CZ286557B6 - Způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu - Google Patents

Způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu Download PDF

Info

Publication number
CZ286557B6
CZ286557B6 CZ19961274A CZ127496A CZ286557B6 CZ 286557 B6 CZ286557 B6 CZ 286557B6 CZ 19961274 A CZ19961274 A CZ 19961274A CZ 127496 A CZ127496 A CZ 127496A CZ 286557 B6 CZ286557 B6 CZ 286557B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
epo
cells
hepo
recombinant
nacglc
Prior art date
Application number
CZ19961274A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ127496A3 (cs
Inventor
Edward Fritsch
Rodney M. Hewick
Kenneth Jacobs
Randal J. Kaufman
Original Assignee
Genetics Institute, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27418329&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ286557(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genetics Institute, Inc. filed Critical Genetics Institute, Inc.
Publication of CZ127496A3 publication Critical patent/CZ127496A3/cs
Publication of CZ286557B6 publication Critical patent/CZ286557B6/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00Preparation of peptides or proteins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505Erythropoietin [EPO]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10Plasmid DNA
    • C12N2800/108Plasmid DNA episomal vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00Vector systems having a special element relevant for transcription
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu, hEPO, který zahrnuje stupně a) kultivace CHO buněk, které obsahují DNA sekvenci kódující hEPO operativně připojenou k expresní kontrolní sekvenci, ve vhodném médiu a b) získání a separace produkovaného rekombinantního hEPO z buněk a média, při němž se použije CHO buněk majících schopnost poskytovat N- a O-připojenou glykosylaci se zavedením fukózy a N-acetylgalaktosaminu, přičemž z buněk a média se získá a oddělí rekombinantní hEPO s N- a O-připojenou glykosylací. Rekombinantní hEPO s výhodou vykazuje následující glykosylační profil: molární poměr hexos k N-acetylglukosaminu (Nacglc) 1,4 : 1, konkrétně molární poměr galaktózy k Nacglc 0,9 : 1 a manózy k Nacglc 0,5 : 1.ŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká způsobu produkce rekombinantního lidského erythropoietinu.
Dosavadní stav techniky
Eiythropoietin (dále označován jako EPO) je cirkulující glykoprotein, který stimuluje tvorbu erythrocytů ve vyšších organismech, viz Camot a spol., Compt. Rend., 143:384 (1906). Jako takový je EPO někdy označován jako eiythrocyty stimulující faktor.
Doba životnosti lidských erythrocytů je asi 120 dnů. Asi 1/120 celkových erythrocytů je denně odbourána v retikulo-endotheliálním systému. Současně je denně produkována relativně konstantní počet erythrocytů, aby byla stále udržena určitá hladina erythrocytů (Guyton, Textbook of Medical Physiology, str. 56 až 60, W.B. Saunders Co., Philadelphia 1976).
Erythrocyty jsou produkovány zráním a diferenciací erythroblastů v kostní dřeni a EPO je faktor, který působí na méně diferencované buňky a indukuje jejich diferenciaci k erythrocytům (viz výše).
EPO je slibným terapeutickým prostředkem pro klinickou léčbu anemie nebo konkrétně renální anemie. V praktické terapii není používání EPO dosud bohužel běžné pro jeho malou dostupnost.
Pro použití EPO jako terapeutického prostředku je třeba uvážit možné problémy antigenicity a proto je výhodné připravovat EPO ze suroviny lidského původu. Je možno například používat lidskou krev nebo moč pacientů, postižených aplastickou anemií nebo podobnými nemocemi, která způsobují vylučování velkého množství EPO. Tyto suroviny však jsou k dispozici v omezeném množství, viz například White a spol, Rec. Progr. Horm. Res., 16; 219 (1960), Espada a spol., Biochem. Med., 3; 475 (1970), Fisher, Pharmacol. Rev., 459 (1972) a Gordon, Vitam. Horm. (N.Y.) 31; 105 (1073).
Příprava EPO produktů se obvykle prováděla koncentrací a čištěním moči pacientů, vykazujících vysokou úroveň EPO, například pacientů postižených aplastickou anemií a podobnými nemocemi, viz například patenty US 4397840, 430365é a 3865801. Omezená zásoba takovéto moči je překážkou praktického použití EPO a tudíž je velmi žádoucí, připravovat EPO produkty z moči zdravých osob. Problém použití moči zdravých lidí spočívá v jejím nízkém obsahu EPO ve srovnání s anemickými pacienty. Moč zdravých jedinců obsahuje určité inhibiční faktory, které v dostatečně vysoké koncentraci působí proti erythropoese, takže dostatečný terapeutický účinek může být u EPO, získaného z takové moči, dosažen pouze s použitím následujícího významného postupu čištění.
EPO lze rovněž regenerovat z ovčí krevní plasmy a separace EPO z této krevní plasmy poskytla dostatečně potentní a stabilní vodorozpustné preparáty, viz Goldwasser, Control Callular Dif. Develop, díl A, str. 487 až 494, Alan R. Liss, lne. N.Y. (1981). Lze však očekávat, že ovčí EPO bude pro lidi antigenní.
Běžné izolační a čisticí metody s použitím přírodních zdrojů EPO tedy nejsou adekvátní masové produkci tohoto žádaného terapeutického prostředku.
-1 CZ 286557 B6
Sugimoto a spol. v patentu USA č. 4377513 popisují jeden ze způsobů masové produkce EPO, zahrnující multiplikace in vivo lidských lymfoblastoidních buněk, zahrnujících Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 a JBL.
Zprávy o produkci EPO jinými metodami genetického inženýrství se objevily ve standardní literatuře. Nebyl však zatím publikován reprodukovatelný způsob výroby ani chemická charakteristika produktu. Předmět tohoto vynálezu naproti tomu představuje reprodukovatelný způsob masové produkce proteinů, vykazujících biologické vlastnosti lidského EPO. Tímto způsobem je možno rovněž produkovat proteiny, které se mohou chemicky lišit od autentického lidského EPO a současně vykazovat podobné (a v některých případech zlepšené) vlastnosti. Pro jednoduchost se zde všechny proteiny, vykazující biologické vlastnosti lidského EPO označovány jako EPO bez ohledu na to, zda s ním jsou nebo nejsou chemicky identické.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu, hEPO, zahrnující stupně
a) kultivace buněk zvaječníků čínského křečka (CHO) které obsahují DNA sekvenci kódující hEPO operativně připojenou k expresní kontrolní sekvenci, ve vhodném médiu a
b) získání a separace produkovaného rekombinantního hEPO z buněk a média, jehož podstata spočívá v tom, že se použije CHO buněk majících schopnost poskytovat N- a O-připojenou glykosylaci se zavedením flukózy a N-acetylgalaktosaminu, přičemž z buněk a média se získá a oddělí rekombinantní hEPO s N- a O-připojenou glykosylaci.
Podle vynálezu se používá rekombinantních technik klonování genu exprimujícího překvapivě vysoké hladiny lidského EPO, jeho exprese a masové produkce aktivního lidského EPO in vitro. Jsou také popsány vhodné expresní vektory pro produkci EPO, expresní buňky, schémata čištění a příbuzné procesy.
Jak je podrobněji dále popsáno, byl EPO získán v částečně čištěné formě a byl dále čištěn do homogenity a štěpen trypsinem za vzniku specifických fragmentů. Tyto fragmenty byly čištěny a sekvenovány. EPO oligonukleotidy byly navrženy a syntetizovány na základě těchto sekvencí. Tyto oligonukleotidy byly použity ke screeningu lidské genomické knihovny, ze které byla izolován EPO gen.
EPO gen byl ověřen na základě své DNA sekvence, která odpovídala mnoha ze sekvenovaných tryptických proteinových fragmentů. Část genomického klonu pak byla použita po demonstraci při hybridizaci, že EPO mRNA by mohla být detegována v lidské fetální mRNA (stáří 20 týdnů). Byla připravena cDNA knihovna jater lidského plodu a byla screenována. Byly získány tři EPO cDNA klony (po screeningu 750000, rekombinantů). Dva z těchto klonů byly stanoveny jako mající plnou délku podle kompletní kódující sekvence a v podstatě 5-konec a 3-konec netranslatované sekvence. Tyto cDNA byly exprimovány jak v SV-40 virem transformovaných opičích buňkách (COS-1 buněčná linie; Gluzman, Cell 23:175-182 (1981)) a buňkách vaječníků čínských křečků (buněčná linie CHO; Urlaub G. a Chasin L. A. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216—4280 (1980)). EPO produkovaný COS buňky je biologicky aktivní EPO in vitro a in vivo. EPO produkovaný z CHO buněk je také biologicky aktivní in vitro a in vivo.
EPO cDNA klon má zajímavý otevřený čtecí rámeček 14-15 aminokyselin (aninoacids-aa) s iniciátorem a terminátorem ze 20 až 30 nukleotidů (nt) proti směru kódující oblasti. Reprezentativní vzorek E. coli transfektované klonovaným EPO genem byl uložen v Američan
-2CZ 286557 B6
Type Culture Collection, Rockville, Maryland, který je dostupný pod přírůstkovým číslem ATCC 40153.
Popis obrázků na výkresech
Tabulka 1 je sekvence 87 párů bází exonu lidského EPO genu;
obr. 1 ilustruje detekci EPO mRNA v lidské fetální jatemí mRNA, tabulka 2 ilustruje aminokyselinovu sekvenci EPO proteinu odvozenou z nukleotidovou sekvenci lambda-HEPOFL13;
tabulka 3 ilustruje nukleotidovou sekvenci EPO cDNA v lambda-HEPOFL13 (uvedena schematicky na obr. 2) a z ní odvozenou aminokyselinovou sekvenci;
obr. 3 ilustruje relativní polohy DNA inzertů čtyř nezávislých lidských EPO genomických klonů;
obr. 4 představuje mapu zjevné intronové a exonové struktury lidského EPO genu;
tabulka 4 ilustruje DNA sekvenci EPO genu ilustrovanou na obr. 4B;
obr. 5A, 5B a 5C ilustrují konstrukci vektoru 910(B);
obr. 6 ilustruje SDS polyakrylamidovou gelovou analýzu EPO produkovaného v COS-1 buňkách ve srovnání s nativním EPO, tabulka 6 ilustruje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci EPO klonu, lambda-HEPOFL8; tabulka 7 ilustruje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci EPO klonu, lambda-HEPOFL13; obr. 7 je schematicky ilustrací plasmidu pRkl-4 a obr. 8 je schematicky ilustrací plasmidu pdBPV-MMTnebo (342-12).
Předložený vynález se týká klonování EPO genů a produkce EPO in vitro expresí těchto genů.
V patentové a vědecké literatuře je uváděno mnoho způsobů vhodných pro produkci rekombinantních proteinů. Obecně tyto techniky zahrnují izolaci nebo syntézu požadované genové sekvence a expresi takové sekvence buď v prokaryotické, nebo eukaryotické buňce za použití technik běžně odborníkům známých. Jakmile byl gen izolován, čištěn a inzertován do transfer vektoru (tj. klonován), je zajištěna dostupnost podstatného množství. Vektor s do něj klonovaným genem je transferován do vhodného mikroorganismu, nebo buněčné linie, například bakterie, kvasinky, savčích buněk jako jsou COS-1 buňky (opičí ledviny), CHO (vaječníky čínského křečka), hmyzí buněčné linie a podobně, kde se vektor replikuje při proliferaci mikroorganismu nebo buněčné linie a ze kterých vektor může být izolován běžnými prostředky. Je tak poskytnut obnovitelný zdroj genu pro další manipulace, modifikace a transfery do jiných vektorů nebo jiných míst v tomtéž vektoru.
Exprese může být často dosažena transferováním klonovaného genu, ve správné orientaci a čtecím rámečku, co vhodného místa v transfer vektoru, tak že translační čtecí postup z prokaryotického nebo eukaryotického genu vede k syntéze proteinového prekurzoru, obsahujícího aminokyselinovou sekvenci, kódovanou klonovaným genem připojeného k Met nebo aminokoncové sekvenci zprokaryotického nebo eukaryotického genu. V obou případech mohou být signály pro iniciaci traskripce a translace dodány vhodným genomickým fragmentem klonovaného genu. Mnoho specifických technik štěpení proteinů může být použito pro štěpení proteinového prekurzoru, je-li produkován, v požadovaném bodě tak, aby se uvolnila požadovaná aminokyselinová sekvence, která může být pak čištěna obvyklými prostředky. V některých případech je protein, obsahující požadovanou aminokyselinovou sekvenci produkován bez potřeby specifických technik štěpení a může být také uvolněn z buněk do extracelulámího růstového média.
-3CZ 286557 B6
Izolace genomického klonu lidského EPO
Lidský EPO byl čištěn do homogenity z moči pacientů postižených aplastickou anemií jak popsáno dále. Úplné štěpení tohoto čištěného EPO proteázovým trypsinem poskytlo fragmenty, které byly odděleny vysokotlakou kapalinovou chromatografíi s reverzní fází, získány z gradientových frakcí a podrobeny mikrosekvenční analýze. Sekvence tryptických fragmentů jsou podrženy v tabulkách 2 a 3 a jsou podrobněji diskutovány dále. Dvě aminokyselinové sekvence, Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys a Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg, byly zvoleny pro návrh oligonukleotidových sond (vedoucích k oligonukleotidovém poolu 17 nt dlouhému a 32 krát degenerovanému a oligonukleotidovému poolu 18 nt dlouhému a 128-krát degenerovanému, ze dřívějšího tryptického fragmentu jakož i dvou poolů 14nt dlouhého, vždy 48-krát degenerovaného, z pozdějšího tryptického fragmentu). 32-krát degenerovaný 17merový pool byl použit pro screening lidské genomické DNA knihovny v Ch4A vektoru (22) za použití modifikace Woo-a a O'Malleye v in šitu amplifikačním postupu (47) pro přípravu filtrů pro screening.
Arabské číslice v závorkách (1) až (60) jsou použity pro označení publikací, které jsou uvedeny v podle čísel na konci tohoto popisu.
Fágy, hybridizující k 17meru, byly vybrány, spojeny do malých skupin a sondovány se 14merovými a 18merovými pooly. Fágy, hygridizující k 17merovým, 18merovým a 14merovým poolům, byla plakově čištěny a fragmenty byly subklonovány do M13 vektorů pro sekvenaci dideoxy-řetězec ukončující metodou podle
-4CZ 286557 B6 gutcctacgcctgtggccagggccagagccttcagggaeecttgactccccgggct.gtgtgcaU_tcag
u t-4 CJ < X
< z: < J
2
< ca O fc,
< < Η H
0 ~ O
< H O ,2
o o O <
H S H ·<
< ω < >»
< < Η H
2 * C~* Q
=1
O m 0 >> <H c-< s ·*-> o o
H O 0 > «UJ <W
0 < ω Rt-J
< >> ·*.*
0 z: < ►J ^—1 -♦u 4»u
< ~ O Í4 +-»
< 2 o
0 o < £-f O O w
é-1 . o Q. <*u br
o ,2 < ω
σ < 0 < br br Ό
0 < O o >4 O < 3
£-f O o »4 0 0
Q _ o 0 Ch
>*l ř*’» ···< H F-M o .J-t fc3
0 o 0 > < s
0 H 0 ho
o x: 0 x: O μ·
< H < < <
o *-» « ba
Λ rt tfl a ώ hc tu a. « C3 ta *-» ctf hĎ tfl
Tabulka
-5ČZ 286557 B6
o >- ω
d —J
d LU θ Λ*
CO o
>- UJ d
UJ —J <
—> LU -J <x > Clu Asn
co o d 3 5
3E O- w O
=□ c
<r UI O 0
> —J wJ <
>- >- 3
—1 —1 > ϋ
o LU U)
Tabu 1ka
Pro Asp Thr Lys Val Asn Plic Tyr Ala Trp Ly3 Ar(j Mot Clu Vol Gly Gin Gin Ala
-6CZ 286557 B6
Tabulka 2 (pokrač.
Tabulka 3 cccbb“ECc ECa«CCCKc caccgcficcc cccctcctccg acáccgcccc
5ÍŽ O ϋ c <
c
u á o
>»o >
-< ϋ ·*
O ϋ c
«< u co
> δ u <
3 O 3
4)
O o •J
ai ϋ
o H e
X -4 >
MO o
U <□ w
«C < <
M ca 4J V v to 8 o F*
U 00 u CJ
04 u
00 u ts H
co M u v 2
4U 4 U
oa 00 a O
u M to H
u «
<J a
CO 00 ca M
Q y -4 U
U W
U 4-1 CJ u => O
u co ω f·
—< < *»4 O
U 5 u o O u
α o U U O a
υ o v u Z H
H w H ►-I Q <
« O 3 O c O O •cí
CJ o σ H O u o *><
< o r- u <J c\ Ar u •M <
μ > 3 P Cl F- Λ o < «3
l·* H u o u c --
o O a u e e -
-4 CJ u o
El H < O Ι- w
c V) s 3 P cl F> Ο u 8 P
< í u a o P
f-t c C3 μ
« F< w O ·<
> Q U Q Q u 4-
o e 9 u o
>> c «J ϋ
«-J e o M H U
μ o n.e u H P
o u o e CJ a
H < Η H W
CLO -A O 1 C1 CJ
10 < d « VI1 <
< o > b <1 <
O á 3 *í O f 0
M -1 ·*. a ί- W
A. o CJ ϋ > ο .J
f4 o < - C3 >>
4 H d F· H
> O > <□ o
-8CZ 286557 B6
O S3 so ·-< <
w O a €0 u t0 co a
u u eo n u a u aj
q CO jo u CO Q co AJ
u AJ £0 au CJ U co u
C3 O AJ u a eo eo AJ
a u u *j 00 £0 4J
u co *j n *3 AJ CJ ?3
u d u *3 to U AJ
«3 <j i-í £0 CO ?3 e0
U <j «U Q a U
S) ΞΖ »H
c.
