LV10505B - Method for the production of erytropoietin - Google Patents

Description

LV 10505

Clonierte menschliche Erythropoietin-Gene und deren Produkte

Die vorliegende Erfindung betrifft klonierte Gene des menschlichen Erythropoietins, die iiberraschenderweise hohe Expressionsraten liefern, die Expression der genannten Gene und die in-vitro Produktion des menschlichen Erythropoietins.

Erythropoietin (im folgenden als EPO abgekiirzt) ist ein zirkulierendes Glycoprotein, das die Erythrozytenbildung in hdheren Organismen stimuliert (vgl. Carnot et al., Compt. Rend. 143, 384 (1906)). Deshalb wird EPO manchmal auch als Elektropoese-stimulierender-Faktor bezeichnet.

Die Lebenszeit von menschlichen Erythrozyten betrāgt ungefahr 120 Tage. Dies bedeutet, da8 ungefahr 1/120 der gesamten Erythrozyten tāglich im retikuloendothelialen System zerstort werden. Gleichzeitig wird eine relativ konstante Anzahl von Erythrozyten tāglich produziert, um die Konzentration von Erythrozyten konstant zu halten (Guyton, Textbook of Medical Physiology, S. 56-60, W.B. Saunders Co., Philadelphia (1976)).

Erythrozyten werden bei der Reifung und Differenzierung der Erythroblasten im Knochenmark gebildet. EPO ist ein Faktor, der auf weniger differenzierte Zellen wirkt und deren Differenzierung zu Erythrozyten induziert ( Guytfn^ s.o.J. EFC ist ein vielversprechendes therapeutisches Mittel fur die klinische Behandlung von Anāmie oder im speziellen von renale,. Anāmie. Der Gebrauch von EPO ist leider in der praktischen Therapie aufgrund seiner geringen Verfugbarkeit noch nicht gelSufig. 2

Um EPO als therapeutisches Mittel anwenden zu konnen, sollte Rūcksicht auf die mdgliche Antigenwirkung genommen werden, und deshalb sollte EPO vorzugsweise aus Rohmaterial menschlichen Ursprungs hergestellt werden. Beispielsweise konnen menschliches Blut oder Urin von Patienten vervendet werden, die an aplastischer Anāmie oder āhnlichen Krankheiten leiden und hohe Mengen an EPO ausscheiden. Diese Rohmaterialien jedoch sind nur in begrenzter Menge verfugbar (vgl. beispielsweise White et al., Rec. Progr. Horm. Res. 1J>, 219 (1960); Espada et al., Biochem. Med. 3_, 475 (1970); Fisher, Pharraacol. Rev. 24, 459 (1972) und Gordon, Vitam. Horm. (Ν.Υ.) 31, 105 (1973)).

Die Herstellung von EPO-Produkten erfolgte im allgemeinen durch Konzentrierung und Reinigung von Urin von Patienten mit hohem EPO-Spiegel, die beispielsweise an aplastischer Anāmie oder āhnlichen Krankheiten leiden (vgl. U.S. Patent 4,397,840, 4,303,650 und 3,865,801). Die begrenzte VerfOgbarkeit von solchem Urin ist ein Hinderniss fūr die praktische Verwendung von EPO. Deshalb ist es sehr wilnschenswert, EPO-Produkte aus dem Urin von gesunden Menschen herzustellen. Das Problem bei der Vervendung von Urin von gesunden Menschen liegt in dem geringen Gehalt von EPO im Vergleich zu dem von anāmischen Patienten. Zusātzlich enthālt der Urin von gesunden Menschen gewisse Inhibierungsfaktoren, die in ausreichend hohen Konzentrationen gegen Elektropoese virken, so dafi ein befriedigender therapeutischer Effekt nur nach grUndlicher Reinigung des EPO erhalten werden kann. EPO kann ebenfalls aus dem Blutplasma von Schafen erhalten werden. Die Trennung von EPO aus dem Blutplasma ergibt ausreichend starke und stabile wasserlbsliche Prāparationen (vgl. Goldvasser, Control Cellular Dif. Develop., Part A, S. 487-494, Alan R. Liss, Inc., Ν.Υ. (1981)). EPO von Schafen jedoch kbnnte im Menschen eine Antigen-Wirkung besitzen. - 3 - LV 10505

Obvohl EPO ein wdnschenswertes therapeutisches Mittel darstellt, sind die bisherigen Isolierungs- und Reinigungstechniken aus natūrlichen Quellen fūr eine Massenproduktion dieser Verbindung nicht angemessen. Sugimoto et al. beschreiben im US-Patent 4,377,513 eine Methode fiir die Massenproduktion von EPO, die die in-vivo Vermehrung von menschlichen lymphoblastischen Zellen, wie Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 und JBL umfafit.

Die Produktion von EPO Uber andere gentechnologische Methoden ist in der Literatur beschrieben. Jedoch ist weder eine vollstāndige EnthUllung noch die chemische Natur des Produktes bisher verdffentlicht. Die vorliegende Anmeldung liefert die vollstāndige EnthOllung fOr die Massenproduktion von Proteinen und zeigt die biologischen Eigenschaften der Proteine und des menschlichen EPO auf. Durch solche Techniken ist es ebenso mdglich, Proteine zu produzieren, die sich chemisch vom authentischen menschlichen EPO unterscheiden, jedoch āhnliche (und in manchen Fāllen bessere) Eigenschaften aufweisen. Solche Proteine, die biologische Eigenschaften von menschlichem EPO aufweisen, sollen im folgenden als EPO bezeichnet werden, unabhāngig davon, ob sie chemisch mit EPO identisch sind oder nicht.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Klonierung eines Gēns, das eine ilberraschend hohe Menge von menschlichem EPO exprimiert, dessen Expression und die in-vitro Massenproduktion von aktivem, menschlichem EPO . Die geeigneten Expressionsvektoren fUr die Produktion von EPO, Expressionszellen, Reinigungsschemata und damit verwandte Prozesse werden ebenso beschrieben. - 4 .

Wie im folgenden nāher beschrieben wird, wurde EPO in teilweise gereinigter Form erhalten, vollstandig gereinigt und mit Trypsin verdaut, um spezifische Fragmente zu erzeugen. Diese Fragmente wurden gereinigt und sequg]ļ£iert. Aus diesen Sequenzen wurden EPO-Oligonucleotide zugeordnet und synthetisiert. Diese 01 igonucleotide wurden zum Screening einer menschlichen Genkartei benutzt, aus der ein EPO-Gen isoliert wurde.

Die Richtigkeit des EPO-Gens wurde aufgrund seiner DNA-Sequenz, die mit vielen sequenzierten tryptischen Protein-Fragmenten Obereinstimmte, festgestellt. Ein Teil des genomischen Klons wurde dann verwendet, um durch Hybridisierung zu zeigen, daS EPO in menschlicher fOtaler, 20 Wochen alter mRNA nachgewiesen werden konnte. Eine cDNA-Bibliothek der menschlichen fdtalen Leber wurde aufgestellt und im Screening-Verfahren getestet. Drei EPO-cDNA-Klone wurde erhalten (nach dem Screening von 750 000 Rekombinanten). Zwei dieser Klone besaSen die volle Lānge, wie aus der kompletten Codierungssequenz und der im vesentlichen unūbersetzten Sequenz des 3'- und 5*-Endes gefolgert wurde. Diese cDNA wurde sowohl in SV-40 virustransformierten Affenzellen (COS-l-Zellinie; Gluzman, Celi 23, 175-182 (1981 )) und in Ovarien des Chinahamsters (CHO-Zellinie; Urlaub G. und Chasin L.A., Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 7J_y 4216-4280 (1980)) exprimiert. Das von COS-Zellen produzierte EPO ist in-vitro und in-vivo biologisch aktives EPO. Das von CHO-Zellen produzierte EPO ist in-vitro biologisch aktiv und wurde in-vivo nicht getestet.

Der EPO-cDNA-Klon hat einen interessanten offenen Ableserahmen von 14-15 Aminosāuren (aa) mit Initiator und Terminator von 20-30 Nucleotiden (nt) oberhalb der Codierungsregion. Eine reprāsentative mit dem klonierten EPO-Gen transfektierte Probe von E. coli wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt, und ist unter der Zuordnungsnummer ATCC 40153 erhSltlich. - 5 - LV 10505

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1 stellt die Basissequenz eines Exons von 87 Basenpaaren des menschlichen EPO-Gens dar.

Abbildung 2 zeigt den Nachweis des EPO-mRNA in der menschlichen fbtalen Leber-mRNA.

Abbildung 3a zeigt die Aminosāuresequenz eines EPO-Proteins, die von der Nucleotidsequenz von Lambda-HEP0FL13 abgeleitet wurde.

Abbildung 3b zeigt die Nucleotidsequenz der EPO-cDNA in Lambda-HEP0FL13 und die davon abgeleitet Aminosāuresequenz.

Abbildung 4a zeigt die relativen Positionen von DNA-EinschOben von vier unabhSngigen menschlichen EPO-Genomklonen.

Abbildung 4b zeigt eine Karte der aparenten Intron- und Exonstrukturen des menschlichen EPO-Gens.

Abbildung 4c zeigt eine DNA-Sequenz des EPO-Gens, das in Abbildung 4b dargestellt ist.

Abbildungen 5a, 5b und 5c zeigen die Konstruktion des Vektors 91023(8).

Abbildung 6 zeigt die SDS-Polyacrylamidgel-Analyse des in COS-1-Zellen produzierten EPO im Vergleich zum nativen EPO.

Abbildung 7 zeigt die Nucleotid- und Aminosāuresequenz des EPO-Klons, Lambda-HEP0FL6. 6

Abbildung 8 zeigt die Nucleotid- und Aminosauresequenz des EPO-Klons Lambda-HEP0FL8.

Abbildung 9 zeigt die Nucleotid- und Aminos3uresequenz des EPO-Klons Lambda-HEP0FL13.

Abbildung 10 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmides pRKL-4 .

Abbildung 11 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmides pdBPV-MMTneo(342-12).

Nahere Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Klonierung von EPO-Genen und die Produktion von EPO durch die in-vitro Expression dieser Gene.

Die Patentiiteratur und die vissenschaftliche Literatur sind ilberfilllt mit Prozessen, die fūr die Produktion von rekombinaten Produkten anwendbar sind. Diese Techniken enthalten im allgemeinen die Isolierung oder Synthese der gevrtlnschten Gensequenz und die Expression dieser Sequenz in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, indēm die vom Fachmann Ublichen Techniken angewendet werden. Sobald ein bestimmtes Gen isoliert, gereinigt und in einen Transfer-Vektor inseriert (d.h. kloniert) wurde, ist seine VerfUgbarkeit in grOSeren Mengen sichergestellt. Der Vektor wird mit seinem klonierten Gen in einen passenden Mikroorganismus oder eine Zellinie transferiert, z.B. in Bakterien, Hefe, Sdugerzellen, wie z.B. COS-1 (Affenniere), CHO (Ovarium des Chinahamsters), Zellinien von Insekten, und dergleichen, in denen der Vektor repliziert wird, sobald der Mikroorganismus oder die Zellinie - 7 - LV 10505 sich vermehrt, und von denen der Vektor durch konventionelle Methoden isoliert werden kann. Auf diese Weise wird eine kontinuierlich erneuerbare Quelle des Gēns geliefert und damit weitere Manipulationen, Modifikationen und der Transfer zu anderen Vektoren oder anderen Orten innerhalb des gleichen Vektors ermOglicht. Die Expression kann oft erreicht werden durch Transfer des klonierten Gēns (in korrekter Richtung und Ableserahmen) in die entsprechende Stelle eines Transfervektors, so dafi die Ubersetzung von einem prokaryontischen oder eukaryontischen Gen zu der Synthese eines Protein-Precursors ftihrt. Damit ist die Aminosāuresequenz mitumfafit, die vom klonierten Gen kodiert wird, das an Methionin oder an einer aminoterminalen Sequenz des prokaryontischen oder eukaryontischen Gēns angeknUpft ist. In anderen Failen kbnnen die Signale fttr die Initiierung der Transkription und Translation durch ein entsprechendes Genomfragment des klonierten Gēns geliefert werden. Eine Vielzahl von spezifischen Proteinspaltungstechniken kann angewendet werden, um den Protein-Precursor an einem gewilnschten Punkt zu spalten, um so die gewiinschte Aminosāuresequenz abzuspalten, die dann durch konventionelle Methoden gereinigt werden kann. In einigen Fāllen wird das Protein, das die gewi)nschte Aminosāuresequenz enthālt, ohne die Notwendigkeit spezifischer Spaltungstechniken produziert und kann somit auch von Zellen in das extrazellulāre Nāhrraedium abgegeben werden.

