JPH01257480A - エリトロポエチンをコードするｄｎａ配列、組換えｄｎａベクター及び形質転換体 - Google Patents

エリトロポエチンをコードするｄｎａ配列、組換えｄｎａベクター及び形質転換体

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JPH01257480A
JPH01257480A JP63065591A JP6559188A JPH01257480A JP H01257480 A JPH01257480 A JP H01257480A JP 63065591 A JP63065591 A JP 63065591A JP 6559188 A JP6559188 A JP 6559188A JP H01257480 A JPH01257480 A JP H01257480A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は驚くほど高い発現レベルを示すヒトエリトロポ
エチンのクローン化遺伝子、その組換えＤＮＡベクター
、および数組換えベクターで哺乳動物細胞を形質転換さ
せて得られる形質転換体に関するものである。
発明の背景 エリトロポエチン（以後ＥＰＯと略す）は高等動物にお
ける赤血球の形成を促進する循環系中の糖タンパク質で
ある。例えば、カルノー（Ｃａｒｎｏｔ）らのＣｏｍｐ
ｔ、　Ｒｅｎｄ、、　１４３　：　３８４　（１９０６
）を参照されたい。それゆえ、ＥＰＯは赤血球形成促進
因子とも呼ばれている。
ヒト赤血球の寿命は約１２０日間である。従って、全赤
血球の約１／１２０は細網内皮系で毎日破壊される。同
時に、比較的一定数の赤血球が常時赤血球レベルを維持
するために毎日生産される〔ガイトン（Ｇｕｙｔｏｎ）
のＴｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　ＭｅｄｉｃａｌＰｈｙｓｌ
ｏｌｏｇｙ、ｐ、５Ｂ−６０，Ｗ、　Ｂ、　５ａｕｎｄ
ｅｒｓ　Ｃｏ、、フィラデルフィア（１９７６）を参照
〕。
赤血球は骨髄中で赤芽球の成熟および分化により生産さ
れ、ＥＰＯは未分化の前駆細胞に作用してそれらの細胞
の赤血球への分化を誘起する因子である（ガイトンの上
記文献参照）。
ＥＰＯは貧血、特に腎性貧血の臨床治療のための有望な
治療薬剤である。しかしあいに＜　ＥＰＯは、治療剤と
して使用するのに必要な十分量を入手することが容易で
ないため実際上の医療面において未だ普及していない。
ＥＰＯを治療薬剤として使用するためには、抗原性の問
題を考慮しなければならないだろう。
従って、ＥＰＯはヒト由来の原料から生産されるのが好
ましい。例えば、再生不良性貧血または同様の症状をも
つ患者（大量のＥＰＯを排出する）からの血液もしくは
尿が使用できる。例えば、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）らの
Ｒｃｃ、　Ｐｒｏｇｒ、　Ｈｏｒｍ、　Ｒｅｓ、＋１６
　：　２１９　（１９６０）　；エスパダ（Ｅｓｐａｄ
ａ）らのＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｍａｄ、、　３　：　４７
５　（１９７０）　；フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）の
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｒｅｖ、、　２４　：　４５９
　（１９７２）　；およびゴートン（Ｇｏｒｄｏｎ）の
Ｖｉｔａｍ、　Ｈｏｒｍ、　（Ｎ、Ｙ、）３１　：　１
０５　（１９７３）を参照されたい（これらの文献の記
載内容は明細書の一部として引用される）。
上記のとおり、ＥＰＯは一般に高いＥＰＯレベルを示す
患者（例えば、再生不良性貧血や同様の症状をもつ患者
）からの尿を濃縮および精製することにより製造される
。例えば、米国特許第４３９７８４０号；同第−４３０
３６５０号；および同第３８６５８０１号の各明細書を
参照されたい（これらの特許の記載内容は明細書の一部
として引用される）。しかしながら、この種の尿の供給
量は限られているため、ＥＰＯの実際上の使用は制限さ
れている。このため、健康なヒトの尿からもＥＰＯ産物
を得ることが非常に望ましい。しかしながら、健康なヒ
トから採取した尿を使用する際の１つの問題点は、その
ＥＰＯ含有量が貧血患者の尿と比較して低いということ
である。さらに、健康なヒトの尿は赤血球形成に対して
作用するいくつかの阻害因子を相当に高濃度で含んでい
るために、満足のゆく治療効果を得るには高度精製後に
得られるＥＰＯを使用しなければならないと考えられる
。
ＥＰＯはヒツジの血漿から回収することもでき、この種
の血漿からＥＰＯを分離して満足すべき効力を有し、安
定な水溶性製剤が得られる。ゴールドバッサ−（Ｇｏｌ
ｄｗａｓｓｅｒ）のＣｏｎｔｒｏｌ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ
Ｄｉｆ、　Ｄｅｖｅｌｏｐ、、　　パートＡ　　；　ｐ
、４８７−４９４．　ＡｌａｎＲ，Ｌｌｓｓ、　ＩｆＨ
ｌ：、＋−ニーヨーク　（１９８１）を参照されたい（
各々の文献については明細書の一部として引用される）
。しかしながら、ヒツジＥＰＯはヒトに対して抗原性が
あると予測される。
以上に述べたとおり、ＥＰＯは有望な治療薬剤であるに
もかかわらず、天然供給源から通常の単離／精製技術で
大量生産することは困難である。
スギモト（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ）らの米国特許第４３７７
５１３号明細書は、Ｎａｍａｌｗａ、　ＢＡＬＬ−１，
ＮＡＬＬ−１，ＴＡＬＬ−１およびＪＢＬを含めたヒト
リンパ芽球細胞のｉｎ　ｖｉｖ。
増殖操作によるＥＰＯの大量生産方法を開示している。
その他にも遺伝子工学技術を用いるＥＰＯの生産に関す
る報告がなされている（例えば、本出願の優先８後に国
際公開されたＷ　Ｏ８５１０２８１０号およびＷ　Ｏ８
５／　０３０７９号を参照）。しかし、その生産技術の
詳細や、その生産物の化学的性質は未だに発表されてい
ない。これとは対照的に、本発明はヒトＥＰＯの生物学
的性質を有するタンパク質の大量生産を可能にする方法
を提供するものである。また、本発明の方法により、天
然のヒトＥＰＯと化学的に異なるかも知れないが類似の
（場合によっては改良された）性質を示すタンパク質を
生産することも可能となる。便宜上、ヒトＥＰＯの生物
学的性質を示すこの種のタンパク質は、ヒトＥＰＯと化
学的に完全同一でないものも含めて、本明細書中で以後
ＥＰＯと総称する。
発明の概要 本発明は驚くほど高いレベルのヒトＥＰＯを発現する遺
伝子のクローニング、その発現組換えＤＮＡベクターお
よび数組換えＤＮＡベクターで形質転換させて、活性ヒ
トＥＰＯをｔｎ　ｖｔｔｒｏで大口に生産できる形質転
換体に関する。
以下でより詳細に説明するように、本発明者らは先ず、
再生不良性貧血患者の尿より部分精製された形で得られ
たＥＰＯを均一になるまでさらに精製し、トリプシンで
消化して特定のフラグメントを得た。これらのフラグメ
ントを精製してそのアミノ酸配列を決定した。これらの
配列に基づいてＥＰＯオリゴヌクレオチドを推定し、そ
して合成した。合成したオリゴヌクレオチドを使用して
ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングし、そのライ
ブラリーからＥＰＯ遺伝子を単離した。
単離されたものがＥＰＯＪ伝子であることは、アミノ酸
配列が決定された上記トリプシン消化タンパク質フラグ
メントの多くに対応する事実に基づいて証明された。さ
らに、単離された上記ゲノムクローンの一断片を使用し
て、ハイブリダイゼーション法によりヒト胎児（２０週
１）ｍＲＮＡ中のＥＰＯｍＲＮＡを単離し、ヒト胎児肝
臓ｃＤＮＡライブラリーを作成して、ゲノムクローンの
一断片から作成されたプローブでスクリーニングした。
７５０，０００以上の組換え体をスクリーニングした後
に３個のＥＰＯｃＤＮＡクローンが得られた。これらの
クローンのうち２つが、完全なコーディング配列および
実質的な５−プライムおよび３−プライム非翻訳配列を
持つことから、全長のＥＰＯｃＤＮＡであると決定され
た。これらのｃＤＮＡはＳ　Ｖ　−４０ウイルス由来の
ベクターに挿入し、このベクターで形質転換したサル細
胞（ＣＯ８−１細胞株；グラズマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）
、　Ｃｅ１ｌ　２３　：　１７５−１８２　（１９８１
）を参照〕およびチャイニーズハムスター卵巣細胞〔Ｃ
ＨＯ細胞株；アーラウプ（Ｕｒｌａｕｂ、　Ｇ、）およ
びカーシン（Ｃｈａｓｌｎ、　Ｌ、　Ａ、）のＰｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。
ＵＳＡ　７７　：　４２１Ｂ−４２８０（１９８０）を
参照〕の両細胞内で発現させた。ＣＯ８細胞から生産さ
れたＥＰＯおよびＣＨＯ細胞から生産されたＥＰＯは共
に１ｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏにおいて生物
学的に活性なＥＰＯである。
クローン化されたＥＰＯｃＤＮＡは第３表に示すように
コーディング領域の２０〜３０ヌクレオチド上流にイニ
シエーターおよびターミネータ−を有する１４〜１５ア
ミノ酸の興味あるオープン・リーディング・フレームを
有する。クローン化ＥＰＯｃＤＮＡでトランスフェクシ
ョンされた代表的な大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｌ）サンプルは
、メリーランド川口・ツクビルのアメリカン・タイプ拳
カルチャ一番コレクションに寄託され、寄託番号ＡＴＣ
Ｃ４０１５３のもとに入手可能である。
表の説明 第１表はヒトＥＰＯ遺伝子中の８７塩基対からなるエク
ソン部分の塩基配列を示すものであり；第２表はヒトＥ
ＰＯｃＤＮＡのクロニンの一つラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１
３のヌクレオチド配列から推定されたＥＰＯタンパク質
のアミノ酸配列を示し； 第３表はラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３中のＥＰＯｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列およびそれから推定される第２表の
ものと同じアミノ酸配列を示し；第４表は第４図に示す
ＥＰＯ遺伝子のｇＤＮＡ配列を示し； 第５表はヒトＥＰＯｃＤＮＡクローン、ラムダ−ＨＥＰ
ＯＦＬ６中のＥＰＯｃＤＮＡのヌクレオチド配列とそれ
から推定されるアミノ酸配列を示し； 第６表はヒトＥＰＯｃＤＮＡクローン、ラムダ−ＨＥＰ
ＯＦＬ８中のＥＰＯｃＤＮＡのヌクレオチド配列とそれ
から推定されるアミノ酸配列を示し； 第７表は第３表と同じもので、ヒトＥＰＯｃＤＮＡクロ
ーン、ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３中のＥＰＯｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
詳細な説明 本発明はヒトＥＰＯｃＤＮＡのクローニングおよびその
ｃＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現によるＥＰＯの生産に
