DE69230561T2

DE69230561T2 - Aus t-lymphozyten gewonnener hämatopoietischer wachstumsfaktor und verfahren zu seiner verwendung

Info

Publication number: DE69230561T2
Application number: DE69230561T
Authority: DE
Inventors: Chandra Choudhury
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-07-12
Filing date: 1992-07-07
Publication date: 2000-08-10
Anticipated expiration: 2012-07-08
Also published as: DE69230561D1; CA2113190A1; AU673333B2; EP0594764A1; WO1993000923A1; AU2347592A; ATE188738T1; EP0594764B1; JPH06508995A; EP0594764A4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Kolonie-stimulierende Faktoren und insbesondere betrifft sie Kolonie-stimulierende Faktoren, die aus T-Zellen stammen.

Hintergrund

Mediatoren der Proliferation und Differentiation für hämatopoetische Vorläuferzellen aller Linien sind häufig in dem selben konditionierten Medium vorhanden. Obwohl diese sezernierten Wachstumsfaktoren ähnliche Molekülmasse haben [gewöhnlich zwischen 25 Kilodaltons bis 35 ("Kd") und offensichtlich überlappende funktionelle Eigenschaften haben können, sind sie Produkte unterschiedlicher Gene.
Hämatopoetische Wachstumsfaktoren schließen Faktoren ein, die die Entwicklung bestimmter hämatopoetischer Zelllinien stimulieren: IL-3, das eine Multi-Linien-Aktivität hat; GM- CSF, der hauptsächlich Granulocyteri- und Makrophagen-Kolonie-Bildung stimuliert, obwohl er unter bestimmten Bedingungen auch Zellen aus megakaryocytischen Linien stimulieren kann; CSF-1, der nur Makrophagen-Kolonien stimuliert; und G-CSF, der nur Granulocyten- Kolonie-Bildung stimuliert. Keiner dieser Wachstumsfaktoren hat eine Molekülmasse ("MW"), die ungefähr 30 Kd überschreitet.
Hämatopoetische Wachstumsfaktoren können nützlich sein beim Behandeln von Patienten mit beeinträchtigter Immunität, einschließlich AIDS-Patienten und gewissem Typ von Krebs- Patienten. Entsprechend ist es wünschenswert, zusätzliche hämatopoetische Wachstumsfaktoren zu erhalten für existierende und neue Anwendungen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine gereinigte und isolierte menschliche Nukleinsäure bereit, die einen TC-CSF codiert mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, die umfaßt:
eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz von menschlicher SEQ ID NO:
7 oder SEQ ID NO: 8 codiert
ein Nukleotid, das unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement von irgendwelchen 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von einem Polynukleotid hybridisiert, das für die menschliche Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 codiert, und
eine menschliche Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement von beliebigen 20 Nukleotiden in der Nukleotidsequenz von Nukleotiden 1-225, wie angegeben in SEQ ID NO: 5, hybridisiert.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen Vektor bereit, einschließlich einer Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, und eine Zelle, vorzugsweise eine eukaryontische Zelle, die einen solchen Vektor einschließt oder die eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung an einem Ort oder in einer Vielzahl einschließt, an dem/in der sie nicht in der Natur vorkommt. Ein solcher Vektor kann der Eukaryontenzell-Vektor sein, der als ATCC- Hinterlegungsnr. 68824 am 28. Oktober 1999 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 hinterlegt worden ist. Andere Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung können prokaryontische oder eukaryontische Expressionsvektoren sein, einschließlich Baculovirus-Vektoren.
Die vorliegende Erfindung stellt ein ebenso ein isoliertes TC-CSF-Polypeptid bereit, das von der Nukleinsäure der Erfindung codiert wird. Der TC-CSF kann ein Expressionsprodukt von einer Zelle sein, die einen Vektor einschließt mit einer DNA, die für TC-CSF codiert, oder von einer Zelle, die eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung an einem Ort oder in einer Vielzahl einschließt, in der sie nicht in der Natur vorkommt. Das isolierte TC-CSF- Polypeptid kann weiterhin ein Verdünnungsmittel, ein Adjuvans oder Träger einschließen, wobei vorzugsweise das Verdünnungsmittel einen isotonischen Puffer oder Wasser mit pharmazeutischem Reinheitsgrad zur Injektion umfaßt, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden.
Das isolierte Polypeptid kann ebenso eine Markierung oder Reportergruppe einschließen oder kann an einen Träger gebunden sein. Das isolierte TC-CSF-Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit einem Träger und einem anti-TC-CSF-Antikörper in einem diagnostischen Kit für einen Immuntest verbunden sein.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung einen isolierten Liganden bereit, der spezifisch an einen TC-CSF bindet, wobei der Ligand ein TC-CSF-Rezeptor sein kann. Ein solcher TC- CSF-Rezeptor kann identifiziert werden unter Verwendung von markiertem TC-CSF gemäß der vorliegenden Erfindung und kann unter Verwendung von aufgereinigtem TC-CSF gemäß der vorliegenden Erfindung mit für Fachleuten gut bekannten Techniken isoliert werden. Alternativ kann der Ligand Serum oder ein isolierter monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein, der eine spezifische Immunreaktivität mit einem TC-CSF aufweist, insbesondere der eine spezifische Immunreaktivität mit einem Expressionsprodukt einer Zelle aufweist, die einen Vektor mit DNA, die für ein TC-CSF codiert, enthält, oder einer Zelle, die eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung an einem Ort oder in einer Vielzahl einschließt, an dem/in der sie nicht in der Natur vorkommt.
Ein aufgereinigtes und isoliertes Antigen wird gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, das immunologische Eigenschaften aufweist, so daß es spezifisch mit einem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper gegen einen TC-CSF reagiert, und die vorliegende Erfindung schließt ebenso eine immortalisierte Zelllinie ein, wie etwa ein Hybridoma, das einen monoklonalen Antikörper gegen einen TC-CSF produziert.
Ein Verfahren zum Reinigen von TC-CSF gemäß der vorliegenden Erfindung schließt die Schritte ein: Auftragen von Zellkulturüberstand, der einen TC-CSF enthält, auf eine Anionenaustauschsäule, und Sammeln einer Fraktion, die ein TC-CSF enthält, von der Anionenaustauschsäule, wobei insbesondere der Auftragungsschritt den Schritt des Einbringens von TC- CSF in eine Säule mit einer an einem Träger gebundenen quartären Ammoniumgruppe umfaßt. Das Aufreinigungsverfahren kann weiterhin die Schritte einschließen: Einbringen des TC-CSF in eine Gelfiltrationssäule und Zurückbehalten von Fraktionen, die TC-CSF umfassen. Das Aufreinigungsverfahren kann ebenso die Schritte einschließen: Konzentrieren des Eluats von der Anionenaustauschsäule; Einbringen einer TC-CSF-enthaltenden Lösung auf eine rpHPLC-Säule und Vereinigen von davon eluierten Fraktionen; und Dialysieren einer TC-CSF-enthaltenden Lösung.
Ein Verfahren zur Herstellung eines aus T-Zellen stammenden Kolonie-stimulierenden Faktors (TC-CSF) gemäß der vorliegenden Erfindung schließt den Schritt ein: Kultivieren eines Mediums, das mit Zellen angereichert ist, die ein Gen enthalten, das für TC-CSF codiert, un ter Bedingungen, die die Expression des Gens erlauben, und Isolieren von TC-CSF aus dem Medium oder den Zellen.
Ebenso Teil der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen TC-CSF einschließt, vorzugsweise einen humanen TC-CSF. Bevorzugt umfaßt eine solche Zusammensetzung einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie etwa isotonischen wässrigen Puffer oder Wasser mit pharmazeutischem Reinheitsgrad zur Injektion.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können in Übereinstimmung mit Standardprozeduren formuliert werden, die für die parenterale Verabreichung an Menschen angepaßt sind. Die Zusammensetzungen für intravenöse Verabreichung sind gewöhnlich Lösungen des sterilen Abkömmlings von sterilem isotonischem wässerigem Puffer. Wo notwendig, kann die Zusammensetzung auch ein löslichkeitsvermittelndes Agens einschließen. Die Zusammensetzung kann in Einheitsdosierungsform geliefert werden, wie etwa einem trockenen Pulver oder einem wasserfreien Konzentrat in einem versiegelten Behälter, wie etwa einer Ampulle. Zur Verabreichung durch Infusion kann die Zusammensetzung aus einer Infusionsflasche abgegeben werden, die steriles Wasser mit pharmazeutischem Reinheitsgrad zur Injektion enthält. Zur Verabreichung durch Injektion kann die Zusammensetzung aus einem Gefäß mit sterilem Wasser zur Injektion abgegeben werden. Die injizierbare oder infusierbare Zusammensetzung wird durch Mischen der Zutaten vor der Verabreichung zubereitet.
Die wirksame Menge an verabreichtem Komplex hängt von vielen Faktoren ab. Die genaue Dosis, die angewandt werden muß, und der Modus der Verabreichung kann gemäß den Umständen entschieden werden, wie sie von einem Arzt bestimmt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein anti-Idiotyp-Antikörper gegen einen TC-CSF aufgezogen werden. Ein solcher Antikörper kann anstelle eines TC-CSF für bestimmte Anwendungen verwendet werden.
Ebenso gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Immuntest einen TC-CSF oder TC-CSF- Liganden verwenden. Ein Hybridisationstest gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine TC-CSF-codierende oder nicht-codierende Sequenz oder eine dazu komplementäre Sequenz verwenden. Ein Primer-Verlängerungstest gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine TC- CSF-codierende oder nicht-codierende Sequenz oder eine dazu komplementäre Sequenz als Primer verwenden. Für Immuntests, Hybridisationstests und Primer-Verlängerungstests können die Bestandteile des Tests in Kit-Form bereitgestellt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen.

Fig. 1 ist eine Nukleotidsequenz, die für einen murinen TC-CSF bestimmt worden ist; und
Fig. 2 ist eine Nukleotidsequenz in umgekehrter komplementärer Form [d. h. die umgekehrte (3'-5')-Form des Komplements der codierenden Sequenz] für einen menschlichen TC-CSF.

Detaillierte Beschreibung

"Operabel verknüpft", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine strukturelle Verbindung, die erlaubt, daß die normale Funktion (wie von Fachleuten verstanden) der Bestandteile durchgeführt wird. So ist eine codierende Sequenz "operabel verknüpft" mit einer Kontrollsequenz, wenn sich die codierende Sequenz auf dem selben oder einem komplementären DNA- Strang befindet und ihre Transkription durch die Kontrolle dieser Sequenz beeinflußt wird.
"Exogene DNA", wie hierin verwendet, bezieht sich auf DNA in einer Wirtszelle, in der sie in der Natur nicht gefunden wird, oder unter der Kontrolle eines Promoters, an den sie in der Natur nicht operabel verknüpft ist, oder in einer Zahl von Kopien pro Zelle, die nicht in der Natur vorkommt.
Wie hierin verwendet, ist ein Medium "angereichert" mit einer Sorte Zellen, wenn es nur diese Zellsorte enthält oder einen höheren Anteil der Zellsorte relativ zu anderen Zellsorten im Medium enthält.
Wie hierin verwendet schließt der Begriff "Zelle" Nachkommenschaft ein. Damit schließen "transformierte Zellen" eine Zelle ein, die mit einem Vektor transformiert ist, und Zellen ein, die davon abgeleitet sind, ohne Rücksicht auf die Anzahl an Zellteilungen, auch wenn die Nachkommenschaft genetisch nicht identisch sein mag aufgrund von beabsichtigten oder unbeabsichtigten Mutationen.
"Expressionssystem" schließt hierin DNA ein, die für ein Polypeptid codiert, das exprimiert werden soll, die an DNA operabel verknüpft ist, die die Transkription der DNA-Sequenz kontrolliert, so daß ein Wirt, der mit einer solchen DNA transformiert ist, die codierten Polypeptide exprimiert. Das Expressionssystem schließt einen Vektor, genannt einen "Expressionsvektor", ein oder kann in das Wirtschromosom integriert sein.
"Post-translationale Modifikation", wie hierin verwendet, schließt Glykosylierung ein, kann aber ebenso Proteolyse, Phosphorylierung, Acylierung, Sulfatierung, γ-Carboxylierung oder β-Hydroxylierung mit einbeziehen.
Eingeschlossen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist ein TC-CSF, exprimiert in einer Zelle, einschließlich: TC-CSF mit der Glykosylierung und Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden TC-CSF; humaner TC-CSF und TC-CSF-Polypeptide anderer Tierarten, wie etwa boviner TC-CSF, pferdeartiger TC-CSF, schweineartiger TC-CSF, schafartiger TC-CSF, hundeartiger TC-CSF, muriner TC-CSF und katzenartiger TC-CSF, ohne Beschränkung darauf; deglykosylierte oder nicht-glykosylierte Formen von TC-CSF- Polypeptiden; und Analoga von TC-CSF, insbesondere immunologisch und biologisch aktive Analoga von TC-CSF.
"Analoga von TC-CSF" schließen zum Beispiel Deletionen oder Insertionen von oder Substitutionen von Resten innerhalb einer Aminosäuresequenz eines TC-CSF-Polypeptids ein, wobei wenigstens 18 aufeinanderfolgende Nukleotide in der Nukleotidsequenz oder 6 aufeinanderfolgende Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von TC-CSF beibehalten werden und wobei eine biologische oder immunologische Aktivität von TC-CSF und eine Gesamt- Aminosäure- und Nukleotidsequenz-Homologie von wenigstens 80% mit einem TC-CSF beibehalten werden. Kombinationen aus Deletion, Insertion und Substitution können ebenso gemacht werden, um bei einem End-Konstrukt anzukommen, vorausgesetzt, daß das End- Konstrukt eine TC-CSF-Aktivität besitzt. Eine TC-CSF-"Aktivität" kann eine immunologische Kreuzreaktivität mit natürlich vorkommendem TC-CSF sein oder kann eine biologische Aktivität (z. B. eine Kolonie-stimulierende Aktivität) von TC-CSF sein. Es wird bevorzugt, daß Mutationen, die an der für TC-CSF codierenden DNA gemacht werden, die Sequenz nicht aus dem Leseraster bringen, und es wird weiter bevorzugt, daß sie keine komplementären Regionen erschaffen, die mRNA-Sekundärstruktur erzeugen. Analoga schließen ebenso Polypeptide ein, die eine post-translationale Modifikation aufweisen, mit der sie nicht in der Natur vorkommen.
Analoga schließen aminoterminale und carboxy-terminale Fusionspeptide von einem Rest bis zu Polypeptiden beliebiger Länge, wobei das Analogon eine TC-CSF-Aktivität besitzt, sowie Insertionen von einem oder mehreren Aminosäureresten innerhalb des Polypeptids ein. Solchen Insertionen können beliebige Länge haben, die nicht verhindert, daß das Analogon eine TC-CSF-Aktivität besitzt, sind aber vorzugsweise eine Aminosäure hinsichtlich ihrer Länge.
Ein TC-CSF mit natürlicher Sequenz oder Analoga eines TC-CSF und Varianten eines TC- CSF können durch direkte chemische Synthese eines Polypeptids oder durch Expression von DNA hergestellt werden, die mit Hilfe von ortsgerichteter Mutagenese von TC-CSF-DNA oder durch chemische Synthese von Oligonukleotiden und Anordnung der Oligonukleotiden mit einer beliebigen von einer Vielzahl von Techniken vor der Expression in einer Wirtszelle erzeugt worden ist. [Siehe zum Beispiel Caruthers, US-Patent Nr. 4,500,707; Balland et al., Biochimie, 67 725-736 (1985); Edge et al., Nature, 292, 756-762 (1981)]. Boten-RNA, die für TC-CSF oder ein Analogon davon codiert, kann ebenso in vitro exprimiert werden. Veränderungen hinsichtlich der Aktivierungsniveaus werden mit einem geeigneten Test gemessen, wie etwa einem Test, der unten beschrieben ist. Modifikationen von solchen Proteineigenschaften, wie Redox- oder thermische Stabilität, Hydrophobie, Empfindlichkeit gegenüber proteolytischem Abbau oder der Tendenz, mit Trägern oder in Multimere zu aggregieren, werden durch Verfahren getestet, die für Fachleute auf dem Gebiet gut bekannt sind.
Prokaryontische Mikroorganismen (wie etwa Bakterien) und eukaryontische Mikroorganismen (wie etwa Hefe, CHO-Zellen oder Insektenzellen) können als Wirtszellen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. S. cerevisiae oder die gemeine Bäckerhefe, ist der am häufigsten verwendete der eukaryontischen Mikroorganismen, obwohl eine Anzahl an anderen Stämmen für gewöhnlich verfügbar sind. Zur Expression in Bakterien und Hefe sind Klonier- und Expressionsvektoren für Fachleute gut bekannt, wie etwa Lambda-Phage und pBR322 in E. coli und YRp7 in S. cerevisiae.
Zellen, die aus vielzelligen Eukaryonten stammen, können ebenso als Wirte verwendet werden. Zellen von Vertebraten- oder Invertebraten-Eukaryonten können verwendet werden, und Fachleute auf dem Gebiet kennen geeignete Expressionsvektoren zur Verwendung darin, wie etwa SV40-Vektoren für Säugetier-Wirtszellen (wie etwa CHO-Zellen), NPV-Vektoren (wie etwa Baculovirus-Vektoren) für Invertebraten-Wirtszellen und Ti-Vektoren für Pflanzenzellen.
Die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden in Übereinstimmung mit Standardprozeduren formuliert, die für eine parenterale Verabreichung an Menschen gemäß Techniken angepaßt werden müssen, die für Fachleute auf dem Gebiet bekannt sind.
Typischerweise sind die Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung Lösungen des sterilen TC-CSF in sterilem isotonischem wässerigen Puffer. Wo notwendig schließt die Zusammensetzung ebenso ein löslichkeitsvermittelndes Agens oder ein stabilisierendes oder Träger-Agens ein. Im allgemeinen wird die Zusammensetzung in Einheitsdosierungsform geliefert, z. B. als ein trockenes Pulver oder ein wasserfreies Konzentrat in einem versiegelten Behälter, wie etwa einer Ampulle. Zur Verabreichung durch Infusion kann die Zusammensetzung aus einer Infusionsflasche abgegeben werden, die steriles Wasser mit pharmazeutischem Reinheitsgrad zur Injektion enthält. Zur Verabreichung durch Injektion kann die Zusammensetzung aus einem Gefäß mit sterilem Wasser zur Injektion abgegeben werden. Die injizierbare oder infusierbare Zusammensetzung kann zubereitet werden durch Mischen der Inhaltsstoffe vor der Verabreichung.
Die wirksame Menge an verabreichtem TC-CSF wird von vielen Faktoren abhängen, einschließlich der Menge an erforderlichem TC-CSF und der Geschwindigkeit, mit der er benötigt wird.
Spezifischere Beschreibungen von Verfahren, Materialien und Produkten gemäß der vorliegenden Erfindung erscheinen in den folgenden Beispielen.

