DE3884776T2

DE3884776T2 - Durch "site-directed" Mutagenese modifzierte Glukoprotein-Hormone und Verfahren zu deren Verwendung.

Info

Publication number: DE3884776T2
Application number: DE88312143T
Authority: DE
Inventors: Edward G Bernstine; Scott C Chappel
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1987-12-21
Filing date: 1988-12-21
Publication date: 1994-02-10
Anticipated expiration: 2008-12-22
Also published as: CA1341284C; EP0322226B2; ES2059545T3; HK143395A; EP0322226B1; DE3884776T3; JPH022384A; EP0322226A2; JP2525048B2; DE3884776D1; US5986068A; US5352779A; ES2059545T5; ATE95424T1; US5260421A; EP0322226A3; GR3032307T3

Description

Diese Erfindung betrifft im allgemeinen Hormone und insbesondere Glycoproteinhormone einschließlich der Hypophysenglycoproteine und schafft ferner Verfahren zur Erzeugung von Hormonanalogen durch ortsspezifische Mutagenese.
Glycoproteinhormone, insbesondere jene, die durch den Hypophysenvorderlappen synthetisiert und sekretiert werden, spielen entscheidend wichtige Rollen bei einer Reihe von Körperfunktionen, einschließlich Metabolismus, Temperaturregulierung, Wachstum und Fortpflanzung. Die Hypophysenglycoproteine, das Luteinisierungshormon (LH), follikelstimulierende Hormon (FSH) und thyreotrope Hormon (TSH) sind in der Struktur dem plazentaren Gonadotropin, dem Choriongonadotropin (hCG) ähnlich. Jedes der Moleküle ist tatsächlich ein Dimer, das aus zwei Proteinketten besteht, die durch nichtkovalente, ionische Wechselwirkungen zusammengehalten werden. Die Alpha-Kette ist für jedes der Hormone identisch. Die Beta-Kette ist der hormonspezifische Teil des Dimers.
Nach der Sekretion wandern die Hormone im Blutstrom zu den Zielzellen, die membrangebundene Rezeptoren enthalten. Das Hormon bindet an den Rezeptor und stimuliert die Zelle. Üblicherweise bewirkt eine solche Stimulation einen Anstieg in der Aktivität eines spezifischen intrazellulären Regulationsenzyms, das seinerseits eine biochemische Reaktion katalysiert, die für die Antwort der Zelle wesentlich ist. Bei hCG stimuliert die Bindung an den hCG-Rezeptor, der auf dem Corpus luteum (einer Ovarialstruktur) angeordnet ist, die Aktivität des Enzyms Adenylatcyclase. Dieses Enzym katalysiert die Umwandlung von intrazellulärer ATP zu cyclo-AMP (cAMP). cAMP stimuliert die Aktivität andere Enzyme, die bei der Erzeugung von ovarialen Steroidhormonen, besonders Progesteron, beteiligt sind. Die hCG-stimulierte Progesteronsekretion ist für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft in den ersten drei Monaten der Gestation wesentlich.
Der genaue Mechanismus, durch den ein dimeres Glycoproteinhormon wie hCG Vorgänge nach der Bindung an den Rezeptor, wie Aktivierung der Adenylatcyclaseaktivität, steuert, ist unbekannt. Durch eine Reihe experimenteller Manipulationen wurde jedoch gezeigt, daß die Kohlehydratstrukturen, von welchen jede durch eine Bindung an entsprechenden Asparaginresten (N-gebunden) an dem hCG-Molekül befestigt ist, in dieser Hinsicht eine wichtige Rolle spielen. Die Behandlung von Glycoproteinhormonen, wie LH, FSH oder hCG, mit Fluorwasserstoff entfernt etwa 70 Prozent der Oligosaccharidseitenketten. Die erhaltenen, teilweise deglycosylierten Moleküle behalten ihre Rezeptorbindeaktivität, sind aber nicht imstande, Vorgänge nach der Bindung an den Rezeptor zu stimulieren. Somit ist offensichtlich, daß der Zuckerteil des Glycoproteinhormons eine entscheidende Rolle bei Vorgängen nach der Bindung an den Rezeptor und somit bei der biologischen Aktivität spielt, obwohl er nicht direkt an der Rezeptorbindung beteiligt ist.
Es ist auch bekannt, daß die Oligosaccharide, neben ihrer Bedeutung in der in vitro-Bioaktivität, auch wichtige Komponenten für die Überlebensdauer der Moleküle im Kreislauf sind. Tatsächlich steht die Plasmahalbwertszeit eines Glycoproteinhormons direkt mit der Menge eines bestimmten Zuckermoleküls, der Sialsäure, in Zusammenhang, das im allgemeinen auf dem distalsten Teil der Oligosaccharidkette vorhanden ist. Die Entfernung der Kohlehydratteile (durch Fluorwasserstoffbehandlung) ergäbe die Erzeugung von Hormonen, die an den Rezeptor binden, aber nicht die erwartete biologische Antwort geben. Zusätzlich besäßen diese Moleküle eine äußerste kurze Plasmahalbwertszeit, da der Mangel an terminalen Sialsäureresten die Bindungsaffinität an den hepatischen Asialoglycoproteinrezeptor erhöht, wodurch die Clearance aus dem großen Kreislauf beschleunigt wird.
Viele klinische Endocrinopathien sind das Ergebnis einer Überproduktion stimulierender Hormone (z.B. führt eine übermäßige TSH-Sekretion zu Hyperthyreoidismus). Eine herkömmliche Behandlung eines pathologischen Zustandes, dessen Ursache ein Hormonüberschuß ist, wäre die Verabreichung eines Hormonantagonisten. Um wirksam zu sein, müßte ein Antagonist mit hoher Affinität an den Rezeptor binden, sollte aber Vorgänge nach der Bindung an den Rezeptor nicht aktivieren, . Aus früheren Diskussionen kann angenommen werden, daß Hormone, die mit Fluorwasserstoff behandelt werden (bei welchen etwa 70 Prozent der Kohlehydrate entfernt werden) wirksame, kompetitive Antagonisten wären. Tatsächlich wurde nachgewiesen, daß HF-behandelte Hormone mit einer etwas größeren Affinität für den biologischen Rezeptor binden, mit nativem Material effektiv konkurrieren und die erwartete biologische Wirkung des nativen Hormons in dosisabhängiger Weise vermindern.
