DE4325699A1 - Rekombinantes DNA-Konstrukt - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein rekombiniertes DNA-Konstrukt und insbesondere ein neuronalspezifisch aktiviertes, transkri­ bierbares DNA-Konstrukt, neuronale Zellen, die ein solches Konstrukt enthalten sowie die Verwendung dieses Konstrukts und solcher Zellen zum Testen von Wirkstoffen.

Die Herstellung eines rekombinierten, heterologen DNA-Frag­ ments zur Einbringung in das Genom eines prokaryontischen und auch eukaryontischen Organismus unter Produktion von Transge­ nizität ist bekannt.

So beschreibt beispielsweise EP-OS 0 169 672 ein Verfahren zur Produktion eines transgenen, nichthumanen Säugetiers mit erhöhter Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von Neoplasmen durch chromosomatische Einbringung einer aktivierten Onkogen­ sequenz in das Genom eines nichthumanen Säugetiers.

Die Erforschung von Nervenzellen war der Untersuchung mit DNA-Rekombinationsverfahren und anderen molekulargenetischen Verfahren bisher nur eingeschränkt zugänglich. So beschränkten sich die Untersuchungen auf nur wenige Typen neuronaler Zel­ len, die kultiviert werden konnten. Biologische Effekte, die man an kultivierten Zellen beobachtet, sind jedoch zu relati­ vieren, da die Untersuchungsobjekte aus ihrer natürlichen Um­ gebung entfernt wurden und z. B. für Faktoren, die dort vom umliegenden Gewebe auf sie einwirken konnten, nicht mehr zu­ gänglich sind. Somit besteht immer die Notwendigkeit, diese in vitro beobachteten Effekte in vivo zu verifizieren.

Das besondere Problem der Einbringung eines rekombinanten, ein Strukturgen enthaltenden DNA-Fragmentes in das Genom eines eukaryotischen Organismus zur Untersuchung seiner Wir­ kung auf Nervenzellen besteht darin, daß die Expression des Proteinprodukts des Strukturgens möglichst spezifisch zu er­ folgen hat, so daß hiervon nur Nervenzellen betroffen werden. Diese hochspezifische Kontrolle der Expression von DNA-Gen­ produkten in Nervenzellen war nach dem Stand der Technik bis­ her weder qualitativ noch quantitativ zufriedenstellend.

Ein weiteres Problem bei der Erforschung der Genexpression in Nervenzellen besteht darin, daß die Mechanismen der Genex­ pression im Nervensystem besonders komplex sind, da dieses aus vielen Unterarten von neuronalen Zellen besteht, die wäh­ rend ihrer Entwicklung und ihrer Differenzierung komplizierte Wechselwirkungen eingehen. Man vermutet dabei, daß Änderungen der Expressionsrate einiger neuronaler Gene mit der Informa­ tionsverarbeitung und -speicherung des Nervensystems zusam­ menhängen.

In neuronalen Zellen spielen die Ras-Proteine eine zentrale Rolle. Sie sind in der Lage Guanosintriphosphat (GTP) zu bin­ den. Gebundenes GTP kann dann durch GTPase-Aktivitäten zu Guanosindiphosphat (GDP) und anorganischem Phosphat (P_i) hy­ drolysiert werden. GDP kann im Anschluß durch einen Aus­ tauschfaktor vom Ras-Protein getrennt und wieder gegen GTP ausgetauscht werden. Durch die intrazelluläre Feinabstimmung der GTPase-Aktivitäten und des Austauschfaktors wird das Ver­ hältnis von Ras/GTP zu Ras/GDP in der Zelle exakt reguliert.

Ras/GTP kann als aktiviertes Ras im Gegensatz zu Ras/GDP in bestimmten Neuronenpopulationen während eines definierten on­ togenetischen Zeitraumes, in dem ein großer Teil der Neuronen dieser Populationen normalerweise absterben würde, ein Überlebenssignal (neurotrophes Signal) weiterleiten, das Neu­ ronen am Absterben hindert. Dieses Überlebenssignal wird von außen an das Neuron durch neurotrophe Faktoren (z. B. NGF = Nerve Growth Faktor) herangetragen und über Thyrosinkinase- Rezeptoren durch die Zellmembran ins Zellinnere von neurona­ len Zellen weitergeleitet. Hier stimuliert es den Austausch­ faktor und erhöht damit der Ras/GTP-Anteil, wodurch das neu­ rotrophe Signal weitergeleitet wird.

