FI104261B - Menetelmä yhdistelmä ihmisen erytropoietiinin tuottamiseksi - Google Patents

Description

5 104261

Menetelmä yhdistelmä ihmisen erytropoietiinin tuottamiseksi Förfarande för producering av rekombinant mänsklig erytropoietin Tämä keksintö kohdistuu ihmisen aktiivisen erytropoietiinin tuottamiseen in vitro ihmisen erytropoietiinin kloonattuun geeniin, jonka ilmentymistaso on yllättävän korkea sekä mainitun geenin ilmentämiseen.

10 Keksinnön taustaa

Erytropoietiini (josta tämän jälkeen käytetään lyhennystä EPO) on kiertävä glykoproteiini, joka kiihottaa erytrosyyttien muodostumista korkeimmissa organismeissa. Katso Carnot et ai, Compt. Rend.. 143:384 (1906). Näin ollen EPO-proteiinia kutsutaan joskus 15 erytrosyyttien muodostumista (erytropoiesis) kiihottavaksi tekijäksi.

Ihmisen erytrosyyttien elinikä on noin 120 vuorokautta. Täten noin 1/120 kaikista erytrosyyteistä tuhoutuu päivittäin retikuloendoteeli-järjestelmässä. Samanaikaisesti erytrosyyttejä muodostuu päivittäin suhteellisen vakiona pysyvä määrä, jotta erytrosyytti-20 taso saataisiin säilymään joka hetki samana (Guyton, Textbook of Medical Physiology, sivut 56-60, W. B. Saunders Co., Philadelpha (1976)).

” Luuytimessä tapahtuva erytroblastien kypsyminen ja erilaistuminen johtaa erytrosyyttien muodostumiseen, ja EPO on tekijä, joka vaikuttaa vähemmän erilaistuneisiin soluihin ja 25 joka indusoi niiden erilaistumista erytrosyyteiksi (Guyton, mainittu edellä).

EPO on lupaava lääkitsevä aine anemian tai erityisesti munuaisanemian kliiniseen hoitoon. EPO-proteiinin käyttö ei ole valitettavasti vielä yleistynyt käytännön lääkintähoidossa, koska sitä on saatavilla vain vähän.

30 Näin ollen, koska EPO on toivottava lääkitsevä aine, niin tämän proteiinin luonnollisiin lähteisiin sovelletut tavanomaiset eristämis- ja puhdistamistekniikat ovat riittämättömiä tämän yhdisteen massatuotantoa ajatellen.

104261 2

Sugimoto et ai. kuvaa US-patenttijulkaisussa n:o 4 377 513 erään menetelmän EPO-proteiinin tuottamiseksi suurina määrinä, tämän menetelmän käsittäessä ihmisen lymfo-blastoidisolujen, kuten Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 ja JBL, moninkertaistamisen in vivo.

5

Muut tutkijat ovat jo esittäneet alan kirjallisuudessa EPO-proteiinin tuottamisen geenitekniikkaa käyttäen. Kuitenkaan alalla ei olla vielä toistaiseksi julkaistu EPO-proteiinin valmistamista mahdollistavaa menetelmää eikä tuotteen kemiallista luonnetta. Tätä vastoin nykyisessä hakemuksessa esitetään menetelmä, joka mahdollistaa sellaisten proteiinien 10 tuottamiseksi suurina määrinä, joilla proteiineilla on ihmisen EPO-proteiinin biologisia ominaisuuksia. Näillä tekniikoilla on samoin mahdollista tuottaa proteiineja, jotka voivat poiketa kemiallisesti ihmisen todellisesta EPO-proteiinista, mutta joilla on kuitenkin samankaltaisia (ja joissakin tapauksissa parempia) ominaisuuksia. Yksinkertaisuuden vuoksi kaikkiin niihin proteiineihin, joilla on ihmisen EPO-proteiinin biologisia ominai-15 suuksia, voidaan tämän jälkeen viitata lyhenteellä EPO riippumatta siitä, ovatko ne kemiallisesti identtisiä ihmisen EPO-proteiinin kanssa vai ei.

Yhteenveto keksinnöstä 20 Tämä keksintö kohdistuu ihmisen aktiivisen EPO-proteiinin massatuotantoon in vitro geenin avulla, joka ilmentää yllättävän suuria määriä ihmisen EPO-proteiinia, tämän geenin kloonaamiseen ja ilmentämiseen. Keksinnössä kuvataan samoin sopivat ilmentämis-vektorit EPO-proteiinin tuottamiseksi, solut, joissa ilmentäminen toteutetaan, puhdistamis-menetelmät sekä muut asiaan liittyvät toimenpiteet.

25

Kuten jäljempänä yksityiskohtaisemmin esitetään, EPO-proteiinia saatiin osittain puhdistuneessa muodossa, ja se puhdistettiin edelleen homogeeniseksi, ja pilkottiin trypsiinillä spesifisten fragmenttien muodostamiseksi. Nämä fragmentit puhdistettiin ja niiden sekvenssit selvitettiin. EPO-oligonukleotidit määritettiin näiden selvitettyjen sekvenssien 30 perusteella ja ne syntetisoitiin. Näitä oligonukleotideja käytettiin ihmisen genomisen kirjaston seulontaan, josta genomisesta kirjastosta EPO-geeni eristettiin, 104261 3 EPO-geeni varmistettiin DNA-sekvenssinsä perusteella, joka DNA-sekvenssi oli yhtäpitävä monen sellaisen tryptisen proteiinifragmentin, jonka sekvenssi oli selvitetty, kanssa. Tämän jälkeen genomisen kloonin palaa ja hybridisaatiota käyttäen osoitettiin, että EPO mRNA:ta voidaan todeta ihmissikiön (20 viikon ikäinen) mRNA:ssa. cDNA-kirjasto 5 valmistettiin ihmissikiön maksasta ja se seulottiin. Tällöin saatiin kolme EPO-proteiinin cDNA-kloonia (sen jälkeen, kun yli 750 000 yhdistelmää oli seulottu). Todettiin, että kaksi näistä klooneista oli täysipitkää, mikä voitiin päätellä täydellisen koodausketjun perusteella sekä olennaisen 5-alkuisen ja 3-alkuisen, lukuvaiheen läpikäymättömän ketjun perusteella. Nämä cDNA-molekyylit on ilmennetty sekä SV-40-viruksella 10 transformoiduissa apinasoluissa (COS-l-solulinja; Gluzman, Cell 23:175-182 (1981)) että kiinanhamsterin munasarjasoluissa (CHO-solulinja; Urlaub, G. ja Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sei USA 77:4216-4280 (1980)). COS-soluista saatu EPO- proteiini on biologisesti aktiivista EPO-proteiinia sekä in vitro että in vivo. CHO-soluista saatu EPO on samoin biologisesti aktiivista sekä in vitro että in vivo.

15 EPO-proteiinin cDNA-kloonissa on mielenkiintoinen, 14-15 aminohapon (ah) avoin lukukehys, käynnistimen ja päättäjän sijaitessa 20-30 nukleotidiä (nt) koodaavan alueen yläpuolella. Edustava näyte kloonatulla EPO-geenillä transfektoidusta E.colibakteerista on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 20 josta se on saatavana tunnusnumeron ATCC 40153 perusteella.

Piirustusten ia taulukoiden lvhvt kuvaus * · f

Taulukko 1 esittää emäsjärjestystä ihmisen EPO-geenin 87 emäsparin pituisessa eksonis-25 sa;

Kuvio 1 esittää EPO mRNA:n ilmaisemista ihmissikiön maksasta saadusta mRNA:sta;

Taulukko 2 esittää aminohappojärjestystä EPO-proteiinissa, joka on johdettu lambda-30 HEPOFL13-ketjun nukleotidijärjestyksestä;

Taulukko 3 esittää EPO cDNA:n nukleotidijärjestystä lambda-HEPOFL13-ketjussa (esitetään kaavamaisesti kuviossa 2) sekä siitä johdettua aminohapposekvenssiä; 4 104261

Kuvio 3 esittää ihmisen EPO-proteiiniin liittyvästä neljästä riippumattomasta genomi-sesta kloonista peräisin olevan DNA-istutteen suhteellisia asemia;

Kuvio 4 esittää karttaa ihmisen EPO-geenin ilmeisestä introni- ja eksonirakenteesta; 5

Taulukko 4 esittää DNAsekvenssiä kuviossa 4B esitetyssä EPO-geenissä;

Kuviot 5A,5B ja 5C esittävät vektorin 91023 (B) muodostamista; 10 Kuvio 6 esittää SDS-polyakryyliamidigeelillä toteutettua analyysiä COS-1-soluissa muodostetusta EPO-proteiinista verrattuna luonnolliseen EPO-proteiiniin;

Taulukko 5 esittää EPO-kloonin, lambda-HEPOFL6, nukleotidi-ja vastaavaa aminohappojärjestystä; 15

Taulukko 6 esittää EPO-kloonin, lambda-HEPOFL8, nukleotidi-ja vastaavaa aminohappojärjestystä;

Taulukko 7 esittää EPO-kloonin, lambda-HEPOFL13, nukleotidi- ja vastaavaa 20 aminohappojärjestystä;

Kuvio 7 esittää kaavamaisesti plasmidia pRKl-4; sekä

Kuvio 8 esittää kaavamaisesti plasmidia pdBPV-MMTneo(342-12).

25

Yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö kohdistuu EPO-geenien kloonaamiseen sekä EPO-proteiinin tuottamiseen ilmentämällä näitä geenejä in vitro.

30

Patenttijulkaisuissa ja tieteellisessä kirjallisuudessa esitetään runsaasti menetelmiä, joita on todettu voitavan käyttää yhdistelmätuotteiden tuottamiseen. Yleisesti ottaen näihin menetelmiin liittyy toivotun geenisekvenssin eristäminen tai syntetisoiminen, sekä tämän 104261 5 sekvenssin ilmentäminen joko prokarioottisessa tai eukarioottisessa solussa käyttäen tekniikoita, jotka ovat tuttuja alan asiantuntijalle. Sen jälkeen, kun kyseinen geeni on eristetty, puhdistettu ja istutettu siirtovektoriin (eli kloonattu), niin sen saatavuus olennaisina määrinä on varmistettu. Vektori ja siinä oleva kloonattu geeni siirretään sopivaan 5 mikro-organismiin tai solulinjaan, esimerkiksi bakteeri-, hiiva- tai nisäkässoluun, kuten COS-l-solulinjaan(apinanmunuaisesta), CHO-solulinjaan(kiinanhamsterinmunasoluista), hyönteisestä saatuun solulinjaan, tai muuhun vastaavaan, jossa vektori monistuu mikro-organismin tai solulinjan lisääntyessä, ja josta vektori voidaan eristää tavanomaisia toimenpiteitä käyttäen. Täten saadaan aikaan geenin jatkuvasti uusiutuva lähde, ja 10 geeniä voidaan edelleen manipuloida, muuntaa ja siirtää muihin vektoreihin tai toisiin kohtiin samassa vektorissa.

Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle menetelmälle yhdistelmä ihmisen erytropoietiinin (hEPO) tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet 15 (a) viljellään sopivassa väliaineessa CHO-soluja, jotka sisältävät, toiminnallisesti kytkeytyneenä ilmentämistä säätelevään sekvenssiin, hEPOrta koodaavan DNA-sekvenssin, ja (b) otetaan talteen ja erotetaan tuotettu yhdistelmä hEPO soluista ja väliaineesta, 20 on tunnusomaista se, että käytetään CHO-soluja, joilla on kyky tuottaa N- ja O-kytkey-tynyttä glykosylaatiota fukoosia ja N-asetyyligalaktosamiinia sisällyttämällä, ja että yhdistelmä hEPO, jossa on N- ja O-kytkeytynyttä glykosylaatiota, otetaan talteen ja erotetaan soluista ja väliaineesta.

25 Ilmentymiseen voidaan usein päästä siirtämällä kloonattu geeni asianmukaisesti suuntautuneena ja asianmukaisessa lukukehyksessä siirtovektorin asianmukaiseen kohtaan siten, . . että prokarioottisen tai eukarioottisen geenin luenta johtaa kloonatun geenin koodaaman amino happo ketjun käsittävän proteiinin esiasteen synteesiin, joka geeni on liittynyt Met-jäännökseen tai prokarioottisesta tai eukarioottisesta geenistä peräisin olevaan amino-30 päätteiseen ketjuun. Muissa tapauksissa kopioitumisen ja luennan käynnistyssignaalit voidaan saada kloonatun geenin sopivan genomisen fragmentin avulla. Lukuisia spesifisiä proteiinien pilkkomistekniikoita voidaan käyttää mahdollisesti muodostuneen proteiinin esiasteen pilkkomiseksi toivotusta kohdasta, jotta toivottu aminohapposekvenssi saataisiin 6 1C4261 irrotetuksi, joka aminohapposekvenssi voidaan tämän jälkeen puhdistaa tavanomaisia toimenpiteitä käyttäen. Eräissä tapauksissa toivotun aminohapposekvenssin sisältävää proteiinia voidaan tuottaa ilman, että tarvittaisiin näitä spesifisiä pilkkomistekniikoita, ja sitä voi myös vapautua soluista solujen ulkopuoliseen kasvatusalustaan.

5

Ihmisen EPO-proteiiniin liittyvän genomisen kloonin eristäminen

Ihmisen EPO puhdistettiin homogeeniseksi lähtien aplastisesta anemiasta kärsivien potilaiden virtsasta, kuten jäljempänä esitetään. Tämä puhdistettu EPO pilkottiin täydelli-10 sesti trypsiiniproteaasilla, ja saadut fragmentit erotettiin käänteisfaasia käyttäen korkean erotuskyvyn nestekromatografian avulla, ja ne otettiin talteen gradienttiajon fraktioista, ja niiden aminohapposekvenssi määritettiin mikrosekvenssianalyysin avulla. Tryptisten fragmenttien sekvenssit on alleviivattu taulukoissa 2 ja 3, ja niitä tarkastellaan yksityiskohtaisemmin jäljempänä. Kaksi näistä aminohapposekvensseistä Val-Asn-Phe-TyrAla-15 Trp-Lys ja Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg, valittiin oligonukleotidikoettimien valmistamista varten (ensimmäisestä tryptisestä kappaleesta saatiin tulokseksi oligonukleotidi-joukko, jossa pituus oli 17 nukleotidiä ja jossa degeneraatio oli 32-kertainen, sekä oligonukleotidijoukko, jossa pituus oli 18 nukleotidiä ja jossa degeneraatio oli 128-kertainen, ja jälkimmäisestä tryptisestä kappaleesta, vastaavasti, kaksi oligonukleotidi-20 joukkoa, joissa pituus oli 14 nukleotidiä ja joissa molemmissa degeneraatio oli 48-kertainen). 32-kertaisesti degeneroituneella 17-meerien joukolla seulottiin ihmisen genominen DNA-kirjasto Ch4A-vektorissa (22) käyttäen muunnosta tutkijoiden Woo ja O’Malley in situ monistamistoimenpiteestä (47) seulontaan tarvittavien suodattimien valmistamiseksi.

25

Ohessa, suluissa esitetyillä arabialaisilla numeroilla (1)-(61) viitataan julkaisuihin, jotka luetellaan numerojärjestyksessä tämän selitysosan lopussa.

17-meeriin hybridisoituvat faagit kerättiin, yhdistettiin pieniksi ryhmiksi ja niiden 30 koettimina käytettiin 14-meerien ja 18-meerien joukkoja. 17-meerien, 18-meerien ja 14-meerien joukkoon hybridisoituvien faagien faagitäplät puhdistettiin, ja niiden fragmentteja alikloonattiin M13-vektoreihin sekvenssin selvittämiseksi ketjun päättymisen dideoksi-menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa Sanger ja Coulson (23) (1977).

7 104261

£ S M

Ho < >,

< S < hO

fcd H e U n g < S u u £f ·*-« aj < < H H o *- o ^ ho 5 ° 3 Q - ? ho < ,H O J® bo to DG OC g, 3 B c * t. 5 O < 10 < >> g S ^ -s ho ti 8 P 3 S o §

n ^ o ^ x: tD

o H tJ .H Oi J3

-rt CO

O to h O H rt *- bo tC f-< ^ c «-* t7 ζ> a < M -rt ~ < CO < < ϋ p Ξ § P/ a ho O ρ*ϊ c-1 a cj

ho H O U > ~ S

ho ^ 3 υ < „ S i - < .2 < >, 2 £ O Um < H -rt O -rt to ti

a < U ^ tJ

to < £ o ä ti

n CT O < H O CJ

O w w rj -rt

O tl CO

’· bD r, Γ-) r· hfl ho G ^ Un ti; *_, M U t < w 3 Λ « o< c< g, a *4 c to H ω < 0 O ^ to o >> o 2 < .H bo hL HUOJUU g5

rt CO

o O ^ ^ H bo :· toc—HaHco*^ g <3 u O > < s S, -*-· bo o rr, , t7 o Ο^Η^,Ο^ +-.

^ oo:u^u^ ti bo < H < H < < a 8 104261 o >- u ci —i M 7·

Q_ CP O ^ Oi" O

evä j »n H o -¾ OO —i r* >- LO co 0 ,3

cj —J ~ O

— p 3 C C

e? > u < u' ^2 9 3 3 >>

a; ci. ^ 3 U

—I =3 _ c — <r lu g m e > -J j < > >* ^ c, 3 3 O O ,d 2 3 kk 3 Ej S | I 2T —1 < W s O t/3 to 3i 3 >, u u O <ί

3 g .2 £J

r, —· j J

^ cc „ a ϊ tel -3 ii

- <^ > C3 H

< _ ΓΤ· te co e 9 o - o - O - —1 k. < en < tn < «v« CC CO- L-J £ >> ^ —! cc O E-1 3 “ 2 ^ < Uj c-

9 n - * C

P > -Cl w —1 U H1 < P ^ _ —“* o ö —* ~ H >

=> - CO

9 S ϋ >p • \ ' — »-< te e! £

u wl "C

< <1 H

S e 3 C.

L—- y X w -* £ e < Q_

ex O 03 O

t_ e. •“O e* ^ C. < e- <=r _ _ _ “ ~ = 0. =.5 «,- ο. 104261 O Ο o u ri ° g £ S w W -< J ^ ^ _ Md 5 e o j: := < > = < u O ϊχ c CO e £ £ c: < < ^ c ,* _« C-ι f-< >> " B -c j=

c| *J O H H

tu a m £ b

t- <λ * i? C

D — C ra 3 o n — ·τ ^

Jj > O < *-= t- y> a .2 5 -c * > E < E-

=» E ^ O O

<; >x O ·-* ^ ..-5 X O'.

~ — o ~ c c ^ ^ u u 3 a y >' Q - ^ < a o " = o 0^0= o tf .2, o1- ~ 'f, c S_' _J Cl CL, --H < >-< *- r-<<.

r~l 3 3 3 ° 3 £ S - O ^ « d J a ~ ^ ^

H 22 ^ S 5 S

• ^

5 2 f | I

►J tX H < < >, C U U ° L? „ _ JS v ai es ^ 'S C H OT cc t-< < , — tl C.

