DE19831312A1 - Nicht-menschliche transgene Säuger, die durch Rekombinase-aktivierte Expression eines Zelltod-induzierenden Gens eine kontrollierte Zellablation in vivo ermöglichen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Säuger - Google Patents

Nicht-menschliche transgene Säuger, die durch Rekombinase-aktivierte Expression eines Zelltod-induzierenden Gens eine kontrollierte Zellablation in vivo ermöglichen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Säuger

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Abstract

Beschrieben sind Verfahren zur Herstellung von transgenen nicht-menschlichen Säugern, die spezifische Zellablation in vivo erlauben. Durch die Kombination von ortsspezifischen Rekombinasen, die Zellinien-spezifisch experimentiert werden und transgenen nicht-menschlichen Säugern, die ein aktivierbares Zelltod induzierendes Gen Zellinien-spezifisch experimentieren, kann eine selektive Abtötung von Zellen im lebenden Tier erreicht werden. Das Prinzip beruht darauf, daß die Rekombinase das Zelltod induzierende Gen aktivieren kann. Es wird eine technische Möglichkeit zur Verfügung gestellt, Tiermodelle zum Austesten von Arzneistoffen und Therapiemodellen zu entwickeln.

Description

Nicht-menschliche transgene Säuger, die durch Rekombinase-aktivierte Expression eines Zelltod-induzierenden Gens eine kontrollierte Zellablation in vivo ermöglichen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Säuger.
Die biomedizinische Forschung verwendet genetisch veränderte Tiere als Modelle, um Arzneimittel gegen Krankheiten zu entwickeln und zu testen. Durch Tiermodelle, die es erlauben, einfach spezifische Zellen oder Gewebe im lebenden Tier zu eliminieren, können neue Wege in der Arzneimittel- Entwicklung beschritten werden.
Definitionen
Zum besseren Verständnis der technischen Aspekte der Erfindung werden wichtige Begriffe kurz definiert: Rekombinase Zielsequenzen sind kurze DNA- Sequenzen, die von einer Rekombinase erkannt werden. Die Cre- Rekombinase ist ein Enzym, das DNA-Rekombination an Rekombinase Zielsequenzen, IoxP genannt, katalysieren kann. Zellablation bezeichnet die gezielte Abtötung oder Eliminierung von Zellen oder Geweben. Eine Zellpopulation ist eine Gruppe von Zellen, die durch die Expression eines oder mehrerer Gene charakterisiert ist. Eine Zielzelle ist eine spezifische Zelle, die ablatiert werden soll. Ein Konstrukt ist eine DNA-Sequenz, die aus verschiedenen DNA-Teilstücken mittels Klonierung zusammengesetzt wurde und zusammen mit einem Vektor im Genom integriert vorliegen kann.
Homologe Rekombination ist eine Technik; die den Austausch von DNA Fragmenten zwischen identischen Regionen zweier DNA-Fragmente ermöglicht.
Ein Zelltod-induzierendes Gen ist ein Gen, dessen Expression zum Absterben einer Zelle führt. Die aktive bzw. inaktive Form des Zell-induzierenden Gens stellt die transkribierbare und translatierbare Konfiguration des Zelltod­ induzierenden Gen-Konstruktes dar bzw. dessen nicht-transkribierbare und nicht-translatierbare Form. Subpopulation ist eine Zellpopulation, die sich von einer charakterisierten Population durch spezifische weitergehende Merkmale unterscheidet. Ein Strukturgen ist der Teil eines Gens, der in Protein übersetzt wird. Die basale Expression einer genregulatorischen Sequenz, z. B. eines Promotors, ist die geringe transkriptionelle Aktivität die zur geringen Expression eines Gens führt. Ein induzierbares Genregulations-System umfaßt genregulatorische Sequenzen in einem Tier oder Zellkultursystem, die erst bei Vorhandensein eines induzierenden Moleküls transkriptionell aktiv werden. Gene Targeting ist ein Verfahren zur gezielten Einführung von Nukleinsäuren an die gewünschte Stelle im Genom mittels homologer Rekombination. Genregulatorische Sequenzen bzw. Genregulationselemente sind Sequenzen, welche die Expression des Strukturgens steuern, z. B. Promotor, Enhancer, Matrix Attachment Site, Methylierungssignale usw. Ein synthetisches Genregulationselement ist ein Genregulationselement, das aus DNA-Sequenzabschnitten aufgebaut ist, die nicht natürlich vorkommen, aber funktionell eine Zellinien-spezifische Genexpression erlauben.
Stand der Technik
Die Manipulation des Genoms insbesondere von nicht-menschlichen Säugern z. B. von Mäusen durch Verfahren, die auf Gene Targeting und homologer Rekombination beruhen (Koller and Smithies, 1992) führen zum Verständnis der Funktion von einzelnen Genen im lebenden Organismus. Die Gene Targeting Technik ermöglicht es, Gene eines Säugers, z. B. einer Maus, zu verändern, zu inaktivieren oder zu ersetzen (Zou et al. 1994). Dadurch wurde es möglich, Krankheitsmodelle im Tier zu entwickeln, die auf der Mutation von essentiellen Genen beruhen. Diese Tiermodelle sind die Basis für die Entwicklung und Tests von Arzneimitteln und Gentherapie im Menschen.
