DE3880922T2

DE3880922T2 - Faktor viii-analog, verfahren zu dessen herstellung und dieses enthaltende zusammensetzung.

Info

Publication number: DE3880922T2
Application number: DE8888402078T
Authority: DE
Inventors: Pierre Meulien; Andrea Pavirani
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1987-08-11
Filing date: 1988-08-10
Publication date: 1993-08-26
Anticipated expiration: 2008-08-11
Also published as: JPS6479124A; FR2619314B1; US5112950A; DE3880922D1; EP0303540A1; EP0303540B1; JP2694280B2; FR2619314A1; CA1341169C; ATE89315T1; ES2054842T3

Description

Die Klonierung der cDNA des Faktors VIII (FVIII) (1- 3) erlaubte es, die Struktur und die Funktionen dieses komplexen Moleküls besser zu verstehen.
Das erste Translationsprodukt der mRNA ist ein Molekül aus 2351 Aminosäuren, das ein Signal-Peptid von 19 Aminosäuren umfaßt. Man beobachtet interne Homologien in den Aminosäuresequenzen, die es erlauben, Domänen (Bezirke) zu definieren: ein Triplett von Domänen A, eine einzelne Domäne B und ein Duplett von Domänen C, die in der folgenden Reihenfolge angeordnet sind: A1-A2-B-A3-C1- C2 (2,4).
Die einzelne Domäne B wird durch ein Exon von 3100 pb (Exon 14 des Gens FVIII) codiert (5) und sie enthält 19 der 25 potentiellen Glycosylierungs-Stellen (Asn); dieser Teil des Moleküls wird bei der Aktivierung durch Thrombin abgeschnitten (abgespalten) und geht verloren (2, 4, 6).
Das derzeitige Modell des Mechanismus der Reifung des Faktors VIII ist in der Fig. 1 schematisch dargestellt.
Bei diesem Modell ist die erste Aktivierung zurückzuführen auf eine Spaltung (Schnitt) des Moleküls zwischen den Aminosäuren Arg¹&sup6;&sup4;&sup8; und Glu¹&sup6;&sup4;&sup9;, was zu einem Vorläufer einer leichten Kette von 80 Kd und zu einem Vorläufer einer schweren Kette von > 200 Kd führt.
Die beiden Ketten sind wahrscheinlich durch ein Metallion (Ca&spplus;&spplus; ?) miteinander verbunden, bevor die Spaltung durchgeführt wird.
Anschließend wird die Domäne B durch mehrere proteolytische Spaltungen (Schnitte) abgebaut, dann wird die Aktivierung mit Thrombin durchgeführt durch eine Spaltung (Schnitt) zwischen den Aminosäuren Arg&sup7;³&sup9; und Ser&sup7;&sup4;&sup0; und zwischen Arg¹&sup6;&sup8;&sup9; und Ser¹&sup6;&sup9;&sup0;, wobei man eine schwere Kette von 90 Kd und eine leichte Kette von 73 Kd erhält. Ob es erforderlich ist, eine ergänzende Spaltung (Schnitt) zwischen Arg³&sup7;¹ und Ser³&sup7;² durchzuführen, um eine maximale Aktivität zu erzielen, ist noch umstritten; diese Spaltung könnte im Gegenteil das Molekül destabilisieren (6,7).
Es ist allgemein anerkannt, daß eine längere Inkubation in Gegenwart von Thrombin eine schnelle Abnahme der Aktivität mit sich bringt. Andere Faktoren können ebenfalls den Faktor VIII inaktivieren, wie das aktivierte Protein C und der Faktor Xa, der das Molekül an mehreren Punkten spaltet (schneidet), insbesondere bei Arg³³&sup6;/Met³³&sup7; (7).
Bei diesem Reifungsprozeß stellt man fest, daß die Domäne B keine Rolle in der Aktivität des reifen Moleküls spielt, da sie nach der Aktivierung durch Thrombin verloren geht. Darüber hinaus haben Toole et al. (8) die Nucleotid-Sequenzen der Gene des Human- und Schweine-Faktors VIII miteinander verglichen und gezeigt, daß die beiden Domänen B sehr verschieden sind, während die schweren und leichten Ketten weitgehend beibehalten werden. Dies läßt vermuten (8, 9, 10, 11), daß ein Molekül, das frei von der Domäne B ist, seine prokuagulierende Funktion nicht verliert.
Es wurden zwei Methoden angewendet, um diese Hypothese zu testen: die Deletion (Auslöschung) von großen DNA-Fragmenten, die der Domäne B entsprechen, in der cDNA, wobei man kürzere Derivate des Faktors VIII erhält (8,9), oder die Coexpression von DNA-Fragmenten, die den schweren und leichten Ketten entsprechen, in Säugetier-Zellen (10, 11).