.£ fe 2 ~ ” a w j < f-4 < G. l·. tl CJ ·“ >> *- 0) o — "> rr H M W < >" ^ _ c| tfi O. tel e

> <| < < < H

3 — 3 O Ή £ ca o *- -C *- C > ui o- a- < _ -3^03^ ca <u i* <D ^ > .u o ^1 —J ° 10 104261 u u u OO OH HU <Λθ UH «5 0 3 O O n H Cl h C5 ω n cu uu o h < O x: u o h u Ooh o u o Sou

Uj «3 HO UU eg n < -J H *·. O < U co n u u υ u u ° <j 60 H U O CO o u CU CO —(U ou H u HU UH ·—* U H H —I < —u n h n o UH HU < U H < UU <u >U ►_ < 00 00

u ω =5 < H.U 3 U CH CU CU «U CU

u 03 H < .Λ **; H —< < -CtO»C ·—<< —, < —HU —< u £ 2j u u"*<3 >U uu <<4 UU uu < o <u O u n· 13 uu o< 3 0 3 U HU >U w< -<f

u to t-t <; HU u H ·—< < h u —, u >. «J JS

“ “ = O HO HH UU UU UU H 2 UU

M U

HO UU 3 U CH —I U ωο CH tn O

< H U H u H in <J 13 H HO/ MC

> U HU HU < < > b <U CU h5 U U —- u o <4 -<3 u u HU HU Ho 3 U 30 3U — U c

CO vj HO HU HC O H *—< < o H CH HC

U CJ OU UU HH HH UU HU >U UU

03 00 w un j υ M f" H O O U cqu l-ι O n o HU ioh cu α υ . n u) h W H n u u u oh oh h < _ u U <-> I h < HU << O < 2 < >u r O c u OH 30 (25 O CO O C3 H 3U H<

U 63 00 HU Hca^cj HU HU a H hU

CO U a HU U U co U H << CU HU UO

63 u CO

CO O 00

eo o u u u su au au 3< au 3U

o CO BO U H CI H H «3 HC hC — J < OH

u H O HU HU 33 U H *4 UU UU HU

CU 03

CC U CO

M U <3 HU —<0 3 C C. O HU 30 CH

HU CH hC HU UU OH HU

c/5H >U OU HH co H HU < o

U 03 U

u 60 U OU td < CH CU 3U c| U O do

60 u 63 HH OHU Uho O *-* U O o H O h u — U|U

a u 60 HU —CO O < U cncu r* H U CT» cJ U —I <| H

H 03 u tl

H C3 U II

O 63 U OU HU C H Hi- 3 0 3' O 31' — n h a HU 0" ( *o o u t— tr— H HU O O —; Ή M CO | HU du du CU CU du 3 0

HU (M < —tiu JZ H —i U HO O H

U 63 OH <U O, U HH <U HH HU

U CO

u a ,

co 60 23 O mH HU CH 30 CU HH

63 *J H H H >1 U —I u t/ll < OH HU HU

. Π O HU HUH H < <1*4 HU HU H<

• · U 63 I

U u 1 <*J

H Hl HU OU HU h h >%u CO HU

U tO HH —i H -CU C H -HO —' < -CU

HU H < H< 3>U UU UU H <

O 60 3D H 3 U OU <n«C CO HU 3U

i-ι O HH OH — H >-, < —1< OU OH

U U HU HU h < H «2 UU c/5 H HU

H (J

tn o u ,

U u O. u K U H H HU CuO HH HU

O u to cd U I·· o ' « »I < -CU HU o, U OU

ti to U HH <U <'< H < HH to H 0-5 <

^ o to I

—3 υ u i ~5 350 C < 30 C.U HO c, u uu

, G HH HU -*< KI< UH « w < HU

% HU HU UU CO >U </< <U

5 to to o to

U U HU 0< CU O -< 3 < HU / 3 H

C u HU HU H U HU H < <C H O H

to u H H HU <U HU OO >U HU

to a

h (J

<J u <U (ClU 3 U HU H< 30 5Η U

(J CO HU .HO CH CH OH HU

o 00 <U —< < O UU 3»U > O HH UU

104261 Ο ί,ο Ο α U u (j nj CO*-» οο&ου -τ >> < ό -« Ο <-> *j co π ti η <- υ —> —ι ·< χ «ra ο m co ra ti toe eου tl4-ioOutltlCOtl <0 tl u tl (0 OO t0 4-1 *B tl tl <0 tl oO CO 4-1 CC U 30 tl CO 4-1 ra n υ ΟΓ3 >- O "-Ί-ί <JQ(jr3C000(j4_4 <C_) OO ratlra4JOOOOraC3 u ti ra u ra m ti 4-1 o u > o

XX -* O

X H O O

Wfc0cj4J<J4J Γ3 £0 «UO0UU4JM4J U (-4 -* «-i CIC3raCOCOtJ4-li-l

X O — o UOtOnJunuU

H «i f- C *->unjur3r3(j4j 04j ta co co co ti co . <J(Jrara4-iratira X O 1-40 ra CO CJ CO -4-J COU ra

C< > < Unuc34_icOUU

«CO e— H Uti4Jtan4-ic0U

C E-C 3 0

χ O C H

< O X O

rauooranurau UUiJOCJUCOCO U X (15 O U4-ICJ4JC3C3CCCO

XO > < 4_i<jra4_iticaraea X < X < nC0nraC04JUC0 u CO OO tl 4-1 fi CO 4-1 ra co co ta cj ta co ra ei u 30 cicamncjcouti ·—< e—· ra x coraeorauracoi-i 4— < .X o tacon co a u co cj u < ra u X O >. < Γ3 H < X < a ta cl e) CO cl ra 4_i u ra uuuracaeoucia tq < >4 < ei co co o totau to ra u o —i O ciucoeoucocicora < o OO raucora-4-inu4_ir: uueotouoijora 'χ , uurararatJtj4-ira ra 0 3 0 o to O 4-<au ci ci ra a ci a O n e X en m CJ tora^joutiuura X —1 x ’j " < ϋ ucocicioueacora

3 I

—i C < 3l O

- u olH

X O XI O CO

4JU4jcocoracoooc tao ra to ra u t04jra e ran co taoocotaui-iuo x >— I o xl H ra4Jrara-4-iuratau χ <o x X oueotooraotara o ora4jAJuutatau x o raooatoeoeou o ra X e <urauuototocj C -—o f. < • Otocirarauc>4jra f- <0 < < Xcicoracaurarara U < 1-0 VO to < O O CO VO l-ι o ot e—· ta H —· < < ciraorauueoea

Cl (J Cl (0 4-J 4-1 CO 4-t rao u o xo t» ti co co co cj ra ei

4-1 o >< V)<UtOCOC04J4-ltlC

<0 t—' t—4 «co4-i4jcototitorara u cora4-i u ta M co tiratitirararara rao 4-40 VtOuuracouurara 4—4 o rai-* xo ra ti ti 4-I 4-4 u toti < O > O OOU4J4Jra4-lutlC3 cj x ta <: u < tn -e 1« o x o ; < O < U X <

Π3 tj GO o Π <J C

. CJfTJiXU C3^C/4-* O << cj O cw O o (j rjeou^J cj*-» J- CJ -CM M (J CO ra CO Π COU ria G- CJ 0«. H cO CO CO CO Π rj cj COoan Π n öj CO m»

4-J rj U CÖ *-» CO U

OM CO W CJ *-» ro n CO CO CO u M O O M X >· O U (J O CO ix 4^ *-» Γ3 0.0 MO C/3 O M CJ U *-> Cj 4J <j 00 rg 12 104261

Taulukossa 1 esitetään 32-kertaisesti degeneroituneeseen 17-meeriin hybridisoituvan alueen järjestys yhdessä kloonissa. Tämä DNA-ketju sisältää avoimessa lukukehyksessä nukleotidit, jotka voisivat koodata täsmällisesti sitä tryptistä fragmenttia, jota käytettiin oligonukleotidien 17-meerien joukon päättelyyn. Lisäksi DNA-ketjun 5 analyysi osoitti, että 17-meerinen hybridisoituva alue sisältyi 87 emäsparin eksoniin, jatkoksen mahdollisen vastaanottaja- ja luovuttajakohdan sitomana.

Luotettavaa tietoa siitä, että nämä kaksi kloonia (joista käytetään ohessa nimityksiä lambda-HEPOl ja lambda-HEP02) ovat EPO-proteiiniin liittyviä genomisia klooneja, 10 on saatu määrittämällä sekvenssi muissa sellaisissa eksoneissa, jotka sisältävät tryptisiä fragmentteja koodaavaa muuta informaatiota.

EPO-proteiinin cDNA-kloonien eristäminen 15 Ihmissikiön (20 viikon ikäinen) maksasta saadun mRNA:n Northern:in analyysi (56) toteutettiin käyttäen 95 nukleotidin pituista yksijuosteista koetinta, joka oli valmistettu osan taulukossa 1 kuvatusta, 87 emäsparin pituisesta eksonista sisältävästä M13-kloonista. Kuten kuviossa 1 esitetään, sikiön maksan mRNAista voitiin todeta vahva signaali. Tämän vyöhykkeen täsmällinen tunnistaminen EPO mRNA:ksi oli mahdollista 20 käyttäen samaa koetinta, jolla voidaan seuloa sikiön maksasta saadun mRNA:n cDNA-kirjasto lambda-bakteriofaagissa. Lukuisia hybridisoituvia klooneja saatiin, esiintymistiheyden ollessa suurin piirtein 1 positiivinen 250 000 seulottua yhdistelmää kohden. Taulukoissa 5 ja 6 esitetään näiden kloonien (lambda-HEPOFL13 ja lambda-HE-POFL8) täydellinen nukleotidisekvenssi sekä siitä johdettu aminohapposekvenssi. EPO-25 proteiinia koodaava informaatio sisältyy 594 nukleotidiin cDNA-molekyylin 5-alkuisessa puoliskossa, käsittäen samoin erittäin hydrofobisen, 27 aminohappojäännöksestä • muodostuvan johtoketjun sekä 166 aminohappoj äännöksestä muodostuvan kypsän proteiinin.

30 Kypsän proteiinin N-päätteen tunnistaminen perustui aplastisesta anemiasta kärsivien henkilöiden virtsaan erittyneen proteiinin N-päätteiseen ketjuun, kuten ohessa esitetään 13 104261 (taulukko 1), ja kuten esitetään julkaisuissa Goldwasser (26), Sue ja Sytkowski (27) sekä Yangawa (21). Tällä hetkellä ei tiedetä, onko tämä N-pääte (Ala-Pro-Pro-Arg— ) kiertävän EPO-proteiinin todellinen N-pääte, vai tapahtuuko munuaisissa tai virtsassa proteiinin tiettyä pilkkoutumista.

5

Taulukoissa 2 ja 3 alleviivatut aminohappoketjut esittävät niitä tryptisiä kappaleita tai N-päätteen osaa, joiden tapauksessa proteiiniketjuun liittyvää informaatiota saatiin. Päätelty aminohappoketju on täsmälleen yhtäpitävä niiden tryptisten fragmenttien kanssa, joiden järjestys on selvitetty, mikä vahvistaa sen, että eristetty geeni koodaa 10 ihmisen EPO-proteiinia.

Ihmisen EPO-eeenin rakenne ia iäriestvs

Kuviossa 3 esitetään ihmisen EPO-proteiiniin liittyvästä neljästä riippumattomasta 15 genomisesta kloonista saatujen DNA-istutteiden suhteelliset asemat. Näiden kloonattujen DNA-ketjujen hybridisaatioanalyysi oligonukleotidikoettimilla sekä erilaisilla, EPO cDNA-kloonien kahdesta luokasta valmistetuilla koettimilla osoitti, että EPO-geeni sijaitsee suurin piirtein 3,3 kiloemäsparin suuruisessa alueessa, joka kuviossa 3 esitetään tummennetulla viivalla. Tämän alueen täydellinen sekvenssianalyysi (katso 20 esimerkki 4) ja vertaaminen cDNA-klooneihin motti tulokseksi kuviossa 4 esitetyn EPO-geenin introni-ja eksonirakenteen kartan. EPO-geeni jakautuu 5 eksoniin. Osa eksonista I, koko eksoni II, III ja IV, sekä osa eksonista V, sisältää proteiinin koodautumiseen liittyvää informaatiota. Eksonien I ja V loppuosa koodaa luentavaiheen läpikäymä-töntä, 5-alkuista ja 3-alkuista ketjua, vastaavasti.

25 EPO-proteiinin väliaikainen ilmentäminen COS-soluissa

Jotta voitaisiin osoittaa, että biologisesti aktiivista EPO-proteiinia saadaan ilmennetyksi in vitro soluviljelyjärjestelmässä, COS-soluilla toteutettiin ilmentämiseen liittyviä 30 tutkimuksia (58). Näissä välitutkimuksissa käytetty vektori, p91023 (B), kuvataan esimerkissä 5. Tämä vektori sisältää adenoviruksen pääasiallisen myöhäisen promoot- 14 104261 torin, SV40-viruksen polyadenylaatiosekvenssin, SV40-viruksesta replikaation alkupisteen, SV40-edistimen, sekä adenoviruksen VA-geenin. cDNA-istute lambda-HEPOFL13-kloonissa (katso taulukko 6) istutettiin p91023 (B)-vektoriin, alaspäin adenoviruksen pääasiallisesta myöhäisestä promoottorista. Tästä uudesta vektorista 5 käytetään nimitystä pPTFLl3.

24 tunnin kuluttua siitä, kun tämä muodoste oli transfektoitu COS-l-solujen M6-kantaan (Horowitz et ai, J. Mol. AdpI. Genet. 2:147-149 (1983)), solut pestiin, siirrettiin seerumia sisältämättömään alustaan, ja solut otettiin talteen 48 tuntia 10 myöhemmin. Tämän jälkeen viljelmästä saatuun supematanttiin vapautuneen EPO-proteiinin määrä määritettiin EPO-proteiinille soveltuvalla kvantitatiivisellä radioim-munokokeella (55). Kuten taulukosta 8 nähdään, (esimerkki 6), ilmentynyt EPO oli immunologisesti reaktiivista. Samoin määritettiin COS-1-soluista vapautuneen EPO-proteiinin biologinen aktiivisuus. Erillisessä kokeessa vektori, joka sisälsi lambda-15 HEPOFL13-kloonista peräisin olevan EPO cDNArn, transfektoitiin COS-1-soluihin, ja alusta otettiin talteen edellä kuvatusti. Sitten alustan sisältämä EPO kvantitoitiin jommalla kummalla biologisella in vitro kokella, 3H-trymidiini ja CFU-E (12,29), ja jommalla kummalla in vivo kokeella, hypoksinen hiirikoe ja ruuatta pidetty rottakoe (30,31) (katso taulukko 9, esimerkki 7). Nämä tulokset osoittavat, että COS-1-soluissa 20 muodostuu biologisesti aktiivista EPO-proteiinia. Western: in täplitysmenetelmän perusteella, käyttäen polyklonaalista anti-EPO-vasta-ainetta, COS-solujen muodostaman EPO-proteiinin liikkuvuus SDS-polyakryyliamidigeeleillä on identtinen ihmisen virtsasta eristetyn luonnollisen EPO-proteiinin liikkuvuuden kanssa (esimerkki 8). Täten COS-1-soluissa syntyneen EPO-proteiinin glykosylaatioaste voi olla samankaltainen kuin 25 luonnollisella EPO-proteiinilla.

Erilaisia, muita promottoreita sisältäviä vektoreita voidaan myös käyttää COS-soluissa, tai muissa nisäkässoluissa tai eukarioottisissa soluissa. Esimerkkeinä tällaisista muista, tämän keksinnön käytännön sovellutuksissa käyttökelpoisista promoottoreista 30 mainittakoon SV40-viruksen varhainen ja myöhäinen promoottori, hiiren metallotione-iinigeenin promoottori, promoottori, joka on löydetty lintujen tai nisäkkäiden retro- 15 104261 viruksissa esiintyvistä pitkistä päätteen toistoista, bacculoviruksen polyhedronigeenin promoottori ja muut. Esimerkkeinä muista, tämän keksinnön käytännön sovellutuksissa käyttökelpoisista solutyypeistä mainittakoon E. coli, hiiva, nisäkässolut, kuten CHO (kiinanhamsterin munasarjasolut), Cl27 (apinan epiteelisolut), 3T3 (hiiren fibroblas-5 tisolut), CV-1 (afrikkalaisen vihreän marakatin munuaissolut), sekä hyönteissolut, jotka on saatu esimerkiksi lajeista Spodoptera frugiperda ja Drosophila metanogaster. Nämä vaihtoehtoiset promoottorit ja/tai solutyypit saattavat mahdollistaa sen, että EPO-proteiinin ilmentymisen ajoittumista tai tasoa voidaan säätää, tai että saadaan muodostumaan soluille spesifistä EPO-tyyppiä, tai että EPO-proteiinia tuottavia soluja voidaan 10 kasvattaa suuria määriä kustannuksiltaan alhaisemmissa, helpommin säädettävissä olevissa olosuhteissa.

Ilmentämisjärjestelmä, jossa nisäkässoluissa toteutetun ilmentämisen edut saadaan säilymään, mutta joka tarvitsee vähemmän aikaa muodostaakseen erittäin hyvin 15 ilmentävän solulinjan, muodostetaan hyönteisen solulinjasta sekä DNA-viruksesta, joka lisääntyy tässä solulinjassa. Tämä virus on nukleaarinen (tumahakuinen) polyhe-droosivirus. Sen perimä muodostuu kaksijuosteisesta rengasmaisesta DNA:sta, jonka pituus on 128 kiloemäsparia. Nukleokapsidi on sauvan muotoinen ja sen on todettu pakkautuvan kahteen muotoon, sulkeutumattomaan muotoon, jolloin virus on peittynyt 20 kalvolla, sekä sulkeutuneeseen muotoon, jolloin virus on pakkautunut proteiinikiteisiin infektoituneessa solutumassa. Nämä virukset voidaan saada lisääntymään tavanomaisesti in vitro hyönteissolujen viljelmässä, ja niihin voidaan soveltaa kaikkia eläinten virologiassa käytettyjä rutiinimenetelmiä. Solujen viljelyalusta on tyypillisesti ravin-nesuolaliuos, joka sisältää 10 % sikiöasteisen vasikan seerumia.

25

In vitro, viruksen kasvu käynnistyy, kun sulkeutumaton virus (NOV) tunkeutuu soluun '? ja liikkuu tumaan, missä se replikoituu. Replikaatio tapahtuu tumassa. Virusaltistamisen alkuvaiheessa (8-18 tuntia infektion jälkeen) nukleokapsidit kerääntyvät tumaan, jonka jälkeen ne työntyvät plasmamembraanin läpi NOV-muodossa, jolloin infektio leviää 30 koko soluviljemään. Tämän lisäksi jotkut nukleokapsidit jäävät tämän jälkeen (yli 18 tunnin kuluttua infektiosta) tumaan, ja ne sulkeutuvat proteiinimatriisin sisään, jolloin 16 104261 muodostuu polyhedraalinen sulkeumakappale (PIB). Tämä muoto ei aiheuta infektiota soluviljemässä. Matriisi muodostuu proteiinista, joka tunnetaan nimellä polyhedriini, molekyylipaino 33 kilodaltonia. Kukin PIB on halkaisijaltaan suurin piirtein 1 mm suuruinen, ja kussakin tumassa voi olla jopa 100 PIB-muodostelmaa. Polyhedriiniä 5 muodostuu selvästi suuria määriä infektiojakson lopussa, ja sitä voi olla jopa 25 % solun koko proteiinista.

