FI105347B - Menetelmä erytropoietiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

5 105347

Menetelmä erytropoietiinin valmistamiseksi Förfarande för framställning av erythropoietin Tämä keksintö kohdistuu ihmisen erytropoietiinin kloonattuun geeniin, jonka ilmentymistaso on yllättävän korkea, mainitun geenin ilmentämiseen sekä ihmisen aktiivisen erytropoietiinin tuottamiseen in vitro.

10 Keksinnön taustaa

Erytropoietiini (josta tämän jälkeen käytetään lyhennystä EPO) on kiertävä glyko-proteiini, joka kiihottaa erytrosyyttien muodostumista korkeimmissa organismeissa. Katso Carnot et ai, Compt. Rend.. 143:384 (1906). Näin ollen EPO-proteiinia 15 kutsutaan joskus erytrosyyttien muodostumista (erytropoiesis) kiihottavaksi tekijäksi.

Ihmisen erytrosyyttien elinikä on noin 120 vuorokautta. Täten noin 1/120 kaikista erytrosyyteistä tuhoutuu päivittäin retikuloendoteeli-järjestelmässä. Samanaikaisesti erytrosyyttejä muodostuu päivittäin suhteellisen vakiona pysyvä määrä, jotta eryt-20 rosyyttitaso saataisiin säilymään joka hetki samana (Guyton, Textbook of Medical , Physiology, sivut 56-60, W. B. Saunders Co., Philadelpha (1976)).

iti I

Luuytimessä tapahtuva erytroblastien kypsyminen ja erikoistuminen johtaa eryt- : rosyyttien muodostumiseen, ja EPO on tekijä, joka vaikuttaa vähemmän erikoistu- » 1· • · 25 neisiin soluihin ja joka indusoi niiden erilaistumista erytrosyyteiksi (Guyton, mainittu edellä).

» :***: EPO on lupaava lääkitsevä aine anemian tai erityisesti munuaisanemian kliiniseen • · · hoitoon. EPO-proteiinin käyttö ei ole valitettavasti vielä yleistynyt käytännön : 30 lääkintähoidossa, koska sitä on saatavilla vain vähän.

< « · < 1 < ·

( I

’. ( Näin ollen, koska EPO on toivottava lääkitsevä aine, niin tämän proteiinin luonnolli- 4 siin lähteisiin sovelletut tavanomaiset eristämis- ja puhdistamistekniikat ovat riittämättömiä tämän yhdisteen massatuotantoa ajatellen.

I « 2 105347

Sugimoto et ai. kuvaa US-patenttijulkaisussa n:o 4 377 513 erään menetelmän EPO-proteiinin tuottamiseksi suurina määrinä, tämän menetelmän käsittäessä ihmisen lymfoblastoidisolujen, kuten Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 ja JBL, moninkertaistamisen in vivo.

5

Muut tutkijat ovat jo esittäneet alan kirjallisuudessa EPO-proteiinin tuottamisen geenitekniikkaa käyttäen. Kuitenkaan alalla ei olla vielä toistaiseksi julkaistu EPO-proteiinin valmistamista mahdollistavaa menetelmää eikä tuotteen kemiallista luonnetta. Tätä vastoin oheisessa hakemuksessa julkaistaan mahdollinen menetelmä 10 sellaisten proteiinien tuottamiseksi suurina määrinä, joilla proteiineilla on ihmisen EPO-proteiinin biologisia ominaisuuksia. Näillä tekniikoilla on samoin mahdollista tuottaa proteiineja, jotka voivat poiketa kemiallisesti ihmisen todellisesta EPO-proteiinista, mutta jolla on kuitenkin samankaltaisia (ja joissakin tapauksissa parempia) ominaisuuksia. Yksinkertaisuuden vuoksi kaikkiin niihin proteiineihin, 15 joilla on ihmisen EPO-proteiinin biologisia ominaisuuksia, voidaan tämän jälkeen viitata lyhenteellä EPO riippumatta siitä, ovatko ne kemiallisesti identtisiä sen kanssa vai ei.

Yhteenveto keksinnöstä 20 I I I I I I l . , , Tämä keksintö kohdistuu sellaisen geenin kloonaamiseen, joka geeni ilmentää 4 C < yllättävän suuria määriä ihmisen EPO-proteiinia, tämän geenin ilmentämiseen sekä ihmisen aktiivisen EPO-proteiinin massatuotantoon in vitro tämän geenin avulla.

• ·

Keksinnössä kuvataan samoin sopivat ilmentämisvektorit EPO-proteiinin tuottami-:T: 25 seksi, solut, joissa ilmentäminen toteutetaan, puhdistamismenetelmät sekä muut asiaan liittyvät toimenpiteet.

• · · • · • · • · · • · ·

Kuten jäljempänä yksityiskohtaisemmin esitetään, EPO-proteiinia saatiin osittain 1 ; ‘: puhdistuneessa muodossa, ja se puhdistettiin edelleen homogeeniseksi, ja pilkottiin < ( t « ; ': 30 trypsiinillä spesifisten fragmenttien muodostamiseksi. Nämä fragmentit puhdistettiin « . . ja niiden sekvenssit selvitettiin. EPO-oligonukleotidit määritettiin näiden selvitettyjen .'' \ sekvenssien perusteella ja ne syntetisoitiin. Näitä oligonukleotideja käytettiin ihmisen genomisen kirjaston seulontaan, josta genomisesta kirjastosta EPO-geeni eristettiin.

3 105347 EPO-geeni varmistettiin DNA-sekvenssinsä perusteella, joka DNA-ketju oli yhtäpitävä monen sellaisen tryptisen proteiinikappaleen, jonka sekvenssi oli selvitetty, kanssa. Tämän jälkeen genomisen kloonin palaa ja hybridisaatiota käyttäen osoitettiin, että EPO mRNA:ta voidaan todeta ihmissikiön (20 viikon ikäinen) mRNA.ssa. 5 cDNA-kirjasto valmistettiin ihmissikiön maksasta ja se seulottiin. Tällöin saatiin kolme EPO-proteiinin cDNA-kloonia (sen jälkeen, kun yli 750 000 yhdistelmää oli seulottu). Todettiin, että kaksi näistä klooneista oli täysipitkää, mikä voitiin päätellä täydellisen koodaussekvenssin perusteella sekä olennaisen 5-alkuisen ja 3-alkuisen, lukuvaiheen läpikäymättömän sekvenssin perusteella. Nämä cDNA-molekyylit on 10 ilmennetty sekä SV-40-viruksella transformoiduissa apinasoluissa (COS-l-solulinja; Gluzman, CeH 23:175-182 (1981)) että kiinanhamsterin munasarjasoluissa (CHO-solulinja; Urlaub, G. ja Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sei USA 77:4216-4280 (1980)). COS-soluista saatu EPO- proteiini on biologisesti aktiivista EPO-proteiinia sekä in vitro että in vivo. CHO-soluista saatu EPO on samoin biologisesti aktiivista 15 sekä in vitro että in vivo.

EPO-proteiinin cDNA-kloonissa on mielenkiintoinen, 14-15 aminohapon (ah) avoin lukukehys, käynnistimen ja päättäjän sijaitessa 20-30 nukleotidiä (nt) koodaavan alueen yläpuolella. Edustava näyte kloonatulla EPO-geenillä transfektoidusta 20 E.coli-bakteerista on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collecti-. on, Rockville, Maryland, josta se on saatavana tunnusnumeron ATCC 40153 . “'; perusteella.

• · • · · • · · « ·

Piirustusten ia taulukoiden lvhvt kuvaus 25 *

Taulukko 1 esittää emässekvenssiä ihmisen EPO-geenin 87 emäsparin pituisessa • « · eksonissa; *»· ' * · • · · : Kuvio 1 esittää EPO mRNA:n ilmaisemista ihmissikiön maksasta saadusta mRNA:- 30 sta; 4 4« • « 4 « • « · · ; Taulukko 2 esittää aminohapposekvenssiä EPO-proteiinissa, joka on johdettu I « « lambda-HEPOFL13:n nukleotidisekvenssistä;

Taulukko 3 esittää EPO cDNArn nukleotidisekvenssiä lambda-HEPOFL13:ssa (esitetään kaavamaisesti kuviossa 2) sekä siitä johdettua aminohapposekvenssiä; . 105347 4

Kuvio 3 esittää ihmisen EPO-proteiiniin liittyvästä neljästä riippumattomasta 5 genomisesta kloonista peräisin olevan DNA-istutteen suhteellisia asemia; '

Kuvio 4 esittää karttaa ihmisen EPO-geenin ilmeisestä introni- ja eksonirakenteesta;

Taulukko 4 esittää DNA-sekvenssiä kuviossa 4B esitetyssä EPO-geenissä; 10

Kuviot 5A, 5B ja 5C esittävät vektorin 91023 (B) muodostamista;

Kuvio 6 esittää SDS-polyakryyliamidigeelillä toteutettua analyysiä COS-1-soluissa muodostetusta EPO-proteiinista verrattuna natiiviin EPO-proteiiniin; 15

Taulukko 5 esittää EPO-kloonin, lambda-HEPOFL6, nukleotidi- ja aminohappo-sekvenssiä;

Taulukko 6 esittää EPO-kloonin, lambda-HEPOFL8, nukleotidi- ja aminohappo- ,:, 20 sekvenssiä; « « « · .··1. Taulukko 7 esittää EPO-kloonin, lambda-HEPOFL13, nukleotidi- ja aminohappo- • « « t sekvenssiä; • · • · · • · · • · 1 25 Kuvio 7 esittää kaavamaisesti plasmidia pRKl-4; sekä »·· :it_: Kuvio 8 esittää kaavamaisesti plasmidia pdBPV-MMTneo(342-12).

♦ · · » · « f; Yksityiskohtainen kuvaus ( ( ( 4 : ‘ ‘'; 30 Tämä keksintö kohdistuu EPO-geenien kloonaamiseen sekä EPO-proteiinin tuotta- M < « miseen ilmentämällä näitä geenejä in vitro.

5 105347 Täsmällisemmin sanottuna keksinnön kohteena on menetelmä ihmisen erytropoietii-nin tuottamiseksi, jolle on tunnusomaista, että viljellään sopivassa alustassa eukary-oottisia isäntäsoluja, jotka sisältävät taulukossa 3 esitetyn DNA-sekvenssin lähtien sekvenssistä ATG, joka koodittaa aloittavaa Met:ia AGA:han asti, joka koodit-5 taa terminaalista Argria, toiminnallisesti kytkeytyneenä ilmentämistä säätelevään sekvenssiin, ja erotetaan näin muodostunut erytropoietiini soluista ja alustasta.

Patenttijulkaisuissa ja tieteellisessä kirjallisuudessa esitetään runsaasti menetelmiä, joita on todettu voitavan käyttää yhdistelmä-DNA-teknisten tuotteiden tuottamiseen. 10 Yleisesti ottaen näihin menetelmiin liittyy toivotun geenisekvenssin eristäminen tai syntetisoiminen, sekä tämän sekvenssin ilmentäminen joko prokaryoottisessa tai eukaryoottisessa solussa, käyttäen tekniikoita, jotka ovat tuttuja alan asiantuntijalle. Sen jälkeen, kun kyseinen geeni on eristetty, puhdistettu ja istutettu siirtovektoriin (eli kloonattu), niin sen saatavuus olennaisina määrinä on saatu taatuksi. Vektori ja 15 siinä oleva kloonattu geeni siirretään sopivaan mikro-organismiin tai solulinjaan, esimerkiksi bakteeri-, hiiva- tai nisäkässoluun, kuten COS-l-solulinjaan (apinan munuaisesta), CHO-solulinjaan (kiinanhamsterin munasoluista), hyönteisestä saatuun solulinjaan, tai muuhun vastaavaan, jossa vektori monistuu mikro-organismin tai solulinjan lisääntyessä, ja josta vektori voidaan eristää tavanomaisia toimenpiteitä , <, 20 käyttäen. Täten saadaan aikaan geenin jatkuvasti uusiutuva lähde, ja geeniä voidaan , , edelleen manipuloida, muuntaa ja siirtää muihin vektoreihin tai toisiin kohtiin ,· samassa vektorissa.

• · • · · • ·« » ·

Ilmentymiseen voidaan usein päästä siirtämällä kloonattu geeni asianmukaisesti 25 suuntautuneena ja asianmukaisessa lukukehyksessä siirto vektorin asianmukaiseen kohtaan siten, että prokaryoottisen tai eukaryoottisen geenin luenta johtaa kloona- »<· tun geenin koodaaman aminohapposekvenssin käsittävän proteiinin esiasteen » ·♦ · synteesiin, joka esiaste on liittynyt Met-jäännökseen tai aminopäätteiseen sekvens- : siin, peräisin prokaryoottisesta tai eukaryoottisesta geenistä. Muissa tapauksissa < . « ;": 30 kopioitumisen ja luennan käynnistyssignaalit voidaan saada kloonatun geenin sopivan genomisen kappaleen avulla. Lukuisia spesifisiä proteiinien pilkkomistek-.···. niikoita voidaan käyttää mahdollisesti muodostuneen proteiinin esiasteen pilkkomi seksi toivotusta kohdasta, jotta toivottu aminohapposekvenssi saataisiin irrotetuksi, 6 105347 joka aminohapposekvenssi voidaan tämän jälkeen puhdistaa tavanomaisia toimenpiteitä käyttäen. Eräissä tapauksissa toivotun aminohapposekvenssin sisältävää proteiinia voidaan tuottaa ilman, että tarvittaisiin näitä spesifisiä pilkkomistek-niikoita, ja sitä voi myös vapautua soluista solujen ulkopuoliseen kasvatusalustaan.

5

Ihmisen EPO-proteiiniin liittyvän genomisen kloonin eristäminen

Ihmisen EPO puhdistettiin homogeeniseksi lähtien aplastisesta anemiasta kärsivien potilaiden virtsasta, kuten jäljempänä esitetään. Tämä puhdistettu EPO pilkottiin 10 täydellisesti trypsiiniproteaasilla, ja saadut kappaleet erotettiin korkean suorituskyvyn nestekromatografisesti käänteisfaasia käyttäen, ja ne otettiin talteen gradientti-ajon fraktioista, ja näille kappaleille suoritettiin mikrosekvenssianalyysi. Tryptisten kappaleiden sekvenssit on alleviivattu taulukoissa 2 ja 3, ja niitä tarkastellaan yksityiskohtaisemmin jäljempänä. Kaksi näistä aminohappoketjuista Val-Asn-Phe-15 TyrAla-Trp-Lys ja Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg, valittiin oligonukleotidikoettimien valmistamista varten (ensimmäisestä tryptisestä kappaleesta saatiin tulokseksi oligonukleotidijoukko, jossa pituus oli 17 nukleotidiä ja jossa degeneraatio oli 32-kertainen, sekä oligonukleotidijoukko, jossa pituus oli 18 nukleotidiä ja jossa degeneraatio oli 128-kertainen, ja jälkimmäisestä tryptisestä kappaleesta, vastaavasti, kaksi 20 oligonukleotidijoukkoa, joissa pituus oli 14 nukleotidiä ja joissa molemmissa degene-, raatio oli 48-kertainen). 32-kertaisesti degeneroituneella 17-meerien joukolla t ,' seulottiin ihmisen genominen DNA-kirjasto Ch4A-vektorissa (22) käyttäen muunnos- ta tutkijoiden Woo ja O’Malley in situ monistamistoimenpiteestä (47) seulontaan tarvittavien suodattimien valmistamiseksi.

25

Ohessa, suluissa esitetyillä arabialaisilla numeroilla (1)-(61) viitataan julkaisuihin, • · « : jotka luetellaan numerojärjestyksessä tämän selityksen lopussa.

• · · • ♦ ·«· 17-meeriin hybridisoituvat faagit kerättiin, yhdistettiin pieniksi ryhmiksi ja niiden 30 koettimina käytettiin 14-meerien ja 18-meerien joukkoja. 17-meerien, 18-meerien ja 14-meerien joukkoon hybridisoituvien faagien faagitäplät puhdistettiin, ja niiden kappaleita alikloonattiin M13-vektoreihin sekvenssien selvittämiseksi ketjun päättymisen dideoksimenetelmällä, joka kuvataan julkaisussa Sanger ja Coulson (23) (1977).

7 105347 2 °» H <D < >,

< S < ►O

fcCl H r- ϋ n ; g < S o £ ω 4-» cö < < H H o

4-* O

m ho g O _ C> cd S) < B O £ ho ω OO o< ä

4-1 4-J

i? h c e-» ^ s p < ω < >i g ho < < £-f E-t 4^ ho ^ o ho ti o O - O ω g g H o H ^ bo a c-< j .h (¾ p 4—* ho O ho rt C f-ι _, *-> b? 0¾ <§ ί ti < w < < "g ^ a ^ ä g O „ H _ - .

^ jv) O H rt a 3 ho H O O > £ hO 4-> ^ rt -+-> S o γλ < w t; - < .:2 < >» - O O" < (J 44 a +4 . ho ϋ ' , :· « < ^ U u £ ho < B o jz ti g C O < H o v ... a Jr. rt g! h o a ti| . “ :..· g a< U< bfe g, ·,· · o bicj cc boHm<^Urt bo : ; bo U >> C ° ^ -bj ω HUOJUU gf 4-4 . rt

": o O . U _ C h S

bo o B? h « h w -¾ ...: ö cuocs g) a t* iJ O E-( ^ O ^ ti £ OorOx:C^ ti :...· ho < H < H < < ö « I « 1 · · g 5 » 0js 105347 1 “ S3 Sh 8 CO 33 £ >- UJ o o ~ <-> -J < ~ ϋ =3 -J 3 p ti _Ji < x M rt! CD > ϋ < U' °° § rt 3 Ξ o. ^ G ϋ d DJ g W ö >- >". u rt 3

d o £1 5 S

hs* —G J-r ¢, +-* cv dj dj £ s «g

I 2C —1 < to S

O £/) ho ^ £ * ij cd ijj o 'h 3D _ tn LD 3 tn >,

, o tp *V

(N —1 DJ — •J

O

m cc a

rt dj 3 G D

3 co £ a H

a H

m ^ ö a “j o d 05 o - -1 ^ < o < m < *ψ*

=> to ^ D

,:, dj £ >, ^

:.,: -> w ϋ H

DID DJ I 0 CO ^ £1 3 : : °° < cDj &< x ',*·: rG «00 d· e ' dj ^ X| tn ,·:·: -D 0 Hl < CD u __ d D 3 rt — DJ H ^ ·*. Sd” :·.; -5 = 5·

. ^ hr C, D

. DI d tnl ’ti

! : ·“ < <1 H

•::,' I

33 r, DJ O rt g*

Cl, O <J

• I < . . . : Cl.

. , cc O 03 o

' ’ < I_ ^ —· D

'. ': a, < o- *=r -f J2 3 3 ^ < O i> 9 105347

0 l g S SS 5 > II

g >3 Ξ CO - w -3 w ^ be 3 5 I = < Ξ C C3 β j- £ 5 < < ^ ° >, «I £ £ J=

5| ^ ϋ H H

to a w £ t[

u w ^ ” fC

<; < *-3 ^ C W ^ 3 £ 5 < 3 f-i 00 -3 M ° JC >i > = < H ^ a ^ o o ^ < 1-3 U -< *-3 cd o td 2 B S " >> •o» Q ϋ t-3 H >-3

<N

8 , - rt bd >, 32 j" ^ t-. — 3 w ^ < < u

^-1 3 O O ^ O 3 O

0<D of- -< 5j J2 C

t~i_3 a> d< t-t <1 >3 r-i<.

