DE10152660A1 - Verwendung einer Nukleotidsequenz kodierend für ein intrazelluläres Hyaluronsäure-bindendes Protein - Google Patents
Verwendung einer Nukleotidsequenz kodierend für ein intrazelluläres Hyaluronsäure-bindendes ProteinInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Nukleotidsequenz, kodierend für ein intrazelluläres Hyaluronsäure-bindendes Protein (IHABP), sowie angrenzender nicht-translatierter Nukleotidsequenzen regulatorischer Funktion zur Identifizierung neuronaler Stammzellen, neuronale Stammzellen und deren Verwendung in weiten Bereichen der Medizin.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Nukleotidsequenz
kodierend für ein intrazelluläres Hyaluronsäure-bindendes Protein (IHABP).
Das Glukosaminoglykan Hyaluronsäure ist eine wesentliche Komponente der
Zellmatrix und scheint in den Zellen Signale zur Zellteilung und Gewebebildung
auszulösen. Ferner ist beschrieben, daß zelluläre Rezeptoren an Hyaluronsäure
binden, die ihrerseits an einem weiten Spektrum biologischer Prozesse beteiligt
sind, wie beispielsweise die Organogenese (L. Sherman et al., Curr. Opin. Cell.
Biol., 6, 726-33, 1994), die Entwicklung embryonaler Strukturen, Verbreitung von
normalen Zellen oder von Tumorzellen (U. Günthert et al., Cell, 65, 13-24, 1991)
sowie die Aktivierung von Immunantworten (R. Arch et al., Science, 257, 682-85,
1992). Beispiele für zelluläre Rezeptoren der Hyaluronsäure sind CD44 (Lesley
et al. 1993, Advan. Immunol., 54: 271-335), ICAM-1 (P. A.. McCourt et al., J.
Biol. Chem., 269, 30081-84, 1994), RHAMM (E. A. Turley et al., Exp. Cell. Res.,
187, 243-49, 1990) oder LYVE-1 (S. Banerji et al., J. Cell. Biol., 144, 789-801,
1999). Die Wechselwirkung des RHAMM-Rezeptors (receptor for hyaluronan-mediated
motility) mit Hyaluronsäure löst dabei verschiedene Mechanismen in
den Zellen aus, wie beispielsweise Signaltransduktionskaskaden (T. E. I. Taher
et al., J. Biol. Chem., 271, 2863-67, 1996).
Verletzungen oder Erkrankungen von Zellen, Geweben oder Organen werden
fast täglich diagnostiziert. Insbesondere bei neuronalen Zellen ist eine Therapie
schwierig und oftmals unmöglich, da bereits differenzierte neuronale Zellen nicht
mehr vermehrungsfähig sind und folglich nicht nachwachsen. Die Identifizierung
von totipotenten Stammzellen, insbesondere des Gehirns und die Regeneration
von neuronalen Stammzellen, beispielsweise zur Anwendung in Bereichen der
Transplantationsmedizin, ist daher wünschenswert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer
Nukleotidsequenz enthaltend einen für ein intrazelluläres Hyaluronsäure-bindendes
Protein (IHABP) oder Allelvariationen oder Isoformen davon
kodierenden Sequenzabschnitt und/oder diesem Strukturgen vorausgehende
und/oder nachfolgende, ggf. regulatorisch wirkende 5'- und/oder 3'-Regionen
oder im wesentlichen gleichwirkende natürliche, chemisch synthetisierte,
modifizierte oder artifiziell erzeugte Nukleotidsequenzen oder mit diesen
homologe und/oder heterologe Nukleotidsequenzen oder Mischungen davon zur
Identifizierung neuronaler Stammzellen, wobei
- a) ein Genkonstrukt enthaltend wenigstens ein promotorloses Reportergen flankiert von Sequenzabschnitten ausgewählt aus der für IHABP kodierenden Nukleotidsequenz mit ihren vorausgehenden und/oder nachfolgenden 5'- und/oder 3'-Regionen oder aus im wesentlichen gleichwirkenden natürlichen, chemisch synthetisierten, modifizierten oder artifiziell erzeugten Nukleotidsequenzen oder mit diesen homologe und/oder heterologe Nukleotidsequenzen oder einem Vektor enthaltend dieses Genkonstrukt und zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Übertragung des Genkonstruktes und/oder dessen Integration in das Genom einer Wirtszelle, in embryonale Säugerzellen übertragen wird,
- b) in diesen transformierten Säugerzellen das chromosomale IHABP-Gen gezielt durch das in Schritt a) eingebrachte Genkonstrukt durch homologe Rekombination inaktiviert wird und dadurch das promotorlose Reportergen unter die Kontrolle des IHABP-Promotors gestellt wird,
- c) die aus Schritt b) resultierenden genetisch veränderten Säugerzellen weiter kultiviert werden,
- d) in der aus den Schritten a), b) und c) resultierenden Zellpopulation genetisch veränderter Säugerzellen ausgehend von dem IHABP-Promotor ein heterologes Genprodukt exprimiert wird und
- e) durch den spezifischen Nachweis dieses heterologen Genproduktes diejenigen Zellen innerhalb der Zellpopulation identifiziert werden, die neuronale Stammzellen sind.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die aus genetisch
veränderten embryonalen Säugerzellen resultierende Zellpopulation in
Blastozysten-Zellen injiziert und ggf. diese Blastozysten-Zellen in die
Gebärmutter eines scheinschwangeren Säugetieres eingebracht und zu einem
genetisch veränderten mehrzelligen Organismus ausgetragen.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden in der nachfolgenden
F1-Generation die homozygoten Nachkommen identifiziert, welche das
heterologe Genprodukt in beiden RHAMM-Genorten erzeugen. In einer anderen
Ausführung werden die heterozygoten Nachkommen identifiziert, bei denen nur
ein Allel ersetzt wurde.
