HUT50501A - Process for producing new polypeptides of growth factor activity and nucleinic-acid-sequences coding them - Google Patents

Description

A találmány olyan új polipeptid kompozíciókkal foglalkozik, ide értve kiméra polipeptideket is, amelyeknek növekedési faktor aktivitása van, és eljárásokat ismertet ezek előállítására rekombináns DN8 technikákat alkalmazva.

Az alábbiakban röviden ismertetjük, hogy a jelen bejelentés milyen más amerikai egyesült államok-beli bejelentésekkel áll kapcsolatban. A jelen bejelentés részbeni folytatása a 172,653 számú bejelentésnek (bejelentve 1988. március 24-én), amely viszont részleges folytatása a 115,139 számú bejelentésnek (bejelentve

1987. október 30-án) és a 149,965 számú bejelentésnek (bejelentve

1988. február 3~án), ez utóbbi a 791,247 számú bejelentés részleges folytatása (bejelentve 1985. október 25-én), amelyről lemondtunk, ez pedig a 666,523 számú bejelentés részleges folytatása (bejelentve 1984. október 30-án), amelyről lemondtunk; mindezek referenciaként épülnek be a jelen bejelentésbe.

Nagy számú polipeptidről, amelyet emlős sejtek választanak ki, állapították meg azt, hogy növekedési faktor aktivitásuk van. Ezeknek a polipeptideknek a szekvenciája lényegében megőrződik sokféle emlősben. Ezek közül a szóban forgó anyagok, közül sok stimulálódik onkogenicitással való kapcsolódással. Az is nagyon fontos, hogyan szabályozódik a növekedési faktor termelése, és ugyanakkor hogyan szabályozzák ezek a celluláris aktivitást.

Azt is meg kell jegyeznünk, hogy emlős sejtek fertőzése vírusokkal a fertőzött sejtek növekedésének burjánzását eredményezi. A jelen találmány céljaira különösen érdekesek a himlővírus család tagjai, pl. a Variola és Vaccinia vírusok, valamint bizonyos betegségekkel kapcsolatos vírusok, mint pl. a Shope fibroma vírus, Yaba tumor vírus és Molluscum contagiosum vírus (MCV).

Fontos lehet annak meghatározása, vajon a vírusok okoznak-e celluláris burjánzást, termelnek-e növekedési faktorokkal kapcsolatos polipeptideket, amelyek vagy növekedési faktorként működnek, vagy növekedési faktor receptorként. Ezeket a vegyületeket lehet alkalmazni azután a vírus-tevékenységek tanulmányozásában, a vírus jelenlétére vonatkozó vizsgálatokban, tápközegekben mitogénként, és terápiás szerek kifejlesztésében vírusos_efértőzések kezelésére. Az is fontos, hogy olyan vegyületeket fejlesszünk ki, amelyek növekedési faktorok agonistái, vagy antagonistái in vitro alkalmazásnál sejtnövesztő tenyészetekben, mitotikus folyamatok vizsgálatában és terápiában.

Az alábbiakban a tárgykörhöz kapcsolódó irodalommal kapcsolatban adunk áttekintést.

Venkateson és munkatársai £J. Virol. 44, 637-646 (1982)J leírják a Vaccinia vírusfehérjéket kódoló strukturgén DNS szekvenciaelemzését, de nem ismerik fel, hogy ezeknek a fehérjéknek bármelyike rendelkezne növekedési faktor aktivitással. Cooper és munkatársai ^J. Virol. 37., 284-294 (1981)] beszámolnak a Vaccinia vírus genom fordított terminális ismétlődésen belül kódolt mRNS-ek transzlációjáról. A himlővírus család tagjainál burjánzás! betegségekről számolnak be Shope fibroma vírusnál ^Shope: J. Exp. Med. 56, 793822 (1932)] , Yaba tumor vírusnál J^Niven és munkatársai: J. Path. Bacteriol. 81 , 1-14 (1961)], és Mollus cum contagiosum vírusnál (MCV) ^Postlethwaite: Arch. Environ. Health. 21 , 432-452 (1970)]. Az epidermális növekedési faktor (EGF) leírása megtalálható Scott és munkatársai £öcience, 221, 236-240 (1983)] és Gray és munkatársai ^Natúré, 303, 722-725 (1983)”^ közleményeiben. Az EGF-ben és a transzformáló növekedési faktorban (TGF) három diszulfid híd jelenlétéről számolnak be Savage és munkatársai ^J. Bioi. Chem. 248,

7669-7692 (1973)J , de ugyanezzel kapcsolatosak az alábbi irodalmi helyek is: Doolittle és munkatársai: Natúré 307, 558-560 (1984);

85006288 számú ausztrál szabadalmi bejelentés. Az EGF molekula receptor-kötő területe azt sugallja, hogy ez a harmadik és negye ···· dik cisztein gyök közötti hurokban van s munkatársai:

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81_, 1351-1355 (1983)]·

Vaccinia vírus növekedési faktor új leírásai találhatók az alábbi irodalmi helyeken: Brown és munkatársai: Natúré, 313, 491492 (1985); Reisner: Natúré 313, 801-803 (1985); Blomquist és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 , 7263-7367 (1984). Természetes Shope fibróma vírus növekedési faktort írnak le Chang W.C. és munkatársai ^Molecular and Cellular Bioi. 7., 535-540 (1987)J. Shope [j. Exp. Med. 56, 793-802 (1932)2] beszámol arról, hogy felnőtt nyulak fertőzése Shope fibroma vírussal fibroblasztok gyors burjánzását idézi elő, amely jóindulatú fibrómához vezet. Újonnan született vagy immun-szuppresszált felnőtt nyulak fertőzése fibroblasztok gyors burjánzását idézi elő, invazív atipikus fibroszarkómához vezetve £ Allison A.C.: J. Natl. Cancer Inst. 36 , 869-876 (1966); Smith és munkatársai: J. Natl. Cancer Inst. 50, 1529-1539 (1973); Allison A.C.: J. Natl. Cancer Inst. 35, 859-868 (1966)j.

Természetes Myxoma vírus növekedési faktort (MGM) írnak le Upton és munkatársai £ J. Virol. , 1271-1975 (1987)J. Felnőtt nyulak fertőzése Myxoma vírussal gyorsan burjánzó invazív mixoszarkómás tumort idéz elő [Strayer D.S. és Sell S.: J. Natl. Cancer Inst. 71 , 105-116 (1983)^]. Kimutattak olyan DNS szekvenciát is, amely egy konzervált növekedési faktort ^természetes Molluscum contagiosum vírus növekedési faktor (MCGF)J kódol ^Porter C.D. és Archard ·· ·

L.C.: J. Gén. Virol. 68, 673-682 (1987)]. Emberek fertőzése Molluscum contagiosum vírussal jóindulatú bőrtumorokat indukál, amelyeket gyorsan burjánzó sejtek jellemeznek ^Brown és munkatársai: Sex. Transm. Dis. 8, 227-234 (1981)]. A Yaba tumor vírus szubkután hisztocitómákat alakít ki majmokban és emberekben £Bearcroft és munkatársai: Natúré (London) 182, 195-196 (1958)], és ennek rokonsága miatt a Shope fibróma vírushoz, Myxoma vírushoz és Molluscum contagiosum vírushoz elvárható, hogy rokon növekedési faktorral bírjon.

Az egér EGF-ről (mEGF) (Scott és munkatársai, 1983, fentebb idézett munka; Gray és munkatársai, fentebb idézett munka) és humán EGF-ről ( hEGF) ^Gregory és munkatársai: Int. J. Pept. Protein Rés. 9, 107-118 (1977)] ismeretes, hogy homológok a humán, egér és patkány TGF-fel £Marquardt és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4684-4688 (1983)] és a Vaccinia vírus genom által kódolt Vaccinia növekedési faktor (VGF) 140 gyökös polipeptid 45-85 közti gyökeivel (Venkatesan és munkatársai, 1982, fentebb idézett munka).

Idegen peptidek kifejezését Baculovírus vektort alkalmazva rovarsejtekben írják le Maeda és munkatársai ^Natúré 3125, 592-594 (1985)], valamint Carbonell és munkatársai [j. of Virology 56, 153160 (1985)] .

Ezek az irodalmi helyek referenciaként épülnek be a jelen bejelentésbe .

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.

Új polipeptid kompozíciókat állítunk elő, amelyekben analógia található vírus-fehérjékkel; ezek a kompozíciók mitogénekként működnek, alkalmazhatók tápközegekben reagensekként növekedési faktor receptoroknak vagy növekedési faktorok jelenlétének a kimu • ···· ·· · ·· ·· ···· ·· • · · ··· ··· • · · ····· · • · · · · · · ··

- 6 tatására, és versengő anyagként a transzformáló növekedési faktorral és epidermális növekedési faktorral szemben. A kompozícióknak gyógyászati felhasználása is lehet pl. a hámosodás elősegítésében és az égések és sebek gyógyulásának elősegítésében. Az új kompozíciókat szintetizálhatjuk. A szóban forgó peptideket oligopeptidekként vagy fúziós fehérjékként alakítjuk ki, rekombináns technikákat alkalmazva gazdaszervezetek széles választékában.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1. ábra a Vaccinia vírus fehérje aminosav-összehasonlítása ismert növekedési faktorokkal, ahol a VGF beindító aminosava aszparaginsav (D) a 20. helyzet a metionintól, amely helyzet a bemu-24 tatott peptidek aa -ének felel meg.

A 2. ábra az érett VGF javasolt szerkezetét mutatja aszparagin (N) helyettesítésekkel. A lehetséges glikozilező helyeket az MGF-ben és SFGF-ben csillaggal jelöljük.

Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmány speciális kiviteli módjait.

Új kompozíciókat állítunk elő, amelyek epidermális növekedési faktor (EGF) vagy transzformáló növekedési faktor (TGF) agonistaként vagy antagonistaként működnek, és ezek széleskörű alkalmazását mutatjuk be sejttenyésztésben, diagnosztikában, in vivő terápiában és más peptidekkel kombinálva hibrid polipeptidek képzésében, amelyek immunogének antitestek termelésénél. Polinukleotid szekvenciákat izolálhatunk vagy készíthetünk, amelyek kifejező vektorokba vezethetők be a szóban forgó kompozíciók kifejezéséhez.

A kompozíciók analógok vírusfehérjék, elsősorban himlő vírusfehérjék fragmentumaival. Amint az 1. ábrában bemutatjuk, a VGFnek töltés nélküli és hidrofób gyökei vannak az N-terminális kö zelében az 5· és 15· gyökök között, és a C-terminális közelében a 100. és 124. gyökök között. Ezeket a gyököket analógoknak tekinthetjük integrális membrán glikoproteinekhez; ezek N-terminális hidrofób szignál-szekvenciával rendelkeznek, amely proteolitikus úton eltávolítódik a transzláció során vagy közvetlenül az után, és rendelkeznek egy C-terminális transzmembrán szekvenciával, amely az érett fehérje horgonyaként szolgál a membránban. A vírus polipeptid hasítása az arg-43-nál és arg-90-nél az érett pepiidben oldható polipeptid kibocsátásához vezethet. A 140 gyökös VV polipeptidről feltételezzük, hogy először egy mintegy 121 gyökös membránnal társult fehérjét hoz létre a 19 aminosavszekvencia eltávolítása után. Az intracelluláris feldolgozás után egy mintegy 77 gyökös oldható növekedési faktor peptidet kapunk [Cell 42, 383393 (1985)].

A Myxoma növekedési faktor (MGF) és a Shape fibroma növekedési faktor (SFGF) összehasonlítása a növeledési faktor család más tagjaival együtt (lásd 1 . ábra) számos jelentős különbséget tár fel. Az MGF és 8FGF, amelyek prekurzor molekulaként szintetizálódnak, szignál szekvenciával rendelkeznek az N-terminálisnál, de a növekedési faktorok családjának többi tagjaitól eltérően nem rendelkeznek transzmembrán tartománnyal a C terminálisnál, jelezve, hogy molekulákat választanak ki. A szekvencia elemzés az aszparagin aminosav jelentős alkalmazását mutatja mind az MGF-ben, mind az 8FGF-ben. Hat helyen mind az MGF, mind az 8FGF aszparagint őriz ott, ahol más tagok nem aszparaginnal rendelkeznek. Ezek közül a helyek közül aszparagin helyettesít két nagyon védett glicin gyököt a

8. és 31. helyeknél, ahol az első cisztein a 2. helynél van. Ezeknek a glicin gyökönek mindegyike nagyon védett tirozin gyökökkel van kombinálva a 9. és 32. helyeknél. Az aminosavak nagyon védett természete miatt a molekulának ezen az oldalán úgy véljük, hogy az ezen az oldalon jelen levő cisztein hurkok érdekeltek az ebbe a családba tartozó növekedési faktorok receptor-kötésében és működésében .

A glicin és aszparagin aminosavakról feltételezik, hogy a legnagyobb béta elfordulási potenciállal rendelkeznek £Ghou és Fassman: Ann· Rév. Biochem. 47, 251-276 (1978)J. így úgy tűnik, hogy ennek az elfordulási potenciálnak a megvédése különlegesen fontos a növekedési faktor aktivitáshoz. A Myxoma és Shope növekedési faktoroktól eltérő növekedési faktorok csaknem kizárólag glicint alkalmaznak a molekula fontos elfordulási területeiben. Az MGF-ben és SFGFben ezek a glicinek csaknem mind át vannak alakítva aszparaginná (lásd a 2. ábrát). Ez fontos biológiai funkcióváltozást jelez a nagyon védett glicin helyettesítése miatt az aszparagin gyökkel, az a lehetőség áll fenn, hogy a glicin helyettesítése aszparaginnal a védett elfordulási területekben a növekedési faktor szerkezetben a növekedési faktor megnövekedett működőképességéhez vezethet vagy az

EGF receptorhoz vagy valamely rokon receptorhoz való kötődés növekedése révén, ezáltal fokozva a növekedési faktor közvetlen hatását az érintett sejtekben, vagy a molekula stabilitásának foko zása révén.

Az aszparaginok új előfordulásából kettő az MGF-ben és 8FGFben lehetséges N-kapcsolt glikozilezési helyet alakít ki. Ezen kívül ezek a helyek jelen vannak a két cisztein hurokban, amely lehetővé teszi az aminosavak változó számát. így az aszparaginok új előfordulásai többszörös előnyt nyújtanak a növekedési faktoroknak a megnövekedett működőképességen túl is. Ezek egyike lehet • ···· ·· · • · · · · · · • · · · · ♦ • · · · ···· · ··· · ·· · ··

- 9 ··· a fehérje in vivő stabilizálása a bomlás elleni védelemmel és az immunogén helyek védelmével glikozilezés segítségével.

A szóban forgó polipeptidek azzal jellemezhetők, hogy képesek legalább egy hurkot vagy kört alkotni, általában három hurkot vagy kört azoknak a ciszteineknek az eredményeképpen, amelyek hidakat képeznek, ahol a növekedési faktorral kapcsolatos aktivitást szolgáltató molekula fiziológiailag aktív része mintegy 12-65 aminosav között van, általában 15-60 aminosav között. A három hurok közül két hurok 12-15 aminosavból (14-17 annuláris aminosav) van a cisztein hídon kívül, pontosabban az egyik 12-13 aminosavból (14 vagy 15 annuláris aminosavból), és a másik 15 aminosavból (17 annuláris aminosavból) van, ahol az N-terminálishoz közelebbi hurok általában 12-13 aminosavból, általánosabban 12 aminosavból van, és a középső hurok 15 aminosavból van.

A harmadik hurok, vagy C-közeli hurok 8 aminosavból (10 annuláris aminosavból) van, és benne foglaltatnak szegélyező aminosavak is; a képlet a következő:

ahol:

az egybetűs jelek az aminosavakhoz hagyományos jelentésűek, vagyis C jelentése cisztein, G jelentése glicin, N jelentése aszparagin, Y jelentése tirozin és R jelentése arginin;

aa valamely semleges aminosav, amely lehet alifás, elsősorban 3-4 szénatomos, vagy arómás, elsősorban 9 szénatomos, és 0-1 hidroxilcsoportja van, ilyen pl. az alanin., szerin, treonin, tiro10 • · ··· ·« · «· ·· ···· · · • · · · ♦ · ··· • · · ··«·· · ·«· · ·· · ·· zin vagy fenilalanin;

aa valamely semleges vagy bázisos aminosav, amely elsősorban 3-6 szénatomos, és amikor semleges, 0-1 karboxamid csoportja van, ilyen pl. az arginin, alanin, valin, leucin, izoleucin, aszparagin vagy glutamin;

aa valamely semleges vagy bázisos aminosav, amely lehet arómás vagy alifás, ahol az arómásra példaként a hisztidint hozzuk fel, és lehet 2-6 szénatomos, általában 3-6 szénatomos alifás, amely 0-1 hidroxilcsoporttal bír, ilyen pl. a szerin, treonin, leucin, valin, izoleucin vagy arginin;

aa valamely semleges aminosav, amely lehet alifás vagy arómás, ahol arómásra példaként a hisztidint hozzuk fel, és lehet 3-6 szénatomos alifás, amely 0-1 hidroxilcsoporttal bír, ilyen pl. a szerin, izoleucin és valin;

aa 2-6, általában inkább 3-6 szénatomos semleges alifás aminosav, amely 0-1 hidroxil csoporttal bír, ilyen lehet leginkább a szerin, treonin, valin, leucin vagy izoleucin, vagy valamely savanyú aminosav, amelyre példaként a glutaminsavat és aszparaginsavat hozhatjuk fel;

aa semleges vagy savanyú aminosav 3-6 szénatommal, ahol semleges aminosavra példaként az alanint, valint, leucint és szerint hozhatjuk fel, és savanyú aminosavra példaként az aszparaginsavat és a glutaminsavat hozhatjuk fel;

nQ aa^J alifás, 4-5 szénatomos semleges helyettesített aminosav, ahol a helyettesítő karboxamidcsoport, vagy savanyú aminosav, pl. aszparagin, glutamin, aszparaginsav vagy glutaminsav;

aa előnyösen arómás aminosav, vagy 3-4 szénatomos semleges alifás aminosav, amely általában hidroxilcsoport szubsztituenssel ·· « • · bír, ilyenek pl. a fenilalanin, hisztidin, tirozin, szerin vagy treonin;

aa^ semleges, helyettesített vagy helyettesítetlen, 3-6 szénatomos alifás aminosav, vagy bázisos aminosav, ilyenek pl. az alanin, valin, izoleucin, glutamin vagy arginin;

m és n jelentése 0 vagy 1;

4

PP és PP lehet azonos vagy különböző és jelentésük vagy hidrogénatom, jelezve a polipeptid befejezését, vagy lehet összesen 1000 aminosavnál nem nagyobb, általában összesen 500 aminosavnál nem nagyobb polipeptid lánc, ahol előnyösen az aminosavak 90 %-a, még előnyösebben mintegy 95 %-a a két polipeptidlánc egyikében van jelen; bizonyos esetekben a lánc lehet csupán egyetlen aminosav és nem több, mint 100 aminosav, gyakran nem több, mint 50 aminosav a polipeptid alkalmazásától és a kiterjesztett lánc szerepétől függően; a polipeptid lánc lehet rokonságban természetben előforduló növekedési faktorokkal és himlő vírus fehérjékkel kapcsolatos termé szetben előforduló polipeptid láncokkal vagy lehet eltérő a képletben speciálisan bemutatott polipeptid lánccal kapcsolatos természet ben előforduló láncoktól vagy ezek fragmentumaitól’általában eltérő.

Az aminosavak definícióját az alábbiakban adjuk meg.

Semleges (Ne) alifás nem helyettesített C, A, V, L, I, P helyettesített oxi ΰ , T tio C, M

N, Q amido • ···· ·· · ·« «· · · · · « « • · · · · · ··· • · · · · ·i9 · arómás nem helyettesített F helyettesítettY heterociklusos H,W

Töltéssel rendelkező (pH 6,0-nál) bázisos (Ba) K,R savanyú (Ac) D,E

A zárójelben levő rövidítések az adott aminosav-csoportra utalnak. A nem helyettesített kifejezés azokra az aminosavakra vonatkozik, amelyek a glicinben jelen levő karboxi- és aminocsoporttól eltérő szubsztituenseket nem tartalmaznak. Az aminosavak természetben előforduló L-aminosavak.

A semleges aminosavakat le lehet írni úgy is, mint amelyek nem poláris vagy poláris (de töltéssel nem rendelkező) R csoporttál bírnak. Azok az aminosavak, amelyek beleesnek ebbe a definícióba, az alábbiak:

Nem poláris aminosavak: A,

Poláris aminosavak:

V, L, I, P,

M, F, W

G, ö, T, C, Y,

N, Q

A hurok a fenti képletben a 28. és

37.

helyen levő ciszteinek között 0-1 savanyú aminosavat tartalmaz.

A ciszteineket a hurkon kívül közvetlenül szegélyező aminosavak (azaz a 27. és 38. aminosavak) között lehet legalább egy töltött aminosav és legalább egy amido-helyettesített alifás aminosav. A hurokban (28 - 37) levő aminosavak közül 4-6, általában 5 aminosav semleges alifás aminosav és 2-nél nem több, általában 1 aminosav arómás aminosav.

Különösen érdekesek azok a vegyületek, ahol a polipeptid

130-nál kevesebb, még inkább 55 aminosavnál kevesebb, és legalább

44, előnyösen legalább 53 aminosavat tartalmaz. Különösen érdeke···· ·* • · · • · · • · · » · · · · · ··· • · · · ··*· · ·«· · ·« · ·· .

- 13 sek a VGF 44. és 88. aminosavai közti polipeptidek és ezek frag1 47 meritumai (aa - aa , lásd az 1. ábrát).

Az aa előnyösen helyettesített vagy nem helyettesített, 3-6 szénatomos alifás aminosav, amely 0-1 hidroxilcsoporttal bír, ez előnyösen szerin vagy valin, vagy valamely arómás aminosav, elsősorban hisztidin;

aa^O előnyösen hisztidin, szerin vagy 5-6 szénatomos nem helyettesített alifás aminosav, elsősorban izoleucin;

aa előnyösen helyettesített vagy nem helyettesített alifás aminosav, amely 0-1 hidroxilcsoporttal bír és előnyösen 3-6 szénatomos ;

aa előnyösen 3-6 szénatomos alifás aminosav;

OO aa^J előnyösen glutamin vagy glutaminsav;

aa előnyösen arómás aminosav, még előnyösebben hisztidin vagy fenilalanin;

aa előnyösen semleges vagy bázisos aminosav.

Különösen jelentős két hurok jelenléte, a második hurokhoz kapcsolt C-közeli (proximális) hurokkal, ahol a második hurok aminosavai nagy mértékben változóak lehetnek. A második hurok előnyösen 14-16 aminosavból áll a cisztein hídon kívül, még előnyösebben 15 aminosavból. Az aminosavak közül 6-9, előnyösen 7-9, még előnyösebben 8 alifás aminosav helyettesített, vagy nem helyettesített, ahol az aminosavak közül előnyösen 3-nál kevesebb, még előnyösebben 1-2 aminosav van helyettesítve; 2-5 arómás aminosav, pontosabban általában 3 arómás aminosav, kívánatos módon hisztidin és tirozin van jelen; 2-4 savanyú aminosav, előnyösen 3 savanyú aminosav, leginkább aszparaginsav van jelen; és 0-2, általában 1 bázisos aminosav, leginkább arginin van jelen. Kívánatos, hogy a szóban ···· ··· • · ·· • · ·· · · ····♦ •·· · ·· • · ··· ·· forgó hurkot képző cisztein a másik hurok legközelebbi ciszteinjétől 0-2, általában 0-1 aminosavval, elsősorban argininnal legyen elválasztva.

Különösen érdekesek a jelen találmány szerinti vegyületek bizonyos alkalmazásainál az alábbi általános képletü vegyületek: _DD11_P 34 5 6 7 8^5

PP -aa -C-aa -aa -aa -aa -aa -aa -F-G-F

H-(aa^12a) -G-aa^U-C-aa^l6-Ar¹-(aa^17a) -(aa^17b) p p p

19 20 21 cici —33 —33 —33

aa²⁴-(aa²⁵-C-aa²⁷-C-aa²⁹-aa³°-G-Y-aa³³-G-aa³⁵

R-C-E_raa³⁹-aa⁴⁰)-aa⁴¹ -L-aa⁴³-aa⁴⁴-PP², ahol a képletben:

40 az aa -aa jelentést a képletben már leírtuk;

2

PP és PP lehet azonos vagy különböző, és lehet hidrogénatom; jelezve a jelzett polipeptid terminális végét vagy lehetnek polipeptidek összesen legfeljebb 1000 aminosavval, általában legfeljebb 500 aminosavval, de lehet összesen csak 1 aminosav is, vagy lehetnek egyénileg vagy külön-külön 1-100 aminosavból, általában 1-75 aminosavból, méginkább 5-500 aminosavból álló polipeptidek; ezek a polipeptidek speciális alkalmazást nyerhetnek a speciálisan leírt szekvencia módosításában egy előre meghatározott célra; PP és pp> lehet azonos a természetben előforduló himlővírus polipeptiddel és lehet eltérő attól', általában eltérő;

aa lehet bármilyen aminosav, elsősorban alifás aminosav vagy savas aminosav, előnyösen 2-6 szénatomos nem helyettesített ali-

fás aminosav; ezek között találjuk a glicint, leucint, valint, lizint, glutaminsavat és aszparaginsavat;

aa valamely, elsősorban 2-4 szénatomos semleges aminosav, különösen aszparagin, glicin és prolin;

4· aa lehet bármilyen aminosav, alifás vagy arómás, elsősorban

2-6 szénatomos, amely lehet semleges vagy savanyú, különösen 3-6 szénatomos; ezek között találjuk a prolint, aszparaginsavat, hisztidint, szerint és leucint;

aa savanyú vagy semleges helyettesített alifás aminosav, elsősorban glutaminsav vagy aszparaginsav, vagy 3-4 szénatomos, hidroxilcsoporttal helyettesített aminosav, elsősorban szerin;

β aa 2-6 szénatomos, általában 2-3 szénatomos helyettesítetlen alifás aminosav vagy valamely arómás aminosav, elsősorban glicin, hisztidin vagy tirozin;

aa valamely savanyú, bázisos vagy semleges, elsősorban 3-6 szénatomos aminosav, mint pl. glutaminsav, aszparaginsav, lizin és treonin;

aa® 2-3 szénatomos,	semleges, nem helyettesített alifás amino-
sav vagy 4-5 széaatomos,	karboxamid-csoporttal helyettesített 4-5
szénatomos aminosav, pl.	aszparagin, glutamin vagy glicin;

aa^ valamely semleges aminosav, akár alifás, akár arómás, általában alifás, ezen belül elsősorban 5-6 szénatomos, különösen leucin vagy fenilalanin;

2 aa arómás aminosav vagy 4-5 szénatomos, karboxamid-csoport tal helyettesített, 4-5 szénatomos alifás aminosav, főleg hisztidin vagy aszparagin;

12a aa valamely semleges alifás aminosav vagy savanyú aminosav, elsősorban glicin, aszparagin vagy aszparaginsav;

aa savanyú aminosav vagy 4-5 szénatomos, helyettesített vagy helyettesítetlen semleges alifás aminosav, amely 0-1 hidroxilcsoporttal bír, főleg aszparaginsav, treonin vagy valin;

6 aa kémiai kötés vagy valamely helyettesített vagy nem helyettesített 4-6 szénatomos semleges vagy bázisos alifás aminosav, elsősorban izoleucin, arginin vagy metionin;

ή

Ar valamely arómás aminosav, amely karbociklusos vagy heterociklusos gyűrű, és ezek között találjuk a hisztidint, fenilalanint vagy tirozint;

7a aa 3-6 szénatomos, általában 3-5 szénatomos, helyettesített vagy helyettesítetlen semleges alifás aminosav, amely 0-1 hidroxilcsoporttal bír; ezek között találjuk a valint, leucint, izoleucint és treonint;

7b aa 5-6 szénatomos, nem helyettesített semleges aminosav vagy valamely savanyú aminosav, elsősorban valin, izoleucin vagy glutaminsav;

aa valamely 2-6 szénatomos, előnyösen 3-6 szénatomos, helyettesített vagy helyettesítetlen, 0-1 hidroxilcsoporttal helyettesített semleges alifás aminosav, elsősorban alanin, szerin vagy glutamin;

aa lehet bármely aminosav, elsősorban 4-6 szénatomos, előnyösen 5-6 szénatomos alifás savanyú vagy bázisos aminosav, főleg arginin, leucin, valin és glutaminsav;

aa valamely savanyú aminosav vagy karboxamidcsoporttal helyettesített alifás aminosav, ezek között találjuk az aszparaginsavat, aszparagint, glutaminsavat és glutamint;

aa 3~6 szénatomos semleges, nem helyettesített alifás aminosav vagy bázisos aminosav, amely 0-1 hidroxil- vagy karboxamid • · csoporttal bír; ezek között találjuk az izoleucint, leucint, aszparagint, szerint, treonint, lizint és arginint;

aa kémiai kötés vagy valamely savanyú aminosav, amely aszparaginsav vagy glutaminsav, vagy valamely semleges alifás aminosav, elsősorban valin;

22a aa valamely semleges alifás aminosav, amely 0-1 hidroxilcsoporttal, elsősorban 1 hidroxilcsoporttal bír, főleg szerin;

2 To aa^á valamely semleges, 4-6 szénatomos alifás aminosav, főleg leucin vagy izoleucin;

aa kémiai kötés, vagy semleges, 2-6 szénatomos, helyettesített vagy helyettesítetlen alifás aminosav, amely 0-1 hidroxil helyettesítővel bír; ezek között találjuk a glicint, szerint, treonint és aszparagint;

aa valamely alifás aminosav, elsősorban tio-szubsztituált alifás aminosav, főleg metionin, prolin vagy valamely arómás aminosav, elsősorban tirozin;

Ζ|.ή aa valamely semleges, helyettesített vagy helyettesítetlen alifás vagy savanyú aminosav 4-6 szénatommal, elsősorban valin, aszparagin vagy aszparaginsav;

aa valamely semleges alifás, savas vagy bázisos aminosav,

4-6 szénatomos, helyettesített vagy helyettesítetlen, ezek között találjuk a valint, leucint, izoleucint, arginint, lizint és aszparaginsavat;

aa lehet bármilyen aminosav, főleg bázisos aminosavaktól eltérő aminosav, és lehet savas, semleges vagy arómás, és amikor arómástól eltérő, 3-6 szénatomos , főleg aszparaginsav, alanin, leucin, triptofán vagy treonin; és p jelentése 0 vagy 1.

