DE69533840T2

DE69533840T2 - Verbesserter expressionsvektor für die herstellung rekombinanter proteine

Info

Publication number: DE69533840T2
Application number: DE69533840T
Authority: DE
Inventors: Gunnar Norstedt; Tim Wood; Daniel Sliva; Bertil Enberg; Peter Lobie; Lars-Arne Haldosen
Original assignee: Biovitrum AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1994-10-21
Filing date: 1995-10-19
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2015-10-20
Also published as: SE9403613D0; PT782628E; AU705594B2; JPH10507633A; EP0782628A1; ES2235175T3; EP1338653A2; US20030192064A1; CA2200465A1; ATE284447T1; NZ294968A; EP1338653A3; AU3820295A; US6773919B2; EP0782628B1; WO1996012815A1; DE69533840D1; MX9702889A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren unter Verwendung von DNA-Plasmiden, um zur Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet zu werden. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung die Addition von spezifischen DNA-Elementen an Expressions-Plasmide, die eine Funktion als Enhancer-Elemente haben. Das Ergebnis soll die Ausbeuten von rekombinanter Proteinherstellung verbessern.
Hintergrund der Erfindung
Es gibt eine Reihe von verschiedenen Strategien für die großtechnische Herstellung von rekombinanten Proteinen, um zum Beispiel in der pharmazeutischen Industrie verwendet zu werden. In gewissen Fällen ist es wünschenswert, dass das rekombinante Protein in eukaryotischen Wirten hergestellt wird. Diese Wirte können kultivierte Zellen oder nicht-humane, bezüglich des interessierenden Gens transgen gemachte Tiere sein. Bei letzterer Situation ist transgene Expression in Milch eine wertvolle Technik, weil in der Brustdrüse wirkende Transgene beschrieben wurden und Milch eine einfach verfügbare Körperflüssigkeit ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbesserung von Expressionsvektoren, die verwendet werden, um rekombinante Proteine in Milch herzustellen. Diese verbesserten Expressionsvektoren werden die Ausbeute an wertvollen rekombinanten Proteinen erhöhen, was für die Erleichterung nachfolgender Behandlungs- und Reinigungsschritte wertvoll sein wird.
Der Aufbau eines Transgens verlangt gewisse Basis-Ingredienzien, wobei eine das strukturelle Gen ist, welches die kodierende Information für das interessierende Protein enthält. Ein grundlegender eukaryotischer Genexpressions-Promotor wird ebenfalls benötigt. Zusätzlich können andere Sequenzen verwendet werden, die Gewebespezifität vermitteln oder die Expression als Antwort auf einen Reiz verbessern. Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf einen spezifischen Typ von Enhancern, und zwar Enhancer, welche auf hormonelle Reize antworten. Der besondere, in Frage stehende Enhancer ist eine DNA-Sequenz, die eine Antwort zu Signalen überträgt, welche durch hypophysäre Hormone hervorgerufen werden, die zu der Gruppe von lactogenischen Hormonen gehören, wie z. B. Prolactin (Prl) und Placenta-Lactogen (PL), und somatogenische Hormone, wie z. B. Wachstumshormon (GH). Beide dieser Hormongruppen besetzen zentrale Rollen in der Stimulierung der Brustdrüsenentwicklung und -funktion. Die vorliegende Erfindung betrifft die Definition von Enhancern, welche sowohl auf lactogenische als auch somatogenische Hormone antworten und die Herstellung von Expressionsvektoren, welche, in ihrer Fähigkeit sowohl auf lactogenische als auch somatogenische Hormone zu antworten, in einer verbesserten Weise als Transgene zur Herstellung von rekombinanten Proteinen in Milch wirken werden.