Die bisherigen Betrachtungen gehen dabei allesamt von einer Bindung der
Hyaluronsäure durch Rezeptoren aus, die auf der extrazellulären Seite der
Zellmembran angeordnet sind. Bei dem als Rezeptor für Hyaluronsäure
fungierenden Protein der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein
intrazelluläres Protein. Das erfindungsgemäße IHABP-Gen ist eine
Splicevariante des Genlokus, der auch für das zuvor beschriebenen RHAMM-
Gen kodiert (Fieber et al., Gene, 226, 41-50, 1999 und M. Hofmann et al., Cell,
95, 591-93, 1998). Gegenüber dem publizierten RHAMM-Rezeptor weist das
erfindungsgemäße IHABP-Gen allerdings vollkommen andere Eigenschaften
auf. So wurde beispielsweise bei der Expression von IHABP in "Knock-out"-Mäusen
eine Benachteiligung der Hämopoiese festgestellt.
Ein Merkmal des erfindungsgemäßen intrazellulären Hyaluronsäure-bindenden
Proteins (IHABP) ist dabei, daß es gewebespezifisch exprimiert wird. Die
Expression des IHABP-Gens erfolgt insbesondere in neuronalen Stammzellen.
Eine weitere Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung zeigt die
spezifische Expression des IHABP-Proteins in Stammzellen des Gehirns.
Die Nukleotidsequenz kodierend für IHABP sowie 5'- und 3'- angrenzende
regulatorisch wirkende Regionen, sind bei Hofman et al. (J. Cell Sci., 111,
1673-84, 1998) und Fieber et al. (Gene, 226, 41-50, 1999) beschrieben.
Unter 5'- und 3'-Regionen sind erfindungsgemäß solche Sequenzen zu
verstehen die keine kodierenden Funktionen tragen und/oder ggf. regulatorische
Funktionen besitzen, wie z. B. Promotoren, Enhancer, Operatoren,
Terminatoren oder "UPE" (upstream promotor elements).
Unter im wesentlichen gleichwirkenden, d. h. funktionell äquivalenten
Sequenzen, die für ein IHABP-Gen kodieren, sind solche Sequenzen zu
verstehen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten
Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich
vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche,
z. B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch der
Wirtszelle angepaßte, künstliche Nukleotidsequenzen.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch
natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten und für ein
intrazelluläres Hyaluronsäure-bindendes Rezeptorprotein kodierenden Sequenz,
welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen
Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines
oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche
Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man
durch Modifikation der IHABP-Nukleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen
Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen
kodierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer
Restriktionsenzym-Schnittstellen sein. Funktionelle Äquivalente sind auch solche
Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment,
abgeschwächt oder verstärkt ist.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben
beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln. Solche artifiziellen
DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels
Molecular Modeling konstruierter Proteine, die IHABP-Aktivität aufweisen oder
durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende
DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß
der für die Wirtszelle spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die
spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit genetischen Methoden vertrauter
Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu
transformierenden Wirtszelle leicht ermitteln.
Unter homologen Sequenzen sind erfindungsgemäß solche zu verstehen, die zu
den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen komplementär sind und/oder mit
diesen hybridisieren. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt
erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe
von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten stringenten Bedingungen
eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den zuvor genannten
Nukleotidsequenzen eingehen. Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen
mit einer Länge von beispielsweise 10 bis 30, bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden.
Unter heterologen Nukleotidsequenzen sind solche Sequenzen zu verstehen,
die im wesentlichen gleich wirken, also funktionell äquivalent sind, jedoch aus
einem anderen Organismus stammen. Unter Isoformen sind Enzyme mit
gleicher oder vergleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verstehen, die
jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.
Diese zuvor gemachten Ausführungen beziehen sich gleichsam auch auf die
dem Strukturgen vorausgehenden und/oder nachfolgenden 5'- und/oder
3'-Regionen.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor enthaltend wenigstens ein
promotorloses Reportergen flankiert von Sequenzabschnitten ausgewählt aus
der IHABP-Sequenz und regulatorisch wirkende 5' und 3' Regionen oder im
wesentlichen gleichwirkende natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte
oder artifiziell erzeugte Nukleotidsequenzen oder mit diesen homologe und/oder
heterologe Nukleotid-Sequenzen kodierend für ein intrazelluläres
Hyaluronsäure-bindendes Protein (IHABP) oder Allelvariationen oder Isoformen
davon und zusätzliche Sequenzen zur Selektion, Replikation und/oder
Integration.
