DE68919229T2

DE68919229T2 - Hybride prokoagulierende proteine.

Info

Publication number: DE68919229T2
Application number: DE68919229T
Authority: DE
Inventors: Randal Kaufman; Debra Pittman
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1988-11-14
Filing date: 1989-11-14
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2009-11-15
Also published as: AU4644689A; EP0442961B1; ATE113475T1; WO1990005530A1; EP0442961A1; US5004803A; DE68919229D1; EP0442961A4; JPH04501508A

Description

Die DNA-Sequenzen, die den menschlichen Blutgerinnungs- Cofaktor Faktor VIII:C (FVIII) codieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt (vgl. zum Beispiel Toole et al., Nature 312 (1984), 312-317; Wood et al., Nature 312 (1984), 330-337; Vehar et al., Nature 312 (1984), 337-342), sowie Verfahren sie zu exprimieren, wobei ein rekombinanter FVIII hergestellt wird (vgl. zum Beispiel WO 87/04187, WO 88/08035 und WO 88/03558). Über Blutgerinnungs-FVIII-Analoge und sie codierende DNA- Sequenzen wurde ebenfalls berichtet (vgl. zum Beispiel WO 86/06101 und WO 87/07144). Im allgemeinen sind solche Analoge so modifiziert, daß ein Teil oder die gesamte B-Domäne fehlt und/oder spezifische Aminosäurepositionen modifiziert sind, zum Beispiel so, daß die normalerweise Protease-labilen Stellen gegen eine Proteolyse, zum Beispiel durch Thrombin oder das aktivierte Protein C, resistent sind. Andere Analoge schließen eine Modifikation an einem oder mehreren Lysin- und/oder Tyrosinresten ein.
Aus Gründen, die noch nicht nit Sicherheit bestimmt wurden, läuft die Expression des rekombinanten FVIII auf verhältnismäßig niedrigem Niveau ab. Verschiedene Verfahren wurden entwickelt, die dazu beitragen, den sonst niedrigen Expressionsspiegel von FVIII und Analogen davon zu steigern, einschließlich der Expression in Gegenwart von Phospholipiden oder des von Willebrand-Faktors (vWF) oder Analogen davon (vgl. zum Beispiel WO 87/04187 und WC 88/08035), der Expression von FVIII in Zellen, die geringe Mengen eines endogenen Proteins des endoplasmatischen Petikulums, das bekannt ist als BiP, exprimieren (vgl. zum Beispiel WO 88/03558) und einer Deletion in der B-Domäne von FVIII oder Analogen davon (vgl. zum Beispiel WO 86/06101).
Der Faktor V (FV) ist ein anderer hochmolekularer Glycoprotein-Cofaktor, der an der Koagulationskaskade beteiligt ist. Ein menschliches FV-Gen wurde cloniert und sequenziert (vgl. zum Beispiel Jenny et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 4846-4850).
Während sich FVIII und FV in der Sequenz voneinander unterscheiden, haben sie bestimmte organisatorische Eigenschaften gemeinsam, beide werden, wie nachstehend schematisch dargestellt, durch DNAs exprimiert, die drei "A"-Domänen, eine "B"-Domäne" und zwei "C"-Domänen codieren:
Im FVIII gehen A-2 und A-3 stark saure Peptidbereiche voraus.
Überraschend wurde auch festgestellt, daß die B-Domäne für die Blutgerinnungs-Aktivität von FVIII nicht notwendig ist und daß das aktive Blutgerinnungs-Protein durch Expression einer FVIII codierenden DNA exprimiert und sezerniert werden kann, in der ein Teil oder der gesamte die B-Domäne codierende Nucleotidbereich fehlt. Das aktive Protein wird nicht nur hergestellt und sezerniert, sondern es reichert sich auch in höheren Mengen in den Medien an als wenn es durch die vollständige DNA exprimiert wird.
Die verminderte Menge des aktiven Blutgerinnungs-FVIII- Proteins in den Medien wurde mindestens teilweise auf mehrere Faktoren zurückgeführt (vgl. zum Beispiel WO 87/04187, WO 88/08035 und WO 88/03558).
Diese Erfindung stellt neue Hybrid-DNAs bereit, die Blutgerinnungs-Hybridproteine codieren, die durch gentechnische Verfahren in höherer Ausbeute und/oder in homogenerer Form als der rekombinante menschliche FVIII hergestellt werden können. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Proteine stabilere Procoagulantien sein oder stabilere aktivierte Arten ergeben; sie können nicht durch Antikörper gegen den nativen PVIII gehemmt werden und können so bei der Behandlung von Blutungsstörungen bei Patienten, die solche Antikörper aufweisen, bevorzugt werden.
Erfindungsgemäße Hybridproteine umfassen Blutgerinnungs-FVIII-Proteine, die anstelle eines Teils oder aller von einer oder mehreren FVIII-Domänen die entsprechenden Polypeptidbereiche von FV enthalten. DNAs, die die Faktor VIII/Faktor V-Hybridproteine codieren, umfassen DNAs, die ein Protein mit Blutgerinnungs-Aktivität codieren (gemessen durch herkömmliche Tests, wie nachstehend beschrieben), die unter stringenten Bedingungen mit einer FVIII codierenden cDNA, vorzugsweise menschlichem FVIII, hybridisieren und mit einer FV codierenden cDNA, vorzugsweise menschlichem FV. Natürlich sind auch DNAs eingeschlossen, die so hybridisieren, die jedoch synonyme Codons einschließen. Die DNA kann weiter modifiziert sein, zum Beispiel an einer oder mehreren Stellen, die proteolytische Spaltungsstellen, Sulfatierungsstellen, etc. codieren, wie in der WO 87/07144 beschrieben, und/oder durch Deletion im die B-Domäne codierenden Bereich. Die DNA kann weiter modifiziert werden, wie in der WO 87/07144 beschrrneben ist, jedoch an den entsprechenden FV-Stellen.
Man nimmt an, daß die FVIII-FV-Hybridproteine, die durch diese chimären Gene codiert werden und die einen Teil oder die gesamte FV-B-Domäne anstelle des entsprechenden FVIII-Bereichs enthalten, in höheren Mengen exprimieren werden können als die, die mit dem FVIII-Wildtyp üblicherweise erhalten werden. Tatsächlich scheint dies für Fälle zu stimmen, die bis jetzt ausgewertet wurden (vgl. zum Beispiel Tabelle II). Außerdem nimmt man an, daß die hergestellten Proteine in einkettiger Form zum Beispiel, wo spezifische proteolytische Spaltungsstellen zusätzlich modifiziert sind) oder als zweikettiges Protein erhältlich sind. Im letzteren Fall nimmt man an, daß das Protein nach dem proteolytischen Ausschneiden der FV- oder FVIII-B-Domäne als Komplex aus Untereinheiten von etwa 90 kD und 80 kD gewonnen wird oder als Komplex einer 80 kD großen Untereinheit der leichten Kette mit einer schweren Kette im Bereich von 90 kD bis etwa 200 kD. In allen Fällen nimmt man an, daß das Protein die Blutgerinnungs-Aktivität in herkömmlichen Koagulierungstests beibehält, wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird.

