DE69533912T2

DE69533912T2 - Antikörper gegen Epitope mit Homologie zu Auto-Antigenen, Verfahren zur Herstellung und deren Verwendungen

Info

Publication number: DE69533912T2
Application number: DE69533912T
Authority: DE
Inventors: Klaus Rajewsky; Werner Mueller; Jürgen Roes
Original assignee: Miltenyi Stefan
Current assignee: Miltenyi Stefan
Priority date: 1994-04-12
Filing date: 1995-04-12
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2015-04-13
Also published as: JP3797680B2; EP0677533B1; CA2146693A1; JP4362121B2; ATE286913T1; DE69533912D1; US7119248B1; CA2146693C; US20070101446A1; JP2006061158A; JPH0856692A; ES2236698T3; EP0677533A3; DK0677533T3; EP0677533A2; JP2006151991A

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Erhalten von autologen monoklonalen Antikörpern (AMAB) für Auto- bzw. Self-Antigene oder Homologe davon, und die Verwendung dieser Antikörper bei der Analyse von Zellpopulationen und bei Zelltrennverfahren.
Stand der Technik
Antikörper haben sich bei medizinischen Anwendungen sowohl für die Diagnose als auch die Therapie und bei Anwendungen in der Biotechnik, einschließlich der Zelltrennung, als nützlich erwiesen. Allgemeiner gesagt erleichtert ihre hohe Bindungsspezifität ihre Verwendung zur Identifizierung und Lokalisierung einer Verbindung, für die Antikörper zusammen mit Verfahren erzeugt werden können, die so verschiedenartig wie Elektronenmikroskopie und enzymgekoppelter Immunadsorptionstest sind.
Antikörper bestehen sowohl aus schweren als auch leichten Polypeptidketten, die über Zwischenketten-Disulfidbindungen und andere intramolekulare Wechselwirkungen miteinander verbunden sind. Eine einzelne schwere Kette wird über diese Disulfidbindungen mit einer einzelnen leichten Kette verbunden. Von den unterschiedlichen Antikörper-Klassen oder -Isotypen bestehen drei Isotypen (IgD, IgE und IgG) aus zwei identischen Schwerketten/Leichtketten-Paaren, die durch eine Disulfidbindung verbunden sind, und die verbleibenden zwei Isotypen (IgA und IgM) bestehen aus komplexeren Polymeren von identischen Schwerketten/Leichtketten-Paaren. Jede Kette enthält eine konstante Region und eine variable Region. Die konstanten Regionen sind dem Tier, das den Antikörper und den spezifischen Antikörper-Isotyp erzeugt, eigen, während die variablen Regionen dem Aufbau des Epitops entsprechen, an das der Antikörper bindet.
Der Begriff „Antigen" wird hier verwendet, um auf eine Substanz hinzuweisen, bei der es sich um ein ganzes Molekül oder eine Domäne in einem Molekül handeln kann, die in der Lage ist, die Erzeugung von Antikörpern mit einer Bindungsspezifität an die Substanz auszulösen. Weiter wird hier der Begriff Antigen auf Substanzen angewendet, die aufgrund einer Selbsterkennung in Wirtsorganismen vom Wild-Typ keine Antikörperproduktion auslösen würden, sondern mit der geeigneten Gentechnik eine solche Reaktion in einem Wirtstier bewirken können.
Der Begriff „Epitop" wird hier verwendet, um auf die separaten, dreidimensionalen Stellen auf einem Antigen hinzuweisen, die von B-Lymphozyten erkannt werden. Epitope sind die immunologisch aktiven Bereiche auf einem komplexen Antigen, die Bereiche, die eigentlich an einen B-Zell-Rezeptor binden und die eigentlich durch die sich ergebenden, von der B-Zelle erzeugten Antikörpermoleküle gebunden werden. Antigene enthalten im Allgemeinen mindestens ein Epitop und gewöhnlich mehr als ein Epitop. Epitope auf Protein-Antigenen können linear oder nicht linear sein. Lineare Epitope bestehen aus benachbarten Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz eines Proteins. Lineare Epitope können eine Konformationsfaltung erfordern oder auch nicht, um den natürlichen dreidimensionalen Aufbau zu bilden, und eine Immunreaktion auszulösen, durch die Antikörper mit einer Bindungsspezifität an das Antigen erzeugt werden. Nicht lineare Epitope bestehen aus nicht benachbarten Aminosäureresten. Daher erfordern nicht lineare Epitope immer eine gewisse Proteinfaltung, um die erforderlichen Aminosäurereste zueinander in Nachbarschaft zueinander zu bringen und so den natürlichen dreidimensionalen Aufbau zu bilden und eine Immunreaktion auszulösen, durch die Antikörper mit einer Bindungsspezifität an das Antigen erzeugt werden.
Der Begriff „Self" bzw. „Selbst" wird hier verwendet, um Antigene oder Epitope zu beschreiben, die durch die B-Zell-Rezeptoren eines Wild-Typ-Mitglieds der Wirtsart nicht erkannt oder nur schlecht erkannt werden würden, und zwar aufgrund der Tatsache, dass sie zu den Substanzen gehören, die normalerweise durch die Wirtsart biosynthetisiert werden oder der die Wirtsart normalerweise ausgesetzt ist. Solche Substanzen rufen eine Verträglichkeit des Immunsystems des Wirts hervor, und der Wirt gilt als für die Substanzen „verträglich gemacht".
Das Immunsystem von Wirbeltieren ist in der Lage, zwischen Self-Antigenen und fremden Antigenen zu unterscheiden, indem eine mittels Antikörper vermittelte Immunreaktion an letztere und nicht an erstere erfolgt. Die Antikörperreaktion wird durch die B-Zellen vermittelt. Gen-Rearrangements der variablen Region treten während der B-Zell-Reifung im Knochenmark in einer geordneten Reihenfolge auf. Am Ende dieses Vorgangs enthält jede B-Zelle eine einzelne, funktionelle DNA-Sequenz der variablen Region, die für eine schwere Kette des Immunglobulins kodiert, und eine einzelne, funktionelle DNA-Sequenz der variablen Region, die für eine leichte Kette des Immunglobulins kodiert. Dieses Verfahren führt zur Erzeugung von reifen, immunkompetenten B-Zellen, von denen jede antigen auf ein einzelnes Epitop festgelegt ist. Bei einem Verfahren, das noch nicht verstanden wird, wird eine immunologische Toleranz für „Selbst"-Komponenten durch die selektive Ablation von B-Zellen mit verschiedenen Regionen erzielt, die antigen auf Selbst-Epitope festgelegt sind. Diese Selbst-Toleranz schließt die Herstellung von Antikörpern aus, die für Antigene oder Epitope spezifisch sind, die durch einen Wirbeltier-Wirt synthetisiert werden. Daher können nur Antigene mit Epitopen, die vom Wirt als fremd erkannt werden, zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden.
Wenn die Selbst- und Fremdepitope vom Aufbau her ähnlich oder „homolog" sind, ist die Immunreaktion des Wirts schwächer; es ist daher praktisch unmöglich, Antikörper mit einer hohen Affinität für solche Epitope zu erhalten. Als Ergebnis ist es extrem schwierig, Antikörper für stark konservierte Proteindomänen zu erzeugen (z. B. N-CAM, Zytokine und Immunglobuline), weil Tiere, die sich die konservierten Domänen teilen, sie nicht als fremd erkennen. Während Antikörper für Self-Antigene als Ergebnis von bestimmten Autoimmunerkrankungen erzeugt werden, haben diese Antikörper Bindungsspezifitäten an einen stark beschränkten Satz von Self-Antigenen, die nicht künstlich manipuliert werden können und generell niedrige Bindungsaffinitäten aufweisen. Die EP-A-286447 beschreibt solche Autoimmunerkrankungen und beschreibt die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern für Self-Antigene, die an einer solchen Autoimmunerkrankung beteiligt sind, und zwar unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren. Daher sind Tiere mit Autoimmunerkrankungen für die Erzeugung von Antikörpern mit einer Bindungsspezifität an Self-Antigene nicht sehr nützlich. Die EP-A-313156 beschreibt ein Proteinantigen, das bezüglich eines Autoantikörpers reaktiv ist, der mit einer Autoimmunerkrankung verbunden ist.
