller som kilde for CFU-E eller en<3>H-tymidin-opptaksanalyse ved bruk av miltceller fra fenylhydrazininjiserte mus. Sensitivitetene for disse analyser er ca. 25 menheter/ml. In vivo biologisk aktivt EPO ble målt enten ved bruk av hypokslsk mus- eller fastet rotte-metoden. Sensitiviteten for disse analyser er ca. 100 mU/ml. Ingen aktivitet ble detektert i noen av analysene fra kontrollmedia. Resultatene av EPO-eksprimert av klon EP0FL13 er vist nedenfor i tabell 9 hvor de angitte aktiviteter er uttrykt i enheter/ml ved bruk av en kommer-siell, kvantifisert EPO (Toyobo,Inc.) som standard.

Eksempel 8: SDS polyakrylamid gelanalvse av EPO fra COS-celler

180 ng EPO frigitt til media av COS-celler transfektert med EPO (X-HEPOFL13 cDNA i vektoren 91023(B) (ovenfor) ble elektroforesebehandlet på en 10% SDS Laemlli polyakrylamidgel og elektrooverført til nitrocellulosepapir (Towbin et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." USA 76:4350 (1979)). Filteret ble probet med et anti-EPO-antistoff som beskrevet i tabell 8, vasket og probet igjen med<125>I-staf A protein. Filteret ble autoradiografert i to dager. Nativ homogen EPO ble beskrevet i eksempel 1, enten før (spor B) eller efter jodering (spor C) ble underkastet elektroforese (se fig. 6). Markører som ble benyttet inkluderte<35>S metionin merket serum albumin (68,000 d) og ovalbumin (45.000 d).

Eksempel 9: Konstruksjon av RK1- 4

Bam HI-PvuII-fragmentet fra plasmid PSV2DHFR (Subramani et al., "Mol. Cell. Biol." 1:854-864 (1981)) inneholdende SV40 tidlig region promoter nær musedihydrofolatreduktase (DHFR) genet, en SV40-forbedrer, det lille antigen intron og SV40 polyadenyleringssekvensen ble isolert (fragment A). De gjenværende fragmenter ble oppnådd fra vektor p91023(A)

(ovenfor) som følger: p91023(A) ble brutt ned med Pst I ved det eneste Pst I-setet nær adenoviruspromoteren for å linearisere plasmidet og enten ligert til syntetisk Pst I til EcoRI-konvertere og resirkularisert (for å oppnå setene Pst I

- EcoRl - Pst I på det opprinnelige Pst I-setet; 91023(B') eller behandlet med det store fragment av DNA polymerase I for å ødelegge Pst I-setene og ligert til en syntetisk EcoRl forbinder og resirkularisert for å danne et EcoRl-sete på det opprinnelige Pst I-setet; 91023(B). Hvert av de to resulterende plasmider 91023(B) og 91023(B') , ble nedbrutt med Xba og EcoRl for derved å gi to fragmenter F og G. Ved å forene fragment F fra p91023(B) og fragment G fra p91023(B') og fragment G fra p91023(B) og fragment F fra p91023(B') ble det dannet to nye plasmider som inneholdt enten et EcoRI-Pst I-sete eller et Pst I - EcoRl-sete på det opprinnelige

Pst I-setet. Plasmidet inneholdende Pst I - EcoRl-sete der Pst I-setet er nærmest den adenovirus sene hovedpromoter ble kalt p91023(C).

Vektoren p91023(C) ble brutt ned fullstendig med Whol og det resulterende lineariserte DNA med klebrige ender ble gjort stumpe ved en endefyllingsreaksjon med det store fragment av E. coli av DNA polymerase I. Til dette DNA ble det ligert et 340 bp Hind III - EcoRl-fragment inneholdende SV40 forbedreren fremstilt som følger: Hind III - Pvu II-fragment fra SV40 som inneholder SV40-opprinnelsen eller replikeringen og forbedreren ble skutt inn i plasmidet c lac (Little et al., "Mol. Biol. Med." 1:473-488