<
o třfo <
u > H
aj £0 u AJ cj aO f? eo
U U to u CJ AJ £0 40
u e3 a co za U AJ AJ
υ a £0 a AJ a 40 40
AJ u a u .J a U 40
a AJ co co to co u CO
o cj π c: AJ σ u
fj £4 CJ co AJ eo u
o n u Λ AU CO a u
u u u CO a aj co u
Ala CCT 5 ►w
μ H «5
<J >
H <
a υ -
rM H CJ
►«· <
U < O
CJ >s
H < U
£É
T-* < CO cj O
Ό Λ O = cj o Cw
μ< r-j <u H ΜΊ >-
— »4 4J <
O
Q. O <
z u CJ v
CJ >-»
cn H e
rt CJ 43
Λ1 < o C-
5 e f-< e
CJ C“.
m < CJ <
t-< u < U
<u CJ O
w H tsi
n CJ u
CJ >
< CJ
c A-f
CJ Q
< CJ >
e H
tn <
< o <
c < Q
a. CJ
A. CJ Cw
O H
u a
a- CJ •j
a AJ co Λ r? u CJ AJ
o u AJ u & CJ £0 co
u AJ CJ aj a a C3 eo
AJ u ?3 4J o eo a CO
to a Λ 30 40 CJ eo
AJ to £0 u IO Γ3 eo 40
CJ tO to co O to co tj
u CO «3 <3 u CO AJ u
co a CO rt u CJ eo AJ
eo eo a <4 σ <J eo U
eo U u to u CJ 40 AJ
AO AJ •J rt 30 co AJ CJ
O CO to U to eo (J eo
u u to to CJ eo CJ eo
<J u £0 n AJ o CJ 40
CJ CJ CO £O u u 40 CJ
u u a a a AJ CJ 40
AJ <0 u u u ro S? u
to a 40 u AU CJ o CJ
w co CJ o O v eo eo
eo u AJ AJ ta CO a eo eo
to Q a co c AJ co 40
co U o eo co U AU u
Q u P3 u υ a eo
CJ O CO eO a a CJ eo
u rj AJ AJ u CJ to
U *3 AJ eo eo co ca
< U a u CJ CJ eo CQ
Q CO CJ *3 o 40 CJ AJ
r* CJ co rj eo 4J a a
Ό C3< O U O
— c < o
0.0 u CJ
w < u
< o 40
XC3 U u CJ
-4 <J a
O u u
a a a
u u a
u eO £0
eo CO CO
AU ta eo
co Γ3 AJ
<a CJ CJ
o n eo
u u AU
AJ 44 <a
u CJ CO
AJ AJ eo
eo u <3
AJ 4J U
U ta a
u co co
<3 a
u u a
4J CJ co
AJ AJ AU
a CJ co u Q CJ m
o Q 4J Q CO AJ CJ
u U CO u 4J u
co <3 eo Π co U «3
AJ 00 eO co co <3
30 to <3 a n to CO
AJ iU rj u co CO
u Λ3 «j Q ca co CO
U U U CO AJ 4J
to u aJ GO «j U CO
aacctcactg acaagnactg anaccaccaa aaaaanaanaaa
-9CŽ 286557 B6
Sangera a Coulsona (23) (1977). Sekvence regionu, hybridizujícího ke 32nábosně degenerovanému 17meru v jednom z klonů, je uvedena v tabulce 1. DNA sekvence obsahuje v otevřeném čtecím rámečku nukleotidy, které by mohly přesně kódovat tryptický fragment použitý k odvození 17merového poolu oligonukletidů. Dále analýza DNA sekvence indikuje, že 17merový hybridizující region byl obsažen v 87bp exonu, navázaném v místech potenciálního sestřihu akceptoru a donoru.
Pozitivní potvrzení, že tyto dva kolony (zde označené jako lambda-HEPOl a lambda-HEP02) jsou EPO genomické klony byly získány sekvenováním další exonů, obsahujících jiný tryptický fragment kódující informaci.
Izolace EPO cDNA klonů
Byla provedena Northem analýza (56) lidské fetální (20) týdnů staré) jatemí MRNA za použití 95nt jednořetězcové sondy připravené z Ml3 klonu, obsahujícího část 87bp exonu popsaného v tabulce 1. Jak je ilustrováno na obr. 1 bylo možno detegovat silný signál ve fetální jaderné MRNA. Přesná identifikace tohoto pásu jako EPO MRNA byla provedena za použití stejné sondy ke screeningu bakteriofágové lambda cDNA knihovny fetální jatemí mRNA (25). Bylo získáno několik hybridizujících klonů při frekvenci přibližně 1 pozitivní na 250000 rekombinantů. Kompletní nukleotid a odvozené od těchto klonů (lambda-HEPOFL13 a lambdas-HEPOFL8) jsou uvedeny v tabulkách 5 a 6. EPO kódující informace je obsažena v 594nt v 5-konec polovině cDNA, zahrnující velmi hydrofobního 27 aminokyselinového leadru a 166 aminokyselinového zralého proteinu.
Identifikace N-konce zralého proteinu byla založena na N-koncové sekvenci proteinu sekretovaného do moči osob saplastickou anemií, viz tabulka 1, a jak publikoval Goldwasser (26), Sue a Sytkowski (27) a Yangawa (21). Zda tento N-konec (Ala-Pro-Pro-Arg-) představuje skutečný N-konec navázaný na EPO v oběhu nebo zda probíhá nějaké štěpení v ledvinách nebo moči, není v současné době známo.
Aminokyselinové sekvence, které jsou podtrženy v tabulkách 2 a 3 označují ty typické fragmenty nebo části, ze kterých byla získána proteinová sekvence. Dedukovaná sekvence přesně souhlasí s typickými gragmenty, které byly sekvenovány, potvrzuje, že izolovaný gen kóduje lidský EPO.
Struktura a sekvence lidského EPO genu
Relativní poloha DNA inzertů čtyř nezávislých lidských EPO genomických klonů jsou uvedeny na obr. 3. Hybridizační analýza těchto klonů s oligonukleotidovými sondami a s různými sondami připravenými ze dvou tříd EPO cDNA klonů umísťuje EPO gen do přibližně 3,3 kb oblasti znázorněné na obr. 3 tmavou čarou. Kompletní sekvenční analýza této oblasti (viz příklad 4) a porovnání s cDNA klony, vede k mapě intronové a exonové struktury EPO genu, uvedené na obr. 4. EPO gen je rozdělen do 5 exonů. Část exonu I, celé exony II, III a IV a část exonu V, obsahují protein kódující informaci. Zbylé exony I a V kódují 5-konec a 3-konec netranslatované sekvence.
Přechodná exprese EPO v COS buňkách
K demonstrování, že biologicky aktivní EPO by mohl být exprimován v in vitro buněčném systému, byla proveden COS buněčná expresní studie (58). Vektor použitý pro přechodné studie, p91023(B), je popsán v příkladu 5. Tento vektor obsahuje edanovirový hlavní pozdní promotor, SV40 polyadenylační sekvenci, SV40 původ replikace, SV40 enhancer a adenovirový VA gen. CDNA inzert v lambda-HEPOFL 13 (viz tabulka 6) byla inzertována do p91023(B)
-10CZ 286557 B6 vektoru, po směru od hlavního pozdního promotoru. Tento nový vektor je označen jako PPTFL13.
Dvacetčtyři hodin po transfekci tohoto konstruktu do M6 kmene COS-+ buněk (Horowitz a 5 spol., J. Mol. Appl. Genet.2:147-149 (1983)), byly buňky promyty, přemístěny do séra prostého média a buňky byly sklizeny o 48 hodin později. Hladina uvolnění EPO do supematantu kultury pak byla hodnocena za použití kvantitativní radioimunozkoušky pro EPO (55). Jak je uvedeno v tabulce 8 (příklad 6), byl exprimován imunologicky reaktivní EPO. Biologická aktivita EPO produkovaného z COS-1 buněk byla také hodnocena. V odděleném pokuse byl vektor, 10 obsahující EPO cDNA a lambda-HEPOFL13 transfektován do COS-1 buněk a médium bylo sklizeno jak popsáno výše. EPO v médiu byl pak kvantifikován buď ve dvou in vitro biologických zkouškách, 3H-thymidinem a CFU-E (12, 29) a buď dvěma in vivo zkouškami, hypoxickou myší a vyhladovělou myší (30, 31) viz tabulka 9, příklad 7). Tyto výsledky demonstrují, že biologicky aktivní EPO je produkován v COS-1 buňkách. Při Westem-blottingu 15 za použití polyklonálních anti-EPO protilátky, EPO produkovaný COS buňkami má mobolitu na
SDS-polyakrylamidových gelech, která je identická s mobilitou nativního EPO připraveného z lidské moče (příklad 8). Rozsah glykosylace EPO produkovaného COS-1 může být podobný jako u nativního EPO.
Různé vektory, obsahující jiné promotory mohou být také použity v COS buňkách nebo v jiných savčích nebo eukaryotických buňkách. Příklady takových jiných promotorů vhodných při provedení vynálezu zahrnují SV40 časné a pozdní promotory, promotor myšího metallothioneinového genu, promotor nalezený v dlouhých terminálních opakováních ptačích nebo savčích retrovirech, promotor bakulovirového polyhedron genu a jiné. Příklady typů jiných 25 buněk vhodných v praktickém provedení tohoto vynálezu zahrnují E. coli, kvasinkové, savčí buňky jako jsou CHO (vaječník čínského křečka), Cl27 (opičí epithel), 3T3 (myší fibroblast), CV-1 (ledviny africké opice - Africal green monkey kidney) a hmyzí buňky, jako jsou buňky ze Spodoptera frugiperda a Dropophila metanogaster. Tyto alternativní promotory a/nebo buněčné typy mohou umožňovat regulaci načasování nebo hladiny EPO exprese, produkce buněčně 30 specifických typů EPO nebo růstu velkých množství EPO produkujících buněk za méně nákladných snadněji kontrolovaných podmínek.
Expresní systém, který si zachovává výhody savčí exprese, ale vyžaduje kratší dobu pro produkci vyšší hladiny exprese buněčné linie, se skládá ze hmyzí buněčné linie a DNA viru, který se 35 reprodukuje v této buněčné linii. Virus je virus jaderné polyhedrozy. Má dvojvláknový cirkulámí
DNA genom o velikosti 128 kb. Nukleokapsid je tyčkovitě tvarován a nalézá se obalen ve dvou formách, neokludované formě viru prorůstajícího membránou a okludované formě, obalené v proteinovém krystalu v jádru infikované buňky. Tyto viry mohou být rutinně propagovány v in vitro hmyzí buněčné kultuře a jsou přizpůsobivé všem rutinním virovým metodám u živočichů. 40 Médium buněčné kultury je typicky živný solný roztok a 10% fetální telecí sérum.
In vitro je růst viru iniciován, jestliže neokludovaný virus (NOV) vstupuje do buňky a přechází do jádra, kde se replikuje. Replikace je jaderná. Během počáteční fáze (8-18 h po infekci) virové aplikace, jsou nukleokapsidy shromážděny v jádře a následně prorůstají plasmovou membránou 45 jako NOV, a rozšiřují infekci v buněčné kultuře. Navíc některé nukleokapsidy následně (18+ h po infekci) zůstávají v jádře a jsou okludovány v proteinové matrici a jsou známy jako polyhedrální inkluzní tělísko (PIB). Tato forma není v buněčné kultuře infekční. Matrice je složena z proteinu známého jako polyhebrin, mol. hmotnost 33 kd. Každý PIB má přibližně 1 mm v průměru a v jádře může být až 100 PIB. V pozdní fázi infekčního cykluje produkován tak 50 velký podíl polyhedrinu, činící až 25 % celkového buněčného proteinu.
Protože PIB nehraje žádnou roli v in vitro replikačním cyklu, může být polyhedrinový gen deletován z virového chromosomu bez ovlivnění životaschopnosti in vitro. Při použití viru jako expresního vektoru byla nahrazena polyhedrinový gen kódující oblast cizí DNA, která má být
-11CZ 286557 B6 exprimována a byla tak umístěna pod kontrolou polyhedrinového promotoru. Výsledkem je virový fenotyp, netvořící PIB.
Tento systém byl použit několika výzkumníky, z nichž jsou nejčastěji uváděni Pannock a spol. a Smith a spol. Pennock a spol. (Gregory D. Pennock, Charles Shoemaker a Lois K. Miller, Molecular and Cell Biology 3:84, str. 399^406) popisují vysokou hladinu exprese bakteriálního proteinu, B-galaktózidázy, jestliže je umístěn pod kontrolou polyhedrinového promotoru.
Jiný expresní vektor odvozený od jaderného polyhedrózního viru byl popsán Smithem a spol. (Gale E. Smith, Max D. Summers a M. J. Fraser, Molecular and Cell Biology, 16. května 1983, str. 2156-2165). Tito autoři demonstrovali účinnost svého vektorů v expresi lidského Binterferonu. Syntetizovaný produkt byl shledán glykosylovaným a sekretovaným ze hmyzích buněk, jak bylo očekáváno. V příkladu 14 jsou popsány modifikace plasmidu, obsahujícího Autographa califomica jaderný polyhedrosis virový (AcNPV) polyhedronový gen, které umožňují snadnou inzerci EPO genu do plasmidu, takže může být pod transkripční kontrolou polyhedrinového promotoru. Výsledná DNa je ko-transfektována intaktní chromasomovou DNA ze standardního typu AcNPV do hmyzích buněk. Genetická rekombinace vede k nahrazení AcNPVC oblasti polyhedrinového genu DNA z plasmidu. Výsledný rekombinantní virus může být identifikován mezi virovým potomstvem tím, že vykazuje DNA sekvence EPO genu. Tento rekombinantní virus má po reinfekci hmyzích buněk produkovat EPO.
Příklady EPO exprese v CHO, C127 a 3T3 a hmyzích buňkách jsou uvedeny v příkladech 10 a 11 (CHO), 13 (Cl27 a 3T3) a 14 (hmyzí buňky).
Rekombinantní EPO produkovaný v CHO buňkách jako v příkladu 11 byl čištěn běžnými metodami sloupcové chromatografie. Relativní množství cukrů přítomných v glykoproteinu byla analyzována dvěma nezávislými metodami [(i) Reinold, Methods in Enzymol. 50:244-249 (Methanolysis) a (II) Takemoto H. a spol., Anal. Biochem. 145:245 (1985) (pyridylaminace, spolu s nezávislým stanovením kyseliny sialové)]. Výsledky získané v každé metodě byly ve vynikajícím souladu. Bylo provedeno několik stanovení, poskytujících následující průměrné hodnoty, kde N-acetylglukosamin je, pro srovnávací účely označen hodnotou 1:
Cukr relativní molámí hladina
N-acetylglukosamin 1
hexosy: 1,4
Galaktóza 0,9
manóza 0,5
kyselina N-acetyluraminová 1
flukóza 0,2
N-acetylgalaktosamin 0,1
Je třeba uvést, že významné hladiny flukozy a N-acetylgalaktosaminu byly reprodukovatelně pozorovány za použití obou nezávislých metod analýzy cukrů. Přítomnost N-acetylgalaktosaminu indikuje přítomnost O-napojené glykosylace na proteinu. Přítomnost O-napojené glykosylace byla dále indikována SDS-PAGE analýzou glykoproteinu s následujícím štěpením glykoproteinu s různými kombinacemi glykosidických enzymů. Po enzymatickém odštěpení všech N-napojených karbohydrátů na glykoproteinech za použití enzymu peptid endo F Nglykosidáza, byla molekulová hmotnost proteinu dále snižována následujícím štěpením s neuraminidásami, jako bylo stanoveno pomocí SDS-PAGE analýzy.
In vitro biologická aktivita čištěného rekombinantního EPO byla zkoušena metodou G. Krystala, Exp. Hematol. 11:649 (1983) (biozkouška proliferace slezinných buněk) s proteinovými ukončeními vypočtenými na základě údajů o aminokyselinovém složení. Po vícenásobných
-12CZ 286557 B6 ukončeních byla in vitro specifická aktivita čištěného rekombinantního EPO vypočtena jako vyšší než 200 000 jednotek/mg proteinu. Průměrná hodnota byla v rozmezí asi 275 000-300 000 jednotek/mg proteinu. Navíc byly také pozorovány hodnoty vyšší než 300 000. Poměry in vivo/polycytemická zkouška na myších, Kazal a Erslev, Am. Clinical Lab. Sci., Vel. B, str. 91 (1975)/in vitro aktivity pozorované pro rekombinantní materiál byly v rozmezí 0,7 až 1,3.
Je zajímavé porovnat glykoproteinové charakteristiky uvedené výše pro rekombinantní CHOprodukovaný EPO materiál dříve uvedený v mezinárodní patentové přihlášce WO 85/02610 (publikované 20. června 1985). Odpovídající srovnatelná analýza cukrů popsaná na str. 65 této přihlášky udává nulovou hodnotu pro flukozu a pro N-acetylgalaktosamin a poměr hexozy: Nacetylgalaktosamin 15,09:1. Nepřítomnost N-acetylgalaktosaminu indikuje nepřítomnost Onapojené glykosylace ve dříve uváděném glykoproteinu. Na rozdíl od tohoto materiálu, rekombinantní CHO-produkovaný EPO podle tohoto vynálezu, který je charakterizován výše, obsahuje významná a reprodukovatelná pozorovatelná množství jak flukózy, tak N-acetylgalaktosaminu, obsahuje méně než jednu desetinu relativního množství hexoz a je charakterizován přítomností O-napojené glykosylace. Dále může být vysoká specifická aktivita výše popsaného CHO-získaného rekombinantního EPO podle tohoto vynálezu přímo vztažena ke svému charakteristickému glykosylačnímu uspořádání.