In den letzten Jahren wurde durch die Verwendung von Rekombinase- Systemen in Säugern in vivo die Möglichkeit geschaffen, Gene im Tiermodell induzierbar und Gewebe- und Zell-spezifisch zu inaktivieren (Lam et al. 1997). Die technischen Möglichkeiten zur Manipulation einzelner Gene in vivo wurden dadurch deutlich erweitert. Dabei wird die Rekombinase entweder transient in embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) exprimiert oder das Rekombinase-Gen stabil durch transgene Techniken in das Genom integriert. Bei den Cre-Rekombinase-transgenen Tieren kann durch geeignete Wahl eines Promotors bzw. einer Promoter-Enhancer-Kombination die Expression der Cre-Rekombinase in Gewebe- oder Zell-spezifischer Weise gesteuert werden. Alternativ kann die Cre-Rekombinase in den Genort eines spezifischen Gens integriert werden und wird folglich in den selben Zellen und zum gleichen Zeitpunkt wie das natürliche Gen exprimiert.
Bei Verpaarung dieser Tiere mit einem Tier, dem die Rekombinase- Zielsequenzen so eingesetzt wurden, daß sie die Exons des Zielgens einrahmen, ist das Resultat eine Gewebe-spezifische Deletion des Gens. Die Folge ist das Fehlen des Genprodukts nur in bestimmten Zellen (Tarutani et al. 1997). Ein Vorteil dieser Methode liegt darin, daß die Funktion von Genen in bestimmten Geweben untersucht werden kann, während die Gene in anderen Geweben weiter exprimiert werden. Ein weiterer Vorteil ist die Untersuchung von Genen, deren Inaktivierung in frühen Stadien der Entwicklung eines Tieres letal ist. Außerdem wurden Verfahren entwickelt, bei denen durch die Gabe von Substanzen, welche die Genexpression stimulieren, die Expression der Rekombinase angeschaltet werden kann. Diese induzierbare Expression führt analog zu dem obengenannten Beispiel zu einer kontrollierten Deletion von Genen. Diese Verfahren sind bisher nur in solchen Fällen angewandt worden, in denen die Funktion von einzelnen Genprodukten in einer zeitlich kontrollierbaren, weil induzierbaren Weise in vivo untersucht werden sollte.
Ein anderes Feld der Forschung beschäftigt sich mit der Funktion von Gewebeverbänden und Zellpopulationen im lebenden Organismus. Sie werden durch die Expression eines oder mehrerer für die Zellpopulation charakteristischen Genprodukte definiert. Diese auch als Marker verwendeten Genprodukte können sehr spezifisch nur in bestimmten Zellen exprimiert sein.
Experimente, welche die Untersuchung der Funktion von bestimmten Zellpopulationen oder Geweben in vivo zum Ziel haben und sich der Inaktivierung oder Deletion der Zellen bedienen, sind bekannt (Palmiter et al. 1987). Es wurden Mausstämme etabliert, die das Diphtherie-Toxin A-Gen unter einem für Pankreaszellen spezifischen Promoter/Enhancer exprimieren und folglich zur Eliminierung des Pankreasgewebes führen (Palmiter et al. 1987). Das Prinzip dieser Experimente beruht auf der Spezifität der genregulatorischen Sequenzen, die mit einem toxischen Strukturgen kombiniert wurden. Dadurch können Zellen spezifisch abgetötet werden, ohne daß andere Zellen in Mitleidenschaft gezogen werden.
Ein ähnliches Verfahren verwendet das Thymidinkinase-Gen unter Kontrolle eines Gewebe spezifischen Promotors (Kamogawa et al. 1993). Zellen, die das Thymidinkinase Gen exprimieren, reagieren sensitiv auf Gancyclovir, eine Substanz, die nach Umsetzung durch die Thymidinkinase toxisch wird. Dadurch ist es möglich, daß man induzierbar spezifische Zellpopulationen in vivo eliminiert. Auch hier ist die Zellspezifität, durch die für die Promotor/Enhancer-Kombination bestimmt.
Die Techniken des Gene Targeting wurden bisher nur bei der Untersuchung der Genfunktion in vivo angewendet. Nur zufällig wurden auch Gene identifiziert, deren Deletion eine Zellablation einer ganzen Zellpopulation oder eines Gewebetypes zur Folge hatte. So können beispielsweise in RAG-1 defizienten Mäusen keine B-und T-Zellen mehr gefunden werden (Mombaerts et al. 1992). Da die Auswirkung der Gendeletion für die das Gen exprimierenden Zellen jedoch von Zielgen zu Zielgen unterschiedlich ist, kann man die klassische Methode der Geninaktivierung nicht für die Zellablation spezifischer Zellpopulationen voraussagbar anwenden.
Die Rekombinase-transgenen Tiere, die zur kontrollierten, zellspezifischen Deletion von einzelnen Genen in vivo verwendet werden, sind in ihrer Zielrichtung bisher nur auf die Untersuchung einzelner Genfunktionen gerichtet. Biomedizinische Untersuchungen zur Funktion definierter Zellen, die durch die Expression mehrerer Gene charakterisiert werden, können durch die bekannten Methoden nicht bearbeitet werden.