Die Coexpression der schweren und leichten Ketten in Säugetierzellen führt darin zu einer nachweisbaren Bildung von FVIII:C, jedoch auf einem Niveau, das fünfmal niedriger ist als dasjenige, das durch die Expression des vollständigen Moleküls erzielt wird. Dies läßt vermuten, daß die Verknüpfung der zwei Ketten unwirksam ist, wodurch die Aktivität des Moleküls vermindert wird (10, 11).
Diese Erfahrungen haben gezeigt, daß ein Molekül, das frei vom größten Teil der Domäne B ist, das jedoch die Reifungsstellen noch enthält, die den Aminosäuren 740, 1649 und 1690 entsprechen (die für die Aktivierung erforderlich zu sein scheinen), eine normale procoagulierende Aktivität aufweist und darüber hinaus den Vorteil hat, daß es 10 mal wirksamer in Säugetierzellen exprimiert wird (8). Dieses Molekül kann durch das Thrombin auf die gleiche Weise aktiviert werden wie das ganze natürliche Molekül (9).
Der Faktor VIII, der in dem Plasma zirkuliert, ist mit dem von Willebrand-Faktor (fvW) verbunden, der ihn zu stabilisieren scheint; die in vivo-Halbwertszeit des FVIII nimmt nämlich in Abwesenheit von fvW sehr stark ab (16).
Eaton et al. (9) haben ein Derivat des Faktors VIII beschrieben, das in der Domäne B delektiert (ausgelöscht) ist, das den fvW wirksam bindet, wodurch es möglich ist, eine normale in vivo-Halbwertszeit für das deletierte Molekül der Domäne B zu erzielen.
Die vorliegende Erfindung betrifft das Analogon des Faktors VIII, dessen Aminosäuren 771 bis 1666 deletiert (ausgelöscht) sind. Es wird hier in der Beschreibung und in den Beispielen als FVIII ΔII bezeichnet.
Das erfindungsgemäße Analogon des Faktors VIII wird vorzugsweise hergestellt aus einer Eukaryonten-Zellenkultur, die das Analogen auf einem geeigneten Kulturmedium bilden, und durch Abtrennung des erhaltenen Faktors VIII.
Die Zellen werden erfindungsgemäß vorzugsweise durch einen rekombinanten Virus-Vektor, wie den Vaccine-Virus (Kuhpocken-Virus), infiziert, der die Expression der cDNA des Analogons des Faktors VIII in die Zellen gewährleistet. Es handelt sich dabei vorzugsweise um BHK21-Zellen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können die Zellen aber auch transfektiert werden durch einen Integrationsvektor, der umfaßt die cDNA des Analogons des Faktors VlII, der umgeben ist von für seine Expression in die Eukaryonten-Zellen erforderlichen Elementen und ein DNA-Segment, das die Integration des Vektors in die Zell-DNA begünstigt.
In diesem Falle wird die cDNA, die für das Analogon des Faktors VIII codiert, vorzugsweise vor einem Gen inseriert, das für einen Selektions-Marker codiert, wobei man ein bicistronisches Transkriptionsprodukt erhält.
Die transfektierten Zellen sind vorzugsweise CHO-Zellen.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktives Prinzip (Wirkstoff) das erfindungsgemäße Analogen des Faktors VIII enthält.
Eine solche Zusammensetzung kann außerdem den von Willebrand-Faktor enthalten.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung liegt vorzugsweise in einer sterilen injizierbaren Form vor.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Reifung des Moleküls des Faktors VIII durch aufeinanderfolgendes proteolytisches Schneiden (Spalten) (nach Toole et al. 1984 (2) und Eaton et al. 1986 (7));
Fig. 2 eine schematische Darstellung des Moleküls des Faktors VIII und der beiden Deletionen ΔI (aa 868 bis 1562) und ΔII (aa 771 bis 1666) . Die Schnittstellen durch das Thrombin (IIa) und durch eine unbekannte Protease (X&sub1; in der Position 1649) sind durch Pfeile angezeigt. Die untere Linie repräsentiert die Sequenz der cDNA mit den Restriktionsstellen, die bei den verschiedenen Konstruktionen angewendet werden;
Fig. 3 eine schematische Darstellung des Expressionsvektors von rFVIII, der für die Transformation der CHO-Zellen verwendet wird;
Fig. 4 die Kinetik der Aktivierung verschiedener Moleküle des Faktors VIII durch Thrombin;
pd = Plasma-Derivat
r = intaktes rekombinantes Molekül
ΔII = deletiertes Molekül ΔII
Fußonte: Die Numerierung der Nucleotide und der Aminosäuren ist diejenige nach Wood et al. (1).