In einer Ausführungsvariante enthält der Vektor:
- a) ein DNA-Konstrukt auf Basis des Vektors pTV-O dadurch gekennzeichnet, daß das Neomycin-Resistenzgen mit Restriktionsenzymen herausgeschnitten wird,
- b) eine cDNA, codierend für ein promotorloses Reportergen
- c) eine 5'-Fragment aus dem knock-out-Konstrukt ohne eigene Promotoraktivität, bevorzugt der kurze 5'-IHABP-Arm
- d) eine 3'-Region, bevorzugt ein genomisches Pstl Fragment und/oder
- e) zusätzliche Sequenzen zur Selektion, Replikation und/oder Integration.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung liegt der Verwendung des Genkonstruktes
oder des Vektors der Vorgang der Integration des Genkonstrukts, z. B. via
homologer Rekombination, in das Genom geeigneter Wirtszellen,
beispielsweise embryonaler Zellen zugrunde. Eine wesentliche Voraussetzung
für eine zielgerichtete homologe Rekombination eines Reportergens unter der
Kontrolle des IHABP-Promotors ist hier durch die in dem Genkonstrukt
enthaltenen und das promotorlose Reportergen flankierenden
Nuklectidsequenzen erfüllt, welche ausgewählt sind aus der für IHABP
kodierenden Sequenz sowie den angrenzenden 5'- und/oder 3'-Regionen. Die
Kriterien zur Auswahl hierzu geeigneter Sequenzbereiche sind dem Fachmann
bekannt. Die Fusion mit dem promotorlosen Reportergen sowie die Herstellung
des Genkonstruktes insgesamt erfolgt nach gängigen molekulargenetischen
Methoden.
Ein Indikator für die erfolgreiche Integration des an sich promotorlosen
Reportergens in das Genom der Wirtszelle ist die Bildung des entsprechenden
Reportergenproduktes, welches nur gebildet werden kann, wenn das
Reportergen der Kontrolle eines genomischen Promotors, hier des
IHABP-Promotors, unterliegt.
Unter einem Reportergen ist erfindungsgemäß eine Nukleotidsequenz zu
verstehen, die für ein Expressionsprodukt kodiert, welches normalerweise nicht
von der Zelle ausgeprägt wird und die sich als sogenannter Selektionsmarker
auszeichnet. Beispiele solcher Selektionsmarker sind in der Literatur zahlreich
beschrieben. Als Beispiele sind Nukleotidsequenzen zu nennen, die den Zellen
in denen sie exprimiert werden einen physiologischen Vorteil vermitteln oder
deren Expressionsprodukt auf einfache Weise detektiert werden kann.
In einer Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung können dies
Nukleotidsequenzen sein, die eine Antibiotika-Resistenz oder einen
Wachstumsvorteil vermitteln oder die z. B. durch enzymkatalysierte Reaktionen
oder einen Farbnachweis oder Fluoreszenz-Messung nachgewiesen werden
können. Besonders geeignete Reportergene sind das lacZ-Gen kodierend für
eine β-Galaktosidase, Gene kodierend für fluoreszierende Proteine, z. B. GFP
("green fluorescence protein") oder die entsprechenden rot bzw. blau
fluoreszierenden Proteine, Gene kodierend für spezifische Oberflächenantigene
die von Antikörpern identifiziert werden oder Gene die für eine
Wirkstoff-Resistenz kodieren, wie z. B. Neomycin, Gentamycin, Hygromycin.
Erfindungsgemäß werden Gene kodierend für fluoreszierende Proteine
bevorzugt. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch alle nicht explizit
aufgeführten und im Sinne der Erfindung geeigneten Selektionsmarker, die aus
der Literatur bekannt sind.
Die zuvor genannten Verfahren zur Integration von Reportergenen in das
Chromosom von Wirtszeilen und die Herstellung der dazu erforderlichen
Genkonstrukte sind gängig. Die resultierenden chromosomal kodierten Fusions-
Konstrukte werden als "Knock-in"-, hinsichtlich der eingeführten
Nukleotidsequenz, bzw. "Knock-out"-Konstrukte, hinsichtlich des
Funktionsverlustes des Gens in das die Nukleotidsequenz eingeführt wird,
beschrieben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung eines
Vektors zur Identifizierung neuronaler Stammzellen enthaltend ein zuvor
beschriebenes Genkonstrukt sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur
Übertragung des Genkonstruktes in eine Wirtszelle und/oder dessen Integration
in das Genom dieser Wirtszelle, bevorzugt einer embryonalen Säugerzelle. Die
zusätzlichen Nukleotidsequenzen sind aus der Literatur bekannt und eine
geeignete Auswahl ist dem Fachmann geläufig.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit zur Identifizierung neuronaler
Stammzellen enthaltend wenigstens ein zuvor beschriebenes Genkonstrukt
und/oder einen zuvor genannten Vektor sowie Anleitungen zu deren
Übertragung in geeignete Wirtszellen und zum Nachweis des spezifisch in
neuronalen Stammzellen gebildeten Expressionsproduktes ausgehend von
einem Reportergen. Bevorzugte Wirtszellen sind embryonale Säugerzellen
außer humanen embryonalen Stammzellen.