Insbesondere bei der Untersuchung des Einflusses von akti­ viertem Ras-Protein auf Nervenzellen wurde nicht mit ras-DNA, sondern mit Ras-Protein gearbeitet, das von außen nur in einen Bruchteil der Neuronen einzubringen war. Bisher war es nicht möglich, eine Population von Neuronen zu erzeugen, die das aktive ras-Strukturgen homogen in ihrem Genom integriert haben und dieses konstitutiv exprimieren.

Bei der Untersuchung der Wirkung von aktiviertem Ras-Protein auf verschiedene Zelltypen wurde ferner festgestellt, daß dieses zusammen mit anderen Induktoren viele nichtneuronale Zellen zur Transformation und damit zur unkontrollierten Pro­ liferation anregen kann. Dies wäre bei stabiler genomischer ras-DNA-Integration für das heranwachsende Tier lethal, so daß die neuronale Spezifität der Ras-Expression für das Über­ leben eines transgenen Tieres, wie vorstehend erwähnt, essen­ tiell ist.

Da exprimierte Ras-Proteine, wie vorstehend angedeutet, auch eine wichtige Rolle bei der Tumorentwicklung spielen, wurde ihre Entstehung und insbesondere die sie exprimierenden ras- Gene intensiv untersucht. So wurde beispielsweise gefunden, daß der Austausch einer einzigen Base in den ras-Genen von Harvey-(v-Ha-ras) und Kirsten (v-Ki-ras)-Sarcoma-Virus zu einem Aminosäureaustausch im vom ras-Gen exprimierten Ras- Protein führt (D.J.Capon et. al., Nature, Vol. 302, S. 33- 37, (1983)). Die so mutierten Produkte führen schließlich zur Zelltransformation und damit zur unkontrollierten Prolifera­ tion dieser Zellen, wodurch sich die Tumorbildung manife­ stiert.

Zur Erforschung der Expressionsspezifität in Nervenzellen wurde das das ubiquitäre neuronale Protein Synapsin I kodierende Gen untersucht. Da regulatorische DNA-Sequenzen, die transkriptionale Kontrolle bewirken, oft in den 5′- flankierenden Regionen von Genen gefunden werden, wurden unter Verwendung von klonierter Synapsin I-cDNA (M.W. Kilimann und L.J. DeGennaro, EMBO J., Vol. 4, S. 1997 bis 2002 (1985)) 5′-flankierende Regionen der Synapsin I-Gene von Ratte und Mensch isoliert, deren Nukleotidsequenzen bestimmt, diese einer Restriktionsanalyse unterzogen und so der Ort des Tran­ skriptionsstarts kartiert. Der so von A. Sauerwald et al. ge­ fundene Synapsin I-Promotor (A. Sauerwald et al, J. Biol. Chem., Vol. 265, Nr. 25, S. 14932-14937 (1990)) ermöglicht eine rein neuronale Expression, die sämtliche anderen, ver­ schiedenen Zelltypen eines Säugetieres ausschließt.

Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, die Expressionsrate bzw. den Expressionsort von durch rekombinante Gene expri­ mierten Proteinen durch Kopplung des rekombinanten DNA-Frag­ mentes mit einem Reportergen zu bestimmen. Dabei wird das re­ kombinante DNA-Fragment mit dem Reportergen so kombiniert, daß dessen Produkt zusammen mit dem Produkt des Strukturgens des rekombinanten DNA-Fragmentes koexprimiert wird. Das Proteinprodukt des Reportergens ist ein meist prokaryonti­ sches Enzym, dessen Aktivität eine substratspezifische Reak­ tion aus löst, die die Kopplung von zu untersuchendem Protein und dem Protein des Reportergens sichtbar macht. Beispiels­ weise läßt sich das für das prokaryontische Enzym β-Galakto­ sidase kodierende lacZ-Gen aus E.coli mit einem je nach Un­ tersuchungsziel aufgebauten rekombinanten DNA-Fragment kombi­ nieren. Bietet man dem exprimierten Enzym, das am Beginn der Metabolisierung vom Laktose steht, unter definierten Bedin­ gungen ein bestimmtes synthetisches Farbstoffvorläufermolekül (X-Gal) an, so wird dieses zu einem blauen Farbstoff umge­ setzt. Diese Blaufärbung zeigt also gleichzeitig die Expres­ sion des mit der β-Galaktosidase gekoppelten, zu untersuchen­ den Proteinprodukts des auf dem rekombinanten DNA-Fragment befindlichen Strukturgens an (A. Kalnins et al., EMBO J. Vol. 2, No. 4,593 (1983)). Durch die Koexistenz von Struktur- und Reportergen auf ein und demselben Transkript, ermöglicht durch die Ribosomenbindungsstelle, ist eine maximale Koex­ pression möglich.