Bei Mäusen haben allogene Unterschiede zwischen Stämmen die Herstellung von Maus anti-Maus Antikörpern ermöglicht, die für Proteine spezifisch sind, von denen solche allogenen Unterschiede erzeugt wurden. Kessler u. a. (1979), J. Immunol. 123: 2772–2778; Reif und Allen (1964) J. Exp. Med. 120: 413–433; Marshak-Rothstein (1979), J. Immunol. 122: 2491–2497; und Oi und Herzenberg (1979) Molec. Immunol. 16: 1005–1017. Anfänglich wurden polyklonale Antiseren und dann monoklonale Antikörper, die für T-Zell-Oberflächenproteine und Maus IgD Antikörper spezifisch sind, auf diese Art erhalten. Allerdings erkennen diese Antikörper nur das Genprodukt von bestimmten Mausstämmen. Diese Antikörper können nur die Epitope erkennen, die vom Aufbau her nicht homolog zu den Self-Antigenen des die Antikörper erzeugenden Wirts sind. Darüber hinaus sind die Epitope, gegen die diese Antikörper erhalten werden können, auf die Unterschiede zwischen den Stämmen und die Verfügbarkeit von allotypischen Stämmen selbst beschränkt und haben daher geringen praktischen Nutzen.
Prusiner u. a. PNAS, 1993, Bd. 90, Nr. 22, 10608–10612 beschreibt die Erzeugung von gentechnisch veränderten Mäusen mit einem Mangel an Prion-Protein. Die Injektion von infektiösen Prion-Proteinen führt bei diesen Mäusen zur Erzeugung von Antikörpern.
Es sind zahlreiche Verfahren zur Analyse und Sortierung von Zellpopulationen formuliert worden, die die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), die mag netische Trennung (mittels Magnetkügelchen-konjugierten Antikörpern) und andere Verfahren, die auf einer Antikörperaffinität für bestimmte Zelloberflächenproteine beruhen, welche als „Marker" bekannt sind, einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Solche Ansätze für die Zellanalyse und -tennung sind besonders für die Bestimmung von Zellabstammungslinien, die Isolierung von Zellen, die in der Lage sind, ein bestimmtes Produkt zu synthetisieren, und die Behandlung von verschiedenen Erkrankungszuständen mit bestimmten Zelltypen nützlich. Zum Beispiel sind hochreine hämatopoetische Stammzellen für die hämatopoetische Verpflanzung wichtig, einschließlich, aber nicht ausschließlich, bei Krebspatienten und der Transplantation von anderen Organen in Verbindung mit einer hämatopoetischen Verpflanzung. Isolierte Zellpopulationen sind auch wichtige Ziele für die Gentherapie bei der Behandlung von genetischen Erkrankungen, AIDS und verschiedenen Formen von Krebs. Daher gibt es zahlreiche Bemühungen in Richtung auf die Isolation von bestimmten Zellsorten in im Wesentlichen reiner oder in reiner Form. In Fällen, wie beispielsweise der Isolation von Stammzellen, erfordert eine wirksame Reinigung von Zellen einer solch niedrigen Konzentration im Körper Antikörper, die Stammzellen-spezifische Marker mit hoher Spezifität erkennen und an diese binden. Solche Antikörper sind aufgrund der Homologie zwischen den Stammzellenmarkern von Menschen und Mäusen schwer zu erhalten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung strebt danach, neue Verfahren zum Erhalten von (autologen) monoklonalen Antikörpern (AMAB) für ein Self-Antigen oder Homolog davon zur Verfügung zu stellen. Das Verfahren kann das Erhalten eines gentechnisch veränderten Wirtstiers, das nicht biosynthetisiert oder eine veränderte Form von mindestens einem Epitop in dem Self-Antigen synthetisiert, und das Benutzen der fehlenden Selbsttoleranz des Wirts für das mindestens eine Epitop umfassen, um Antikörper, die für das Antigen spezifisch sind, zu erzeugen. Die Erfindung umfasst auch die Antikörper oder ein funktionelles Derivat davon, die durch das Verfahren erzeugt werden. Die Erfindung beinhaltet weiter Verfahren zur Isolation von Zellen, umfassend die Verwendung der Antikörper, welche durch das Verfahren der Erfindung erhalten wurden und für ein Zelloberflächenantigen spezifisch sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den beigefügten Zeichnungen, die zur Veranschaulichung der Erfindung bereitgestellt sind, zeigen:
1 ein Bild, das die anti-IgD-Antikörperfärbung von Mausmilzgewebe in B-Zellen-reichen Gebieten zeigt;
2 die Ergebnisse der Titration von δ1,3 und δ3,5 AMAB auf Mausmilzzellen;
3 die Ergebnisse einer FACS-Analyse von doppelt gefärbten Mausmilzzellen mit anti-IgM- und anti-IgD-Antikörpern; und
4 die Ergebnisse der Trennung von Mausmilzzellen mit anti-IgD-Antikörpern, die an kolloidale superparamagnetische Partikel konjugiert sind.
Methoden zur Durchführung der Erfindung
Die Erfindung strebt danach, neue Verfahren zum Erhalten von AMAB zur Verfügung zu stellen, die eine Bindungsspezifität an Self-Antigene oder Homologe davon aufweisen. Die Erfindung kann ein Mittel zum Überwinden der eingeschränkten Herstellung von AMAB für Antigene zur Verfügung stellen, die der Wirt als eigen erkennt, sowie ein Verfahren zum Erhalten von „zielorientierten Antikörpern", d. h. AMAB mit einer Bindungsspezifität an bekannte, besondere und äußerst präzise Epitope. Die Erfindung ermöglicht auch, AMAB für biologische Moleküle oder Epitope davon zu erhalten, die für das Wachstum und die Entwicklung als wichtig erachtet werden. Wie hier genauer erörtert, ermöglicht der gezielte genetische Ersatz die Erzeugung von funktionellen Äquivalenten der Moleküle und ermöglicht daher das ausreichende Wachstum und die Entwicklung des Tiers zur Erzeugung von Antikörpern.
Der Begriff „Homolog" wird hier verwendet, um ein Antigen mit einem Aufbau zu bezeichnen, der einem durch das Wirtstier erzeugten Antigen, einem „Self-Antigen", so ähnlich ist, dass die Erzeugung von Antikörpern für das Homolog ausgeschlossen ist oder ernsthaft gestört wird. Der Ausdruck „Self-Antigen oder Homolog davon" wird hier verwendet, um anzudeuten, dass die Erfindung nicht nur auf das Erhalten von AMAB mit einer Bindungsspezifität an Self-Antigene gerichtet ist, sondern dass die Erfindung vielmehr auf das Erhalten von AMAB für eine Verbindung mit einer solchen hohen strukturellen Ähnlichkeit zu einem Self-Antigen gerichtet ist, dass das Homolog ausreichend als eigen erkannt wird, so dass das Wirtstier keine entsprechende Antikörper-vermittelte Immunreaktion erzeugt. Bei einer entsprechenden Antikörper-vermittelten Immunreaktion werden entweder AMAB nicht erhalten oder, falls sie erzeugt werden, weisen sie keine hohe Affinität für das Antigen auf.
Der Begriff „Zielantigen" wird hier verwendet, um auf die Zusammensetzung hinzuweisen, der das Wirtstier ausgesetzt ist und gegen die eine Immunreaktion erzeugt wird. Das „Zielantigenepitop" ist eine Region auf dem Zielantigen, an das die AMAB binden.
Der Begriff „Immunreaktion" wird hier verwendet, um auf die Erzeugung von AMAB mittels B-Zellen hinzuweisen. Diese Antikörper binden an ein bestimmtes Antigen, egal ob sie eine Änderung im Antigen bewirken, z. B. eine Immunität gegenüber einem eine Krankheit hervorrufenden Erreger vorsehen. Die AMAB können mit der B-Zellenoberfläche in Verbindung stehen und können auch frei zirkulieren.
Der Begriff „strukturell nicht homolog" wird hier als Beschreibung verwendet, um Self-Antigene mit Antigenen zu vergleichen, die durch Wirtstiere als Ergebnis ei ner Genmanipulation biosynthetisiert wurden. Zwei Antigene sind strukturell nicht homolog, wenn ein Antikörper erzeugt werden kann, der an eins aber nicht an das andere bindet. Strukturell nicht homolog bedeutet, dass es einen gewissen strukturellen Unterschied, vielleicht nur einen leichten, zwischen zwei oder mehreren Antigenen gibt. Der strukturell nicht homologe Unterschied zwischen zwei Antigenen kann so gering wie ein Unterschied in einer einzelnern Aminosäure oder das Vorhandensein oder Fehlen einer Methylgruppe sein.
