DE19828377A1

DE19828377A1 - Transgene nicht-menschliche Säugetiere, die das Gen der Schweren Kette des menschlichen Immunglobulin E tragen

Info

Publication number: DE19828377A1
Application number: DE1998128377
Authority: DE
Inventors: Philipp Yu
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1998-06-25
Publication date: 1999-12-30

Abstract

Beschrieben sind transgene nicht menschliche Säuger, die das Gen der Schweren Kette des menschlichen Immunglobulin E tragen. Diese Tiere werden als Testsysteme antiallergisch wirkender Arzneimittel und als humanisierter IgE Standard in der Allergie Diagnostik verwendet.

Description

Definitionen

Die in der vorliegenden Beschreibung benutzten Begriffe werden wie folgt definiert: Ein transgenes Tier ist ein Tier, das in seinem Genom ein zusätzliches Gen integriert trägt. Ein doppeltransgenes Tier ist ein Tier, das in seinem Genom zwei zusätzliche Gene integriert trägt. Screening ist ein Verfahren, das eine große Anzahl an potentiellen Wirkstoffen auf eine erwünschte Eigenschaft untersucht und zur Isolierung dieser Wirkstoffe führt. Humanisiertes IgE ist ein Antikörper eines nicht-menschlichen Säugers, der aus den Leichten Ketten des Säugers und aus den Schweren Ketten des menschlichen IgE besteht. Immunglobulin E Standard ist eine Präparation eines Antikörpers der Klasse E oder eines humanisierten IgE Antikörpers, der eine bekannte Antigenspezifität und bekannte Konzentration hat und mit dem in einer unbekannten Probe die IgE-Konzentration der gleichen Spezifität verglichen werden kann. Heterologes Tier-Modell ist ein experimentelles Tiermodell, bei dem der Nachweis einer Medikamentenwirkung in unterschiedlichen Spezies geführt wird. Die SCID Maus ist eine etablierte Mauslinie (Severe Combined Immunodeficiency), die über ein defektes Immunsystem verfügt und deshalb mit menschlichen Zellen rekonstituiert werden kann. Arzneimittel ist in den erwähnten Beispielen ein Mittel, das die Produktion oder Funktion von menschlichem IgE hemmt. Allergen ist ein Antigen, das im Menschen eine Antigen-spezifische IgE Bildung auslösen kann. hIgE-Maus ist eine transgene Maus, die das humane IgE Schwere Kette Gen im Genom integriert trägt. Die Cre-IoxP Technologie verwendet die Cre-Rekombinase und die Rekombinase Zielsequenze IoxP genannt, um durch DNA Rekombination gezielte Mutationen in das Genom einzuführen. Das endogene Immunglobulin Gen ist das Wildtyp-Immunglobulin Gen in seiner natürlichen unveränderten Konfiguration und Sequenz. Ein Selektionsmarker ist eine Genkassette, die für ein Protein kodiert, das einer Zelle durch seine Expression eine selektierbare Eigenschaft verleiht. z. B. ermöglicht es die Neomycin-Resistenzkassette transfektierten Zellen in G418 haltigem Medium zu wachsen. PCR ist die Polymerase-Ketten-Reaktion zur Amplifizierung von DNA. Knock in ist eine Form des Gene Targeting, die es erlaubt, Gene in einen spezifischen Genlocus einzusetzen.

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Tiere, die das Gen für die menschliche Schwere Kette der IgE Antikörper an definierter Stelle im Immunglobulin Genort eines nicht-menschlichen Säugetieres tragen. Das Anwendungsgebiet, in dem diese transgenen Tiere eingesetzt werden sollen, sind in vivo Testsysteme für anti-allergische Arzneimittel mit Bindungsspezifität gegen humanes IgE oder Moleküle, die spezifisch mit humanem IgE interagieren können. Die Antikörper der Klasse E vermitteln allergische Reaktionen im Menschen (Sutton und Gould 1993). Arzneimittel, welche die IgE Bildung und die zellvermittelten Effektorfunktionen von IgE unterdrücken, könnten gegen Krankheitsbilder wie allergisches Asthma, Rhinitis und Conjunctivitis eingesetzt werden. Das Ziel ist die Etablierung eines Tiermodells zum Testen der Effektivität von neuen anti-IgE-Arzneimitteln im lebenden Organismus. Außerdem können die transgenen Tiere zur Herstellung von Allergen-spezifischen humanisierten IgE Antikörpern dienen. Diese Antikörper können als Standard in der in vitro Diagnostik zur Quantifizierung der IgE Antwort von Allergikern verwendet werden.