Auf den ersten Blick scheint eine derartige Hormonzubereitung ein entwicklungsfähiger Kandidat für ein therapeutisches Mittel in Form eines kompetitiven Antagonisten zu sein. Mit der Herstellung solcher Zubereitungen im großtechnischen Maßstab sind jedoch vier Probleme verbunden. Erstens sind alle Hypophysenhormonzubereitungen im allgemeinen mit anderen Hormonen kontaminiert. Es besteht zwar die Möglichkeit, eine Zubereitung eines Hormons herzustellen und es teilweise zu deglycosylieren, die erhaltene Zubereitung enthielte aber auch andere deglycosylierte Hormone als Kontaminanten, die nachteilig unerwünschte und nicht annehmbare Nebenwirkungen nach der Verabreichung erzeugen könnten. Zweitens unterscheiden sich Zubereitungen von teilweise gereinigten Hormonen stark in ihrer Potenz, ihren physicochemischen Eigenschaften und in ihrer Reinheit. Daher müßte jede hergestellte Charge sorgfältig analysiert werden. Die Möglichkeit von chargenweisen Schwankungen bedingt die wiederholte Durchführung von klinischen Versuchen zur Bestimmung der wirksamen Dosis. Drittens ist das zur Deglycosylierung eingesetzte Verfahren unvollständig und somit bis zu einem gewissen Grad nicht kontrollierbar. Es gibt keine Information über die Schwankungen, die mit der Fluorwasserstoffbehandlung aufeinanderfolgender Hormonchargen verbunden sind. Mögliche Schwankungen in diesen Verfahren erforderten auch eine umfassende Kennzeichnung jeder hergestellten Charge. Viertens spielen die Kohlehydratseitenketten auch eine wichtige Rolle bei der Festlegung der Plasmahalbwertszeit eines Moleküls. Es wurde gezeigt, daß teilweise deglycosylierte Hormone nach der Injektion rasch aus dem Kreislauf ausgeschieden werden. Daher wären wiederholte Injektionen großer Dosen deglycosylierter Hormone zur Erzielung einer gewünschten Wirkung erforderlich. Die Notwendigkeit solch große Hormondosen zu deglycosylieren und zu verabreichen führt zu einem weiteren Problem, nämlich der Verfügbarkeit. Große Mengen an Hormonen sind gegenwärtig nicht verfügbar und könnten vermutlich nur durch rekoinbinante DNA-Technologie verfügbar gemacht werden.
Wie zuvor erwähnt, wären deglycosylierte Hormone, während sie die gewünschten kompetitiven antagonistischen Eigenschaften in vitro zeigen, aufgrund ihrer äußerst kurzen Plasmahalbwertszeit in vivo von geringem therapeutischem Wert. Die einzige mögliche Lösung dieses Dilemmas wäre vorzugsweise jene Kohlehydratreste zu entfernen, die für die biologische Wirkung der Moleküle verantwortlich sind, und jene zu verschonen, die den Molekülen die lange Plasmahalbwertszeit verleihen. Es ist jedoch wegen der nichtspezifischen Art der chemischen Behandlung unmöglich, dieses Ergebnis mit herkömmlichen chemischen oder enzymatischen Mitteln (d.h., Fluorwasserstoffbehandlung oder enzymatischem Verdau) zu erzielen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens, durch das vorzugsweise jene Kohlehydratereste entfernt werden, die für die biologische Wirkung der Moleküle verantwortlich sind, und jene verschont bleiben, die mit einer langen Plasmahalbwertszeit zusammenhängen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von Molekülen durch nichtchemische Behandlung, welche die gewünschte antagonistische Eigenschaft in Verbindung mit einer langen Halbwertszeit besitzen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer rekombinanten Technik zur Herstellung therapeutisch wirksamer Glycoproteinhormone, die teilweise deglycosyliert wurden, indem zumindest eine Oligosaccharidkette vollständig entfernt wurde, indem zumindest eine Glycosylierungsstelle fehlt oder entfernt wurde, die der fehlenden oder entfernten Oligosaccharidkette entspricht.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung neuartiger kompetitiver Hormonantagonisten mit therapeutischem Nutzen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung kompetitiver Hormonantagonisten, die im wesentlichen von Charge zu Charge gleichförmig sind und eine beständige Potenz aufweisen.
Daher wird gemäß einem ersten Merkmal der vorliegenden Erfindung ein modifiziertes Glycoproteinhormon geschaffen, das im wesentlichen die gesamte Rezeptorbindekapazität beibehält, die das Hormon in unmodifizierter Form besitzt, wobei das Hormon derart modifiziert ist, daß zumindest eine Oligosaccharidkette vollkommen fehlt oder entfernt wurde. In einigen Fällen kann es sein, daß nicht alle Oligosaccharidketten entfernt wurden oder fehlen. Dies wird erzielt, indem eine Glycosylierungsstelle, die der fehlenden oder entfernten Oligosaccharidkette entspricht, fehlt oder durch ortsspezifische Mutagenese entfernt wurde, wobei das Hormon an einer gewählten (Glycosylierungs-) Stelle deglycosyliert wird. Die Stelle kann auf der "a"-Untereinheit des Hormons liegen, wie die Aminosäurepositionen 52 und 78. Vorzugsweise ist das Hormon im wesentlichen nicht imstande, eine biologische Aktivität nach der Bindung an den Rezeptor auszulösen.
Üblicherweise besitzt das Hormon zumindest einen Sialsäurerest und es ist vorteilhaft, daß es eine Plasmahalbwertszeit aufweist, die jener des natürlichen, unmodifizierten Hormons annähernd gleich ist. Zu solchen Hormonen zählen das Luteinisierungshormon, follikelstimulierende Hormon, thyreotrope Hormon oder Choriongonadotropin (hCG). Das Hormon kann daher mit dem natürlichen (unmodifizierten) Glycoproteinhormon konkurrieren, das üblicherweise von derselben Art ist, wie z.B. luteinisierend, stimulierend, thyreotrop oder hCG.
Die Erfindung betrifft daher auch ein Glycoproteinhormon, das imstande ist, mit dem natürlichen Glycoprotein um eine Bindung an einen Rezeptor zu konkurrieren, aber im wesentlichen unfähig ist, eine Erhöhung der biologischen Aktivität nach der Bindung an den Rezeptor auszulösen, wobei bei dem Hormon zumindest eine Oligosaccharidkette vollkommen entfernt wurde, indem zumindest eine Glycosylierungsstelle fehlt oder entfernt wurde, die der fehlenden oder entfernten Oligosaccharidkette entspricht.