BEISPIEL 1

Verfahren zur Isolierung von TC-CSF

Ein TC-CSF kann hergestellt werden durch Stimulierung einer murinen T-Lymphocyten- Zelllinie, der EL-4-Zelllinie (erhältlich als Kultur Nr. ATCC TIB 181 von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri). Die Zellen können in RPMI-1640 (GIBCO, Grand Island, New York) wachsen gelassen werden, das 5% bovines Serumalbumin oder 5% fötales Kälberserum enthält, bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; in Luft. Zur Stimulierung mit PMA können die EL-4-Zellen bei 500 g für 10 Minuten zentrifugiert und dann in RPMI- 1640, 1% fötalem Kälberserum (FCS) (GIBCO) und 56 Einheiten/ml Penicillin (GIBCO) 56 ug/ml Streptomycin und 10 ug/ml Glutamin resuspendiert werden. Die Zellkonzentration wird dann auf 1 · 10&sup6; Zellen pro ml eingestellt. Das Volumen der Zellsuspension kann gemessen werden; und zu diesem Volumen kann eine berechnete Menge von PMA zugegeben werden, um eine endgültige Konzentration von 10 ng/ml PMA zu ergeben. Die Stimulierung wird bevorzugt in sterilen Glasbehältern mit näherungsweise 150 ml Zellsuspension in jedem Glasbehälter mit 500 ml Kapazität durchgeführt. Die Zellsuspension kann bei 37ºC für 2 Tage in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; in Luft inkubiert werden. Nach der Inkubation können die Zellen durch Zentrifugation bei 2000 rpm für 10 Minuten entfernt werden, und der Überstand, der den Wachstumsfaktor enthält, kann bei 4ºC gelagert werden.
Jedes restliche PMA im Überstand kann durch Behandlung mit aktiviertem Dextran durch das folgende Verfahren entfernt werden. Für jede 100 ml Überstand können 0,3 g Norit A Alkaline (Fisher, Pittsburgh, Pennsylvania) und 1,2 g Dextran T 10 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) in 200 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) plus 1% fötalem Kälberserum oder in 200 ml RPMI-1640 und 1% FCS suspendiert werden. Das Norit A und Dextran kann in der Hälfte des PBS gemischt werden, dann in Zentrifugenflaschen mit 200 ml Kapazität gegossen und bei 2000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert werden. Der Überstand wird verworfen, und das verbleibende PBS wird dem Norit A und Dextran zugegeben, die Prozedur wird wiederholt und der Überstand verworfen. Dann kann nach diesen zwei Waschungen mit Norit A und Dextran der Wachstumsfaktor-enthaltende Kulturüberstand dem Norit A plus Dextran zugegeben, vermischt und bei 2000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert werden. Der mit Wachstumsfaktor konditionierte Mediumsüberstand wird abgegossen und kann dann durch ein 0,45 u- Filter gefiltert werden, der von Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts erhältlich ist.

BEISPIEL 2

Biotest für TC-CSF

Die das hämatopoetische Wachstum stimulierende Aktivität eines konditionierten Mediums kann getestet werden unter Verwendung des Agar-Klon-Tests. Nach der Stimulation mit ei nem Wachstumsfaktor bilden hämatopoetische Vorläuferzellen Kolonien in den Agarkulturen. Hämatopoetische Zellen, die für den Biotest verwendet werden, können aus Knochenmark oder der Milz von Nagetieren stammen, wie etwa C57B1/6J-Mäuse.
Nach Euthanasie einer Maus wird der Femur herausseziert, und Knochenmarkszellen können mit RPMI-1640 unter Verwendung einer Spritze und Nadel herausgespültwerden. Die Zellen können durch Pipettieren dispergiert werden, und eine Einzelzell-Suspension kann hergestellt werden. Die Lebendzellzahlbestimmung kann durch Trypanblau-Ausschluß von Zellen, die in einem Hämocytometer gezählt werden, erhalten werden. Knochenmarkszellen können in 1 · 10&sup5; oder 5 · 10&sup4; Zellen pro Platte ausplattiert werden. Doppel- oder Tripel-Platten können angesetzt werden. Die Zellkulturen können in 0,3% Agar (Bactoagar, GIBCO) in Dulbecco's Medium (GIBCO) mit 20% Pferdeserum (GIBCO), das mit 56 Einheiten/ml Penizillin und 56 ug/ml Streptomycin supplementiert ist, angesetzt werden. TC-CSF-konditionierte Medien können bei 10% V/V zu den Agar-Kulturen zugegeben werden. Die Kulturen werden dann bei 37ºC für sieben Tage in einer Atmosphäre von 10% CO&sub2; in Luft inkubiert.

BEISPIEL 3

Bioaktivität von TC-CSF

Die Kolonien, die nach der Stimulation mit konditionierten Medien, die TC-CSF enthalten, gebildet worden sind, können mikroskopisch bei 40X Vergrößerung gezählt werden.
Kolonie-bildende Einheits-Kultur(CFU-C)-Kolonien enthielten 50 oder mehr Zellen.
Die Linienspezifität von CFU-C-Kolonien kann durch morphologische Beurteilung der Zellen, die jede Kolonie umfassen, bestimmt werden. Intakte Agar-Kulturen können auf Glas- Objektträgern dehydriert und auf Acetylcholinesterase gefärbt werden. Eine Gegenfärbung, die für Kerne verwendet werden kann, ist Methylgrün. Die Kolonien können dann mikroskopisch untersucht werden, die Kernkonfiguration, Zellform und -größe erlauben eine Unterscheidung zwischen den Zelllinien, wie etwa granulocytischen, mononuklearen, fibrocytischstromalen und megakaryocytischen Zellen. Zusätzlich färbt sich das megakaryocytische Cytoplasma aufgrund der Anwesenheit von Acetylcholinesterase braun. Cluster von drei oder mehreren Megakaryocyten können als eine Megakaryocytenkolonie repräsentierend angenommen werden.
TC-CSF-enthaltende konditionierte Medien, wie in der Prozedur von Beispiel 1 hergestellt, stimulieren die Bildung von näherungsweise 90 ± 20 CFU-C-Kolonien (Mittelwert ± 2 SD) und 20 ± 4 CFU-M (Megakaryocytenkolonien), pro 1 · 10&sup5; Knochenmarkszellen. Die morphologische Analyse der Kolonien offenbart, daß TC-CSF-erzeugte Kolonien zusammengesetzt sind aus: Granulocyten; Makrophagen, Megakaryocyten; Mischungen aus Granulocyten und Makrophagen; gemischte Kolonien, die im Vergleich mit den anderen Kolonien sehr groß waren, (gemischte Kolonien umfassen mehr als 150 Zelteinheiten, zusammengesetzt aus Granulocyten, Makrophagen und Megakaryocyten); und fibrocytischen stromalen Zellkolonien.

BEISPIEL 4

Isolierung von TC-CSF

Proteinfraktionen, die in den konditionierten Medien enthalten waren, welche wie bei dem Endprodukt aus Beispiel 1 abgeleitet waren, können durch Hochdruck- Flüssigchromatographie (HPLC) auf einer Anionenaustauschsäule DEAE-5PW, 7,5 mm X 7,5 cm getrennt werden, die von Waters Associates, Milford, Massachusettes erhältlich ist. Ein Phosphat-gepufferter Salzgradient kann zur Elution verwendet werden mit einem Gradientenbereich von 10 mM NaCl bis 1 M NaCl. Die Fraktionen können in einer Flußrate von 0,5 ml/min gesammelt werden, und dann kann jede Fraktion auf Kolonie-stimulierende Aktivität getestet werden, wie in Beispielen 2 und 3 beschrieben. Der Biotest auf Koloniestimulierende Aktivität der Fraktionen demonstrierte eine Spitzenaktivität bei einem 0,23 M NaCl-Gradienten. Es kann eine mehr als 90% Wiedergewinnung von Aktivität geben im Vergleich zu dem konditionierten Anfangsmedium. Die Aktivität des TC-CSF bei einem 0,23 M NaCl-Gradienten dient dazu, das TC-CSF-Molekül von Interleukin-3 (IL-3) zu unterscheiden, das ebenso hämatopoetische Kolonie-Bildung stimulieren kann, weil IL-3 nicht an DEAE bindet und durch eine DEAE-Säule vor den NaCl-Gradienten-Fraktionen läuft.
Das TC-CSF-Molekül kann von anderen Molekülen auf Grundlage der Größe des TC-CSF- Moleküls, erhalten mit Gelfiltration, getrennt werden. Eine Molekularsiebsäule Protein Pak 125 (Größenausschluß für natives globuläres Protein, 2.000 bis 80.000 Daltons), 7,8 mm · 30 cm, von Waters Associates kann mit HPLC mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min verwendet werden. Ein Spektrophotometer mit variabler Wellenlänge und ein Integrator/Aufzeichner können an den Detektor angehängt werden, der auf 280 nm eingestellt ist, um die Chromatogramme aufzuzeichnen und zu integrieren. Die Fraktionen können in PBS (pH 7,3) gesammelt werden und dann jede Fraktion auf Kolonie-stimulierende Faktoren getestet werden. Tests der Fraktionen zeigte, daß Aktivität in drei Fraktionen vorhanden war, und die entsprechenden Spitzen der optischen Dichte bei 280 nm zeigten die Anwesenheit von Protein in den aktiven Fraktionen an. Eine erste Fraktion entspricht einer Molekülmasse (MW) von 65 bis 70 Kilodaltons (Kd), in Übereinstimmung mit der in Spuren vorhandenen Menge an bovinem Serumalbumin und bovinem fötalem Albumin, das in den konditionierten Medien vorhanden war. Eine zweite Fraktion kann Spitzenaktivität haben und entspricht einem MW 50 bis 55 Kd. Eine dritte Fraktion mit minimaler Aktivität entspricht MW 25 bis 30 Kd.

BEISPIEL 5

Molekulargewicht, das durch elektrophoretische

Mobilität bestimmt wird

Die bioaktive zweite Fraktion, die nach der HPLC-Gelfiltration in Beispiel 4 erhalten worden war, und die nicht-getrennten, konditionierten Medien können weiter mit Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) analysiert werden. Entweder kann Polyacrylamid-Harnstoff- Gelelektrophorese bei pH 9, 9 in einem reduzierenden Puffer von 50 mM 2-Merkaptoethanol (2-ME) und 10 M Harnstoff oder SDS-PAGE in 0,3% SDS, 7,5% Acrylamid und 10 mM 2- ME in Glycerinpuffer verwendet werden. Die Proben können in 50 ul pro Spur mit Wachstumsfaktormedien oder mit von Pharmacia gekauften Molekulargewichtsmarkern laufen gelassen werden. Die Spuren, die mit Molekulargewichtsmarkern bzw. bestimmten Proben laufen gelassen werden, können mit Silberfärbung gefärbt werden, um das Proteinmolekül gemäß der elektrophoretischen Mobilität zu identifizieren. Der TC-CSF zeigt eine elektrophoretische Mobilität in PAGE unter reduzierenden Bedingungen entsprechend einem MW von ungefähr 55 Kd.
Eine Bestätigung der Bioaktivität in dem durch elektrophoretische Mobilität identifizierten Molekül kann erhalten werden, indem man Spuren, die die zu erforschende Probe enthalten, laufen läßt. Nach der Elektrophorese kann die gesamte Spur in 1 mm breite Abschnitte, ausgehend vom Kathoden-Ende und bis zum Anoden-Ende reichend, geschnitten werden. Das Protein von jedem 1 mm-Abschnitt kann in 1 ml PBS bei pH 7,2 eluiert und dann auf Kolonie-stimulierenden Faktor getestet werden. Angrenzende Spuren mit geeigneten Molekular gewichtsmarkern können gefärbt werden, um die elektrophoretische Mobilität des bioaktiven Moleküls zu bestimmen, was einem MW von ungefähr 55 Kd entsprach.
Nach dem Bioassay des aus dem Gel-Abschnitt stammenden Proteins kann eine Portion des Eluats auf SDS-PAGE wieder laufen gelassen werden und zeigt nach Färbung mit Silber- Färbung eine einzelne Proteinbande bei ungefähr 55 Kd. Somit kann eine Bestätigung erhalten werden, daß das bioaktive TC-CSF-Molekül ein MW von ungefähr 55 Kd hat, gezeigt durch die elektrophoretische Mobilität unter reduzierenden Bedingungen.

BEISPIEL 6

Proteingehalt und Potenz von TC-CSF

Der Proteingehalt der TC-CSF-enthaltenden Medien und der der Fraktionen kann durch eine Mikrotest-Prozedur gemessen werden.
Eine spektrophotometrische Analyse ist bei 595 nm möglich nach einer Reaktion mit einem Proteintest-Farbreagenz, das von Bio-Rad, Richmond, Californien erhältlich ist, und der Proteingehalt kann aus einer Standardkurve, die mit BSA hergestellt worden ist, bestimmt werden.
Nachdem der kleinste meßbare Proteingehalt geschätzt worden ist, können weitere Verdünnungen gemacht werden und der Proteingehalt berechnet werden. Tests der Verdünnungen der Fraktionen, die mit 10 bis 14 Nanogramm Protein korreliert waren, stimulieren 5 bis 8 CFU-C pro 1 · 10&sup5; Knochenmarkszellen. Dies entsprach einer Aktivität bei einer 1 bis 2 picomolaren Konzentration von TC-CSF, ein Anzeichen für die Potenz des Wachstumsfaktors.

BEISPIEL 7

Herstellung eines Antikörpers gegen einen TC-CSF und Tests

Tiere, wie etwa Balb/c-Mäuse oder Lewis-Ratten können durch intraperitoneale Injektion einer TC-CSF-enthaltenden Fraktion immunisiert werden, die nach HPLC-Säulentrennung wie in Beispiel 4 erhalten worden ist. Die Wachstumsfaktor-enthaltende Fraktion kann mit Freund'schem Adjuvans (ein Teil auf drei) kombiniert und in die Tiere injiziert werden, ge folgt von einer Booster-Dosis 4 Wochen später, wonach die Tiere geopfert und die Seren erhalten werden können.
In einem ELISA-Test kann die zweite, aus der HPLC stammende Fraktion aus Beispiel 4, die den TC-CSF enthielt, als Antigen verwendet und in Auftragungspuffer verdünnt werden, um eine Protein-Endkonzentration von ungefähr 0,5 ug/ml zu ergeben (der Auftragungspuffer wird hergestellt durch Auflösen von 0,795 g wasserfreiem Na&sub2;CO&sub3; und 1,466 g NaHCO&sub3; in 450 ml entionisiertem Wasser bei pH 9,6). Als nächstes kann 100 ul des verdünnten Antigens jedem Napf einer Mikro-ELISA-Platte (Corning) zugegeben werden, und dann können die Platten in einen abgedeckten Behälter bei 4ºC über Nacht eingebracht werden. Die Platten können dann entfernt und jeder Napfdreimal mit 200 ul PBS/Tween-20TM gewaschen werden (Stammlösung, hergestellt durch Zugabe von 1,5 ml Tween-20TM auf 1.000 ml PBS). Das Antikörper-enthaltende Serum wird 1 : 50 in PBS/Tween-20TM zugegeben, und 100 ul des verdünnten Antiserums kann den Näpfen zugegeben und für eine Stunde bei 37ºC inkubiert werden. Die Näpfe können dann dreimal gewaschen und 100 ul anti-Maus-IgG-alkalische- Phosphatase-Konjugat (Sigma), das 1 : 1.000 in Stamm-PBS/Tween-20TM verdünnt worden war, können jedem Napfzugegeben werden. Nach einer weiteren Stunde Inkubation bei 37ºC können die Näpfe dreimal gewaschen werden, und 100 ul Volumen Diethanolamin-Substrat (Sigma) kann in jeden Napfeingebracht werden. Eine positive Reaktion wird anhand von gelber Farbbildung innerhalb einer halben Stunde beobachtet, was eine spezifische Reaktion mit TC-CSF (Antigen) und Antikörper, enthalten in dem Serum, anzeigt. Nach der Zugabe des Antikörper-Serums in Verdünnungen von 1 : 1.000 wird ungefähr 56% der Koloniestimulierenden Aktivität der TC-CSF-Fraktion neutralisiert.
Seren aus immunisierten, Antikörper-produzierenden Tieren ergaben einen positiven Test, wenn sie gegen eine TC-CSF-enthaltende Fraktion mit der ELISA-Technik unter Verwendung von Reagenzien, die von Sigma Chemical Company erhalten worden waren, gescreent wurden. Kontrollseren aus nicht-injizierten Mäusen und denjenigen, denen nur Freund'sches Adjuvans injiziert worden war, ergaben einen negativen Test. Der Antikörper kann auf neutralisierende Aktivität in dem Biotest getestet werden, wobei der TC-CSF-enthaltende Wachstumsfaktor Kolonie-stimulierende Aktivität bereitstellt.
Bei einer Western-Blot-Analyse kann der HPLC-gelgefilterte TC-CSF der zweiten Fraktion aus Beispiel 4 auf SDS-PAGE-Elektrophorese laufen gelassen werden und kann dann in das Transblot-System gebracht werden (Hoeffer Scientific, San Francisco, Californien). Die Proteinbanden können dann auf ein Nitrozelluloseblatt transferiert werden, das dann für eine Stunde in einem Blockier-Puffer (Sigma) inkubiert werden kann. Antikörper kann dann zugegeben werden, und eine weitere Stunde Inkubation durchgeführt werden. Nach drei Waschungen kann anti-Maus-IgG-alkalische-Phosphatase-Konjugat (Sigma) zugegeben werden, und das Substrat Naphtol-As-Mx-Phosphat-Natriumsalz (Sigma) kann nach einer Stunde Inkubation und fünf Waschungen in PBS/Tween-20TM zugegeben werden. Eine positive Reaktion wird anhand der Immunfärbung mit Fast-Red-Substrat (Sigma) bestimmt. Die Proteinbanden in aneinander angrenzenden Spuren können durch Färbung auf Protein visualisiert werden, wie z. B. mit Amido Black.
Damit wird die Spezifität des Antikörpers gegen den TC-CSF ebenso in einer Western-Blot- Analyse beobachtet. Der Antikörper reagiert stark mit der Proteinbande bei 55 Kd. Eine Reaktion wurde ebenso mit den Banden bei 67 Kd und 65 Kd gesehen, die fötalem Kälberalbumin bzw. bovinem Serumalbumin entsprachen, wobei das Albumin ein Trägerprotein für die Wachstumsfaktormoleküle ist. Keine Reaktion wird mit Proteinen unterhalb von 55 Kd MW gesehen.
Die Antikörper-Seren können gegen IL-3 getestet werden, um auf Kreuzreaktivität zu untersuchen. Keine Neutralisierung von IL-3-Aktivität wird beobachtet. Dies dient dazu, TC-CSF von IL-3 zu unterscheiden.
Antikörper gegen ein TC-CSF können aus Serum aufgereinigt werden unter Verwendung von Techniken, die für Fachleute auf dem Gebiet gut bekannt sind und das Laufenlassen einer TC- CSF-Antikörper-enthaltenden Flüssigkeit über eine Säule einschließen, an die TC-CSF gebunden ist, wie etwa bspw. Material, das aus der aktiven zweiten Fraktion von Beispiel 4 stammt. Auf ähnliche Weise kann TC-CSF durch eine Prozedur aufgereinigt werden, die einen Schritt des Laufenlassens einer Flüssigkeit, die TC-CSF enthält, über eine Säule einschließt, an die anti-TC-CSF-Antikörper gebunden ist.

BEISPIEL 8

Wirkung anderer Antikörper auf TC-CSF

Spezifische Antikörper gegen mehrere Wachstumsfaktoren, die mit der Hämatopoese im Zusammenhang gebracht werden, können gegen den TC-CSF-Wachstumsfaktor getestet werden, um eine Neutralisierung zu bestimmen, unter Verwendung des Agar-Klon-Tests, wie in Beispiel 2 und 3 beschrieben. Einige dieser Antikörper sind gegen IL-3, GM-CSF, BSF-1 und den IL-2-Rezeptor gerichtet. Monoklonale Antikörper können in einer 1 : 1-Verdünnung mit der TC-CSF-Wachstumsfaktor-Fraktion und Tierseren, die Antikörper in einer Verdünnung von 1 : 500 enthalten, getestet werden. Die Spezifität der Antikörper und damit ihre Fähigkeit, die jeweiligen Wachstumsfaktoren oder Rezeptor zu neutralisieren, ist früher festgestellt worden. [Siehe z. B. anti-IL-2-Rezeptoren-Antikörper 3C7 und 7D4, Ortega et al., J. Immunol., 133, 1970 (1984); Malek et al., J. Immunol., 133, 1976 (1984); anti-muriner rekombinanter GM-CSF, Mochizuki et al., J. Immunol., 136, 3706 (1986); für anti-IL-3, monoklonalen Antikörper 19B3.1, Abrams et al., J. Immunol., 140, 131 (1988); anti-BSF-1, monoklonaler Antikörper 11B11, Ohara et al., Nature, 315, 333 (1985).] Keine neutralisierende Aktivität durch diese Antikörper für den TC-CSF wird beobachtet. Dieses Resultat veranschaulicht, daß der TC-CSF von diesen anderen Wachstumsfaktoren unterschiedlich ist.