Különösen érdekes az, ahol pp az alábbi szekvenciával bír:

-15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

213» —3,3, —3,3, “3,3, —33, ““3,3, —3,3, “3,3, —3,3. —3,3, “3,3, 3,3,

-3 -2 -1

3,3, “3,3, “3,3, ahol:

'

PP az ezt követő aminosav jelzésekkel együtt a fenti szekál 1 venciában a PP -gyei ekvivalens. A fenti szekvencia a pp definiál I dójából következik; PP lehet hidrogénatom vagy valamely amino savszekvencia. Egy vagy több aminosav, amelyet aa -szel jelképeztünk (x lehet bármilyen szám) lehet egy kémiai kötés, ez arra szolgál, hogy csökkenjen az aminosavak száma az N-terminális láncon.

Ennek megfelelően a jelzett aminosavszekvencia egésze vagy része lehet jelen. Amikor a szekvencia egy része van jelen, a szekvencia előnyösen összefüggő aminosavakat foglal magában, vagyis aminosavakat számszerű sorrendjükben kihagyások nélkül. Általában legalább egy aminosav, méginkább legalább három aminosav, leginkább hat aminosav van jelen, amikor a további felfelé levő aminosavak hiáή _ή —θ nyoznak, vagyis a PP az aa -hez, aa -hoz, stb. csatlakozhat;

aa lehet bármely aminosav, elsősorban 3-6 szénatomos alifás aminosav, előnyösen semleges vagy bázisos; különösen a lizin, arginin, prolin, aszparagin vagy szerin tartozik ezek közé;

_2 aa lehet bármely aminosav, vagy alifás, vagy arómás, főleg alifás, elsősorban 3-6 szénatomos alifás aminosav;

aa lehet alifás vagy arómás, elsősorban 2-6, inkább 2-5 szénatomos alifás, poláris vagy nem poláris aminosav, ahol az alifás aminosav 0-1 hidroxil szubsztituenssel bír;

aa ⁴ lehet bármilyen, semleges vagy bázisos, általában 3-6 szénatomos, de inkább 5-6 szénatomos alifás aminosav, főleg asz19 paragin, prolin vagy lizin;

_5 aa lehet bármilyen alifás aminosav, elsősorban semleges, általában 3-6 szénatomos, főleg valin vagy izoleucin;

^—6 aa valamely semleges vagy savanyú aminosav, amely amikor alifás, akkor 3-6, általában inkább 4-6 szénatomszámú, leginkább izoleucin, valin vagy aszparaginsav;

-7 -8 -9 -12 -14 -15 -16 -17-19 cici y 33« , 33 33 , 33 , 33 > 33 , 33 , 33,

-20 -21 , -23 n r , . , , ..

aa , aa es aa 3-6 szénatomos, poláris vagy nem poláris, de általában inkább poláris alifás aminosavak, amelyek 0-1 hidroxilszubsztituenssel bírnak, vagy arómás aminosavak;

aa és aa ³ 2-6 szénatomos, elsősorban 2-3 szénatomos nem poláris alifás aminosavak vagy savanyú aminosavak;

-13' -22 -24 aa , aa és aa 4-5 szénatomos poláris alifás aminosavak vagy savanyú aminosavak, amelyek gyakran tartalmaznak karboxamido szubsztituenst;

aa és aa poláris vagy nem poláris alifás aminosavak vagy savanyú aminosavak.

-1 -2Zi -1 —7

Különösen érdekesek az aa -tői aa -ig vagy aa -tői aa -ig, elsősorban aa -tői aa -ig terjedő'Ν-terminális fragmentumok. A '

PP alkalmasan lehet valamely nem rokon aminosavszekvencia, amely fúziós fehérjeként szolgálhat, főleg abból a célból, hogy valamely immunogén peptidet állítsunk elő az adott anyag elleni antitest termeléséhez.

40

A jelen kompozíció elsőrendű tárgyai az aa -tői aa -ig terjedő szekvencia, elsősorban a 28. helyen levő ciszteintől a 37. helyen levő ciszteinig terjedő szekvencia, és a 2. hely és 10. hely ciszteinjei és a 15· hely és 26. hely ciszteinjei által kialakított hurkok. Kívánatosán a szóban forgó kompozíciók rendelkeznek a • · · · « · · • 4

28. és 37. helyeknél levő ciszteinek által alkotott hurokkal a 15.

és 26. helyeken levő ciszteinek által alkotott hurokkal együtt.

Kiméra polipeptid szekvenciákat készíthetünk különböző polipeptidek fragmentumainak kombinálásával, amely polipeptidek lényegében a természetben előforduló polipeptidekhez hasonlóak, és természetben előforduló növekedési faktorokkal és himlővírus fehérjékkel társultak. Az így létrejövő kiméra polipeptidek általában 40-65 aminosavból, elsősorban 49-53 aminosavból állnak. Minden esetben a ciszteinek keret-szerkezete a cisztein-hidakkal őrződik meg, amelyek meghatározzák a korábban leírt hurkok méreteit. így bármelyik növekedési faktorból alkalmazhatunk fragmentumot, amelynek lényeges homológiája van VGF-fel (lásd pl. az 1. ábrát), vagy más ι

olyan növekedési faktorból amely azonos keret-szerkezettel bír, mint a szóban forgó kompozíciók és hasonló a fiziológiai aktivitása. Itt nem kell tekintettel lenni az emlős forrás eredetre, ez lehet főemlős, pl. ember, rágcsáló, pl. patkány és egér, szarvasmarha, madár, sertés, stb.

Szükségesek lehetnek csatlakozások is, legfeljebb három, a fragmentumok forrásától és a kívánt polipeptid hosszától függően.

-6 1

Kívánatosán az elágazások lehetnek valamely ponton az aa és aa , .. .... 11 _x 15-.-- .... 25 x 29 , ·· .... x42 kozott; az aa és aa kozott; az aa és aa kozott; és az aa

53-615 és aa között. A szekvenciát az aa és aa között N-terminális

1429 szekvenciának nevezzük; a szekvenciát az aa és aa között köz25 ponti fragmentumnak nevezzük; és a szekvenciát az aa es a peptid

4447 vége (általában aa - aa ) között C-terminális tartománynak nevezzük. A csatlakozás pontos pontja változhat a restrikciós helyek elhelyezkedésétől, stb. függően. Ezen kívül minális szekvencia, amely az aa és aa egy rendkívüli N-ter— általában az aa és ···

_7 aa közti szekvenciát tartalmazza, szintén csatlakozhat a kiméra polipeptidhez.

A fragmentumok általában 15-50, leginkább 15-45 aminosavból állnak; az aa nem a vegyület 20. aminosava szándékozik lenni, hanem csak egy speciális szekvencia 20. aminosava, amelyet speciálisan meghatározunk (lásd az 1. ábrát).

Számos alkalmas restrikciós helyet tervezünk a kiméra polipeptidek megalkotására alkalmazott szintetikus génekbe. Amikor lehetséges, a restrikciós helyek változatlanul megőrzik a növekedési faktor gén aminosavszekvenciáját. Bizonyos esetekben azonban az új restrikciós hely beépítése megváltozott aminosavszekvenciát eredményez. Különösen érdekes az, ahol a VGF-hez tartozó kódoló szekvencia módosul egy KpnI restrikciós hely beépítésével, megváltozik 15 tatva az aa - aa közti aminosavszekvenciát GDC-ről GTC-re és

28 bevezetve egy új Sphl helyet az aa és aa között, a GMYCRC szekvenciát GYACVC-re változtatva. Ezek a változások kényelmes helyeket biztosítanak a VGF génből származó fragmentumok kapcsolására más növekedési faktorokból való fragmentumokhoz. így pl. az aa²^ 47 aa közti génfragmentumot alkalmasan össze lehet kapcsolni az —6 2 5 oí -TGF gén fragmentumával, amely az aa és aa közti gyököknek megfelelő aminosavakat kódolják ; így alakíthatunk ki egy TGF/VGF hibrid polipeptidet. így a kiméra polipeptid szekvenciája tartalmazza az aa - aa^u közti részt (N-terminális), az TGF-ből származó aa^ és aa²^ közti szekvenciát (központi fragmentum), valamint a VGF-ből származó aa²^ és aa⁴^ közti (C—terminális) szekvenciát, a fentiek szerint módosítva. Több, mint egy növekedési faktor vagy himlővírus polipeptid fragmentumaiból származó aminosavszekvenciákkal bíró kiméra fehérjék kifejezésére képes plazmi• · • ·· ··· ·· · • · · · ··♦· · ··· · · · · · ·

- 22 dók, amelyek olyan szekvenciaváltozásokon esnek át, amelyek egy alkalmas restrikciós hely bevezetéséhez szükségesek, előállítását részletesen leírjuk a kísérleti részben.

Fúziós fehérjéket is készíthetünk, ahol egy növekedési faktor vagy egy kiméra polipeptid egy szignál szekvencia N-terminális aminosavaival vagy egy magas fokon kifejeződő baktérium-, bakteriofág-vagy eukarióta gén N-terminális aminosavaival együtt fejeződik ki. Ezen kívül egy enzimes vagy kémiai hasítási hely is bevezethető a vezető szekvenciát követően, hogy lehetővé tegyük az érett polipeptid lehasítását a vezető szekvenciáról. Ezeknek a fúziós polipeptideknek a kifejezésére képes plazmidok előállítását és a kívánt polipeptid hasítására és izolálására szolgáló eljárásokat részletesen leírjuk a kísérleti részben.

Növekedési faktorok előállítása

A szóban forgó kompozíciókat sokféle módon előállíthatjuk a kompozíció méretétől függően. Elsősorban 80 aminosav, leginkább 60 aminosav alatt a kompozíciót előállíthatjuk szintetikus úton hagyományos eljárásokkal összhangban. Lásd pl. Merrifield: SolidPhase Peptide Synthesis, The Peptides Analysis, Synthesis Biology, Special Methods in Peptide Synthesis, A rész, 2. kötet; szerkesztők: Gross és Meinhofer; kiadó: Academic Press, New York (1980), 1-284 oldal; vagy lásd a 4,127,526 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírást.

Egy másik módszer szerint hibrid DNS technológiát alkalmazhatunk, ahol olyan DNS szekvenciákat alkalmazhatunk, amelyek a kívánt polipeptidet vagy prekurzorát kódolják. A szóban forgó növekedési faktort kódoló DNS szekvenciákat hagyományos technikákat alkalmazva szintetizálhatjuk, pl. egyedi szálak átfedésével, ame• · • · ·· ·· ·

- 23 • ···· ·· • · · · · • · · · • · · · lyek egymással ligálhatók, hogy kialakítsák a kívánt kódoló szekvenciát. A terminálisokat úgy tervezhetjük, hogy restrikciós helyeket nyújtsanak, vagy egyik vagy mindkét terminális lehet tompavégű egy kifejező vektor komplementer végeihez való ligáláshoz. A szekvencia kifejezéséhez egy beindító metionint szolgáltatunk. A kifejező vektorok általában rendelkezésre állnak és sokszorozhatók az irodalomban leírt eljárások szerint.

A szóban forgó gén szintetizálása helyett a növekedési faktor gén különböző technikákkal izolálható. így pl. ahol a növekedési faktor vírus növekedési faktor, olyan mRNS-t izolálhatunk a vírusból, amely a növekedési faktőrtmagában foglaló polipeptidet kódolja, az mRNS-t reverz átírásnak vetjük alá, a létrejövő egyszálú (ss) DNS-t templátként használjuk kettős szálú (ds) DNS előállítására és a ds DNS gént izoláljuk. Egy másik technika a vírus DNS egyik darabjának izolálása és egy célszerűen degenerált vizsgáló minta alkalmazása, amely minta a növekedési faktor génben leginkább megőrzött szekvenciák valamely területét tartalmazza; ilyen módon azonosítunk a vírus genomban egy faktort kódoló szekvenciákat. A vizsgáló minta jelentősen rövidebb lehet, mint a teljes szekvencia, de legalább 10, előnyösen legalább 14, még inkább előnyösen legalább 20 nukleotid hosszúságú. Hosszabb oligonukleotidők is alkalmasak, egészen a növekedési faktor gén teljes hosszáig. Mind DNS, mind RNS vizsgáló mintákat alkalmazhatunk.

A felhasználás során a vizsgáló mintákat tipikusan kimutatható módon jelezzük (pl. ^J P-vel vagy biotinilezett nukleotidokkal) és abból az organizmusból származó egyszálú DNS-sel vagy RNS-sel inkubáljuk, amelyben a gént keressük. A hibridizálást a jelzés segítségével mutatjuk ki, miután az egyszálú és kétszálú (hibri-

dizált) DNS-t (vagy DNS/RNS-t) elkülönítettük, tipikusan nitrocellulóz papír alkalmazásával. Az oligonukleotidokkal való hibridizációs technikák, amelyeket itt megfelelően felhasználhatunk, jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak.

Bár általában kimutatható jelzést tartalmazó vizsgáló mintákat alkalmazunk, amelyek lehetővé teszik a könnyű azonosítást, nem jelzett oligonukleotidők is alkalmazhatók, mind prekurzorként jelzett vizsgáló mintákhoz, mind olyan eljárásokban való felhasználáshoz, amelyek a kettős szálú DNS (vagy DNS/RNS) közvetlen kimutatását teszik lehetővé. Következésképpen az oligonukleotid kifejezés vonatkozik mind a jelzett, mind a nem jelzett formákra.

Amikor a kívánt DNS szekvenciát megkaptuk, sokféle úton lehet \

manipulálni, hogy kifejeződést érjünk el; így pl. kiméra polipeptid szekvenciákat állíthatunk elő legalább két polipeptidnek megfelelő génfragmentumok kombinálásával, ahol a nevezett polipeptidek olyan szekvenciákkal bírnak, amelyek legalább 30 %-ban homológok a természetben előforduló növekedési faktorokkal, amelyek az EGF receptorhoz kötődnek (természetes ligandumok)· Nagyon kívánatos, hogy a polipeptid három dimenziós szerkezete, elsősorban a hurokszerkezete, megmaradjon, elsősorban a szerkezetnek azok a részei, amelyek felelősek az EGF receptor kötődéséért és azoknak a természetben előforduló növekedési faktoroknak a biológiai aktivitásáért, amelyek az EGF receptorhoz kötődnek.

A fragmentumok forrásától és a kívánt polipeptid hosszától függően alkalmas restrikciós helyeket lehet tervezni a kiméra polipeptidek megalkotására alkalmazott szintetikus génekre, amint fentebb leírtuk. Amikor lehetséges, a restrikciós helyek a polipeptis aminosavszekvenciáját változatlanul hagyják. Bizonyos esetek* 9 ·· · «· • · · · • · · ·«· • ···· · * « · · ·

- ²5 ben azonban egy új restrikciós hely vagy helyek beépítése megváltozott aminosavszekvenciát alakíthat ki a nélkül, hogy a fehérje aktivitása változna.

Ahol a gént olyan gazdaszervezetben fejezzük ki, amely a növekedési faktor vad típusú átírási és transzlációs szabályozó területeit felismeri, a teljes gént bevezethetjük vad típusú 5'- és 3'-szabályozó területeivel együtt egy megfelelő kifejező vektorba. Különböző kifejező vektorok léteznek, amelyek emlős vírusokból £pl. Simian vírus 40(EV 40), adenovírus, szarvasmarha papilloma vírus, vaccinia vírus, rovar baculovírus, stb. eredő replikációs rendszereket alkalmaznak. Ezek a replikációs rendszerek arra vannak kifejlesztve, hogy markereket szolgáltassanak, amelyek lehetővé teszik a transzfektáns kiválasztását, valamint megfelelő restrikciós helyeket szolgáltassanak, amelykbe a géneket be lehet iktatni.

Ahol a gén olyan gazdaszervezetben fejezendő ki, amely nem ismeri fel a természetben előforduló vad-típusú transzlációs ás átírási szabályozó területeket, további manipuláció szükséges. Alkalmasan sokféle 3'-4 átírási szabályozó terület ismeretes és iktatható be a stop kodontól lefelé. A nem kódoló 5' terület a szóban forgó géntől lefelé enclonukleázos hasítással, Bal31-es lemetszéssel, vagy hasonlóval távolítható el. Egy másik módszer szerint ahol alkalmas restrikciós hely van jelen a szóban forgó gén 5'-terminálisának közelében, a szóban forgó gén elhasítható és egy adapter alkalmazható a szóban forgó génnek a promotor területhez való kötéséhez, ahol az adapter szolgáltatja a szóban forgó gén elveszett nukleotidjait. Különböző stratégiákat alkalmazhatunk egy kifejező kazetta előállításához, amely az átírás 5'—^3' irányában átírás szabályozási területtel és transzlációs iniciációs területtel bír,

• · ·· • ν · · ♦·!» •·· · ·« » ·« és amely magában foglalhatja még a szabályozás indukcióját lehetővé tevő szabályozó szekvenciákat; a szóban forgó gént az iniciációs kodon átírási és transzlációs szabályozása alatt; és az átírási és transzlációs terminációs területet.

A megfelelő szabályozó szekvenciák kiválasztásánál az alábbi tényezőket kell figyelembe vennünk, amelyek érintik a kifejeződést. Az átírási szabályozás tekintetében a hírvivő RNS mennyisége és stabilitása fontos tényezők, amelyek befolyásolják a géntermékek kifejeződését. Az mRNS mennyiségét az adott gén kópiaszáma, promotorjának relatív hatékonysága és azok a tényezők határozzák meg, amelyek a promotort szabályozzák, pl. a fokozók vagy represszorok.

A beindításról (iniciációról) úg .... . , .., ,, y véljük, hogy abban a területben történik, amely éppen a kódoló szekvencia kezdeténél van.

A promotor prokarióta sejtekben olyan nukleotid szekvenciákat tartalmaz, amelyek hathatnak az átírás hatékonyságára. A szekvenciák magukban foglalják a szabályozó területeket a -35 és -10 nukleotidoknál a DNS láncának rajtjától számítva. A hatékony promotorok között találjuk azokat, amelyekben a -35 és -10 szabályozó területek nukleotid szekvenciája lényegében azonos az ezeknek a területeknek bakteriális promotorokban lévő, nagyon hatékony génekből származó megfelelő szekvenciával. Ezek a területek általában 5 illetve 6 nukleotid hosszúságúak, és mindegyik szekvencia egy nukleotiddal változhat hosszban és/vagy szekvenciában. A -35 megfelelő terület szekvenciához előnyös szekvencia a trp promotorból származó szekvencia, nevezetesen a TGACA, és a -10 megfelelő szekvenciához a lac promotorból származó szekvencia, nevezetesen a TATAAT.

Nem csupán a nukleotid szekvencia, hanem a -35 és -10 megfe• 4 * ··«· ·· • · · · ♦·«· · »·· · «« Λ ·,

- 27 lelő szekvenciák egymáshoz viszonyított térköze is fontos, hogy a szóban forgó gén optimális átírását kapjuk meg. A -35 és -10 szabályozó területek megfelelő (konszenzus) szekvenciáit általában 16-18 nukleotid, előnyösen 17 nukleotid szekvencia választja el. Mindegyik szekvencia változhat egy nukleotiddal.

Átírás-szabályozó területekre vagy promotorokra példák lehetnek baktériumoknál a p-gal promotor, a lambda jobb és bal promotorok, trp és lac promotorok, trp-lac fúziós promotor, stb.; szintetikus promotorok, amelyek lényegében hasonló szekvenciával bírnak, mint a fentebb említett szekvenciák, szintén alkalmazhatók. Baktériumokhoz előnyös promotor egy olyan fúziós promotor, amelyben a -35 szabályozó terület a trp promotorból származik és a -10 szabályozó terület a lac promotorból származik. Legelőnyösebben a promotor olyan promotor, amelyben a -35 trp konszenzus szekvencia 17 nukleotiddal fölfelé helyezkedik el a -10 lac konszenzus szekvenciától. Élesztőknél a glikolitikus enzim promotorok, pl. az ADH-I és II promotorok, PGI promotor, trp promotor, stb., emlős sejteknél az 8V40 korai és késői promotor, adenovírus késői promotorok, 18 promotor vagy fokozó szekvenciák hozhatók fel példaként.

Az átírás szabályozó terület továbbá magában foglalhat olyan szabályozó szekvenciákat, amelyek lehetővé teszik a szóban forgó gén kifejeződési idejének módosítását pl. tápanyagok vagy kifejezési termékek jelenléte vagy távolléte₍vagy hőmérséklet, stb. szabályozása révén. így pl. a szóban forgó gén kifejeződése szabályozható a gazdasejt növesztő tápközeg hőmérsékletével, olyan szabályozó szekvenciát alkalmazva, amely tartalmazza a lambda bakteriofág P^ promotort, a lambda bakteriofág 0^ operátort és a CI857 gént, amely a hőmérséklet-érzékeny represszort kódolja a kifejező vek- • ···· ·«4 ·· · 4 * · ·» • · · · ♦ β «·* • * · · ♦»·· · ··· · 99· 9Λ

- 28 torban. Ez lehetővé teszi a promotor szabályozását a represszor és az operátor közti kölcsönhatás révén alacsony hőmérsékleteknél, pl. mintegy 30°C-nál. A hőmérsékletet 42°C-ra emelve a represszor inaktiválódik és a szóban forgó gén kifejeződése lehetővé válik.

Növesztő tápközeg alkotórészeket alkalmazó módosításra példaként a lac vagy trp-lac hibrid promotor szabályozást a Laci represszorhoz tartozó gén alkalmazásával végezhetjük, amely gén a lac promotor területhez a -10 szabályozó területtől lefelé kötődik. A Laci represszor gén egy episzómában lehet jelen, előnyösen a Laci növelt mutánson, vagy benne lehet a kifejező kazettában magában. A represszor molekula jelentős koncentrációjának jelenléte a növesztő tápközegben gátolja a promotor funkciót induktorok távollétében, így IPGT vagy laktóz hozzáadása a gazdasejt növesztő tápközeghez fokozza a promotor funkciót. Amikor a baktériumtörzs Lac⁺, laktózt alkalmazhatunk induktorként IPGT helyett. Mind eukarióta, mind prokarióta rendszerekben a terminációs területek tartalmazhatnak olyan szekvenciákat vagy szerkezeteket, amelyek fokozzák az mRNS fajta stabilitását és lehetővé teszik a nagyobb fokú kifejeződést. így az átírási szabályozó terület magában foglalhat még olyan szabályozó szekvenciákat, amelyek befejezik az átírást, és amelyek olyan szekvenciákat vagy szerkezeteket biztosítanak, amelyek gátolják az mRNS lebomlását és így fokozzák az mRNS fajta stabilitását és lehetővé teszik a nagyobb fokú kifejeződést. Prokarióta szekvenciákra számos példa ismeretes, pl. a Trp terminátor, a 32(T4) terminátor gén, vagy szintetikus terminálorok, amelyek a 32 gén szekvenciájához hasonlóak.

Eukarióta rendszerekben átírás terminációs, RNÍS hasítási és poliadenilező területek megfelelő érettséget biztosítanak az mRNS • « • · • · · · * · · · · · • · · »··«· , 9999 ·· «

- 29 átíráshoz és szükségesek a hatékony kifejeződéshez. A natív 3' nem transzlatált terület elegendő lehet, de a poliadenilező jelet pl. az 8V40-ből, amely elsősorban egy illesztő helyet foglal magában, ahol ez hatékonyabb kifejeződést biztosít, szintén alkalmazhatjuk. Egy másik módszer szerint egy adott sejttípusban nagy mértékben kifejeződő (pl. lg mielóma sejtekben) génből származó 3'nem transzlatált területet fuzionálhatunk a szóban forgó génnel. Az ilyen 3' szekvenciákat össze lehet párosítani ugyanazon magasan kifejeződő génből származó 5' szabályozó szekvenciákkal és ezek még magukban foglalhatnak kódoló területeket is a leolvasó kereten belül, hogy fúziós fehérjék alakuljanak ki, amint ezt a későbbiekben leírjuk.

A transzláció szabályozását illetően, amely mRNS jelenlétében adott, a kifejeződést a beindítás (iniciáció) (riboszóma kötés az mRNS-hez) sebességének befolyásolásával, a meghosszabbítás sebességével (a riboszóma transzlációja az mRNS-en keresztül), a transzláció utáni módosítások sebességével és a géntermék stabilitásával lehet szabályozni. A meghosszabbítás sebességére valószínűleg hat a kodon kezelése; kodonok alkalmazása ritka tRNö-ekhez csökkenti a transzlációs sebességet. Ennek következtében előnyös olyan kodonokat alkalmazni, amelyek gyakran feltűnnek olyan génekben, amelyek normálisan kifejeződnek a gazdasejt révén, hogy növeljük a transzlációs sebességet.

Prokariótákban a -35 és -10 szabályozó területektől lefelé van egy megfelelő (konszenzus) nukleotid szekvencia, általában AGGA, amelyet Shine-Dalgarno szekvenciának neveznek; erről úgy vélik, hogy érdekelt a riboszomális kötésben. A transzláció optimális riboszomális kötését és beindulását olyan riboszóma kötőhely alkal····

- 30 mazásával érhetjük el, amely működőképes a gazdasejtben, és egy nagy mértékben kifejező génből ered. Bizonyítékok mutatnak a ShineDalgarno szekvenciát körülvevő nukleotid szekvenciák és a kódoló területen belül levő szekvenciák jelenlétére, amelyek hatással vannak a riboszóma kötésre, valószínűleg olyan szerkezeti motívumok képződése révén, amelyeken keresztül a riboszóma felismeri az iniciációs helyet. A kódoló terület nukleotid szekvenciáinak változtatása tehát használható, hogy optimális kötést és a transzláció optimális beindulását érjük el. Az ATG iniciációs kodon utáni első

7-30 kodon szekvenciája szintén hatással lehet a kötésre és kifejeződésre. A vezető szekvenciát és a Shine-Dalgarno szekvenciát előnyösen ugyanabból a génből kapjuk, vagy ahol ezeket különböző génekből kapjuk, a vezető szekvencia kodonjait módosíthatjuk a kodon degenerációt alkalmazva, hogy közelebb jussunk annak a természetes génnek a nukleotid szekvenciájához, amely a vezető szekvenciát kö- /

veti, amint ezt az ezzel a bejelentéssel összefüggő, 264,098 sorozatszámon 1988 október 28-án bejelentett amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás ismerteti; ez a leírás referenciaként beépül a jelen bejelentésbe.

Az AGGA szekvencia helyzete a beindító ATG kodonhoz viszonyítva befolyásolhatja a kifejeződést. A Shine-Dalgarno szekvencia általában 5-9 nukleotidra helyezkedik el a beindító kodontól, bár nem várt módon, magas szintű kifejeződés érhető el olyan kifejező kazetták alkalmazásával, ahol a Shine-Dalgarno szekvencia 10-13 nukleotidra, előnyösen 11-12 nukleotidra helyezkedik el a beindító kodontól.