(1983). c lac-vektoren ble fremstilt ved nedbrytning av c lac DNA med BamHI, oppfylling av klebrige ender med det store fragment av DNA polymerase I og nedbrytning av DNA med Hind III. Det resulterende plasmid (c SVHPlac) regenererte BamHI-setet ved ligering til den Pvu II stumpe ende. EcoRl - Hind III-fragmentet ble fremstilt fra c SVHPlac og ligert til EcoRl - Hind III-fragmentet av PSVOd (Mellon et al., ovenfor) som inneholdt plasmidopprinnelsen av replikeringen og det resulterende plasmid pSVHPOd ble selektert. 340 bp EcoRIHind III-fragmentet fra PSVHPOd inneholdende SV40-opprin-nelse/forbedreren ble så preparert, gjort stumpe i begge ender med store fragmenter av DNA polymerase I og ligert til den Xhol nedbrutte, stumpgjorte p91023(c)-vektor som beskrevet ovenfor. Det resulterende plasmid (p91023(C)/Xho/- stump pluss EcoRI/Hind III/stump SV40 opprinnelig pluss forbedrer) hvori orienteringen av Hind III - EcoRI-fragmentet var slik at BamHI-setet i dette fragment var nærmest VA-genet, ble kalt pES105. Plasmidet PES105 ble brutt ned med Bam HI og PvuII og også med PvuII alene og BamHI - PvuII-fragmentet inneholdende den sene adenovirus hovedpromoter (fragment B) og PvuII fragmentet inneholdende plasmidet under resistensgenet (tetracyklinresistens) og andre sekvenser (fragment C) ble isolert. Fragmentene A, B og C ble ligert og det resulterende plasmid som vist i fig. 7 ble isolert og kalt RK1-4. Plasmidet RK1-4 er deponert ved ATCC og tilgjengelig under nummeret ATCC 39940.

Eksempel 10: Eksprimering av EPO i CHO- celler - metode I

20>jg DNA fra plasmid pPTFL13 som beskrevet ovenfor i eksempel 6 ble brutt ned med restriksjonsendonuklease Cia I for å

linearisere plasmidet og ble så ligert til Cia I-nedbrutt DNA

fra plasmid pAD26SVp(A) 1 (2pg) som inneholder en intakt dihydrofolat reduktase (DHFR) gen drevet av en sen adenovirus hovedpromoter (Kaufman and Sharp, "Mol. and Cell Biol." 2:1304-1319 (1982)). Dette ligerte DNA ble benyttet for å transfektere DHFR-negative CHO-celler (DUKX-BII, Chasin L.A.

and Urlaub G. (1980) "PNAS" 77 4216-4220) og efter dyrking i to dager ble celler som inneholdt minst et DHFR-gen selektert i a-media uten nukleotider og supplert med 10$ dialysert føtal storfeserum. Efter dyrking i to uker i selektive media ble kolonier fjernet fra de opprinnelige plater, slått

sammen i grupper på 10-100 kolonier pr. masse, replatert og ° dyrket til konfluens i a-media som mangler nukleotider.

Supernatantmedia fra masser dyrket før metotreksatseleksjon ble analysert for EPO ved RIA. Masser som viste positiv EPO-produksjon ble dyrket i nærvær av metotreksat (0,02 pM) og

så subklonet og analysert igjen. EPO Cia 4 4,02-7, en 5 enkelt subklonet fra EPO Cla4 4.02 massen, frigjorde 460 ng/ml EPO til media inneholdende 0,02 pM MTX (tabell 10). EPO Cia 4 4.02-7 er den cellebetegnelse som ble valgt for EPO-produksjon og er deponert ved ATCC under nummeret ATCC

CRL8695. I dag er denne klon underkastet trinnvis seleksjon i<!>° økende konsentrasjoner av MTX og vil antagelig gi celler som produserer ennu høyere nivåer av EPO. For masser som var negative ved RIA ble metotraksatresistente kolonier oppnådd fra motpartkulturene som ble dyrket 1 nærvær av metotreksat

(0,02 pM) igjen analysert i masser med henblikk på EPO ved 55 hjelp av RIA. De kulturer som Ikke var positive ble subklonet og underkastet dyrking i ytterligere økende konsentrasjoner av metotreksat.

Trinnvis metotraksat (MTX) seleksjon ble oppnådd ved gjentatte cykler av dyrking av cellene i nærvær av økende konsentrasjoner av metotreksat og selektering for over-levende. Ved hver runde ble EPO målt i kultursupernatanten ved hjelp av RIA og ved in vitro biologisk aktivitet.