Stand der Technik

Die in vivo Manipulation von Genen von Tieren mit Hilfe der homologen Rekombination hat die Möglichkeit eröffnet, verschiedene Tiermodelle und Testsysteme für menschliche Erkrankungen zu entwickeln. Die Kombination von homologer Rekombination und Sequenz-spezifischen Rekombinase Systemen gestattet es, definierte humane Gene in spezifische Genloci der Keimbahn nicht-menschlicher Säuger zu integrieren (Zou et al. 1993; DE 42 28 162 C1). So wurde das Schwere Kette Immunglobulin Gen der Klasse IgG1 der Maus durch das Schwere Kette Immunglobulin-Gen der Klasse IgG1 des Menschen ersetzt (Zou et al. 1994). Mit einer anderen Methode wurden transgene Tiere erzeugt, die zusätzlich zu einem inaktivierten Immunglobulin Locus einen artifiziellen Schwere Kette Minigenlocus im Genom integriert tragen. Die Schweren Kette Gene des Menschen, die in das Genom der Maus eingeführt wurden, waren von der Klasse IgG1 und IgG3 (Loneberg and Huszar 1995; US Patent 5 661 016, 5 633 425, 5 625 126, 5 569 825, 5 545 806). Eine weitere Art von transgenen Säugetieren trägt einen Minigenlocus, der die IgM Schwere Kette integriert hat (Bruggemann et al. 1989; US Pat. 5 545 807).

Eine häufig auftretende Erkrankung des Menschen ist die Allergie. Allergische Symptome entstehen, wenn durch Allergen spezifische Antikörper der Klasse E (IgE) inflammatorische Zellen aktiviert werden und diese Zellen Mediatoren ausschütten, deren Effekte durch Anti-Histaminika oder Cortison behandelt werden. Diese Therapie führt nur zur Linderung der Symptome und beruht nicht auf einer Verhinderung der Entwicklung von Allergie in einem frühen Stadium. Die Unterdrückung der Bildung von IgE oder der Interaktion von IgE mit spezifischen Rezeptoren wäre als neuer Therapieansatz sehr wünschenswert.

In der Entwicklung von Arzneimitteln, welche die IgE Bildung und somit eine Allergie verhindern sollen, wird zuerst auf Zellkultur-Assays zurückgegriffen. Diese eignen sich für breit angelegte Screening Verfahren zur Identifikation biologisch aktiver Substanzen. In der Regel folgt als nächster Schritt ein Test im Tierversuch. Hierbei können Arzneimittel, die hohe Spezifität gegen ein bestimmtes Zielmolekül aufweisen, getestet werden. Meistens werden Primaten, die eine höhere Verwandtschaft mit dem Menschen aufweisen, verwendet (Meng et al. 1996). Das Nagetiermodell, z. B. Maus oder Ratte, kann nur für allgemeine Verträglichkeitsstudien verwendet werden.

Tiermodelle, welche die Untersuchung von Arzneimitteln erlauben, die spezifisch gegen die Bildung von humanem IgE oder dessen Interaktion mit seinen Rezeptoren gerichtet sind, sind nicht beschrieben.

Die in vitro Diagnostik der IgE vermittelten allergischen Erkrankungen wird zur Zeit durch die Messung von Allergen-spezifischen IgE Antikörpern im Blut durchgeführt. Die Quantifizierung für die meisten Allergene ist nur relativ aber nicht absolut möglich, da keine Quelle für Allergen spezifisches IgE des Menschen vorhanden ist, das als Standard für diesen Zweck geeignet wäre. Durch gentechnische Verfahren kann ein vorhandener Antikörper der Maus in einen die humanen IgE Regionen enthaltenden Antikörper umgewandelt werden. Diese Antikörper werden "humanisierte" IgE Antikörper genannt (Schuurman et al. 1997).