... j O 1-5 Ci *-5 : : rt a p a ^ .·. : < h »j < ^ 4 · · t ·

.T. a n ^ ca C

... 3 P r- ® W

...^ j o, H < < >> c ^ f-< p o kf _Τ7 J5 £ o CU tor ^ U O H to to ·-< < » · • ··* . — U 0< .· c t" 3 « s~, to . Jt; o ai >— s' zi ..* O co ►-) < ^ < • ' o, ^ u . a ~ ^ " ‘ ’ *i <d c; — ,r ~ ,' * , H co co < P* ^ « cl to a tc) £ ...

> <1 < < < H

:*.: I

2 «] 2 £ %. u u > ^ cu a- <

SC

— 3 >> O 3 5£ W

a & u a) ^

> .-3 ϋ P« O

10 105347 U ci OH HO (Λ O '-'H ™ O 3 H 0 3 0

co o O U HO OH< OHO .ra? 7j H OcjH O o O cm o O

u M HO OO r-J H <; ΌΓ H < c£)<o cq_:o —> CO < —i co H

CO CO

u u O U t/3 H OO OO uo Ci5 c: O HO o O , U U HO H H HO hH 7:70 HO OH r-if-.

O (J OH HO < O H< OO < O 2> O h<

o CO 0< H.O 30 3 H CO CO OO CO

U CO H <0 3h h c -e (Λ < H< H < HO n o ·

3 ra o O^cl P>0 OO C < OO OO <io < O

U CO

CO AJ

tj Γ3 COO 0< DO V O >> O > O CO < ^ <j co v—< -< c^o oh h < < o -h o ><; <

3 CO HO HO ΠΗ OO OO OO Hl< OO

U CO

CO u

HO D U 30 C H HO MU CH CO

<H HH o H w < ra h 3 0/ M < H< >0 HO HO < -¾ >0 <0 <0 H<

U U

u u ^-q -<3

O h HO HO 3 0 30 30 30 ho CO

CO cj HO HO H< O H h< o H ΠΓ H H<

3 U OO OO HH HH OO HU >U OO

CO CO

u ra 1 u coc-~ho oo «jo 30 ho ho (oh rao

a u.cmLjh h H 30 ci O OH raH h < _i O

u U I Ξ < HO << to < > O 3 U <o OH 30 ra O MO (0 H 30 H<

CJ CO CO cZ O H < M H O 30 HO oh hO

CO U ra HO O O LO O H < < <0 HO OO

CO U CO

CO O 00 CO <J U 03 O 30 O O CO O 3 < CO 30 m u co co H H ci H h< H h< oh

_ U H U HO HO 030 H<j OO OO HO

S CU CO

-0000

3$ CO U C HO ho 3 < e. O 30 30 CH

H ulo OHH<; 30 O U o H h O

3 in H >OOOHHOHHO <0 cd f—< (J CO U , a co u o O o < ra H rao 30 e o o o) o CO H CO HH 030 OHO O h cj Ooh 03U ~I 31 o

ra U CO HO -—CO 0<0 C0<0 c^HO OHO —< < i O

CO CO U I

O co u !

CJ CO U OO 30 OH 3 3, 30 310 3; H

o CO u H H 4J O 30 >, O > ·ί e- H —-Ί < Cl I H

cj 3 ra HO co e t/o O H HH HO O o HO

,:. « « ··· co o a o o ra o rao no 3 0

< HO M < h! O HH ·—< O 3 0 UH

U CO OH <0 O, O HH <0 HH HO

. . i u co ... ura ,

. . co COOO O! H 3jO CH 30 OO 3 H

* CO 3 H H 20 > O ra.u CJ H 3CJ HO

' ‘ 1 ra (J HO OOH H <f < <0 HO HO H"< : U CO , . ·. U U 1 • 31 31 030 CJO 3,0 hh HO CO 3 0 ... U CO H H H H HO ran HO H< ho ;; HO 3<<H<>000 O O H < 7. U CO p H 30 CJ O CD <i CO 30 30

>> 3 O OH UH —(H H < H< OO cj H

O U HO HO H< H <j OO CO H HO

3 U

u u , U u HO « o C1H 30 0.0 3 H 3 0

O CO EdO' 3 0 · «C CT, < HO 30 » U OO

• co u HH < o <' <c H < HH to H (/)< U CO )

U <J I

·*, 230 o <S 30 0.0 HO e. O coo . ω h 30 h< in e ro h * c/r 30' '·· HO H000<0>0 <1 <· < <3

• CO M

. ra co ; - u u ho o < rao o < 3< hOidh

.... ra u ho 30 ho 30 h <! raH uH

,,, co U HH HO <0 HO OO >0 HO

... co ra 3 cj

CJ 3 <0 1C u 30 HO H < 30 HO

' u co ho ho h< raH ran oh ho

o M < O —<0 O OO 0> O >0 HH OO

" 105347

O 10 < O CO U AI U ra CO AJ CO CO U

<; ud ·—i o aj aj coro o n aj aj

•H |J S ^ < U ta CO (O U CO ro CO AJ

U AJ CO AJ CJ U COU

CO U AJ U CO CO CO AJ

COUUCOUCOCOAJ CCU o O UCOajcocoajocO

au *-< < ucoucococouaj

<U uo raucOAJCOCOcOCO

UUtOAJeorOUAJ

O) u > u

jo H f-o O

a, h u u AJ CO u aj u aj to £0

UUCOUCJAJOOAJ

a H a <; UaOrocOoOUAjAJ

— U -e o UracOCOAJCOAJAJ

f-* <: h <; ijutoucotouu

u aj cocococoo co uutocoAjrauco au a U COCOUCOAJCOUCO

<0 < >- <0 UfOUCOAJCOUU

< U f-* H UuajcocoajcOU

to h a o

1—t U C H

< o ►-! U

tOiJCOtOcOCJtO-U UUajUCOUCOCO af-* tn O uajuajcocOcoco

JO U > < AJUtOAJUCOCOCO

H < »J <3 racOracOCOAJUCO

a CO 60 U aj <0 CO aj to co co to u cocoa au au ucotoacjcoj-ju •—i e—< an coco coau a co aj t-ι < .*-; u cocoacocoucou O a < o o 5 jo u < to S H <o >-) <. ra 72 cooatociauura cts ajajucococoajuco Ό e; < >. < ucocoucocoucora au *—t U uucocoucoucora f* < u uu toucocoj-icooiJra O uucocouuajucj u uucococoajuajco j2 oauoeju tJtaouora tooa -3 u a H ^ M U COcoajuajuuUco *—; u ---1 <2 u ajcouucjocococ oo

cO

H o < a u

au a H

Po U -i O CO

aj u aj coeora coeora cou to co ra aj co a* ra • e H au couococouajuu , ·;* *-h u j h rauraraaiutocou .... <u a. h uueoeouraueoto

. UtOAJAJUUCOCOU

... UtOAJCOCOCOCOU

af-* e h <uraocjucocora r-ί u a <£ ·υυυαααιθΑΑπ3 <u < <o Hueoacouroato * * a < au to co <o ! *♦! au au vo a u . · co H OOH—·<< urautoAJucoco

'»· UOUCOAJAJCOAJ

‘ t * rau au a*uuucococouau *-(U > < a<ucococoAJAJora . ' CO Hf-I CUajajCOCOUCOcoco >· u oo ra aj u co co co urauurararara au *-"t u >^ouuracoa>ucora *—t u ra h rH u ra U U AJ AA u cou

<U >U OUUAJAJtTJAJAJAJCO

a H cd < a <;

tn < au JO U

< U < U H < • toucoorauraco

iUCJAIUCOAJUAJ

* o< au ctuuuracouAJUAj • au jo h aucotocoracourara ;; e u p* h c-aAJcocooococorau * cocorararacocoAj

,,, AJAJtOUCQAJCOU

* O F—* aU tnUAJiOAJroCOCOOOu au af-*ao>uuuucOAJAJAj(o cau aJ u ta u H cou aj coaj u cora 12 105347

Taulukossa 1 esitetään 32-kertaisesti degeneroituneeseen 17-meeriin hybridisoituvan alueen järjestys yhdessä kloonissa. Tämä DNA-sekvenssi sisältää avoimessa lukukehyksessä nukleotidit, jotka voisivat koodata täsmällisesti sitä tryptistä kappaletta, jota käytettiin oligonukleotidien 17-meerien joukon päättelyyn. Lisäksi DNA-sekvenssin 5 analyysi osoitti, että 17-meerinen hybridisoituva alue sisältyi 87 emäsparin eksoniin, jatkoksen mahdollisen vastaanottaja- ja luovuttajakohdan sitomana.

Luotettavaa tietoa siitä, että nämä kaksi kloonia (joista käytetään ohessa nimityksiä lambda-HEPOl ja lambda-HEP02) ovat EPO-proteiiniin liittyviä genomisia 10 klooneja, on saatu määrittämällä sekvenssi muissa sellaisissa eksoneissa, jotka sisältävät tryptisiä kappaleita koodaavaa muuta informaatiota.

EPO-proteiinin cDNA-kloonien eristäminen 15 Ihmissikiön (20 viikon ikäinen) maksasta saadun mRNA:n Northern: in analyysi (56) toteutettiin käyttäen 95 nukleotidin pituista yksijuosteista koetinta, joka oli valmistettu osan taulukossa 1 kuvatusta, 87 emäsparin pituisesta eksonista sisältävästä M13-kloonista. Kuten kuviossa 1 esitetään, sikiön maksan mRNA:sta voitiin todeta vahva signaali. Tämän vyöhykkeen täsmällinen tunnistaminen EPO mRNA:ksi oli mahdol-20 lista käyttäen samaa koetinta, jolla voidaan seuloa sikiön maksasta saadun mRNA:n i

IMI

. cDNA-kirjasto lambda-bakteriofaagissa. Lukuisia hybridisoituvia klooneja saatiin, i * i ."' < esiintymistiheyden ollessa suurin piirtein 1 positiivinen 250 000 seulottua yhdistel- M* mää kohden. Taulukoissa 5 ja 6 esitetään näiden kloonien (lambda-HEPOFL13 ja « · lambda-HEPOFL8) täydelliset nukleotidisekvenssit sekä niistä johdetut aminohappo-25 sekvenssit. EPO-proteiinia koodaava informaatio sisältyy 594 nukleotidiin cDNA-molekyylin 5-alkuisessa puoliskossa, käsittäen samoin erittäin hydrofobisen, 27 • · c aminohappojäännöksestä muodostuvan johtoketjun sekä 166aminohappojäännökses- • · » *...· tä muodostuvan kypsän proteiinin.

* I « • I « I « t « * » » f': 30 Kypsän proteiinin N-päätteen tunnistaminen perustui aplastisesta anemiasta kärsivi- i . en henkilöiden virtsaan erittyneen proteiinin N-päätteiseen ketjuun, kuten ohessa

«IM

esitetään (taulukko 1), ja kuten esitetään julkaisuissa Goldwasser (26), Sue ja Sytkowski (27) sekä Yangawa (21). Tällä hetkellä ei tiedetä, onko tämä N-pääte 13 105347 (Ala-Pro-Pro-Arg—) kiertävän EPO-proteiinin todellinen N-pääte, vai tapahtuuko munuaisissa tai virtsassa proteiinin tiettyä pilkkoutumista.

Taulukoissa 2 ja 3 alleviivatut aminohapposekvenssit esittävät niitä tryptisiä kappa-5 leita tai N-päätteen osaa, joiden tapauksessa proteiinisekvenssiin liittyvää informaatiota saatiin. Päätelty aminohappoketju on täsmälleen yhtäpitävä niiden tryptisten kappaleiden, joiden sekvenssi on selvitetty, kanssa, mikä vahvistaa sen, että eristetty geeni koodaa ihmisen EPO-proteiinia.

10 Ihmisen EPO-geenin rakenne ia sekvenssi

Kuviossa 3 esitetään ihmisen EPO-proteiiniin liittyvästä neljästä riippumattomasta genomisesta kloonista saatujen DNA-istutteiden suhteelliset asemat. Näiden kloonattujen DNA-sekvenssien hybridisaatioanalyysi oligonukleotidikoettimilla sekä 15 erilaisilla, EPO cDNA-kloonien kahdesta luokasta valmistetuilla koettimilla osoitti, että EPO-geeni sijaitsee suurin piirtein 3,3 kiloemäsparin suuruisessa alueessa, joka kuviossa 3 esitetään tummennetulla viivalla. Tämän alueen sekvenssin täydellinen analyysi (katso esimerkki 4) ja vertaaminen cDNA-klooneihin tuotti tulokseksi kuviossa 4 esitetyn EPO-geenin introni- ja eksonirakenteen kartan. EPO-geeni jakautuu ... 20 5 eksoniin. Osa eksonista I, koko eksoni II, III ja IV, sekä osa eksonista V, sisältää : proteiinin koodautumiseen liittyvää informaatiota. Eksonien I ja V loppuosa koodaa * * · luentavaiheen läpikäymätöntä 5-alkuista ja 3-alkuista sekvenssiä vastaavasti.

« · • · · • · · • « · ' EPO-proteiinin väliaikainen ilmentäminen COS-soluissa 0 : 25

Jotta voitaisiin osoittaa, että biologisesti aktiivista EPO-proteiinia saadaan ilmenne-tyksi in vitro soluviljelyjärjestelmässä, niin COS-soluilla toteutettiin ilmentämiseen • » ···’ liittyviä tutkimuksia (58). Näissä välitutkimuksissa käytetty vektori, p91023 (B), ;,· · kuvataan esimerkissä 5. Tämä vektori sisältää adenoviruksen pääasiallisen myöhäi- 30 sen promoottorin, SV40-viruksen polyadenylaatiosekvenssin, SV40-viruksesta ·:· replikaation alkupisteen, SV40-edistimen, sekä adenoviruksen VA-geenin. cDNA-

• 4 I I

istute lambda-HEPOFL13-kloonissa (katso taulukko 6) istutettiin p91023 (B)- 14 105347 vektoriin, alavirran puolelle adenoviruksen pääasiallisesta myöhäisestä promoottorista. Tästä uudesta vektorista käytetään nimitystä pPTFL13.

24 tunnin kuluttua siitä, kun tämä muodoste oli transfektoitu COS-l-solujen M6-5 kantaan (Horowitz et ai, J. Mol. Appi. Genet. 2:147-149 (1983)), solut pestiin, siirrettiin seerumia sisältämättömään alustaan, ja solut otettiin talteen 48 tuntia myöhemmin. Tämän jälkeen viljelmästä saatuun supernatanttiin vapautuneen EPO-proteiinin määrä määritettiin EPO-proteiinille soveltuvalla kvantitatiivisellä radioim-munokokeella (55). Kuten taulukosta 8 nähdään, (esimerkki 6), ilmentynyt EPO oli 10 immunologisesti reaktiivista. Samoin määritettiin COS-1-soluista tuotetun EPO-proteiinin aktiivisuus. Erillisessä kokeessa vektori, joka sisälsi lambda-HEPOFL13-kloonista peräisin olevan EPO cDNA:n, transfektoitiin COS-l-soluihin, ja alusta otettiin talteen edellä kuvatusti. Sitten alustan sisältämä EPO kvantitoitiin jommalla kummalla biologisella in vitro kokella, 3H-trymidiini ja CFU-E (12,29), ja jommalla 15 kummalla in vivo kokeella, hypoksinen hiirikoe ja ruuatta pidetty rottakoe (30,31) (katso taulukko 9, esimerkki 7). Nämä tulokset osoittavat, että COS-1-soluissa muodostuu biologisesti aktiivista EPO-proteiinia. Western: in täplitysmenetelmän perusteella, käyttäen polyklonaalista anti-EPO-vasta-ainetta, COS-solujen muodostaman EPO-proteiinin liikkuvuus SDS-polyakryyliamidigeeleillä on identtinen ihmisen ·<· 20 virtsasta eristetyn luonnollisen EPO-proteiinin liikkuvuuden kanssa (esimerkki 8).

: Täten COS-1-soluissa syntyneen EPO-proteiinin glykosylaatioaste voi olla samankal- täinen kuin luonnollisella EPO-proteiinilla.

• « • · · « «· • · • · · V ; Erilaisia, muita promottoreita sisältäviä vektoreita voidaan myös käyttää COS- • ♦ « ·.· · 25 soluissa, tai muissa nisäkässoluissa tai eukaryoottisissa soluissa. Esimerkkeinä tällaisista muista, tämän keksinnön käytännön sovellutuksissa käyttökelpoisista • · * • · *·..* promoottoreista mainittakoon SV40-viruksen varhainen ja myöhäinen promoottori, • ♦ · • « ·;·* hiiren metallotioneiinigeenin promoottori, promoottori, joka on löydetty lintujen tai ·.· j nisäkkäiden retroviruksissa esiintyvistä pitkistä päätteen toistoista, bacculoviruksen 30 polyhedronigeenin promoottori ja muut. Esimerkkeinä muista, tämän keksinnön ··· käytännön sovellutuksissa käyttökelpoisista solutyypeistä mainittakoon E. coli, hiiva, nisäkässolut, kuten CHO (kiinanhamsterin munasarjasolut), C127 (apinan epiteelisolut), 3T3 (hiiren fibroblastisolut), CV-1 (afrikkalaisen vihreän marakatin munu- 15 105347 aissolut), sekä hyönteissolut, jotka on saatu esimerkiksi lajeista Spodoptera frugiperda ja Drosophila metanogaster. Nämä vaihtoehtoiset promoottorit ja/tai solutyypit saattavat mahdollistaa sen, että EPO-proteiinin ilmentymisen ajoittumista tai tasoa voidaan säätää, tai että saadaan muodostumaan soluille spesifistä EPO-tyyppiä, tai 5 että EPO-proteiinia tuottavia soluja voidaan kasvattaa suuria määriä kustannuksiltaan alhaisemmissa, helpommin säädettävissä olevissa olosuhteissa.

Ilmentämisjärjestelmä, jossa nisäkässoluissa toteutetun ilmentämisen edut saadaan säilymään, mutta joka tarvitsee vähemmän aikaa muodostaakseen erittäin hyvin 10 ilmentävän solulinjan, muodostetaan hyönteisen solulinjasta sekä DNA-viruksesta, joka lisääntyy tässä solulinjassa. Tämä virus on nukleaarinen (tumahakuinen) polyhe-droosivirus. Sen perimä muodostuu kaksijuosteisesta rengasmaisesta DNA:sta, jonka pituus on 128 kiloemäsparia. Nukleokapsidi on sauvan muotoinen ja sen on todettu pakkautuvan kahteen muotoon, sulkeutumattomaan muotoon, jolloin virus on peit-15 tynyt kalvolla, sekä sulkeutuneeseen muotoon, jolloin virus on pakkautunut prote-iinikiteisiin infektoituneessa solutumassa. Nämä virukset voidaan saada lisääntymään tavanomaisesti in vitro hyönteissolujen viljelmässä, ja niihin voidaan soveltaa kaikkia eläinten virologiassa käytettyjä rutiinimenetelmiä. Solujen viljelyalusta on tyypillisesti ravinnesuolaliuos, joka sisältää 10 % sikiöasteisen vasikan seerumia.

·:· 20 : In vitro, viruksen kasvu käynnistyy, kun sulkeutumaton virus (NOV) tunkeutuu soluun ja liikkuu tumaan, missä se replikoituu. Replikaatio tapahtuu tumassa.