使用する組換えＤＮＡベクターおよびその形質転換体に
関する。
ヒトＥＰＯｃＤＮＡは、次のようにして得ることが可能
である。なお、明細書中で使用する（１〉から（１７）
の数字は、本明細書の終わりに番号順に掲載した刊行物
を意味する。
ヒトＥＰＯのゲノムクローンの単離 先ずヒトＥＰＯを以下で説明するように再生不良性貧血
に悩む患者の尿等の材料から均一に精製する。この精製
ＥＰＯをタンパク質分解酵素トリプシンで完全消化して
フラグメントを得、これらのフラグメントを逆相高速液
体クロマトグラフィーで分離し、勾配画分から回収し、
そして微量アミノ酸配列分析法にかける。この分析によ
り決定される各トリプシン消化フラグメントのアミノ酸
配列は、例えば第２表および第３表において下線が施さ
れた部分に相当する。これらのうち、適当なフラグメン
ト、好ましくはＶａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｃ−Ｔｙｒ−Ａｌ
ａ−Ｔｒｐ−ＬｙｓおよびＶａｉＴｙｒ−５ｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｐｈａ−Ｌａｕ−Ａｒｇを選んで、その配列に対応
するオリゴヌクレオチドプローブを合成する。前者のト
リプシン消化フラグメントからは１７ヌクレオチド長の
３２種類のオリゴヌクレオチドプールと１８ヌクレオチ
ド長の１２８種類のオリゴヌクレオチドプール、および
後者のトリプシン消化フラグメントからは各々１４ヌク
レオチド長の４８種類の２つのプールがそれぞれ得られ
る。これらのうちから、３２種類の１７オリゴヌクレオ
チド（以下ｍａｒと略す）プールを使用してＣｈａｒｏ
ｎ　４Ａ　　（Ｃｈ４Ａ）ベクター（３）中のヒトゲノ
ムＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。なお、ス
クリーニングはウー（Ｗｏｏ）およびオマレー（０°Ｍ
ａｌ　Ｉｅｙ）のｉｎ　５１ｔｕ増幅法（１１）の変法
を使用できる。スクリーニング用のフィルター調製その
他の詳細は、実施例１で詳述する。
１７ｍａｒとハイブリダイズするファージを採取し、小
グループ別にプールし、そしてプローブとじて１４ｍｅ
ｒおよび１８ｍｅｒプールを使用してさらに検索する。
１７ｍｅｒおよび１４ｍｅｒプールとハイブリダイズす
るファージをプラーク精製し、精製ファージの塩基フラ
グメントをＭ１３ファージベクター中にサブクローニン
グして、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）およびクールソン（
Ｃｏｕｌｓｏｎ）のジデオキシ・チエイン・ターミネー
ション法（４）　（１９７７）により塩基配列を決定す
る。本発明者らが得た一つのクローン中の、３２種類の
１７ｍａｒとハイブリダイズする領域の塩基配列を第１
表に示す。このＤＮＡ配列は、オープン・リーディング
・フレーム内に１７ａ＋ｅｒプールのオリゴヌクレオチ
ドを推論するのに使用したトリプシン消化フラグメント
を正確にコードしうるヌクレオチドを含んでいた。さら
に、分析結果はこのＤＮＡ配列は、１７ｍａｒとハイブ
リダイズする領域がスプライス受容部位と供与部位（夫
々第１表中、ａおよびｄで示される）によって境界され
る８７ｂｐのエクソン内に含まれることを示した。
ＥＰＯｃＤＮＡクローンの単離 次に、上記で得られたＥＰＯのゲノムＤＮＡをプローブ
として、適当なヒトｃＤＮＡライブラリーからＥＰＯｃ
ＤＮＡを単離する。本発明者らの研究によれば、胎児肝
臓ｍＲＮＡから作られたヒトｃＤＮＡライブラリーがこ
の目的に最適であった。即ち、本発明者らは、第１表に
示す８７ｂｐ工クソン部分を含む前記Ｍ１３クローンか
ら９５ヌクレオチド−本鎖を調製し、これをプローブと
して用いて、ヒト胎児（２０週１）肝臓ｍＲＮＡのノー
ザン分析（１５）を行った。第１図に示すように、強い
シグナルが胎児肝臓ｍＲＮＡ中に検出された。そこで同
じプローブを使って胎児肝臓ｍＲＮＡからバクテリオフ
ァージラムダ中に作られたｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングしたところ（５）、スクリーニングした２５
０．０００個の組換え体当たり約１個の陽性クローンの
頻度で、数個のハイブリダイズするクローンが得られた
。これらのｃＤＮＡクローン（ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１
３およびラムダ−ＨＥＰＯＦＬ８と命名した）の完全な
ヌクレオチド配列およびそれから推定されたアミノ酸配
列を第３表と第６表に示す。ＥＰＯコーディング情報は
非常に疎水性の２７個のアミノ酸からなるリーダ一部分
と１６６個のアミノ酸からなるマチュア部分を含むｃＤ
ＮＡの５−プライム側半分の５９４ヌクレオチド内に含
まれる。なお、マチュアタンパク質のＮ末端の推定は、
ゴールドバッサ−（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ）　（６）　
、スー（Ｓｕｅ）およびシトコツスキ−（Ｓｙｔｋｏｗ
ｓｋｉ）　（７）、およびヤナガワ（Ｙａｎａｇａｗａ
）　（２）により発表された結果、または本発明者らが
別に決定した再生不良性貧血患者の尿中に排泄されたタ
ンパク質のＮ末端配列に基づいた。このＮ末端（Ａｌａ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ・・・）が循環中のＥＰＯに
見られる実際のＮ末端であるのかどうか、または腎臓や
尿中でい（つかの切断が起こるのかどうか今のところ不
明である。
第２表および第３表で下線を施したアミノ酸配列は、タ
ンパク質配列情報が得られたトリプシン消化フラグメン
トまたはＮ末端の部分を示す。りローン化されたｃＤＮ
Ａ配列から推定されたアミノ酸配列は、アミノ酸配列が
決定されたトリプシン消化フラグメントと正確に一致し
、単離されたｃＤＮＡはヒトＥＰＯをコードすることが
確かめられた。
ヒトＥＰＯ遺伝子の構造および塩基配列Ｃｈ４Ａベクタ
ー（３）に組込まれたヒトゲノムＤＮＡライブラリーを
作製し、先に得られた２種類のＥＰＯｃＤＮＡクローン
から調製されたオリゴヌクレオチドプローブ及び他の種
々のプローブを用いてハイブリダイゼーション分析を行
った。
この分析により４個の独立したヒトＥＰＯゲノムクロー
ン（ｇＤＮＡ）を得、またこれらクローンのＤＮＡ挿入
物の１目対位置を確認して第３図に示した。第３図に黒
い線で示される約３Ｊｋｂ領域内にＥＰＯ遺伝子が存在
することが示されている。
この領域の完全な塩基配列分析（参考例１を参照）およ
びｃＤＮＡクローンとの比較から、第４図に示されるＥ
ＰＯ遺伝子のイントロンおよびエクソン構造の地図を描
くことができた。ＥＰＯ遺伝子は５個のエクソンに分割
される。エクソン■の一部、エクソン■、■および■の
全部、およびエクソンＶの一部がタンパク質コーディン
グ情報を含む。エクソン■およびＶの残部はそれぞれ５
−プライムおよび３−プライム非翻訳配列をコードする
。
こうして得られるクローン（本明細書中ではラムダ−Ｈ
ＥＰＯＩおよびラムダ−ＨＥＰＯ２と呼ぶ２つのクロー
ンが得られた）が完全なＥＰＯゲノムクローンであると
いうことは、他のトリプシン消化フラグメントのコーデ
ィング情報を含んだ別のエクソンの塩基配列を決定する
ことにより確認できた。
ＣＯ８細胞によるＥＰＯの発現 本発明は、単離されたＥＰＯｃＤＮＡを含む組換えＤＮ
Ａベクターを調製しそれを用いて哺乳動物細胞を形質転
換させ、そして活性なＥＰＯを生産する方法も提供する
。得られたｃＤＮＡが生物学的に活性なＥＰＯをｉｎ　
ｖｉｔｒｏ細胞培養系において発現し得ることを確認す
るためには、Ｇ　ｌ　ｕｚｍａｎの方法でＣＯ８細胞の
形質発現実験を行う（１６）。この試験的発現に使用可
能なベクターｐ９１０２３　（Ｂ）は実施例４に示され
る。このベクターはアデノウィルス主要後期プロモータ
ー（ｍａｊｏｒ　１ａｔｅ　ｐｒｏｃｏｔｅｒ）、ＳＶ
４０ポリＡ付加配列、ＳＶ４０複製開始点、ＳＶ４０エ
ンハンサ−１およびアデノウィルスＶＡ遺伝子を含む。
前記ｃ　ＤＮＡクローン、例えばラムダ−ＨＥＰＯＦＬ
１３（第７表を参照）中のｃＤＮＡ挿入物をｐ９１０２
３　（Ｂ）ベクター内のアデノウィルス主要後期プロモ
ーターの下に連結挿入する。本発明者らは、このように
して得られた新しいベクターをｐＰＴＦＬ１３と命名し
た。
こうして構築されたベクターで、例えばＣＯ８−１細胞
のＭｏ株〔ホロビッツ（Ｈｏｒｏｗｌ　ｔｚ）らのＪ、
　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｃｎｃｔ、２　：　１４７
−１４９　（１９８３）を参照〕をトランスフェクショ
ンし、約２４時間後に細胞を洗浄し、無血清培地に変え
、そして約４８時間後に培養上清を集める。そして、培
養上清中に放出されたＥＰＯの■をＥＰＯに関するＳｈ
ｃｒｗｏｏｄ、　Ｊ、　Ｂ、らの定量的ラジオイムノア
ッセイを用いて試験する（１４）。この方法によれば、
第８表（実施例５）に示すように、免疫学的に反応性を
有するＥＰＯの発現が検出される。生産されたＥＰＯの
生物学的活性も試験できる。例えば、本発明者らは培地
中のＥＰＯを２つのｉｎ　ｖｉｔｒｏバイオアッセイ（
３Ｈ−チミジンおよびＣＦＵ−Ｅ（１，８））および２
つのＩｎ　ｖｉｖｏアッセイ〔低酸素性マウスおよび飢
餓ラット（９，１０）　）により定量化した（実施例６
の第９表を参照）。これらの結果は、生物学的に活性な
ＥＰＯがＣＯＳ　−１細胞で生産されることを示してい
る。
本発明の方法で生産されたＥＰＯがヒト尿から得られた
天然ＥＰＯと同じものであることは、ポリクローナル抗
ＥＰＯ抗体を使用するウェスターンブロッティング（Ｗ
ｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により、５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル上で同じ移動度を有していること
から証明された（実施例７を参照）。従って、Ｃ０８−
１細胞で生産されたＥＰＯのグリコジル化の程度は天然
ＥＰＯのそれと同様でありうる。
本発明はまた、ヒトＥＰＯｃＤＮＡの発現のために特に
好適な、他のプロモーターを含む異なるベクターを使用
した、極めて効率的なＥＰＯの生産法も開示する。その
ようなベクターは、ＣＯ８細胞もしくは他の哺乳動物細
胞において使用することができる。本発明の実施に有用
なこの種の他のプロモーターの例にはＳＶ４０初期およ
び後期プロモーター、マウスメタロチオネイン遺伝子プ
ロモーター、トリまたは哺乳動物レトロウィルスの長い
末端繰返し配列中に見出されるプロモーター、バキュロ
ウィルスポリヘドロン遺伝子プロモーターおよびその他
のものが含まれる。
本発明の実施に際して有用な他の細胞の例にはＣＨＯ（
チャイニーズハムスター卵巣）　、Ｃ１２７（サル上皮
）、３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＣＶ−１（アフリカ
ン・グリーン・モンキー腎臓）のような哺乳動物細胞が
含まれる。このように本発明の形質転換体は、哺乳動物
細胞を用いる。
これは大腸菌等の微生物に比べＥＰＯが細胞外へ分泌さ
れるためＥＰＯの精製が容易であること、また生物的活
性に寄与する糖鎖が付加するという利点があるためであ
る。これらの特定のプロモーターおよび／または細胞は
ＥＰＯの発現タイミングや発現レベルの調節、細胞に特
異的な型のＥＰＯの生産、または比較的費用がかからず