Erfindungsgemäße DNA-Sequenzen

Ein Gesichtspunkt dieser Erfindung ist die Bereitstellung einer DNA-Hybridsequenz, die eine Polypeptidsequenz codiert, die im wesentlichen dem menschlichen FVIII oder Varianten davon entspricht, und die mit Ausnahme eines oder mehrerer Bereiche, die einen Teil oder den gesamten Bereich einer FV-Domäne codieren, modifiziert wurde, wie jetzt auf dem Fachgebiet bekannt ist oder wie in verschiedenen Patentanmeldungen offenbart wurde. Zum Beispiel umfaßt eine solche Domäne, die die B-Domäne codiert, die Aminosäurepositionen 740 bis 1649, wobei die Numerierung mit dem N-Terminus des reifen Proteins, nämlich dem Rest Ala-1 beginnt. Innerhalb des (der) modifizierten Bereichs(e) umfaßt die DNA-Sequenz eine Nucleotidsequenz, die eine Peptidsequenz codiert, die gleich oder im wesentlichen gleich der menschlichen FV-Peptidsequenz ist, vorzugsweise entsprechend der Sequenz, die in FVIII modifiziert wurde. Es ist selbstverständlich, daß der Rest der DNA-Sequenz den nativen menschlichen FVIII codieren oder eine zusätzliche Modifikation umfassen kann, wobei ein Teil der Polypeptidsequenz deletiert ist, wie zum Beispiel in der WO 86/06101 oder WO 87/07144 offenbart wurde, und/oder eine Modifikation an einer oder mehreren spezifischen Stellen, wie zum Beispiel in der WO 87/07144 offenbart wurde, die auch exemplarische Oligonucleotide und Verfahren zur Durchführung einer solchen zusätzlichen Modifikation offenbaren.
Eine erfindungsgemäße DNA-Variante umfaßt auch allele Variationen, d.h. Variationen in der Sequenz aufgrund der natürlichen Variabilität von Individuum zu Individuum oder mit anderen Codonsubstitutionen oder -deletionen, die die Blutgerinnungs-Aktivität des Faktor VIII:c-Typs beibehalten.
Folglich umfaßt diese Erfindung DNA-Sequenzen, die ein Blutgerinnungs-Protein codieren. Die Sequenzen können wie nachstehend erörtert unter stringenten Bedingungen mit der in pSP64-VIII inserierten cDNA hybridisieren, die den Wildtyp des menschlichen FVIII codiert solange die DNA-Sequenz innerhalb des die B-Domäne codierenden Bereichs, wie hier beschrieben, modifiziert ist, und mit einer menschlichen FV-cDNA, wie der in pMT2-V (ATCC-Nr. 40515) inserierten FV-cDNA (ATCC-Nr. 40515)