Az mRNS stabilitását az mRNS fogékonysága szabályozza a ribonukleáz enzimre. Az exonukleáz emésztést általában gátolja bizo31 • · · · · ♦ • · · · ···· · »·· · ·♦ · ·· nyos szerkezeti motívumok jelenléte az mRNS végeinél, pl. palindrom szerkezetek, megváltozott nukleotidok vagy fajlagos nukleotidok jelenléte. Az endonukleázos emésztés, úgy véljük, speciális felismerő helyeknél megy végbe az mRNS-en belül, és a stabil mRNS-ek nélkülözik ezeket a helyeket. Arra is van néhány bizonyíték, hogy a transzláció magas szintjének alávetett mRNS-ek szintén védettek a lebomlástól az mRNS-en levő riboszómák jelenlétében.

A kifejezési termék stabilitását elérhetjük egy fúziós fehérje szintézisének kivitelezésével, amelyben a kívánt polipeptid egy második polipeptiddel vagy fragmentumával együtt fejeződik ki. A kifejezési termék stabilitását előnyösen egy olyan fúziós fehérje szintézisének kivitelezésével érhetjük el, amelyben a szóban forgó polipeptid egy vezető szekvenciával együtt fejeződik ki. Egy N-terminális aminosavszekvenciát kódoló DNS szekvencia pl. egy magas szinten kifejeződő baktérium- vagy bakteriofág génből, pl. lambda N-bakteriofág fehérje génből, a β-galaktozidáz cro génjéből, vagy valamely eukarióta génből lehet összekapcsolva a szóban forgó géntől felfelé és azzal azonos leolvasó keretben. A vezető szekvencia általában 8-50, előnyösen 15-45, még előnyösebben 18-25 N-terminális aminosavat foglal magában.

A szóban forgó polipeptid kifejezése egy másik génből származó vezető szekvenciával képzett fúziós fehérjeként számos előnynyel bír a stabilitás kialakításán kívül. így pl. az N-terminális aminosavak jelenléte eszközt nyújt az olyan általános tisztítási technikákhoz, amelyek a sokféle polipeptid bármelyikének tisztításához alkalmas. így pl. az N-fehérje N-terminális aminosavai erősen antigén jellegűek, és így az N-fehérje N-terminális aminosavai ellen kialakuló fajlagos antitestek eszközként alkalmazhatók az N32 • · · · · < *·· • · ······ · ·· » · ·· · ·· fehérje N-terminálisát tartalmazó fúziós fehérjék tisztításához.

Ezen kívül az N-fehérje N-terminálisának pozitív töltése van, amely megkönnyíti a kívánt fehérje tisztítását ioncserélő kromatográfiával vagy hasonlókkal.

A vezető szekvencia lehet valamely hidrofób aminosavszekvencia, amely továbbá működhet szignál szekvenciaként a kiválasztáshoz. A szignál szekvenciát kódoló DNS szekvencia a szóban forgó géntől felfelé és azzal azonos leolvasó keretben van összekapcsolva. Tipikusan a szignál szekvencia egy hasítási helyet foglal magában, amelyet egy szignál szekvencia peptidáz ismer fel. így a szóban forgó polipeptid elhelyezése közvetlenül a szignál szekvencia hasítási hely után lehetővé teszi,' hogy a szóban forgó polipeptid fajlagosan lehasítható legyen a szignál szekvenciáról és érett polipeptidként választódjék ki. Hidrofób aminosavszekvenciákra példák lehetnek: a bakteriális alkálikus foszfatáz szignál szekvencia; az OMP-A-B-C-D-E vagy F szignál szekvenciák; az LPP szignál szekvencia; a ö -laktamáz szignál szekvencia, és a toxin szigi nál szekvenciák és ezek mutánsai. Eukarióta sejteknél a szignál szekvenciák között találjuk a majom TGF-^-ból, a p97 génből (humán melanóma antigén), K.lactis ölő toxin szekvenciából és Ά-párosodási típusú faktorból származó szignál szekvenciákat és más ölő toxinszignál szekvenciákat, vagy azokat a normális szignál szekvenciákat, amelyek a szóban forgó génnel társulnak, és mindezeknek a szignál szekvenciáknak a mutánsait.

A további vezető szekvenciák között, amelyeket alkalmazhatunk, találunk hidrofil szekvenciákat, pl. az amfiregulinból származó N-terminális 41 aminosavas gyököt, amely a szóban forgó polipeptid működésének a módosításához vezethet. Ezen kívül valamely citotoxi33 kus szer, pl. valamely toxin A-lánc fragmentum, ricin A-lánc, kígyőméreg növekedést megkötő peptid, vagy valamely célzó molekula, pl. hormon vagy antitest lehet kovalensen összekapcsolva a vezető szekvenciával, legtöbb esetben minimális hatással a szóban forgó géntermék biológiai aktivitására. Amint a többi vezető szekvenciáról leírtuk, a vezető szekvenciát kódoló DNS szekvencia fölfelé van összekapcsolva a szóban forgó génnel, és azonos leolvasó keretben.

Ahol a vezető szekvencia nem szignál szekvencia vagy nem tartalmaz alkalmas természetes hasítási helyet, további olyan aminosavakat lehet beiktatni, amelyek enzimes vagy kémiai hasítóhelyet biztosítanak a vezető peptid lehasításához a fúziós fehérje tisztítása után, hogy lehetővé váljék az érett polipeptid ezt követő tisztítása. így pl. sav-labilis aszpartil-prolin kötések bevezetése a fúziós fehérje két szegmense közé megkönnyíti ezek elkülönítését alacsony pH-nál. Ez a módszer nem megfelelő, ha maga a kívánt polipeptid is sav-labilis. Másik példaként említhetjük, hogy a fúziós fehérjét el lehet hasítani cianogén bromiddal, amely a metionin gyökök karboxi oldalára fajlagos. Metionint helyezve el a vezető szekvencia és a kívánt polipeptid közé lehetővé válik a kívánt polipeptid felszabadítása. Ez a módszer nem alkalmas akkor, amikor a kívánt polipeptid metionin gyököket tartalmaz.

Ahol a vezető szekvencia egy szignál szekvenciát tartalmaz, a kiválasztó vezető szekvenciával bíró, szóban forgó gének kifejezhetek a vezető szekvenciával vagy a nélkül olyan körülmények között, ahol a szekvencia megőrizhető vagy lehasítható. Ezen kívül hogy a kívánt polipeptid nagyobb arányát kapjuk meg a tápközegbe kiválasztott érett, hasított és újra megfelelően felcsavart • c · · · · • · « · · ··· • · · ·*·· · • ·· · ·· formában, előnyös olyan promotor, pl. tac promotor alkalmazása, amely alacsonyabb hőmérsékleten, pl. 30°C hőmérsékleten működik. Nem várt módon a kiválasztás magasabb szintjeit kaphatjuk meg kisebb hőmérsékleteken. A rendkívül magas kifejeződési szintek megakadályozhatják, hogy a fehérje teljes transzlációs módosulása bekövetkezzék, amely aggregálódást és a hasítatlan prekurzor (vagyis szerkezeti fehérje és kiválasztó vezető) felhalmozódását eredményezi. Hasonlóképpen a növesztés magasabb hőmérsékleteken, pl. 42°C hőmérsékleten, szintén hajlamosít arra, hogy az eredmény a nem hasított prekurzor aggregálódása és felhalmozódása legyen. Fúziós fehérjék előállítását, beleértve a szóban forgó polipeptid hasításának és újra felcsavarásának módszereit, leírja az ezzel a bejelentéssel összefüggő 264,098 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi bejelentés, amelyet korábban idéztünk.

A DNS minden egyes manipulációja után a kazetta kifejlesztésében a plazmidot klónozzuk és izoláljuk, és amennyiben szükséges, az adott kazetta komponenst elemezzük szekvenciájára, hogy biztosak legyünk: a megfelelő szekvenciát kaptuk. A manipuláció természetétől függően a kívánt szekvenciát kimetsszük a plazmidból és bevezetjük egy másfajta plazmidba, vagy a plazmidot korlátozhatjuk és a kifejező kazetta·komponenst manipuláljuk, ahogy alkalmas. Bizonyos esetekben egy ingázó vektort alkalmazhatunk, ahol a vektor képes replikációra különböző gazdaszervezetekben, amelyek különböző replikációs rendszereket igényelnek. Ez igényelhet vagy nem igényelhet további markereket, amelyek mindkét gazdaszervezetben működőképesek. Ahol ilyen markerek szükségesek, ezek benne foglaltathatnak a vektorban. A kazettát, a két replikációs rendszert és a markert vagy markereket tartalmazó plazmidot átvihetjük az egyik ·« ν · • · ·· gazdaszervezetből a másikba, amennyiben szükséges. A szelekcióhoz bármilyen alkalmas markert használhatunk. Kívánatosán neomicinre vagy tetraciklinre való rezisztencia jön szóba. Bár a szelekciós marker nagyon kívánatos kényelmi szempontokból, a transzformált sejtek átvizsgálására más módszereket is írtak le jlásd pl. Reipin

G. és munkatársai: Current Genetics, 189-193 ( máit sejteket átvizsgálhatjuk azzal a fajlagos termékkel, amelyet képez, pl. a kívánt termék szintézisét határozhatjuk meg immunológiai vagy enzimes módszerekkel.

A kifejező kazettát magában foglalhatja az episzomális fenntartáshoz szolgáló replikáciős rendszer megfelelő celluláris gazdaszervezetben, vagy szolgáltatható replikáciős rendszer nélkül is, ahol az integrálódhat a gazdaszervezet genomjába. A DNS-t ismert technikákkal vezethetjük be a gazdaszervezetbe, pl. transzformálással, kalcium-foszfáttal kicsapott DNS-t alkalmazva, átfertőzéssel a sejteket a vírussal érintkezésbe hozva, a DNS mikroinjektálásával a sejtekbe, stb. Amikor a szóban forgó gént bevezettük a megfelelő gazdasejtbe, a gazdasejtet növeszthetjük, hogy kifejezzük a szóban forgó gént.

Gazdasejtek széles választékát alkalmazhatjuk. Prokarióta gazdasejtekre példák lehetnek a gram negatív organizmusok, pl. E. coli, ezen belül a JM109, JM101, JM107, HB101, DH1 vagy DH5 törzsek. Különösen előnyösek az olyan gram negatív organizmusok, mint a B. subtilis, amelyeknek nincs periplazmatikus tere és közvetlenül képesek kiválasztani a polipeptideket a növesztő tápközegbe. Az eukarióta gazdasejtek között találjuk az élesztő sejteket, rovarsejteket és emlős sejteket, pl. a COS sejteket, CHO sejteket, majomvese sejteket és selyemhernyó sejteket (sf9).

J···* ·♦ « ·· • · · * · « « * · · » t ··· ♦ · ····»· · ··· * ·· « ··

- 36 A szóban forgó gént és a kifejezés szabályozását biztosító szegélyező területeket tartalmazó konstrukció bármilyen alkalmas módon bevezethető a kifejező gazdaszervezetbe, pl. transzformálással pl. kalcium-foszfáttal kicsapott DNS-sel, átfertőzéssel, transzdukcióval, konjugációval, mikroinjektálással, stb. A gazdaszervezetet azután nagy sűrűségig növeszthetjük megfelelő tápközegben. Ahol a promotor indukálható, ezután megengedő (permisszív) körülményeket alkalmazhatunk, pl. hőmérsékletcserét, a metabolikus termék vagy tápanyag fölöslegének eltávolítását, stb.

így pl. ahol a szabályozó szekvencia tartalmazza a i/Ip^ bakteriofág promotort, av4o^ bakteriofág operátort és a CI857 hőérzékeny represszort, a gazdasejt növekedhet a megengedő hőmérsékleten, általában kb. 30°C-on, amely hőmérsékletnél a promotortól eredő átírás vissza van szorítva, és a gazdasejtek növekedhetnek a nélkül, hogy az idegen géntermék szintézisének igényei gátolnák ezt; ez a géntermék ráadásul még toxikus is lehet a gazdaorganizmusra. Amikor a gazdasejtek optimális sűrűséget érnek el, a hőmérsékletet növelhetjük nem-megengedő hőmérsékletre, pl. mintegy 42°C hőmérsékletre, amikor a Cl represszor inaktívvá válik, lehetővé téve az átírást a promotorból. Maximális kiválasztást kaphatunk a lac promotort vagy egy trp-lac promotort alkalmazva, egy metabolikus induktorral, pl. egy lac+ g_azdatörzshöz laktózzal végzett indukálást alkalmazva, és a vektoron lacl^-t szolgáltatva. Az olyan gazdasejtekre, amelyek egy ilyen rendszerrel alkalmazhatók, példák lehetnek a DH1, DH5 vagy HB101 törzsek.

Ahol a termék visszamarad a gazdasejtben, a sejteket kinyerjük, lizáljuk, és a terméket izoláljuk és tisztítjuk extrakcióval, kicsapással, kromatográfiával, elektroforézissel, stb. Ahol a tér·· · · · » « φ • · · · · · ··· • ♦ * ♦ ···· · ♦·· · ·· · ··

- 37 mék kiválasztódik, a tenyészközeget összegyűjtjük és a terméket hagyományos módon izoláljuk, pl. affinitáskromatográfiával. Hogy aktív fehérjét termeljünk, szükséges lehet a fehérjét visszatekeredni hagyni. Ha a fehérje a vezető szekvenciával alkotott fúziós fehérjeként fejeződik ki, a vezető szekvenciát el lehet távolítani pl. hangyasavval vagy cianogérv-bromiddal végzett kezeléssel. A vezető szekvenciát előnyösen a fehérje visszatekeredése után távolítjuk el.

A rekombináns termék lehet glikozilezett vagy nem glikozilezett, ezen belül rendelkezhet vad-típusú vagy más glikozilezéssel. Általában a glikozilezés nem különbözik 50 %-nál nagyobb mértékben, de inkább 20 %-nál nagyobb mértékben a vad típusú glikozilezéstől. A glikozilezés mértéke függ részben a szóban forgó peptid szekvenciájától, valamint attól az organizmustól, amelyben ez termelődik. így a kifejeződés E. coli sejtekben nem glikozilezett terméket eredményez, és a termék kifejeződése rovarsejtekben általában kevesebb glikozilezést eredményez, mint a termék kifejeződése emlős sejtekben.

Növekedési faktorok alkalmazása

A szóban forgó kompozíciók széleskörű felhasználást nyernek in vitro és in vivő egyaránt növekedési faktorok, pl. epidermális növekedési faktor (EGF) és transzformáló növekedési faktor, elsősorban -TGF agonistájaként vagy antagonistájaként. A növekedési faktorokról, önmagukban vagy más kompozíciókkal, elsősorban polipeptid kompozíciókkal kombinálva sejtek növekedésének szabályozásához és más tevékenységekhez, összefoglaló található pl. az alábbi irodalmi helyeken: Handbook of Experimental Pharmacology, Tissue Growth Factors (szerkesztő: Baseraga, kiadó: Springer Verlag, Berlin, 1981), 57· kötet, 3· fejezet, elsősorban a 98-109 oldalak; és Carpenter: Ann. Rév. Biochem. 48, 193-216(1979) .

A humán EGF úgy tűnik, azonos a humán urogasztronnal és sokféle hatást gyakorol a születés előtti és közvetlen születés utáni szöveti növekedésre. A • *··· ·· · ·· ·· · · · · · · • 9 · « « « ·«· • · · · ···· · ··· « ·· · ··

- 38 A hatások között vannak a korai szem-nyitás, sebgyógyulás, metszőfog kiemelkedés és a tüdő gyorsított érése. EGF receptorokat találunk felnőtt szövetek sokaságában. Az EGF-ről úgy találták, hogy stimulálja saját receptorának foszforilezését. Az EGF-ről azt is felfedezték, hogy kapcsolatban van a megnövekedett csontfelszívódással .

A transzformáló növekedési faktornak, elsősorban az (A-TGF-nek számos analóg aktivitása van, mint az EGF-nek. A TGF kötődik az EGF receptorhoz, amely a receptor foszforilezéséhez, tirozin-specifikus kináz aktivitásának fokozásához és a sejtnövekedés fokozásához vezet £Cohen: A Biological Response and Modulators című szakkönyvben (szerkesztő: August J.T.) kiadó: Academic, New York (1983),

7-12 oldal; Tam és munkatársai: Natúré 309, 376-378 (1984); Ibbotson és munkatársai: ücience, 221, 1292-1294 (1983)].

A Myxoma és Shope fibróma vírusok szignifikáns növekedést indukálnak a sejtek burjánzási potenciáljában az érintett területen belül.Míg a Vaccinia kisebb burjánzási tevékenységet indukál a fertőzés helyén, a Shope fibróma vírus nagyobb burjánzási eseményt indukál; ez tumor-képződéshez vezet, amely felnőtt nyulakban jóindulatú, de iiranun-szuppresszált felnőtt nyulakban vagy újszülött nyulakban burjánzó és terjedő jellegű. A Myxoma vírus gyorsan terjedő mixoszarkóma tumort indukál. Bár ezek a burjánzási események tulajdoníthatók más vírusfaktoroknak is, a vírus növekedési faktor, úgy tűnik, nagy mértékben érdekelt a vírusfertőzés által okozott indukált sejtburjánzásban.

A szóban forgó vegyületek elsősorban gyógyszerként nyernek alkalmazást EGF agonistaként és sebgyógyítóként, pl. a sebek, úgymint égések, szemsérülések, sebészi bemetszések és hasonlók hámosodásához. Az aktív alkotórészt alkalmas hordozóanyagban alkalmazhatjuk, pl. Silvadene-ben, olyan mennyiségben, amely elősegíti a hámképződést és/vagy sebgyógyulást, általában olyan mennyiségben, amely 0,01-10 ^g/ml, inkább 0,075-5,0^ g/ml, előnyösen 0,5-5^ g/ml • · ··· • · · · ···· · ··· · ·· · ··

- 39 EGF ekvivalens tartományban van. A kiszerelési formát úgy alkalmazzuk, hogy rászórjuk a sebre, hogy a seb a gyógyszerrel teljesen be legyen fedve. A kezelést alkalmazhatjuk gyakrabban, akár, naponta négyszer is, vagy csak ritkán, pl. minden második napon vagy még ritkábban a seb természetétől, a kezelésre adott válaszától, az aktív alkotórész koncentrációjától, stb. függően.

A szóban forgó kompozíciót alkalmazhatjuk reagensként diagnosztikus vizsgálatokban vagy reagensek, pl. poliklonális vagy monoklonális antitestek előállításához. Reagensként ezeket lehet alkalmazni analóg növekedési faktorok kimutatásához vagy a növekedési faktorok elleni antitestek kimutatásához fiziológiás folyadékokban, pl. vérben.

A szóban forgó munkamenettől és a reagens céljától függően a polipeptidet jelezhetjük, de lehet jelzetlen is. Jelzések széles választékát alkalmazhatjuk, amelyek közvetve vagy közvetlenül kimutatható jelzést nyújtanak. Ezek között a jelzések között találjuk a radionuklidokat, enzimeket, fluoreszcens anyagokat, részecskéket, kemolumineszcens anyagokat, enzim-szubsztrátumokat vagy kofaktorokat, enzim-gátlókat, mágneses részecskéket, stb. Lásd pl. az alábbi lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásokat: 3,654,090; 3,817,837; 3,935,074; 3,996,345; 4,277,437; 4,374,925; és 4,366,241.

A jelzéseknek a polipeptidekhez való kapcsolására módszerek széles választéka létezik; ezek között találjuk pl. az N-terminális aminocsoport alkalmazását funkciós csoport kialakítására pirazolont képezve, míg a további szabad aminocsoportok védve vannak, ahol a pirazolont azután érintkezésbe lehet hozni különböző reagensekkel, pl. aminocsoportokkal, hogy a kimutatható jelet kialakító csoportot • ···· ·· · ·· ·· ······ • · · · « · ··· • · · · ···· · ♦ ·· · ·· · ··

- 40 hozzákapcsoljuk. A harmadik hurokkal társult vagy ehhez közeli arginin aminosavat megvédve a további arginineket funkciós csoporttá alakíthatjuk aminocsoportokhoz vagy tiocsoportokhoz konjugálva ismert eljárásokkal összhangban. Egy másik módszer szerint a polipeptidet egy aktív szerrel hozhatjuk érintkezésbe, pl. aktivált karbonsavval, és véletlenszerűen helyettesítjük, ahol a biológiailag aktív anyagot el lehet különíteni a biológiailag inaktív anyagtól a véletlenszerű helyettesítés eredményeképpen. Végül a szintézis módszerétől függően a polipeptidet módosíthatjuk a szintetikus eljárás részeként, hogy a kívánt működőképességet érjük el.

A szóban forgó kompozíciókat alkalmazhatjuk az EGF receptorok követésére is. A szóban forgó kompozíciókat alkalmazhatjuk az EGFre és/vagy TGF-re való celluláris válasz követésére, versengést alakítva ki e között a két természetben előforduló anyag és a jelen találmány szerinti valamely kompozíció között. Ezen az úton a receptor konformációban történő változásokat követhetjük.

A szóban forgó kompozíciókat alkalmazhatjuk különböző terápiás célokra is, ide értve a növekedés stimulálását és a csontképződés szabályozását. Ezeket az anyagokat beadhatjuk megfelelő fiziológiás hordozókban intraperitoneálisan, szubkután, intravénásán, intraartériásan, vagy az adott helyen alkalmazva. Ezen kívül a szóban forgó kompozíciókat bevezethetjük liposzómákba is, amelyek antitestek alkalmazását is magukkal vonhatják a megfelelő helyre irányításhoz, de ezek nélkül is alkalmazhatók. A különböző hordozók között találjuk a foszfáttal pufferőit fiziológiás sóoldatot, vizet, és hasonlókat. Az adalékanyagok koncentrációja széles határok között változhat, a végső felhasználástól és az aktivitástól függően.

·· · · · · ·· • ·· ··· ··· • · · ····· · • · · · ·« · ··

Más adalékok is szerepelhetnek a készítményekben, mint pl. EGF,

TGF, egyéb növekedési faktorok, bakteriocidek, pl. antibiotikumok, bakteriosztatikumok, pufferok, stb.

Antitestek előállításához a szóban forgó polipeptideket, ahol ή__Zj.

PP jelentése hidrogén vagy rövid oligopeptid-lánc (öt aminosavnál rövidebb), hozzá lehet kapcsolni antigén polipeptidekhez vagy fehérjékhez, emlős gazdaszervezetekbe való injektáláshoz. Az antigén fehérje legalább 6b aminosavból áll, és nem több, mint 100kilodalton (kDal). Számos technika létezik polipeptidek összekapcsolásához, vagy egy speciális helyen, vagy véletlenszerűen, bifunkcionális reagenseket, pl. p-maleimidobenzoesavat, glutáraldehidet, ρ, p'-benzidint, stb. alkalmazva. A közös antigén fehérje lehet pl', szarvasmarha szérum albumin, kulcslyuk kagyló hemocianin, tetanusz toxoid, stb. A szóban forgó polipeptidet megfelelő számban kapcsolhatjuk össze az antigén fehérjével, hogy a kívánt immunválaszt elérjük. Általában két vagy több emlékeztető injekciót adunk a kiindulási injekció után. Az antiszérumokhoz vért veszünk az immunizált gazdaszervezetből és az immunglobulin frakciót izoláljuk. A monoklonális antitestekhez a lépet izoláljuk és splenocitákat fuzionálunk megfelelő fúziós partnerral hagyományos eljárásokkal összhangban. Az így létrejövő hibridómákat azután átvizsgáljuk olyan antitestekre, amelyek a szóban forgó polipeptid epitóp helyeihez kötődnek. Ezeket az antitesteket sokféle célra lehet használni, pl. diagnosztikus reagensként, terápiában, stb.Az antitestek, amikor reagensként használjuk, lehetnek jelzettek vagy jelzetlenek, amint ezt a polipeptideknél leírtuk.

Az alábbi példákat bemutatásra szánjuk, és semmiképpen sem a korlátozás céljából.

KÍSÉRLETI RÉSZ

Tartalomjegyzék

I. példa. A szóban forgó szintetikus gének előállítása

A. TGF szintetikus oligonukleotidok

B. VGF szintetikus oligonukleotidok

C. EGF szintetikus oligonukleotidok

II. pé1daA klónozó és kifejező plazmidok leírása

A. pLEBam plazmid

B. pBM11 plazmid

C. pBM11M4 plazmid

D. pBM11M5 plazmid

E. pBM11/NDP plazmid

F. pBM11/PAD plazmid

G. pBM11/PAK plazmid

H. pTCPt plazmid

I. piac plazmid plazmid •K. pRSV plazmid

L. pAcőlO plazmid

M. pTox1 és pTox2 plazmidok

N. TakPak

III. példa. Növekedési faktor gének összeállítása prokarióta gének- ben való kifejezéshez

A. A pLEBam/TVV plazmid előállítása

B. A pLEBam/TVV VGF plazmid és fragmentumai előállítása

IV. példa. A szóban forgó polipeptidek kifejezése N-fehérjével kép- zett fúziós fehérjeként

A. Módosított szintetikus TGF • · ·· ·

- 43 B. Módosított szintetikus TGF-VGF hibrid

V. példa. A szóban forgó polipeptid előállítása N-fehérjével és egy hasítási hellyel képzett fúziós fehérjeként

A. Módosított szintetikus VGF

B. Módosított TGF-VGF hibridek

C. Szintetikus EGF

VI. példa. A szóban forgó polipeptid előállítása módosított alká- likus foszfatáz szignál szekvenciával képzett fúziós fehérjeként

A. pBM11/PAD/EGF előállítása

B. pBM11/PAD/nVGFa előállítása

VII. példa. A szóban forgó polipeptid kifejezése alkálikus foszfa- táz szignállal képzett fúziós fehérjeként

A. pBM11/PAK/nVGFa előállítása (alkálikus foszfatáz szignál szekvencia/nVGFa természetes VGF N-terminálissal és GTC és GYACRC szekvenciákkal)

B. pBM11/PAK/EGF előállítása

C. TacPak/EGF előállítása (alkálikus foszfatáz szignál szekvencia/humán EGF)

VIII. példa. A szóban forgó polipeptid kifejezése alkálikus foszfa- táz szignál szekvenciával képzett fúziós fehérjeként egy átírás terminációs területet tartalmazó kifejező kazettát alkalmazva

A. pTCPt/EGF előállítása ( [trp-35] 16bp [lac-1 oj [lacSü] 11 bp [ATG] / alkálikus foszfatáz szignál/humán EGF/trans.term.-NEO)

B. pTCPt/nVGFa előállítása ( ftrp-35] 1 6bp [lac-1 Oj [lacöD] [croSüJ

11bp [ATg3/alkálikus foszfatáz szignál/n-terminális VGFa

GTC és GYACRC szekvenciával/trans.term.-NEO)

C. pTNPt/EGF előállítása ( £trp-35j 1 7bp £lac-1 oJ £nSD_~] 8bp £aTg] / alkálikus foszfatáz szignál/humán EGF/trans.term.-NEO)

IX. példa. Növekedési faktor gének összeállítása eukarióta sejtek- ben való kifejeződéshez

A. PRSV/VGF plazmád előállítása

B. pAc/VGF plazmád előállítása

C. pAc/SFGF előállítása

X. példa. Polipeptidek előállítása

A. BGF és TGF szilárd fázisú szintézise

B. Prokarióta sejtekben termelt rekombináns polipeptidek izolálása

C. A természetes gének eukarióta kifejezésével termelt VGF és SFGF izolálása

D. Természetes EGF

XI. példa. Aktivitás vizsgálatok

A. Mitogén vizsgálatok

B. Lágy agar telepnövekedés-stimulálási vizsgálatok

C. EGF receptor kötés gátló vizsgálatok

D. Radioimmunassay

E. Sebgyógyulás

XII. példa. Prokarióta sejtekben készített rekombináns növekedési faktorok

A. EGF receptor kötés

B. Mitogén aktivitás

C. Sebgyógyulás

XIII. példa. Eukarióta sejtekben készített VGF biológiai aktivitása

A. Majomvese-sejtekben (BSC-1) készített VGF

B. CHO sejtekben készített VGF

C. Selyemhernyóban készített VGF

D. VGF és TGF immunológiai aktivitása

Biológiai deponálások

Az alábbi kifejező plazmidokat, mind E. coli HB101-be transzformálva, deponáltuk a jelzett időpontokban az American Type Culture Collection-nál (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852); ezek az alábbi azonosítási jellel és ATCC jelzéssel lettek ellátva:

Azonosítási jel	ATCC jelzés	A deponálás dátuma
PMB11	67366
PMB14	67367
PMB11/PA/VGF	67417	1987. június 3
PMB11/DP/VGFa	67418	1987. június 3
PMB11/PA/EGF	67419	1987. június 3
PMB11/M5	67436
PMB11/C2	67437
PMB11/NDP/EGP	67547	1987. október 23

Módszerek. Az általános klónozó technikákat alkalmazzuk, amint ezt Maniatis és munkatársai leírták ^Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, New York (1982)J. Az összes DNS-módosító enzimet kereskedelmi forgalomból szerezzük be. Ezeket a szállító cég útmutatásai szerint alkalmazzuk. Az anyagokat és a DNS tisztításához és elkülönítéséhez szükséges berendezéseket a szállító cégtől kapott útmutatások szerint alkalmazzuk.