BEISPIEL 9

Aminosäure-Zusammensetzung von TC-CSF

Die Aminosäure-Zusammensetzung einer TC-CSF-Probe kann auf die folgende Weise erzeugt werden. Nach der Gelelektrophorese wie in Beispiel 5 kann ein TC-CSF-enthaltendes Gel auf eine PVDF-Blot-Membran bei 90 Volt für 24 Minuten geblottet werden. Die TC- CSF-Proteinbande kann durch Färben mit Coomassie-Blau identifiziert und die Bande ausgeschnitten und in einem Waters Pico Tag Aminosäure-Analysesystem verwendet werden. Das Verfahren beinhaltet Hydrolyse und Prä-Säulen-Derivatisierung der Probe, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC. Es beruht auf der Anwendung der Phenylisothiocyanat (PITC)-Chemie, die von Edman zur Sequenzierung aminoterminaler Reste von Proteinen entwickelt worden war, unter Verwendung von PITC als ein Markierungsreagens bei der Prä-Säulen- Derivatisierung von Protein- und Peptid-Hydrolysaten. Das folgende Protokoll kann verwendet werden: 1) Sammle und Trockne die Proben; 2) Hydrolyse bei 110ºC für 24 Stunden; 3) Trockne die Probe weiter; 4) Derivatisierung; 5) Flüssigchromatographie und 6) Datenanalyse.
Ein Beispiel der erzeugten Daten wird in Tabelle 1 gegeben. Es sollte beachtet werden, daß bei dieser Bestimmung der prozentuale Anteil der Probeninjektion im Endvolumen 50% ist. Die Aminosäuren Tryptophan und Cystein werden während der Säurehydrolyse zerstört. TABELLE 1
Die Aminosäure-Zusammensetzungsdaten unterstützen die in anderen Beispielen berichteten Resultate, was anzeigt, daß der TC-CSF ein MW von ungefähr 55 Kd hat und von anderen bekannten hämatopoetischen Wachstumsfaktoren unterschiedlich ist.

BEISPIEL 10

Aminosäureseguenzierung

Ein Applied Biosystem Sequenzierer (Applied Biosystems, Foster City, Californien) automatisiert die Bestimmung von Aminosäuresequenzen von Proteinen. Eine Probe kann auf die folgende Weise hergestellt werden. Nach Gelelektrophorese wie in Beispiel 5 kann das Gel auf eine PVDF-Blot-Membran bei 90 Volt für 24 Minuten gebloftet werden. Die TC-CSF- Proteinbande kann durch Färben mit Coomassie-Blau identifiziert und die Bande ausgeschnitten und auf eine Säule des Sequenzierers zum Sequenzieren gemäß der vom Hersteller empfohlenen Prozedur gebracht werden. Das Kontrollgerät des Sequenzierers kann dann die chromatographischen Daten sammeln und analysieren, um die Information zu interpretieren.
Die Interpretation von chromatographischen Daten vom Aminosäuresequenzieren von TC- CSF legte eine aminoterminale Restsequenz von SEQ ID NO: 3 nahe.

BEISPIEL 11

Unterscheidung von TC-CSF von anderen bekannten hämatopoetischen Wachstumsfaktoren

Ein Wachstumsfaktor TC-CSF gemäß der vorliegenden Erfindung hat ein MW von 55 Kd und eine Multi-Linien-Aktivität. Wie oben bemerkt, hat keiner der IL-3, GM-CSF, CSF-1 und G-CSF ein MW, das 30 Kd überschreitet. Die Aktivität dieses Wachstumsfaktors wird nicht durch spezifische Antikörper gegen IL-3, GM-CSF, BSF-1 und anti-IL-2-Rezeptor inhibiert. Ein Vergleich der Proteinkonformation und der Aminosäureverteilung ist mit Albumin, CSF- 1, GM-CSF und IL-3 durchgeführt worden mit keiner Demonstration von Homologie.
Weiterhin ist eine partielle Sequenz des TC-CSF mit Albumin, CSF-I, GM-CSF, G-CSF, IL- 3, BSF-1, BSF-2, IL-6 und Neuroleukin verglichen worden, mit keiner Demonstration einer richtigen Homologie. Neuroleukin wurde eingeschlossen, weil es ein T-Zell-Lymphokin ist, das ein MW von 56 Kd hat, obwohl keine hämatopoetische Wachstumsfaktoraktivität von diesem Molekül gezeigt worden ist.
Die partielle Sequenz von TC-CSF wurde mit einer Datenbank, die über eine Million Reste in 4749 Sequenzen umfaßt, verglichen. Die höchsten Punktzahlen wurden mit dem Hüllprotein des Bakteriophagen q-be, Fibronektin und viralem Polyprotein erhalten. Dies legt nahe, daß TC-CSF einige Ähnlichkeit mit diesen Proteinen haben kann, aber nicht mit ihnen identisch ist. Es dient ebenso dazu, TC-CSF weiter von anderen bekannten Wachstumsfaktoren zu unterscheiden, die mit der Hämatopoese im Zusammenhang gebracht werden können.

BEISPIEL 12

Konstruktion von TC-CSF-Oligonukleotiden

Oligonukleotide, die für Teile von TC-CSF Oligonukleotiden codieren, können unter Verwendung der obigen Aminosäuresequenz durch die Prozedur von Caruthers, US-Patent Nr. 4,415,732 synthetisiert werden, und Desoxyribonukleinsäure- und Ribonukleinsäure-Sonden und -Primer zur ortsgerichteten Mutagenese (z. B. zur Verwendung bei einem Polymerase- Kettenreaktions-Test oder -Amplifizierungsprozedur) können durch in vitro-Transkription der Oligonukleotide gemacht werden.
Plasmide, die DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung einschließen, können mit einem radioaktiven Isotop oder mit einer nicht-radioaktiven chemischen Markierung markiert und als Sonden verwendet werden. Solche Plasmide können ebenso verwendet werden, um die markierten RNA-Sonden zu synthetisieren. Die markierten Sonden können verwendet werden, um das Vorhandensein von homologen DNA-Sequenzen und/oder mRNA- Sequenzen, die von diesen DNA-Sequenzen codiert werden, in Zellen irgendeiner Spezies z. B. durch die Southern- oder Northern-Hybridisierungs-Prozedur oder durch Dot-Blot oder Slot-Blot-Hybridisierung oder durch in situ-Hybridisierungs-Techniken nachzuweisen. Stringente Hybridisierungsbedingungen für Hybridisierungstests gemäß der vorliegenden Erfindung können allgemein als Reaktionen definiert werden, die funktionell äquivalent zu einer Hybridisierung sind, die in 4 · SSC und 0,5% SDS bei einer Temperatur von 65ºC bei der letzten Waschung durchgeführt wird.
Nichtstringente Hybridisierungsbedingungen zum Identifizieren von für TC-CSF codierende DNA durch Screenen von Zellbibliotheken können durch Prinzipien bestimmt werden, die für Fachleute auf dem Gebiet des Klonierens von homologen Genen bekannt sind.
Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung können an Kügelchen gebunden sein oder können zur Verwendung in Tests mit Verfahren markiert werden, die von Fachleuten auf dem Gebiet gut verstanden werden.

BEISPIEL 13

TC-CSF-Peptide und Antikörper dazu

Peptide, die unterschiedlichen Teilen von TC-CSF-Proteinen entsprechen, vorzugsweise 12- 20 Aminosäuren-Reste lang, können durch Festphasen-Verfahren chemisch synthetisiert werden. Alle TC-CSF-Polypeptide oder Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um spezifische polyklonale und monoklonale Antikörper auszulösen [Lerner, Nature, 299, 592-596 (1982); Niman et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80, 4949-4953 (1983)]. Die Aminosäuresequenz von TC-CSF erleichtert das Design immunogener Peptide entsprechend geeigneten immunogenetischen Regionen, die gemäß Verfahren bestimmt werden können, die für Fachleute auf dem Gebiet gut bekannt sind [siehe z. B. Novotny et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 83, 226-230 (1986) und Van Regenmortel, Trends Biochem. Sci., 11, 36-39 (1986)].

BEISPIEL 14

Rekombinante Expression von TC-CSF

Vollständige und partielle TC-CSF-Genprodukte und Analoga können in Bakterien, Hefe oder Säugetier-Expressionssystemen exprimiert werden, die erhalten worden sind unter Verwendung von Produkten auf der Grundlage von Aminosäuresequenzen, die aus isoliertem TC- CSF gemäß der vorliegenden Erfindung hergeleitet worden sind, durch Einführen der DNA, die für TC-CSF codiert, in einen Expressionsvektor, z. B. ein Plasmid, Phagen oder viralen Expressionsvektor [Vieira et al., Gene, 19, 259-268 (1982); Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80, 1194-1198 (1983); Bittner et al., Gene, 32, 263-274 (1984); Cepko et al., Cell, 37, 1053-1062 (1984); und Groman et al., Mol. Cell. Biol., 2, 1044-1051 (1982)].
Die exprimierten Proteine oder Polypeptide können aufgereinigt werden, z. B. in Beispiel 4, und verwendet werden, um spezifische Antikörper zu ziehen (ein Epitop, das ungefähr 6 oder mehr Aminosäuren, wie sie durch 18 bzw. mehr Nukleotide codiert werden), oder als Liganden für Antikörper, wie sie in einem Immuntest angewandt werden können.

BEISPIEL 1 S

Sonden und Screenen auf einen TC-CSF-Klon

Oligonukleotide, die für Teile von TC-CSF codieren, wurden synthetisiert unter Verwendung einer partiellen Aminosäuresequenz von TC-CSF, dargestellt in SEQ ID NO: 4, die aus erneutem Sequenzieren von TC-CSF und der Interpretation der Resultate davon hergeleitet worden war.
Die cDNA-Bibliothek wurde aus murinen T-Lymphocyten, der EL4-Zelllinie, in dem Lambda-Zap 11-Vektor konstruiert, der das Bluescript-Plasmid enthielt [Bullock et al., Biotechniques, 5, 376-379 (1987)]. Die cDNA-Bibliothek wurde vom kommerziellen Verkäufer dieses Produkts erworben (Maus EL4-cDNA-Bibliothek, Produkt Nr. 936303, Stratagene Kloning Systems, La Jolla, CA). Der Primer für die Bibliothek war Oligo-(dT), die durchschnittliche Insert-Größe 1,0 Kb und die Klonierstelle EcoRI. Die Anzahl an primären Plaques war 2,0 · 10&sup6; mit einem geschätzten Titer 4,0 · 10&sup9;/ml. Der Wirtsstamm, der zum Screenen und zur Amplifizierung in der Stratagene-Produktliteratur empfohlen wird, war XL 1-Blue.
Mit der Prozedur von Caruthers, US-Patent No. 4,415,732, wurde eine 17-mer-Sonde mit 64 Permutationen konstruiert. Die TC-CSF-Oligonukleotide wurden mit radioaktivem Phosphor (P³²) markiert und als Sonden verwendet, um die cDNA-Bibliothek zu screenen, die aus EL4- Zellen im Lambda-Bakteriophagenvektor stammte. Um die Spezifität der Oligonukleotide für cDNA in der Bibliothek festzusetzen, wurden nicht-markierte Oligonukleotide als Primer bei der Polymerase-Kettenreaktion und zur in vitro-Transkription von dem Primer verwendet. Die Target-DNA waren 8,1 · 10&sup8; Lambda-Bakteriophagen-Klone, die cDNA von der EL4- Zelllinie enthielten. Die Primer für die PCR waren (i) das Oligonukleotid und (ii) entweder der T3- oder T7-RNA-Polymerase-Promoter für den Lambda-Bakteriophagen. Die Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) wurden bei Sättigungsbedingungen (200 mikromolar für jedes dNTP) und Taq DNA-Polymerase (Perkin Elmer Cetus N801-0046) in näherungsweise 2 Einheiten verwendet, um eine typische Amplifizierungsreaktion zu katalysieren. Das Zyklusprofil für eine Amplifizierungsreaktion kann sein: Denaturierung bei 94ºC für eine Minute; Annealing bei 50ºC für 1 Minute; und Polymerisierung 72ºC für 2 Minuten für 30 Zyklen, und dann kann der Unterschied im letzten Zyklus sein, daß die Polymerisierung bei 72ºC auf 5 Minuten ausgedehnt wird. Ein Aliquot (10u1) des Reaktionsgemisches wurde 1%- iger Agarose-Gelelektrophorese unterworfen und ergab ein Hauptamplifizierungsprodukt von näherungsweise 800 Basenpaaren Größe. Dies zeigte, daß die Oligonukleotide spezifisch waren für die Target-DNA, die in den 8,0 · 10&sup8; g Lambda-Bakteriophagen-Klonen enthalten war, die cDNA aus EL4-Zellen enthielten. Der nächste Schritt war, Aliquots kleinerer Bibliotheken zu screenen, um den Klon zu identifizieren.
Ein anfängliches PCR-Filter-Screening wurde durchgeführt. Insgesamt wurden sechs Filter hergestellt, wobei jeder 1 · 10&sup6; Plaque-bildende Einheiten enthielt. Zubereitungen von jedem dieser Filter wurden amplifiziert unter Verwendung der Oligonukleotide, die von der Aminosäuresequenz von TC-CSF wie oben konstruiert worden waren. Ein Haupt-PCR-Produkt von näherungsweise 800 Basenpaaren Größe wurde gesehen, und eine Anzahl diskreter Produkte im Bereich von näherungsweise 250 bis 1.000 Basenpaaren wurden beobachtet. Deshalb wurden die PCR-Produkte durch Southern-Hybridisierung bewertet. Das amplifizierte Material von den Filtern wurde einer Elektrophorese auf einem 1, 2% Agarosegel unterworfen und Kapillar-geblottet auf eine Nylon-Membran. Die geblottete DNA wurde mit radioaktiv markierten Oligonukleotiden hybridisiert. Sogar unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisierte die 800 Basenpaar-Hauptbande an die markierten Oligonukleotide. Wobei die Bedingungen einer Hybridisierung äquivalent waren, die bei 4 X SSC und 0,5% SDS bei einer Temperatur von 65ºC bei der letzten Waschung durchgeführt wurde. Dies zeigte an, daß die Oligonukleotide spezifisch an die DNA hybridisierten, die in den 1 · 10&sup6; Plaques auf dem Filter enthalten war.
Als nächstes wurde eine Plaque-Hybridisierung durchgeführt. Insgesamt 10 Filter, von denen jeder immobilisiertes Protein aus 5 · 10&sup4; Pfu enthielt, wurden mit dem P³²-markierten Oligonukloetid hybridisiert. Eine erfolgreiche Hybridisierung wurde durch Autoradiographie festgestellt. Unter Bedingungen niedrigerer Stringenz wurden sechs vermeintliche positive Klone identifiziert. Unter Bedingungen hoher Stringenz war ein Klon stark positiv. Die Pfu auf der Sonde, die dem immobilisierten positiven Klon auf dem Filter entsprach, wurde gepickt und in E. coli-XL1-Blue-Zellen expandiert.
Der Lambda Zap 11-Vektor (Stratagene) ermöglicht das in vivo-Subklonieren des klonierten Inserts, das in dem Bluescript-Plasmid innerhalb des Lambda-Vektors enthalten war, um ein Phagemid zu bilden, das das klonierte Insert enthielt. Die Methodologie war wie in den technischen Handbüchern von Stratagene und der Produktliteratur. Der R408 Helferphage und XLI-Blue-Zellen (Stratagene) wurden verwendet, um das klonierte DNA-Insert erfolgreich auszuschneiden. Das naszierende Insert, das den Phagemid enthielt, wurde aus den E. coli sezerniert durch Pili aufgrund von Signalen, die innerhalb der f1-Terminator-Ursprung-DNA- Sequenz enthalten waren. Nach der Sezernierung des Phagemid, der gegenüber Hitzebehandlung resistent war, wurden die E. coli-Zellen von dem Überstand entfernt durch Erhitzen bei 70ºC. Miniprep-DNA wurde durch Transfektion der frischen E. coli gemacht. Die DNA, stammend aus Zubereitungen dieser Kolonien, wurde zur Analyse und Sequenzierung des Inserts verwendet.
Das Insert, das zwischen den T3- und T7-RNA-Polymerase-Promotern enthalten war, wurde entnommen und auf einem 1% Agarosegel analysiert. Die Größe des Inserts war näherungsweise 2,3 Kb. Alle passenden Kontrollen und Marker wurden für die Analyse verwendet. Eine gute Ausbeute an klonierter DNA wurde mit dem Helfer-Phagen R408 (Stratagene) erhalten und zur Didesoxynukleotidsequenzierung verwendet. Nach der Lyse mit Alkali fand die Gewinnung und Aufreinigung entweder durch Fraktionierung in Agarosegelen mit niedriger Schmelztemperatur oder durch Gleichgewichtszentrifugation in Cäsiumchlorid- Ethidiumbromid-Gradienten statt. Die DNA wurde markiert unter Verwendung von [S³&sup5;]- dATP-Markierungsmischung und mit dem Restriktionsenzym EcoRI zum Sequenzieren ausgeschnitten.

BEISPIEL 16

Seguenzierung des TC-CSF-Klons

Das Verfahren, das zum DNA-Sequenzieren verwendet wurde, war die enzymatische Methode nach Sanger et al., (Proc. Natl., Acad. Sci., 74, 5463 (1977). Taq-DNA-Polymerase, AmpliTaqTM (Perkin Elmer Cetus) wurde für die Kettenextensions- und Kettenterminationsreaktionsmischungen, zusammen mit Lösungen von dNTPs und ddNTPs verwendet. Denaturierende Polyacrylamidsequenziergele wurden laufen gelassen und nach Autoradiographie der Sequenziergele gelesen. Einheitliche Bandenintensitäten wurden beobachtet bei den Sequen zierungsleitern für 257 Nukleotidsequenzen am 5'-Ende und 234 Nukleotidsequenzen am 3'- Ende. Die Nukleotidsequenz mit der entsprechenden Aminosäuresequenz für murinen TC- CSF wird in SEQ ID NO: 1 angegeben. Verifizierung und Bestätigung der Spezifität der Sequenz für murinen TC-CSF wurde durchgeführt durch Isolieren und Sequenzieren einiger anderer Klone, die mit der Oligonukleotidsonde schwach positiv unter weniger stringenten Bedingungen waren, und einiger negativer Klone. Keine Homologie wurde identifiziert mit der Sequenz dieser anderen Klone mit der der Sequenz der Oligonukleotidsonde.
Die Sequenz von murinem TC-CSF wurde mit Sequenzen anderer bekannter Wachstumsfaktormoleküle verglichen, und keine wirkliche Homologie wurde demonstriert mit anderen Wachstumsfaktormolekülen. Nur vier Aminosäuren in der Sequenz bei TC-CSF stimmten mit vier Aminosäuren in murinem IL-3 überein. Diese waren Lys-Ser-Asn-Leu in der Position 71- 74 bei TC-CSF und in der Position 97-101 bei IL-3. Jedoch war die Nukleotidsequenz für diese vier Aminosäuren bei den zwei Molekülen vollkommen unterschiedlich.
Es wird geglaubt, daß SEQ ID NO: 1 eine Nukleotidsequenz eines partiellen Klons ist, dahingehend, daß die ersten elf Nukleotide Teil einer Restriktionsstelle sind. Entsprechend wird in SEQ ID NO: 2 eine Aminosäuresequenz präsentiert, die aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 abgeleitet ist, die mit Pro-Leu als zweitem und drittem Rest (wie von vorherigem Nukleotidsequenzieren in einem T7-Vektor erhalten) und einem Anfangs-Met (wie beim Aminosäuresequenzieren erhalten) supplementiert war. Stopcodons vor der Position 1662 von SEQ ID NO: 1 sind als unbekannte Reste (d. h. "Xaa") in SEQ ID NO: 2 identifiziert worden auf der Grundlage, daß die Aminosäurezusammensetzungsdaten anzeigen, daß die Länge eines Maus-TC-CSF näherungsweise 554 Aminosäuren ist und daß deshalb Stopcodons vor der Position 1662 Mutationen oder Sequenzierfehler repräsentieren. Ein Fachmann kann SEQ ID NO: 2 ergänzen nach Betrachtung der Wiederholungsaminosäuresequenz-Daten des folgenden Beispiels.

BEISPIEL 17

Wiederholtes Aminosäuresequenzieren

Ein wiederholtes Aminosäuresequenzieren führte zur Identifizierung von 45 Aminosäuren vom aminoterminalen Ende, wie in Tabelle 2 offenbart.