Beispiel 1

Herstellung von Plasmiden, die Derivate der cDNA des Faktors VIII tragen, die in dem der Domäne B entsprechenden Bereich deletiert (ausgelöscht) sind

Das Ausgangs-Plasmid ist das Plasmid pTG1080, welches die cDNA des Faktors VIII, die Nucleotide -64 bis 8230, kloniert an der Stelle SalI von pUC8 trägt (dieses Plasmid ist in dem französischen Patent 86 08 258 beschrieben).
Ausgehend von diesem Plasmid wurden zwei Derivate hergestellt, das eine (ΔI) umfaßt eine Deletion in dem den Aminosäuren 868 bis 1562 entsprechenden Bereich; das andere (ΔII) entspricht einer Deletion der Aminosäuren 771 bis 1666.
Die Konstruktion ΔII hebt dann die Schnittstelle in der Position 1649 auf.
Die beiden Konstruktionen sind in der Fig. 2 schematisch dargestellt.
a) Das Plasmid pTG1080 wird durch das Enzym PstI digeriert unter Freisetzung eines Fragments von 2,7 kb, welches das 5'-Ende umfaßt, das den Nucleotiden -64 bis 2641 der cDNA des Faktors VIII entspricht.
Dieses Fragment PstI wurde in den Vektor pTG1POLY (dem Klonierungsvektor-Derivat von pML2, das einen aktiven Replikationsursprung aufweist) in E. coli und das Gen der β-Lactamase kloniert, in das ein "Polylinker" inseriert wurde, der 12 einzelne Restriktionsstellen aufweist. Dieser Vektor ist identisch mit dem in dem Patent PCT/FR85/00096 beschriebenen Vektor pTG14 mit Ausnahme des "Polylinkers", der den "Linker" HindIII ersetzt. Bei dieser Konstruktion ist die Stelle BglII des Polylinkers benachbart zu der Stelle PstI (Nucleotid 2641) der Sequenz FVIII.
Anschließend führt man in diese Stelle BglII ein, die 3'-Position der Codierungs-Sequenz von FVIII (Nucleotide 4801 bis 8230) in Form des Fragments BamHI, das ebenfalls aus pTG1080 isoliert wurde.
Die Konstruktion, welche die beiden Segmente von FVIII in der richtigen Orientierung aufweist, wird als pTG1501 bezeichnet. Die Sequenz der cDNA FVIII, die von dieser Konstruktion getragen wird, wird als FVIII ΔI bezeichnet. Die so gebildete Verbindungsstelle PstI/BglII/BamHI) behält die Lesephase von FVIII bei.
b) Ausgehend von pTG1501 gewinnt man ein Fragment KpnI- SphI (das den Nucleotiden 1811 bis 6580 entspricht), um es in den Vektor M13TG131 einzuführen (20) und daraus die Nucleotide 2367 bis 5056 zu deletieren (auszulöschen) nach einer Methode, die als "Loop out-Mutagenese", bezeichnet wird (17), mit einem Synthese-Oligonucleotid, das die folgende Sequenz aufweist:
5'TCATTTCAACTGATATGGTGTCAGTCTT3'
Der deletierte (ausgelöschte) Vektor wird als M13TG1510 bezeichnet; die deletierte Sequenz von cDNA FVIII wird als FVIII ΔII bezeichnet. Die Sequenzierungs- Analyse bestätigt, daß die Sequenz richtig ist.