Koska PIB on merkityksetön in vitro replikaatiojaksossa, niin polyhedriinin geeni voidaan hävittää viruksen kromosomista vaikuttamatta lainkaan viruksen in vitro 10 elinkykyyn. Kun tätä virusta käytetään ilmentämisvektorina, niin tällöin polyhe-driinigeenin koodausalue korvataan ilmennettävällä vieraalla DNA :11a, joka sijoitetaan polyhedriinin promoottorin säätelyn alaisuuteen. Tämä johtaa viruksen fenotyyppiin, joka ei muodosta PIB-muotoa.

15 Useat tutkijat, joista mainittakoon erityisesti Pennock et ai. sekä Smith et ai. ovat käyttäneet tätä järjestelmää. Pennock et ai. (Gregory D. Pennock, Charles Shoemaker ja Lois K. Miller Molecular and Cell Biology 384, sivut 399-406) ovat esittäneet bakteeriperäisen proteiinin, β-galaktosidaasin, suurten määrien ilmentymisen, kun geeni on ollut polyhedriinin promoottorin säätelyn alaisuudessa.

20

Smith et ai. (Gale E. Smith, Max D. Summers ja M. J. Fraser, Molecular and Cell ' Biology, toukokuu 16., 1983, sivut 2156-2165) ovat esittäneet toisen ilmentämisvekto rin, joka on saatu tumahakuisesta polyhedroosiviruksesta. Nämä tutkijat ovat osoittaneet tämän vektorin tehokkuuden ihmisen β-interferonia ilmentämällä. Syntetoitunut tuote 25 todettiin glykosyloituneeksi ja se erittyi hyönteissoluista odotuksia vastaten. Esimerkissä 14 kuvataan plasmidin. joka sisältää polyhedronigeenin Autographa californica-hyöntei-sen tumahakuisesta polyhedroosiviruksesta (AcNPV), muunnoksia, jotka mahdollistavat EPO-geenin vaivattoman istuttamisen plasmidiin siten, että se on polyhedriinin promoottorin kopioitumiseen kohdistuvan säätelyn alaisuudessa. Tuloksena oleva DNA transfek-30 toidaan yhdessä villityypin AcNPV-viruksesta peräisin olevan täydellisen kromosomi-DNA:n kanssa hyönteissoluihin. Geneettinen yhdistäminen johtaa siihen, että 17 104261

AcNPVC:stä saatu polyhedriinigeenin alue korvautuu plasmidista peräisin olevalla DNA:lla. Tuloksena oleva yhdistelmävirus voidaan tunnistaa virusjälkeläisten joukosta sillä perusteella, että siinä on DNA-ketjuja EPO-geenistä. Kun tämä yhdistelmäviruk-sella infektoidaan uudestaan hyönteissoluja, niin sen voidaan odottaa tuottavan EPO-5 proteiinia.

Esimerkkejä EPO-proteiinin ilmentymisestä CHO-, Cl27- ja 3T3-soluissa sekä hyönteissoluissa, esitetään esimerkeissä 10 ja 11 (CHO), 13 (C127 ja 3T3) sekä 14 (hyönteissolut).

10 CHO-soluissa muodostunut yhdistelmä-EPO, kuten esimerkissä 11 esitetään, puhdistettiin tavanomaisia pylväskromatografisia menetelmiä käyttäen. Glykoproteiinissa läsnäolevien sokereiden suhteelliset määrät analysoitiin kahdella toisistaan riippumattomalla menetelmällä [(i) Reinhold, Methos in Enzymol. 50:244-249 (metanolyysi) sekä 15 (ii) Takemoto, H. et ai., Anal. Biochem. 145:245 (1985) (pyridyyliaminaatio, ja samalla riippumaton sialiinihapon määrittäminen)]. Kummallakin menetelmällä saadut tulokset olivat erinomaisella tavalla yhtäpitävät. Täten tehtiin useita määrityksiä, joista saatiin seuraavat keskiarvot siten, että vertaamisen helpottamiseksi N-asetyyliglukosamiinille annetaan arvoksi 1: 20

Sokeri Suhteellinen molaarinen määrä * N-asetyyliglukosamiini 1

Heksoosit: 1,4

Galaktoosi 0,9 25 Mannoosi 0,5 N-asetyylineuramiinihappo 1 * Fukoosi 0,2 N-asetyyligalaktosamiini 0,1.

30 Huomattakoon, että merkittäviä määriä fukoosia ja N-asetyyligalaktosamiinia todettiin toistettavasti käyttäen sokerianalyysissä molempia riippumattomia menetelmiä. N- 18 104261 asetyyligalaktosamiinin läsnäolo osoittaa, että proteiinissa on läsnä O-kytkeytynyttä glykosylaatiota. O-kytkeytyneen glykosylaation läsnäolo osoitettiin edelleen glykoprote-iinin SDS-PAGE-analyysillä sen jälkeen, kun glykoproteiini oli pilkottu glykosidisten entsyymien erilaisilla yhdistelmillä. Erityisesti, sen jälkeen, kun glykoproteiineista oli 5 poistettu entsymaattisesti kaikki N-kytkeytyneet hiilihydraatit käyttäen entsyymiä peptidi-endo-F N-glykosidaasi, niin proteiinin molekyylipaino pieneni edelleen, kun se tämän jälkeen pilkottiin neuramiinidaasilla, kuten SDS-PAGE-analyysi osoitti.

Puhdistetun yhdistelmä-EPO-proteiinin in vitro biologinen aktiivisuus määritettiin 10 menetelmällä, joka esitetään julkaisussa G. Krystal, Exp. Hematol. 11:649 (1983) (pernasolujen lisääntymisen biologinen määritys) laskettujen proteiinimääritysten perustuessa aminohappokoostumukseen liittyvään tietoon. Useiden määritysten perusteella puhdistetun yhdistelmä-EPO-proteiinin in vitro ominaisaktiivisuuden laskettiin olevan suurempi kuin 200 000 yksikköä/mg proteiinia. Keskiarvo oli suurin 15 piirtein alueella 275 000 - 300 000 yksikköä/mg proteiinia. Lisäksi on todettu arvoja, jotka ovat suurempia kuin 300 000. Tämän yhdistelmämateriaalin tapauksessa todettu in vivo/in vitro aktiivisuuksien suhde on suurin piirtein alueella 0,7-1,3 (in vivo aktiivisuus: koe polysyteemisellä hiirellä Kazal ja Erslev, Am. Clinical Lab. Sei., Voi. B, sivu 91 (1975)).

20

On mielenkiintoista verrata edellä esitettyä glykoproteiinikarakterisointia niihin CHO- soluissa tuotetun yhdistelmä-EPO-materiaalin tunnusomaisiin piirteisiin, jotka esitetään aikaisemmin julkaistussa kansainvälisessä patenttihakemuksessa, jonka julkaisunumero on WO 85/02610 (julkaistu kesäkuun 20. päivänä 1985). Tämän hakemuksen sivulla 25 65 kuvatussa vastaavassa, vertailevassa sokerianalyysissä fukoosille ja N-asetyyligalak- tosamiinille saatiin arvoksi nolla, ja heksoosien ja N-asetyyligalaktosamiinin väliselle suhteelle arvoksi 15,09:1. N-asetyyligalaktosamiinin puuttuminen osoittaa 0-kytkeyty-neen glykosylaation puuttumisen aikaisemmin esitetystä glykoproteiinista. Toisin kuin tämä materiaali, tämän keksinnön mukainen, CHO-soluilla tuotettu yhdistelmä-EPO, 30 jonka tunnusomaiset piirteet esitetään edellä, sisältää merkittäviä, ja toistettavasti todettavissa olevia määriä sekä fukoosia että N-asetyyligalaktosamiinia, se sisältää • · 19 104261 vähemmän kuin yhden kymmenesosan heksoosien suhteellisesta määrästä, ja sen tunnnusomaisena piirteenä on O-kytkeytyneen glykosylaation läsnäolo. Tämän lisäksi tämän keksinnön mukaisen, edellä kuvatun, CHO-soluista peräisin olevan yhdistelmä-EPO-proteiinin suurta ominaisaktiivisuutta voidaan pitää suoraan verrannollisena sille 5 ominaiseen glykosylaatiokuvioon.

Lääkärit ja/tai eläinlääkärit voivat käyttää tätä biologisesti aktiivista EPO-proteiinia, jota on tuotettu ilmentämällä prokarioottisesti tai eukarioottisesti tämän keksinnön mukaisia kloonattuja EPO-geenejä, eri nisäkkäiden in vivo hoitoon. Annettavan 10 aktiivisen aineen määrä riippuu luonnollisestikin hoidettavan tilan vakavuudesta, valitusta antotavasta, sekä aktiivisen EPO-proteiinin ominaisaktiivisuudesta, ja loppujen lopuksi hoitava lääkäri tai eläinlääkäri päättää annettavan määrän suuruuden. Tällaista aktiivisen EPO-proteiinin määrää, jonka hoitava lääkäri on määrittänyt, kutsutaan ohessa samoin "EPO-hoidossa tehokkaaksi määräksi”. Esimerkiksi hoidettaes-15 sa lampaissa munuaisten krooniseen vajaatoimintaan liittyvää, indusoitua hypoprolifera-tiivista anemiaa, EPO-proteiinin tehokkaan vuorokautisen määrän todettiin olevan 10 yksikköä/kg 15-40 vuorokauden aikana. Katso Eschbach et ai., J. Clin. Invest.. 74:434 (1984).

20 Aktiivista EPO-proteiinia voidaan antaa mitä tahansa sellaista reittiä, joka on asianmukainen käsiteltävän tilan tapauksessa. EPO-proteiini injektoidaan mieluiten käsiteltävän ! nisäkkään verenkiertoon. Alan asiantuntijalle on selvää, että edullisin reitti vaihtelee käsiteltävän tilan mukaan.

25 On mahdollista, että aktiivista EPO-proteiinia annetaan puhtaana tai oleellisesti puhtaana yhdisteenä, mutta sitä annetaan edullisesti farmaseuttisena valmisteena tai seoksena.

Tämän keksinnön mukaiset, sekä eläimille että ihmisille tarkoitetut valmisteet käsittävät edellä kuvattua aktiivista EPO-proteiinia, sekä tälle proteiinille sopivaa, yhtä tai 30 useampaa farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta, ja valinnaisesti myös muita lääkitseviä aineosia. Kantajien tulee olla hyväksyttäviä siinä mielessä, että ne sopivat 20 104261 yhteen valmisteen muiden aineosien kanssa, ja etteivät ne ole haitallisia valmisteen saajalle. On suotavaa, ettei valmiste sisällä hapettavia aineita eikä muita sellaisia aineita, jotka eivät tunnetusti sovi yhteen peptidien kanssa. Valmisteet on vaivattominta valmistaa yksikköannoksiksi, ja niitä voidaan valmistaa millä tahansa farmasiassa hyvin 5 tunnetulla menetelmällä. Kaikki menetelmät käsittävät vaiheen, jossa aktiivinen aineosa tuodaan yhteen kantajan kanssa, joka kantaja käsittää yhtä tai useampaa lisäainetta. Yleisesti, nämä valmisteet valmistetaan siten, että aktiivinen aineosa tuodaan yhteen nestemäisten kantajien tai hienojakoisten kiinteiden kantajien, tai molempien, kanssa, sekoitetaan huolellisesti homogeniseksi, jonka jälkeen tarvittaessa 10 tuote saatetaan toivotun valmisteen muotoon.

Ruuansulatuskanavan ulkopuoliseen antamiseen sopivat valmisteet käsittävät mielellään aktiivisen aineosan steriilin vesiliuoksen, joka on mieluiten isotonista vastaanottajan veren kanssa. Tällaiset valmisteet voidaan valmistaa vaivattomasti liuottamalla kiinteätä 15 aktiivista aineosaa veteen vesiliuoksen tuottamiseksi, jonka jälkeen mainittu liuos steriloidaan yhden annoksen tai useita annoksia sisältävissä säiliöissä, esimerkiksi suljetuissa ampulleissa tai lääkepulloissa.

Ohessa käytettyyn EPO/cDNA:han kuuluu kypsän proteiinin EPO/cDNA-geeni, jota 20 edeltää ATG-kodoni, sekä EPO/cDNA, joka koodaa EPO-proteiinin alleelisia muunnoksia. Yksi alleeli esitetään taulukoissa 2 ja 3. EPO-proteiineja ovat EPO-proteiinin 1-metioniinijohdannainen (Met-EPO) sekä EPO-proteiinin alleeliset muunnokset. Kypsä EPO-proteiini, jota taulukon 2 ketju esittää, alkaa ketjulla Ala.Pro.Pro.Arg..., jonka alku on merkitty numerolla "1" taulukossa 2. Met-EPO alkaa ketjulla Met. Ala.Pro.Pro.-25 Arg...

Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on helpottaa tämän keksinnön ymmärtämistä, jonka keksinnön varsinainen laajuus määritellään liitteenä olevissa patenttivatimuksis-sa. On selvää, että esitettyihin toimenpiteisiin voidaan tehdä muunnoksia tämän 30 keksinnön hengestä poikkeamatta. Kaikki lämpötilat esitetään Celsius-asteina, ja niitä 21 104261 ei olla korjattu. Mikronin tai etuliitteen mikro-, esimerkiksi mikrolitra, mikromooli, jne., symbolina on "μ", esimerkiksi μΐ, μπιοί, jne.

ESIMERKIT

5

Esimerkki I: EPO-proteiinin eenomisen kloonin eristäminen EPO-proteiinia puhdistettiin aplastisesta anemiasta kärsivien potilaiden virtsasta käyttäen olennaisesti menetelmää, joka on esitetty julkaisussa (Miyake, et ai., J. Biol. Chem.. 10 252:5558 (1977)) paitsi ettei fenolikäsittelyä toteutettu, vaan se korvattiin lämpökäsitte lyllä 80°C:n lämpötilassa 5 minuuttia neuraminidaasin inaktivoimiseksi. Puhdistamisen viimeisenä vaiheena oli fraktioihin jako HPLC-kromatografisesti C-4 Vydac-kolonnilla (The Separations Group), käyttäen 0-95 % asetonitriiligradienttia sekä 0,1 % trif-luorietikkahappoa (TFA), ja eluution kestäessä 100 minuuttia. EPO-proteiinin asema 15 gradientissa määritettiin geelielektroforeettisesti, sekä analysoimalla N-päätteen sekvenssi (21,26,27) pääasiallisista piikeistä. EPO eluoitui, kun asetonitriilin pitoisuus oli suurin piirtein 53 %, ja se muodosti noin 40 % käänteisfaasin avulla toteutettuun HPLC-käsittelyyn johdetusta proteiinista. EPO-proteiinin sisältävät fraktiot haihdutettiin 100 mikrolitraksi, jonka pH säädettiin arvoon 7,0 ammoniumbikarbonaatilla, pilkottiin 20 täydellisesti käsittelemällä 18 tunnin ajan 37°C:n lämpötilassa 2 % TPCK-käsiteltyä trypsiiniä (Worthington). Sitten tryptinen pilke käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla HPLC-kromatografisesti käänteisfaasia käyttäen. Optista tiheyttä seurattiin sekä aallonpituudella 280 nm että aallonpituudella 214 nm. Hyvin erottuneet piikit haihdutettiin lähes kuiviin, ja niistä analysoitiin suoraan N-päätteen aminohappojärjestys (59) 25 käyttäen yhtiön Applied Biosystems kaasufaasiin perustuvaa sekvenssin määrittäjää, malli 480A. Saadut sekvenssit on alleviivattu taulukoissa 2 ja 3. Kuten edellä esitetään, kaksi näistä tryptisistä fragmenteista valittiin oligonukleotidikoettimien synteesiä varten. Sekvenssistä Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (aminohapot 46-52 taulukoissa 2 ja 3) valmistettiin 17-meeri 30 • * 22 104261

TTCCANGCGTAGAAGTT

joka oli 32-kertaisesti degeneroitunut sekä 18-meeri

5 CCANGCGTAGAAGTTNAC

joka oli 128-kertaisesti degeneroitunut. Ketjusta Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (aminohapot 144-150 taulukoissa 2 ja 3) valmistettiin kaksi erilaista 14-meeriä

10 TACACCTAACTTCCT sekä TACACCTAACTTCTT

jotka kummatkin olivat 32-kertaisesti degeneroituneita, ja jotka eroavat toisistaan leusiinikodonin ensimmäisen aseman suhteen. Nämä oligonukleotidit merkittiin 5-alkuisesta päästä merkkiaineella 32P käyttäen polynukleotidikinaasia (New England 15 Biolabs) sekä y32P-ATP:tä (New England Nuclear). Oligonukleotidien ominaisaktiivi-suus vaihteli alueella 1000-3000 Ci/mmol oligonukleotidiä. Bakteeriofaagissa lambda oleva ihmisen genominen DNA-kirjasto (Lawn et ai., 22) seulottiin käyttämällä muunnosta in situ monistamismenetelmästä, joka kuvataan alun perin julkaisussa Woo et ai., (47) (1978). Suurin piirtein 3,5 x 105 faagia maljattiin tiheydellä 6000 faagia halkaisijal-20 taan 150 millimetrin petrimaljaa kohden (NZCYM-alusta) ja niitä inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa niin kauan, että faagitäplät voitiin nähdä, niiden ollessa kuitenkin pieniä (suurin piirtein 0,5 mm). Sen jälkeen, kun maljoja oli jäähdytetty 4°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan, faagitäplien kuvio kopioitiin kahdelle nylonkalvolle (New England Nuclear) ja inkuboitiin yön yli 37°C:n lämpötilassa uusilla NZCYM-maljoilla. Tämän 25 jälkeen suodattimet denaturoitiin ja neutraloitiin pitämällä niitä kulloinkin 10 minuuttia ohuen kalvon pinnalla, joka kalvo käsitti 0,5 N NaOH - 1 M NaCl-liuosta ja sitten 0,5 M Tris (pH 8) - 1 M NaCl-liuosta. Suodattimia kuumennetaan vakuumissa 80°C:n lämpötilassa 2 tuntia, jonka jälkeen ne pestään liuoksella, joka käsittää 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1 tunnin ajan, ja suodattimien pinnalla oleva solujäte poistettiin raaputtamalla 30 varovaisesti märällä paperilla. Tämä raaputtaminen vähensi koettimen taustasitoutu-mista suodattimiin.Sitten suodattimet huuhdottiin vedellä ja esihybridisoitiin 4-8 tunnin 23 104261 ajan 48°C:n lämpötilassa liuoksessa, joka käsitti 3 M tetrametyyliammoniumkloridia, 10 mM NaP04 (pH 6,8), 5 x Denhardt:in liuosta, 0,5 % SDS sekä 10 mM EDTA. Tämän jälkeen 32P-merkitty 17-meeri lisättiin pitoisuutena 0,1 pmol/ml ja hybridisaatio toteutettiin 48°C:n lämpötilassa 72 tuntia. Hybridisaation jälkeen suodattimia pestiin 5 huolellisesti 2 x SSC-liuoksessa (0,3 M NaCl - 0,03 M Na-sitraatti, pH 7) huoneen lämpötilassa, sitten 1 tunnin ajan liuoksessa, joka käsitti 3 M TMAC1 - 10 mM NaP04 (pH 6,8) huoneen lämpötilassa sekä 5-15 minuuttia hybridisaation lämpötilassa. Kaksi vuorokautta kestäneen, voimistavalla varjostimella toteutetun autoradiografian jälkeen suodattimilta saatiin ilmaistuksi suurin piirtein 120 vahvaa kaksoissignaalia. Positiiviset 10 täplät otettiin talteen, ryhmiteltiin 8 kappaleen joukoiksi, maljattiin uudestaan ja seulottiin uudestaan kolmena kopiona, käyttäen kummallakin kahdella suodattimena puolta 14-meerin liuoksesta ja kolmannella suodattimena 127-meeriä. Olosuhteet ja mal-jaukseen sekä hybridisaatioon käytetty 17-meeri olivat edellä esitetyn mukaiset, paitsi että 14-meerillä toteutettu hybridisaatio tapahtui 37°C:n lämpötilassa. Autoradiografian 15 jälkeen koetin poistettiin 17-meerin suodattimena käsittelemällä sitä 50 % formamidilla 20 minuuttia huoneen lämpötilassa, ja suodatin hybridisoitiin uudestaan 52°C:n lämpötilassa 18-meerisellä koettimella. Kaksi erillistä faagia hybridisoitui kaikkiin kolmeen koettimeen. Yhdestä näistä faageista (josta ohessa käytetään nimitystä lambda-HEPOl) saatu DNA pilkottiin täydellisesti entsyymillä Sau3A ja alikloonattiin vektoriin 20 M13 DNA-ketjun analysoimiseksi käyttäen ketjun päättymisen dideoksimenetelmää.