Die Technik, Zellablation durch die Expression eines Toxins unter der direkten Kontrolle eines zellspezifischen Promotors zu erreichen, ist nur für bestimmte Gene beziehungsweise Zellen geeignet. Das Problem ist die begrenzte Anwendbarkeit der Methode, da keine Subpopulationen von Zellen deletiert werden können, die durch die Expression von zwei unterschiedlichen Genen definiert sind.
Diese Nachteile werden am folgenden Beispiel erläutert.
So können nur Zellpopulationen untersucht werden, die durch ein bestimmtes Gen X definiert sind, wenn die spezifische genregulatorische Elemente des Gens X spezifisch nur in diesen Zielzellen aktiv sind. Falls andere Zellen auch das Gen X exprimieren werden auch sie ablatiert. Wenn diese Zellen z. B. während der embryonalen Entwicklung die regulatorischen Elemente des Gen X aktivieren, kann frühe embryonale Letalität eintreten.
Auch das induzierbare, auf der Thymidinkinase beruhende Verfahren kann nur genregulatorische Elemente zur Kontrolle der Toxinexpression verwenden, die ein bestimmtes begrenztes Expressionsmuster zeigen. So können die spezifischen genregulatorischen Elemente zur Zelldeletion nur dann verwendet werden, wenn die Thymidinkinase nicht in lebenswichtigen Zellen z. B. des zentralen Nervensystems exprimiert wird. Andernfalls würde die Gabe von Gancyclovir auch zur ungewollten Schädigung von lebenswichtigen Zellen führen.
Zellpopulationen, die durch die Expression von Genen gekennzeichnet sind, die von zwei unabhängigen genregulatorischen Elemente gesteuert werden, können nicht spezifisch ablatiert werden, wenn kein für diese Zellpopulation spezifisches Genregulationselement bekannt ist.
Ein weiterer Nachteil ist, daß für jede Zellart (engl. cell-lineage), die in vivo ablatiert werden soll, eine bzw. mehrere transgene Tierlinien etabliert werden müssen. Hierfür müssen jeweils die DNA-Konstrukte kloniert und in vitro getestet werden. Ferner ist die zufällige Integration des Expressions­ regulierten Toxin-Konstrukts in unterschiedlichste Integrationsorte, die einen großen Einfluß auf die Transgen-Expression haben können, von Nachteil. Deshalb müssen immer mehrere transgene Tierlinien etabliert, analysiert und gehalten werden, was einen großen logistischen und finanziellen Aufwand darstellt. Auch kann bei hoher Toxizität des verwendeten Toxins eine basale Expression auf niedrigem Niveau nicht toleriert werden. Dies erschwert die Nutzung der zur Zeit verwendeten Systeme erheblich, da eine vollständige Expressions-Kontrolle des Toxingens nicht gegeben ist.
Die Nachteile und Limitationen der bekannten Verfahren zur Zellablation und zur Herstellung standardisierter Mausstämme schränken die Forschung deutlich ein.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, nicht-menschlichen Säuger zu etablieren, die vereinfachte spezifische Zellablation von Zellen und Gewebe in vivo erlauben.
Es ist außerdem wünschenswert, verschiedene Rekombinase-transgene nicht-menschliche Säuger, die unterschiedliche zellspezifische Expression des Enzyms aufweisen, auch für diese Technik der spezifischen Zellablation zu verwenden. Schließlich sollen doppel-transgene Tiermodelle bereitgestellt werden, in denen Zellen ablatiert werden, die von mehr als einer Art von genregulatorischen Sequenzen mit Spezifität für Zellinien- bzw. Gewebe­ spezifische Expression abhängen, um dadurch eine höhere Selektivität der Zellablation in vivo zu erreichen. Als Zielzellen oder Zielgewebe der Zellablation kommen insbesondere Zellen in Frage, die durch die Expression von Adhäsionsmolekülen, Virusrezeptoren, MHC-Genen, Cytokine, Cytokinerezeptoren charakterisiert sind.