Beispiel 2

Expression der Sequenzen FVIII ΔI und ΔII durch rekombinante Vaccine (Kuhpocken)-Viren

In dem französischen Patent 86 08258 ist das Plasmid pTG1016 beschrieben, das die cDNA-Sequenz des Faktors VIII stromabwärts von dem Promotor des Gens trägt, das für das Protein 7,5 K des Vaccine-Virus codiert, und dieser Expressionsblock wird in das TK-Gen des Vaccine-Virus inseriert.
Ein Derivat des Plasmids pTG1016, das pTG1030 (das mit dem vorgenannten identisch ist mit Ausnahme einer Deletion BglII-PstI in dem nicht übertragenen 5'-Bereich der Sequenz FVIII) wurde verwendet, um die deletierten Konstruktionen FVIII ΔI und ΔII anstelle der nativen Sequenz in den Vektor zu integrieren, der konzipiert ist, um die Integration in das Genom des Vaccine-Virus zu erlauben.
Das Fragment BamHI-BglI (das den Nucleotiden 1864 bis 6050 entspricht) der nativen Sequenz von pTG1030 wird herausgeschnitten und durch das Fragment BamHI-GblI von pTG1501 (FVIII ΔI) ersetzt unter Bildung von pTG1506 oder durch das Fragment BamHI-BglI von M13TG1510 (FVIII ΔII) ersetzt unter Bildung von pTG1507.
Die DNA-Blöcke, die dem Vaccine-Gen TK entsprechen, das unterbrochen ist durch die cDNA FVIIIΔ, das unter dem Promotor 7,5 K des Vaccins angeordnet ist, werden in das Genom des Vaccine-Virus integriert durch homologe Rekombination nach dem klassischen Verfahren (18).
Die entsprechenden rekombinanten Viren werden als VV.TG.FVIII1506 (FVIIIΔI)und VV.TG.FVIII1507 (FVIIIΔII). bezeichnet.
Die rekombinanten Viren werden verwendet, um den Zell-Rasen von BHK21 (2.10&sup6; Zellen) mit 1 ufp/Zelle zu infizieren. Nach 1-stündiger Adsorption werden die Kulturen gewaschen und in einem frischen Medium ohne Serum, dem 1 % BSA und 1 mM CaCl&sub2; zugesetzt worden sind, erneuert. Nach 24 h und nach 48 h werden Medium-Proben entnommen und es werden die Menge an darin vorhandenem Faktor VIII, bestimmt durch radioimmunometrische Messung (FVIII:Ag), und die prokoagulierende Aktivität des Faktors VIII (FVIII:C) gemessen.
Das Antigen FVIII oder FVIIIΔ wird in "Sandwichform" zwischen das Immunglobulin G eines hämophilen Inhibitor- Patientenserums, das an der Wand des Reagensgläschens adsorbiert wurde, und einen monoklonalen Antikörper Antifaktor VIII, der für ein radioaktives Epitop der leichten Kette spezifisch ist, nach einem von Lee et al beschriebenen Verfahren eingeführt (21).
Die Messung der Aktivität des Faktors VIII (FVIII:C) wird auf klassische Weise durch die aktivierte Thromboplastin-Partialzeit (TPTA) durchgeführt (22).
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Tabelle 1 Bestimmung der Menge an FVIII:Ag und der prokoagulierenden Aktivität von FVIII:C in der überstehenden Flüssigkeit von BHK21-Kulturen, die mit den rekombinanten Viren VV infiziert worden sind (die Ergebnisse sind ausgedrückt in mU/ml - Nachweis-Schwellenwert = 1 mU/ml) rekombinante VV-Viren
Die Ergebnisse zeigen, daß die deletierten (ausgelöschten) beiden Moleküle in einem Blutkoagulationstest biologisch aktiv sind und daß man eine größere Menge an Protein mit den Konstruktionen FVIIIΔ erhält als mit dem intakten FVIII (Erhöhung um das 2-fache mit FVIII ΔI und um das 5-fache mit FVIII ΔII).
Darüber hinaus fällt die Aktivität von FVIII:C zwischen 24 und 48 h nicht ab, während sie bei dem intakten Molekül abfällt. Man weiß, daß dieses durch den von Willebrand-Faktor stabilisiert werden muß, um seine Aktivität beizubehalten (französisches Patent 86 08 258).