:/♦* Virusaltistamisen alkuvaiheessa (8-18 tuntia infektion jälkeen) nukleokapsidit • · · ·.· : kerääntyvät tumaan, jonka jälkeen ne työntyvät plasmamembraanin läpi NOV- ♦.· · 25 muodossa, jolloin infektio leviää koko soluviljemään. Tämän lisäksi jotkut nukle okapsidit jäävät tämän jälkeen (yli 18 tunnin kuluttua infektiosta) tumaan, ja ne sulkeutuvat proteiinimatriisin sisään, jolloin muodostuu polyhedraalinen sulkeuma- • · · ·«·* kappale (PIB). Tämä muoto ei aiheuta infektiota soluviljemässä. Matriisi muodostuu ·,· · proteiinista, joka tunnetaan nimellä polyhedriini, molekyylipaino 33 kilodaltonia.

30 Kukin PIB on halkaisijaltaan suurin piirtein 1 mm suuruinen, ja kussakin tumassa « • · · voi olla jopa 100 PIB-muodostelmaa. Polyhedriiniä muodostuu selvästi suuria määriä infektiojakson lopussa, ja sitä voi olla jopa 25 % solun koko proteiinista.

16 105347

Koska PIB on merkityksetön in vitro replikaatiojaksossa, niin polyhedriinigeeni voidaan hävittää viruksen kromosomista sen vaikuttamatta lainkaan viruksen in vitro elinkykyyn. Kun tätä virusta käytetään ilmentämisvektorina, niin tällöin polyhe-driinigeenin koodausalue korvataan ilmennettävällä vieraalla DNA: 11a, joka sijoite-5 taan polyhedriinin promoottorin säätelyn alaisuuteen. Tämä johtaa viruksen feno-tyyppiin, joka ei muodosta PIB-muotoa.

Useat tutkijat, joista mainittakoon erityisesti Pennock et ai. sekä Smith et ai. ovat käyttäneet tätä järjestelmää. Pennock et ai. (Gregory D. Pennock, Charles Shoema-10 ker ja Lois K. Miller Molecular and Cell Biology 384, sivut 399-406) ovat esittäneet bakteeriperäisen proteiinin, β-galaktosidaasin, suurten määrien ilmentymisen, kun geeni on ollut polyhedriinin promoottorin säätelyn alaisuudessa.

Smith et ai. (Gale E. Smith, Max D. Summers ja M. J. Fraser, Molecular and Cell 15 Biology, toukokuu 16., 1983,sivut 2156-2165) ovat esittäneet toisen ilmentämisvekto- rin, joka on saatu tumahakuisesta polyhedroosiviruksesta. Nämä tutkijat ovat osoittaneet tämän vektorin tehokkuuden ihmisen β-interferonia ilmentämällä.

Syntetisoitu tuote todettiin glykosyloituneeksi ja se erittyi hyönteissoluista odotuksia vastaten. Esimerkissä 14 kuvataan plasmidin, joka sisältää polyhedriinigeenin Auto- ·; 20 grapha califomica-hyönteisen tumahakuisesta polyhedroosiviruksesta (AcNPV), : muunnoksia, jotka mahdollistavat EPO-geenin vaivattoman istuttamisen plasmidiin : siten, että se on polyhedriinin promoottorin kopioitumiseen kohdistuvan säätelyn • · alaisuudessa. Tuloksena oleva DNA transfektoidaan yhdessä villityypin AcNPV- • · · ; viruksesta peräisin olevan täydellisen kromosomi-DNA:n kanssa hyönteissoluihin.

• * · ·.· * 25 Geneettinen yhdistäminen johtaa siihen, että AcNPVC:stä saatu polyhedriinigeenin alue korvautuu plasmidista peräisin olevalla DNA :11a. Tuloksena oleva yhdistelmä- • ♦ « • · *···' DNA-tekninen virus voidaan tunnistaa virusjälkeläisten joukosta sillä perusteella, • · ···* että siinä on DNA-sekvenssejä EPO-geenistä. Kun tällä yhdistelmä-DNA-teknisellä 4 4 i. · viruksella infektoidaan uudestaan hyönteissoluja, niin sen voidaan odottaa tuottavan :’ 30 EPO-proteiinia.

17 105347

Esimerkkejä EPO-proteiinin ilmentymisestä CHO-, C127- ja 3T3-soluissa sekä hyönteissoluissa, esitetään esimerkeissä 10 ja 11 (CHO), 13 (C127 ja 3T3) sekä 14 (hyönteissolut).

5 CHO-soluissa tuotettu yhdistelmä-DNA-tekninen EPO, kuten esimerkissä 11 esitetään, puhdistettiin tavanomaisia pylväskromatografisia menetelmiä käyttäen. Glykoproteiinissa läsnäolevien sokereiden suhteelliset määrät analysoitiin kahdella toisistaan riippumattomalla mentelmällä [(i) Reinhold, Methos in Enzymol. 50:244-249 (metanolyysi) sekä (ii) Takemoto, H. et ai., Anal. Biochem. 145:245 (1985) 10 (pyridyyliaminaatio, ja samalla riippumaton sialiinihapon määrittäminen)]. Kummallakin menetelmällä saadut tulokset olivat erinomaisella tavalla yhtäpitävät. Täten tehtiin useita määrityksiä, joista saatiin seuraavat keskiarvot siten, että vertaamisen helpottamiseksi N-asetyyliglukosamiinille annetaan arvoksi 1: 15 Sokeri Suhteellinen molaarinen määrä N-asetyyliglukosamiini 1

Heksoosit: 1,4

Galaktoosi 0,9

Mannoosi 0,5 ·«· 20 N-asetyylineuramiinihappo 1 : Fukoosi 0,2 :''': N-asetyyligalaktosamiini 0,1.

• · • · ♦ • · · v · Huomattakoon, että merkittäviä määriä fukoosia ja N-asetyyligalaktosamiinia : 25 todettiin toistettavasti käyttäen sokerianalyysissä molempia riippumattomia menetel miä. N-asetyyligalaktosamiinin läsnäolo osoittaa, että proteiinissa on läsnä O-kytkeytynyttä glykosylaatiota. O-kytkeytyneen glykosylaation läsnäolo osoitettiin • · · edelleen glykoproteiinin SDS-PAGE-analyysillä sen jälkeen, kun glykoproteiini oli _· j pilkottu glykosidisten entsyymien erilaisilla yhdistelmillä. Erityisesti, sen jälkeen, kun :,.. ‘ 30 glykoproteiineista oli poistettu entsymaattisesti kaikki N-kytkeytyneet hiilihydraatit « *:· käyttäen entsyymiä peptidi-endo-F N-glykosidaasi, niin proteiinin molekyylipaino pieneni edelleen, kun se tämän jälkeen pilkottiin neuramiinidaasilla, kuten SDS-PAGE-analyysi osoitti.

18 105347

Puhdistetun yhdistelmä-DNA-teknisen EPO-proteiinin in vitro biologinen aktiivisuus määritettiin menetelmällä, joka esitetään julkaisussa G. Krystal, Exp. Hematol. 11:649 (1983) (pernasolujen lisääntymisen biologinen määritys) laskettujen prote-iinimääritysten perustuessa aminohappokoostumukseen liittyvään tietoon. Useiden 5 määritysten perusteella puhdistetun yhdistelmä-DNA-teknisen EPO-proteiinin in vitro ominaisaktiivisuuden laskettiin olevan suurempi kuin 200 000 yksikköä/mg proteiinia. Keskiarvo oli suurin piirtein alueella 275 000 - 300 000 yksikköä/mg proteiinia. Lisäksi ollaan todettu arvoja, jotka ovat suurempia kuin 300 000. Tämän yhdistelmämateriaalin tapauksessa todettu in vivo/in vitro aktiivisuuksien suhde on 10 suurin piirtein alueella 0,7-1,30'« vivo aktiivisuus: koe polysyteemisellä hiirellä Kazal ja Erslev, Am. Clinical Lab. Sei., Voi. B, sivu 91 (1975)).

On mielenkiintoista verrata glykoproteiinin edellä esitettyjä tunnusomaisia piirteitä niihin CHO-soluissa tuotetun yhdistelmä-DNA-teknisen EPO-materiaalin tun-15 nusomaisiin piirteisiin, jotka esitetään aikaisemmin julkaistussa kansainvälisessä patenttihakemuksessa, jonka julkaisunumero on WO 85/02610 (julkaistu kesäkuun 20. päivänä 1985). Tämän hakemuksen sivulla 65 kuvatussa vastaavassa, vertailevassa sokerianalyysissä fukoosille ja N-asetyyligalaktosamiinille saatiin arvoksi nolla, ja heksoosien jaN-asetyyligalaktosamiinin väliselle suhteelle arvoksi 15,09:1.N-asetyyli-· 20 galaktosamiinin puuttuminen osoittaa 0-kytkeytyneen glykosylaation puuttumisen : : aikaisemmin esitetystä glykoproteiinista. Toisin kuin tämä materiaali, tämän : t _, keksinnön mukainen, CHO-soluilla tuotettu yhdistelmä-DNA-tekninen EPO, jonka :.*·· tunnusomaiset piirteet esitetään edellä, sisältää merkittäviä, ja toistettavasti todetta- ·.· : vissa olevia määriä sekä fukoosia että N-asetyyligalaktosamiinia, se sisältää vähem- ; 25 män kuin yhden kymmenesosan heksoosien suhteellisesta määrästä, ja sen tunnus omaisena piirteenä on O-kytkeytyneen glykosylaation läsnäolo. Tämän lisäksi tämän

«M • I

keksinnön mukaisen, edellä kuvatun, CHO-soluista peräisin olevan yhdistelmä-DNA- ·;·* teknisen EPO-proteiinin suurta ominaisaktiivisuutta voidaan pitää suoraan verran- « « i nollisena sille ominaiseen glykosylaatiokuvioon.

30 ·;· Lääkärit ja/tai eläinlääkärit voivat käyttää tätä biologisesti aktiivista EPO-proteiinia, : : jota on tuotettu ilmentämällä prokaryoottisesti tai eukaryoottisesti tämän keksinnön mukaisia kloonattuja EPO-geenejä, eri nisäkkäiden in vivo hoitoon. Annettavan 19 105347 aktiivisen aineen määrä riippuu luonnollisestikin hoidettavan tilan vakavuudesta, valitusta antotavasta, sekä aktiivisen EPO-proteiinin ominaisaktiivisuudesta, ja loppujen lopuksi hoitava lääkäri tai eläinlääkäri päättää annettavan määrän suuruuden. Tällaista aktiivisen EPO-proteiinin määrää, jonka hoitava lääkäri on määrittä-5 nyt, kutsutaan ohessa samoin ΈΡΟ-hoidossa tehokkaaksi määräksi". Esimerkiksi hoidettaessa lampaissa munuaisten krooniseen vajaatoimintaan liittyvää, indusoitunutta, hypoproliferatiivista anemiaa, EPO-proteiinin tehokkaan vuorokautisen määrän todettiin olevan 10 yksikköä/kg 15-40 vuorokauden aikana. Katso Eschbach et ai.. J- Clin. Invest.. 74:434 (1984).

10

Aktiivista EPO-proteiinia voidaan antaa mitä tahansa sellaista reittiä, joka on asianmukainen käsiteltävän tilan tapauksessa. EPO-proteiini injektoidaan mieluiten käsiteltävän nisäkkään verenkiertoon. Alan asiantuntijalle on selvää, että edullisin reitti vaihtelee käsiteltävän tilan mukaan.

15

On mahdollista, että aktiivista EPO-proteiinia annetaan puhtaana tai oleellisen puhtaana yhdisteenä, mutta sitä annetaan kuitenkin mieluummin farmaseuttisena koostumuksena tai valmisteena.

... 20 Tämän keksinnön mukaiset, sekä eläimille että ihmisille tarkoitetut valmisteet : käsittävät edellä kuvattua aktiivista EPO-proteiinia, sekä tälle proteiinille sopivaa, : yhtä tai useampaa farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta, ja valinnaisesti myös muita lääkitseviä aineosia. Kantajien tulee olla hyväksyttäviä siinä mielessä, ··· V : että ne sopivat yhteen valmisteen muiden aineosien kanssa, ja etteivät ne ole « · « ‘ 25 haitallisia valmisteen saajalle. On suotavaa, ettei valmiste sisällä hapettavia aineita eikä muita sellaisia aineita, jotka eivät tunnetusti sovi yhteen peptidien kanssa.

♦ · «

Valmisteet on vaivattominta valmistaa yksikköannoksiksi, ja niitä voidaan valmistaa • · · • · ···* millä tahansa farmasiassa hyvin tunnetulla menetelmällä. Kaikki menetelmät ·, , käsittävät vaiheen, jossa aktiivinen aineosa tuodaan yhteen kantajan kanssa, joka : 30 kantaja käsittää yhtä tai useampaa lisäainetta. Yleisesti, nämä valmisteet valmiste- • i · taan siten, että aktiivinen aineosa tuodaan yhteen nestemäisten kantajien tai hienojakoisten kiinteiden kantajien, tai molempien, kanssa, sekoitetaan huolellisesti 20 105347 homogeniseksi, jonka jälkeen tarvittaessa tuote saatetaan toivotun valmisteen muotoon.

Ruuansulatuskanavan ulkopuoliseen antamiseen sopivat valmisteet käsittävät 5 mielellään aktiivisen aineosan steriilin vesiliuoksen liuosten kanssa, jotka ovat mieluiten isotonia vastaanottajan veren kanssa. Tällaiset valmisteet voidaan valmistaa vaivattomasti liuottamalla kiinteätä aktiivista aineosaa veteen vesiliuoksen tuottamiseksi, jonka jälkeen mainittu liuos steriloidaan yhden annoksen tai useita annoksia sisältävissä säiliöissä, esimerkiksi suljetuissa ampulleissa tai lääkepulloissa.

10

Ohessa käytettyyn EPO/cDNA:han kuuluu kypsän proteiinin EPO/cDNA-geeni, jota edeltää ATG-kodoni, sekä EPO/cDNA, joka koodaa EPO-proteiinin alleelisia muunnoksia. Yksi alleeli esitetään taulukoissa 2 ja 3. EPO-proteiineja ovat EPO-proteiinin 1-metioniinijohdannainen (Met-EPO) sekä EPO-proteiinin alleeliset 15 muunnokset. Kypsä EPO-proteiini, jota taulukon 2 ketju esittää, alkaa ketjulla Ala.Pro.Pro.Arg...,jonka alku on merkitty numerolla " 1"taulukossa 2. Met-EPO alkaa ketjulla Met.Ala.Pro.Pro.Arg...

Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on helpottaa tämän keksinnön ymmärtämistä, •; · 20 jonka keksinnön varsinaiset puitteet määritellään liitteenä olevissa patenttivatimuk- : sissa. On selvää, että esitettyihin toimenpiteisiin voidaan tehdä muunnoksia tämän keksinnön hengestä poikkeamatta. Kaikki lämpötilat esitetään Celsius-asteina, ja mitä ei olla korjattu. Mikronin tai etuliitteen mikro-, esimerkiksi mikrolitra, mikro- • · · V : mooli, jne., symbolina on "μ".esimerkiksi μΐ, μπιοί, jne.

• · « v i 25

ESIMERKIT

• · · • · • · « · · • * · • · ···* Esimerkki I: EPO-proteiinin genomisen kloonin eristäminen 30 EPO-proteiinia puhdistettiin aplastisesta anemiasta kärsivien potilaiden virtsasta · käyttäen olennaisesti menetelmää, joka on esitetty julkaisussa (Miyake, et ai.. J. Biol.

Chem.. 252:5558 (1977)) paitsi ettei fenolikäsittelyä toteutettu, vaan se korvattiin lämpökäsittelyllä 80°C:n lämpötilassa 5 minuuttia neuraminidaasin inaktivoimiseksi.

21 105347

Puhdistamisen viimeisenä vaiheena oli fraktioihin jako HPLC-kromatografisesti C-4 Vydac-kolonnilla (The Separations Group), käyttäen 0-95 % asetonitriiligradienttia sekä 0,1 % trifluorietikkahappoa (TFA), ja eluution kestäessä 100 minuuttia. EPO-proteiinin asema gradientissa määritettiin geelielektroforeettisesti, sekä analysoimal-5 la N-päätteen sekvenssi (21,26,27) pääpiikeistä. EPO eluoitui, kun asetonitriilin pitoisuus oli suurin piirtein 53 %, ja se muodosti noin 40 % käänteisfaasin avulla toteutettuun HPLC-käsittelyyn johdetusta proteiinista. EPO-proteiinin sisältävät fraktiot haihdutettiin 100 mikrolitraksi, pH säädettiin arvoon 7,0 ammoniumbi-karbonaatilla, pilkottiin täydellisesti käsittelemällä 18 tunnin ajan 37°C:n lämpötilas-10 sa 2 % TPCK-käsiteltyä trypsiiniä (Worthington). Sitten tryptinen pilke käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla HPLC-kromatografisesti käänteisfaasia käyttäen. Optista tiheyttä seurattiin sekä aallonpituudella 280 nm että aallonpituudella 214 nm. Hyvin erottuneet piikit haihdutettiin lähes kuiviin, ja niistä analysoitiin suoraan N-päätteen aminohapposekvenssi (59) käyttäen yhtiön Applied Biosystems kaasufaasiin perustu-15 vaa sekvenssin määrittäjää, malli 480A. Saadut sekvenssit on alleviivattu taulukoissa 2ja3.Kuten edellä esitetään, kaksi näistä tryptisistä kappaleista valittiin oligonukle-otidikoettimien valmistamista varten. Sekvenssistä Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (aminohapot 46-52 taulukoissa 2 ja 3) valmistettiin 17-meeri

20 TTCCANGCGTAGAAGTT

joka oli 32-kertaisesti degeneroitunut sekä 18-meeri • · • · « • · · t «

:T: CCANGCGTAGAAGTTNAC

0’: 25 joka oli 128-kertaisesti degeneroitunut. Sekvenssistä Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg « · · (aminohapot 144-150 taulukoissa 2 ja 3) valmistettiin kaksi erilaista 14-meeriä • · · • « • · ·

; TACACCTAACTTCCT sekä TACACCTAACTTCTT

IM ( C: 30 jotka kummatkin olivat 32-kertaisesti degeneroituneita, ja jotka eroavat toisistaan « « « i leusiinikodonin ensimmäisen aseman suhteen. Nämä oligonukleotidit merkittiin 5- < 1 4 alkuisesta päästä merkkiaineella 32P käyttäen polynukleotidikinaasia (New England 22 105347

Biolabs) sekä γ32P-ATP:tä (New England Nuclear). Oligonukleotidien ominaisaktii-visuus vaihteli alueella 1000-3000 Ci/mmol oligonukleotidiä. Bakteeriofaagissa lambda oleva ihmisen genominen DNA-kirjasto (Lawn et al.,22) seulottiin käyttämällä muunnosta in situ monistamismenetelmästä, joka kuvataan alun perin jul-5 kaisussa Woo et ai.,(47) (1978). Suurin piirtein 3,5x 105 faagia maljattiin tiheydellä 6000 faagia halkaisijaltaan 150 millimetrin petrimaljaa kohden (NZCYM-alusta) ja niitä inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa niin kauan, että faagitäplät voitiin nähdä, niiden ollessa kuitenkin pieniä (suurin piirtein 0,5 mm). Sen jälkeen, kun maljoja oli jäähdytetty 4°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan, faagitäplien kuvio kopioitiin kahdelle 10 nylonkalvolle (New England Nuclear) ja inkuboitiin yön yli 37°C:n lämpötilassa uusilla NZCYM-maljoilla. Tämän jälkeen suodattimet denaturoitiin ja neutraloitiin pitämällä niitä kulloinkin 10 minuuttia ohuen kalvon pinnalla, joka kalvo käsitti 0,5 N NaOH - 1 M NaCl-liuosta ja sitten 0,5 M Tris (pH 8) - 1 M NaCl-liuosta.