Biologicky aktivní EPO produkovaný prokaryotickou nebo eukaryotickou expresí klonovaným EPO genů podle předloženého vynálezu může být použit pro in vivo léčbu savčích druhů lékařů a/nebo veterináři. Množství účinné složky bude, samozřejmě, záviset na intenzitě léčené choroby, zvoleném způsobu podání a specifické aktivitě aktivního EPO a v konečné podobě bude stanoveno příslušným lékařem nebo veterinářem. Takové množství aktivního EPO stanovené příslušným lékařem je zde také označováno jako „léčebně účinné EPO“ množství. Například v léčbě indukované hypoproliferativní anemie spojené s chronickým selháním ledvin u ovce, bylo účinné denní množství EPO nalezeno 10 jednotek/kg po 15 až 40 dnů. Viz Eschbach a spol.,
J. Clin. Invest., 74:434 (1984).
Účinný EPO může být podáván jakýmkoliv způsobem vhodným pro stav, který je léčen. Výhodně je EPO injektován do krevního proudu léčeného savce. Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že preferovaný způsob podání se bude měnit podle léčeného stavu.
U účinného EPO je možné, aby byl podáván jak jako čistá tak v podstatě čistá sloučenina, je výhodné ho podávat ve formě farmaceutické formulace nebo preparátu.
Formulace podle předloženého vynálezu, jak pro veterinární tak humánní použití, obsahují účinný EPO protein jak je popsán výše, spolu sjedním nebo více jeho farmaceuticky přijatelnými nosiči a popřípadě další terapeutické složky. Nosič(e) musí být přijatelné vtom smyslu, že jsou kompatibilní s jinými složkami formulace a neškodí jejímu příjemci. Je žádoucí, aby formulace neobsahovala oxidační činidla a jiné substance, o kterých je známo, že nejsou s peptidy kompatibilní. Formulace může být výhodně ve formě jednotkové dávkové formy a může být připravena jakoukoliv metodou známou v oboru farmacie. Všechny metody zahrnují stupeň uvedení do spojení účinné složky a nosičem, který tvoří jedna nebo více pomocných složek. Obecně jsou formulace připraveny homogenním a dokonalým spojením účinné složky s kapalnými nosiči nebo jemně dělenými pevnými nosiči nebo oběma typy nosičů a pak jsou, jeli to nezbytné, tvarovány produkty do požadovaného tvaru.
Formulace vhodné pro parenterální podání obvykle zahrnují sterilní vodné roztoky účinné složky s roztoky, které jsou výhodně isotonické s krví příjemce. Takové formulace mohou být výhodně připraveny rozpuštěním pevné účinné složky ve vodě za vzniku vodného roztoku a sterilizací roztoku v jedno nebo vícedávkových nádobách, například zatavených ampulích nebo lahvičkách.
-13CŽ 286557 B6
Zde používaný EPO/cDNA zahrnuje zralý EPO/cDNA gen, jemuž předchází ATG kodon a EPO/cDNA kódující alelické variace EPO proteinu. Jedna alela je ilustrována v tabulkách 2 a 3. EPO protein zahrnuje 1-methioninový derivát EPO proteinu (Met-EPO) a alelické variace EPO proteinu. Zralý EPO protein ilustrovaný sekvencemi v tabulce 2 začíná sekvencí Ala-Pro-ProArg..., jejíž začátek je v tabulce 2 označen číslem „1“. Met-EPO by začínal sekvencí Met-AlaPro-Prc-Arg...
Následující příklady slouží lepšímu porozumění vynálezu, jehož rozsah je dán připojenými nároky. Je pochopitelné, že modifikace mohou být provedeny v uvedených postupech, aniž by byl překročen rozsah vynálezu. Všechny teploty jsou udávány ve stupních Celsia a nejsou korigovány. Symbol Mikron nebo mikro, např. mikrolitr, mikromol atd., je „u“, např. ul, um atd.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace genomického klonu EPO
EPO byl čištěn z moči pacientů s aplastickou anemií v podstatě jak bylo popsáno dříve (Miyake a spol., J. Biol. Chem., 252:5558 (1977)) stím rozdílem, že bylo vynecháno zpracování s fenolem a nahrazeno tepelným zpracováním při 80 po 5 min pro inaktivaci stupních neuraminidasy. Konečný stupeň v čištění byla frakcionace na C-4 Vydac HPLC koloně (The Separation Group) s použitím 0 až 95% acetonového gradientu s 0,1% kyselinou trifluoroctovou (TFA) během 100 minut. Poloha EPO v gradientu byla stanovena gelovou elektroforézou a Nterminální sekvenční analýzou (21, 26, 27) hlavních píků. EPO byl eluován přibližně 53% acetonitrilem a představuje přibližně 40% proteinu podrobeného HPLC s reverzní fází. Frakce, obsahující EPO byly odpařeny na 100 μΐ, upraveny na pH 7,0 hydrogenuhličitanem amonným, dokonale štěpeny 2% TPCK-zpracovaným trypsinem (Worthington) po 18 hodin při 37 stupních. Produkt tryptického štěpení byl pak podroben HPLC s reverzní fází jak je popsáno výše. Byla sledována optická hustota jak při 280, tak 214 nm. Dobře oddělené píky byly odpařeny téměř dosucha a podrobeny přímo N-terminální aminokyselinové sekvenční analýze (59) za použití Applied Biosystems Model 480Ab sekvenátoru v plynné fázi. Získané sekvence jsou v tabulkách 2 a 3 podtrženy. Jak je zde uvedeno výše byly dva z těchto tryptických fragmentů zvoleny pro syntézu oligonukleotidových sond. Ze sekvence Val-Asn-Phe-Tyr-AlaTrp-Lys byly připraveny (aminokyseliny 46 až 52 v tabulkách 2 a 3) 17mer 32násobná degenerace
TTCCANGCGTAGAAGTT a 18 mer 128násobné degenerace CCANGCGTAGAAGTTNAC.
Ze sekvence Val-Tyr-Ser-ASn-Phe-Leu-Arg (aminokyseliny 144 až 150 v tabulkách 2 a 3) byly připraveny dva pooly 14merů, každý 32 násobně degenerován
TACACCTAACTTCCT a TACACCTAACTTCTT které se liší v první poloze připraveného leucinového kodonu. Oligonukleotidy jsou značeny na 5-konec konci pomocí 32P použitím polynukleotid-kinásy (New England Biolabs) a gamma 32PATP (New England Nuclear). Specifická aktivita oligonukleotidů se měnila mezi 1000 a 3000 Ci/mmol oligonukleotidu. Lidská genomická DNA knihovna v bakteriofágu lambda (Laen a spol., 22) byla screenována za použití modifikace in šitu amplifikačního postupu původně popsaného Woo-em a spol. (47) (1978). Přibližně 3,5 x 105 fágů bylo umístěno v hustotě 6000 fágů na 150 mm Petriho misku (NZCYM medium) a inkubováno při 37 stupních do viditelných plaků, které jsou však malé (přibližně 0,5 mm). Po 1 hodině chlazení při 4 stupních byly dublikátové kopie vzorků plaků přeneseny na nylonové membrány (New England Nuclar) a
-14CZ 286557 B6 inkubovány přes noc při 37 stupních na čerstvých NZCYM plotnách. Filtry pak byly denaturovány a neutralizovány lOminutovým pohybem vždy po 10 min na tenkém filmu 0,5N NaOH - 1M NaCl a 0,5M Tris (pH 8) - 1M NaCl. Po vakuovém sušení při 80 stupních po 2 hodinách byly filtry promyty v 5 x SSC, 0,5% SDS po 1 h a buněčné zlomky na povrchu filtru byly odstraněny mírným škrabáním vlhkou tkaninou. Toto škrabání redukuje podstatnou vazbu sondy k filtrům. Filtry pak byly promyty vodou a prehybridizovány po 4 až 8 hodin při 48 stupních ve 3M tetramethylamoniumchloridu, 10 mM NaPO4 (pH 6,8), 5 x Denhardtově roztoku, 0,5% SDS a 10 mM EDTA. 32P značený 17mer byl pak přidán v koncentraci 0,1 pmol/ml a hybridizace byla provedena při 48 stupních po 72 h. Po hybridizaci byly filtry intenzivně promyty 2 x SSC (0,3M NaCl - 0,03M Na-citrát, pH 7) při teplotě místnosti a pak 1 h ve 3M TMACI - 10 mm NaPO4 (pH 6,8) při teplotě místnosti a od 5 do 15 min při hybridizační teplotě. Přibližně 120silných dublikátových signálů bylo detegováno 2 dny po autoradiografii za intenzifikačního screeningu. Pozitiva byla vybrána, shromážděna po 8 a znovu třikrát rescreenována za použití jedné poloviny 14merového poolu na každém ze dvou filtrů a 127 meru na třetím filtru. Podmínky a 17mer pro umístění na plotnu jsou popsány výše s výjimkou, že hybridizace pro 14mer byla při 37 stupních. Po autoradiografii byly sondy odstraněny ze 17merového filtru v 50% formamidu po 20 min při teplotě místnosti a filtr byl rehybridizován při 52 stupních s 18merovou sondou. Dva nezávislé fágy hybridizují ke všem třem sondám. DNA z jednoho z těchto fágů (zde označen lambda HEPO1) byla dokonale štěpena pomocí Sau3A a subklonována do Ml3 pro DNA sekvenční analýzu za použití dideoxy řetězec terminující metody podle Sangera a Coulsona, (23) (1977). Nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová sekvence otevřeného čtecího rámečku, kódující pro EPO tryptický fragment (podtržená oblast) jsou zde popsány. Intranové sekvence jsou uvedeny malými písmeny, exonové sekvence (87nt) velkými písmeny. Sekvence, které souhlasí s místy akceptorového (a) a donorového (d) střihu jsou podtrženy (viz tabulka 4).
Příklad 2
Northem analýza mRNA jater lidského plodu ug mRNA jater lidského plodu (připravené z jater 20týdenního lidského fetu) a mRNA jater dospělého člověka bylo elektroforezováno v 0,8% agarózovém formaldehydovém gelu a transferováno na nitrocelulózu za použití metody Dermana a spol., Cell, 23:731 (1981). Jednořetězcová sonda pak byla připravena zM13 templátu, obsahujícího inzert ilustrovaný v tabulce 1. Konec byl 20mer získaný ze stejného tryptického fragmentu jako původní 17merová sonda. Sonda byla připravena jak popsal Anderson a spol., PNAS, (50)(1984) s tím rozdílem, že následující štěpení pomocí Amal (které produkuje požadovanou sondu délky 95nt, obsahující 74nt kódující sekvence), malý fragment byl čištěn zml3 templátu chromatografii na sloupci sepharosy C14B
-15CZ 286557 B6 agcttctgggcttccagacccaBctactctgcggaactcagcaacccaggcatctctgagtctccgcccaagacc
Bggatgccccccaggaggtgtccgggagcccagcccttcccagat ngcagctccgccagtcccaíigggtgcgcaa 150
u u fl o
u u 63 υ
u u a o
60 u u <
<e fl υ o
u 00 60 cj
o ω o
c 60 υ υ
u 60 a o
C0 u u <
XJ U u o
O u u o
XJ u <0 o
cd u ed o
υ a u cj
XJ o H
u u O
ed U Q O
U u 60 H
fl u a O
u 00 o f-
4 co <0 O
U XJ fl CJ
O co xj o
o 00 fl o
a co co o
co u fl o
XJ o u -<
fl u od o
U υ u cj
u fl fl cj
O 60 u D
u XJ a O
U U u o
c0 XJ fl CJ
Q O u ř-
U to co υ
60 XJ u a
a Q fl o
60 U u o
63 U cd t-
CO u u o
o co 60 cj
u XJ u υ
u O o Η
cd O u ο
60 M fl ο
Cd 60 u ο
Q U u ο
U 00 u ο
u 60 u ο
u fl u ο
<0 o fl CJ
to u u Ο
o u o U
60 c? u C
Q a u υ
U u u υ
U xj XJ ίώ
u U u Μ
u O u to
u CO Q U
u O u υ
u CO od υ
60 fl 3
υ U υ U
fl u a 00
o Q Q α
63 U fl ta
XJ 60 U <3
U fl ad U
60 U u co
00 w fl u
u CO u u
u o w u
o Q XJ u
CJ CJ XJ u
H < 60 u
CJ O XJ fl
CJ o U «
CJ c u 60
CJ < υ a
CJ o XJ a
H Ε- ed u
CJ υ 60 M
a CJ 60 c0
o O U XJ
c H O u
CJ O <j u
c CJ to fl
< < U 60
CJ o u U
CJ CJ u co
H o 60 60
CJ CJ u O
CJ CJ o U
H CJ υ fl
CJ CJ XJ 00
H o 00
CJ CJ 63 fl
CJ o U fl
CJ Q 60 u
CJ CJ 60 XJ
CJ (J to u
CJ < XJ 60
CJ Cj O 00
< É- 60 60
CJ o CO XJ
< CJ 60 O
CJ υ 60
CJ CJ 60 60
E- U XJ
CJ G XJ 60
CJ CJ u CO
CJ CJ. fl fl
CJ CJ XJ 60
CJ CJ 60 CO
CJ CJ a fl
CJ CJ to u
CJ CJ xj u
CJ u 60
CJ CJ CJ CJ «
< CJ «0 £j
CJ Cj < *-< u
< ř-* CJ X fl
CJ s CJ »—( XJ
CJ CJ H fl u
CJ CJ o > 60
s CJ o X 60
CJ CJ CJ rH y
CJ CJ CJ CJ u
H CJ CJ 4J U
CJ H H <> u
ί- S 60
ο (J u
CJ CJ < 00
CJ < CJ fl
o CJ CJ XJ
CJ CJ CJ XJ
CJ CJ O XJ
CJ c O fl
CJ CJ efl
CJ CJ O ω
CJ < < co
< u CJ 63
CJ CJ CJ U
CJ p CJ td
CJ CJ CJ fl
CJ CJ o ed
c CJ CJ XJ
(J co 60 fl 00
fl fl CO fl XJ
fl Q CO fl
fl a U XJ ed
fl 60 U fl 60
fl 60 «3 fl 60
u U U 00 co
69 CO fl XJ XJ
00 Q O XJ eo
XJ U XJ fl CJ
fl u 60 00 a
a) 60 u 00 00
63 XJ u fl fl
63 00 XJ u CO
63 XJ CJ ω fl
XJ u u fl u
XJ co 60 o co
u XJ eo co
u Q O 60 cd
4J C4 U co
09 XJ Cd fl XJ
fl 63 eo u u
to CO 60 fl eo
63 00 fl u a
CO 00 CO co 60
60 00 Q XJ U
60 00 U 60 fl
XJ XJ u XJ co
XJ XI CO 63 co
U XJ XJ ω a
fl 00 O C0 a
60 eo XJ 60 63
00 fl fl XJ 60
60 a XJ Cd fl
60 co XJ C0 U
u a U 60 fl
Cd a fl CO 60
fl ed u 60
υ 00 u XJ 60
u to fl CJ Cd
eo to u CJ XJ
XJ fl u 60 XJ
63 eo 60 fl 60
U XJ fl XJ 60
fl XJ CO ad XJ
υ eo 60 00 fl
υ eo XJ XJ O
XJ to 6J U Cd
u eo 63 00 XJ
u co U XJ XJ
63 XJ 00 fl U
fl XJ 60 63 63
CJ XJ C0 Cd XJ
ed 60 XJ XJ td
eo fl υ CO fl
to U u fl CO
60 fl rt fl XJ
XJ u a tO CJ
to fl w a u
60 63 fl co fl
eo 60 to 60 u
co 63 XJ O ed
60 03 O u fl
60 fl Cd eo u
fl fl fl 60 00
Cd od a XJ cd
60 XJ XJ xj a
to 60 a XJ Cd
CO XJ 60 Cd 63
ed U XJ fl 60
A u O fl fl
a fl 60 ed O
od cd fl XJ u
td XJ fl xj ed
u u 60 fl ad
H oo tó u XJ
Q >o )-· u XJ
3 □< r-> O o a u ta U « u
to O CU fl 00
a -< o ω CD
XJ CJ U XJ XJ
u CJ tu co U
LJ <J « o u U
XJ CJ «-< o X fl
Cd CJ < «e d
XJ CJ >» o 60
(J o ·-* ί- efi
XJ CJ α < W a
fl CJ 3 íí C u
^J H a «5 Cd u
cl CJ M
63 a —< o d
60 ί- a < ec
XJ ο > o a C3
(J < o o a U
u υ u o rX υ
Cd υ e- cj < u
fl CJ 5 O fl XJ
Η « -e rH u
XJ CJ ►4 O u u
(j CJ > CJ 01 M
XJ o F-ι rf X u
(j CJ o -2 -J fl
Q CJ □ Q fl fl
60 XJ s <V u <-» o ri < Od eo
(J H o o fl 60
y CJ I d
C0 CJ Cu. y O u
Q CJ = O D XJ
» « e> XJ
U U Cj CJ CJ ť £ M CJ X fl U ed
o e> h fl to.
u Cj H <n o U td
CJ 3 CJ u <0
(J Ι- u
XJ Ο O H 60 XJ U
XJ H « O M 03
XJ O rJ < O
(j o o 3 fl
Cj o o -e r-í CJ
Cj H tn cj c M
Q O 3 O fl u
U CJ O “δ fl u fl fl
o = O 60
rj ί- <J H fl fl
Q ο — o > CJ
fl ř- 3 —; ed d
CJ f- 3 O u u
tj o — CJ < u
LJ a· o u XJ
XJ O M CJ fl XJ
CJ ί- H < cn fl
CJ ο 3 O CL u
Xj ί- 3 < V) d
co ο rJ cj < a
XJ υ Q.Í-. « ed
CJ o U U >> a
Cd ί- t- ί- u u
fl ο α o o CJ
fl o T! Η u
eo o < < rR u
60 fl G S π M «-4 Ώ fl xJ XJ
fl o cx. CJ X u
-16CZ 286557 B6 ggtccgcBgtggagctcggaaGccagacactcccccccCacacaaBaataogtctggtggccccaaaccatacct 1500 ώ
\O
O o ca
O o O
o m
cn <N
·-* rq C9
44 O JS
u a 3¾.