Jedoch war es bisher nicht möglich, heterologe DNA herzustel­ len, in der ein beliebiges DNA-Strukturgen unter Kontrolle eines geeigneten Promotors neuronalspezifisch transkribiert und dessen Proteinprodukt in vivo konstitutiv exprimiert wird. Dabei wäre insbesondere die Kombination eines neuronal­ spezifischen Promotors mit einem Struktur-Onkogen nützlich, die bei der Erforschung des Mechanismus und der Beeinflussung neurodegenerativer Erkrankungen helfen könnte.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein neuronalspezifisch ak­ tiviertes DNA-Konstrukt mit transkribierbarer Sequenz eines Strukturonkogens zur Einbringung in das Genom eines nichthu­ manen Säugetieres zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einem DNA-Konstrukt gelöst, das ein neuronalspezifisches DNA-Kontrollelement zur Transkriptionsinitiation eines in 3′-Richtung stromabwärts befindlichen Strukturgens, ein transkribierbares, eukaryoti­ sches Struktur-Onkogen, das in 3′-Richtung stromabwärts zum neuronalspezifischen DNA-Kontrollelement eingefügt ist, und ggf. ein in 3′-Richtung stromabwärts des Strukturgens einge­ fügtes Konstrukt, bestehend aus einem transkribierbaren Re­ portergen, gekoppelt mit einem in 5′-Richtung stromaufwärts eingefügten DNA-Fragment, das für eine interne Ribosomenbin­ dungsstelle (IRES) kodiert, aufweist.

Besonders bevorzugt weist dieses Konstrukt den Synapsin I- Promotors der Ratte (nachstehend als "synp" bezeichnet) als hochspezifisches Werkzeug zur rein neuronalen Expression ei­ nes unter seiner Kontrolle stehenden, in 3′-Richtung stromab­ wärts befindlichen DNA-Strukturgens,
das komplette, genomische v-Ha-ras Strukturgen des Menschen (nachstehend mit "ras" bezeichnet) in 3′-Richtung strombab­ wärts des synp-Promotors,
ein Reportergen, vorzugsweise das bekannte lacZ-Gen, mit dem der Nachweis der Expression von aktiven Ras-Protein ermög­ licht wird, wobei dem Reportergen in 5′-Richtung stromauf­ wärts ein Gen für die interne Ribosomenbindungsstelle (IRES) vorgeschaltet ist, auf.

Es versteht sich, daß unter den erfindungsgemäß verwandten Begriffen Promotor, Kontrollelement, Struktur-Onkogen, Repor­ tergen und DNA-Konstrukt und -Fragment sowohl die vollständi­ gen Sequenzen, wie sie vorgefunden werden, als auch deren Teile verstanden werden, die für die Initiierung der Tran­ skription und der Expression der Produkte notwendig und hin­ reichend sind.

Durch diese Konstruktion kann insbesondere das vom ras-Struk­ turgen kodierte Ras-Protein durch die rein neuronale Kon­ trolle des synp-Promotors ausschließlich in neuronalen Zellen exprimiert werden. Ferner wird die vom lacZ-Gen kodierte β- Galaktosidase durch Einwirkung der IRES koexprimiert, so daß durch β-Galaktosidase-Aktivität und der damit verbundenen Farbreaktion diejenigen neuronalen Populationen, in denen ak­ tives Ras-Protein exprimiert wird, identifiziert werden kön­ nen.

Der synp-Promotor bietet also den Vorteil, die Wirkung eines beliebigen Proteins auf Nervenzellen zu untersuchen. Da die Expression des Proteins somit hochspezifisch nur in Nerven­ zellen durchgeführt wird, ist es möglich, eine Population von Neuronen zu erzeugen, die homogen in ihrem Genom das aktive ras-Strukturgen integriert haben und dieses konstitutiv ex­ primieren. Diese Expression geschieht unabhängig vom Typ der neuronalen Zellen, was nach dem Stand der Technik bisher un­ möglich war.

Anstelle des synp-Promotors der Ratte können naturgemäß auch andere neuronalspezifische Promotoren oder Kontrollelemente verwandt werden, insbesondere auch synp-Promotoren des Men­ schen und andere Säugetiere, beispielsweise der Maus.