joka esitetään julkaisussa Sanger ja Coulson, (23) (1977). Ohessa kuvataan EPO-proteii-nin tryptistä fragmenttia (alleviivattu alue) koodaavan avoimen lukukehyksen nukleotidi-sekvenssi sekä siitä päätelty aminohapposekvenssi. Intronisekvenssit esitetään pienillä kirjaimilla; eksonisekvenssit (87 nt) esitetään suurilla kirjaimilla. Sekvenssit, jotka 25 vastaavat jatkoksen yhtäpitäviä vastaanottaja- (a) ja luovuttajakohtia (d), on alleviivattu. (Katso taulukko 4) 24 104261 O o o o O O O O omo m m O m o u") OOcvj rn ·—· n r~~ cr. ·—‘ —< O a y yiiuCJo4-1 CJ y 60 CO H) U ^ oCJ M U « u a u o co tj u u u y «ora 00 n) « (j >03 u y « auo o o u H < co o a co ra eo a uu < o u CO CO CO O O < O U « ri Π3Π) O « CO <; 3< o a « njuarcouuoou co a co o « oo <; .«u o oo u . a 00 · o 00 CO O O O o CO a 00 ra ra CO co U a 00 y<j co o co c_> (J < o a a « o 00 co « < o 00 co u co ra co o u o u « m cocoray«ijcjo« « ucoucouohh00 o corao«coouo.co u oocjco«o<uc_;oo « «υ«βυ<_>υαυοο O r « · O O O CJ . O CO > CO fl) O COCO a « u -1 u o e (J |j y O O CJ (_) CJ O « COCO«COoOcOO'<'<i-.ra

4Jy4-> O CJ CJ U H Cl « CO « OraOijO^UOöO

uucoococjocjc* u coco«ocooU’-(r-'.-'CO

4jy u ra o cj U o co ta co « o co ra *j u o < « ra

• CO y · CO « O H < < u 00 «O on) UaC^-H-O

aonuuocjur>u o ococoueo^Ho^tfu C0m CO O O CJ <_) (J o CO O « QOOCOy U ·-! ·< <C « 4j y y y CO f—1 E-* c_) CO CO UO raoOCOooU^O^ra

Oy n u 1; y U n O O « « eoy to uj h O < h c£

o. CO O. CO O H U . CJ 0.0 CO o C0n)«4jU>UUO

OMfOcOQCjHoC) « racOCOUOy^OUCU

u jj o « Ö CJ CJ CJ « 00 COCO 00 C CO y CJ o CJ «' U

CJjj O CO « CJ H CJ O CO CO CO O O <0 00 U CO CJ < O

oyocoracjCJcjM ca coooeoeoeoracj3cj3«

.00 co CO tO U u U n O to COCO <0 « O y · H O < ·—i O

ööfCOu^UOrjtO O CO CO CO C3 3« ·-“* O L> t) • a u « O o < U (1 CO O « « O « COy CJ >% CJ « «

OcO° O CO u U <J M « '-'O CO CO M w CJ - < >. O

ur o y « cj cj <· « co O O «oorayUU<o_'ra o.Jo.aracjU.cj o co « co o co ra a 9 F. υ ^ 2i

<3 i- o M) O rj <(Z CO CO CO CO « COC^^F-iJcji—OO

«rcOijecoOcoCO 4j cora ra«coi_, rJ.-Jcj<0?

Ur,UyOcj<(jCO O C0o«C0ayr-;'-'CJ3^

UnUuCr-ϋί,Ο CO COcO«CJOyUO<^ra <T .a y.n y o ^ o G 00 CO U a O O S tj.UC^O “

On o S) CO G ^ h o 4J CO a CcOCOyUScjSU

?, O^COtJubuc*-' CO «CO O COOOy 9 o^rayrajjCJcju coUcoUwCOyO-J^^o

-½ OTj CO y O Γ; CJ >j α C3 C'CO^oCOy^OcjrCO

— Π ^ CO , y CO £ CJ , Γ) " CO COcOCIyOjj^Oe-D?^· — CoHcOyOjjUoCO cj«cUcO«„yf;'^CjUU)

= eO^-oäcOtoOroCO e COcOCOoC_uC-(_JoCO

< oiro“uhtjHcO 5 O^C^CO^i-ac^O

~ COyOyO^CJtjO U ^‘-'COCO^JJ^; — . 4J H CO yoG-Ufi co CO OcO C3c0fly*v-UM^,

3 H « uh CJ CJ S CJ CO « O uh HOUUCJ

O u U U u < < u ta « «CO O o U u ur<<0 O « UUCJ Ογτ<*«« OCO CuC0«y a o couco < t· U 3 o oco u ««ci « c — o «.co o . co o cj u . < u^-h« co« co a ^ o

o iSurO'juuf-'eu O « COCOOO^U-CJOU

äo« y«2uJjU>cO U « M Mti,U

a m co u o ' U>%co co co « « o0(j u·— cjU j 6hoouhuhur«y co σ oco« co^=u-j9 .o ω ω e U r · o h uuo too o n u „ · ^ g h i ’ offo aUyHcjU«o coa ca«y«-jo.«u a«.oijOyU«.HOo «o aoooar-^^^ S^u ««mHh<-m ω<τ1 9 y ° Π " 9 ^ o 3 j? S S 2 3 S £ < äSSS)gShu-H.rfi« « g' “3 ? ö’g S 2 S3 O o 3 ti h ^ a ou«ä«o&h^ ii a 3 a3ähG^<“« . ä h y oSh-8h U O COCO <3 « C0co-U«u< 0

ro^r MCSr'-Of'O CO Cd u c-OCO

M M U r* O h O to toto O 4J CO u 0^0^- «^£)'ο«5>^<< m “« cococoaot-Hhv:y ri '“L i. λτΟγ" <0f' '«J tO tO V ^ K t« O — w « « ϋο - o 5 3 . h a .o «O O C «a :' «'9 to'6u3u'M0 Ml βο ““θΜ-<<·^ 3äS^«yuSg äSffS0ä?Ö£^3u “ “ S ϊ CC Sj u frioiaSaU^Guo 25 104261

O O O o O O

o in o m o m m vo eo O' ·—* cn —i —< -< "* fM cg aj aj υ .c p ooCOeoöO ra roro u <-> <(->"> ω 00 ro aj ra u « u rt u O. rt «‘-‘«o ro aj to ro co < en 00 to ci co co co aj to aj P O < « AJ Cl AJ CO QtCfj <q 4-1 < o CO ra U CO rt π) υ 60

U U U P M 00 CO CO 00 fl aj cO

U P O β< u a rt «0 aj β aj a o u o —1 p to « cj p 00 ro u a o a-< rt p njppp (0 ci co »o m . u > *j υ p cod co p . to υοοι-,ΡΟ oflOtcm ro p to (j M (J ' O 00 P “ ra 18 60 cj ro < e-* p (jPijCO aoaj U CJ CJ CJ ^ 60 υ Cl d cj Qfl coPj-itHO a rt ro p u u u 60 p <£ ip p to rt ro p 4jc0(j aj oi^c« to °o a ci fj cj to ec p < <0 p aj ?_ ro « p p aj 00 « <J < aj ro 00 « « eo p 0

aj <8.C3U · <0 *0 « P «.CO

υ 00 < ^ aj o ?? p “ ϋθΜ cjOoop e “ y “ p p co ao u ί-ι e u p 2. p H, u u to O 0<5u)P 60 C3 « 60 rt aj a · “ <S < p oa?, cio cociaj aj coqj-p rt t? ^ U ropy e cot_cjp n o ro rt co o to a ro lj j p a o <5 00 ^ a aj S u Ct y 2, “ 0 ω Μ o m

r O.rjriP CO “ · β ? (3 P.CO

n CO^f/dP to P P M 60 P aa S to h M ^ *? C3 a W c « ä y-s ^ w S ^ rt ° rt aj cj «_j co « rt 00 il ^ o ti U U = r- « ?η ϋ ?n « * " (jOO^-gCO 00 cj to c: u 5 2 05“ « « ° ti u S “

rt u n , o u ~ ro ? · p tl p aj'P

—1 Cl Ρ H rt y JjJ c3 u UM U tt P

w ,, u _, < p a p aj “ u p. aj CO υ CO <T 'p ^ CO H ro ? co co to <r “ρΗ«^ΡΜΡω?„<οΡΑΑ U « <J ° « 2 « “ P «Cl o smhu<:p«w“mp4“,p ί Z ^cocL^^raPpp aj co aj ύ roci^^up^raeoput-lu oo t * 60^αγ-·<<ϊμΡ ra " ro « u

d o ra.^^ocn^u.Ajc-- 3 m. S

= 2 o u^^^rtti»^ «Pp < utJ<-t_<A-tat0a? Aj(3ra H ä«« UQ.MUe3S?pP, p ro«a o u ? e A ti “ ts ro ro ci HHaj^cici cj p aj n ra aj cjroAjPasciociAj »5 a aj u p aj p ω ci ra cfla ?Ξ cOaj o<a coroP u «aj aj «ro t" p co 5? p S? « 2?p aj «,u <>>aj ro. a ro υ ra . α CO «CO H E- o S? u tl P “aj - Oaj cj u u roroeoa p 00 1 cörotoH— tt o ro “ co « ro ^ 00 r~ Ηαοθυυ&5«^^ -j 00 i_j < ίο ο to rj oo 4J f3 q £ a u <<ωω“Ρ u 2«

Spco Η^"ω«?60«α /tUaP h ro aj p u p ro rt p AJ rt.« 0>AJ P.P CO CO rt p 2 ro u <?uia Ppp aj «ro U a 2 ^^αωΡ““?υ

e- «<j <Si-3ijPc3“a rtAJ

co«u up0 drop u rt*j 26 104261 o O O o ° ° ° 9 O o -j 10 ^ oo S 22 2

CM <N CM

u c o o o c u o o. h v> t- o < £1 p y y P ^ <-'Ut-<-ir3 O l·1 O M U o u H H <ί < p <-> O O o C- U U fl U <U < >,H O < i5i 15 **· yt υ

OaosUOMHcnt-iHCI o υ Ρ 5 ° < υι-<:Ρο·-.οοοαο·-ιΗ u υ P "S u < ra H H n n U < <o H h μ k o <; U 1Jj <· U · H H > ra O ~ u c. < ^ U < >-» U > O U < O U H p «

H ^ p ^ U H ^ O ra m; cO <C ζ^Ο^Ο£-< OH O

O > h H u O O-homO £ U O H O OO U

< Ξ O O U 3 £0 O < O < U G < 51 O U O H 1-> < ^ H u h ° · α <; >< u w< .u o · u u < o - p a o o ϋ £ b n ω <-ihj=o· h ρ y y ^ y h y <.—.r;;;HraoOUUOa.H oyy.^H y H 2 f-, ra < —, O Ή a U ra o 3 < 63 < H O O < < O « o>JoO<a < ?»> h a u >-< u P < u to O < eo o ra y b u ω ^ <>-!oo<< u y h p u < ο<^^ο<εο q < >,< to op y p o y y m

U 3 O u H 3 1-> O < _J U < O^-1 UO< UH O

·- ""^ O CJ ^ ϋ ^ 03 U mu >> (J < U < U py- o u P o n. u u y y po jty jj o c Π u 3 u 1-> υ < u u ou c- o ^P 11

<~l<?HO to 1j U<y<u HU p y < PP P

U U 5 y O H to U t_i_cO^O ri < HOo H H ^

Pli<<Pu h u h£<h Po h < h h< <-· oCh rOO ra -< P^uto y O o U < · O 0.0

u O n > < H ra o o — rj 1-. <P 15 P U Ph P

^ " u 3 υ ^ ω p < H < < o n doP b b £

O > n J < h ώ U < S" o ^ d < y P H U U U

to ϊ1 - cj " · u u ϋ ^ O , n 0-0 u u u ^ n h r, h o S co o o < o u o ω ^ i_j ^ ^ _! to 1J CjrHU1—'L^HUU<; UH ω 0 ΖΓ H_^wOcj u - u<cj cjh±j u H ^ < en to w U^<H nM^'Sn'Ij P o g^otorao <Hpuo<Pyt:ouo

•P « 2 ^ ZSdZ ul3 hM

P yir^s.if ? 5 < < o. b s. Ö -

-T U PPoHu 00 u-H^ruUOUi-t-. yu O

e " ““unil3 <ui3^u5uuuug 1 ? y < g -2 ΰ S3 g ^ g H- b g g Ö g · g p · ö P toPn^OoO οΡόο,^ΗΡ ^ΗΗΗΟ h rs P-CcnofO Htlf^o^py^y^ri o ΰ P, “uPttoo nPouPocccoop ^ o f-.'^nrauto <"ο:-:,ι/>οΡΡΡρΓ3Ρ<ο

H O CO θΜ<^.ϋ.Ρ·5<·ρ P-g % M

o P^OT U Ua<H up p uu po

r y τ: o < “ “ O^H5ÖoÖb<UUUO

u y-s<^s o y^bPyoH<u h< h^ w p o u O-, <uouu.h<.uo o 5''<J " u PS < o U ^u^.o o Hopa.po.<yp U.u ^o o y - h ui o o u < υ < h t- y h y y y P ϋ « pr. < - 00 O urapr < p o . o u · ^ “ · P " ra n r o = ra aj o —r h o u y y y y (i μ <to O b ra - 3 y ^ P < P r O y H b b u u u u cj -jj ? o o ra p <ui[-"pu yp y y p f_ G « u u 3 c u ω ^<yy h y.u uu uu uo y h s < r? m s ^?<.vh<<<huo ^ “

GC fj o O n <-1 r- < CO? CO < tO

« ω ^ Uo.<<<5-ir5S?S2u cj1-» e r- Ί) 1-» ^ S- G ^ u CJ U ^ ?ifc£ MO H<->

to Q_o -J CiQ 1J U ^ ^ ^ UH HU

27 104261

Esimerkki 2: Ihmissikiön maksasta saadun mRNA:n Northem:in analyysi 5 ug ihmissikiön maksasta saatua mRNA.ta (valmistettu 20 viikon ikäisen sikiön maksasta) sekä aikuisen maksasta saama mRNA:ta käsiteltiin elektroforeettisesti 5 käyttäen 0,8 % agaroosi-formaldehydi-geeliä, ja siirrettiin nitroselluloosalle menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa Derman et ai., Cell. 23:731 (1981). Tämän jälkeen yksijuosteinen koetin valmistettiin M13-mallista, joka sisälsi taulukossa 1 esitetyn istutteen. Alukkeena (primeeri) käytettiin 20-meeriä, joka oli saatu siitä samasta tryptisestä fragmentista kuin alkuperäinen 17-meerinen koetinkin. Tämä koetin valmistettiin 10 menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa Anderson et ai., PNAS, (50) (1984), paitsi että entsyymillä Smal pilkkomisen jälkeen (jolloin saatiin toivottu 95 nukleotidin pituinen koetin, joka sisälsi 74 nukleotidin pituisen koodaavan sekvenssin) pieni fragmentti puhdistettiin M13-mallista kromatografisesti Sepahrose C14B-kolonnilla liuoksessa, joka käsittää 0,1 N NaOH - 0,2 M NaCl. Suodatin hybridisoitiin 12 tuntia 68°C:n lämpöti-15 lassa tällä koettimella, jota kului suurin piirtein määrä 5 x 106 cpm, pestiin 2 x SSC-liuoksella 68°C:n lämpötilassa, ja niillä toteutettiin 6 vuorokauden pituinen autoradio-grafia voimistavaa varjostinta käyttäen. Näytteiden vieressä ajettiin yhtä ainoata 1200 nukleotidin pituista merkitsin-mRNA:ta (merkitty nuolella). (Kuvio 1).

20 Esimerkki 3: Sikiön maksasta saatu cDNA

Ensin valmistettiin esimerkissä 2 kuvatun kaltainen koetin, jota käytettiin vektoriin

• I

lambda-Ch21A (Toole et ai., Nature. (25) (1984)) valmistetun, sikiön maksasta saadun cDNA-kirjaston seulomiseen tavanomaisilla faagitäplien seulontatoimenpiteillä (Benton 25 Davis, Science, (54) (1978)). Kolme erillistä positiivista kloonia (joista käytetään ohessa lyhenteitä lambda-HEPOFLö (1350 emäsparia), lambda-HEPOFL8 (700 emäsparia) sekä lambda-HEPOFL13 (1400 emäsparia)) eristettiin sen jälkeen, kun 1 x 106 faagitäplää oli seulottu. Sekvenssi kloonien lambda-HEPOFL13 ja lambda-HE-POFL6 koko istutteessa selvitettiin sen jälkeen, kun ne oli alikloonattu vektoriin M13. 30 (Taulukot 7 ja 5, vastaavasti). Sekvenssi määritettiin vain osissa kloonia lambda-HEPOFL8, ja loppuosia pidettiin identtisinä muiden kahden kloonin kanssa. (Taulukko 6). Luentavaiheen läpikäymättömät 5-alkuiset ja 3-alkuiset sekvenssit esitetään pienillä kirjaimilla. Koodaava alue esitetään suurilla kirjaimilla.