CO < y
u o <
u < o
o <J M
u υ a.
u O
<0 60 BO
00 H u
00 G jc
ti < ί-
V ο v
u H ·-<
u < w
u t- a
o co
«3 O 3
00 < -t
O O O
o H 3
u < u
00 < <
co O 3
co f- U
ti P 4
u O M
u O O
00 < w
co o o
4J o >.
to ř- o
14 o a
u < —
u o -
CO •«d s
u 3 Ή
<3 o o
14 £- «
U O -4
u O *d
u H w
ti O >>
00 f- o
ti o >>
U O -4
c0 o <J
ti o u
u o —
u < H
CO ω
«3 a
*3 o
a u
u ta
ta u
ti a]
co U
ca Bfl
<3 4J
ti ta
u w
co ca
eo u
a o
w ca
u
ti ca
<5 o
<3 u
co u
co <J
14 60
ti CO
a a
co co
«3 44
00 a
ca co
u a
44 co
44 a
U o
U 60
44 a
u u
u eO
u «3
u eo
w co
44 44
4J ti
U ti
44 a
44 a
U 44
44 co
44 co
44 ti
U ti
u ti
w CO
u to
u ca
u a
u cO
44 u
44 44
co 03
ti ca
ca 44
44 <3
<3
O 5 CO
< tí «
e o 63
o
H « co
O ch <3 tó
O >- <3
< < ts3
O w 44
«d >» £
< •d co
o c. to
u u ta
t~ ί- 44
ο rt 44
o — 44
o < <3
H u CO
< >. 44
f- ί- U
Ο « CJ
H -= CO
<- cu ti
h c co
u co 44
p a 44
o > 44
«d 10 P
«2 >i ó
< M
O M O
to co co ti a a
co ti 44 ti o co
44 ti u a 44 ca
U CO 63 63 44 60
u 44 CO a ti ti
u CO a ti U 60
co w 63 ti 44 co
ti ti u ti 44 a
Cti o u ta ti u
44 u M ti u 60
kJ eo a ti 4J 60
U ti ti ti 44 co
cO 44 C4 a ti 60
44 44 to a U
44 ti ti <3 44 60
<4 ti u U U 44
a ti u 44 ti u
00 ti U V u cO
a ti eO 44 44 14
co ti a CO U u
CO ti co 44 ti co
CO 44 w U u 60
44 44 44 O u 60
ta 44 u u <J 60
to ti C3 ca ti U
4 u U co u 44
CO ti 44 ti 44 CJ
a a a ca U 60
u ti 60 u a W
co u to ta u 60
CG a ti ti 44 60
4J 44 CO co 44 44
ti O 00 a a W
to 44 co u u Q
a u u a 44 63
co 44 cO 60 44 ti
A4 ti CO u ti u
U u ti co 44 u
CO o co ti 44 Q
CO u 44 u ť* ca
a u Q 44 u 44
u u 63 u 44 U
o 44 CO u 44 44
(J ti ti ca 63 63
44 co ti a U 44
ti ti CO u ti O
ti 00 eo u 44 w
u 44 44 *4 ti 44
ti eo u a u
u ti 44 ti 60 u
u 44 ti u 60 a
44 ti M co 4J 44
CO u ti 44 ti ti
υ co eo u 44 u
a ti Q ti co 60
u 14 U u 44 44
44 to u o U 44
co u ti c0 ti
ca ti 44 u ca 44
cn 44 CG a 60 44
ti u ti u a Q
co <4 44 14 ta 44
ti ti ca a 4J 60
u ti co to ti ti
to U 44 44 ti ti
u u CO 63 44 U
co ti ca 44 ti ti
co co 44 u ti ti
co ti a co ti u
44 Q o ti a *4
u 44 co e3 ti. 4J
υ 14 44 M co ti
ca 44 60 63 u
44 60 CO a ti 44
O ti 44 u e ta
O vn vn <N O O r* <N o 1/1 CO CM
cj c a CJ H ιη H CJ
< ti cj M CJ μ cj o
(J o ti CJ V < >sH o
CJ a Cd & w H f- P o
CJ >— Cd v CJ ·-< Ι- cj
O a H a-4 t- α CJ
< >> υ -e q > p
cj •a cj Q ·< o
o u AU o w o μ U t-
CJ 3 cd o < cj <. P O
G 4J * Cd 5 o H Cl < jz P. cj H
<3 ta o O H Cu H cd CJ
G a CJ a <
o o ί- ϋ O u o
o « AU ο < < o
O *u co CJ coq u
u u co CJ μ rH CJ
3 u M O < o O o
O cd CJ « < u H
u cd u {-* X xz U
u cd CJ r* a· < H CJ
£ a a aJ O (- u ω jz o CJ co o <;
u Cd 44 < ί- CJ
»*ζ ti aj ο c. v> <
H Cd au < w >> CJ
3 Cd w cj -< í-4 CJ CJ
CJ co cd H a O ti CJ
co au G »-< ω t-4 H
H a U U < o < CJ
0 ti u f- μ o 3 t-
cn cd AU G λ < *-4 f-
CO ti u -C ř— o O CJ
Vi ti a O CJ o CJ
< w ti f- Ή Q H
co co < I— O O H
O ω o < μ < M ·<
u u cd O JZ o CJ
ti < H <
iH <J < tz o u -2
ϋ au cd CJ u < CJ
u u «4 o < H ř-» CJ
a u u cj 3 O 3 <
ω u ti H <1 H O CJ
rU cd u o -j O J F>
ti kj cd ·< o O VJ CJ
> 4-1 cd (j μ < CJ
a Q AU cj cu ti CJ
r-4 ca «Ο É— «3 o 3 ί-
< 4M AU O <-< H ο
ti U U o < O O
AJ 44 ř— a O <
4J 44 O i-f CJ
CL U A4 CJ < ·—J o
0 ti O < μ <
-ti u CJ o U CJ i-H o
ti u H W o O CJ
ti Cd AU υ a o cd H
> cd AU ω <-> Q M <
<4 wU u cd u u g-5 CJ o ·< 3 f<
*-* a AU O r-i H CJ CJ
3 co au U < O »-d o
O ca ti H &. CJ O CJ
a 4J -i 41 fc! CJ
c XJ Cd CJ < c* H
iH CO U < o H 3 o
O ti u o μ 6 ň o
3 00 AU CJ t. •ti <
ti w cd H o <J $-· o
U oo AU υ μ U c; Q
cgccgtcctcggaaccatgaagacacgatcgcgcctcgcctctggctctcatcgggtccaacttttgtgtattct 3300 TCAACCTCATTCACAAGAACTCAAACCACCaatatgactc ttggct ctr ctgtt ttctgggaacctccaaatccc ctggctctgtcccactcctggcagca 3400
-18CZ 286557 B6 v O,1N NaOH-0,2M NaCl. Filtr byl hybridizován k přibližně 5x106 cpm této sondy po 12 hodin při 68 stupních, promyt ve 2 x SSC při 68 stupních a vystaven 8 dnů intenzivnímu screeningu. Jediná merkarová mRNA o 1200 nt (označeno šipkou) probíhala v sousední dráze (obr. 1).
Příklad 3 cDNA z jater plodu
Byla připravena sonda shodná se sondou popsanou v příkladu 2 a byla použita ke screenngu cDNA knihovny jater plochu připravené ve vektoru lambda-Ch21A (Toole a spol., Nátuře, (25)(1984) za použití standardního screeningového (Benton Davis, Science, (54)(1978)) postupu. Při nezávislé pozitivní klony (označené zde lambda-HEPOFLó (1350bp), lambda-HEPOFL8 (700 bp) a lambda-HEPOFL3 (1400 bp) byly izolovány po screeningu 1 x 106 plaků. Celý inzert lambda-HEPOFL13 a lambda-HEPOFLó byly sekvenovány po subklonování do Ml3. (Tabulka 7 a 5). Pouze části lambda-HEPOFL8 byly sekvenovány a zbytek byl považován za shodný s ostatními dvěma klony (tabulka 6). 5-konec a 3-konec netranslatované sekvence jsou uváděny malými písmeny. Kódující oblast je zapsána písmeny velkými.
V tabulkách 2 a 3 je dedukovaná aminokyselinová sekvence uvedena pod nukleotidovou sekvencí a je číslována tak, že číslo 1 platí pro první aminokyselinu maturovaného proteinu. Předpokládaný vedoucí peptid (leader peptid) je označen zápisem celých zkratek pro zápis aminokyselin. Cysteinové zbytky ve zralém proteinu jsou dále označeny SH a potenciální Nnapojená glykosylační místa hvězdičkou. Aminokyseliny, které jsou podtrženy označují ty zbytky identifikované N-terminálním proteinovým sekvenováním nebo sekvenováním tiyptických fragmentů EPO jak je popsáno v
-19CZ 286557 B6
Tabu lka 5 cacar.tjaag gacgagctgg gacdgagacg tggggatgaa
H > ω _ « a u
CJ u u o O -=
CJ O CJ rs <_1 <
VI H ϋ
> O ω f-1 «Μ
O H u ϋ <
«< -3 t> 3 C3
3 < H -4 <
e*3 > O CJ u
o
Q O < 3 O
U CO o CJ H
*J &. u - H
C4
4J 3 U = CJ
ω Η 3 H
-1 o H CJ
a
4-1 4 >- o CJ
u u x<
u O ϋ Η H
03
CO 4J 3 P C3C5
Q u O
U -4 CJ < <
O t-> 3 O
eo a tj •4 <
n e. cj CJ o
u
w □ CJ
u 3 CJ
u UC ϋ H
u U CJ F-ί O
a
C9 AJ =: u CJ
JJ o 3 H
Vi H > O
U u 3 — eo <f
W H o U CJ
J U CJ ·— < CJ
u
u u = U v. CJ
M U3 $-« 3 CJ
u CJ cn <
u e£ U c. u
M CJ VI <
u CQ f-· < o
M
u M =5 O cn H
U H 22 XCJ
u CJ V3 CJ H
u
v rd =1 O 3 CJ
u U> H *4 H
.J CJ * <
u = H □ O
co U H CJ p
e -J CJ •J CJ
u
<s u S- U «Ο
u si o u CJ
L> H H < CJ
AJ
u => U ti H o < U CJ
_J CJ &» CJ
u
u CJ a. a 0 <
44 =: o u
u í-< «— ~ CJ
CJ
c a -ť CJ a u
CJ ^4 *J -4 CJ
cu < CJ ** < CJ
re u 3 O O u
cj O 4» f-· o o
.< cj n u u •*4 tQ
a O e o d O O
FM F4 ·-* < _< O H
b* < o o < ϋ > U
C H s o d 9 a O
(Λ < *4 < -M < rM. o
< 5 o o <J O < o
3 U xo
·—t <· •4 O ·—< o .
CJ o CJ O o o ►J
£ H *4 Q čů CJ CUf-i
ta <3 H U O co <
< 2 > CJ < ω ϋ
3 o 3 CJ 3 2 f-4 u
ϋ H *-· < a Η
J H cj o J o > Q
u o u O ~4 CJ C] Η
3 u 3 H rt H «>4 <
cn < X < 5> U O
to CJ £4 O 3 r* 3 a
X CJ u o O V H
O H < < < o *J O
'Z CJ CT CJ 3 < c O
x < X < ·—* < ·« <
22 CJ _J < cj O o sJ
3 < o* U u CZ = o
-» < u CJ u o ’o H
CJ CJ Η H cn h *— CJ
?3 J-* rí O 3 O a O
»-< CJ O CJ O C H O u ζ_}
< o wn < e .4 U cr» z* CJ
Sl H U H 3 CJ 3 o
xcj X < -j H <
U H ř— H CJ í_3 o
X o 3 U a o c.u
— c J2 ř* O lu u
o o C4 r- < CJ H H
u u S H 3 O o CJ
cj « < 3 r* u Q
H < < < -4 CJ c. CJ
u O —* t-» xp c U
O r$ H o <
H < > C o o U CJ
cj p w < c u u vj
X < a CJ
- < J < o o Ui H
n cj cucj u F-·
v> -3 CJ u O CJ CJ
< 3 H < Η H cn H
— CJ C. CJ -* <J - CJ
—· *3 « < re H «: ‘λ <
O <J < O > ϋ < <
c o O < □ < Ό
— CJ M !j < ř-·
< Q c. u a ω > U
3 CJ ·—* 5J < - O
< Π r— f3 8- γ-
c O > o > i? •J Η
Cly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Cly Ala Cln Lys Clu Ala Ile Ser
CGC CTT CGC ACC CTC ACC ACT CTG CTT CCG GCT CTC CGA CCC CAC AAC CAA CCC ATC TCC
-20CZ 286557 B6 >o CÚ L
O CL to <ΰ
Tabu
O fl u XJ U
Ό -< o u XJ
r·* < u Q 60
U xj
<g o
a a
s « u co
—' < v a
o o <g u
u u
>x U •Ί u ϋ o u 00
u u
L < Q cQ
~ U Q rt
H < xj o
O xj
O υ
u U cj 00
>> < U
E- H u υ
3 O « H -J ω * XJ
u u
n o u xj
>> < XJ O
_j < cg 63
XJ CO
<9 C3
□ u u ¢0
u H to a
U <J 00 CO
« u x<
J < 60 u
XJ XJ
>> < u 60
r~< U <J Q
O O a U
u CJ
u u
O ca o xj a
l υ 00 Γ3
< o XJ 60
r$ ω XJ ω 00 u
tO <g o <a u XJ
<4 O cO a 60 xJ
00 XJ a CO U
XJ u ej 63 co XJ
(j cg U 60 00 XJ
w tó- cg XJ u 4
u ra 60 CO u XJ
ej XJ 60 eO cg co
a XJ (0 Q o XJ
u XJ u XJ o 03
00 U o XJ co XJ
tg 60 co U xj XJ
tti a XJ Q XJ XJ
<g u π rt a XJ
oO co 60 ω υ 60
OJ a u «3 u cg
u CO XJ co o <3
u Q XJ 60 u o
u CO to XJ ω u
eo a fl o a XJ
XJ u CO u 60 60
Q XJ <0 rt a co
Q XJ u e>0 Π 00
cj a co XJ O 60
00 u XJ <0 60 XJ
00 60 U 60 CO c3
<5 a u O0 XJ u
CO a u o 60 XJ
co a u CO a
u 63 u o XJ XJ
Q Π co 60 XJ u
60 u 60 60 CJ 60
60 60 U 60 O co
00 Q XJ ra o XJ
co 60 O u XJ u
Q <g <0 XJ u JJ
u u u <g u
XJ u XJ U Q u
u u <J u co co
3 U 41 H —i CJ co
u u XJ
co u a
o o « u υ
JC ř“* n XJ a
P-ι H u Q co
u a XJ
a
C H < o a
O ř- 60 U (j cd
h o sC 60 <
« u 50 P O
<zl H .< < u <3
u U
U U Q.U u U
>, < 0 < u CG
H ř- < C XJ u XJ 60
u a
—H xj 0x0 u u
Q Ε-» >-< o σ u
> CJ o c u XJ
ω < U <í
u u Λ O
< o H < a u
u a
a o eou o o
Š £ P U < < co XJ <3 ω
co co
XJ w
3 ϋ n O XJ a
i) H xo O u
-I u ω U H 60 u
00 co d 00 tfl
60 <0 XJ 60 XJ
co 60 U U u
a XJ u a 60
03 u a u 00
XJ o u 63 60
XJ co 60 CO eO
O o U CO to
a (3 u u XI
a 03 XJ a a
o rf XJ u 60
u 65 XJ eo
60 60 00 U CJ
60 CO u XJ U
30 CO u eo tg
a XJ υ to 60
u V c a a
ZQ XJ CJ <a
U XJ XJ u 30
M C XJ XJ XJ
« u * u
u u CO XJ U
Π 60 U u u
eo a CO <J <g
60 60 oo a cg
a a (3 co eo
u 03 XJ 30
XJ <3 60 63 CO
U 30 XJ XJ XJ
XJ CO XJ u co
aacctcattg acaajjaactg aaaccaccaa aaaaaaaaaaaa
21CZ 286557 B6 ctcfictecBc tBCgccgcac cgcgccgtcc tcccggagcc ggaccggggc caccgcgccc gccctgctccg acaccgcgcc
u
60 Q H > υ
w ca CJ •J 3
ca λ. CJ • ·» w CJ
60
U
CJ U tn H 3 CJ
u CJ ω f~
o cj Ε-» 3
63 za < 3 CJ
60 3 < ί-
C3 U O > ο
60
t9 tn cj o <
60 3 < ta CJ
60 ·** CJ CU CJ
60
U 3 o 3 CJ
r-« ω ř-
> CJ x CJ
u
o u o > cj
4J 3 CJ x o
u cj CJ CJ ω
CO
CJ co A- η CJ 3 o
rJ UI H x s->
I X < x CJ
o f-
60 60 CÍ CJ
U ΣΧ* CJ
u 60
a 60
u a 3 CJ
60 30 3 E-
O u -1 O
U 63
u CO
<J <3 sí O tu o
CZJ 3
to U
60 U 5 CJ
U 63 3 H
O CO 3 CJ
60 u
eo u 3 CJ
60 u
CO u ca H
u ro 3 o
co 63 ca cj ω cj
u 63 tn t->
o CO
a «3
co 60 s P
03 U ω H
U 3 CJ
o 60
<J
4J 3 CJ
<J 00 ω H 3 CJ
u 00 3 ř-<
XJ <9 ÍsJ H
u U 3 CJ
kJ u
u u
u u i, cj
o 63 S4 U
60 U Η H
u 03
u U 3 CJ ω h
3 CJ
60 CO
Č3 63
u O a. o
C5 C0 U u 3 CJ Η H
ta ts
Χμ u
U M ta G3 38
U CO < O
a CJ Μ Η
o >> < O ~ CJ
cm X < -J Ji <
-a CJ ti CJ
— CJ 3 tj
< 3 3 <
3 CJ C H
·“* <í * <n <
CJ CJ < <
□ CJ 3 O
Cl H 3 -C
3 3 CJ CJ
9 CJ C ř-
O H. 52 5
3 CJ
U o 3 CJ
>> -e « H—
Η H 3 H
« cj W CJ
U CJ 4) CJ
< < tn <
3 CJ tn o
•“4 3 >»CJ
O CJ tn CJ H
3 CJ a CJ
4) i·* —1 <
3 CJ 3 CJ
3 CJ 3 S
<3 H «a
> CJ CJ u
co < O H
O w CJ O —< CJ
— < CJ <n < cj
U CJ <n H
U CJ 3 >»O
tn < w U H
C.CJ >.CJ
« < -t CJ
< CJ CJ CJ
« H U CJ
3 XCJ 3 CJ
tn cj h ř< <
&J CJ U CJ
3 f- 3 CJ
3 < H <
9 CJ ti O
α H Ή
3 CJ
M O
u o * w <
< CJ < <
o < 3 O
W CJ
&. CJ u O
o < O CJ
u CJ « CJ
c. o < CJ
<3 CJ 3 CJ
3 CJ *<
< CJ Q O
flj U O *-4 O o 90 □ CJ U H 3 CJ
vO < a
= CJ cj CJ
< 3 CJ
a cj < CJ
C CJ C CJ
·-* < 3 <J
CJ CJ cj υ
>>CJ XCJ
»-c CJ 3 CJ
a o CJ CJ
·—< ^j COCJ
a {-· M 3
> CJ < CJ
9 CJ 3 CJ
•m O H
CJ CJ 3 O
u O 3 O
<1 H q H
X < > CJ
eocj <S H
M CJ 3 CJ
·< < •sf CJ
m u 3 í
Js < 3 <·
3 < a cj
G.CJ U CJ
U. o CJ CJ
Η H <n E-·
O O □ CJ
O -H CJ O o fr-
«A < CJ r* 3 CJ
M H 3 P
Λ <
t- r- 3 CJ
U CJ <3 CJ
X H 3 O
o- H < CJ
C F- 3 CJ
« < « H
< <J 3 CJ
•3 E~ >>CJ
9 H 3 U
> CJ ϋ CJ
a ·< c a
>» -4 3 <
3 CJ CJ
W CJ fi.CJ
3 U U CJ
H < Η H
S>CJ 3 CJ
tn < «J H
< CJ > CJ
o < □ <
CJ 3 <ς
c. CJ CJ CJ
3 CJ 3 <
C5 H ra f-<
=> CJ > CJ
-22CZ 286557 B6
O U μ o u u
o a O <N o ω
co < —4 oa H
r-4 O 0 u
C P* *-* 4
CJ k O < U
Tabulka 6 pokrač.