I. példa

A szóban forgó szintetikus gének előállítása

Szintetikus növekedési faktor géneket tervezünk, amelyek a kifejezés magas szintjéhez optimalizált gazdasejt kodonokat alkalmaznak. Ezen kívül számos alkalmas restrikciós helyet tervezünk a ·· ·· • · · · · · ··· • · · · ···· · ··· · ·♦ · ··

- 46 szintetikus génekbe. Amikor lehetséges, az új restrikciós helyek a növekedési faktor gén aminosavszekvenciáját változatlanul hagyják, bizonyos esetekben azonban az új restrikciós hely beépülése megváltozott aminosavszekvenciát eredményez. Ezek a helyek a szintetikus géneket durván harmadokra osztják, N-terminális, középső és C-terminális tartományokat alakítva ki.

A természetes VGF géntermék egy többlet N-terminális tartományt tartalmaz, amelynek nincs megfelelője az érett TGF-ben. Azokat a VGF fragmentumokat, amelyekből ez a tartomány hiányzik, a továbbiakban csonkítottnak nevezzük. A restrikciós helyeket alkalmazzuk a végső gének kezdeti megalkotásához részleges szintetikus oligonukleotidokból, amelyek az egyik restrikciós helytől a másikig terjednek. Az oligonukleotidokat Applied Biosystems oligonukleotid szintetizáló berendezésen szintetizáljuk és akrilamid gélen tisztítjuk. Az oligonukleotidot az 5' végen foszforilezzük T4 polinukleotid kinázt alkalmazva, és ezután az egyes oligonukleotidokat összeforrasztjuk komplementerükkel.

A. TGF szintetikus oligonukleotidok

1.) Humán TGF N-terminális tartomány

TGF

BssHIINcoI

Μ V VSHFNDCPDSHTQFC

5' CGCGCCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGC

3'

GGTACCAACAAAGAGTGAAATTGCTGACGGGCCTGAGAGTATGAGTCAAAACG

KpnI
F H G T
TTTCATGGTAC	3'	TGF104
AAAGTAC	3'	TGF103

2. ) Módosított humán TGF középső tartomány, ahol a QEDK humán szekvencia QEEK-ra váltott, a patkány TGF-ben található szekvencia bán

KpnI Sphl

CRFLVQEEKPA C

5' CTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATG 3' TGF101

3' CATGGACGGCAAAAGACCAAGTCCTTCTTTTTGGCC 5' TGF102

3. ) Humán TGF C-terminális tartomány

Sphl

VCHSGYVGARCEHADLL

5' C.GTTTGCCATTCTGGCTACGTTGGCGCACGTTGCGAACACGCTGACCTGCTG

3' GTACGCAAACGGTAAGACCGATGCAACCGCGTGCAACGCTTGTGCGACTGGACGAC

BamHI

A Tér

GCTTAAG 3' TGF205

CGAATTCCTAG 5' TGF206

B. VGF szintetikus oligonukleotidők

1.) VGF szélső N-terminális tartomány ··· » · • · · • · · ··

- 48 Hindin

EDSGNAIETTSPEITN ATT

5' AGCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTACTTCTCCGGAAATCACTAACGCTACTACT 3' V

3' CTGAGACCATTGCGAT.AGCTTTGATGAAGAGGCCTTTAGTGATTGCGATGATGA 5' V

2.) Módosított VGF N-terminális tartomány, beleértve az Asp-Pro hasítási helyet, HTG szekvenciával, amely a természetes HDG szekvenciát helyettesíti

BamHI

IDPMDIPAIRLCGPEGDGY

5' GATCGATCCCATGGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGGTAC

3' CTAGGGTACCTGTAGGGCCGATAGGCAGACACGCCGGGCCTTCCGCTGCCGATG

KpnI
C L H G T
TGCCTGCATGGTAC	3'	VGF104a
ACGGACGTAC	5'	VGF103a
3.) Módosított	VGF	középső	tartomány, amely	GYAC szekvenciával
bír, amely	a természetes	GMYC	szekvenciát	helyettesíti
KpnI				Sphl
T C I H A	R	D I D	G Y	A C

5' CTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATG 3' VGF101a

3' CATGGACGTAGGTACGTGCACTGTAGCTGCCGATGC 5' VGF102a

4.) VGF C-terminális tartomány, 5' vég ·· · · ·· · ♦ * · · · • · · · · · ·♦· • · a ····« · ··· · »· · ··

- 49 Sphl EcoRI

CRCSHGYTG

5' CCGTTGCTCTCATGGCTACACTGG 3' VGF1A

3' GTACGGCAACGAGAGTACCGATGTGACCTTAA 5' VGF2A

5.) Módosított C-terminális tartomány, 5' vég, amelyben VCS szekvencia helyettesíti a természetes RCS szekvenciát

Sphl EcoRI

VCSHGYTG

5' CGTTTGCTCTCATGGCTACACTGG 3' VGF1

3' GTACGCAAACGAGAGTACCGATGTGACCTTAA 5' VGF2

6.) VGF C-terminális tartomány, 3' fragmentum, amely a természetesen kiválasztódó VGF kikövetkeztetett C-terminálisának PNT-je helyett YQR-rel végződik

EcoRI BamHI

IRCQHVVLVDYQR Tér

5' AATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGTTAAGGATC 3' VGF3 3' GCAACGGTCGTACAACAAGACCAGCTGATGGTCGCAATTC 5' VGF4

C. EGF szintetikus oligonukleotidők

Humán EGF-et kódoló 1(A,B), 2(A,B) és 3(A,B) átfedő szintetikus oligonukleotidokat szintetizálunk Applied Biosystems oligonukleotid szintetizáló berendezésen, és akrilamid gélen tisztítjuk ezeket. Az oligonukleotidokat az 5' végen foszforilezzük T4 polinukleotid kinázt alkalmazva. Az egyes oligonukleotidokat komple ··· menterjeikhez forrasztjuk.

1.)

NcoIEcoRI

M NSDSECPLSHDGY

5' CATGAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGACGGCTAC 3'

3' TTAAGACTGAGACTTACGGGCGACAGAGTACTGCCGATGACGGA 5'

2.)

Nsil Sphl

CLHDGVCMYIEALDK YAC

5' TGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATG 3' EGF1B

3' GTACTGCCGCATACGTACATGTAGCTTCGAGACCTGTTCATGC 5' EGF2B

3.)

Sphl

NCVVGYIGERCQYRDLK

5' CAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAA

3' GTACGTTGACGCAACAACCGATGTAGCCGCTTGCAACGGTCATGGCACTGGACTTT

BamHI

W W E L R *

TGGTGGGAACTGCGTTAAG 3' EGF3

ACCACCCTTGACGCAATTCCTAG 5' EGF4

II. PÉLDA

A klónozó és kifejező plazmidok leírása

A. A pLEBam plazmidot szintetikus oligonukleotid fragmentumok klónozására használjuk alkalmas BssHII és BamHI restrikciós helyei • · ·«· ·· miatt. Ncol és BamHI restrikciós helyekkel bíró plazmidokat, mint pl. a pBM11-et vagy pBM11/NDP-t (amelyeket a későbbiekben írunk le) alkalmazhatunk a szintetikus nukleotid fragmentumok és más szóban forgó DNS szekvenciák klónozására.

B. A pBM11 plazmid, amelyet az ezzel összefüggő, 264,098 számon 1988. október 28-án bejelentett szabadalmi leírás ismertet, lehetővé teszi a szóban forgó gén klónozását a bakteriofág Ngén 33 N-terminális aminosavát kódoló DNS szekvenciáktól lefelé egy BamHI restrikciós helynél. A PL promotor indukciójára a CI857 hőmérséklet-érzékeny represszor inaktiválásával 42°C hőmérsékleten az idegen géntermék egy fúziós fehérje C-terminális részeként fejeződik ki, amelynek N-terminálisa az N-gén N-terminálisa

C. A pBM11M4 plazmid, amelyet az ezzel összefüggő, 264,098 számon 1988. október 28-án bejelentett szabadalmi leírás ismertet, a pBM11-ből származik, és lehetővé teszi egy szóban forgó gén klónozását egy BamHI restrikciós helynél közvetlenül az N-gén beindító metioninja után. A pBM11/M4 plazmid tartalmaz egy Ncol helyet is a neomicin génben.

D. A pBM11M5 plazmid, amelyet az ezzel összefüggő, 264,098 számon 1988. október 28-án bejelentett szabadalmi leírás ismertet, a pBM11-ből származik, amelyben egy Ncol hely, amely a neomicin rezisztencia génben van, el van távolítva helyre irányuló mutagenezissel. Egy szóban forgó gén klónozása pBM11/M5-be ezért nem igényli a vektor részleges emésztését Ncol-gyel.

E. A ρΒΜ11/NDP plazmid, amelyet az ezzel összefüggő, 264,098 számon 1988. október 28-án bejelentett szabadalmi leírás ismertet, a pBM11-ből származik és egy savra labilis aszparaginsavprolin dipeptidet kódoló DNS szekvenciával bír az N-gént kódoló és egy szóban forgó gént kódoló szekvencia között. A plazmid tartalmaz egy Ncol helyet és egy Clal helyet egy szóban forgó gén klónozására a promotortól lefelé.

F. A pBM11/PAD plazmid, amelyet az ezzel összefüggő 264,098 számon 1988. október 28-án bejelentett szabadalmi leírás ismertet, a pBM11M4 plazmidból származik és lehetővé teszi egy szóban forgó gén klóno-

zását egy HindlII, Smal vagy BamHI helynél egy módosított alkálikus foszfatáz szignál szekvenciától lefelé.

G. A pBM11/PÁK plazmid, amelyet az ezzel összefüggő, 264,098 számon 1988 október 28-án bejelentett szabadalmi leírás ismertet, a pBM11M4 plazmidból származik és lehetővé teszi egy szóban forgó gén klónozását HindlII, Smal vagy BamHI helynél egy alkálikus foszfatáz szignál szekvenciától lefelé.

H. A pTCPt plazmidot úgy tervezzük, hogy rendelkezzék a tac promotor elemekkel és hasznosítsa a cro SD-t, hogy kifejezze a szóban forgó gént az alkálikus foszfatáz szignál szekvencia mögött. Ennek a plazmidnak a megalkotásáról példát adunk az alábbiakban pTCPt/EGF megalkotásában.

pTNPt megalkotása ( Ltrp-3511 7bp flac-1 oj [nbpl 8bp fATG~| ) alkálikus foszfatáz szignál/kapcsoló/trans.term.-NEQ)

Ezt a plazmidot úgy tervezzük, hogy rendelkezzék a tac promotor elemekkel és hasznosítsa az N-gén 8D-t egy adott gén kifejezésére az alkálikus foszfatáz szignál szekvencia mögött. Ennek pBR322 háttere van neomicin rezisztencia génnel. A pTNPt plazmidot a következőképpen alkotjuk meg.

(a) A pBM16t-VGFa 2,8 kb-s EcoRI-BamHI fragmentumának megalkotása, amelyből hiányzik a HindlII hely

A pBM16t/VGFa plazmidot EcoRI-gyel és BamHI-gyel emésztjük és a 2,8 kb-s fragmentumot izoláljuk. A 2,8 kb-s fragmentumot ligáljuk egy EcoRI-BamHI kapcsolóval és korrekt konstrukciót izolálunk restrikciós elemzéssel; ezt nevezzük I. intermediernek.

Az egyedi HindlII helyet a neomicin rezisztencia gén közelében eltávolítjuk az I. intermedier plazmidból HindlII-mal végzett emésztéssel, Klenow fragmentum segítségével tompa végek kialakítá-54 _ sával és újra-ligálással. Ez eredményezi a II. intermedier plazmidot, amelyből hiányzik a HindlII hely.

A pBM1őt/VGFa 2,8 kb-s EcoRI-BamHI fragmentumát, amelyből hiányzik a HindlII hely, a II. intermedier EcoRI-gyel és BamHIgyel végzett emésztésével izoláljuk. Az így létrejövő 2,8 kb-s fragmentumot agaróz gélelektroforézissel izoláljuk.

(b) A pBM11/PÁK 150 bp-s BamHI-BsmI fragmentumának előállítása

A pBM11/PAK azonos a pBM11/PAK/EGF-fel, azzal a kivétellel, hogy ez egy Hindii, Smal és BamHI helyeket tartalmazó kapcsoló területet tartalmaz az alkálikus foszfatáz szignál szekvenciától lefelé EGF gén helyett. pBM11/PAK-ot emésztünk BsmI-gyel és BamHIgyel, és a 150 bp-s fragmentumot, amely tartalmazza az N-gén SD-t, az alkálikus foszfatáz szignál szekvenciát és a kapcsoló területet, izoláljuk.

(c) A TacA+ és TacA- oligonukleotidok előállítása

TacA+ és TacA- oligonukleotidokat szintetizálunk Applied Biosystems oligonukleotid szintetizáló berendezésen, és úgy tervezzük, hogy legyen egy EcoRI túlnyúlás az 5' végen a trp-35 konszenzus szekvenciával, amely 17 nukleotiddal van elkülönítve a lac10 konszenzus szekvenciától, amelyen belül egy SstI hely helyezkedik el. A.szekvencia tartalmazza a lac mRNS 5' végét, a lac represszor kötőhelyet és tartalmaz egy BsmI túlnyúlást.

TacA+ 5' AATTACTCCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGAGGTC GTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAG 3'

TacA- 5' GTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATA

CGAGCTCGATGATTAATTGTCAACAGGGGGATGGGGAGT 3' • · · • · • · · • · · (d) pTNPt ligálása és izolálása

A 2,8 kb-s EcoRI-BamHI fragmentumot, a 150 bp-s BsmI-BamHI fragmentumot és a TacA+ és TacA- oligonukleotidokat együtt ligáljuk DNS ligázt alkalmazva, és a DNS-t kompetens JM109 (laclfl) transzformálására alkalmazzuk. A korrekt konstrukciót restrikciós elemzéssel és DNS szekvenciaelemzéssel izoláljuk.

(pBM11 EcoRI helye)

GAATTACTCCCCATCC

SstI trp-35 (17bp) lac-10 ccctg [ttgaca]attaatcatcgagctcg(tataatg)

BsmI

5'lac mRNS n mRNS

TGTGG/AATTGTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGCATTCAAAGCAGAAGGCT

TTGGGGTGTGTGATACGAAACGAAGCATTGGCCGTAAGTGCGATTCCGGATTAGC

TGCCAATGTGCCAATCGCGGGGGGTTTTCGTTCAGGACTACAACTGCCACACACC

Pvul mSD (8bp) szignál szekvencia accaaagctaactgacÍagga] GAATCCAG ATGAAACAATCTACGATCGCCC

MKQSTIAL

Smal

HincLIII BamHI

TCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTTCCCGGGATCCGTG

ALLPLLFTPVTK (a pMB11 BamHI helye)

Átírás befejezés

ACTAATTGGGGACCCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAACGATCC

I. A plac/cro-^-gal plazmid az E. coli laktóz (lac) operon operátor-promotor területét, valamint a lac és cro riboszomális kötőhelyeit tartalmazza. A plazmidot úgy alkottuk meg, amint ezt az ezzel a bejelentéssel összefüggő 264,098 számon, 1988. október 28-án bejelentett szabadalmi bejelentés leírja. Az ezzel a vektorral kifejezett fúziós fehérjék tartalmazzák a bakteriofág Cro fehérjéje N-terminálisát, a beiktatott DNS által kódolt aminosavszekvenciát, és a j? -galaktozidáz C-terminálisát. Ennek a vektornak a szabályozó elemei az E. coli laktóz(lac) operon operátorpromotor területéből, valamint a lac és cro riboszomális kötőhelyekből állnak.

J. A ptac/cro-p-gal plazmid lehetővé teszi egy szóban forgó gén klónozását a bakteriális Cro fehérje 21 N-terminális aminosavától lefelé. A plazmidot úgy alkotjuk meg, amint ezt az ezzel összefüggő, 1988. október 28-án benyújtott amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásban bemutatták. A ptac/cro-^-gal kifejező vektor hasonló a plac/cro-^-gal-hoz azzal a kivétellel, hogy a ptac/crop>-gal a triptofán operon promotorjából származó -35 területet és a lac operon Pribnow boxát tartalmazza. Ez a hibrid fehérje a kife• · · ··

- 57 jeződés magasabb szintjét teszi lehetővé, mint a plac/cro—^S-gal.

K. A pRSV plazmid lehetővé teszi egy szóban forgó gén kifejeződését eukarióta sejtekben az RSV LTR promotorral [_Gormán és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781 (1982)].

L. A_pAc6lO plazmid ^Smith és munkatársai: Molec · Cell. Bioi. 12, 2156-2165 (1983)] idegen gének kifejeződését teszi lehetővé rovarsejtekben .

M. A pTox1 és pTox2 plazmidok egy szóban forgó gén kifejeződését teszik lehetővé, K. lactis ölő toxin szignál szekvenciát alkalmazva ^EMBO

6, 229-234 (1987)]. Ez a konstrukció URA3 génnel bír élesztőkben való szelektáláshoz és az AMP génnel bír a baktériumokban való szelektáláshoz. Az átírás a CYC1 promotorral és GÁL felfelé levő aktiváló szekvenciával upstream activation sequence, Method Enzymol. 101, 181-191 (1983)] kezdődik és az FLP gén 3' végén belül ^Mol. Cell. Bioi. 5., 2770-2780 (1985)] fejeződik be. A konstrukció rendelkezik mind a 2 mikronos origóval, mind a pBR322 origóval az élesztőben, illetve a baktériumokban való replikációhoz.

Az ölő toxin N-terminális területet a szignál szekvenciával és a Kex2 hasítási helyet megfelelő oligonukleotidokon vezetjük be, ez tartalmazza az A-T-ben dús területet közvetlenül az iniciációs kodon előtt, hogy fennmaradjanak az optimális transzlációs iniciációs és meghosszabbító szignálok. Számos restrikciós helyet tervezünk be, hogy lehetővé váljék a szóban forgó gének beiktatása mind a szignál hasítási helytől, mind a Kex2 hasítási helytől lefelé.

1.) A pBR322 3 kb-s, az origót és az AMP rezisztencia gént tartalmazó EcoRI-EspI fragmentumának előállítása

A pLGSD5(-ATG) plazmidot, amely élesztő kifejező vektor, • · • ·· • · · »···· · ··· · ·· · ··

- 58 ^Methods Enzymol. 101 , 181-191 (1983)J, emésztjük EcoRI-gyel és

Espl-gyel, és a 3,0 kb-s fragmentumot izoláljuk.

2. ) A 2 mikronos plazmid 2,1 kb-s EcoRI-EspI fragmentumának, amely tartalmazza az FLP gén 3' végét és az origót, előállítása

A pLGED5(-ATGr) plazmidot EcoRI-gyel és Espl-gyel emésztjük és a 2,1 kb-s fragmentumot izoláljuk.

3. ) Ligálás és a köztes fragmentum izolálása

A 2,1 kb-s és 3 kb-s EcoRI-EspI fragmentumokat együtt ligáljuk, DNS ligázt alkalmazva és a DNS-t kompetens HB101 törzs transzformálására használjuk. Restrikciós elemzéssel egy korrekt konstrukciót izolálunk.

4. ) pLGSD5(-ATG) URA3 gént, a GÁL UAS-t és a CYC1 promotort tartalmazó 1,8 kb-s EcoRI-BamHI fragmentumának előállítása

A pLGSD5(-ATG) plazmidot EcoRI-gyel és BamHI-gyel emésztjük és az 1,8 kb-s fragmentumot izoláljuk. A BamHI hely egy kapcsolón belül van a CYC1 iniciátortól 4 bp-re felfelé beiktatva;

5. ) A pTox1A+, 2A-, 1B+ és 2B-oligonukleotidok előállítása

Oligonukleotidokat tervezünk, hogy a K. lactis ölő toxin szignál szekvencia kodonjait a BamHI helyhez kapcsoljuk a CYC1 iniciátortól lefelé. Abból a célból, hogy megőrizzük az optimális transzlációs iniciációt, ez magában foglalja az A-T-ben gazdag szekvencia 13 bp-jét az ölő toxin iniciációs kodontól felfelé. Ez a szekvencia illeszkedik az élesztő iniciációs kodonok által meghatározott konszenzus szekvenciához. Egy BglII hely helyezkedik el közvetlenül az A-T területtől felfelé, hogy lehetővé váljék az iniciációs terület és a szignál szekvencia mutagenezise. Egy HindlII helyet helyezünk el 10 nukleotiddal a szignál hasítási helytől fölfelé, hogy lehetővé váljék a lefelé levő szekvenciák mutagenezise és a szóban forgó

gén ligálása. A pTox1-ben egy Aval, Xhol hely van elhelyezve közvetlenül a szignál hasítási helytől lefelé, míg a pTox2-ben egy Nael hely van elhelyezve a szignál hasítási helynél tompa végű klónozáshoz közvetlenül a szignál hasítási hely fölött, amely GlyLeu-ról Ala-Gly-re változik. A heteroduplex felbontása a hasítási helynél a pTox1 szekvenciákat tartalmazó kiónok és a pTox2 szekvenciát tartalmazó kiónok kialakulását eredményezi. Mindkét konstrukcióban az ezt követő szekvenciák az ölő toxin prekurzor szekvencia további részét kódolják a Kex2 Lys-Arg hasítási helytől lefelé, ahol számos restrikciós hely (Stul, ball, AccI, HincII és BamHI) helyezkedik el, hogy a szóban forgó gén klónozása könnyebb legyen. A Stul hely lehetővé teszi a tompa végű klónozást közvetlenül Kex2 hasítási hely Arg kodonja után. Az oligonukleotidoknak van egy BamHI túlnyúlása az 5' végnél és egy HindlII tűlnyúlása a 3' végnél, hogy lehetővé váljék a klónozás a köztes vektorba. Az így létrejövő szekvencia már nem tartalmazza a két hely egyikét sem.

(BamHI) BglII HindlII

MNIFYIFLFLLS

1A+ 5' GATCAGATCTAATAATTATAAAATGAATATATTTTACATATTTTTGTTTTTGCTAAGC 2A- 3' TCTAGATTATTAATATTTTACTTATATAAAATGTATAAAAACAAAAACGATTCGAAG

Szignál hasítási hely Kex2 hasítási hely (pTox1)/ Aval, Xhol /Stul, Sáli, Acci, BamHI

FVQGLEHTHRRGSLVKRPLSTDP

1B+ 5' TTCGTTCAGGGCCTCGAGCATACTCATAGAAGAGGCTCCTTAGTCAAAAGGCCTTTGTCGACGGATCC 2B- 3' AAGTCCGGCCGCTCGTATGAGTATCTTCTCCGAGGAATCAGTTTTCCGGAAACAGCTGCCTAGGTCG A G (pTox2)NaeI

Ezeket az oligonukleotidokat Applied Biosystems Synthesizer berendezésen szintetizáljuk és gélelektroforézissel tisztítjuk.

Ezt követően ezeket foszforilezzük T4 kinázt alkalmazva és a komplementer párokat összeforrasztjuk, ligáljuk, és gélen tisztítjuk.

6. ) EcoRI-HindlII intermedier vektor

Intermedier vektort emésztünk EcoRI-gyel és HindlII-mal, majd borjúbél alkálikus foszfátázzál kezeljük. Ez a kezelés eltávolít egy kis EcoRI-HindlII fragmentumot és meghagy egy HindlII helyet az FLP 3' szekvenciától fölfelé.

7. ) Ligálás és pTox1 és pTox2 izolálása

Az 1,8 kb-s EcoRI-BamHI fragmentumot az oligonukleotid fragmentumhoz ligáljuk, DNS ligázt alkalmazva és az így létrejövő fragmentumot gélen tisztítjuk, majd ezt követően az EcoRI-HindlII intermedier vektorhoz ligáljuk, és a DNS-t kompetens HB101 transzformálására alkalmazzuk. Korrekt konstrukciókat azonosítunk restrikciós elemzéssel és DNS szekvenciaelemzéssel, és egy kiónt, amely pTox1 szekvenciával bír, és egy kiónt, amely pTox2 szekvenciával bír, izolálunk. Mindkét kiónból hiányzik a BamHI hely az oligonukleotid és az intermedier vektor találkozásánál.

III. példa

Növekedési faktor gének összeállítása prokarióta sejtekben való kifejeződéshez

A TTV-nek vagy (TGF/TGF/VGF)-nek nevezett szintetikus kiméra növekedési faktort a pLEBam klónozó vektorban állítjuk össze. Ez a hibrid növekedési faktor tartalmazza a humán TGF aminosavszekvenciáját a gén amino-terminális kétharmadában, kivéve a QEEK szekvenciát, amely változást jelent a természetes humán QEDK szekvenciához viszonyítva. A karboxi-terminális a VGF aminosavszekvenci···

- 61 ájából származik és az YQR szekvenciával fejeződik be a természetes PNT szekvenciától felfelé. A pLEBam plazmidot BssHII-vel és BamHIgyel emésztjük. A BssHII-BamHI pLEBam-et azután a TGF101, 102, 103 és 104, illetve VGF1 , 2, 3 és 4 oligonukleotidokhoz ligáijuk DNS ligázt alkalmazva és az így létrejövő plazmidot kompetens HB101 transzformálására használjuk. A transzformánsokat ampicillinen szelektáljuk és restrikciós elemzéssel vizsgáljuk át, EcoRI-et, Ncolet és BamHI-et alkalmazva, valamint nukleotid szekvenciaelemzéssel vizsgáljuk át, a Maxam-Gilbert féle módszert alkalmazva. Egy korrekt konstrukciót izolálunk és pLEBam/TTV-nek nevezzük el.

TGF —>

Ne o.I

CCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTT

MVVSHFNDCPDSHTQFCF

VGF -->

KpnI Sphl

TCATGGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCTCT

HGTCRFLVQEEKPACVCS

EcoRI

CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT HGYTGIRCQHVVLVDYQR

BamHI

TAAGGATCC

Tér

B. A pLEBam/TVV plazmid előállítása ··· • ···· ·· · ·· · · · · « • · · · · · * · ······ · ··· · ·· · «_ν

- 62 A szintetikus kiméra növekedési faktort, amelyet TVV-nek vagy (TGF/VGF/VGF)-nek nevezünk, a pLEBam klónozó vektorban állítjuk össze. Ez, a hibrid növekedési faktor a humán TGF aminosavszekvenciá ját tartalmazza a gén N-terminális tartományában. A középső és C-terminális tartományok a csonkított VGF szekvenciából származnak és YQR szekvenciával végződnek a természetes PNT szekvenciától felfelé. Ezen kívül a szintetikus génben van módosítás is, GYACVC van CMYCRC helyett.

(a) A pLEBam/TTV 4,3 kb-s KpnI-Sphl fragmentumának előállítása

A pLEBam/TTV plazmidot KpnI-gyel és SphI-gyel emésztjük és a

4,3 kb-s KpnI-Sphl fragmentumot gélen tisztítjuk. Ez az emésztés eltávolítja a középső TGF tartományt a szintetikus TTV génből a pLEBam klónozó plazmidban.

(b) Ligálás és a pLEBam/TVV izolálása

A VGF101a és 102a oligonukleotidokat a pLEBam/TTV 4,3 kb-s KpnI-Sphl fragmentumhoz ligáljuk DNS ligázt alkalmazva, és az így létrejövő keveréket kompetens HB101 transzformálására használjuk. A transzformánsokat ampicillinen kiválasztjuk és nukleotid szekvenciaelemzéssel átvizsgáljuk, a Sanger didezoxi módszert alkalmazva. Egy korrekt konstrukciót izolálunk, ezt pLEBam/TVV-nek nevezzük.