Suodattimia kuumennettiin vakuumissa 80°C:n lämpötilassa 2 tuntia, jonka jälkeen 15 ne pestiin liuoksella, joka käsitti 5 xSSC, 0,5 % SDS, 1 tunnin ajan, ja suodattimien pinnalla oleva solujäte poistettiin raaputtamalla varovaisesti märällä paperilla. Tämä raaputtaminen vähentää koettimen taustasitoutumista suodattimiin.Sitten suodattimet huuhdottiin vedellä ja esihybridisoitiin 4-8 tunnin ajan 48°C:n lämpötilassa liuoksessa, joka käsitti 3 M tetrametyyliammoniumkloridia, 10 mM NaP04 (pH 6,8), ψ 20 5 xDenhardt:in liuosta, 0,5 % SDS sekä 10 mM EDTA. Tämän jälkeen 32P-merkitty : 17-meeri lisättiin pitoisuutena 0,1 pmol/ml ja hybridisaatio toteutettiin 48°C:n ;' lämpötilassa 72 tuntia. Hybridisaation jälkeen suodattimia pestiin huolellisesti 2 x :/·· SSC-liuoksessa (0,3 M NaCl - 0,03 M Na-sitraatti, pH 7) huoneen lämpötilassa, V : sitten 1 tunnin ajan liuoksessa, joka käsitti 3 M TMAC1 - 10 mM NaP04 (pH 6,8) • · · *.· °c 25 huoneen lämpötilassa sekä 5-15 minuuttia hybridisaation lämpötilassa. Kaksi vuorokautta kestäneen, voimistavalla varjostimella toteutetun autoradiografian • · « • · *·..* jälkeen suodattimilta saatiin ilmaistuksi suurin piirtein 120 vahvaa kaksoissignaalia.

* · · « * ···* Positiiviset täplät otettiin talteen, ryhmiteltiin 8 kappaleen joukoiksi, maljattiin , · ; uudestaan ja seulottiin uudestaan kolmena kopiona, käyttäen kummallakin kahdella 30 suodattimena puolta 14-meerin liuoksesta ja kolmannella suodattimena 127-meeriä.

• *· Olosuhteet ja maljaukseen sekä hybridisaatioon käytetty 17-meeri olivat edellä esitetyn mukaiset, paitsi että 14-meerillä toteutettu hybridisaatio tapahtui 37°C:n lämpötilassa. Autoradiografian jälkeen koetin poistettiin 17-meerin suodattimena 23 105347 käsittelemällä sitä 50 % formamidilla 20 minuuttia huoneen lämpötilassa, ja suodatin hybridisoitiin uudestaan 52°C:n lämpötilassa 18-meerisellä koettimella. Kaksi erillistä faagia hybridisoitui kaikkiin kolmeen koettimeen. Yhdestä näistä faageista (josta ohessa käytetään nimitystä lambda-HEPOl) saatu DNA pilkottiin 5 täydellisesti entsyymillä Sau3A ja alikloonattiin vektoriin M13 DNA-sekvenssin analysoimiseksi käyttäen ketjun päättymisen dideoksimenetelmää, joka esitetään julkaisussa Sanger ja Coulson, (23) (1977). Ohessa kuvataan EPO-proteiinin tryptistä kappaletta (alleviivattu alue) koodaavan avoimen lukukehyksen nukleotidisekvenssi sekä siitä päätelty aminohapposekvenssi. Intronisekvenssit esitetään pienillä kirjai-10 millä; eksonisekvenssit (87 nt) esitetään suurilla kirjaimilla. Sekvenssit, jotka vastaavat jatkoksen yhtäpitäviä vastaanottaja- (a) ja luovuttajakohtia (d), on alleviivattu. (Katso taulukko 4)

« I I

I I I

« I

« i • · • · · • · · « « • · « • · · » · « • · · • « · • · · • · 1 • · • « • · · • · · • · · · 24 105347 o o o oooo o ^ in O tn o tn ° 0 <N <n i ' U(TJ u u re O O o m υ u co co rt ta μ cnO Ma m

v a υ u co υ υ υ <-i u w 2, 5? 2, ^ u H u P

rt U U U D O H < CO U rt CO rt CO rt H ου < u u

COcOCOUU-<Oom rt rt W O m CO < 3"< ° rt O

mu rt rtUCJOO O M «court CO < HU U M U

.rt eo . u co co Ο υ o u co rtcortrtcocoocna oo o m co u co o O < u a uni u co co co -< o co co UCOrt COUOOCjni rt cOCOrtmmmOUm m u co U COUOfnf-ι CO U OOrt U m C0u CU Cn CO u cococomocuoco m mumrt umoaumu

Urt m * U u O 0.0 co. co rtu cocOrt jjO^jUjrtrt u rt u u o o υ o ci m cocomcococoO*<<atnrt

mu m u rt o υ H rt m com urt ra m O tn O u CO

UUCOUCOOOOrt U COCO m. U COu O^HH M

murtrtuoöoco n comUCOrtmOU<mirt

. CO m · rt m U Pm <0 rt CO mu U rt rtö O 3 H 3 U

rtcou u u o O co rt u mcocou Mm H <u <0 to u

SirtMUrtCuurt ti) umrtCOCOuUJ^Cm mu u u co μ Η υ co co uu rtcococ^o^nourt ti 3 n urtoau υ u mm cou cocoHrtCruco m, co u . co u pn υ.οο rt .u co m cört m^j CU ^ O O rt uu rt co ra o H cj rt rt « co cou uu < o o rt u mu u mrtöofb m CO COCOCOrtCOyOHU-lrt am o comrjHcj rt co coco rt u ra co O en o «rt u U^rtMrtöuScO rt COcOCOcO COtcOUODm

• CO CO 'rt CO CO O O O rt rt COCO o m U (j · H O < ·—I U

Μ“ώυ«8υ^ω 3 cocoucortmOJouu rt U m U U -rt CU rj CO m mm U m « y P O rt m u co rt ucOrjUrj co m mm cococOmPp*rt>Su

Uru3m5C3<m co Ummcort0p9<0rt rt, m u. to rt π υ,ο υ co β co rt co !?,rt P au re ra aa u taOu^t-. u co cocomco^coprt;_),--<co «ti,UmraoOrjC0 m COrt«mfcpjjOv-4o<?5 ^ 3rtrt3ug<gco U “rtmcOrtuHOou^ 0 cOiiCOmrtoCOf-irt co cOcomcjrt^om^rHrt S .rt3.rturtH-UoC0 MrtrtrtcorttC*2m2°m

1 kJ {j r. f-n tO r 5 E-** t_j U aj ¢4} Q ö CO ^ (j ^ ^ O P

2 m^comUu^om co 2 « 3 M ™ <-> £ " H o £

*—< Ui> CT3 <j C3 r> O CJ> U CO

g a y CO 3 U 0 O {j rt « 2.°2°mC)2Hp3co rt rttjCO.3copo.ym to M CO rt rt m O U H CJ M.

tri rt ts M CJ Π O ri to f rv <3 O .CO·^ <J H LO U ^ « « s “ £ § 8 § a 3 rt“ f? | 2 s 3 g cO^UurtPOrHm (J rem COcom^j O >m f_. p-, m .mticOuUo'ob co co Uc0 00 C0rto‘p3Oc0rt

m 3 « 3 rt b oh ΟΟω rt co m m uH H o o m CO

ti «“u uco t; g ä ä f? ti 8*cd1 s 5. g 3 . S 3 g 5.¾ 852 «m|ää"PbGti äg-SSSgögÖ^äStiSgffS^gs? ' rt(>C0urtt_;t-.uO>^C0 ^COnm MtjO.--CU.-J« . . u3uuUHOt3otHu cortrtcort toP^ormco .utijä^ rt^.Ou rtaou cou rt SPfrt-HUHrtrt •tl Ui»UfoOoHc)0<i-Jo core e: α *-* u H 'rti ^ ^ ^ ‘ Om^cjcjCJcjUc—( H CJ u i-'orotiOcJfljH'w < cc ^ :· i· g 2 5 t s ö ö §s s> s ä ίί a a 3 s ‘ · 2 ?? 3 ? o u g tn O 5 «co rt u ra u H H «rt co rt

ti2uS3o3ogo rn COrtCOCOUo030Q.U

:: u2m cnrtmCjgu Ijort«O0C0mHrt<tnC

.ä3 ti g 3 ti · o g o rt coco « m co to ’ p o o < υ s i s S11 N 1 p | s! s listi

Uftim cortn < U o CO cou m ««nj Ortpurt m 3?u.titi)S Ο.Γ5 O .u rau rt rt rt n) P^H-irt ti’^COurtcOOM^ co rt rt COCOrtcOP^^Hm •j “ I “ “ “ ä i N 5 5; ssäs 105347

O O o o O O

o m o ^ o ΙΛ

LA"| \D CO ^ *—♦ (N

—c < r-H ·—1 cn r\j AJ AJ O ^ AJ to W) CO (3 Q C3

U U << H ^ to 00 ^ ^ Π3 <J CO

(J Cj O D- ^ ^ AJ Cd U Γ3 AJ CO

C3 tö < (/} tJ) CO *J CO CO CO AJ

i_j AJ u <0 Q AJ U*-JCO C3 CC O

Γ3 < O ω Γ3 <JC0^3 Π) U di}

<J CJ CJ M CO CiqCOCOCO C3 AJ CO

U <-> (J Cu GJ 03 C3 ±-* C3 aj c3 Ö U U H ^ CO CO CJ ^-1 CO Γ3 cj o α h <3 ^ ^ *-* ^ *“* cd u co cd co . cj t> ^ o to α <ΰ aj. co U 00 t_ u U 60 u, n J <0 ^ 00 V CO O JZ *-> CO CO aj CO rd O3&0 O GJ <£ μ-< AJ CJ 40ajW) cd u 03 u o o o> ^ co tf rJ ^ σ ^ co co) aj μ h u Q 2 ^ H O u u co u <; ►—< cj Ö0 « « H *->Qu

AJ U £-_, J3 AJ ω CO Cd U u u CO

CC U <) ii) ^ AJ 2v ^ ^ AJ

co co < «o a-j nj ^ JJ o AJ *3 · O D ^ -C3 CO Cd CO AJ Cd. w

u M < H ^ Cd fc? *-* j“[ u u CO

aj a o o ^ cd td ^ ti u t co CO CJ C_( £ AJ ?ft ^ 2, O Ό o cj<^u}Aj co to cd co co cd 5 to 5 ,2 aj ω * <J u cOUaj r-v aj to o “ u d ^ ^ t cd-^u s cdtoHCJ4JrjUcc^ couC0

O. rl Cd C, 1 AJ nUtO^AjCÖAJ

^ CO u O l-< u Οθ^υί? to ^ co a o H, « o o u ω “ · « ä « Jj ω • »—> n CO <- c/> aj tO t! ^ S to ^ u ^ CJ ϋΛ ϋ h ^ w CO . ^ to o u 0 o rj to r_, f», aj f. cd <j v a co 3 2u<45«>niJ'3S)^rto

r, Uf5—«^tin^CJ^CO^AJ

£ “ω<·5ω^τωα“π^υ r03 υπ^οω to rt · o, “ aj υ . aj H u*-JM«0::1oUtJ^u*-'*-i 7! u-, ^<^ηυ^ω u ^ aj ff aj h, „ ^ ^ co ^ ω 2, «s ^ aj u ro o >* t-1 ° oo 2 ro ° ° u etoStjCSn^M^u^Aj ^uR^ouSroco^u^o . ?:M5o<<5jAJrtAJ ro « u 11 ' μ UU'"<1'>'l«IJnCJrt ϋη“

1 ' ti M U U B. tj <-> to00 U ^ O

',..· 2" ro o θΜ“««^„ωω rj TOu H H aj ao^J O^AJ ‘<1 c-jTOijUOij'-’caUyU Aj

1 · U 00 id o < « 00 ro " u 00 *J

,·;·. f? m a ΗΜωί?υ^?α £? *-* ; J aj oo. S < ?>. u λ o «o o jo . w

< MOOcoE-i^oSfutf Aj OOAJ

<<· ^TOijUCJoflrtOOcjAJoo '! u « U Hi 65 "O M 00 O fl

t; O aj HC'-'TO 00 U ^-1 aj O CO

AJ 00 £) P C Sl u “ “ “ f u «ooaj < q u torooojj 2^ et «ο· <<ίωωω,2 oi o o

Saj^i h74aj ooto « to 2° : “α,^δ>ΰυ.ΑΑθοω2νω • u C3 m ^>>5 ω^“οο«° .: £ ω ii ^^fjAJtoooöjAj 26 105347 § s s s § g § §

S £ S S ^ ^ n H

o c o o o c u u Qj h w h u < h £ R ö h H

u o o χ u u a u a> < hh u 3 o 3 3 R C H

OD-opUOCOHCORHU

o >-i < u *-i oo υ o o ih h o u r 3 < R S 2 h h o o u < ω h ό h « o <; ο <5 < u · h hj’2 u2^<; ^ u < χ o > ο 5; o 3 u o H O <ä HRopcit-< r u a ·< co< u ^ R u ^ ^ b Ϋ O > i_, H O U aj U H O μ U f_, O R H U U O 2 < => R O O P CO o < o < R o < R R R R . R a ϋ U ^ ^ U iJ CO < H R X O · h ^ R R R R b 2

<^ocHrt co o o h r h a R 3 < y R Ö S

H tO <- R U H O OtOUP<CO<HR U < < U « U > o O U < ° < H H O O Ij o 3 3 R R R 3 , 55

u ra R R u co aj < χ o h < < a R H R R · 3 3 S

c-3 1-1 υ ο υ M u ω <i‘oc->c-u3RR<· 3 R ff

u<Hmu< co a 3 >,< “uRRRRRRR

O C R μ, H P aj o <5 h u < o R R R < Ro AJ

< --J R y H CJ aj ω U coU >^ U 3 R 3 R Ro u

u o R 3 u h cj CO 0Μ0ο,0<ί·0υ.0 H · u AJ

Ό C o c O P «j AJ u < R u uR R R R R R ij c^Ruhcjco aj o o < ^ hR R R < RR o

oo3<o-Jco U H j= U X o < RRR R R R

o h R 3 h m co O R x < o o R h Ry R O.u

o ^ R rt o x ra AJ Huoco u u R R < · R R M

1? RRP^R3r£ RfR^Rölö<HH^ I ä Hgs.g g.y s y < § i £ 2 RRÖx S S5 R g § | < R g u * f? g « S S g o R 3 r | R < RoR.hR.u

S g R^S'S. g3 o RRRÖ R g g o R <o AJ

I a <rr^ 2 g rrr^rR rrE rr a 1 g rröR’? a §S§1 < §§ h r p g H 2 R rR22 2 3 3¾¾ 3 g | R 8 g § « g* o S S<hh R g g o g .0 s.5 ,;«' g r^RoS’R <oRbRRooo<|y2 2 R>82R3 f? 8 £ < χ ' 8 d*g g'8 g'o | ä :/ ^y^R<^bR«RgRRgoRoooo ::> ? ^ s s “^y“ < y y sI-ss·§§ · cooRho-uaj o<<!-juR3RS2 3<?oo

.: ra82<tnrao<1_,-2>p<;HU<5yo<CUU

• Uf_coo<;ucjoaiU'-<oRR3RoR<iu <t* 4-J 0 p O ^ ^ u y-'CO^1 ^ · O ^ ^ μπ'κτ* O cd uRRo>c0AJOr-Aui:A<y<y<y<<u Ο π « t-1 tO CJ CJ ζ_5 •‘i ^ . -a f*s c_j ζ) . aj R P < A-t CO O uduo^U'iU 'i ^gh" • « OOu:=; « u, U^HOJ o yR'RR RR <C0 o uro^w^j o<uooRR3yRRoAJ 0o.-(HCJC0PHCi.'-JcJoPRRr3RRF-<0 CO R<UO re AJ < u H x; o yR RR RR Caj aj r-T^PPAJ co O<|H0jf-|Uy3Ryy fin

·. u <h. ta U < °^i;,u ^'< 2 μ o o <: M

: ΜοουϋηυυΜ'53'-33 5ο^<ο<ω • ω R^UP u Λ ^ < < Ro Ro hR O aj R,5riHOAjeOHoUlJU C>P<OMOAJu ; co R_o u J coaj HU uh HU h c » 27 ; 105347

Esimerkki 2: Ihmissikiön maksasta saadun mRNA:n Northern:in analyysi 5 ug ihmissikiön maksasta saatua mRNA:ta (valmistettu 20 viikon ikäisen sikiön maksasta) sekä aikuisen maksasta saatua mRNA:ta käsiteltiin elektroforeettisesti 5 käyttäen 0,8 % agaroosi-formaldehydi-geeliä, ja siirrettiin nitroselluloosalle menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa Derman et ai.. Cell. 23:731 (1981). Tämän jälkeen yksijuosteinen koetin valmistettiin M13-mallista, joka sisälsi taulukossa 1 esitetyn istutteen. Alukkeena (primeeri) käytettiin 20-meeriä, joka oli saatu siitä samasta tryptisestä kappaleesta kuin alkuperäinen 17-meerinen koetinkin. Tämä koetin valmistettiin 10 menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa Anderson et al-.PNAS. (50) (1984), paitsi että entsyymillä Smal pilkkomisen jälkeen (jolloin saatiin toivottu 95 nukleotidin pituinen koetin, joka sisälsi 74 nukleotidin pituisen koodaavan ketjun) pieni kappale puhdistettiin M13-mallista kromatografisesti Sepahrose C14B-kolonnilla liuoksessa, joka käsittää 0,lNNaOH - 0,2 M NaCl. Suodatin hybridisoitiin 12 tuntia 68°C:n lämpötilassa tällä 15 koettimella, jota kului suurin piirtein määrä 5 x 106 cpm, pestiin 2 x SSC-liuoksella 68°C:n lämpötilassa, ja niillä toteutettiin 6 vuorokauden pituinen autoradiografia voimistavaa varjostinta käyttäen. Näytteiden vieressä ajettiin yhtä ainoata 1200 nukleotidin pituista merkitsin-mRNA:ta (merkitty nuolella). (Kuvio 1).

20 Esimerkki 3: Sikiön maksasta saatu cDNA

I 1 1 ' —1 (Hl i i 4 i »ti

Ensin valmistettiin esimerkissä 2 kuvatun kaltainen koetin, jota käytettiin vektoriin

« I I

lambda-Ch21A (Toole et ai..Nature. (25) (1984)) valmistetun, sikiön maksasta saadun ««· ί#5 J cDNA-kirjaston seulomiseen tavanomaisilla faagitäplien seulontatoimenpiteillä (Benton n» V · 25 Davis. Science. (54) (1978)). Kolme erillistä positiivista kloonia (joista käytetään ohessa lyhenteitä lambda-HEPOFL6 (1350 emäsparia), lambda-HEPOFL8 (700 emäsparia) • * · sekä lambda-HEPOFL13 (1400 emäsparia)) eristettiin sen jälkeen, kun 1 x 106 ··« • · ···* faagitäplää oli seulottu. Sekvenssit kloonien lambda-HEPOFL13 ja lambda-HEPOFL6 fj · koko istutteessa selvitettiin sen jälkeen, kun ne oli alikloonattu vektoriin M13. (Taulu- a · « 30 kot 7 ja 5, vastaavasti). Sekvenssit määritettiin vain osissa kloonia lambda-HEPOFL8, a >«· ja loppuosia pidettiin identtisinä muiden kahden kloonin kanssa. (Taulukko 6).