Isolierung eines Genklons des menschlichen EPO

Menschliches EPO wurde aus Urin von Patienten mit aplastischer Anamie in hochreiner Form isoliert, wie im folgenden beschrieben wird. Dieses gereinigte EPO wurde durch Trypsin vollstāndig verdaut. Dabei wurden Fragmente erhalten, die durch reversed-phase-HPLC getrennt wurden. Aus den 8

Gradient-Fraktionen wurden die einzelnen Fragmente gewonnen und der Mikroanalyse unterworfen. Die Sequenzen der tryptischen Fragmente sind in Abbildung 3 unterstrichen und werden im folgenden nāher diskutiert. Zwei der AminosSuresequenzen, Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys und Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg wurden filr die Konstruktion von Oligonucleotidproben ausgevShlt (dies ergibt einen 17 Nucleotide langen und 32fach entarteten Pool von 01igonucleotiden bzw. einen 18 Nucleotide langen und 128fach entarteten Pool von Oligonucleotiden, aus den frUheren tryptischen Fragmenten, sowie zwei 14 Nucleotide lange, jeweils 48fach entarteten Pools aus den letzteren tryptischen Fragmenten). Der 32fach entartete 17-mer-Pool wurde verwendet £(ir das Screening einer menschlichen Genom-DNA-Bibliothek in einem Ch4A-Vektor (22), indēm fūr die Herstellung der Filter fUr das Screening eine Modifizierung des

Woo-und-0'Malley-in-situ-Verstārkungsverfahrens (47) angevendet wurde.

Die im Text verwendeten arabischen Nummern (1)-(61) beziehen sich auf die Publikaiionen, die am Ende dieser Anmeldung in numerischer Reihenfolge aufgelistet sind.

Die Phagen, welche mit den 17-mer Nucleotiden hybridisieren, wurden gesammelt, in kleine Gruppen zusammengegeben und mit den 14-mer und 18-mer Pools ilberprtlft. Die Phagen, welche mit den 17-mer-, 18-mer- und 14-mer-Pools hybridisieren, wurden mittels der Plaque-Technik gereinigt und Fragmente wurden in M13-Vektoren subkloniert ftlr die Sequenzierung mittels der Dideoxy-Kettenterminierungs-Methode von Sanger und Coulson (23) (1977). Die Sequenz der Region, die mit dem 32fach entarteten 17-mer-Nucleotid in einem der Klone hybridisiert, ist in Abbildung 1 dargestellt. Diese DNA-Sequenz enthait innerhalb eines offenen Ableserahmens die Nucleotide, die genau das tryptische Fragment - 9 - LV 10505 codieren konnten, das fūr die Ableitung des 17-mer-Pools der Oligonucleotide verwendet wurde. Weiterhin zeigte die Analyse der DNA-Sequenz, daB die 17-mer-Hybridisierungsregion innerhalb eines 87 bp-Exons enthalten war, das durch potentielle SpleiBakzeptoren und Donorstellen eingegrenzt war. Die positive Bestātigung, dafi diese beiden Klone (im folgenden als Lambda-HEPOl und Lambda-HEP02 bezeichnet) EPO-Genomklone sind, wurde durch Sequenzierung zusfltzlicher Exons erhalten, die weitere Code-Informationen beinhalten, die liber tryptische Fragnentierung gewonnen wurden.

Isolierung von EPO-cDNA-Klonen

Die N'orthern-Analyse (56) menschlicher fbtaler (20 Wochen alter) Leber-mRNA wurde durchgefūhrt, indēm eine 95 nucleotid-lange einstrāngige Probe verwendet wurde, die aus eineii M13-Klon hergestellt wurde, der ein Teil des in Abbildung 1 beschriebenen 87 bp-Exons enthālt. Wie in Abbildung 2 gezeigt ist, konnte ein starkes Signal in fetaler Leber-mRNA entdeckt werden. Die genaue Identifizierung dieser Bande als EPO-mRNA gelang, indēm die gleiche Probe fūr das Screening der Bakteriophagen-Lambda-cDNA-Bibliothek der fbtalen Leber-mRNA vervendet wurde (25). Mehrere Hybridisierungsklone wurden mit einer Hāufigkeit von ungefahr 1 pro 250 000 Rekombinanten erhalten. Die kompletten Nucleotid- und davon abgeleitete AminosMuresequenzen fūr diese Klone (Lambda-HEP0FL13 und Lambda-HEPOFL8) sind in den Abbildungen 7 und 8 dargestellt.

Die EPO-codierende Information ist innerhalb 594 Nucleotiden in der 5'-Hālfte der cDNA enthalten, die ein sehr hydrophobes, 27 Aminosāuren-langes Anfangsstilck und das fertige Protein mit einer L3nge von 166 Aminosāuren beinhalten. 10

Die Zuordnung des N-Terminus des fertigen Proteīns beruht auf der N-terminalen Sequenz des Proteīns, das im Urin von Personen mīt aplastischer Anāmie ausgeschieden wird (vgl. Abbildung 1; Goldwasser (26), Sue and Sytkowski (27) und Yanagawa(21)). Ob dieser N-Terminus (Ala-Pro-Pro-Arg---) den aktuellen N-Terminus des zirkulierenden EPO darstellt, oder ob Spaltungen in der Leber oder im Urin stattfinden, ist zur Zeit unbekannt.

Die Aminos3uresequenzen, die in Abbildung 3 unterstrichen sind, weisen auf diejenigen tryptischen Fragmente oder Teile des N-Terminus hin, filr die die Proteinsequenz erhalten wurde. Die abgeleitete Aminosāuresequenz stimmt exakt mit den tryptischen Fragmenten Oberein, die sequenziert vurden, womit bestātigt wird, daB die isolierten Gene menschliches EPO codieren.

Struktur und Seguenz von menschlichen EPO-Genen

Die Abbildung 4a zeigt die relativen Positionen von DNA-Einschtiben von 4 unabh&ngigen menschlichen EPO-Genomklonen. Hybridisierungsanalysen von diesen klonierten DNA's mit Oligonucleotidproben und mit verschiedenen Proben, die von zwei verschiedenen Klassen der EPO-cDNA-Klonen hergestellt wurden, belegen die Position des EPO-Gens schātzungsweise innerhalb der 3,3 kb-Region, wie in Abbildung 4a durch die dunklen Linien gezeigt wird. Vollstāndige Sequenzanalysen von dieser Region (vgl. Beispiel 4) und Vergleich mit den cDNA-Klonen ergeben die Karte der Intron- und Exonstrukturen der EPO-Gene (vgl. Abbildung 4b). Das EPO-Gen ist in ftlnf Exons unterteilt. Ein Teil von Εχοη I, die gesamten Exons II, III und IV und ein Teil von Εχοη V enthalten die Proteincodierungsinformation. Der Rest von Εχοη I und V codiert die 5'- und 3'- unubersetzten Sequenzen. - 11 - LV 10505

Vorilbergehende Expression von EPO in COS-Zellen

Um zu zeigen, daB biologisch aktives EPO in einem in-vitro Zellkultursystem exprimiert werden kann, vurden COS-Zellexpressionsstudien durchgefUhrt (58). Der Vektor p91023(B), der fur die voriibergehenden Studien verwendet wurde, ist in Beispiel 5 beschrieben. Dieser Vektor enthait den Adenovirus-major-late-Promotor, eine SV40-Polyadenylierungs-Sequenz, einen SV40-Ursprung der Replikation, einen SV40-Enhancer und das Adenovirus-VA-Gen. Der cDNA-Einschub Lambda-HEP0FL13 (vgl. Abbildung 8) wurde in einen p91023(B)-Vektor inseriert, unterhalb des

Adenovirus-major-late-Promotors. Dieser neue Vektor wird als pPTFL13 identifiziert. 24 Stunden nach der Transfektion dieser Konstruktion in den M6-Stamm von COS-1-Zellen (Horowitz et al., J. Mol. Appl.

Genet. 1_, 147-149 (1983)) vurden die Zellen gewaschen und das Medium gegen serumfreies Medium ausgetauscht. Die Zellen werden 48 Stunden spāter geerntet. Der Grad der Abgabe von EPO in den Kulturilberstand wurde dann mit Hilfe eines quantitativen Radioiraunoassays fUr EPO (55) untersucht. Wie Tabelle 1 (Beispiel 6) zeigt, wurde immuhologisch reaktives EPO expriraiert. Die biologische Aktivitāt des EPO, das von COS-1-Zellen erzeugt wurde, wurde ebenfalls untersucht. In eiiiem getrennten Experiment wurde der Vektor,. der EPO-cDNA von Lambda-HEPOFL13 enthait, in COS-1-Zellen transfektiert und die Medien, wie oben beschrieben, geerntet. EPO wurde dann im Medium quantitativ durch einen von zwei in-vitro biologischen Assays bestimmt, ^H-Trymidin und CFU-E (12,29), und durch einen der beiden in-vivo Assays (bei hypoxischen Mausen und bei hungernden Ratten (30,31)) (vgl. Tabelle 2, Beispiel 7). 12

Diese Ergebnisse zeigen, daB biologisch aktives EPO in COS-1-Zellen produziert wird. In Western-Blots konnte mit Hilfe eines polyklonalen Anti-EPO-AntikOrpers gezeigt werden, daB EPO, das von COS-Zellen produziert wird, eine Mobilitāt auf SDS-Polyacrylamidgelen besitzt, die identisch mit derjenigen des nativen EPO ist, das aus menschlichem Urin hergestellt wurde (Beispiel 8). Daher kann geschlossen werden, daB das AusmaB der Glycosi1ierung von COS-1 produziertem EPO āhnlich der des nativen EPO ist.