a o r-t U < CJ <u o -< o < o
« ·< 3 3
>> -5 r~t -C
U ·< O O
C.H a O
a < >> 5
< a J <
-r O 3 O
« H —< <
> O O o
a f-· η o
—· «o Ή O
=: cj < O
s c: X*
y V- <-· O
u <-> O O
3 O 5 O
—< «4 « č-*
a a J O
□ C5 <s P
o ř~ —< O
u u < o
o u O MC
o . k CJ —· U O
o ř. CJ — < o
3 O 3 fc
-< ·< O o JSo
0.0 5 p
u <j 5 H
Η ř·* •3 sj
o a M H
U CJ
c- U H <
c o k CJ
*-< —4 JS O
o o H <
k Q 3 O
a <_> « h
</> H u u
U f~> k O
Cl CJ U <J
<n H w <
s cj co o
« 31 ·*< k O
< 5 <i o
— o 3 ř*
a H 3 h
> <J U CJ
□ O >U
ci S· —< o
•J ř-· o o
ao m «e <.C
<a CJ «( Q -· O ·< u
O. H u> < < O oo < u o < cj
H CJ a. cj o u -Z H a. fo fk <J £U Q
CJ f— J u
-23CZ 286557 B6 cccpjjagcc CP.acccccftC caccgccccc gccct:gctcc(· · acacčp,c[;c.c
u U ř-·
cs u ►J tj
u 1/
CJ u
£J 44 =) CJ
u M LJ H
-J CJ
CJ »* R
LJ fz -i. r*
CJ Q •J CJ
J4 M U
u U
U ZJ C- CJ
o Q M 3Ž CJ
13 V ř* H
ccJ Q M
H U U
3 C
UJ ř-
U CJ
ec £3
rj 63
u *J A. U
Π *J ϋ O
M r- H
M íj
w U
U «4 < CJ
U ·· —* u
u CJ < CJ
a a í-» c a c CJ
* W < «—* <
cj cj < CJ u <J CJ
2 o o xo X CJ
O í“· < *~4 o *“· CJ
-J Í-* u CJ CJ o CJ CJ
o *4 H Ή o M CJ
Q H < «J ί- U CJ
CJ < < > ο . < o
u O u • 2 o CJ
X < <1 h < V
H «-· ϋ o CJ
ta O u a u o •-H CJ
u CJ o a o f- a r-»
< < !A < = < > CJ
O VI CJ MU <3 H
< zz x o U CJ «Μ CJ
C u CO CJ r-· < < < CJ
p 15 O tt a 2 <
5 «4 < > < <
u b cj u < CJ CJ
^4 o -- a o u o
“ i ^4 U o CJ
> CJ a o u. H CO H
rt C CJ 3
CJ O -» CJ o —« <J O v í—
< U <~i < CJ v% < r* —Ϊ CJ
1 ul-J w u F-* 3 CJ
OICJ 3 XCJ > < Ό J-4
* ín cj r* r* U cj
eJcJ X CJ 3 CJ CJ
ς· < CJ JZlř-1 a«4
< L3 ur cj 1 Sm H < CJ
Vt k?-· L·. CJ = p
X CJ 11 < ζ»
CJ < < 3
1
O U U CJ C-« X CJ
H CJ l·· CJ
< r* < CJ o CJ
Z O CJ VI = CJ
CJ ih é· X «J <
CJ - < CJ CJ
e 14 CJ c.
M X ·ΛΙ < J3 CJ u
< -4 * ř- < F- r~
J s CJ -^ CJ -4
Utu < < ·*
c. Ό CJ < u 3* CJ
o * CJ o < 3 <
u. U —t u u CJ «—» <
C-»· u < *- cu. u
r; CJ 2 • * •w» CJ
< a H •Ί j—1
<IO c o > CJ CJ
-24CZ 286557 B6
J4 u <3 tl 44 5* os U
«4 44 tc ř* O 44 o
a 35 r} u co t 03 44
u w CO w u U u
π U u u e> ΖΔ to u
CZ O <J í3 u to 00 u
u to w a ra U Ό OJ
u ‘Pí U *; co 30 U 44
u rz U 00 co co
u o a 44 a *< Q 44
M 30 o U u M J3 33
O U CC u «4 30 44
u cO n CO 35 u u u
<J a to ÍJ w c 44 u
4J Q c u CO o 44
a u 30 co to co u to
u u a Π 44 a u c
a to u ec u u Π
u a u n 4J CO Q u
u u Í4 co 73 44 30 u
O 44 Q co w tz U <9 a U u rt co w CO
o u 44 U XJ ta Π ca
u υ <Q U u CO «3 33
co a t2 co *4 O to
44 to co O XJ .3 to 44
Q 30 co co υ ca co
O u CO íj O u co «4 u
H co Π 03 Q CJ Ζ» to M
Q 35 ca t; CO o co Q
>o «ί u o O.
tO - u υ 05 u 7* u 44
xj w u Γ7 33 33 44 u
u €3 co Q CO CO u 33
u <J to CO U > Λ o CO
σ u co a 44 u w
u U co 50 U u 44 O
u u CJ •4 a 44 u 44
*4 a u u u a O
30 c 44 u 44 u v u
44 ca u u u u ZZ 30
t''.
<s Aí
F—<
X>
« H <S <
< <
=1
M 44 14 30 *3 TJ *3 i.
A* w π 53 <4 33 • «4
Z *J C. 33 to ‘4 «4 '4
44 *7 ur U ϋ
U CO co υ 33 u 35
*4 a w A4 Q U cO *3
u sc w co 30 C3 33
< υ Π U w υ CO
t3 eO u rj 44 V •4
t-4 O co á to 44 tj n
<O £0 < Ό w Ά
u u fl u u υ C3 n 44 44 u 44 CO to
G.O o u co 33 to U ít
71 < u to 53 to w u
< O 4J X<4 35 =5 :a r;
u co Q υ 35 CO
u t3 Q V ,·ς ?j
ísO u u rz 33 X4 'J r:
«X zo n c «4 ct
c ~ u w *- «4 ta
H <
a V CZ U u rz
L *J Π Cl 35 44 c
b υ c •z 5* w •j
Σ7 e C3 ta ; 33 *4
< < 44 53 *3 to •ζ Π
C3 <3 CO to
*4 44 * ·* •u
·· u *4 ·< *> to 33
»** u *4 J 33 b4 «-» *4
·* A* '4 V « » ta to
a.ivctcat cg aeaagaactg aaaccaccaa uannaaaaaaa/i
-25CZ 286557 B6 příkladu 1. Částečné podtržení označuje zbytky v aminokyselinové sekvenci určitých tryptických fragmentů, které nemohly být stanoveny jednoznačně. CDNA klony lambda-HEPOFL8 a lambda-HEPOFL13 byly screenovány, uloženy a jsou dostupné z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem ATCC 40156, ATCC 40152 a ATCC 40153.
Příklad 4
Genomická struktura EPO genu
Relativní velikost a polohy čtyř nezávislých genomických klonů (lambda-HEPOl, 2, 3 a 6) z knihovny HaelII/AluI jsou ilustrovány překrývajícími se čarami na obr. 3. Silná čára označuje polohu EPO genu. Je uvedena stupnice (v kb) a polohy známých míst štěpení restrikční endonukleázou. Oblast, obsahující EPO gen byla kompletně sekvenována zobou řetězců za použití řízené série delecí v této oblasti. Schematické znázornění pěti exonů, kódujících EPO mRNA je uvedeno na obr. 4. Přesná 5-konec vazba exonu I je v současnosti neznámá. Protein kódující podíly exonů jsou tmavší. Kompletní nukleotidová sekvence oblasti je uveden v tabulce 4. Známé hranice každého exonu jsou označeny pomocí silných vertikálních čar genomické klony lambda-HEPOl, lambda-HEPO2, lambda-HEPO3 a lambda-HEPO6 byly uloženy a jsou dostupné z Amarican Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem ATCC 40154, ATCC 40155 a ATCC 40150 a ATCC 40151.
Příklad 5
Konstrukce vektoru p91023 (b)
Transformačním vektorem byl pAdD26SVpA (3) popsaný Kaufmanem a spol., Mol. Cell Biol., 2:1304 (1982). Struktura tohoto vektoru je uvedena na obr. 5A. Stručně, tento plasmid obsahuje gen cDNA myší dihydrofolát reduktázy (DFHR), který je pod transkripční kontrolou adenovirus 2 (Ad2) hlavního pozdního promotoru. 5-konec střihové místo je indikováno v adenovirové DNA a 3-konec střihové místo, odvozené od imunoglobulinového genu, je přítomno mezi Ad2 hlavním pozdním promotorem a DFHR kódující sekvencí. SV40 časné polyadenylační místo je přítomno za DHFR kódující sekvencí. Prokaryoticky odvozená sekce pAdD26SVpA (3) je z pSVOd (Mellon a spol., Cell, 27:279(1981)) a neobsahuje pBR322 sekvence, o nichž je známé, že inhibují replikaci v savčích buňkách (Lusky a spol., Nátuře, 293:79 (1981)).
pAdD26SVpA (3) byl převeden na plasmid pCVSVL2 jak je ilustrováno na obr. 5A. pAdD26SVpA (3) byl převeden na plasmid pAdD26SVpA (3) (d) delecí jednoho ze dvou Pstl míst v pAdD26SVpA (3). Toto bylo provedeno parciálním štěpením pomocí Pstl za použití deficitu enzymu tak, aby byla získána subpopulace linearizovaných plasmidů, ve kterých bylo štěpeno pouze jedno Pstl místo, s následujícím zpracováním Klenowem, ligací pro recirkulaci a screeningem na deleci Pstl místa umístěného 3-konec k SV40 polyadenylační sekvenci.
Adenovirový trojdílný leader a s virem spojené geny (VA geny) byly inzertovány do pAdD26SVpA (3) (d) jak je ilustrováno na obr. 5A. Nejprve byl pAdD26SVpA (3) (d)) štěpen pomocí PvuII pro získání lineární molekuly otevřené ve 3-konec části tří elementů, tvořících trojdílný leader. Potom byl pJAW 43 (Zain a spol., Cell, 16:851 (1979)) zpracován s Klenowem, štěpen pomocí PvuII a 140bp fragment, obsahující druhou část třetího leaderu byl izolován elektroforézou na akrylamidovém gelu (6% ve Tris borátovém pufru; Maniatis a spol., supra). 140bp fragment byl pak ligován do PvuII štěpeného pAdD26SVpA (3) (d). Ligační produkt byl použit ke transformaci E.coli na tetracyklinovou rezistenci a kolonie byly screenovány za použití
-26CZ 286557 B6
Grunstein-Hognessova postupu za použití 32P značené sondy, hybridizující ke 140 bp fragmentu. DNA byla připravena z pozitivně hybridizujících kolonií pro test, zda PvuII rekonstruované místo bylo 5-konec nebo 3-konec inzertované 140bp DNA specifické ke druhému a třetímu adenovirovému pozdnímu leaderu. Správná orientace PvuII místa je na 5-koncové straně 140bp inzertu. Tento plasmid je označen tTPL na obr. 5A.
Ava II D fragment SV40, obsahující SV40 enhancerovou sekvenci byl získán štěpením SV40 DNA pomocí AVA II, zatupením konců Klenowým fragmentem pol I, ligací Xho 1 linkerů k fragmentům, štěpením s Xho 1 pro otevření Xho 1 místa a izolaci čtvrtého největšího (D) fragmentu gelovou elektroforézou). Tento fragment byl pak ligován k Xho lštěpenému pTLL za vzniku plasmidu pCVSVL2-TPL. Orientace SV40 D fragmentu v pCVSVL2-TPL byla taková, že SV40 pozdní promotor byl ve stejné orientaci jako adenovirový hlavní pozdní promotor.
Pro zavedení s adenovirem spojených (VA) genů do pCVSVL2-TPL byl nejprve konstruován plasmid pBR322, který obsahuje adenovirus typ 2 Hind III B fragment. Adenovirus typ 2 DNA byla štěpena s Hind III a B fragment byl izolován gelovou elektroforézou. Tento fragment byl inzertován do pBR322, který byl předem štěpen pomocí Hind III. Po transformaci E. coli na amplicilinovou rezistenci, byly rekombinanty screenovány na inzerci Hind III B fragmentu a orientace inzertu byla stanovena štěpením restrikčním enzymem. pBR322-Ad Hind III B obsahuje adenovirus typ 2 Hind III B fragment v orientaci znázorněné na obr. 5B.
Jak je ilustrováno na obr. 5B, jsou VA geny výhodně získány z plasmidu pBR322-Ad Hind III B štěpením s Hpa I, přídavkem EcoRl linkerů a štěpením pomocí EcoRI a následujícím odstraněním 1,4 kb fragmentu. Fragment mající EcoRI lepivé konce se pak liguje do EcoRI místa PTL, předem štěpeného s EcoRI. Po transformaci E.coli HB101 a selekci na tetracyklinovou rezistenci, byly kolonie screenovány filtrovanou hybridizací k DNA specifické pro VA geny. DNA byla připravena z pozitivně hybridizujících klonů a charakterizována štěpením restrikční endonukleázou. Výsledný plasmid je označen p91023.
Jak je ilustrováno na obr. 5C, byla dvě EcoRI místa vp91023 odstraněna úplným rozštěpením p91023 pomocí EcoRI za vzniku dvou DNA fragmentů, jeden asi 7kb a druhý asi l,3kb. Posledně uváděný fragment obsahuje V A geny. Konce obou fragmentů pak byly vzájemně k sobě ligovány. Plasmis p91023(A), obsahující VA geny a podobně p91023, ale s delecí dvou EcoRI míst, byly identifikovány pomocí Grunstein-Hognessova screeningu s Va genovým fragmentem a běžnou analýzou restrikčních míst.
Jediné Pstl místo v p91023 (A) bylo odstraněno a nahrazeno EcoRI místem. p91023(a) byl úplně rozřezán pomocí Pstl a zpracován s Klenowým fragmentempoll pro vytvoření vyrovnaných konců. EcoRI linkery byly ligovány kzatupenému Pstl místu p91023(A). Lineární p91023(A) s EcoRI linkery připojenými k ztupenému Pst místu byly odděleny od neligovaných linkerů a plně rozštěpeny pomocí EcoRI a religovány. Byl získán plasmid p91023(B) jak je znázorněn na obr. 5C a byl identifikován jako mající strukturu podobnou p91023(A), ale s EcoRI místem místo dřívějšího Pstl místa. Plasmid p91023(B) byl uložen a je dostupný z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem ATCC 39754.