Vorangegangene Studien haben ein Gen definiert, das Serinprotease-Inhibitor 2.1 (SPI)-Gen, das auf GH antwortet. In der 5' Flanke diese Gens wurde ein DNA-Element identifiziert, das Genexpression in einer GH-abhängigen Art und Weise verbessert. Die Sequenz dieses in Frage stehenden GH-Antwortelements (SPI GH-RE) ist:
GATCTACGCTTCTACTAATCCATGTTCTGAGAAATCATC CAGTCTGCCCATG, (Yoon et al., J. Biol. Chem. 265; 19947 (1991)).
Innerhalb dieser Sequenz offenbaren wir nun eine kürzeres "SPI-GAS-ähnliches Element"; TTCTGAGAA, das die zentrale GH geregelte Sequenz darstellt. Wie unten beispielhaft dargestellt, ist das SPI-GAS Element auch funktional, wenn es auf ein Reporter-Gen wie z. B. Luciferase-Gen (Sliva D. et al., J. Biol. Chem. in press) übertragen wird. Im folgenden offenbaren wir auch, dass die oben beschriebenen GH-geregelten Sequenzen, auch durch Prolactin geregelt werden, und dass dies zur Gestaltung neuer Expressions-Vektoren verwendet werden kann, die existierende, zur Herstellung rekombinanter Proteine in Milch verwendete Vektoren verbesseren.
Beispiele
Beispiel 1 zum Vergleich. Identifikation einer zentralen GH geregelten Sequenz
Das 52 bp SPI-GHRE;
(GATCTACGCTTCTACTAATCCATGTTCTGAGAAATCATC CAGTCTGCCCATG) wurde verwendet, um eine zentrale GH geregelte Sequenz, unter Verwendung eines Gelelektrophorese-Mobilitäts-Shift-Assays (GEMSA) zu identifizieren. Kern-Extrakte wurden hergestellt und mit einem 32P gelabelten 50 bp SPI-GHRE inkubiert. Nachfolgend wurden die Extrakte auf Polyacrylamid-Gelen analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass Kernproteine abhängig von GH an diese DNA-Sequenz gebunden wurden. Durch Konkurrenz mit kürzeren, von SPI-GHRE erhaltenen Oligo nukleotiden wurde eine zentrale GH Sequenz identifiziert. Basierend auf gewissen Sequenzhomologien zu Interferon Antwort-Elementen haben wir diese Sequenz SPI-GAS benannt und auch gezeigt, dass SPI-GAS als ein GH geregeltes DNA Element wirkt, wenn es in einen Reportervektor verbracht wird. Das zentrale SPI-GAS hat die folgende Sequenz: TTCTGAGAA.
Beispiel 2. Prolactin und Wachtstumshormone aktivieren beide SPI-TK-Reporter-Gene
Ein Expressions-Plasmid, enthaltend einen rekombinanten Hormon-Antwort-Reporter, beinhaltend sechs Wiederholungen eines 50 bp Wachtstumshormon-Antwort-Elements (GH-RE) von dem Serinprotease-Inhibitor (SPI) 2.1 Promotor angefügt an den Thymidin-Kinease (TK) Promotor, wurde aufgebaut. Entsprechende Konstrukte wurden unter Verwendung des SPI-GAS Elements hergestellt. Varianten, die entweder die bakterielle Protein-Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT) oder Glühwürmchen-Luciferase (SPI-CAT oder SPI-Luc entsprechend) cDNAs exprimieren, wurden dann aufgebaut. Techniken zur Herstellung dieser Vektoren sind den Fachleuten des Gebiets wohlbekannt. Die Plasmid DNA Konstrukte wurden zusammen mit Plasmid-Expressionsvektoren, die entweder auf Ratten-Wachstumshormon-Rezeptoren oder Maus-Prolactin-Rezeptoren kodieren, in China-Hamster-Ovarium (CHO), COS, und Büffelrattenleberzellen (BRL) unter Verwendung von DOTAP Liposomen und gemäß den Herstellerangaben transfiziert. Zellen wurden über Nacht mit DNA und DOTAP in serumfreiem Medium inkubiert, ruhen gelassen und dann dem Wachtstumshormon oder Prolactin für 12 Stunden ausgesetzt. Zell-Lysate wurden dann hergestellt und CAT oder Luciferase-Enzymaktivität gemessen. Sowohl Wachstumshormon- als auch Prolactinbehandlung