Herstellung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen

Alle erfindungsgemäßen DNA-Varianten können durch Modifizieren der den menschlichen FVIII codierenden DNA-Sequenzen hergestellt werden. Die DNA-Varianten-Sequenzen können durch eine herkömmliche Stellen-gerichtete Mutagenese der DNA- Sequenzen, die den menschlichen Faktor VIII:C oder Analoge davon codieren, hergestellt werden und/oder durch Ligierung der gewünschten DNA-Sequenzen.
DNA-Sequenzen, die den menschlichen Faktor VIII:C codieren, wurden cloniert. Eine cDNA, die das vollständige menschliche Protein codiert, sowie eine cDNA, die das Deletionsanalog pDGR-2 codiert, wurden bei der ATCC jeweils unter den Hinterlegungsnummern ATCC 39812 und 53100 hinterlegt.
Die Herstellung und/oder die Nucleotidsequenz einer vollständigen menschlichen cDNA des Faktors VIII:C wurde in den US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 546,650 (eingereicht am 28. Oktober 1983) und 644,086 (eingereicht am 24. August 1984) ausführlich dargelegt und in der internationalen Patentanmeldung PCT/US84/01641, veröffentlicht am 9. Mai 1985 (Veröffentlichungsnummer WO 85/01961). Ein rekombinanter pSP64-Clon, bezeichnet als pSP64-VIII, mit der vollständigen Nucleotidsequenz des menschlichen FVIII wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC 39812 hinterlegt.
Die Herstellung und die Nucleotidsequenz einer vollständigen cDNA des menschlichen FV wurde bei Jenny et al., a.a.O., dargelegt. Ein Säugetierexpressionsvektor mit der Nucleotidsequenz, die den menschlichen FV codiert, wie bei Jenny et al., a.a.O., veranschaulicht, wurde bezeichnet als pMT2-V und bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC 40515 hinterlegt.
Um genetische Manipulationen zu vereinfachen, wurden in die cDNAs von FVIII und FV durch Stellen-gerichtete Mutagenese nur einmal vorkommende Restriktionsstellen eingebaut. Solche Techniken wurden auch dazu verwendet, eine cDNA an spezifischen Stellen zu modifizieren, entweder durch Ersetzen oder Deletion einer oder mehrerer Basen. Solche Mutageneseverfahren schließen das M13-System von Zoller und Smith, Nucleic Acids Res. in (1982) , 6487-6500; Methods Enzymol. 100 (1983), 468- 500 und DNA 3 (1984), 479-488, unter Verwendung einzelsträngiger DNA ein und das Verfahren von Morinaga et al., Biotechnology Juli 1984), 636-639, unter Verwendung von Heteroduplex- DNA. Exemplarische Oligonucleotide, die gemäß solchen Verfahren verwendet werden, sind in Tabelle I aufgeführt. Es ist natürlich selbstverständlich, daß alle erfindungsgemäßen DNA- Varianten durch den Fachmann mit Verfahren, die z.B. hier für die exemplarischen Konstrukte beschrieben wurden, analog hergestellt werden können.
Der einfache Austausch von Domänen zwischen FVIII und PV wurde durch Einschleusen von MluI-Stellen in die cDNAs erzielt, die die jeweiligen Faktoren codieren. Da MluI weder innerhalb der cDNAs noch innerhalb des Vektorgerüsts spaltet, vereinfachen die nur einmal vorkommenden eingeschleusten MluI- Stellen die Fähigkeit, die Domänen zwischen den FVIII- und FV- cDNAs nach Belieben auszutauschen. Liegt eine solche Stelle in anderen cDNAs oder Vektoren vor, können solche Stellen natürlich durch Stellen-gerichtete Mutagenese verändert werden. Es ist selbstverständlich, daß andere nur einmal vorkommende Restriktionsstellen anstelle von MluI ähnlich eingeschleust werden können, oder daß natürlich vorkommende Restriktionsstellen der Einfachheit halber beseitigt werden können. Ergänzend hierzu erkennt MluI die DNA-Sequenz [5]'-ACGCGT-[3]', die Thr-Arg codiert. Dies ermöglicht das Einschleusen von MluI- Stellen an bestimmten Spaltungsstellen, zum Beispiel Thrombin- Spaltungsstellen, in denen der N-terminale Rest Arg ist. Man hofft, daß dies drastische Konformationsänderungen an der Stelle und eine erhebliche Beeinträchtigung der biologischen Aktivität vermeidet. Die bisherigen Ergebnisse bestätigen dieses Ziel. Die zur Vermittlung eines B-Domänen-Austausches zwischen den Faktoren V und VIII eingeschleusten bestimmten MluI- Stellen befinden sich in unserer FVIII-cDNA in Nucleotidpositionen, die den Peptidpositionen 739-740 (Änderung der codierten Sequenz -PR- zu -TR-) und den Positionen 1647-1648 (Änderung von -QR- zu -TR-) entsprechen, und in unserer FV-cDNA den Positionen 708-709 (Änderung von -IR- zu -TR-) und 1544-1545 (Änderung von -LR- zu -TR-) . Partielle Restriktionskarten sind nachstehend aufgeführt:
Um die exemplarische, FVIII codierende, jedoch eine FV- B-Domäne aufweisende DNA zu konstruieren, verwendeten wir das folgende Schema. Zuerst wurde der FVIII-MluI90K-Expressionsvektor mit MluI und SalI gespalten, wobei die FVIII-B-Domäne und der die leichte Kette codierende Bereich ausgeschnitten wurde. Der FVIII-MluI80K-Expressionsvektor wurde entsprechend gespalten und das die leichte Kette codierende MluI-SalI-Fragment wurde isoliert. Die FV-Expressionsvektoren MluI74K und MluI94K wurden mit MluI und BstEII gespalten, wobei die die FV-B-Domäne codierende DNA in zwei Teilen herausgeschnitten wurde. Die entstandenen DNAs wurden dann wie nachstehend veranschaulicht miteinander ligiert.
Der entstandene Vektor, der den FV-B-Domäne-codierenden Bereich in der richtigen Orientierung innerhalb der FVIII codierenden Sequenz enthält, wurde identifiziert und als pMT2-VIIIB5 bezeichnet. Es sollte angemerkt werden, daß die -T(R)-Codons an den 5'- und 3'-Verbindungsstellen der B-Domäne, falls erwünscht, durch eine herkömmliche Stellengerichtete Mutagenese wieder in -P(R)- und -L(R)-Codons umgewandelt werden können oder in alle anderen gewünschten Codons.
Dieses Verfahren kann dazu verwendet werden, einen anderen Bereich als den B-Domäne-codierenden Bereich oder einen Teil eines Bereichs auszutauschen und kann mehrfach wiederholt werden, wobei mehrere Bereiche ausgetauscht werden, wobei dazwischen, falls erwünscht, (durch Mutagenese) MluI- Stellen die nicht länger nützlich sind, entfernt werden können. In einer anderen Ausführungsform können zum Beispiel mehere MluI-Stellen (zum Beispiel 4, 6, 8, etc.) in den Startvektor eingebaut werden, wobei mehrere Bereiche für den Austausch definiert werden. In diesem Fall müssen die entstandenen Vektoren sorgfältig analysiert werden, um sicherzustellen, daß die Austausche ohne Verlust oder Desorientierung einer gewünschten Domäne richtig ausgeführt wurden.
Das B-Domänen-Austauschbeispiel veranschaulicht einen Gesichtspunkt dieser Erfindung, nämlich die Einschleusung von günstigen Restriktionsstellen, wie MluI-Stellen, in die Verbindungsstellen zwischen unterschiedlichen Domänen innerhalb der die Faktoren VIII und V codierenden DNAs und die Verwendung solcher DNAs bei der Konstruktion von Hybrid-DNAs, die FVIII-FV-Fusionsproteine codieren. Es ist selbstverständlich, daß es eine gewisse Flexibilität bei der Definition der Domänengrenzen gibt. Beispielsweise weist die A1-Domäne von FVIII ihre 3'-Grenze zwischen den Aminosäureresten 329 und 336 auf. Die 5'-Grenze der A2-Domäne von FVIII wird zwischen den Resten 337 und 372 liegend definiert. Die 3'-Grenze der FVIII- A2-Domäne wird zwischen den Resten 698 und 740 definiert. Die 5'-Grenze der FVIII-A3-Domäne wird zwischen den Resten 1689 und 1721 definiert. Die Flexibilität bei der Definition der Domänengrenzen wurde schon diskutiert. Vgl. Vehar et al., a.a.O.; Kane & Davie, Blood in (1988), 539, und Jenny et al., a.a.O.. Zur Vereinfachung werden häufig die Stellen der durch Thrombin, aktiviertes Protein C oder den Faktor Xa vermittelten Spaltung als Grenzen der Domänen genommen. Natürlich umfaßt diese Erfindung auch den Austausch von Teilen einer oder auch mehrerer Domänen.
Bei der Durchführung bestimmter spezifischer erfindungsgemäßer Ausführungsformen können MluI-Stellen in die FVIII und FV codierenden DNAs an oder innerhalb einer oder mehrerer der folgenden Domänengrenzen eingebaut werden: Aminosäurereste an den Domänengrenzen Domäne Grenze Saure Domäne der schweren Kette Saure Domäne der leichten Kette * Die Aminosäurenummer wird in Hinsicht auf das reife FVIII- oder FV-Polypeptid angegeben.
Als Beispiel für einen anderen Domänenaustausch kann anstelle der FVIII-A2-Domäne die FV-A2-Domäne inseriert werden, durch Expression einer analog hergestellten Hybrid-DNA. Zum Beispiel können die MluI-Stellen in die FVIII und FV- Expressionsvektoren an den 5'- und 3'-Grenzen der A2-Domänen eingebaut werden. Die MluI-Fragmente können dann aus den Vektoren ausgeschnitten werden und der pV-A2-codierende Bereich kann in den FVIII-Expressionsvektor ligiert werden, aus dem der entsprechende A2-codierende Bereich mit oder ohne Verbleiben des sauren Bereichs der schweren Kette von FVIII ausgeschnitten wurde, abhängig von der Stelle der in die FVIII-cDNA eingeschleusten MluI-Stelle.
Andere Beispiele des DNA-Austausches umfassen das Inserieren eines oder mehrerer FV-DNA-Bereiche in die FVIII-DNA im Austausch gegen einen nicht-korrespondierenden Bereich, zum Beispiel Ersetzen einer FVIII-A1-Domäne durch eine PV- A2-Domäne.
Abgesehen von dem Austausch der gesamten oder eines Teils der B-Domäne sind Modifikationen bestimmter Unterbereiche innerhalb der schweren Kette von FVIII und innerhalb der C2-Domäne der leichten Kette von besonderem Interesse. Innerhalb der C2-Domäne sind Modifikationen innerhalb der meisten C-terminalen 100-200 Aminosäurereste von besonderem Interesse. Modifikationen der schweren Kette stellen FVIII-Varianten bereit, die verglichen mit der nativen Sequenz von FVIII in höherer Ausbeute hergestellt werden können, während Modifikationen in Bereichen der schweren als auch der leichten Kette FVIII-Varianten bereitstellen, die gegenüber einer Kreuzreaktion mit Antikörpern gegen FVIII in bestimmten "Inhibitor"- Patienten weniger empfindlich sind.
Ausführlichere schematische Darstellungen der schweren und leichten Ketten von FVIII werden nachstehend gezeigt, wobei spezifische Domänen angegeben werden, saure Bereiche durch diagonale Schraffur angezeigt und die C-terminalen Aminosäurepositionen der Verbindungsstellen spezifiziert werden: Schwere Kette Leichte Kette
So umfassen die erfindungsgemäßen DNA- und Proteinarten Ausführungsformen, in denen eine oder mehrere der A1-, A2-, A3-, C1- und C2-Domänen ganz oder teilweise mit der entsprechenden Sequenz aus FV ersetzt sind. Die Übereinstimmung der Domänen von FVIII und FV ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und wird sehr ausführlich zum Beispiel bei Kane & Davie, Blood 71 (3), 539-555 gezeigt.
Beispielsweise kann der Austausch bei Ausführungsformen, in denen ein Teil der Domänen der schweren Kette von FVIII durch die entsprechende FV-Sequenz ersetzt wird, im FVIII-Bereich in den Positionen 1-225, 226-372, 336-562 und/oder 562-740 erfolgen. In Ausführungsformen, die einen teilweisen Domänenaustausch in der leichten Kette von FVIII umfassen, kann der Austausch innerhalb des Bereichs der FVIII- Position 1648-1721, 1689-2020, 2020-2173 und/oder 2173-2332 erfolgen. Bestimmte erfindungsgemäße Ausführungsformen werden so sowohl in Bereichen der schweren als auch der leichten Kette modifiziert. Es sollte beachtet werden, daß die Bereiche der FV-Sequenz, die zum Austausch einer nativen FVIII-Sequenz verwendet werden, länger oder kürzer als der entsprechende FVIII-Bereich sein können. Dies sollte zum Beispiel aus Figur 4 von Kane & Davie, 988, a.a.O. erkennbar sein. Je nachdem, was geeigneter ist, wird die DNA-Sequenz, die die gewünschte Variante codiert, durch Ligierung von (zum Beispiel) MluI- Restriktionsfragmenten, Stellen-gericntete Mutagenese oder durch eine Kombination beider Verfahren hergestellt.
Wenn der Domänenaustausch in anderen Vektoren als den erwünschten Expressionsvektoren durchgeführt wird, können die neuen DNA-Sequenzen, die die erfindungsgemäßen Varianten codieren, aus den Mutagenesevektoren ausgeschnitten und in geeignete Expressionsvektoren, vorzugsweise in Säugetierzellen, eingeschleust werden. Die von den vorübergehend transfizierten oder stabil transformierten Wirtszellen produzierte Blutgerinnungs-Aktivität kann mit Standardtests für Blutplasmaproben gemessen werden. Tabelle I: Exemplarische Oligonucleotide Name Sequenz Mutation Screen (Fortsetzung T) (Tabelle I, Fortsetzung) Screen [Faktor V] Nr. Sequenz Mutation (Fortsetzung T) (Tabelle I, Fortsetzung) (Fortsetzung T) (Tabelle I, Fortsetzung)
*Wurde zur Überwachung des Mutageneseereignisses verwendet, das mit dem in Klammern aufgeführten Oligonucleotid bewirkt wurde. Codons für den Austausch von Aminosäuren sind unterstrichen. Der Fachmann wird erkennen, daß Oligonucleotide, die zur Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren oder zur Insertion einer unterschiedlichen Aminosäure (Austausch) an einer gewünschten Stelle verwendet werden, jeweils durch Deletion eines oder mehrerer Codons oder durch Substitution des Codons der gewünschten Aminosäure im Oligonucleotid einfach konstruiert werden können. Andere Mutagenese-Oligonucleotide können basierend auf einer Sequenz von etwa 20-50 Nucleotiden konstruiert werden, die die gewünschte Stelle umfaßt, und durch Austausch oder Deletion der ursprünglichen Codons, die ausgetauscht werden sollen.
Die hier beschriebenen Expressionsvektoren eukaryontischer Zellen können durch Verfahren die dem Fachmann gut bekannt sind, synthetisiert werden. Die Bestandteile der Vektoren, wie bakterielle Replicons, Selektionsgene, Enhancer, Promotoren und ähnliches, können aus natürlichen Quellen erhalten oder durch bekannte Verfahren synthetisiert werden. Vgl. Kaufman et al., J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621, und Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci., 82 1985), 689-693. Die bei der Herstellung von erfindungsgemäßen Varianten nützlichen eukaryontischen Expressionsvektoren können auch induzierbare Promotoren enthalten oder auf dem Fachgebiet bekannte induzierbare Expressionssysteme umfassen.
Etablierte Zellinien, einschließlich transformierter Zellinien, sind als Wirte geeignet. Normale diploide Zellen, Zellstämme, die aus in vitro-Kulturen primärer Gewebe stammen sowie primäre Explantate (einschließlich verhältnismäßig undifferenzierter Zellen, wie hämatopoetische Stammzellen) sind ebenfalls geeignet. Den Kandidatenzellen muß genotypisch kein Selektionsgen fehlen so lange das Selektionsgen dominant wirksam ist.
Die Wirtszellen sind vorzugsweise etablierte Säugetierzellinien. Zur stabilen Integration der Vektor-DNA in die chromosomale DNA und zur folgenden Amplifikation der integrierten Vektor-DNA durch übliche Verfahren werden derzeit CHO-Zellen (Ovarzellen des Chinesischen Hamsters) bevorzugt. In einer anderen Ausführungsform kann die Vektor-DNA das gesamte oder einen Teil des Rinderpapilloma-Virusgenoms (Lusky et al., Cell 3L (1984), 391-401) umfassen und kann in Zelllinien wie den C127-Mauszellen als ein stabiles episomales Element getragen werden. Andere verwendbare Säugetierzellinien schließen HeLa-Zellen, COS-1-Affenzellen, Melanomzellinien wie Bowes-Zellen, L-929-Mauszellen, von Swiss- Balb-c- oder NIH- Mäusen stammende 3T3-Linien, BHK- oder HaK-Hamsterzellinien und ähnliches ein.
Welche Expressionsvektorart auch immer verwendet wird, es könnte von Vorteil sein, die variante FVIII-DNA mit einer vWF-codierenden DNA-Sequenz oder einem Analog davon zu coexprimieren oder in Gegenwart eines Phospholipids, wie zum Beispiel in der WO 87/06101 und WO 88/08035 beschrieben wurde. Es kann auch von Vorteil sein, das Protein in Medien mit einem Protease-Hemmstoff wie Aprotinin zu exprimieren, zum Beispiel in einer Menge von etwa 0,01 bis 5%, vorzugsweise 0,5 bis 1,0% (Vol./Vol.) (Aprot., 15-30 Trypsin-Inhibitoreinheiten (TIU)/ml, Sigma) oder in entsprechenden Mengen von Aktivitätseinheiten anderer Protease-Hemmstoffe.
Stabile Transformanten werden durch immunologische Standard- oder Aktivitätstests auf die Expression des Blutgerinnungs-Produkts abgesucht. Das Vorhandensein der DNA, die die Blutgerinnungs-Proteine codiert, kann mit Standardverfahren wie dem Southern-Blot nachgewiesen werden. Die vorübergehende Expression der Blutgerinnungs-Gene über mehrere Tage nach der Einschleusung der Expressionsvektor-DNA in geeignete Wirtszellen, wie COS-1-Affenzellen, wird ohne Selektion der Proteine durch einen Aktivitäts- oder einen immunologischen Test im Kulturmedium gemessen.
Nach der Expression der DNA-Varianten durch ein herkömmliches Verfahren kann das so hergestellte Protein gewonnen, gereinigt und/oder in Hinsicht auf physikochemische, biochemische und/oder klinische Parameter durch bekannte Verfahren charakterisiert werden.
Die erfindungsgemäßen Proteine sollten an geeignete, gegen den menschlichen Faktor VIII:C oder FV gerichtete monoclonale Antikörper binden (d.h. wo das erkannte Epitop in dem gewünschten Protein vorliegt) und können so durch Immunaffinitäts-Chromatographie unter Verwendung solcher Antikörper und/oder durch herkömmliche FVIII-Reinigungsverfahren gewonnen und/oder gereinigt werden. Darüberhinaus sollten diese Verbindungen eine Blutgerinnungs-Aktivität besitzen.
Die Proteine, die gemäß diesem Erfindung hergestellt wurden, können gemäß auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren in pharmazeutisch verträgliche Präparate mit einem pharmazeutisch verträglichen, zum Beispiel parenteral verträglichen, Träger und/oder einem oder mehreren Excipienten formuliert werden.
Solche für die parenterale Verabreichung geeigneten Arzneimittel können einfacherweise ein steriles gefriergetrocknetes Präparat des Proteins umfassen, das durch Zugabe einer sterilen Lösung zubereitet werden kann, wobei Lösungen hergestellt werden, die zum Blut des Empfängers vorzugsweise isotonisch sind. Die Präparate können in Einzel- oder Mehrfachdosisbehältern vorliegen, zum Beispiel in versiegelten Ampullen oder Fläschchen. Ihre Anwendung wäre, für die gewünschte Wirksamkeit geeignet eingestellt, analog der des menschlichen Faktors VIII (oder in bestimmten Fällen, wo eine oder mehrere FV-A- und/oder C-Domänen vorliegen, des FV).
Die Erfindung wird unter Bezug auf die folgenden veranschaulichenden, experimentellen Beispiele und Verfahren, die rein exemplarisch sind, verständlicher. Sie sollen den wahren Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht begrenzen.