Příklad 6 cDNA klony (lambda-EPOFLó a lambda-EPOFL13, příklad 3) byly inzertovány do plasmidu p91023(B) za vzniku PPTFL6 a PPTFL13. 8 ug každé z čištěných DNA bylo pak použito k transfektování 5 x 106 COS buněk za použití DEAE-dextranové metody (infra). Po 12 hodinách byly buňky promyty a zpracovávány s chloroquinem (0,1 mm) po 2 h, opět promyty a vystavena 10 ml média, obsahujícího 10% fetálního telecího séra po 24 hodin. Médium bylo zaměněno za 4 ml séra prostého média a sklizeno o 48 hodin později.
-27CZ 286557 B6
Produkce imunologicky aktivního EPO byla kvantifikována radioimunozkouškou jak popsali Sherwood a Goldwasser (55). Protilátka byla poskytnuta Dr. Judith Sherwood. Jodovaný značkovač byl připraven z homogenního EPO popsaného v příkladu 1. Citlivost zkoušky je přibližně 1 ng/ml. Výsledky jsou uvedeny dále v tabulce 8.
Tabulka 8
Vektor______________________________________hladina EPO uvolněného do média (ng/ml) pPTFL13 330 pTPFLÓ 31
PTFL13 byl uložen a je dostupný z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem ATCC3990.
Příklad 7
EPO cDNA (lambda-HEPOFL13) byla inzertována do p91023(B) vektoru a byla transfektována do COS-1 buněk a sklizena jak popsáno výše (příklad 6) s tím rozdílem, že bylo vypuštěno zpracování chloroquinem.
In vitro byl stanoven biologicky aktivní EPO pomocí zkoušky tvorby kolonií s buňkami jater myšího plodu jako zdroje CFU-E nebo zkoušky příjmu EH-thymidinu za použití buněk sleziny myší, kterým byla předem podána injekce fenylhydrazinu. Citlivosti těchto zkoušek jsou přibližně 25 milijednotek/ml. In vivo byl biologicky aktivní EPO měřen použitím metod buď shypoxickou myší, nebo vyhladovělou krysou. Citlivost těchto zkoušek je přibližně 100 milijednotek/ml. Nebyla detegována žádná aktivita u obou zkoušek ani v kontrolním pokuse. Výsledky EPO exprimovaného klonem EPOFL13 jsou uvedeny dále v tabulce 9, kde uváděné aktivity jsou vyjádřeny v jednotkách/ml za použití komerčního, kvantifikovaného EPO (Toyobo, lne.) jako standardu.
Tabulka 9
EPO exprimovaný z COS buněk transfektovaných EPO cDNA typ I
Zkouška
RIA
CFU-E 3H-Thy hypoxická myš vyhladovělá krysa aktivita
100 ng/ml 20,5j./ml
3,1 l,8j./ml lj./ml
j./ml
Příklad 8
Analýza EPO z COS buněk na polyakiylamidovém gelu
180 ng EPO uvolněného do média COS buněk transfektovaných EPO (lambda-HEPOFL13) cDNA ve vektoru 91023(B) (viz výše) bylo elektroforezováno na 10% SDS Laemli polyakiylamidovém gelu a elektrotransferováno na nitrocelulózový papír (Towbin a spol., Proč.
-28CZ 286557 B6
Nati. Acad. Aci. US 76:4350 (1979)). Filtr byl sondován s anti-EPO protilátko jak je popsána v tabulce 8, promyt a znovu prohledán pomocí 125I-staph A proteinem. Filtr byl zpracováván autoradiografií po dva dny. Nativní homogenní EPO popsané v příkladu 1, buď před (dráha B), nebo po jodaci (dráha C) byly podrobeny elektroforéze (viz obr. 8). Použité markéry zahrnují 35S značený methionin, sérový albumin (68 000 d) a ovalbumin (45 000 d).
Příklad 9
Konstrukce RK1-4
Bam HI-PvuII fragment zplasmidu PSV2DHFR (Subramani a spol., Mol Cell. Biol. 1:854-864 (1981)), obsahující oblast časného promotoru SV40 připojeného ke genu myší dihydrofolát reduktasy (HDFR), SV40 enhancer, malý intron t antigenu a SV40 polyadenylační sekvenci, byl izolován (fragment A). Zbývající fragmenty byly získány z vektoru p91023(A) (viz výše) následovně: p91023 (A) byl štěpen pomocí Pst I v jediném Pst I místě blízkém adenovirovému promotoru pro linearizaci plasmidu a buď ligován k syntetickým Pst I až EcoRI konverterům a recirkulován (vytvoření míst Pst Ι-EcoRI - Pst I na původním Pst I místě; 91023(B'), nebo zpracován s velkým fragmentem DNA polymerázy I k rozrušení Pst I míst a ligován k syntetickému EcoRI linkeru a recirkularizován (vytvořením EcoRI místa na původním místě Pst I; 91023 (B). Každý ze dvou výsledných fragmentů 91023 (B) a 91023 (B); byly štěpeny pomocí Xba a EcoRI za vzniku dvou fragmentů (F a G). Spojením F fragmentu z p91023 (B) a fragmentu G zp91023 (B') a fragmentu G zp91023(B) a fragmentu F zp91023(B') byly vytvořeny dva nové plasmidy, které obsahují buď EcoRI - Pst I místo, nebo Pst i - EcoRI místo na původním Pst I místě. Plasmid, obsahující Pst I - Eco RI místo, kde Pst I místo je nejblíže adenovirovému hlavnímu pozdnímu promotoru byl nazván p91023 (C).
Vektor p91023 (C) byl kompletně štěpen pomocí Xhol a výsledná linearizovaná DNA s lepivými konci byla zatupena reakcí zaplnění konců s velkým fragmentem E. coli z DNA polymerázy I. K této DNA byl ligován 340 bp Hind III EcoRI fragment, obsahující SV40 enhancer připravený následovně:
Hind III - Pvu II fragment ze SV40, který obsahuje SV40, který obsahuje SV40 počátek replikace a enhancer byl inzertován do plasmidu c lac (Little a spol., Mol. Biol. Med. 1:473—488 (1983)). c lac vektor byl připraven štěpením c lac DNA pomocí BamHI, zaplněním na lepivých koncích velkým fragmentem DNA polymerázy I a štěpením DNA pomocí Hind III. Výsledný plasmid (c SVHPlaC) regeneroval BamHI místo při ligaci k Pvu II tupému konci. Fragment EcoRI-Hind III byl připraven zc SVHPlac a ligován kEcoRI-Hind III fragmentu pSVOd (Mellon a spol, supra), který obsahuje plasmidový počátek replikace a byl selektován výsledný plasmid PSVHPOd. Pak byl připraven 340 bp EcoRI-Hind III fragment z PSVHPOd, obsahující SV40 počátek/enhancer, zatupen na obou koncích pomocí velkého fragmentu DNA polymerázy I a ligován k Xhol štěpenému, zatupenému p91023(c) vektoru popsanému výše. Výsledný plasmid (p91023(C) /Xho/zatupený plus EcoRI/Hind III/zatupený SV40 počátek plus enhancer), ve kterém byla orientace Hind III - EcoRI fragmentu taková, že BamHI místo v tomto fragmentu bylo co nejdříve VA genu byl označen pES105. Plasmid Pes 105 byl štěpen pomocí Bam HI a PvuII a také PvuII samotným a byl izolován BamHI-PvuII fragment, obsahující adenovirový hlavní pozdní promotor (fragment B) a PvuII fragment, obsahující plasmid trvání rezistence genu (tetracyklinová resistence) a jiné sekvence (fragment C). Fragmenty A, B a C byly ligovány a výsledný plasmid je uveden na obr. 7 a byl izolován nazván RK1-4. Plasmid RK1-4 byl uložen v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland, kde je dostupný pod přírůstkovým číslem ATCC 399940.
-29CZ 286557 B6
Příklad 10
Exprese EPO v CHO buňkách - metoda I
DNA (20 ug) zplasmidu pPTFL13 popsaného výše (příklad 6) byla štěpena restrikční endonukleázou Cla I k linearizaci plasmidu a byla ligována k Cla I-štěpené DNA z plasmidu pAdD26SP(A) 1 (2 ug), který obsahuje intaktní dihydrofolát reduktasový (DHFR) gen řízený adenovirovým hlavním pozdním promotorem (Kaufman a Sharp, Mol. and Cell. Biol. 2:13041319 (1982)). Takto ligovaná DNA byla použita k transfektování DHFR-negativních CHO buněk (DUK.S-BII, Chasin L.A. a Urlaub G. (1980) PNAS 77 4216-4220) a ponechána růst dva dny, buňky, které inkorporovaly alespoň jeden DHFR gen byly selektrovány v alfa médiu postrádajícím munkleatidy a doplněném 10 % dialyzovaného fetálního hovězího séra. Po dvou týdnech růstu v selektivním médiu byly kolonie odstraněny z originálních ploten, spojeny do skupiny 10-100 kolonií na skupinu, znovu umístěny na plotnu a ponechány růst do slití v médiu, postrádajícím nukleotidy. Supematanty média ze skupin rostlých před methotrexátovou selekcí byly zkoušeny na EPO pomocí RIA. Skupiny, které vykazují pozitivní EPO produkci rostly za přítomnosti methotrexátu (0,02 uM) a pak byly subklonovány a znovu zkoušeny. EPO Cla 4 4.02-7, jediný subklonovaný z EPO Cla 4 4.02 skupiny, uvolňuje 460 ng/ml EPO do média, obsahujícího 0,02 uM MTX (tabulka 10). EPO Cla 4 4.02-7 je buněčná linie volby pro produkci EPO a byla uložena v Američan Type Culture Collection pod přírůstkovým číslem ATCC CRL8695. V současnosti je tento klon podroben postupné selekci ve zvyšujících se koncentracích MTX a bude pravděpodobně poskytovat buňky, které produkují i vyšší hladiny EPO. Pro skupiny, které na základě RIA byly negativní, byly kolonie rezistentní k metotrexátu získány z dublikátních kultur, které rostly za přítomnosti methotrexátu (0,02 uM) opět ve skupinách zkoušeny na EPO pomocí RIA. Tyto kultury, které nebyly pozitivní byly subklonovány a podrobeny růstu v dále se zvyšujících koncentracích methotrexátu.
Postupná methtrexátová selekce (MTX) byla dosažena opakováním cyklů kultivace buněk za přítomnosti zvyšujících se koncentrací methotrexátu a selekcí přežívajících. V každém cyklu byl měřen EPO v kulturách supematantu pomocí RIA a in vitro biologické aktivity. Hladiny methotrexátu použité v každé postupné amplifikaci byly 0,02 uM, 0,1 uM a 0,5 uM. Jak je uvedeno v tabulce 10 po jednom cyklu selekce v 0,02 uM MTX byly do kultivačního média uvolněny významně vysoké hladiny EPO.
Tabulka 10
Hladina EPO uvolněného do média
Vzorek zkouška získaného z média alfa 0,02 uM methotrexát v médiu alfa
skupina 4 4 RIA 17 ng/ml 50 ng/ml
jediná kopie 4 4 klon
(.02-7) RIA - 460 ng/ml
Příklad 11
Exprese EPO v CHO buňkách - metoda II
DNA z klonu lambda HEPOFL 13 byl štěpen pomocí EcoRI a malý fragment, obsahující EPO gen byl subklonován do EcoRI místa plasmidu RK1—4 (viz příklad 10). Tato DNA (RKFL13)
-30CZ 286557 B6 pak byla použita ke transfekci DHFR-negativních CHO buněk přímo (bez štěpení) a selekce a amplifikace byla provedena jak je popsáno výše v příkladu 10.
RKFL13 DNA byla také inzertována do CHO buněk protoplastovou fúzí a mikroinjekcí. Plasmid RKFL13 byl uložen a je dostupný z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maiyland přírůstkovým číslem ATCC 39989.
Tabulka 11
Vzorek
Hladina EPO uvolněného do média zkouška získaného z média 0,02 uM methotrexát alfa v médiu alfa
skupina kolonií
A RIA 3 ng/ml 42 ng/ml (skupina) 150 ng/ml (klon)
3H-Thy - 1,5 j./ml
jediná RIA - 90 ng/ml
kolonie klon(.02C-Z) mikroinjektovaná 3H-Thy 5,9j./ml
skupina RIA 60 ng/ml 160 ng/ml
(DEPO-1) 3H-Thy 1,8 j./ml
Preferovaný klon jediné kolonie byl uložen a je dostupný z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland přírůstkovým číslem ATCC CRL8695.
Příklad 12
Exprese EPO genomického klonu v COS-1 buňkách
Pro expresi EPO genomického klonu byl použit vektor pSVOd (Mellon a spol., supra). DNA z pSVOD byla úplně štěpena pomocí Hind III a zatupena s velkým fragmentem DNA polymerázy I. EPO genomický klon lambda-HEP3 byl úplně štěpen s EcoRI a Hind III a 4,0 kb fragment, obsahující EPO gen byl izolován a zatupen jako výše. Nukleotidová sekvence tohoto fragmentu z Hind III do oblasti právě za polyadenylačním signálem je uvedena na obr. 4 a v tabulce 4. EPO genový fragment byl inzertován po pSVOd plasmidového fragmentu a správně konstruované rekombinanty v obou orientacích byly izolovány a ověřeny. Plasmid CZ2-1 má EPO gen v orientaci „a“ (tj. 5' konec EPO nejblíže kSV40 počátku) a plasmid CZ1-3 je v opačné orientaci (orientace „b“).
Plasmidy CZ1-3 a CZ2-1 byly transfektovány do COS-1 buněk jak je popsáno v příkladu 7 a média byla sklizena a zkoušena na imunologicky reaktivní EPO. Přibližně 31 ng/ml EPO bylo defektních v supematantu kultury z CZ2-1 a 16-31 ng/ml CZ1-3.
Genomické klony HEPO1, HEPO2 a HEPO5 mohou být inzertovány do COS buněk pro expresi podobným způsobem.
-31CZ 286557 B6
Příklad 13
Exprese v C127 a v 3T3 buňkách. Konstrukce pBPVEPO
Plasmid, obsahující EPO cDNA sekvenci pod transkripční kontrolou myšího metalothioneinového promotoru a nepojen ke kompletní DNA hovězího papilloma viru, byl připraven následovně:
pEPO49F
Plasmid SP6/5 byl získán od Promega Biotec. Tento plasmid byl štěpen kompletně pomocí EcoRI a 1340 bp EcoRI fragment z lambda-HEPOFL13 byl inzertován DNA ligasou. Výsledný plasmid, ve kterém 5' konec EPO genu byl nejblíže k SP6 promotoru (stanoveno pomocí štěpení BglI a Hind III) byl nazván pEPO49F. V této orientaci je BamHI místo v PSP6/5 polylinkeru 15 přímo připojeno k 5' konci EPO genu.
pMMTneo BPV
Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) (Law a spol., Mol. and Cell Biol., 3:2110-2115 (1983)), 20 ilustrovaný na obr. 8, byl štěpen kompletně pomocí BamHI za vzniku dvou fragmentů - velkého fragmentu asi 8 kb v dávce, obsahující BPV genom a menšího fragmentu asi 6,5 kb délky, obsahujícího pML2 počátek replikace a gen amplicilinové rezistence, metallothioneinový promotoe, gen rezistence neomycinu a SV40 polyadenylační signál. Štěpení DNA byla recirkularizována DNA ligasou a plasmidy, které obsahují pouze 6,8 kb fragment byly identifikovány 25 pomocí EcoRI a BamHI restrikčním endonukleázovým štěpením. Jeden z těchto plasmidů byl nazván pMMTneo BPV.
pEPO15a pMMT nebo BPV byl kompletně štěpen pomocí BglII. PEPO49f byl štěpen kompletně pomocí BamHI a BglII a přibližně 700 bp fragment byl připraven izolací na gelu. BglII štěpený pMMTneo BPV a 700 bp BamHI/BglII Epo fragment byly ligovány a výsledné plasmidy, obsahující EPO cDNA byly identifikovány koloniovou hybridizací s oligonukleotidovou d(GGTCATCTGTCCCCTGTCC) sondou, která je specifická pro EPO gen. Z plasmidů, které 35 byly pozitivní při hybridizační analýze, byl jeden (pEPO15a) který měl EPO cDNA v orientaci takové, že 5' konec cDNA byl nejbližší metallothioneinovému promotoru identifikován štěpením pomocí EcoRI a Kpnf.
pBPV-EPO
Plasmid pEPO15A byl štěpen kompletně BamHI pro linearizaci plasmidů. Plasmid pdBPVMMTneo (342-12) byl také štěpen kompletně pomocí BamHI za vzniku dvou fragmentů 6,5 a 8b. 8kb fragment, který obsahuje celý genom hovězího Papilloma viru, byl izolován na gelu. PEPO15a/BamHI a 8kb BamHI fragment byly spolu ligovány a plasmid (pBPV-EPO), který 45 obsahuje BPV fragment byly identifikovány koloniovou hybridizací za použití oligonukleotidové sondy d(P-CCACACCCGGTACACA-OH), která je specifická pro BPV genom. Štěpení pBPEPO DNA pomocí Hind III indikuje, že směr transkripce BPV genomu byl stejný jako směs transkripce metallothioneinového promotoru (jako v pdBPV-MMTnec(342-12) viz obr. 8).
Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) je dostupný z Američan Type Culture Collection, 50 Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem č. ATCC 37 224.
-32CZ 286557 B6
Exprese
Následující metody byly použity pro expresi EPO.