Der Begriff „funktionell äquivalent" wird hier als Beschreibung verwendet, um Self-Antigene und Zielantigene zu vergleichen, die durch Wirtstiere als Ergebnis einer Genmanipulation biosynthetisiert wurden. In vielen Fällen kann sich eine Unterbrechung der Synthese eines Self-Antigens als tödlich erweisen, das Überleben oder die Gesamtgesundheit von gentechnisch veränderten Wirtstieren reduzieren, so dass der Erhalt von Antikörpern gestört wird. Daher kann wie hier beschrieben die Gentechnik dazu verwendet werden, die Biosynthese eines Self-Antigens auszuschalten und die Erzeugung eines anderen, funktionell äquivalenten Antigens zu bewirken. Dieses funktionell äquivalente Antigen übt eine ausreichende Self-Antigen-Funktion aus, um das schädliche Ausschalten des Self-Antigens durch Verbessern der Überlebensrate, der Gesamtgesundheit oder der Immunkompetenz des Wirtstiers in dem Ausmaß auszugleichen, in dem AMAB erhalten werden können. Wie hier verwendet, versteht man unter funktionell äquivalenten Antigenen strukturell nicht homologe.
Der Begriff „biosynthetisches Repertoire" wird hier verwendet, um die Gesamtsumme von allen Verbindungen zu bezeichnen, die durch ein bestimmtes Wirtstier biosynthetisiert werden.
Der Begriff „Wild-Typ" wird hier verwendet, um Einzelne aus Wirtsart und -stamm zu beschreiben, die keiner Genmanipulation in Bezug auf das Zielantigen unterworfen wurden und nicht von einem solchen gentechnisch veränderten Organismus abstammen. Daher erzeugen solche Einzelnen gewöhnlich das interessante Self-Antigen.
Der Begriff „gentechnisch verändert" wird verwendet, um Tiere zu beschreiben, bei denen ein oder mehr Gene direkt geändert oder ausgeschaltet wurden, um so die Synthese eines bestimmten Antigens oder eines Antigensatzes zu ändern oder auszuschalten. Eine solche Änderung oder Ausschaltung erfolgt auf der genetischen Ebene, zum Beispiel durch bestimmten genetischen Knockout oder Ersatz. Eine Genmanipulation des Zielantigens ist im Allgemeinen derart beschränkt, dass Antikörper mit einer erhöhten Bindungsspezifität an mindestens ein Epitop auf dem Antigen oder Antigensatz erhalten werden können, wie hier beschrieben. Der Begriff „gentechnisch verändert" wird auch auf die Nachkommen der ursprünglich veränderten Tiere angewandt.
Der Begriff „Domäne" wird hier verwendet, um auf eine Region oder einen Bereich eines Antigens, einschließlich das ganze Antigen, einen Teil, der weniger als das ganze Antigen ist, oder eine Region, die aufgrund der Hinzufügung von Komponenten, die dazu dienen können, mindestens ein Epitop zu maskieren, mehr als das ganze Antigen ist, hinzuweisen.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Wirtstier genetisch verändert, so dass es kein bestimmtes Self-Antigen synthetisiert. Wenn der gentechnisch veränderte Wirt mit dem Self-Antigen oder einem Homolog davon immunisiert wird, erkennt das Immunsystem des Wirts das Antigen nicht als eigen und ist daher in der Lage, eine Antikörper-vermittelte Immunreaktion zu erzeugen, aus der AMAB erhalten werden können. Verfahren zum Erhalten von solchen „Knock-out"-Mutanten sind auf dem Fachgebiet bekannt und zum Beispiel in Mansour u. a. Nature 336: 348–352 (1986) beschrieben. Wie bei den meisten genetisch veränderten, hier verwendeten Wirtstieren kann ein Züchten dazu verwendet werden, um eine homozygote Mutante zu erhalten oder um mehrfach gentechnisch veränderte Wirtstiere zu erhalten. Daher kann die genetische Modifikation für den Wirt schließlich durch Keimlinien-Transmission erlangt werden.
Die Nachkommen der gentechnisch veränderten Mäuse sind auch von der Erfindung umfasst. Ein anderes Verfahren, das auf dem Fachgebiet zur Erzeugung von transgenen Tieren bekannt ist, ist für die Verwendung hier geeignet. Geeignete Verfahren umfassen die von Kitamura u. a. (1991) Nature 350: 423–426; Shinkai u. a. (1993) Science 259: 822–825; und Komori u. a. (1993) Science 261: 1171–1185 beschriebenen, sind aber nicht darauf beschränkt. Kurz gesagt können im Fall von Self-Antigenen des Immunsystems embryonale Stamm(ES)-Zellen, die für die Genmodifikation homozygot sind, in Blastozysten von immundefizienten Mäusen, wie beispielsweise RAG-defizienten Mäusen, implantiert werden. Dem neu gebildeten Tier fehlt in vielen Fällen der immundefiziente Phänotyp und es enthält die Genmodifikation in seinen Lymphozyten.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Wirtstier gentechnisch so verändert, dass die Synthese eines bestimmten Self-Antigens durch die Synthese eines funktionell äquivalenten Antigens ersetzt wird. Daher können Antikörper für Antigene erhalten werden, deren Ausschaltung sich als tödlich erweist, das Überleben drastisch reduziert oder auf andere Weise die Bemühungen zum Erhalten von Antikörpern erschwert.
Das Self-Antigen, das aus dem biosynthetischen Repertoire des Wirts eliminiert wird, kann jede Verbindung, Domäne oder Epitop davon sein, das normalerweise durch ein Wild-Typ-Mitglied der Wirtsart synthetisiert wird. Die durch die Erfindung erhaltenen Antikörper können auf jedes Antigen gerichtet sein, einschließlich, aber nicht ausschließlich, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Nukleinsäuren, Enzymkofaktoren oder alle natürlich vorkommenden Aggregate oder kovalent gebundenen Kombinationen davon oder alle phosphorylierten oder sulfonierten Arten davon. Für diese Ausführungsformen der Erfindung kann der Wirt gentechnisch auf jede Weise so verändert werden, dass die Biosynthese des Antigens ausgeschaltet oder verändert wird. Zum Beispiel kann das Knock-out der Expression eines bestimmten Enzyms, das an der Biosynthese des Antigens beteiligt ist, zu einer Nicht-Erzeugung des Antigens oder zur Erzeugung eines funktionell äquivalenten Antigens führen. Solche Enzyme umfassen Enzyme, die an der Polymerisation beteiligt aber nicht darauf beschränkt sind, und die Anlagerung von Kohlenhydraten, Phosphatgruppen, Lipiden, Schwefel enthaltenden Gruppen an Proteine könnte ausgeschaltet werden, was zum Ausschalten oder zur Änderung des Aufbaus der Verbindungen führt, die kovalent an Proteine gebunden sind, wie bei der Synthese von Glycoproteinen. Daher können Antikörper mit Bindungsspezifität an bestimmte Self-Glycoproteine oder Kohlenhydratstrukturen auf Glycoproteinen durch die Verfahren der Erfindung erhalten werden.
Allgemeinere Verfahren zum Ausschalten oder Ändern der Erzeugung von Antigenen können verwendet werden. Diese Verfahren umfassen das Ausschalten der Synthese von bestimmten Genen oder Genfamilien und das Ausschalten von bestimmten Zelltypen, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispiele für geeignete Gene und Genfamilien umfassen die durch das Vorhandensein von bestimmten Faktoren regulierten, wie beispielsweise Steroide oder Zytokine oder Gene, die in einer Zelltyp-spezifischen Art exprimiert sind. Ein Beispiel für einen Zelltyp sind braune Fettzellen.
In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Antigen ein Protein. Eine Knockout-Mutation für ein Protein könnte das Verhindern der Synthese des gesamten Proteins beinhalten (durch Entfernen des ganzen Gens oder durch Ändern von Transkriptions- oder Translations-Kontrollelementen) oder das Ausschalten der Synthese von nur einer antigenen Domäne, während ermöglicht wird, dass der verbleibende Teil des Proteins normal synthetisiert wird. Im Fall eines Proteinantigens kann der Ersatz des Self-Antigens durch ein funktionell äquivalentes Antigen durch mindestens drei deutliche Ersatztypen erzielt werden, obwohl jeder formale Ersatz, der auf dem Fachgebiet bekannt ist, für die Verwendung hier geeignet ist.
Zuerst kann das Gen, das für das Self-Antigen kodiert, durch ein rekombinantes Gen ersetzt werden, das von dem für das Self-Antigen kodierenden Gen stammt. Das Gen, das für das Protein kodiert, wird so geändert, dass eine antigene Region deletiert, durch eine alternative Aminosäuresequenz ersetzt oder durch Hin zufügen einer neuen Aminosäuresequenz maskiert wird. Daher kann bei der Modifikation eines Self-Protein-Antigens das genetisch veränderte Ausschalten des Antigens so gering wie das Hinzufügen, Ausschalten oder die Substitution einer einzelnen Aminosäure sein. Im Wesentlichen machen es solche kleinen Änderungen im Aufbau des Self-Protein-Antigens möglich, dass AMAB für äußerst präzise Epitope erhalten werden, ohne dass die Funktion des Self-Antigens ernstlich gestört wird. Eine einzelne Aminosäurenänderung in einer geeigneten Domäne würde zu AMAB für Epitope führen, die die einzelne Aminosäure aufweisen.