Tabelle 2

1. Met
2. Pro
3. Leu oder Glu
4. Leu
5. Cys oder Gly oder Tyr
6. Ala
7. Ser
8. Gly oder Glu
9. Asp
10. Thr
11. Pro
12. Met
13. Pro
14. Glu
15. Asn oder Lys
16. Leu
17. Asp oder Glu
18. Tyr
19. Thr
20. Phe
21. Tyr
22. Glu oder Ser
23. Glu
24. Leu
25. Tyr oder Pro
26. Phe
27. Cys oder Ser
28. Pro oder Ile
29. Ile
30. Leu oder Phe oder Tyr
31. Ser oder Tyr
32. Ser oder Phe oder Ile
33. Ile
34. Tyr oder Ser
35. Phe
36. Ser
37. Ile
38. Ser
39. Ser oder Ile
40. Ile
41. Phe
42. Ser
43. Tyr
44. Gly oder Tyr oder Lys
45. Lys
Ein Vergleich der Nukleotidsequenz mit Aminosäuren 1-45 vom Aminoterminus zeigt, daß es ein Anfangs-Met vor dem Pro gibt.
Aminosäure Nr. 12 codiert für ein Met, wobei die Nukleotidsequenz GTG ist. Dies kann entweder für Met oder Val codieren.
Aminosäure Nr. 42 ist Serin; die Nukleotidsequenz ist TAA, eine Ochre-Mutation.
Aminosäure Nr. 43 ist Tyr; die Nukleotidsequenz ist TAG, eine Amber-Mutation.

BEISPIEL 18

Anti-Idiotyp-Antikörper gegen TC-CSF

Anti-Idiotyp-Antikörper können aus Antikörpern gemacht werden, die gegen eine beliebige Spezies TC-CSF aufgezogen worden sind, wie für Antikörper gegen Maus-TC-CSF oben beschrieben wurde. Siehe z. B. Kennedy et al., Scientific American, 48-56 (Juli 1986); Jerne, Scientific American, 52-60 (Juli 1973); Marx, Science, 228, 162-165 (1985); Finberg et al., CRC Critical Reviews in Immunology, 7, 269-284 (1987); und Kennedy et al., Science, 232, 220-223 (1986).

BEISPIEL 19

Screening auf den humanen TC-CSF-Klon

Das Exprimieren des klonierten humanen Gens, das erhalten worden ist durch Verwendung der Aminosäure-, Nukleotidsequenzen oder hierin offenbarten Antikörpern, erlaubt den Gebrauch von TC-CSF durch Patienten mit einer ansonsten tödlichen Krankheit. Schritte zum Klonieren des humanen Gens werden wie folgt beschrieben. Partielle Homologie wurde zwischen dem klonierten murinen Gen und genomischer DNA aus einer humanen Jurkat-T- Lymphocyten-Zelllinie durch Southern-Hybridisierung nachgewiesen. Eine cDNA-Bibliothek wurde aus der humanen Jurkat-T-Lymphocyten-Zelllinie in einem Lambda-Bakteriophagen- Vektor konstruiert. Markierte Sonden auf der Grundlage des murinen Gens wurden verwendet, um die Bibliothek zu screenen.
Obwohl das murine Gen als Sonde verwendet wurde, können Fragmente des Gens oder Oligonukleotide, die aus der murinen Gensequenz synthetisiert worden sind, als Sonden oder als Primer in einer Polymerase-Kettenreaktion mit Target-DNA verwendet werden, die aus humanen T-Lymphocyten stammt. Die Amplifizierungsprodukte können markiert und als Sonden verwendet werden, um die Bibliothek zu screenen, oder sequenziert werden, um das Vorhandensein von homologen DNA-Sequenzen zwischen Spezies nachzuweisen. Auf der Grundlage dieser Sequenzen können Oligonukleotidsonden synthetisiert werden, um die humane Bibliothek zu screenen.
Insbesondere wurde das klonierte Insert, das das Gen für murinen TC-CSF enthielt, mit P³² markiert und als eine Sonde verwendet, um die humane T-Zell-Bibliothek auf das humane TC-CSF-Gen zu screenen.
Die cDNA-Bibliothek wurde aus humanen T-Lymphocyten, der Jurkat-Zelllinie, in dem Lambda Zap 11-Vektor konstruiert, der das Bluescript Plasmid enthielt. Die cDNA- Bibliothek wurde vom kommerziellen Verkäufer dieses Produktes erworben (humane Jurkat cDNA-Bibliothek, Produkt Nr. 936204, Stratagene Kloning Systems, La Jolla, Californien). Der Primer für die Bibliothek war Oligo-(dT), durchschnittliche Insertgröße 0,8 kb. Der Restriktionsenzym-Verdau der Klonierstelle war EcoRI. Die Anzahl an primären Plaques war 2,0 · 10&sup6;, mit einem geschätzten Titer von 2,0 · 10¹&sup0;/ml. Der Wirtsstamm, der zum Screenen und zur Amplifizierung empfohlen wird, war XL1-Blue E. coli.
Plaque-Hybridisierung wurde mit insgesamt 30 Filtern durchgeführt, wobei jeder immobilisiertes Protein aus 5 · 10&sup4; Plaque-bildenden Einheiten enthielt. Erfolgreiche Hybridisierung wurde mit Autoradiographie nachgewiesen. Sogar unter niedrigen Stringenzbedingungen wurde nur ein positiver Klon identifiziert. Nach Bestätigung bei höher Stringenz wurde der Klon gepickt und expandiert. Das in vivo-Subklonieren, Ausschneiden und Erhalt des Inserts wurde wie in den technischen Handbüchern von Stratagene durchgeführt, wie in Beispiel 15 für das murine Gen beschrieben.
Die Größe des Inserts war näherungsweise 800 Basen. Miniprep-DNA wurde erzeugt nach Alkali-Lyse; Erhalt und Aufreinigung entweder durch Fraktionierung in Agarosegelen mit niedriger Schmelztemperatur oder durch Gleichgewichtszentrifugation in Cäsiumchlorid- Ethidiumbromid-Gradienten. Die DNA wurde mit einem S³&sup5;dATP-Markierungsgemisch markiert und mit Restriktionsenzym EcoRI für das Didesoxynukleotidsequenzieren geschnitten.
Die cDNA für TC-CSF wurde in den Helferphagen M13 kloniert und mit dem Sanger- Verfahren sequenziert, wie vorher beschrieben. Die gesamte Nukleotidsequenz für die cDNA des TC-CSF ist analysiert worden, und potentielle Initiationscodons sind identifiziert worden.
Aus der Nukleotidsequenz und der codierten Aminosäuresequenz ist es offensichtlich, daß das gesamte Gen kloniert worden ist, und daß der TC-CSF ein monocistronisches Produkt ist.

BEISPIEL 20

Sequenzieren des humanen TC-CSF-Klons und Homologie mit murinem TC-CSF-Klon

Das Verfahren, das zum DNA-Sequenzieren verwendet wurde, war das enzymatische Verfahren von Sanger et al., wie in Beispiel 16 beschrieben. Die Nukleotidsequenz und eine abgeleitete Aminosäuresequenz für humanen TC-CSF wird in SEQ ID NO: 5 gegeben, Stopcodons (wie durch ein Sternchen "*", in SEQ ID NO: 5 angezeigt), können aus Sequenzierfehlern, Kontaminierung oder Sequenzieren von komplementärer DNA resultieren, die aus mRNA gebildet wird, wie unten beschrieben. Ein vorläufiges Expressionsprodukt von ungefähr 110 Aminosäuren Länge kann dem offenen Leserahmen zwischen Position 133 und 540 entsprechen. Fig. 2 ist eine Darstellung des reversen Komplements der codierenden Region.
Homologie mit dem murinen TC-CSF wurde bestimmt und ist in Tabelle 3 angegeben, wobei Aminosäuren, die sowohl bei Maus als auch humanem TC-CSF identisch sind, durch ein Sternchen oberhalb der humanen Sequenz angezeigt sind. TABELLE 3 Seguenzvergleich von humanen und murinen homologen Regionen
In Tabelle 3 ist die humane Sequenz für TC-CSF auf Homologie-Übereinstimmung mit der murinen TC-CSF-Sequenz gebracht worden. Die homologe Region in der humanen Sequenz war 100 Basen, ausgehend von Nukleotidsequenz Nr. 81 bis 177. In der murinen Sequenz überspannte die Region 310 Basen von Nukleotidsequenz Nr. 840 bis 1150. Innerhalb dieser Region von 310 Basen in der murinen Sequenz gab es einen Homologie-Bruch von 210 Basen von Nukleotidsequenz Nr. 865 bis 1076. Zwischen muriner Sequenz Nr. 1100 bis 1105 gab es einen Bruch von zwei Aminosäuren, bezeichnet durch zwei Balken (diese waren T und E), verglichen mit einer Aminosäure in der humanen Sequenz. Zwischen Sequenz Nr. 1121 bis 1132 gab es einen Bruch von vier Aminosäuren, bezeichnet durch vier Balken (diese waren F; T; V; S), verglichen mit zwei Aminosäuren in der humanen Sequenz. Homologe Aminosäuren wurden durch ein Sternchen oberhalb der humanen Sequenz angezeigt. Jede homologe Region machte näherungsweise 15% der DNA-Sequenz in den jeweiligen Gen-Inserts aus.
Eine Homologie zwischen der Sequenz des humanen Gens und murinen Gens wurde über einige Regionen in den zwei Gen-Inserts konzentriert gesehen. Diese homologe Region war zwischen Nukleotidsequenzen 81 bis 180 in der humanen DNA-Sequenz und zwischen Nukleotiden 840 bis 1150 in der murinen DNA-Sequenz. Die 100 Nukleotide, enthalten in dieser Region im humanen Gen, und die 310 Nukleotide, enthalten in der Region, die im murinen Gen Homologie zeigte, machen näherungsweise 15% jeder DNA-Sequenz in den jeweiligen Gen-Inserts aus. Die größere Spanne in der murinen Sequenz, die der humanen DNA-Sequenz homolog ist, kann so gesehen werden, daß sie durch Regionen von dazwischen liegenden Sequenzen verursacht ist, die gewöhnlich in mRNA nicht-transkribiert sind und in der murinen DNA-Sequenz und Kern-RNA vorhanden sind.
Es ist bekannt, daß hämatopoetische Wachstumsfaktoren, wie etwa GM-CSF und IL-3, zwei verschiedene mRNAs mit auffallenden strukturellen Ähnlichkeiten haben. Splicing der heterogenen Kern-RNA (hnRNA) resultiert in mRNA verschiedener Längen. Die VorläuferhnRNA codiert für das selbe Protein wie die kurze mRNA, jedoch ist sie länger aufgrund der zusätzlichen Peptide an der aminoterminalen Domäne, die durch die zusätzlichen Sequenzen an der 5'-Region codiert werden. Die hnRNA kann mehr als ein AUG-Initiationscodon haben, jedoch ist demonstriert worden, daß in vitro-Translation am ersten AUG in Vorzug zum zweiten oder dritten anfängt. Weiterhin ist bekannt, daß in 95% der eukaryontischen mRNAs die Translation am AUG-Codon am nächsten zum 5'-Ende der mRNA beginnt. (Kozak, Nucleic Acid Res., 12, 857 (1984)). In DNA-Bibliotheken, gemacht aus RNA, die hnRNA enthält, kann die Sequenz dazwischen liegende Sequenzen einschließen, die nicht in cDNA- Bibliotheken eingeschlossen sind, welche aus mRNA gemacht worden sind.
Es kann in Erwägung gezogen werden, daß der murine TC-CSF, der in vitro durch PMA- Stimulierung der EL-4-Zellen gebildet worden ist, TC-CSF enthalten kann, der aus hnRNA synthetisiert worden ist, die die zusätzlichen 5'-Reste hat. Oligonukleotidsonden, konstruiert anhand der Aminosäuresequenz der aminoterminalen Domäne des Proteins, können auf einen hnRNA-abgeleiteten DNA-Klon selektionieren. Restriktionsenzymverdau mit EcoRI des Plasmids, das den murinen Klon enthielt, ergab nur ein einzelnes Fragment, das 2,6 kb lang war, übereinstimmend damit, daß dies eine einzelne Insertion an der Klonierungsstelle war.
Das markierte murine Insert, das verwendet wurde, um die humane Bibliothek zu screenen, kann den Klon selektionieren, in dem transkribierte homologe Regionen vorhanden waren. Wodurch vorzugsweise der homologe mRNA-abgeleitete cDNA-Klon aus der humanen Bibliothek selektioniert wurde. Dies erklärte die geringere Insertgröße von 800 Basen des humanen Klons mit dem "Ziehharmonika-artigen" Effekt auf die homologe Region, im Vergleich mit der murinen DNA-Sequenz. Ein weiteres Anzeichen, daß die Transkriptionsregion für mRNA im murinen Gen näherungsweise 800 Basen sein kann, war von dem in vitro- Transkriptionsprodukt von 800 Basen in der PCR, beschrieben in Beispiel 14, offensichtlich. Polymerase-Kettenreaktionen mit einem verankerten Primer für Sequenzen an der 5'-Region des murinen Gens, mit zweiten Primern, jeder aus Sequenzen in einer variierenden Distanz vom 3'-Ende, einschließlich Vektor-Sequenzen, die die Insertionssstelle flankieren, ergaben alle in Reaktionen mit dem murinen Insert in vitro-Transkriptionsprodukte von näherungsweise 800 Basen.
Eine vollständige Aminosäuresequenz für das klonierte humane TC-CSF-Insert wird in SEQ ID NO: 6 bereitgestellt. In SEQ ID NO: 6 sind Codons, angezeigt als Stopcodons in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5. als unbekannte Aminosäuren identifiziert ("Xaa").
Die Nukleotidsequenz von murinem und humanem TC-CSF sind von der Sequenz von allen anderen bekannten Wachstumsfaktoren unterschiedlich. Damit sind murine und humane Gene für einen neuen Wachstumsfaktor kloniert worden.

BEISPIEL 21

TC-CSF-Tests

TC-CSF gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Gegenstand von Immuntests, Hybridisierungstests und Primer-Verlängerungstests, wie etwa die unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") sein. Solche Tests können verwendet werden, um das Vorhandensein, den Ort oder Menge eines TC-CSF nachzuweisen. Durch Bestimmen des Vorhandenseins oder der Menge eines TC-CSF wird die Diagnose von Bedingungen erleichtert, die durch eine Insuffizienz oder einen Überschuß von TC-CSF charakterisiert sind. Auf ähnliche Weise kann eine Behandlung mit TC-CSF überwacht werden hinsichtlich dem Erreichen oder der Aufrechterhaltung einer erwünschten Konzentration von TC-CSF.
Wenigstens ein Mitglied eines TC-CSF-Antigen/Antikörper-Komplexes kann an ein Signalmolekül geknüpft sein, das einen Nachweis oder quantitative Analyse ermöglicht. Polyklonale oder monoklonale Antikörper oder eine Mischung davon können in einem TC-CSF- Immuntest verwendet werden, ebenso wie einzelkettige Antikörper, Antikörper-Fragmente (einschließlich Fab-Fragmente), dabs und mabs.
Das Format von TC-CSF-Immuntests kann einseitig oder zweiseitig sein ("Sandwich"). Sandwich-TC-CSF-Tests können z. B. einschrittige Tests oder zweischrittige Tests sein.
Solche Tests können in der Form eines Kits hergestellt werden, der einen Antikörper gegen einen TC-CSF und/oder TC-CSF, lyophilisiert oder in Lösung, in getrennten Flaschen enthält. Entweder kann ein TC-CSF oder ein Antikörper dagegen markiert sein. Ein fester Träger kann an entweder einen TC-CSF oder einen Antikörper dazu verknüpft sein.
Für Hybridisierungstests können Sonden in der Form eines Kits hergestellt werden. Behälter, einschließlich einer Nukleotidsonde, die in ihrer Sequenz zu einem TC-CSF-Polynukleotid komplementär ist (codierender oder komplementärer Strang), können markiert sein und können in Lösung oder in lyophilisierter Form hergestellt werden. Eine solche Sonde kann an einen Träger gebunden sein, oder ein TC-CSF-Polynukleotid kann an einen Träger gebunden sein. Eine Sonde oder ein TC-CSF-Polynukleotid kann an ein Signal- oder ein Reportermolekül gebunden sein.
PCR- oder andere Primer-Verlängerungssonden für TC-CSF-Tests können codierende oder komplementäre TC-CSF-Polynukleotide sein, wie oben beschrieben. Solche Polynukleotide können in lyophilisierter Form in einem Kit verpackt sein.

BEISPIEL 22

Produkte der in vitro-Transkription und -Translation

Weitergehende Charakterisierung der murinen und humanen Gen-Inserts wurde durch in vitro-Transkription und -Translation erhalten. Ein RNA-Transkriptionskit (Stratagene, Katalog # 200340) wurde verwendet. Der RNA-Transkriptionskit erhält die Polymerasen, Puffer und Ribonukleotide, die zur in vitro-Synthese von RNA-Transkripten aus Vektoren notwendig sind, die T3- oder T7-Promotoren enthalten, wie von Fachleuten gut verstanden wird. Die erzeugten RNA-Transkripte wurden mit einem in vitro-Translationskit translatiert (Stratagene, Katalog # 200360) in einem eukaryontischen Kaninchen-Retikulocyten-Lysat, einer zellfreien Umgebung zum Translatieren exogener mRNA in Proteine. Die exogene Nachricht, die dem Lysat zugegeben worden ist, wurde in Anwesenheit von ³&sup5;S-Methionin translatiert, das in die neu synthetisierten Proteine eingebaut wurde. Die Prozeduren gemäß den technischen Handbüchern von Stratagene, die den Kits beilagen, wurden befolgt. Die exprimierten Proteine wurden elektrophoresiert auf einem SDS-Polyacrylamidgel mit geeigneten Kontrollen. Die ³&sup5;S-markierten Proteine wurden durch Fluorographie sichtbar gemacht. Das Gel wurde in Amplify eingeweicht (Amersham, Arlington Heights, Illinois, Katalog # NAMP-100), mit 2% Glycerin für 30 Minuten und getrocknet. Autoradiographie wurde in Kodak- Entwicklungskassetten unter Verwendung von Kodak XAR-5-Film durchgeführt (Kodak, Rochester, New York).
Das murine Genprodukt wies eine elektrophoretische Mobilität von 20 bis 23 kd auf Das humane Genprodukt wurde bei näherungsweise 11 bis 13 kd beobachtet.