Ein zweites Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft ein modifiziertes Glycoproteinhormon, das im wesentlichen die gesamte Rezeptorbindekapazität beibehält, die das unmodifizierte Hormon besitzt, zur Verwendung in der Medizin, wobei das Hormon derart modifiziert ist, daß zumindest eine Oligosaccharidkette vollkommen fehlt oder entfernt wurde, indem zumindest eine Glycosylierungsstelle fehlt oder entfernt wurde, die der fehlenden oder entfernten Oligosaccharidkette entspricht.
Ein drittes Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein modifiziertes Glycoproteinhormon, das im wesentlichen die gesamte Rezeptorbindekapazität beibehält, die das unmodifizierte Hormon besitzt, wobei das Hormon derart modifiziert ist, daß zumindest eine Oligosaccharidkette vollkommen fehlt oder entfernt wurde, indem zumindest eine Glycosylierungsstelle fehlt oder entfernt wurde, die der fehlenden oder entfernten Oligosaccharidkette entspricht, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger aufweist.
Ein viertes Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines modifizierten Glycoproteinhormons, das im wesentlichen die gesamte Rezeptorbindekapazität beibehält, die das unmodifizierte Hormon besitzt, in der Herstellung eines kompetitiven unmodifizierten Hormonantagonisten, wobei das Hormon derart modifiziert ist, daß zumindest eine Oligosaccharidkette vollkommen fehlt oder entfernt wurde, indem zumindest eine Glycosylierungsstelle fehlt oder entfernt wurde, die der fehlenden oder entfernten Oligosaccharidkette entspricht. Das Verwendungsmerkmal umfäßt auch die Verwendung von hCG, das gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert wurde, bei der Herstellung eines Mittels zur Auslösung eines Aborts in den ersten drei Monaten und die Verwendung der modifizierten Hormone der vorliegenden Erfindung in der Herstellung eines Mittels zur Behandlung der Überproduktion von stimulierenden Hormonen.
Ein fünftes Merkmal betriftt eine DNA-Sequenz, die für ein modifiziertes Glycoproteinhormon codiert, das die gesamte Rezeptorbindekapazität beibehält, die das Hormon in unmodifizierter Form besitzt, wobei das Hormon derart modifiziert ist, daß zumindest eine Oligosaccharidkette vollkommen fehlt oder entfernt wurde, indem zumindest eine Glycosylierungsstelle fehlt oder entfernt wurde, die der fehlenden oder entfernten Oligosaccharidkette entspricht.
Ein sechstes Merkmal betrifft einen Vektor, der eine DNA-Sequenz des fünften Merkmals umfaßt.
Ein siebentes Merkmal betrifft einen Wirt, der einen Vektor des sechsten Merkmals umfaßt.
Ein achtes Merkmal betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, bestehend aus dem Vermischen eines modifizierten Glycoproteinhormons, das im wesentlichen die gesamte Rezeptorbindekapazität beibehält, die das Hormon in unmodifizierter Form besitzt, wobei das Hormon derart modifiziert ist, daß zumindest eine Oligosaccharidkette vollkommen fehlt oder entfernt wurde, indem zumindest eine Glycosylierungsstelle fehlt oder entfernt wurde, die der fehlenden oder entfernten Oligosaccharidkette entspricht, mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Bevorzugte Eigenschaften des zweiten bis achten Merkmals der vorliegenden Erfindung sind wie bei dem ersten Merkmal mutatis mutandis.
In Übereinstimmung mit den Prinzipien und Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Erzeugung antagonistischer Moleküle durch Entfernen spezifischer Glycosylierungsstellen, die üblicherweise auf dem Molekül vorhanden sind, durch eine rekombinante DNA-Technik, die ortsspezifische Mutagenese genannt wird, geschaffen. Genauer wird bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung die Tatsache genutzt, daß sich N-gebundene Oligosaccharide nur an den Proteinteil von Hormonen bei Asparaginresten anheften, wenn solche Asparaginreste in der Kohlehydrat-Befestigungssignalsequenz: Asparagin - irgendeine Aminosäure - Threonin oder Serin, vorhanden sind. Das Verfahren der gegenwärtigen Erfindung beseitigt vorteilhaft die Glycosylierungsstelle durch Veränderung der Nucleotidsequenz des Gens, das für das Hormon codiert. Dies wird vorteilhaft durch Mutation des Codons für Asparaginreste zu irgendeiner anderen Aminosäure erzielt, vorzugsweise zu einer, die die gesamte Ladung des Proteins bewahrt, oder auch durch Austausch des Threonin- oder Serincodons gegen eine andere Aminosäure, wodurch das Glycosylierungssignal entfernt wird. Dem erhaltenen exprimierten Proteinhormon fehlt der Zucker, der normalerweise an der nun veränderten Glycosylierungsstelle vorhanden ist, vollständig, wodurch es zu einem kompetitiven Antagonisten wird.
Das Verfahren ermöglicht vorteilhaft weiterhin die spezifische Existenz anderer Kohlehydratbefestigungspunkte zur Verlängerung der Plasmahalbwertszeit des Moleküls, ohne die Transduction der Bioaktivität nach der Bindung an den Rezeptor nachteilig zu beeinflussen. Daher kann im Gegensatz zu früheren Verfahren die gegenwärtige Erfindung eine große Quantität kompetitiver Hormonantagonisten mit gleichförmiger Qualität und langer Plasmahalbwertszeit schaffen. Die Erfindung umfaßt ferner therapeutisch wirksame Zubereitungsformen dieser modifizierten Moleküle, einschließlich pharmazeutisch annehmbarer Salze davon und auch jede Kombination der vorangehenden mit einem Träger, der optimal gewählt wird, um die Verabreichung des Moleküls an ein Säugetier oder anderes Tier zu unterstützen, ohne sich auf das Molekül oder Tier schädlich auszuwirken.
