KR20190140950A - 인간 유전자 교정 - Google Patents

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오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티
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Abstract

영장류 세포에서 관심 유전자의 돌연변이체 대립유전자를 교정하는 방법을 개시한다. 본 방법은 a) 함께 작용하여 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 파단을 도입하는 비자연적으로 발생된 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드를 영장류 세포 내로 도입하는 단계로서, 여기서, i) 상기 영장류 세포는 유사 세포 분열 중이고; ii) 상기 영장류 세포는 돌연변이체 대립유전자에 대해 이형접합성인 게놈을 포함하여, 상기 게놈은 돌연변이체 대립유전자 한 카피 및 야생형 대립유전자 한 카피를 포함하고; iii) 상기 야생형 대립유전자에 상동성인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 영장류 세포 내로 도입되지 않는 것인 단계를 포함한다. 본 방법은 또한 b) 상기 영장류 세포가 돌연변이체 대립유전자에서 이중 가닥 DNA 파단의 상동성 지정 수복을 활성화하도록 하여, 수복 주형으로서 정상 야생형 대립유전자를 사용하여 돌연변이체 대립유전자를 교정하고, 야생형 대립유전자에 대해 동형접합성인 영장류 세포를 생산하는 단계를 포함한다. 영장류 세포는 단세포 배아 및/또는 인간 세포일 수 있다.

Description

인간 유전자 교정
[관련 출원(들)에 대한 상호 참조]
본 출원은 2017년 4월 17일 출원된 미국 출원 제62/487,989호의 이익을 주장하고, 상기 출원은 본원에서 참조로 포함된다.
[본 개시내용의 분야]
본 출원은 유전자 교정 분야, 구체적으로, 이형접합성 영장류 세포에 존재하는 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 파단을 함께 도입하여, 수복 주형으로서 정상 야생형 대립유전자를 사용하여 돌연변이체 대립유전자를 교정하고, 야생형 대립유전자에 대해 동형접합성인 영장류 세포(예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 단세포 배아)를 생산하는, 비자연적으로 발생된 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드의 용도에 관한 것이다.
10,000개 초과의 단일유전자 유전성 장애가 확인되었으며, 전 세계 수백만 명의 사람들이 앓고 있다. 그 중에는, 단일 카피의 결함 유전자의 유전이 임상 증상을 초래할 수 있는 상염색체 우성 돌연변이가 있다. 후발성 성인 장애로서 발현되는 우성 돌연변이는 유방암 및 난소암의 위험성이 높은 것과 연관이 있는 BRCA1 및 BRCA2(문헌 [Antoniou, et al., Am J Hum Genet, 72:1117-1130, 2003]), 및 비대성 심근증(HCM: hypertrophic cardiomyopathy; 문헌 [Carrier et al., Gene, 573:188-197, 2015])을 유발하는 MYBPC3을 포함한다. 지연 발현으로 인해 상기 돌연변이는 자연 선택되지는 않지만, 이는 대개 다음 세대로 전달된다. 그 결과, 특정 인간 집단에서의 상기 시조 돌연변이 중 일부 돌연변이에 대한 빈도는 매우 높다. 예를 들어, 주요 인디언 집단에서는 25-bp 결실을 보유하는 MYBPC3 돌연변이가 2% 내지 8% 범위의 빈도로 발견되는 반면(문헌 [Dhandapany et al., Nat Genet, 41:187-191, 2009]), 아슈케나지 유대인(Ashkenazi Jews) 사이에서 BRCA1 및 BRCA2 돌연변이, 둘 모두에서 추정되는 빈도는 2%를 초과한다(문헌 [Struewing, et al., N Engl J Med, 336:1401-1408, 1997]). 영장류 세포, 예컨대, 영장류 체세포 및 단세포 배아에서 상기 돌연변이를 교정하는 것이 요구되고 있다.