Metotreksatnivåene som ble benyttet i hver trinnvise forsterkning var 0,02 pm, 0,1 pm henholdsvis 0,5 pm. Som vist i tabell 10 ble efter første rundes seleksjon i 0,02 pm MTX, signifikante nivåer av EPO frigitt til kulturmediet.

Eksempel 11: Eksprimering av EPO i CHO- celler - metode II

DNA fra klonen X HEP0FL13 ble nedbrutt med EcoRl og det lille RI-fragment inneholdende EPO-genet ble subklonet inn i EcoRI-setet i plasmid RK1-4, se eksempel 10. Dette DNA (RKFL13) ble så benyttet for å transfektere de DHFR-negative CHO celler direkte og uten nedbrytning og seleksjonen og forsterkningen ble gjennomført som beskrevet i eksempel 10 ovenfor.

Dette RKFL13 DNA ble også skutt inn i CHO-celler ved protoplastfusjon og mikroinjeksjon. Plasmid RKFL13 er deponert og tilgjengelig fra ATCC under nummeret ATCC 39989. Den foretrukne enkeltkoloniklon er deponert og tilgjengelig fra ATCC under nummeret ATCC CRL8695.

Eksempel 12: Eksprimering av EPO- genomisk klon i COS- 1 celler Vektoren som ble benyttet for eksprimering av den EPO-genomiske klon er pSVOD (Mellom et al., ovenfor). DNA fra pSVOD ble nedbrutt fullstendig med Hind III og gjort stump med det store fragment av DNA polymerase I. Den EPO-genomiske klon X-HEP03 ble brutt ned fullstendig med EcoRl og Hind III og et 4,0 kb fragment inneholdende EPO-gen ble isolert og gjort stump som ovenfor. Nukleotidsekvensen av dette fragment fra Hind III-setet til et område akkurat ut over polyadeny-leringssignalet er vist i fig. 4 og tabell 4. EPO-genefragmentet ble skutt inn i pSVOD-plasmidfragmentet og korrekt konstruerte rekombinanter i begge retninger ble isolert og verifisert. Plasmidet CZ2-1 hadde EPO-genet i orientering "a"

(det vil si med 5<*->enden av EPO nærmest SV40 opprinnelsen) og plasmidet CZ1-3 hadde motsatt orientering, orientering "b".

Plasmidene CZ1-3 og CZ2-1 ble transfektert til COS-1 celler som beskrevet i eksempel 7 og media ble høstet og analysert med henblikk på immunologisk reaktivt EPO. Omtrent 31 ng/ml EPO ble detektert i kultursupernatanten fra CZ2-1 og 16-31 ng/ml fra CZ1-3.

Genomiske kloner HEP01,' HEP02 og HEP06 kan skytes inn i COS celler for eksprimering på tilsvarende måte.

Eksempel 13: Eksprimering i C127- og 3T3- celler.

konstruksjon av pBVEPO

Et plasmid inneholdende EPO cDNA-sekvensen under den transkripsjonene kontroll av en muse-metallotionein-promoter og bundet til det totale storfepapillon virus DNA ble fremstilt som følger:

<p>EP049f

Plasmidet SP6/5 ble anskaffet fra Promega Biotec. Dette plasmid ble brutt ned fullstendig med EcoRl og 1340 bp EcoRl-fragmentet fra X-HEP0F13 ble skutt inn ved DNA-ligase. Et resulterende plasmid der 5'-enden av EPO-genet var nærmest SP6-promoteren (bestemt ved Bgll- og Hind III-nedbrytning)

ble kalt pEP049F. I denne orientering er BamHI-setet i PSP6/5-polybinderen direkte nær 5'-enden av EPO-genet.

pMMTneo BPV

Plasmidet pdBPV-MMTneo (342-12) (Law et al., "Mol. and Cell Ciol." 3:2110-2115 (1983), illustrert i fig. 8, ble brutt ned fullstendig med BamHI for å produsere to fragmenter, et stort fragment~8kb lengde inneholdende BPV-genomet og et mindre fragment, -6,5 kb i lengde, inneholdende pML2-opprinnelsen av replikering og ampicillinresistensgene, metallotioneinpromoteren, neomycinresistensgenet og SV40-polyadenylerings-signalet. Det nedbrutte DNA ble resirkularisert ved DNA-ligase og plasmider som inneholdt kun 6,8 kb-fragmentet ble identifisert ved EcoRl- og BamHI-restr iksjonsendonukleasened-brytning. Et slikt plasmid ble kalt pMMTneo BPV.