Die vorliegenden Erfindung umfaßt somit auch genetisch stabil veränderte
embryonale Zellen sowie deren Nachkommen enthaltend ein Genkonstrukt oder
einen Vektor der zuvor genannten Art oder zumindest Teile davon,
beispielsweise das promotorlose Reportergen, zur Identifizierung neuronaler
Stammzellen aus einer Vielzahl von Zellen, d. h. einer Zellpopulation. Unter
stabil veränderten Zellen sind im Sinne der Erfindung solche zu verstehen, bei
denen das Reportergen via homologer Rekombination in das Genom integriert
vorliegt. Unter Nachkommen sind insbesondere stabile Zellinien und ggf. aus
diesen regenerierte genetisch veränderte Organismen zu verstehen.
Die vorliegenden Erfindung umfaßt weiterhin genetisch veränderte embryonale
Zellen sowie deren Nachkommen enthaltend ein inaktives IHABP-Gen in
heterozygoter Form sowie genetisch veränderte embryonale Zellen sowie deren
Nachkommen enthaltend ein inaktives IHABP-Gen in homozygoter Form.
Auch ein genetisch veränderter Organismus, Zellen davon und/oder
dessen/deren Nachkommen enthaltend ein zuvor beschriebenes Genkonstrukt
oder einen Vektor oder Teile davon sind von der vorliegenden Erfindung
eingeschlossen. Gleiches gilt für einen genetisch veränderten Organismus,
Zellen davon und/oder dessen/deren Nachkommen enthaltend ein inaktives
IHABP-Gen in heterozygoter Form oder ein genetisch veränderter Organismus,
Zellen davon und/oder dessen/deren Nachkommen enthaltend ein inaktives
IHABP-Gen in homozygoter Form.
Im Sinne der Erfindung zeichnet sich der genetisch veränderte Organismus,
Zellen davon und/oder dessen/deren Nachkommen dadurch aus, daß er ein
Säugetier, bevorzugt ein Tier aus der Gattung der Nagetiere, besonders
bevorzugt der Spezies Maus ist. Der Mensch als Säuger ist erfindungsgemäß
ausgeschlossen.
Humane, neuronale Stammzellen können jedoch mit Hilfe der vorliegenden
Erfindung außerhalb des menschlichen Körpers identifiziert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner auch neuronale
Stammzellen sowie deren Nachkommen identifiziert auf zuvor beschriebene
Weise enthaltend ein erfindungsgemäßes Genkonstrukt oder einen
erfindungsgemäßen Vektor oder Teile davon.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung neuronale Stammzellen identifiziert
auf zuvor beschriebene Weise sowie deren Nachkommen enthaltend ein
inaktives IHABP-Gen in heterozygoter Form. Auch sind neuronale Stammzellen
sowie deren Nachkommen enthaltend ein inaktives IHABP-Gen in homozygoter
Form in die Erfindung mit eingeschlossen.
Die Selektion kann durch den Nachweis des IHAB-Proteins selbst,
beispielsweise durch spezifische Antikörper, den Nachweis eines zellfremden
Reportergenproduktes, beispielsweise photospektrometrisch oder die
Hybridisierung mit geeigneten Nukleotidsonden, beispielsweise durch nicht
radioaktive Markierung erfolgen.
Ein als Selektionsmarker bevorzugter Sequenzbereich zur Identifizierung
neuronaler Stammzellen stellt der dem IHABP-Strukturgen vorausgehende
Sequenzbereich und bevorzugt der erfindungsgemäße Promotorbereich des
IHABP-Gens dar, der erfindungsgemäß die gewebespezifische Expression der
entsprechend mit ihm operativ verknüpften Strukturgene kontrolliert. Dieser
Promotorbereich muß dem Strukturgen nicht unmittelbar vorausgehen. So kann
er beispielsweise mehrere 100 bis mehrere tausend Basenpaare von dem durch
ihn regulierten Strukturgen entfernt sein.
Die vorliegende Erfindung umfaßt somit einen Sequenzbereich ausgewählt aus
der Nukleotidsequenz stromaufwärts des IHABP-Gens oder im wesentlichen
gleichwirkende natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifiziell
erzeugte Nukleotidsequenzen oder mit diesen homologe und/oder heterologe
Nuklectidsequenzen enthaltend eine Promotorregion, die spezifisch in
neuronalen Stammzellen aktiv ist.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch einen Sequenzbereich stromaufwärts
des IHABP-Gens enthaltend regulatorische Elemente wie z. B. Promotoren,
Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder "UPE" (upstream promotor elements).