Diese Aufgaben werden gelöst durch die in den Ansprüchen und der Beschreibung und den Zeichnungen erläuterten Ausführungsformen. Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Herstellung von nicht-humanen transgenen Säugern, die ein Zelltod-induzierendes Gen tragen. Dieses Gen wird durch Rekombinase-Zielsequenzen so eingerahmt, daß die entsprechende Rekombinase in der Lage ist, durch Rekombination auf DNA- Ebene die Expression des Zelltod-induzierendes Gens zu aktivieren. Dabei wird das Zelltod-induzierende Gen so positioniert, daß das Gen vom Promotor nicht abgelesen werden kann. Eine Möglichkeit ist, das Gen relativ zur Promotor-Position zu invertieren. Das Gen wird durch zwei Rekombinase- Zielsequenzen so eingerahmt, daß durch die entsprechende Rekombinase ein DNA-Rekombinationsereignis katalysiert werden kann, bei dem das Gen invertiert wird. Bei Anwesenheit der Rekombinase tritt ein Gleichgewicht zwischen beiden Orientierungen ein. In der einen, der aktiven Orientierung kann das Zelltod-induzierende Gen von strangaufwärts gelegenen Genregulationselementen (Promotor/Enhancer) transkribiert und ein Zelltod­ induzierendes Protein oder eine Zelltod-induzierende RNA hergestellt werden. Es folgt der Zelltod. Das Zelltod-induzierende Gen ist so gewählt, daß auch eine kurzzeitige Bereitstellung der aktiven Orientierung und eine geringe Expression zum Zelltod führt. Dies ist nötig, da bei Vorhandensein der Rekombinase ein ständiger Wechsel beider Orientierungen des Zelltod induzierenden Gens relativ zu den Genregulationselementen auftritt. Anstelle des Strukturgens des Zelltod-induzierenden Gens können auch die genregulatorischen Sequenzen durch die Rekombinase-Zielsequenzen eingerahmt werden. Ist die Rekombinase anwesend, werden die genregulatorischen Sequenzen anstelle des des Zelltod induzierenden Strukturgens invertiert. Eine weitere Ausführungsform stellt ein nicht­ menschlicher-transgener Säuger dar, in dem in seinem Genom zwischen genregulatorischen Sequenzen und Strukturgen transkriptionsinhibierende Sequenzen von Rekombinase-Zielsequenzen eingerahmt sind. Die Deletion der transkriptionsinhibierenden DNA-Sequenzen mittels Rekombinase führt zur Expression eines Gens das ein Zelltod induzierendes Protein kodiert.
Eine wichtige Eigenschaft dieser Technik ist, daß nur bei gleichzeitiger Expression sowohl des Rekombinase-Gens als auch des Zelltod induzierenden Gens die Zielzelle abgetötet wird. Folglich kann die Spezifität der Zielzellen durch die Kombination von zwei unabhängigen Genregulationselementen (z. B. Promotoren/Enhancer) gesteuert werden. So kann eine Zielpopulation, die in vivo durch die Expression von Gen X und Gen Y charakterisiert ist, dadurch abgetötet werden, daß die Rekombinase unter der Kontrolle der genregulatorischen Elemente des Gens X exprimiert wird. Wird gleichzeitig das erfindungsgemäße Zelltod-induzierende Gen in der inaktiven Form unter die Kontrolle der genregulatorischen Elemente des Gens Y gestellt, kann nur in den Zellen, die beide genregulatorischen Elemente aktivieren können, der Zelltod eintreten. Nur in diesen Zellen wird die Rekombinase aktiviert, die das inaktive Zelltod-induzierende Gen durch DNA- Rekombination invertieren und somit vom genregulatorischen Element Y aus transkribierbar macht. Andere Zellen, die nur eines der beiden genregulatorischen Elemente der Gene X bzw. Y exprimieren können, werden nicht ablatiert.
Eine andere Anwendungsmöglichkeit ist die Kombination eines zellspezifischen Promotors für die Rekombinase oder das Zelltod induzierende Gen mit einem induzierbaren Regulations-System. Dadurch könnten Tiermodelle entwickelt werden, die eine induzierbare Deletion von definierten Zellen erfordern. Dabei kann das Zelltod-induzierende Gen an einem beliebigen Ort im Genom integriert werden. Die Spezifität wird durch die Anfügung der genregulatorischen Sequenzen an das Zelltod induzierende Gen erreicht.
Eine weitere Möglichkeit, die Expression eines heterologen Gens in zellspezifischer Weise zu steuern, kann durch die Integration des heterologen Gens in den Genlocus eines spezifisch exprimierten Gens erreicht werden (sogenannter "Knock-in"). In dem erfindungsgemäßen Fall handelt es sich um einen Knock-in des inaktiven Zelltod-induzierenden Gens in einen endogenen Genlocus, wobei das Zelltod-induzierende Gen relativ zu den genregulatorischen Sequenzen des Zielgens invertiert und mit Rekombinase- Zielsequenzen eingerahmt ist. Analog wie in dem vorstehend beschriebenen Verfahren kann durch eine Rekombinase ein DNA-Rekombinationsereignis aktiviert werden, das zur Inversion des Strukturgens des Zelltod­ induzierenden Gens und somit zur Transkription und Expression des Zelltod­ induzierenden Gens führt.
Erfindungsgemäß ist das System der doppelten Kontrolle der Expression eines Zelltod-induzierenden Gens mit verschiedenen Kombinationen von genregulatorischen Elementen verwendbar und prinzipiell auf alle Zellen anwendbar, die in der biomedizinischen Forschung relevant sind. Durch die Kombination mit synthetischen Genregulationselementen, die in ihrer Zellinien-spezifischen Expression durch höhere Selektivität den natürlichen Genregulationselementen überlegen sind, kann die beschriebene Technik in ihrer Anwendung erweitert werden.