Gewisse spezifische Hormone der gegenwärtigen Erfindung können auch vorteilhaft als sichere und wirksame Abtreibungsmittel in den ersten drei Monaten eingesetzt werden. Nachdem ein soeben ovuliertes Ei in den Eileitern befruchtet wurde, wandert es zum Uterus, wo es in der innersten Schicht, dem Endometrium implantiert wird. Kurz nach der Implantation differenzieren die trophoectodermalen Schichten in Chorionzotten, die fingerähnliche Fortsätze sind, die tiefer in der endometranen Schicht "verwurzeln". Sobald die Chorionzotten wachsen, beginnt ein Zelltyp in ihnen, große Mengen an hCG herzustellen. Bis zur Differenzierung dieser Zotten und deren Proliferation in eine Plazenta mit steroidogener Kapazität, wandert das sekretierte hCG zu dem Eierstock, um den Gelbkörper vor seinem programmierten Absterben zu "retten", indem seine steroidogene Kapazität aufrechterhalten wird. Zusätzlich stimuliert hCG die fortgesetzte Sekretion von Progesteron, wodurch die Uteruskontraktionskraft und ein Abwerfen des Endometriums (Menstruation) verhindert wird, wodurch ansonsten die Schwangerschaft beendet wäre. Wenn die angemessenen Serum-Progesteronspiegel nicht aufrechterhalten werden können, kommt es im Gegensatz dazu bis nach den ersten drei Monaten der Schwangerschaft zu einem spontanen Abort, denn dann beginnt die Plazenta ausreichend Progesteron zur Erhaltung des Fötus zu liefern. Daher führt die Behandlung von schwangeren Frauen in den ersten drei Monaten mit einem hCG-kompetitiven Antagonisten der vorliegenden Erfindung zu einem Versagen des endogenen hCG in der Erhaltung des Gelbkörpers, wodurch es zu einem Absinken im Serum-Progesteronspiegel und einem Abort kommt.
Die ortsspezifische Mutagenese stellt eine bedeutende Technik zur Erzeugung definierter Punktmutanten dar. Das allgemeine Verfahren wurde von Zoller, M. J. und Smith, M. (1982) in Nucl. Acids Res. 10, 6487-6500 beschrieben und läßt sich wie folgt zusammenfassen: Das fragliche DNA-Fragment wird in einen M13-abgeleiteten Vektor geklont und es wird eine einzelsträngige DNA (ssDNA) hergestellt. Als Primer wird ein synthetisches Oligonticleotid verwendet, das üblicherweise 18% 2 Basen lang und komplementär zu einer Region der ssDNA ist, mit Ausnahme einer fehlenden Übereinstimmung, welche die Mutagenese lenkt. Die Matrize und der Primer werden verschmolzen. Es werden ein großes Fragment E. coli DNA Polymerase I (Klenow), Desoxyribonucleotide und T4 DNA Ligase zugegeben und eine geschlossene kreisförmige doppelsträngige DNA (ccDNA) synthetisiert und ligiert. Die Anreicherung auf ccDNA erfolgt durch eines von verschiedenen Verfahren. Die angereicherte ccDNA wird mit kompetenten JM101 Zellen transfectiert und es wird eine Population von sowohl mutierten als auch Wildtyp-Molekülen erhalten. Es kann jedes aus einer Reihe allgemein bekannter Durchmusterungsverfahren vorteilhaft zur Differenzierung zwischen den mutierten und Wildtyp-Molekülen verwendet werden. Das mutierte Molekül wird dann isoliert und durch Sequenzierung bestätigt.
Bei Anwendung dieser Methode sind einige Punkte zu berücksichtigen. Es ist besonders wünschenswert, eine gründliche Suche mittels Computer mit dem vorgeschlagenen Oligonucleotid zur Bestätigung eines spezifischen Primings an der gewünschten Stelle durchzuführen. Das Oligonucleotid sollte zur Bestätigung gegen den M13 Vektor und das zu mutagenisierende DNA-Fragment geprüft werden. Eine weitere mögliche Schwierigkeit, die vorzugsweise vermieden wird, ist der verstärkte Hintergrund von Wildtyp-Molekülen, der sich aus der ineffizienten Umwandlung von ssDNA zu ds ccDNA ergibt. Zoller und Smith beziehen sich auf verschiedene Methoden, die zur Bewältigung dieses möglichen Problems zur Verfügung stehen. Zoller und Smith verwendeten selbst alkalische Sucrosegradienten zu deren Anreicherung. Es kann ebenso S1-Nucleasebehandlung verwendet werden.
Bei der Konstruktion des miitagenen Oligonucleotids wird vorzugsweise eine Restriktionsenzymstelle wo dies möglich ist, geschaffen oder zerstört. Dadurch wird die Durchmusterung auf mutierte DNA durch eine einfache Restriktionsstellen-Fragmentgrößen-Analyse deutlich erleichtert.
Wenn es nicht möglich ist, geeignete Restriktionsstellen zu schaffen oder zu zerstören, kann die Durchmusterung durch eine Hybridisierungstestmethode unter Verwendung des mutagenen Oligonucleotids als Sonde durchgeführt werden. Diese letztgenannte Methode ist vorteilhafterweise von der Mutationsposition unabhängig und kann entweder unter Verwendung eines Phagen oder isolierter DNA durchgeführt werden. Das Prinzip des Hybridisierungstests besteht darin, daß das mutagene Oligonucleotid einen stabileren Doppelstrang mit der mutierten DNA bildet, da sie perfekt übereinstimmen; während der Wildtyp eine fehlende Übereinstimmung aufweist und daher ein geringeres Maß an Komplementarität besitzt. Vorteilhafterweise wird die Hybridisierung zunächst unter schwach stringenten Bedingungen ausgeführt, so daß sowohl die Mutante als auch der Wildtyp zu dem ³²P-markierten Oligonucleotid hybridisieren. Die Filter werden dann bei zunehmend höheren Temperaturen gewaschen, bis nur die Mutanten hybridisieren. Dieses Verfahren ist sehr rasch und kann üblicherweise in einem Tag durchgeführt werden. Während eine isotopische Markierung für die Sonde vorgeschlagen wurde, können auch andere Markierungen verwendet werden, obwohl andere Markierungen im allgemeinen bei sehr geringen Werten nicht so gut nachweisbar sind wie isotope Markierungen.
Die Erfindung wird nun nur beispielhaft beschrieben und die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1 - Ortswahl:

Es gibt zwei Glycosylierungsstellen bei der menschlichen a-Untereinheit, die an den Aminosäurepositionen 52 und 78 vorkommen. Die vorliegende Erfindung verlangt, daß die Aminosäuresequenz an diesen Positionen, Asn-X-Thr, in Asn-X-Val, Asn-X-Met oder Gln-X-Thr geändert wird. Für "a52" gibt es einige mögliche Mutationen, die in das obengenannte Schema passen und alle fehlende Übereinstimmungen von 2 Basen enthalten. Das Codon, das für Thr an der Position 54 verwendet wird, ist ACC. Die Codons für Val sind GTT, GTC, GTA und GTG; für Met ATG. Die Möglichkeiten sind daher ACC$GTC und ACC$ATG. AAC codiert für Asn bei Aminosäure 52 und wenn diese in Gln (CAA oder CAG) geändert wird, ist wieder eine fehlende Übereinstimmung von 2 Basen beteiligt. Leider erzeugt keine der obengenannten Mutationen eine Retriktionsenzymstelle. Es werden einige Stellen zerstört, aber diese sind sehr häufig und bieten keine nützliche Durchmusterungsinformation.
Für "a78" gibt es zwei Möglichkeiten für die Mutation von Thr (ACG). Zur Änderung dieses Codons in Met, ATG, ist eine einbasige Substitution erforderlich. Für Val, GTG, ist eine doppelte Mutation notwendig. Die Asn$Gln-Umwandlung erfordert dieselben Änderungen wie bei a52. Auch hier werden keine Restriktionsstellen an diesen Positionen geschaffen oder zerstört. Wie zuvor erwähnt, ist jedoch eine fehlende Übereinstimmung von 2 Basen leichter auf die Mutante zu durchmustern, da für das Oligonucleotid eine größere Homologie besteht als für den Wildtyp.
In der Folge ist eine bevorzugte Ausführungsform für die Umwandlung des Asn$Thr für a78 angeführt. mutiertes oligo