容易に制御できる条件下でのＥＰＯ生産細胞の大量増殖
を可能にしうる。細胞培養培地は一般に栄養素塩類溶液
とｌθ％ウシ胎児血清である。−ＣＨｏ、Ｃ１２７およ
び３Ｔ３によるＥＰＯ発現の例は実施例９および１０（
ＣＨＯ）ならびに１２（Ｃ１２７と３Ｔ３）に示される
。
実施例１ＯのようにＣＨＯ細胞により生産された組換え
ＥＰＯは慣用のカラムクロマトグラフィー法により精製
した。糖タンパク質中に存在する糖の相対量は、２つの
独立した方法〔（Ｉ）レインホールド（Ｒｅｉｎｈｏｌ
ｄ）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　５
０　：２４４−２４９−　（メタツリシス）および（Ｉ
ｆ）タケモト（Ｔａｋｅｍｏｔｏ、　Ｈ，）らのＡｎａ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４５　：　２４５Ｃ１９８
５）　（独立したシアル酸測定を伴うピリジルアミノ化
）〕で分析された。これらの方法のそれぞれによって得
られた結果は中し分なく一致した。
こうして、いくつかの測定が行われて次の平均値を得た
（この場合比較目的のために、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンを１とする）。
糖　　　　　相対モル量 Ｎ−アセチルグルコサミン　　１ ヘキソース類：１．４ ガラクトース　　　　０．９ マンノース　　　０．５ Ｎ−アセチルノイラミン酸　　ｌ＊ フ　　　コ　　　−　　　ス　　　　　　　　　０．２
Ｎ−アセチルガラクトサミン　０．１ ＊Ｎ−アセチルノイラミン酸は不安定であり、その値は
約０．４〜約１の範囲で変動する。
両方の独立した糖分析法によって有意量のフコースとＮ
−アセチルガラクトサミンが再現可能に観察されたこと
は注目に値する。Ｎ−アセチルガラクトサミンの存在は
タンパク質における〇−結合グリコシル化の存在を示す
。〇−結合グリコシル化の存在はさらに種々の組合せの
グリコシド酵素による糖タンパク質の消化後の５ＤＳ−
ＰＡＧＥ分析によっても示された。特に、酵素ペプタイ
ド、Ｎ−グリコシダーゼＦを使用して、糖タンパク質の
全てのＮ−結合炭水化物を酵素的に除去した後、さらに
、ノイラミニダーゼ消化を行うとＳＤＳ　−ＰＡＧＥ分
析で測定したそのタンパク質の分子量はさらに減少した
。
精製された組換えＥＰＯのｉｎ　ｖｉｔｒｏ生物学的活
性は、アミノ酸組成のデータに基づいて計算されたタン
パク質定量値を使用するクリスタル（Ｇ、　Ｋｒｙｓｔ
ａｌ）のＥｘｐ、　Ｉｌｅｍａｔｏｌ、、　１１　：　
６４９　（１９８３）に記載の方法（ＩＩＩＦ臓細胞増
殖バイオアッセイ）により検定した。複数の測定におい
て、精製組換えＥＰＯのｉｎ　ｖｉｔｒｏ比活性は２０
０，０００単位／ｍｇタンパク質以上であると計算され
た。平均値は約２７５．０００〜３００，０００単位／
　ｎａｇタンパク質の範囲であった。さらに、３００，
０００以上の値も観察された。この組換え物質に対して
観察されたｉｎ　ｖｉｖ。
〔赤血球増加マウス検定；カザール（Ｋａｚａｌ）およ
びアースレブ（Ｅｒｓｌｃｖ）のＡｍ、　Ｃ１１ｎｉｃ
ａｌ　Ｌａｂ、　Ｓｅｔ、。
Ｖｏｌ、肌ｐ９１　（１９７５）を参照１］　／ｉｎ　
ｖｉｔｒｏ活性比は０．７〜１．３であった。
先に示した糖タンパク質の特性と、本出願の優先臼より
後の国際公開ＷＯ３５１０２６１０（１９８５年６月２
０日付）〔特表昭６１５０１６２７　（１９８８年８月
７日付）〕に記載されている組換えＣＨＯ生産ＥＰＯ物
質の特性とを比較することは興味のあることである。上
記公表公報明細書の第２６ページ左下欄に記載されてい
る対応する糖の比較分析は、Ｎ−アセチルグルコサミン
１に対してフコースおよびＮ−アセチルガラクトサミン
は、ゼロの値を、そしてヘキソース類は１５．０９と大
きな値を報告している。Ｎ−アセチルガラクトサミンの
不在は上記国際出願に報告された糖タンパク質中に〇−
結合グリコシルが存在しないことを示す。この物質と対
照的に、本発明の組換えＣＨＯ生産ｐ：　ｐ　Ｏ＋：先
に性状決定がなされたように、再現可能に観察しう°る
釘意量のフコースとＮ−アセチルガラクトサミンの双方
を含み、ヘキソース類は相対量として１／１０以下であ
り、そして〇−結合グリコシルの存在によって差異があ
り、本発明で得られるＥＰＯはヒト尿から得られるＥＰ
Ｏと同一か近似のグリコジル化パターンを有する。さら
に、本発明の上記ＣＨＯ細胞由来組換えＥＰＯの高い比
活性はそのグリコジル化パターンと直接関連していると
考えられる。
本発明のクローン化ＥＰＯ遺伝子の哺乳動物細胞発現に
より生産された生物学的に活性なＥＰＯは、医師や獣医
師によるヒトおよび哺乳動物種のｉｎ　ｖｉｖｏ治療に
使用できる。活性成分の量はもちろん治療しようとする
症状の程度、選ばれた投与経路、および活性ＥＰＯの比
活性に依るであろうが、最終的には主治医や獣医により
決定されるだろう。主治医によって決定された活性ＥＰ
Ｏのこのような量は、本明細書中で“ＥＰＯ治療治療有
効色量ばれる。例えば、ヒツジにおける慢性腎不全に伴
う増殖低下性貧血の治療において、ＥＰＯの一日の有効
量は１５〜４０日の間１０単位／　ｋｇであることがわ
かった。ニッシュバッハ（Ｅｓｃｈｂａｅｈ）らのＪ、
　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７４　：　４３４　　
（１９８４）を参照されたい。
活性ＥＰＯは治療しようとする症状に適する経路で投与
される。好ましくは、ＥＰＯは治療されるべき哺乳動物
の血流中に注射される。好適な投与経路は治療しようと
する症状ごとに変化する。
活性ＥＰＯは純粋な又は実質的に純粋な化合物として投
与することができるが、医薬配合物または医薬製剤とし
てそれを提供することが好ましい。
本発明を使用して得られる配合物は、上記のような活性
ＥＰＯタンパク質のほかに、１種または２種以上の薬剤
上許容される担体と他の治療成分を含有する。担体は配
合物の他の成分と共存でき且つそれを投与される者に有
害であってはならない。望ましくは、配合物としては酸
化剤やペプチドと共存できないような他の物質を含むべ
きでない。配合物は簡便には単位投与形体（ｕｎｉｔ　
ｄｏｓａｇｅｆｏｒｍ）で提供され、薬剤掌上よく知ら
れた方法により調製される。全ての方法は活性成分と１
種または２種以上の補助成分を含む担体とを混合する工
程を含む。一般に、配合物は活性成分と液体担体または
微細な固体担体またはその両者とを均一にかつ緊密に混
合し、その後必要に応じてその生成物を所望配合物へ成
形することにより作られる。
非経口投与に適する配合物は簡便には活性成分の滅菌水
溶液からなり、その際その溶液は受容者の血液と等張で
あるのが好ましい。この種の配合物は固体活性成分を水
に溶解して水溶液をっ（す、その水溶液を滅菌すること
により適宜調製され、そして例えば密封アンプルやバイ
アルのような単位用量容器または多用量容器で提供され
る。
本発明で哺乳動物細胞にヒトＥＰＯを生産させるために
使用されるＥＰＯ／ｃＤＮＡにはＡＴＧコドンの後につ
ながるマチュアＥＰＯ／ｃＤＮＡ遺伝子、およびＥＰＯ
タンパク質の対立遺伝子変異体をコードするＥＰＯ／ｃ
ＤＮＡが含まれる。
１つの対立遺伝子は第３〜６表に示される。
ＥＰＯタンパク質にはＥＰＯタンパク質の１−メチオニ
ン誘導体（Ｍｅｔ　−Ｅ　Ｐ　Ｏ）およびＥＰＯタンパ
ク質の対立遺伝子変異体が含まれる。マチュアＥＰＯタ
ンパク質は第２表の配列Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ・・・から始まる配列（最初のアミノ酸残基には番号
１（第２表）が付されている）によって示される。Ｍｅ
ｔ−ＥＰＯは配列Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ−から始まる。
ＥＰＯ／ｃＤＮＡの発現の結果生成する糖タンパク質は
、形質転換体内または発現系外に存在するタンパク質分
解酵素の作用を受けることが充分者えられ、ＤＮＡ配列
から読みとられるアミノ酸配列１〜１６６のすべてを備
えていないことがあり得る。例えばＣ末Ａｒｇの脱離が
、ＣＨＯ発現ＥＰＯについて見出されている。しかし、
この種の糖タンパク質もｔｎ　ｖｉｖｏ活性を有してお
り、本発明を使用して得られる目的物に含まれる。なお
、Ｃ末Ａｒｇの脱離はヒト尿ＥＰＯについても見出され
ており、ｉｎ　ｖｉｖｏ活性が保持されていることが確
認されている。
次の実施例は本発明を理解しやすくするためのものであ
り、本発明の真の範囲は請求の範囲によって説明される
。ここに記載の方法において多くの修飾が本発明の精神
から逸脱することなくなされ得ることを理解すべきであ
る。全ての温度は℃で表わされ未補正である。マイクロ
リッター、マイクロモル等に於けるマイクロの略号とし
て「μ」を用い、それぞれ「μｇ」、「μｓ」として表
わす。
実施例 実施例１： ＥＰＯのゲノムＤＮＡ断片クローンの単離ＥＰＯのゲノ
ムＤＮＡを単離するには、ヒトゲノムＤＮＡライブラリ
ーから、適当なヌクレオチドプローブを用いてスクリー
ニングする必要がある。そのプローブの配列は、ＥＰＯ
のアミノ酸配列の少なくとも一部分に対応するものでな
ければならない。そこで、まず、ＥＰＯを再生不良性貧
血患者の尿からミャケらの方法〔ミャケ（Ｍｉｙａｋｅ
）らのＪ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５２　：　
５５５８　（１９７７）を参照〕で精製したが、但しフ
ェノール処理を省略しその代わりに８０℃で５分の熱処
理を行ってノイラミニダーゼを失活させた。精製の最終
工程は、０．１％トリフルオル酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）を含
む０〜９５％アセトニトリル勾配を１００分間で使用す
るＣ−４Ｖｙｄａｃ　ＩＩＰＬＣカラム（Ｔｈｅ　５ｅ
ｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ）での分画化により行
った。上記勾配中のＥＰＯの位置は、主要ピークのゲル
電気泳動およびＮ末端アミノ酸配列分析（２，６，７）
により測定した。
ＥＰＯは約５３％アセトニトリルで溶離され、逆相ＨＰ
ＬＣにかけたタンパク質の約４０％に相当した。
ＥＰＯを含む画分を次いで１００μａになるまで蒸発さ
せ、重炭酸アンモニウムでｐＨ７，０に調節し、２％ト
シルフェニルアラニルクロロメチルケトン（Ｔ　Ｐ　Ｃ
Ｋ）処理トリプシン（Ｗｏｒｔｈｌｎｇｔｏｎ）により
８７℃で１８時間完全消化した。その後、トリプシン消
化物を上記と同様の逆相Ｊ（ＰＬＣにかけた。
２８０１層および２１４ｎｍでの光学密度を監視した。
十分に分離した各ピークの成分を乾固状態近くにまで蒸
発させ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ　４８
０Ａ型気相シークエネーターを使って直接Ｎ末端アミノ
酸配列分析（１７）にかけた。各ピークの成分は第２表
および第３表において下線が施されているアミノ酸配列
を有することが判明した。
先に述べたように、これらのトリプシン消化フラグメン
トのうち２つがヌクレオチドプローブの合成用に選ばれ
た。配列：　Ｖａｌ　−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌ
ａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ　（第２表および第３表のアミノ酸