HCM은 좌심실 비대, 근원섬유 혼란, 및 심근 경직을 특징으로 하는 심근 질환이다. 성인에서의 유병률은 1:500인 것으로 추정되고 있으며(문헌 [Maron, et al., Circulation, 92:785-789, 1995]), 임상적으로 심부전 및 돌연사와 함께 발현된다. MYBPC3 돌연변이가 HCM의 가장 빈번한 유전적 원인이며, 다른 유전성 심근병증의 큰 부분을 차지한다(문헌 [Schlossarek, et al., J Mol Cell Cardiol, 50:613-620, 2011]). MYBPC3은 근절 구조의 유지 뿐만 아니라, 수축과 이완, 이 둘 모두의 조절에 기여하는 심장 근육세포에서의 한 신호전달 노드인, 두꺼운 필라멘트와 연관된 단백질인 심장 미오신 결합 단백질 C(cMyBP-C: cardiac myosin-binding protein C)를 코딩한다(문헌 [Carrier et al., Gene, 573:188-197, 2015]).
HCM에 대한 현행 치료 옵션은 질환의 유전적 원인에 집중하지 않고, 대부분 증상 완화만을 제공하고 있다. 2세대 전달을 예방하기 위한 한 가지 접근법은 착상 전 유전 진단(PGD: preimplantation genetic diagnosis)을 수행한 후, 시험관내 수정(IVF: in vitro fertilization) 맥락에서 전달을 위해 비돌연변이체 배아를 선택하는 것이다. 오직 한 부모만이 이형접합성 돌연변이를 보유할 때, 배아 중 50%는 반드시 돌연변이가 없어야 하고, 전달에 이용가능하여야 한다. 그러나, 캐리어 배어 중 50%는 폐기하게 되는데, 이는 명백히 임신율에 영향을 미치고, 가족에 대한 윤리적 딜레마를 생성한다. 따라서, 예컨대, MYBPC3에 의해 유발되는 질환을 위한 시조 돌연변이의 생식세포계열 전달을 예방하는 신규 전략법이 바람직하다. 상기 방법은 또한 다른 시조 돌연변이의 교정, 및 상기 유전자에서 돌연변이에 의해 유발되는 장애 치료에도 적용가능하다. 추가로, 상기 전략법은 또한 체세포에도 적용될 수 있다.
본원에서는 영장류 세포에서 관심 유전자의 돌연변이체 대립유전자를 교정하는 방법을 개시한다. 본 방법은 단계 a) 함께 작용하여 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 파단을 도입하는 비자연적으로 발생된 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드를 영장류 세포 내로 도입하는 단계로서, 여기서, i) 상기 영장류 세포는 유사 세포 분열 중이고; ii) 상기 영장류 세포는 돌연변이체 대립유전자에 대해 이형접합성인 게놈을 포함하여, 상기 게놈은 돌연변이체 대립유전자 한 카피 및 야생형 대립유전자 한 카피를 포함하고; iii) 상기 야생형 대립유전자에 상동성인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 영장류 세포 내로 도입되지 않는 것인 단계를 포함한다. 표적화된 뉴클레아제는 클러스터된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복서열(CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeat) 연관(Cas)9, 아연 핑거 단백질(ZNF: zinc finger protein), 또는 전사 활성화인자 유사 이펙터(TALEN: transcription activator-like effector)일 수 있다. 본 방법은 또한 단계 b) 상기 영장류 세포가 돌연변이체 대립유전자에서 이중 가닥 DNA 파단의 상동성 지정 수복을 활성화하도록 하여 수복 주형으로서 정상 야생형 대립유전자를 사용하여 돌연변이체 대립유전자를 교정하고, 야생형 대립유전자에 대해 동형접합성인 영장류 세포를 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 영장류는 인간이다. 일부 실시양태에서, 영장류 세포는 배아 세포, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 단세포 배아이다.
본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점은 첨부 도면을 참조로 하여 진행되는 수개의 실시양태에 관한 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 자명해질 것이다.
도 1. S기 주입된 인간 배아에서의 유전자 교정. 세포 주기 중 S기에서의 인간 접합체 내로의 CRISPR/Cas9의 주입에 의한 MYBPC3 ΔGAGT 유전자 표적화 개략도. MII 난모세포를 동일한 개수의 돌연변이체 및 WT 정충을 갖는 이형접합성 환자로부터의 정자에 의해 수정시켰다. 이어서, CRISPR/Cas9를 단세포 접합체 내로 주입하였다. 유전 분석을 위해 4-8 세포기의 배아를 수집하였다.