führen zu einer näherungsweise 5-fachen Stimulation von Reporter-Enzym-Expression relativ zu transfizierten, aber nicht hormonbehandelten Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl das Wachstumshormon als auch Prolactin das Reporter-Konstrukt regeln können, und dass ein Erfordernis dafür die Präsenz von SPI-Elementen ist. Das zentrale Element in dem SPI-TK-Reporter-Gen, das GH Regulation vermittelt ist wahrscheinlich TTCTGAGAA, und es können ähnliche Resultate mit diesem SPI-GLE benannten Element, ebenso wie mit dem längeren, 50 bp Element, genannt SPI-GHRE, erhalten werden.
Beispiel 3. Multimere SPI Elemente vor einem TK Promotor geben eine bessere Antwort
Reporter-Plasmide, enthaltend eine bis sechs Kopien von dem 50 bp SPI Element, angefügt an den TK Promotor, wurden aufgebaut. Die Wachstumshormon-Antwortfähigkeit von diesen Konstrukten wurde durch Transfizierung in eine CHO Zelllinie getestet, die stabil die Ratten-Wachstumshormon-Rezeptor DNA exprimiert. Wachstumshormon-Stimulation von diesen Zellen zeigte, dass Multimerisation von SPI Elementen in einer größeren Wachstumshormon-Antwort resultierte.
Beispiel 4 zum Vergleich. Exprimierung von stabil inkorporierter SPI-TK-Luciferase ist Wachstumshormon-geregelt
Um zu zeigen, dass SPI Elemente eine Wachstumshormon-Antwortfähigkeits-Funktion, wenn sie genomikal integriert wurden beibehalten, wurden CHO Zellen mit den drei folgenden Plasmiden transfiziert: SPI-LUC (beschrieben in Beispiel 1), einem den CMV Promotor und Ratten-Wachstumshormon-Rezeptor cDNA enthaltenden Expressionsvektor und einen Neomycin-Expressionsvektor. Neomycin-resistente Klone wurden auf Wachstumshormon-Antwort durch Aussetzung von Zellen gegen das Wachtstumshormon für 12 h unter serumfreien Bedingungen getestet und dann die Luciferase-Aktivität in Zell-Lysaten gemessen. Die Ergebnisse zeigten eine dreifach Wachstumshormon-geregelte Induktion der Exprimierung des stabil integrierten Reporter-Gens.
Beispiel 5 zum Vergleich. SPI Elemente vor einem starken Promotor (SV40) ergibt eine Proteinproduktion, die weiter durch GH verstärkt wird
Sechs Kopien von den SPI Elementen wurden stromaufwärts von einem starken CMV Promotor, der Exprimierung von den CAT cDNA in Plasmid-Konstrukte unterstützt, eingebaut. Dieses Konstrukt wurde in CHO-4 Zellen transfiziert und die GH Regulation wurde, wie oben beschrieben getestet. Es wurde gefunden, dass GH die Herstellung von CAT stimulierte.

Claims

Verfahren zur Verbesserung der Transkription eines Gens in einem DNA-Konstrukt, welches in das Genom einer nicht-humanen eukaryotischen Gastrelle aufgenommen ist, wobei das DNA-Konstrukt ein strukturelles Gen für ein gewünschtes Protein oder Polypeptid und einen Genpromotor stromaufwärts des strukturellen Gens umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) das Bereitstellen, stromaufwärts von dem Promotor eingebaut, wenigstens eines Spi 2.1 GH Antwort-Elements umfassend die Nukleotidsequenz GATCTACGCTTCTACTAATCCATGTTCTGAGAAAT CATCCAGTCTGCCCATG, oder einen, die Nukleotidsequenz TTCTGAGAA umfassenden Teil davon, und (ii) die Aussetzung des DNA-Konstrukts gegenüber von Prolactin hervorgerufenen Signalen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Teil des Spi 2.1 GH Antwort-Elements im Wesentlichen aus der Nukleotidsequenz TTCTGAGAA besteht.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, worin der Teil des Spi 2.1 GH Antwort-Elements aus der Nukleotidsequenz TTCTGAGAA besteht.