TGF —>

Ncol CCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTT MVVSHFNDCPDSHTQFCF ·· • · ···· ·· · ·· • · · • · · ·· ··

Sphl

TCATGGTACCTGCATCCATGCACTGGACATCGACGGCTACGCATGCGTTTGCTCT

HGTCIHARDIDGYACVCS

EcoRI

CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGCTCGACTACCAGCGT

HGYTGIRCQHVVLVDYQR

BamHI

TAAGGATCC

Tér

IV. példa

Egy szóban forgó fehérje kifejeződése N-fehérjével képzett fúziós fehérjeként

A. Módosított szintetikus TGF

2.) pBM11/N/TGF előállítása

A módosított humán TGF-et ebben a rendszerben az N-gén 33 Nterminális aminosavával alkotott fúziós termékként fejezzük ki, amelyben QEEK szekvencia helyettesíti a QEDK humán szekvenciát.

(a) pBM11/N/TTV 780 bp-s SphI-Pvul fragmentumának előállítása pBM11/N/TTV plazmidot emésztünk SphI-gyel és Pvul-gyel és a

780 bp-s SphI-Pvul fragmentumot gélen tisztítjuk. Ez a fragmentum a pBM11 plazmid egy részét tartalmazza a Pvul végnél és az Sphl végnél, tartalmazza továbbá az N-gént és a humán TGF gén N-terminális kétharmadát.

(b) A pBM11/N/TTV 5 kb-s BamHI-Pvul fragmentumának előállítása A pBM11/N/TTV plazmidot BamHI-gyel és Pvul-gyel emésztjük és az 5 kb-s BamHI-Pvul fragmentumot gélen tisztítjuk.

(c) Ligálás és a pBM11/N/TGF izolálásaa

A TGF 205 és 206 oligonukleotidokat és a pBM11/N/TTV 780 bp-s SphI-Pvul fragmentumát és 5 kb-s BamHI-Pvul fragmentumát együtt ligáljuk és kompetens HB101 transzformálására alkalmazzuk. A trnszformánsokat neomicinen szelektáljuk és restrikciós elemzéssel átvizsgáljuk EcoRI-et alkalmazva, valamint átvizsgáljuk nukleotid szekvenciaelemzéssel is a Sanger didezoxi módszert követve. Egy korrekt konstrukciót izolálunk, ezt pBM11/N/TGF-nek nevezzük .

N-gén

ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA

MDAQTRRRERRAEKQAQWK

BamHI

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCCGCAT

AANPLLVGVSAKPVRIRM

TGF

GGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTTTCAT

VVSHFNDCPDSH TQFCFH

KpnI

GGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCCATTCTG

GTCRFLVQEEKPACVCHSG

BamHI

GCTAGGTTGGCGCACGTTGCGAACACGCTGACCTGCTGGCTTAAGGATCC

YV GARCEHADLLATer • 4 * • · · ··

B. Módosított szintetikus TGF-VGF hibrid

1.) pBM11/N/TTV előállítása

Ebben a konstrukcióban egy szintetikus módosított TTV kiméra gént fejezünk ki egy fúziós fehérje C-terminális részeként, amely fúziós fehérje az N-gén első 33 aminosavával rendelkezik az N-terminálisnál. Ez a hibrid növekedési faktor tartalmazza a humán TGF aminosavszekvenciáját a gén amino-terminális kétharmadában, azzal a kivétellel, hogy a természetes humán QEDK szekvencia QEEK szekvenciára változik. A karboxi terminális a VGF aminosavszekvenciájából származik és YQR szekvenciával fejeződik be a természetes PNT szekvenciától felfelé.

(a) Ncol(tompa)-BamHI TTV szintetikus gén előállítása pLEBam/TTV plazmidot emésztünk Ncol-gyel és a végeket tompává tesszük a túlnyúlások betöltésével, DNS polimeráz Klenow fragmentumát alkalmazva. A DNS-t azután BamHI-gyel emésztjük és a 170 bp-s Ncol(tompa)-BamHI TTV fragmentumot gélen tisztítjuk.

(b) BamHI-gyel emésztett pBM11 előállítása

A pBM11 plazmidot BamHI-gyel emésztjük.

(c) Ligálás és a pBM11/N/TTV izolálása

A BamHI-gyel emésztett pBM11-et, az Ncol(tompa)-BamHI TTV fragmentumot és a BamHI kapcsolót (5' GATCCG 3') együtt ligáijuk DNS ligázt alkalmazva, és az így létrejött keveréket kompetens HB101 transzformálására alkalmazzuk. A transzformánsokat neomicinen választjuk ki és átvizsgáljuk egyrészt restrikciós elemzést alkalmazva, másrészt nukleotid szekvenciaelemzést alkalmazva Sanger didezoxi módszer segítségével. Egy korrekt konstrukciót izolálunk, ezt pBM11/N/TTV-nek nevezzük el.

N -gén —>

ATGGATGCAGAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA

MDAQTRRRERRAEKQAQWK

BamHI

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCCGCAT

AANPLLVGVSAKPVRIRM

TGF —>

GGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTTTCAT

VVSHFNDCPDSHTQFCFH

KpnI Sphl VGF —>

GGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCTCTCATG

GTCRFLVQEEKPACVCSHG EcoRI

GCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGTTAAG

YTGIRCQHVVLVDYQR Tér

BamHI

GATCC

V. példa

Egy szóban forgó polipeptid előállítása N-fehérjével és egy hasítási hellyel képzett fúziós fehérjeként

A. Módosított szintetikus VGF

1.) pBM11/NDP/VGFA előállítása

A szintetikus VGFA gén N-terminális szekvenciája a természe

- 67 tes VGF szekvencia csonkított változata és a DIPAIR szekvenciával kezdődik. Ebben a plazmidban a VGFA fragmentum 32 aminosavval lefelé helyezkedik el a lambda N-fehérjétől és az aszparaginsav-prolin dipeptidtől. Abból a célból, hogy megőrizzük a KpnI klónozó helyet, a szintetikus szekvenciát megváltoztatjuk olyan módon, hogy a természetes VGF szekvencia CLHGDC-je helyett CLHCGTC-t kódoljon, és YQR-rel fejeződjék be a természetes szekvencia PNT-jétől felfelé. Ezen kívül a VGFA gén a GYACVC szekvenciát is kódolja, amely a természetes GMYCRC szekvenciát helyettesíti.

a. ) A szintetikus VGF gén 80 bp-s KpnI-BamHI C-termin^lis fragmentumának előállítása

A pLEBam/TVV plazmidot KpnI-gyel és BamHI-gyel emésztjük és a 80 bp-s KpnI-BamHI fragmentumot gélen tisztítjuk. Ez a fragmentum a szintetikus VGF gén C-terminális kétharmadát tartalmazza a KpnI hellyel az 5' végen.

b. ) BamHI-gyel emésztett defoszforilezett pBM11 előállítása pBM11/N/TTV plazmidot emésztünk BamHI-gyel és az 5' foszfát végeket eltávolítjuk borjúbél foszfatázzal végzett kezeléssel. Az

5,6 kb-s BamHI plazmid fragmentumot gélen tisztítjuk.

c. ) Ligálás és a pBM11/NDP/VGFA izolálása ’

A VGF 103a, 104a oligonukleotidokat, a pBM11 5,6 kb-s fragmentumát és a pLEBam/TVV 80 bp-s KpnI-BamHI fragmentumát együtt ligáijuk, DNS ligázt alkalmazva, majd ezt a terméket alkalmazzuk kompetens HB101 transzformálására. A transzformánsokat neomicinen szelektáljuk és restrikciós elemzéssel átvizsgáljuk Clal-et alkalmazva, valamint átvizsgáljuk nukleotid szekvenciaelemzéssel is a Sanger didezoxi technikát alkalmazva. Egy korrekt konstrukciót izolálunk, ezt pBM11/NDP/VGFA-nak nevezzük. Ez a konstrukció a

GTC és GYACVC szekvenciákkal bír az autentikus GDC és GMYCRC VGF szekvenciák helyett.

N-gén—>

ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACTGCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA

MDAQTRRRERRAE KQAQWK

Clal

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATC

AANPLLV GVSAKPV RIDP

Ncol VGF —>

CCATGGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGCCT

MDIPAIRLC GPEGDGYCL

KpnI Sphl

GCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCGTTTGCTCT

HGTCIHARDIDG YAC VC-8

JScoRI

CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT

HGYTGIRCQHVVLVDYQR

BamHI

TAAGGATCC

Tér

2.) pBM11/NDP/VGFa előállítása

A VGFa N-terminális szekvenciája a természetes VGF szekvenciá··· • · ···· » *· · *t

- 69 nak csonkított változata és a DIPAIR szekvenciával kezdődik. A

VGFa szekvencia ezen kívül tartalmazza a megváltozott GTC és GYACR szekvenciákat a természetes GDC és GMYCRC VGF szekvenciák helyett. Ebben a plazmidban a VGFa gén 32 aminosavval lefelé helyezkedik el a lambda N-fehérjétől és az aszparaginsav-prolin dipeptidtől. A tisztított fúziós fehérje kezelése hangyasavval hasítást eredményez a sav-labilis aszparaginsav-prolin peptid kötésben, lehetővé téve a VGF fehérje elkülönítését a lambda N-fehérje amino-terminálisától. A hasítás olyan, hogy a VGFa fehérje prolin-gyökkel marad az amino-terminálisánál.

a. ) SphI-gyel emésztett, defoszforilezett pBM11/DP/VGFA előállítása pBM11/DP/VGFA plazmidot (10^ g) emésztünk 30 egység SphI-gyel és az 5' foszfátokat eltávolítjuk borjúbél alkálikus foszfatázzal végzett kezeléssel. Az 5 kb-s plazmid fragmentumot agaróz gélen végzett elektroforézissel különítjük el.

b. ) A pBM11/DP/VGFA 70 bp-s EcoRI-8phI fragmentumának előállítása pBM11/DP/VGFA plazmidot (10^ g) emésztünk 30 egység EcoRIgyel, majd 30 egység SphI-gyel. A 70 bp-s fragmentumot agaróz gélen végzett elektroforézissel különítjük el.

3.) Ligálás és a pBM11/NDP/VGFa izolálása

A VGF 1A és 2A oligonukleotidokat tartalmazó 24 bp-s fragmentumot, valamint a pBM11/DP/VGFA 5 kb-s Sphl fragmentumát és 70 bp-s EcoRI-öphl fragmentumát együtt ligáljuk és a keveréket kompetens E. coli HB101 sejtek transzformálására használjuk. A transzformánsokat nukleotid szekvenciaelemzéssel vizsgáljuk át, a Sanger-féle didezoxi-módszert alkalmazva. Egy korrekt kiónt izolálunk, ezt • 4 ···

- 70 ρΒΜ11/NDP/VGFa-nak nevezzük.

N-gén ->

ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA

MDAQTRRRERR AEKQAQWK

Clal

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATCC

AANPL LVGVSAKPVRIDP.

Ncol VGF -->

CCATGGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGCCT

MDIPAIRLCGPEGDGYCL

KpnI Sphl

GCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCCGTTGCTCT

HGTCIHARDIDGY ACRCS

EcoRI

CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT

H GYTGIRCQHVVLVDY qR

BamHI

TAAGGATCC

Tér

B. Módosított szintetikus TGF-VGF hibridek

1.) pBM11/NDP/TTV előállítása • · · · · · ··«

..% : %.···:· ..·

Ebben a konstrukcióban a szintetikus, módosított TTV kiméra gént egy olyan fúziós fehérje C-terminális részeként fejezzük ki, amely N-terminálisánál az N-gén első 32 aminosavával rendelkezik. Sav-labilis aszparaginsav-prolin dipeptid különíti el a fúziós térnék két részét. A hibrid növekedési faktor tartalmazza a humán TGF aminosavszekvenciát a gén amino-terminális kétharmadában, azzal a különbséggel, hogy a természetes humán TRF QEDK szekvenciáról a szekvencia QEEK-ra változott. A karboxi-terminális a VGF aminosavszekvenciából származik és az YQR szekvenciával fejeződik be a természetes PNT szekvenciától felfelé.

a. ) Az 5 kb-s Ncol pBM11 plazmid fragmentum előállítása

A pBM11/NDP/VGFA plazmidot Ncol-gyel emésztjük és az 5 kb-s Ncol fragmentumot gélen tisztítjuk. Ennek a fragmentumnak van egy Ncol túlnyúlása az aszparaginsav-prolin hasítási helyen az N-gén első 32 aminosavát kódoló szekvenciáktól lefelé. A másik Ncol hely a neomicin rezisztencia génben van.

b. ) A 0,6 kb-s NcoI-BamHI pBM11 fragmentum előállítása

A pBM11/N/TTV plazmidot Ncol-gyel és BamHI-gyel emésztjük és a 0,6 kb-s NcoI-BamHI plazmid-fragmentumot gélen tisztítjuk. Ennek a fragmentumnak Ncol túlnyúlása van a neomicin rezisztencia génben.

c. ) A 70 bp-s szintetikus TGF/TGF/VGF fragmentum tisztítása

A pLEBam/TTV plazmidot Ncol-gyel és BamHI-gyel emésztjük, és a TGF/TGF/VGF szintetikus gént tartalmazó 170 bp-s NcoI-BamHI fragmentumot gélen tisztítjuk. Ennek a fragmentumnak Ncol túlnyúlása van a gén 5' végén és BamHI túlnyúlása van a gén 3' végén.

d. ) Ligálás és a pBM11/NDP/TTV izolálása

Az 5 kb-s Ncol és a 0,6 kb-s NcoI-BamHI plazmid fragmentumo kat ligáijuk a 170 bp-s NcoI-BamHI TTV-génnel DNS ligázt alkalmazva

és az így létrejövő keveréket használjuk kompetens HB101 transzformálására. A transzformánsokat neomicinen szelektáljuk úgy, hogy csak a korrekt módon rekonstruált neomicin rezisztencia gének éljenek túl. Transzformánsokat vizsgálunk át Ncol-gyel végzett restrikciós elemzést alkalmazva, valamint nukleotid szekvenciaelemzést alkalmazva a Sanger-féle didezoxi technika szerint. Egy korrekt konstrukciót izolálunk és ezt pBM11/NDV/TTV-nek nevezzük.

ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA

MDA QTRRRERRAEKQAQWK

Clal

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATC

AANPLLVGVSAKPVRIDP

Ncol TGF —>

CCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTT

MV VSHFNDCPDSHTQFCF

KpnI

VGF

TCATGGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCTCT

HGTCR FLVQEEKPACVC8

EcoRI

CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT

H GYTGIR CQHVVLVDYQR

BamHI

TAAGGATCC

Tér

2.) _PBM11/NDP/VTV előállítása

Ebben a konstrukcióban a szintetikus módosított VTV kiméra gént egy fúziós fehérje C-terminális részeként fejezzük ki, amely fúziós fehérje N-terminálisánál az N-gén első 32 aminosavával bír. A fúziós termék két részét sav-labilis aszparaginsav-prolin dipeptid választja el. A hibrid növekedési faktor a humán TGF aminosavszekvenciáját tartalmazza a középső tartományban, ám QEEK aminosavszekvencia helyettesíti a természetes QEDK szekvenciát. Az Nterminális és C-terminális tartományok a megcsonkított VGF szekvenciából származnak, és a DIPAIR szekvenciával kezdődnek és az YQR szekvenciával végződnek, amely a természetes PNT szekvenciától fölfelé van.

a. ) A pBM11 5 kb-s BamHI-NcoI fragmentumának előállítása

A pBM11/N/TTV plazmidot BamHI-gyel és EcoRI-gyel emésztjük és az 5 kb-s BamHI-NcoI fragmentumot gélen tisztítjuk. Ez a fragmentum egy BamHI túlnyúlást tartalmaz az N-gén első 32 aminosavát kódoló szekvenciák 3' végén és egy Ncol helyet tartalmaz a neonácin rezisztencia génben.

b. ) pBM11/N/TTV 700 bp-s KpnI-NcoI fragmentumának előállítása

A pBM11/N/TTV plazmidot KpnI-gyel emésztjük és a 700 bp-s KpnI-NcoI fragmentumot gélen tisztítjuk. Ez a fragmentum a pBM11 plazmid egy részéből áll, amely a neomicin reziszencia gén egy részét tartalmazza az Ncol túlnyúlásnál, valamint a TTV szintetikus gén C-terminális VGF tartományából áll a KpnI túlnyúlásnál.

c.) Ligálás és a pBM11/NDP/VTV izolálása

A VGF 103a és 104a oligonukleotidokat, a pBM11 5 kb-s BamHINcol fragmentumát és a pBM11/N/TTV 700 bp-s KpnI-NcoI -fragmentumát együtt ligáljuk DNS ligázt alkalmazva, majd ezt alkalmazzuk kompetens HB101 transzformálására. A transzformánsokat neomicinen szelektáljuk és restrikciós elemzéssel átvizsgáljuk Clal-et alkalmazva, valamint nukleotid szekvenciaelemzéssel átvizsgáljuk a Sanger-féle didezoxi-technikával.

ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA

MDAQTRRRERRAEKQAQWK

Clal

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATC

AANPLLVGVSAKPVRIDP

Ncol VGF —>

CCATGGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGCCT

MDIPAIRLCGPEGDGYCL

KpnI TGF —> Sphl VGF —>

GCATGGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCTCT

HGTCR FLVQEEKPACVCS

BamHI

TAAGGATCC

Tér

3.) pBM16/NDP/TVV előállítása

Ebben a konstrukcióban a szintetikus módosított TVV kiméra gén • ·

- 75 egy fúziós fehérje C-terminális részeként fejeződik ki, amely fúziós fehérje rendelkezik az N-gén első 32 aminosavával az N-terminálisnál. A fúziós termék két részét sav-labilis aszparaginsavprolin dipeptid választja el. A hibrid növekedési faktor tartalmazza a humán TGF aminosavszekvenciáját az N-terminális tartományban. A középső és C terminális tartományok a megcsonkított VGF szekvenciából származnak és YQR szekvenciával végződnek. Ezen kívül a szintetikus génben a GYACVC helyettesíti a GMYCRC-t.

a. ) pBM11/NDP/VGFa 4,3 kb-s NcoI-BglII fragmentumának előállítása

A pBM11/NDP/VGFa plazmidot Ncol-gyel és BglII-vel emésztjük és a 4,3 kb-s fragmentumot gélen tisztítjuk. Az Ncol túlnyúlás az aszparaginsav-prolin hasítási helynél helyezkedik el az N-gén első 32 aminosavától éppen lefelé.

b. ) A pBM11M5 1,2 kb-s BamHI-BglII fragmentumának előállítása

A pBM11M5 plazmidot BamHI-gyel és BglII-vel emésztjük és az

1,2 kb-s fragmentumot gélen tisztítjuk. Ez a fragmentum a normális pBM11 fragmentumtól annyiban különbözik, hogy az Ncol hely a neomicin rezisztencia génben el van távolítva; minden olyan vektort, amelyből az Ncol hely hiányzik, ezután pBM16-nak nevezünk.

c. ) A 170 bp-s NcoI-BamHI TVV szintetikus gén előállítása

A pLEBam/TVV plazmidot Ncol-gyel és BamHI-gyel emésztjük és a

170 bp-s NcoI-BamHI fragmentumát gélen tisztítjuk. Ez a szintetikus gén fragmentum Ncol hellyel bír az 5' végén és BamHI hellyel bír a 3' végén.

d. ) Ligálás és a pBM16/NDP/TVV izolálása

A pBM11/NDP/VGFa 4,3 kb-s NcoI-BglII fragmentumát és a pBM115M

1,2 kb-s BamHI-BglII fragmentumát, valamint a 170 bp-s NcoI-BamHI

TVV szintetikus gén fragmentumot együtt ligáljuk DNS ligázt alkal-

mazva és az így létrejött keveréket kompetens HB101 transzformálására alkalmazzuk. A transzformánsokat neomicinen szelektáljuk és átvizsgáljuk restrikciós elemzéssel, valamint nukleotid szekvenciaelemzéssel a Sanger didezoxi technikát alkalmazva. A plazmidot pBMl6-nak nevezzük, jelezve az Ncol restrikciós hely hiányát a neomicin rezisztencia génben.

N-gén —>

ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA

MDAQTRRRERRAEKQAQWK

Clal

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATC

AANPLLVGVSAKPVRIDP

Ncol TGF -->

CCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGTTT

MVVSHFNDCPDSHTQFLF

KpnI VGF —> Sphl

TCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCGTTTGCTCT

HGTCIHARDIDGYACVCS

EcoRI

CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT

HGYTGIRCQHVVLVDYQR • · ·

- 77 BamHI

TAAGGATCC

Tér

C. Szintetikus EGF

1.) pBM11/NDP/EGF előállítása

Ebben a konstrukcióban a humán EGF gén egy, az N-gén 32N-terminális aminosavval alkotott fúziós termék részeként fejeződik ki, amely N-gén rész az Asp-Pro hasítási helytől lefelé helyezkedik el.

a. ) A pBM11 5 kb-s Nco fragmentumának előállítása

A pBM11/DP/VGFA plazmidot Ncol-gyel emésztjük és az 5' foszfátokat borjúbél alkálikus foszfatázzal végzett kezeléssel eltávolítjuk. Az 5 kb-s plazmid fragmentumot gélen tisztítjuk. Ennek a fragmentumnak Ncol túlnyúlása van az Asp-Pro hasítási helyen az Ngén első 32 aminosavát kódoló szekvenciától lefelé. A másik Ncol hely a neomicin rezisztencia génben van.

b. ) A pBM11 0,6 kb-s NcoI-BamHI fragmentumának előállítása

A pBM11/N/TTV plazmidot Ncol-gyel és BamHI-gyel emésztjük és a 0,6 kb-s NcoI-BamHI fragmentumot gélen tisztítjuk. Ennek a fragmentumnak Ncol túlnyúlása van a neomicin rezisztencia génben.

c. ) Ligálás és a pBM11/DP/EGF izolálása

Az összeforrasztott, az 5' végen Ncol túlnyúlást és a 3' végen BamHI túlnyúlást tartalmazó EGF oligonukleotidok három készletét, a pBM11 5 kb-s Ncol fragmentumát és a pBM11 0,6 kb-s NcoIBamHI fragmentumát együtt ligáljuk T4 DNS ligázt alkalmazva, és az így létrejövő keveréket kompetens E. coli HB101 transzformálásához alkalmazzuk. A transzformánsokat neomicinen szelektáljuk úgy, hogy csak a korrekt módon helyreállított neomicin rezisztencia gén

nel rendelkező telepek éljenek túl. A transzformánsokat restrikciós elemzéssel vizsgáljuk át EcoRI-et és BamHI-et alkalmazva, valamint DNS szekvenciaelemzéssel vizsgáljuk, amint a korábbiakban leírtuk.

N-gén —> ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGCGTCAATGGA

MD AQTRRRERRAEKQAQWK

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATCC AANPLLVGVSAKPVRIDP

EGF1—» EcoRI EGF2

CATGAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGAGGGCTACTGCCTGGATGAC

MNSDSECPLSHDGYCLHD

EGF3

Nsil Sphl

GGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATGCAACTGCGTTGTTG GVCMYIEALDKYACNCVVG

GCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTA

YIGERCQYRDLKWWELRx

BamHI

AGGATCC

VI. példa

Egy szóban forgó polipeptid előállítása módosított alkálikus foszfatáz szignál szekvenciával alkotott fúziós fehérjeként • ···· ·· · ·· ·· · · · · · · • · · · · ♦ ··· • · ·»···· · ··· · ·· · ··

A. pBM11/PAD/EGF előállítása

Szintetikus oligonukleotidokat tervezünk, hogy lehetővé tegyük egy módosított alkálikus foszfatáz szignál peptidet kódoló DNS és egy 3 klónozó helyet (HindlII, Smal és BamHI) tartalmazó kapcsoló (linker) terület beiktatását a pBM11 kifejező vektorba a P^ promotortól és az N-gén riboszómális kötőhelytől lefelé. A nukleotid szekvenciát úgy optimalizáljuk, hogy olyan hasonló legyen a lambda N gén amino-terminális nukleotid szekvenciájához, amennyire csak lehetséges, mivel a lambda N gén szekvencia hatékony riboszóma beinduláshoz és transzlációhoz való riboszómális kötőhely szekvenciát tartalmaz. Ezen kívül az alkálikus foszfatáz szignál szekvencia második aminosava, a bázisos lizin aminosav savanyú aminosavvá, aszparaginsavvá változik.

1. ) Az EGF 0,17 kb-s EcoRI-BamHI fragmentumának előállítása

A pBM11/NDP/EGF plazmidot (30 ^g) 30 egység EcoRI-gyel emésztjük, majd 4 egység DNS polimeráz Klenow fragmentummal kezeljük, hogy tompa végeket alakítsunk ki. A DNS-t végül 30 egység BamHI-gyel kezeljük és az EGF gén 0,17 kb-s fragmentumát agaróz gélen végzett elektroforézissel eltávolítjuk. Az így tisztított DNS-nek egy tompává tett EcoRI helye van az 5' végén és egy BamHI túlnyúlása a 3' végén.

2. ) A pBM11/PAD 0,5 kb-s Pvul-HindlII fragmentumának előállítása

A pBM11/PAD plazmidot (le^g) 30 egység HindlII-mal emésztjük, majd Klenow-fragmentummal kezeljük, hogy a végeket tompává tegyük. A DNS-t azután Pvul-gyel emésztjük és a 0,5 kb-s Pvul-HindlII(tompa) fragmentumokat agaróz gélen végzett elektroforézis után elkülönítjük .

3. ) A pBM11/PAD 5,2 kb-s PvuI-BamHI fragmentumának előállítása ·· · · · · · · • · · · · · ··· • · · ····· · ··· · ·· · ··

- 80 A pBM11/PAD plazmidot (18^v(g) 30 egység Pvul-gyel, majd ezt követően 30 egység BamHI-gyel kezeljük. Az 5,2 kb-s fragmentumot agaróz gélen végzett elektroforézissel elkülönítjük.

4.) Ligálás és a pBM11/PAD/EGF elkülönítése

A 0,17 kb-s EcoRI(tompa)-BamHI fragmentumot, a 0,5 kb-s PvulHindlll(tompa) fragmentumot és az 5,2 kb-s Pvul-BamHI fragmentumot együtt ligáljuk és az így létrejövő keveréket kompetens E. coli HB101 transzformálására használjuk fel. A transzformánsokat átvizsgáljuk DNS szekvenciaelemzést alkalmazva, amint fentebb leírtuk.

A kívánt szekvencia/EGF területnek az alábbi szekvenciája van:

Szignál szekvencia ATGGATCAATCTACAATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACT MDQSTIALALLPLLFT

EGF CCAGTGACAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGAC PVTKANSDSECPLSHD

Nsil GGCTACTGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTG GYCLHDGVCMYIEAL

Sphl

GACAAGTACGCATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGCGAACGT

DKYACNCVVGYIGER

• ···· ···

TGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTAAGGATCC

CQYRDLKWWELRx.

Az idegen fehérje termelésének hatékonyságát a pBM11/PAD kifejező rendszerben és a fúziós termékből funkcionálisan aktív idegen fehérjék tisztításának képességét példaként pBM11/PAD/EGFet alkalmazva mutatjuk be. Méretkizárásos kromatográfia (TSK-250) után 10,3 mg aktív EGF fúziós polipeptidet nyerünk ki 23 g (8 liter) E. coliból, amely az EGF gén kifejezésére lett derepresszálva. Az EGF aktivitás 40 %-a a szignál szekvenciából hasított EDFből származik.

B. A pBM11/PAD/nVGFa előállítása

Szintetikus oligonukleotidokat tervezünk, hogy összekössük a VGFa szintetikus gént egy alkálikus foszfatáz módosított szignál szekvenciával optimális szignál szekvencia hasítási hely szolgáltatása céljából; ezek a természetes VGF szignál szekvencia hasítási helyétől közvetlenül lefelé levő többlet N-terminális gyököket kódolnak, amelyeket korábban többlet N-terminálisnak neveztünk. Az nVGFa szekvencia a megváltozott GTC és GYACRC szekvenciákat tartalmazza a GDC és GMYCRC VGF-szekvenciák helyett és az YQR szekvenciával fejeződik be a természetes PNT szekvenciától fölfelé. Ebben a kifejező rendszerben, a molekulák többségénél a szignál szekvencia az nVGFa-hoz rögzítve marad, fúziós fehérjét képezve az nVGFa-val a C-terminálisnál.

1.) A 0,5 kb-s, HindlII-mal és Pvul-gyel emésztett pBM11/PAD előállítása

A pBM11/PAD plazmidot HindlII-mal és Pvul-gyel emésztjük és a 0,5 kb-s fragmentumot gélen tisztítjuk. A HindlII hely a ····

- 82 módosított alkálikus foszfatáz szignál szekvencia C-terminálisánál helyezkedik el.

2. ) Az 5,2 kb-s Pvul-BamHI pBM11 plazmid fragmentum előállítása

A pBM11/NDP/VGFa plazmidot Pvul-gyel és BamHI-gyel emésztjük és az 5,2 kb-s fragmentumot gélen tisztítjuk.