Die Erfindung wird durch die Abbildungen weiter erläutert. Die umgekehrt geschriebenen Gennamen beschreiben invertierte Gensequenzen. Fig. 1 zeigt schematisch die Anordnung des Zelltod-induzierenden Gen- DNA-Konstruktes nach der Integration in das Genom. Strangaufwärts liegen die zell- bzw. gewebespezifischen genregulatorischen Elemente, wie der Promotor, hier Px (1) genannt. Sie steuern die für das Gen X chrakteristische zell- bzw. gewebespezifische Expression. Strangabwärts liegt eine Rekombinase Zielsequenz (2). Weiter strangabwärts liegt in invertierter Anordnung das Zelltod-induzierende Gen (3). Am Ende des Konstruktes ist eine weitere Cre-Rekombinase Zielsequenz positioniert (4). Das von zwei Rekombinase Zielsequenzen eingerahmte Zelltod-induzierende Gen ist so angeordnet, daß der kodierende Strang der doppelsträngigen DNA vom genregulatorischen Element, hier Px (1) genannt, nicht abgelesen werden kann, da die Transkription in falscher Richtung am anti-parallelen Strang des Zelltod-induzierenden Gens erfolgt. Dies stellt die inaktive Form (5) des Konstrukts dar, wie sie in allen Zellen des erfindungsgemäßen transgenen nicht-menschlichen Säugers vorliegt. Die Rekombinase-Zielsequenzen (2, 4) sind so zueinander angeordnet, daß eine ortspezifische DNA-Rekombination katalysiert werden kann, die zur Inversion des zwischen den Rekombinase- Zielsequenzen gelegenen DNA-Fragments führt.
Fig. 2 zeigt schematisch ein Rekombinase-DNA-Konstrukt nach der Integration in das Genom eines transgenen nicht-menschlichen Säugers. Strangaufwärts liegen Zell- bzw. Gewebe-spezifische Genregulations­ elemente (6), mit Ey und Py bezeichnet. Sie steuern die für das Gen Y chrakteristische Zell- bzw. Gewebe-spezifische Expression. Strangabwärts liegt das Strukturgen für die Rekombinase (7).
Fig. 3 zeigt schematisch den für die Erfindung grundlegenden Mechanismus. Dabei muß sich die Zielzelle des transgenen nicht-menschlichen Säugers, die ablatiert werden soll, dadurch auszeichnen, daß beide Zell- bzw. Gewebe­ spezifische Genregulationselemente (1, 8) in dieser bestimmten Zelle aktiv sind.
Es erfolgt die Expression der Rekombinase (10). Die Rekombinase erkennt die Rekombinase-Zielsequenz und deren Orientierung (11) und katalysiert eine DNA-Rekombination, die zur Inversion des Zelltod-induzierenden Gens führt (12). Das Zelltod-induzierende Gen liegt somit in einer Orientierung zum Zell- bzw. Gewebe-spezifischen Genregulationselement (1) vor, die es erlaubt, das funktionelle Zelltod-induzierende Gen in mRNA zu transkribieren (14), in Protein zu translatieren (15) und die Zielzelle abzutöten (16). Dies wird die aktive Form des Konstrukts genannt (13).
Fig. 4 zeigt schematisch ein induzierbares Zelltod-induzierendes Gen- Konstrukt, nachdem es ins Genom integriert wurde. Das in diesem Beispiel verwendete induzierbare System ist ein induzierbarer Promotor (17). Die Rekombinase Zielsequenz (18, 20) und das Zelltod-induzierende Gen (19) sind wie in Fig. 1 erläutert angeordnet.
Fig. 5 zeigt schematisch den Mechanismus, durch den Zell- bzw. Gewebe­ spezifische und gleichzeitig induzierbare Zellablation in vivo durchgeführt werden kann. In den Zielzellen erfolgt die Aktivierung des Rekombinase-Gens (22) und die Bildung der Rekombinase (23): Erst wenn ein induzierbarer Promotor (24) durch ein spezifisches Aktivatormolekül aktiviert ist (25), wird die Transkription von diesem Promotor aus gestartet. Die Rekombinase erkennt die Rekombinase-Zielsequenz und deren Orientierung (26) und katalysiert eine DNA-Rekombination, die zur Inversion des Zelltod­ induzierenden Gens führt (27). Das Zelltod-induzierende Gen liegt somit in einer Orientierung zum induzierbaren Genregulationselement, in diesem Beispiel dem induzierbarer Promotor (24), die es erlaubt, das funktionelle Zelltod-induzierende Gen in mRNA zu transkribieren (28), in Protein zu translatieren (29) und die Zielzelle abzutöten (30).
Fig. 6 zeigt schematisch die "Knock-in" Strategie zur Konstruktion von zell- bzw. gewebespezifischen Konstrukten, die eine Integration in einen endogenen Genlocus erlaubt und damit die Spezifität der Genexpression des endogenen Gens auf das Toxin-Gen überträgt. Es ist möglich, das Zelltod­ induzierende Gen anstelle des endogenen Gens oder als Fusionsprotein mit dem endogenen Gen zu exprimieren. Fig. 6a zeigt die genomische Konfiguration des Wildtyp-Zielgens mit Exon-Intron-Struktur (31). Der Promotor des Gens liegt vor dem Exon 1 (32). Fig. 6b stellt den Gene- Targeting-Vektor dar (33). In einem linearisierten Klonierungsplasmid (schwarze breite Balken) liegt stromaufwärts eine homologe Sequenz zum endogenen Gen (34). Es folgt eine Rekombinase-Zielsequenz (35), danach folgt ein invertiertes Zelltod-induzierendes Gen mit einem ebenfalls invertierten Teil eines Exons (36). Es folgt strangabwärts eine Resistenzkassette (z. B. eine Neomycin-Resistenzkassette) (38), die von zwei Rekombinase-Zielsequenzen (37, 39) eingerahmt ist. Die Rekombinase- Zielsequenzen sind so angeordnet, daß durch die Rekombinase eine Deletion der Neomycin-Resistenzkassette (38) katalysiert wird. Durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen (ES) (40) wird der Gene- Targeting-Vektor (33) in das Genom integriert (41). In den ES-Zellen wird durch transiente Transfektion (42) eines Rekombinase Expressionsvektors die Neomycin-Resistenzkassette deletiert (43). ES-Zellen, die das Zelltod­ induzierende Gen mit dem Teil des Exons in invertierter Position zwischen zwei Rekombinase-Zielsequenzen tragen (44), werden identifiziert und transgene Tiere mit den üblichen Verfahren hergestellt.