Zweitens kann das für das Self-Antigen kodierende Gen durch das Gen ersetzt werden, das für ein homologes Protein kodiert, welches von einem Organismus erhalten wurde, der mit der Wirtsart verwandt ist, so dass das kodierte Protein funktionell äquivalent aber mindestens teilweise antigen nicht äquivalent ist. Eng verwandte Arten haben gewöhnlich eine hohe Sequenzhomologie für dasselbe Protein, typischerweise über 90%. Daher ist diese Strategie für das Durchführen der Erfindung in den Fällen ideal, in denen die Expression des Antigens kritisch für die Gesundheit des Organismus ist und AMAB mit einer Bindungsspezifität an eine kleine Zahl der Epitope gewünscht ist. Diese Strategie kann auch praktiziert werden, indem nur eine Region des für das Self-Antigen kodierenden Gens, durch die entsprechende Region des Gens ersetzt wird, das für dasselbe Antigen von einer verwandten Art kodiert.
Drittens kann das Gen, das für das Self-Antigen kodiert, durch ein Gen ersetzt werden, dass für ein Protein kodiert, das bekanntermaßen dieselbe oder eine ähnliche Funktion hat, aber strukturell nicht homolog ist. Diese Strategie ist besonders nützlich, wenn die Expression des Antigens für die Gesundheit des Organismus kritisch ist und AMAB mit einer Bindungsspezifität an besondere Epitope nicht erforderlich ist.
Beispiele für die Protein-Antigene, an die die AMAB, die durch die Erfindung erhalten werden, eine Bindungsspezifität aufweisen können, umfassen Zelloberflächenantigene, zum Beispiel Adhäsionsmoleküle, MHC-Moleküle der Klasse I und Klasse II, Integrin, Zytokine, Selektine, Zytokinrezeptoren und Immunglobuline, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Erfindung kann mit jedem nicht menschlichen Wirts-Wirbeltier, einschließlich Fischen, Reptilien, Amphibien, Vögeln und Säugetieren, durchgeführt werden. Allerdings ist der Wirt vorzugsweise ein Säugetier und gehört gewöhnlich zu einer Ordnung, die Rodentia, Lagomorpha, Primates, Karnivora, Perissodactyla und Artiodactyla umfasst, ist aber nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise gehört der Wirt zu den Rodentia oder zu den Mäusen, und ist besonders bevorzugt eine Maus.
Verfahren zum Erzeugen von AMAB sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden deshalb hier nicht ausführlich beschrieben. Jedes Verfahren, das auf dem Fachgebiet für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern bekannt ist, kann hier verwendet werden. Solche Verfahren umfassen das Trennen von B-Zellen mit Zelloberflächenantikörpern der gewünschten Spezifität, das Klonieren der DNA, die die variablen Regionen der leichten und schweren Ketten exprimieren, und das Exprimieren der rekombinanten Gene in einer geeigneten Wirtszelle, sind aber nicht darauf beschränkt. Standardverfahren für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern können verwendet werden, wobei die AMAB von immortalisierte Antikörper produzierenden Hybridomazellen erhalten werden. Diese Hybridomen können durch Fusion von B-Lymphozyten, die vorzugsweise aus der immunisierten Wirtsmilz isoliert wurden, mit kompatiblen immortalisierten Zellen, vorzugsweise einem B-Zellmyelom, erzeugt werden.
Die Erfindung beinhaltet weiter Stoffzusammensetzungen, die die AMAB umfassen, die durch hier beschriebene Verfahren erhalten werden. Wie hier verwendet, umfassen die Begriffe „AMAB", „der Antikörper" oder „die Antikörper" den gesamten Antikörper sowie Antikörperfragmente, die funktionellen Bereiche davon enthalten. Der Begriff „AMAB" beinhaltet jede monospezifische Verbindung, die aus einem ausreichenden Bereich der variablen Region der leichten Kette und/oder der variablen Region der schweren Kette besteht, um eine Bindung an das Epitop zu bewirken, an das der ganze Antikörper eine Bindungsspezifität aufweist. Die Fragmente können die variable Region von mindestens einem Immunoglobulinpolypeptid der schweren oder leichten Kette aufweisen und Fab-Fragmente, Fab2-Fragmente und Fv-Fragmente umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Darüber hinaus können die monospezifischen Domänen durch jedes auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren an ein anderes geeignetes Molekül angelagert sein. Die Anlagerung kann zum Beispiel chemisch oder mittels Gentechnik erfolgen. Die AMAB können durch jedes rekombinante Mittel, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, erzeugt werden. Solche rekombinanten AMAB umfassen Fragmente, die in Bakterien erzeugt werden, und AMAB, bei denen die Mehrzahl der konstanten Regionen durch konstante Regionen des menschlichen Antikörpers erzeugt wurden, sind aber nicht darauf beschränkt. Darüber hinaus können solche „humanisierten" AMAB durch Züchten der gentechnisch veränderten, hier beschriebenen Wirts-Wirbeltiere mit einem kompatiblen transgenen Tier erhalten werden, das funktionelle, menschliche Ig-Loki anstelle der Wild-Typ-Ig-Loki exprimiert. Hinsichtlich einer Erörterung von transgenen Tieren, die menschliche Ig-Loki exprimieren, siehe die WIPO-Veröffentlichung Nummer WO 91/10741 und Rajewsky u. a. DE P 422 81 62.8. Bei aufeinander folgenden Kreuzungen können Wirtstiere, die kein bestimmtes Self-Antigen exprimieren aber humanisierte Ig-Proteine exprimieren, erhalten werden. Wenn solche Tiere immunisiert werden, erzeugen sie humanisierte oder teilweise humanisierte AMAB für bestimmte Self-Antigene. Solche humanisierten AMAB sind für die Verwendung bei therapeutischen Indikationen bevorzugt.
Die AMAB können an andere Verbindungen konjugiert werden, einschließlich – aber nicht ausschließlich – Enzyme, Magnetkügelchen, kolloidale Magnetkügelchen, Haptene, Fluorchrome, Metallverbindungen, radioaktive Verbindungen, Medikamente oder Haptene. Die Enzyme, die an die AMAB konjugiert werden können, umfassen alkalische Phosphatase, Peroxidase, Unease und β-Galactosidase, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Fluorchrome, die an die AMAB konjugiert werden können, umfassen Fluoresceinisothiocyanat, Tetramethylrhodamin, Isothiocyanat, Phycoerythrin, Allophycocyanine und Texas Rot, sind aber nicht darauf beschränkt. Für zusätzliche Fluorochrome, die an Antikörper konjugiert werden können, siehe Haugland, R. P., Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992–1994). Die Metallverbindungen, die an die AMAB konjugiert werden können, umfassen Ferritin, kolloidales Gold und insbesondere kolloidale superparamagnetische Kügelchen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Haptene, die an die AMAB konjugiert werden können, umfassen Biotin, Digoxygenin, Oxazalon und Nitrophenol, sind aber nicht darauf beschränkt. Die radioaktiven Verbindungen, die an die AMAB konjugiert oder in diese eingebracht werden können, sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen Technetium 99m (⁹⁹TC), ¹²⁵I und Aminosäuren, sind aber nicht darauf beschränkt, die alle Radionuklide umfassen, einschließlich, aber nicht ausschließlich, ¹⁴C, ³H und ³⁵S. Jedes auf dem Fachgebiet bekannte Medikament, das mit jedem auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren an das Protein konjugiert werden kann, ist für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Solche Medikamente können zur hochspezifischen Abgabe an das Zielmolekül an die AMAB konjugiert werden.
Die Erfindung stellt weiter Verfahren zur Verwendung der AMAB zur Verfügung, einschließlich, aber nicht ausschließlich, Immunosassays und die Trennung von Zellen. Geeignete Immunoassays sind auf dem Fachgebiet bekannt und müssen hier nicht ausführlich beschrieben werden. Sie umfassen ELISA und RIA, sind aber nicht darauf beschränkt. Verfahren zur Zelltrennung umfassen die Trennung auf der Grundlage der Sekretion von Molekülen und Trennung auf der Grundlage von Zelloberflächenmolekülen, sind aber nicht darauf beschränkt. Verfahren zur Trennung von Zellen, die auf der Sekretion von Molekülen beruhen, sind in Serien Nr. 07/965,934 und der internationalen Anmeldung Nr. PCT/US93/10126 beschrieben. Verfahren zur Trennung von Zellen, die auf bestimmten Zelloberflächenmarkern beruhen, umfassen allgemein die Schritte des Erhaltens der AMAB mittels der hier beschriebenen Verfahren, das Kontaktieren der AMAB mit einer heterogenen Zellpopulation und das Durchführen eines Zelltrennungsverfahren, das auf der Affinität der AMAB für das Zelloberflächenantigen beruht. Jedes auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren kann verwendet werden, um die Zellen durch anfängliches Entfernen von Zellen mit besonderen Zelloberflächenantigenen oder besonderen Abstammungslinien zu trennen oder zu isolieren.