BEISPIEL 23

Prokaryontische Expression der humanen und murinen Gene

Das murine und das humane Gen wurden in einem prokaryontischen Expressionssystem exprimiert. Beide Gene wurden in das pBluescript-Plasmid kloniert, wie zuvor im Detail beschrieben. Beide Inserts können aus dem pBluescript-Plasmid durch die Klonierungsstellen- Restriktionsendonuklease EcoRI freigesetzt werden. Eine vollständige Vektorkarte ist von Stratagene erhältlich. Restriktionsendonukleasen-Analyse der zwei Inserts wurde anfänglich durchgeführt, um die Restriktionsstellen zu bestimmen, die innerhalb der Gensequenzen vorhanden sind. Es wurde nach Restriktionsenzymverdau und Elektrophorese der Produkte auf 1% Agarosegelen festgestellt, daß die Restriktionsendonukleasen EcoRI, SaII und BamHI nicht innerhalb der murinen und humanen Gen-Inserts verdauen. Dies Enzyme können deshalb mit kompatiblen Stellen in der Polyklonierungsregion von anderen Vektoren verwendet werden, um die Inserts in geeignete Expressionsvektoren zu klonieren. Eine einzige XbaI- Stelle ist in dem murinen Gen vorhanden, die 0,7 Kb- und 1,8 Kb-Produkte nach dem Verdau mit XbaI ergab. Die Möglichkeit wurde in Betracht gezogen, daß Stern-Aktivität (nichtspezifischer Verdau) mit Xbalt auf dem humanen Gen-Insert gesehen werden kann, und daß Stern-Aktivität bei HindIII* an sowohl den murinen als auch humanen Gen-Inserts gesehen werden kann, und deshalb wurden diese Enzyme für Subklonierungsexperimente nicht verwendet.
Prokaryontische Expression der murinen bzw. humanen Genen produziert rekombinantes Protein, wenn in einen von mehreren verschiedenen Expressionsvektoren einkloniert wurde. Dies schließt das pGEM-4Z-Plasmid (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, Katalog # p2161) ein, einen Vektor, der die Synthese in vitro von RNA-Transkripten ermöglicht. Dieser Vektor enthält duale, gegenüberliegende SP6- und T7-Promotoren die eine vielfache Klonierungsstelle flankieren, und ermöglicht es, daß RNA von jedem Strang des Inserts transkribiert wird.
Der Vektor erlaubt eine blauweiß-Farbselektion auf Rekombinanten, aufgrund seiner Eigenschaft, daß er eine Sequenz enthält, die für das lac-alpha-Peptid codiert, welches dadurch, daß es das Produkt des lac Z Δ M15-Gen der Wirtszelle komplementiert, zur Produktion funktioneller β-Galaktosidase führt. Bakterielle Kolonien mit dem lac Z-Gen und ebenso einen pGEM-42-Vektor enthaltend waren blau in der Farbe, wenn sie auf Indikatormedien ausplattiert wurden, die IPTG und X-gal enthalten. Wenn jedoch das lac-alpha-Peptid zerstört war, durch Klonierung in die pGEM-42 multiple Klonierungsregion, fand Komplementation nicht statt, und keine β-Galactosidase-Aktivität wurde erzeugt. Deshalb waren bakterielle Kolonien, die rekombinante pGEM-42-Vektorkonstrukte beherbergten, weiß.
Eine vollständige Vektorkarte des pGEM-42-Plasmids wird von Promega zur Verfügung gestellt. Die murinen und humanen Gen-Inserts können aus dem pBluescript-Plasmid nach Verdau mit EcoRI und Isolierung in Agar mit Niedrigtemperatur-Schmelzpunkt entnommen werden. Der pGEM-42-Vektor kann zum Subklonieren durch Verdau mit EcoRI hergestellt werden, um kompatible Enden zum Klonieren der Gene zu erzeugen. Die Standardmethodologie war wie in Molecular Kloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Laboratory Press, 2. Auflage (1989). Anweisungen oder Bedingungen, die in der begleitenden Produktliteratur zitiert wurden, wurden befolgt.
Die Vektor-DNA wurde mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIAP) (Promega Katalog # M1821) behandelt, um die 5'-Phosphatgruppen zu entfernen und Rezirkularisierung des Vektors während der Ligation zu verhindern. Nach Inkubation mit CIAP für 60 Minuten bei 37ºC wurde die Reaktion gestoppt mit 0,5 M EDTA, das CIAP und Restriktionsenzym wurde entfernt, und die DNA wurde aufgereinigt durch Phenolextraktion und Ethanolfällung vor der Ligation. Das optimale Verhältnis zur Ligation der murinen und humanen Inserts an die Vektor-DNA wurde als 1 : 1 für das murine Insert bzw. 3 : 1 für das humane Insert bestimmt. Die Ligationsreaktionen wurden mit dem passenden Verhältnis von Insert- zu Vektor- DNA angesetzt, z. B. 1 ug Insert-DNA mit 1 ug Vektor-DNA für ein 1 : 1-Verhältnis; und 1 ug Insert-DNA mit 0,3 ug Vektor-DNA für das 3 : 1 Verhältnis, wobei: T4 DNA-Ligase (Promega Katalog #M1801), 1 Weiss-Einheit pro Reaktion; Ligase 10X Puffer, 1 ul pro Reaktion; und entionisiertes Wasser, zugegeben, um das Endvolumen auf 10 ul zu bringen. Die Ligationsreaktionsmischungen wurden bei 25ºC für 1 Stunde inkubiert.
Nach der Ligation wurden die Plasmide, die die murinen bzw. humanen Gen-Konstrukte enthielten, verwendet, um kompetente E. coli des JM 109 Stammes (Promega) zu transformieren, Transformation wurde mit DMSO induziert, und Inkubation wurde auf Eis für 30 Minuten durchgeführt. Die resultierenden E. coli mit rekombinanten Konstrukten wurden durch weiße Färbung selektioniert, nachdem sie auf Indikatormedien, die IPTG und X-gal enthälten, ausplattiert worden waren. Die nicht-rekombinanten Bakterien waren blau.
Das rekombinante Protein wurde exprimiert, indem man die ausgewählten E. coli in LB- Medium für 24 Stunden wachsen ließ und dann IPTG auf eine Endkonzentration von näherungsweise 0,5 mM zugab. Die Kultur wurde inkubiert für 3 bis 4 Stunden oder über Nacht, um die Ausbeute an exprimiertem Protein zu erhöhen.
Nach der Zentrifugation war lösliches Protein im Überstand vorhanden. Intrazelluläres Protein kann von dem bakteriellen Pellet durch Resuspension in Puffer extrahiert werden (z. B. 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 2 mM EDTA, 0,1 M NaCl und Lysozym auf eine Endkonzentration von 100 ug/ml). Nach der Inkubation bei 30ºC für 15 Minuten kann die Probe zentrifugiert werden, um den Überstand zu sammeln, der löslich gemachtes Protein enthält. Das Protein kann dann Studien mit SDS-PAGE, Fraktionierung und in vitro-Tests zur weiteren Charakterisierung unterzogen werden.
Prokaryontische Expression kann ebenso erreicht werden durch Klonieren der murinen und humanen Gen-Inserts in den pPL-Lambda thermoinduzierbaren Expressionsvektor (Pharmacia, Piscataway, New Jersey, Katalog # 27-4946-010). Der Phagen-abgeleitete PL- Promoter-Vektor kann zur Produktion und Erzeugung regulierter Transkription verwendet werden. Jedoch können Plasmide, die den PL-Promoter tragen, aufgrund des hohen Transkriptionsniveaus instabil sein. Dieses Problem der Instabilität kann überwunden werden durch Unterdrückung der PL-Transkription unter Verwendung von bakteriellen Wirten, die eine integrierte Kopie eines Teils des Phagengenoms enthalten. Wie z. B. in E. coli-Stamm N 99 cI+(Pharmacia), der ein K-12-Lambda-Lysogen ist. Dieser Stamm enthält den Wildtyp cI+-Lambda-Repressor und kann zu bequemem Wachstum von entweder modifiziertem oder nicht-modifiziertem pPL-Lambda verwendet werden. Der Wirtsstamm, der zur thermoinduzierbaren Proteinexpression für pPL-Lambda verwendet wurde, war E. coli N4830-1 (Pharmacia). Dieser Stamm trägt den temperaturempfindlichen cl 857-Lambda-Repressor und die N-Gene. Die N-Expression stellt sicher, daß die Transkription die gesamte PL- Transkriptionseinheit durchläuft. Eine vollständige Vektorkarte ist von Pharmacia erhältlich. Behandlung der EcoRI-Klonierstelle des Vektors kann kompatible Enden mit EcoRI-Verdau und Erhalt der murinen bzw. humanen Gen-Inserts erzeugen. Der Vektor trug ein Ampicillin- Resistenzgen, das verwendet werden kann zur Selektion von transformierten E. coli, die Vektoren mit Konstrukten tragen. Eine Standard-Methodologie wurde verwendet, wie zuvor beschrieben. Die E. coli, die den Vektor tragen, können bei niedriger Temperatur (28ºC - 30ºC) auf eine hohe Dichte wachsen gelassen werden ohne Expression des klonierten Gens und anschließend induziert werden, um das Produkt bei hoher Temperatur (42ºC) zu synthetisieren. Das lösliche Protein kann geerntet und zur weiteren Charakterisierung verwendet werden.

BEISPIEL 24

Eukaryontische Expression der humanen und murinen Gene

Eukaryontische Expression der murinen und humanen Gen-Inserts produziert authentisches rekombinantes Protein, wenn in einen von mehreren verschiedenen Expressionsvektoren einkloniert. Dies schließt den pSV2-neo und darauffolgende Transfektion von Säugetierzelllinien ein.
Der Vektor pSV2-neo (ATCC 37149) ist ein Expressionsvektor, der regulatorische Sequenzen, abgeleitet von SV40, trägt, während das meiste der codierenden Region des viralen Genoms fehlt. Nach Transfektion in Säugetierzellen wird fremde DNA, die in diese Vektoren einkloniert ist, vorübergehend exprimiert, jedoch werden keine viralen Partikel produziert. Der Vektor trägt Ampicillin-Resistenz- und Neomycin-Resistenz-Gene und stellt dominante selektionierbare Marker für die Resistenz gegenüber Antibiotikum G418 in Säugetierzelllinien bereit. Eine Vektorkarte von pSV2-neo wurde durch die American Type Culture Collection bereitgestellt und offenbarte, daß er eine einzige EcoRI-Restriktionsendonukleasestelle in pSV2neo enthielt, die mit der EcoRI-Stelle der pBluescript-Klonierungsstelle kompatibel war, die die murinen bzw. humanen Gen-Inserts enthielt.
TC-CSF-Gen-Inserts und der Vektor können durch Verdau mit EcoRl hergestellt werden, wobei Rezirkularisierung der Vektor-DNA durch CIAP verhindert wird, wie zuvor beschrieben wurde. Nach der Ligation hatten die Hälfte der Plasmide die Inserts in der richtigen Orientierung.
Die rekombinanten Plasmide wurden im E. coli-Stamm HB 101 (ATCC 33694) durch Selektion auf Ampicillinresistenz expandiert. Plasmid-DNA wurde durch Alkali-Denaturierung gewonnen und aufgereinigt mit einem Ethidiumbromid-Cäsiumchlorid-Dichtegradienten. Die aufgereinigte Plasmid-DNA wurde verwendet, um CHO-Zellen durch Calciumphosphatvermittelte Transformation zu transfizieren, um die Fremd-DNA in die kultivierten CHO- Zellen einzuführen. Es wurde darauf geachtet, den pH zwischen 7,2 und 7,28 zu halten. Der pH des Transformationspuffers war genau 7,12. Kulturen wurden bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 bis 7% CO&sub2; in Luft gehalten.
Erfolgreiche Transformanten wuchsen in selektiven Medien, unter Anwendung einer Selektion auf 6418-Resistenz. Klone erschienen in 10 bis 12 Tagen und wurden isoliert und expandiert. Die Expansion kann in nicht-selektiven Medien gemacht werden. Der Überstand, der das rekombinante Protein enthielt, wurde in 72-stilndigen Intervallen für sechs Tage geerntet. Insgesamt wurde eine aseptische Technik verwendet. Der Überstand wurde bei 4ºC gelagert und zur weiteren Charakterisierung verwendet.

BEISPIEL 25

Charakterisierung der humanen und murinen Genprodukte

Proben der Genprodukte aus prokaryontischer und eukaryontischer Expression können mit SDS-PAGE bei 0,1% SDS und 16% Acrylamid laufen gelassen werden. Proben von Schein- Überständen, aus Zellen stammend, die mit Vektoren ohne Konstrukte transformiert worden waren, wurden mit geeigneten Molekulargewichtsmarkern in jeweils angrenzenden Spuren laufen gelassen. Einzelne Proteinbanden können gesehen werden, die die Expression von rekombinantem Protein bei 11 bis 14 kd für das humane Genprodukt und 20 bis 24 Kd für das murine Genprodukt anzeigen.
Die elektrophoretische Mobilität und angezeigten MW-Eigenschaften können variieren, abhängig von: der Länge der RNA-Transkripte, die durch die Gen-Inserts codiert wird; posttranslationalen Modifikationen, denen das Produkt unterzogen werden kann abhängig vom verwendeten Expressionsystem; und ob das exprimierte Protein ein Fusionsprotein oder Nicht-Fusionsprotein ist. Obwohl Expressionsvektoren ausgewählt werden können, von denen angenommen wird, daß sie Nicht-Fusionsproteine produzieren, kann nichtsdestotrotz ein Gen im Raster mit einem offenen-Leserahmen einer Leader-Sequenz inseriert werden, der einzigartig für den Vektor ist. Dies kann zur Expression eines rekombinanten Proteins führen, das mit einem kleinen Teil eines Proteins fusioniert ist, das durch die Leadersequenz codiert wird. Dieses Produkt kann eine unterschiedliche elektrophoretische Mobilität und MW haben im Vergleich mit dem authentischen Protein, das durch in vitro-Transkription und -Translation des Gens alleine produziert wird.
Die rekombinanten Proteine wurden in Klon-Tests verwendet, um Kolonie-stimulierende Aktivität auf hämatopoetische Zellen zu bestimmen. Artspezifische Vorläuferzellen wurden ver wendet, weil die Kolonie-stimulierende Aktivität gewöhnlich artspezifisch ist, um die Testresultate zu quantifizieren.
Murine Knochenmarkszellen wurde aus C57B1- oder Balb C-Mäusen entnommen und in Agar-Klon-Tests verwendet, wie zuvor beschrieben. Das murine Genprodukt, wenn es für Kolonie-stimulierende Aktivität verwendet wurde, ergab bei 10% v/v in einer 1 ml Agar-Kultur näherungsweise 6 bis 10 CFU-C mit 1 · 10&sup5; Knochenmarkszellen. Die spezifische Proteinkonzentration war näherungsweise 1 Nanogramm pro ml. Kontrollkulturen ohne Koloniestimulierende Aktivität ergab kein Wachstum.
Menschliche Vorläuferzellen wurden aus Knochenmark oder peripheren Blutproben oder normalen freiwilligen Spendern entnommen. Es wird davon ausgegangen, daß die Vorteile von Vorläuferzellen, die aus peripherem Blut abgeleitet sind, Leichtigkeit des Zugangs und sehr spezifische Unterscheidung der Vorläuferzellproliferation und -differentiation in vitro sind. Zum Beispiel werden Zellen wie Megakaryocyten nicht in peripherem Blut gesehen und deshalb zeigt die Anwesenheit solcher Zellcluster in in vitro-Kulturen aus aus peripherem Blut stammenden Vorläuferzellen Proliferation und Differentiation in vitro aus der Vorläuferzelle an. Blutproben wurden in Heparin von normalen Freiwilligen gesammelt, die nicht unter Medikation standen. Die mononukleare Zellfraktion aus peripherem Blut (PBMC) wurde durch Ernten der Leukocyten- und Thrombocyten-Schicht mittels Sedimentation und dann durch Ficoll-Hypaque (Ficoll-Paque®, Pharmacia, Katalog # 17-0840-02) und für den Test verwendet. Jeder Test verwendete ein 1 ml Plasmagerinnsel, zusammengesetzt aus: 10% v/v von der Zellfraktion; 0,02 mg L-Asparagin; Kolonie-stimulierende Aktivität; bzw. 4 Einheiten Thrombin. Alpha-Medium (GIBCO), supplementiert mit 10% humanem Serum, wurde auf 0,5 ml (50% v/v) zugegeben. Humanes Serum wurde von einem normalen freiwilligen Spender entnommen, bei dem zuvor untersucht worden war, daß er negativ hinsichtlich blutübertragener Infektionen war, und der niemals Bluttransfusionen empfangen hatte. Spender vom Blutgruppentyp AB wurden verwendet, so daß es keine natürlich vorkommenden Antikörper gab, die den Test stören oder beeinflussen können. Das Gemisch wurde ausplattiert und Gerinnselbildung induziert durch Zugabe von 0,1 ml von bovinem citriertem Plasma. Die Kulturen wurden bei 37ºC in einer voll befeuchteten Atmosphäre von 5 bis 7% CO&sub2; in Luft für 12 Tage inkubiert. Die Kulturen wurden dann mikroskopisch bei 40 · Vergrößerung auf CFU-C bewertet. Das humane Genprodukt ergab näherungsweise 3 bis 8 CFU-C mit 1 · 10&sup5; PBMC aus Medium, das näherungsweise 1 Nanogramm pro ml an spezifischem Protein enthielt.
Kontrollkulturen ohne Kolonie-stimulierende Aktivität aus Schein-Überständen ergaben kein Wachstum.

BEISPIEL 26

Baculovirus-Expression der humanen und murinen Gene

Eukaryontische Genexpression kann auch unter Verwendung des Max BacTM-Baculovirus- Expressionsvektor-Systems, zur Expression von Fremdgenen auf hohem Niveau, erreicht werden. Wie in der Produktliteratur und "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures", Summers et al., Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555, detailliert ausgeführt, ist das Autoaranha Californica Kern- Polyhidrosevirus (AcMNPV) das Prototyp-Virus der Familie Baculoviridae. Während einer AcMNPV-Infektion werden zwei Typen viraler Nachkommenschaft produziert; extrazelluläre Viruspartikel und verschlossene Virus-Partikel. Diese verschlossenen viralen Partikel, die in polyedrisches Protein eingebettet sind, werden Polyeder genannt. Das Polyeder-Protein hat ein Molekulargewicht von 29 Kd und kann bis zu sehr hohen Konzentrationen akkumulieren. Das Polyeder-Gen ist nicht-essentiell für die Infektion oder Replikation des Virus in Gewebekultur. Eine Inaktivierung des Polyeder-Gens führt zur Produktion von Verschluß-negativen Plaques, was ein einfaches Mittel darstellt, um auf rekombinante Viren zu screenen, in denen das Wildtyp-AcMNPV-Polyeder-Gen durch ein gewähltes Hybridgen ersetzt worden ist.
Mehrere Transfer-Plasmide sind erhältlich (Invitrogen Corporation, San Diego, Californien, Katalog # K822-03). Diese schließen Funktionsvektoren mit der natürlichen Polyeder-Leader- Sequenz, wie etwa pAc 360, Fusionsvektoren ohne die natürliche Polyeder-Leader-Sequenz, wie etwa 700, 701 und 702, die sich in dem Leseraster unterscheiden; nicht-Fusionsvektoren, die die entgegengesetzte Orientierung haben und ebenso die natürliche Leader-Sequenz haben, wie etwa pVL 1392, 1393; und pBlueßac-nicht-Fusionsvektor mit der natürlichen Leader-Sequenz, der zur Co-Expression von β-Galaktosidase zur Farb-Selektion fähig ist, ein. Von diesen Vektoren besitzen die pVL 1392 und 1393 eine intakte 5'-nicht-codierende Region, ein mutiertes Polyeder-Translations-Initiationscodon (AT6 bis ATT), und eine Polylinker-Region, die eine einzelne EcoRI-Stelle enthielt. In diesen Vektoren beginnt die Protein- Translation an einem mutierten ATG (ATT), wenn das rekombinante Gen in Raster mit dem Polyeder-offenen-Leserahmen inseriert wird. Dies kann zu zwei rekombinanten Expressions produkten führen, dem nicht-fusionierten rekombinanten Protein und dem rekombinanten Protein, das mit einem Polyeder-Protein fusioniert ist.
Die murinen und humanen Gen-Inserts können durch EcoRI-Verdau und Elektrophorese auf Agar mit niedrigem Temperaturschmelzpunkt, wie zuvor beschrieben, entnommen werden. Der Vektor kann mit EcoRI präpariert und die Rezirkularisierung durch CIAP verhindert werden. Nach der Ligation kann die Orientierung der Inserts im Plasmid überprüft und die rekombinanten Plasmide mit Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten-Zentrifugation aufgereinigt werden.
Plasmide, die Fremdgene enthalten, können mit einer Calciumphosphat-Fällungstechnik [Graham et al., Virology, 52, 456-467 (1973)] mit Wildtyp-AcMNPV-DNA co-transfiziert werden, modifiziert für Insektenzellen, wie unten beschrieben. Das Fremdgen kann in das AcMNPV-Genom in einer Subpopulation der transfizierten Zellen durch homologe Rekombination übertragen werden. Zur Transfektion wurden 2 · 106 Sf-9-Zellen in einem 25 cm² Kolben ausgesät, und man ließ sie sich für näherungsweise 30 Minuten anheften. 1 ug AcMNPV-DNA und 2 ug der Plasmid-DNA wurden in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen vermischt. Zu dieser Mischung können 0,75 ml Transfektionspuffer (25 mM Hepes, pH 7,1; 140 mM NaCl; und 125 mM CaCl&sub2;) zugegeben und leicht gemischt werden. Das Medium über den angehängten Sf 9-Zellen kann sorgfältig entfernt werden, ohne die Mono-Schicht aufzubrechen, und mit 0,75 ml Grace-Medium ersetzt werden, das 10% fötales Kälberserum und Antibiotika (50 ug/ml Gentamycin und 2,5 ml Amphotericin B) enthält. Die DNA- Lösung kann dann tropfenweise den Zellen zugegeben werden und der Kolben bei 27ºC für 4 Stunden inkubiert werden. Nach der Inkubation kann das überstehende Medium entfernt und die Zellen mit frischem vollständigem TNM-FH (d. h. Grace Insektenmedium + Zusätze + 10% fötales bovines Serum) gespült werden, dann können 5 ml vollständiges TNM-FH zugegeben und die Zellen für 5 Tage bei 27ºC inkubiert werden. Erfolgreiche Transfektion kann durch Betrachten der Zellen nach der Inkubation auf einem Umkehr-Mikroskop bei 250X bis 400X Vergrößerungen bestimmt werden. Ungefähr 20 bis 50% der Zellen können virale Einschlüsse enthalten, die als Brechungskristalle im Kern der Insektenzelle erschienen. Die Zellen können ebenso hinsichtlich ihrer Größe vergrößert erscheinen, und es kann Anzeichen von Zell-Lyse geben. Das überstehende Medium aus dem Transfektionsexperiment kann in einem Plaque-Test verwendet werden, um auf rekombinantes Virus zu testen.
Für den Plaque-Test können 1,75 · 10&sup6; Sf 9-Zellen in 60 · 15 mm Kulturplatten in vollständigem TNM-FH-Medium ausgesät werden. Man kann die Zellen für näherungsweise 30 min anhängen lassen. Zehnfache Verdünnungen (10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup5;) des Virus-Inoculums können in TNM-FH gemacht werden, wobei näherungsweise 1 ml einer viralen Verdünnung für jede Platte zugelassen wird. Zell-Anhaftung an die Kulturplatten kann durch mikroskopische Untersuchung bestätigt werden.
Das überstehende Medium kann sorgfältig entfernt werden, ohne die Mono-Schicht zu zerstören, und mit 1 ml verdünntem Virus-Inoculum ersetzt werden. Die Platten können dann bei 27ºC für eine Stunde inkubiert werden. Eine Agarose-Überschichtung kann bei 5 ml pro Platte zubereitet werden. Für jede Platte kann 0,075 g Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt zu 2,5 ml destilliertem Wasser zugegeben und für 10 bis 15 Minuten autoklaviert und bei 42ºC äquilibriert werden. Zu jeweils 2,5 ml Agarose können 2,5 ml des Medium-Gemischs zugegeben werden (2 ml von 2X TNM-FH, und 0,5 ml fötales Kälberserum und Antibiotika, äquilibriert auf 42ºC), nach Entfernen des Virus-Inoculums von den Kulturplatten können 4,5 ml der Agarose-Überschichtungsmischung zugegeben werden, um die Zell-Mono-Schicht abzudecken. Die Agarose kann bei Zimmertemperatur für 30 Minuten sich verfestigen gelassen werden und dann für 5 Tage bei 27ºC in einer befeuchteten Atmosphäre inkubiert werden.
Plaques können sich sehr wohl in fünf Tagen bilden, und rekombinante Plaques können als Verschluß-negative Plaques identifiziert werden aufgrund der Anwesenheit von rekombinantem Virus. Die Plaques können durch Entnahme von ihnen selbst und dem Agarose-Stopfen direkt über dem Plaque mit einer Pasteur-Pipette isoliert werden. Dies kann in ein Röhrchen übertragen werden, das 1 ml frisches TNM-FH-Medium enthält. Plaque-Aufreinigung kann X2 oder X3 durchgeführt werden, indem jeder isolierte Plaque auf separate Mono-Schicht- Kulturen passagiert wird. Nach zwei Passagen können virale Stämme durch Inoculieren von 1 ml des rekombinanten Virus in einem Gesamt-Inoculum von 5 ml erzeugt werden, um 2 · 10&sup7; Sf-9-Zellen in einem T-150-Kolben zu infizieren. Nach einer einstündigen Absorptionsperiode können zusätzliche 20 ml vollständiges TNM-FH-Medium zugegeben werden, und Virus drei Tage nach der Infektion geerntet werden. Dieser Überstand kann nach der Zentrifugation der Suspension als Stamm gelagert werden. Die Zellen und der Überstand können separat gesammelt werden. Der Überstand kann durch Ultrazentrifugation bei 100.000 X g für 30 Minuten bei 4ºC Virus-frei gemacht werden.