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner die Verwendung eines zuvor
beschriebenen regulatorisch wirkenden Sequenzbereiches zur operativen
Verknüpfung mit zelleigenen oder zellfremden Strukturgenen und/oder
Mischungen davon und deren spezifische Expression in neuronalen
Stammzellen.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man hierbei die sequenzielle
Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und
ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente
seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz
bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner die Herstellung und der Einsatz einer
Sonde enthaltend eine zusammenhängende Abfolge von wenigstens 5,
bevorzugt 6-8, besonders bevorzugt 10-15 Nukleotiden ausgewählt aus dem
regulatorisch wirkendem Sequenzbereich des IHABP-Gens zur spezifischen
Hybridisierung und Identifizierung weiterer Nukleotidsequenzen mit
regulatorischer Funktion, bevorzugt Promotorfunktion, welche spezifisch die
Expression von Strukturgenen in neuronalen Stammzellen kontrollieren. Dazu
enthält die erfindungsgemäße Sonde eine zum spezifischen Nachweis
geeignete Markierung, beispielsweise durch ein Digoxygenin-System
(Boehringer Mannheim).
Die vorliegende Erfindung umfaßt somit auch die stromabwärts der
Promotorsequenzen gelegenen Gene sowie deren Expressionsprodukte, die der
natürlichen Kontrolle dieser zuvor identifizierten Promotoren im Chromosom der
Säugerzellen unterliegen und damit gewebespezifisch, d. h. in neuronalen
Stammzellen exprimiert werden. Eine genauere Charakterisierung der Gene, die
der Kontrolle diesen Promotoren unterliegenden kann nach gängigen Methoden,
wie beispielsweise "chromosomal walking" oder PCR erfolgen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit zur Identifizierung von
spezifisch in neuronalen Stammzellen aktiven Promotoren sowie die ihrer
Kontrolle natürlicherweise unterliegenden Gene enthaltend wenigstens eine
Sonde der zuvor beschriebenen Art sowie Anleitungen zur Hybridisierung mit
Nukleotidsequenzen und Detektion der entsprechend spezifischen
Hybridisierungsprodukte.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch das erfindungsgemäße IHAB-Protein
selbst, das vielfältig einsetzbar ist. So kann das IHAB-Protein zur Herstellung
von spezifischen Antikörpern genutzt werden, zur Untersuchung von
Rezeptor-Liganden-Bindungsverhalten und zur Identifzierung von Verbindungen, welche
die Aktivität des Rezeptors regulierend beeinflussen und somit Einfluß auf die
zelluläre Signalübertragung nehmen.
Die vorliegende Erfindung schließt dabei auch die Verwendung eines
Genkonstrukts zur spezifischen Expression in neuronalen Stammzellen
enthaltend einen regulatorisch wirkenden Sequenzbereich sowie operativ damit
verknüpfte Strukturgene ein.
Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Vektors zur
spezifischen Expression in neuronalen Stammzellen enthaltend ein
Genkonstrukt sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen für die Replikation in einer
Wirtszelle und/oder die Integration des Genkonstruktes in das Genom einer
Wirtszelle.
Darüber hinaus kann erfindungsgemäß die Menge an gebildetem Genprodukt
beispielsweise durch eine verstärkte Genexpression ausgehend von einem
genetisch veränderten Promotor reguliert werden. Die genetischen
Veränderungen basieren dabei auf natürlichen oder synthetischen Mutationen.
Neben einer genetischen Veränderung des Promotors kann die verstärkte
Expression des gewünschten Strukturgens auch in einer erhöhten
Genkopienzahl begründet sein. Eine erhöhte Genkopienzahl kann chromosomal
kodiert vorliegen oder in einer bevorzugten Ausführungsvariante der
vorliegenden Erfindung durch einen Vektor bewerkstelligt werden, der
extrachromosomal in erhöhter Kopienzahl in den Zellen vorliegt. Solche
Vektoren sind dem Fachmann geläufig. Ferner kann die Stabilität der spezifisch
in neuronalen Zellen gebildeten Genprodukte derart reguliert sein, daß sie
beispielsweise gegenüber dem Abbau durch Proteasen verstärkt oder
vermindert anfällig sind. Dies kann nach an sich bekannten Methoden durch
genetische Veränderungen auf Ebene der Nukleotidsequenz erfolgen.
Die Verwendung der Nukleotidsequenzen, Genkonstrukte und/oder Vektoren im Sinne
der vorliegenden Erfindung können sowohl in in-vitro aber auch in in-vivo-Systemen
eingesetzt werden. Beispiele für in-vivo-Systeme sind u. a.
Zellkulturen oder Zellinien eukaryontischer Zellen oder auch genetisch
veränderte Tiere. Erfindungsgemäß bevorzugt sind hierzu genetisch veränderte
Mäuse. Ein Vorteil eines solchen Tiermodells ist dessen Einsatzmöglichkeit als
Screening- und Validierungssystem für Medikamente im Vorfeld der klinischen
Prüfung.
Aufgrund der zuvor genannten Verwendungen des IHABP-Promotors zur Fusion
mit ausgewählten Strukturgenen lassen sich beliebige Genprodukte,
insbesondere solche mit therapeutischer Wirkung erfindungsgemäß
gewebespezifisch, also z. B. im Gehirn eines Säugers zur Ausprägung bringen.