3. ) A 170 bp-s Ncol(tompa)-BamHI szintetikus VGFa gén előállítása

A pBM11/NDP/VGFa plazmidot Ncol-gyel emésztjük és az 5' túlnyúló végeket S1 nukleázzal végzett emésztéssel eltávolítjuk.

Ez tompa véget képez a VGFa csonkított szintetikus gén első kodonjánál. Ezt a DNS-t azután BamHI-gyel emésztjük és a 170 bp-s Ncol (tompa)-BamHI fragmentumot gélen tisztítjuk.

4. ) Ligálás és a pBM11/PAD/nVGFa izolálása

A VGF105 és 106 oligonukleotidokat, a pBM11/PAD 0,5 kb-s HindlII-Pvul fragmentumát, az 5,2 kb-s Pvul-BamHI pBM11 fragmentumot és a 170 bp-s Ncol(tompa)-BamHI szintetikus VGFa gént együtt ligáljuk, DNS ligázt alkalmazva, és az így létrejött keveréket kompetens HB101 transzformálására alkalmazzuk. A transzformánsokat neomicinen szelektáljuk és restrikciós elemzéssel, valamint a Sanger-féle didezoxi technikát alkalmazva nukleotid szekvenciaelemzéssel átvizsgáljuk. Egy korrekt konstrukciót izolálunk, amely a módosított alkálikus foszfatáz gént az nVGFa génnel azonos keretben tartalmazza.

Szignál szekvencia ATGGATCAATCTACAATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGA MDQSTIALALLPLLFTPVT • · · · • · • ·

nVGF -->

CAAAAGCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTACTTCTCCGGAAATCACTAACGC

KADSGNAIETTSPEITNA

TACTACTGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGC

TTDIPAIRLCGPEGDGYC

KpnI Sphl

CTGCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCCGTTGCT

LHGTCIHARDIDGYACRÖS

EcoRI

CTCATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCG

HGYTGIRCQHVV LVDYQR

BamHI

TTAAGGATCC

Tér

VII. példa

A szóban forgó polipeptid kifejezése alkálikus foszfatáz szignál szekvenciával képzett fúziós fehérjeként

A. pBM11/PAK/nVGFa előállítása (alkálikus foszfatáz szignál szekvencia/nVGFa természetes VGF N-terminálisával, valamint GTC és GYACRC szekvenciákkal^ pBM11/PAD/nVGF-et mutagenizálunk in vitro £Morinaga és munkatársai: Biotechnology 2_, 636-643 (1984)J , hogy megváltoztassuk a szignál szekvenciában levő második aminosavat, nevezetesen az Asp(D) kodont visszaváltoztassuk Lys(K) kodonra, vagyis arra a • · · • ···· gyökre, amely a természetben található. Ez a mutagenezis Pvul helyet is vezet be a szignál szekvenciába.

Szignál szekvencia ATGGATCAATCTACAATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAA MDQSTIALALLPLLFTPVTK nVGF -->

GCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTACTTCTCCGGAAATCACTAACGCTACTACT

ADSGNAIETTSPEITNATT

KpnI

GACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGCCTGCATGGT

DIPAIRLCGPEGDGY CLHG

Sphl

ACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCCGTTGCTCTCATGGCTACACT

TCIHARDIDGYACRCSHGYT

EcoRI BamHI

GGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGTTAAGGATCC GIRCQHVVLVDYQR Tér

B. pBM11/PAK/EGF előállítása

Ebben a kazettában az EGF gén egy alkálikus foszfatáz szignál szekvenciával képzett fúziós termék része.

A pBM11/PAD/EGF plazmidot mutagenizáljuk in vitro, hogy megváltoztassuk a szignál szekvenciában levő második aminosavszekven85 ciát kódoló kodont, vagyis az Asp(D) kodont kicseréljük Lys(K) kodonra, vagyis arra a gyökre, amely a természetes szekvenciában található. Ez a mutagenezis egy Pvul helyet is vezet be a szignál szekvenciába.

Szignál szekvencia —> ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGA MKQSTIALALLPLLFTPVT

EGF -->

CAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGACGGCTACTGCCTGCA

KANSDSECPLSHDGYCLH

Nsil Sphl

TGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATGCAACTGCGTT

DGVCMYIEALDKYAC NCV

GTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGC

VGYIGERCQYRDLKWW ELR

BamHI

GTTAAGGATCC

C. A TacPak/EGF (alkálikus foszfatáz szignál szekvencia/humán EGF) előállítása

1.) Plazmid fragmentumok előállítása

A p135-1 plazmid a pDR540-ből (Pharmacia) származik és tar'· · · · • · · · • · ♦ · • · ·»··

• ··· ·· talmazza a cro gén SD-t és a BglII helyet a lac SD-től lefelé. A pDR540 olyan kifejező vektor, amely a trp-lac hibrid, promotort tartalmazza. A p135-1-et BglII-vel és BamHI-gyel emésztjük és bakteriális alkálikus foszfatázzal kezeljük.

A pBM11/PAK/EGF-et PvuII-vel és BamHI-gyel kezeljük és a

230 bprs fragmentumot, amely az alkálikus szignál szekvencia egy részét és a humán EGF-et kódolja, izoláljuk.

2.) A TacPakl és TacPak2 oligonukleotidek előállítása

A TacPakl és TacPak2 szintetikus oligonukleotidokat olyan túlnyúlással tervezzük, amely a p135-1 BglII helyével összeegyeztethető, továbbá olyan PvuII túlnyúlással, amely az alkálikus foszfatáz/EGF PvuII/BamHI fragmentumában levő PvuII hellyel öszszeegyeztethető. Az oligonukleotidokat Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer berendezésen szintetizáljuk.

BglII

I

Pvul

TacPakl 5'

GATCTATGAAACAATCTACGAT 3

TacPak2 3'

ATACTTTGTTAGATGC

5'

3.) Ligálás . ás a TacPak/EGF klón izolálása

A BglII-vel és BamHI-gyel emésztett p135-1-et, a 230 bp-s

PAK/EGF fragmentumot és a TacPakl és TacPak2 oligonukleotidokat ligáljuk DNS ligázt alkalmazva, transzformáljuk kompetens HB101be, és egy korrekt konstrukciót izolálunk DNS szekvenciaelemzéssel .

(pDR540 HindlII helye)

AAGCTTACTCCC ··· trp-35 (16 bp) lac-10 catccccctg[ttgaca] attaatcatcggctcg(tataatg) mRNS 5' lacl kötő hely lacSD

TGTGG/AATTGTG AGCGGATAACAATTTCACAC^AGGAj AACAGGATCACTA

Pvul croSD (11 bp)BglII [agga] GGTTCAGATCT

Szignál szekvencia —

ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGA

MKQSTIALALLPLLFTPVT

EGF

CAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGACGGCTACTGCCCTGCA

KANSDSECPLSHDGYCLH

Nsil Sphl

TGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATGCAACTGCGTT

DGVCMYIEALDKYACNCV

GTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGC

VGYIG ERCQYRDLKWWELR

BamHI

GTTAAGGATCC • ···· ·· · ·· ·· · · · · · · • · · · · · ··· • · · · ···· · ··· · ·· · ··

VIII. Példa

A szóban forgó polipeptid kifejezése alkálikus foszfatáz szignál szekvenciával képzett fúziós fehérjeként egy átírás termnációs területet tartalmazó kifejező kazettát alkalmazva

A. pTCPT/EGF előállítása (£trp-35]l6 bp [lac-1 ollacSPjl 1 bpfATGj/ alkálikus foszfatáz szignál/humán EGF/trans.termrNEO)

Ezt a plazmidot úgy tervezzük, hogy rendelkezzék a tac promotor elemekkel és hasznosítsa a cro SD-t a humán EGF kifejezésére az alkálikus foszfatáz szignál szekvencia mögött. Ennek pBR322 háttere van a neomicin rezisztencia génnel.

1. ) A TacPak/EGF 420 bp-s HindIII(tompa)-BamHI fragmentumának előállítása

A TacPak/EGF—et HindlII-mal emésztjük, majd a DNS polimeráz Klenow fragmentumával kezeljük, hogy tompa végeket alakítsunk ki. A DNS-t azután BamHI-gyel emésztjük és a tac promotor elemeket, valamint az alkálikus foszfatáz szignál szekvenciát és humán EGFet kódoló területet tartalmazó 420 bp-s fragmentumot agaróz gélelektroforézissel izoláljuk.

2. ) A pBM16t/NDP/VGFa 2,8 kb-s EcoRI(tompa)-BamHI fragmentumánk előállítása

A pBM16t/NDP/VGFa-t EcoRI-gyel emésztjük, majd Klenow-val kezeljük, hogy tompa végeket alakítsunk ki. A DNS-t azután BamHIgyel emésztjük és a 2,8 kb-s fragmentumot izoláljuk. Ez a DNS fragmentum tartalmazza a pBR322 origót, a neomicin rezisztencia gént, de Ncol helyének eltávolításával, és a 32. gén-szerű átírás-terminátőrt a BamHI helyétől lefelé.

3. ) Ligálás és a pTCPt/EGF izolálása

A pBM16t/NDP/VGFa 2,8 kb-s EcoRI(tompa)-BamHI fragmentumát • · · ··· ··· • · · ····· · •••· ·· · ·· ligáljuk a TacPak/EGF 420 bp-s HindIII(tompa)-BamHI fragmentumához és az így létrejövő DNS-t alkalmazzuk kompetens JM109(lacI ) transzformálására. Egy korrekt konstrukciót izolálunk neomicinre való rezisztenciája és DNS szekvenciaelemzése alapján.

(pDR540 HindlII helye)

I

AAGCTTACTCCC trp-35 (16 bp) lac-10 catcccctg[ttgaca]ATTAATCATCGGCTCG(TATAATG) mRNS 5' lacl kötő hely lacSD

TGTGG/AATTGTG AGCGGATAACAATTTCACAC ^AGGaJ AACAGGATCACTA

Pvul croSD (11bp)BglHszignál szekvencia —>

[ággá} GGTTCAGATCT ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCC MKQSTIALALLP

EGF -->

CACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTC LLFTPVTKANSDSECPLS

Nsil

TCATGACGGCTACTGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGAC HDGYCLHDGVCMYIEALD

Sphl

AAGTACGCATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGC

KYACNCVVGYIG

BamHI GAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTAAGGATCCGTGA ERCQYRDLKWW ELR*

Trans.Term

CTAATTGGGGACCCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAACGATC

B. pTCPt/nVGFa előállítása ([trp~35]l6 bp [lac-1 p] flacSP] [croSp] bp[ATG] /alkálikus foszfatáz szignál/n-terminális VGFa GTC és GYACRC szekvenciával/trans.term.-NEO)

Ez a plazmid rendelkezik a tac promotor elemekkel és a cro SP-t alkalmazza az olyan módosított VGF gén kifejezésére, amely N-terminális kiterjesztéssel rendelkezik az alkálikus foszfatáz szignál szekvenciától lefelé. Ennek a plazmidnak pBR322 háttere van neomicin rezisztencia génnel.

1. ) A pBM11/PAK/nVGFa 350 bp-s Pvul-BamHI fragmentumának előállítása

A pBM11/PAK/nVGFa plazmidot Pvul-gyel és BamHI-gyel emésztjük és a 350 bp-s fragmentumot gélelektroforézissel izoláljuk. Ez a fragmentum tartalmazza az alkálikus foszfatáz szignál szekvencia legnagyobb részét és az nVGFa gént.

2. ) A pTCPt/EGF 2,8 kb-s Pvul-BamHI fragmentumának előállítása

A pTCPt/EGF plazmidot Pvul-gyel és BamHI-gyel emésztjük és a 2,8 kb-s fragmentumot gélelektroforézissel izoláljuk.

3.) Ligálás és a pTCP/nVGFa izolálása

A 2,8 kb-s fragmentumot és 350 bp-s fragmentumot ligáljuk

DNS ligázt alkalmazva és ezt a DNS-t alkalmazzuk kompetens JM109 (laclq) transzformálására. Egy korrekt konstrukciót izolálunk restrikciós elemzést alkalmazva.

(pDR540 HindlII helye) l

AAGCTTACTCCC trp-35 (I6bp) lac-10 catccccctg[ttgaca] ATTAATCATCGGCTCG(TATAATG) mRNS 5' lacl kötő hely lacSD

TGTGG/AATTGTG AGCGGATAACAATTTCACAC{aGGa}AACAGGATCACTA

Pvul croSD (llbp)BglII Szignál szekvencia —> {agga} ggttcagatct atgaaacaatctacgatcgccctcgcacttctccc

MKQSTIALALLP nVGF -->

ACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTACT

LLFTPVTKADSGNAIETT

TCTCCGGAAATGACTAACGCTACTACTGAGATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCC

SPEITNATTDIPAIRLCGP

KpnI

CGGAAGGCGACGGCTACTGCCTGCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGA

EGDGYCLHGTCIHARDID

- 92 Sphl EcoRI

CGGCTACGCATGCCGTTGCTCTCATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTT

GYACRCSHGYTGIRCQH-V

BamHI Trans.

GTTCTGGTCGACTACCAGCGTTAAGGATCCGTGACTAATTGGGGACCCTAGAGGT VLVDYQRx

Term.

CCCCTTTTTTATTTTAAAACGATC

C. pTNPt/EGF előállítása ( ftrp~35]l 7bp[lac-1 p]f nSD]8bp [aTg]/alkálikus foszfatáz szignál/humán EGF/trans.term.-NEO)

Ezt a plazmidot úgy tervezzük, hogy rendelkezzék a tac promotor elemekkel és az N-gén SD-t hasznosítsa a humán EGF kifejezésére az alkálikus foszfatáz szignál szekvencia mögött. Ennek pBR22 háttere van a neomicin rezisztencia génnel.

1. ) A pTNPt 2,8 kb-s Pvul-BamHI fragmentumának előállítása

A pTNPt plazmidot Pvul-gyel és BamHI-gyel emésztjük és a 2,8 kb-s fragmentumot gélelektroforézissel izoláljuk.

2. ) A pBM11/PAK/EGF 300 bp-s Pvul-BamHI fragmentumának előállítása

A pBM11/PAK/EGF plazmidot Pvul-gyel és BamHI-gyel emésztjük és a 300 bp-s fragmentumot izoláljuk.

3. ) Ligálás és a pTNPt/EGF izolálása

A 2,8 kb-s fragmentumot és a 300 bp-s fragmentumot ligáijuk DNS ligázt alkalmazva és a DNS-t kompetens JM109(LacIq)-ba transzformáljuk. Egy korrekt konstrukciót izolálunk restrikciós elemzéssel és DNS szekvenciaelemzéssel.

(pBM11 EcoRI helye)

I

GAATTACTCCCCATCC

SstI trp-35 (17bp) lac-10 5'lac cctg[ttgaca] ATTAATCATCGAGCTCG(TATAAG)TGTGG/AATG

BsmI mRNS —> n mRNS —>

TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGCATTCAAAGCAGAAGGCTTTGGGGTGTGT

GATACGAAACGAAGCATTGGCCGTAAGTGCGATTCCGGATTAGCTGCCAATGTGC

CAATCGCGGGGGGTTTTCGTTCAGGACTACAACTGCCACACACCACCAAAGCTAA

Pvul nSD (8bp) Szignál szekvencia -->

ctgac [agga^gaatccag ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTC

MKQSTIALALL

EGF -->

CCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGT

PLLFTPVTKANSDSECPLS

Nsil

CTCATGACGGCTACTGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGA

HDGYCLHDGVCMYIEALD

- 94 Sphl

CAAGTACGCATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGT

KYACNCVVGYIGERCQYR

BamHI BamHI

GACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTAAGGATCCGTGACTAATTGGGGA DLKWWELRx (pBM11 BamHI helye)

Trans. Term.

CCCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAACGATCC

IX. példa

Növekedési faktor gének összeállítása eukarióta sejtekben való kifejeződéshez

A. pRSV/VGF plazmid előállítása

Ennek a plazmidnak az átfertőzése kínai hörcsög petefészeksejtbe természetes VGF termelését eredményezi.

(a) HindIII(tompa)-BglII(tompa) pRSV előállítása. A pRSV plazmidot HindlII-mal és BglII-vel emésztjük és a 4 kb-s fragmentumot gélen tisztítjuk. A túlnyúló végeket DNS polimeráz Klenow fragmentummal tompává tesszük, majd az 5' foszfátokat borjúbél alkálikus foszfatázzal eltávolítjuk.

(b) Egy, a VGF gént tartalmazó Ddel fragmentum előállítása. Vaccinia DNS szubklónozott genom fragmentumait Ddel-gyel emésztjük, a túlnyúló végeket Klenow-fragmentumot alkalmazva tompa végűvé tesszük, és egy 550 bp-s Ddel fragmentumot gélen tisztítunk.

(c) Ligálás és pRSV/VGF izolálása. A pRSV 4 kb-s HindlII • ···· ·· · ·· •· ♦ · · · · · • 9 · · · · ··· • · · ····· * ··· ·· · ··

-95(tompa)-BglII(tompa) fragmentumát és a Vaccinia DNS 550 bp-s (tompa) fragmentumát együtt ligáljuk DNS ligázt alkalmazva és a transzformánsokat ampicillinnel szelektáljuk, majd restrikciós elemzéssel átvizsgáljuk. Egy korrekt konstrukciót izolálunk és ezt pRSV/VGF-nek nevezzük el.

(d) CHO sejtek átfertőzése pRSV/VGF-fel pRSV/VGF plazmidot együtt fertőzünk át pRSV plazmiddal kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekbe kalcium-foszfátos kicsapást alkalmazva. A transzfektánsokat Southern pont-folt (dot-blot) hibridizálással átvizsgáljuk és egy pozitív kiónt izolálunk; ezt pRSV/VGF52-nek nevezzük.

B. pAc/VGF plazmid előállítása

Egy további kifejező rendszer, amelyet VGF rekombináns fehérje kifejezéséhez alkalmazunk, egy rovar rendszer (lásd Maeda és munkatársai, valamint Carbonell és munkatársai fentebb idézett munkáit). Az egyik ilyen rendszerben Autographa califomica nukleáris polihedrózis vírust (AcNPV) alkalmazunk vektorként, hogy idegen géneket kifejezzünk. A vírus Spodoptera frugiperda sejteken növekszik. A burkolati gént a vírus nem-esszenciális területeibe (pl. a polihedrin génbe) klónozhatjuk és egy AcNPV promotor (pl. a polihedrin promotor) szabályozása alá helyezhetjük. A VGF gén sikeres beiktatása a polihedrin gén inaktiválását és egy nem beburkolt rekombináns vírus termelését eredményezi (vagyis olyan vírusét, amelyből hiányzik a polihedrin gén által kódolt fehérje-jellegű burok). Ezeket a rekombináns vírusokat alkalmazzuk ezután Spodoptera frugiperda sejtek fertőzésére, amelyekben a beiktatott gén kifejeződik.

A szóban forgó VGF gént egy rovarsejt rendszerhez megfelelő promotor szabályozása alá helyezzük. A pAc6lO plazmid tartalmazza a polihedrin gént egy olyan plazmid vektorba klónozva, amelynek ampicillin rezisztencia markerja van. Többcélú kapcsolót.’ (polilinkert) iktatunk be ebbe a génbe, amely 50 bázissal van lefelé a polihedrin gén átírási rajthelyétől és 7 bázissal van az első ATG előtt. A VGF gént megfelelő polilinker helybe klónozzuk úgy, hogy a polihedrin promotor szabályozása alatt legyen. Az ATG iniciációs metionin kodon és a transzlációs terminációs kodonok a VGF gén megfelelő kodonjai; az átírási rajthelyek és a poliadenilező szignálok a polihedrin gén megfelelő helyei illetve szignál jai.

(a) pAc6lO Smal-BamHI fragmentumának előállítása. A pAcölO plazmidot Smal-gyel és BamHI-gyel emésztjük (b) A VGF gén HindlII)(tompa)-BglII fragmentumának előállítása . A pRSV/VGF plazmidot HindlII-mal emésztjük és a túlnyúló végeket tompává tesszük a Klenow-fragmentumot alkalmazva. A DNS-t azután BglII-vel emésztjük és az 560 bp-s fragmentumot gélen tisztítjuk.

(c) Ligálás és a pAc/VGF izolálása. A pAc6lO Smal-BamHI fragmentumát és a pRSV/VGF 560 bp-s, a VGF gént tartalmazó fragmentumát együtt ligáljuk DNS ligázt alkalmazva, és a transzformánsokat restrikciós elemzéssel átvizsgáljuk. Egy korrekt konstrukciót izolálunk, ezt pAc/VGF-nek nevezzük el.

(d) Sf9 sejtek átfertőzése pAc/VGF-fel pAc/VGF plazmidot AcNPV vad típusú baculovírus DNS-sel együtt fertőzzük Sf9 rovarsejtekbe (Spodoptera frugiperda). A transzfektánsokat átvizsgáljuk okkluzió-negatív fenotípusokra tarfolt-vizsgálatokban. Egy okkluzió-negatív tarfoltot izolálunk • · ··· · · · • · ····* ·

- 97 és egymás után ötször elvégzett tarfolt-tisztítás után nagytiterű rekombináns vírus készletet állítunk elő.

C. pAC/SFGF előállítása

A természetes Shope fibróma vírus növekedési faktor Baculovírus kifejezése (a) BamHI-gyel és Smal-gyel emésztett pAc610 előállítása pAcőlO plazmidot emésztünk BamHI-gyel és Smal-gyel. Az Smal hely ebben a plazmidban a baculovírus polihedrin gén promotorból lefelé helyezkedik el.

(b) A Shope fibrőma vírus genom DNS 430 bp-s HincII-Sau3a fragmentumának előállítása. A Shope fibróma vírus genom DNS 19 kb-s BamHI C-fragmentumának 3,7 kb-s BglII fragmentumát egy BamHIgyel emésztett SP64 plazmidba klónozzuk, és ezt SP64/3«7-nek nevezzük. Az SP64/3-7 plazmidot HincII-vel emésztjük és az 1 kb-s HincII fragmentumot gélen tisztítjuk. Az 1 kb-s fragmentumot azután Sau3a-val emésztjük és a 430 bp-s HincII-Sau3a fragmentumot gélen tisztítjuk.

(c) Ligálás és a pAc/SFGF izolálása. A BamHI-gyel és Smalgyel emésztett pAc6lO-et ligáljuk a 430 bp-s, az SFGF gént tartalmazó HincII-Sau3a fragmentumhoz, és az így keletkezett keveréket kompetens E. coli HB101-be transzformáljuk. A transzformánsokat restrikciós elemzéssel átvizsgáljuk és egy korrekt konstrukciót izolálunk; ezt pAc/SFGF-nek nevezzük.

X. példa

Polipeptidek előállítása

A. VGF és TGF szilárd fázisú szintézise

1.) Szintetikus VGF fragmentum. A csonkított VGF-nek, amely a DIPAIR szekvenciával kezdődik és az LVDY szekvenciával végződik, « · · · * · ··· • ♦ · · ♦·· · · • · · * ♦♦ · «♦ megfelelő szekvenciát Applied Biosystems Model 430A Peptide Synthesizer berendezésen állítjuk össze, standard munkamenetet alkalmazva. A végső peptid gyanta kezelése folyékony HF-fel standard alacsony-magas (low-high) körülmények között adja a védőcsoportoktól mentesített nyers pepiidet. A peptidet PBE94-en (Pharmacia) kromato-fókuszálásnak vetjük alá. A részlegesen tisztított peptidet pH 6,5-nél eluáljuk. Rövid kezelés 0,2 n nátriumhidroxiddal eltávolítja a ciszteint védő (etil-karbamoil) csoportokat és a peptid oxidált és redukált glutation jelenlétében oxidálódik. A tisztítás gélszűréssel és -HPLC-vel nagy mértékben tisztított VGF-et eredményez, amelynek szekvenciája az alábbi:

DIPAIRLCG'PEGDGYCLHGDCIHARDIDGMYCRCSHGYTGIRCQHVVLVDY

2.) Szintetikus humán és patkány TGF-»(. Humán és patkány TGF-/-t szintetizálunk kémiai úton, lényegében úgy, ahogyan azt fentebb a VGF-nél leírtuk; ezt számunkra egyébként a Penninsula Labs szolgáltatja.

B. Prokarióta sejtekben előállított rekombináns polipeptidek izolálása

1.) pBM-alapú vektorokban előállított növekedési faktorok, a PL promotort és a ts Cl represszort alkalmazva

A pBM11/NDP/növekedési faktor plazmidokat tartalmazó E. coli B(HB101) törzset Luria tápközegen növesztjük 30°C hőmérsékleten. A tenyészet sűrűségét 550 nm-nél mérjük, és amikor a sűrűség eléri a 0,7-0,9 abszorbanciát, a növekedési faktor fúziós fehérje szintézisét indukáljuk olyan 'módon, hogy a hőmérsékletet 42°Cra emeljük. A tenyészetet ezen a hőmérsékleten inkubáljuk 5-20 órán át, majd a baktériumokat centrifugálással izoláljuk és felhasználásig -70°C hőmérsékleten fagyasztjuk.

- 99 • ··· · ·· · ·· ·« · · · · · · • « · · · · ν·« • * ·«♦·»· * ·· · * ·· · ··

A rekombináns fehérje izolálásához a sejteket felengedtetjük 0,05 mól/1 NaH₂P0₄-et (pH 7,2), 0,5 mól/1 NaCl-t és 0,01 mól/1 EDTA-t tartalmazó pufferban. 150 ml puffért használunk 50 g baktérium feldolgozásához. A sejteket ultrahangos kezeléssel összezúzzuk, jégen 15 percen át végezve a kezelést, 1/4 hüvelykes (r^0,635 cm) szondát és 50 % gerjesztést alkalmazva 60 wattnál. A sejtek szétzúzását követően az oldhatatlan fehérjét centrifugálással összegyűjtjük, a centrifugálást GSA rotorban végezve 12000 fordulat/percnél 90 percen át. Az üledéket, amely az oldhatatlan fehérjét tartalmazza, ezután újra szuszpendáljuk 50 ml 6 mól/literes guanidin-hidroklorid oldatban. Az oldhatatlan anyagot 2 órán át 25000 fordulat/perccel Beckman 30 típusú ultra centrifuga rotorban végzett centrifugálással összegyűjtjük. A felülúszót összegyűjtjük és -20°C hőmérsékleten tároljuk a további felhasználásig.

A fúziós fehérje tisztítását vagy Sephacryl 8300, vagy Fractogel HW-55 oszlopon végezzük, amely oszlopok 1 mól/1 guanidin hidrokloriddal vannak kiegyensúlyozva. A fúziós fehérjét tartalmazó frakciókat olyan frakciókként azonosítjuk, mint amelyek a szintetikus gén által kódolt polipeptid molekulatömegével egybevágó molekulatömeggel bírnak, amint ezt 15 %-os poliakrilamidkarbamid gélen meghatározzuk.

Abból a célból, hogy a rekombináns növekedési faktor aktív formáját kapjuk meg, a fúziós fehérjét engedjük visszatekeredni olyan módon, hogy inkubáljuk 50 mmól/1 trisz.HCl pufferban (pH 8,7), amely 1 mól/1 guanidin-hidrokloridot, 1,25 mmól/1 redukált glutationt és 0,25 mmól/1 oxidált glutationt tartalmaz, 4°C hőmérsékleten 3-10 napon át. A növekedési faktor biológiai aktivi- • · · · · · V·· • · · · ♦·*« » ·« · ·« · ··

100 tását követjük versengő receptor-kötési vizsgálattal, amint fentebb leírtuk (lásd az I.C. példát). Amikor az aktivitás maximális szintjét elérjük, a fehérjét desztillált vízzel szemben dializáljuk, és liofilizáljuk, hogy száraz formát kapjunk.

Ha a vezető szekvenciát szükséges eltávolítani, a fehérjét elhasítjuk vagy 70 %-os hangyasavban újra szuszpendálva és 3 napon át 40°C hőmérsékleten inkubálva, vagy egy éjszakán át szobahőmérsékleten inkubálva cianogén-bromid 100-szoros mólfölöslegével. A hasított terméket desztillált vízzel szemben dializáljuk és liofilezéssel szárítjuk.

Abból a célból, hogy tovább tisztítsuk a rekombináns növekedési faktort, a növekedési faktort újra szuszpendáljuk 40 % acetonitrilt és 0,1 % TFA-t tartalmazó oldatban és HPLC-vel tisztítjuk, Bio-Rad TSK-250 oszlopot alkalmazva. A növekedési faktort tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és tovább tisztítjuk fordított fázisú HPLC-t alkalmazva, vagy Waters /1 Bondapak C-18-at vagy Rainin Dynamax C-8-at. Az eluáló anyag 0,1 % TFA-t tartalmazó 2040 % acetonitril lineáris gradiens. A receptor kötő aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, liofilezzük, és felhasználásig -20°C hőmérsékleten tároljuk.