• 1 4 I

Luentavaiheen läpikäymättömät 5-alkuiset ja 3-alkuiset sekvensit esitetään pienillä kirjaimilla. Koodaava alue esitetään suurilla kirjaimilla.

JO

105347 OM O CrtO V-/f—< d U rt O O J-< 6—< O U O O V) 00 cc U O o o>s< o ~ o O M O OOH OOO CNCJO ^

i_j HO OO r\ >J s -sj h ^ Ό <« O COHO ·—* LO <C ^ 00 H —« H

rt to S CO H 00 rt O 00 CO rt O rHU O O CO o no HO UJH HO h H H<i ^ O rt H ·—< H J-«0 4J UH HO CO *-< < OO <0 >0 h< M tD < HO rt O C H CO CO rt O rt o o o

<j H< <TH .—<<£·* ui <! h-<C η<Ξ HO h O ~ H

CO 00 >0 OO < < OO OO <0 <0 H H

CO rt

S> O O < 30 DO CO CO w C 3 < n H

ra +j HO o) H ·—ho *—i O H ^ r—<<. ~ O

u jj no uh 00 00 00 H c 00 h< O 60

M ^ OO 30 CH H O MU H H W O HO

uh y h ra < ran no « c c c _io 00 <-5 >0 <0 <0 o c <0

60 O

if O c O HO 30 30 30 -IO CO CH

CJ u OO c C OH h < u H CH H C o O U OO HH O H OO OO >0 OO <0 c 63

ff if OO too no n O HO OH C U nH

o CJ OH nO oO raH ra H h c HO OO

te ο 00 cc oo < u e >0 ero <0 h<

OH 30 CO O 630 raH CO C < OO

H CO OO Hereto no HO OH H O *n H

α O HO OOeoOH CC <0 OO OO H< rt e H CJ OO 30 co O CD O 3 < CO 30 n<

C> Jr u OH OH H< e C h <j H< CJ H ~ O

0 cj CJ 00 o o 00 o< 00 OO O O H< 01 e ra ”3 ω if HO HO 3 < O. O no 30 OH C3< 35 ΌΟ raH —i <; no OO OH HO no § CO H >0 OO HH COH OO <0 <0 i-1 cj cj 00 cd C raH rao 30 00 0630 oco 63 OH ono OHO OHO OOH Ono huO ooh

(J OO H<o 0<0 era C O hOO σ\ H U —"CO *~* — U

o

ϋ OO no co H nH 30 30 cH O C

JJ OH CJ O CJ C O C < OH H< OH __n H

CJ OO CO C CO O H HH OO OO OO HO

CJ

HO HO HO CJ O rao HO 3 O CH

OO en < HO JC H HO no OH ·-; O

O toH <0 O O HH <0 HH OO < n | n ' u OO W H no CH 30 OO nH « j~*

u OH H e U OO to C OH no O O *-< O

‘ O OU co O H H C CC OO HO H CO

u . * ra oo rao no h h e o co no n< <· r) LO H ·—i H -rtO rt H *—♦ O «—1 < O ,h· ^ u M < H< > O OU OU H< % * CJ a H 30 CJO en C CO no 30

CO OH CJ H HH h < H< CJO raH

e OO OO hC OC OO OH OO <w ο

• S HO 600 cH no HO nH n U

; u ho n o ·κ « e oo no rao rao ^

. HH CO CC H < HH OH O < < O

. . -u ♦ ^ CoO OC 30 HO HO CO 60 O ΠΗ * oh no h < co e raH-eme no *2 <:

' OO HO OO <o >o CC CO CO

. ’ . CJ

'·· ϋ HO OC rao OC 3*4 ho 3H o < ''· HO no HO no h< ra H a H no

: <J HH HU CO HO OO > O OO HO

63 a CU rao 30 ho h< ao >>o oh ... to oo ho hC raH raH raH ho no

' Cu CO <—‘CO oo >o >o OH OO HO

29 105347

O d O AJ CJ d CO AJ CO bO CJ

H (J AJAJCOdCJdAJAJ

—« <: o nj co d u oo d oo aj u aj co aj u u to υ

nuAJOtawiMAJ

ducjdcJbocoAj 3 o ucOAJddAJud

—1 c udcjdcobOcjAJ

O O dCJdAJCOCOdbO

CJUdAJddCJAJ

>s O

•—i o o o

AJOOCJAJCJAJdbO CJ U CO CJ [J AJ CO AJ

Aj <J CJCOdbOOOCJAJAJ

JO UdOOdAJdAJAJ

• H< AJOrtunjnoAJ

o aj co bo co to cj co OCJddAJdCJd Aj O dCOCJCOAJCOCJd is < odOdAJCoucj

HH uUAJCOdAJCOU

3 O (U H J O

d AJ CO d (3 CJ d AJ

CJ CJ AJ U d CJ CO 00

MO CJAJCJAJdddbO

Cs < AJCJdAJCJtOdCO

,-J < dbOddCOAJCJOO

AJ OO CO CJ aj d to AJ

ra co co co o co co d

30 CJOOddCJOOAJCJ

CJ H COdCOdUdCOAJ

jo cocodcodcjcou S w o cd ό <0 3 ;·-> CO OcJbOCJdAjAJd AJAJu dcotOAJOd Ό >>< UCOOOCJCOCOCJCOd (-, I—I o cjuooboucoucod S oo rautodAJdUAJd XJ uubObOuOAJOd 3 uodddiJOAJra .-3 o coo AJdouodduro 3 m aj o codAjUAJcjooro 3 —<<U AJbOcjcjucjcobOd c 1

3 O

OJ H

JO 00 jj AJ AJ co cod CO CO d • I , coudcOdAicoAJd

' OO COCJCJCOCOUAJCJU

1 JH njAJd a aj cj d co υ < JH CJCJCObOOdCJCOd I; odAJAJOUCotoo < odAJcococobocj ... 3H <CJdCJCJCJCObOd • to< .ocouddAJOAJd ,,,‘ < <3 E-HOCOdCOAJddd • , ·· U o ^ Ö0 <

CJ O O k U

WH rt<< u « . y d aa u to to

CJ CJ u CO A-J AJ

< · WO Cu CJ CJ U 00C0C4DU CO O

< l >^< C0< u CiODOtOAJ ijG O

£-f I—( < c_n A_i XJ &OCOW

u ciOdw u &d w co

Cjq3CJUC3CjCOr3 JO tsOUUdtOAJUd d

, dHJOduUAJAJOCOU

• >OOOUAJAJdAJAJAJd CO < w < • wo jt o U H<"dobOUdtJdco

' UdAJUbOAJUAJ

;; oo cooaodcouAJUAJ

· JH AJObOdbOdbOOdd .,, (a h <;<AJCoöocoMddu • cocod d d co to aj ,,,1 4jtjdoW)Ajeoo

, 30 <n O AJ d aj o CO bO bO CJ

oHKcsO cj u u coaj aj aj d .,, JObCOHbOUAJCOAJUCOd 30 105347 f? O to OH ho W O WH 3 0 3 u

U 00 m S U HO 0>^< Ο Λ O Or-jO OOH

oo o to HO OO OJ J < <3 H <C V0<.0 COOO

to to CO

ο o u υ o utoHoo 3 o wo co 3 p o u Η Ο Η Η h O H H p< 3 U Ο Η Π O < O H < oo < o

S « Π < Π O CO C H cp CO

u co Π <2 <dH I—f -<i * w <3 ·—< < h <: μ η ο ο > o oo < < OO oo o to

r\f\ I I

u to to U O < 30 3p >pO >>p

v ¢3 >—<I < Di u OH 1—(< r-HO rHO

u CO XU HO κ4 H OO oo OO

O CO

M U Π Ο Π O 30 CH HO top <H C H <D H W <T ton

>o HO HO << p>o < O

υ u O m H O H O M p 3 0 P p 30

Μ μ Π Ο Π O >n < <D H H< CJ H

U αΟΟΟΟ HH H H OO HO

to to

O to (+~ H O OO too Cp iJO HO

ra o Μ H H H H CO op CH 3 H

o o t 2 < Π O << o< Η < > O

OH 30 WO tOO CH

o to COHO H < H H O C O H P

to u te HO OO CO O H <. < <0 CO a to S3 COO 30 wp wp 3 < u to to w h qjh h ·< h *5 η λ

CO o μ υ HO HO 330 H *2 OO

Q O U to

*r4 to O WHO ,—lO 3 *3 HO VaO

-¾ oo chh<2 mo a u

J2 w H 3> O OO HH coH

33

03 U CC U

[H u to OHO to < 3 H (00 30

tCp DOWHOPOOHOOHOOcjH

O U to HO —I < O H|<0 W| < o HHO

to CO U

CO CO CJ

O to O 30 O MO COH MH 30

U tO UHH 0JO33HO >>< OH

O 4-j 3 HO CO< COOH HH HO

ο to tO

> HO HO >, O 30 30

, WOw<HO-CHHO

υ u to CO H <0 OO HH < o ,. o o to SS ώ O O CO H MO CH 30

' ‘ . m to m H H 33 Η Ο J3 O cn<3 CJ H

. U 3 tl HO CO O H H < << HO

' · tO CJ Η

* tj u CJ

'* COM MOO (DO MO H H HO

* uu CO U2 H ' I H rCO CH i—tO

,,. H0H<H<>000 * * ·

(J (J to OH 30 (DO W < CO

, . 3M (3 H H OH h H H< H <3

· o O (J HO HO H <3 H < OO

CO M O

V U o u U UHO MU CH P O Cup cou coaiO ^ a ^ ~ O pp

. uco UHH < O < << H< HH

• to u to

. M O CJ

OO 0< 30 HO HO

WHMOH<w<3H

• HO HO OO <0 > U

• a to to ' to 3 to _ .

OO OHO 0< 30 0< 3< ,, tO 3 OHO MO HO MO H<

'< m to O H H HO <0 HO OO

,,. O CO 3 CO M o ,,, OO M<iO 30 30 Ho H<

m O COHO HO H< 3 H 3 H

O U tO < O —I < o oo >o >o 105347 O w H O w ο O ra <|

Ο α O rsiocj H <J

r<w< huiH -ί-1<ι

HO GO MO

«Η h H wo λ] P

>0 h < <U £ < Π3 O C3 O OJ O .

<3 8 <0 Π £ £ g >, <j H <3 .CO £ £3 J < OO H <5 C. H O O C-U l, c ,

10 C >,< 5< £, P

<0 o-2 <.0 p p —10 CO «Η -, ,,

OH —I < HO jy H

>0 00 <0 ,2 c_) » b «^ ϋ h ^0 *H<; ’—I w Γ-”! ^<r· =O <0 H< ,j ^ co π <: ϋρ _u

CJ H h 0 —1 e—* „ H

OO OO H < ^5 c3 .

y Hccn-co^o -¾ O O H O H < ^ VO 30 «Η <*><-- Ό CJHHOWOji'g o oo^oco^o; 2 3 OOO MO 0 3 0 _ ω„ "3 OUO^^OOGH^Ff^

§ tM^U h<u HJU

H

3 0 3 Η Ο «ί - ,,

H < O H W O 3 P

OO OO OO ,2c5

0.0 30 CH GO

I WOGH'-jP_£P

, H H -30 <io £ £ 11 OOWHCHC,_

;;: i8 38 IS

'•I is ss S8 . . OOH<OH^p . WO 30 CO ^ „ ·. cjowH-jor^ WHOO^O^^ w H WO CO ,_< rj

00 00 h 0 „ P

W H w < <0 > £ • CO MO 0.0 tst <* °. -»ra-CWOraC^g ^ <3<o<o^^ < —ΙΟ 3H O < .. ,, :: c h o h w ο ϊ p :: >oHono££ ; 3 o >> o o h _ ,,

· oh ho wo =P

‘ OH OO HO J3 £5 32 105347 U i->

irä Shi “Ί Η tn O m H 3 U COOmhomU

ff hn -raH? O >, < O — O 0--10 ooh* O o O rj a O

U to HU O O H H 5 < H < o<o «HU -o< J £ h ra u

U U

trj U OH HO O (J <UO CO ra O H (J C)0

u u HO H H 1—i O h H H < ( o QH .h H

° u u i-1 HO <0 h < oo < o >G h <

M tO

^ <i ~ U 3 0 CH do CO CO «o U M H <H hi< -k w -ra h < J; < ΰ g, oo^ > O oo < < oo oo <o < o

CO

a-1 n tri o 0< 3 0 3 0 >n o u u cn O to ~ < d u oh —i <ο -h o 2Γ o "5 υ ω 3:u ho n h o o oo oo n <2 oo to o

-op OO ao CH HO too ΠΗ en O

< H U H OH W < W H MO ra < >, < > O HO HO < < > O < O <0 H< o u ^

U ^ >^0 ><0 U o 30 30 30 C

·—}CJ) H-) O <Z O H »—< <C CJ f—' Π3 H -—<·< ä ä ^ ^ HH hh oo ho >o oo U ra U MH H o OO too MO mi o HO n H rao ra ογνιηη h h m|o oo OH raH -m < ho u u I H < HO < < o < H < >0 ~ o < o

OH CO CO too ra H CO

ra ^ H HO H < H H O MO i—iO OH , {O

H O d^ HO O O OOH < < <0 HÖ OO

to ra co

O ä £ S H S H h < = <2 -3 S

^ d O o H O H O H 5 OO OO HO

to o to S M u ra -o ho c < cJ o mo co ra h ra5 ho raH '—i < mo oo oh ho

3 OH > O OO HH OH Ho < O

3 ra to ra

<3 ^ 00 ra q O to< OH rao CO OoOtoO

H to -Ml to H H OMO OHO OHO O a H o M o —< m o ra ra to ho —i < o <η<ο < u h _o o c-. h o — <o to to u I ^ to CO u

ra to u OO MO to H mh CO CIO CH

ra p ra n h cjjooHO hJ -ra OH nj < OH

ra Ml ra HO ora < to O H HH HO OO HO

CO CO ( H O Hio HO OO CO HO -Ό ,, -o C|< -o HH HO MO 5h i ra to to h <; o olo hh <o hh ho '1 u to , i . —i v- ura

!! «3 Öpp tn H MO CH CO OO MH

<!« CO i~J t~1 — >%Ιθ 3 U 00 <c o O '—O — o 2 UHO OOH HX < < no HO H < u u 1 ^8 • ^ ^ 3>0 OO ^ O '—'H >-.0 30 30

<♦ u CO 3 H -—H H -30 3H *h o --O

*; OO ^<H< >0000 0 H< ^ CO OH 30 OO C0<: CO ^o 30 C O r~* O t—' r—i fc—* <1 ♦—( o CJ f-* < * u ^ OO oo ^ < 0< OO w μ oo ' ! -U u u u ^ O o O cc O Cr- ^ O O O UH uo

υ O OO U O tX OC <C -30 UO OO O O

CO o H h <CO <C*^ H<C Hr- OH OC

u co •e u u \

• OO 0< 30 HO ·—^ O 3*0 to O

Hra- m h> —' < ra < ra H ra1 <; m -j

. „ HU HUUU<UHU<I<<U

; u o i ra to

u u HU o< rau o< C< HU CH

< ra u HU mu —<u mu h< raH cjh

;; “ ra HH HU <U HU UU i»U HU

' I MO

ra P < u rau CU HU H< 3U -ra U

i ( ra ~ ra p u h< ran raH oh —i u

, ra to < O — < O UU >U HU HH OO

( 105347

o M < 0Π30 LJ U TO CO ro» 60 60 U

<2 '--•-jo iJAJMiroUrrjiJAJ

_ _j <- — Co ro ton u m ro co o CJrolcOroiUUCOU ro u ij υ ro co oo o rouuroucotoo cc o 30 uto-uroro-uoro w n ^ < urourocooooLj

Co O o roon-uooooroto uuroijrorooj-' o o x o xh r? u

Cl, H U O

u oo u o u j-> ro oo UOtCUUJ-loO-u ro H ^ C uoorooocouijij .n o — o uoeonronroiro t-i<^ H e j-iurounrooro u -u co co oo to u eo uuranronon o. o t-^o rooouoc-uocuro co e h e urooro-i-icooo <(_o H H u u ro to n ro co u ro H 3 0

^ o 1 M

CO -Jo rorotonrouroro u o ro u ro u co cc ro h w p uouorororooo x: o ^ h roonroueoroeo H e -J e neonneorouto o to co u ro ro 60 o ro co co co o co co ro au "o <joonnocoroo -ro f—< roH ooraconuncoro n < "Jo ooeoro oo ro u co u M u < S.2 a x u ^5 ro t3> H < o < n oouutouoijijro H- -Ljouroooooouro O Cole >> < a COtOU 6063U coro J2 roo "io uuoooouoooooro X) < o oo nuconroouroo 3 ootooouaj-iaro

-ro _ uurororoouxjQ

2 o ro o o tJO rorauuunnon 03 noo l-, ro o cc n ro o ro u u oc H — -Jo — <u rocouuoucotcn

° < ·= P

ro O roro;

CL, O -JO CO

i Ljojjtotorotoocro ‘, 1 touroeororoeoron ro h ro o ccuucoccurouu , "O — roi ro-urorouoroeou i <o "n uueoeounutoro ,' jroo-uuucocou oro-ucooocotou < ro h roro; coroouueotoo i "O C 1ooouroo-LJU4Jro 1 co cc Hutoroeo^roroa •

• ro C ro O O CO C

-j cj ro o o e, o

• to h oh "CC

ooororoucoco

u u u ro ro ro oo 4J

• no e, o cxouucococouroo • h;u > C tn e o co co co ro ro a ro CO HH CO-rorocOoocJCOnro uoonrouoocuco urouurorotoro roo -jo >> o o u ro to ro u ro ro —«O 3H —lOrocuroroucou j co o-o o o u ro ro rorojjoro e. o cl e ro e • ΙΛ e ro o j: o

CO CO H C

rocjcounutito lUOroucOroU ro OC 30 caouynccurouro ' roo e h roo ooro coro oou ro ro ' JX. o H j r-1 CC ro 60 oO CC CO n (Uu oo cl. ro ro ro <Λ oo 4-i

LiLJroUtOLJbOLi OH 30 ttoronroocococou roo 3 H — O u <J u co ro ro ro n c_0 4-5 0 L6 OH 600 ro 60 ro o to n 34 105347

Taulukoissa 2 ja 3 nukleotidiketjun alapuolella esitetty, johdettu aminohapposekvenssi on numeroitu siten, että kypsän proteiinin ensimmäiselle aminohapolle on annettu numeroksi 1. Oletettu johtopeptidi on esitetty kirjoittaen aminohappojen lyhenteet suurilla kirjaimilla. Tämän lisäksi kypsän proteiinin kysteiinijäännökset on 5 merkitty kirjaimin SH ja mahdolliset N-kytkeytyneet glykosylaatiokohdat tähdellä. Alleviivatut aminohapot tarkoittavat niitä jäännöksiä, jotka tunnistettiin määrittämällä sekvenssi proteiinin N-päätteessä, tai määrittämällä sekvenssi EPO-proteii-nin tryptisissä kappaleissa, kuten esimerkissä 1 esitetään. Osittaisella alleviivauksella on merkitty tiettyjen tryptisten kappaleiden aminohapposekvenssissä ne jäännökset, 10 joita ei saatu määritetyksi yksiselitteisesti. cDNA-kloonit lambda-HEPOFLö, lambda-HEPOFL8 sekä lambda-HEPOFL13 on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, josta ne on saatavana tunnusnumeroilla ATCC 40156, ATCC 40152 ja ATCC 40135, vastaavasti.