Nach Expression der Rekombinase wird am veränderten Allel (44) eine DNA- Rekombination auftreten, welche die DNA-Sequenzen (47) zwischen den Rekombinase-Zielsequenzen (45, 46) invertiert. Es entsteht eine exprimierbare Genkonfiguration (48), die zu einem Zelltod induzierenden Fusionsprotein führt.
Fig. 7 zeigt schematisch die Anordnung eines Zelltod-induzierenden Gen- DNA-Konstruktes nach Integration in das Genom. Dieses Konstrukt ist analog zum Konstrukt in Fig. 1 aufgebaut und unterscheidet sich nur durch die Invertierung der durch Rekombinase-Zielsequenzen eingerahmten genregulatorischen Elemente, hier Px genannt (50). Strangaufwärts liegt eine Rekombinase-Zielsequenz (49). Strangabwärts liegen die Zell- bzw. Gewebe­ spezifischen genregulatorischen Elemente, wie der Promotor, in invertierter Anordnung (50). Sie steuern die für das Gen X chrakteristische zell- bzw. gewebespezifische Expression. Weiter strangabwärts liegt eine zweite Rekombinase-Zielsequenz (51). Weiter strangabwärts liegt das Zelltod­ induzierende Gen (52).
Die von zwei Rekombinase-Zielsequenzen eingerahmten zell- bzw. gewebespezifischen gen regulatorischen Elemente sind so angeordnet, daß der kodierende Strang der doppelsträngigen DNA des Zelltod-induzierenden Gens nicht abgelesen werden kann. Dies stellt die inaktive Form (53) des Konstrukts dar, wie sie in allen Zellen des erfindungsgemäßen transgenen nicht-menschlichen Säugers vorliegt. Die Rekombinase-Zielsequenzen (49, 51) sind so zueinander angeordnet, daß eine DNA Rekombination katalysiert werden kann, die zur Inversion des zwischen den Rekombinase- Zielsequenzen gelegenen DNA-Fragments führt. Dies führt zur aktiven Form (54) des Konstruktes, in der von den genregulatorischen Elementen (55) aus das Zelltod-induzierende Gen exprimiert werden kann.
Durch die Etablierung von nicht-menschlichen Säugern, die ein Zelltod induzierendes-Gen tragen, das erst durch eine Rekombinase und seine spezifischen genregulatorischen Elemente aktiviert werden kann, wird ein neuer Säuger erzeugt, der für verschiedene Zellablationsexperimente verwendet werden kann. Variabilität und Herstellung von transgenen Säugern, die ein Toxin-Transgen tragen, entfällt.
Ein weiterer Vorteil ist, daß man für andere Zwecke (Gendeletion) hergestellte Rekombinase-transgene nicht-menschliche Säuger, die die Rekombinase Zellinien-spezifisch exprimieren, durch Kreuzung mit den erfindungsgemäßen transgenen nicht-menschlichen Säugern erhalten kann. Dadurch kann in den erfindungsgemäßen doppel-transgenen Tieren die Ablation von Zellinien unter der Kontrolle der Rekombinase und des Zelltod induzierenden Gens erfolgen. Ein nicht einschränkendes Beispiel sind verschiedene Cre-Rekombinase-transgene Mäuse, welche die Rekombinase in unterschiedlichen Geweben und Zellen exprimieren. Diese können mit den erfindungsgemäß im nicht-einschränkenden Beispiel beschriebenen Toxin- Gen-transgenen Mauslinien in üblicher Weise gekreuzt werden. Dies hat den entscheidenden Vorteil, daß die Rekombinase-transgenen Säuger nicht nur für gewebespezifische Deletion von Genen sondern auch für spezifische Zellablationsexperimente genutzt werden können. Für viele Fragen zur Genfunktion in vivo wurden bereits und werden in Zukunft Cre-Rekombinase transgene Mäuse hergestellt. Durch diese weitere Verwendungsweise könnten zudem viele Tierversuche eingespart werden.
Ein wichtiger Vorteil ist, daß durch entsprechende Wahl der beiden Genregulationselemente eine Zellablation von Subpopulationen einer bestimmten Zellart durchgeführt werden, die durch die Expression von zwei unabhängigen Genen definiert sind.
Durch die Regulierbarkeit der Toxin-Expression auf der Ebene der Genregulationselemente des Toxins und der Rekombinase kann eine spezifischere Art der in vivo Zellablation eingeführt werden. So können Zellinien-spezifische und induzierte Zellablation von Gewebe oder Zellen erfolgen. Die molekularbiologische Konstruktion von Plasmiden von zellspezifischen genregulatorischen Elementen in Kombination mit einem Toxin kann entfallen.