Plasmidgewinnung

A. FVIII

Die Mutagenese der Faktor VIII-cDNAs wurde direkt im Expressionplasmid durchgeführt, um die Schwierigkeit beim Austauschen der Sequenzen zwischen unterschiedlichen Vektoren auf ein Minimum zu verringern. Das im allgemeinen angewendete Verfahren zur Mutagenese wurde von dem Verfahren von Morinaga mit Modifikationen abgeleitet. Dieses Verfahren wird durch die Konstruktion von Plasmiden vereinfacht, die günstige, nur einmal vorkommende Restriktionsstellen im Faktor VIII-Expressionsplasmid aufweisen. Das Folgende veranschaulicht die Konstruktion eines Faktor VIII-Expressiotsplasmids, das nur einmal vorkommende EcoRV-, HpaI-, ClaI- und XbaI-Restriktionsstellen aufweist. Das Plasmid pMT2 kann durch Spaltung von pMT2-VWF, das bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 67122 hinterlegt wurde, mit EcoRI erhalten werden. Die EcoRI-Spaltung schneidet die im pMT2-VWF inserierte cDNA aus, wobei pMT2 in einer linearen Form gewonnen wird, die ligiert und dazu verwendet werden kann, eine Ampicillinresistenz auf E. coli-HB101 oder DH-5 zu übertragen. Die Plasmid-pMT2-DNA kann durch herkömmliche Verfahren präpariert werden. pMT2VIII wurde dann durch Spaltung von pMT2 mit EcoRV und XbaI, Behandlung der gespaltenen DNA mit dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase I und Ligierung von ClaI-Linkern (NEBiolabs, CATCGATG) konstruiert. Dies entfernt, beginnend von der HindIII-Stelle in der Nähe des SV40-Replikationsursprungs und der Enhancersequenzen von pMT2 (ClaI-Derivat von pMT2) die Basen 2171 bis 2421. Die Faktor VIII-cDNA wurde aus pSP64 mit Sall ausgeschnitten und mit der T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und EcoRI-Adaptoren (AATTCCTCGAGAGCT) wurden zugesetzt. Die EcoRI-angepaßte Faktor VIII-cDNA wurde dann in die EcoRI-Stelle des ClaI-Derivats von pMT2 ligiert. Das entstandene Plasmid wird als pMT2-VIII bezeichnet.