Die bekannten Arzneimittel wirken nur gegen die Symptome der allergischen Reaktion. Sie zeichnen sich im Fall der Antihistaminika, durch eingeschränkte Effektivität oder im Fall von Cortison, durch starke Nebenwirkungen aus. Da sie außerdem nicht an frühen Stadien der Entstehung von Allergie angreifen, ändern sie nichts an den zugrundeliegenden pathogenen Mechanismen. Daraus folgt, daß diese Arzneimittel kontinuierlich gegeben werden müssen und somit hohe Kosten verursachen. Zudem führt eine langandauernde Exposition durch ubiquitäre Allergene in vielen Patienten zu chronischen Entzündungsprozessen, die resistent gegen die vorgenannten Arzneimittel sind. Aufgrund dieser unbefriedigenden Situation besteht ein Bedarf an neuen therapeutischen Ansätzen, welche die der Allergie zugrunde liegende IgE Produktion im Patienten unterbinden.

Da der angestrebte therapeutische Effekt von der hochspezifischen Interaktion der Arzneimittel, z. B. monoklonale anti-humanes IgE Antikörperoder blockierende Peptide, abhängt, ist eine Testung in heterologen Tiermodellen technisch nicht möglich. Die Testung der Funktionalität der gegen IgE gerichteten Arzneimittel in einem lebenden Organismus ist aber von grundlegender Bedeutung in der Entwicklung neuer Arzneimittel. So wird nach dem Stand der Technik zuerst an in vitro Zellkulturen die Hemmung der IgE Bildung experimentell untersucht. Beispielsweise werden Substanzen auf ihre IgE hemmende Wirkung durch Inkubation IgE produzierender B-Zellen in der Zellkultur untersucht. Diese Methoden sind von der tatsächlichen Situation im Patienten so weit entfernt, daß sie nur für erste Untersuchungen von pharmakologisch wirksamen Substanzen dienen können.

Tierexperimente, die in der pharmakologischen Prüfung Anwendung finden, haben vor allem das Ziel, die biologische Verträglichkeit und das Abbauverhalten der Arzneimittel im lebenden Organismus zu untersuchen. Sie können aufgrund der Strukturunterschiede des IgE-Systems zwischen Mensch und Tier keine Aussagekraft bezüglich der anti-allergischen Funktion spezifischer anti-IgE Arzneimittel haben.

Andere mögliche Tiermodelle, wie z. B. mit menschlichen Immunzellen rekonstituierte SCID Mäuse (Herz et al. 1997), sind nur eingeschränkt für Tests von anti-IgE Arzneimitteln geeignet, da die Expression von humanem IgE gering ist. Zelluläre Interaktionen, die bei der komplexen IgE-Regulation eine Rolle spielen, können nur bedingt auftreten. Schließlich sind die Variabilität der Rekonstitution und die hohen Kosten der Herstellung und Haltung dieser Mäuse Argumente gegen ihre Verwendung in der Arzneimittelentwicklung. Es sind aus der Literatur keine entsprechenden Versuche in dieser Richtung bekannt.

Mäuse, die transgen für einen Minigenlocus sind, das heißt, Teile des Schwere Kette Immunglobulin Genlocus des Menschen tragen (Loneberg and Huszar 1995; US Patent 5 661 016, 5 633 425, 5 625 126, 5 569 825, 5 545 806; Bruggemann et al. 1989; US Pat. 5 545 807) sind nicht für die Testung von anti-IgE Arzneimittel verwendbar, da sie nur die IgG1 und IgG3, bzw. die IgM Schweren Ketten des Menschen im Genom der Maus integriert tragen.

Auch Experimente an Primaten (Saban et al. 1997; Meng et al. 1996) sind aufgrund der Speziesunterschiede zum Menschen nicht aussagekräftig und außerdem sehr kostspielig.

Allergen-spezifische humane IgE Antikörper könnten in der in vitro Diagnostik von allergischen Erkrankungen als Standard zur absoluten Vergleichbarkeit von diagnostischen Nachweisen dienen. Dafür werden große Mengen von identischen Antikörpern benötigt. Die Isolierung aus Patienten ist nicht möglich, da dies zu aufwendig ist. Die Alternative könnten mit der IgE Region "humanisierte" Allergen spezifische Antikörper sein (Schuurman et al. 1997).

So besteht das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem darin, ein Tiermodell zu etablieren, zum Studium der Effektivität und Verträglichkeit spezifischer Arzneimittel, die durch die Interaktion mit humanem IgE eine anti-allergische Wirkung erreichen. Die Anforderungen sind hohe Aussagekraft und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und kostengünstige Tierexperimente; wie sie z. B. in einem Mausmodell gegeben sind. Außerdem wäre die kostengünstige reproduzierbare Herstellung von humanisiertem IgE mit Allergenspezifität zur Verwendung als Standard in der in vitro Diagnostik erstrebenswert.