Beispiel 2 - Materialien:

M13mp18 und mp19F, IPTG, XGal und Phenol wurden von BRL (Bethesda Research Laboratories) erhalten. T4 DNA Ligase, T4 Polynucleotidkinase, alle Restriktionsendonucleasen und E. coli DNA Polymerase I großes Fragment Klenow, wurden von New England Biolabs erworben. ATP wurde von Sigma erhalten. q³²P-ATP und a³²P-ATP wurden von DuPont/NEN Medical Products erworben. PEG-6000 wurde von Kodak erhalten. Acrylamid, bis-Acrylamid und TEMED wurden von BioRad erworben. S1-Nuclease, Ribonuclease A und E. coli tRNA wurden von Boehringer Mannheim erhalten. Desoxyribonucleotid-triphosphate, pUC 18 und pUC 19 Plasmide wurden von PL-Pharmacia erworben. Nitrocellulosefilter wurden von Schleicher und Schuell erhalten.

Puffer, Medien und Stammlösungen

Die folgenden Puffer wurden zubereitet: Puffer 10x Kinase 10x Ligase S1 "Stop" Lösung A 50x Denhardt's Spermidin 50mM Tris-Base 1ug Träger tRNA 1 % Ficoll 1 % Polyvinylpyrrolidon 15mM Na-Citrat Medien 5x M9 Salze 0,5 g/l Na-Citrat Autoklavieren und Erweichen bei 55ºC. Zugabe mit sterilen Techniken: 1 ml 1M MgSO&sub4;"7 H&sub2;O; 0,7 ml 0,7% Thiamin, 10 ml 20% Glucose.

Minimalmediumplatten

Zugabe von 15g Bactogar zu 800 ml ddH&sub2;O, Autoklavieren. Nach dem Erweichen auf 55ºC, Zugabe von 200 ml 5 x M9 Salzen und Ausgießen der Platten.

YT

8 g/l Bactotrypton
5g/l Hefeextrakt
5g/l NaCl
Autoklavieren

Beispiel 3- Herstellung der ssDNA:

Das gewünschte DNA-Fragment, das für die Alpha-Untereinheit codiert, wurde mit dem geeigneten Restriktionsenzym digeriert und von einem Polyacrylamidgel isoliert. Das Fragment wurde in die geeignete Stelle in den gewählten M13-Vektor durch herkömmliche Techniken ligiert. Etwa 300 ng des Fragments und 30 ng digerierter M13 wurden in 10x Ligasepuffer, 10x ATP und 400E T4 DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 50ul vermischt. Die Ligationsreaktion wurde vier bis sechs Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, kann aber auch 20 Stunden bei 16ºC inkubiert werden.
Eine Öse voll JM101 Zellen wurde von einer M9-Minimalplatte in einen Kolben überführt, der das angemessene Volumen von YT enthielt, und bei 37ºC und Belüftung zu einer Dichte von OD&sub6;&sub6;&sub0; = 0,3 - 0,4 vermehrt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation in einem Sorvall SS-34 bei 8.000 rpm 10 Minuten bei 4ºC gesammelt, sofort in 0,5 Volumina eiskaltem 50mM CaCl&sub2; resuspendiert und 20 Minuten auf Eis gehalten. Die Zellen wurden wieder zentrifugiert und in 1/10 Volumen des ursprünglichen Wachstumsvolumen mit abgekühltem 50mM CaCl&sub2; resuspendiert. Die kompetenten Zellen werden, bis sie zur Verwendung bereit sind, auf Eis gelassen.
Teilmengen der Ligationsreaktion wurden den kompetenten JM101 Zellen beigegeben und nach der Beschreibung von Messing, J. (1984) Methods Enzym. 101, 20, transfectiert. Aus den einzelnen Plaques wurde ssDNA durch Vermehrung von 5 ml YT Kulturen mit 50 ul exponentialen JM101 über sechs bis acht Stunden bei 37ºC bereitet. Die Zellen wurden bei 3000 rpm 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert und 4 ml Überstände wurden in saubere Corex-Röhrchen überführt. Es wurde PEG, NaCl und RNaseA auf Endkonzentrationen von 4%, 500mM bzw. 10 ug/l beigegeben. Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubiert. Die Lösungen wurden dann bei 8000 rpm 10 bis 15 Minuten bei 4ºC im SS-34 Rotor zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und die Pellets in 300 ul 1xTE resuspendiert und in Eppendorf-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Es wurde eine TE-gesättigte Phenol-, dann Etherextraktionen durchgeführt, worauf eine Ethanolausfällung mit 1/10 Volumen 3M NaOAc, pH 5,2, folgte. Das getrocknete Pellet wurde in TE resuspendiert. Dann wurde eine Rekombinante mit der gewünschten Orientierung ausgewählt und eine 1-Liter-Kultur von ssDNA durch die obengenannte Methode in größerem Maßstab bereitet. Diese ssDNA dient als Matrizenquelle für alle Mutageneseexperimente.

Beispiel 4 - 5' Phosphorylierung des Oligonucleotids:

Für die Mutagenese:

1000-3000 pmol Oligonucleotid wurden in einer Lösung phosphoryliert, die 2 ul 10x Kinasepuffer, 2 ul 10x ATP und 4E Polynucleotidkinase in einem Gesamtvolumen von 20 ul enthielt. Die Reaktion wurde bei 37ºC 30-60 Minuten inkubiert und durch Inkubation bei 65ºC über 10 Minuten beendet.

Für die Hybridisierung:

Das Oligonucleotid wurde wie oben in einem Volumen von 50 ul phosphoryliert, wobei 50-100uCi q³²P-ATP als einzige ATP-Quelle verwendet wurden. Zur Entfernung des nicht eingefügten Nucleotids wurde die Reaktion mit einein 1/2 Volumen 7,5M NH&sub4;OAc und drei Volumina kaltem Ethanol ausgefällt. Das Pellet wurde mehrere Male mit kaltem 70% Ethanol gewachsen, getrocknet und in 50 ul TE resuspendiert.

Beispiel 5 - Oligonucleotid-spezifische Synthese von ds ccDNA:

Schmelzen:

Etwa 13 pmol ssDNA, 260 pmol 5'-phosphoryliertes Oligonucleotid und 1ul von Lösung A wurden in einem Gesamtvolumen von 10 ul vermischt. Zur Kontrolle wurde dasselbe ohne Oligonucleotid durchgeführt. Die Reaktionen wurden fünf Minuten bei 55ºC, dann fünf Minuten bei 22ºC inkubiert.

Extension:

1,5 ul 10x Klenow-Puffer, 1,5 ul 10x dNTP und 5E Klenow wurden den Schmelzreaktionen in einem Endvolumen von 15 ul zugegeben. Diese Reaktionen wurden fünf Minuten bei 22ºC inkubiert.