Beispiel 3

Erstellung von Zellinien, die den Faktor VII oder den Faktor VIII ΔII exprimieren

1) Konstruktion von Plasmiden

Die codierenden Sequenzen des Faktors VIII und des Faktors VIII ΔII wurden in einen Vektor pTG384 eingeführt, der konzipiert wurde, um seine Integration in das Genom von Säugetierzellen in Form von Mehrfachkopien zu fördern. Dieser Vektor ist in dem französischen Patent 86 09 043 beschrieben. Die wichtigen Elemente dieses Vektors (vgl. Fig. 3) sind folgende:
a) ein Maus-Mitochondrien-DNA-Segment, das die Integration der exogenen DNA-Sequenzen in Form von mehreren Kopien in Form als Tandem begünstigt (15);
b) eine Expressionskassette, welche die "Verbesserungs"- Sequenzen (Transkriptions-Aktivator) von SV 40 (wiederkehrende Sequenzen von 72 pb), den Hauptverzögerungspromotor (MLP) des Adenovirus 2, das Gen, das für den Selektions-Marker XGPRT (Xanthin-Guanin-Phosphoriboxyl- Transferase) codiert, umfaßt. Der Vektor ist so konzipiert, daß er die Insertion des Gens XGPRT einer ausgewählten cDNA in 5'-Stellung in der Weise erlaubt, daß man ein bicistronisches Transkriptionsprodukt erhält. Der Vektor umfaßt außerdem in 3'-Stellung von XGPRT das Intron des kleinen Antigens t von SV40 und seine Polyadenylierungssequenzen;
c) die Vermehrung des Vektors in E. coli wird durch den Replikationsursprung ColE1 gewährleistet.
Die codierenden Sequenzen von FVIII werden in den Vektor pTG384 in die einzelne Stelle HindIII (stromaufwärts von dem Gen XGPRT) inseriert. Die durch die Digerierung freigesetzten Enden HindIII werden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der Polymerase I-DNA freigemacht.
Man gewinnt die vollständige Sequenz von FVIII aus dem Plasmid pTG1080 (vgl. Beispiel 1) in Form des Fragments SmaI-HpaI (die Stelle SmaI ist in dem "Polylinker" stromaufwärts von der Initiator-ATG angeordnet und die Stelle HpaI ist in dem Nucleotid 7434 angeordnet). Die Ligation dieses Fragments in dem Vektor pTG384, der durch HindIII geöffnet und mit dem Klenow-Fragment behandelt worden ist, ergibt das Plasmid pTG1020.
Um die Konstruktion analog zu dem deletierten Gen des Faktors VIII zu machen, tauscht man in dem pTG1020 das Fragment GamHI-BglI (die Nucleotide 1864 und 1650 von FVIII) gegen das Fragment FVIII ΔII, BamHI-BglI von M13TG1510 nach dem gleichen Prinzip aus wie für die Konstruktion von pTG1507. Der Vektor pTG304, der in FVIII Δ II inseriert worden ist, wird als pTG1509 bezeichnet.