Das ras-Struktur-Onkogen kodiert für aktives Ras-Protein. Es enthält im 12. Triplett gegenüber dem Wildtypgen eine G-T- Punktmutation, die auf Aminosäureebene einen Glycin-Valin- Austausch bedingt. Dies hat zur Folge, daß die Tertiärkonfor­ mation des Proteins in der aktiven, GTP-gebundenen Form ein­ gefroren wird, so daß GTP nicht mehr hydrolysierbar ist und so permanent ein neurotrophes Signal unabhängig von der Akti­ vierung des Austauschfaktors weitergeleitet wird.

Dies bietet erfindungsgemäß den Vorteil, daß neuronale Popu­ lationen, deren neurotrophe Faktoren ihr Überlebenssignal über Ras/GTP weiterleiten, somit von diesen Faktoren unabhän­ gig sind , wenn in ihnen aktives Ras-Protein exprimiert wird. In diesen Populationen findet demzufolge während des ontoge­ netischen Zeitraumes ihrer Abhängigkeit von neurotrophen Fak­ toren kein neuronaler Zelltod statt.

Alternativ können andere Onkogene verwandt werden, deren Pro­ teine eine Rolle in neuronalen Zellen spielen. Insbesondere sind dies andere ras-Onkogene, wie N-ras oder Ki-ras in allen ihren Varianten sowie Naras in seinen von der Val 12-Variante abweichenden Varianten, beispielsweise mit einer Abweichung im 50. Triplett.

Durch die Integration des Konstruktes in das Genom der be­ fruchteten Eizelle des werdenden Tieres ist gewährleistet, daß in sämtlichen Neuronen aller Populationen sowohl des zen­ tralen, als auch des peripheren Nervensystems des erwachsenen Tieres das Konstrukt vorhanden ist und exprimiert wird, da es an die Genome aller Körperzellen mitotisch weitergegeben wird. Damit stehen im adulten Tier sämtliche neuronalen Sub­ typen zur Erforschung der Wirkung von aktivem Ras-Protein zur Verfügung.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die beobachteten Ef­ fekte durch das Einbringen in das Genom eines nichthumanen Säugetieres in vivo verifiziert werden können, so daß Ergeb­ nisse erhalten werden, die für einen ganzheitlichen Organis­ mus gültig sind, wodurch die Bereitstellung des erfindungsge­ mäßen DNA-Fragments erheblich leistungsfähigere Ergebnisse liefert, als die in-vitro-Untesuchungen nach dem Stand der Technik.

Vorteilhaft ist ferner die Koexpression des biologisch akti­ ven Ras-Proteins mit einem Reportermolekül, da es möglich ist, die Expression von Ras-Protein sowohl vom Ort als auch von ihrer Stärke abzuschätzen, in dem man sie mit der Signal­ intensität der durch das Reportermolekül ausgelösten Farbreaktion korreliert. Hierdurch wird wesentlich die Aus­ wahl einer bestimmten transgenen Linie oder bestimmter neuro­ naler Strukturen mit erhöhter Überlebensfähigkeit, die man auf Ras-Effekte hin untersuchen will, erleichtert.

Die Erfindung wird durch die folgende eingehende Beschreibung mit Bezug auf die folgenden Figuren deutlicher.

Fig. 1 zeigt schematisch die Klonierungsstrategie zur Her­ stellung des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts.

Fig. 2 zeigt maßstabgerecht den Anteil der DNA-Elemente am Gesamthaushalt einschließlich einer Eingangssequenz von 2,9 kpb. Die Eingangssequenz ist ohne Bedeutung für die Aktivität und Spezifität des Promotors an sich, kann aber einen Einfluß auf das Ausmaß der Aktivität ha­ ben.

Fig. 3 zeigt die DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Kon­ strukts.

Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird nun das Verfah­ ren zur Herstellung des erfindungsgemäßen DNA-Fragmentes mit Bezug auf Fig. 1 beschrieben.