Unterschiedliche Vektoren, die andere Promotoren enthalten, kdnnen ebenso in COS-Zellen oder in anderen Sāugerzellen oder eukaryontischen Zellen verwendet werden. Beispiele von solchen anderen Promotoren im Sinne der vorliegenden Erfindung beinhalten SV40-Frūh- und Spātpromotoren, den Mause-Metallothionein-Gen-Promotor, den Promotor, der in Retroviren von Vbgeln oder Sāugern gefunden wird, der Bacculovirus-Polyeder-Gen-Promotor und andere. Beispiele von anderen Zelltypen im Sinne der vorliegenen Erfindung beinhalten E. coli, Hefe, SSugerzellen, wie z.B. CHO (Ovarium des Chinahamsters), C127 (Affenepithelium), 3T3 (MSusefibroblasten), CV-1 (african green monkey kidney) und Insektenzellen, wie z.B. diejenigen von Spodoptera frugiperda und Drosophila metanogaster. Diese wechselnden Promotoren und/oder Zelltypen kbnnen die Regulation hinsichtlich der Zeit oder des Grades der EPO-Expression bewirken, indēm Sie einen zellspezifischen Typ von EPO produzieren oder das Wachstum von groBen Mengen von EPO-produzierenden Zellen unter veniger teuren, aber leichter kontrollierbaren Bedingungen ermbglichen. - 13 - l_V 10505

Ein Expressionssystem, das die Vorzilge einer Expression bei Saugern besitzt, aber weniger Zeit bendtigt, um eine hochgradige Expressionszellinie zu produzieren, setzt sich zusammen aus einer Insektenzellinie und einem DNA-Virus, der sich in dieser Zellinie vermehrt. Der Virus ist ein Nuclear-polyhedrosis-Virus. Er besitzt ein doppelstrangiges zirkuiares DNA-Genom von 128 kb. Das Nucleokapsid ist stabchenfdrmig und liegt in zwei Formen vor, der nichtokkludierten Form ira membrangebundenen Virus und in einer okkludierten Form, die im infizierten Zellkern von einem Proteinkristall eingehOllt wird. Diese Viren kdnnen Ublicherveise in in-vitro Insektenzellkulturen fortgepflanzt werden und sind durch aile routinemMfiigen tierisch-virologischen Methoden abanderbar. Das Zellkulturmedium ist tiblicherweise eine Nāhrsalzldsung von 10-ligem fdtalem Kaiberserum.

Das Viruswachstum wird in-vitro iniziiert, wenn ein nichtokkludierter Virus (NOV) in eine Zelle eindringt und sich zum Kern hinbewegt, in dem er sich fortpflanzt. Die Replikation findet im Kern statt. W3hrend der Anfangsphase (8-18 Stunden nach der Infektion) verden Nucleokapside im Zellkern angesammelt und keimen daraufhin als NOV durch die Plasmamembran und verbreiten somit die Infektion durch die Zellkultur. Einige der Nucleokapside verbleiben daraufhin zusatzlich (mehr als 18 Stunden nach der Infektion) im Zellkern und werden in einer Proteinmatrix okkludiert (bekannt als polyhedrale Inclusions-Kdrper, (PIB)). Diese Form wirkt nicht infektids in der Zellkultur. Die Matrix setzt sich zusammen aus einem Protein, das als Polyhedrin bekannt ist (Molmasse 33 kd). Jeder PIB besitzt einen ungefahren Durchmesser von 1 mm und es kdnnen mehrere hundert PIB pro Nucleus vorkommen. Es wird sicherlich eine grofie Menge von Polyhedrin erst spat im Infektionszyklus produziert (ungefahr 25 % der gesamten zelluiaren Proteinmenge). 14

Da die PIB keinē Rolle in den in-vitro Repiikationszyklen spielen, kann das Polyhedrin-Gen ohne nachhaltigen Effeķt auf die in-vitro Lebensfahigkeit vom Viruschromosom gelCscht werden. Durch Verwendung des Vīrus als Expressionsvektor haben wir die codierende Region fūr das Polyhedrin-Gen mit der freraden zu exprimierenden DNA ersetzt, indēm wir es unter die Kontrolle des Polyhedrin-Promotors stellten. Dies ergibt einen nicht-PIB-bildenden Vi rus-Phānotyp.

Dieses System wurde von vielen Forschern verwendet, insbesondere von Pennock et al. und Smith et al.. Pennock et al. (Gregory D. Pennock, Charles Shoemaker und Lois K. Miller, Mol. Celi. Biol. 3, 399-406 (1984)) berichteten Uber den hohen Exressionsgrad eines bakteriellen Proteins, β-Galactosidase, wenn es unter die Kontrolle des Polyhedrin-Promotors gestellt wird.

Ein anderer nuclearer vom Polyhedrosisvirus abgeleiteter Expressionsvektor wurde von Smith et al. vorgestellt (Galē E. Smith, Mas. D. Summers und M.J. Fraser, Mol. Celi. Biol., 16. Mai, 2156-2165 (1983)). Die Autoren demonstrierten die Effektivitāt ihres Vektors durch die Expression von menschlichem β-Interferon. Das synthetisierte Produkt wurde als glycosilierte Form gefunden und wie erwartet von Insektenzellen sekretiert. In Beispiel 14 werden Modifizierungen des Plasmides beschrieben, welches das Polyhedron-Gen des Autographa-californica-nucleare-polyhedrosis-Virus (AcNPV) enthālt, das eine einfache Insertion des EPO-Gens in das Plasmid erlaubt, so dafi es unter der Transkriptionskontrolle des Polyhedron-Promotors steht. Die resultierende DNA wird in Insektenzellen co-transfektiert mit intakter chromosomaler DNA des Wildtyps AcNPV. Ein genetischer Rekombinationsversuch ergibt die Ersetzung der AcNPVC-Polyhedrin-Gen-Region durch die DNA des Plasmides. Der resultierende rekombinate Virus kann aus - 15 - LV 10505 der viralen Nachkommenschaft durch das Vorhandensein der DNA-Sequenzen des EPO-Gens identifiziert werden. Dieser rekombinante Virus sollte erwartungsgemafi nach Reinfektion von Insektenzellen EPO produzieren.

Beispiele der EPO-Expression in CHO, C127 und 3T3 und Insektenzellen sind in den Beispielen 10 und 11 (CHO), 13 (C127 und 3T3) und 14 (Insektenzellen) gegeben.

Das biologisch aktive EPO, das durch prokaryontische oder eukaryontische Expression der klonierten EPO-Gene der vorliegenden Erfindung produziert wurde, kann von Arzten und/oder Veterināren f(lr die in-vivo Behandlung von SSugern angewendet werden. Die Menge von aktiven Bestandteilen wird natūrlich von der Schwere des zu behandelnden Zustandes abhāngen, vom Weg der gewāhlten Verabreichung, von der spezifischen Aktivitāt des aktiven EPO und wird letztendlich vom behandelnden Arzt oder Veterinarmediziner entschieden werden. Diejenige Menge von aktivem EPO, die vom behandelnden Arzt festgelegt wird, wird im folgenden als "EPO-behandlungseffektive Menge” bezeichnet. Beispielsweise wurde ftlr die Behandlung von induzierter hypoproliferativer Anāmie, die bei Schafen von einer chronischen renalen Schwāche begleitet wird, Ober den Zeitraum von 15-40 Tagen eine tāgliche effektive Menge von EPO von 10 U/kg gefunden (vgl. Eschbach et al, J. Clin. Invest, 74^ 434 (1984)). Das aktive EPO kann auf jedem, vom zu behandelnden Zustand abhāngigen Weg verabreicht werden. Vorzugsweise wird das EPO in die Blutbahn des zu behandelnden SSugetieres injiziert. Es kann leicht durch den Fachman abgeschātzt verden, dafi der bevorzugte Verabreichungsweg je nach Art des zu behandelnden Zustandes variieren kann. 0bwohl es mOglich ist, das aktive EPO in reiner Form oder als nahezu reine Verbindung zu verabreichen, wird es vorzugsweise als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht. 16

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Verbindungen, sowohl fūr die Anwendung im Verterinār- als auch im Humanbereich, umfassen das aktive EPO-Protein, wie oben beschrieben, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutischen vertrāglichen Trāgerstoffen und gegebenenfalls anderen therapeutischen Beimischungen. Die Trāgerstoffe mUssen vertrāglich sein mit anderen Inhaltsstoffen der Zusammensetzung und fiir den Patienten nicht schādlich. Die Zusammensetzung sollte keine Oxidationsmittel und andere Substanzen enthalten, von denen bekannt ist, dafi sie mit Peptiden unvertrāglich sind. Die Zusammensetzungen kOnnen zweckmāBigerweise in einheitlichen Dosierungsformen abgepackt werden und kOnnen durch viele in der Pharmazie bekannten Methoden hergestellt werden. Aile Methoden beinhalten den Schritt des Mischens von aktivem Inhaltsstoff mit dem Trāgermaterial, das sich aus einem oder mehreren Hilfsstoffen zusammensetzt. Im allgemeinen vrerden die Zusammensetzungen durch einheitliches und intensives Mischen von aktivem Inhaltsstoff mit fliissigen Trāgern oder feinverteilten festen Trāgerstoffen oder beidem hergestellt und dann, fails notwendig, wird das Produkt in die gevOnschte Form der Zusammensetzung ilberfilhrt.

Die Zusammensetzungen fūr parenterale Verabreichungen umfassen zweckmā6igerweise sterile wāssrige LOsungen des aktiven Inhaltsstoffes und LOsungen, die vorzugsweise isotonisch mit dem Blut des cmpfāngers sind. Solche Zusammensetzungen kOnnen zweckmāBigerweise hergestellt werden durch LOsen des festen aktiven Inhaltsstoffes in Wasser, um eine vāssrige LOsung zu erzeugen, und unter sterilen Bedingungen kann diese LOsung in einheitlichen oder mehrfach dosierbaren Darreichungsformen, z.B. in versiegelten Ampullen oder Gefāfien, abgepackt werden. - 17 - LV 10505

Die hier verwendete EPO-cDNA beinhaltet das reife EPO-cDNA-Gen, dem ein ATG-Codon vorausgeht, und EPO-cDNA, die fūr allelomorphische Variationen des EPO-Proteins codiert. Eine allelomorphische Variation ist in den Abbildungen 3a und 3b dargestellt. Das EPO-Protein enthālt das 1-Methionin-Derivat des EPO-Proteins (Met-EPO) und allelomorphische Variationen des EPO-Proteins. Das reife EPO-Protein, das durch die Sequenz in Abbildung 3a dargestellt ist, beginnt mit der Sequenz Ala-Pro-Pro-Arg ..., deren Anfang durch die Zahl "1" in Abbildung 3 gekennzeichnet wird. Das Met-EPO w(irde mit der Sequenz Met-Ala-Pro-Pro-Arg ... beginnen. • ·

Die folgenden Beispiele sollen zum besseren Verstāndnis der vorliegenden Erfindung dienen, deren wahre Reichweite in den anliegenden Patentansprtlchen dargelegt wird. Ebenso sind Abānderungen der dargelegten Verfahren mčglich, die von der vorliegende Erfindung mitumfafit werden. Aile Temperaturen werden in °C angegeben und sind unkorrigiert. Das Symbol fOr Micron oder Micro, z.B. Microliter, Micromol usw., ist "u", z.B. ul, um usw 18

Beispiele

Beispiel 1: Isolierung eines Genom-Klons von EPO EPO aus dem Urin von Patienten mit aplastischer Anāmie wurde im vesentlichen nach der von Miyake et al., J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977) entwickelten Methode gereinigt, mit der Ausnahme, daB die Phenolbehandlung nicht durchgefUhrt wurde und durch eine Hitzebehandlung bei 80°C (fūnf Minuten) ersetzt wurde, um die Neuraminidase zu inaktivieren. Der letzte Schritt der Reinigung erfolgte durch Fraktionierung auf einer C-4 Vydac HPLC-Saule (The Separatious Group), indēm ein 0-95 liger Acetonnitril-Gradient mit 0,1 % Trifluoressigsaure (TFA) filr eine Dauer von 100 Minuten angelegt wurde. Die EPO-Fraktion wurde durch Gelelektrophorese und N-terminale Sequenzanalyse (21, 26, 27) der Hauptfraktionen bestimmt. Das EPO wurde bei etwa 53 I Acetonnitril eluiert und stellte ungefāhr 40 I des Proteins dar, das durch reversed-phase-HPLC getrennt wurde. Die EPO enthaltenden Fraktionen wurden zu 100 ul einrotiert, mit Ammoniumbicarbonat auf pH 7.0 eingestellt und mit 2 % TPCK-behandelten Trypsin (Worthington) 18 Stunden lang bei 37°C vollstāndig verdaut. Die tryptischen Verdauungsprodukte wurden dann einer reversed-phase-HPLC, wie oben beschrieben, unterworfen. Die optische Dichte bei 280 nm und 214 nm wurde gemessen. Gut sepa.rierte Peaks wurden bis fast zur vollstSndigen Trockne einrotiert und direkt der N-terminalen Aminosauresequenzanalyse (59) unterworfen (Applied Biosystems Modei 480A Gas phase sequenator). Die erhaltenen Sequenzen sind in Abbildung 3 unterstrichen. Wie zuvor beschrieben, wurden zwei dieser tryptischen Fragenmente fūr die Synthese von - 19 - LV 10505