28 104261 r; n oh ho n U u h> n u äo o u h o u o o tn o M K U HO O >. O 0 — 0 0 — 0 O O H O o O r-j ci U -^r >, o

u 0.0 OO <N H O H < O < O COOU — OO < —OH — HO

a

CO

oo o H OO ra u o O co au — o mu co u

00 HO UJH — O — H — < — O an — H u O

u UH HO O O — O OU O O >U — < <U

oo 3 0 no 30 cH co co au au aa

<j Ho OH — O * <n < — O — O —I O — U — H

<0 00 >U OO O O OU OU O U <U H H

co <9 a u OO O O O 30 30 HO HU en O 3 0 u f-

q u K U OH — O — O — O H<i — < HU

U u HU 1-1 H OO OO OO —! O OO HO

Π 00

CO U

3 U SU CH H U COO O. H «1 O O. O

U r OH ιο O aH 1-0 en O H O a O

HU HU O O >0 <U < O HO <0

OO U

CO U

u O HU co 30 30 30 HO CO a H

U u H O H < Cl H — < oH an — < — u

co ej uo HH —'H OO HU >U OU <U

C CO

CO CO

u u no coo u u uo — u en h au uh c υ uh uu oo oh aH — < — o ho

CO U HU < < 0Q< H < >U HU O U H O

CH 30 MU COO aH 3 0 H < oo

CO CO CO O — < H H O UO — O OH — o — H

r- a HU O O CO U H << < O HU oo — < a o cö u 30 30 a o tn o 3 O co 30 u< (- u H H ClH — O H < — O — O Cl H -30 ό ej HO HU 3 U H < UO OU HU H< a a ^ u coo — u r< ho uo co an co< ho an — o uu ou oh — u uu

CT H >0 O O HH to H HO < O < O

o _ _ υ 3 0 co< aH au s o ouomoosu CO H— OUU 3 — U O — O OciH C u u — uu raa — U HU — <U m O O ur < u eu n U C^HO — O U — Hu

O

u 30 UU CH uu- 30 30 3— o < u HH CJ O 3 >> O < OH — < O.— uu

O HU W < K U H HH HU OO H H — O

O

KO HU >, U OU au HO 3 0 CH

HU u) O — O J3H — U UO O H " p

U OH < O O O HH < o e- H HU

4J

·· h 30 en H UO CH 30 OO UH Ου HH = H U HU ei O OH uu HO — —

O HU oo O H H < << HU HU HO

(J

a 3U ou uu — H >>u CO UU U< u h — — H HU an — o — < HU au

HU -O H< > U OO OU e- O

O 3H 3 U ou a< CO UU CU — H

co HH oh — H ^ s — < au a n oo

O HU HU -< HO OU OH HU <U

u U HO coo CH uu HO UH uu u U KO u o * M "o HU U^_, OU 0 u <-r^

o H- <U O O r-< HH OH OO <U

tn o O U 30 OO 3 0 HU — U CU MU H — HH uu — O t->< ° it Π “H -2 ,1 HU HU OU OU O o < o Ou ou

3 O

o o ho oo au oo 30 -1 u 3 h o o

c *_i e: o in Li —< w ^ lj ·—· <* n f— o H ,T*H

P u i-*H- a, u < u c~ cj ^ ~ <3 — o cc S ^ u ro r c: —»o —* < 3 c >, cj oh*

_J rj «—H C_J '-C Π3 r- TH- a»h- ' Ό t-O

^ ^ cj « << o c u >o > ϋ « i— <j cj 29 104^ ' ϋ ϋ ο « o *j υ η ω υ οο οο υ Ο U 4J U 00 Ο U O 4j u —< <ί cj (ooo<ouooogo4_> (J 4-1 00 4-1 (J U 00 u

(004J00 00004J

auuauoooou 3 u uoouiqrguum

—1C UO(J<0 03 0Q(J4J

O U (0004-ic0 00c(jo0 (J U CIJ 4_i eg O (J 4-4 ^ u

Ή O

o o uoou^uunoo

UCJOOOU-UOOiJ

1-4 c u oo o oooouuu c: cj uooo04->04J4j H< 4juouo<ou*j U4J oo oo oo oo u oo uon)Oi->oun] ocj (0000004-10000 os < oooooooou

HH OOiJCOO-UOOO

3 O

4) f-•-J (J

(04JOOOnO(TI4J

oo4j0(oc-ioooo wc 04-to4Jnj (oooo

Os C 4J004-<000000

-j < OOOOOC04JOOO

4JO0C0U4J (0004J

to coooooo oo oo o

30 OOOOOOOQ4JO

<yt_ OOOC0000004-I

_iu οοοοοωοοοοο

^ (0 O

2 o »-J < ^ ^ eo o o ooo (04J4J n ij4J0000004-400 - >, < oooooooocoooao 1—10 O U 00 oo u oo O 00 o

v_-’ UU (gOC0C4-i<0O*JO

OOOOCOOOiJOO lp, ooooo4-iu4jra

OcOO ocgouooooo

o tnoo 00O4-IUUUUOO

£2 —<<u ijoaououtocoo

Oii ro -: 3 υ

o O H

< —1 U 00 _ jj4J4-|00 00 O00M(0 00000004JC04-40 o o toouootoo4-iuu

.C H (04J(in4jOOOOO

(O* c— oocoooo rjuooo

Cl cg 4-1 4-1 U OOOOOU

O roucOOOOOOOO

cc- «SOOOUOOOOOO

(0< .o OOO O O 4J 04J o CC E— 0 00 0 00 4-1(000 • · U O VO to <

Zl o Ό C4 O

H<< o o o o u o oo oo

oauo4-i4joo4J

U U Q, o O O OO 00 00 o o o

Os C 75 C o OO 00 00 4J 4-1 o o e—« c__ —---i^jjaocoooooo

(J C0O4J O OOOOCO

UOUUOOOO —(J Os O U U O04J O *? *0

n —HO o O U 4-1 4J UCO-J

> (j ^0(j;04-i4J(04J4-4-c

00 < o C

1-1 O .3 U

^ u H<:nuoooOooco CJC4JO004JO4J <UU 60U0000004J04-1 c μ OCJ ooo coo oo u o o

CL, f— CC 4-1 CO 00 00 GO O <0 O

ooeoo m o C0O04.4

4JU iflu O04JCOU

3U (0CJ4-) O 4-1 (O 00 00 CO u

<y f— c: CJ (J U OI 00 4-4 4-4 4-1 O

—)(J c/OOf-i oo o* 00 4J u 00 a 30 104261

u* u M OH HU ω O u H DO DO

u 00 ci oi U —JO 0>>< O .3 U O H O O id H

oo u oo 0-0 OO <m —J <; <r H < vo <t O ao H U

oo oo oo a u u u u u u a u o H o O do do c o do

U u HU LtJ H h o H H H <J h O

ra u Ο Η π u <o i-i < uu < o 00 00

U 0o O <J -J O DO C H CO CO

u co π <J H h ·< * w <! h <J h <J

ci c00>0 OO ΐ'ζ OO OO

Cl oo OO ci

Cl ra CO O O <! CO CO HO HU

U eo W <0 C U D H H < rt U I—lO

Cl CO = U H U -JH oo oo oo U 00 M ° OO OO CO C H ho OO o

<H OH D Η W < HI H CiO

>0 -JO -JO <-«5 >0 < O

O U

Cl u

U ci H O H O C U CO CO CO

00—1 -JO OO H < D H <-1 < dh

u CIOOOO f-ι H OH OO OO

oo eo

Cl c

Cl CO^OO OO OO O Ci O ci CJ I-IO

(0 urJOOOE-t Ci O DO DH D H

u u I Ξ < OO << tn < 2 < > O

OH CO WO OOO OH

U oo OOOO h <J JOO H U Cl O »—I o CO D ITJ HU OO tOOH << <0 00 υ co 00 (0 00 co c> circo co wo wo d <

U CO COOH DH H <J h <J H -C

UCI uoo oo 300 0< OO

Π cl CO

CO Cl 00 C0U D Η Ο HU C< 0.0 Cl o

OO D H —I <C Ci o DO

00 H >0 OO HH 01 H

Cl 60 Cl 01 co uoo co < a h too co

CO ci OO OH O u O O H O OOO OdH

Ö Cl 00 OO —' < O 0|<0 UICO i~- -J U

0 CO 03 0) 00 OO Cl

r~, WOO CIJCO Cl O WH Cifc DO

JT/ WOO u id H DO OHO H < DH

w Wei d —JO WJ < oo Ο Η HH —JO

— Cl OO 00 — CO O HU HU DO ΠΟ

U U W<0hO.3HhU

2 UU 60 M H <0 OO HH <0 w u oo cl u <0

cOcfl OO 3 0 WH UO CH CO

ci oo ciUHJCHO JCO cn< aH

U ¢5 W-JOUOOH H < <<C -JO

oo u oo

WWW

. COci circO DO U U I—I H HU

* oiw oO C-J H ' h H coo c h h O

UUh<H<J>OOU

UU 60 — H CO DO W <£ CO

Cici OUH DH 1-hH H <J d<

w u w-JO -JO H < —I < OO

OO c U

u u o U U UCL.O 00 C r-* WO c*

OU COOiO u * W < -CO WO

u to UHH < U <<J H < He-·

tO u tO

(J (j

ro u o < 30 HO HO

ojH ci o hC co <c DH

HO HO oo <o > o W 00 00 CO D 00 _ .

U U WHO 0< DO O < 3-¾ COD UHO UO HO UO H<i

c CO UHH HO <J O HU U U

U CO <U

CO c u

Cl U Cl <J U DO 30 HO H<

c Cl 60 —3 0 I-- O H *0 D H D H

w U 00 < O — < O OO >U >0 „ 104261 O H H O H U O m <

o tl U (N tl U Ί λ S

—i V) < —· CO H -» H < -HU O U mu

«H —h H HU

> o ~ « <u £ < o u au o u .. u -h u - u n H Xpg <o <o H £ g £3 .2 2 £5 s< H < O U H< £ ^

O. H O U H U u U

-HU CU «H

OH -H < --O SH

> U UU <U j tn H cu >- H _ 0 -H < -HU .c u = U <0 H< CU >>< CU -. u oh —iu —1 «-J Sh

HU UU -H< CH

C U CU >- < „ UU HU H< CU a H M < ^ OH -HU IH U i

HU < u < U UU

o U o 60 u o o u

O n U — HU fCOH

σ> H U -h < U —HU £ < u

CU O N o < 3U

-H < OH 1-0 jj H

00 UU UU

0.0 CU OH n, rj h o oh —h u

HH HU < U CuH

_ OU MH OH CH

Q Ηυπυ-2ί·2<ή<

5 HU H < < U

S CU M U H < UU

H -H < HU «u : h

^ UU H < <S> c- (Λ H

^ HU CU OU uci C « H OH 2 H >. < 2 Mr- - u <CJ hh

H

— UH HU OU ,u u U OU OU U ro c— — OOH C/0 < <U >2

c u mu c.H

* -Λ < HU tn < “ u << <u <U <2 —1 U CH O < rj t o

ΠΗ OH HU S? H

CU HU HU £ £ CU >* u OH 3t_,

OH -HU HU 3 P

HH UU HU

32 104261 to if 2b. 0 5 2 O-U 3 U O e H O e o U QO 2mCJ r - ^ 2 ^ 9 Γ Ϊ ^ ^ OOM O C O rjou cc co ^ h <: vc<o x -; u ^ < -wh υ u 2 S £ 2 5 5 52 52 52 aH ou α u u ^ u <U |->C o o <2 >5 h <

CO CO

2 3 2:5- <' 2 5!2 * 5¾ 52 52 52 - a oc<|>o o o <<5 aS G o <o 2 2 5 “ 5< Py j“ -< -8 38 2,1 52 o 2 -° ^ u -3 h ow <u ο o o »o «2 o o to u

H P 3^-3 30 CH hI CJ COO C_ f—« LI'I

5b 5 5 OH m < C3H “2 ? < 5,2 a o U “ ° < < => o <o <o n2 u a -q h| 2 u 5 5 5 5 3U 3 O 3 0 — O C o*

co 2 c c ° u H lH ~ H ° U JU > O O O

u Π3 I

o CO f-* f- ο => C «!0 uo i-J o o w ?-. ffleu S u7-2 55 5¾ ^ o oh oh 52 52 o o I— < --5 < -- cn< — < >o =: o <o a eo to 25 52-^5 “ U «5 = C3 x < cc tT ~ h h, p ^ O — O O H h o

2 y ^ ° H o CO O CH < < < O HIO O O

to to e; I I

ff ί^Λ 5 o O 3 10 MU M O 3 < - o 3 0 O “ Π Hr- air- —I < XI -C — <- —I 2 3 £

^ 5 2 Hlu = o Hl< oo 0)0 HO

to u co I I

to υ 3 =: u —1;o 3< do eo 30 e h

— H 3'— —I < e 10 CJO CIO HO

Or- > jO OO H H OH Π) Ο < O

U to u I I

0 ω u 00 00!< c h c: 0 3 0 c! o O coo « 5 - - H c - ,0 Oho 0-0 oSh oho 55o ^ w — HO — < IΟ ο < O U~I <; O 1— HO OHIO — 0 to to a : I '

to to -j I

^ y pH uio M H e H 3 0 3! O 3|H

H 27 ίο —. Γ. ο ; ο — x o X < oh — · < a I h U e, — H -J-. \< cnOr-H hiH HO OI Ο πιο

— o HIO x O 010 tr 0 coo -'O

s § SS i’5 eu Eli: <3 ijg iis

» S = u n!r 2u =!r 5-J J.. UL

E? -1 H h — HIO -=' O Ml< OH HO Hid 5 d - Ή ΉΟ,Γ- Η·< <|C HO H, O H<

U O j ' ^ I

M -E = μ olo ei o -H XO =lo e|o

o H .— h — jr- ΠιΟ C t- — O —l<C HIO

ho h 1 < h ' < > I u 00 o;o h<

o to OH 3 10 CIO M -C CO elo CO

*“* to Hr- O iH ·—I H Η·< I—I < CIO Cj|H

o U HO Hio H| < H < OO ΕΛ H Hl]o

00 I I

o 'J HO COIO Cl H e o HO el H e] O

o o OO e 1 o -K μ I < -CO e O CM o o | O

r- to o r-H <IO <i< H -c H f— CCH ccl< ^ ^ Il 1

O e ο I

h 00 ok elo ho ho c'o tao H n — e o — 1 < '.·. < c H ·*: -M < e o O — O H, o OIO <0 >0 << <0

H to to j I

O c to

< CI a HO 0'< c!o O-C 3 H — lo 3 H

H c CI CO O e. o Hio e o h < Cl H Cl h

to O HH HIO < IO HO OO ->'0 HO

if S i ! i

Cl ^ <0 elo 3:0 H CJ, H < 3| o xO

e tO HO —10 — IΌ n H rtj H ai H — O

o CO < W —" 5 |(J ^ lu i>w —It-· OO

» 33 104261

Oio< ano t-> u n tow ca ta υ C--HCJ «»JMfjoinuij , - ta n tan u tori cau

<J 4-» CO *J CJUCOU C3U*->unC0G0o j ^ fCUUfT3UC0OQU

C£CJ 30 Ut04-»C3ig4-iUf^ uicj: Ti < uou^tocou^j

{J OO 3 Ow-o COC-O^n CO

' O U flj 4J rj rj (j -u 2r'd aj.^ υ ° uoooj-iui-Jnjeo uuecuuuoou i_. j f—. >-·< utontotouijij

I ^ ta untonuniJiJ

t_ I Η < xJunu(ottu-<-i uijcacaootouca uunnuoun cj ta i-O ntautcjjcaon v.)<£ .>> < umunijoaau uoutan-^oou

n H 3 U

_|Π « H

2 -J u I ^ n-utantounji-i I uuu'jraotota uih « y UiJUi-iennta _rita a "j '-'unuotonca t-.< o c ntannca^uta iJCOtOUAjncaJi-i n ca ta ca u ca ca a t cj 3U utannotoijci —.it_, «J s-1 taratancjncai-i —I j '< —«] ta ta ca n ton u cao J< «52 - rj ^ ~ —! <a ^ ^ n _ tsuotaurtijijn ^ I ‘-'•‘-Jcjneaaatjcjn - ucataaitaaacjacn T; -ica ta utcacautaucaa •j <!ta ^ ta nutanucu*.n _ uutatauuj_iuo ! uunncguuu^ ctrlw otata u n ti o u n n u n ___ m t, i—, -n u ta ca n t t» ca u cj rc — —; ; t> — <CJ u COu o (j <j ca ~ n

- I

~ ci< r ^ — u I ta -· I r- -μ « — ^'-‘utaeanrcatar:

I cauntattiJcauQ

n I — ai ta ca a t ca ta υ u -j ci ^ ~ I ij τ-ir1 n^nraj-iuntau C , ta —, r-1 ootacounuMn an^jt-iuutatau I ont->catotacau r c— c f- Cuntauucacan — I - j ά < · ta ta cj η η -u ο c ** < 13 << i-otoncatJcann '1 i* cj to ta < — u j o t, ta «Λ έ- — < < , unarjAJutota ucjunuucau — ta *- ta c. ta u u ca ca ta u n u — — >< ai<utataca—,*-,'jn <; 2 H h < u u u ca ca o ca n n u ca n 4-1 u ca ta ca <j n u u n n n n — t; ~*CJ a^tauuntaijunn —, ‘3; n l·- ,—itan<-'cj*_i4Jucao a>c_a tatau^.t-,n*-<^-n c_- cilC u <

v-1 > ^ic O

< ^ < u h c ^ ] w I cu^cjriun^ ' I U Π (J S3 *-» '·’ 4- ^< aio ccFw u o r te u *-» u ^ ΰ,-« —! I—« 1<C CO fZ cO Π CO <J r] pj

-ILJ << *-» c-c CO CC CO η Γ3 (J

, c-0 u. - r: - UC CO ^ ; i cj ro ^ co o O It—· 3 0 _ 'Λ o *-> O .J r: CO CO cO ^ u!··· ol·'- = U U -J J to ·-» ^ ^ -1| *-J 1/. U l· CO -J «-» c_T N u CO -3 104261 34

Taulukoissa 2 ja 3 nukleotidiketjun alapuolella esitetty, johdettu aminohapposekvenssi on numeroitu siten, että kypsän proteiinin ensimmäiselle aminohapolle on annettu numeroksi 1. Oletettu johtopeptidi on esitetty kirjoittaen aminohappojen lyhenteet suurilla kirjaimilla. Tämän lisäksi kypsän proteiinin kysteiinijäännökset on merkitty 5 kirjaimin SH ja mahdolliset N-kytkeytyneet glykosylaatiokohdat tähdellä. Alleviivatut aminohapot tarkoittavat niitä jäännöksiä, jotka tunnistettiin määrittämällä sekvenssi proteiinin N-päätteessä, tai määrittämällä sekvenssi EPO-proteiinin tryptisissä fragmenteissa, kuten esimerkissä 1 esitetään. Osittaisella alleviivauksella on merkitty tiettyjen tryptisten fragmenttien aminohapposekvenssissä ne jäännökset, joita ei saatu 10 määritetyksi yksiselitteisesti. cDNA-kloonit lambda-HEPOFL6, lambda-HEPOFL8 sekä lambda-HEPOFL13 on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, josta ne on saatavana tunnusnumeroilla ATCC 40156, ATCC 40152 ja ATCC 40135, vastaavasti.