Die Erfindung erlaubt, bessere Tiermodelle für degenerative, entzündliche oder tumorbiologische Fragestellungen in der Medizin zu entwerfen und zu nutzen.
Die Erfindung wird durch das Beispiel näher erläutert, ohne es einzuschränken. Auf der Basis des Klonierungsvektors pBluescript II KS(+) (Stratagen, Heidelberg, Deutschland) wurde ein Vektor kloniert, der B Zell spezifische Expression von cDNA Inserts erlaubt. Dieser Vektor hat strangaufwärts ein 0,7 kB Sacl-Xbal-Fragment positioniert, das den murinen Eµ-Immunoglobulin-Enhancer enthält. Strangabwärts liegt ein 1,5 kB Xbal Ncol-Fragment, das den murinen Immunglobulin Promotor VH4C8 enthält (58). Weiter strangabwärts folgt, die Splice-Donor Sequenz und das Intron 1 des Kanninchen-β-Globin-Gens. Danach folgt eine singuläre Xhol Restriktionsschnittstelle, in welche die zu exprimierende cDNA eingesetzt werden kann. Am Ende strangabwärts liegt ein Polyadenylierungssignal. Erfindungsgemäß wurde das Diphtherie-Toxin-A (DTA) Gen (Greenfield et al. 1984) durch PCR mit den Primern 5'-acagctatggacgctgatgatgttgttgatt-3' und 5'-atcaattcagacacgatttcctgcacag-3' amplifiziert und kloniert. Strangaufwärts und strangabwärts des DTA Gens wurde jeweils eine IoxP Sequenz positioniert (56, 57). Diese Genkassette wurde in invertierter, also inaktiver Konfiguration (59), relativ zum B Zell Promotor in die Xhol Schnittstelle des Vektors pEmVhp eingesetzt. In Abb. 8 ist das Konstrukt schematisch dargestellt. Teile der Sequenz des DTA-Gens (62) und der beiden IoxP Sequenzen (61; die IoxP-Sequenzen sind unterstrichen) sind dargestellt. Die Position relativ zum B Zell-spezifischen Promotor ist ebenfalls angegeben. Hieraus ist ersichtlich, daß das DTA Gen nur in der aktiven Form (60) vom Promotor aus über eine der IoxP Sequenzen hinweg am ersten "atg" Startcodon B Zell-spezifisch exprimiert werden kann (62, die Codons des DTA sind kleingeschrieben und durch Bindestriche getrennt, das Startcodon ist fett gedruckt). Das erhaltene Konstrukt wird "pDTA IoxP-I" genannt (60).
Abb. 9 zeigt schematisch den Cre-Rekombinase (64) vermittelten Übergang (63) von der inaktiven (59) zur aktiven (60) Form, die dann vom B Zell-spezifischen Promotor trankribiert werden kann und in der Maus zum Zelltod der B Zellen führen wird (65).
Das erhaltene Konstrukt wird durch Scal Verdau linearisiert und in ES- Zellen transfektiert. Aus positiven ES Zellklonen entstehen durch Morulaaggregation chimäre Mäuse, die zu heterozygoten Mäusen verpaart werden.
Die Funktionsfähigkeit der eingeführten genetischen Veränderung wird wie folgt getestet. Zuerst werden die transgenen Mäuse mittels Durchflußzytometrie getestet. Dabei wird durch die Analyse verschiedener Oberflächenmarker untersucht, ob sich die Zusammensetzung der Zellpopulationen verändert hat.
Die einfach-transgenen Mäuse, die nur das inaktive DTA-Gen trugen, werden mit Cre-Rekombinase transgenen Tieren gekreuzt. Die dadurch erhaltenen doppel transgenen Tiere exprimieren die Cre-Rekombinase ebenfalls unter der Kontrolle von Immunglobulin-Promotor und -Enhancer. Die Tests mit Durchflußzytometrie und PCR sollen zeigen, ob die B-Zellen der Maus ablatiert werden.
SEQUENZPROTOKOLL
Referenzen
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Claims (22)

1. Ein transgener nicht-menschlicher Säuger, der ein Zelltod-induzierendes Gen in inaktiver Konfiguration trägt, wobei das Strukturgen des Zelltod induzierenden Gens relativ zu den genregulatorischen Sequenzen invertiert ist, das Strukturgen des Zelltod induzierenden Gens strangaufwärts und strangabwärts von Rekombinase-Zielsequenzen so eingerahmt ist, daß in Zellen des nicht-menschlichen transgenen Säugers durch ein Rekombinase-katalysiertes DNA Rekombinationsereignis an besagten Rekombinase-Zielsequenzen, die Inversion des Zelltod induzierenden Strukturgens katalysiert wird, so daß das Zelltod induzierende Gen unter der Kontrolle der genregulatorischen Sequenzen exprimiert wird.