Oligonucleotidproben ausgevahlt. Aus der Sequenz Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (Aminosāuren 46-52 in Abbildung 3) wurde 17mer mit 32facher Entartung

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TTCCANGCGTAGAAGTT und ein 18mer mit 128facher Entartung

A A A

CCANGCGTAGAAGTTNAC hergestellt. Aus der Sequenz Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (Aminosāuren 144-150 in Abbildung 3) wurden zwei Pools von 14mers, jevreils 32£ach entartet

TTGN T T TACACCTAACTTCCT

und TTGN T T

TACACCTAACTTCTT hergestellt, die sich in der ersten Position des Leucincodons 32 unterscheiden. Die Oligonucleotide wurden am 5'-Ende mit P durch Polynucleotid-Kinase (New England Biolabs) und 32P-ATP (New England Nuclear) markiert. Die spezifische Aktivitāt der Oligonucleotide variierte zwischen 1 000 und 3 000 Ci/mmol. Im Screening-Verfahren der menschlichen Genom-DNA-Bibliothek im Bakteriophagen-Lambda (Lawn et al., (22)) wurde eine Modifizierung der in-situ-Vermehrungsmethode vorgenommen, wie ursprūnglich von Woo et al. (47) (1978) beschrieben. Ungefahr 3,5 x 10^ Phagen wurden mit einer Dichte von 6 000 Phagen auf Petrischalen mit 150 mm Durchmesser (ΝΖΤΥΜ-Medium) platiert und bei 37°C inkubiert, bis Plaques von ca. 0,5 mm sichtbar wurden. Nach einstilndigem Abkilhlen auf 4°C wurden doppelte Replika der Plaques-Muster auf Nylonmembranen (New England Nuclear) tlbertragen und Ober Nacht bei 37°C auf frischen NZCYM-Platten inkubiert. Die Filter wurden dann denaturiert und durch 10-miniltiges Waschen mit 0.5 n NaOH/lm NaCl und 0.5 m Tris (pH 8)/1 m NaCl neutralisiert. Nach darauf folgendem Erhitzen im Vakuum bei 80°C filr zwei Stunden wurden die Filter gewaschen (5 x SSC, 0.5 I SDS; 1 h) und der ZellrOckstand auf 20 der Filteroberflāche durch vorsichtiges Ankratzen mit einem feuchten Tuch entfernt. Dieses Ankratzen reduziert das Anhaften der Probe auf den Filtern. Die Filter wurden dann mit Kasser gewaschen und filr eine Dauer von 4-8 Stunden bei 48°C in 3 m Tetramethylammonium-chlorid, 10 mM NaPO^ (pH 6.8), 5 x

Denhardt's, 0.5 % SDS und 10 mM EDTA prehybridisiert. Das 32 P-markierte 17mer wurde dann mit einer Konzentratīon von 0.1 pmol/ml zugegeben und die Hybridisierung wurde bei 48°C 72 Stunden lang durchgefUhrt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter intensiv mit 2 x SSC (0.3 m NaCl/0.03 m Na-Citrat, pH 7) bei Raumtemperatur gewaschen, dann filr eine Stunde in 3 m TMAC1/10 mM NaPO^ (pH 6.8) bei Raumtemperatur und anschlieBend filr eine Dauer von 5-15 Minuten bei der Hybridisierungstemperatur. Nach zweit3giger Autoradiographie mit einem verstārkenden Schirm wurden ungefMhr 120 starke Duplett-Signale aufgenommen. Die Positiven wurden herausgesucht, in Pools zu acht zusammengegeben, replatiert und ein Screening-Verfahren durchgefUhrt, indēm eine HSlfte des 14mer-Pools auf jedem der beiden Filter und die 17mer auf dem dritten Filter verwendet wurden. Die Bedingungen fUr das Auftragen auf die Platten und die Hybridisierung sind weiter oben beschrieben, allerdings wurde die Hybridisierung des 14mer bei 37°C durchgefUhrt. Nach der Autoradiographie wurde die Probe vom 17mer-Filter in 50 I Formamid OberfUhrt, und nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde der Filter bei 52eC mit der lSmer-Probe rehybridisiert. Zwei unabhSngige Phagen hybridisierten in allen drei Proben. Die DNA einer dieser Phagen (im folgenden als Lambda-HEPOl bezeichnet) wurde mit Sau3A vollstandig verdaut und in M13 filr die DNA-Sequenzanalyse subkloniert, indēm die Dideoxy-Kettenterminierungsmethode von Sanger und Coulson (23) (1977) vervendet wurde. Die Nucleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosāuresequenz des offenen Ableserahmens, der fUr das EPO tryptische Fragment (unterstrichene Region) - 21 - LV 10505 codiert, ist in dieser Anmeldung beschrieben. Die Intron-Sequenzen werden in Kleinbuchstaben angegeben, die Exon-Sequenzen (87 Nucleotide) werden in GroBbuchstaben angegeben. Ubereinstimmende Sequenzen zwischen SpleiB-Akzeptor-(a) und Donor-(d)-Stellen sind unterstrichen (vgl. Abbildung 4c).

Beispiel 2: ΜΝθΓΐϊΐ6ΓηΜ-Αη8ΐγ56 der menschlichen fbtalen-Leber-mRNA 5 ug der menschlichen fOtalen Leber-mRNA (aus einer 20 Wochen alten fdtalen Leber hergestellt) und eine Leber-mRNA eines Erwachsenen wurden in einem 0,8-ligen Agarose-Formaldehyd-Gel einer Elektrophorese unterworfen und mit Hilfe der Methode von Derman et al., Celi, 23, 731 (1981) auf Nitrocellulose transferiert. Eine einstrāngige Probe wurde dann aus dem M13-Templat hergestellt, das den in Abbildung 1 dargestellten Einschub enthait. Der Primer war ein 20-mer, der aus dem gleichen tryptischen Fragment wie die ursprUngliche 17mer-Probe abgeleitet wurde. Die Probe wurde, wie bereits von Anderson et al., PNAS, (50) (1984) beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, dafi nach der Verdauung mit Smaī (womit die gewūnschte Probe mit einer Lānge von 95 Nucleotiden hergestellt wurde, die 74 Nucleotide der Codierungssequenz enthālt), die kleinen Fragmente von M13-Templat durch Chromatographie an einer Sepharose-CI4B-S3ule mit 0.1 n NaOH/O.2 m NaCl gereinigt wurden. Der Filter wurde zu ungefahr 5 x 10® cpm dieser Probe 12 Stunden lang bei 68°C hybridisiert, zweimal mit SSC bei 68°C gewaschen und sechs Tage lang einem verstMrkenden Schirm ausgesetzt. Eine einzelne Marker-mRNA von 1200 Nucleotiden (durch einen Pfeil gekennzeichnet) wurde als Vergleich in der benachbarten Reihe (siehe Abbildung 2) mitlaufen gelassen. 22

Beispiel 3: Ffltale Leber-cDNA

Eine zu Beispiel 2 identische Probe wurde hergestellt und fUr das Screening einer fbtalen Leber-cDNA-Bibliothek benutzt, die durch das Standard-Plaques-Screening-Verfahren (Benton Dāvis, Science (54) (1978)) im Vektor Lambda-Ch21A (Toole et al., Nature, (25) (1984)) hergestellt wurde. Drei unabhāngige positive Klone (im folgenden als Lambda-HEP0FL6 (1350 bp), Lambda-HEPOFL8 (700 bp) und Lambda-HEP0FL13 (1400 bp)) vurden isoliert und anschlieSend erfolgte ein Screening der 1 x 10^ Flecken. Der gesamte Einschub von Lambda-HEP0FL13 und Lambda-HEPOFL6 wurde sequenziert und anschliefiend in M13 subkloniert (vgl. Abbildung 9 bzw. 7). Von Lambda-HEPOFL8 wurden nur Teile sequenziert und der Rest als identisch zu den anderen beiden Klonen angenommen (vgl. Abbildung 8). Die 5’-und 3 ’-unilbersetzten Sequenzen werden durch Kleinbuchstaben gekennzeichnet. Die Codierungsregion wird durch Grofibuchstaben dargestellt.

Beztiglich der Abbildungen 3a und 3b wird die abgeleitete Aminosauresequenz, die unterhalb der Nucleotidsequenz abgebildet ist, beginnend mit Nummer 1 fūr die erste Aminosāure des fertigen Proteīns durchnumeriert. Das mutmaeiiche Voriauferpeptid wird ebenso angegeben. Cystein-Reste im fertigen Protein werden zusatzlich durch die Bezeichnung SH und mdgliche N-Glycosilierungsstellen durch einen Stern angegeben. Die unterstrichenen AminosSuren veisen auf solche Reste hin, die durch N-terminale Proteinsequenzierung oder durch Sequenzierung der tryptischen Fragmente von EPO, wie in Beispiel 1 beschrieben, identifiziert wurden. Teilweise durchgezogene Linien weisen auf Reste in der - 23 - LV 10505

Aminosāuresequenz von gewissen tryptischen Fragmenten hin, die nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Die cDNA-Klone Lambda-HEP0FL6, Lambda-HEP0FL8 und Lambda-HEP0FL13 wurden hinterlegt und sind von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter den Zuordnungsnummern ATCC 40156, ATCC 40152 und ATCC 40153 erhaitich.

Beispiel 4: Genom-Strukturen der EPO-Gene

Die relativen GrdBen und Positionen der vier unabhāngigen Genom-Klonen (Lambda-HEPOl, 2, 3, und 6) von der HaelII/Alul-Bibliothek sind durch die Uberlappenden Linien in Abbildung 4a dargestellt. Die stārker durchgezogene Linie weist auf die Position des EPO-Gens hin. Eine Skalierung (in Kb) und die Positionen der bekannten Spaltungsstellen fUr die Restriktions-Endonucleasen sind angegeben. Die das EPO-Gen enthaltende Region wurde vollstflndig von beiden Strāngen sequenziert, indēm durch Exonuclease-III erzeugte Serien von AuslCschungen innerhalb dieser Region vervendet wurden. Eine schematische Darstellung von fūnf Exons, die fūr EPO-mRNA codieren, ist in Abbildung 4b dargestellt. Die genaue 5'-Grenze des Exons I ist zur Zeit nicht bekannt. Der proteincodierende Teil dieser Exons ist schattiert. Die komplette Nucleotidsequenz dieser Region ist in Abbildung 4c dargestellt. Die bekannten Grenzen jedes Exons sind durch vertikāle Balken skizziert. Die Genomklone Lambda-HEPOl, Lambda-HEP02, Lambda-HEP03 und Lambda-ΗΕΡΟό wurden hinterlegt und sind von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter den Zuordnungsnummern ATCC 40154, ATCC 40155, ATCC 40150 und ATCC 40151 erhāllich. 24

Beispiel 5: Konstruktion des Vektors p91023(B)

Der verwendete Transformationsvektor war pAdD26SVpA(3), wie von Kaufman et al., Mol. Celi. Biol. l_y 1304 (1982 ) beschrieben.