B. FV

Die Mutagenese der FV-cDNAs wurde sowohl im Expressionsvektor als auch in einem "Shuttle"-Clonierungsvektor ausgeführt. Das Mutageneseverfahren wurde mit Modifikationen von Morinaga, a.a.O., abgleitet.
Der für die PV-Expression verwendete Expressionsvektor war ebenfalls ein pMT2-Derivat. Die Plasmid-pMT2-DNA wurde, wie vorher beschrieben, in linearer Vorm aus pMT2-VWF (ATCC 67122) gewonnen. Die EcoRI-Stelle wurde dann durch Ligierung an einen Adapter mit einer SalI-Stelle modifiziert (siehe nachstehend). Das ClaI-Derivat von pMT2 wurde dann durch Spaltung mit EcoRV und XbaI, Behandlung der gespaltenen DNA mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und Ligierung der ClaI-Linker (N. E. Biolabs, CATCGATG) konstruiert. Dies entfernt die Basen 2267-2421, die beginnend von der HindIII- Stelle der frühen Seite des pMT2-SV40-Replikationsursprungs und der Enhancersequenzen im Uhrzeigersinn numeriert werden.
Die FV-cDNA wurde aus zwei überlappenden Charon 21Aλ- Rekombinanten, λV401 und λV1, zusammengesetzt, die jeweils Teile einer FV-cDNA enthalten, die aus einer Oligo(dT)-geprimten menschlichen foetalen Leber-cDNA-Bank stammen (vgl. Jenny et al., a.a.O.).
Die folgende Strategie wurde dazu verwendet, die vollständige cDNA zusammenzusetzen und die flankierenden DNA- Sequenzen zu entfernen. Der λV401-Clon wurde mit SacII gespalten, wobei die FV-cDNA entfernt wird, die an einen mit SacII linearisierten Bluescript KS-(+)-Clonierungsvektor (Stratagene) ligiert wurde, wobei das Plasmid 401B5-6 erhalten wurde. Die λ-DNA-Sequenzen wurden aus 401B5-6 durch Spaltung mit HhaI (Nucleotid 41 in der FV-cDNA), Behandlung mit dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase I und anschließender Spaltung mit BgIII (Nucleotid 4275 in der FV-cDNA) entfernt. Dies ergab ein 4234 bp großes, mit glatten Enden versehenes BgIII-Fragment ohne flankierende λ-Sequenzen. Dieses 4234 bp große Fragment wurde durch Ligierung in die EcoRV- und BamHI-Clonierungsstellen von Bluescript KS(+) inseriert, wobei das Plasmid Blu401 gebildet wurde.
Die FV-cDNA im λV1-Clon wurde durch SacII-Spaltung des λV1 entfernt. Dieses SacII-Fragment wurde dann an den linearisierten SacII-Bluescript KS(+)-Clonierungsvektor ligiert, wobei das Plasmid VlBS10 erhalten wurde. VlBS10 wurde dann mit HpaI (Nucleotid 6854 in der PV-cDNA) gespalten und an die folgenden EcoRI-modifizierten Adaptoren ligiert:
wobei das Plasmid BluVl-RI erhalten wurde.
Drei Restriktionsstellen waren bei der Konstruktion des Expressionsvektors wichtig, der die vollständige FV-cDNA enthält. Eine SalI-Stelle im Polylinker-Clonierungsbereich des Bluescript KS(+) stellt eine nur einmal vorkommende SalI- Stelle bereit, die sich 5' der FV-cDNA-Sequenzen befindet. In der FV-cDNA ist auch eine einmal vorkommende BstEII-Stelle (Nucleotid 3666) vorhanden, die in den beiden Plasmiden Blu401 und BluV1-Rl vorliegt. Eine einmal vorkommende SalI-Stelle entsteht durch die Addition der in das 3'-Ende des BluVl-Rl eingeschleusten modifizierten EcoRI-Adaptoren.
Das rekombinante Blu401 trägt die Sequenzen des 5'-Endes der FV-cDNA bei, während BluVl-Rl das 3'-Ende der intakten cDNA umfaßt. Drei Restriktionsfragmente aus dem pMT2- Derivat, Blu401 und BluVl-Rl wurden nach einer Elektrophorese in einem 1%igen niedrigschmelzenden Agarosegel in Tris-Acetat gereinigt. Die Isolierung des 3625 bp großen SalI-BstEII-Fragments wurde auch durch die Spaltung mit XMNI vereinfacht, wobei eine kontaminierendes mitgewandertes Fragment entfernt wurde. Der pMT2-Expressionsvektor wurde durch eine Spaltung mit SalI linearisiert und dann mit Phosphatase aus Kälberdarm behandelt. Die drei Fragmente: (i) das 3625 bp große SalI/BstEII-Blu401-Fragment, (ii) das 3188 bp große SalI/BstEII-BluVl-Rl-Fragment und (iii) das mit SalI gespaltene pMT2 wurden ligiert, wobei das Expressionsplasmid pMT2-V gebildet wurde, das bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer 40515 hinterlegt wurde.
Ein zweites Plasmid mit der vollständigen FV-cDNA wurde in Bluescript KS(+) konstruiert. Blu401 wurde mit SacII (3'-Stelle im Bluescript-Clonierungspolylinker) und BstEII (Nucleotid 3666 in der FV-cDNA) gespalten. Dieses Fragment, das die Bluescript-Vektorsequenzen und das 3625 bp große Fragment der FV-Sequenzen beginnend am 5'-Ende der FV-cDNA bis zur BstEII-Stelle enthält, wurde isoliert. Die BluVl-RI-DNA wurde mit BstEII (Nucleotid 3666) und SalI (3'-Ende des EcoRI-modifizierten Adapters) gespalten, wobei ein Fragment von etwa 3900 bp freigesetzt wird, das das 3'-Ende der FV-cDNA-Sequenzen enthält. Die genaue Größe dieses Fragments ist unklar, da es noch λ-DNA-Sequenzen enthält. Die BstEII/SacII-Blu401- und BstEII/SacII-BluVl-RI-Fragmente wurden miteinander ligiert, wobei das Plasmid BluV hergestellt wurde.
Die λ-DNA-Sequenzen wurden durch Spaltung von BluV mit SalI entfernt und die im SalI-Fragment enthaltene intakte vollständige FV-cDNA (6813 bp) wurde isoliert. Bluescript KS(+) wurde durch Spaltung mit SalI linearisiert, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt und an das SalI- Fragment ligiert, das die vollständige FV-cDNA enthielt. Das entstandene, als BIuKSVΔλ bezeichnete Plasmid, enthält die vollständige FV-cDNA, die frei ist von allen λ-Sequenzen.