(a) TGF és módosított TGF (i) N/TGF

Rekombináns módosított humán TGF-et állítunk elő pBM11/N/TGF plazmidból; ez az N-gén 33 aminosavát tartalmazza az N-terminálisnál, és tartalmaz egy szekvencia-módosulást, amennyiben QEEK van benne a természetes humán szekvencia QEDK-ja helyett.

(b) Módosított és csonkított VGF (i) PAD/nVGFa • ···· ·· · ·· ·· · · · · · · • · · · · 4 ··· • · · · ···· · *« · · 99 · *·

- 101 Rekombináns módosított VGF-et állítunk elő a pBM11/PAD/nVGFaból; ez tartalmazza a VGF többlet N-terminális szekvenciáját, valamint a GTC és GYACRC szekvenciákat tartalmazza a természetes VGF GDC és GMYCRC szekvenciái helyett. Az nVGFA fragmentumot a módosított alkálikus foszfatáz szignállal az N-terminálisnál képzett fúziós fehérjeként fejezzük ki, ez a C-terminálisnál az YQR szekvenciánál meg van csonkítva.

(ii) NDP/VGFa

Rekombináns módosított VGF-et alakítunk ki a pBM11/NDP VGFa plazmidból, amely fehérje a VGF-ben levő DIPAIR szekvenciánál kezdődik és az YKQR szekvenciánál végződik. Ez módosított szekvenciákkal bír, mégpedig GTC-vel és GYACRC-vel a természetes VGF szekvenciában található GDC és GMYCRC helyett. A VGFa fragmentumot fúziós fehérjeként fejezzük ki, ahol a fúziós fehérje az N gén 32 aminosavával képződik az N-terminálisnál, valamint a savlabilis aszparaginsav-prolin dipeptiddel.

(iii) VGFa

A VGF fragmentumot úgy készítjük, amint a fenti 2 b. pontban leírtuk, majd a fúziós fehérje savas kezeléssel végzett hasítása után HPLC-vel tovább tisztítjuk.

(iv) NDP/VGFA

Rekombináns módosított VGF-et állítunk elő pBM11/NDP/VGFA plazmidból; ez a VGF-ben levő a DIPAIR szekvenciával kezdődik és az YKQR szekvenciával végződik, és a módosított GTC és GYACVC szekvenciákkal rendelkezik a természetes VGF szekvenciában levő GDC és GMYCRC helyett. A VGFA fragmentumot fúziós fehérjeként fejezzük ki, ahol a fúziós fehérje az N-gén 32 aminosavával képződik az N-terminálisnál, valamint a sav-labilis aszparaginsav• ·« ··

- 102 prolin dipeptiddel.

(c) Kiméra TGF/VGF hibridek (i) N/TTV (TGF/TGF/VGF)

Rekombináns módosított TTV-t állítunk elő pBM11/N/TTV-ből; ez a humán TGF aminosavszekvenciáját tartalmazza a QEEK szekvencia kivételével a gén amino-terminális kétharmadában, a QEEK szekvencia a természetes humán QEDK szekvencia helyett van. A karboxi terminális a VGF aminosavszekvenciájából származik és az YQR szekvenciával fejeződik be a természetes PNT szekvenciától felfelé. A TTV fragmentum az N-gén 33 aminosavával az N-terminálisnál képzett fúziós fehérjeként fejeződik ki.

(ii) NDP/TTV

Rekombináns TTV-t állítunk elő a pBM11/N/TTV plazmádból és ugyanúgy módosítjuk, ahogyan ezt az (a) pontban leírtuk, azzal a kivétellel, hogy a TTV fragmentum az N-gén 32 aminosavával az N-terminálisnál képzett, valamint a sav-labilis aszparaginsavprolin dipeptiddel képzett fúziós fehérjeként fejeződik ki.

(iii) NDP/VTV

Módosított rekombináns VTV-t állítunk elő pBM11/NDP/VTV plazmidból, amely a humán TGF aminosavszekvenciáját tartalmazza a középső tartományban, QEEK aminosavszekvenciával a természetes QEDK szekvencia helyett. Az N-terminális és C-terminális tartományok a megcsonkított VGF szekvenciából erednek és DIPAIR szekvenciával kezdődnek és YQR szekvenciával végződnek. A VTV fragmentum az N-gén 32 aminosavával az N-terminálisnál képzett és a savlabilis aszparaginsav-prolin dipeptiddel képzett fúziós fehérjeként fejeződik ki.

(iv) NDP/TVV

9 • · • · ,«···· · ·*· · »« · ··

- 103 -

Módosított rekombináns VTV-t állítunk elő pBM11/NDP/TVV-ből, amely a humán TGF aminosavszekvenciáját tartalmazza a gén N-terminális tartományában. A középső és C-terminális tartományok a csonkított VGF szekvenciából származnak és az YQR szekvenciával végződnek. Ezen kívül a szintetikus génnek van módosítása is GYACVC-re GMYCRC-ről. A TVV fragmentum az N-gén 32 aminosavával az N-terminálisnál képzett és a sav-labilis aszparaginsav-prolin dipeptiddel képzett fúziós fehérjeként fejeződik ki.

2.) A tac vagy lac promptorokat tartalmazó vektorokban előállított növekedési faktorok

A tac vagy lac promotorokból álló kifejező kazettákat tartalmazó bakteriális gazdaszervezeteket 30-37°C hőmérsékleten növesztjük A^qq = 0,2-0,8 optikai sűrűségig vagy LB tápközegben vagy kémiailag definiált tápközegben, pl. tiaminnal és glükózzal kiegészített M9 tápközegben. Megfelelő antibiotikum található a növesztő tápközegben, hogy kiválaszthassuk a kifejező kazettát tartalmazó gazdaszervezeteket. A baktériumtenyészeteket 100-1000 mmól/1 koncentrációban IPTG-vel indukáljuk, és 30°C hőmérsékleten növesztjük 16-24 órán át. lacl gén-hiányos kifejező kazettáknál a bakteriális gazdaszervezetek F-faktort hordoznak lacql génnel, ilyen pl. a JM109, XL1 , JM103, stb. A lacl gént hordozó kifejező kazettáknál a bakteriális gazdaszervezetekre példák a HB101, DH1, DH5, stb. Abban az esetben, ahol a bakteriális gazdaszervezetnek funkcionális lac operonja (lac⁺) van, a kifejező kazettát 1 % laktózzal lehet indukálni. Az indukciós periódus után növekedési faktorokat izolálhatunk vagy a tápközegből, vagy a sejtüledékből.

(a) A TacPak/EGF és pTcCPT/EGF kifejező kazettákból előállított humán EGF-et izolálunk a tápközegből aktív formában, eltá• ·»» · ·· · «* •4 · · · · · · * 4 · · · 4·♦· • · 4 · ····· ·* ν · 44 ···

- 104volított alkálikus foszfatáz szignál szekvenciával. Az aktív EGFnek mintegy 85 %-át találjuk a tápközegben, a többi viszont a sejtüledékkel van társulva. Ezek a kifejező kazetták 4 mg/1 aktív EGF-et termelnek. A sejteket a tápközegtől centrifugálással különítjük el és a tápközeget Amicon SY30 típusú, 30000 M^ kizárású spirális szűrőn engedjük át, majd Q-Sepharose oszlopon engedjük át, és a nagy mértékben tisztított humán EGF-et 20 mmól/1 NaPO^ (pH 7)-ben levő 0-0,5 mól/1 NaCl gradienssel eluáljuk. Egy másik módszer szerint a növekedési faktorokat a sejtüledékből ozmotikus sokk-kai vagy ultrahangos kezeléssel izolálhatjuk és lényegében azonos eljárással tisztítjuk, amint fentebb leírtuk.

(b) PAK/nVGFa

Rekombináns DNS-t állítunk elő a pTCPt/nVGFa kifejező kazettából. Az nVGFa-t a sejtüledékből ultrahangos kezeléssel izoláljuk és kimutatjuk erről, hogy a teljes baktériumfehérjének mintegy 40 %-át alkotja.

C. A természetes gének eukarióta kifejezésével termelt VGF és 8FGF izolálása

1.) VGF előállítása majomvese sejtekben

Természetes VGF-et állítunk elő majomvese sejteket Vaccinia vírussal fertőzve. Cercopithecus majom vese (BBC-1) sejt egyrétegeit fertőzzük 15 tarfolt-képző egység (pfu)/sejt tisztított VV-vel ^WR törzs Hela sejtekben növesztve és szacharóz sűrűséggradiens ülepítéssel tisztítva, lásd Moss B.: a Gene Amplification and Analysis c. kiadványban, szerkesztők: Chirickjian J. G. és Papis T.Ö.; kiadó: Elsevier/North-Holland, New York; 2. kötet, 253-266 (1981. A fertőzött sejteket 37°C hőmérsékleten inkubáljuk mintegy 1 ml, 2 % borjúembrió-szérummal kiegészített ·*»

- 105 Eagle-féle alap-tápközeggel 2.10θ sejtre számítva. Az ál-fertőzött sejteket azonos módon kezeljük. Sejttenyészet felülúszókat derítünk kis sebességű centrifugálással és liofilezzük. A maradékot azután újra szuszpendáljuk 1 mól/1 ecetsavban és erőteljesen dializáljuk 0,2 mól/1 ecetsavval szemben. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk és a felülúszót liofilezzük, majd újra szuszpendáljuk az eredeti térfogat 1/100-ának megfelelő térfogatú 1 mól/literes ecetsavban, és 4°C hőmérsékleten tároljuk .

2. ) VGF előállítása CHO sejtekben

Természetes VGF-et állítunk elő a VGF gén fragmentumot tartalmazó pRSV/VGF plazmid átfertőzésével kínai hörcsög petefészek sejtekbe. Az átfertőzött sejteket szaporítjuk és mind a tápközeget, mind a sejteket átvizsgáljuk VGF jelenlétére immunkicsapással, N-terminális VGF peptid elleni antiszérumokat alkalmazva.

3. ) VGF előállítása selyemhernyóban, Baculovírus promotort alkalmazva (a) Transzformálás. Az AcNPV-hez a gazdasejt öpodoptera frugiperda (sf9). Abból a célból, hogy rekombináns vírus készletet állítsunk elő, a VGF-et tartalmazó plazmidot összekeverjük AcNPV DNö-sel és sf9 sejtekbe fertőzzük, a kalcium-foszfátos technikát alkalmazva. Rekombináns vírusokat izolálunk a tápközegből és tarfolt-tisztításnak vetjük alá sf9 sejteken. Rekombináns tarfoltokat azonosítunk hibridizálással, vizsgáló mintaként radioaktívan jelzett VGF DNö-t alkalmazva.

(b) Kife jeződés. Amikor a rekombináns vírust azonosítottuk, ezt sf9 sejteken szaporítjuk. A rekombináns vírus készletet azután sf sejtek fertőzésére alkalmazzuk, a sejteket lizáljuk, és a • * · · · 4··♦ • 4 4 444·«· •44 · ·» 4··

- 106 felülúszókat VGF fehérje termelésére átvizsgáljuk; ezt a fehérjét azután úgy tisztítjuk, amint fentebb a Vaccinia vírussal fertőzött emlős sejteknél fentebb leírtuk.

A rovarsejtekben termelt VGF jósolt szekvenciája az alábbi: DSGNAIETTÖPEITNATTDIPAIRLCGPEGDGYCLHGDCIHARDIDGMYCRCÖHGYTGIR CQHVVLMYQRSENPNTTTSYIPSPGIMLVLVGIIIITCCLLSVYRFTRRTKLPIQDMVVP

Egy potenciális glikozilező hely van a polipeptid N-terminális végétől számított 15· helyen.

Ez a 121 gyökös szekvencia az N-terminális szekvenciával kezdődik, amelyet közvetlenül a VV-vel fertőzött majomsejtekből tisztított VGF határoz meg (vagyis a VGF nyitott leolvasó keret 20. gyökénél) és a nyitott leolvasó keret utolsó gyökéig folytatódik. így ebből hiányzik a szignál peptid (a nyitott leolvasó keret 1-19 gyökei), de magában foglalja a transzmembrán szekvenciát (YIPSPGIMLVLVGIIIITCCLSVY).

A 121 gyökös peptid kiszámított molekulatömege 13304, a szénhidrátokat nem számítva. A Baculovírus által termelt VGF látszólagos molekulatömege 17000, jelentősen kisebb annál, mint amelyet a VV-vel fertőzött sejtekből kapunk, jelezve, hogy a két forma valószínűen eltérően dolgozódik fel. A Baculovírus által termelt VGF-ből hiányozhat az N-terminális szekvencia egy további része, vagy a C terminális szekvencia egy része, vagy mindkettő, és/vagy különbség lehet a glikozilezés típusában és terjedelmében .

4.) 8FGF előállítása selyemhernyóban, Baculovírus promotort alkalmazva (a) Sf9 sejtek átfertőzése pAc/SFGF-fel pAc/üFGF plazmidot AcNPV vad típusú Baculovírus DNü-sel • · »*···< · »Α· » ·· « ··

- 107 együtt fertőzünk Sf9 rovarsejtekbe (Spodoptera frugiperda). A transzfektánsokat átvizsgáljuk okklúzió-negatív fenotípusra tarfolt-vizsgálatokban. Egy okklúzió-negatív tarfoltot izolálunk és 5 egymást követő tarfolt tisztítás után magas titerű rekombináns vírus készletet állítunk elő. A rekombináns vírusról Southernelemzéssel kimutatjuk, hogy tartalmazza az SFGF gént.

D. Természetes EGF

1.) Természetes EGF-et izolálunk egér nyálmirigyekből, vagy a Collaborative Research-től megvásároljuk.

XI. példa

Aktivitásmérések

A. Mitogenicitás mérése

A mitogenezis vizsgálatokat az alábbiak szerint végezzük:

Újszülött fityma explantátumokból kapott diploid humán fibroblasztokat oltunk 3.10^ sűrűséggel üregenként (96 üreges lemezek, Nunclon, Roskilde, Dánia), és összefolyásig növesztjük Dulbecco által módosított Eagle-féle tápközegben (GIBCO), amely 10 % újszülött borjú szérumot tartalmaz. A tenyészeteket ezután 0,2 % újszülött borjú szérumot tartalmazó tápközegbe visszük át és két nappal később EGF-et (10 ng/ml) vagy vizsgálandó növekedési faktort (10 ng EGF ekvivalens/ml) adunk hozzá. 8 óra múlva a tenyészeteket jelezzük jód-2 ' -dezoxi-uridinnel (Amersham, 10

J^Ci/ml, 5 Ci/mg; 1 Ci = 37 GBq), és a TCA-oldhatatlan anyagba beépült izotóp mennyiségét meghatározzuk, amint ezt Twardzik és munkatársai leírták £Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 182, 5300-5304 (1985)] ·

B· Lágy agar telepnövekedés stimulálási vizsgálat

0,5 %-os agar (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michi « ···· «· · ··_ ·· φ φ · φ ♦ · • · φ · « * ·«· « · ······ · • φ φ · · * · ·φ

- 108 gan) növesztő tápközegben levő 0,5 ml-es alaprétegét 24 üreges

Costar szövettenyésztő lemezekre visszük fel. 0,3 %-os növesztő tápközegben levő agart, amely 1-1,5.10 sejt/ml NRK sejtet vagy más szóban forgó sejtvonalat és különböző koncentrációban vizsgálandó faktort tartalmaz, felülrétegezzük az agar alaprétegére. A lemezeket 37°C hőmérsékleten inkubáljuk nedvesített atmoszférájú, 5 % COg-t tartalmazó levegőben és 7 nap múlva újra tápláljuk 0,5 ml, növesztő tápközegben levő 0,3 %-os agar hozzáadásával, amely ugyanolyan koncentrációban tartalmazza a vizsgálandó faktort. Telepeket számolunk rögzítetlenül és festetlenül. A 6 sejtnél nagyobb telepek számát feljegyezzük.

C. EGF receptor kötés gátlási vizsgálat

A radioreceptor vizsgálatokat a következőképpen hajtjuk végre: ^²^I-vel jelzett EGF (^²^I-EGF) A430 sejtek mono-rétegein levő receptorához való kötését módosítjuk a Cohen és Carpenter által leírt eljárásból^Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 1317-1321 (1975)J. Sejteket (1.10^/üreg) rögzítünk a vizsgálat előtt 24 üreges lemezeken (Linbro, Flow Laboratories) 10 %-os formaiinnal foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban. A formaiinnal rögzített sejtek nem hámlanak le olyan könnyen a lemezekről, mint a nem rögzített sejtek, és az ismételt értékek így jobban egybe125 10 vágnak. Ilyen vizsgálati körülmények között a I-EGF (1.10 cpm/nmól) telíti a kötési vizsgálatot 3 nmól/ml-nél; a vizsgálatot 10 %-os telítési értéknél hajtjuk végre. A növekedési faktor koncentrációkat EGF ng ekvivalens/ml-ben fejezzük ki, ez az

25 a mennyiség, amely olyan I-EGF kötési gátlást alakít ki, mint amelyet egy ismert mennyiségű EGF alakít ki.

D. Radioimmunassay ·»♦

V··*

- 109 Minden 50^x1 reakciókeverék az alábbiakat tartalmazza: 20 mmól/1 nátrium-foszfát (pH 7,4), 200 mmól/1 NaCl, 40 mmól/1 di1 25 tiotreitol, 0,1 % szarvasmarha szérum albumin, 0,1 % NaN^, ^1vel jelzett peptid (2.10^ cpm), amely az jl-TGF 17 karboxi-terminális gyökének felel meg ^Linsley és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 356-369 (1985)j , antiszérum 1:5000 végső hígításban, és ha jelezzük, további alkotórészek. A reakciót antiszérum hozzáadásával indítjuk be és 23°C hőmérsékleten folytatjuk 90 percen át. Azonos térfogatú 10 % formaiinnal rögzített S. aureust (Pansorbin, Calbiochem) adunk ezután hozzá és az inkubálást folytatjuk további 30 percen át 23°C hőmérsékleten. Az immun-adszorbeált anyagot ülepítéssel kinyerjük és a kötött, 1 25

I-vel jelzett peptid mennyiségét mérjük. A kötött peptid menynyiségét a nem fajlagos kötéssel korrigálva mérjük antitest távollétében (kevesebb, mint az összes 5 %-a) és a maximális kötés százalékában fejezzük ki.

E. Sebgyógyulás . ) Közép-bőr hő-sérülések

Közép-bőr hő-sérüléseket idézünk elő érzéstelenített nőstény Yorkshire sertések (*^13,5 kg) hátbőrén, amely sertések háta előzőleg borotválva és kereskedelmi forgalomban levő szőreltávolítóval szőrtelenítve volt. Sárgaréz mintadarabot (3x3 cm, 147 g) 70°C hőmérsékletű vízfürdőben kiegyensúlyozunk és szoros kontaktusba hozzuk a bőrrel pontosan 10 másodpercen át. Az így létrejövő hólyagot azután eltávolítjuk. 5 közép-bőr égési sebet helyezünk el a hátgerinc mindkét oldalán, amelyek egymástól mintegy 1 hüvelyk (2,54 cm) távolságban vannak. Az égési sebeket naponta kétszer kezeljük mintegy 3 ml hordozó krémmel (Silvadene) önma·· • · · · « · • · · · ···· ··· · ·· ·

- 110 gában, vagy növekedési faktort tartalmazó hordozóval, vagy nem kezeljük. A természetes VGF-fel végzett kezelés 9. vagy 10. napja után a sertéseket érzéstelenítjük és a fedőréteget eltávolítjuk az égési sebekről. Az egyes égési sebekből, az újra hámosodott területekről biopsziás mintákat veszünk.

2.) Donor bőrátültetési közép-bőr sérülések hónapos törpe sertést (20,5 kg) érzéstelenítünk 20 mg/kg ketaminnal és 2 mg/kg Rompum-mal. A hátbőrt borotváljuk, betadinnel előkészítjük és fiziológiás sóoldattal alaposan átöblítjük. Hat 5x5 cm-es donor hely sorozatát alakítjuk ki Padgett derülátómmal 60/1000 hüvelykkel (1 hüvelyk = 2,54 cm), két 30/1000. hüvelykes metszetet véve ki. A helyi kezelés 1 ml fiziológiás sóoldatból áll 20 gramm Silvadene-ben, egyenletesen elosztva a baloldali hat seb között. A jobb oldalt 20 g Silvadene-ben levő 1 ml vizsgálandó növekedési faktorral kezeljük egyenletesen elosztva a hat seb között. Minden sebet befedünk nagy égési sebkötözővel, burkolattal és tapasszal. Az állatot érzéstelenítjük, amint fentebb leírtuk, a műtét utáni 1., 2., 3·, 4., 7., 8., 9·, 10. és 11. napon. A sebkötöző burkolatokat eltávolítjuk. A sebeket gyengéden átkenjük betadinnel és alaposan átöblítjük fiziológiás sóoldattal. A megfelelő szert alkalmazzuk és a sebeket felszabadítjuk, amint fentebb leírtuk.

XII. példa

Prokarióta sejtekben előállított rekombináns növekedési faktorok biológiai aktivitása

A. EGF receptor kötés

Ez a vizsgálat a molekulának azt a képességét határozza meg, hogy az EGF receptorhoz kötődik; ezt azzal a képességével mérjük, ···

- 111 hogyan gátolja az EGF kötődését receptorához. Minden eddig izolált növekedési faktor és kiméra növekedési faktor, akár módosított, akár csonkított, aktív az EGF receptor kötés gátlási vizsgálatban. Ezeknek az eredményeknek az összefoglalását az alábbi táblázatban adjuk meg:

TÁBLÁZAT

Rekombináns növekedési faktorok EGF receptor kötése

Peptid	Kifejező kazetta	Tisztaság	Kötés az EG receptorhoz
N/TGF-módosított csonkított fúziós termék	pBM11/N/TGF	95 %	Igen
PAD/nVGFa-módosított csonkított fúziós termék	pBM11/PAD/nVGFa	95 %	Igen
NDP/VGFa-módosított csonkított fúziós termék	pBM11/NDP/VGFa	95 %	Igen
NDP/VGFA-módosított csonkított fúziós termék	pBM11/NDP/VGFA	95 %	Igen
N/TTV-módosított csonkított kiméra fúziós termék	pBM11/N/TTV	95 %	Igen
NDP/TTV-módosított csonkított kiméra fúziós termék	pBM11/NDP/TTV	95 %	Igen

I • · • e ···

112

NDP/VTV-módosított tott kiméra fúziós	csonki- termék	pBM11/NDP/VTV	95 %	Igen
NDP/TVV-módosított tott kiméra fúziós	csonki- termék	pBM11/NDP/TVV	95 %	Igen
PAK/EGF		pBM11/PAK/EGF	95 %	Igen
EGF		pBM11/PAK/EGF	95 %	Igen
PAD/EGF		pBM11/PAD/EGF	95 %	Igen
EGF		pBM11/PAD/EGF	95 %	Igen
PAK/EGF		TacPak/EGF	95 %	Igen
EGF		TacPak/EGF	95 %	Igen
PAK/EGF		pTGPt/EGF	95 %	Igen
EGF		pTCPt/EGF	95 %	Igen

A természetes egér EGF-fel és az N/TTV bakteriálisán kifejezett rekombináns kiméra növekedési faktorral kialakított kötésgátlási görbék összehasonlítása (az N/TTV a lambda N-gén 32 Nterminális aminosavából és a módosított és csonkított TGF/VGF hibridből kialakított fúziós polipeptid) azt sejteti, hogy nincs különbség a kötési aktivitásban.

- 113

Β. Mitogén aktivitás

Számos tisztított növekedési faktor aktivitását vizsgáljuk át és az aktivitást minden esetben az EGF által okozott hatáshoz hasonlónak határozzuk meg. A vizsgált vegyületeket az alábbi táblázatban mutatjuk be:

TÁBLÁZAT

Növekedési faktorok mitogén aktivitása

Peptid Mitogén aktivitás*

TTV-módosított, csonkított, kiméra termék Igen

N/TTV-módosított, csonkított, kiméra fúziós termék Igen *3 Ί 2 5

H-timidin vagy I - dU beépüléssel mérve

C. Sebgyógyulás

1.) Közép-bőr sérülések

A természetes vagy szintetikus TGF, EGF és VGF, valamint a rekombináns növekedési faktorok hatását a közép-bőr sérülésekre úgy becsüljük meg, amint ezt a XI.E1. példában leírtuk. Az eredetileg égett terület, amely meggyógyult, százalékát számítógéppel ellátott telemetriával mérjük, és a százalékos újrahámosodást meghatározzuk. A kizárólag Silvadene-vel vagy Silvadene + EGF-fel végzett kezelés mintegy 50 % újrahámosodást^: eredményez, míg a szintetikus TGF-fel vagy természetes VGF-fel végzett kezelés mintegy 90 % újrahámosodást eredményez. Az EGF optimális kon114 • · · · · · • · · · · ··· * · ····· · • · · · · · centrációja az újra hámosodás előidézésére 1-1 0/(g/ml, míg a szintetikus TGF és természetes VGF 0,1 /tg/ml-nél ad maximális választ.

A fentebb leírt kísérletekhez hasonló kísérleteket végzünk, hogy megvizsgáljuk a TGF-nek, a VGF egyik módosított, csonkított formájának (VGFa), vagy a TGF és VGF egy módosított, csonkított kiméra fúziós termékének (TTV), amelyeket mind rekombináns technikával állítottunk elő baktériumokban, hatását a sebgyógyulásra. Ezek a rekombináns növekedési faktorok és hibrid növekedési faktorok éppen olyan mértékben gyorsítják a sebgyógyulást, mint a szintetikus TGF vagy a természetes VGF, és optimális koncentrációjuk 0,1 g/ml.

2.) Donor bőrátültetési közép-bőr sérülések

Módosított, csonkított VGFa-t vizsgálunk arra a képességére, hogy meggyorsítja a sebgyógyulást a donor bőrátültetési modellben. A kezelési munkamenet az, amelyet fentebb leírtunk (XI. példa), 1 ml VGFa-t (5/1 g/ml) alkalmazva 20 g Silvadene-ben. Naponta készítünk fényképeket. Az eredmények összefoglalását az alábbi táblázatban adjuk meg:

TÁBLÁZAT

Rekombináns VGFa hatása a sebgyógyulásra

A seb állapota x

Kezelés*	POD 7	POD 8	POD 9	POD 10
Fiziológiás	nagyon	nyílt bizo-	j órészt	gyógyult
sóoldat	nyílt	nyos gyógyu-	gyógyult

lássál

115

VGFa-módosított, nyílt, lát- jórészt gyógyult gyógyult csonkított termék ható hám- gyógyult képződés £

Silvadene a hordozóban

POD = napok száma a műtét után

A módosított, csonkított VGFa meggyorsítja a seb gyógyulását, ha a hordozó kontrollal hasonlítjuk össze. A fényképek (ezeket nem mellékeljük) jelentős különbségeket mutatnak a fiziológiás sóoldat és a VGFa között.

XIII. példa

Eukarióta sejtekben termelt VGF biológiai aktivitása

A. . Majomvese sejtekben (BSC-1) előállított VGF

1.) A BSC-1 sejtekből származó tápközeget 24 órával a VV-vel végzett fertőzés után megvizsgáljuk olyan anyag jelenlétére, amely

125 verseng a I-EGF-fel az EGF receptorban dús humán epideimoid karcinóma sejtekhez (A431) való kötésért. A VV-vel fertőzött sejtek jelentős aktivitást bocsátanak ki, amely EGF-fel verseng, és amely aktivitást VGF aktivitásnak nevezünk. Az ál-fertőzött BSC-1 kontroll tenyészetek megfelelő térfogatai csak minimális aktivitást tartalmaznak az EGF-fel való versengésben.

A VGF termelést követve a legkorábban vizsgált időpontban, órával a fertőzés után, VGF megnövekedett szintjeit figyeljük meg a tenyészközegben. 12 óra múlva ennek az aktivitásnak maximális mennyiségét találjuk meg a tenyészet felülúszójában, míg a 24. órában már csak csekély növekedést figyelünk meg.

• · · ·

- 116 A VGF termelés szintjéről úgy találjuk, hogy a vírusfertőzés tömegének függvénye, amint ezt az alábbi táblázatban bemutatjuk.