15 Esimerkki 4: EPO-geenin genominen rakenne

Haelll/AIuI-kirjastosta peräisin olevan neljän riippumattoman genomisen kloonin (lambda-HEP01,2,3 ja 6) suhteellisia kokoja ja asemia esitetään kuviossa 3 osittain päällekkäin menevillä viivoilla. Paksunnettu viiva osoittaa EPO-geenin aseman. 20 Kuviossa esitetään asteikko (kiloemäspareina) sekä restriktioendonukleaasien < « < * : ; tunnettujen pilkkomiskohtien asemat. EPO-geenin sisältävän alueen sekvenssi « i ·

määritettiin täydellisesti molemmista juosteista käyttäen eksonukleaasilla III

* · « aikaansaatujen ohjattujen häviämien sarjaa koko tässä alueessa. Kuviossa 4 esitetään

Ml 'S *· kaavamaisesti viisi eksonia, jotka koodaavat EPO-proteiinin mRNA-molekyylejä.

• M

V * 25 Tällä hetkellä ei tunneta eksonin I täsmällistä 5-alkuista rajaa. Proteiinia koodaava osa eksoneissa on tummennettu. Nukleotidien täydellinen sekvenssi tässä alueessa • · · ·...* esitetään taulukossa 4. Kunkin eksonin tunnetut rajat esitetään yhtenäisillä pys- « · · ···’ tysuorilla viivoilla. Genomiset kloonit lambda-HEPOl, lambda-HEP02, lambda- * HEP03 sekä lambda-ΗΕΡΟό on tallennettu kantakokoelmaan American Type

• M

30 Culture Collection, Rockville, Maryland, josta ne on saatavana tunnusnumeroiden · ATCC 40154, ATCC 40155, ATCC 40150 ja ATCC 40151, vastaavasti, perusteella.

« I « ·

Esimerkki 5: Vektorin p91023ib) muodostaminen 35 105347

Transformaatioon käytetty vektori oli pAdD26SVpA(3), joka kuvataan julkaisussa Kaufman et ai.. Mol. Cell Biol., 2:1304 (T982). Tämän vektorin rakenne esitetään 5 kuviossa 5A. Lyhyesti, tämä plasmidi sisältää hiirestä peräisin olevan dihydrofolaatti-reduktaasin (DFHR) cDNA-geenin, joka on adenoviruksen 2 (Ad2) pääasiallisen myöhäisen promoottorin kopiointisäätelyn alaisuudessa. Adenoviruksen DNA ihan on merkitty 5-alkuinen jatkoskohta ja immunoglobuliinigeenistä peräisin oleva 3-alkui-nen jatkoskohta on läsnä Ad2-viruksen pääasiallisen myöhäisen promoottorin sekä 10 DFHR-entsyymiä koodaavan ketjun välissä. SV40-viruksen varhainen polyadenylaa-tiokohta sijaitsee alavirran puolella DHFR-entsyymiä koodaavasta ketjusta. Vektorin pAdD26SVpA(3) prokaryootista peräisin oleva osa on plasmidista pSVOd (Mellon et ai., Cell. 27: 279 (1981), ja se ei sisällä pBR322-ketjuja, joiden tiedetään inhiboivan replikokumista nisäkässoluissa (Lusky et ai.. Nature. 293: 79 (1981).

15

Vektori pAdD26SVpA(3) muunnettiin plasmidiksi pCVSVL2 kuviossa 5A esitetyllä tavalla. pAdD26SVpA(3) muunnettiin plasmidiksi pAdD26SVpA(3) (d) hävittämällä yksi kahdesta Pstl-kohdasta vektorissa pAdD26SVpA(3). Tämä toteutettiin pilkkomalla vektori osittain entsyymillä pSTl käyttäen hyväksi entsyymin puutteellisuutta 20 siten, että saadaan lineaariksi muuttuneiden plasmidien sellainen alipopulaatio, jossa . ainoastaan yksiPstl-kohta oli pilkkoontunut, mitä seurasi käsittely Klenow-fragmen- « « « tiliä, ligaatio renkaan sulkemiseksi uudestaan, sekä seulonta Pstl-kohdan sellaisen häviämän suhteen, joka häviämä sijaitsee 3-alun puolella SV40-viruksen poly- :T: adenylaatioketjusta.

• · · : : : 25

Adenoviruksen kolmiosainen johtoketju ja viruksiin liittyvät geenit (VA-geenit) « · · ·...* istutettiin vektoriin pAdD26SVpA(3) (d) kuviossa 5A esitetysti. Plasmidi ··· pAdD26SVpA(3) (d) pilkottiin ensin entsyymillä PvuII lineaarisen molekyylin : : saamiseksi, joka molekyyli oli auennut kolmiosaisen johtoketjun käsittävän kolmen :,,.1 30 elementin muodostamasta 3-alkuisesta osasta. Tämän jälkeen plasmidi pJAW 43 ··· (Zain et ai.. Cell, 16: 851 (1979) pilkottiin entsyymillä Xho 1, käsiteltiin Klenow- fragmentilla, pilkottiin entsyymillä PvuII, ja kolmannen johtoketjun toisen osan sisältävä 140 emäsparin kappale eristettiin elektroforeettisesti akryyliamidigeeliä 36 105347 käyttäen (6 % Tris-boraatti-puskuri; Maniatis et ai., mainittu edellä). Sitten tämä 140 emäsparin suuruinen kappale ligatoitiin entsyymillä PvuII pilkottuun plasmidiin pAdD26SVpA(3) (d). Ligaation tuotetta käytettiin E. co/i-bakteereiden transformoi-miseen, jolloin ne saatiin tetrasykliinille vastustuskykyisiksi, ja pesäkkeet seulottiin 5 käyttäen Grunstein-Hogness-menetelmää, sekä 140 emäsparin kappaleeseen hybridisoituvaa, 32P-merkittyä koetinta. DNA otettiin talteen positiivisesti hybridisoi-tuneista pesäkkeistä sen selvittämiseksi, sijaitseeko muodostettu PvuII-kohta 5-alun vai 3-alun puolella istutetusta 140 emäsparin DNA-sekvenssistä, joka on spesifinen adenoviruksen toiselle ja kolmannelle myöhäiselle johtoketjulle. PvuII-kohta sijaitsee 10 asianmukaisesti 5-alun puolella 140 emäsparin suuruisesta istutteesta. Tästä plas-midista käytetään lyhennettä tTPL kuviossa 5A.

SV40-viruksen Ava II D-kappale, joka sisältää SV40-edistinsekvenssin, saatiin pilkkomalla SV40-viruksen DNA entsyymillä Ava II, jonka jälkeen päät tehtiin 15 tylpiksi (blunt) PolT.n Klenow-kappaleella, näihin kappaleisiin ligatoitiin Xho 1-kytkijät, pilkottiin entsyymillä Xho 1 Xho 1-kohdan aukaisemiseksi, ja neljänneksi suurin (D) kappale eristettiin elektroforeettisesti geelillä. Sitten tämä kappale ligatoitiin entsyymillä Xho 1 leikattuun plasmidiin pTPL, jolloin saatiin plasmidi pCVSVL2-TPL. SV40-viruksen D-kappale oli suuntautuneena plasmidissa 20 pCVSVL2-TPL siten, että SV40-viruksen myöhäinen promoottori oli samalla tavalla ; suuntautuneena kuin adenoviruksen pääasiallinen myöhäinen promoottorikin.

( <

Adenovirukseen liittyvien (VA) geenien viemiseksi plasmidiin pCVSVL2-TPL ’ muodostettiin ensin plasmidi pBR322, joka sisälsi adenovirustyypin 2 Hind III B- • · · ·.· : 25 kappaleen. Adenovirustyypin 2 DNA pilkottiin entsyymillä Hind III ja B-kappale eristettiin elektroforeettisesti geeliä käyttäen. Tämä kappale istutettiin plasmidiin ·...* pBR322, joka oli tätä ennen pilkottu entsyymillä Hind III. Ampisilliinin vastustusky- ·*· ..·* vynaikaansaamiseksi toteutetun E. coli-bakteeriin transformoimisen jälkeen yhdistellä · mät seulottiin sen suhteen, oliko Hind III B-kappale saatu istutetuksi, ja istutettu 30 suuntautuminen määritettiin restriktioentsyymeillä pilkkomalla. Plasmidi pBR322 -<< Ad Hind III B sisältää adenovirustyypin 2 Hind III B-kappaleen kuvassa 5B esitetyl- lä tavalla suuntautuneena.

37 105347

Kuten kuviossa 5B esitetään, VA-geenit saadaan vaivattomasti plasmidista pBR322 -Ad Hind III B entsyymillä Hpa I pilkkomalla, jonka jälkeen lisätään EcoRI-kytkijöitä ja pilkotaan entysyymillä EcoRI, mitä seuraa l,4kiloemäsparin suuruisen kappaleen ottaminen talteen. Sitten kappale, jossa on tarttuvat EcoRI-päät, ligatoi-5 daan PLT-ketjun EcoRI-kohtaan, joka on tätä ennen pilkottu entsyymillä EcoRI. E. co/i-bakteeriin HB101 transformoimisen ja tetrasykliinin vastustuskykyyn perustuvan valikoinnin jälkeen kolonnit seulottiin suodattimena hybridisointia käyttäen VA-geeneille spesifisen DNA:n suhteen. DNA otettiin talteen positiivisesti hybri-disoituneista klooneista ja sen tunnusomaiset piirteet selvitettiin restriktioendonukle-10 aaseilla pilkkomalla. Tuloksena olevasta plasmidista käytetään lyhennettä p91023.

Kuten kuviossa 5C esitetään, plasmidin p91023 kaksi EcoRI-kohtaa poistettiin pilkkomalla plasmidi p91023 täydellisesti entsyymillä EcoRI, jolloin syntyi kaksi DNA-kappaletta, joista toinen oli noin 7 kiloemäsparin pituinen ja toinen noin 1,3 15 kiloemäsparin pituinen. Jälkimmäinen kappale sisälsi VA-geenit. Molempien kappaleiden päät täytettiin käyttäen Poll-entsyymin Klenow-kappaletta, jonka jälkeen nämä kaksi kappaletta ligatoitiin yhteen. Plasmidi p91023(A), joka sisältää VA-geenit ja joka on plasmidin p91023 kaltainen, mutta josta kaksi EcoRI-kohtaa on hävitetty, tunnistettiin seulomalla Grunstein-Hogness-menetelmällä VA-geenikap-20 paletta käyttäen, sekä tavanomaisella restriktiokohtien analyysillä.

( 4 4 4 4 4

Plasmidin p91023(A) ainoa Pstl-kohta poistettiin ja korvattiin EcoRI-kohdalla. Plasmidi p91023(A) leikattiin täydellisesti entsyymillä Pstl ja käsiteltiin Poll-entsyymin Klenow-kappaleella tasapäiden muodostamiseksi. EcoRI-kytkijät ligatoi-· 25 tiin plasmidin p91023(A) tylpäksi tehtyyn Pstl-kohtaan. Lineaarinen p91023(A), jossa EcoRI-kytkijät olivat kiinnittyneet tylpäksi tehtyyn Pstl-kohtaan, erotettiin * · · ligatoitumattomista kytkijöistä ja pilkottiin täydellisesti entsyymillä EcoRI, ja «»« ligatoitiin uudestaan. Kuviossa 5C esitetty plasmidi p91023(B) otettiin talteen, jäsen : rakenne todettiin samankaltaiseksi kuin plasmidilla p91023(A), jossa rakenteessa I · « : 30 kuitenkin aikaisempi Pstl-kohta oli korvautunut EcoRI-kohdalla. Plasmidi ·; p91023(B) on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, josta se on saatavana tunnusnumeron ATCC 39754 perusteella.

Esimerkki 6: 38 105347 cDNA-kloonit (lambda-EPOFL6 ja lambda-EPOFL13 esimerkistä 3) istutettiin plasmidiin p91023(B), jolloin saatiin pPTFL6 ja pPTFL13, vastaavasti. Kumpaakin 5 puhdistettua DNA:ta käytettiin tämän jälkeen 8 ug 5 x 106 COS-soIun transfektoimi-seen käyttäen DEAE-dekstraani-menetelmää, joka kuvataan jäljempänä. 12 tunnin kuluttua solut pestiin ja niitä käsiteltiin tuotteella Chlogoquin (0,1 mM) 2 tuntia, pestiin uudestaan, ja sekoitettiin 10 millilitraan alustaa, joka sisälsi 10 % sikiöastei-sen vasikan seerumia, ja pidettiin 24 tuntia tässä alustassa. Alustaksi vaihdettiin 4 ml 10 seerumia sisältämätöntä alustaa, ja solut otettiin talteen 48 tunnin kuluttua.

Immunologisesti aktiivisen EPO-proteiinin tuotanto todettiin radioimmunokokeella, joka kuvataan julkaisussa Sherwood ja Goldwasser (55). Vasta-ainetta saatiin tutkijalta Dr. Judith Sherwood. Jodattu merkkiaine valmistettiin esimerkissä 1 15 kuvatusta homogeenisesta EPO-proteiinista. Kokeen herkkyys on suurin piirtein 1 ng/ml. Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa 8.

Taulukko 8 .. 20 : Vektori Alustaan vapautuneen EPO-proteiinin määrä (ng/ml) 4 < « 4 4 4 pPTFL13 330 :T: pPTFLö 31 • · ♦ v ; 25 pPTFL13 on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, • · · • · .··' Rockville, Maryland, josta se on saatavana tunnusnumeron ATCC 39990 perusteella.

1 « « 30

Esimerkki 7 39 105347 EPO cDNA (Iambda-HEPOFL13) istutettiin vektoriin p91023(B) ja transfektoitiin COS-1-soluihin ja otettiin talteen edellä kuvatusti (esimerkki 6), paitsi että kloro-5 kiinilla käsittely jätettiin toteuttamatta.

In vitro biologisesti aktiivinen EPO määritettiin joko pesäkkeiden muodostumisko-keella käyttäen CFU-E-lähteenä sikiöasteisen hiiren maksasoluja, tai 3H-tymidiinin kulutusta mittaavalla kokeella käyttäen pernasoluja hiiristä, joihin oli injektoitu 10 fenyylihydratsiinia. Näiden kokeiden herkkyydet ovat suurin piirtein 25 m-yksik-köä/ml. In vivo biologisesti aktiivinen EPO määritettiin käyttäen joko hypoksiseen hiireen tai ruuatta pidettyyn rottaan perustuvaa koetta. Näiden kokeiden herkkyys on noin 100 mU/ml. Aktiivisuutta ei voitu todeta kummassakaan kokeessa valetilan alustasta. Kloonin EPOFL13 ilmentämällä EPO-proteiinilla saadut tulokset esitetään 15 alla olevassa taulukossa 9, missä esitetyt aktiivisuudet on ilmoitettu yksikössä yksikköä/ml, käyttäen standardina kaupallista, kvantitoitua EPO-proteiinia (Toyobo, Inc.).

Taulukko 9 20

; : Tyypin I EPO cDNA:lla transfektoiduista COS-soluista erittynyt EPO

Koe Aktiivisuus RIA 100 ng/ml 25 CFU-E 2 0,5U/ml 3H-Thy 3,1 1,8 U/ml ♦ · · ·...* hypoksinen hiiri 1 U/ml ·«· ...* ruuatta pidetty rotta 2 U/ml.

« * 30 « 40 105347

Esimerkki 8: CQS-soluista saadun EPO-proteiinin analysointi SDS-polvakrvvliamidigeelillä 180 ng COS-soluista, jotka oli transfektoitu EPO cDNA:lla (lambda-HEPOFL13) 5 vektorissa 91023(B) (edellä), alustaan vapautunutta EPO-proteiinia käsiteltiin elektroforeettisesti käyttäen 10 % SDS Laemlli polyakryyliamidigeeliä, ja siirrettiin sähköllä nitroselluloosapaperille (Towbin et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:4350 (1979). Suodattimelle laitettiin koettimeksi anti-EPO-vasta-ainetta taulukossa 8 esitetysti, pestiin, ja sille laitettiin uudeksi koettimeksi 125I-merkittyä Staph. A-10 proteiinia. Suodatinta autoradiografoitiin kaksi vuorokautta. Esimerkissä 1 kuvattu luonnollinen EPO, joko ennen jodikäsittelyä (ura B) tai sen jälkeen (ura C), käsiteltiin elektroforeettisesti (katso kuvio 6). Merkkiaineina käytettiin esimerkiksi 35S-merkittyä metioniinia, merkittyä seerumin albumiinia (68 000 d) sekä ovalbumii-nia (45 000 d).

15

Esimerkki 9: RKl-4:n muodostaminen

Bam HI-PvuII-kappale plasmidista pSV2DHFR (Subramani et ai.. Mol. Cell. Biol.

1:854-864 (1981)), joka kappale sisälsi SV40-viruksen aikaisen alueen promoottorin ., 20 hiirestä saadun dihydrofolaattireduktaasin (DHFR) geenin vieressä, SV40-edistimen, .·, pienen t-antigeenin intronin sekä SV40-viruksen polyadenylaatiosekvenssin, eristet- tiin (kappale A). Muut kappaleet saatiin vektorista p91023(A) (edellä) seuraavasti: p91023(A) pilkottiin entsyymillä PstI ainoasta Pstl-kohdasta, joka sijaitsi adenoviruk- :T: sen promoottorin läheisyydessä, jolloin plasmidi saatiin lineaariseksi, jonka jälkeen • · » : 25 se joko ligatoitiin synteettisiin PstI - EcoRI-muuntajiin ja suljettiin uudestaan renkaaksi (jolloin alkuperäisen Pstl-kohdan asemasta saatiin kohdat PstI - EcoRI - • · ·

PstI; 91023(B’)) tai se käsiteltiin DNA-polymeraasin I suurella kappaleella PstI- ··· kohtien tuhoamiseksi, ja ligatoitiin synteettiseen EcoRI-kytkijään ja suljettiin : uudestaan renkaaksi (jolloin alkuperäisen Pstl-kohdan tilalle saatiin EcoRI-kohta; 30 91023(B)). Kumpikin tuloksena oleva plasmidi 91023(B) ja 91023(B’) pilkottiin entsyymeillä Xba ja EcoRI, jolloin saatiin kaksi kappaletta (F ja G). Kappale F :' ”: plasmidista p91023(B) ja kappale G plasmidista p91023(B’) ja kappale G plasmidista p91023(B) ja kappale F plasmidista p91023(B’) liitettiin toisiinsa siten, että saatiin 41 105347 aikaan kaksi uutta plasmidia, jotka sisälsivät joko EcoRI - Pstl-kohdan tai PstI -EcoRI-kohdan alkuperäisen Pstl-kohdan tilalla. Siitä plasmidista, joka sisältää PstI -EcoRI-kohdan siten, että Pstl-kohta on lähimpänä adenoviruksen pääasiallista myöhäistä promoottoria, käytetään nimitystä p91023(C).