４６〜５２）からは、３２種類（縮重）の７ｍａｒ ＡＡ ＴＴＣＣＡＮＧＣＧＴＡＧＡＡＧＴＴ および１２８種類の（縮重）の１８ｍｅｒＡＡ ＣＣＡＮＧＣＧＴＡＧＡＡＧＴＴＮＡＣが合成された。
配列：　Ｖａｌ　−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ　（第２表および第３表のアミノ酸１４
４〜１５０）からは、ロイシンコドンの第１位で異なる
それぞれ４８種類（縮重）の２つの１４ｍａｒプール が合成された。これらのオリゴヌクレオチドプローブを
ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢ
ｉｏｌａｂｓ）およびガン？”２Ｐ　−Ａ　Ｔ　Ｐ　（
Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）を用いて３２
Ｐで５−プライム末端を標識した。オリゴヌクレオチド
の比活性はオリゴヌクレオチド１ミリモル当り１０００
〜３０００Ｃ１であった。
この標識プローブを使用して、バクテリオファージラム
ダ中のヒトゲノムＤＮＡ　（ヒト染色体をＨａｅｍ／Ａ
１ｕＩで切断したＤＮＡ断片）ライブラリー（Ｃｈ４Ａ
ベクター使用）（ローン（Ｌａｗｎ）ら、３）をウー（
Ｗｏｏ）ら、　（１１）　（１９７８）によるｉｎ　５
ｉｔｕ増幅法の変法を用いてスクリーニングした。即ち
、ヒトゲノムＤＮＡを含む上記ファージ約３．５Ｘ１０
５を１５０ｎ＋ｍペトリ皿（ＮＺＣＹＭ培地）当り６０
００フアージの密度でまいて、肉眼で見える小さな（約
０．５ｍｍ）プラークが形成されるまで３７°Ｃでイン
キュベートした。４℃で１時間冷却後、プラークパター
ンの２通りのレプリカをナイロン膜（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）に移行させ、新しいＮＺＣＹ
Ｍ平板上３７℃で一部インキユベートした。その後、フ
ィルターをそれぞれ０．５ＮＮａＯＨ−ＩＭ　　ＮａＣ
ｇおよび０．５Ｍ　トリス（ｐＨ８）−１Ｍ　　ＮａＣ
ｇの薄膜上で１０分間ずつ処理することにより変性およ
び中和した。フィルターを８０℃で２時間真空ベーキン
グした後、５×ＳＳＣ，０，５％ＳＤＳで１時間洗い、
フィルター表面の細胞破砕物を湿ったティッシュで穏や
かにかき取ることにより除去した。このかき取りはプロ
ーブのフィルターへのバックグラウンド結合を減少させ
た。次に、フィルターをＨ２Ｏですすぎ、３Ｍ塩化テト
ラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣΩ）　、１０ｍＭ　　
ＮａＰＯ３（ｐＨ６，８）、５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ
’ｓ、　　０．５％ＳＤＳおよび１０ｍ　ＭＥＤＴＡ中
４８℃で４〜８時間プレハイブリダイゼーションを行っ
た。その後、３２Ｐ−標識Ｌａｍｅｒを０．１ｐｎ＋ｏ
ｌ／ｍｌの濃度で加えて４８℃で７２時間ハイブリダイ
ゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、フィ
ルターを２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０，３’１Ｎ　ａ　ＣＯ
−０，０３Ｍクエン酸Ｎａ　、　ｐＨ７）で室温にて十
分に洗浄し、さらに３Ｍ　　ＴＭＡＣ！Ｑ　−１０ｍＭ
　　Ｎ　ａ　Ｐ　０４（Ｉ）１１６．８）で室温にて１
時間、次にハイブリダイゼーションを行った時と同じ温
度（４８℃）で５〜１５分間洗浄した。増感板を使用し
た２日間のオートラジオグラフィー後、約１２０の強い
レプリカされたシグナルが検出された。
陽性ファージを拾って８プールに分け、再度ファージプ
ラークを形成させ、２枚のフィルターの各々に対しては
１４ｆｉｌｅｒプールの１／２ずつを使用し、２枚目の
フィルターに対しては１７ａ＋ｅｒを使用して３通りの
再スクリーニングを行った。プラーク形成およびハイブ
リダイゼーションの条件は先に述べた通りであるが、１
４１１１ｅｒについてのハイブリダイゼーションは３７
℃で行った。オートラジオグラフィー後、室温にて２０
分間５０％ホルムアミド中で１７ｍａｒフィルターから
プローブを除去し、そのフィルターを５２℃で１８ａ＋
ｅｒプローブと再度ハイブリダイズさせた。２つの独立
のファージが３種のプローブ全部とハイブリダイズした
。
これらのファージの１つ（本明細書ではラムダ−ＨＥＰ
ＯＩと呼ぶ）からのＤＮＡを５ａｕ３Ａで完全消化し、
Ｍ１３中でサブクローニングし、サンガーおよびクール
ソン、（４）のジデオキシ・チエイン・ターミネーショ
ン法によるＤＮＡ配列分析のためにＭ１３というベクタ
ー（市販品）に組込み、大腸菌に挿入し、増殖させた。
ＥＰＯ）リプシン消化フラグメント（第１表下線領域）
をコードするオープン・リーディング台フレームのヌク
レオチド配列および推定上のアミノ酸配列を本明細書中
第１表に示す。イントロン配列は小文字で表わされ、エ
クソン配列（８７ヌクレオチド）は大文字で表わされる
。コンセンサススプライス受容部位（ａ）および供与部
位（ｄ）と一致する配列には下線が施されている。第１
表の配列は、そのま＼第４表の配列の一部を構成してい
る。
実施例２：ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡのノーザン分析本実施
例では上記ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡのライブラリーを作成
し、このライブラリー中に目的とするｍＲＮＡが存在す
ることを確認し、またそのｍＲＮＡのおよそのサイズを
測定することを目的としている。
５μｇのヒト胎児肝臓ｍ　ＲＮ　Ａライブラリー（２０
週口の胎児肝臓から調製したもの）および成人肝臓ｍＲ
ＮＡライブラリーを０．８％アガロースホルムアルデヒ
ドゲルによる電気泳動に付し、ダーマン（Ｄｃｒｍａｎ
）らのＣｅ１１．２３　：　７３１　（１９８１）に記
載の方法を用いてニトロセルロースに移行させた。
これと別に、第１表に示す配列を挿入物中に含むＭ１３
テンプレートから、ノーザン分析用の９５ヌクレオチド
−本鎖プローブを作成した。その際、プライマーとして
は初めの１７ｍｅｒプローブと同じトリプシン消化フラ
グメントから誘導された２０ｍｅｒのものを使用した。
プローブはアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）らのＰＮ
ＡＳ、　（１２）　（１９８４）に記載された方法で作
成したが、Ｓ　ｍａ　Ｉ消化（７４ヌクレオチドのコー
ディング配列を含む９５ヌクレオチド長の目的プローブ
をもたらす）後、０．１ＭＮ　ａ　ＯＨ−０，２Ｍ　　
ＮａＣ，ｆｆ中セファロースＣ１４Ｂカラムでのクロマ
トグラフィーによりその９５ｍｅｒの小さなフラグメン
トをＭ１３テンプレートから精製した。
このプローブ約５　ｘ　１１０６ｃｐを、上記ニトロセ
ルロースフィルターと６８℃で１２時間ハイブリダイズ
させ、６８℃にて２ｘｓｓｃで洗浄し、増感板を用いて
６日間感光させた。１２００ヌクレオチドの単一のマー
カーｍＲＮＡ　（矢印で示す）は隣接レーンで泳動させ
た。（第１図） その結果、ヒト胎児肝臓ｍ　ＲＮ　Ａライブラリー中に
、プローブとハイブリダイズする一本のバンドが見出さ
れた。
実施例３：胎児肝臓ｃＤＮＡの単離 前記ノーザン分析の結果、胎児肝臓のｍＲＮＡからｃＤ
ＮＡライブラリーを作成し、この中からスクリーニング
を行えば、ヒトＥＰＯｃＤＮＡが単離できると予測され
た。そこで、実施例２に記載のプローブと同じ９５ｍｅ
ｒのプローブを使用し、そして標準プラークスクリーニ
ング〔ベントン・デービス（Ｂｅｎｔｏｎ　Ｄａｖｉｓ
）の５ｃｉｅｎｃｅ、　（１３）　（１９７７）を参照
〕方法を使用して、胎児肝臓ｍＲＮＡ誘導され、ベクタ
ーラムダ−Ｃｈ２１Ａ［トール（Ｔｏｏｌｅ）らのＮａ
ｔｕｒｅ、　（５）　　（１９８４）を参照〕中に作ら
れた胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
た。その結果、１×１０６個のプラークをスクリーニン
グした後に３つの独立の陽性ｃＤＮＡクローン〔本明細
書ではラムダ−ＨＥＰＯＰＬ６　（１３５０ｂｐ）、ラ
ムダ−ＨＥＰＯＰＬ８　（７００ｂｐ）およびラムダ−
）ＩＥＰＯＰＬ１３　（１４００ｂｐ）と呼ぶ〕を単離
した。
ラムダ−ＨＥＰＯＰＬ１３およびラムダ−ＨＥＰＯＦＬ
６の完全挿入物についてはＭ２Ｓでのサブクローニング
後に塩基配列を決定した。それぞれの塩基配列を第７表
および第５表に示す。ラムダ−ＨＥＰＯＰＬ８について
も部分的に塩基配列を決定し、残りの部分は他の２つの
クローンと同じであると推定した。その塩基配列を第６
表に示す。５−プライムおよび３−プライム非翻訳配列
は小文字で表わされる。
コーディング領域は大文字で表わされる。
第７表（および第３表）に関して、ヌクレオチド配列の
上に示される推定上のアミノ酸配列は成熟タンパク質の
第１番目のアミノ酸を１として番号が付けられている。
推定上のリーダーペプチドはアミノ酸の略号が大文字で
示される。成熟タンパク質中のシスティン残基はさらに
ＳＨで示され、またＮ−結合グリコシル化の可能性があ
る部位は星印で示される。下線が施されているアミノ酸
は、Ｎ末端タンパク質配列決定または実施例１で述べた
ようなＥＰＯのトリプシン消化フラグメントの配列決定
により同定されたアミノ酸残基を示す。
点線は明確に決定し得なかったトリプシン消化フラグメ
ントのアミノ酸配列中の残基を示す。
ｃＤＮＡクローンのラムダ−ＨＥＰＯＦ’Ｌ６、ラムダ
−１１ＥＰＯＰＬ８およびラムダ−１１ＥＰＯＰＬ１３
はメリーランド州ロックビルのアメリカンφタイプ・カ
ルチャー・コレクションに寄託され、それぞれ寄託番号
ＡＴＣＣ４０１５Ｂ、　ＡＴＣＣ４０１５２およびＡＴ
ＣＣ４０１５３として入手可能である。
参考例１　：　ＥＰＯ遺伝子のゲノム構造本発明者等は
ＥＰＯゲノムＤＮＡの構造および塩基配列も明らかにし
た。実施例３で得た３種類のＥＰＯｃＤＮＡクローンか
ら調製されたオリゴヌクレオチドおよび種々のプローブ
を用いてヒトゲノムＨａｅＩ［Ｉ／ＡＩｕＩライブラリ
ー（ＣｈＡ４ベクター使用）をスクリーニングを行い、
４個の独立したゲノムクローンを得た。これら４個の独
立したゲノムクローン（ラムダ−ＨＥＰＯＩ、２゜３お
よび６）の相対的な大きさおよび位置は、第３図におい
て重複する線によって示されることが判明している。太
くて濃い３Ｊｋｂの線がＥＰＯ遺伝子の存在する部分で
ある。既知制限エンドヌクレアーゼ切断部位の位置とス
ケール（ｋｂ）も示されている。次に、ＥＰＯ遺伝子を
含む領域は、この領域の一連の欠失を生じさせる特異的
エキソヌクレアーゼ■を使用して、両鏡から完全に塩基
配列が決定された。ＥＰＯｍＲＮＡをコードする５つの
エクソンとイントロンの構造の模式図を第４図に示す。
エクソンＩの正確な５−プライム境界は今のところ不明
である。それぞれのエクソンのタンパク質コーディング
部分は黒く塗りつぶされている（この領域の完全なヌク
レオチド配列は既に第４表に示した）。第４図において
、各エクソンの既知範囲は垂直線で示される。エクソン
■の一部、エクソン■、■および■の全部、およびエク
ソンＶの一部がタンパク質コーディング情報を含む。エ
クソンＩおよびＶの残部はそれぞれ５−プライムおよび
３−プライム非翻訳配列をコードする。ゲノムクローン
のラムダ−ＨＥＰＯｌ、ラムダ−ＨＥＰＯ２，ラムダ−
ＨＥＰＯ３およびラムダ−ＨＥＰＯ６はメリーランド州