Somit ist eine gezielte Darreichung von physiologisch aktiven Verbindungen, wie
beispielsweise Enzyme oder auch Hormone in neuronalen Zellen oder
Geweben denkbar.
So lassen sich mit Hilfe der vorliegenden Erfindung aus totipotenten
embryonalen Zellen, solche identifizieren, die sich in Laufe ihrer weiteren
Differenzierung zu neuronalen Stammzellen und noch weiter beispielsweise zu
Gehirnzellen weiter entwickeln. Dies bietet insbesondere in der Regenerations- und
Transplantationsmedizin zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten sowie in der
Behandlung degenerativer Nervenerkrankungen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf die Verwendung zuvor
beschriebener neuronaler Stammzellen und/oder genetisch veränderter
embryonaler Zellen und/oder eines genetisch veränderten mehrzelligen
Organismus, zur Regeneration von Nerven- und/oder Gehirnzellgewebe, zum
Einsatz in der Transplantationsmedizin und/oder zur Identifizierung und
Validierung von Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen des
Nervensystems.
Aufgrund der erfindungsgemäß gewebespezifischen Expression des
IHABP-Gens in neuronalen Stammzellen, liefert die der Erfindung zugrundeliegende
IHABP-Sequenz zahlreiche Möglichkeiten zur Identifizierung neuronaler
Stammzellen aus einer Zellpopulation. Ein besonderer Vorteil der vorliegenden
Erfindung besteht in der Möglichkeit aus sich differenzierten embryonalen
Zellen diejenigen in einem frühen Zellstadium zu identifizieren, die sich zu
Stammzellen des Gehirns entwickeln.
Die zuvor beschriebenen Vorgehensweisen zur Identifizierung neuronaler
Stammzellen, deren Kultivierung und die erfindungsgemäß gewebespezifische
Expression beliebiger Genprodukte in neuronalen Zellen, eröffnet zahlreiche
Diagnose- und/oder Therapieansätze mit enormer medizinischer Relevanz.
Hierzu zählen beispielsweise Anwendungen in Bereichen der Hämopoiese, der
Knochenmarkskultivierung, der Transplantationsmedizin sowie die Behandlung
neuronaler Erkrankungen, wie beispielsweise Morbus Parkinson oder Morbus
Alzheimer.
Aufgrund der Möglichkeit erfindungsgemäß eine Vielzahl regulatorisch
wirkender Sequenzen, insbesondere Promotoren, identifizieren zu können, die
spezifisch in neuronalen Stammzellen aktiv sind, lassen sich hochkonservierte
Bereiche, sogenannte Konsensussequenzen erstellen, deren Kenntnis zur
Expression heterologer Gene in neuronalen Stammzellen von Vorteil ist.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die
Beispiele näher erläutert, die aber keinesfalls limitierend für die Erfindung sind:
Das Konstrukt wurde unter Verwendung des Vektors pTV-O (Institut für Genetik
in Köln, Dr. W. Müller, G. Texido et al., Mol. Cell Biol. 20, 1227-33, 2000)
kloniert. Hierfür wurde der Vektor mit den Restriktionsenzymen Xhol und BamHI
verdaut, wobei das Neomycin-Resistenzgen herausgeschnitten wird. Der Vektor
wurde dann von dem Neomycin-Fragment über eine Gelelektrophorese getrennt
und in einer Drei-Fragmente-Ligation eingesetzt. Hierfür wurden die folgenden 3
Fragmente verwendet:
der Vektor wie oben beschrieben;
eine cDNA, welche für das promotorlose Neomycin-Resistenzgen codiert. Dieses wurde aus dem Vektor pHA14 mittels der Restriktionsenzyme EcoRI (5') und BamHI (3') herausgeschnitten;
der kurze Arm, 5'-IHABP-Arm ohne eigene Promotoraktivität (= ein durch PCR generiertes 0,4 kb Fragment, welches zwischen exon 9 und 10 amplifiziert wurde und das zuerst beschriebene Startcodon von RHAMM-IHABP enthält). Das Fragment wurde so amplifiziert, daß es eine Xhol Schnittstelle am 5'Ende und eine EcoRI Schnittstelle am 3'Ende besitzt. Das 3'Ende ist so konzipiert, daß eine in-frame Fusion des Startcodons des IHABP Gens mit dem Neomycingen entstehen kann. Dies hat zur Folge, daß das Resistenzgen nur in den Fällen exprimiert wird, in denen das endogene IHABP-Gen angeschaltet wird (wie z. B. auch in embryonalen Stammzellen).
der Vektor wie oben beschrieben;
eine cDNA, welche für das promotorlose Neomycin-Resistenzgen codiert. Dieses wurde aus dem Vektor pHA14 mittels der Restriktionsenzyme EcoRI (5') und BamHI (3') herausgeschnitten;
der kurze Arm, 5'-IHABP-Arm ohne eigene Promotoraktivität (= ein durch PCR generiertes 0,4 kb Fragment, welches zwischen exon 9 und 10 amplifiziert wurde und das zuerst beschriebene Startcodon von RHAMM-IHABP enthält). Das Fragment wurde so amplifiziert, daß es eine Xhol Schnittstelle am 5'Ende und eine EcoRI Schnittstelle am 3'Ende besitzt. Das 3'Ende ist so konzipiert, daß eine in-frame Fusion des Startcodons des IHABP Gens mit dem Neomycingen entstehen kann. Dies hat zur Folge, daß das Resistenzgen nur in den Fällen exprimiert wird, in denen das endogene IHABP-Gen angeschaltet wird (wie z. B. auch in embryonalen Stammzellen).