Die Struktur dieses Vektors ist in Abbildung 5a dargestellt. Dieses Plasmid enthālt ein Māuse-Dihydrofolat-Reduktase-(DHFR)-cDNA-Gen, das unter der Transkriptionskontrolle des

Adenovirus-2-(Ad2)-major-late-Promotors steht. Eine 5'-Spleifi-Stelle ist in der Adenovirus-DNA angegeben und eine 3'-SpleiB-Stelle, von einem Immunglobulin-Gen abgeleitet, befindet sich zwischen dem Ad2-major-late-Promotor und der DHFR-Codierungssequenz. Die SV40-early-Polyadenylierungsstelle befindet sich ira Strang unterhalb der DHFR-Codierungssequenz. Die prokaryontisch abgeleitete Sektion von pAdD26SVpA(3) stammt von pSVOd (Mellon et al., Celi 27_t 279 (1981)) und enthālt nicht die pBR322-Sequenzen, die bekannt sind ftlr die Inhibierung der Replikation in Sāugerzellen (Lusky et al., Nature 293, 79 (1981)). pAdD26SVpA(3) wurde in das Plasmid pCVSVL2 tiberftihrt, (vgl. Abbildung 5a). pAdD26SVpA(3) wurde in das Plasmid pAdD26SVpA(3)(d) durch LOschen einer der beiden Pstl-Stellen in pAdD26SVpA(3) dberfdhrt. Dies wurde durch teilweise Verdauung rait Pstl erreicht, indēm ein UnterschuB von Enzvm verwendet wurde, so daB eine Subpopulation von 1inearisierten Plasmiden erhalten wurde, in denen nur eine einzige Pstl-Stelle gespalten wurde, anschlieBend erfolgte eine Behandlung mit Klenow, die Ligation, um zu rezirkularisieren, und das Screening bzgl. AuslOschungen der Pstl-Stelle, die sich am 3'-Ende der SV40-Polyadenylations-Sequenz befindet. - 25 - LV 10505

Der Adenovirus-Tripartit-Leader und die virusassoziierten Gene (VA-Gene) wurden in pAdD26SVpA(3)(d) inseriert (vgl. Abbildung 5a). Zuerst wurde pAdD26SVpA(3)(d) mit PvuII gespalten, um ein lineares MolekCil zu erhalten, das innerhalb der 3'-Region der drei Elemente, die den Tripartit-Leader umfassen, gebffnet ist. Dann wurde pJAW43 (Zain et al., Celi _16, 851 (1979)) mit Xhol verdaut, mit Klenow behandelt, mit PvuII verdaut und die 140 bp-Fragmente, die den zweiten Teil des dritten Leaders enthalten, wurden durch Elektrophorese auf Acrylamidgel (6 I in Tris-Borat-Puffer; Maniatis et al., s.u.) isoliert. Das 140 bp-Fragment wurde dann mit dem PvuII-verdauten pAdD26SVpA(3)(d) verbunden. Das verbundene Produkt wurde dažu verwendet, E.coli zur Tetracyclinresistenz zu transformieren, und die Kolonien wurden nach dem Grunstein-Hoguess-Verfahren gescreent, indēm eine P-markierte Probe verwendet wurde, die zu dem 140 bp-Fragment hybridisiert. Eine DNA aus positiv hybridisierten Kolonien wurde hergestellt, um zu testen, ob die rekonstruierte PvuII-Stelle ein 5’-oder 3'-Ende der inserierten 140 bp-DNA war, die spezifisch filr die zweiten und dritten Adenovirus-late-Leaders ist. Die richtige Orientierung der PvuII-Stelle ist das 5'-Ende des 140 bp-Einschubes. Dieses Plasmid wird als pTPL in Abbildung 5a bezeichnet.

Das AvalID-Fragment von SV40, das die SV40-Enhancer-Sequenz enthālt, wurde durch Verdauung von SV40-DNA mit AvalI erhalten, die Enden wurden mit dem Klenow-Fragment von Poli in glatte Enden Oberfilhrt, Xhol-Linker mit den Fragmenten verbunden, mit Xhol verdaut, um die Xhol-Stellen zu dffnen, und die vier griJfiten (D)-Fragmente durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde dann mit aus Xhol geschnittener pTPL verkntlpft und somit das Plasmid pCVSVL2-TPL erhalten. Die Orientierung des SV40-D-Fragmentes in pCVSVL2-TPL war derart, daD der SV40-late-Promotor in der gleichen Orientierung war wie der Adenovirus-major-late-Promotor. 26

Um die Adenovirus-assoziierten (VA)-Gene in die pCVSVL2-TPL zu ūberfOhren, wurde zuerst ein Plasmid pBR322 konstruiert, das das Adenovirus-Typ-2-HINDIII-B-Fragment enthielt. Die Adenovirus-Typ-2-DNA wurde mit HindIII verdaut und das B-Fragment durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde in pBR322 inseriert, das zuvor mit HindIII verdaut wurde. Nach der Transformation von E.coli zur Ampicillin-Resistenz wurden die Rekombinanten hinsichtlich der Insertion des HindiII-B-Fragmentes gescreent und die inserierte Orientierung durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestimmt. pBR322-AdHindIII-B enthālt das

Adenovirus-Typ-2-HindIII-B-Fragment in der in Abbildung 5b gezeigten Orientierung.

Wie in Abbildung 5b dargestellt wird, werden die VA-Gene ūbicherveise aus dem Plasmid pBR322-Ad HindIII-B durch Verdauung mit HpaI erhalten, indēm EcoRl-Linker zugegeben werden und mit EcoRl verdaut wird, und anschlieBend das 1.4 kb-Fragment zurūckgewonnen wird. Das Fragment mit den ilberstehenden EcoRl-Enden wird dann mit der EcoRl-Stelle von PTL verknllpft, das zuvor mit EcoRl verdaut wurde. Nach der Transformation von E.coli HB101 und Selektion hinsichtlich Tetracyclin-Resistenz wurde mit den Kolonien ein Screening-Verfahren durch Filterhybridisierung zur DNA durchgefUhrt, die fūr die VA-Gene spezifisch ist. Die DNA wurde aus positiv hybridisierten Klonen hergestellt und durch Verdauuung mit Restriktionsendonucleasen charakterisiert. Das erhaltene Plasmid wird als p91023 bezeichnet.

Wie in Abbildung 5c dargestellt ist, werden die zwei EcoRl-Stellen in p91023 durch vollstāndiges Schneiden von p91023 mit EcoRl entfernt, so daB zwei DNA-Fragmente erzeugt werden, eines mit ungefahr 7 kb, das andere mit ungefahr 1,3 kb. Das letzere Fragment enthielt die VA-Gene. Die Enden von beiden Fragmenten wurde mit Hilfe des Klenow-Fragmentes von - 27 - LV 10505

Poli aufgefūllt, und die beiden Fragmente wurden dann zusammengeftigt. Ein Plasmid p91023(A), das die VA-Gene enthālt und zu p91023 āhnlich ist, jedoch die beiden EcoRl-Stellen nicht enthait, wurde sowohl nach dem

Grunstein-Hogness-Screening-Verfahren mit dem VA-Gen-Fragment als auch durch konventionelle Restriktionsstellen-Analyse identifiziert.

Die einzelne Pstl-Stelle in p91023(A) wurde entfernt und durch eine EcoRl-Stelle ersetzt. p91023(A) wurde vollstandig mit Pstl geschnitten und dem Klenow-Fragment von Poli behandelt, um frische Enden zu erhalten. EcoRl-Linker wurden mit den glatten Pstl-Stellen von p91023(A) verknUpft. Die lineare p91023(A) mit den EcoRl-Linkern an den glatten Pstl-Stellen wurde von den unverknUpften Linkern abgetrennt und vollstandig mit EcoRl verdaut und wieder neu verknUpft. Ein Plasmid p91023(B) wurde erhalten (vgl. Abbildung 5c) und mit einer zu p91023(A) ahnlichen Struktur charakterisiert, jedoch mit einer EcoRl-Stelle anstelle der frUheren Pstl-Stelle. Das Plasmid p91023(B) wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 39754 erhaitlich.

Beispiel 6:

Die cDNA-Klone (Lambda-HEPOFL6 und Lambda-HEP0FL13, vgl. Beispiel 3) wurden in das Plasmid p91023(B) inseriert, so daB pPTFL6 und pPTFL13 erhalten wurden. 8 ug jeder gereinigten DNA wurden dann dažu vervendet, 5 χ 106 COS-Zellen mit Hilfe der DEAE-Dextran-Methode (siehe unten) zu transfektieren. Nach 12 Stunden wurden die Zellen gevaschen und mit Chlorochin (0,1 mM) zwei Stunden lang behandelt, wieder gewaschen und fUr 24 Stunden 10 ml Medium ausgesetzt, das 10 % fdtales Kaiberserum enthait. Das Medium wurde dann gegen 4 ml serum-freies Medium ausgetauscht und 48 Stunden spater geerntet. 28

Die Produktion von immunologisch aktivem EPO wurde mit Hilfe eines Radioimmunoassays nach der Methode Sherwood und Goldwasser (55) quantifiziert. Der Antikbrper wurde von Dr. Judith Sherwood zur VerfUgung gestellt. Der jodierte Tracer wurde aus dem gereinigten EPO (vgl. Beispiel 1) hergestellt.

Die Empfindlichkeit des Assays betrāgt ungefāhr 1 ng/ml. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestelIt.

Tabelle 1

Vektor Konz. an in das Medium abgegebenem EPO (ng/ml) PPTFL13 330 pPTFL6 31 pPTFL13 wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 3999 erhāltlich.

Beispiel 7:

Die EPO-cDNA (Lambda-HEP0FL13) wurde in den p91023(B)-Vektor inseriert, in COS-1-Zellen transfektiert und wie oben (Beispiel 6) geerntet, mit der Ausnahme, dafi die Chlorochinbehandlung weggelassen wurde.

In-vitro biologisch aktives EPO wurde dadurch vermessen, indēm entweder ein koloniebildender Assay mit fdtalen Leberzellen aus 3 Māusen als Quelle fūr CFU-E oder der H-Tymidinau£nahmeassay verwendet wurde, bei dem Milzzellen mit Phenylhydrazin injizierten Māusen verwendet werden. Die Empfindlichkeit dieser Nachweise betrāgt ungefāhr 25 mU/ml. Biologisch aktives EPO wurde in-vivo entweder nach der Methode mit hypoxischen Māusen - 29 - LV 10505 oder mit hungernden Ratten gemessen. Die Empfindlichkeit dieser Nachveise betrSgt ungefāhr 100 mU/ml. Bei beiden Nachweisen wurden in B1indversuchen keine Aktivitaten nachgewiesen. Die Ergebnisse des durch den Klon HEP0FL13 exprimierten EPO's sind in Tabelle 2 dargestellt, in der die Aktivitāten in U/ml ausgedrilckt sind, wobei kommerzielies EPO (Toyobo Incorp.) als Standard vervendet wurde.