Mutagenese

(1) Die Mutagenese wurde mit den folgenden DNA-Präparaten durchgeführt. Das Plasmid pMT2-VIII wurde mit ClaI linearisiert, mit Phosphatase aus Kälberdarm behandelt und in einem niedrigschmelzenden Agarosegel in Tris-Acetat abgetrennt. Die Bande der linearisierten DNA wurde dann durch Absorption an Siliciumdioxid und Elution in Tris-EDTA extrahiert, oder durch eine Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation. Eine zweite Menge von pMT2-VIII wurde mit KpnI-XhoI, KpnI-EcoRV oder EcoRV-XbaI gespalten und die DNA-Fragmente wurden durch eine Elektrophorese in einem niedrigschmelzenden Agarosegel getrennt und wie vorstehend extrahiert. Das Plasmid pMT2-V wurde mit NheI linearisiert, mit Phosphatase aus Kälberdarm behandelt und durch eine Elektrophorese in einem niedrigschmelzenden Tris-Acetat-Agarosegel getrennt. Die linearisierte DNA-Bande wurde mit Phenol extrahiert und in Ethanol präzipitiert. Das DNA-Pellet wurde in Tris-EDTA resuspendiert. Eine zweite Menge von pMT2-V wurde mit ApaI und DraII gespalten, die DNA-Fragmente wurden auf einem niedrigschmelzenden Agarosegel getrennt und wie vorstehend beschrieben extrahiert. Das Plasmid BluKSV wurde mit SacII linearisiert, mit Phosphatase aus Kälberdarm behandelt und die DNA wurde durch eine Elektrophorese in einem niedrigschmelzenden Agarosegel getrennt. Eine zweite Menge von BluKSV wurde mit EcoRV und SphI gespalten und auf die gleiche Weise getrennt. Die DNA- Fragmente wurden wie beschrieben mit Phenol extrahiert.
(2) Je 1 ug der geeigneten Plasmide wurde gemischt und das Volumen wurde auf 18 ul eingestellt und 2,0 ul 2 N NaOH wurden zugegeben.
(3) Das Gemisch wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur denaturiert, dann mit 180 ul einer Lösung aus 0,02 N HCl und 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, neutralisiert.
(4) 20 picoMole des phosphorylierten mutagenen Oligonucleotids wurden zu 40 ul des Heteroduplex-Gemisches zugegeben.
(5) Das Gemisch wurde 90 Minuten auf einen 68ºC heißen Wärmeblock gestellt. Nach der Inkubation ließ man das Gemisch sich langsam auf Raumtemperatur abkühlen.
(6) Für jede mutagene Reaktion wurden 40 41 des Heteroduplex- Oligonucleotidgemisches verwendet. Die Reaktionen wurden in einem Gemisch aus 2 mM MgCl&sub2;, 1 mM β-Mercaptoethanol, 400 uM ATP, 100 uM Desoxynucleotidtriphosphat, 3 bis 4 Einheiten/ul des Klenow-Fragments der E. coli-DNA-Polymerase I und 400 Einheiten/ul der T4-DNA-Ligase durchgeführt.
(7) Die Reaktionsgemische wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, auf 16ºC abgekühlt und über Nacht inkubiert.
(8) Die Reaktion wurde durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion und eine Ethanol-Präzipitation beendet und der entstandene Rückstand wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und in 10 ul sterilem H&sub2;O wieder suspendiert.
(9) Die DNA wurde dann dazu verwendet, kompetente HB101- oder DH-5-Bakterien zu transformieren. Die Ampicillin-resistenten Kolonien wurden mit 1 x 10&sup6; cpm/ml eines ³²P-markierten Screening-Oligonucleotids in 5xSSC, 0,1% SDS, 5x Oenhardt-Reagenz und 100 ug/ml denaturierter Lachssperma-DNA abgesucht.
(10) Die Filter wurden mit 5xSSC und 0,1% SDS bei einer Temperatur gewaschen, die 5 Grad unter der berechneten Schmelztemperatur der Oligonucleotidsonde lag.
(11) Die DNA wurde aus positiv hybridisierenden Clonen präpariert und zuerst durch Spaltung mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen und einer Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Die DNA wurde auf Nitrocellulose übertragen und Filter wurden hergestellt und mit den Screeningsonden hybridisiert, um sicherzustellen, daß das mutagene Oligonucleotid in das richtige Fragment eingeschleust wurde.
(12) Die DNA wurde dann wieder in E. coli eingeschleust und Ampicillin-resistente Kolonien wurden zur Hybridisierung mit dem Screening-Oligonucleotid abgesucht.
(13) Die entstandenen Mutationen wurden durch eine DNA-Sequenzierung (zum Beispiel Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) bestätigt.

Experimentelle Strategie und Testverfahren

Die Aktivität des FVIII-FV-Hybridproteins wurde durch eine vorübergehende Expression der Proteine durch COS-1-Affennierenzellen analysiert, die mit den erfindungsgemäßen DNAs transfiziert wurden. Die Plasmid-DNAs wurden durch Bandierung der DNA in CsCl präpariert und dazu verwendet, Cos-1-Zellen wie beschrieben zu transfizieren (Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985), 689). 60 Stunden nach der Transfektion wurden konditionierte Medien für den FVIII- oder FV-Aktivitätstest verwendet. FVIII wird mit dem chromogenen Kabi-Coatest-Testverfahren (Kabi) getestet oder durch die Fähigkeit, Plasma mit einem FVIII-Mangel vor und nach der Thrombinaktivierung (aktivierte partielle Thromboplastinzeit, APTT) gerinnen zu lassen. FV wird durch die Fähigkeit getestet, Plasma mit einem FV-Mangel vor und nach der Thrombinaktivierung (APTT) gerinnen zu lassen. Um die Synthese und Sekretion der mutierten Moleküle zu analysieren, und um sicherzustellen, daß die Einschleusung der MluI-Restriktionsstellen (Thr-Arg) die Spaltung an durch Mutagenese veränderte Spaltungsstellen nicht ändert, wurden die transfizierten Zellen 60 Stunden nach der Transfektion 6 Stunden mit S-Methionin markiert. Konditionierte Medien und Zellextrakte wurden hergestellt und durch Immunpräzipitation mit anti-FVIII- oder FV-spezifischen Antikörpern analysiert und durch Elektrophorese der Präzipitate auf SDS- Polyacrylamidgelen.

Beispiele

Beispiel 1:

Veränderung der 90 kDa-FVIII-Spaltstelle

Die Mutagenese der 90 kDa-Spaltstelle im Faktor VIII wurde mit dem beschriebenen Lücken-Heteroduplex-Verfahren ("gapped heteroduplex method") (Morinaga et al., Biotechnology 84, 636-639) unter Verwendung des 10,1 kb großen Kpn-EcoRV- Fragments aus pMT2-VIII und der mit ClaI linearisierten pMT2-VIII-DNA durchgeführt, wobei Heteroduplices mit Lücken hergestellt wurden. Das mutagene Oligonucleotid war die Nr. 1 in Tabelle I und das Screening-Oligonucleotid war das 15mer, Nr. 2 in Tabelle I. Die entstandene Mutante wurde durch eine DNA-Sequenzierung (Sanger et al., PNAS 74 (1977), 5463) auf ihre Richtigkeit überprüft. Die entstandene DNA (MluI90K) wurde durch Gleichgewichts-Bandierung in CsCl präpariert und wie vorstehend beschrieben in COS-1-Zellen eingeschleust. Die Analyse der ³&sup5;S-Methionin-markierten Zellextrakte und des konditionierten Mediums durch Immunpräzipitation und Gelelektrophorese zeigte, daß der Faktor VIII entsprechend in Größe und Menge zum Faktor VIII-Wildtyp synthetisiert und durch Thrombin richtig gespalten wurde. Die Mutation hatte keinen Einfluß auf die Faktor VIII-Aktivität, wie durch den Kabi-Coatest-Aktivitätstest gemessen wurde (Tabelle II).