5

Vektori p91023(C) pilkottiin täydellisesti entsyymillä XhoI, ja tuloksena olevan lineaarisen DNA:n tarttuvat päät tehtiin tylpiksi pään täyttämisreaktiolla käyttäen DNA-polymeraasilla IE. co/hsta saatua suurta kappaletta. Tähän DNA:han ligatoi-tiin 340 emäsparin suuruinen Hind III - EcoRI-kappale, joka sisältää seuraavasti 10 valmistetun SV40-edistimen: SV40-viruksesta saatu Hind III - Pvu II-kappale, joka sisältää SV40-viruksen replikaation alkukohdan sekä edistimen, istutettiin plasmidiin c lac (Little et ai., Mol. Biol. Med. 1:473-488(1983)). clac-vektori valmistettiin pilkkomalla clacDNA 15 entsyymillä BamHI, täyttämällä tarttuva pää DNA-polymeraasin I suurella kappaleella ja pilkkomalla DNA entsyymillä Hind III. Tuloksena olevaan plasmidiin (c SVHPlac) saatiin BamHI-kohta tylppään Pvu ΙΙ-päähän ligatoimalla. EcoRI - Hind III-kappale valmistettiin plasmidista c SVHPlac ja ligatoitiin plasmidin PSVOd EcoRI - Hind ΙΙΙ-kappaleeseen (Mellon et ai., edellä), joka sisälsi plasmidin ,: < 20 replikaation alkukohdan, ja tuloksena oleva plasmidi pSVHPOd valikoitiin. Tämän ,', jälkeen valmistettiin plasmidin PSVHPOd 340 emäsparin suuruinen EcoRI - Hind III-kappale, joka sisälsi SV40-viruksen alkukohdan/edistimen, sen molemmat päät :*·.· tehtiin tylpiksi DNA-polymeraasin I suurella kappaleella, ja ligatoitiin entsyymillä « ·

Xhol pilkottuun, päistään tylpäksi tehtyyn, edellä kuvattuun vektoriin p91023(C).

: 25 Tuloksena olevasta plasmidista (p91023(C)/Xho/tylppä plus EcoRI/Hindlll/tylppä SV40-alkukohta plus edistin), jossa Hind III - EcoRI-kappale on suuntautuneena siten, että tässä kappaleessa oleva BamHI-kohta oli lähinnä VA-geeniä, käytetään lyhennettä pES105. Plasmidi PES105 pilkottiin entsyymeillä BamHI ja PvuII sekä : myöskin pelkällä entsyymillä PvuII, ja BamHI - PvuII-kappale, joka sisälsi adenovi- : 30 ruksen pääasiallisen myöhäisen promoottorin (kappale B), sekä PvuII-kappale, joka .:. sisältää vastustuskyvyn geenin (tetrasykliinin vastustuskyky) käsittävän plasmidin sekä muita sekvenssejä (kappale C), eristettiin. Kappaleet A, B ja C ligatoitiin ja tulokse- a « « na oleva plasmidi, joka esitetään kuviossa 7, eristettiin ja siitä käytetään lyhennettä 42 105347 RK1-4. Plasmidi RK1-4 on talennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, josta se on saatavana tunnusnumeron ATCC 39940 perusteella.

5 Esimerkki 10: EPO-proteiinin ilmentäminen CHO-soluissa - Menetelmä I

Edellä kuvatun plasmidin pPTFL13 (esimerkki 6) DNA (20 μ g) pilkottiin restriktio-endonukleaasilla Cla I, jotta plasmidi saataisiin lineaariseksi, ja se ligatoitiin plasmidin pAdD26SVp(A) 1 entsyymillä Cla I pilkottuun DNA:han (2 ^g), joka 10 sisältää adenoviruksen pääasiallisen myöhäisen promoottorin alaisuudessa olevan, vahingoittumattoman dihydrofolaattireduktaasin (DHFR) geenin (Kaufman ja Sharp, Mol, and Cell Biol, 2:1304-1319 (19821). Tällä ligatoidulla DNA:lla transfektoitiin DHFR-negatiivisia CHO-soluja (DUKX-BII, Chasin L.A.ja Urlaub G. (1980) PNAS 77 4216-4220) ja niitä kasvatettiin kaksi vuorokautta, jonka jälkeen vähintään yhden 15 DHFR-geenin käsittävät solut valikoitiin alfa-alustassa, josta nukleotidit puuttuivat, ja johon oli lisätty täydennykseksi 10 % dialysoitua sikiöasteisen naudan seerumia. Soluja kasvatettiin kaksi viikkoa selektiivisellä alustalla, jonka jälkeen pesäkkeet poistettiin alkuperäisiltä maljoilta, yhdistettiin 10-100 pesäkettä sisältäviksi ryhmiksi, maljattiin uudestaan ja kasvatettiin yhteen alfa-alustalla, josta nukleotidit puuttuivat. 20 Kasvatettujen pesäkeryhmien alustasta ennen metotreksaatilla valikointia saadusta l < I ( . .‘j supernatantista määritettiin EPO RLA-menetelmällä. Niitä pesäkeryhmiä, joissa * 4 « esiintyi EPO-proteiinin muodostumista kasvatettiin metotreksaatin (0,02 μΜ) läsnäollessa, jonka jälkeen ne alikloonattiin ja määritys toteutettiin uudestaan. EPO Cla 4 4.02-7, ainut ahkiooni EPO Cla 4 4.02-joukosta, vapautti 460 ng/ml EPO-· 25 proteiinia alustaan, joka sisälsi 0,02 μΜ MTX (taulukko 10). EPO Cla 4 4.02-7 on EPO-tuotantoon valittu solulinja, ja se on tallennettu kantakokoelmaan American • ♦ ♦

Type Culture Collection tunnusnumerolla ATCC CRL 8695. Tällä hetkellä tällä • « · ...* kloonilla toteutetaan asteittaista valikointia MTX-pitoisuutta kasvattamalla, ja siitä i : : saadaan todennäköisesti soluja, jotka tuottavat EPO-proteiinia vieläkin suurempia F,,: 30 määriä. RIA-menetelmän perusteella negatiivisten pesäkeryhmien tapauksessa ]· metotreksaatin (0,02 μΜ) läsnäollessa kasvatetuista vastinviljelmistä saaduista, metotreksaatille vastustuskykyisistä pesäkkeistä, jotka yhdistettiin, määritettiin uudestaan EPO RIA-menetelmällä. Ne viljelmät, jotka eivät olleet EPO:n suhteen 43 105347 positiivisia, alikloonattiin ja niitä kasvatettiin metotreksaatin pitoisuuksia edelleen suurentaen.

Asteittainen metotreksaatilla (MTX) valikointi toteutettiin viljelemällä soluja 5 toistuvasti metotreksaatin kasvavien pitoisuuksien läsnäollessa, ja valikoimalla eloon jääneet solut. Kussakin kasvatuksessa EPO määritettiin viljelmän supernatantista RIA-menetelmällä sekä in vitro biologisen aktiivisuuden kokeella. Metotreksaatin pitoisuus kasvatuksen kussakin vaiheessa oli 0,02 μΜ, 0,1 μΜ ja 0,5 μΜ. Kuten taulukosta 10 nähdään, valikoinnin ensimmäisen kierroksen, jossa MTX-pitoisuus oli 10 0,02 μΜ, jälkeen viljelyalustaan vapautui merkittäviä EPO-pitoisuuksia.

Taulukko 10 15 Alustaan vapautuneen EPO-proteiinin määrä Näyte Koe Saanto Saanto alfa-alustasta, joka alfa-alustasta sisältää 0,02 μΜ metotreksaattia 20 4 4-joukko Rl A 17 ng/ml 50 ng/ml 4 4- "'! yksi pesäke • t * I 4 < < * < :"': 25 klooni ///: (.02-7) RIA - 460 ng/ml • · · • · • · · • · · « * · • · · • · « » « «

... 30 Esimerkki 11: EPO-proteiinin ilmentäminen CHO-soluissa - Menetelmä II

• * « · • · · • · · *·’ DNA kloonista lambda-HEPOFL13 pilkottiin entsyymillä EcoRI ja EPO-geenin ;;/ sisältävä pieni RI-kappale alikloonattiin plasmidin RK1-5 (katso esimerkki 10)

EcoRI-kohtaan. Tällä DNAilla (RKFL13) transfektoitiin sitten suoraan (pilkkomat-

4 I I

...! 35 ta) DHFR-negatiivisia CHO-soluja, ja valikointi ja kasvattaminen toteutettiin edellä '" ' esimerkissä 10 kuvatusti.

44 105347 RKFL13 DNA istutettiin samoin CHO-soluihin käyttäen protoplastifuusiota ja mikroinjektiota. Plasmidi RKFL13 on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, josta se on saatavana tunnusnumerolla ATCC 39989.

5

Taulukko 11

Alustaan vapautuneen EPO-proteiinin pitoisuus 10 Näyte Koe Saanto Saanto alfa-alustasta, joka alfa-alustasta sisältää 0,02 μ M metotreksaattia 15 Pesäke Rl A 3 ng/ml 42 ng/ml (joukko) joukko A 150 ng/ml (klooni) 3H-Thy - 1,5 U/ml 20 Yksi pesäke Rl A - 90 ng/ml klooni (.02C-Z) 3H-Thy - 5,9 U/ml , 25 Mikroinjektoitu RIA 60 ng/ml 160 ng/ml joukko (DEPO-1) 3H-Thy l,8U/ml • · « · · ·· " 30 • · · » · · • · · • · » • · ·

Edullisin yhden pesäkkeen klooni on talennettu kantakokoelmaan American Type ... Culture Collection, Rockville, Maryland, josta se on saatavana tunnusnumerolla • « ::: atcc crl8695.

V 35 • « * « · « · « « < ««44 « · 45 105347

Esimerkki 12: Genomisen EPO-kloonin ilmentäminen COS-1-soluissa

Genomisen EPO-kloonin ilmentämiseen käytettiin vektoria pSVOd (Mellon et ai., edellä). Vektorin pSVOD DNA pilkottiin täydellisesti entsyymillä Hind III ja tehtiin 5 tylpäksi DNA-polymeraasin I suurella kappaleella. Genominen EPO-klooni lambda-HEP03 pilkottiin täydellisesti entsyymeillä EcoRI ja Hind III, ja EPO-geenin sisältävä 4,0 kiloemäsparin suuruinen kappale eristettiin ja tehtiin tylpäksi edellä esitetysti. Kuviossa 4 ja taulukossa 4 esitetään tämän kappaleen nukleotidisekvenssi Hind ΙΙΙ-kohdasta välittömästi polyadenylaation signaalin takana sijaitsevaan 10 alueeseen saakka. EPO-geenin kappale istutettiin pSVOd-plasmidikappaleeseen, ja asianmukaisesti muodostuneet yhdistelmät molemmalla tavalla suuntautuneena eristettiin ja varmistettiin. Plasmidi CZ2-1 käsittää EPO-geenin "a"-tavalla suuntautuneena (eli EPO:n 5’-pää lähimpänä SV40-alkukohtaa) ja plasmidi CZ1-3 on vastakkaisesti suuntautunut (suuntautuminen "b").

15

Plasmidit CZ1-3 ja CZ2-1 transfektoitiin COS-l-soluihin esimerkissä 7 kuvatulla tavalla, alusta otettiin talteen, ja siitä määritettiin immunologisesti reaktiivinen EPO. Suurin piirtein 31 ng/ml EPO-proteiinia todettiin plasmidin CZ2-1 viljelmän supernatantissa ja 16-31 ng/ml plasmidin CZ1-3 supernatantissa.

20

(III

, ,·. Genomiset kloonit HEPOl, HEP02 jaHEP06 voidaan istuttaa ilmentämistä varten I I i COS-soluihin samalla tavalla.

• · • · · * · · • ·

Esimerkki 13: Ilmentäminen C127- ia 3T3-soluissa .* 25 Plasmidin pBPVEPO muodostaminen • · ·

Plasmidi, joka sisältää EPO cDNA-sekvenssin hiirestä saadun metallotioneiini- • · · promoottorin kopiointisäätelyn alaisuudessa, ja joka on kytketty naudan täydellisen i papilloma-viruksen DNA:han, valmistettiin seuraavasti: 30 • «441

I I

1 | I

pEP049f 46 105347

Plasmidi SP6/5 saatiin yhtiöstä Promega Biotec. Tämä plasmidi pilkottiin täydellisesti entsyymillä EcoRI ja kloonista lambda-HEPOFL13 saatu 1340 emäsparin 5 suuruinen EcoRI-kappale istutettiin DNA-ligaasin avulla. Tuloksena olevasta plasmidista, jossa EPO-geenin 5’-pää oli lähimpänä SP6-promoottoria (määritetty entsyymeillä Bgll ja Hind III pilkkomalla), käytetään lyhennettä pEP049F. Tällä tavalla suuntautuneena BamHI-kohta PSP6/5-polykytkijässä on suoraan EPO-geenin 5’-pään vieressä.

10

pMMTneo BPV

Plasmidi pdBPV-MMTneo (342-12) (Law et ai.. Mol, and Cell Biol, 3:2110-2115 (1983)), joka esitetään kuviossa 8, pilkottiin täydellisesti entsyymillä BamHI, jolloin 15 saatiin kaksi kappaletta - suurempi kappale, jonka pituus oli noin 8 kiloemäsparia, ja joka sisälsi BPV-genomin, sekä pienempi kappale, jonka pituus oli noin 6,5 kiloemäsparia, ja joka sisälsi pML2-replikaation alkukohdan sekä ampisilliinin vastustukyvyn geenin, metallotioneiinipromoottorin, neomysiinin vastustuskyvyn geenin, sekä SV40-viruksen polyadenylaation signaalin. Pilkottu DNA tehtiin 20 uudestaan renkaaksi DNA-ligaasilla, ja plasmidit, jotka sisälsivät ainoastaan 6,8 : kiloemäsparin suuruisen kappaleen, tunnistettiin pilkkomalla restriktioendonukle- aaseilla EcoRI ja BamHI. Yhdestä tällaisesta plasmidista käytetään nimitystä pMMTneo BPV.

• · · • · · O’: 25 pEP015a • · · ·...1 pMMTneo BPV pilkottiin täydellisesti entsyymillä Bglll. pEP049f pilkottiin täydelli- • 1 ···’ sesti entsyymeillä BamHI ja Bglll, ja suurin piirtein 700 emäsparin suuruinen

1 C

;, | | kappale, joka sisältää koko EPO-proteiinin koodaavan alueen, otettiin talteen geelin

I ( I

30 avulla eristäen. Entsyymillä Bglll pilkottu pMMTneo BPV ja 700 emäsparin ·; BamHI/Bglll EPO-kappale ligatoitiin ja tuloksena olevat, EPO cDNA:n sisältävät plasmidit tunnistettiin pesäkehybridisaatiolla käyttäen oligonukleotidikoetinta d(GGTCATCTGTCCCCTGTCC), joka on spesifinen EPO-geenille. Hybridisaatio- 47 105347 analyysin perusteella positiivisista plasmideista yksi (pEPO 15a), jossa EPO cDNA oli suuntautuneena siten, että EPO cDNA:n 5’-pää oli lähimpänä metallotioneiinipro-moottoria, tunnistettiin pilkkomalla entsyymeillä EcoRI ja Kpnl.

5 pBPV-EPO

Plasmidi pEP015a pilkottiin täydellisesti entsyymillä BamHI plasmidin tekemiseksi lineaariseksi. Plasmidi pdBPV-MMTneo-(342-12) pilkottiin samoin täydellisesti entsyymillä BamHI, jolloin saatiin kaksi kappaletta, 6,5 ja 8 kiloemäsparia. 8 10 kiloemäsparin kappale, joka sisälsi koko naudan papillomaviruksen genomin, eristettiin geelin avulla. pEP015a/BamHI ja 8 kiloemäsparin BamHI-kappale ligatoitiin yhteen, ja BPV-kappaleen sisältämä plasmidi (pBPV-EPO) tunnistettiin pesäkehybridisaatiolla käyttäen oligonukleotidikoetinta d(P-CCACACCCGGTACA-CA-OH), joka on spesifinen BPV-genomille. Plasmidin pBPV-EPO DNA:n pilkko-15 minen entsyymillä Hind III osoitti, että BPV-genomin kopioitumissuunta oli sama kuin metallotioneiinipromoottorin kopioitumissuunta (kuten plasmidissa pdBPV-MMTneo (342-12), katso kuvio 8). Plasmidi pdBPV-MMTneo (342-12) on saatavana kantakokoelmasta American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, tunnusnumerolla ATCC 37224.

v 20 : ;': Ilmentäminen • ·

Seuraavia menetelmiä käytettiin EPO-proteiinin ilmentämiseksi • · · • · » • · » M» ·.· · 25 Menetelmä I 1 · · pBPV-EPO DNA valmistettiin ja sitä käytettiin suurin piirtein 25 ug noin 1 x 10 '··' C127 (Lowy et ah. J. of Virol, 26:291-98 (1978)) CHO-solujen transfektoimiseen ;,< < käyttäen tavanomaisia, kalsiumfosfaatilla saostamiseen perustuvia tekniikoita « I < 30 (Grahm et ah, Virology. 52:456-67 (1973)). Transfektoimiseen käytetty väliaine ·;· poistettiin viiden tunnin kuluttua transfektoinnista, solut iskukäsiteltiin glyserolilla, pestiin, ja niihin lisättiin uutta alfa-alustaa, joka sisälsi 10 % sikiöasteisen vasikan seerumia. Solut trypsinoitiin 48 tuntia myöhemmin, ja ositettiin suhteessa 1:10DME- 48 105347 alustaan, joka sisälsi 500 ug/ml G418-tuotetta (Southern et ai.. Mol. Appi. Genet. 1:327-41 (1982)), ja soluja inkuboitiin kahdesta kolmeen vikkoa. Tämän jälkeen G418:lle vastustuskykyiset pesäkkeet eristettiin toisistaan erillään mikrotiitterilevyn koloihin, ja ne kasvatettiin lähes yhteen G418:n läsnäollessa. Sitten solut pestiin, 5 niihin lisättiin uutta alustaa, joka sisälsi 10 % sikiöasteisen vasikan seerumia, ja alusta otettiin talteen 24 tunnin kuluttua. Käsitelty alusta testattiin ja se todettiin positiiviseksi EPO-proteiinin suhteen radioimmunokokeella ja biologisella in vitro kokeella.

10 Menetelmä II

C127- tai 3T3-solut transfektoitiin sekä 25 mikrogrammalla pBPV-EPO:a että 2 mikrogrammalla pSV2neo:a (Southern et ai., edellä), kuten menetelmässä I kuvataan. Tämä vastaa pBPV-EPO:n suurin piirtein 10-kertaista molaarista ylimäärää. 15 Transfektion jälkeen toimenpiteet ovat samat kuin menetelmässä I.

Menetelmä III

C127-solut transfektoitiin 30 mikrogrammalla pBPV-EPO:a menetelmässä Ikuvatul-20 la tavalla. Transfektion ja osittamisen (1:10) jälkeen alusta vaihdettiin uuteen joka kolmas vuorokausi. Suurin piirtein 2 viikon kuluttua BPV-transformoitujen solujen keskukset (focus) tulivat näkyviin. Erilliset keskukset otettiin talteen ja siirrettiin • · :/·· mikrotiitterilevyn koloihin, joiden suuruus on 1 cm, kasvatettiin lähes yhtyneeksi « · · : monokerrokseksi, ja käsitellystä alustasta määritettiin EPO-proteiinin aktiivisuus tai • · · · 25 antigeenisyys.