도 2a-2f. S기 주입된 인간 배아에서의 유전자 표적화 및 상동성 지정 수복(HDR: homology-directed repair) 효율. 도 2a, 접합체, S기 주입된 배아에서의 유전자 표적화 효율. 도 2b, 모자이크 배아에서의 난할구 유전자형분석 결과. 도 2c, 모자이크 배아에서의 다양한 난할구 유전자형의 분포. 도 2d, 전체 표적화 및 HDR 효율. 도 2e, 환자 iPSC 및 S기 주입된 배아에서의 표적화 효율. 도 2f, 대조군(n=19) 및 S기 주입된(n=54) 배아에서의 WT/WT 배아의 수율.
도 3a-3e. M기 주입된 인간 배아에서의 유전자 교정. 도 3a, M기 난모세포 내로의 CRISPR/Cas9의 주입에 의한 MYBPC3 ΔGAGT 유전자 표적화 개략도. CRISPR/Cas9를 정자 현탁액가 혼합하고, ICSI 동안 MII 난모세포 내로 공동 주입하였다. 정자가 단일 돌연변이체 카피를 함유할 때, CRISPR/Cas9의 M기 전달을 통해 게놈 편집이 이루어질 수 있고, 이로써, 균일한 배아가 생산되고, 모자이크 현상이 제거된다. 도 3b, M기 주입된 배아에서의 표적화 효율. 도 3c, 대조군(n=19) 및 M기 주입된(n=58) 배아에서의 WT/WT 배아의 수율. 도 3d, ssODN의 존재 또는 부재하에서의 HDR 결과. 도 3e, 비처리된 대조군 대비의 S기 및 M기 주입된 배아에서 추정되는 HDR 효율.
도 4a-4d. 처리된 인간 배아의 Digenome - seq 기반 오프 타겟 돌연변이 스크리닝. 도 4a, DNA 절단 점수를 보여주는 게놈와이드 써코스(Circos) 플롯. Cas9로만 처리된 DNA는 회색으로 표시되어 있고, CRISPR/Cas9 처리된 DNA는 청색으로 표시되어 있다. 도 4b, 디게놈 포착 부위를 사용하여 웹로고(WebLogo)를 통해 수득된 서열 로고(DNA 절단 점수 >2.5). 온 타겟 서열은 서열 로고 아래 명시되어 있다(서열 번호 6). 도 4c, Digenome-seq에 의해 검출된 28개의 개별 난할구에 대한 온 타겟. 오직 NHEJ 시그니처를 보유하는 난할구만이 Digenome-seq에 의해 포착되었다. 도 4d, CRISPR/Cas9 처리된 인간 배아(n=5) 및 비처리된 대조군 인간 배아(n=2; 서열 번호 7-30, 위에서 아래로)에서의 Digenome-seq에 의해 포착된 잠재적 오프 타겟 부위에 대한 indel 빈도. 미스매치 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있다. OnT: 온 타겟 부위; OT: 오프 타겟 부위.
도 5a-5f. CRISPR / Cas9 디자인 및 환자 iPSC에서의 시험. 도 5a, 및 도 5b, CRISPR/Cas9-1(서열 번호 2) 및 CRISPR/Cas9-2(서열 번호 3) 구성물(각각 서열 번호 31 및 서열 번호 32인 야생형 및 돌연변이체 대립유전자에서의 서열)의 개략도. 두 시스템 모두 MYBPC3 Δ GAGT 결실을 표적화하도록 디자인된 단일 쇄 키메라 sgRNA 및 Cas9 단백질로 구성된다. HDR을 촉진시키니기 위해 표적화된 영역에 대한 상동성 아암을 코딩하는 외인성 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN: single-stranded oligodeoxynucleotide) 주형을 각 시스템에 대해 디자인하였다(ssODN-1, 서열 번호 33; ssODN-2, 서열 번호 34). 밑줄로 표시된 바와 같이, 동의 단일 뉴클레오티드 치환을 각 ssODN 주형 내로 도입하였다. 추가로, ssODN-2 뉴클레오티드 치환은 오픈 박스로 표시된 바와 같은 제한 효소(BstBI) 인식 부위를 제공한다. 도 5c, 환자 iPSC를 전기천공에 의해 CRISPR/Cas9 플라스미드로 형질감염시키고, 클로닝된 개별 단일 iPSC를 분석하였다. 도 5d, 이형접합성 돌연변이체를 갖는 비표적화된 iPSC 클론(좌측; 위에서 아래로 서열 번호 35 및 36), 수복 주형으로서 ssODN-2를 사용하여 HDR을 통해 교정된 유전자를 갖는 표적화된 iPSC 클론(중간; 위에서 아래로 서열 번호 37 및 38), 및 주형으로서 WT 서열을 사용하여 HDR을 통해 교정된 유전자를 갖는 표적화된 iPSC 클론을 보여주는 대표 크로마토그래프. 도 5e, CRISPR/Cas9-1과 CRISPR/Cas9-2 사이의 표적화 및 HDR 효율 비교. 도 5f, 야생형 ES 세포(H9) 및 미리 어셈블리된 Cas9 리보뉴클레오단백질(RNP: ribonucleoprotein)로 형질감염된 환자 iPSC에서의 HDR 및 NHEJ 효율.