Metoda I
DNA pBPV-EPO byla připravena a přibližně 25 ug bylo použito k transfektování asi lxlO6 C127 (Lowy a spol., J. of Virol. 26:291-98 (1978)) CHO buněk za použití standardních technik srážení fosforečnanem vápenatým (Grahm a spol., Virology, 52:456-67 (1973)). Pět hodin po transfekci byla transfekční média odstraněna, buňky byly podrobeny glycerinovému šoku, promyty a bylo přidáno čerstvého α-média, obsahujícího 10 % fetálního bovinního séra. Po 48 hodinách byly buňky trypsinizovány a štěpeny v poměru 1:10 v DME médiu, obsahujícím 500 ug/ml G418 (Southem a spol., Mol. Appl. Genet. 1:327—41 (1982)) a buňky byly inkubovány dva až tři týdny. G418 rezistentní kolonie pak byly individuálně izolovány do mikrotitračních jamek a ponechány růst do stadia za přítomnosti G418. Buňky pak byly promyty, bylo přidáno čerstvé médium, obsahující 10 % fetálního hovězího séra a média byla sklizena o 48 hodin později. Kondicionované médium bylo testováno a zjištěno jako pozitivní při radioimunoeseji a in vitro biologické eseji.
Metoda II
C127 nebo 3T3 buňky se 25 ug pBPV-EPO a 2ug pSV2neo (Southem a spol., supra) jak je popsána v metodě I. Je zde přibližně 10-násobný molámí přebytek pBPV-EPO. Po transfekci, postup je stejný jako v metodě 1.
Metoda III
Cl27 buňky byly transfektovány 30 ug pBPV-EPO jak je popsáno v metodě I. Po transfekci a štěpení (1:10) bylo každé tři dny vyměňováno čerstvé médium. Po asi 2 týdnech byla zřejmá ložiska transformovaných buněk. Jednotlivá ložiska byla odebrána jednotlivě do 1 cm jamek mikrotitrační plotny, ponechána růst do subsouvislé monovrstvy a zkoušena na EPO aktivitu nebo antigenicitu v kondicionovaném médiu.
Příklad 14
Exprese ve hmyzích buňkách. Konstrukce pIVEV EPOFL13
Plasmidový vektor pIVEV byl uložen a je dostupný od Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem č. ATCC 39991. Vektor byl modifikován následovně:
pIVEVNI pIVEV byl štěpen pomocí EcoRI k linearizaci plasmidu, zatupen použitím velkého fragmentu DNA polymerázy I a jediného Notl linkeru
GGCGGCCGCC
CCGCCCGGCGG byl inzertován ligací kotupeným koncům. Výsledný plasmid je nazván pIVEVNL pIVENSI pIVEV byl štěpen pomocí Smál k linearizaci jediného Sfil linkeru GGGCCCCAGGGGCCC
-33CZ 286557 B6
CCCGGGGTCCCCGGG byl inzertován ligací k otupeným koncům. Výsledný plasmid byl nazván pIVEVSI. PIVEVSIBgKp
Plasmid pIVEVSI byl štěpen pomocí KpnI k linearizaci plasmidu a přibližně 0 až 100 bp bylo získáno z každého konce štěpením dvouřetězcovou exonukleázou Bal 31. Jakékoliv konce, které nebyly perfektně tupé byly zatupeny pomocí velkého fragmentu DNA polymerázy I a polylinker _XhQ_ I _ Jbal
Barii Tco^I ícial KpnI Γ >7 |“----J . ----]
AGATCTCGAGAATTCTAGATCGATGGTACC TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG byl inzertován ligací k tupým koncům. Polylinker byl inzertován v obou orientacích. Plasmid, ve kterém je polylinker orientován tak, že BglII místo v polylinkeru je nejbližší k promotoru polyhedron genu je nazván pIVEVSIBgKp. Plasmid, ve kterém KpnI místo v polylinkeru je nejbližší k promotoru polyhedron genu je nazván pIVEVSIKpBg. Počet párů bází, které byly deletovány musí původním KpnI místem v pIVEVSI a polyhedron promotorem, nebyl stanoven. PIEIVSIBgKp byl uložen a je dostupný z Američan Type Culture Collection, Rockville^ Maiyland pod přírůstkovým číslem č. ATCC 399988.
PIEVSIBgKpNl pIVEVNI byl štěpen kompletně pomocí KpnI a Pstl za vzniku dvou fragmentů, Větší fragment, který obsahuje plasmidový počátek replikace a 3' konec polyhedron genu byl připraven izolací na gelu (fragment A). pIVEVSIBgKp byl štěpen kompletně pomocí pstl a Kpn za vzniku dvou fragmentů a menší fragment, který obsahuje polyhedron genový promotor a polylinker byl připraven izolacemi na gelu (fragment B). Fragment A a B pak byly spojeny DNA ligasou za vzniku nového plasmidu pIVEVSIBgKpNI, který obsahuje částečně deletovaný polyhedron gen, do kterého byl inzertován polylinker a obsahuje také Notl místo (nahrazení zničeného EcoRI místa) a Sfil místo, které přiléhá k polyhedron genové oblasti.
pIVEPO pIVEVSI BGKpNI byl štěpen kompletně pomocí EcoRI pro linearizaci plasmidu a 1340 bp EcoRI fragment z lambda-HEPOFL13 byl inzertován. Plasmidy, obsahující EPO gen v orientaci takové, že 5' konec EPO genu je nejbližší polyhedron promotoru a 3' konec polyhedron genu, byly identifikovány štěpením s BglII. Jeden z těchto plasmidů ve výše popsané orientaci byl označen pIVEPO.
Exprese EPO ve hmyzích buňkách
Velká množství pIVEPO plasmidu byla vyrobena transformací E. coli kmene JMIOl-tgl. Plasmidová DNA byla izolována technikou čištění lyzátu (Maniatis a Fritsch, Cold Spring Harbor Manual) a dále čištěna pomocí CsCl odstředění. L-l DNA polyhedrosis viru standardního typu Autographa califomica (AcNPV) byla připravena fenolovou extrakcí částic viru a následným CsCl čištěním virové DNA.
Tyto dvě DNA pak byly kotrasfektovány do Spodoptera frugiperda buněk IPLB-SF-21 (Vaughn a spol., In Vitro, díl B, str. 213-17 (1977) za použití transfekčního postupu s fosforečnanem vápenatým (Potter a Millere, 1977). Pro každou plotnu kotransfektovaných buněk byl použit 1 ug DNA standardního typu AcNPV a lOug pIVEPO. Plotny byly inkubovány při 27 °C 5 dnů.
-34CZ 286557 B6
Supematant pak byl oddělen a EPO exprese v supematantů byla potvrzena radioimunoesejí a in vitro biologickou eseji.
Příklad 15
Čištění EPO
COS-buněčná kondicionovaná média (121) sEPO koncentracemi až 200 ug/litr byla koncentrována na 600 ml za použití ultrafiltračních membrán se schopností dělení 10000 mol. hmotnosti, jako je Millipore Pellicans 0,46 m2 na membránu. Eseje byly provedeny pomocí RIA jak je popsáno v příkladu 6. Retentát z ultrafiltrace byl diafiltrován proti 4 ml 10 mM 10 mM fosforečnanu sodného pufrovaného na pH 7,0. Koncentrovaná a diafiltrovaná kondiční média obsahují 2,5 mg EPO ve 380 mg celkového proteinu. EPO roztok byl dále koncentrován na 186 ml a vysrážené proteiny byly odstraněny odstředěním při 110000 x g po 30 minut.
Supematant, který obsahuje EPO (2,0 mg) byl upraven na pH 5,5 s 50% kyselinou octovou, ponechán míchat při 4 °C 30 minut a sraženina byla odstraněna odstřeďováním při 13000 x g po 30 minut.
Chromatografíe na karbonylmethylsepharose
Supematant z odstřeďování (20 ml), obsahující 200 ug EPO (24 mg celkového proteinu) byl nanesen na kolonu naplněnou CM-Seipharosou/20 ml) ekvilibrovanou v 10 mM octanu sodném pH 5,5, promytou 40 ml stejného pufru. EPO, který se navázal k CM-Sepharose, byl eluován 100 ml gradientu NaU (0-+) v 10 mM fosforečnanu sodném pH 5,5. Frakce, obsahující EPO (celkem 50 ug ve 2 mg celkových proteinů) byly spojeny a koncentrovány na 2 ml za použití Amicon YM10 ultrafíltrační membrány.
HPLC s reverzní fází
Koncentrované frakce z CM-Sepharosy, obsahující EPO byly dále čištěny pomocí HPLC s reverzní fází za použití Vydac-4 kolony. EPO byl nanesen na kolonu ekvilibrovanou v 10% rozpouštědle B (rozpouštědlo A bylo 0,1 % CF3CO2H ve vodě; rozpouštědlo B bylo 0,1 % CF3CO2H v CF3CO2H v CF3CN) při průtokové rychlosti 1 ml/min. Kolona byla promývána 10% B po 10 minut a EPO byl eluován s lineárním gradientem B( 10-70% po 60 minut). Frakce, obsahující EPO, byly spojeny (asi 40 ug EPO ve 120 ug celkových proteinů) a lyofilizovány. Lyofilizovaný EPO byl rekonstituován v 0,lM Tris HC1 při pH 7,5, obsahujícím 0,15M NaCl a rechromatografován pomocí HPLC s reverzní fází. Frakce, obsahující EPO, byly spojeny (asi 40 ug EPO ve 120 ug celkových proteinů) a lyofilizovány. Lyofilizovaný EPO byl rekonstituován v 0,lM Tris HC1 při pH 7,5, obsahujícím 0,15M NaCl a rechromatografován pomocí HPLC s reverzní fází. Frakce, obsahující EPO byly spojeny a analyzovány SDS-polyakrylamidovou (10%) gelovou elektroforézou (Lameli U.K., Nátuře). Spojené frakce EPO obsahují 15,5 ug EPO ve 25 ug celkového proteinu.
Vynález byl podrobně popsán svými výhodnými provedeními. Odborník v oboru může snadno provést modifikace a vylepšení na základě popisu a předložených obrázků, aniž by byla porušena myšlenka a rozsah vynálezu, který je dán připojenými nároky.
-35CZ 286557 B6
Seznam publikací, na které je odkaz z textu popisu
1) Jacobson, L O., Goldwasser, E. Fried, W., a- Pizak, L. F„ Trans. Assoc. Am. Physicians TO:305-317 (1957).
2) Krantz, S. B. a Jacobson, L. O. Chicago: University of Chicago Press 1970. pp. 29-31.
3) Hammond, O a Winnick, S. Ann. N.Y. Acad. Sci. 23Q-219-227 (1974).
4) Sherwood, J. B. z Goldwasser, E., Endocrinology 103:866-870 (1978).
5) Fried, W. Blood 40:671-677 (1972).
6) Fisher, J. J. Lab. arJ Clin. Med. 93:695-699 (1979).
7) Naughton, B. A., Kaplan, Š. M., Roy, M., Burdowski, A. J., Gordon, A. S., a> Piliero, S. J. Science 196:301-302.
8) Lucarelli, G. P., Howard, D„ a.. Stohlman, F., Jr. J. Clin. Invest 43:2195-2203 (1964).
9) Zanjani, E. D., Poster, J„ Burlington, H., Mann, L*T.,a . Wasserman, L. R. J. Lab. Clin. Med. 89:640644(1977).
10) Krantz, S. B„ Gallien-Lartigue, O., ai Goldwasser, E. J. Biol Chem. 238:4085-4090 (1963).
11) Dunn, C. D., Jarvis, J. H. a: Greeňman, J. M. Exp. Hematol. 3:65-78 (1975).
12) Krystal, G. Exp. Hematol. 11:649-660 (1983)
13) Iscove, N.N. a· Guilbert, L.J., M.J. Murphy, Jr. (Ed.) New York: Springer-Verlag, pp. 3-7 (1978).
14) Goldwasser, E., ICN UCLA Symposium , Control of Cellular Division and Development, A. R. Liss, lne., pp. 487-494 (1981)
15) Cline, M. J. a Golde, D. W. Nátuře 277:177-181 (1979)
16) Melcalf, O., Johnson, G. R., a< Burgess, A. W. Blood 55:138- (1980)
17) Krane, N. Henry Ford Hosp. Med. J. 31:177-181 (1983)
18) Eschbach, J., Madenovic, JÍ/Garcia, J., Wahl, P., a. Adamson, J. J. Clin. Invest 74;434-441 (1984)
19) Anagnostou, A., Barone, J„ Védo, A., ai . Fried, W. Br. J. Hematol 37:85-91 (1977)
20) Miyake, T., Kung, C., a Goldwasser, E. J. Biol. Chem.~252:5558-5564 (1977)
21) Yanagawa, S., Hirade, K., Ohnota, H., Sasato, R., Chiba, H., Veda, M., ai Goto, M. J. Biol. Chem. 259:2707-2710 (1984)
22) Lawn, R. M„ Fritsch, E. F., Parker, R. C., Bíake, G., a' Maniatis, T. Cell 15:1157 - (1978)
23) Sanger, F., Nicklen, S., a. , Coulson, A. R. Proč. Naťl. Acad. Sci., U.ŠA 74:5463- (1977)
24) Zanjanc, E.D., Ascensao, J.L., McGlave, P.B., Banisadrě’M./aT' Ash, R. C. J. Clin. Invest. 67:1183(1981)
25) Toole, J.J., Knopf, J.L., Wozney, J.M., Sultzman, L.A. Buecker, J. L., Pittman, D. D., Kaufman, R. J.,
-36CZ 286557 B6
Brown, E., Shoemaker, C., Orr, E. C., Amphlett, G. W., Poster, W. B., Coe, M. L., Knutson, G. J., Fass, D. N., a. . Hewick, R. M. Nátuře in Press
26) Goldwasser, E. Blood Suppi. 1,58, xlii (abstr) (1881)
27) Sue, J. M. ai : Sytkowdki, A J. Proč. Naťl Acad. Sci U.SA 80:3651-3655 (1983)
29) Bersch, N. a j Golde, D.W., ln Vitro Aspects of Erythropoiesis, M. J. Murphy (Ed.) New York: Springer-Verlag (1978)
30) Cotes, P. M. a Bangham, O. R. Nátuře 191:1065- (1961)
31) Goldwasser, E. a . Gross, M. Methods in Enzymol 37:109-121 (1975)
32) Nabeshima. Y. -I, Fujii-Kuriyama, Y„ Muramatsu, M., a Ogata, K. Nátuře 308:333-338 (1984)
33) Young, R. A, Hagencuhle, 0. a Schibler, U. Cell 23:451-558 (1981)
34) Medford, R. M., Nguyen, Η. T., Destree, A T., Šummers, E. a Nadal-Ginard, B . Cell 38:409-421 (1984) ~
35) Ziff, E. B. Nátuře 287:491-499 (1980)
36) Early, P. Cell 20:313-319 (1980)
37) Sytkowski, A Bio. Biop. Res. Comm. 96:143-149 (1980)
38) Murphy, M. ai '7 Mtyake, T. Ácta Haematol. Jpn. 46:1380-1396 (1983)
39) Wagh, P. V. a Bahl, O. P. CRČ Critical Reviews in Biochemistry 307-377 (1981)
40) Wang, F. F., Kung, C. K. -H.a Goldwasser, E. Fed. Proč. Fed. Am. Soc. Exp. Biof. 42:1872 (abstr) (1983)
41) Lowy, P., Keighley, G. a·./ Borsook, H. Nátuře 185:102-103 (1960)
42) VanLenten, L a. Ashwell, G. J. Biol. Chem. 247:4633-4640 (1972)
43) Lee-Huang, S. Proč. Naťl Acad. Stí7U.Š.A· 81:2708-2712 (1984)
44) Fyhrquist, F., Rosenlof, K., Gronhagen-Riska, C., Hortling, L. ai Tikkanen. I. Nátuře 308:649-562 (1984)
45) Ohkubo, H., Kageyama, R., VJihara, M., Hirose, T., Inayama, S., at Nakanishi, S. Proč. Naťl Acad. Sci. U.SA 80:2196-2200 (1983)
46) Šuggs, S.V., Wallace, R. B., Hirose, T., Kawashima, E. H. ar Itakura, K. Proč. Naťl. Acad. Sci. U.SA -78:6613-6617 (1981)
47) Woo, S. L C., Dugaiczyk, A, Tsai, M. -J„ Lai, E. C., Catterall, J. F. ar I O'Malley, B. W. Proč. Naťl.· Acad. Stí. U.SA 75:3688- (1978)
48) Melchior, W, B. ai -’ VonHippel, P. H. Proč. Naťl Acad, Soc. U.SA 70:298-302 (1973)
49) Orosz, J. M. a: . Wetmis, j. G. Biopolymers 16;1183-1199 (1977)
50) Anderson, S a Kingston, I. B. Proč. NaťTÁcad. Sci.-U.SA 80:6836-6842 (1983)
51) Ullrich, A., Coussens. L, Hayflick, J. S. Duli, T. J„ Gray, A, Tam, A W„ Lee. J., Yarden, Y., Libermann, T. A, Schlessinger, J., Downward, J., Mayes, E. L. V., Whittle, H.. Waterfield, M.D. a. Seeburg, P. H. Nalure 309: 418-425 (1984)
52) Fisher, J. Proč. Soc. Exptl. Biol. and Med . 173:289-305 (1983)
53) Kozák, Μ.'ΝΰΞ Átíď ^^15857^872(1984)
54) Benton, W.D. a Davis, R.W. Science 196:180-182 (1977)
55) Sherwood, J.B. a. Goldwasser, E. Blood 54:885-893 (1979)
56) Derman, E., Krauter, K., Walling, L, Weinberger, C„ Ray, M., a . Damell, J. T., Cell 23:731- (1981)
57) Gluzman, Y., Cell 23:175-182 (1981)
58) Hewick, R. M„ Hunkapiller, Μ. E., Hood, L. E., < Dreyer. W. J. J. Biol. Chem. 256:7990-7997 (1981)
59) Towbin, H.. Stachelin, T.. a,·. Gordon. J., Proč. Naťl Acad. Sci, 76:4380- (1979)
60) Camott, P., Deflandre, C. C. R. Acad. Sel. Paris 143:432-(1960)
-37CZ 286557 B6

Claims (2)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu, hEPO, zahrnující stupně
    a) kultivace buněk zvaječníků čínského křečka (CHO) které obsahují DNA sekvenci kódující hEPO operativně připojenou k expresní kontrolní sekvenci, ve vhodném médiu a
    b) získání a separace produkovaného rekombinantního hEPO z buněk a média, vyznačující se tím, že se použije CHO buněk majících schopnost poskytovat N-a O-připojenou glykosylaci se zavedením fukózy a N-acetylgalaktosaminu, přičemž z buněk a média se získá a oddělí rekombinantní hEPO s N- a O-připojenou glykosylaci.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že rekombinantní hEPO vykazuje následující glykosylační profil: molámí poměr hexod k N-acetylglukosaminu (Nacglc) 1,4:1, konkrétně molámí poměr galaktózy k Nacglc 0,9:1 a manózy k Nacglc 0,5:1.