ロックビルのアメリカン−タイプΦカルチャー・コレク
ションに寄託され、それぞれ寄託番号ＡＴＣＣ４０１５
４゜ＡＴＣＣ４０１５５，ＡＴＣＣ４０１５０およびＡ
ＴＣＣ４０１５１として入手可能である。
実施例４：ベクターｐ９１０２３（Ｂ）の作成形質転換
用ベクターとしてカウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）らのＭ
ｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｌｏｌ、、　２　：　１３０４　
（１９８２）に記載のｐＡｄＤ　２６ＳＶｐＡ　（３）
を用イタ。コノベクターノ構造は第５Ａ図に示す。簡単
に述べれば、このプラスミドはアデノウィルス（Ａｄ２
）主要後期プロモーターの転写制御下にあるマウスジヒ
ドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡ遺伝子を含む。
５−プライムスプライス部位はアデノウィルスＤＮＡ中
に示され、３−プライムスプライス部位（免疫グロブリ
ン遺伝子から誘導される）はＡｄ２主要後期プロモータ
ー（ａ＋ａｊｏｒ　ｌａｔｅｐｒｏｍｏｔｅｒ）とＤＨ
ＦＲＨＦ−ディング配列ノ間ニ存在する。ＳＶ４０初期
ポリＡ部位はＤＨＦＲコーディング配列から下流に存在
する。ｐＡｄＤ　２ＢＳＶｐＡ（３）の原核生物由来部
分はｐｓＶＯｄ　　（メロン（Ｍｅｌｌｏｎ）らのＣｅ
１１．２７　：　２７９（１９８１）を参照〕から由来
し、哺乳動物細胞内で複製を阻害することが知られてい
るｐＢＲ３２２配列を含まない〔ラスキー（Ｌｕｓｋｙ
）らのＮｅｔｕｒｅ、　２９３　：　７９（１９８１）
を参照〕。
ｐＡｄＤ　２８ＳＶｐＡ　（３）は第５Ａ図および第５
Ｂ図に示すようにプラスミドｐｃＶｓＶＬ　２へ変換し
た。
ｐＡｄＤ　２ＢＳＶｐＡ　（３）はその中の２個のＰｓ
ｔＩ部位の一方を欠失させることによりプラスミドｐＡ
ｄＤ　２６ＳＶｐＡ　（３）（ｄ）ｊ、：変換した。コ
ノ変換は１個のＰｓｔＩ部位のみが切断された線状プラ
スミドのサブ集団を得るために酵素活性を弱めたＰｓｔ
Ｉで部分消化し、続いてフレノウ（Ｋｌｃｎｏｗ）で処
理し、連結して環状化し、そしてＳＶ４０のポリＡ配列
の３−プライム側に位置するＰｓｔＩ部位の欠失につい
てスクリーニングすることにより達成された。
次イテ、ｐＡｄＤ　２６ＳＶｐＡ　（３）　（ｄ）　ニ
、以下のようにしてアデノウィルス３分節系（ｔｒｌｐ
ａｒｔｉｔｅ）リーダーおよびウィルス関連遺伝子（Ｖ
Ａ遺伝子）ヲ挿入シタ。即チ、最初ニ、ｐＡｄＤ　２６
ＳＶｐＡ　（３）（ｄ）をＰｖｕＩＩで切断して、３分
節系リーダーからなる３つの要素の３−プライム部分内
で開環した線状分子を作った。次に、ｐＪＡ１ｆ４３　
［ゼイン・（Ｚａｉ　ｎ）らのＣｅ１１．１６　：　８
５１　（１９７９）を参照〕をＸｈｏＩで消化し、フレ
ノウで処理し、ＰｖｕＩＩで消化し、そして第３番目の
リーダーの第２部分を含む１４０ｂｐフラグメントをア
クリルアミドゲル（トリス−ホウ酸緩衝液中６％；マニ
アチスらの上記文献参照）による電気泳動により単離し
た。その後、この１４０ｂｐフラグメントをＰｖｕＩＩ
で消化したｐＡｄＤ　２８ＳＶｐＡ　（３）（ｄ）へ連
結した。この連結生成物を用いて大腸菌をテトラサイク
リン耐性へと形質転換し、Ｌ４０ｂｐフラグメントとハ
イブリダイズする３２ｐ標識プローブを使用するグルン
スタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）−ホグネス（Ｉｌｏｇ
ｎｅｓｓ）法によりコロニーを選択した。ポジティブに
ハイブリダイズするコロニーからＤＮＡを調製して、再
構成されたＰｖｕＩＩ部位が第２および第３アデノウィ
ルス後期リーダーに特異的な１４０ｂｐＤＮＡ挿入物の
５−プライム側にあるかあるいは３−プライム側にある
かについて試験した。正しい向きのＰｖａｎ部位はＬ４
０ｂｐ挿入物の５−プライム側に存在する。このプラス
ミドは第５Ａ’図にｐＴＰＬとして示される。
次に、ｐＴＰＬにＳＶ４０エンハンサ−を含むＳＶ４０
のＡｖａＩＩＤフラグメントを挿入するため、第５Ｂ図
に示すようにＳＶ４０　　ＤＮＡをＡｖａＩＩで消化し
、Ｐｏ１Ｉのフレノウフラグメントで両末端を平滑にし
、これらのフラグメントにＸｈｏＩリンカ−を連結し、
ＸｈｏＩで消化してＸｈｏＩ部位を開き、そしてゲル電
気泳動で４番目に大きいフラグメント（Ｄフラグメント
と呼ぶ）を単離した。このＤフラグメントをＸｈｏＩ消
化ｐＴＰＬに連結してプラスミドｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰ
Ｌを得た。
ｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬ中の５ｖ４０Ｄフラグメントの
向きは、ＳＶ４０後期プロモーターがアデノウィルス主
要後期プロモーターと同じ向きで存在するものであった
。
ｐｃＶｓＶＬ２−ＴＰＬ内ニアデノウイルス関連（ＶＡ
）遺伝子を導入するために、ＶＡ遺伝子供給源としての
アデノウィルス２型ＨｉｎｄＩＩＩＢフラグメントを含
むプラスミドｐＢＲ３２２を作成した。即ち、アデノウ
ィルス２型ＤＮＡをＨｌｎｄｍで消化して、Ｂフラグメ
ントをゲル電気泳動により単離した。このフラグメント
をあらかじめＨｌｎｄｍで消化したｐＢＲ３２２の中に
挿入し、第５Ｂ図に示すｐ　ＢＲ３２２−Ａｄ　Ｈｌｎ
ｄ　ｍＢを得た。
このフラグメント（アンピシリン耐性をマーカーとして
持つ大腸菌を形質転換した後、形質転換体をＨｉｎｄｍ
Ｂプラスミドの挿入についてアンピシリン耐性を指標に
スクリーニングし、挿入された向きを制限酵素消化によ
Ｏ調べた。ｐＢＲ３２２−Ａｄ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩＢは
第５Ｂ図に示す向きでアデノウィルス２型Ｈ１ｎｄｍＢ
フラグメントを含む。
第５Ｂ’図に示すように、ＶＡ遺伝子はプラスミドｐ　
ＢＲ３２２−Ａｄ　Ｈｉｎｄ　ｍＢをＨｐａＩで消化し
、ＥｃｏＲＩリンカ−を付加してＥｃｏＲＩで消化し、
続いて１．４ｋｂフラグメントを回収することにより得
られる。このＥｃｏＲＩ接着末端をもつ１．４ｋｂフラ
グメントは、次に前もってＥｃｏＲＩで消化したｐＣＶ
ＳＶＬ２−ＴＰＬのＥｃｏＲＩ部位に連結した。得られ
たプラスミドで大腸菌ＨＢ　１０１を形質転換してテト
ラサイクリン耐性を指標にして選別した後、ＶＡ遺伝子
に特異的なりＮＡに対するフィルターハイブリダイゼー
ションによりコロニーをスクリーニングした。
ポジティブにハイブリダイズするクローンからＤＮＡを
調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により同定した。
得られたプラスミドはｐ　９１０２３と命名した（第５
Ｂ’図）。
続いてｐ　９１０２３に存在する２個のＥｃｏＲＩ部位
を除去するため、第５Ｃ図に示すように、ｐ　９１０２
３をＥｃｏＲＩで完全消化して２つのＤＮＡフラグメン
ト（一方は約７ｋｂであり、他方はＶＡ遺伝子を含んで
おり、約１．３ｋｂである）を生成させた。両フラグメ
ントの末端をＰｏ１Ｉのフレノウフラグメントを用いて
夫々修復し、次にその２つのフラグメントを再度連結し
た。ＶＡ遺伝子を含み、ｐ　９１０２３に類似するが２
個のＥｃｏＲＩ部位を欠失したプラスミドｐ９１０２３
　（Ａ）は、ＶＡ遺伝子フラグメントを使用するグルン
スタインーホグネススクリーニングにより、または慣用
の制限部位分析により同定した。
さらに、ｐ９１０２３　（Ａ）中の単一のＰｓｔＩ部位
を除き、その代わりにＥｃｏＲＩ部位を入れた。即ち、
ｐ９１０２３　（Ａ）をＰｓｔＩで完全消化し、Ｐｏ１
Ｉのフレノウフラグメントで処理して平滑末端を生成さ
せた。ｐ９１０２３　（Ａ）のその平滑末端化ＰｓｔＩ
部位にＥｃｏＲＩリンカ−を連結した。平滑末端化Ｐｓ
ｔＩ部位にＥｃｏＲＩリンカ−を連結させた線状ｐ９１
０２３　（Ａ）を非連結リンカ−から分離し、ＥｃｏＲ
Ｉで完全消化して再び連結させた。第５Ｃ図に示すプラ
スミドｐ９１０２３　（Ｂ）を回収し、ｐ９１０２３　
（Ａ）に類似するがＰＳｔＩ部位の代わりにＥｃｏＲＩ
部位を有するものを単離同定した。
プラスミドｐ９１０２３　（Ｂ）はメリーランド州ロッ
クビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ３９７５４として入手
可能である。
実施例５：Ｃ０８−１細胞中でのＥＰＯｃＤＮＡの発現
例１ ｃＤＮＡクローン（ラムダ−ＥＰＯＦＬ６およびラムダ
−ＥＰＯＦＬ１３．実施例３参照）をプラスミドｐ９１
０２３　（Ｂ）に挿入した。挿入後のプラスミドをそれ
ぞれｐＰＴＦＬ６およびｐＰＴＦＬ１３と命名した。そ
の後、それぞれのプラスミドからの精製ＤＮＡ８μｇを
用いて５Ｘ１０６個のＣ０８−１細胞をＤＥＡＥ−デキ
ストラン法（以下参照）によりトランスフェクションし
た。１２時間後、細胞を洗浄し、クロロキン（０，１ｍ
Ｍ）で２時間処理し、再び洗浄し、そして１０％ウシ胎
児血清を含む培地１０ｍ１に２４時間さらした。その培
地を無血清培地４ｍｌに変えて４８時間後に収穫した。
免疫学的に活性なＥＰＯの生産は、シェアウッド（Ｓｈ
ｅｒｗｏｏｄ）およびゴールドバッサ−（Ｇｏｌｄｗａ
ｓｓｅｒ）　　（１４）により示されるラジオイムノア
ッセイにより定量化した。抗ＥＰＯ抗体はシュディス・
シェアウッド博士（Ｄｒ、　ＪｕｄｉｔｈＳｈｃｒｖｏ
ｏｄ）により提供された。ヨウ素化トレーサーは実施例
１に記載の均一なＥＰＯから製造した。検定の感度は大
体１１ｇ／ｍｌである。結果を下記の第８表に示す。
第　　　８　　　表 培地中に放出された ベクター　ＥＰＯのｆｉｔ　（ｎｇ／ｍｔ）ｐ　Ｐ　Ｔ
　Ｆ　Ｌ　１３　　　　　　３３０ｐＰＴＦＬ６　　　
　　　　３１ ｐＰＴＦＬ１Ｂはタリーランド州ロックビルのアメリカ
ンφタイプ拳カルチャーφコレクションに寄託され、寄
託番号ＡＴＣＣ３９９９０のもとに人手可能である。
実施例６：Ｃ０８−１細胞中でのＥＰＯｃＤＮＡの発現
例２ ＥＰＯｃＤＮＡ　（ラムダ−ＨＥ　Ｐ　ＯＦ　Ｌ　１３
）をｐ９１０２３　（Ｂ）に挿入し、Ｃ０８−１細胞を
トランスフェクションして上記（実施例５）のように収
穫した。ただしクロロキン処理を省いた。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏで生物学的に活性なＥＰＯは、ＣＦＵ
−Ｅ源としてマウス胎児肝臓細胞を用いるコロニー形成
検定またはフェニルヒドラジン注射マウスからの膵臓細
胞を用いる３Ｈ−チミジン取込み検定により測定した。
これらの検定の感度は大体２５ｍＵ／ｍｌである。ｉｎ
　ｖｉｖｏで生物学的に活性なＥＰＯは低酸素性マウス
法または飢餓ラット法により測定した。これらの検定の
感度は大体１００ｍｕ／ｍｌである。コントロール実験
で得られた培地（ｍｏｃｋ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｍｅ
ｄｌｕｎ）からの検定では活性が全く検出されなかった
。クローンＨＥＰＯＦＬ１３によって発現されたＥＰＯ
の結果は下記の第９表に示す〔活性は単位／　ｍｌで表
わし、標準対照として市販の比活性の明示されたＥ　Ｐ
　Ｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を使用した〕。
第　　　９　　　表 ＥＰＯｃＤＮＡでトランスフェクションＲＩ　Ａ　　　
　　　　　　　１１００ｎ／ｍ１ＣＦＵ−Ｅ　　　　　
　２±０．５Ｕ／ｍ１３Ｈ−Ｔｈｙ　　　　　　３．１