Tabelle 2

Aus mit Typ I-EPO-cDNA transfektierten Zellen ausgeschiedenes EPO

Aktivitat 100 ng/ml 2^o.5 U/ml 3.1^1.8 U/ml 1 U/ml 2 U/ml

Nachweis

RIA

CFU-E 3H-Thy hypoxische Maus hungernde Ratte

Beispiel 8: SDS-Polyacrylamid-Gel-Analyse von EPO aus COS-Zellen 180 ng von EPO, das in das Medium von COS-Zellen abgegeben wurde, die mit EPO (Lambda-HEP0FL13)-cDNA im Vektor 91023CB) (siehe oben) transfektiert wurden, wurden auf einem 10-ligen SDS-Laemlli-Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch getrennt und auf Nitrocellulose-Papier elektrotransferiert (Towbin et al.,

Proc. Nati. Acad. Sci., USA 7£, 4350 (1979)). Der Filter wurde mit Anti-EPO-Antikdrpern, wie in Tabelle 1 beschrieben, 12 5

Uberprilft, gevraschen und mit I-staph-A-Protein neu ūberprtift. Der Filter wurde zwei Tage lang autoradiographiert. Natives reines EPO, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde entweder vor (Linie B) oder nach der Jodierung (Linie C) elektrophoretisch getrennt (vgl. Abbildung 6). Die verwendeten Marker beinhalteten 33S-Methionin-markiertes Serumalbumin (68 000 D) und Ovalbumin (45 000 D). 30

Beispiel 9: Konstruktion von RK1-4

Das BamHI-PvulI-Fragment aus dem Plasmid PSV2DHFR (Subramani et al., Mol. Celi. Biol. 1, 854-864 (1981)), das den zum Māuse-Dihydrofolat-Reductase-(DHFR)-Gen benachbarten SV40-early-region-Promotor, einen SV40-Enhancer, das kleine t Antigen-Intron und die SV40-Polyadenylierungssequenz enthālt, wurde isoliert (Fragment A). Die verbleibenden Fragmente wurden aus dem Vektor p91023(A) (siehe oben) wie folgt erhalten: p91023(A) wurde mit PstI an der einzelnen Pstl-Seite neben dem Adenovirus-Promotor verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, und entweder mit synthetischem PstI oder mit EcoRI-Konvertern verknUpft und rezirkularisiert (dabei werden die Stellen PstI-EcoRI-PstI an der ursprOnglichen Pstl-Stelle erzeugt; 91023(B')) oder mit dem groflen Fragment der DNA-Polymerase I behandelt, um die Pstl-Stellen zu zerstbren, und mit den synthetischen EcoRl-Linker verkniipft und rezirkularisiert (dabei wird eine EcoRI-Stelle an der ursprOnglichen Pstl-Stelle erzeugt; 91023(B)). Jedes der beiden resultierenden Plasmide 91023(B) und 91023(B') vrurden mit Xba und EcoRI verdaut, wobei zwei Fragmente (F und G) gebildet werden. Durch Verbinden von Fragment F aus p91023(B) und Fragment G aus p 91023 (B') und Fragment G aus p91023(B) und Fragment F aus p91023(B’) wurden zwei neue Plasmide erzeugt, die entweder eine EcoRI-PstI-Stelle oder eine Pstl-EcoRI-Stelle an der ursprOnglichen Pstl-Stelle enthielten. Das Plasmid, das die PstI-EcoRI-Stelle enthielt, wo die Pstl-Stelle dem Adenovirus-major-late-Promotor am nSchsten ist, wurde als p91023(C) bezeichnet.

Der Vektor p91023(C) wurde mit XhoI vollstandig verdaut und die resultierende linearisierte DNA mit Uberstehenden Enden wurde mit einem groBen Fragment von E.coli DNA Polymerase 1 in eine DNA mit glatten Enden UberfOhrt. An diese DNA vurde ein - 31 - LV 10505 340 bp Hindi 11-EcoRI-Fragment gebunden, das den SV40-Enhancer enthait, der wie folgt hergestellt wurde:

Das Hindi 11-Pvul I-Fragment aus SV40, das den SV40-Ursprung oder die Replikation und den Enhancer enthait, wurde in das Plasmid c-lac inseriert (Little et al., Mol. Biol. Med. ļ, 473-488 (1983)). Der c-lac-Vektor wurde durch Verdauung von c-lac-DNA mit BamHI hergestellt, anschliefiend die Uberstehenden Enden mit einem groSen Fragment von DNA-Polymerase 1 aufgefilllt und die DNA mit HindIII verdaut. Das resultierende Plasmid (c-SVHPlac) regenerierte die BamHI-Stelle durch Verknūpfen der glatten Enden von PvuII. Das EcoRI-Hindi 11-Fragment wurde aus c-SVHPlac hergestellt und an das EcoRI-HindIII-Fragment von PSVOd gebunden (Mellou et al., siehe oben), das den Plasmid-Ursprung der Repliklation enthielt, und das resultierende Plasmid PSVHPOd vurde selektioniert. Das 340 bp EcoRI-HindIII-Fragment von PSVHPOd, das den SV40-Ursprung/Enhancer enthait, wurde dann hergestellt, beide Enden mit einem groBen Fragment von DNA-Polymerase in glatte Enden OberfOhrt und an den Xhol-verdauten p91023(c)-Vektor, wie oben beschrieben, gebunden. Das resultierende Plasmid (p91023(C)/Xho/glattes Ende plus EcoRI/HindIII/glattes Ende, SV40-Ursprung plus Enhancer), in dem die Orientierung des HindIII-EcoRI-Fragmentes derart var, daB die BamHI-Stelle innerhalb dieses Fragmentes dem VA-Gen am nachsten var, vurde als pES105 bezeichnet. Das Plasmid pESlOS vurde mit BamHI und PvuII und‘ ebenso mit PvuII allein verdaut, und das BamHI-PvulI-Fragment, das den Adenovirus-major-late-Promotor (Fragment B) enthait, und das PvuII-Fragment, das das Plasmid innerhalb der Resistenzgene (Tetracyclinresistenz) enthait, und andere Sequenzen (Fragment C) vurden isoliert. Die Fragmente A, B und C vurden verkntipft und das in Abbildung 10b dargestelle Plasmid vurde isoliert und als RK1-4 bezeichnet. Das Plasmid RK1-4 vurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und ist dort unter der Zuordnungsnummer ATCC 39940 erhaitlich. 32

Beispiel 10: Expression von EPO in CHO-Zellen (Methode I

Die DNA (20 ug) aus dem Plasmid pPTFL13 (vgl. Beispiel 6) wurde mit der Restriktions-Endonuclease Clal verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, und wurde mit Cla-1-verdauter DNA aus dem Plasmid pAdD26SVp(A)1 (2ug) verknUpft, das ein durch den Adenovirus-major-late-Promotor (Kaufman und Sharp, Mol. and Celi. Biol. 2^ 1304-1319 (1982)) reguliertes intaktes Dihydrofolatreductase-(DHFR)-Gen enthālt. Diese verknūpfte DNA wurde vervendet, um DHFR-negative CHO-Zellen (DUKX-BII, Chasin L.A. und Urlaub G., Proc. Nati. Acad. Sci. 7_7, 4216-4220 (1980)) zu transfektieren, und nach zweitāgigem ZOchten wurden die Zellen, die mindestens ein DHFR-Gen beinhalteten, in nucleosidfreiem Alphamedium selektioniert und 10 \ dialysiertes fdtales Kālberserum zugegeben. Nach zweiw8chigem Wachstum in selektiven Medien wurden die Kolonien von den Originalplatten entfernt, in Gruppen zu 10 bis 100 Kolonien zusammengefOgt, replattiert und in nucleosidfreiem Alphamedium gezūchtet. Die Uberstehenden Medien der Pools, die vor der

Methotrexat-Selektion gewachsen waren, wurden auf EPO mit Hilfe eines RIA getestet. Pools mit positiver EPO-Produktion wurden in Gegenvrart von Methotrexat (0,02 UM) gezūchtet, dann subkloniert und wieder getestet. EPO-Cla4alpha4.02-7, ein einzelner Subklon aus dem EP0-Cla4alpha4.02-Pool, gibt 460 ng/ml EPO in das Medium ab, das 0,02 uM ΜΤΧ (vgl. Tabelle 3) enthālt. EP0-Cla4alpha4.02-7 ist die Zellinie der Wahi fUr die EPO-Produktion und wurde bei der American Type Culture Collection (Zuordnungsnummer ATCC CRL869S) hinterlegt. Zur Zeit wird dieser Klon einer schrittweisen Selektion mit steigenden Konzentration vom ΜΤΧ untervorfen und wird voraussichtich Zellen ergeben, die noch hdhere Konzentrationen von EPO - 33 - LV 10505 produzieren. Fūr Pools, die im RIA negativ waren, wurden Methotrexat-resistente Kolonien, welche aus den Gegenkulturen erhalten wurden, die in der Gegenwart von Methotrexat (0,02 uM) gewachsen waren, erneut mittels RIA auf EPO geprūft. Diejenigen Kulturen, die nicht positiv waren, wurden subkloniert und in weiter steigenden Konzentrationen von Methotrexat gezUchtet.

Die schrittweise Methotrexat-(MTX)-Selektion wurde durch sich viederholende Zyklen des ZUchtens von Zellen in Gegenwart von steigenden Konzentrationen an Methotrexat und durch die Selektion der tlberlebenden Zellen erreicht. Nach jedem Durchgang wurde EPO ira Kulturtlberstand durch RIA und durch in-vitro biologische Aktivitāt gemessen. Die Konzentrationen von Methotrexat, die in jeder schrittveisen Verstflrkung vervendet wurden, waren 0,02 M, 0,1 M und 0,5 M. Wie in Tabelle 3 dargestellt ist, wurden nach einem Durchgang der Selektion in 0,02 Μ ΜΤΧ signifikante Konzentrationen von EPO in das Kulturmedium abgegeben.

Tabelle 3

Konzentration von in das Mediura abgegebenera EPO

Probe Tēst alpha-Medium-Ernte 0,02 uM methotrexat in ____der alpha-Mediurn Ernte 4« 4 Pool RIA 17 ug/ml 50 ng/ml 4<< 4 Single Pool

Klon (.02-7)

RIA 460 ng/ml 34

Beispiel 11: Expression von EPO in CHO-Zellen (Methode 2)

Die DNA des Klons Lambda-HEPOFL13 wurde mit EcoRI verdaut und das kleine RI-Fragment, das das EPO-Gen enthālt, wurde in die EcoRI-Stelle des Plasmides RK1-4 (vgl. Beispiel 10) subkloniert. Diese DNA (RKFL13) wurde dann benutzt, um die DHFR-negativen CHO-Zellen direkt zu transfektieren (ohne Verdauung). Die Selektion und VerstSrkung wurde wie in Beispiel 10 beschrieben durchgefūhrt.

Die RKFL13-DNA wurde ebenfalls in CHO-Zellen durch Protoblastenfusion und Mikroinjektion inseriert. Das Plasmid RKFL13 wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 39989 erhāltlich.

Tabelle 4

Konzentration von in das Medium abgegebenem EPO

Probe Tēst alpha-Medium-Ernte 0.02 uM Methotrexat in der alpha-Medium Ernte 42 ng/ml (Pool) 150 ng/ml (Klon) 1.5 U/ml 9G ng/ml 5.9 U/ml - 35 - LV 10505

Beispiel 12: Expression des EPO-Genom-Klons in COS-1-Zellen

Der Vektor, der fūr die Expression des EPO-Genom-Klons verwendet wurde, ist pSVOd (Mellon et. al., s.o.). Die DNA von pSVOd wurde vollstāndig mit HindIII verdaut und die Enden mit dem grofien Fragment von DNA-Polymerase-I in glatte Enden umgewandelt. Der EPO-Genom-Klon Lambda-HEP03 wurde mit EcoRI und HindIII vollstāndig verdaut und das 4,0 kb-Fragment, das das EPO-Gen enthālt, wurde isoliert und wie oben beschrieben in glatte Enden umgewandelt. Die Nucleotidsequenz dieses Fragmentes von der HindiII-Stelle bis zur Region oberhalb des Polyadenylierungssignals ist in Abbildung 4 dargestellt. Das EPO-Gen-Fragment wurde in das pSVOd-Plasmid-Fragment inseriert. Korrekt konstruierte Rekombinanten in beide Richtungen konnten isoliert und verifiziert werden. Das Plasmid CZ2-1 besitzt das EPO-Gen in der Orientierung "a" (d.h., da8 das 5'-Ende von EPO dem SV40 Ursprung am nfichsten liegt) und das Plasmid CZ1-3 besitzt die entgegengesetzte Orientierung (Orientierung Mb").