TÁBLÁZAT

A fertőzés tömegének hatása a VGF kibocsátásra

Vírus tömeg	Kibocsátott VGF
pfu/sejt	EGF ekvivalens ng/ml
0	—
10	2,7
20	4,5
40	6,1
80	10,1

pfu = tarfolt képző egység

BSC-1 sejtek tenyészeteit fertőzzük a jelzett pfu/sejt arányban, és a felülúszókat (mintegy 1 ml/2.10° sejt) 24 órával a fertőzés után kinyerjük. Az egyes mintákat savanyítjuk, liofilezzük és két párhuzamosban vizsgáljuk EGF-re vonatkozó radioreceptor vizsgálatban, amint ezt Delarco és Todaro leírták ^Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 401-405 (1978)J .

2.) A VGF részleges tisztítása

Az EGF-fel versengő VV-vel fertőzött BSC-1 sejtekben talált aktivitást részlegesen tisztítjuk savval extrahált tenyészet felülúszókból 24 órával a fentebb leírt fertőzés után. A felülúszókból kapott savval szolubilizált polipeptideket (10,5 mg) 1 mól/1 ecetsavval kiegyensúlyozott Biogel P10 oszlopra visszük

117 fel és az egyes frakciók mintáit EGF-fel versengő aktivitásra vizsgáljuk. A nagyobb aktív csúcsot (42. frakció) valamivel az

M 29000 szénsavanhidráz marker után eluáljuk M 25000 látszólar r gos molekulatömeggel. A molekulatömeget megerősítjük egymás után (tandem) kapcsolt Bio-Sil TÖK 250 HPLC méretkiválasztó oszlopok alkalmazásával, amelyek mindegyikénél az aktivitás fő csúcsa az 25000 fehérje marker területében van. 1 mikrogramm részlegesen tisztított VGF ekvivalens 90 ng EGF-fel a radioreceptor versengési vizsgálatban.

3.) VGF további tisztítása

A gélszürő oszlopról összegyűjtött frakciókat (25-35) vákuumcentrifugálással koncentráljuk, újra szuszpendáljuk 0,05 % trifluorecetsavban (TFA), derítjük és 3,9 mm x 30 cm // Bondapak C^q oszlopba injektáljuk (Waters, Milford, Massachussets). Peptideket eluálunk 20-60 % acetonitril lineáris gradiensével 0,05 %os TFA-ban 1,0 ml/perc áramlási sebességnél 22°C hőmérsékleten. Az egyes funkciók alikvotjait radioreceptor vizsgálatban vizsgáljuk EGF-versengő aktivitásra. A csúcs-aktivitásnak megfelelő pepiidet összegyűjtjük és hígítjuk 0,05 % TFA-val, és újra injektáljuk Bondapak oszlopba és eluáljuk izokratikus körülményeket alkalmazva. Az acetonitril koncentráció mintegy 22-25 %.

A 15 pfu VV/sejt mennyiségben fertőzött BöC-1 sejtek által termelt VGF szintek összehasonlítását a retrovírussal transzformált: , sejtek által termelt o(-TGF szintekkel az alábbi táblázatban mutatjuk be.

TÁBLÁZAT

VGF biológiai aktivitásának összehasonlítása <4-TGF-fel és

EGF-fel • ·

EGF receptor kötés

DNS szintézis

Rögzítéstől független sejtnövekedés stimulálása indukciója

Növekedési	EGF ekvivalens	[125l]ldU béé-	Lágy-agar
faktor'	ng/ml tápközeg	pül és (cpm/edény)	telepek/lemez
Semmi	—	1779	2 20
VGF	2,3	3760	108
TGF-4.	0,2	NT	294
EGF	___	8462	346

NT = nem vizsgáltuk

VGF-et (90 EGF ekvivalensig fehérje) tisztítunk gélszűréssel, ezt eluálás követi Ο^θ JA, Bondapak oszlopról (Waters Associates). Az ol-TGF-et Synder- Theilen macska szarkóma vírussal transzformált Fisher patkányembrió sejtekből tisztítjuk, amint ezt Marquardt és munkatársai leírták ^Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4684-4688 (1983)^· Az EGF-et egér állkapocs alatti mirigyből tisztítjuk [Cohen és munkatársai: J. Bioi. Chem. 255, 41834-41842 (1980)J.

25

Az EGF ekvivalens mennyiségi meghatározása standard I-EGF kötés versengési görbén alapul, amint ezt leírtuk.

A mitogenezis vizsgálata a már leírtak szerint történik; diploid humán fibroblasztok nyugvó tenyészeteit kezeljük 10 ng tisztitott EGF/ml-rel vagy ugyanennyi EGF-fel ekvivalens VGF/ml-rel.

A beépült jód dezoxi-uridin^ i? IdU) értékek három párhuzamos meghatározás átlagát képviselik.

A lágy-agar telepek száma olyan telepek átlagos számát képviseli, amelyek minimum 20 NRK-t tartalmaznak hat véletlenszerű kis erejű mezőnként 10 nappal a beoltás (1,5.10^ sejt/ml) után, • · ·· ·· · ·· • · ··· ··· • · ····· ·

119 tisztított EGF-fel (5 ng/ml) vagy ugyanilyen mennyiségű EGF-fel ekvivalens VGF-fel milliliterenként és 2,0 ng TGF-β -val milliliterenként, amelyet humán vérlemezkékből tisztítunk olyan módon, ahogyan ezt Assoian és munkatársai leírták £j. Bioi. Chem. 258, 7155-7160 (1983)J. Csak TGF-^3-val kezelt NRK sejtek lemezei nem képeznek telepeket.

B. CHO sejtekben készített VGF

CHO sejtekben készített VGF biológiai aktivitását értékeljük

EGF receptor kötési vizsgálatot alkalmazva. A tenyésztő tápközeget alkalmazzuk további tisztítás nélkül. A növekedési faktor az EGF receptorhoz kötődik.

C. Selyemhernyóban készített VGF

Részlegesen tisztított (mintegy 50 %) selyemhernyóban készített VGF biológiai aktivitását értékeljük EGF receptor kötési vizsgálatot alkalmazva, és kimutatjuk, hogy ez kötődik EGF receptorhoz .

TÁBLÁZAT

Sebek hámképződésének százaléka a növekedési faktorral végzett kezelés után

1. Sertés (9 nappal az égés után)

Természetes VGF,/4g/ml

Jobb oldal	Silvadene	Nem kezelt	0,1	0,1
	15 %	0 %	70 %	65 %

·· • * • · · * ·

• « • · « • · · ··

		- 120 -
			h-EGF /tg/ml
Bal oldal	Silvadene	Nem kezelt	P_l1	0 l1	0x1
	75 %	55 %	60 %	70 %	30	%
2. sertés
(10 nappal	az égés után)
			VGF*	i/^g/ml
Jobb oldal	Silvadene	Nem kezelt	P^-L	P i 5	liO
	50 %	0 %	95 %	95 %	60	%
Bal oldal	Silvadene	Nem kezelt		0χ5	LiO
	50 %	0 %	60 %	75 %	40	%
3. sertés
(9 nappal	az égés után)
			Patkány TGF./lg/ml
Jobb oldal	Silvadene	Nem kezelt	0,1	IxP.	1_0
	20 %	15 %	90 %	65 %	90	%
			Humán	TGF	g/ml
Bal oldal	Silvadene	Nem kezelt	0,1	1 ,0	10
	25 %	5 %	90 %	85 %	65	%
*VGF: Vacc	inia vírussal fertőzött sejtekből	készített természetes
D. VGF és	TGF immunológiai	összehasonlítása

VGF

A fentebb leírt radioimmunassayban az antigénnek a patkány

121 ···· ·· · ·· • · · · · · • · * · · · · · • * *···· ·

TGF-ού-molekula karboxi-terminális 17 aminosava elleni antitesttől való 50 %-os kiszorulását figyeljük meg mintegy 0,2-0,3 ng EGF

125 / ekvivalens antigén koncentrációnál, ahol I-vel jelzett a-TGF verseng oC-TGF-fel. Amikor VGF-et vizsgálunk ekvivalens koncentrációknál, versengést nem figyelünk meg. Versengő radioimmunassayban natív EGF-hez a VGF készítmények, még akkor is, amikor 50 ng 125

EGF ekvivalens/ml koncentrációnál vizsgáljuk, csak a I-EGF minimális kiszorulását (^10 %) mutatják poliklonális antitestből natív EGF-be.

A fenti eredményekből nyilvánvaló, hogy a VGF jelenős hámképző szer megfelelően összehasonlítva más növekedési faktorokkal, amelyeket előzőleg vizsgáltak és amelyekről kimutatták, hogy mitogén aktivitásuk van. A szóban forgó polipeptideket alkalmazhatjuk különböző gazdaszervezeteknél immunogén válasz indukálására, sejtburjánzás fokozására, sebgyógyításra és hasonlókra. A sebeknél hámképződés és eresedés figyelhető meg, valamint a sebgyógyulás gyors helyreállása, vagyis ellenállás a széttagolódás vagy ellen. A gazdaszervezetek lehetnek emlősök, pl. rágcsálók, háziállatok, főemlősök és ember.

A jelen találmány szerint új kompozíciókat nyújtunk, amelyek képességek széles tartományát mutatják különböző területeken, pl. alkalmazhatók diagnosztikumként, sejtekre való in vitro és in vivő hatóanyagként működhetnek nitrogénként, adalékanyagként tápközegekben, alkalmazhatók EGF-re és TGF-re való antagonistaként, működhetnek immunogénként, gyógyszerként, fokozhatják a sebgyógyulást, stb. Ezen kívül kötő aktivitással bíró kis oligopeptidet szolgáltatunk; ezt az oligopeptidet alkalmazhatjuk magában vagy más polipeptidekkel egyesítve, más polipeptidekkel fuzionálva,

122 • · · * · * • · · · · ·*· • · ···· · •« · · · hogy a más polipeptidek tulajdonságai variálódjanak; ez a polipeptid kötését eredményezi növekedési faktor receptorokkal bíró sejtekhez. így lehet reverzibilisen különböző polipeptideket kötni növekedési faktor receptorokkal bíró sejtekhez, a sejtek tulajdonságára hatva előre meghatározott módon.

A jelen leírásban említett összes közlemények és szabadalmi bejelentések a szakterületen jártas egyének szintjén alátámasztják, mire vonatkozik ez a szabadalom. Az összes említett közlemények és szabadalmi bejelentések referenciaként épülnek be a jelen be jelenésbe, ez az együttes beépülés éppen olyan mértékű, mintha az egyes közleményeknél egyenként jeleznénk, hogy referenciaként épülnek be a jelen bejelentésbe.

A találmányt most teljes egészében leírtuk; azok számára, akik a szakterületen jártasak, nyilvánvaló, hogy sokféle változtatás és módosítás végezhető el ebben a nélkül, hogy a mellékelt igénypontok szellemétől vagy oltalmi körétől eltérnénk.

Claims (2)

1.) Eljárás DNS szekvencia előállítására, amely az alábbi jellemzőkkel bíró polipeptidet kódol:

(1) képes EGF receptorhoz kötődni;

(2) lényegében azonos hurok-szerkezettel bír, mint egy természetben előforduló, valamely EGF receptorhoz kötődni képes növekedési faktor (természetes ligandum), és (3) legalább 30 % homológiája van egy természetes EGF recep tor kötővel, ahol az említett polipeptid három tartomnyt tartalmaz, amelyek- mindegyike olyan aminosavszekvencia, amely legalább 30 % homológiával bír ugyanazon vagy eltérő természetes ligandumok fragmentumaihoz és ugyanolyan relatív helyzettel bír, mint az említett természetes ligandumok említett fragmentumai, ahol az említett tartományokat úgy határozzuk meg, mint egy legalább mintegy 11 aminosavból álló N-terminális első

-6 1 tartományt, amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és

11 15 a mintegy aa -aa aminosavnál fejeződik be;

egy legalább 11 aminosavból álló központi fragmentum máso1115 dik tartományt, amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a mintegy aa²³-aa²^ aminosavnál fejeződik be;

egy legalább 14 aminosavból álló C-terminális harmadik

2529 tartományt, amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és

4253 a mintegy aa -aa aminosavnál fejeződik be; és kívánt esetben az említett DNS szekvencia kódol még egy negyedik tartományt is legalább mintegy 6 aminosavból álló N-terminális többlet-tar-7-1 tományként, amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a

-45-7 mintegy aa -aa aminosavnál fejeződik be, kívánt esetben egy ···· ·· · • · · ··» ·· · • · »····· ♦ ··· · ·· * ··

-124 szelektív lehasadásra képes aminosavszekvenciával az említett negyedik tartomány karboxi-terminálisánál beiktatva, ahol az említett negyedik tartomány az említett első tartomny amino-terminálisához csatlakozik, azzal a feltétellel, hogy az említett polipeptidnek egy természetes ligandummal azonos aminosavszekvenciája van, az említett negyedik tartományt kódoló DNS szekvencia jelen van és az említett DNS szekvencia által kódolt természetes ligandum N-terminális többlet-aminosavaitól eltérő N-terminális aminosavakat kódol, azzal jellemezve, hogy az említett szekvenciát dezoxinukleotidok sorozatos adagolásával készítjük, hogy az említett DNS szekvencia egészét vagy részét előállítsuk és ezt a szintetizált részt a teljes szekvencia bármelyik további szekvencia-részéhez ligáijuk.

2. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett természetes ligandum VGF, TGF-alfa, EGF, MGF, SF'GF vagy antiregulin.

3. ) Az 1.igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett DNS szekvencia továbbá egy vezető szekvenciát is kódol, kívánt esetben egy szelektív lehasadásra képes aminosavszekvenciával az említett vezető szekvencia karboxi-terminálisánál beiktatva, ahol az említett vezető szekvencia az említett első tartomány amino-terminálisához csatlakozik, vagy ahol az említett negyedik tartomány is jelen van, az említett negyedik tartomány amino-terminálisához csatlakozik.

4. ) A 3· igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett vezető szekvenciaként egy lambda N-fehérje, cro fehérje, vagy antiregulin N-terminális fragmentumát alkalmazzuk.

• · · · · • · · · • ·· · · · · · * • · · ····· · •·· · ·· · ··

- 125 -

5. ) A 3· igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett vezető szekvenciaként valamely szignál szekvenciát vagy valamely módosított szignál szekvenciát alkalmazunk.

6. ) Az 5· igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett szignál szekvenciaként alkálikus foszfatáz szignál szekvenciát, majom TGF-béta szignál szekvenciát vagy K. lactis ölő toxin szignál szekvenciát alkalmazunk.

7. ) Az 1. és 3-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett tartományok legalább egyike legalább 30 %-ban homológ a VGF, TGF-alfa, EGF vagy SFGF valamely fragmentumával .

8. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett DNS szekvencia VGF-et kódol.

9. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett DNS szekvencia SFGF-et kódol.

10. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett szekvencia legalább egy változást tartalmaz egy természetes ligandumot kódoló szekvenciához viszonyítva, amely az aminosavszekvenciában a következő változásokat eredményezi: HGD HGT-re; GMYC GYAC-re; RCS VCS-re; CLH.GDC CLHGTC-re; és GMYCRC GYACVC-re.

11. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett DNS szekvencia legalább egy további szekvenciával van egyesítve, hogy egy, a pBM11/NDP/EGF; pBM11/PAD/EGF; pBM11/PÁK/ EGF; pBM11/N/TGF; pBM11/NDP/VGFA; pBM11/NDP/VGFa; pBM11/PAD/nVGFa; pBM11/PAK/nVGFa; pRSV/VGF; pAc/SFGF; pAc/VGF; ptac/TTV; TacPak/EGF; pTCPt/EGF; pTCPt/nVGFa; PBM11/N/TTV; pBM11/NDP/TTV; pBM11/NDP/VTV; vagy pBM16/NDP/TVV funkcionális tartományait tartalmazó plazmidot • ···· ·· · ·· ·· · · · · · · • · · ··· *·· • · ·····« · ·♦· · ·· * ··

- 126 - állítsunk elő.

12.) Eljárás kifejező kazetta előállítására, amely az átírás irányában az alábbiakat tartalmazza:

- egy gazdasejtben működőképes transzkripciós és transzlá- ciós iniciációs szabályozó terület

- DNS szekvencia, amely az alábbi jellemzőkkel bíró polipep- tidet kódol:

(1) képes EGF receptorhoz kötődni;

(2) lényegében azonos hurok-szerkezettel bír, mint egy természetben előforduló, valamely EGF receptorhoz kötődni képes növekedési faktor (természetes ligandum); és (3) legalább 30 % h omológiája van egy természetes ligandummal, ahol az említett polipeptid három tartományt tartalmaz, amelyek mindegyike olyan aminosavszekvencia, amely legalább 30 % homológiával bír ugyanazon vagy eltérő természetes ligandumok fragmentumaihoz és ugyanolyan relatív helyzettel bír, mint az említett természetes ligandumok említett fragmentumai;

ahol az említett tartományokat úgy határozzuk meg, mint egy legalább tartományt, amely . . 11 15 mintegy aa -aa egy legalább tartományt, amely . . 25 29 mintegy aa -aa mintegy 11 aminosavból álló N-terminális első

-6 -1 a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a aminosavnál fejeződik be;

11 aminosavból álló központi fragmentum második

11 15 a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a aminosavnál fejeződik be;

egy legalább

14 aminosavból álló C-terminális harmadik tartományt, mintegy

25 29 amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a

40 53 aa -aa aminosavnál fejeződik be; és kívánt esetben ···· ·· · • · · ♦

- 127 az említett DNS szekvencia kódol még egy negyedik tartományt is legalább mintegy 6 aminosavból álló N-terminális többlet-tar-7 -1 töményként, amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a

-45 -7 mintegy aa -aa aminosavnál fejeződik be, kívánt esetben egy szelektív lehasadásra képes aminosavszekvenciával az említett negyedik tartomány karboxi-terminálisánál beiktatva, ahol az említett negyedik tartomány az említett első tartomány amino-terminálisához csatlakozik, azzal a feltétellel, hogy ahol az említett polipeptidnek egy természetes EGF receptor kötővel azonos aminosavszekvenciája van, az említett negyedik tartományt kódoló DNS szekvencia jelen van és az említett. DNS szekvencia által kódolt természetes EGF receptor kötő N-terminális többlet-aminosavaitól eltérő N-terminális aminosavakat kódol,

- az említett gazdasejtben működőképes transzkripciós és transzlációs terminációs szabályozó terület, azzal jellemezve, hogy az említett DNS szekvenciát az említett szabályozó területekhez ligáljuk, hogy az említett kifejező kazettát megalkossuk.

13·) Eljárás kifejező kazettát tartalmazó gazdasejt előállítására, amely kazetta az átírás irányában az alábbiakat foglalja magában:

^- egy gazdasejtben működőképes transzkripciós és transzlációs iniciációs szabályozó terület;

- DNS szekvencia, amely az alábbi jellemzőkkel bíró polipaptidet kódol:

(1) képes EGF receptorhoz kötődni;

(2) lényegében azonos hurok-szerkezettel bír, mint egy természetben előforduló, valamely EGF receptorhoz kötődni képes növekedési faktor (természetes ligandum); és • <«««· ·· 1» ·· • · ···· · · • ·· ··· ··« • · · ····« · •♦· · «· · ♦·

128 (3) legalább 30 % homológiája van egy természetes ligan dummal, ahol az említett polipeptid három tartományt tartalmaz, amelyek mindegyike olyan aminosavszekvencia, amely legalább 30 % homológiával bír ugyanazon vagy eltérő természetes ligandumok fragmentumaihoz és ugyanolyan relatív helyzettel bír, mint az em lített természetes ligandumok természetes fragmentumai;

ahol az említett tartományokat úgy határozzuk meg, mint egy legalább mintegy 11 aminosavból álló N-terminális első tartományt, amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a mintegy aa^-aa^ aminosavnál fejeződik be;

egy legalább 11 aminosavból álló központi fragmentum máso11 15 dik tartományt, amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a mintegy aa²^-aa²^ aminosavnál fejeződik be;

egy legalább 14 aminosavból álló C-terminális harmadik tar25 29 tományt, amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a mintegy aa^O-aa^³ aminosavnál fejeződik be; és az említett DNS szekvencia kívánt esetben kódol még egy ne gyedik tartományt is legalább mintegy 6 aminosavból álló N-termi-7 -1 nális többlet-tartományként, amely a mintegy aa -aa aminosav-45 -7 nál kezdődik és a mintegy aa -aa aminosavnál fejeződik be, kívánt esetben egy szelektív lehasadásra képes aminosavszekvenciával az említett negyedik tartomány karboxi-terminálisánál beiktatva, ahol az említett negyedik tartomány az említett első tartomány amino-terminálisához csatlakozik, azzal a feltétellel, hogy ahol az említett polipeptidnek egy természetes ligandummal azonos aminosavszekvenciája van, az említett negyedik tartományt kódoló DNS szekvencia jelen van és ··♦

- 129 - • 9··# ·· · •· · · * · · • · · · · ♦ • · · · ··»< · ·«· · ·· · f az említett DNS szekvencia által kódolt természetes ligandum Nterminális többlet-aminosavaitól eltérő N-terminális aminosavakat kódol,

- az említett gazdasejtben működőképes transzkripciós és transzlációs terminációs szabályozó terület, azzal jellemezve, hogy az említett gazdasejtet transzformáló körülmények között az említett kifejező kazettával transzformáljuk.

14.) Eljárás az alábbi jellemzőkkel bíró polipeptid előállítására:

(1) képes EGF receptorhoz kötődni;

(2) lényegében azonos hurok-szerkezettel bír, mint egy természetben előforduló, valamely EGF receptorhoz kötődni képes növekedési faktor (természetes ligandum); és (3) legalább 30 % homológiája van egy természetes ligandummal, ahol az említett polipeptid három tartományt tartalmaz, amelyek mindegyike olyan aminosavszekvencia, amely legalább 30 % homológiával bír ugyanazon vagy eltérő természetes ligandumok fragmentumaihoz és ugyanolyan relatív helyzettel bír, mint az említett ligandumok természetes fragmentumai;

ahol az említett tartományokat úgy határozzuk meg, mint egy legalább mintegy 11 aminosavból álló N-terminális

-6 —1 első tartományt, amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a mintegy aa^-aa^ aminosavnál fejeződik be;

egy legalább 11 aminosavból álló központi második tar1115 tományt, amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a

25 29 mintegy aa -aa aminosavnál fejeződik be;

egy legalább 14 aminosavból álló C-terminális harmadik

25 29 tartományt, amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a • ···· ·· · ·· • 4 · · · 4 · ·

4 4 4 * · ♦t»· • · 4 ·«···4 • * · · ·· 44 ·

- 130mintegy aa^-aa^ aminosavnál fejeződik be; és az említett DNS szekvencia kívánt esetben kódol még egy negyedik tartományt is legalább mintegy 6 aminosavból álló N-ter-7-1 minális többlet-tartományként amely a mintegy aa -aa aminosav-45-7 nál kezdődik és a mintegy aa -aa aminosavnál fejeződik be, kívánt esetben egy szelektív lehasadásra képes aminosavszekvenciával az említett negyedik tartomány karboxi-terminálisánál beiktatva, ahol az említett negyedik tartomány az említett első tartomány amino-terminálisához csatlakozik, azzal a feltétellel, hogy ahol az említett polipeptidnek egy természetes EGF receptor kötővel azonos aminosavszekvenciája van, az említett negyedik tartományt kódoló DNS szekvencia jelen van, és az említett DNS szekvencia által kódolt természetes EGF receptor kötő N-terminális többlet-aminosavaitól eltérő N-terminális aminosavakat kódol,

- az említett gazdasejtben működőképes transzkripciós és transzlációs trminációs szabályozó terület, azzal jellemezve, hogy egy kifejező kazettát tartalmazó gazdasejtet, amely kazetta az átírás irányában magában foglal egy, az említett gazdasejtben működőképes transzkripciós és transzlációs iniciációs szabályozó területet, egy, az említett polipeptidet kódoló DNS szekvenciát és egy transzkripciós és transzlációs terminációs szabályozó területet, megfelelő tenyészközegben növesztjük, ezáltal az említett polipeptidet kifejezzük; és az említett polipeptidet izoláljuk.

15·) Eljárás az alábbi jellemzőkkel bíró polipeptid előállítására :

(1) képes EGF receptorhoz kötődni;

···· ·· « ·· • · · ♦ · ·

9 · · · « ·« I • · · «··· · • « ·* * ··

131 (2) lényegében azonos hurok-szerkezettel bír, mint egy természetben előforduló, valamely EGF receptorhoz kötődni képes növekedési faktor (természetes ligandum); és (3) legalább 30 % homológiája van egy természetes ligandummal, ahol az említett polipeptid három tartományt tartalmaz, amelyek mindegyike olyan aminosavszekvencia, amely legalább 30 % homológiával bír ugyanazon vagy eltérő természetes ligandumok fragmentumaihoz és ugyanolyan relatív helyzettel bír, mint az említett ligandumok természetes fragmentumai;

ahol az említett tartományokat úgy határozzuk meg, mint egy legalább mintegy 11 aminosavból álló N-terminális _ ή első tartományt, amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a mintegy aa^-aa^ aminosavnál fejeződik be;

aminosavból álló egy legalább 11

11 amely a mintegy aa aa aminosavnál fejeződik be;

-aa¹⁵ aminosavnál központi második tartományt,

25 kezdődik és a mintegy aa egy

C-terminális harmadik tartományt, mintegy legalább 14 aminosavból álló

25 29 amely a mintegy aa -aa aminosavnál kezdődik és a aa^-aa^ aminosavnál fejeződik be; és az említett DNS szekvencia kívánt esetben kódol még egy negyedik tartományt is legalább mintegy 6 aminosavból álló N-ter-7 -1 minális többlet-tartományként, amely a mintegy aa -aa aminosav-45 —7 nál kezdődik és a mintegy aa -aa aminosavnál fejeződik be, kívánt esetben egy szelektív lehasadásra képes aminosavszekvenciával az említett negyedik tartomány karboxi-terminálisánál beiktatva, ahol az említett negyedik tartomány az említett első tartomány amino-terminálisához csatlakozik, ·· • · ·*·

- 132 azzal a feltétellel, hogy ahol az említett polipeptidnek egy természetes ligandummal azonos aminosavszekvenciája van, az említett negyedik tartományt kódoló DNS szekvencia jelen van, és az említett DNS szekvencia által kódolt természetes ligandum N-terminális többlet-aminosavaitól eltérő N-terminális aminosavakat kódol, azzal jellemezve, hogy az említett szekvenciát védett aminosavai’ egymás utáni beadásával állítjuk elő az említett polipeptid szekvencia elkészítésére;

a védőcsoportokat eltávolítjuk; és az említett polipeptidet izoláljuk.

16.) A 14. és 15- igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett polipeptid az alábbi aminosavszekvenciát vagy legalább 37 aminosavas fragmentumát tartalmazza, amely magában foglalja legalább az 1.-37. aminosavakat:

aa -24 -20 -15 -10 -5-1

DSGNAIETTSPEITNATTDIPAIR

1 5 10 1520

LCGPEGDGYCLHX¹ G D C I Η X² A R D

25 30 3540

IDGX3MYCRCSHGYTGIRCQHVV

45 5053

LVDYQRSENPNT

133 ahol X jelentése kötés kötés vagy 1-2 aminosav; X3

1 2 és X , X és X3 lehet azonos • ···· «· « w ·· · · · · · · • · · · · · ··· • · · · ···· · ··· · ·♦ · ·· vagy valamely aminosav; X jelentése jelentése kötés vagy 1-4 aminosav;

17.) A 16. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve,

14 24 említett aa legalább egyike treonin; az említett aa

25 27 az említett aa alanin; és az említett aa valin.

hogy az tirozin;

18.) A 16. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, -6 47 említett aminosavszekvenoia aa -tói aa -ig tart.

hogy az

19.) A 18. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, említett aa^ treonin, az említett aa²^ tirozin és az említett hogy az aa²⁵ alanin.

20.) A 19. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az _θ ή 3 említett aminosavszekvenoia említett aa -aa közti területe az alábbi szekvenciával van helyettesítve:

aa -6

VVSHFNDCPDSHT

21.) A 19. igénypont szerinti eljárás említett aminosavszekvenoia említett azzal jellemezve, hogy az

14 27 aa -aa közti területe az alábbi szekvenciával van helyettesítve:

aa 1 4

20 25 27

TCRFLVQEDKPACV

22.) A 21. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az 22 említett aa glutaminsavval van helyettesítve.

23·) Eljárás a 16-22 igénypontok bármelyike szerinti aminosav···

- 134 szekvenciával bíró polipeptidet kódoló DNS szekvencia előállítására azzal jellemezve, hogy az említett szekvencia elkészítésére dezoxiribonukleotidokat adagolunk megfelelő sorrendben mindaddig, amíg az említett DNS szekvencia egésze vagy része ki nem alakul, és ezt a szintetizált részt ligáljuk bármilyen további szekvenciához.