Die Ligation dieser Fragmente resultierte in einem Zwischenkonstrukt (500-pTV-O-neo),
welches den 5'Arm des knock-out Konstrukts integriert hat und für den
Einbau des 3'Arms verwendet wurde: Als 3'Arm dient ein genomisches Pstl
Fragment, welches zwischen Exon 11 und Intron 14 liegt.
Das Zwischenkonstrukt wurde mit Hpal geöffnet und das 3.5 kb Pstl Fragment
blunt ligiert. Das Konstrukt wurde verschiedenen Restriktionsverdaus
unterzogen, um die Orientierung und den Erfolg der Ligation zu überprüfen. Die
kritischen Fusionsstellen wurden zusätzlich ansequenziert, um deren Integrität
zu überprüfen.
Die Vektoren aus 1) werden mittels Mikroinjektion in embryonale Stammzellen
übertragen. Bei den injizierten Stammzellen handelt es sich um murine
embryonale Stammzellen aus 129 Mäusen. Die Stammzellen wurden auf
primären embryonalen Feeder-Fibroblasten in Stammzellmedium kultiviert
(Stammzellmedium = Dulbeccos, 15% FCS, Gin, Pyr, AA, LIF). Die positiven
Zellklone wurden bei einer Konzentration von 0.5 mg/ml G418 in
Stammzellmedium selektioniert, welches den Differenzierungsinhibitor LIF
enthielt. Die als positiv identifizierten wurden für die Generierung der Mäuse
benutzt.
Die Identifizierung des gewünschten Allels erfolgt via Southern Blot von
genomischer DNA, welche mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut wurde.
Das rekombinierte Allel zeigt ein 7.5 kB Signal während das Wildtypallel eine
Größe von 8.0 kb besitzt. Als Probe diente ein 500 bp Fragment, welches wie in
der beigelegten Karte (Fig. 1) beschrieben, lokalisiert ist. Weiterhin wurde das
gewünschte Allel mittels PCR identifiziert. Hierfür wurde ein Primer 5' des
integrierten Konstrukts in Kombination mit einem Primer im
Neomycin-Resistenzgen benutzt.
Die Hybridisierungsprobe enthält ein kurzes Intron und ein Fragment zwischen
+43 und +143, mit 1 = ATG in Exon 7 des IHABP-Gens, das amplifiziert wurde.
Fig. 1 Schematische Darstellung der Knock-out Konstruktion für das
IHABP-Gen.
Claims (8)
1. Verwendung einer Nukleotidsequenz enthaltend einen für ein
intrazelluläres Hyaluronsäure-bindendes Protein (IHABP) oder
Allelvariationen oder Isoformen davon kodierenden Sequenzabschnitt
und/oder diesem Strukturgen vorausgehende und/oder nachfolgende, ggf.
regulatorisch wirkende 5'- und/oder 3'-Regionen oder im wesentlichen
gleichwirkende natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder
artifiziell erzeugte Nukleotidsequenzen oder mit diesen homologe und/oder
heterologe Nukleotidsequenzen oder Mischungen davon zur Identifizierung
neuronaler Stammzellen, wobei
- a) ein Genkonstrukt enthaltend wenigstens ein promotorloses Reportergen flankiert von Sequenzabschnitten ausgewählt aus der für IHABP kodierenden Nukleotidsequenz mit ihren vorausgehenden und/oder nachfolgenden 5'- und/oder 3'-Regionen oder aus im wesentlichen gleichwirkenden natürlichen, chemisch synthetisierten, modifizierten oder artifiziell erzeugten Nukleotidsequenzen oder mit diesen homologe und/oder heterologe Nukleotidsequenzen oder einem Vektor enthaltend dieses Genkonstrukt und zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Übertragung des Genkonstruktes und/oder dessen Integration in das Genom einer Wirtszelle, in embryonale Säugerzellen übertragen wird,
- b) in diesen transformierten Säugerzellen das chromosomale IHABP-Gen gezielt durch das in Schritt a) eingebrachte Genkonstrukt durch homologe Rekombination inaktiviert wird und dadurch das promotorlose Reportergen unter die Kontrolle des IHABP-Promotors gestellt wird,
- c) die aus Schritt b) resultierenden genetisch veränderten Säugerzellen weiter kultiviert werden
- d) in der aus den Schritten a), b) und c) resultierenden Zellpopulation genetisch veränderter Säugerzellen ausgehend von dem IHABP- Promotor ein heterologes Genprodukt exprimiert wird und
- e) durch den spezifischen Nachweis dieses heterologen Genproduktes diejenigen Zellen innerhalb der Zellpopulation identifiziert werden, die neuronale Stammzellen sind.