Zur Herstellung wurden fünf verschiedene Vektoren benutzt:

• 1. pBluescript SK⁻ mit der Insertion des Synapsin 1- Promotors der Ratte in 5′-3′-Richtung zwischen den SaII- und BamH1-Stellen (ohne Synapsin-Startkodon) = SK⁻-syp (Dr. M. W. Kilimann, Inst. f. Physiol. Chemie, Ruhr- Universität Bochum, Deutschland).
• 2. pBluescript SK⁻ mit der Insertion des kompletten genomi­ schen v-Ha-ras-Strukturgens des Menschen in der BamH1- Stelle = SK⁻-ras (R. Jaggi, Inselspital Bern, Schweiz).
• 3. pBluescript SK⁺ = SK⁺.
• 4. pBR322 (Fa. Stratagene, Heidelberg).
• 5. p1726, das das IRES des Enzephalomyokarditisvirus und das hierzu richtig orientierte komplette lacZ-Strukturgen von E.coli enthält (J. Majors, Washington Univ. School of Me­ dicine, St. Louis, Miss. USA).

Zur Erzeugung des in Fig. 1 gezeigten Vektors 6 wurde der SK⁻ -synp-Vektor mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnit­ ten und damit das Ende des Synapsinpromotors im 5′- nichttranslatierten Bereich geöffnet. Der SK⁻-ras-Vektor 2 wurde ebenfalls mit BamHI geschnitten, wodurch das ras-Struk­ turgen von dem mit ihm verbundenen Vektor SK befreit wurde.

Das ras-Strukturgen wurde mit dem geöffneten SK⁻-synp-Vektor ligiert und die korrekte Orientierung des Strukturgens durch Sequenzierung des Überganges Promotor/Strukturgen verifi­ ziert, wodurch sich Vektor SK⁻-synp-ras 6 ergab. Anschließend wurde Vektor 6 mit der Restriktionsendonuklease NotI verdaut, wodurch die meisten genomischen ras-Sequenzen in 3′-Richtung stromabwärts des Stoppkodons einschließlich der Polyadenylie­ rungsstelle entfernt wurden. Der geöffnete Vektor (6) war so­ mit bereit zur Aufnahme des IRES/lacZ-Fragments, dessen Enden zu den durch NotI generierten Schnittstellen kohäsiv sein mußten. Die entsprechenden Schnittstellen wurden durch XmaIII erzeugt, wodurch sich Enden ergaben, die mit den durch NotI generierten kompatibel waren.

Zur Integration des IRES/lacz-Fragments in Vektor (6) wurde folgende Klonierungsstrategie angewandt:

Das DNA-Plasmid p1726 5, das das IRES/lacZ-Fragment innerhalb zweier xbaI-Schnittstelle eingefügt besaß, wurde mit der Re­ striktionsendonuklease XbaI geschnitten, wodurch das IRES/lacZ-Fragment von mit ihm verbundenen Plasmidsequenzen befreit wurde. Das DNA-Plasmid pBluescriptSK⁺ wurde mit XbaI geöffnet und mit dem IRES/lacZ-Fragment ligiert. Die korrekte Orientierung von IRES in Nachbarschaft zu der bereits vorhan­ denen XmaIII-Schnittstelle wurde durch eine Restriktionsana­ lyse verifiziert. Um auf der anderen Seite des IRES/lacZ- Fragments eine weitere xmaIII-Schnittstelle zu erhalten, wurde das DNA-Plasmid pBR322 (Vektor 4 in Fig. 1) einem NruI/BamHI-Doppelverdau unterzogen und das entstandene, eine XmaI-Schnittstelle enthaltende Fragment zwischen die Plasmid­ schnittstellen SmaI und BamHI unter Erzeugung des Vektors 3 einligiert. Durch einen XmaIII-Verdau ließ sich auf diese Weise das IRES/lacZ-Fragment zurückgewinnen. Es wurde in den geöffneten Vektor 6 unter Erzeugung des in Fig. 1 gezeigten Vektors 7 eingefügt, und die korrekte Orientierung von IRES in Nachbarschaft des ras-Strukturgens wurde durch eine Re­ striktionsanalyse verifiziert. Um die für die Injektion in Zygoten geeignete DNA zu erhalten, mußten vorher alle Vektorsequenzen entfernt werden. Dies ließ sich durch einen Verdau von Vektor 7 mit XhoI erreichen, durch den man das gebrauchsfertige linearisierte DNA-Konstrukt erhielt, das in Fig. 2 komplett und in Fig. 3 in seien wesentlichen Bestandteilen dargestellt ist.

Die Einbringung dieses DNA-Fragmentes in das Genom eines nicht humanen Tieres geschah mit dem Fachmann bekannten Tech­ niken.