Ligation:

Den obengenannten Reaktionen wurden 1 ul 10x Ligase, 2 ul 10x ATP und 400E T4 DNA-Ligase zu einem Endvolumen von 20 ul beigegeben. Die Reaktionen wurden bei 16ºC 20 Stunden inkubiert.

Beispiel 6 - Anreicherung auf ccDNA:

Der Ligationsreaktion wurden 3 ul 10x S1-Puffer und 0,9E S1-Nuclease zu einem Endvolumen von 30 ul beigegeben. Eine 15 ul Teilmenge wurde sofort in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen entfernt, das 40 ul S1-"Stopp"-Puffer enthielt. Die S1-Nuclease-Reaktion wurde drei Minuten bei Raumtemperatur laufen gelassen. Nach drei Minuten wurden dem ursprünglichen Reaktions-Eppendorf 40 ul "Stopp"-Puffer zugegeben. Die Reaktionen waren extrahiertes Phenol:CHCl&sub3; und ausgefälltes Ethanol. Die Pellets wurden dann in TE resuspendiert.

Beispiel 7 - Transfection von ccDNA:

Teilmengen der Ligationsreaktionen wurden zur Transfection kompetenter JM101-Zellen wie zuvor beschrieben verwendet.

Beispiel 8 - Durchmusterung:

Ein trockener Nitrocellulosefilter wurde sorgfältig auf die Oberseite jeder Transfectionsplatte gebracht und bei 4ºC 15-30 Minuten belassen. Die Filter wurden wie von Maniatis, L., Fritsch, E.F. und Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, beschrieben, behandelt. Die wärmebehandelten Filter wurden mit 2x SSC befeuchtet und zwei oder mehr Stunden in einer Lösung von 150mm Tris-Cl (8,0), 750mM NaCl, 10 mM EDTA, 5x Denhardt, 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumphosphat in einem verschlossenen Schlauch bei Raumtemperatur vorhybridisiert. Die Vorhybridisierungslösung wurde entfernt und durch eine frische Lösung ersetzt, die 1x 10&sup6; cpm/ml Lösung ³²P-markiertes Oligonucleotid enthielt. Die Hybridisierung wurde bei Raumtemperatur 2-20 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden dann mit 6x SCC, 0,1 % SDS und 0,01M Natriumphosphat (pH 7,2) 20-30 Minuten bei zunehmender Temperatur gewaschen, wobei nach jeder Temperaturänderung eine Stunde bei -80ºC eine Autoradiographie mit zwei Verstärktingsschirmen vorgenommen wurde. Die endgültige Waschtemperatur beruhte auf der Gleichung: Tm = 2ºC x (Anzahl der A-T-Basen) + 4ºC x (Anzahl der G-C-Basen) nach Hanahan, D. und Meselson, M. (1983) Methods Enzym. 100, 333-342. Es wurde beobachtet, daß der Wildtyp üblicherweise bei Tm-10ºC entfernt war.

Beispiel 9 - Isolation der ds Mutante:

Einzelne, gut isolierte Positive wurden in 5 ml YT mit 50 ul exponentialen JM101 entfernt sowie in eine YT-Platte mit einem JM101-Rasen ausgestrichen. Die Kulturen wurden bei 37ºC mit Belüftung sechs bis acht Stunden inkubiert und dann bei 3000 rpm zehn Minuten bei 4ºC zentrifugiert. ds DNA wurde wie bei Maniatis, L., Fritsch, E.F. und Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, beschrieben, isoliert. Wenn möglich, wurden die Mutationen durch Restriktionsverdaus bestätigt. Falls nicht, wurde das Durchmusterungsverfahren (im Idealfall) auf den ausgestrichenen Platten wiederholt. Eine große Kultur der vorgeschlagenen mutierten ds DNA wurde nach dem Verfahren, das bei Maniatis, S. 90, beschrieben wird, bereitet.

Beispiel 10 - DNA-Sequenzierung:

Die doppelsträngige mutierte DNA wurde dann mit den geeigneten Restriktionsenzymen digeriert und von Polyacrylamidgels isoliert. Diese Fragmente wurden endmarkiert und durch das Verfahren sequenziert, das bei Maxam, A.M. und Gilbert, W. (1980) Methods Enzym. 65, 499-560, beschrieben ist. Die Fragmente können aber auch in M13 oder pUC-Vektoren subkloniert und durch das Didesoxyverfahren, das von Sanger, J., Nicklen, S. und Coulson, A. R. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 74, 5463-5467 beschrieben wurde, sequenziert werden.
Die Transfection von Säugetierzellen und die Wahl einer Zellinie, die durch die obengenannten Verfahren erzeugt wurde, kann dann durch die folgende Vorgangsweise durchgeführt werden: Die mutierte ds DNA kann mit Bam-Linkern ligiert und in eine Rinderpapillomavirus (PBV) Expressionskassette eingefügt werden, die das BPV-Genom, den Maus-Metallothionein-Promotor und SV40 poly-(A)-Sequenzen enthält, wie von Hsiung et. al. (1984) J. Mol. Applied Genetics 2, 497, beschrieben. Epithelähnliche Mauszellen (C127) können dann unter Verwendung des Kalziumphosphat-Ausfällungsverfahrens transfectiert werden. Transformierte Zellen werden im Idealfall 10-14 Tage nach der Transfection durch ihre Anhäufung identifiziert. Die Foci der Zellen sollten dann subkloniert werden, um eine reine Population zu erhalten, und in Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM), das mit 2% fötalem Rinderserum ergänzt war, vermehrt werden. Mutiertes hCG, das in das Kulturmedium sekretierte, wird durch ein Verfahren aus drei Schritten gereinigt, das die Tris-Acryl-Blue-Chromatographie, die Ionenaustausch- und die Gelfiltrationschromatographie umfaßt. Die Aktivität kann während des Reinigungsverfahrens durch einen Radioimmunoassay-Satz aufgezeichnet werden, der für diesen Zweck von Serono Laboratories erhältlich ist.
Die Zellinie, die die größte Menge von mutiertem hCG exprimiert, stimuliert die Sekretion von Testosteron von Suspensionskulturen aus Leydig-Zellen. Leydig-Zellen können von den Hoden erwachsener männlicher Mäuse erhalten werden. Im Idealfall werden etwa 0,25 x 10&sup6; Leydig-Zellen in etwa 1 ml (DMEM) inkubiert, das einen von mehreren Dosenhölien an nativem, den Zellen beigegegeben hCG enthält. Eine halbe Maximaldosis von hCG kann dann rasch bestimmt werden. Ein zweiter Satz der Suspensionskulturen sollte dann mit einer halben Maximaldosis von hCG und einer von mehreren zunehmenden Dosen des mutierten rekombinanten hCG behandelt werden. Eine biologisch inaktive Form von hCG wird um die Bindung an den Rezeptor auf den Leydig-Zellen konkurrieren und die Testosteronantwort der nativen Form vermindern.
Nach der Bestimmung des Dosisverhältnissen zwischen nativem und mutiertem hCG, das zur vollständigen Hemmung der von dem nativen hCG ausgelösten Testosteronantwort erforderlich ist, kann die mutierte Form sofort bei zahlreichen Arten einschließlich des Rhesusaffen, von denen bekannt ist, daß sie ein Choriongonadotropin sekretieren, auf ihre Fähigkeit, einen Abort auszulösen, geprüft werden und das wahlweise Antagonisthormon in Übereinstimmung mit den Prinzipien der vorliegenden Erfindung gewählt werden.

Claims

1. Modifiziertes Glycoproteinhormon, das im wesentlichen die gesamte Rezeptorbindekapazität beibehält, die das Hormon in unmodifizierter Form zeigt, wobei das Hormon dadurch modifiziert ist, daß zumindest eine Oligosaccharidkette vollkommen fehlt oder entfernt wurde, indem zumindest eine Glycosylierungsstelle fehlt oder entfernt wurde, die der fehlenden oder entfernten Oligosaccharidkette entspricht.

2. Hormon nach Anspruch 1, das im wesentlichen unfähig ist, eine Erhöhung der nach der Bindung an den Rezeptor vorliegenden biologischen Aktivität hervorzurufen.

3. Hormon nach Anspruch 1 oder 2 mit zumindest einem Sialsäurerest.

4. Hormon nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einer Plasmahalbwertszeit, die jener des natürlichen, unmodifizierten Hormons annähernd gleich ist.

5. Hormon nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem die Glycosylierungsstelle fehlt oder von der "a"-Untereinheit entfernt wurde.

6. Hormon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches das Luteinisierungshormon (LH), follikelstimulierendes Hormon (FSH), thyreotropes Hormon (TSH) oder Choriongonadotropin (hCG) ist.

7. Modifiziertes Glycoproteinhormon, das im wesentlichen die gesamte Rezeptorbindekapazität beibehält, die das unmodifizierte Hormon zeigt, wobei das Hormon dadurch modifiziert ist, daß zumindest eine Oligosaccharidkette vollkommen fehlt oder entfernt wurde, indem zumindest eine Glycosylierungsstelle fehlt oder entfernt wurde, die der fehlenden oder entfernten Oligosaccharidkette entspricht, zur Verwendung in der Medizin.

8. Hormon nach Anspruch 7, welches das Luteinisierungshormon, follikelstimulierendes Hormon, thyreotropes Hormon oder Choriongonadotropin ist.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung, bestehend aus einem modifizierten Glycoproteinhormon, das im wesentlichen die gesamte Rezeptorbindekapazität beibehält, die das unmodifizierte Hormon zeigt, wobei das Hormon dadurch modifiziert ist, daß zumindest eine Oligosaccharidkette vollkommen fehlt oder entfernt wurde, indem zumindest eine Glycosylierungsstelle fehlt oder entfernt wurde, die der fehlenden oder entfernten Oligosaccharidkette entspricht, und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Hormon Luteinisierungshormon, follikelstimulierendes Hormon, thyreotropes Hormon oder Choriongonadotropin ist.

11. Verwendung eines modifizierten Glycoproteinhormons, das im wesentlichen die gesamte Rezeptorbindekapazität beibehält, die das unmodifizierte Hormon zeigt, in der Herstellung eines kompetitiven unmodifizierten Hormonantagonisten, wobei das Hormon dadurch modifiziert ist, daß zumindest eine Oligosaccharidkette vollkommen fehlt oder entfernt wurde, indem zumindest eine Glycosylierungsstelle fehlt oder entfernt wurde, die der fehlenden oder entfernten Oligosaccharidkette entspricht.

12. DNA-Sequenz, die für ein modifiziertes Glycoproteinhormon codiert, das im wesentlichen die gesamte Rezeptorbindekapazität beibehält, die das Hormon in unmodifizierter Form zeigt, wobei das Hormon dadurch modifiziert ist, daß zumindest eine Oligosaccharidkette vollkommen fehlt oder entfernt wurde, indem zumindest eine Glycosylierungsstelle fehlt oder entfernt wurde, die der fehlenden oder entfernten Oligosaccharidkette entspricht.

13. Vektor, der eine DNA-Sequenz nach Anspruch 12 umfaßt.

14. Wirt, der einen Vektor nach Anspruch 13 umfaßt.