±１．８Ｕ／ｍｌ低酸素性マウス　　　　　ＩＵ／ｍｌ 飢餓ラット　　　　２Ｕ／ｍｌ 実施例７：Ｃ０８−１細胞からのＥＰＯの５ＤＳＥＰＯ
ｃＤＮＡ　（ラムダ−ＨＥ　Ｐ　ＯＦ　Ｌ　１３）を含
むベクターｐ９１０２３　（Ｂ）でトランスフェクショ
ンされたＣＯ８細胞から培地に分泌されたＥ　Ｐ　Ｏ１
８０ｎｇを１０％ＳＤＳ　　Ｌａｅｍｌｌｉのポリアク
リルアミドゲルによる電気泳動にかけ、ニトロセルロー
ス紙に電気移動させた〔トービン（Ｔｏｗｂｉｎ）らの
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃｅｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ　７Ｂ　＋　４３５０（１９７９）を参照〕。このフ
ィルターは実施例５に記載されたような抗ＥＰＯ抗体を
用いて検索し、洗浄し、そして　　Ｉ−黄色ブドウ球菌
Ａプロティンを用いて再度検索した。その後２０間オー
トラジオグラフィーを行った。天然の均−ＥＰＯは実施
例１に記載されたものを使用し、ヨウ素化前（レーンＢ
）またはヨウ素化後（レーンＣ）に電気泳動を行った（
第６図参照）。使用したマーカーは３５Ｓメチオニン標
識された血清アルブミン（６８，０ＯＯｄ）および卵白
アルブミン（４５，０００ｄ）であった。
実施例８：ｐＲＫｌ−４の作成 実用上の目的に適し、１つのプロモーターにより目的ｃ
ＤＮＡ、ＤＨＦＲの２つの遺伝子が支配される特徴を持
つ発現ベクターを作成するため、次に述べるフラグメン
トＡ、ＢおよびＣを連結してプラスミドＲＫＩ−４を作
成した。このプラスミドは第７図の構造を持ち、特に実
用的特徴がある。
フラグメントＡは次のようにして得られた。
マウスジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）遺伝子に
隣接するＳＶ４０初朋領域プロモーター、ＳＶ４０エン
ハンサ−１小さなｔ抗原イントロン、およびＳＶ４０ポ
リＡ配列を含むプラスミドＰＳＶ２ＤＨＦＲ［サブラマ
ニ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）らのＨｏｔ、　Ｃｅ１１．　
Ｂｉｏｌ、、　１　：　８５４−８６４　（１９８１）
を参照〕からＢａｍＨＩ　−ＰｖｕＩＩフラグメントを
単離した（フラグメントＡ）。
残りのフラグメントＢおよびＣは次のようにしてベクタ
ーｐ９１０２３　（Ａ）　　（実施例４および第５ｃ図
参照）から得られた：　ｐ９１０２３　（Ａ）をアデノ
ウィルスプロモーターの近くの単一のＰｓｔＩ部位でＰ
ｓｔＩにより消化してこのプラスミドを線状化し、次に
ＰｓｔＩ　−ＥｃｏＲＩ部位へ変換するための合成フラ
グメントに連結して再環状化する〔もとのＰｓｔＩ部位
にＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ　−ＰｓｔＩ部位を作る；　ｐ
９１０２３　（Ｂ’）　）か、あるいは実施例４で述べ
たようにＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントで処理
してＰｓｔ１部位を破壊し、合成ＥｃｏＲＩリンカ−に
連結して再環状化した〔もとのＰｓｔＩ部位にＥｃｏＲ
部１部位を作る；　ｐ９１０２３　（Ｂ）　）。
得られた２つのプラスミドｐ９１０２３　（Ｂ）とｐ９
１０２３　（Ｂ’）の各々をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ
で消化して２つのフラグメント（ＦおよびＧ）を得た。
ｐ９１０２３　（Ｂ）からのフラグメントＦとｐ　９１
０２３　（Ｂ’）からのフラグメントＧおよびｐ９１０
２３　（Ｂ）からのフラグメントＧとｐ　９１０２３（
Ｂ′）からのフラグメントＦを連結することにより、も
とのＰｓｔＩ部位にＥｃｏＲＩ　−ＰｓｔＩ部位または
ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位のいずれかを含む２つの新し
いプラスミドを作成した。ＰｓｔＩ　−ＥｃｏＲＩ部位
を含むプラスミド（ＰｓｔＩ部位がアデノウィルス主要
後期プロモーターに最も接近している：プロモーターに
近接している位置に目的ｃＤＮＡを挿入できるようにＰ
ｓｔＩサイトが設けられている）をｐ９１０２３　（Ｃ
）と命名した。
ベクターｐ９１０２３　（Ｃ）をＸｈｏＩで完全消化し
、接着末端をもつ得られた線状プラスミドは大腸菌のＤ
ＮＡポリメラーゼＩ大フラグメントを用いる末端修復反
応により平滑末端とした。このＤＮＡに、次のようにし
て作成したＳＶ４０エンハンサ−含有の３４０ｂｐ　Ｈ
ｌｎｄ　ｍ　−ＥｅｏＲＩフラグメントを連結した： ＳＶ４０からのＳＶ４０複製開始点およびエンハンサ−
を含むＨｉｎｄ　ｍ　−ＰｖｕＩＩフラグメントをプラ
スミドｃｌａｃ［リトル（Ｌｌｔｔｌｓ）　　らのＭｏ
１．　Ｂｉｏｌ。
取ｄ　、、　ｌ　：　４７３−４８８　（１９８３）を
参照〕に挿入した。
ｃｌａｃベクターはｅｌａｅＤＮＡをＢａｍＨＩで消化
し、接着末端をＤＮＡポリメラーゼＩ大フラグメントで
修復し、そのＤＮＡをＨｉｎｄｍで消化することにより
調製した。得られたプラスミド（ｃ　５ＶＨＰ　　１ａ
ｃ）はＰｖｕＩＩ平滑末端を連結されたことによりＢａ
ｍＨＩ部位を再生していた。
ｃＳＶＨＰ　　ＩａｃからＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ｍ
フラグメントを作り、プラスミドの複製開始点を含むｐ
ｓＶＯｄ　（実施例４に示したメロンらの上記文献参照
）のＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍフラグメントに連結し
、得られたプラスミドｐｓＶＨＰＯｄを選択した。その
後、ＳＶ４０複製開始点／エンノ＼ンサーを含むｐｓＶ
ＨＰＯｄの３４０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ■フラ
グメントを作り、両末端をＤＮＡポリメラーゼＩ大フラ
グメントで平滑末端とし、そして上記のＸｈｏＩ消化し
、平滑末端化ｐ９１０２３　（Ｃ）ベクターに連結した
。
Ｈｉｎｄ　ｍ’−ＥｃｏＲＩフラグメント中のＢａｍＨ
Ｉ部位がＶＡ遺伝子に最も接近するような向きをもつ得
られたプラスミド（ｐ　９１０２３　（Ｃ）　／　Ｘ　
ｈｏ　Ｉ　／平滑末端プラスＥｃｏＲＩ／Ｈ１ｎｄ　ｍ
／平滑末端ＳＶ４０複製開始点プラスエンハンサ−）は
ｐＥＳ１０５と命名した。このプラスミドｐ　Ｅ　Ｓ　
１０５をＢａｍＨＩとＰｖｕＩＩで、またはＰｖｕＩＩ
だけで消化して、アデノウィルス主要後期プロモーター
を含むＢａｍＨＩ　−ＰｖｕＩＩフラグメント（フラグ
メントＢ）および耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性）
と他の配列との間にそのプラスミドを含むＰｖｕＩＩフ
ラグメント（フラグメントＣ）を単離した。
フラグメントＡ、ＢおよびＣを連結し、第７図に示すプ
ラスミドを単離してＲＫＩ−４と命名した。プラスミド
ＲＫＩ−４はメリーランド州ロックビルのアメリカン・
タイプ−カルチャー・コレクションに寄託され、寄託番
号ＡＴＣＣ３９９４０のもとに入手可能である。
実施例９：ＣＨＯ細胞によるＥＰＯの発現−方法Ｉ 上記実施例５のプラスミドｐＰＴＦＬ１３からのＥＰＯ
ｃＤＮＡを含むＤＮＡ（２０μｇ）を制限エンドヌクレ
アーゼＣＩａＩで消化して線状化し、そしてプラスミド
ｐＡｄＤ　２６ＳＶｐ　（Ａ）　ｌ　（カウフマン等の
Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　２　：　１３０
４　（１９８２））からのＣ１ａＩ消化ＤＮＡ　（２μ
ｇ）　　［アデノウィルス主要後期プロモーターにより
制御される完全なジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を
含む〕に連結した【カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）およ
びシャープ（Ｓｈａｒｐ）のＭｏ１．　ａｎｄ　Ｃｅ１
ｌ　Ｂｉｏｌ、　２　：　１３０４−１３１９　（１９
８２）を参照〕。この連結ＤＮＡを使ってＤＨＦＲ−ネ
ガティブＣＩＯ細胞［ＤＵＫＸ−ＢＩ　Ｉ、カーシン（
Ｃｈａｓｌｎ　Ｌ、　Ａ、）およびアーラウプ（Ｕｒｌ
ａｕｂ　Ｇ、）のＰＮＡＳ　７７　：　４２１Ｂ−４２
２０（１９８０）を参照〕をトランスフェクションし、
２日間増殖後、少なくとも１つのＤＨＦＲ遺伝子を組み
込んだ細胞をアルファ培地（ヌクレオチドを欠き、１０
％透析ウシつ児血清を補充したもの）で選択した。選択
培地で２週間増殖後、コロニーをもとの平板から採取し
、１ブール当り１０〜１００個のコロニーから成るグル
ープに分け、再度ヌクレオチド欠損培地で培地上全面に
増殖するまで培養した。増殖プールからの培地上清をメ
トトレキセート（ＭＴＸ）選択に先立ってＲＩＡでＥＰ
Ｏについて検定した。陽性のＥＰＯ生産を示したプール
はメトトレキセート（０，０２μＮ）の存在で増殖させ
、サブクローニングして再度検定した。ＥＰＯＣ１ａ　
　４σ４．０２（ＭＴＸ耐性のものを精製したもの）プ
ールからサブクローニングされた単一のＥＰＯＣ１ａ４
α４．０２−７は０．０２μＭＭＴＸを含む培地中に４
６０ｎｇ／ｍｌのＥＰＯを放出した（第１０表参照）。
ＥＰＯＣ１ａ　　４（ｌＥ４．０２−７はＥＰＯ生産に
特に適する細胞株であり、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ　８６９
５として寄託された。一般に、このクローンは次第に増
加する濃度のＭＴＸ中で段階的選択にかけると、さらに
高レベルのＥＰＯを生産する細胞を生成するであろう。
ＲＩＡで陰性であったプールについては、メトトレキセ
ー）　（０，０２μＭ）の存在下で増殖した相対培養物
からのメトトレキセート耐性コロニーをＲＩＡでＥＰＯ
についてプールごとに再び検定した。陽性でなかったこ
れらの培養物をサブクローニングし、さらに濃度を高め
たメトトレキセート中で増殖させた。
段階的にメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を上げて培養
する選択は、次第に増加する濃度のメトトレキセートの
存在下で細胞を培養して生存細胞を選択するというサイ
クルを繰り返すことにより達成された。各回ごとに培養
上清中のＥＰＯをＲＩＡおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏ生物活
性により測定した。
各段階的増幅において使用されたメトトレキセートの量
は０．０２μＭ、０．１μＭおよび０．５μＭであった
。第１０表に示すように、０，０２μＭのＭＴＸによる
１回の選択後に有意量のＥＰＯが培地中に放出された。
アルファ　アルファ培地中 ４α４プール　ＲＩＡ　　１７ｎｇ／ｍｌ　　　５０ｎ
ｇ／ｍ１４α４単一 コロニー クローン （，０２−７）　　　ＲＩＡ　　　　　　　　　　４８
０ｎｇ／　ｍｌ実施例１０：ｃＨＯ細胞によるＥＰＯの
発現−方法■ クローンラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３からのＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩで消化し、ＥＰＯ遺伝子を含む小さなフラグメン
ト（Ｒ１フラグメント）をプラスミドＲＫＩ−４（実施
例８参照）のＥｃｏＲＩ部位内でサブクローニングした