AMAB sind besonders nützlich für die Identifizierung von Markern, die mit bestimmten Zellabstammungslinien und/oder Differenzierungsstufen verbunden sind. Die AMAB können direkt oder indirekt an einen festen Träger angelagert werden, um eine Trennung zu ermöglichen. Die verwendeten Trennungsverfahren sollten die Erhaltung der Lebensfähigkeit der zu sammelnden Fraktion maximieren. Verschiedene Verfahren von unterschiedlicher Wirksamkeit können verwendet werden, um die Trennungen zu erhalten. Solche Trennungen können, wenn bis zu 10%, gewöhnlich nicht mehr als etwa 5%, vorzugsweise nicht mehr als etwa 1%, der gesamten, vorhandenen Zellen nicht den Marker aufweisen, bei der erhaltenden Zellpopulation bleiben. Das besondere, verwendete Verfahren hängt von der Wirksamkeit der Trennung, der Cytotoxizität der Methode, der Leichtigkeit und Geschwindigkeit der Durchführung und der Notwendigkeit einer hoch entwickelten Ausrüstung und/oder technischen Fertigkeit ab.
Die Verfahren für die Zelltrennung umfassen die magnetische Trennung mittels Antikörper, die mit kolloidalen magnetischen Partikeln verbunden sind, die Affinitätschromatographie und cytotoxische Mittel, die mit einem monoklonalen Antikörper verbunden sind oder in Verbindung mit jedem von einem Antikörper abhängenden, auf dem Fachgebiet bekannten Trennverfahren verwendet werden, sind aber nicht darauf beschränkt. Darüber hinaus können Zellen mittels „Panning" mit einem Antikörper getrennt werden, der an einer festen Matrix, z. B. einer Platte, angelagert ist. Die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) kann auch verwendet werden und kann unterschiedliche Schwierigkeitsstufen haben, einschließlich, aber nicht ausschließlich, eine Vielzahl von Farbkanälen, Kanäle, die einen kleinen Winkel und dumpfe Lichtstreuung erfassen, und Impedanzkanäle. Jedes von einem Antikörper abhängende Trennverfahren, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann sowohl in Verbindung mit positiven als auch negativen Trennverfahren verwendet werden, die auf den physikalischen Eigenschaften der Zelle und nicht der Antikörperaffinität beruhen, einschließlich, aber nicht ausschließlich, die Elutriation und Dichtegradientenzentrifugation.
Verfahren zum Trennen von Zellen sind im kommerziell von Dynal, Oslo, Norwegen, Cellpro, Seattle oder Advanced Magnetics, Boston erhältlich. Zum Beispiel können autologe monoklonale Antikörper direkt mit magnetischen Polystyrolpartikeln, wie Dynal M 450, oder ähnlichen magnetischen Partikeln, verbunden und z. B. für die Zelltrennung verwendet werden. Alternativ können Antikörper biotinyliert oder mit Digoxigenin konjugiert und in Verbindung mit Avidin oder an ti-Digoxigenin überzogenen Affinitätssäulen wie SEPARATE LC (Cellpro) verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden allerdings die autologen monoklonalen Antikörper in Verbindung mit kolloidalen superparamagnetischen Mikropartikeln mit einem organischen Überzug beispielsweise durch Polysaccharide verwendet. Miltenyi u. a. (1990), Cytometry 11: 231–239. Diese Partikel können mit einer Größe von 10 bis 200 nm, vorzugsweise zwischen 40 und 100 nm, verwendet werden und können entweder direkt an autologe Antikörper konjugiert werden oder in Kombination mit anti-Immunglobulin, Avidin oder anti-Hapten-spezifischen Mikrokügelchen verwendet werden. Mit Polysacchariden überzogene superparamagnetische Partikel sind im kommerziell von Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland erhältlich.
Ein Verfahren, das verwendet werden kann, umfasst zuerst eine Inkubation der Zellen für eine kurze Zeitdauer bei reduzierten Temperaturen, generell etwa 4°C, mit sättigenden Niveaus an AMAB, die für ein bestimmtes Zelloberflächenantigen spezifisch sind, und dann das Waschen der Zellen mit PBS und fötalem Kälberserum (FCS)-Kissen. Die Zellen können dann in einem Puffermedium, wie oben beschrieben, suspendiert und auf der Grundlage der AMAB für die bestimmten Determinanten mittels verschiedener Proteine) getrennt werden, die für die AMAB oder den AMAB-Antigen-Komplex spezifisch sind.
Die AMAB können mit Markern konjugiert werden, einschließlich, aber nicht ausschließlich, Magnetkügelchen, die die direkte Trennung ermöglichen, Biotin, das mit Avidin oder Streptavidin, das mit einem Träger verbunden ist, entfernt werden kann, Digoxigenin, das mit anti-Digoxigenin-Antikörpern erfasst werden kann, und Fluorchrome, die mit einem FACS oder dergleichen verwendet werden können, um eine leichte Trennung des bestimmten Zelltyps zu ermöglichen. Es kann jedes Verfahren verwendet werden, das für die Lebensfähigkeit der verbleibenden Zellen nicht übermäßig schädlich ist.
Nach einer beträchtlichen Anreicherung der Zellen, die das Zelloberflächenantigen enthalten, um generell mindestens etwa 50%, vorzugsweise mindestens etwa 70%, können die Zellen dann mittels FACS oder andere Methoden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, getrennt werden. Mit einer großen Anzahl der Verfahren können Mehrfarbanalysen verwendet werden, einschließlich, aber nicht ausschließlich, FACS und Fluoreszenzmikroskopie. Die Zellen können auf der Grundlage des Färbeniveaus für die bestimmten Antigene getrennt werden.
Die Erfindung umfasst weiter das Erhalten von AMAB für Self-Antigene, die Rezeptoren sind, durch das hier beschriebene Verfahren und das Verwenden von solchen AMAB als pharmazeutische Mittel, wobei die AMAB die Wirksamkeit als Rezeptoragonisten oder -antagonisten zeigen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht einschränken.
Beispiel 1
Gen-Targeting
Das Gen-Targeting des Cδ-Gens wurde wie von Roes und Rajewsky, J. Exp. Med. 177: 45–55 (1993); und Roes und Rajewsky, Int. Immunol. 3: 1367 (1991) beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, wurden insgesamt 10⁸ E 14-1 ES Zellen mit dem Zielvektor transfiziert, der so aufgebaut war, dass er einen großen Teil des Cδ1-Exons ersetzte und Frameshift-Mutationen in Cδ3 durch Ausfüllen von in diesem Exon vorhandenen Restriktionsstellen einbrachte. Die Einführung der Mutationen in die Keimlinie führte zu einer funktionellen Inaktivierung von beiden Ig-Domänenexons der δ-Kette. Dies wurde als wichtig angesehen, um die Möglichkeit der Expression einer abgeschnittenen δH-Kette auszuschließen, die mit μ für die L-Ketten konkurrieren könnte und sekretiert werden könnte. Das Vorhandensein des Frameshift in der Maus-Keimlinie wurde durch eine NheI Restriktionsstelle aufgezeigt, die aus dem Ausfüllen der HindIII Stelle in Cδ3 resultierte. Das Cδ2-Exon ist aufgrund eines nicht funktionellen Spleiß-Akzeptors ein Pseudoexon.
Die Selektion überlebenden Kolonien wurden mittels PCR analysiert und positive Klone wurden weiter durch Southern Blotting analysiert, um den Aufbau des angezielten Lokus zu bestätigen. Homologe Rekombinante wurden mit einer Häufigkeit von 1/17 doppelt-resistenten oder 1/103 G418-resistenten Klonen erhalten. Es werden Restriktionskarten vom Wild-Typ und mutierte Cδ-Loki sowie die Restriktionsanalyse von HindIII-verdauter genomischer DNA aus fünf einzelnen Kandidatrekombinanten und Kontrollzellen gezeigt. Ein homologes Rekombinationsereignis würde zu einer Bande von 4,4 oder 6,0 kb zusätzlich zu der Keimlinienbande von 3,8 kb führen, je nach dem Vorhandensein oder Fehlen der Frameshift-Mutation in Cδ3, was zu einem Verlust der HindIII Stelle führt. 9 von 10 homologen rekombinanten Klonen zeigten das 6,0 kb Fragment, was anzeigt, das der Stopppunkt der Rekombination 3' vom Cδ3-Exon angeordnet war. Daher wurden die Exons Cδ1 und Cδ3 in diesen Klonen nicht funktionsfähig gemacht. Ein Klon behielt die HindIII Restriktionsstelle im Cδ3-Exon, was zu einem diagnostischen Restriktionsfragment von 4,4 kb führte. Der Aufbau des angezielten Lokus wurde mittels einer Reihe von anderen Sonden und Restriktionsenzymen bestätigt. Eine Southern-Blot-Analyse wurde durchgeführt wie von Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989) beschrieben.