pEP015a

pMMTneo BPV ble brutt ned fullstendig med Bglll. pEP049f ble nedbrutt fullstendig med BamHI og Bglll og det ca. 700 bp store fragment inneholdende hele EPO-kodingsområdet ble

preparert ved gelisolering. Bglll-nedbrutt pMMTneo BPV og 700 bp BamHI/Bglll EPO-fragmentet ble ligert og resulterende plasmider inneholdende EPO cDNA ble identifisert ved koloni-hybridisering med en oligonukletid d(GGTCATCTGTCCCCTGTCC) som er spesifikt for EPO-genet. Et av plasmidene som var positivt ved hybridiseringsanalyse, et (pEP015a) som hadde EPO cDNA i orienteringen slik at 5'-enden av EPO cDNA var nærmest metallotioneinpromoteren, ble identifisert ved nedbrytning med EcoRl og Kpnl.

pBPV- EPO

Plasmidet pEP015A ble brutt ned fullstendig med BamHI for å linearisere plasmidet. Plasmidet pdBPV-MMTneo-(342-12 ) ble også brutt ned fullstendig med BamHI for å gi to fragmenter på 6,5 og 8kb. 8kb-f ragmentet som inneholdt hele storfe-Papillomvirusgenomet ble gelisolert. pEP015a/BamHI og 8kb BamHI-fragmentet ble ligert sammen og et plasmid (pBPV-EPO) som inneholdt BPV-fragmentet ble identifisert ved koloni-hybridisering ved bruk av en oligonukleotid probe d(P-CCACACCCGGTACACA-OH) som er spesifikk for BPV-genomet. Nedbrytning av pBPV-EPO DNA med Hind III antydet at retningen for transkripsjon av BPV-genomet var den samme som retningen for transkripsjon av metallotioneinpromoteren (som i pdBPV-mmtneo(342-12 ), se figur 8). Plasmidet pdBPV-MMTneo(342-12 ) er tilgjengelig fra ATCC under nummeret ATCC 37224.

Eksprimering

De følgende metoder ble brukt for å eksprimere EPO.

Metode I

DNA pBPV-EPO ble preparert og ca. 25 pg ble benyttet for å transfektere~lx IO<6>C127 (Lowy et al., "J. of Virol." 26:291-98 (1978)) CHO celler ved bruk av standard kalsium fosfat precipiteringsteknikker (Grahm et al., "Virology", 52:456-67 (1973)). Fem timer efter transfeksjon ble trans-feksjonsmediet fjernet, cellene glycerolavskrekket, vasket og friskt a-medium inneholdende 10$ føtal storfeserum tilsatt.

48 t. senere ble cellene trypsinisert og spaltet i et forhold på 1:10 idet DME-medium inneholdende 500 Yg/ml G418 (Southern et al., "Mol. Appl. Genet." 1:327-41 (1982)) og cellene ble inkubert i to-tre uker. G418-resistente kolonier ble så isolert individuelt til mikrotiterbrønner og dyrket inntil sub-konfluens i nærvær av G418. Cellene ble så vasket, friskt medium inneholdende 10$ føtal storfeserum tilsatt og mediet høstet 24 t. senere. De kondisjonerte media ble prøvet og viste seg å være positive for EPO ved radioimmunoanalyse og ved in vitro biologisk analyse.

Metode II

C127- eller 3T3 celler ble kotransfektert med 25>jg pBPV-EPO

og 2pg pSV2neo (Southern et al., ovenfor) som beskrevet i metode I. Dette er omtrent et 10 x molart overskudd av pBPV-EPO. Efter transfeksjon er prosedyren den samme som i metode

I.

Metode III

C127-celler ble transfektert med 30pg pBPV-EPO som beskrevet

1 metode I. Efter transfeksjon og splitting (1:10) ble friskt medium byttet ut hver tredje dag. Efter ca. 2 uker ble foci av BPV-transformerte celler synlig. Individuelle foci ble plukket separat til 1 cm brønner på en mikrotiterplate, dyrket til sub-konfluent monskikt og analysert på EPO-aktivi-

tet og antigenitet i det kondisjonerte medium.