15 Esimerkki 4: EPO-geenin genominen rakenne

Haelll/AluI-kirjastosta peräisin olevan neljän riippumattoman genomisen kloonin (lambda-HEP01,2,3 ja 6) suhteellisia kokoja ja asemia esitetään kuviossa 3 osittain päällekkäin menevillä viivoilla. Paksunnettu viiva osoittaa EPO-geenin aseman. 20 Kuviossa esitetään asteikko (kiloemäspareina) sekä restriktioendonukleaasien tunnettujen pilkkomiskohtien asemat. EPO-geenin sisältävän alueen järjestys määritettiin täydellisesti molemmista juosteista käyttäen eksonukleaasilla III aikaansaatujen ohjattu- • · ' jen häviämien sarjaa koko tässä alueessa. Kuviossa 4 esitetään kaavamaisesti viisi eksonia, jotka koodaavat EPO-proteiinin mRNA-molekyylejä. Tällä hetkellä ei tunneta 25 eksonin I täsmällistä 5-alkuista rajaa. Proteiinia koodaava osa eksoneissa on tummennettu. Nukleotidien täydellinen sekvenssi tässä alueessa esitetään taulukossa 4. Kunkin eksonin tunnetut rajat esitetään yhtenäisillä pystysuorilla viivoilla. Genomiset kloonit lambda-HEPOl, lambda-HEP02, lambda-HEP03 sekä lambda-HEP06 on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, josta ne on 30 saatavana tunnusnumeroiden ATCC 40154, ATCC 40155, ATCC 40150 ja ATCC 40151, vastaavasti, perusteella.

» 35 104261

Esimerkki 5: Vektorin p91023(b) muodostaminen

Transformaatioon käytetty vektori oli pAdD26SVpA(3), joka kuvataan julkaisussa Kaufman et ai., Mol. Cell Biol,. 2:1304 (1982). Tämän vektorin rakenne esitetään 5 kuviossa 5A. Lyhyesti, tämä plasmidi sisältää hiirestä peräisin olevan dihydrofolaatti-reduktaasin (DFHR) cDNA-geenin, joka on adenoviruksen 2 (Ad2) pääasiallisen myöhäisen promoottorin kopiointisäätelyn alaisuudessa. Adenoviruksen DNA: hän on merkitty 5-alkuinen jatkoskohta ja immunoglobuliinigeenistä peräisin oleva 3-alkuinen jatkoskohta on läsnä Ad2-viruksen pääasiallisen myöhäisen promoottorin sekä DFHR-10 entsyymiä koodaavan ketjun välissä. SV40-viruksen varhainen polyadenylaatiokohta sijaitsee alavirran puolella DHFR-entsyymiä koodaavasta ketjusta. Vektorin pAdD26SV-pA(3) prokariootista peräisin oleva osa on plasmidista pSVOd (Mellon et ai., Cell. 27: 279 (1981), ja se ei sisällä pBR322-ketjuja, joiden tiedetään inhiboivan replikoitumista nisakässoluissa (Lusky et ai., Nature. 293: 79 (1981).

15

Vektori pAdD26SVpA(3) muunnettiin plasmidiksi pCVSVL2 kuviossa 5A esitetyllä tavalla. pAdD26SVpA(3) muunnettiin plasmidiksi pAdD26SVpA(3) (d) hävittämällä yksi kahdesta Pstl-kohdasta vektorissa pAdD26SVpA(3). Tämä toteutettiin pilkkomalla vektori osittain entsyymillä pSTl käyttäen hyväksi entsyymin puutteellisuutta siten, 20 että saadaan lineaariksi muuttuneiden plasmidien sellainen alipopulaatio, jossa ainoastaan yksi Pstl-kohta oli pilkkoontunut, mitä seurasi käsittely Klenow-fragmentilla, ligaatio renkaan sulkemiseksi uudestaan, sekä seulonta Pstl-kohdan sellaisen häviämän suhteen, joka häviämä sijaitsee 3-alun puolella SV40-viruksen polyadenylaatioketjusta.

25 Adenoviruksen kolmiosainen johtoketju ja viruksiin liittyvät geenit (VA-geenit) istutettiin vektoriin pAdD26SVpA(3) (d) kuviossa 5A esitetysti. Plasmidi pAdD26SVpA(3) (d) pilkottiin ensin entsyymillä PvuII lineaarisen molekyylin saamiseksi, joka molekyyli oli auennut kolmiosaisen johtoketjun käsittävän kolmen elementin muodostamasta 3-alkui-sesta osasta. Tämän jälkeen plasmidi pJAW 43 (Zain et ai., Cell. 16: 851 (1979) 30 pilkottiin entsyymillä Xho 1, käsiteltiin Klenow-fragmentilla, pilkottiin entsyymillä PvuII, ja kolmannen johtoketjun toisen osan sisältävä 140 emäsparin kappale eristettiin elektroforeettisesti akryyliamidigeeliä käyttäen (6 % Tris-boraatti-puskuri; Maniatis et ai., mainittu edellä). Sitten tämä 140 emäsparin suuruinen fragmentti ligatoitiin entsyy- 36 104261 millä PvuII pilkottuun plasmidiin pAdD26SVpA(3) (d). Ligaation tuotetta käytettiin E. coli-bakteereiden transformoimiseen, jolloin ne saatiin tetrasykliinille vastustuskykyisiksi, ja pesäkkeet seulottiin käyttäen Grunstein-Hogness-menetelmää, sekä 140 emäspa-rin kappaleeseen hybridisoituvaa, 32P-merkittyä koetinta. DNA otettiin talteen positiivi-5 sesti hybridisoituneista pesäkkeistä sen selvittämiseksi, sijaitseeko muodostettu PvuII-kohta 5-alun vai 3-alun puolella istutetusta 140 emäsparin DNA-ketjusta, joka on spesifinen adenoviruksen toiselle ja kolmannelle myöhäiselle johtoketjulle. PvuII-kohta sijaitsee asianmukaisesti 5-alun puolella 140 emäsparin suuruisesta istutteesta. Tästä plasmidista käytetään lyhennettä tTPL kuviossa 5A.

10 SV40-viruksen Ava II D-fragmentti, joka sisältää SV40-edistinsekvenssin, saatiin pilkkomalla SV40-viruksen DNA entsyymillä Ava II, jonka jälkeen päät tehtiin tylpiksi (blunt) Poll:n Klenow-kappaleella, näihin kappaleisiin ligatoitiin Xho 1-kytkijät, pilkottiin entsyymillä Xho 1 Xho 1-kohdan aukaisemiseksi, ja neljänneksi suurin (D) 15 fragmentti eristettiin elektroforeettisesti geelillä. Sitten tämä fragmentti ligatoitiin entsyymillä Xho 1 leikattuun plasmidiin pTPL, jolloin saatiin plasmidi pCVSVL2-TPL. SV40-viruksen D-kappale oli suuntautuneena plasmidissa pCVSVL2-TPL siten, että SV40-viruksen myöhäinen promoottori oli samalla tavalla suuntautuneena kuin adenoviruksen pääasiallinen myöhäinen promoottorikin.

20

Adenovirukseen liittyvien (VA) geenien viemiseksi plasmidiin pCVSVL2-TPL muodostettiin ensin plasmidi pBR322, joka sisälsi adenovirustyypin 2 Hind III B-fragmentin. Adenovirustyypin 2 DNA pilkottiin entsyymillä Hind III ja B-fragmentti eristettiin elektroforeettisesti geeliä käyttäen. Tämä fragmentti istutettiin plasmidiin pBR322, 25 joka oli tätä ennen pilkottu entsyymillä Hind III. Ampisilliinin vastustuskyvyn aikaansaamiseksi toteutetun E. coli-bakteeriin transformoimisen jälkeen yhdistelmät seulottiin sen suhteen, oliko Hind III B-kappale saatu istutetuksi, ja istutettu suuntautuminen määritettiin restriktioentsyymeillä pilkkomalla. Plasmidi pBR322 - Ad Hind III B sisältää adenovirustyypin 2 Hind III B-kappaleen kuvassa 5B esitetyllä tavalla suuntau-30 tuneena.

Kuten kuviossa 5B esitetään, VA-geenit saadaan vaivattomimmin plasmidista pBR322 -Ad Hind III B entsyymillä Hpa I pilkkomalla, jonka jälkeen lisätään EcoRI-kytkijöitä 37 104261 ja pilkotaan entysyymillä EcoRI, mitä seuraa 1,4 kiloemäsparin suuruisen fragmentin ottaminen talteen. Sitten fragmentti, jossa on tarttuvat EcoRI-päät, ligatoidaan PLT-ketjun EcoRI-kohtaan, joka on tätä ennen pilkottu entsyymillä EcoRI. E. coli-bakteeriin HB 101 transformoimisen ja tetrasykliinin vasmstuskykyyn perustuvan valikoinnin 5 jälkeen kolonnit seulottiin suodattimena hybridisointia käyttäen VA-geeneille spesifisen DNA:n suhteen. DNA otettiin talteen positiivisesti hybridisoituneista klooneista ja sen tunnusomaiset piirteet selvitettiin restriktioendonukleaaseilla pilkkomalla. Tuloksena olevasta plasmidista käytetään lyhennettä p91023.

10 Kuten kuviossa 5C esitetään, plasmidin p91023 kaksi EcoRI-kohtaa poistettiin pilkkomalla plasmidi p91023 täydellisesti entsyymillä EcoRI, jolloin syntyi kaksi DNA-kappaletta, joista toinen oli noin 7 kiloemäsparin pituinen ja toinen noin 1,3 kiloemäs-parin pituinen. Jälkimmäinen kappale sisälsi VA-geenit. Molempien kappaleiden päät täytettiin käyttäen Poll-entsyymin Klenovv-kappaletta, jonka jälkeen nämä kaksi kappa- 15 letta ligatoitiin yhteen. Plasmidi p91023(A), joka sisältää VA-geenit ja joka on plasmidin p91023 kaltainen, mutta josta kaksi EcoRI-kohtaa on hävitetty, tunnistettiin seulomalla Grunstein-Hogness-menetelmällä VA-geenikappaletta käyttäen, sekä tavanomaisella restriktiokohtien analyysillä.

20 Plasmidin p91023(A) ainoa Pstl-kohta poistettiin ja korvattiin EcoRI-kohdalla. Plasmidi p91023(A) leikattiin täydellisesti entsyymillä Pstl ja käsiteltiin Poll-entsyymin Klenow-kappaleella tasapäiden muodostamiseksi. EcoRI-kytkijät ligatoitiin plasmidin p91023(A) ’ tylpäksi tehtyyn Pstl-kohtaan. Lineaarinen p91023(A), jossa EcoRI-kytkijät olivat kiinnittyneet tylpäksi tehtyyn Pstl-kohtaan, erotettiin ligatoitumattomista kytkijöistä ja 25 pilkottiin täydellisesti entsyymillä EcoRI, ja ligatoitiin uudestaan. Kuviossa 5C esitetty plasmidi p91023(B) otettiin talteen, ja sen rakenne todettiin samankaltaiseksi kuin plasmidilla p91023(A), jossa rakenteessa kuitenkin aikaisempi Pstl-kohta oli korvautunut EcoRI-kohdalla. Plasmidi p91023(B) on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, josta se on saatavana tunnusnumeron ATCC 39754 perusteella.

30 38 104261 ' Li

Esimerkki 6: cDNA-kloonit lambda-EPOFL6 ja lambda-EPOFL13 (esimerkistä 3) istutettiin plasmi-diin p91023(B), jolloin saatiin pPTFL6 ja pPTFL13, vastaavasti. Kumpaakin puhdistet-5 tua DNA:ta käytettiin tämän jälkeen 8 ug 5 x 106 COS-solun transfektoimiseen käyttäen DEAE-dekstraani-menetelmää, joka kuvataan jäljempänä. 12 tunnin kuluttua solut pestiin ja niitä käsiteltiin tuotteella Chlogoquin (0,1 mM) 2 tuntia, pestiin uudestaan, ja sekoitettiin 10 millilitraan alustaa, joka sisälsi 10 % sikiöasteisen vasikan seerumia, ja pidettiin 24 tuntia tässä alustassa. Alustaksi vaihdettiin 4 ml seerumia 10 sisältämätöntä alustaa, ja solut otettiin talteen 48 tunnin kuluttua.

Immunologisesti aktiivisen EPO-proteiinin tuotanto todettiin radioimmunokokeella, joka kuvataan julkaisussa Sherwood ja Goldwasser (55). Vasta-ainetta saatiin tutkijalta Dr.

Judith Sherwood. Jodattu merkkiaine valmistettiin esimerkissä 1 kuvatusta homogeeni-15 sesta EPO-proteiinista. Määrityksen herkkyys on suurin piirtein 1 ng/ml. Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa 8.

Taulukko 8 20 Vektori Alustaan vapautuneen EPO-proteiinin määrä (ng/ml) pPTFL13 330 pPTFL6 31 25 pPTFL13 on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, josta se on saatavana tunnusnumeron ATCC 39990 perusteella.

Esimerkki 7 30 EPO cDNA (lambda-HEPOFL13) istutettiin vektoriin p91023(B) ja transfektoitiin COS- 1-soluihin ja otettiin talteen edellä kuvatusti (esimerkki 6), paitsi että klorokiinilla käsittely jätettiin toteuttamatta.

39 104261

In vitro biologisesti aktiivinen EPO määritettiin joko pesäkkeiden muodostumiskokeella käyttäen CFU-E-lähteenä sikiöasteisen hiiren maksasoluja, tai 3H-tymidiinin kulutusta mittaavalla kokeella käyttäen pernasoluja hiiristä, joihin oli injektoitu fenyylihydratsii-nia. Näiden menetelmien herkkyydet ovat suurin piirtein 25 m-yksikköä/ml. In vivo 5 biologisesti aktiivinen EPO määritettiin käyttäen joko hypoksiseen hiireen tai ruuatta pidettyyn rottaan perustuvaa menetelmää. Näiden menetelmien herkkyys on noin 100 mll/ml. Aktiivisuutta ei voitu todeta kummassakaan kokeessa valetilan alustasta. Kloonin EPOFL13 ilmentämällä EPO-proteiinilla saadut tulokset esitetään alla olevassa taulukossa 9, missä esitetyt aktiivisuudet on ilmoitettu yksikössä yksikköä/ml, käyttäen 10 standardina kaupallista, kvantitoitua EPO-proteiinia (Toyobo, Inc.).

Taulukko 9

Tyypin I EPO cDNAilla transfektoiduista COS-soluista erittynyt EPO 15

Menetelmä Aktiivisuus RIA 100 ng/ml CFU-E 2 0,5 U/ml 3H-Thy 3,1 1,8 U/ml 20 hypoksinen hiiri 1 U/ml ruuatta pidetty rotta 2 U/ml

Esimerkki 8: COS-soluista saadun EPO-proteiinin analysointi SDS-polv akrvv- 25 liamidigeelillä 180 ng alustaan vapautunutta EPO-proteiinia COS-soluista, jotka oli transfektoitu EPO *’ cDNA:lla (lambda-HEPOFL13) vektorissa 91023(B) (edellä), käsiteltiin elektroforeetti- sesti käyttäen 10 % SDS Laemmli polyakryyliamidigeeliä, ja siirrettiin sähköllä 30 nitroselluloosapaperille (Towbin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:4350 (1979). Suodattimelle laitettiin koettimeksi anti-EPO-vasta-ainetta taulukossa 8 esitetysti, pestiin, ja sille laitettiin uudeksi koettimeksi 125I-merkittyä Staph. A-proteiinia. Suodatinta • · autoradiografoitiin kaksi vuorokautta. Esimerkissä 1 kuvattu natiivi homogeeninen EPO, 104261 40 joko ennen jodikäsittelyä (ura B) tai sen jälkeen (ura C), käsiteltiin elektroforeettisesti (katso kuvio 6). Merkkiaineina käytettiin esimerkiksi 35S-merkittyä metioniinia, merkittyä seerumin albumiinia (68 000 d) sekä ovalbumiinia (45 000 d).

5 Esimerkki 9: RKl-4:n muodostaminen

Bam HI-PvuII-fragmentti plasmidista pSV2DHFR (Subramani et ai., Mol. Cell. Biol. 1:854-864 (1981)) eristettiin (fragmentti A), joka fragmentti sisälsi SV40-viruksen aikaisen alueen promoottorin hiirestä saadun dihydrofolaattireduktaasin (DHFR) geenin 10 vieressä, SV40-edistimen, pienen t-antigeenin intronin sekä SV40-viruksen poly-adenylaatioketjun. Muut fragmentit saatiin vektorista p91023(A) (edellä) seuraavasti: p91023(A) pilkottiin entsyymillä PstI ainoasta Pstl-kohdasta, joka sijaitsi adenoviruksen promoottorin läheisyydessä, jolloin plasmidi saatiin lineaariseksi, jonka jälkeen se joko ligatoitiin synteettisiin PstI - EcoRI-muuntajiin ja suljettiin uudestaan renkaaksi (jolloin 15 alkuperäisen Pstl-kohdan asemasta saatiin kohdat PstI - EcoRI - PstI; 91023(B’)) tai se käsiteltiin DNA-polymeraasin I suurella fragmentilla Pstl-kohtien tuhoamiseksi, ja ligatoitiin synteettiseen EcoRI-kytkijään ja suljettiin uudestaan renkaaksi (jolloin alkuperäisen Pstl-kohdan tilalle saatiin EcoRI-kohta; 91023(B)). Kumpikin tuloksena oleva plasmidi 91023(B) ja 91023(B’) pilkottiin entsyymeillä Xba ja EcoRI, jolloin saatiin 20 kaksi fragmenttia (F ja G). Fragmentti F plasmidista p91023(B) ja fragmentti G plasmidista p91023(B’) ja fragmentti G plasmidista p91023(B) ja fragmentti F plasmidista p91023(B’) liitettiin toisiinsa siten, että saatiin aikaan kaksi uutta plasmidia, jotka sisälsivät joko EcoRI - Pstl-kohdan tai PstI - EcoRI-kohdan alkuperäisen Pstl-kohdan tilalla. Siitä plasmidista, joka sisältää PstI - EcoRI-kohdan siten, että Pstl-kohta on 25 lähimpänä adenoviruksen pääasiallista myöhäistä promoottoria, käytetään nimitystä p91023(C).