Beispiel 2
Erzeugung von IgD-defizienten Mäusen
Die Erzeugung von IgD-defizienten Mäusen wurde durchgeführt wie von Roes und Rajewsky (1993) J. Exp. Med. 177: 45–55 beschrieben. Kurz gesagt war die Strategie der Cδ-Geninaktivierung und das Screening-Verfahren für positive Klone wie im Beispiel 1 beschrieben. Die angezielten ES-Zellklone wurden in ein Blastozyst injiziert, das von C57BL/6-Mäusen isoliert war, und auf (C57BL/6 × BALB/c) Pflegetiere übertragen. Männliche chimäre Nachkommen wurden mit C57BL/6-Weibchen für die Keimlinienübertragung der δT-Mutation gepaart. Die Nachkommen, die von den ES-Zellen stammten, wurden mittels der Überzugsfarbe identifiziert und auf Vorhandensein der Mutation namens δT analysiert, und zwar mittels Southern Blotting oder phänotypisch durch Durchflusszytometrie. Homozygote mutante Mäuse (δT/δT) wurden durch Kreuzen von heterozygoten Nachkommen erhalten.
Beispiel 3
Northern-Blot-Analyse von vermeintlichen (δT/δT) mutanten Mäusen
Die Northern-Blot-Analyse von vermeintlichen (δT/δT) mutanten Mäusen wurde wie von Roes und Rajewsky (1993) beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt führt die δT-Mutation zu einer funktionellen Inaktivierung von beiden Exons, die für die Ig-Domänen der H-Kette kodieren. Die Transmembran und die Hingeregion-Exons bleiben allerdings intakt und potentiell funktionsfähig. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass ein abweichendes Spleißen von Vorläufer-RNA, die sowohl die Cμ- als auch die Cδ-Gene umfasst, zur Erzeugung einer signifikanten Menge an chimären Ig-Transkripten führen würde, die die extrazellulären Domänen des Cμ-Gens und des transmembranen und zytoplasmatischen Bereichs von Cδ kodiert, wurde poly(A)⁺-RNA, die aus Milz von homozygoten Mutanten (δT/δT) und Wild-Typ-Mäusen isoliert wurde, mittels Northern-Blotting analysiert. Die mRNA, die Cμ-Exons enthielt, welche bis zum Cδ-Transmembranexon gespleißt wurden, wäre länger als die normalen Cμ-Transkripte von 2,4 (μs) oder 2,7 kb (μm), weil die 3' nicht translatierte Region der δ-Information 600 bp länger als die der μ-Information ist.
Eine Hybridisierung der Milz-poly(A)⁺-RNA von homozygoten mutanten Mäusen mit einer Cδ-Transmembran-spezifischen Sonde zeigt Banden von 4,8, 4,0, 3,8 und 3,0 kb. Allerdings hybridisierte keine dieser Banden mit der Cμ-spezifischen Sonde. Die Erfassungsgrenze der beiden Sonden lag ähnlich in einem Faktor von zwei (1,2 × 10⁶ Kopien für die Cμ- und 0,6 × 10⁶ für die δm-Sonde), wie durch die Signale, die von einer Hybridisierung zu Standard-Plasmid-DNA erhalten wurden, beurteilt. Die Cμ-Sonde ist ein cDNA-Fragment von 1 kb mit vollständigem Gegenstück für die mRNA und dem Standardplasmid, während die δm-Sonde mit der mRNA über einen Bereich von nur 480 bp hybridisiert, aber von 700 bp auf dem Plasmidstandard, weil dieser das δm1/m2-intron enthält. Demgemäß sollte eine mRNA, die die Cμ-Exons repräsentierte, die zu den δm-Exons spleißten, wenn eine Detektion mittels der δm-Sonde erfolgte, auch mit der Cμ-Sonde erkannt werden. Weil die Banden von 3,0, 3,8, 4,0 und 4,8 kb deutlich über der Erfassungsgrenze der δm-Sonde liegen, sollten sie, wenn sie Cμ-Sequenzen enthalten, auch mit der Cμ-Sonde erfasst werden. Dies ist allerdings nicht der Fall.
Weiterhin zeigte eine sequentielle Hybridisierung desselben Blots mit einem neo⁺-Gen und einer Sonde, die für das Cδ3-Exon spezifisch ist, dass die Banden von 3,8, 4,0 und 4,8 kb auch Sequenzen enthalten, die vom neo⁺-Gen stammen, was anzeigt, dass sie abweichende Spleißprodukte darstellen. Die Bande von 3,0 kb hybridisierte mit der Sonde, die für das Cδ3-Exon spezifisch ist, das wegen der im Beispiel 1 beschriebenen Frameshift-Mutationen in dem angezielten Allel nicht funktionsfähig ist. Zusätzlich wurde mit der neo⁺-Sonde auch mRNA von 2,4 kb, die nicht mit der δm-Sonde hybridisierte, entdeckt. mRNA mit geringer Abundanz von 1,6 und 2,0 kg, die mit einer Cδm-spezifischen Sonde hybridisieren, sind sowohl in 10 μg poly(A)⁺-RNA von normalen als auch mutanten Mäusen feststellbar. Diese mRNA sind allerdings kleiner als die normale Cμ-Nachricht, und es ist daher unwahrscheinlich, dass sie für ein funktionelles Ig-Molekül kodieren.
Zusammen genommen waren die mRNA-Arten, die potentiell funktionelle chimäre μ/δ-Moleküle darstellen, in Northern Blots mit so viel wie 10 μg Milz poly(A)⁺-RNA von δT/δT-Mäusen nicht feststellbar. Weil mRNA, die für die δ-H-Kette kodiert, mit der Cδm-spezifischen Sonde in so wenig wie 300 ng poly(A)⁺-RNA einer Milz von normalen Mäusen detektiert werden kann, wäre eine vermeintliche mRNA, die für die extrazellulären Domänen von μ und den Transmembranbereich von δ kodiert, mindestens 30-fach weniger abundant als die δ-H-Ketteninformation in normalen Mäusen, wenn sie überhaupt existent wäre. Daher ist mRNA, die potentiell in der Lage ist, für ein IgD-artiges Molekül zu kodieren, in homozygoten mutanten Mäusen (δT/δT) mittels Northern-Blot-Analyse nicht feststellbar.
Beispiel 4
Erzeugung von Maus-anti-Maus-IgD monoklonale Antikörper
IgD-defiziente Mäuse wurden mittels Gen-Targeting wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben erzeugt. Ein auf diese Weise erhaltenes Tier wurde intraperitoneal (i. p.) mit Maus-monoklonalem Antikörper der Klasse IgD (267,7 δ „a"-Allotyp), in Alaun ausgefällt, immunisiert.
Nach 6 Wochen wurde das Tier i. p. mit löslichem B1–8 des „b"-Allotyps geboostet, um monoklonale Antikörper zu erhalten, die beide Allotypen erkennen.
Nach 3 Tagen wurden Milzzellen der immunisierten Maus mit X63 Ag8.6.5.3 mittels eines Standard-PEG-Fusionsprotokolls fusioniert. Die Hybride wurden direkt in acht 96-Loch-Platten kloniert und mittels HAT-selektivem Medium selektiert. Die erhaltenen Hybridome wurden auf die Erzeugung von anti-IgD-Antikörper durch ELISA unter Verwendung von Platten gescreent, die mit B1–8 (IgD), BSA (Rinderserumalbumin), 267,7 (IgD), R33-24-12 (anti-IgM) überzogen waren und mittels R33-18-10,1-Biotin (Ratten anti-Maus-Kappa) und R33-60-Biotin (anti-IgM) Antikörper entwickelt. 17 Klone zeigten eine Reaktionsfähigkeit gegenüber B1–8 (IgD^b), 13 davon zeigten eine Reaktionsfähigkeit gegenüber 267,7 (IgD^a), einer davon gehörte zur IgM-Klasse. Zwei andere Klone zeigten eine Reaktionsfähigkeit gegenüber IgM aber nicht gegenüber IgD. Die Hybridome waren weiter durch eine relative Bindungsaffinität und den Isotyp gekennzeichnet. 15 von 21 getesteten Klonen zeigten den IgG1-Isotyp. Zusätzlich wurden Klone zur Bindung an mit Trypsin behandelten und nicht behandelten Mausmilzzellen mittels biotinylierter anti-Maus-IgG1 und Streptavidin-Phycoerythrin charakterisiert. Trypsin schneidet Oberflächen-IgD und ermöglicht eine Lokalisierung des Epitops auf den IgD-Molekülen.