Eksempel 14: Eksprimering i Insektceller.

konstruksjon av pIVEV EPQFL13

Plasmidvektoren pIVEV er deponert og tilgjengelig ved ATCC under nummeret ATCC 39991. Vektoren ble modifisert som følger:

<p>IVEVNI

pIVEV ble brutt ned med EcoRl for å linearisere plasmidet, gjort stumpt ved bruk av det store fragment av DNA polymerase I og en enkelt Notl-forbinder

ble skutt inn ved stumpendeligering. Det resulterende plasmid kalles pIVEVNI.

<p>lVEVSI

pIVEV ble brutt ned med Smal for å llnearisere plasmidet og en enkel Sfil-forbinder

ble skutt inn ved stumpendeligering. Det resulterende plasmid ble kalt pIVEVSI.

<p>IVEVSlBaK<p>

Plasmidet pIVEVSI ble brutt ned med Kpnl for å llnearisere plasmidet og omtrent 0 til 100 bp ble fjernet fra hver ende ved nedbrytning med den dobbelt-strengede eksonuklease Bal 31. Enhver resulterende ende som ikke var perferkt stump ble gjort stump ved bruk av det store fragment av DNA polymerase I og polyforbinderen

ble skutt inn ved stumpendeligering. Polyforbinderen ble skutt inn i begge retninger. Et plasmid hvori polyforbinderen er orientert slik at Bglll-setet i polyforbinderen er nærmest polyhedrongenepromoteren kan kalles pIVEVSIBgKp. Et plasmid hvori Kpnl-setet i polyforbinderen er nærmest polyhedrongenepromoteren kalles pIVEVSIKpBg. Antallet basepar som ble utelukket mellom det opprinnelige Kpnl sete i pIVEVSI og polyhedronpromoteren ble ikke bestemt. pIEIVSIBgKp er deponert og tilgjengelig ved ATCC under nummeret ATCC 39988.<p>IEVSIB<g>K<p>NI

pIEVSIBgKpNI ble brutt ned fullstendig med Kpnl og Pstl for å gi to fragmenter. Det største fragment som inneholdt plastmidoforbindelsen for replikering og 3'-enden av polyhedron genet ble preparert ved gelisolering (fragment A). pIVEVSIBgKp ble brutt ned fullstendig med Pstl og Kpn for å gi to fragmenter og det minste fragment som inneholdt polyhedrongenepromoteren og polyforbinderen ble preparert ved

gelisoleringer (fragment B). Fragmentene A og B ble forenet ved DNA ligase for å danne det nye plasmid pIVEVSIBgKpNl som inneholdt et partielt utelukket polyhedrongen hvori en polyforbinder var skutt inn og inneholdt også et Notl-sete (som erstattet det ødelagte EcoRl-sete) og et Sfil-sete som flankerte polyhedron-geneområdet.

<p>IVEPO

pIVEVSI BGKpNI ble brutt ned fullstendig med EcoRl for å linearisere plasmidet og 1340 bp EcoRI-fragmentet fra X-HEP0FL13 ble inskutt. Plasmider inneholdende EPO-genet i en orientering slik at 5'-enden av EPO-genet er nærmest polyhedronpromoteren og 3'-enden av polyhedron-genet ble identifisert ved nedbrytning med Bglll. Et av disse plasmider i den orientering som er beskrevet ovenfor ble betegnete pIVEPO.

Eksprimering av EPO i insektceller

Store mengder plVEPO-plasmid ble fremstilt ved transformering av E. coli stammen JM101-tgl. Plasmid-DNA ble isolert ved klaret lysatteknikk (Maniatis and Fritsch, "Cold Spring Harbor Manual") og renset ytterligere ved CsCl sentrifugering. Vill-type Autographa californlca polyhedrose virus (AcNPV) stamme L-l DNA ble fremstilt ved fenolekstrahering av viruspartikler og efterfølgende CsCl-rensing av dette viral-DNA.

Disse to DNAer ble så kotransf ektert inn i Podoptera fruigiperda celler IPLB-SF-21 (Vaughn et al., "In Vitro" Vol.

B, s. 213-17 (1977) ved bruk av kalsiumfosfattransfeksjons-prosedyren (Potter and Miller, 1977). For hver plate av celler som ble kotransf ektert ble det benyttet 1 pg vill-type- AcNPV DNA og 10 pg pIVEPO. Platene ble inkubert ved 27°C i 5 dager. Supernatanten ble så høstet og EPO-eksprimering i supernatanten blir bekreftet ved radioimmunoanalyse og ved in vitro biologisk analyse.