Beispiel 2:

Veränderung der 80 kDa-Faktor VIII-Spaltstelle

Die Mutagenese der 80 kDa-Spaltstelle wurde durch Herstellung eines Lücken aufweisenden Heteroduplexes unter Verwendung der mit ClaI-linearisierten pMT2-VIII-DNA und dem 9,2 kb großen EcoRV-XbaI-Fragment von pMT2-VIII durchgeführt. Das mutagene Oligonucleotid war die Nr. in Tabelle I und das Screening-Oligonucleotid war die Nr. 4 in Tabelle I. Die entstandene Mutante wurde wie vorstehend durch DNA-Sequenzierung auf ihre Richtigkeit überprüft. Die entstandene DNA (MluI80K) wurde präpariert und wie vorstehend beschrieben in COS-1-Zellen eingeschleust. Die Analyse der sezernierten FVIII-Aktivität durch das Kabi-Coatest-Verfahren und die Analyse der ³&sup5;S-Methionin-markierten Zellextrakte und des konditionierten Mediums durch Immunpräzipitation und Gelelektrophorese bewies daß der Faktor VIII geeignet sezerniert, durch Thrombin gespalten und in seiner Cofaktor-Aktivität nicht verändert wurde (Tabelle II).

Beispiel III:

Mutagenese der 73 kDa-Spaltstelle in FVIII

Die Mutagenese wurde wie in Beispiel II beschrieben unter Verwendung des 44-mer-Oligonucleotids Nr. 5 in Tabelle I und des Screening-Oligonucleotids Nr. in Tabelle I durchgeführt. Die entstandene DNA (MluI73K) wurde durch DNA-Sequenzierung auf ihre Richtigkeit überprüft. Die entstandene DNA wurde wie vorstehend beschrieben in COS-1-Zellen eingeschleust. Das synthetisierte Protein entsprach dem FVIII-Wildtyp, was die Faktor VIII-Aktivität als auch die Expressionsmenge betrifft (Tabelle II).

Beispiel IV:

Mutagenese der 94 kDa-Faktor V-Spaltstelle

Die Mutagenese der 94 kDa-Spaltstelle des Faktors V wurde unter Verwendung eines Heteroduplexes mit Lücken durchgeführt, der mit dem 10,2 kb großen NheI/ApaI-Fragment von pMT2 und dem mit DraII linearisierten 11,8 kb großen pMT2V hergestellt wurde. Das mutagene Oligonucleotid war ein 43-mer, Nr. 27 in Tabelle I, und das Screening-Oligonucleotid ein 15-mer, Nr. 28 in Tabelle I. Die Korrektheit der entstandenen DNA (MluI94K) wurde durch eine DNA-Sequenzierung bestätigt und sie wurde wie vorstehend beschrieben in COS-1-Zellen eingeschleust. Das entstandene sezernierte Protein entsprach in der Menge dem Faktor-V-Wildtyp, wie durch Faktor-V-Gerinnungstests vor und nach einer Thrombinaktivierung bestimmt wurde und durch Analyse der Synthese und Sekretion des Faktors V durch die ³&sup5;S-Methionin-Markierung von Zellen sowie durch Analyse von Zellextrakten und konditioniertem Medium durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese des immunpräzipierten Faktors V.

Beispiel V:

Mutagenese der 74 kDa-Faktor V-Spaltstelle

Die Mutagenese wurde wie vorstehend beschrieben durch Herstellung von Heteroduplices mit Lücken mit dem 9,0 kb großen EcoRV-SphI-Fragment von BluKSVΔλ und dem mit SacI linearisierten 9,8 kb großen BluKSVΔλ unter Verwendung des mutagenen Oligonucleotids (Nr. 29, Tabelle I) und dem 15-mer-Screening- Oligonucleotid (Nr. 30, Tabelle I) durchgeführt. Die entstandene DNA (MluI74K) wurde durch eine DNA-Sequenzierung auf ihre Korrektheit überprüft.

Beispiel VI:

Herstellung der FVIII codierenden DNA mit einer FV-B-Domäne

Ein Faktor VIII/Faktor V-Hybrid wurde unter Anwendung des folgenden Verfahrens zusammengesetzt. Das Faktor VIII- Expressionsplasmid MluI90K wurde mit SalI und MluI gespalten und das 7,2 kb große Fragment wurde durch eine Elektrophorese in einem niedrigschmelzenden Agarosegel isoliert. Das Faktor VIII-Expressionsplasmid MluI80K wurde mit MluI und SalI gespalten und das kleine 2,3 kb große Fragment wurde durch eine Elektrophorese in einem niedrigschmelzenden Gel isoliert. Die B-Domäne des Faktors V wurde aus zwei Fragmenten zusammengesetzt: 1) Plasmid MluI74K wurde mit MluI und BstEII gespalten, wobei ein 1,1 kb großes 3'-Ende der Faktor V-B-Domäne gewonnen wurde; und 2) Plasmid MluI94K wurde mit MluI und BstEII gespalten, wobei ein 1,4 kb großes 5'-Ende der Faktor V B-Domäne gewonnen wurde. Diese Fragmente wurden nach einer Elektrophorese in einem niedrigschmelzenden Agarosegel isoliert.
Das Hybrid wurde durch eine 4-Wege-Ligierung der vorstehenden Fragmenten in einer niedrigschmelzenden Agarose zusammengesetzt. Das Hybrid wurde durch umfassende Restriktionsendonucleasespaltung, Gelelektrophorese und Sequenzierung der Faktor V-Faktor VIII-Verbindungsstellen auf seine richtige Zusammensetzung hin überprüft. Die entstandene DNA, pMT2-VIIIB5, wurde in COS-1-Zellen eingeschleust und wie vorstehend beschrieben analysiert.
Die Faktor VIII-Aktivität wurde mit dem Kabi-Coatest- Testverfahren gemessen (Tabelle II). In Kontrollexperimenten wird der Faktor VIII-Wildtyp exprimiert und als zweikettiges Molekül sezerniert. Faktor V wird als einkettiges Polypeptid sezerniert und wird in einer 10- bis 40fach größeren Menge als FVIII exprimiert. Das Hybrid zeigte eine 2- bis 4fach höhere Aktivität als das FVIII-Wildtyp-Protein, vielleicht infolge einer effizienteren Sekretion aus der Zelle. Die Analyse des ³&sup5;S-Methionin-markierten konditionierten Mediums ergab, daß das Hybridprotein als einkettiges Polypeptid sezerniert wurde, das mit einem etwas niedrigeren relativen Molekulargewicht (etwa 300 kDa) als Faktor V wandert. Die geeigneten Spaltprodukte wurden durch eine Thrombinspaltung vor der Elektrophorese erhalten. Zusätzlich wurde das Hybrid durch einen monoclonalen Antikörper, der für die schwere Kette des Faktors VIII spezifisch ist, und einen monoclonalen Antikörper, der für die B-Domäne des Faktors V spezifisch ist, immunpräzipitiert, was darauf hindeutet, daß das Protein richtig gefaltet ist.

Beispiel VII:

Austausch der leichten Kette von FVIII gegen die leichte Kette von FV

Das Plasmid MluI90K wird mit SalI und EcoRV gespalten und das die schwere Kette des Faktors VIII codierende 8,9 kb große Fragment isoliert. Die B-Domäne des Faktors VIII wird aus MluI80K oder MluI73K durch Spaltung mit MluI und EcoRV isoliert, und die jeweils 1178 und 1054 bp großen Fragmente werden isoliert. Das die leichte Kette des Faktors V codierende 2,0 kb große MluI-SalI-Fragment wird aus MluI74K isoliert. Die Fragmente werden durch eine 3-Wege-Ligierung durch Standardverfahren zusammengesetzt. Dies ergibt ein Hybrid, das den sauren Bereich der leichten Kette des Faktors VIII enthält, wenn man das 1178 bp große Fragment verwendet, oder unter Verwendung des 1054 großen Fragments ein Hybrid, dem der saure Bereich fehlt.