Die Lösung des vorstehenden technischen Problems wird erfindungsgemäß erreicht durch die in den Patentansprüchen 1 bis 5 angegebenen Ausführungsformen. In einer ersten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von transgenen nicht-menschlichen Säugern, in denen das Gen für die menschliche Schwere Kette des Immunoglobulins der Klasse E in den Immunoglobulin Genlocus des nicht-menschlichen Säugers integriert wird.

Durch Homologe Rekombination in Zusammenspiel mit der Cre-IoxP Technologie werden transgene Varianten des nicht-menschlichen Säugers hergestellt. Dazu wird analog zu einer bekannten Methode vorgegangen (Zou et al. 1994, Patentschrift DE 42 28 162 C1).

Dabei kann durch die nachstehend geschilderte Anwendung der Methode ein jeder Isotyp (IgM, IgD, IgGl, IgG3, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA) des nicht- menschlichen Säugers, nämlich die Schweren Kette der Immunglobuline durch die humane Schwere Kette des Immunoglobulins der Klasse E ersetzt werden. Die Immunglobulin Genloci sind aus einer strangaufwärts liegenden Switch-Region und den strangabwärts liegenden Exons für die konstante Region der Schweren Kette des jeweiligen Isotyps zusammengesetzt. Ein Gene Targeting Vektor zum Austausch des endogenen Immunglobulin Genlocus ist erfindungsgemäß wie folgt aufgebaut: Strangaufwärts liegen unveränderte klonierte Sequenzen aus dem zu verändernden Immunglobulin Genlocus. Strangabwärts folgen die Exons der humanen Schweren Kette des Immunoglobulins der Klasse E. Weiter strangabwärts liegt eine IoxP Sequenz. Es folgt ein Selektionsmarker, d. h. eine Genkassette, die die Selektion von Zellen erlaubt, die den Gene Targeting Vektor integriert haben (z. B. Neomycin-Resistenz Kassette). Den strangabwärts folgenden konstanten Exons des zu deletierenden endogenen Immunglobulins folgt weiter strangabwärts eine zweite IoxP Sequenz. Die beiden IoxP Sequenzen sind so zueinander orientiert, daß eine Deletion der DNA zwischen den beiden IoxP Sequenzen durch die Cre-Rekombinase erfolgen kann. Abschließend liegt strangabwärts eine weitere Sequenz aus dem endogenen Immunglobulin Genlocus, die zusammen mit der am weitesten strangaufwärts liegenden Sequenz aus dem endogenen Immunglobulin Genlocus homologe Rekombination zwischen Gene Targeting Vektor und endogenem Gen erlaubt. Dieser Gene Targeting Vektor wird in einem Standardklonierungsvektor kloniert.

Durch homologe Rekombination zwischen dem Gene Targeting Vektor und dem endogenen Immunglobulin Genlocus in Embryonalen Stammzellen (ES) werden ES Zellinien hergestellt, welche die genetischen Veränderungen im endogenen Immunglobulin Genlocus tragen. Durch transiente Expression der Cre-Rekombinase werden die Exons des endogenen Immunglobulin Genlocus und das Gen des Selektionsmarkers, z. B. Neomycin-Resistenz Kassette, deletiert. Es verbleiben eine IoxP Sequenz und die Exons der humanen Schweren Kette des Immunoglobulins der Klasse E. Aus derartig veränderten ES Zellinien werden durch Morulaaggregation oder Blastocysteninjektion chimäre Mäuse hergestellt, welche die Veränderung in der Keimbahn an ihre Nachkommen weitergeben (Nitschke 1996, Zou et al., 1994).

Die Erfindung wird durch Abbildungen weiter erläutert: Fig. 1 zeigt die Integration des humanen IgE Schwere Kette Gens in den Immunglobulin Genlocus eines nicht-menschlichen transgenen Säugers durch homologe Rekombination.

Die Keimbahn Konfiguration einer Immunglobulin Genregion mit Switch Region und konstanten Exons der Schweren Kette des zu ersetzenden Immunglobulins sind dargestellt (1). Der humane IgE "knock-in" Gene Targeting Vektor (2) trägt Regionen homolog zu den Exons des zu ersetzenden Gens mit integrierter IoxP Sequenz, einen Selektionsmarker (Neomycin-Resistenz-Kassette), eine zweite IoxP-Sequenz, die humane IgE konstante Region und eine weitere homologe Region des zu ersetzenden Gens.