Eksempel 15: Rensing av EPO

COS-cellekondisjonerte media (121) med EPO-konsentrasjoner opp til 200 >jg/liter ble konsentrert til 600ml ved bruk av ultrafiltreringsmembraner med molekylvekt 10.000 sperre-grense, for eksempel et Millipore Pellican utstyrt med 5 kvadratfot membran. Analyser ble gjennomført ved RIA som beskrevet i eksempel 6. Retentatet fra ultrafiltrering ble diafUtrert mot 4ml lOmM natriumfosfat, buffret til pH7,0. Konsentratet og diafiltrert kondisjoneringsmedium inneholdt 2,5 mg EPO i 380 mg totalt protein. EPO oppløsningen ble ytterligere konsentrert til 186 ml og precipiterte proteiner ble fjernet ved sentrifugering ved 110.000 x g i 30 minutter.

Supernatanten som inneholdt 2,0 mg EPO ble justert til pH5,5 med 50$ eddiksyre, tillatt omrøring ved 4°C i 30 minutter og precipitatet fjernet ved sentrifugering ved 13.000 x g i 30 minutter.

Karbonylsefarosekromatograf i

Supernatanten fra centrifugeringen, 20 ml, inneholdende 200 pg EPO (24 mg totalt protein) ble bragt på en kolonne pakket med 20 ml CM-sefarose ekvilibrert i 10 mM natriumacetat pH 5,5, vasket med 40ml av den samme buffer. EPO som bandt til CM-sefarosen ble eluert med en lOOml gradient av NaU(O-l) i 10 mM natriumfosfat pH 5,5.Fraksjonene inneholdende EPO (tilsammen 50 jag i 2 mg totale proteiner) ble slått sammen og konsentrert til 2 ml ved bruk av Amicon YM10 ultraf iltrer-ing smemb r an .

Reversefase- HPLC

De konsentrerte fraksjoner fra CM-sefarose inneholdende EPO ble ytterligere renset ved reversfase-HPLC ved bruk av Vydac C-4 kolonne. EPO ble ført på kolonnen, ekvibilert i 10$ oppløsningsmiddel B (oppløsningsmiddel A var 0,1$ CF3CO2H i vann; oppløsningsmiddel B var 0,1$ CF3C02H i CF3CN) i en strømningshastighet på lml/min. Kolonnen ble vasket med 10$B i to minutter og EPO ble eluert med en lineær gradient av B

(10-70$ 1 60 minutter). Fraksjonene inneholdende EPO ble slått sammen (~40jjg EPO i 120>jg totale proteiner) og lyofilisert. Det lyofiliserte EPO ble rekonstituert i 0, IM tris-HCl ved pH 7,5 inneholdende 0,15 M NaCl og rekromato-grafert på reversfase HPLC. Fraksjonene inneholdende EPO ble slått sammen og analysert ved SDS-polyakrylamid (10$) gelelektroforese (Lamell, U.K., "Nature"). De sammenslåtte fraksjoner av EPO inneholdt 15,5 >ig EPO i 25 jjg totale proteiner.

REFERANSER

1) Jacobson, L. 0., Goldwasser, E. Fried, W., and Plzak, L. F./ frrans. Assoc. Am. Physicians"TO:305-317 (1957). 2) Krantz, S. B. and Jacobson, L. 0. ■i Chicago: University of Chicago Press"1970, pp. 29-31. 3) Hammond, D and Winnick, S. Ann. N. Y. Acad. Sei. 230:219-227 (1974). 4) Sherwood, J. B. and Goldwasser, E.." Endocrinology" 103:866-870 (1978). 5) Fried, W."Blood"40:671-677 (1972).

6) Fisher, J." J. Lab, and Clin. Med."93:695-699 (1979).

7) Naughton, B. A., Kaplan, S. M., Roy, M., Burdowski, A. J.,

Gordon, A. S., and Piliero, S. J." Science"196:301-302. 8) Lucarelli, G. P., Howard, D., and Stohlman, F., Jr. J. " Clin. Invest"43:2195-2203 (1964). 9) Zanjani, E. D., Poster, J., Burlington, H., Mann, L. I., and Wasserman, L. R." j. Lab. Clin. Med." 89:640-644

(1977). 10) Krantz, S. B., Gallien-Lartigue, 0., and Goldwasser, E. " J. Biol Chem." 238:4085-4090 (1963). 11) Dunn, C. D., Jarvis, J. H. and Greenman, J. M." Exp.