도 6a-6b. 잠재적인 오프 타겟 부위의 디게놈 시퀀싱. 도 6a, 온 타겟 부위에서 CRISPR/Cas9를 사용하여 생성된 대표적인 IGV(통합 게노믹스 뷰어: Integrative Genomics Viewer) 영상. 미스매칭된 뉴클레오티드는 더 밝은 회색으로 표시되어 있다. 도 6b, 잠재적 오프 타겟 부위에서의 CRISPR/Cas9 유도 DNA 절단을 보여주는 대표적인 IGV 영상. 화살표 표시는 각 오프 타겟 부위에서의 DNA 절단 부위를 나타낸다.
도 7a-7k. 모자이크 배아 및 M기 주입된 인간 배아의 개별 난할구에서의 큰 결실을 검출하기 위한 롱 레인지 PCR 분석. 도 7a, MYBPC3 ΔGAGT 돌연변이 부위에 걸쳐 있는 8개의 롱 레인지 PCR 프라이머의 개략도. 도 7b-7g, CRISPR-Cas9-표적화된 난할구 및 대조군 난할구에서의 PCR1, PCR2, 및 PCR4-PCR7 증폭의 아가로스 겔 영상. 도 7h-7i, CRISPR-Cas9-표적화된 난할구 및 대조군 난할구에서의 PCR3 및 PCR8의 대표적인 아가로스 겔 영상. 도 7j-7k, M기 주입된 WT/WT 난할구 및 대조군 난할구에서의 PCR3 및 PCR8의 대표적인 아가로스 겔 영상. 화살표 표시는 예상 DNA 크기를 반영하는 PCR 밴드를 나타낸다.
도 8a-8b. 난자 기증자 1로부터 생산된 모자이크 인간 배아 및 대조군 인간 배아에서의 HDR 수복 및 전환 트랙 길이 평가. 도 8a, MYBPC3 유전자의 게놈 영역 내의 3개의 유용한 정보를 주는 유익한 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP: single nucleotide polymorphism)의 개략적 지도(야생형, 상단; 돌연변이체, 하단). 각 SNP 아래의 rs 번호는 NCBI dbSNP(Short Genetic Variation 데이터베이스)에 기록되어 있는 참조 번호를 나타낸다. 도 8b, 모자이크 배아 및 대조군 배아로부터의 개별 난할구에서의 SNP 유전자형의 대표적인 크로마토그래프.
도 9. S기 및 M기 주입된 WT/WT 인간 배아에서의 HDR 수복 및 전환 트랙 길이 평가. S기 및 M기 주입된 WT/WT 인간 배아로부터의 개별 난할구에서의 SNP 유전자형의 대표적인 크로마토그래프.
도 10a-10b. CRISPR - Cas9 주입된 배아의 착상 전 발생. 도 10a, CRISPR-Cas9 처리된 MII 난모세포(n = 22) 및 대조군(n = 10) MII 난모세포의 수정 및 그의 후속된 8 세포 및 배반포 단계 배아로의 발생. 난모세포/배아/배반포의 개수는 막대로 제시되어 있고; 백분율(%)이 막대 위에 제시되어 있다. 오차 막대는 평균 ± s.e.m.이다. 스튜던츠 t 검정을 이용하여 유의도를 확립하였다. 도 10b, CRISPR-Cas9 주입된 전핵 단계 접합체, 8 세포 배아, 및 배반포의 정상적인 형태를 보여주는 대표적인 영상.