BEISPIEL 27

Aufreinigung von TC-CSF

Eine Aufreinigung des rekombinanten Proteins kann nach prokaryontischer oder eukaryontischer Expression gemäß Standard-Methodologie durchgeführt werden. [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 1982, Springer-Verlag, New York (1982); Methods in Enzymology, 22, 233-577 (1971)].
Eine Aufreinigung des Proteins in Lösung kann in seriellen, schrittweisen Stufen erfolgen. Anfänglich kann quartäre Aminoethyl-("QAE")säulenchromatographie verwendet werden, die QAE-Säule kann mit wenigstens drei Säulenvolumen 20 mM Tris-HCl bei pH 7,5 äquilibriert werden. Der pH des TC-CSF-enthaltenden Überstands oder Extrakts kann auf pH 7,5 mit Natriumhydroxid oder Salzsäure eingestellt werden und auf die Säule aufgebracht werden. Die Säule kann in einem Natriumchloridgradient von 0 bis 0,5 M in 20 mlvi Tris-HCl- Puffer für ungefähr zehn Säulenvolumen eluiert werden. Die TC-CSF-enthaltenden Fraktionen können durch SDS-PAGE identifiziert und dann vereinigt und mit Ultrafiltration (Amicon) konzentriert werden mit einer Membran mit einem Ausschluß MW von 3.000 bis 5.000. Das Protein im Konzentrat wurde mit 60 bis 70% Amoniumsulfat gefällt und mit Zentrifugation gesammelt. Das Präzipitat kann mit 20 mM Tris-HCl bei pH 7,5, enthaltend 60 bis 70% Amoniumsulfat, gewaschen werden. Das Präzipitat kann durch Zentrifugation gesammelt und dann in 20 mM Tris-HCl bei pH 7,5 wiederaufgelöst werden. Die Lösung kann durch einen 0,22 u-Filter gefiltert und auf eine Sephadex G-100-Säule geladen werden, die mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 äquilibriert worden ist. Die Säule kann dann mit demselben Puffer eluiert und die Fraktionen gesammelt werden. Die Protein-enthaltenden Fraktionen können durch SDS-PAGE identifiziert und kombiniert werden.
Nach der Filtration durch einen 0,22 u-Filter kann das Filtrat auf eine Umkehrphasen- Hochdruck-Flüssig-Chromatographie ("rpHPLC")-Säule aufgebracht werden. Die Säule kann mit 1% Trifluoressigsäure äquilibriert werden, die dann mit einem Acetonitril-Gradienten von 0 bis 100%, aufgelöst in 0,1% Trifluoressigsäure, eluiert wird. Die Fraktionen können gesammelt und auf Grundlage von SDS-PAGE MW-Schätzungen kombiniert werden, die von dem verwendeten Expressionssystem erwartet werden. Alle Fraktionen können behalten und erneut verarbeitet werden, um die Ausbeute zu erhöhen. Die vereinigten Fraktionen wurden gegen 20 mM Natriumphosphat bei pH 7,2 dialysiert, mit zwei Pufferwechseln in 4- bis 5 stündigen Intervallen durch Ultrafiltration mit einer Membran mit 3.000 bis 5.000 Ausschluß MW. Das Konzentrat wurde dann durch einen 0,22 u-Filter gefiltert und kann dann für weitere Studien verwendet oder bei -20ºC gelagert werden.
Variationen in der Aufreinigungsprozedur können eingeführt werden abhängig von der Quelle des rekombinanten Proteins und des Wachstumsmediums und der Zusätze, die für das Expressionssystem verwendet werden. Bestimmte Aufreinigungsschritte können wiederholt werden, um ein zufriedenstellendes Produkt für diesen Schritt im Verfahren zu erhalten. Modifikationen können eingeführt werden, um die beste Ausbeute des Produktes zu erhalten und optimale Aktivität beizubehalten.

BEISPIEL 28

Analyse der murinen TC-CSF-Nukeotidsequenz und des Proteinmoleküls

Eine Analyse der murinen TC-CSF-Proteinmoleküle und Nukleotidsequenzen legt nahe, daß es wenigstens zwei Formen des Proteins gibt. Eine ist das große 55 Kd-Molekül, das aus der EL-4-Zelllinie durch PMA-Stimulierung exprimiert werden kann. Aminosäuresequenzierung dieses Proteins und Vergleich mit der Nukleotidsequenz des murinen DNA-Klons legt nahe, daß die Transkription am ersten Met initiiert wird und sequentiell, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, fortschreitet. Dies ist die abgeleitete Aminosäuresequenz aus der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 angegeben ist. Die aus einem Sequenzierer stammende Aminosäuresequenz des 55 Kd-Proteinmoleküls wird in Tabelle 2, oben, angegeben.
Die Existenz einer zweiten Form von TC-CSF-Protein wird durch Expressionsdaten unterstützt, d. h. ein Protein mit einer geringeren Größe von näherungsweise 23 bis 24 Kd. Analyse der Nukleotidsequenz zeigte, daß das erste Met entweder im DNA-Strang nicht vorhanden war oder durch Verdau mit dem Klonierstellen-Restriktionsenzym EcoRI verloren wurde, zusammen mit mehreren anderen Basen während der Subklonierungsprozeduren. Initiation der Proteinsynthese mußte deshalb an einer internen Met-Stelle stattfinden, am wahrscheinlichsten das zweite Met an Position 161, SEQ ID NO: 2. Nachfolgend zu diesem Met, an Position 168, gibt es ein Terminationscodon, bezeichnet als Xaa, mit dem nächsten Terminationscodon an Position 189. Da diese DNA-Sequenz aus hnRNA stammt, sind die Sequenzen, die in mRNA transkribiert und nicht-transkribiert sind, in dieser DNA-Sequenz vorhanden.
Die Demarkationen der Regionen können durch die Terminationscodons angezeigt werden. Die Sequenz von 20 bis 25 vorwiegend hydrophoben Aminosäuren, die typisch für eine Signal- oder Leader-Peptid-Sequenz eines sezernierten Proteins sind und zwischen dem Terminationscodon an Position 168 bis zum nächsten Stopcodon bei Position 189 sind, können eine nicht-transkribierte Region repräsentieren, diese wird von einer transkribierten Region von Position 190 an gefolgt. Nach Spaltung dieses Leader-Peptids vom sezernierten Protein, das von den transkribierten Regionen des DNA-Klons exprimiert werden kann, wäre es schlüssig, daß das exprimierte Protein etwa 23 Kd hinsichtlich des MW und nicht 55 Kd wäre. Da die Bioaktivität beibehalten wird, wird das kleinere Protein durch die bioaktive Region codiert, während das größere Molekül die bioaktive Region zusammen mit einer ungewöhnlichen aminoterminalen Sequenz enthält.
Die Ergebnisse und die Analyse sind zu Studien mit GM-CSF und IL-3 analog, bei denen es offensichtlich ist, daß vielfache Formen von mRNA existieren für die Kolonie-stimulierenden Faktor-Gene. Dies ist mit Studien von GM-CSF und seinen Transkripten demonstriert worden, Stanley et al., EMBO J., 4, 2569 (1985).
Expression des murinen Insert im pSV2-neo-Vektor nach Subklonierung an der EcoRI-Stelle legt nahe, daß das murine Insert seine eigenen Promoter-Sequenzen oder kryptische Promoter innerhalb des verwendeten Expressionssystems hat. Da an der EcoRI-Stelle das Gen nicht unter Einfluß des SV40-Promoters ist. Eine Analyse von SEQ ID NO: 1 zeigt eine GC-reiche Region, die mit CAAT-stimulierenden Sequenzen und Sequenzen die für TATA in der Region stromaufwärts codieren, assoziiert ist. Der Promoter kann jedoch im Vergleich mit dem SV40-Promoter schwach sein, und die Poly-A-Zugabe mag nicht effizient sein, deshalb die schwache Expression. Expressionsdaten unterstützen das Konzept, daß das murine Insert ein einzelnes Gen ist, wobei die DNA-Sequenzen aus hnRNA abgeleitet sind, und wobei die Terminationscodons transkribierte und nicht-transkribierte Regionen anzeigen, innerhalb von Teilen der DNA. Die Expressiondaten unterstützen ebenso das Konzept, daß der murine TC- CSF ein monocistronisches Produkt ist.

BEISPIEL 29

Analyse der humanen TC-CSF-Nukleotid- sequenz und des Proteinmoleküls

Die humane TC-CSF codierende Sequenz wird wenigstens teilweise in einem 800 Basenpaar- Insert enthalten. Die Sequenz von 630 Basen dieses Inserts wird als SEQ ID NO: 5 angegeben. Eine weitere Sequenzierung des Insert ergab zusätzlich 30 Basen stromaufwärts am 5'-Ende. Diese zusätzliche Sequenzierung offenbarte, daß das 800 Basenpaar-Insert eine nichtcodierende Region von 45 Basen stromaufwärts vom initüerenden ATG enthielt, bis zur Klonierstellenrestriktionsenzym-EcoRI-Stelle. Das initüerende ATG für TC-CSF befindet sich an Positionen 16-18, die für Aminosäure 6 codieren (SEQ ID NO: 5). Zwischen Nukleotidposition 55-84 sind Codons für vorwiegend hydrophobe Aminosäuren, die mit der Identität als Signalpeptid-Sequenz konsistent sind. Nach Spaltung dieses Leader-Peptids bis zu einem polaren, ungeladenen Tyrosin demonstriert die darauffolgende Sequenz von Nukleotiden bei Positionen 85-177 starke Homologie mit der murinen Sequenz, die zwischen Nukleotidpositionen 843-1150 der murinen Sequenz (Tabelle 3) enthalten ist.
In Nachfolge zu diesen Regionen gibt es keine apparente Homologie zwischen den murinen und humanen TC-CSF-Sequenzen. Suchen in Datenbanken, einschließlich Genebank, offenbaren, daß es innerhalb eines Teils des humanen 800 Basen-Insert Homologie mit humanem Thioredoxin-Protein gibt. Die Homologie beginnt in der humanen TC-CSF-Sequenz bei Nukleotid 170 und erstreckt sich bis Nukleotid 630. Das Thioredoxin-Protein ist ein hitzestabiles Redox-Protein, das als eine Protein-Disulfid-Reduktase funktioniert. Keine hämatopoetisches Wachstum fördernde Aktivität ist dem Thioredoxin-Protein zugeschrieben worden. Offensichtlich gibt es zwei unterschiedliche Proteine, die als ein Fusionsprodukt im humanen 800 Basenpaar-Insert codiert sind. Da die ersten 170 Nukleotide der TC-CSF-Gensequenz, die das Anfangs-ATG (bei Nukleotidpositionen 16-18) enthalten, die Signalpeptidsequenz (bei Nukleotidposition 55-84) und die Homologie-Region mit dem murinen Gen (bei Nukleotidpositionen 85-170) abwesend sind aus der bekannten Thioredoxin-Proteinsequenz. Das früheste Anfangs-ATG für das Thioredoxin-Protein entspricht Nukleotidpositionen 227-228 der 630 Basensequenz, die für TC-CSF angegeben ist. Dies zeigt an, daß die Basen an Positionen 1 bis 225 der 630 Basen nicht für das Thioredoxin-Protein per se codieren. Ein Gen-Insert in einer cDNA-Bibliothek, das für die kombinierten Sequenzen der zwei Proteinmoleküle codiert, könnte sein, daß die Fusion während der Konstruktion der Bibliothek stattfand. Es gibt Anzeichen dafür, daß die Inzidenz zweier Gensequenzen, die ohne ein dazwischen liegendes Terminationscodon zusammen verknüpft sind, gering ist. Nichtsdestotrotz kann sie stattfinden.
Zwei Klone können aneinander ligiert sein. Wenn die ersten und zweiten Stränge synthetisiert werden, dann sind die Stränge stumpf-endig, und die cDNAs werden methyliert und Polylinkern zur Ligation angefügt. Während der Ligationsreaktion können zwei Stücke DNA ligiert werden, anstatt daß Polylinker zwei individuelle Klone verbinden. Diese Verknüpfung kann insbesondere unter Bedingungen stattfinden, bei denen Klone so selektioniert werden, daß sie eine Größe von 600 Basen oder größer haben, wie im vorliegenden Fall.
Damit kann das kleine TC-CSF-Gen von näherungsweise 200 Basen an ein anderes Gen ligiert worden sein. Die Ligation kann entweder direkt, stumpfes Ende auf stumpfes Ende, oder durch ein kleines, dazwischen liegendes Stück eines Polylinkers stattgefunden haben. Letzteres wird in Betracht gezogen, da das Klonierstellen-Restriktionsenzym für die Bibliothek EcoRI ist und an beiden Enden des Insert vorhanden ist. Die Sequenz an der Stelle, wo die beiden Gene fusioniert haben können, ist TTGGATCCA. Diese neun Basen haben acht Restriktionsenzymstellen auf sich, nämlich BIN 1, XHO 2, BAM 1, NLA 4, MBO 1, DPN 2, DPN 1 und BiN 1. Deshalb kann die Ligation einen Fusionsklon produziert haben, der als ein einzelnes Insert, das die zwei Gene an der Klonierstelle verknüpft, getragen wurde.
Eine Bestätigung der hämatopoetischen Aktivität der humanen TC-CSF-Sequenz und Resultate, die sie vom Thioredoxin-Protein unterscheiden, wurden durch Restriktionsenyzmverdau des Insert in der Region nach Nukleotid 177, um die Sequenz, die für TC-CSF codiert, zu trennen, und durch Subklonierung in einen Expressionsvektor erhalten.
Eine Restriktionsenzymanalyse des humanen 800 Basenpaar-Klons hat die einzige BamHI- Stelle an der Verknüpfungsstelle des TC-CSF-Gens und der Thioredoxin-Gen-Sequenz offenbart. BamHI schnitt nicht innerhalb der humanen Gensequenz und wurde verwendet, um die zwei Sequenzen zu trennen. Der Restriktionsenzymverdau wurde durchgeführt mit 0,5 Einheiten/ug DNA mit dem empfohlenen BamHI Reaktionspuffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris- HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol - pH 7,9 bei 25ºC), supplementiert mit 100 ug/ml bovinem Serumalbumin und inkubiert bei 37ºC. Die Proben wurden mit Agarose- Elektrophorese auf Restriktionsfragmente untersucht. Nach Verdau und Elektrophorese waren die Restriktionsfragmente ein 200 Basen-Fragment, das den einzigen TC-CSF-Teil enthielt, und ein 600 Basen-Fragment, das mit Thioredoxin homolog war.
Das 200 Basen-Fragment, das für humanes TC-CSF codiert, hatte eine EcoRl- Restriktionsstelle am 5'-Ende und BamHI am 3'-Ende. Dieses Fragment wurde in den Baculovirus-Expressionsvektor pVL 1392 subkloniert. Der Vektor pVL 1392 besitzt eine intakte nicht-codierende 5'-Region, ein mutiertes Polyeder-Translations-Initiationscodon (ATG bis ATT) und eine Polylinker-Region, die eine EcoRI-Stelle näher am Vektor 5'-Ende und eine BamHI-Stelle nahe am Vektor 3'-Ende enthielt. Damit kann das TC-CSF-Fragment durch gerichtetes Klonieren in der richtigen Orientierung inseriert werden. In diesem Vektor kann Proteintranslation am mutierten ATG initiiert werden, wenn das rekombinante Gen im Raster mit dem Polyeder-offenen-Leserahmen oder am Anfangs-ATG im Insert inseriert wird. Dies kann zu zwei rekombinanten Expressionsprodukten führen: das nicht-fusionierte rekombinante Protein und das rekombinante Protein, fusioniert mit Polyeder-Protein. Der Vektor kann durch Verdau mit EcoRI und BamHI vorbereitet werden, um die kompatiblen Enden des Insert zu erhalten, nach Ligation kann die Orientierung des Insert überprüft werden. Der Kontrollvektor war einer, bei dem kein Genkonstrukt inseriert war. Die Plasmide wurden durch Cäsiumchlorid- und Ethidium-Bromid-Dichtegradienten-Zentrifugation aufgereinigt. Co-Transfektion der Insektenzellen mit dem Insert-enthaltenden Plasmid bzw. Kontrollplasmid wurde durchgeführt mit Wildtyp-AcMNPV-DNA, mit der Calciumphosphat- Fällungstechnik, wie in Beispiel 26 detailliert ausgeführt. Rekombinante Plaques können als Verschluß-negative Plaques identifiziert werden. Der Überstand von diesen und den Kontroll- Plaques wurde gesammelt und auf Bioaktivität in CFU-C-Klon-Tests getestet. Zusätzliches Material, das als Kontrollen verwendet wurde, waren Polyeder-Protein, und die AcMNPVtransfizierten Insektenzell-Kulturmedien.
Der bioaktive Überstand wurde auf SDS-PAGE laufen gelassen, um eine rekombinante Proteinbande zu identifizieren. Doch war keine rekombinante Proteinbande klar feststellbar. Es sollte beachtet werden, daß erwartet werden würde, daß dieses rekombinante Protein bei einer elektrophoretischen Mobilität von 3 bis 3,5 Kd im Vergleich mit Molekulargewichtsmarkern laufen würde. Es wurde der Schluß gezogen, daß die Konzentration des rekombinanten Proteins weniger als 10 ng/ml war. Die Aktivität ist potent, da der Überstand mit Koloniestimulierender Aktivität von 4 bis 6 CFU-C assoziiert werden kann, wenn 0,1 ml des Überstands in 1 ml Kulturen verwendet wurde, um die Wachstumsaktivität zu bestimmen. Kon trollkulturen, wie etwa der Schein-Überstand oder Polyeder-Protein oder AcMNPVtransfizierte Insektenzell-Kulturmedien ergaben kein Wachstum von CFU-C.