Hematol." 3:65-78 (1975).

12) Krystal, G." exp. Hematol."11:649-660 (1983)

13) Iscove, N.N. and Guilbert, L.J., M.J. Murphy, Jr. (Ed.)

New York fSpringer- Verlagl' pp. 3-7 (1978).

14) Goldwasser, E.." ICN UCLA Symposium,"Control of Cellular Division and Development, A. R. Liss, Inc., pp. 487-494 (1981) 15) Cline, M. J. and Golde, D. W." Nature" 277:177-181 (1979) 16) Metcalf, D., Johnson, G. R., and Burgess, A. W." Blood" 55:138- (1980) 17) Krane, N." Henrv Ford Hosp. Med. J." 31:177-181 (1983) 18) Eschbach, J., Madenovic, J., Garcia, J., Wahl, P., and Adamson, J." J. Clin. Invest." 74;434-441 (1984) 19) Anagnostou, A., Barone, J., Vedo, A., and Fried, W." Br. J. Hematol"37:85-91 (1977) 20) Miyake, T., Kung, C., and Goldwasser, E. ii J. Biol. Chem.<ii>252:5558-5564 (1977) 21) Yanagawa, S., Hirade, K. , Ohnota, H. , Sasaki, R., Chiba, H. , Veda, M., and Goto, M. J. Biol. Chem. 259:2707-2710 (1984) 22) Lawn, R. M., Fritsch, E. F., Parker, R. C, Blake, G., and Maniatis, T."Cell"15:1157 - (1978) 23) Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R." Proc. Nat' l.

Acad. Sei.. U. S. A." 74:5463- (1977)

24) Zanjanc, E.D., Ascensao, J.L., McGlave, P.B., Banisadre, M., and Ash, R. C." J. Clin. Invest."67:1183- (1981) 25) Toole, J.J., Knopf, J.L., Wozney, J.M., Sultzman, L.A. Buecker, J. L. , Pittman, D. D. , Kaufman, R. J. , Brown, E., Shoemaker, C, Orr, E. C, Amphlett, G. W., Foster, W. B. , Coe, M. L., Knutson, G. J., Fass, D. N., and Hewick, R. M." Nature in Press" 26) Goldwasser, E."Blood"Supp1. 1, 58, xlii (abstr) (1981) 27) Sue, J. M. and Sytkowdki, A. J." Proc. Nat' l Acad. Sei

U. S. A."80:3651-3655 (1983)

29) Bersch, N. and Golde, D.W.." ln Vitro Aspects of Ervthro-poiesis," M. J. Murphy (Ed.) New York: Sprinoer- Verlag

(1978)30) Cotes, P. M. and Bangham, D. R." Nature" 191:1065- (1961)31) Goldwasser, E. and Gross, M." Methods in Enzymol" 37:109-121 (1975) 32) Nabeshima, Y. -i, Fujii-Kuriyama, Y., Muramatsu, M., and Ogata, K." Nature" 308:3 33-33 8 (1984) 33) Young, R. A., Hagencuhle, O. and Schibler, U." Cell" 23:451-558 (1981) 34) Medford, R. M., Nguyen, H. T., Destree, A. T., Summers,

E. and Nadal-Ginard, B."Cell"38:409-421 (1984)

35) Ziff, E. B."Nature"287:491-499 (1980) 36) Early, P."Cell"20:313-319 (1980) 37) Sytkowski, A." Bio. Bio<p.>Res. Comm."96:143-149 (1980) 38) Murphy, M. and Miyake, T." Acta. Haematol. Jpn." 46:1380-1396 (1983) 39) Wagh, P. V. and Bahl, O. P." CRC Critical Reviews in

Biochemistrv" 307-377 (1981)

40) Wang, F. F., Kung, C. K. -H. and Goldwasser. E." Fed. Proe.