* ·· Vektori p91023(C) pilkottiin täydellisesti entsyymillä XhoI, ja tuloksena olevan lineaari sen DNA:n tarttuvat päät tehtiin tylpiksi pään täyttämisreaktiolla käyttäen DNA-30 polymeraasilla I E. coli:sta saatua suurta fragmenttia. Tähän DNA:han ligatoitiin 340 emäsparin suuruinen Hind III - EcoRI-fragmentti, joka sisältää seuraavasti valmistetun SV40-edistimen: » · 41 104261 SV40-viruksesta saatu Hind III - Pvu II-fragmentti, joka sisältää SV40-viruksen replikaation alkukohdan sekä edistimen, istutettiin plasmidiin c lac (Little et ai., Mol. Biol. Med. 1:473-488 (1983)). c lac-vektori valmistettiin pilkkomalla c lac DNA entsyymillä BamHI, täyttämällä tarttuva pää DNA-polymeraasin I suurella fragmentil-5 la ja pilkkomalla DNA entsyymillä Hind III. Tuloksena olevaan plasmidiin (c SVHPlac) saatiin BamHI-kohta tylppään Pvu II-päähän ligatoimalla. EcoRI - Hind III-fragmentti valmistettiin plasmidista c SVHPlac ja ligatoitiin plasmidin PSVOd EcoRI - Hind III-fragmenttiin (Mellon et ai., edellä), joka sisälsi plasmidin replikaation alkukohdan, ja tuloksena oleva plasmidi pSVHPOd valikoitiin. Tämän jälkeen valmistettiin plasmidin 10 PSVHPOd 340 emäsparin suuruinen EcoRI - Hind III-fragmentti, joka sisälsi SV40-viruksen alkukohdan/edistimen, sen molemmat päät tehtiin tylpiksi DNA-polymeraasin I suurella fragmentilla, ja ligatoitiin entsyymillä Xhol pilkottuun, päistään tylpäksi tehtyyn, edellä kuvattuun vektoriin p91023(C). Tuloksena olevasta plasmidista (p91023(C)/Xho/tylppä plus EcoRI/Hindlll/tylppä SV40-alkukohta plus edistin), jossa 15 Hind III - EcoRI-fragmentti on suuntautuneena siten, että tässä fragmentissa oleva BamHI-kohta oli lähinnä VA-geeniä, käytetään lyhennettä pES105. Plasmidi PESI05 pilkottiin entsyymeillä BamHI ja PvuII sekä myöskin pelkällä entsyymillä PvuII, ja BamHI - PvuII-fragmentti, joka sisälsi adenoviruksen pääasiallisen myöhäisen promoottorin (fragmentti B), sekä PvuII-fragmentti, joka sisältää vastustuskyvyn geenin 20 (tetrasykliinin vastustuskyky) käsittävän plasmidin sekä muita sekvenssejä (fragmentti C), eristettiin. Fragmentit A, B ja C ligatoitiin ja tuloksena oleva plasmidi, joka , esitetään kuviossa 7, eristettiin ja siitä käytetään lyhennettä RK1-4. Plasmidi RK1-4 on talennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, josta se on saatavana tunnusnumeron ATCC 39940 perusteella.

25

Esimerkki 10: EPO-proteiinin ilmentäminen CHO-soluissa - Menetelmä I

" Edellä kuvatun plasmidin pPTFL13 (esimerkki 6) DNA (20 pilkottiin restriktioen- donukleaasilla Cla I, jotta plasmidi saataisiin lineaariseksi, ja se ligatoitiin plasmidin 30 pAdD26SVp(A) 1 entsyymillä Cla I pilkottuun DNA:han (2 /ig), joka sisältää adenoviruksen pääasiallisen myöhäisen promoottorin alaisuudessa olevan, vahingoittumattoman dihydrofolaattireduktaasin (DHFR) geenin (Kaufman ja Sharp, Mol, and Cell Biol, 2:1304-1319 (1982)). Tällä ligatoidulla DNA:lla transfektoitiin DHFR-negatiivisia 104261 42 CHO-soluja (DUKX-BII, Chasin L.A. ja Urlaub G. (1980) PNAS 77 4216-4220) ja niitä kasvatettiin kaksi vuorokautta, jonka jälkeen vähintään yhden DHFR-geenin käsittävät solut valikoitiin alfa-alustassa, josta nukleotidit puuttuivat, ja johon oli lisätty täydennykseksi 10 % dialysoitua sikiöasteisen naudan seerumia. Soluja kasvatettiin 5 kaksi viikkoa selektiivisellä alustalla, jonka jälkeen pesäkkeet poistettiin alkuperäisiltä maljoilta, yhdistettiin 10-100 pesäkettä sisältäviksi ryhmiksi, maljattiin uudestaan ja kasvatettiin yhteen alfa-alustalla, josta nukleotidit puuttuivat. Kasvatettujen pesäkeryhmi-en alustasta ennen metotreksaatilla valikointia saadusta supematantista määritettiin EPO RIA-menetelmällä. Niitä pesäkeryhmiä, joissa esiintyi EPO-proteiinin muodostumista 10 kasvatettiin metotreksaatin (0,02 μΜ) läsnäollessa, jonka jälkeen ne alikloonattiin ja määritys toteutettiin uudestaan. EPO Cla 4 4.02-7, ainut ahkiooni EPO Cla 4 4.02-joukosta, vapautti 460 ng/ml EPO-proteiinia alustaan, joka sisälsi 0,02 μΜ MTX (taulukko 10). EPO Cla 4 4.02-7 on EPO-tuotantoon valittu solulinja, ja se on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection tunnusnumerolla ATCC CRL 15 8695. Tällä hetkellä tällä kloonilla toteutetaan asteittaista valikointia MTX-pitoisuutta kasvattamalla, ja siitä saadaan todennäköisesti soluja, jotka tuottavat EPO-proteiinia vieläkin suurempia määriä. RIA-menetelmän perusteella negatiivisten pesäkeryhmien tapauksessa metotreksaatin (0,02 μΜ) läsnäollessa kasvatetuista vastinviljelmistä saaduista, metotreksaatille vastustuskykyisistä pesäkkeistä, jotka yhdistettiin, määritet-20 tiin uudestaan EPO RIA-menetelmällä. Ne viljelmät, jotka eivät olleet EPO:n suhteen positiivisia, alikloonattiin ja niitä kasvatettiin metotreksaatin pitoisuuksia edelleen suurentaen.

Asteittainen metotreksaatilla (MTX) valikointi toteutettiin viljelemällä soluja toistuvasti 25 metotreksaatin kasvavien pitoisuuksien läsnäollessa, ja valikoimalla eloonjääneet solut. Kussakin kasvatuksessa EPO määritettiin viljelmän supematantista RIA-menetelmällä . sekä in vitro biologisen aktiivisuuden kokeella. Metotreksaatin pitoisuus kasvamksen *· kussakin vaiheessa oli 0,02 μΜ, 0,1 μΜ ja 0,5 μΜ. Kuten taulukosta 10 nähdään, valikoinnin ensimmäisen kierroksen, jossa MTX-pitoisuus oli 0,02 μΜ, jälkeen viljely-30 alustaan vapautui merkittäviä EPO-pitoisuuksia.

• t

Taulukko 10 104261 43

Alustaan vapautuneen EPO-proteiinin määrä 5 Näyte Menetelmä Saanto Saanto alfa-alustasta, joka alfa-alustasta sisältää 0,02 μΜ metotreksaattia 4 4-joukko RIA 17 ng/ml 50 ng/ml 10 4 4- yksi pesäke klooni 15 (.02-7) RIA - 460 ng/ml

Esimerkki 11: EPO-proteiinin ilmentäminen CHO-soluissa - Menetelmä II

20 DNA kloonista lambda-HEPOFL13 pilkottiin entsyymillä EcoRI ja EPO-geenin sisältävä pieni RI-fragmentti alikloonattiin plasmidin RK1-5 (katso esimerkki 10) EcoRI-kohtaan. Tällä DNA :11a (RKFL13) transfektoitiin sitten suoraan (pilkkomatta) DHFR-negatiivisia CHO-soluja, ja valikointi ja kasvattaminen toteutettiin edellä esimerkissä 10 kuvatusti.

25 RKFL13 DNA istutettiin samoin CHO-soluihin käyttäen protoplastifuusiota ja mikroin-jektiota. Plasmidi RKFL13 on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, josta se on saatavana tunnusnumerolla ATCC 39989.

30 44 104261

Taulukko 11

Alustaan vapautuneen EPO-proteiinin pitoisuus 5 Näyte Menetelmä Saanto Saanto alfa-alustasta, joka alfa-alustasta sisältää 0,02 μΜ metotreksaattia

Pesäke RIA 3 ng/ml 42 ng/ml (joukko) joukko A 150 ng/ml (klooni) 10 ^H-Thy - 1,5 U/ml

Yksi pesäke RIA - 90 ng/ml klooni (.02C-Z) 15 JH-Thy - 5,9 U/ml

Mikroinjektoitu RIA 60 ng/ml 160 ng/ml joukko (DEPO-1) 20 JH-Thy 1,8 U/ml 25

Edullisin yhden pesäkkeen klooni on talennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, josta se on saatavana tunnusnumerolla ATCC CRL8695.

30 Esimerkki 12: Genomisen EPO-kloonin ilmentäminen COS-1 -soluissa . Genomisen EPO-kloonin ilmentämiseen käytettiin vektoria pSVOd (Mellon et ai., edellä). Vektorin pSVOD DNA pilkottiin täydellisesti entsyymillä Hind III ja tehtiin tylpäksi DNA-polymeraasin I suurella fragmentilla. Genominen EPO-klooni lambda-35 HEP03 pilkottiin täydellisesti entsyymeillä EcoRI ja Hind III, ja EPO-geenin sisältävä 4,0 kiloemäsparin suuruinen kappale eristettiin ja tehtiin tylpäksi edellä esitetysti. : Kuviossa 4 ja taulukossa 4 esitetään tämän fragmentin nukleotidijärjestys Hind III- kohdasta välittömästi polyadenylaation signaalin takana sijaitsevaan alueeseen saakka. EPO-geenin fragmentti istutettiin pSVOd-plasmidikappaleeseen, ja asianmukaisesti 40 muodostuneet yhdistelmät molemmalla tavalla suuntautuneena eristettiin ja varmistettiin. Plasmidi CZ2-1 käsittää EPO-geenin "a"-tavalla suuntautuneena (eli EPO:n 5’-pää lähimpänä SV40-alkukohtaa) ja plasmidi CZ1-3 on vastakkaisesti suuntautunut (suuntautuminen "b").

45 104261

Plasmidit CZ1-3 ja CZ2-1 transfektoitiin COS-1-soluihin esimerkissä 7 kuvatulla tavalla, alusta otettiin talteen, ja siitä määritettiin immunologisesti reaktiivinen EPO. Suurin piirtein 31 ng/ml EPO-proteiinia todettiin plasmidin CZ2-1 viljelmän supematan-tissa ja 16-31 ng/ml plasmidin CZ1-3 supematantissa.

5

Genomiset kloonit HEPOl, HEP02 ja HEP06 voidaan istuttaa ilmentämistä varten COS-soluihin samalla tavalla.

Esimerkki 13: Ilmentäminen C127- ia 3T3-soluissa 10 Plasmidin pBPVEPO muodostaminen

Plasmidi, joka sisältää EPO cDNA-ketjun hiirestä saadun metallotioneiinipromoottorin kopiointisäätelyn alaisuudessa, ja joka on kytketty naudan täydellisen papilloma-viruksen DNA-molekyyliin, valmistettiin seuraavasti: 15 pEPQ49f

Plasmidi SP6/5 saatiin yhtiöstä Promega Biotec. Tämä plasmidi pilkottiin täydellisesti entsyymillä EcoRI ja kloonista lambda-HEPOFL13 saatu 1340 emäsparin suuruinen 20 EcoRI-fragmentti istutettiin DNA-ligaasin avulla. Tuloksena olevasta plasmidista, jossa EPO-geenin 5’-pää oli lähimpänä SP6-promoottoria (määritetty entsyymeillä Bgll ja Hind III pilkkomalla), käytetään lyhennettä pEP049F. Tällä tavalla suuntautuneena BamHI-kohta PSP6/5-polykytkijässä on suoraan EPO-geenin 5’-pään vieressä.

25 pMMTneo BPV

Plasmidi pdBPV-MMTneo (342-12) (Law et ai., Mol, and Cell Biol. 3:2110-2115 · (1983)), joka esitetään kuviossa 8, pilkottiin täydellisesti entsyymillä BamHI, jolloin saatiin kaksi fragmenttia - suurempi fragmentti, jonka pituus oli noin 8 kiloemäsparia, 30 ja joka sisälsi BPV-genomin, sekä pienempi fragmentti, jonka pituus oli noin 6,5 kiloemäsparia, ja joka sisälsi pML2-rep!ikaation alkukohdan sekä ampisilliinin vastusm-kyvyn geenin, metallotioneiinipromoottorin, neomysiinin vastustuskyvyn geenin, sekä SV40-viruksen polyadenylaation signaalin. Pilkottu DNA tehtiin uudestaan renkaaksi 46 104261 DNA-ligaasilla, ja plasmidit, jotka sisälsivät ainoastaan 6,8 kiloemäsparin suuruisen fragmentin, tunnistettiin pilkkomalla restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI. Yhdestä tällaisesta plasmidista käytetään nimitystä pMMTneo BPV.

5 pEPQ15a pMMTneo BPV pilkottiin täydellisesti entsyymillä Bglll. pEP049f pilkottiin täydellisesti entsyymeillä BamHI ja Bglll, ja suurin piirtein 700 emäsparin suuruinen fragmentti, joka sisältää koko EPO-proteiinin koodaavan alueen, otettiin talteen geelin avulla 10 eristäen. Entsyymillä Bglll pilkottu pMMTneo BPV ja 700 emäsparin BamHI/Bglll EPO-kappale ligatoitiin ja tuloksena olevat, EPO cDNA:n sisältävät plasmidit tunnistet-tiin pesäkehybridisaatiolla käyttäen oligonukleotidikoetinta d(GGTCATCTGTCCCCTGTCC), joka on spesifinen EPO-geenille. Hybridisaatio-analyysin perusteella positiivisista plasmideista yksi (pEP015a), jossa EPO cDNA oli 15 suuntautuneena siten, että EPO cDNA:n 5’-pää oli lähimpänä metallotioneiinipromoot-toria, tunnistettiin pilkkomalla entsyymeillä EcoRI ja Kpnl.

pBPV-EPO

20 Plasmidi pEP015a pilkottiin täydellisesti entsyymillä BamHI plasmidin tekemiseksi lineaariseksi. Plasmidi pdBPV-MMTneo-(342-12) pilkottiin samoin täydellisesti entsyymillä BamHI, jolloin saatiin kaksi fragmenttia, 6,5 ja 8 kiloemäsparia. 8 kiloemäsparin kappale, joka sisälsi koko naudan papillomaviruksen genomin, eristettiin geelin avulla. pEP015a/BamHI ja 8 kiloemäsparin BamHI-fragmentti ligatoitiin yhteen, ja BPV-25 fragmentin sisältämä plasmidi (pBPV-EPO) tunnistettiin pesäkehybridisaatiolla käyttäen oligonukleotidikoetinta d(P-CCACACCCGGTACACA-OH), joka on spesifinen . BPV-genomille. Plasmidin pBPV-EPO DNA:n pilkkominen entsyymillä Hind III osoitti, ·· että BPV-genomin kopioitumissuunta oli sama kuin metallotioneiinipromoottorin kopioitumissuunta (kuten plasmidissa pdBPV-MMTneo (342-12), katso kuvio 8). 30 Plasmidi pdBPV-MMTneo (342-12) on saatavana kantakokoelmasta American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, tunnusnumerolla ATCC 37224.

47 104261

Ilmentäminen

Seuraavia menetelmiä käytettiin EPO-proteiinin ilmentämiseksi 5 Menetelmä I

pBPV-EPO DNA valmistettiin ja sitä käytettiin suurin piirtein 25 ug noin 1 x 106 C127 CHO-solun (Lowy et ai., J. of Virol. 26:291-98 (1978)) transfektoimiseen käyttäen tavanomaisia, kalsiumfosfaatilla saostamiseen perustuvia tekniikoita (Grahm et ai., 10 Virology. 52:456-67 (1973)). Transfektoimiseen käytetty väliaine poistettiin viiden tunnin kuluttua transfektoinnista, solut iskukäsiteltiin glyserolilla, pestiin, ja niihin lisättiin uutta alfa-alustaa, joka sisälsi 10 % sikiöasteisen vasikan seerumia. Solut trypsinoitiin 48 tuntia myöhemmin, ja ositettiin suhteessa 1:10 DME-alustaan, joka sisälsi 500 ug/ml G418-tuotetta (Southern et ai., Mol. Appi. Genet. 1:327-41 (1982)), 15 ja soluja inkuboitiin kahdesta kolmeen vikkoa. Tämän jälkeen G418:lle vastustuskykyiset pesäkkeet eristettiin toisistaan erillään mikrotiitterilevyn koloihin, ja ne kasvatettiin lähes yhteen G418:n läsnäollessa. Sitten solut pestiin, niihin lisättiin uutta alustaa, joka sisälsi 10 % sikiöasteisen vasikan seerumia, ja alusta otettiin talteen 24 tunnin kuluttua. Käsitelty alusta testattiin ja se todettiin positiiviseksi EPO-proteiinin suhteen radio-20 immunokokeella ja biologisella in vitro kokeella.

Menetelmä II

C127- tai 3T3-solut transfektoitiin sekä 25 mikrogrammalla pBPV-EPO:a että 2 25 mikrogrammalla pSV2neo:a (Southern et ai., edellä), kuten menetelmässä I kuvataan. Tämä vastaa pBPV-EPO:n suurin piirtein 10-kertaista molaarista ylimäärää. Transfek-. tion jälkeen toimenpiteet ovat samat kuin menetelmässä I.

Menetelmä III 30 C127-solut transfektoitiin 30 mikrogrammalla pBPV-EPO:a menetelmässä I kuvatulla tavalla. Transfektion ja osittamisen (1:10) jälkeen alusta vaihdettiin uuteen joka kolmas vuorokausi. Suurin piirtein 2 viikon kuluttua BPV-transformoitujen solujen keskukset 48 104261 (focus) tulivat näkyviin. Erilliset keskukset otettiin talteen ja siirrettiin mikrotiitterilevyn koloihin, joiden suuruus on 1 cm, kasvatettiin lähes yhtyneeksi mono kerrokseksi, ja käsitellystä alustasta määritettiin EPO-proteiinin aktiivisuus tai antigeenisyys.

5 Esimerkki 14: Ilmentäminen hvönteissoluissa

Plasmidin pIVEV EPOFL13 muodostaminen

Plasmidivektori pIVEV on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, josta se on saatavana tunnusnumeron ATCC 39991 10 perusteella. Vektoria muunnettiin seuraavasti:

pIVEYNI

pIVEV pilkottiin entsyymillä EcoRI, jotta plasmidi saatiin lineaariseksi, tehtiin tylpäksi 15 DNA-polymeraasin I suurella fragmentilla, ja yksi Notl-kytkijä

GGCGGCCGCC

CCGCCGGCGG

istutettiin tylppään päähän ligatoimalla. Tuloksena olevasta plasmidista käytetään 20 lyhennettä pIVEVNI.

pIVEVSI

pIVEV pilkottiin entsyymillä Smal plasmidin tekemiseksi lineaariseksi, ja yksi Sfil-25 kytkijä

GGGCCCCAGGGGCCC

CCCGGGGTCCCCGGG

30 istutettiin tylppään päähän ligatoimalla. Tuloksena olevasta plasmidista käytetään lyhennettä pIVEVSI.