BEISPIEL 30

Konstruktion eines synthetischen TC-CSF-Gens

Mehrere Verbesserungen können in Richtung auf die Expression eines optimalen Produktes durch Synthese eines künstlichen Gens gemacht werden. Die Techniken für die Konstruktion und Expression synthetischer Gene sind fest etabliert: z. B. Sproat et al., Nucleic Acid Res., 13, 2959-2977 (1985); Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, U. K. (1984); Ferretti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 83, 599-603 (1986).
Ein synthetisches Gen für TC-CSF kann im Hinblick auf die folgenden Überlegungen konstruiert werden. Das Anfangs-ATG in der TC-CSF-Sequenz ist 45 Basen stromabwärts vom 5'-Ende und der EcoRI-Stelle, an der die Insert-Sequenz vom Polylinker des Vektors verdaut wurde. Promoter-Sequenzen in den Expressionsvektoren, in die das TC-CSF-Gen inseriert ist, können abgeschwächt sein, dadurch, daß sie 45 nicht-codierende Basen vor dem Anfangs- ATG dazwischen liegen haben. Weiterhin kann die nicht-codierende Region des Insert in eine codierende Region translatiert werden während der Expression in Vektoren, die ein Translations-Initiationscodon haben. Abhängig vom gewählten Leserahmen kann die translatierte dazwischenliegende Region jetzt für ein Translations-Terminations-Codon codieren und damit die weitere Translation der codierenden Sequenz verhindern. Im synthetischen Gen kann die nicht-codierende Region verkürzt sein und das Anfangs-ATG näher an Promoter- Sequenzen plaziert werden, so daß daraus eine starke Expression folgt.
Ein weiteres Beispiel zur Verbesserung durch Konstruktion eines synthetischen Gens ist die Zugabe eines Terminationscodons an einen TC-CSF-Teil eines Insert. Da nach dem Verdau des 800 Basenpaar-Insert mit BamHI, um die TC-CSF-Sequenz von der Thioredoxin-Sequenz zu trennen, das 3'-Ende des TC-CSF eine BamHI-Stelle enthielt, aber nicht ein Terminationscodon enthielt. Für geeignete Expression mußte das 3'-Ende so konstruiert werden, daß es entweder ein Terminationscodon angehängt hatte oder Gebrauch von den Vektorsequenzen machte, die in ein Terminationscodon im geeigneten Leserahmen translatieren. Im letzteren Fall wird eine gewisse Menge an Vektorprotein an das TC-CSF-Protein fusioniert. Dieses Protein ist nicht notwendig und wird vorzugsweise vermieden. Adäquate und geeignete ein zelne Restriktionsenzymstellen mögen im isolierten cDNA-Insert nicht verfügbar sein, um das Erreichen aller geplanter Verbesserungen zu ermöglichen, und damit wäre das synthetische Gen von Vorteil für die Produktion eines optimalen Produkts.
Die synthetischen Fragmente werden unter Verwendung von Standardtechniken synthetisiert, vorzugsweise wird ein automatisierter Synthesizer verwendet, wie etwa Applied Biosystems Inc., Modell 380A (Foster City, Californien). Die Basensequenzen für die synthetischen Gene wurden so ausgewählt, daß das zusammengesetzte synthetische Gen das erwünschte Codierungssegment mit einem optimal gelegenen Anfangs-ATG am 5'-Ende und ein Translations- Terminationscodon am 3'-Ende enthielt. Die Basensequenzen wurden so konstruiert, daß sie für einzelne Restriktionsenzymstellen an beiden Enden kodieren, hinsichtlich der erwünschten Vektoren, die das Gen tragen oder das Gen exprimieren. Einzelne Restriktionsenzymstellen können innerhalb des Gens konstruiert werden, so daß Segmente des Gens, definiert durch die einzelnen Restriktionsstellen, ausgeschnitten und mit Segmenten ersetzt werden können, die veränderte Basensequenzen haben. Dies ermöglicht die Konstruktion von Mutanten; Produktion von mutanten Genprodukten; und spezifische partielle Produkte etc., von denen alle medizinische und wissenschaftliche Anwendungen haben mögen.
Die Nukleinsäure-Kassette umfaßt das doppelsträngige DNA-Fragment, das für den bioaktiven Teil des TC-CSF codiert. Zum Beispiel der Teil, der die Sequenz zwischen Nukleotidpositionen 16 bis 177, wie in SEQ ID NO: 5 gezeigt, ausmacht. Diese codierende Sequenz wird durch Linker an jedem Ende flankiert. Die Linker für das 5'-Ende und das 3'-Ende können Basensequenzen für einzelne Restriktionsenzymstellen haben, ausgewählt hinsichtlich der Kompatibilität zum gerichteten Klonieren mit dem 5'-Ende bzw. dem 3'-Ende des erwünschten Expressionsvektors oder Trägervektors.
Eine große Auswahl an synthetischen Linkem, die für jede ausgewählte Restriktionsendonuklease codieren, sind erhältlich von: Midland Certified Reagent Co., Midland, Texas; Research Genetics, Huntsville, Alabama; Lofstrand Laboratories, Gaithersburg, Maryland. Diese kommerziellen Laboratorien synthetisieren die vollständige Genkassette mit den Linker- Enden gemäß genauen Angaben nach vertraglicher Vereinbarung.

BEISPIEL 31

Konstruktion eines synthetischen TC-CSF-Peptids

Expression des TC-CSF-Teil des Gen-Insert ergab ein bioaktives rekombinantes Protein, wie in dem vorherigen Beispiel beschrieben. Eine Analyse der Nukleinsequenz und partiellen Aminosäuresequenz zeigte, daß das exprimierte rekombinante Protein eine Sequenz haben kann (wie in SEQ ID NO: 7 angegeben) von:
Animo- Terminus Y W T F V I K I N L F Y N S N S P V W K K K Q P A L F G A L Carboxy- Terminus
Zur weiteren Bestätigung, daß die Aminosäuresequenz die bioaktive Sequenz war, wurde ein synthetisches Peptid synthetisiert.
Die Methodologie zur Festphasen-Peptidsynthese ist fest etabliert und hat allgemeine Akzeptanz erreicht. Fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)-Schutz für die alpha-Aminogruppe und die Entwicklung neuer Träger, aktiver Ester und neuer Aktivierungsstrategien haben die Methodologie beträchtlich gegenüber dem gegenwärtigen Stand der Technik verbessert. Chang et al., Int. J. Pept. Protein Res., 11, 246-249 (1978); Atherton et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 3, 165-166 (1985); Hudson, J. Org. Chem., 53, 617-626 (1988). Für die Synthese kann ein automatisierter Peptid-Synthesizer, wie etwa das Advanced Chemtech Modell MPS 350 (Louisville, Kentucky) verwendet werden. Die Schritte in der Synthese für einen Zyklus und die verwendeten Methoden werden diskutiert.
Bei der Kopplungsprozedur wurde die Aktivierung unter Verwendung von Diisopropylcarbodümid (DIPCDI) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) durchgeführt, es wird berichtet, daß mit dieser Kombination die Kopplungseffizienzen 1,33-mal derjenigen sind, die mit symmetrischen Anhydriden beobachtet werden, und ergaben reinere Produkte. Der praktische Wert von DIPCDI und HOBt wird weiter verstärkt durch den Mangel an Racemisierung unter Verwendung dieses Verfahrens. Doppelte Kopplung kann verwendet werden, was die Effizienz er höht. Ein fakultatives Versehen mit Kappengruppen kann mit Essigsäureanhydrid und Pyridin durchgeführt werden. Unter den meisten Umständen eliminiert jedoch die hohe Effizienz der Fmoc-Chemie den Bedarf nach einem Versehen mit Kappengruppen. Das Entblockieren, d. h. die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe, kann durch Behandlung mit dem sekundären Amin Piperidin gemacht werden. Die sanften Entblockierungs-Bedingungen sind ein wichtiger Vorteil des Fmoc-Verfahrens. Nachdem der Entblockierungsschritt gemacht worden ist, wird der Zyklus wiederholt. Das Peptid kann dann gespalten und von seiner Schutzgruppe befreit werden unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA), einer relativ milden organischen Säure, mit Abfang-Reagens R. (Research Genetics, Huntsville, Alabama).
Die präparative Peptid-Aufreinigung mit HPLC wurde in einer präparativen C-18-Säule im TFA-Acetonitril-System durchgeführt, mit Waters Delta Pak (Millipore Corp., Waters Division, Marlborough, Massachusetts). Die Säulenspezifizierungen waren 25 · 30 mm, 15 u; die Bedingungen waren A = 0,1% TFA; B = 0,1% TFA in Acetonitril. Der Gradient war 0-60% B mit 1% pro Minute.
Analytische HPLC kann unter Verwendung einer Vydac-Säule durchgeführt werden mit den Spezifizierungen: C18, 4,6 · 250 mm 5 um 300 Angstrom (Vydac Hesperia, Californien). Die Bedingungen können sein A = 0,1% TFA, B = 0,1% TFA in Acetonitril, der Gradient war 0% B für 3 Minuten, dann 0-60% B in 27 Minuten. Der UV-Detektor wurde auf 210 nm festgesetzt. Das HPLC-Chromatogramm des Produktes war übereinstimmend mit mehr als 80% Reinheit mit einer einzelnen Spitze, was Homogenität der zusammengesetzten 25 Reste anzeigt. Das synthetische Peptid kann dann lyophilisiert werden.
In Übereinstimmung mit Empfehlungen wurde die Länge des Peptids auf 25 Reste beschränkt. Die Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 8] des ausgewählten Peptids war: YFVIKINLFYNSNSPVWKKKQPALF, wobei das Anfangs-Tyrosin acetyliert war und das terminale Phenylalanin amidiert war. Das Anfangs-Tyrosin wurde beibehalten, so daß es dem Phenylalanin voranging, um eine Markierung mit radioaktivem Jod zu erleichtern. Das radioaktiv markierte Produkt kann verwendet werden, um den TC-CSF-Rezeptor zu erforschen, zur Erforschung des Mechanismus, durch den die Wirkung von TC-CSF vermittelt wird, oder bei Tests als ein Kompetitor für TC-CSF. Weitere Variationen im synthetischen Peptid schließen eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen oder -deletionen an verschiedenen Positionen ein, so daß neue verbesserte Moleküle verfügbar sind und der Effekt der Substitutionen auf Krankheitszustände erforscht werden kann.
Die biologische Aktivität des synthetischen Peptids wurde durch in vitro-Klon-Zellkultur- Tests getestet, ähnlich den Klon-Tests, die zuvor beschrieben worden sind, wie etwa in Beispiel 2. Anders als bei der Prozedur aus Beispiel 2 wurde jedoch Methylzellulose als die halbfeste Matrix verwendet, supplementiert mit alpha-Medium (GIBCO) und 30% fötalem Kälberserum. Dieses Kultursystem erlaubt die Beurteilung von CFU-C, CFU-M sowie BFU-E. Die Kolonie-stimulierende Aktivität für CFU-C und CFU-M wird durch den TC-CSF in Testkulturen und rekombinantes IL-3 (GIBCO) in Kontrollkulturen bereitgestellt. Zur Stimulierung von BFU-E-Wachstum wurde 1 Einheit rekombinantes Erythropoietin (Amgen, Thousands Oaks, California) jedem 1 ml Kultur zugesetzt. Die humanen CFU-C-Kulturen wurden für 14 Tage bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 bis 7% CO&sub2; in Luft inkubiert.
In den Testkulturen wurde das synthetische Peptid bei Konzentrationen getestet, von denen erwartet wurde, daß sie näherungsweise von 3 Einheiten bis 100 Einheiten Aktivität reichen. Die Resultate der Kontrollkulturen mit 100 Einheiten rekombinantem IL-3 wurden verglichen mit denen des synthetischen Peptids, von denen erwartet wurde, daß sie näherungsweise 100 Aktivitätseinheiten haben, und sind unten angegeben. Die Resultate mit IL-3 sind in Klammern neben denen des synthetischen Peptids angegeben. Der CFU-C-Test wurde mit 5 · 10&sup4; humanen Knochenmarkszellen pro Kultur durchgeführt. Kolonie-stimulierende Aktivität wurde mit Koloniebildung gesehen von: BFU-E 38 bis 47 (IL-3, 52 bis 77); CFU-GM 15 bis 18 (IL-3, 37 bis 47); CFU-M 2 bis 3 (IL-3, 2 bis 3); CFU-F 3 bis 4 (IL-3, 2 bis 3); Lymphocyten 3 bis 4 (IL-3, 1 bis 2).
Die Wachstumsaktivität des synthetischen Peptids war näherungsweise 30% bis 40% derjenigen, die von einer ähnlichen Konzentration an rekombinantem hämatopoetischem Wachstumsfaktor erwartet wurde. Die Erklärung dafür kann multifaktoriell sein, dahingehend, daß das synthetische Peptid 80% Reinheit hatte, Spurenmengen der verwendeten Chemikalien vorhanden sein können, die Wachstumsinhibition verursachen; das synthetische Peptid ausgesprochen empfindlich gegenüber Proteasen ist, die im Gewebekultursystem vorhanden sein mögen, mit daraus folgender Wachstumsinhibition durch Aufhebung der wachstumsstimulierenden Eigenschaften; die Sekundärstruktur und stöchiometrische Konfiguration des synthetischen Peptids nicht identisch mit dem biologischen Produkt sein mag und nicht mit derjeni gen übereinstimmen mag, die für größere Bioaktivität erforderlich ist. Da das Gesamtspektrum an Koloniestimulierender Aktivität vorhanden war und eine morphologische Untersuchung der CFU-C ein extrem gesundes Erscheinungsbild offenbarte, kann gefolgert werden, daß der Teil des synthetischen Peptids, der bioaktiv war, optimale funktionelle Eigenschaften beibehielt. Während es einen großen Bestandteil gab, der synthetisiert wurde, der nichtfunktionell und inert für Bioaktivität im verwendeten Klon-Testsystem war oder durch die Wirkung von Proteasen oder Spuren von Verunreinigungen dazu gemacht wurde. Die Potenz des synthetischen Peptids kann erhöht werden, wenn alle Aminosäurereste des bioaktiven Teils des biologisch-erhaltenen Proteins sequenziell zusammengesetzt wurden anstelle der modifizierten Sequenz von 25 Aminosäuren.
Verbesserungen im Prozeß der Peptidsynthese und -zusammensetzung werden in Erwägung gezogen und implementiert werden. Nichtsdestotrotz stellte der Dosis-Antwort-Test steigende Wachstums-stimulierende Aktivität entsprechend einer erhöhten Dosierung fest. Koloniestimulierende Aktivität wurde gesehen mit einem Anstieg der Anzahl an Kolonien von BFU- E (erythroid); CFU-GM (Granulocyten und Makrophagen); CFU-M (Megakaryocyten); CFU- F (Fibrocytische stromale Zellen); und die der Lymphocytenlinie.
Es wird geschlossen, daß die Nukleotidsequenz für TC-CSF ein Protein codiert, dessen Aminosäuresequenz multipotentielle Wachstums-stimulierende Aktivität hat.

BEISPIEL 32

Analyse von TC-CSF-antigenen Determinanten und TC-CSF-Antikörpern

Um die Aminosäuresequenz des TC-CSF weiter zu bewerten, wurde eine Computeranalyse zur Vorhersage von antigenen Determinanten durchgeführt. Das verwendete Verfahren war das von Hopp et al., Proc. Nat'1. Acad Sci. (USA), 78, 3824-3828 (1981). Wie von den Autoren empfohlen, war die mittelnden Gruppenlänge sechs Aminosäuren, und die durchschnittlichen Hydrophilie-Punkte wurden notiert. Die drei höchsten Hydrophilie-Punkte wurden eingestuft. 1. Durchschnittlicher Hydrophilie-Wert 1,45 für Aminosäuren 48-53 in SEQ ID NO: 6: 2. Durchschnittlicher Hydrophilie-Wert 0,62 für Aminosäuren 33-38 in SEQ ID NO: 6: 3. Durchschnittlicher Hydrophilie-Wert 0,08 für Aminosäuren 13-18 in SEQ ID NO: 7:
Es sollte beachtet werden, daß bei einer Gruppe von Kontrollproteinen der höchste Punkt in 100% der Fälle einer bekannten antigenen Gruppe zugeordnet wurde, was den vorhersagenden Wert des höchsten Punkts anzeigt. Der zweite und dritte Punkt ergaben einen Anteil von näherungsweise 67% korrekten Vorhersagen und 33% inkorrekten Vorhersagen.
Da das synthetische Peptid bioaktiv ist, kann es verwendet werden, um spezifische Antikörper gegen bioaktive Stellen von TC-CSF zu ziehen, und diese Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Die Techniken zum Erzeugen von monoklonalen Antikörpern sind fest etabliert, z. B. Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975); Kohler, in: Immunological Methods, Hrsg. Lefkovits et al., Academic Press, New York, NY (1979). Die immunogenen Regionen des TC-CSF-Moleküls sind durch Vorhersagen von antigenen Determinanten analysiert und im Hinblick auf Hydrophilie eingestuft worden. Antikörper können gegen die entsprechenden Regionen aufgezogen und verwendet werden, um die Konstruktion von diagnostischen oder therapeutischen Mitteln zu erleichtern.