Fed. Am. Soc. Exp. Biol." 42:1872 (abstr) (1983)

41) Lowy, P., Keighley, G. and Borsook, H. n Nature"185:102-103

(1960)

42) VanLenten, L. andAshwell, G." J. Biol. Chem."247 : 4633-4640

(1972)

43) Lee-Huang, S." Proc. Nat' 1 Acad. Sei. U. S. A." 81:2708-2712

(1984) 44) Fyhrquist, F., Rosenlof, K. , Gronhagen-Riska, C. , Hortling, L. and Tikkanen, I."Nature"308:649-562 (1984) 45) Ohkubo, H., Kageyama, R., Vjihara, M., Hirose, T. , Inayama, S., and Nakanishi, S." Proe. Nat' l Acad. Sei. UiS^Aj' 80:2196-2200 (1983) 46) Suggs, S.V., Wallace, R. B., Hirose, T., Kawashima, E. H. and Itakura, K." Proc. Nat' 1. Acad. Sei. U. S. A.-1' 78:6613-6617 (1981) 47) Woo, S. L. C, Dugaiczyk, A., Tsai, M. -J., Lai, E. C. , Catterall, J. F. and 0'Malley, B. W. " Proe. Nat' 1.-Acad. Sei. U. S. A." 75:3688- (1978) 48) Melchior, W. B. and VonHippel, P. H." Proc. Nat' 1 Acad.

Soc. U. S. A."70:298-302 (1973)

49) Orosz, J. M. and Wetmis, J. G." Biopolvmers" 16:1183-1199

(1977) 50) Anderson, S and Kingston, I. B." Proc. Nat' 1 Acad. Sci.-U. S. A."80:6836-6842 (1983)51) Ullrich, A., Coussens, L., Hayflick, J. S. Dull, T. J., Gray, A., Tam, A. W., Lee, J., Yarden, Y., Libermann, T. A., Schlessinger, J., Downward, J., Mayes, E. L. V. , Whittle, H. , Waterfield, M.D. and Seeburg, p. H." Nature" 309: 418-425 (1984) 52) Fisher, J." Proc. Soc. Ex<p>tl. Biol, and Med." 173:289-305

(1983)

53) Kozak, M." Nuc. Acid Res." 12:857-872 (1984)

54) Benton, W.D. and Davis, R.W." Science" 196:180-182 (1977) 55) Sherwood, J.B. and Goldwasser, E. "Blood"54:885-893 (1979) 56) Derman, E., Krauter, K., Walling, L., Weinberger, C, Ray, M., and Darnell, J. T.,"Cell" 23:731- (1981) 57) Gluzman, Y. ,» Cell» 23 :175-182 (1981) 58) Hewick, R. M. , Hunkapiller, M. E., Hood, L. E., and

Dreyer, W. J." J. Biol. Chem." 256:7990-7997 (1981)

59) Towbin, H., Stachelin, T., and Gordon, J.," Proc. Nat' 1

Acad. Sei."76:4380- (1979)

60) Carnott, P., DeFlandre, C. " C. R. Acad. Sei. Paris"l43:432-(1960)

3

5

Claims (9)

1. Genomisk DNA-molekyl som koder human erytropoietin,karakterisert vedat det omfatter nukleotid-sekvensen som angitt i tabell 4 fra ATG-sekvensen som koder den initiale Met gjennom AGA som koder den terminale Arg.

2. cDNA-molekyl som koder human-erytropoietin,karakterisert vedat det omfatter nukleotid-sekvensen som angitt i tabell 3 fra GCC-kodonet som koder en Ala gjennom AGA-kodonet som koder 166 Arg.

3. cDNA-molekyl ifølge krav 2,karakterisertved at det videre omfatter en DNA-sekvens som koder aminosyre-ledersekvensen som angitt i tabell 3 fra Met-27 Gly til Leu 94.

4 . Mikro-organisme eller cellelinje,karakterisert vedat den inneholder DNA-molekylet ifølge krav 1 eller 2, operativt bundet til en ekspresjonskontroll-sekvens i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA, hvorpå DNA-molekylet uttrykkes i nevnte mikroorganisme eller cellelinje.

5 . Mikro-organisme eller cellelinje ifølge krav 4,karakterisert vedat den omfatter en vektor inneholdende bovin-papillomvirus-DNA og DNA-molekylet ifølge krav 1 eller 2.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av human-erytropoietin,karakterisert vedat den omfatter dyrking, i et egnet medium, av en mammal vertscelle inneholdende en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2, operativt forbundet til en ekspresjonskontroll-sekvens i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA-sekvens, og separering av det således fremstilte erytropoietin fra cellene og medium.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisertved at vertscellene er Kina-hamster-ovarie (CHO)-celler.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisertved at cellene er C127- eller 3T3-celler.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisertved at vertscellene omfatter en mikroorganisme ifølge krav 5.