。次に、このＤＮＡ（ＲＫＦＬ１３）を用いてＤＨＦＲ
−ネガティブＣＨＯ細胞を直接（消化せずに）トランス
フェクションし、そして上記の実施例９のようにして選
択および増幅を行った。
また、ＲＫＦＬ１３ＤＮＡはプロトプラスト融合または
微量注射法によりＣＨＯ細胞に挿入した。
プラスミドＲＫＦＬ１３はメリーランド州ロックビルの
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
され、寄託番号ＡＴＣＣ３９９８９のもとに人手可能で
ある。
好適な単一コロニークローンはメリーランド州ロックビ
ルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
寄託され、寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ８６９５のもとに入
手可能である。
実施例１１：ｃＯ８−１細胞によるＥＰＯゲノムＤＮＡ
の発現 ＥＰＯゲノムクローンの発現のために使用したベクター
はｐｓＶＯｄ　（実施例４に示したメロンらの上記文献
参照）である。ｐｓＶＯｄからのＤＮＡはＨｌｎｄｍで
完全消化し、ＤＮＡポリメラーゼ１大フラグメントで平
滑末端とした。
ＥＰＯゲノムクローンのラムダ−ＨＥＰＯ３はＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄｍで完全消化し、ＥＰＯ遺伝子を含む４．
Ｏｋｂフラグメントを単離して上記のように平滑末端と
した。Ｈ１ｎｄＩＩＩ部位からポリＡシグナルをちょう
ど越えた領域までのこのフラグメントのヌクレオチド配
列は第４図および第４表に示す。ＥＰＯ遺伝子フラグメ
ントをｐｓＶＯｄプラスミドフラグメント内に挿入し、
そして両方の向きの正しく構築された組換え体を単離し
て確かめた。プラスミドＣＺ２−１は“ａ”の向き（す
なわちＥＰＯの５′末端がＳＶ４０開始点に最も接近す
る）でＥＰＯ遺伝子を有し、プラスミドＣＺＩ　−３は
それと反対の向き（すなわち“ｂ”の向き）である。
プラスミドＣＺＩ−３およびＣ２０−１は実施例６のよ
うにしてＣＯ３−１細胞をトランスフェクションし、培
地を収穫して免疫学的に反応性のＥＰＯについて検定し
た。Ｃ２０−１からは培養上清中に約３１ｎｇ／ｍｌの
ＥＰＯが検出され、ＣＺｌ−３からは１８〜３１ｎｇ／
　ｍｌのＥＰＯが検出された。
ゲノムクローンＨ′ＥＰＯ１，ＨＥＰＯ２およびＨＥＰ
Ｏ６は類似の方法でＣＯ８細胞に挿入し且つ発現させる
ことができる。
マウスメタロチオネインプロモーターの転写制御下にあ
り且つ完全ウシ乳頭腫ウィルスＤＮＡに結合されたＥＰ
ＯｃＤＮＡ配列を含むプラスミドを次のようにして作成
した： ｐＥＰＯ４９ｆ プラスミド５Ｐ８１５をＰｒｏｍｅｇａ　Ｂｌｏｔｅｃ
から購入した。このプラスミドをＥｃｏＲＩで完全消化
し、ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３からのＥＰＯｃＤＮＡを
含む１３４０ｂｐＥ　ｃｏＲＩフラグメントをＤＮＡリ
ガーゼにより挿入した。ＥＰＯ遺伝子の５′末端がＳＰ
６プロモーターに極めて接近している（Ｂｇｌ■および
Ｈｉｎｄｍ消化で測定）得られたプラスミドをｐＥＰＯ
４９５と命名した。なお、方向性に関して、ｐＳＰ６１
５ポリリンカー中のＢａｍＨＩ部位はＥＰＯ遺伝子の５
′末端に直接に隣接している。
ｐ　Ｍ　Ｍ　Ｔ　ｎｅｏΔＢＰＶ 第８図に示すプラスミドｐｄＢ　Ｐ　Ｖ　−ＭＭＴｎｃ
。
（３４２−１２）　　（ＣＦ　−（Ｌａｗ）らのＨｏｔ
、　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。
３　：　２１１０−２１１５　（１９８３）を参照〕を
ＢａｍＨＩで完全消化して、ＢＰＶゲノムを含む約８ｋ
ｂの大きなフラグメントと、ｐＭＬ２複製開始点および
アンピシリン耐性遺伝子、メタロチオネインプロモータ
ー、ネオマイシン耐性遺伝子およびＳＶ４０ポリＡシグ
ナルを含む約６．５ｋｂの小さなフラグメントの両フラ
グメントを生じさせた。消化したＤＮＡを分離すること
なくＤＮＡリガーゼで再び環状化し、目的とする約６．
５ｋｂフラグメントのみを含むプラスミドをＥｃｏＲＩ
（！：ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化により同
定した。この種のプラスミドの一つをｐＭＭＴｎｅｏ　
ＪＢＰＶと命名した。
ｐＥＰＯ１５ａ ｐＭＭＴｎｅｏΔＢＰＶをＢｇｌｍで完全消化した。
ｐＥＰＯ４９５をＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで完全消化し
て、全ＥＰＯコーディング領域を含む、約７ｏｏｂｐフ
ラグメントプラスミドをゲル電気泳動により単離した。
ＢｇｌＩＩ消化ｐＭＭＴｎｅｏ　ＪＢＰＶと７００ｂｐ
　ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩＥＰＯ７ラグメントとを連結
し、ＥＰＯｃＤＮＡを含む得られたプラスミドはＥＰＯ
遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブｄ　（Ｇ
ＧＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣ）を使用するコ
ロニーハイブリダイゼーションにより同定した。ハイブ
リダイゼーション分析で陽性であったプラスミドのうち
、ＥＰＯｃＤＮＡの５′末端がメタロチオネインプロモ
ーターに最も接近する方向性のＥＰＯｃＤＮＡをもつ１
つのプラスミド（ｐ　Ｅ　Ｐ　０１５ａ）がＥｃｏＲＩ
およびＫｐｎＩ消化により同定された。
ｐＢＰＶ−ＥＰＯ プラスミドｐＥＰＯ１５ａをＢａｍＨＩで完全消化して
線状化した。プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　　
（３４２−１２）もまたＢａ１ＨＩで完全消化して、約
６．５ｋｂと８ｋｂの２つのフラグメントを得た。全ウ
シ乳頭腫ウィルスゲノムを含む８ｋｂフラグメントをゲ
ル電気泳動により単離した。
ｐ　Ｅ　Ｐ　０１５ａ　／　ＢａｍＨＩと８　ｋｂＢ　
ａｍＨＩ　７ラグメントとを一緒に連結し、ＢＰＶフラ
グメントを含むプラスミド（ｐＢＰＶ−ＥＰＯ）は、Ｂ
ＰＶゲノムに特異的なオリゴヌクレオチドプローブｄ（
Ｐ−ＣＣＡＣＡＣＣＣＧＧＴＡＣＡＣＡ−ＯＨ）を使用
するコロニーハイブリダイゼーションニヨリ同定した。
　ｐＢＰＶ−ＥＰＯＤＮＡ（７）Ｈ１ｎｄＩＩｒ消化は
、ＢＰＶゲノムの転写方向がメタロチオネインプロモー
ター（第８図のｐｄＢＰＶ−Ｍ　Ｍ　Ｔ　ｎｅｏ　　（
３４２−１２）を参照）の転写方向と同じであることを
示した。プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　　（３
４２（２）はメリーランド州ｏ　ッ’）　ｌ：’ルのア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから寄託
番号ＡＴＣＣ３７２２４のもとに入手可能である。
発　　　現 ＥＰＯを発現させるために次の方法を使用した。
方法■ ＤＮＡ　　ｐＢＰＶ−ＥＰＯを作成し、約２５μｇを使
用して約１×１０６個のＣ１２７Ｃローライー（Ｌｏｗ
ｙ）　らのＪ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、、　２６　：　２
９１−２９８　（１９７８）を参照〕および３Ｔ３細胞
を標準的なリン酸カルシウム沈殿法〔ダラム（Ｇｒａｈ
ｍ）らのＶｉｒｏｌｏｇＬ５２二４５Ｂ−４６７（１９
７３）を参照〕によりトランスフェクションした。トラ
ンスフェクションの５時間後、トランスフェクション用
培地を除き、グリセロールショック（ｇｌｙｃｅｒｏｌ
　５ｈｏｃｋ）を行い、洗浄し、そして１０％ウシ胎児
血清を含む新しいアルファ培地を加えた。４８時間後、
細胞をトリプシン処理して５００μｇ／ｍｌの抗生物質
０４１８を含むＤＭＥ培地中に１：１０の比で分散させ
〔サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）らのＨｏｔ、　Ａｐｐｌ
、　Ｇｅｎｅｔ、、　ｌ　：　３２７−３４１（１９ｇ
２）を参照〕、それらの細胞を２〜３週間インキュベー
トした。次いで、０４１８耐性コロニーをミクロタイタ
ーウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｗｅｌｌ）内に個々
に単離し、Ｇ４１８の存在下で培地全面がやや密集する
まで増殖させた。その後、細胞を洗浄し、１０％ウシ胎
児血清を含む新しい培地を加えて２４時間後に培地を収
穫した。その生産培地を試験し、ラジオイムノアッセイ
およびｉｎ　ｖｉｔｒｏバイオアッセイによりＥＰＯに
ついて陽性であることがわかった。
方法■ Ｃ１２７または３Ｔ３細胞を、方法Ｉで述べたように、
２５μｇのｐＢＰＶ−ＥＰＯと２μｇのｐＳＶ２ｎｅｏ
（サザンらの上記文献参照）を用いて同時トランスフェ
クションした。これは大体１０倍モル過剰のｐＢＰＶ−
ＥＰＯを使用する。トランスフェクション後の手法は方
法■と同じである。
方法■ 方法Ｉで述べたように、Ｃ１２７細胞を３０μｇのｐＢ
ＰＶ−ＥＰＯでトランスフェクションした。
トランスフェクションおよび分散（１：１０）の後、３
日おきに新しい培地と取り換えた。約２週間後にＢＰＶ
形質転換細胞の斑点が出現した。各々の斑点をミクロタ
イター皿の１　ｃｍ径のウェル内に別々に装置し、やや
密集した単層になるまで増殖させ、生産培地中のＥＰＯ
活性または抗原性について検定した。
実施例１３：ＥＰｏの精製 ＥＰＯ濃度が２００μｇ／ρ程度のＣＯＳ細胞生産培地
（１２Ｎ　）を０．４６５ｒｒ１″（５平方フイート）
の膜を備えたミリポアΦペリカン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
Ｐｅｌ　１１ｃａｎ）のような１０．０００分子量で分
離する限外消過膜を使用して、６００ｍ１に濃縮した。
検定は実施例５のようにしてＲＩＡで行った。限外ン濾
過からの濃縮物はｐＨ７，０に緩衝化したｌＯｍ　Ｍリ
ン酸ナトリウム４１に対して透析した。こうして濃縮お
よび透析された生産培地は全タンパク質３８０ｍｇ中に
ＥＰＯ２，５ｍｇを含んでいた。このＥＰＯ溶液をさら
に１８６ｍ１に濃縮し、沈殿したタンパク質を１１０．
０００　Ｘ　ｇで３０分間遠心することにより除いた。
Ｅ　Ｐ　Ｏ（２，０ｍｇ）を含む上清を５０％酢酸でｐ
Ｈ５，５に調節し、４℃で３０分間攪拌し、沈殿物を１
３、ＯＯＯＸｇで３０分間遠心することにより除いた。
カルボニルメチルセファロースクロマトグラフィー Ｅ　Ｐ　Ｏ２００μｇ　（全タンパク質２４ｍｇ）を含
む遠心上清（２０ｍｌ）を、ｌＯｍ　Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５，５）中で平衡化したＣＭ−セファロース（２
０ｍｌ）を充填したカラムに加え、同じ緩衝液４０ｍ１
で洗浄した。
ＣＭ−セファロースに結合したＥＰＯは１０ｍ　Ｍリン
酸ナトリウム（ｐＨ５，５）中のＮ　ａ　Ｕ　（０−１
）の勾装置００ｍ１で溶離した。ＥＰＯ含有画分（全タ
ンパク質２　ｍｇ中全全部５０μｇ）を集め、アミコン
（Ａｍｉｃｏｎ）　ＹＭＩＯ限外ン濾過膜を使って２ｍ
ｌに濃縮した。
逆相ＨＰＬＣ ＣＭ−セファロースからのＥＰＯを含む濃縮画分は、バ
イダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ−４カラムを使用する逆相Ｈ