Die Plasmide CZ1-3 und CZ2-1 wurden in COS-1-Zellen, wie in Beispiel 7 beschrieben, transfektiert, das Medium geerntet und auf immunologisch aktives EPO getestet. Ungefāhr 31 ng/ml von EPO wurde im Kulturilberstand von CZ2-1 nachgeviesen bzw. 16-31 ng/ml von CZ1-3.

Die Genom-Klone HEP01, HEP02 und HEP06 kčnnen in COS-Zellen zur Expression auf āhnliche Weise inseriert werden. 36

Beispiel 13: Expression in C127 und CHO-Zellen und Konstruktion von pBPVEPO

Ein Plasmid, das die EPO-cDNA-Sequenz unter der Transkriptions-Kontrolle des Metallothionein-Promotors von Māusen enthālt und das an die komplette Papilloraa-virus-DNA von Rindern gebunden ist, wurde wie folgt hergestellt: pEPQ49f

Das Plasmid SP6/5 wurde von Promega Biotec. kauflich erworben. Dieses Plasmid wurde mit EcoRI vollstSndig verdaut und das 1340 bp EcoRI-Fragment von Lambda-HEPOFL13 wurde durch DNA-Ligase inseriert. Das resultierende Plasmid, in dem das 5'-Ende des EPO-Gens dem SP6-Promotor (durch BglI und HindIII-Verdauung bestimmt) am nachsten war, wurde als pEP049f bezeichnet. In dieser Orientierung ist die BamHI-Stelle im PSP6-5-Poly-Linker dem 5'-Ende des EPO-Gens direkt benachbart.

pMMTneo^BPV

Das Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) (Law et al., Mol. and Celi Biol. 3, 2110-2115 (1983)), das in Abbildung 11 dargestellt ist, wurde mit BamHI vollstāndig verdaut, um zwei Fragmente zu erzeugen: Ein grofies Fragment einer Lange von ca. 8 kb, das das BPV-Genom enthālt, und ein kleineres Fragment der Lange von ungefahr 6,5 kb, das den pML2-Ursprung der Replikation und das Ampicillin-Rcsistenz-Gen, den Methallothionein-Promotor, das Neomycin-Resistenz-Gen und das SV40-Polyadenylierungssignal enthālt. Die verdaute DNA wurde durch DNA-Ligase rezirkularisiert und die Plasmide, die nur das 6,8 kb-Fragment enthielten, wurden durch Verdauung mit EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonucleasen identifiziert. Eines dieser Plasmide wurde als pMMTneo%PV bezeichnet. - 37 - LV 10505 pEPOl5a pMMTneo BPV vurde mit BglII vollstāndig verdaut. pEP049f wurde mit BamHI und BglII vollstāndig verdaut und die ungefāhr 700 bp-Fragmente, die die gesamte EPO-Codierungsregion enthielten, vurden durch Gelisolierung hergestellt. Die BglII verdauten pMMTneo BPV- und die 700 bp BamHI/BGlII-EPO-Fragmente vurden verknūpft und die resultierenden Plasmide, die die EPO-cDNA enthielten, wurden identifiziert durch Koloniehybridisierung mit der 01igonucleotid-d(GGTCATCTGTCCCCTGTCC)-Probe, die spezifisch fūr das EPO-Gen ist. Von den Plasmiden, die bei der Hybridisierungsanalyse positiv varen, wurde eines (pEP015a), das die EPO-cDNA in der Orientierung besaB, so daS das 5'-Ende der EPO-cDNA dem Metallothionein-Promotor am nāchsten war, durch Verdauung mit EcoRI und KpnI identifiziert.

pBPV-EPO

Das Plasmid pEP015a wurde vollstāndig durch BamHI verdaut, um das Plasmid zu linearisieren. Das Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) wurde ebenfalls vollstāndig mit BamHI verdaut, um zwei Fragmente von 6,5 und 8 kb zu erzeugen. Das 8 kb-Fragment, das das gesamte Rinder-Papilloma-Virus-Genom enthielt, wurde isoliert (Gel). pEP015a/BamHI und das 8 kb-BamHI-Fragment wurden miteinander verknūpft und ein Plasmid (pBPV-EPO), das das BPV-Fragment enthielt, vurde durch Koloniehybridisierung identifiziert, indēm eine Oligonucleotidprobe d(P-CCACACCCGGTACACA OH) vervendet wurde, die spezifisch fūr das BPV-Genom ist. Die Verdauung von pBPV-EPO-DNA mit HindIII vies darauf hin, dafl die Richtung der Transkription des BPV-Genoms die gleiche var vie die Richtung der Transkription des Metallothionein-Promotors (vie in pdPBV-MMTneo(342-12), vgl. Abbildung 11). Das Plasmid pdBPV-MMTneo(342-12) ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 37224 erhāltlich. 38

Expression

Die folgenden Methoden wurden fūr die Expression von EPO vervendet.

Methode I DNA-pBPV-EPO wurde hergestellt und ungefahr 25 ug wurden verwendet, um ungefahr 106 C127 (Lowy et al., J. of Virol. 26, 291-298 (1978))-CHO-Zellen zu transfektieren, indēm die Standardtechnik der Kalziumphosphatfailung verwendet wurde (Grahm et al., Virology 5^, 456-467 (1973)). Fūnf Stunden nach der Transfektion wurde das Transfektionsmedium entfernt, die Zellen mit Glycerin abgeschreckt, gewaschen und frisches alpha-Medium mit 10 %igem fOtalem Rinderserum zugegeben. 48 Stunden spSter wurden die Zellen trypsiniert und im Verhaitnis von 1:10 in DME-Medium mit 500 ug/ml G418 (Southern et al.,

Mol. Appl. Genet. ļ, 327-341 (1982)) aufgeteilt und die Zellen fūr zwei bis drei Wochen inkubiert. G418-resistente Kolonien wurden einzeln auf in Mikrotiterplatten isoliert und in der Gegenwart von G418 gezūchtet. Die Zellen wurden dann gevaschen, frisches Medium mit 10 I fdtalem Rinderserum zugegeben und die Medien 24 Stunden spSter geerntet. Die konditionierten Medien wurden durch Radioimmunoassay und durch in-vitro biologische Versuche getestet und waren positiv fUr EPO.

Methode II C127 oder CHO-Zellen wurden cotransfektiert mit 25 ug von pBPV-EPO und 2ug von pSV2neo (Southern et al, siehe oben ; vgl. Methode I). Dies bedeutet einen ungefahr lOfachen molaren UberschuB von pBPV-EPO. Nach der Transfektion ist das Verfahren das gleiche wie in Methode I. - 39 - LV 10505

Methode III C127-Zellen wurden rait 30 ug von pBPV-EPO transfektiert (vgl. Methode I). Nach der Transfektion und der Aufteilung (1 : 10) wurde das Medium aile drei Tage gegen frisches ausgetauscht. Nach ungefāhr zwei Wochen wurden Punktē von pBPV transformierten Zellen sichtbar. Einzelne Punktē wurden getrennt in 1 cm Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben, zu einem subkonfluenten Monolayer gezUchtet und auf EPO-Aktivitāt oder auf Antigenitat im konditionierten Medium getestet.

Beispiel 14: Expression in Insektenzellen Konstruktion von pIVEV EP0FL13

Der Plasmidvektor pIVEV wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 39991 erhaitlich. Der Vektor wurde wie folgt modifiziert:

pIVEVNI pIVEV wurde mit EcoRI verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, durch Verwendung eines groBen Fragmentes von DNA-Polymerase I wurden die Enden in glatte Enden umgewandelt und ein einzelner Notl-Linker

GGCGGCCGCC

CCGCCGGCGG wurde durch Verbinden der glatten Enden inseriert. Das resultierende Plasmid wird als pIVEVNI bezeichnet.

pIVEVSI pIVEV wurde mit Smal verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, und ein einzelner Sfil-Linker

GGGCCCCAGGGGCCC

CCCGGGGTCCCCGGG wurde durch Verbinden der glatten Enden inseriert. Das resultierende Plasmid wurde als pIVEVSI bezeichnet. 40 pIVEVSIBgKp

Das Plasmid pIVEVSI wurde mit KPnI verdaut, um das Plasraid zu linearisieren, und ungefāhr 0 - 100 bp vurden von jedem Ende durch Verdauung mit der doppelstrāngigen Exonuclease Bal31 entfernt. Aile resultierenden Enden, die nicht vollstāndig glatt waren, wurden mit Hilfe des groBen Fragmentes von DNA-Polymerase I in glatte Enden umgewandelt und der Poly-Linker

XhoI Xbal 1 :

BgL'lI EcoHI Clal KpnI _! ! ; t 1 ^AG ATC Tb G AGAATTC T AGATCG ATGG TACC TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG wurde durch Verbinden der glatten Enden inseriert. Der Poly-Linker wurde in beide Richtungen inseriert. Ein Plasmid, in dem der Poly-Linker so orientiert ist, daB die BglII-Stelle innerhalb des Poly-Linkers dem Polyhedron-Gen-Promoter am nāchsten ist, wird als pIVEVSIBgKp bezeichnet. Ein Plasmid, in dem KpnI-Stelle innerhalb des Poly-Linkers dem Polyhedron-Gen-Promotor am nāchsten liegt, wird als pIVEVSIKpBg bezeichnet. Die Anzahl der Basenpaare, die zwischen der ursprilnglichen KPnI-Stelle in pIVEVSI und dem Polyhedron-Promotor geldscht wurde, wurde nicht bestimmt. pIEIVSIBgKp wurde hinterlegt und ist unter der Zuordnungsnummer ATCC 39988 von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. erhāltich.

pIVEVSIBgKpN pIVEVNI wurde mit KPnI und PstI vollstāndig verdaut, um zwei Fragmente zu erhalten. Das grdBere Fragment, das den Plasmidursprung der Replikation und das 3'-Ende des Polyhedron-Gens enthālt, wurde durch Gelisolierung hergestellt (Fragment A). pIVEVSIBgKp wurde vollstāndig mit PstI und KPn verdaut, um zwei Fragmente sowie ein kleines Fragment zu - 41 - LV 10505 erhalten, das den Polyeder-Gen-Promotor enthait. Der Poly-Linker wurde durch Gelisolation hergestellt (Fragment B). Die Fragmente A und B wurden dann durch die DNA-Ligase miteinander verbunden, um das neue Plasmid pIVEVSIBgKpNI zu bilden, das ein teilweise geldschtes Polyeder-Gen enthait, in das ein Poly-Linker inseriert wurde, und das ebenso die Notl-Stelle (Ersetzen der zerstbrten EcoRI-Stelle) und eine Sfil-Stelle enthait, die die Polyhedron-Gen-Region flankiert.

pIVEPO pIVEVSI BgKpNI wurde vollstandig rait EcoRĪ verdaut, um das Plasmid zu 1inearisieren, und das 1340 bp EcoRI-Fragment von Lambda-HEP0FL13 wurde inseriert. Die Plasmide, die das EPO-Gen in der Orientierung enthielten, so dafl das 5'-Ende des EPO-Gens dem Polyeder-Promotor am nachsten war, und das 3'-Ende des Polyeder-Gens wurden durch Verdauung mit BglII identifiziert. Eines dieser Plasmide in der obenbeschriebenen Orientierung wurde als pIVEPO bezeichnet.