2) Transfektion der CHO-Zellen mit den Plasmiden pTG1020 und pTG1509

CHO-Zellrasen wurden mit der DNA der Plasmide pTG1020 (FVIII) oder pTG1509 (FVIII ΔII) transfektiert nach der Calciumphosphatfällungs-Methode (19) mit 5 oder 10 µg DNA pro Petrischale mit einem Durchmesser von 8,5 cm. 48 h nach der Transfektion werden die Zellen mit Trypsin behandelt, verdünnt und in ein selektives Medium MEM α2000, das durch Hypoxanthin (15 mg/l), Thymidin (10 mg/l), Xanthin (250 mg/l) Aminopterin (0,2 mg/l), Mycophenolsäure (25 mg/l) und 10 %iges dialysiertes Kalbsfötusserum ergänzt worden ist, inokuliert.
Nach 2 Wochen werden die gegenüber dem selektiven Milieu resistenten Zellklone entnommen, in 1 mm-Gläschen und dann in 2 mm-Gläschen kultiviert. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 % erreicht haben, wird das Medium entnommen, die Zellrasen werden gewaschen und in einem frischen Medium, das 5 % inaktiviertes Serum enthält (um ein starkes Hintergrundrauschen in den Koagulationstests zu vermeiden) erneuert.
Nach 24 h wird das Medium geerntet und analysiert zur Bestimmung der Anwesenheit (FVIII:Ag) und der Aktivität (FVIII:C) des Faktors VIII. Dabei werden mehrere Klone erhalten. Bei der ersten Analyse scheint es, daß die Mehrzahl der Klone, die den vollständigen FVIII exprimieren, weniger Material bilden als die Klone, die den Faktor VIII Δ II exprimieren.
Es wurden zwei Klone selektioniert:
CHO-TG1020-22-12, der den vollständigen FVIII exprimiert, und
CHO-TG15O9-18, der den FVIII ΔII exprimiert.
Die Expressions- und Aktivitätswerte von FVIII sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Tabelle 2 Bestimmung von FVIII:Ag und FVIII:C in der überstehenden Flüssigkeit der CHO-Klone (10&sup6; Zellen), die nach 24 h geerntet wurde.
Man stellt eine Bildung des Faktors VIII ΔII fest, die 10-fach höher ist als diejenige des vollständigen Faktors VIII, was die in dem Vaccine-Modell beobachteten Ergebnisse bestätigt.

Beispiel 4

Aktivierung verschiedener Moleküle des nativen Faktors VIII und von Rekombinanten durch Thrombin

Verschiedene Moleküle des Faktors VIII wurden in einer Kinetik zur Aktivierung durch Thrombin miteinander verglichen: der aus dem Plasma gewonnene native Faktor VIII und der rekombinante vollständige und ΔII Faktor VIII, die in die CHO-Klone exprimiert worden sind.
Die Aktivierung wird nach einem klassischen Koagulationstest (TPTA) nach der Inkubation in Gegenwart von katalytischen Thrombin-Mengen bestimmt.
Die Fig. 4 zeigt, daß der rekombinante FVIII und der Plasma-FVIII in gleicher Weise aktiviert sind (um einen Faktor 20) und nach sehr ähnlichen Kinetiken. Der FVIII Δ II ist viel stärker aktiviert (um einen Faktors 80 nach 5- minütiger Inkubation mit Thrombin).
Obgleich der Faktors VIII ΔII viel stärker aktiviert ist, wird er nicht schneller aktiviert als die beiden anderen Moleküle (im Gegensatz zu dem, was von anderen (9) bei ihren Konstruktionen des Faktors VIIIΔ beobachtet wurde), was zeigt, daß der Faktors VIII ΔII nicht voraktiviert ist, was wichtig ist im Hinblick auf seine therapeutische Verwendung.
Die Tatsache, daß FVIII ΔII nicht voraktiviert ist, wird durch die gute Korrelation zwischen den Gehalten an FVIII:Ag und FVIII:C sowohl in dem Vaccine-Modell als auch in den CHO-Linien bestätigt.