2. Ein transgener nicht-menschlicher Säuger, der ein Genkonstrukt im Genom integriert trägt, in dem genregulatorische Sequenzen von Rekombinase-Zielsequenzen eingerahmt sind und strangabwärts ein Zelltod-induzierendes Gen liegt, wobei die genregulatorischen Sequenzen so orientiert sind, daß die entsprechende Rekombinase in der Lage ist, durch Rekombination die Expression des Zelltod­ induzierenden Gens zu aktivieren.
3. Ein transgener nicht-menschlicher Säuger, in dem zwischen genregulatorischen Sequenzen und einem Zelltod-induzierendem Gen transkriptionsinhibierende Sequenzen liegen, die von Rekombinase- Zielsequenzen so eingerahmt sind, daß Rekombinase vermittelte Deletion der transkriptionsinhibierenden DNA-Sequenzen zur Expression des Zelltod-induzierendem Gen führt.
4. Ein transgener nicht-menschlicher Säuger gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Rekombinase die Cre Rekombinase ist und die Rekombinase-Zielsequenzen LoxP Sequenzen sind, oder wobei die Rekombinase die FLP-Rekombinase ist und die Rekombinase- Zielsequenzen FRT-Sequenzen sind.
5. Ein transgener nicht-menschlicher Säuger gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der transgene nicht-menschliche Säuger ein Nager, insbesondere eine Maus ist.
6. Ein transgener nicht-menschlicher Säuger gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Zelltod induzierende Gen ein Toxin-Gen ist.
7. Ein transgener nicht-menschlicher Säuger gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Zelltod induzierende Gen das Diphtherie-Toxin Gen ist.
8. Ein transgener nicht-menschlicher Säuger gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Zelltod induzierende Gen ein Apoptose induzierendes Gen ist.
9. Ein transgener nicht-menschlicher Säuger gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die genregulatorischen Sequenzen Gewebe-spezifische oder Zellinien-spezifische Promotoren, Enhancer, Matrix-Bindungsstellen, Methylierungssignale und Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren umfassen.
10. Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 wobei:
  • - eine embryonale Stammzell-Linie, die mit einem selektierbar markierten Vektor transfiziert ist, der ein Zelltod induzierendes Gen, Rekombinase- Zielsequenzen und genregulatorische Sequenzen in einer Anordnung wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beschrieben trägt,
  • - aus der transfizierten embryonalen Stammzell-Linie ein stabil transfizierter Klon selektiert wird,
  • - aus dem erhaltenen Klon ein chimärer nicht-menschlicher Säuger durch Morulaaggregation oder Blastozysteninjektion hergestellt wird,
  • - durch Kreuzung der chimären nicht-menschlichen Säuger der transgene nicht-menschliche Säuger hergestellt wird.
11. Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers gemäß einem der Ansprüche 10, wobei die Rekombinase die Cre Rekombinase ist und die Rekombinase-Zielsequenzen LoxP Sequenzen sind.
12. Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers gemäß des Anspruch 10, wobei der transgene nicht-menschliche Säuger ein Nager, insbesondere eine Maus ist.
13. Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers gemäß Anspruch 10, wobei das Zelltod induzierende Gen ein Toxin-Gen ist.
14. Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers gemäß Anspruch 10, wobei das Zelltod induzierende Gen das Diphtherie-Toxin Gen ist.
15. Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers gemäß Anspruch 10, wobei das Zelltod induzierende Gen ein Apoptose induzierendes Gen ist.
16. Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers gemäß Anspruch 10, wobei die genregulatorischen Sequenzen Gewebe-spezifische oder Zellinien-spezifische Promotoren, Enhancer, Matrix-Bindungsstellen, Methylierungssignale und Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren umfassen.
17. Ein doppel-transgener nicht-menschlicher Säuger, der in seinem Genom ein Rekombinase-Gen trägt, das in Gewebe-spezifischer, Zellinien­ spezifischer oder induzierbarer Weise exprimiert wird und wobei der Säuger zugleich ein transgener nicht-menschlicher Säuger gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 ist.
18. Ein transgener nicht-menschlicher Säuger gemäß dem Anspruch 17, wobei die Rekombinase bevorzugt die Cre-Rekombinase ist oder die FLP-Rekombinase.
19. Ein nicht-menschlicher Säuger gemäß dem Anspruch 17, wobei der nicht-menschliche Säuger ein Nager, insbesondere eine Maus ist.
20. Verfahren zur Herstellung doppel-transgener nicht-menschlicher Säuger gemäß Anspruch 17, wobei eine Gewebe-spezifische, Zellinien­ spezifische oder in induzierbarer Weise exprimierbare Rekombinase durch einen retroviralen Vektor in das Genom des transgenen nicht­ menschlichen Säugers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 eingeführt wird.
21. Verfahren zur Herstellung transgener nicht-menschlicher Säuger gemäß Anspruch 17, durch Kreuzung von transgenen nicht-menschlichen Säugern gleicher Art, welche eine Gewebe-spezifische, Zellinien­ spezifische oder in induzierbarer Weise exprimierbare Rekombinase im Genom integriert tragen, mit transgenen nicht-menschlichen Säugern nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
22. Verwendung des transgenen nicht-menschlichen Säugers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 und Anspruch 17 zum Austesten von Arzneistoffen und Therapiemodellen.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DE10023887A1 (de) * 2000-05-17 2001-11-29 Axel Haverich Verfahren zur transienten Insertion genetischer Elemente
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