Homologe Rekombination (3) in Embryonalen Stammzellen (4) integriert den Vektor in den endogenen Genlocus eines der Allele der ES Zelle (6). Durch PCR werden ES Zellen identifiziert, die positiv für das homologe Rekombinationsereignis sind (5).

Durch transiente Expression der Cre-Rekombinase in den ES Zellen wird die DNA zwischen den beiden IoxP Sequenzen deletiert (7). Es entsteht die endgültige Konfiguration mit humanem IgE an der Stelle des endogenen Immunglobulins (8). Mit "Switch" ist die Region bezeichnet, in welcher der Klassensprung stattfindet. Die LoxP Sequenz ist mit einem Kreis dargestellt, der ein Dreieck zur Orientierung der IoxP Sequenz zeigt (9).

Die Pfeile zeigen die Position der PCR-Primer (5).

Fig. 2 zeigt die Gewinnung von humanisiertem IgE mit Allergenspezifität zur Verwendung als Standard in der Allergiediagnostik. Die in den Patentansprüchen 1 bis 3 beschriebenen transgenen nicht-menschlichen Säuger (10) werden mit Allergenen immunisiert. B-Zellen des transgenen nicht-menschlichen Säugers werden isoliert, transformiert oder mit Myeloma (12) nach bekannter Methode fusioniert (13) (Köhler und Milstein, 1975) um Antikörper produzierende Hybridoma zu erhalten (14). Nach Selektion (15) von humanisiertem Antigen-spezifischem IgE (16) können in vitro große Mengen des humanisierten Antigen-spezifischen IgE hergestellt werden und als Antigen-spezifischer Standard in der Allergiediagnostik verwendet werden.

Durch die beschriebene Positionierung des humanen Gens entstehen transgene nicht-menschliche Säuger, die humanes IgE stark exprimieren und gleichzeitig Antigen-spezifische Antikörper der humanen IgE Klasse exprimieren können. Diese transgenen nicht-menschlichen Säuger können dazu dienen, Therapeutika zu testen, die selektiv humanes IgE und dessen Effektor-Funktionen in vivo blockieren können. Dabei kann wie folgt vorgegangen werden: Ein neues auf seine Wirkungsweise zu prüfendes Arzneimittel X wird den transgenen Tieren appliziert. Nach einem gewissen Zeitraum wird mit etablierten Standardmethoden, z. B. einem spezifisch gegen humanes IgE gerichteten ELISA (Kemeny et al. 1986), die Konzentration im Blut der transgenen nicht-menschlichen Säuger untersucht. Die erhaltenen Werte werden mit denen von unbehandelten transgenen Tieren verglichen und lassen eine Aussage über die Effektivität der Behandlung zu.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, welche die konstante humane IgE Region besitzen, durch Hybridoma Herstellung mit B Zellen der in Anspruch 1-3 genannten nicht-menschlichen Säuger. Diese Antikörper können laut Anspruch 7, 8 und 9 als Standard in der in vitro Diagnostik zur Quantifizierung der IgE Antwort von Allergikern verwendet werden (Fig. 2).

Die transgenen Tiere sollen dazu dienen, Arzneimittel, die spezifisch die Produktion von humanem IgE blockieren sollen, in vivo zu testen. Da transgene Tierstämme genetisch identisch und stabil ihr definiertes Merkmal an ihre Nachkommen weitergeben, kann ein Höchstmaß an Reproduzierbarkeit der gewonnenen Ergebnisse gewährleistet werden. Da die transgenen nicht-menschlichen Säuger starke humanes IgE Produzenten sind kann die Effektivität einer Vielzahl von Arzneimittel deutlich und reproduzierbar untersucht werden.

Durch Rekonstitution anderer Moleküle, die an der allergischen Reaktion im Menschen beteiligt sind, kann definiert ein vollständiges System im Tiermodell entstehen, das die Untersuchung von Arzneimitteln erleichtert. Da humanes IgE im Menschen spezifisch an Rezeptoren, wie FcεRl oder CD23 bindet, kann das vorgestellte Tiermodell durch transgene Tiere erweitert werden, die außer humanem IgE auch einen oder beide humane IgE Rezeptoren exprimieren.