Hinterlegung von repräsentativen Stämmen der Erfindung

Die folgenden Stämme wurden bei der Collection Nationale de Culture des Microorganismes, 25 Rue de Docteur Roux, Paris, am 24. Juli 1987 hinterlegt:
E. coli BJ5183/pTG1020 unter der Nr. I-679
C. coli 5K/pTG1507, unter der Nr. I-680
E. coli BJ5183/pTG1509 unter der Nr. I-681

Literaturstelle

1) W.I. Wood, et al. "Nature" 312, 330 (1984).
2) J.J. Toole et al."Nature" 312, 342 (1984).
3) M.A. Truett et al. "DNA" 4, 333 (1985).
4) G.A. Vehar et al. "Nature" 312, 337 (1984).
5) J. Gitschier et al. "Nature" 312, 326 (1984).
6) C.A. Fulcher et al. "Blood" 61, 807 (1983).
7) D.L. Eaton et al. "Biochemistry" 25, 505 (1986).
8) J.J. Toole, et al. "Proc. Natl. Acad. Sci USA" 83, 5939 (1986).
9) D.L. Eaton et al. "Biochemistry" 25, 8343 (1986).
10) R.L. Burke et al. "Biol. Chem." 261, 12574 (1986).
11) A. Pavirani et al. "In press."
12) A. Pavirani et al. "Bio/Technology" (1987).
13) R.C. Mulligen und P. Berg "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 78, 2072-2076 (1981).
14) H. De La Salle und R. Elkaim, "französisches Patent Nr. 86.09043.
15) Lutfalla et al. "Somatic cell and Mol. Genet." 11, 223-238.
16) K.M. Brinkhous et al. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 82, 8752-8756 (1985).
17) M.J. Zoller und M. Smith "Methods Enzymol." 100B, 408-500 (1983).
18) M.P. Kieny et al "Nature" 312, 163-166 (1984).
19) F.L. Graham und A.J. van der Eb, "Virology" 52, 456- 467 (1973).
20) M.P. Kieny, R. Lathe und J.P. Lecocq, "Gene" 26, 91- 99 (1983).
21) M.L. Lee, E.A. Maghalang und M.J. Kingdon, "Thromb. Res." 30, 511-519 (1983).
22) J.P. Girma, J.M. Lavergne, D. Meyer und M.J. Larrien "Br. J. Haematol." 47, 269-282 (1981).

Claims

1. Analogon des Faktors VIII, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei handelt um die deletierte (ausgelöschte) Verbindung der Aminosäuren 771 bis 1666.

2. Verfahren zur Herstellung des Analogons des Faktors VIII nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Eukaryonten-Zellen kultiviert, die das Analogon auf einem geeigneten Kultur-Medium bilden, und daß man das erhaltene Analogen des Faktors VIII abtrennt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Eukaryonten-Zellen durch einen rekombinanten Virus-Vektor infiziert worden sind, um die Expression der cDNA zu gewährleisten, die für das Analogon des Faktors VIII codiert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Virus-Vektor um das Vaccine-Virus handelt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die infizierten Zellen BHK21- Zellen sind.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Eukaryonten-Zellen durch einen Integrations-Vektor transfektiert worden sind, der umfaßt die cDNA des Analogons des Faktors VIII und die für seine Expression in die genannten Eukaryonten-Zellen erforderlichen Elemente sowie ein DNA-Segment, das die Integration des Vektors in die Zell-DNA begünstigt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Analogon des Faktors VIII codierende cDNA inseriert wird vor einem Gen, das für einen Selektionsmarker codiert, um ein bicistronisches Transkriptionsprodukt zu ergeben.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Eukaryonten-Zellen CHO-Zellen sind.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktives Prinzip (Wirkstoff) das Analogen des Faktors VIII nach Anspruch 1 enthält.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem den von Willebrand-Faktor enthält.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um eine Zusammensetzung in einer injizierbaren sterilen Form handelt.