2. Vektor enthaltend
- a) ein DNA-Konstrukt auf Basis des Vektors pTV-O dadurch gekennzeichnet, daß das Neomycin-Resistenzgen mit Restriktionsenzymen herausgeschnitten wird,
- b) eine cDNA, codierend für ein promotorloses Reportergen
- c) eine 5'-Fragment aus dem knock-out-Konstrukt ohne eigene Promotoraktivität, bevorzugt der kurze 5'-IHABP-Arm
- d) eine 3'-Region, bevorzugt ein genomisches Pstl Fragment und/oder
- e) zusätzliche Sequenzen zur Selektion, Replikation und/oder Integration.
3. Verwendung eines Vektors gemäß Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet,
daß die aus den Schritten 1a), 1b) und 1c) resultierende Zellpopulation
genetisch veränderten Säugerzellen in Blastozysten-Zellen injiziert werden
und ggf. diese Blastozysten-Zellen in die Gebärmutter eines
scheinschwangeren Säugetieres eingebracht und zu einem genetisch
veränderten mehrzelligen Organismus ausgetragen werden.
4. Neuronale Stammzellen identifiziert gemäß Anspruch 1 und/oder deren
Nachkommen enthaltend
- a) ein Genkonstrukt oder Teile davon, welches wenigstens ein promotorloses Reportergen flankiert von Sequenzabschnitten ausgewählt aus der für IHABP kodierenden Nukleotidsequenz und/oder vorausgehenden und/oder nachfolgenden 5'- und/oder 3'-Regionen oder aus im wesentlichen gleichwirkenden natürlichen, chemisch synthetisierten, modifizierten oder artifiziell erzeugten Nukleotidsequenzen oder mit diesen homologe und/oder heterologe Nukleotidsequenzen enthält oder
- b) einen Vektor gemäß Anspruch 2 oder Teile davon, welcher ein zuvor genanntes Genkonstrukt sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Übertragung des Genkonstruktes und/oder dessen Integration in das Genom einer Wirtszelle, bevorzugt eine embryonale Säugerzelle enthält.
5. Neuronale Stammzellen gemäß Anspruch 4 sowie deren Nachkommen
enthaltend ein inaktives IHABP-Gen in heterozygoter Form.
6. Neuronale Stammzellen gemäß Anspruch 4 sowie deren Nachkommen
enthaltend ein inaktives IHABP-Gen in homozygoter Form.
7. Kit zur Identifizierung neuronaler Stammzellen enthaltend wenigstens ein
Genkonstrukt enthaltend wenigstens ein promotorloses Reportergen
flankiert von Sequenzabschnitten ausgewählt aus der für IHABP
kodierenden Nukleotidsequenz mit ihren vorausgehenden und/oder
nachfolgenden 5'- und/oder 3'-Regionen oder aus im wesentlichen
gleichwirkenden natürlichen, chemisch synthetisierten, modifizierten oder
artifiziell erzeugten Nukleotidsequenzen oder mit diesen homologe und/oder
heterologe Nukleotidsequenzen oder einem Vektor enthaltend dieses
Genkonstrukt und zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Übertragung des
Genkonstruktes und/oder dessen Integration in das Genom einer Wirtszelle
und/oder einen Vektor gemäß Anspruch 3 sowie Anleitungen zu deren
Übertragung in geeignete Wirtszellen, bevorzugt embryonale Säugerzellen
und zum Nachweis eines spezifisch in neuronalen Stammzellen gebildeten
Expressionsproduktes des Reportergens.
8. Verwendung neuronaler Stammzellen gemäß einem der Ansprüche 4 bis
6 zur Regeneration von Nerven- und/oder Gehirnzellgewebe, zum Einsatz in
der Transplantationsmedizin und/oder zur Identifizierung und/oder
Validierung von Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen des
Nervensystems.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10152660A DE10152660A1 (de) | 2000-11-16 | 2001-10-16 | Verwendung einer Nukleotidsequenz kodierend für ein intrazelluläres Hyaluronsäure-bindendes Protein |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10056893 | 2000-11-16 | ||
| DE10152660A DE10152660A1 (de) | 2000-11-16 | 2001-10-16 | Verwendung einer Nukleotidsequenz kodierend für ein intrazelluläres Hyaluronsäure-bindendes Protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10152660A1 true DE10152660A1 (de) | 2002-05-23 |
Family
ID=7663571
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE10152660A Withdrawn DE10152660A1 (de) | 2000-11-16 | 2001-10-16 | Verwendung einer Nukleotidsequenz kodierend für ein intrazelluläres Hyaluronsäure-bindendes Protein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE10152660A1 (de) |
-
2001
- 2001-10-16 DE DE10152660A patent/DE10152660A1/de not_active Withdrawn
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