Es gibt drei grundsätzliche Vorteile von Tierexperimenten zur Arzneimitteluntersuchung in dem erfindungsgemäßen System. Erstens sind Experimente in den transgenen Säugern aussagekräftiger als Experimente in vitro. Zweitens sind Experimente im Nagetiermodell wesentlich kostengünstiger als in Primaten.

Drittens sind Experimente sicherer, welche die Bindung eines blockierenden Arzneimittels gegen IgE an Versuchstieren untersuchen, die humanes IgE tragen. Da jedes Arzneimittel, das IgE durch Bindung an dieses unterdrücken soll, auch das IgE, welches auf Zellen gebunden ist, potentiell aktivieren kann, ist eine ungewollte Induktion eines anaphylaktischen Schocks möglich. Eine solche potentielle Gefahr kann in einem humanisierten Tiermodell in vivo untersucht und die mögliche Gefährdung von Patienten im Vorfeld verringert werden.

Eine weitere Anwendung laut Anspruch 7 bis 9 liegt in der einfachen Gewinnung von Antigen-spezifischem humanisiertem IgE mit vorherbestimmter Antigenspezifität. In der Diagnose von Allergien wird unter anderem die Serumkonzentration von Allergen-spezifischem IgE gemessen. Aus mit Allergenen immunisierten transgenen Säugern kann man mit Standardmethoden der Hybridomagewinnung oder Immortalisierung von B Zellen, in vitro kultivierbare Zellen erhalten, die humanisiertes IgE mit definierter Antigen- bzw. Allergenspezifität produzieren. Dies kann als Vergleichs-Standard zur Quantifizierung von IgE in vitro dienen. Die Alternative, dieses spezifische IgE aus Allergikern zu gewinnen, ist aufgrund der extrem niedrigen Expression von IgE im Menschen nicht praktikabel. Auch einzelne Antigen-spezifische Antikörper gentechnisch zu "humanisieren" ist sehr aufwendig (Schuurman et al. 1997).

Die Erfindung wird durch das Beispiel näher erläutert, ohne es einzuschränken. Gemäß Fig. 3 wurde durch Klonierung eines als "phuIgE- TV" (18) bezeichneten Vektors ein Gene Targeting Vektor hergestellt. Das Plasmid phuIgE-TV ist auf der Basis des Klonierungsvektors pCR-Script (E) (Firma Stratagen, Heidelberg, Deutschland) kloniert worden. Zwei Fragmente der IgG1 Genregion der Maus (Honjo et al. 1979; Akahori 1996) wurden in das Plasmid eingesetzt (A, D). Zuerst wurde ein 5 kB langes genomisches DNA Fragment kloniert, das durch EcoRV Restriktionsverdau erhalten wurde. Es umfaßt die konstanten Exons von IgG1, die Region der transmembran Exons und die strangabwärts liegende untranslatierte Region ein (D). Hieran schließt strangaufwärts (5'gelegen) eine Thymidinkinase-Gen-Kassette und eine Neomycin-Resistenz-Kassette, gefolgt von einer IoxP Sequenz an (C) (Capecchi M. 1989; Sauer, B. 1993; Zou et al. 1994). Der nächste Teil des Plasmides ist ein 1,9 kB BamHl-BamHl Genfragment, das die Exons 1 bis 4 der humanen IgE Schweren Kette enthält (Flanagan et al. 1982) (B). Schließlich wurde eine 843 bp DNA Sequenz angefügt (A), die strangaufwärts von den konstanten Exons des Maus IgG1 liegt und mittels PCR und den Primern.5'-cctggggcagtgtgaa-3 und 5'-ctgtcagacaggacaggacagg-3' amplifiziert und kloniert wurde. Zusätzlich wurde eine IoxP Sequenz in die Sacl Schnittstelle, die 539 bp nach dem Exon 3 von Maus IgG1 liegt, so inseriert, daß durch transiente Cre-Rekombinase-Expression (23) eine Deletion der Neomycin-und Thymidinkinase-Kassette (C) und der endogenen IgG1 Region der Maus erfolgt, (F).