BEISPIEL 33

Polyethylenglycol und TC-CSF-Konjugation

Eine Therapie mit Proteinmolekülen kann mit Nebenwirkungen verbunden sein, die hinsichtlich ihrer Größe durch den parenteralen Therapiemodus verstärkt werden können. Einige dieser Probleme mögen sekundär sein gegenüber der kurzen Zirkulationshalbwertszeit des Pro teins, so daß hohe Dosen notwendig sein können, um Wirksamkeit zu erreichen, und ziemlich oft mögen häufige Dosen erforderlich sein. Andere Nebenwirkungen mögen durch die Immunogenität des Proteins verursacht sein, die allergische Manifestationen oder Überempfindlichkeitsreaktionen zur Folge hat. Es ist vorteilhaft, in der Lage zu sein, das Leben des therapeutischen Proteins zu verlängern und die Immunogenität zu verringern.
Die Zugabe von Polyethylenglycol (PEG) zu therapeutischen Proteinen ist fest etabliert, z. B. Lundblad et al. in: Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press, Boca Raton, Florida (1984); Zalipsky et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 15, 100-114 (1992), Berger et al., Blood, 71, 1641-1647 (1988). Die Zugabe von PEG zu Proteinen kann ihre Erkennung durch das Immunsystem verhindern oder verzögern, wodurch die Immunogenität erniedrigt wird. Weiterhin ist gezeigt worden, daß PEG-Protein-Konjugate, wenn sie Tieren injiziert worden sind, länger zirkulieren als das nicht-konjugierte Protein. Wodurch die Lebensspanne des Proteins verlängert und möglicherweise die erforderliche Gesamtdosis reduziert wird.
TC-CSF-PEG-Konjugate mögen wirksam sein, indem sie länger zirkulieren und dadurch die erforderliche Dosis reduzieren. Zusätzlich mag das TC-CSF-und-PEG-Konjugat weniger immunogen sein, wenn es für die Therapie verwendet wird, und damit die Nebenwirkungen reduzieren, sofern solche stattfinden.
Auf der Grundlage der obigen Resultate wird unterbreitet, daß ein neues Wachstumsfaktormolekül aus T-Lymphocyten synthetisiert worden ist. Der Wachstumsfaktor stimulierte das Wachstum von multipotenten, hämatopoetischen Vorläuferzellen. Das Wachstumsfaktor- Protein wurde isoliert und eine partielle Aminosäuresequenz abgeleitet. Oligonukleotidsonden wurden konstruiert, die die partiellen Aminosäuresequenzen von TC-CSF codieren, und das Gen für das Wachstumsfaktormolekül kloniert. Die Nukleotidsequenz für das Gen bestätigt, daß dies ein neues Wachstumsfaktormolekül ist. Keine wirkliche Homologie mit irgendwelchen anderen bekannten Wachstumsfaktormolekülen war nachweisbar.
Beträchtliche Anzeichen existieren dafür, daß T-Lymphocyten essentiell zur Regulierung der Proliferation und Differentiation von hämatopoetischen Vorläuferzellen ist. Stimulation durch Phorbolester oder Lektine von humanen T-Zellen, wie etwa der Jurkat-Zelllinie, produziert einen T-Zell-abgeleiteten Wachstumsfaktor, der die Hämatopoese unter kontrollierten Bedin gingen, wie etwa in vitro-Plasma-Gerinnsel-Kulturen, stimuliert. Obwohl spezifische Kolonie-stimulierende Faktoren, wie etwa IL-3 und GM-CSF, die eine Multi-Linienhämatopoetische Kolonie-stimulierende Aktivität haben, von T-Lymphocyten produziert werden mögen, ist die potenteste Quelle von IL-3 und GM-CSF nicht T-Zellen. Darüber hinaus gibt es Anzeichen aus klinischen Beobachtungen von Patienten mit T-Zell-Defizienzen, wie etwa bei erworbenen Immundefizienz-Syndromen (AIDS), daß eine anfängliche Antwort mit einer Verbesserung hinsichtlich der Blutzellenzahl auf eine Therapie mit IL-3 oder GM-CSF gewöhnlich nicht anhaltend ist. Die Antwort kann wieder auftreten, wenn es eine Verbesserung im T-Zell-Status gibt, was anzeigt, daß ein T-Zell-abgeleiteter Faktor zur Hämatopoese notwendig ist, der sich von IL-3 oder GM-CSF unterscheidet.
Die Möglichkeit wird in Betracht gezogen, daß Mutationen in anderen Teilen der Sequenz für eine Aminosäure codieren, einschließlich der Amber-Mutation TGA, die für Cys oder Trp codieren kann.
Die obigen Daten und Beispiele etablieren, daß der TC-CSF ein neuer hämatopoetischer Wachstumsfaktor ist. Mögliche Verwendungen für TC-CSF schließen ein: 1) Entwurf der Regulierung der Hämatopoese; 2) Identifizierung von Krankheitszuständen, in denen eine Deregulierung stattfindet; 3) Stimulation der Hämatopoese (dies kann in vitro oder in vivo sein, insbesondere bei Patienten, die eine Unterdrückung der Hämatopoese haben entweder aufgrund von Krankheit oder zweitrangig infolge von chemotherapeutischen Mitteln, die zur Behandlung einer bösartigen Geschwulst verwendet werden); 4) Gentherapie, bei der die Einführung dieses Gens in Zellen vorteilhafte Wirkung haben kann; 5) andere Verwendungen können in Betracht gezogen werden, wie etwa die Behandlung von immuneingeschränkten Patienten, die einhergehend niedrige Blutzellzahlen haben; und Stimulation von hämatopoetischen Zellen in eine Zellzyklus-Phase, so daß chemotherapeutischen Agenzien, die für eine Zellzyklus-Phase spezifisch sind, dann effektiver wirken können.
Der TC-CSF-Wachstumsfaktor stimuliert das Wachstum von fibrocytischen stromalen Zellen. Diese Zellen führen zu der hämatopoetischen Mikro-Umgebung, die für die Aufrechterhaltung von hämatopoetischen Vorläuferzellen, ihre Proliferation und Differentiation essentiell ist. Klinische Verwendung des Wachstumsfaktors wäre bei der Rekonstituierung der Mikro- Umgebung und Wiederherstellung von Funktion bei den Krankheitszuständen nützlich, bei denen diese beeinflußt sein können.
Der TC-CSF stimuliert das Wachstum von Zellen der Lymphocyten-Linie. Es gibt Hinweise, daß der Wachstumsfaktor prä-B-Lymphocyten-Zellen stimuliert. Immunrekonstitution und Wiederherstellung von Immunfunktion können zur therapeutischen Verwendung des Wachstumsfaktors in Erwägung gezogen werden.
Die bioaktive Einheit des TC-CSF ist ein sehr kleines Molekül. Die Bioaktivität des synthetischen Peptids demonstriert, daß eine Wachstums-stimulatorische Aktivität mit breitem Spektrum durch 25 bis 30 Aminosäurereste codiert sein kann, die Teil der TC-CSF-Sequenz ausmachen. Die geringe Größe würde mit verringerten Nebenwirkungen, insbesondere bei der parenteralen Therapie, konsistent sein, mit einer daraus folgenden Reduktion der Risikofaktoren, während gleichzeitig die hohen therapeutischen Vorteile beibehalten werden. Im Hinblick darauf und die Wachstums-stimulierenden Eigenschaften des TC-CSF mit breitem Spektrum dienen die zuvor erwähnten therapeutischen Verwendungen lediglich zum Anzeigen einiger Krankheitsgrößen, bei denen das Produkt als ein therapeutisches Mittel in Erwägung gezogen werden kann. Es ist nicht beabsichtigt, daß die Verwendung exklusiv auf diese Gruppen beschränkt ist. Im Gegenteil, die Behandlung würde auf jeden Krankheitszustand ausgeweitet werden, wo das Produkt vorteilhaft sein kann, vorbehaltlich regulatorischer Richtlinien von Stellen, die zu diesem Zweck ernannt worden sind. Dies sind Stellen, wie etwa die FDA in den USA und ähnliche Stellen in anderen Teilen der Welt.
Die Möglichkeit wird in Erwägung gezogen, daß das TC-CSF-Gen ein regulatorisches Gen sein kann, das die Transkription von anderen Wachstumsfaktor-Genen regulieren kann. In diesem Fall kann es beträchtliches Potential bei der Verwendung des TC-CSF-Gens zur Gentherapie geben.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER: Choudhury, Chandra
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Aus T-Lymphocyten gewonnener hämatopoetischer Wachstumsfaktor und Verfahren zu seiner Verwendung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 8
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) EMPFÄNGER: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Bicknell
(B) STRASSE: Two First National Plaza, 20 South Clark Street
(C) ORT: Chicago
(D) STAAT: Illinois
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 60603
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release 1.0, Version 1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) INFORMATION ZUM ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Gruber, Lewis S.
(B) REGISTRIERNUMMER: 30,060
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 27620/30933
(ix) INFORMATION ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (312) 346-5750
(B) TELEFAX: (312) 984-9740
(C) TELEX: 25-3856

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2560 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1
GAATTCCGTC CTATGCGCCT CATTAGACAC ACCAGTGCCT GAAAAGCTTC TTTATACGTT 60
CTATTCCCAA CTCCCCTTTT CCCCTATTTT CTCTTTCATC TATTTTTAAA TATCATCTAT 120
TTTTTAATAG GGGAAGGAGT ATGTTAAAAA TGACTCAGAG TCTTAAACAT GCTATGCAGA 180
CACTCTACCA CTGAGCTATC TCCACGTGCT TAAATCTAAT TTAGTCATTA AGCAGCCCTG 240
ACAAAGACA ATCTATTCTG GTCAATGTTT CCAAGGACCT TCATAATCCT AAGGCAAGTG 300
ATTACCATCC TCATTTCTGA CCTGTTAGCA TATTTGACAC AGTTAATTGT CTGATTCGGA 360
GAGTTGGACT TATCAAGCTG AAAAAGATGA GCAGGACACC CTTGGTATCT TGTCATCATG 420
TAGTTCTGAC TTAGTCTGTC TAGGTGGAAT CAGAGAGTCT AGCTTTCCAC TGATATAGGT 480
GATGCTGACC CATCGATCAC ACTGAATAGC AAGACTCAAG GGCATTACAC ACCTTGCTTC 540
CAGGTTTTCT TCTTCTACAG TTTTTTAGAG TAAAGTTTTC CAAGCATGTC TTCTACTTAT 600
AAAACTATTT GAGTATTTAT TATTACTTAT TCCAACCACG TGGTTTGTCC CACAAAGCTC 660
CATGAGTTTA AGCATCATCT GTCTCTCAAA GCCTCTTAAA ATTATAACTT AAACTTGGAT 720
ATTTTTCCAA ACTCTAGACT TCCAACGACT TCTTCCTACC TGGCACCTTC AATTGAACAT 780
CTkACAGACT GCTTTTTCTT AATCTAACTA AACTTAACGC CAATTGATCT TCCTTTCAGC 840
CTACTTTGTG TGAAAGGGTT CCCTGTTAGC AACTCCATCA TTCAAATGAC TTAGGCTCCA 900
AACACTGCAA TCAGATTTGA TGGGAACTTT TTTTTTTCCC TAAACTTCAA CTGTGTCCCA 960
TCTGGATTCC TGCATTAATT TTTAAAAACA CCATTCTTAT GCTTACTCTT TTCATGCCCA 1020
ACTGATCTTT CCCTAACAGA ATACCCAAGG TATTTTAGGT AGAGTCATGA ATGTCAATAG 1080
TTGAGCCAAA ACCCCTGTTA CAGAGAAAAA AAAATCACCC TTTACAGTGA GCTTTGAGAC 1140
TTTGTGTGAT ACAATTAAAG TGCCCTTTCA AAACATTTTC TGGTTCAGTG TGACAGAATC 1200
ATCCCATCAG ACTCTTTCTA CCTTTGAACC CAGACTTTAA TAGACCTTTT TCCAGAAACA 1260
CTATCTTTAA TTCATCTGTT TGGTGACGTC TCCCTTAAGT CTCTGCTCTG ATTTCATCTT 1320
CTAAATGAAG TCCCCTCATG AGCCTTCTTT CTGGCACTGT TGCTTGCTGC CTAATCCTGC 1380
TTCCCCTTAA GCTTCTCCAC CTTTATCTTC TCCATAGCAC CAATCAATTT CTCAAGACTG 1440
GATAGCCGAC TCTCTTTGCT GTTCTATTTA TTGTTTATTT ATGTGTAAGT GCGAGTCCCA 1500
AAAGACCACC AAGGGGCTGA TTCTAGTGCA ATCACACAAG GGTCTTTACC CAAGCTGGAG 1560
CTTGGGCTCT CCACTGACCC TGACTCAGCA AGACCTGAAG GTGGAGCCCC ACCCAGTTTC 1620
AAGCXAACGT TTATAGGGGT AAGCAATCAA GCAAGAGTGT TTTTAGCCTG ATACACATTT 1680
GATTGGTGGT CTATTATGGA ATTTTGTTGC CCTTTAAAAT AATTGGCTGC TGCTGGGAGC 1740
CAAACCATAA GTTTAACTTC TGCTTTCCTC CTGATTGGTG GTTGTCAGGA AGTGAAGAGC 1800
CAGGTACAGT AACGGAGACA CAGGTTTGTT TGGGAGTAAA CATGGAAACT GGTGCTAAAC 1860
CCACTCCTCC CCCCAGCTTG GCTTGATGGT TAACTCAGTT CAACTTTAGG TCAGGTTCTC 1920
TAAGATGGAG TCTGACTCCA GGATCTGGTC TCTCAGTGAG CACAGTTGCT TCCGAGACAG 1980
GCTTTACAGT AAACACATAG GCATCACTCT AGGGCCAAGG GACAAAGAAG CAAAGTCCTC 2040
CAGATTAATT CTTCATTGTA TTAATAACCF TGGTGATTGT TAAATCGGAT GCCCTGACAG 2100
GTCTTCGCCA AACAGTATGC TCTGAACCTT TAGATCACGT TCCAGTTGCT AATACTCAGT 2160
GTTGATGATA GCACTGACTA CTGTCTGGCA TCTGAGAGTT CCCTGCCCTT AGCAGTTTGC 2220
TTCCCTATTC TAAATATCTC ATTGAAGGTT TGCTGTGTTT TGCTTGCGTT TCCTGTTGCC 2280
TTAAAGAGAG AGTTAGTTAG TTTGAAACAT GCCCCATCAC ATGCTAGATA AATGTATCCA 2340
GTTCTTACCG ACTGCGAAAA ATAAGATGAT AGTCTTCCGA AAATTTTTTC CCATGAAATA 2400
TGAAAATTTA AATTTAGCTG AAATGTTTGT AGGTTTTGAA GAGTGTTCTG CTGGGGAGAC 2460
TTCCCCCAGC TCCCTTTTCA GGTACTTCGG TCGGCCGAAA ATTTAGGGCA AAATCTGCCA 2520
TTAAAATCG AGGTCTTCTC CGGTTGATGG CTTTGAATAC 2560

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 554 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBVNG: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 630 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..630
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 210 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

Claims

1. Eine gereinigte und isolierte menschliche Nukleinsäure, die einen TC-GSF codiert mit einer Nukleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfaßt:

eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz von menschlicher SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 codiert

ein Nukleotid, das unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement von irgendwelchen 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von einem Polynukleotid hybridisiert, das für die menschliche Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 codiert, und,

eine menschliche Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement von beliebigen 20 Nukleotiden in der Nukleotidsequenz von den Nukleotiden 1 bis 225, wie angegeben in SEQ ID NO: 5, hybridisiert.

2. Die Nukleinsäure nach Anspruch 1, welche weiter einen Vektor umfaßt.

3. Die Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei der Vektor ein Klonierungsvektor ist.

4. Die Nunkleinsäure nach Anspruch 2, wobei der Vektor ein Expressionsvektor ist.

5. Die Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei der Vektor ein E. coli-Vektor ist.

6. Die Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei der Vektor ein Expressionsvektor für eukaryontische Zellen ist.

7. Die Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei der Vektor ein Bacculovirus-Expressionsvektor ist.

8. Die Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei der Vektor ein Expressionsvektor für Säugetierzellen ist.

9. Die Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei der Vektor pSVCC101 ist, der als ATCC- Hinterlegungsnummer 68824 hinterlegt ist.

10. Die Nukleinsäure nach Anspruch 2, die weiter eine Wirtszelle umfaßt, die den Vektor umfaßt.

11. Die Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei die Wirtszelle eine eukaryontische Zelle ist.

12. Die Nukleinsäure nach Anspruch 1, die weiter eine Wirtszelle umfaßt, die die Nukleinsäure an einer Stelle oder in einer Vielzahl umfaßt, die nicht in der Natur gefunden wird.

13. Die Nukleinsäure nach Anspruch 12, wobei die Zelle eine eukaryontische Zelle ist.

14. Ein isoliertes TC-CSF-Polypeptid, das durch die Nukleinsäure von Anspruch 1 codiert ist.

15. Das isolierte TC-CSF-Polypeptid nach Anspruch 14, das ein Expressionsprodukt einer Zelle nach Anspruch 11 ist.

16. Das isolierte TC-CSF-Polypeptid nach Anspruch 14, das ein Expressionsprodukt einer Zelle nach Anspruch 13 ist.

17. Das isolierte TC-CSF-Polypeptid nach Anspruch 14, das weiter ein Verdünnungsmittel, ein Adjuvans oder einen Träger umfaßt.

18. Das isolierte TC-CSF-Polypeptid nach Anspruch 17, wobei das Verdünnungsmittel einen isotonischen Puffer oder Wasser mit pharmazeutischem Reinheitsgrad für Injektion umfaßt, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden.

19. Das isolierte TC-CSF nach Anspruch 14, welches weiter eine Markierung oder Reportergruppe umfaßt.

20. Das isolierte TC-CSF nach Anspruch 14, welches weiter einen an das Polypeptid gebundenen Träger umfaßt.

21. Das isolierte TC-CSF nach Anspruch 14, wobei das Polypeptid verbunden ist mit einem Träger und einem anti-TC-CSF-Antikörper in einer Packung eines diagnostischen Kites.

22. Ein isolierter Ligand, der spezifisch an menschliches TC-CSF, der durch die Nukleinsäure nach Anspruch 1 codiert ist, bindet.

23. Der isolierte Ligand nach Anspruch 22, wobei der Ligand ein menschlicher TC-CSF- Rezeptor ist.

24. Der isolierte Ligand nach Anspruch 23, wobei der isolierte Ligand ein isolierter monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist, der eine spezifische Immunreaktivität mit einem TC-CSF-Polypeptid nach Anspruch 14 aufweist.

25. Der isolierte Ligand nach Anspruch 24, wobei der Antikörper eine spezifische Immunreaktivität mit einem Polypeptid nach Anspruch 14 aufweist.

26. Der isolierte Ligand nach Anspruch 24, wobei der monoklonale oder polyklonale Antikörper eine spezifische Immunreaktivität mit einem Polypeptid nach Anspruch 14 aufweist.

27. Ein isoliertes Antigen, das immunologische Eigenschaften aufweist, so daß es spezifisch mit einem isolierten Polypeptid nach Anspruch 14 reagiert.

28. Eine immortalisierte Zellinie, die einen Antikörper gegen einen menschlichen TC-CSF herstellt.

29. Ein TC-CSF-Polypeptid nach Anspruch 14 zur Verwendung bei einer Behandlung, wobei die Behandlung umfaßt:

Induzieren einer TC-CSF-hämatopoietischen Reaktion.

30. Ein Verfahren zum Reinigen eines menschlichen TC-CSF, das die Schritte umfaßt:

Auftragen von Zellkulturüberstand, der einen TC-CSF enthält, auf eine Anionenaustauschsäule; und

Sammeln einer Fraktion, die einen menschlichen TC-CSF enthält, von der Anionenaustauschsäule.

31. Das Verfahren nach Anspruch 30, wobei der Auftragungsschritt den Schritt umfaßt des Einbringens von TC-CSF in die Säule, die eine an einen Träger gebundene quartäre Ammoniumgruppe umfaßt.

32. Das Verfahren nach Anspruch 30, welches weiter die Schritte umfaßt:

Einbringen einer Flüssigkeit, die einen TC-CSF enthält, in eine Gelfiltrationssäule;

und

Zurückbehalten einer Fraktion, die einen TC-CSF umfaßt.

33. Das Verfahren nach Anspruch 32, welches weiter die Schritte umfaßt:

Konzentrieren des Eluates von der Anionenaustauschsäule;

Einbringen einer TC-CSF-enthaltenden Lösung in eine rpHPLC-Säule und Vereinigen von davon eluierten Fraktionen; und

Dialysieren einer TC-CSF-enthaltenden Lösung.

34. Ein anti-Idiotyp-Antikörper gegen menschlichen TC-CSF.

35. Ein Immuntest, der menschlichen TC-CSF oder einen menschlichen TC-CSF-Liganden verwendet.

36. Ein Hybridisierungstest, der den Schritt des Hybridisierens mit einem Polynukleotid, das eine menschlichen TC-CSF-kodierende Sequenz von Nukleotiden oder eine Sequenz von Nukleotiden, die komplementär dazu ist, umfaßt.

37. Ein Primer-Verlängerungstest, der den Schritt des Verwendens einer menschlichen TC- CSF-codierenden Sequenz von Nukleotiden oder einer Sequenz von Nukleotiden, die komplementär dazu ist, als Primer umfaßt.

38. Ein Testkit für menschlichen TC-CSF.

39. Die Verwendung eines menschlichen TC-CSF-Polypeptids bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der der Therapie bedarf, wobei der TC-CSF durch eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 codiert ist.