ＰＬＣによりさらに精製した。ｌＯ％溶剤Ｂ（溶剤Ａは
０．１％ＣＦ　ＣＯＨ／Ｈ２０であす；溶剤Ｂは０．１
％ＣＦ３ＣＯ２Ｈ／ＣＨ３ＣＮである）で平衡化したカ
ラムに１ｍｌ／分の流量でＥＰＯを加えた。このカラム
を１０％溶剤Ｂで１０分間洗浄し、ＥＰＯを溶剤Ｂの直
線濃度勾配（６０分で１０〜７０％）で溶離した。ＥＰ
Ｏ含有画分（全タンパク質１２０μｇ中ＥＰＯ約４０μ
ｇ）を集めて凍結乾燥した。凍結乾燥ＥＰＯは０．１５
Ｍ　　Ｎ　ａ　ＣＩを−含む０．１Ｍトリス−ＨＣＮ　
　（ｐＨ７，５）中で再調製し、逆相ＨＰＬＣにより再
びクロマトグラフ処理を行った。ＥＰＯ含有画分を集め
、５ＤＳ−ポリアクリルアミド（１０％）ゲル電気泳動
により分析した〔ラメリ（Ｌａｍｃｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、
）、　Ｎａｔｕｒｅを参照〕。
集めたＥＰＯ画分は全タンパク質２５μｇ中ＥＰＯ１５
，５μｇを含んでいた。
発明の効果 本発明はヒトエリトロポエチンの効率的生産に使用でき
るヒトエリトロポエチンのクローン化逍伝子、組換えＤ
ＮＡベクターおよび該発現形質転換体を提供するもので
、各種貧血症の治療薬等の開発に利用できるものである
。
文　　　　献 １）Ｋｒｙｓｔａｌ、Ｇ、Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌ、１
１　：　６４９−６６０（１９８３）。
２）　Ｙａｎａｇａｗａ、　Ｓ、、　Ｈｌｒａｄｅ、　
Ｋ、、　０ｈｎｏｔａ、　Ｈ，。
５ａｓａｋｉ、　Ｒ，、Ｃｈｉｂａ、　Ｈ，、Ｖｅｄａ
、　Ｍ、、およびＧｏｔｏ、Ｍ、　Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、２５９　：　２７０７−２７１０（１９８４）。
３）Ｌａｗｎ、Ｒ，Ｍ、、Ｐｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｐ、、
Ｐａｒｋｅｒ、Ｒ。
Ｃ，、Ｂｌａｋｅ、　Ｇ、、およびＭａｎｉａｔｉｓ、
　Ｔ、　Ｃｅ１１１５　：　１１５７−（１９７８）。
４）　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ
、、およびｅｏｕｌｓｏｎ。
Ａ、Ｒ，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
、Ｕ、Ｓ、Ａ。
７４　：　５４６３−（１９７７）。
５）　Ｔｏｏｌｅ、　Ｊ、　Ｊ、、　Ｋｎｏｐｆ、　Ｊ
、　Ｌ、、　Ｗｏｚｎｅｙ、　Ｊ。
Ｍ、、Ｓｕｌｔｚｍａｎ、Ｌ、Ａ、Ｂｕｅｃｋｅｒ、Ｊ
、Ｌ、。
Ｐｉｔｔｍａｎ、Ｄ、Ｄ、、Ｋａｕｆｍａｎ、Ｒ，Ｊ、
、Ｂｒｏｗｎ、Ｅ、。
Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、　Ｃ，、Ｏｒｒ、　Ｅ、　Ｃ，、
Ａｍｐｈｌｅｔｔ。
Ｇ、　Ｗ、、　　Ｐｏ５ｔｅｒ、讐、　Ｂ、、　Ｃｏｅ
、　Ｍｏ、　Ｌ、、　　Ｋｎｕｔｓｏｎ。
Ｇ、　Ｊ、、　Ｆ’ａＳＳ、　Ｄ、　Ｎ、、および）ｌ
ｅＴＪｉｅｋ、　Ｒ，Ｍ。
Ｎａｔｕｒｅ　３１２　：　３４２−３４７　（１９８
４）８）　Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ、　Ｅ、　　Ｂｌｏｏ
ｄ　５ｕｐｐ１．　ｌ、　５ｇ。
ｘｌｉｌ　　（ａｂｓｔｒ）　　（１９８１）。
７）　Ｓｕｅ、　Ｊ、　Ｍ、およびＳｙｔｋｏｗｄｋｉ
、　Ａ、　Ｊ、　　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ’ｌ　　Ａｅａｄ、ＳｃＩ　　Ｕ、Ｓ、Ａ、８０
　　：　　３６５１−３６５５（１９８３）　。
８）　Ｂｅｒｓｃｈ、　Ｎ、およびＧｏｌｄｅ、　Ｄ、
　Ｗ、、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒ。
Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｅｒｙｔｈｒｏ−ｐｏｌｅｓｉ
ｓ、　Ｍ、　Ｊ、　Ｍｕｒｐｈｙ（Ｅｄ、）　Ｎｅｗ　
Ｙｏｒｋ　：　　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　　
（１９７８）。
９）　Ｃｏｔｅｓ、　Ｐ、　Ｍ、およびＢａｎｇｈａｍ
、　Ｄ、　Ｒ，Ｎａｔｕｒｅ１９１　：　　１０６５−
（１９６１）。
１０）　Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ、　Ｅ、およびＧｒｏｓ
ｓ、　Ｍ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＥｎｚｙｍｏｌ　　
３７　：　１０９−１２１　（１９７５）。
１１）　Ｗｏｏ、　Ｓ、　Ｌ、　Ｃ，、Ｄｕｇａｉｃｚ
ｙｋ、　Ａ８．　Ｔｓａｉ、　Ｍ、−Ｊ、、　Ｌａｄ、
　Ｅ、　Ｃ，、Ｃａｔｔｃｒａｌｌ、　Ｊ、　Ｆ、およ
び０°Ｍａｌｌｅｙ、　　Ｂ、　　Ｗ、　　Ｐｒｏｃ、
　　Ｎａｔ’１．−Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、　　７５　：　　３８８８−（１９７ｇ）
。
１２）　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｓ、およびにＩｎｇＳｔ
Ｏｎ、　１．　Ｂ、　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　−Ｕ、　Ｓ、　Ａ
、　８０　：　６８３８−６８４２（１９８３）　。
１３）　Ｂｅｎｔｏｎ、　Ｗ、　Ｄ、およびＤａｖｉｓ
、　Ｒ，Ｗ。
５ｃｉｅｎｃｅ　　１９６　：　１８０−１８２　（１
９７７）。
１４）　Ｓｈｅｒｗｏｏｄ、　Ｊ、　Ｂ、およびＧｏｌ
ｄｗａｓｓｅｒ、　Ｅ。
Ｂｌｏｏｄ　　５４　：　８８５−８９３　（１９７９
）。
１５）　Ｄｅｒｍａｎ、　Ｅ、、　Ｋｒａｕｔｅｒ、　
Ｋ、、　Ｗａｌｌｉｎｇ、　Ｌ、。
Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ，、Ｒａｙ、　Ｍ、、およ
びＤａｒｎｅｌｌ、　Ｊ。
Ｔ、、劇旦２３　：　７３１−（１９８１）。
１Ｂ）　Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｙ、、　　Ｃｅ旦２３　：
　１７５−１８２　（１９８１）。
１７）　Ｈｅｗｉｃｋ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｈｕｎｋａｐｉ
ｌｌｅｒ、　Ｍ、　Ｅ、、　Ｈｏｏｄ。
Ｌ、　Ｅ、、およびＤｒｅｙｅｒ、　Ｗ、　Ｊ、　Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。
２５６　：　７９９０−７９９７　（１９８１）。
【図面の簡単な説明】
第１図はヒト胎児肝臓ｍＲＮＡ中のＥＰＯｍＲＮＡの検
出を示す電気泳動図であり；第２図はラムダ−ＨＥＰＯ
ＦＬＩＳ中（７）ＥＰＯｃＤＮＡのヌクレオチド配列の
模式図であり；第３図は４個の独立したヒトＥＰＯゲノ
ムクローンのＤＮＡ挿入物の相対位置を示し；第４図は
ヒトＥＰＯ遺伝子のイントロンおよびラスミド９１０２
３　（Ｂ）の作成を示し；第６図は天然ＥＰＯと比較し
たときのＣＯ５−１細胞で生産されたＥＰＯのＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル分析を示し； 第７図はＥＰＯの発現用プラスミドｐＲＫＩ−４（実施
例９参照）の模式図であり；そして 第８図は、実施例１２で材料として用いたプラスミドｐ
ｄ　Ｂ　Ｐ　Ｖ　−Ｍ　Ｍ　Ｔ　ｎｅｏ（３４２−１２
）模式図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）リーダー部分とマチュア部分とから成り、マチュア
    部分が下記のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列であ
    るエリトロポエチンをコードするｃＤＮＡ。 【遺伝子配列が有ります】 ２）マチュア部分が下記のＤＮＡ配列である特許請求の
    範囲第１項に記載のｃＤＮＡ。 【遺伝子配列が有ります】 ３）リーダー部分が下記のアミノ酸配列をコードするＤ
    ＮＡ配列である特許請求の範囲第１項に記載のｃＤＮＡ
    。 【遺伝子配列が有ります】 ４）リーダー部分が下記のＤＮＡ配列である特許請求の
    範囲第３項に記載のｃＤＮＡ。 【遺伝子配列が有ります】 ５）リーダー部分とマチュア部分が下記のＤＮＡ配列で
    ある特許請求の範囲第１項に記載のｃＤＮＡ。 【遺伝子配列が有ります】 ６）リーダー部分とマチュア部分とからなり、マチュア
    部分が下記のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列であ
    るエリトロポエチンをコードするｃＤＮＡを含む組換え
    ＤＮＡベクター。 【遺伝子配列があります】 ７）マチュア部分が下記のＤＮＡ配列である特許請求の
    範囲第６項に記載の組換えＤＮＡベクター。 【遺伝子配列があります】 ８）リーダー部分が下記のアミノ酸配列をコードするＤ
    ＮＡ配列である特許請求の範囲第６項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクター。 【遺伝子配列があります】 ９）リーダー部分が下記のＤＮＡ配列である特許請求の
    範囲第８項に記載の組換えＤＮＡベクター。 【遺伝子配列があります】 １０）リーダー部分とマチュア部分が下記のＤＮＡ配列
    である特許請求の範囲第６項に記載の組換えベクター。 【遺伝子配列があります】 １１）プラスミドＲＫ１−４を用いて構築された特許請
    求の範囲第１０項に記載の組換えＤＮＡベクター。 １２）リーダー部分とマチュア部分とからなり、マチュ
    ア部分が下記のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列で
    あるエリトロポエチンをコードするｃＤＮＡを含む組換
    えベクターで哺乳動物細胞を形質転換させて得られる形
    質転換体。 【遺伝子配列があります】 １３）マチュア部分が下記のアミノ酸をコードするＤＮ
    Ａ配列である特許請求の範囲第１２項に記載の形質転換
    体。 【遺伝子配列があります。】 １４）リーダー部分が下記のアミノ酸をコードするＤＮ
    Ａ配列である特許請求の範囲第１２項に記載の形質転換
    体。 【遺伝子配列があります。】 １５）リーダー部分が下記のＤＮＡ配列である特許請求
    の範囲第１４項に記載の形質転換体。 【遺伝子配列があります。】 １６）リーダー部分とマチュア部分とからなるＤＮＡ配
    列が下記のＤＮＡ配列である特許請求の範囲第１２項に
    記載の形質転換体。 【遺伝子配列があります。】 １７）哺乳動物細胞がＣＨＯである特許請求の範囲第１
    ２項に記載の形質転換体。 １８）哺乳動物細胞がＤＨＦＲ＾−／ＣＨＯであり、組
    換えＤＮＡベクターがＲＫＦＬ１３である特許請求の範
    囲第１２項に記載の形質転換体。 １９）哺乳動物細胞がＣ１２７である特許請求の範囲第
    １２項に記載の形質転換体。 ２０）哺乳動物細胞が３Ｔ３である特許請求の範囲第１
    ２項に記載の形質転換体。
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