Der Vektor phuIgE-TV wird durch Scal Verdau linearisiert und in Embryonalen Stammzellen (ES) der Linie SV129 (Robertson 1987) nach bekannten Methoden transfektiert. In den ES Zellen erfolgte Homologe Rekombination (20). Durch Integration von phuIgE-TV entstand die gezeigte Mutation eines der Allele im IgG1 Genlocus (22). Nach Deletion des Fragmentes F durch Cre vermittelte DNA Rekombination (23) verblieb das Gen für die Schwere Kette des humanen IgE in der Position der Maus IgG1 Schweren Kette (24) gefolgt von einer einzelnen IoxP Sequenz (25).

Das Testen der transfektierten ES Zellen erfolgte mittels PCR (21) und Southern-Blot analog bekannter Methoden (Zou et al. 1994). Aus den erfolgreich veränderten ES-Zellen wurden durch Morulaaggregation chimäre Mäuse hergestellt, welche die Veränderung in der Keimbahn an ihre Nachkommen weitergaben. Zur Vermehrung und Testung werden die Mäuse weiter verpaart.

Referenzen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Ein transgener nicht-menschlicher Säuger, dadurch gekennzeichnet, daß das humane Immunglobulin E Schwere Kette-Gen im Immunglobulin Genlocus anstelle eines endogenen Immunoglobulin Schweren Kette-Gens positioniert ist und anstelle dieses exprimiert wird.

2. Ein transgener nicht-menschlicher Säuger nach Anspruch 1, bei dem das humane Immunglobulin E Schwere Kette-Gen im IgG1 Genlocus positioniert ist und anstelle des IgG1 Schwere Kette-Gens des nicht-menschlichen Säugers exprimiert wird.

3. Ein transgener nicht-menschlicher Säuger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der transgene nicht-menschliche Säuger ein Nager, insbesondere eine Maus ist.

4. Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Gen für die menschliche Schwere Kette des Immunoglobulins der Klasse E durch homologe Rekombination in den Immunoglobulin Genlocus eines Zellklons stabil transfiziert wird, der endogene Immunglobulin Genlocus und der Selektionsmarker, die durch IoxP Sequenzen eingerahmt sind, durch die Cre- Rekombinase deletiert werden, der stabil transfizierte Zeliklon mit Morulas aggregiert wird oder in Blastozysten injiziert wird, die entstandenen Blastozysten in Leihmütter übertragen werden, die geborenen chimären, nicht menschlichen Säuger verpaart werden und deren Nachkommen auf das Vorhandensein des Gens für die menschliche Schwere Kette des Immunoglobulins der Klasse E im Immunoglobulin Genlocus getestet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der transgene nicht-menschlichen Säuger ein Nager, insbesondere eine Maus ist.

6. Verwendung der transgenen nicht-menschlichen Säuger nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Testung von Arzneimitteln mit Bindungsspezifität gegen humanes IgE oder gegen Moleküle, die mit humanem IgE im Menschen interagieren können.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Arzneimittel anti-humanes IgE Antikörper oder Peptide sind; welche die Interaktion zwischen humanem IgE und Molekülen, die mit humanem IgE im Menschen interagieren können, blockieren, oder anti-FcεRI Antikörper, oder anti-FcεRII Antikörper, oder anti sense Oligonucleotide gegen das humane IgE Schwere Kette Gen sind, welche die Expression des IgE Schwere Kette Gens inhibieren.

8. Verfahren zur Herstellung von humanisierten IgE Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß sie die konstante humane IgE Region besitzen und Allergen spezifische Bindungsspezifität aufweisen, erhalten durch die Herstellung und Kultivierung von Hybridoma, die durch Fusion von B Zellen aus den in Ansprüchen 1 bis 3 genannten transgenen nicht-menschlichen Säuger erhalten wurden, wobei die transgenen nicht-menschlichen Säuger mit Allergenen immunisiert worden sind.

9. Verwendung von Allergen-spezifischen humanisierten IgE Antikörpern erhalten durch Immunisierung der transgenen nicht-menschlichen Säuger gemäß einem der Patentansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in der in-vitro Diagnostik als Allergen-spezifischer humaner IgE-Standard, zur Quantifizierung von Allergen-spezifischen IgE Konzentrationen.

10. Verwendung von Allergen-spezifischen humanisierten IgE Antikörper nach dem Anspruch 9, erhalten aus den Hybridomen gemäß Anspruch 8, wobei die Allergene Pflanzenpollen, Pilzsporen, Hausstaubmilben, Stoffwechselprodukte der Hausstaubmilbe, Haustiere, Stoffwechselprodukte der Haustiere, Insektengifte und Nahrungsmittel sind.