Drei Klone mit höchster Affinität und dem IgG1-Isotyp (δ1,2, δ1,3 und δ3,5) wurden für weitere Experimente verwendet. Mehrere mg von gereinigten AMAB, die mit diesen Klonen erzeugt wurden, wurden mittels „roller bottles" gemäß Standardverfahren erzeugt. 16 Klone wurden in einem Färbeassay durch Inkubation von Mausmilzzellen mit Kulturüberstand getestet. Gebundene anti-IgD-AMAB wurde mit einem biotinylierten anti-Maus-IgG1 erfasst und durch Streptavidin-PE aufgedeckt.
Beispiel 5
IgD-AMAB-Färbung von Mausmilzgewebe in an B-Zellen reichen Zonen
Gefrorene Milzabschnitte von einer C57BL/6 Maus wurden mit biotinyliertem Maus anti-Maus IgD AMAB δ1,3 gefärbt, das wie im Beispiel 4 beschrieben hergestellt und mittels Pierce NHS Biotin gemäß den Anweisungen der Lieferfirma biotinyliert war. Die Färbemuster wurden mit Peroxidase entwickelt, gekoppelt mit Streptavidin unter Verwendung des AEC Staining Kit von Sigma gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 1 gezeigt. Das Färbemuster ist mit dem für die polyklonalen Ziegen anti-Maus IgD Antiseren identisch, was zeigt, dass die IgD AMAB, die mit der Erfindung erhalten werden, eine Bindungsspezifität an das gewünschte Self-Antigen aufweisen.
Beispiel 6
Antikörper-Konjugation für Fluorescein und Färben von Milzzellen bei unterschiedlichen Konzentrationen
0,5 mg gereinigtes AMAB (δ1,3 und δ3,5), jeweils aus Beispiel 4 erhalten, wurde erneut in 1,5 ml 0,1 M NaHCO₃ gepuffert und 1 Stunde lang mit 15 μl Carboxylfluoresceinhydroxysuccinimidester (Boehringer Mannheim) reagiert, das in DMSO (1 mg/ml) gelöst war. Ungebundenes Fluorescein wurde durch Gelfiltration entfernt. Das F/P-Verhältnis lag wie bestimmt bei etwa 3–3,5 für beide Konjugate. Eine Million Mausmilzzellen wurden 15 Minuten mit den unterschiedlichen Verdünnungen der konjugierten AMAB, die in der 2 gezeigt sind, inkubiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 2 veranschaulicht. Die Daten zeigen, dass so geringe Konzentrationen wie 1 μg/ml zum Erfassen der IgD-positiven Zellen ausreichen und dass die AMAB eine hohe Affinität aufweisen.
Beispiel 7
Zwei-Farben-Färben von Mausmilzzellen
Milzzellen, die von einer B6 × 129 Maus erhalten wurden, wurden mit dem Fluorescein-konjugierten AMAB δ1,3 und Phycoerythrin-konjugierten anti-Maus IgM Antikörper (R33-24) gefärbt, gewaschen und in einem FACScan Durchflusszytometer analysiert, indem Lymphozyten eingegabelt („gating") wurden und tote Zellen durch Propidiumiodidfärbung ausgeschlossen wurden.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 3 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die meisten IgM-tragenden Zellen IgD koexprimieren; allerdings wurden nur einige IgM⁺ IgD^– Zellen erhalten. Dieses Färben stimmt gut mit dem erwarteten Färbemuster für IgD überein. Es zeigt auch, dass die AMAB an Moleküle binden, die gewöhnlich in normalen Mäusen vorhanden sind, und daher autologe monoklonale Antikörper sind.
Beispiel 8
Magnetische Trennung von Zellen mittels autologen monoklonalen, mit kolloidalen magnetischen Partikeln verbundenen Antikörpern
Konjugation von Antikörpern an magnetische Partikel
Gereinigte AMAB δ1,3 und δ3,5 wurden mittels SPDP (Pierce) Kopplungschemie gemäß den Anweisungen der Lieferfirma an MACS Amino-Mikrokügelchen konjugiert (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland). Ungefähr 200 μg aktivierter Antikörper wurde an 1 ml SPDP modifizierte MACS-Aminomikrokügelchen konjugiert (OD450 = 10). Die konjugierten Kügelchen wurden zweimal mittels einer MACS A1 Säule gereinigt und in PBS erneut auf eine Konzentration von OD450 = 1 gepuffert (siehe Miltenyi u. a., 1990, Cytometry, 11: 231–238).
Magnetische Markierung von Zellen
10 Millionen Milzzellen in 80 μl wurden 15 Minuten lang bei 4°C mit einer Verdünnung von 1 zu 5 der δ1,3 und δ3,5 konjugierten magnetischen Partikel inkubiert, dann wurde derselbe Fluorescein-konjugierte AMAB einer Endkonzentration von 8 μg/ml zugesetzt. Zellen wurden mit dem Antikörper 5 Minuten lang reagieren gelassen und dann einmal mit PBS gewaschen. Magnetisch und fluoreszent markierte Zellen wurden mittels eines MACS Magnetzellsortierers (Miltenyi Biotech GmbH) gemäß den Anweisungen der Lieferfirma getrennt. Die Zellen wurden auf eine vorgefüllte A2 MACS-Säule gegeben, die mit einem 25G-Strömungsbegrenzer betrieben wurde, die Säule wurde mit 4 ml Puffer gewaschen und Zellen, die durch die Säule wanderten, wurden als nicht magnetische Fraktion gesammelt. Die Säule wurde mit einem Rückströmverfahren mittels eines 23G Strömungsbegrenzers gewaschen und die zurückgehaltenen Zellen wurden eluiert. Alle Fraktionen wurden mittels Durchflusszytometrie (FACScan) analysiert. Tote Zellen wurden mittels Propidiumiodidfärbung identifiziert und von der Analyse ausgeschlossen.
Die 4 zeigt die Histogramme einer FACS-Analyse der Auftrennungen. In der 4 zeigt die erste Reihe die Zellen von der Trennung, die zweite Reihe veranschaulicht die nicht magnetische Fraktion und die dritte Reihe zeigt die positiven Zellen. Die δ1,3-Ergebnisse sind in der linken Säule und die δ3,5-Ergebnisse in der rechten Säule gezeigt. Die Daten zeigen, dass mindestens 95% der IgD-exprimierenden Zellen durch die Säule zurückgehalten werden, während die IgD-Zellen, die zurückgehalten und von der Säule eluiert werden, eine Reinheit von mindestens 92% aufweisen. Hintergrundfärben wird bei dieser Trennung und Analyse hauptsächlich durch Makrophagen bewirkt, die Antikörper in einer nicht spezifischen Weise aufnehmen.
Beispiel 9
Erhalt von NCAM-Knockout-Mäusen
Nervenzelladhäsionsmoleküle (NCAM) sind Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie, die die homo- und heterophilen Zell-Zell-Wechselwirkungen vermittelt. NCAM treten in verschiedenen Isoformen auf, die durch alternatives Spleißen erzeugt werden. Hemperly u. a. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 3037–3041; Barthels u. a. (1987) EMBO J. 6: 907–914; und Barthels u. a. (1992) Eur. J. Neurosci. 4: 327–337. Während der embryonalen Entwicklung werden NCAM in Derivaten von allen drei Keimschichten exprimiert, während sie bei dem erwachsenen Tier hauptsächlich im Nervengewebe vorliegen. Verfahren, wie die Neurulation, der axonale Auswuchs, die Histogenese der Retina und die Entwicklung des olfaktorischen Systems, werden mit der regulierten Expression von NCAM korreliert. Crossin u. a. (1990) Exp. Neurol. 109: 5–15; Tosney u. a. (1986), Dev. Biol. 114: 437–452; Thiery u. a. (1977) J. Biol. Chem. 252: 6841–6845; Key u. a. (1990) J. Cell Biol. 110: 1729–1743; und Chung u. a. (1991) J. Comp. Neurol. 314: 290–305. Homozygote NCAM-negative Mäuse, die mittels Gen-T argeting erzeugt wurden, scheinen gesund und fruchtbar zu sein. Erwachsene Mutanten zeigen eine 10%-ige Reduktion des gesamten Gehirngewichts und einen 36%-igen Abfall in der Größe des olfaktorischen Bulbus. Ein Mangel an NCAM fällt mit fast dem gesamten Verlust an proteingebundener α-(2,8)-gekoppelter Polysialinsäure zusammen, einem Kohlenhydrataufbau, der mit der Nervenentwicklung und Plastizität korrelieren soll. Theodosis u. a. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 5494–5498. Das Testen der Tiere in dem Morris-Wasser-Labyrinth, wie von Morris (1981) Learn. Motiv. 12: 239–260 beschrieben, zeigte Defizite beim räumlichen Lernen, während die Aktivität und motorischen Fähigkeiten von mutanten Mäusen normal erschienen.