Expression von EPO in Insektenzellen

Grofie Mengen des pIVEPO-Plasmides wurden durch Transformation des E.coli Stranges JMlOl-tgl hergestellt. Die Plasmid-DNA wurde durch die "cleared-lysate"-Technik isoliert (Maniatis und Fritsch, Cold Spring Harbor Manual) und weiter durch CsCl-Zentrifugation gereinigt. Die L-l-DNA aus dem Wildtyp autographa-californica-Polyhydrosis Virus (AcANPV) wurde durch Phenolextraktion von Viruspartikeln und darauf folgender CsCl-Reinigung der viralen DNA hergestellt.

Diese beiden DNAs wurde dann in spod.-frugiperda-Zellen IPLB-SF-21( Vaughn et al. , in-vitro, Vol. B, S. 213 - 217 (1977)) cotransfektiert, indēm das Verfahren der 42

Kalziumphosphat-Transfektion (Potter und Miller, 1977) verwendet wurde. FUr jede Platte der zu cotransfektierenden Zellen wurden 1 ug des Wild-Typs AcNPV-DNA und 10 ug von pIVEPO verwendet. Die Platten wurden fUnf Tage lang bei 27°C inkubiert. Der Uberstand wurde dann geerntet und die EPO-Expression im Uberstand wurde durch Radioimmunoassay und durch in-vitro biologische Methoden bestatigt.

Beispiel 15: Reinigung von EPO

Die mit COS-Zellen konditionierten Medien (121) mit EPO-Konzentration bis zu 200 ug/1 vurden auf 600 ml konzentriert, indēm Ultrafiltrationsmembranen mit einer Ausschlufigrenze eines Molekulargewichts von 10.000 verwendet wurden, z.B. eine Millipore-Pellikan-Membran. Die Tests vurden mit Hilfe eines RIA, wie in Beispiel 6 beschrieben, durchgefdhrt. Der Uberstand aus der Ultrafiltration wurde gegen 4 ml eines 10 mM-Natriumphosphatpuffe^s (pH 7,0) diafiltriert. Die konzentrierten und diafiltrierten, konditionierten Medien enthielten 2,5 mg EPO (380 mg Gesamtprotein). Die EPO-LOsung wurde auf 186 ml veiterkonzentriert und die ausgefallenen Proteine vurden 30 Minuten lang bei 120.000 xg abzentrifugiert.

Der Uberstand, der 2,0 mg EPO enthielt, vurde mit 50 liger Essigsaure auf pH 5,5 eingestellt, 30 Minuten bei 4°C gerūhrt und der Niederschlag 30 Minuten lang bei 13.000 xg abzentrifugiert. - 43 - LV 10505

Carbonylmethyl-Sepharose-Chromatographie

Der Uberstand der Zentrifugation (20 ml), der 200 ug von EPO (24 mg Gesamtprotein) enthielt, wurde auf eine Sāule aufgetragen, die mit CM-Sepharose (20 ml) gepackt und mit 10 mM Natriumacetat (pH 5,5) āquilibriert var. AnschlieBend wurde die Sāule mit 40 ml des gleichen Puffers gewaschen. Das an die CM-Sepharose gebundene EPO wurde nach 100 ml eines Gradienten von NaU (0 - 1) in 10 mM Natriumphosphat (pH 5,5) eluiert. Die Fraktionen, die EPO enthielten (insgesamt 50 ug von 2 mg Gesamtprotein) wurden vereinigt und auf 2 ml mit Hilfe einer Amicon-YM10-Ultrafiltrationsmembran konzentriert.

Reversed-phase-HPLC

Die konzentrierten Fraktionen nach der Sāulenchromatographie, die EPO enthielten, wurden weiter durch reversed-phase-HPLC Ober eine Vydac C-4-Sāule gereinigt. Das EPO wurde mit einer FluErate von 1 ml/min auf die Sāule aufgetragen, die mit 10 % Lbsung B (Lūsung A war 0,1 % CFjCOOH in Wasser; Lbsung B war 0,1 % CF^COOH in CF^CN) āquilibriert wurde. Die Sāule wurde mit 10 % der LOsung B 10 Minuten lang gevaschen und das EPO wurde mit einem linearen Gradienten von B (10 - 70 I ; 60 min) eluiert. Die EPO enthaltenden Fraktion wurden vereinigt (ungefāhr 40 ug von EPO von 120 ug Gesamtprotein) und lyophilisiert. Das lyophilisierte EPO wurde in 0,1 m Tris-HCl-Pfuffer (pH 7,5) mit 0,15 m NaCl rekonstituiert und auf einer reversed-phase-HPLC rechromatographiert. Die EPO enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid-(10 !)-Gel Elektrophorese (Lamelli, U.K. Nature) analysiert. Die vereinigten Fraktionen von EPO enthielten 15,5 ug von EPO (25 ug Gesamtprotein). LV 10505

Patentansprtiche

Verfahren zur Herstellung eines menschlichen cDNA-Klons, der biologisch aktives Erythropoietin exprimiert, dadurch gekennzeichnet, daB a) gereinigtes Erythropoietin-Protein durch Trypsin verdaut wird, b) ein Pool von Oligonukleotidproben hergestellt wird, der au£ der Aminosauresequenz der in Schritt a) produzierten tryptischen Fragraente basiert, c) eine menschliche Genom-DNA-Bibliothek mit den Oligonecukleotidproben von Schritt b) gescreent wird, d) Klone selektioniert werden, die mit den Proben hybridisieren, und die Klone sequenziert werden, um zu bestimmen, ob sie Erythropoietin-Klone darstellen, e) ein Erythropoietin-Klon von Schritt d) identifiziert wird, f) ein Klon von Schritt e) filr das Screening einer cDNA-Bibliothek verwendet wird, die aus menschlicher fčtaler Leber hergestellt wurde, und g) ein Erythropoietin-Klon aus der fotalen Leber-cDNA-Bibliothek selektioniert wird.

Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin, dadurch gekennzeichnet, dafi Wirtszellen in einem entsprechenden Medium gezilchtet werden, die eine wie im wesentlichen in Abb. 3 B dargestellte DNA-Sequenz enthalten, die wirksam an eine Expressions-Kontrollsequenz gebunden ist und das auf diese Weise von den Zellen und dem Medium produzierte Erythropoietin abgetrennt wird. 2 3. Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin, dadurch gekennzeichnet, dafi eukaryontische Wirtszellen in einem entsprechenden Medium gezilchtet werden, die eine wie im vesentlichen in Abb. 4 C dargestellte DNA-Sequenz enthalten, die wirksam an eine Expressions-Kontrollsequenz gebunden ist, und das auf diese Weise von den Zellen und dem Medium produzierte Erythropoietin abgetrennt wird. 4. Verfahren gemāB Anspruch 2 oder 3, in dem die Wirtszellen Sāugerzellen sind. 5. Verfahren gemāfl Anspruch 4, in dem die Sāugerzellen 3T3-Zellen sind. 6. Verfahren gemāfi Anspruch 4, in dem die Sāugerzellen Ovarien-Zellen des China-Hamsters (CHO) sind. 7. Verfahren gemāfl Anspruch 4, in dem die betreffende DNA-Sequenz in einem Vektor beinhaltet ist, der auch die Rinder-Papilloma-Virus-DNA enthālt.

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Clonierte menschliche Erythropoietin-Gene und deren Produkte

Die vorliegende Erfindung betrifft klonierte Gene des menschlichen Erythropoietins, die uberraschenderweise hohe Expressionsraten liefern, die Expression der genannten Gene und die in-vitro Produktion cjes raenschī ieben Erythropo iet ins.

Abstract

Cloned gencs for human erythropoietin (EPO) obtained from human fetal liver that provide surprisingly high Ievels of «pression. Also deseribed is the expression of said genes in vitro to producē active human EPO. - 2 - LV 10505 14) Goldwasser, E., ICN UCLA Symposium, Control of Cellular Division and Development, A.R. Liss, Inc., S. 487-494 (1981) 15) Cline, M. J. and Golde, D. W., Nature 277, 177-181 (1979). 16) Metcalf, D., Johnson, G. R., and Burgess, A. W., Blood 55, 138 (1980) 17) Krane, N., Henry Ford Hosp. Med. J. 31, 177-181 (1983). 18) Eschbach, J., Mladenovic, J., Garcia, J., Wahl, P., and Adamson, J., J. Clin. Invest. 7_4. 434-441 (1984). 19) Anagnostou, A., Barone, J., Vedo, A., and Fried, W. Br., J. Hematol 37, 85-91 (1977). 20) Miyake, T., Kung, C., and Goldwasser, E., J. Biol. Chem. 252, 5558-5564 (1977). 21) Yanagawa, S., Hirade, K., Ohnota, H., Sasaki, R., Chiba, H., Veda, M., and Goto, M., J. Biol. Chem. 259, 2707-2710 (1984). 22) Lawn, R. M., Fritsch, Ef. F., Parker, R. C., Blake, G., and Maniatis, T., Celi 15, 1157 (1978) 23) Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R., Proc. Nati. Acad. Sci., U.S.A. 74, 5463 (1977). 24) Zanjanc, E. D., Ascensao, J. I., McGlave, P. B., Banisadre, M. , and Ash, R. C., J. Clin. Invest. 67, 1183 (1981). 3 25) Toole, J. J., Knopf, J. L., Wozney, J. M., Sultzmann, L.

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Claims (7)

1. Lv 10505 Patentformulas punkti 1. Paņēmiens cilvēka cDNS klonu, kuru ekspresija dod bioloģiski aktīvu eritropoetīnu, iegūšanai, kas atšķiras ar to, ka a) attīrītu eritropoetīna olbaltumvielu sašķeļ ar tripsīnu, b) izveido oligonukleotīdu zondu komplektu, kas atbilst aminoskābju secībai posmā (a) iegūtajos triptiskajos fragmentos, c) ar posmā (b) iegūtajām zondēm pārbauda cilvēka genoma DNS pūlu, d) izdala klonus, kuri hibridizējas ar zondēm, sekvencē tos, lai noteiktu, vai tie veido eritropoetīna klonus, e) identificē eritropoetīna klonus, kas atdalīti posmā (d), f) posmā (e) iegūto klonu izmanto cDNS pūla pārbaudei,kurš iegūts no cilvēka embrija aknām, un g) no cilvēka embrija aknu cDNS pūla izdala eritropoetīna klonu.
2. 2. eritropoetīna iegūšanai, kas atšķiras ar to, ka piemērotā vidē kultivē saimniekšūnas, kas satur DNS secību, pamatā tādu, kāda tā parādīta zīm. 3B, kura operatīvi saistīta ar ekspresiju regulējošo secību, un pēc tam atdala tādā veidā šūnās un vidē veidoto eritropoetīnu.
3. 3. P§5l!ī!i®?}§ eritropoetīna iegūšanai, kas atšķiras ar to, ka piemērotā vidē kultivē saimniekšūnas, kas satur DNS secību, pamatā tādu, kāda tā parādīta zlm. 4C, kura operatīvi saistīta ar ekspresiju regulējošo secību, un pēc tam atdala tādā veidā šūnās un vidē veidoto eritropoetīnu.
4. 4. Paņēmiens pēc punkta 2 vai 3, kas atšķiras ar to, ka saimniekšūnas ir zīdītāja šūnas.
5. 5. Paņēmiens pēc punkta 4, kas atšķiras ar to, ka zīdītāja šūnas ir šūnas 3T3.
6. 6. Paņēmiens pēc punkta 4, kas atšķiras ar to, ka zīdītāja šūnas ir Ķīnas kāmja olnīcu šūnas (CHO).
7. 7. pēc Pun^ta 4, kas atšķiras ar to, ka attiecīgā DNS secība ietilpst vektorā, kas satur arī vērša papilomas vīrusa DNS.