• · · • · *·«·* Esimerkki 14: Ilmentäminen hvönteissoluissa ·;·* Plasmidin pIVEV EPOFL13 muodostaminen 30 Plasmidivektori pIVEV on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture •: Collection, Rockville, Maryland, josta se on saatavana tunnusnumeron ATCC 39991 : perusteella. Vektoria muunnettiin seuraavasti: 49 105347

pIVEVNI

pIVEV pilkottiin entsyymillä EcoRI, jotta plasmidi saatiin lineaariseksi, tehtiin tylpäksi DNA-polymeraasin I suurella kappaleella, ja yksi Notl-kytkijä

5 GGCGGCCGCC

CCGCCGGCGG

istutettiin tylppään päähän ligatoimalla. Tuloksena olevasta plasmidista käytetään lyhennettä pIVEVNI.

10

pIVEVSI

pIVEV pilkottiin entsyymillä Smal plasmidin tekemiseksi lineaariseksi, ja yksi Sfil-kytkijä

15 GGGCCCCAGGGGCCC

CCCGGGGTCCCCGGG

istutettiin tylppään päähän ligatoimalla. Tuloksena olevasta plasmidista käytetään lyhennettä pIVEVSI.

20 pIVEVSIBgKp

Plasmidi pIVEVSI pilkottiin entsyymillä Kpnl, jolloin plasmidi saatiin lineaariseksi, ... ; ja kummastakin päästä poistettiin suurin piirtein 0-100 emäsparia pikkomalla • · · * · 25 kaksijuosteisella eksonukleaasilla Bal31. Jokainen tuloksena oleva pää, joka ei ollut * · « »

täysin tylppä, tehtiin tylpäksi käyttäen DNA-polymeraasin I suurta kappaletta, ja polykytkijä ]__Xho_I _XbaI

3σΠΐ JEcokl |cial Koni I i I M il Π I 1 I

AGATCTCGAGÄATTCTAGATCGATGGTACC

···’ TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG

; 30 istutettiin tylppään päähän ligatoimalla. Polykytkijä istutettiin molemmilla tavoilla il! suuntautuneena. Plasmidista, jossa polykytkijä on suuntautuneena siten, että polykyt- kijässä oleva Bglll-kohta on lähimpänä polyhedronigeenin promoottoria, käytetään 50 105347 nimitystä pIVEVSIBgKp. Plasmidista, jossa polykytkijässä oleva Kpnl-kohta on lähimpänä polyhedronigeenin promoottoria, käytetään nimitystä pIVEVSIKpBg. Emäsparien, jotka hävisivät plasmidissa pIVEVSI olevan alkuperäisen Kpnl-kohdan ja polyhydronipromoottorin välistä, lukumäärää ei määritetty. Plasmidi pIVEV-5 SIBgKp on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, josta se on saatavana tunnusnumeron ATCC 39988 perusteella.

pIEVSIBgKpNl 10 pIVEVNI pilkottiin täydellisesti entsyymeillä Kpnl ja PstI, jolloin saatiin kaksi kappaletta. Suurempi kappale, joka sisälsi plasmidista replikaation alkukohdan ja polyhedronigeenin 3’-pään, otettiin talteen geelin avulla eristämällä (kappale A). pIVEVSIBgKp pilkottiin täydellisesti entsyymeillä PstI ja Kpnl, jolloin saatiin kaksi kappaletta, ja pienempi kappale, joka sisälsi polyhedronigeenin promoottorin ja 15 polykytkijän, otettiin talteen geelin avulla eristämällä (kappale B). Tämän jälkeen kappale A ja B liitettiin DNA-ligaasilla, jolloin saatiin muodostumaan uusi plasmidi pIVEVSIBgKpNl, joka sisältää osittain hävinneen polyhedronigeenin, johon on istutettu polykytkijä, ja joka sisältää samoin Notl-kohdan (joka korvaa tuhoutuneen EcoRI-kohdan) sekä Sfil-kohdan, joka rajoittuu polyhedronigeenin alueeseen.

20

pIVEPO

pIVEVSI BGKpNI pilkottiin täydellisesti entsyymillä, jolloin plasmidi saatiin : lineaariseksi, ja siihen istutettiin 1340 emäsparin suuruinen EcoRI-kappale kloonista • · · : 25 lambda-HEPOFL13. Plasmidit, jotka sisälsivät EPO-geenin sillä tavalla suuntau tuneena, että EPO-geenin 5’-pää on lähimpänä polyhedronipromoottoria ja polyhe- ··» *...· dronigeenin 3’-päätä, tunnistettiin entsyymillä Bglll pilkkomalla. Yhdestä näistä • · » • » plasmidista, edellä kuvatulla tavalla suuntautuneena, käytetään nimitystä pIVEPO.

« « I < I I « · I < I * :,,,· 30 EPQ-proteiinin ilmentäminen hvönteissoluissa pIVEPO-plasmidia valmistettiin suuria määriä transformoimalla E. coli-kanta JM 101-tgl. Plasmidi-DNA eristettiin kirkastettuun lysaattiin perustuvalla tekniikalla (Maniatis 51 105347 ja Fritsch, Cold Spring Harbor Manual) ja sitä puhdistettiin edelleen CsCl-sentrifu-goinnilla. Autographa califomica-hyönteisen villityypin polyherdoosi-viruskannan (AcNPV) L-l DNA otettiin talteen uuttamalla viruspartikkeleita fenolilla, jonka jälkeen virus-DNA puhdistettiin CsCl-käsittelyllä.

5 Tämän jälkeen nämä kaksi DNA:ta transfektoitiin yhdessä Spodoptera frugiperda-hyönteisen soluihin IPLB-SF-21 (Vaughn et ai.. In Vitro Voi. B, sivut 213-17 (1977)) käyttäen kalsiumfosfaattiin perustuvaa transfektointitoimenpidettä (Potter ja Miller, 1977). Yhdessä transfektoitavien solujen kutakin maljaa kohden käytettiin 1 ug 10 villityypin AcNPV DNA:ta ja 10 ug pIVEPO-plasmidia. Maljoja inkuboitiin 27°C:n lämpötilassa 5 vuorokautta. Tämän jälkeen supernatantti otettiin talteen, ja EPO-proteiinin ilmentyminen supernatantissa vahvistettiin radioimmunokokeella sekä biologisella in vitro kokeella.

15 Esimerkki 15: EPO-proteiinin puhdistaminen COS-solujen käsitelty alusta (121), jossa EPO-pitoisuus oli jopa 200 pgllitra, väkevöi- tiin 600 millilitraksi ultrasuodattamalla, käyttäen kalvoja, joiden molekyylipainoon perustuva leikkausarvo ("cut off") on 10 000, ja esimerkiksi Millipore-yhtiön Pellicam- 20 laitteistoa, joka käsitti 5 neliöjalkaa kalvoa. Kokeet suoritettiin RIA-menetelmällä,

kuten esimerkissä 6 esitetään. Ultrasuodatuksesta saatu pidäte diasuodatettiin 10 mM

.·. : natriumfosfaattia, jota käytettiin 4 ml, ja jonka pH oli puskuroitu arvoon 7,0, vastaan.

• · Väkevöity ja diasuodatettu käsittely alusta sisälsi 2,5 mg EPO-proteiinia yhteensä 380 milligrammassa proteiinia. EPO-liuos väkevöitiin edelleen 186 miililitraksi ja saostu-25 neet proteiinit poistettiin sentrifugoimalla nopeudella 110 000 x g 30 minuuttia.

* · · • · • · • · · * EPO-proteiinin sisältävän (2,0 mg) supernatantin pH asetettiin arvoon 5,5 50 % : '. etikkahapolla, sitä sekoitettiin 4°C:n lämpötilassa 30 minuuttia ja saostuma poistettiin : ‘‘: sentrifugoimalla nopeudella 13 000 x g 30 minuuttia.

30 52 105347

Kromatografia karbonyylimetyyli-Sepharose-geelillä 200 EPO-proteiinia (yhteensä 24 mg proteiinia) sisältävä supernatantti sentrifugoin-nista laitettiin kolonniin, johon oli pakattu CM-Sepharose (20 ml) -geeliä, joka geeli 5 oli tasapainotettu 10 mM natriumasetaatilla, pH 5,5, ja pesty 40 millilitralla samaa puskuria. EPO, joka sitoutui CM-Sepharose-geeliin, eluoitiin 100 millilitralla NaU(0-l)-gradienttia 10 mM natriumfosfaatissa, pH 5,5. EPO-proteiinia (yhteensä 50 μg, proteiinien kokonaismäärän ollessa 2 mg) sisältävät fraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin 2 millilitraksi ultrasuodattamalla, käyttäen Amicon YM 10 kalvoa.

10 HPLC-käsittelv käänteisfaasia käyttäen CM-Sepharose-ksäittelystä saadut väkevöidyt, EPO-proteiinia sisältävät fraktiot puhdistettiin edelleen HPLC-käsittelyllä käänteisfaasikolonnia Vydac C-4 käyttäen. EPO 15 laitettiin kolonniin, joka oli tasapainotettu 10 % liuotinta B (liuotin A oli 0,1 % CF3C02H vedessä; liuotin B oli 0,1 % CF3C02H liuottimessa CF3CN) virtausnopeudella 1 ml/min. Kolonnia pestiin 10 % B-liuotinta 10 minuuttia ja EPO eluoitiin liuottimen B lineaarisella gradientilla (10-70 % 60 minuutissa). EPO-proteiinia sisältävät fraktiot yhdistettiin (noin 40 μζ EPO-proteiinia yhteensä 120 mikrogrammassa 20 proteiinia) ja lyofilisoitiin. Lyofilisoitu EPO kasteltiin uudestaan 0,1 M Tris-HCl-puskurilla, pH 7,5, joka sisältää 0,15 M NaCl, ja käsiteltiin uudestaan kromatografi- : sesti (HPLC) käänteisfaasia käyttäen. EPO-proteiinia sisältävät fraktiot yhdistettiin ja • · analysoitiin elektroforeettisesti SDS-polyakryyliamidigeeliä (10 %) käyttäen (Lameli, U.K., Nature). Yhdistetyt, EPO-proteiinia sisältävät fraktiot sisälsivät 15,5 ug EPO-25 proteiinia yhteensä 25 mikrogrammassa proteiinia.

• « • t • · · - Keksintö on täten kuvattu yksityiskohtaisesti, sen edulliset suoritusmuodot mukaan ♦ : .'. lukien. Kuitenkin on selvää, että alan asiantuntijat voivat tehdä keksintöön muutoksia :"': ja parannuksia ohessa esitetyn kuvauksen ja piirustusten perusteella, kuitenkaan poik- 30 keamatta tämän keksinnön hengestä ja tavoitteista, jotka määritellään liitteenä olevissa patenttivaatimuksissa.

105347 53

Kirjallisuusviitteet 1) Jacobson, L. O., Goldwasser, E., Fried, W. ja Plzak, L. F.. Trans, Assoc. Am. Physicians TO: 305-317 (1957).

5 2) Krantz, S. B. ja Jacobson, L. O. Chicago: University of Chicago Press 1970, sivut 29-31.

3) Hammond, D ia Winnick, S. Ann. N.Y. Acad. Sei. 230:219-227 (1974).

10 4) Sherwood, J. B. ja Goldwasser, E.. Endocrinology 103:866-870 (1978).

5) Fried, W. Blood 40:671-677 (1972).

15 6) Fisher, J. J. Lab, and Clin. Med. 93:695-699 (1979).

7) Naughton, B. A., Kaplan, S. M., Roy, M.,Burdowski, A. J., Gordon, A. S. ja Piliero, S. J. Science 196:301-302.

20 8) Eucarelli- G. P..Howard. D. ja Stohlman. F..Jr. J. Clin. Invest 43:2195-2203 ·, (1964).

• t « · # • · · • · 9) Zanjani, E. D., Poster, J., Burlington, H.,Mann, L. I. ja Wasserman, L. R. J. Lab. Clin. Med. 89:640-644 (1977).

25 10) Krantz, S. B., Callien-Lartigue, O. ja Goldwasser, E. J. Biol.Chem.

• · · 238:4085-4090(1963).

• · · < I ( « 11) Dunn, C. D., Jarvis, J. H. ja Greenman, J. M. Exp. Hematol. 3:65-78 (1975). 30 « · < 54 105347 12) Krystal, G. Exp. Hematol. 11:649-660 (1983).

13) Iscove, N.N.ja Guilbert, Murphy, Jr. (Ed.) New York: Springer-

Verlag, sivut 3-7 (1978).

5 14) Goldwasser, E.,ICN UCLA Symposium. Control of Cellular Division and Development, A. R. Liss, Inc., sivut 487-494 (1981).

15) Cline, M.J. ja Golde, D. W. Nature 277:177-181 (1979).

10 16) Metcalf, D., Johnson, G. R. ja Burgess, A. W. Blood 55:138- (1980).

17) Krane. N. Henry Ford Hosp. Med. J. 31:177-181 (1983).

15 18) Eschbach, J., Madenovix, J., Garcia, J.,Wahl, P.,ja Adamson, J. J. Clin.

Invest. 74: 434-441 (1984).

19) Anagnostou, A.,Barone, J.,Vedo, A. ja Fried, W. Br. J, Hematol 37:85-91 (1977).

20 20) Mivake, T.,Kung, C. ia Goldwasser, E. J. Biol. Chem. 252:5558-5564(19771.

• « 4 4 9 9 9 9 4 9 55 105347 24) Zanjanc, E.D., Ascensao, J.L., McGlave, P.B.,Banisadre, M. ja Ash, R. C. J. Clin. Invest. 67:1183- (1981).

25) Toole, J.J., Knopf, J.L., Wozney, J.M., Sultzman, L.A., Buecker, J.L., 5 Pittman, D.D.,Kaufman, R.J.,Brown, E.,Shoemaker, C.,Orr, E.C.,Amph- lett, G.W., Foster, W.B.,Coe, M.L.,Knutson, G.J.,Fass, D.N. ja Hewick, R.M. Nature in Press.

26) Goldwasser, E. Blood Suppl. 1, 58, xlii (abstr) (1981).

10 27) Sue, J.M. ja Sytkowdki, A.J. Proc. Nat’l Acad. Sei U.S.A. 80:3651-3655 (1983).

29) Bersch, N. ja Golde, D.W., In Vitro Aspects of Erythropoiesis, M. J.

15 Murphy (Ed.) New York: Springer-Verlag (1978).

30) Cotes, P.M. ja Bangham, D.R. Nature 191:1065-(1961).

31) Goldwasser, E. ja Gross, M. Methods in Enzvmol 37:109-121 (1975).

20 32) Nabeshima, Y.-i, Fujii-Kuriyama, Y., Muramatsu, M.,ja Ogata, K. Nature 308:333-338 (1984).

• · · • · » · · • · · • » 33) Young, R.A., Hagencuhle, O. ja Schibler, U. Cell 23:451-558 (1981).

• · · .::: 25 34) Medford, R.M., Nguyen, H.T.,Destree, A.T.,Summers, E. ja Nadal-Ginard, C.’.: B. Cell 38:409-421 (1984).

• « · • * < : :/: 35) Ziff, E.B. Nature 287:491-499 (1980).

//: 30 36) Early, P. Cell 20:313-319 (1980).

56 105347 37) Sytkowski, A. Bio. Biop. Res. Comm. 96:143-149 (1980).

38) Murphy, M. ja Miyake, T. Acta. Haematol, Jpn. 46: 1380-1396 (1983).

5 39) Wagh, P.V. ja Bahl, O.P. CRC Critical Reviews in Biochemistry 307-377 (1981).

40) Wang, F.F.,Kung, G.K.-H. ja Goldwasser, E. Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 42:1872 (abstr) (1983) 10 41) Lowy, P., Keighley, G. ja Borsook, H. Nature 185:102-103 (1960).

42) VanLenten, L. ja Ashwell, G. J. Biol. Chem. 247:4633-4640(1972).

15 43) Lee-Huang, S. Proc. Nat’l Acad. Sei. U.S.A. 81:2708-2712 (1984).

44) Fyhrquist, F.,Rosenlof, K.,Gronhagen-Riska, C.,Hortling, L. j a Tikkanen, I. Nature 308:649-562 (1984).

,:, 20 45) Ohkubo, H.,Kageyama, R.,Vjihara, M.,Hirose, T.,Inayama, S.jaNakanis- hi. S. Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 80:2196-2200 Π983).

• * * · • · · 46) Suggs, S.V.,Wallace, R.B.,Hirose, T.,Kawashima, E.H. ja Itakura, K. Proc.

:T: Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 78:6613-6617 Π981Τ • · · ::: 25 47) Woo, S.L.C.,Dugaiczyk, A.,Tsai, M.-J.,Lai, E.C.,Catterall, J.F. ja O’Mal-ley, B.W. Proc.NatT. Acad. Sci. U.S.A. 75:3688- (1978).

♦ : 48) Melchior, W.B. ja VonHippel, P.FL Proc. Nat’l Acad. Soc. U.S.A. 70:298- 30 302 (1973).

57 105347 49) Orosz. J.M. ia Wetmis. J.G. Biopolvmers 16:1183-1199(1977).

50) Anderson, S. ja Kingston, I.B. Proc. Nat’l Acad. Sei. U.S.A. 80:6836-6842 (1983) .

5 51) Ullrich, A., Coussens, L.,Hayflick, J.S.,Dull, T.J.,Gray, A., Tam, A.W., Lee, J.,Yarden, Y.,Libermann, T.A.,Schlessinger, J.,Downward, J.,Mayes, E.L.V.,Whittle, H., Waterfiled, M.D. ja Seeburg, P.H. Nature 309:418-425 (1984) .

10 52) Fisher, J. Proc. Soc. Exptl. Biol ia Med. 173:289-305 (1983).

53) Kozak, M. Nuc. Acid Res. 12:857-872 (1984).

15 54) Benton, W.D. ja Davis, R.W. Science 196:180-182(1977).

55) Sherwood, J.B. ja Goldwasser, E. Blood 54:885-893 (1979).

56) Derman, E.,Krauter, K., Walling, L., Weinberger, C., Ray, M. ja Darnell, ,:, 20 J.T..Cell 23:731-(1981).

57) Gluzman, Y., Cell 23:175-182 (1981).

• · · • » • · · • · · « * 58) Hewick. R.M..Hunkapiller. M.E..Hood. L.E. ia Drever. W.J. J. Biol. Chem.

25 256:7990-7997(1981).

• · · 59) Towbin, H., Stachelin, T. ja Gordon, J.. Proc. Nat’l Acad. Sci. 76:4380- • « · (1979).

:, ,4 30 60) Carnott, P.,DeFlandre, C. C. R. Acad. Sci. Paris 143:432- (I960).

Claims (7)

105347

1. Menetelmä ihmisen erytropoietiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään sopivassa alustassa eukaryoottisia isäntäsoluja, jotka sisältävät taulukossa 3 esitetyn 5 DNA-sekvenssin lähtien sekvenssistä ATG, joka koodittaa aloittavaa Met:ia AGA:han asti, joka koodittaa terminaalista Arg:ia, toiminnallisesti kytkeytyneenä ilmentämistä säätelevään sekvenssiin, ja erotetaan näin muodostunut erytropoietiini soluista ja alustasta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelyalusta sisältää sikiön seerumia.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolut ovat nisäkässoluja. 15

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nisäkässolut ovat COS-, CHO-, C127- tai 3T3-soluja.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nisäkässolut 20 ovat 3T3-soluja.

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nisäkässolut • · ’·.’·· ovat kiinanhamsterin munasarja (CHO) -soluja. • · · • * · « 4 · « *.* * 25

7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi sisältyy vektoriin, joka sisältää myös naudan papillooma-viruksen • · » ’···' DNA:n. • « · 105347