CZ19961274A 1984-12-04 1996-05-02 Způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu CZ286557B6 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67781384A 1984-12-04 1984-12-04
US68862285A 1985-01-03 1985-01-03
US69325885A 1985-01-22 1985-01-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ127496A3 CZ127496A3 (cs) 2000-02-16
CZ286557B6 true CZ286557B6 (cs) 2000-05-17

Family

ID=27418329

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS858804A CZ281756B6 (cs) 1984-12-04 1985-12-03 DNA sekvence, kodující aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu, vektory, obsahující takové DNA sekvence, prokaryotické a eukaryotické hostitelské buňky transformované takovým vektorem, způsob přípravy lidského erythropoietinu, rekombinantní lidský erythropoietin a farmaceutický přípravek, obsahující erythropoietin
CZ19961274A CZ286557B6 (cs) 1984-12-04 1996-05-02 Způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu
CZ19994314A CZ287620B6 (cs) 1984-12-04 1999-12-02 Způsob produkce lidského erythropoietinu

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS858804A CZ281756B6 (cs) 1984-12-04 1985-12-03 DNA sekvence, kodující aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu, vektory, obsahující takové DNA sekvence, prokaryotické a eukaryotické hostitelské buňky transformované takovým vektorem, způsob přípravy lidského erythropoietinu, rekombinantní lidský erythropoietin a farmaceutický přípravek, obsahující erythropoietin

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19994314A CZ287620B6 (cs) 1984-12-04 1999-12-02 Způsob produkce lidského erythropoietinu

Country Status (24)

Country Link
EP (2) EP0411678B2 (cs)
JP (4) JPH02104284A (cs)
KR (1) KR890001011B1 (cs)
AT (2) ATE71408T1 (cs)
AU (1) AU621535B2 (cs)
CA (1) CA1341502C (cs)
CZ (3) CZ281756B6 (cs)
DE (3) DE3585161D1 (cs)
DK (4) DK172953B1 (cs)
ES (1) ES8800049A1 (cs)
FI (2) FI104261B1 (cs)
GE (1) GEP19970775B (cs)
GR (1) GR852890B (cs)
HK (2) HK105693A (cs)
HU (1) HU216079B (cs)
IL (1) IL77081A (cs)
LV (2) LV10505B (cs)
MD (1) MD1639C2 (cs)
NO (1) NO304469B1 (cs)
PL (2) PL157926B1 (cs)
PT (1) PT81590B (cs)
SK (2) SK281799B6 (cs)
UA (1) UA44882C2 (cs)
WO (1) WO1986003520A1 (cs)

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4677195A (en) * 1985-01-11 1987-06-30 Genetics Institute, Inc. Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions
EP0236059B1 (en) * 1986-02-27 1994-04-27 Snow Brand Milk Products Co. Ltd. Preparation of erythropoietin-producing cells and production process of erythropoietin using same
DK173067B1 (da) * 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
DE3730599A1 (de) * 1986-09-12 1988-07-07 Genentech Inc Verfahren zur kontinuierlichen herstellung von heterologen proteinen in eukaryontischen wirtszellen
US4954437A (en) * 1986-09-15 1990-09-04 Integrated Genetics, Inc. Cell encoding recombinant human erythropoietin
US4835260A (en) * 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5888774A (en) * 1994-12-19 1999-03-30 Cangene Corporation Recombinant DNA molecules and expression vectors for erythropoietin
IL122614A0 (en) 1995-06-15 1998-08-16 Introgene Bv Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
EP0752474A1 (en) 1995-07-07 1997-01-08 Boehringer Mannheim Gmbh Nucleic acid coding for CMP-N-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins
EP0837942A1 (en) * 1995-07-07 1998-04-29 Boehringer Mannheim Gmbh Nucleic acid coding for cmp-n-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins
DE19535571A1 (de) 1995-09-14 1997-03-20 Boehringer Mannheim Gmbh Pharmazeutische Kombinationspräparate und deren Verwendung zur Behandlung von Hämodialysepatienten
US5952226A (en) * 1996-11-05 1999-09-14 Modex Therapeutiques Hypoxia responsive EPO producing cells
SI0977582T1 (en) 1997-03-18 2002-12-31 Roche Diagnostics Gmbh Pharmaceutical combined preparations containing erythropoietin and iron preparations
EP0885613A1 (de) 1997-06-21 1998-12-23 Roche Diagnostics GmbH Verwendung von modifizierten Hämoglobinen zur Behandlung von Anämien und Kombinationspräparate umfassend Erythropoietin und modifiziertes Hämoglobin
KR100641969B1 (ko) 1997-07-23 2006-11-06 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 내인성 유전자 활성화에 의한 에리트로포이에틴의제조방법
ATE341625T1 (de) * 1997-07-23 2006-10-15 Roche Diagnostics Gmbh Herstellung von erythropoietin durch endogene genaktivierung mit viralen promotoren
US6548296B1 (en) 1997-07-23 2003-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof
DK1000154T3 (da) 1997-07-23 2007-06-18 Roche Diagnostics Gmbh Identificering af humane cellelinjer til produktion af humane proteiner ved endogen genaktivering
KR100622203B1 (ko) 1997-07-23 2006-09-07 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 내인성 유전자 활성화에 의해 사람 단백질을 생성시키는 사람 세포주를 확인하는 방법
ATE255634T1 (de) * 1997-09-01 2003-12-15 Aventis Pharma Gmbh Rekombinantes humanes erythropoietin mit vorteilhaftem glykosylierungsmuster
AR019025A1 (es) 1998-04-09 2001-12-26 Roche Diagnostics Gmbh Uso de eritropoyetina en bajas dosis para producir un preparado farmaceutico para el tratamiento de hemocromatosis, preparado farmaceutico combinadoutilizado segun dicho uso y envase farmaceutico unitario que contiene al referido preparado farmaceutico combinado
BR9905867A (pt) 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Linhagem celular produtora de eritropoietina humana recombinante e a eritropoietina humana recombinante produzida por esta célula
BR9917606A (pt) 1998-11-06 2002-12-31 Bio Sidus S A Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
BR9905868A (pt) 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Procedimento de cultivo massivo de células de mamìfero para a obtenção de eritropoetina humana, recombinante e a eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
US6777205B1 (en) 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
DE19857609A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Hannelore Ehrenreich Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen
US7604960B2 (en) 1999-04-15 2009-10-20 Crucell Holland B.V. Transient protein expression methods
US7297680B2 (en) 1999-04-15 2007-11-20 Crucell Holland B.V. Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content
US6855544B1 (en) 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
US8236561B2 (en) 1999-04-15 2012-08-07 Crucell Holland B.V. Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells
US7527961B2 (en) 1999-11-26 2009-05-05 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7192759B1 (en) 1999-11-26 2007-03-20 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7521220B2 (en) 1999-11-26 2009-04-21 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
AU2002233230B2 (en) 2000-12-20 2007-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Erythropoietin conjugates
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
KR100505152B1 (ko) * 2001-09-10 2005-08-03 (주)가이아진 아스코르브산을 이용한 에리트로포이에틴의 생산방법
US6930086B2 (en) 2001-09-25 2005-08-16 Hoffmann-La Roche Inc. Diglycosylated erythropoietin
ATE384785T1 (de) 2001-12-07 2008-02-15 Crucell Holland Bv Herstellung von viren, virusisolaten, und impfstoffen
EP2277910A1 (en) 2001-12-21 2011-01-26 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10234192B4 (de) 2002-07-26 2009-11-26 Epoplus Gmbh Co.Kg Verwendung von Erythropoetin
US7459435B2 (en) 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
RU2329274C2 (ru) 2002-09-11 2008-07-20 Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх Способ получения производных гидроксиалкилкрахмала
EP1681303B1 (en) 2002-09-11 2013-09-04 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
ES2314238T3 (es) 2002-10-08 2009-03-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugados de oligosacaridos farmaceuticamente activos.
US7459436B2 (en) 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
DK1623023T3 (da) 2003-05-09 2009-03-02 Crucell Holland Bv Kulturer af E1-immortaliserede celler og fremgangsmåder til dyrkning deraf til forögelse af produktudbytter derfra
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
CA2539440A1 (en) 2003-09-29 2005-04-14 Warren Pharmaceuticals, Inc. Tissue protective cytokines for the treatment and prevention of sepsis and the formation of adhesions
DK1699915T3 (da) 2003-12-30 2010-09-13 Augustinus Bader Anvendelse af erythropoietin til levervævsregenerering
DE102004063927A1 (de) 2004-01-23 2005-12-15 Epoplus Gmbh Co.Kg Einsatz von niedrig dosiertem Erythropoietin zur Stimulation endothelialer Vorläuferzellen sowie zur Organregeneration und Progressionsverlangsamung von Endorganschäden
EP1732609B1 (en) 2004-03-11 2012-07-11 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
TWI417303B (zh) 2004-03-11 2013-12-01 Fresenius Kabi De Gmbh 經由還原胺化作用製得之羥烷基澱粉及蛋白質的接合物
GB0507123D0 (en) * 2005-04-08 2005-05-11 Isis Innovation Method
EP1762250A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
AR053416A1 (es) * 2005-11-10 2007-05-09 Protech Pharma S A Combinacion de glicoisoformas para el tratamiento o prevencion de la septicemia, linea celular transgenica productora de glicoformas de eritropoyetina, composicion farmaceutica que comprende a dicha combinacion, procedimientos para obtener la linea celular, procedimiento para producir dicha combinac
TW200804415A (en) 2006-01-18 2008-01-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method of removing sialic acid and process for producing asialoerythropoietin
DE102006004008A1 (de) 2006-01-27 2007-08-02 Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose
EP1991569A4 (en) * 2006-03-07 2009-12-23 Regenetech Inc MAMMALIAN BIOLOGICAL MOLECULES WITH NATURAL GLYCOSYLATION PRODUCED BY ELECTROMAGNETIC STIMULATION OF LIVING MAMMALIAN CELLS
JP5553506B2 (ja) 2006-03-22 2014-07-16 中外製薬株式会社 エリスロポエチン溶液製剤
CA2659990C (en) 2006-08-04 2016-03-22 Prolong Pharmaceuticals, Inc. Polyethylene glycol erythropoietin conjugates
WO2009010107A1 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Hannelore Ehrenreich Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2095829A1 (en) 2008-02-27 2009-09-02 LEK Pharmaceuticals D.D. Selenium containing modifying agents and conjugates
DE102008002209A1 (de) 2008-06-04 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin
DE102008002210A1 (de) 2008-06-04 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Erythropoietin
ES2435272T3 (es) 2008-09-23 2013-12-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Purificación de la eritropoyetina
DE102008054716A1 (de) 2008-12-16 2010-06-17 Evonik Degussa Gmbh Inprozesskontrolle in einem Verfahren zur Herstellung von EPO
US20100272816A1 (en) 2009-04-27 2010-10-28 Wolfgang Rudinger Microcapsules comprising liver cells and erythropoietin, methods for preparing said microcapsules and methods for treating a patient comprising applying said microcapsules to the patient
CN102712688B (zh) 2009-09-23 2015-06-24 通益制药有限公司 重组人红细胞生成素(epo)的纯化方法、由此纯化的epo以及包含纯化的epo的药物组合物
WO2017068051A1 (en) 2015-10-21 2017-04-27 Lek Pharmaceuticals D.D. Peg-based dendron and process for producing the same
CN106906359B (zh) 2015-12-22 2018-12-11 理查德.亨威克 从硅酸盐矿物收取锂
JP2020511499A (ja) 2017-03-20 2020-04-16 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 赤血球生成刺激タンパク質のインビトロでの糖鎖改変のための方法
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US439780A (en) * 1890-11-04 Method of and apparatus for casting ingots
US3865801A (en) * 1973-06-15 1975-02-11 Atomic Energy Commission Stabilization of urinary erythropoietin using sodium p-aminosalicylate and extracting into phenol
JPS5455790A (en) * 1977-10-05 1979-05-04 Tomoyuki Tajima Production of erythropoetin
JPS5653696A (en) * 1979-10-09 1981-05-13 Ajinomoto Co Inc Isolation of erythropoietin by adsorption
JPS6045849B2 (ja) * 1980-08-25 1985-10-12 林原 健 ヒトエリトロポエチンの製造方法
US4419446A (en) * 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
JPS6043395A (ja) * 1983-08-19 1985-03-07 Sumitomo Chem Co Ltd エリスロポエチンの製造法
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
IT1185503B (it) * 1984-01-11 1987-11-12 Univ New York Cloni di odna di eritropietina umana
JPS60215632A (ja) * 1984-04-12 1985-10-29 Japan Found Cancer エリスロポエチンの製造法
US4732889A (en) * 1985-02-06 1988-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for the treatment of the anemia of rheumatoid arthritis
JPH062070B2 (ja) * 1988-07-06 1994-01-12 農林水産省食品総合研究所長 ▲o下−▼アシルアミノ酸の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
SK168799A3 (en) 2001-08-06
LV10505B (en) 1996-04-20
KR890001011B1 (en) 1989-04-18
PL256589A1 (en) 1986-10-21
CZ281756B6 (cs) 1997-01-15
CA1341502C (en) 2006-03-21
SK281799B6 (sk) 2001-08-06
GR852890B (cs) 1986-04-03
JPH02442A (ja) 1990-01-05
JPH02104284A (ja) 1990-04-17
PL154180B1 (en) 1991-07-31
EP0205564A4 (en) 1987-12-14
DK173254B1 (da) 2000-05-22
DK173293B1 (da) 2000-06-13
EP0205564A1 (en) 1986-12-30
DK95197A (da) 1997-08-20
DK368786A (da) 1986-08-01
DE3582732D1 (de) 1991-06-06
ATE71408T1 (de) 1992-01-15
FI863044A0 (fi) 1986-07-24
FI104261B (fi) 1999-12-15
MD1639C2 (ro) 2001-10-31
GEP19970775B (en) 1997-01-27
HK105593A (en) 1993-10-15
EP0411678B1 (en) 1992-01-08
DK200000527A (da) 2000-03-29
HK105693A (en) 1993-10-15
LV10507A (lv) 1995-02-20
AU621535B2 (en) 1992-03-19
IL77081A0 (en) 1986-04-29
EP0411678A1 (en) 1991-02-06
SK880485A3 (en) 1999-03-10
MD1639B2 (en) 2001-03-31
EP0411678B2 (en) 2000-01-12
ATE63137T1 (de) 1991-05-15
DK199901147A (da) 1999-08-20
DE3585161D1 (de) 1992-02-20
UA44882C2 (uk) 2002-03-15
FI105347B (fi) 2000-07-31
HUT40706A (en) 1987-01-28
IL77081A (en) 1999-10-28
CZ880485A3 (en) 1996-08-14
CZ287620B6 (cs) 2001-01-17
LV10507B (lv) 1996-06-20
SK279765B6 (sk) 1999-03-12
DK175826B1 (da) 2005-03-14
FI19992064A (fi) 1999-09-27
FI104261B1 (fi) 1999-12-15
PT81590B (pt) 1987-10-20
MD940371A (en) 1996-06-28
NO863050D0 (no) 1986-07-28
ES549539A0 (es) 1987-10-16
WO1986003520A1 (en) 1986-06-19
JPH0655144B2 (ja) 1994-07-27
EP0205564B1 (en) 1991-05-02
DK368786D0 (da) 1986-08-01
ES8800049A1 (es) 1987-10-16
NO304469B1 (no) 1998-12-21
CZ127496A3 (cs) 2000-02-16
AU5313486A (en) 1986-07-01
JPH01257480A (ja) 1989-10-13
JPH07184681A (ja) 1995-07-25
PL157926B1 (pl) 1992-07-31
DE411678T1 (de) 1991-10-17
PT81590A (en) 1986-01-01
HU216079B (hu) 1999-04-28
FI863044A (fi) 1986-07-24
KR870700099A (ko) 1987-02-28
DK172953B1 (da) 1999-10-18
NO863050L (no) 1986-07-28
LV10505A (lv) 1995-02-20
EP0205564B2 (en) 2000-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ286557B6 (cs) Způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu
TW203100B (cs)
JP2957974B2 (ja) エリスロポエチン活性を有するタンパク質の製造方法
RU2129613C1 (ru) Способ получения эритропоэтина человека
LT3944B (en) Method for the production of erythropoietin
AU5711199A (en) Method for the production of erythropoietin
KR930005917B1 (ko) 에리트로포이에틴의 제조방법
AU604051B2 (en) Recombinant human erythropoietin
DD251788A5 (de) Verfahren zur Herstellung eines menschlichen cDNA-Klons
DD279687A5 (de) Verfahren zur herstellung von erythropoietin

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20051203