49 104261 prVEVSIBgKp

Plasmidi pIVEVSI pilkottiin entsyymillä Kpnl, jolloin plasmidi saatiin lineaariseksi, ja kummastakin päästä poistettiin suurin piirtein 0-100 emäsparia pikkomalla kaksijuostei-5 sella eksonukleaasilla Bal31. Jokainen tuloksena oleva pää, joka ei ollut täysin tylppä, tehtiin tylpäksi käyttäen DNA-polymeraasin I suurta fragmenttia, ja polykytkijä (__Xho_ I JXbal

Bcrl‘11 ‘Ecokl Iclal Koni .

I i i M 1 I Γ.-i-—I

10 agatctcgagaattctagaTcgatggtacc

TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG

istutettiin tylppään päähän ligatoimalla. Polykytkijä istutettiin molemmilla tavoilla 15 suuntautuneena. Plasmidista, jossa polykytkijä on suuntautuneena siten, että polykytki-jässä oleva Bglll-kohta on lähimpänä polyhedronigeenin promoottoria, käytetään nimitystä pIVEVSIBgKp. Plasmidista, jossa polykytkijässä oleva Kpnl-kohta on lähimpänä polyhedronigeenin promoottoria, käytetään nimitystä pIVEVSIKpBg. Emäsparien, jotka hävisivät plasmidissa pIVEVSI olevan alkuperäisen Kpnl-kohdan ja 20 polyhydronipromoottorin välistä, lukumäärää ei määritetty. Plasmidi pIVEVSIBgKp on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, josta se on saatavana tunnusnumeron ATCC 39988 perusteella.

pIEVSIBgKpNl 25 pIVEVNI pilkottiin täydellisesti entsyymeillä Kpnl ja PstI, jolloin saatiin kaksi frag-. menttia. Suurempi fragmentti, joka sisälsi plasmidista replikaation alkukohdan ja • polyhedronigeenin 3’-pään, otettiin talteen geelin avulla eristämällä (kappale A).

pIVEVSIBgKp pilkottiin täydellisesti entsyymeillä PstI ja Kpnl, jolloin saatiin kaksi 30 fragmenttia, ja pienempi fragmentti, joka sisälsi polyhedronigeenin promoottorin ja polykytkijän, otettiin talteen geelin avulla eristämällä (kappale B). Tämän jälkeen kappale A ja B liitettiin DNA-ligaasilla, jolloin saatiin muodostumaan uusi plasmidi pIVEVSIBgKpNl, joka sisältää osittain hävinneen polyhedronigeenin, johon on 104261 50 istutettu polykytkijä, ja joka sisältää samoin Notl-kohdan (joka korvaa tuhoutuneen EcoRI-kohdan) sekä Sfil-kohdan, joka rajoittuu polyhedronigeenin alueeseen.

dIVEPO

5 pIVEVSI BGKpNI pilkottiin täydellisesti entsyymillä, jolloin plasmidi saatiin lineaariseksi, ja siihen istutettiin 1340 emäsparin suuruinen EcoRI-fragmentti kloonista lambda-HEPOFL13. Plasmidit, jotka sisälsivät EPO-geenin sillä tavalla suuntautuneena, että EPO-geenin 5’-pää on lähimpänä polyhedronipromoottoria ja polyhedronigeenin 3’-10 päätä, tunnistettiin entsyymillä Bglll pilkkomalla. Yhdestä näistä plasmidista, edellä kuvatulla tavalla suuntautuneena, käytetään nimitystä pIVEPO.

EPO-proteiinin ilmentäminen hvönteissoluissa 15 pIVEPO-plasmidia valmistettiin suuria määriä transformoimalla E. coli-kanta JM 101-tgl. Plasmidi-DNA eristettiin kirkastettuun lysaattiin perustuvalla tekniikalla (Maniatis ja Fritsch, Cold Spring Harbor Manual) ja sitä puhdistettiin edelleen CsCl-sentrifugoin-nilla. Autographa califomica-hyönteisen villityypin polyherdoosi-viruskannan (AcNPV) L-l DNA otettiin talteen uuttamalla viruspartikkeleita fenolilla, jonka jälkeen virus-20 DNA puhdistettiin CsCl-käsittelyllä.

Tämän jälkeen nämä kaksi DNA:ta transfektoitiin yhdessä Spodoptera frugiperda-hyönteisen soluihin IPLB-SF-21 (Vaughn et ai., In Vitro Voi. B, sivut 213-17 (1977)) käyttäen kalsiumfosfaattiin perustuvaa transfektointitoimenpidettä (Potter ja Miller, 25 1977). Transfektoitavien solujen kutakin maljaa kohden käytettiin 1 ug villityypin

AcNPV DNA:ta ja 10 ug pIVEPO-plasmidia. Maljoja inkuboitiin 27°C:n lämpötilassa 5 vuorokautta. Tämän jälkeen supematantti otettiin talteen, ja EPO-proteiinin ilmenty-· minen supematantissa vahvistettiin radioimmunokokeella sekä biologisella in vitro kokeella.

30 I » « 51 104261

Esimerkki 15: EPO-proteiinin puhdistaminen COS-solujen käsitelty alusta (121), jossa EPO-pitoisuus oli jopa 200 μg/litra, väkevöi-tiin 600 millilitraksi ultrasuodattamalla, käyttäen kalvoja, joiden molekyylipainoon 5 perustuva leikkausarvo ("cut off") on 10 000, ja esimerkiksi Millipore-yhtiön Pellican-laitteistoa, joka käsitti 5 neliöjalkaa kalvoa. Kokeet suoritettiin RIA-menetelmällä, kuten esimerkissä 6 esitetään. Ultrasuodatuksesta saatu pidäte diasuodatettiin 10 mM natriumfosfaattia, jota käytettiin 4 ml, ja jonka pH oli puskuroitu arvoon 7,0, vastaan. Väkevöity ja diasuodatettu käsittelyalusta sisälsi 2,5 mg EPO-proteiinia yhteensä 380 10 milligrammassa proteiinia. EPO-liuos väkevöitiin edelleen 186 millilitraksi ja saostuneet proteiinit poistettiin sentrifugoimalla nopeudella 110 000 x g 30 minuuttia.

EPO-proteiinin sisältävän (2,0 mg) supematantin pH säädettiin arvoon 5,5 50 % etikkahapolla, sitä sekoitettiin 4°C:n lämpötilassa 30 minuuttia ja saostuma poistettiin 15 sentrifugoimalla nopeudella 13 000 x g 30 minuuttia.

Kromatografia karbonvvlimetvvli-Sepharose-geelillä 200 μg EPO-proteiinia (yhteensä 24 mg proteiinia) sisältävä supematantti sentrifugoin-20 nista laitettiin kolonniin, johon oli pakattu CM-Sepharose (20 ml) -geeliä, joka geeli oli tasapainotettu 10 mM natriumasetaatilla, pH 5,5, ja pesty 40 millilitralla samaa puskuria. EPO, joka sitoutui CM-Sepharose-geeliin, eluoitiin 100 millilitralla NaU(O-l)- gradienttia 10 mM natriumfosfaatissa, pH 5,5. EPO-proteiinia (yhteensä 50 proteiinien kokonaismäärän ollessa 2 mg) sisältävät fraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin 2 25 millilitraksi ultrasuodattamalla, käyttäen Amicon YM 10 kalvoa.

HPLC-käsittelv käänteisfaasia käyttäen CM-Sepharose-ksäittelystä saadut väkevöidyt, EPO-proteiinia sisältävät fraktiot 30 puhdistettiin edelleen HPLC-käsittelyllä käänteisfaasikolonnia Vydac C-4 käyttäen. EPO laitettiin kolonniin, joka oli tasapainotettu 10 % liuotinta B (liuotin A oli 0,1 % CF3C02H vedessä; liuotin B oli 0,1 % CF3C02H liuottimessa CF3CN) virtausnopeudella 1 ml/min. Kolonnia pestiin 10 % B-liuotinta 10 minuuttia ja EPO eluoitiin 52 104261 liuottimen B lineaarisella gradientilla (10-70 % 60 minuutissa). EPO-proteiinia sisältävät fraktiot yhdistettiin (noin 40 μg EPO-proteiinia yhteensä 120 mikrogrammassa proteiinia) ja lyofilisoitiin. Lyofilisoitu EPO kasteltiin uudestaan 0,1 M Tris-HCl-puskurilla, pH 7,5, joka sisältää 0,15 M NaCl, ja käsiteltiin uudestaan kromatografi-5 sesti (HPLC) käänteisfaasia käyttäen. EPO-proteiinia sisältävät fraktiot yhdistettiin ja analysoitiin elektroforeettisesti SDS-polyakryyliamidigeeliä (10 %) käyttäen (Lameli, U.K., Nature). Yhdistetyt, EPO-proteiinia sisältävät fraktiot sisälsivät 15,5 ug EPO-proteiinia yhteensä 25 mikrogrammassa proteiinia.

10 Keksintö on täten kuvattu yksityiskohtaisesti, sen edulliset suoritusmuodot mukaan lukien. Kuitenkin on selvää, että alan asiantuntijat voivat tehdä keksintöön muutoksia ja parannuksia ohessa esitetyn kuvauksen ja piirustusten perusteella, kuitenkaan poikkeamatta tämän keksinnön hengestä ja tavoitteista, jotka määritellään liitteenä olevissa patenttivaatimuksissa.

15 4 « 4 » « ·· 53 104261

Kirjallisuusviitteet 1) Jacobson, L. 0., Goldwasser, E., Fried, W. ja Plzak, L. F., Trans. Assoc. Am. Physicians TO: 305-317 (1957).

5 2) Krantz, S. B. ja Jacobson, L. O. Chicago: University of Chicago Press 1970, sivut 29-31.

3) Hammond, D ja Winnick, S. Ann. N.Y. Acad. Sci. 230:219-227 (1974).

10 4) Sherwood, J. B. ja Goldwasser, E., Endocrinology 103:866-870 (1978).

5) Fried, W. Blood 40:671-677 (1972).

15 6) Fisher, J. J. Lab, and Clin. Med. 93:695-699 (1979).

7) Naughton, B. A., Kaplan, S. M., Roy, M., Burdowski, A. J., Gordon, A. S.

ja Piliero, S. J. Science 196:301-302.

20 8) Lucarelli, G. P., Howard, D. ja Stohlman, F., Jr. J. Clin, Invest 43:2195-2203 (1964).

9) Zanjani, E. D., Poster, J., Burlington, H., Mann, L. I. ja Wasserman, L. R. J. Lab. Clin. Med. 89:640-644 (1977).

25 10) Krantz, S. B., Callien-Lartigue, O. ja Goldwasser, E. J. Biol.Chem. 238:4085-4090 (1963).

11) Dunn, C. D., Jarvis, J. H. ja Greenman, J. M. Exp. Hematol. 3:65-78 (1975). 30 12) Krystal, G. Exp. Hematol. 11:649-660 (1983).

54 104261 13) Iscove, N.N. ja Guilbert, L.J., M.J. Murphy, Jr. (Ed.) New York: Sprineer-Verlag. sivut 3-7 (1978).

14) Goldwasser, E., ICN UCLA Symposium. Control of Cellular Division and 5 Development, A. R. Liss, Inc., sivut 487-494 (1981).

15) Cline, M.J. ja Golde, D. W. Nature 277:177-181 (1979).

16) Metcalf, D., Johnson, G. R. ja Burgess, A. W. Blood 55:138- (1980).

10 17) Krane, N. Henry Ford Hosp. Med. J. 31:177-181 (1983).

18) Eschbach, J., Madenovix, J., Garcia, J., Wahl, P., ja Adamson, J. J. Clin.

Invest. 74: 434-441 (1984).

15 19) Anagnostou, A., Barone, J., Vedo, A. ja Fried, W. Br. J. Hematol 37: 85-91 (1977).

20) Miyake, T., Kung, C. ja Goldwasser, E. J. Biol. Chem. 252:5558-5564 20 (1977).

21) Yanagawa, S., Hirade, K., Ohnota, H., Sasaki, R., Chiba, H., Veda, M. ja Goto, M. J. Biol. Chem. 259:2707-2710 (1984).

25 22) Lawn, R. M., Fritsch, E. F., Parker, R. C., Blake, G. ja Maniatis, T. Cell 15:1157-(1978).

·: 23) Sanger, F., Nicklen, S. ja Coulson, A. R. Proc. Nat’l. Acad. Sei.. U.S.A. 74: 5463- (1977).

30 24) Zanjanc, E.D., Ascensao, J.L., McGlave, P.B., Banisadre, M. ja Ash, R. C. J. Clin. Invest. 67:1183- (1981).

55 104261 25) Toole, J.J., Knopf, J.L., Wozney, J.M., Sultzman, L.A., Buecker, J.L., Pittman, D.D., Kaufman, R.J., Brown, E., Shoemaker, C, Orr, E.C., Amphlett, G.W., Foster, W.B., Coe, M.L., Knutson, G.J., Fass, D.N. ja Hewick, R.M. Nature in Press.

5 26) Goldwasser, E. Blood Suppl. 1, 58, xlii (abstr) (1981).

27) Sue, J.M. ja Sytkowdki, A.J. Proc. Nat’l Acad. Sei U.S.A. 80:3651-3655 (1983).

10 29) Bersch, N. ja Golde, D.W., In Vitro Aspects of Ervthropoiesis. M. J. Murphy (Ed.) New York: Sprineer-Verlag (1978).

30) Cotes, P.M. ja Bangham, D.R. Nature 191:1065- (1961).

15 31) Goldwasser, E. ja Gross, M. Methods in Enzvmol 37:109-121 (1975).

32) Nabeshima, Y. -i, Fujii-Kuriyama, Y., Muramatsu, M., ja Ogata, K. Nature 308:333-338 (1984).

20 33) Young, R.A., Hagencuhle, O. ja Schibler, U. Cell 23:451-558 (1981).

34) Medford, R.M., Nguyen, H.T., Destree, A.T., Summers, E. ja Nadal-Ginard, B. Cell 38:409-421 (1984).

25 35) Ziff, E.B. Nature 287:491-499 (1980).

:· 36) Early, P. Cell 20:313-319 (1980).

30 37) Sytkowski, A. Bio. Biop. Res. Comm. 96:143-149 (1980).

38) Murphy, M. ja Miyake, T. Acta. Haematol. Jpn, 46: 1380-1396 (1983).

56 104261 39) Wagh, P.V. ja Bahl, O.P. CRC Critical Reviews in Biochemistry 307-377 (1981).

40) Wang, F.F., Kung, G.K.-H. ja Goldwasser, E. Fed. Proc. Fed. Am. Soc, 5 Exp. Biol. 42:1872 (abstr) (1983) 41) Lowy, P., Keighley, G. ja Borsook, H. Nature 185:102-103 (1960).

42) VanLenten, L. ja Ashwell, G. J. Biol, Chem. 247:4633-4640 (1972).

10 43) Lee-Huang, S. Proc. Nat’l Acad. Sei. U.S.A. 81:2708-2712 (1984).

44) Fyhrquist, F., Rosenlof, K., Gronhagen-Riska, C., Hortling, L. ja Tikkanen, I. Nature 308:649-562 (1984).

15 45) Ohkubo, H., Kageyama, R., Vjihara, M., Hirose, T., Inayama, S. ja Nakanis-hi, S. Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A, 80:2196-2200 (1983).

46) Suggs, S.V., Wallace, R.B., Hirose, T., Kawashima, E.H. ja Itakura, K. Proc.

20 Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 78:6613-6617 (1981).

47) Woo, S.L.C., Dugaiczyk, A., Tsai, M.-J., Lai, E.C., Catterall, J.F. ja O’Malley, B.W. Proc.Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 75:3688- (1978).

25 48) Melchior, W.B. ja VonHippel, P.H. Proc. Nat’l Acad. Soc. U.S.A. 70:298- 302 (1973).

:* 49) Orosz, J.M. ja Wetmis, J.G. Biopolvmers 16:1183-1199 (1977).

30 50) Anderson, S. ja Kingston, I.B. Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 80:6836-6842 (1983).

57 104261 51) Ullrich, A., Coussens, L., Hayflick, J.S., Dull, T.J., Gray, A., Tam, A.W., Lee, J., Yarden, Y., Libermann, T.A., Schlessinger, J., Downward, J., Mayes, E.L.V., Whittle, H., Waterfiled, M.D. ja Seeburg, P.H. Nature 309:418-425 (1984).

5 52) Fisher, J. Proc. Soc. Exptl. Biol ia Med. 173:289-305 (1983).

53) Kozak, M. Nuc. Acid Res. 12:857-872 (1984).

10 54) Benton, W.D. ja Davis, R.W. Science 196:180-182 (1977), 55) Sherwood, J.B. ja Goldwasser, E. Blood 54:885-893 (1979).

56) Derman, E., Krauter, K., Walling, L., Weinberger, C., Ray, M. ja Darnell, 15 J.T., Cell 23:731-(1981).

57) Gluzman, Y., Cell 23:175-182 (1981).

58) Hewick, R.M., Hunkapiller, M.E., Hood, L.E. ja Dreyer, W.J. J. Biol, 20 Chem. 256:7990-7997 (1981).

59) Towbin, H., Stachelin, T. ja Gordon, J., Proc. Nat’l Acad. Sci. 76:4380- (1979).

25 60) Carnott, P., DeFlandre, C. C. R. Acad. Sci. Paris 143:432- (1960).

• ·

Claims (2)

58 104261

1. Menetelmä yhdistelmä ihmisen erytropoietiinin (hEPO) tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet 5 (a) viljellään sopivassa väliaineessa CHO-soluja, jotka sisältävät, toiminnallisesti kytkeytyneenä ilmentämistä säätelevään sekvenssiin, hEPO:ta koodaavan DNA-sekvenssin, ja 10 (b) otetaan talteen ja erotetaan tuotettu yhdistelmä hEPO soluista ja väliaineesta, tunnettu siitä, että käytetään CHO-soluja, joilla on kyky tuottaa N- ja O-kytkey-tynyttä glykosylaatiota fukoosia ja N-asetyyligalaktosamiinia sisällyttämällä, ja että yhdistelmä hEPO, jossa on N- ja O-kytkeytynyttä glykosylaatiota, otetaan talteen ja 15 erotetaan soluista ja väliaineesta.

2, Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä hEPO:11a on glykosylaatiomalli, joka käsittää heksoosien ja N-asetyyliglukosamiinin (Nacglc) väliset suhteelliset molaariset määrät 1,4:1, erityisesti galaktoosi: Nacglc = 20 0,9:1 ja mannoosi: Nacglc = 0,5:1. 59 104261