Die Herstellung erfolgte nach Standardtechniken, wie sie im einzelnen von Brigid Hogan, Frank Costantini und Elizabath Lacy in dem Laborhandbuch "Manipulating the Mouse Embryo", Cold Spring Harbor Laboratory, 1986, beschrieben werden:

• - hormonelle Stimulation der Oozyten-Donoren zwecks Super- und Zwangsovulation;
• - Befruchtung der Oozyten durch Zusammensetzen der Donoren mit Böcken;
• - Entnahme der Zygoten nach Tötung der Donoren;
• - Injektion der DNA-Lösung in einen der beiden Vorkerne einer Zygote;
• - Zusammensetzen der Zygoten-Rezipienten mit vasektomierten Böcken zur Identifikation empfängnisbereiter Tiere;
• - Transfer der injizierten Zygoten in die Ampulla betäubter empfängnisbereiter Rezipienten;
• - Zucht und Identifikation transgener Nachkommen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das er­ findungsgemäße DNA-Konstrukt in einem Test-Verfahren zur Be­ stimmung neuronaler Schädigung verwendet. Gemäß diesem Ver­ fahren wird ein Säugetier, etwa eine Maus oder eine Ratte, in dessen Genom das erfindungsgemäße DNA-Fragment eingebracht wurde, der Wirkung einer Substanz mit Verdacht auf neuronen­ schädigende Wirkung ausgesetzt. Das Ausmaß der Schädigung bzw. Zerstörung der neuronalen Zellen in diesem Versuchstier wird mit dem Zustand der neuronalen Zellen eines unbehandel­ ten Tieres verglichen, wodurch die Wirkung bestimmt werden kann. Es ist ein besonderer Vorteil, Substanzen mit Verdacht auf neuronenschädigende Wirkung spezifisch und in viel klei­ neren Mengen als bisher prüfen zu können.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Her­ stellung neuronaler Zellkulturen ermöglicht, deren Zellen das erfindungsgemäße DNA-Fragment homogen enthalten. Es ist ein Vorteil dieses Verfahrens, mit dieser Zellkulturen die spezi­ fische Wirkung des erfindungsgemäßen Strukturgens auf neuro­ nale Zellen zu untersuchen. So können Versuche in vitro durchgeführt werden, die im Versuchstier nicht möglich wären oder durch die das Versuchstier unerwünschten Beeinträch­ tigungen ausgesetzt wäre.

Claims (13)

1. Rekombiniertes, neuronalspezifisch aktiviertes, transkri­ bierbares, lineares DNA-Kontrukt, gekennzeichnet durch:
ein neuronalspezifisches DNA-Kontrollelement zur Transcriptionsinitiation eines in 3′-Richtung stromabwärts befindlichen Strukturgens;
ein transkribierbares, eurokaryotisches Struktur-On­ kogen, das in 3′-Richtung stromabwärts zum neuronal­ spezifischen DNA-Kontrollelement eingefügt ist, und
ggf. ein in 3′-Richtung stromabwärts des Strukturgens eingefügtes Konstrukt, bestehend aus einen transkri­ bierbaren Reportergen, gekoppelt mit einem in 5′- Richtung stromaufwärts eingefügten DNA-Fragment, das für eome omtereme Ribosomenbindungsstelle (IRES) ko­ diert.

2. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das neuronalspezifische DNA-Kontrollelement ein Synapsin I-Promotor, insbesondere der Ratte ist.

3. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Struktur-Onkogen ein ras-Onkogen ist.

4. DNA-Konstrukt nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Struktur-Onkogen das komplette, genomische v- Ha-ras-Strukturgen des Menschen ist.

5. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen für β-Galactosidase kodiert.

6. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung des DNA-Konstrukts Plasmide verwendet werden, ausgewählt aus pBlue­ scriptSK⁻, pBluescriptSK⁺, pBR322 und p1726.

7. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es in Zygoten eingebracht wird.

8. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es in somatische Zellen eingebracht wird.

9. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das vom Struktur-Onkogen kodierte aktive Protein im Genom des transgenen, nichthumanen Säugetiers konstitutiv exprimiert wird.

10. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt des Struktur-Onkogens unter Kontrolle des neuronalspezifischen Kontrollele­ ments spezifisch in neuronalen Zellen exprimiert wird.

11. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß durch Expression des Protein­ produktes des Reportergens Expressionseigenschaften des Struktur-Onkogens überprüft werden können.

12. Neuronale Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie das DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 11 enthält.

13. Verwendung des DNA-Konstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder der Zelle nach Anspruch 12 zum Testen von Wirkstoffen auf neuronalspezifische Aktivität.