Gen-Targeting und die Erzeugung von homozygoten mutanten Mäusen wurden mittels Standardprotokollen durchgeführt und durch Southern Blotting und Allel-spezifischer PCR bestätigt. Nuklease-SI-Schutzassays, Northern und Western Blotting bestätigten den angezielten Ort als Null-Allel. Die immuncytochemische Analyse von Gehirnabschnitten für NCAM mittels monoklonaler Antikörper und polyklonaler Seren zeigte die intensivste Färbung in den Glomeruli und der granulären Zellschicht des olfaktorischen Bulbus bei Wild-Typ und heterozygoten Tieren. Die Gesamtfärbung stimmte gut mit Berichten über die NCAM-Expression im erwachsenen Gehirn überein. Chung u. a. (1991). In homozygoten mutanten Mäusen gab es, wie erwartet, einen Gesamtverlust der NCAM-Immunreaktivität.
Heterozygote Tiere von zwei Linien wurden gepaart und hatten 78 Nachkommen. Von diesen waren 38 Tiere (49%) heterozygot, 22 (28%) Wild-Typ und 18 (23%) homozygot bezüglich des mutierten Allels, was eine fast perfekte Mendelsche Verteilung anzeigt. Homozygote mutante Tiere sind fruchtbar und sehen im Alter bis zu vier Monaten gesund aus, obwohl sie etwa 10% kleiner im Gewicht als Wild-Typ und heterozygote Tiere desselben Wurfs sind. Isolierte Gehirne eines mutanten und eines heterozygoten Tiers wiesen offensichtliche anatomische Unterschiede auf: der olfaktorische Bulbus war im Vergleich zu +/+ und +/– Tieren bei den Mutanten kleiner; und das Gehirngewicht warum etwa 10% reduziert (nach der Korrektur für das Körpergewicht).
Um AMAB mit hoher Affinität für NCAM zu erzeugen, werden die oben beschriebenen Mäuse mit einer antigenen Menge an in einem geeigneten Hilfsstoff suspendierten NCAM inokuliert. Booster-Shots werden wie erforderlich gegeben, und der Antikörpertiter wird periodisch gemessen. Sobald der Titer ausreicht, folgt ein geeignetes Verfahren zur Erzeugung von AMAB.
Die vorangehende Erfindung wurde mit einiger Ausführlichkeit mittels Veranschaulichung und Beispiel zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses beschrieben, jedoch weiß der Fachmann, dass gewisse Modifikationen durchgeführt werden können. Daher sollten die Beschreibung und Beispiele nicht als einschränkend für die Erfindung, die in den beigefügten Ansprüchen definiert ist, ausgelegt werden.

Claims

Verfahren zum Erhalten eines autologen monoklonalen Antikörpers für ein Auto- bzw. Self-Antigen von einem nicht menschlichen Wirbeltier, umfassend: a) Herstellen von monoklonalen Antikörpern unter Verwendung von Zellen oder genetischem Material, das von Zellen stammt, die von einem nicht menschlichen Wirbeltier gesammelt wurden, wobei das Genom des Tiers modifiziert wurde, so dass es nicht mindestens ein Epitop eines Self-Antigens erzeugt, und wobei das Tier mit einem Self-Antigen oder einem Homolog davon immunisiert wurde, um eine Immunantwort auf das mindestens eine Epitop hervorzurufen, wobei das Homolog ein Antigen mit einer hohen strukturellen Ähnlichkeit zu einem Self-Antigen umfasst und keine durch Antikörper vermittelte Immunantwort auf das Epitop in dem nicht modifizierten Tier erzeugt und wobei die Zellen in Ansprechung auf das Self-Antigen oder sein Homolog produziert werden und Antikörper dagegen exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Tier ein funktionelles Äquivalent oder ein strukturelles Homolog des mindestens einen Epitops erzeugt.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Self-Antigen ein Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Lipid, Enzym-Kofaktor, natürlich vorkommendes Aggregat oder eine kovalent gebundene Kombination davon ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Self-Antigen ein Zelloberflächenantigen, ein Zytokin, ein Zelladhäsionsmolekül oder ein Immunglobulin ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Self-Antigen ein IgD-Antikörper ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Sammeln der Zellen das Anreichern oder Isolieren von antigenspezifischen B-Zellen umfasst.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Antikörper unter Verwendung des genetischen Materials durch Expression von rekombinanten, die Antikörper kodierenden Genen erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die rekombinanten Gene unter Verwendung von einzelnen, vorher angereicherten antigenspezifischen B-Zellen und Einzelzellen-PCR isoliert werden.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Antikörper zumindest teilweise humanisiert sind.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Tier ein Säugetier ist und zur Gruppe der Rodentia, Lagomorpha, Primates, Carnivora, Perissodactyla oder Artiodactyla gehört.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Tier zu den Rodentia oder zu den Mäusen gehört.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Biosynthese des Self-Antigens oder Homologs davon durch Mutation eines Gens, das ein Enzym kodiert, welches den Stoffwechselablauf beeinflusst, durch den das Self-Antigen oder Homolog davon erzeugt wird, verhindert, behindert oder ausgeschaltet wird.
Monoklonaler Antikörper, erhältlich durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, oder ein Fragment davon, der bzw. das an das Self-Antigen binden kann.
Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 13, wobei das Fragment ein Fab-Fragment ist.
Antikörper oder Fragment davon gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei der Antikörper konjugiert oder an eine andere Substanz, Marker oder Medikament gebunden ist.
Antikörper oder Fragment davon gemäß Anspruch 15, wobei die Substanz ein Reporterenzym, ein Fluorchrom, eine metallische Verbindung, ein Toxin, ein Hapten, ein magnetisches Teilchen, ein fester Träger, ein Liposom oder ein fluoreszierender Partikel ist.
Antikörper oder Fragment davon gemäß Anspruch 16, wobei der magnetische Partikel ein kolloidaler superparamagnetischer Partikel ist, das Enzym alkalische Phosphatase, Peroxidase oder Unease ist, das Fluorchrom ein Fluoreszeinisothiocyanat, Tetramethylrhodaminisothiocyanat, Phycoerythrin, Allophycocyanin oder Texas Rot ist oder die metallische Verbindung Ferritin, kolloidales Gold oder ein Magnetkügelchen ist.
Antikörper oder Fragment davon gemäß Anspruch 15, wobei die Substanz ein radioaktives Isotop umfasst oder Biotin ist.
Antikörper oder Fragment davon nach einem der Ansprüche 13 bis 18 zur Verwendung in einem Immunassay oder ELISA.
Antikörper oder Fragment davon, wie in einem der Ansprüche 13 bis 18 definiert, zur Verwendung in einem Verfahren zum Behandeln des menschlichen oder tierischen Körpers mittels einer Therapie oder einem diagnostischen Verfahren, die bzw. das am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen wird.
Hybridom, das einen Antikörper wie im Anspruch 13 definiert erzeugt.
Verfahren zum Trennen von Zellen basierend auf der Gegenwart von Zelloberflächenantigenen, wobei das Verfahren umfasst: a) Erhalten von autologen monoklonalen Antikörpern mit einer Bindungsspezifität an ein Zelloberflächenantigen durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13; b) Kontaktieren der Antikörper mit einer heterogenen Zellpopulation, wobei eine Subpopulation der Zellen das Zelloberflächenantigen exprimiert, für das die Antikörper eine Bindungsspezifität aufweisen; und c) Trennen der vom Antikörper erkannten Zellen von den Zellen, die vom Antikörper nicht erkannten wurden.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Antikörper in Verbindung mit kolloidalen superparamagnetischen Teilchen mittels Hochgradienten-Magnetseparation isoliert werden.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Antikörper an die kolloidalen superparamagnetischen Teilchen konjugiert werden, die Subpopulation der Zellen an die Antikörper gebunden wird und die Antikörper von anti-immunglobulinspezifischen, kolloidalen superparamagnetischen Teilchen erkannt werden oder die Antikörper durch ein Hapten modifiziert werden und die kolloidalen superparamagnetischen Teilchen die Haptenmodifikation erkennen.