Beispiel VIII:

Austausch der schweren Kette von FVIII gegen die schwere Kette von FV

Das die B-Domäne und die leichte Kette von FVIII codierende 9,9 kb große XhoI-MluI-Fragment wird aus MIuI90K isoliert, und das die schwere Kette von FV codierende 2,3 kb große SalI-MluI-Fragment wird aus MluI94K isoliert. Diese Fragmente wurden miteinander ligiert, wobei das Plasmid VIII- HCV hergestellt wurde, das in COS-1-Zellen eingeschleust und durch Immunpräzipitation des ³&sup5;S-Methionin-markierten konditionierten Mediums analysiert wurde. Das Hybrid wird durch die COS-1-Zellen sowohl als einkettiges Polypeptid als auch als zweikettige Polypeptidart in 20 bis 50fach höheren Mengen als der FVIII-Wildtyp hergestellt. Tabelle II: Beobachtete Aktivität (mu/ml) Faktor VIII - Aktivität Faktor V - Aktivität (ND = nicht bestimmt)

Beispiel IX:

Austauschen der leichten Kette von FVIII gegen die leichte Kette von FV

Das Plasmid MluI73K wird mit MluI und SalI gespalten, wobei das die leichte Kette von FVIII codierende 10,1 kb große Fragment ausgeschnitten wird. Das Plasmid MluI74K wird mit MluI und SalI gespalten, wobei die 2045 bp große leichte Kette von FV ausgeschnitten wird, die dann isoliert und mit der MluI/SalI-gespaltenen MluI73-Plasmid-DNA ligiert wird. Das entstandene Plasmid codiert ein Hybridprotein umfassend die schwere Kette von FVIII, die B-Domäne von FVIII, den sauren Bereich der leichten Kette von FVIII und die leichte Kette von FV. Wenn MluI80K anstelle von MluI80K (MluI73K ?) verwendet wird, wird ein 9,95 kb großes Fragment ausgeschnitten, das die leichte Kette von FVIII mit dem sauren Bereich codiert. Dem hergestellten Hybridprotein fehlt deshalb dieser saure Bereich.

Beispiel X:

Austauschen der leichten Kette und der B-Domäne von FVIII gegen entsprechende Elemente aus FV

Ein Satz überlappender synthetischer Oligonucleotide wird hergestellt, phosphoryliert und ligiert, wobei die folgende synthetische DNA hergestellt wird:
Diese synthetische DNA ist eine MluI-Cassette, die den sauren Bereich zwischen den 80kD- und 73kD-Spaltstellen von FVIII codiert. In einer anderen Ausführungsform können die MluI- Stellen wie in den Beispielen II und III beschrieben in den FVIII-Expressionsvektor in die 80kD- und 73kD-Stellen unter Verwendung der Oligonucleotide #3 und #5 aus Tabelle I eingeführt werden. Die entsprechende Cassette kann dann mit MluI einfach aus dem Vektor ausgeschnitten werden. Die Cassette wird dann an das in Beispiel VI aus MluI74K isolierte MluI/BstEII-Fragment ligiert und das entstandene MluI-Fragment, das den sauren Bereich von FVIII codierende Fragment enthält, das in der richtigen Orientierung an das die partielle B-Domäne von FV codierende Fragment ligiert wurde, wurde isoliert. Dieses Fragment wird dann durch das Verfahren von Beispiel VI an das SalI/MluI-Fragment von MluI90K, das MluI/BstEII-Fragment von MluI94K (beide erhalten wie in Beispiel VI) und an das die leichte Kette von FV codierende MluI/SalI-Fragment von MluI74K ligiert. Das Hybrid wird wie in Beispiel VI auf die richtige Zusammensetzung überprüft. Die entstandene DNA pMT2-VIIIB5/LC5 codiert ein Hybridprotein, umfassend in der Reihenfolge vom N-Terminus zum C-Terminus die schwere Kette von FVIII mit ihrem sauren Bereich, die B-Domäne von FV, den sauren Bereich aus der leichten Kette von FVIII und die leichte Kette von FV.

Beispiel XI:

Deletion der B-Domäne von FVIII und Austausch der leichten Kette gegen die leichte Kette von FV

Das Beispiel X wird mit den folgenden Modifikationen wiederholt. Die MluI-Cassette, die den sauren Bereich der leichten Kette von FVIII codiert, wird direkt an das mit MluI/SalI gespaltene MluI90K-FVIII-Plasmid und das MluI/SalI- Fragment von MluI74K ligiert, das die leichte Kette codiert. Die richtig zusammengesetzte Hybrid-cDNA codiert ein Protein, umfassend die schwere Kette von FVIII, gebunden an die leichte Kette von FV über den aus der leichten Kette von FVIII stammenden sauren Bereich.

Beispiel XII:

Austausch der A2-, B-, A3-, C1- und C2-Domänen von FVIII

A. Die MluI-Cassette, die den sauren Bereich der leichten Kette von FVIII codiert, wird an das BstEII/MluI-Fragment ligiert, das den C-terminalen Teil der B-Domäne von FV codiert. Das so erhaltene, mit dem sauren Bereich der leichten Kette von FVIII verknüpfte, richtig orientierte BstEII/MluI- Reaktionsprodukt, das den C-terminalen Teil der B-Domäne von FV codiert, wird an das MluI/SalI-Fragment aus MluI74K ligiert, das die leichte Kette von FV codiert. Das richtig orientierte BstEII/SalI-Fragment (Fragment "A") wird identifiziert und durch ein Gel gereinigt.
B. Unter Verwendung des Oligonucleotids #41 wird ein FV-Vektor mit einer MluI-Stelle hergestellt, die an den Peptidpositionen 312-313, genau 5' von dem Bereich eingeführt wurde, der die A2-Domäne codiert. Das MluI/BstEII-Fragment, das die A2- und einen Teil der B-Domäne von FV codiert, wird daraus ausgeschnitten und durch ein Gel gereinigt (Fragment "B").
C. Unter Verwendung des Oligonucleotids #7 wird ein FVIII-Vektor mit einer MluI-Stelle hergestellt, die an der Peptidposition 372, genau 5, von dem A2-Bereich eingeführt wurde. Dieser Vektor wird dann mit MluI und SalI gespalten, wobei der größte Teil des FVIII codierenden Bereichs ausgeschnitten wird, wobei nur der A1- und der saure Bereich der schweren Kette zurückbleibt. Das größere MluI/SalI-Fragment wird dann durch ein Gel gereinigt und an die Fragmente A und B ligiert. Der entstandene richtig orientierte Vektor enthält den folgenden codierenden Bereich:

Claims

1. DNA-Sequenz mit den folgenden Merkmalen:

(a) sie hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit einer Faktor VIII codierenden cDNA-Sequenz und einer Faktor V codierenden cDNA-Sequenz; und

(b) sie codiert ein Faktor VIII/Faktor V Hybridprotein mit procoagulierender Aktivität, die durch einen standardgerinnungstest gemessen wird.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die Faktor VIII codierende cDNA-Sequenz eine menschliche cDNA-Sequenz ist.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die Faktor V codierende cDNA-Sequenz eine menschliche cDNA-Sequenz ist.

4. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die eine Polypeptidsequenz von menschlichem Faktor VIII codiert, jedoch anstelle der B-Domäne von menschlichem Faktor VIII die B-Domäne von menschlichem Faktor V enthält.

5. Vektor, der eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.

6. Vektor nach Anspruch 5, der ein Expressionsvektor ist.

7. Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 5 oder 6 enthält.

8. Wirtszelle nach Anspruch 7, die eine Säugerzellinie ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines procoagulierenden Proteins, umfassend die Züchtung einer Wirtszelle, die genetisch so verändert worden ist, daß sie eine DNA- Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält und diese unter zur Expression der DNA-Sequenz geeigneten Bedingungen exprimieren kann, und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur.

10. Procoagulierendes Protein, das von einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert oder nach dem Verfahren nach Anspruch 9 erhalten wird.

11. Arzneimittel enthaltend ein Protein nach Anspruch 10 in Beimischung mit einem pharinazeutisch verträglichen Träger.

12. Arzneimittel nach Anspruch 11 zur Behandlung von Blutgerinnungsstörung.

13. Arzneimittel nach Anspruch 11 zur Behandlung von Blutgerinnungsstörung in Patienten, die inhibierende Antikörper gegen nativen Faktor VIII gebildet haben.