서열 목록
첨부된 서열 목록에 열거되어 있는 핵산 서열 및 아미노산 서열은 37 C.F.R. 1.822에서 정의된 바와 같이, 뉴클레오티드 염기에 대해서는 표준 문자 약칭 및 아미노산에 대해서는 3문자 코드를 사용하여 제시되어 있다. 각 핵산 서열의 단 하나의 가닥만이 제시되어 있지만, 상보적인 가닥도 제시된 가닥에 대한 언급에 포함되는 것으로 이해된다. 서열 목록은 2018년 4월 20일 작성된, 18.5 KB의 ASCII 텍스트 파일로서 제출되었고, 이는 본원에서 참조로 포함된다. 첨부된 서열 목록에서:
서열 번호 1은 예시적인 스트렙토코쿠스 파이오진스(Streptococcus pyogenes) Cas9 아미노산 서열이다.
서열 번호 2는 예시적인 gRNA 표적 핵산 서열이다.
서열 번호 3은 예시적인 gRNA 표적 핵산 서열이다.
서열 번호 4는 예시적인 gRNA 핵산 서열이다.
서열 번호 5는 예시적인 gRNA 핵산 서열이다.
서열 번호 6은 예시적인 온 타겟 MYBPC3 돌연변이체 핵산 서열이다.
서열 번호 7은 예시적인 인간 RPS14 핵산 서열이다.
서열 번호 8은 예시적인 인간 유전자간 핵산 서열이다.
서열 번호 9는 예시적인 인간 유전자간 핵산 서열이다.
서열 번호 10은 예시적인 인간 TTC7B 핵산 서열이다.
서열 번호 11은 예시적인 인간 SLC36A2 핵산 서열이다.
서열 번호 12는 예시적인 인간 HS6ST3 핵산 서열이다.
서열 번호 13은 예시적인 인간 유전자간 핵산 서열이다.
서열 번호 14는 예시적인 인간 유전자간 핵산 서열이다.
서열 번호 15는 예시적인 인간 MRP22 핵산 서열이다.
서열 번호 16은 예시적인 인간 유전자간 핵산 서열이다.
서열 번호 17은 예시적인 인간 유전자간 핵산 서열이다.
서열 번호 18은 예시적인 인간 유전자간 핵산 서열이다.
서열 번호 19는 예시적인 인간 XRRA1 핵산 서열이다.
서열 번호 20은 예시적인 인간 유전자간 핵산 서열이다.
서열 번호 21은 예시적인 인간 SHROOM4 핵산 서열이다.
서열 번호 22는 예시적인 인간 CDS2 핵산 서열이다.
서열 번호 23은 예시적인 인간 RP11-718G2.5 핵산 서열이다.
서열 번호 24는 예시적인 인간 MPP6 핵산 서열이다.
서열 번호 25는 예시적인 인간 AUTS2 핵산 서열이다.
서열 번호 26은 예시적인 인간 DECR1 핵산 서열이다.
서열 번호 27은 예시적인 인간 유전자간 핵산 서열이다.
서열 번호 28은 예시적인 인간 NAA16 핵산 서열이다.
서열 번호 29는 예시적인 인간 NR6A1 핵산 서열이다.
서열 번호 30은 예시적인 인간 MYBPC3 핵산 서열이다.
서열 번호 31은 예시적인 야생형 MYBPC3 핵산 서열이다.
서열 번호 32는 예시적인 돌연변이체 MYBPC3 핵산 서열이다.
서열 번호 33은 예시적인 단일 가닥 올리고 기증자(ssODN) 핵산 서열이다.
서열 번호 34는 예시적인 단일 가닥 올리고 기증자(ssODN) 핵산 서열이다.
서열 번호 35는 예시적인 MYBPC3 이형접합성 핵산 서열이다.
서열 번호 36은 예시적인 MYBPC3 이형접합성 핵산 서열이다.
서열 번호 37은 예시적인 ssODN 교정된 MYBPC3 이형접합성 핵산 서열이다.
서열 번호 38은 예시적인 ssODN 교정된 MYBPC3 이형접합성 핵산 서열이다.
서열 번호 39는 예시적인 야생형 MYBPC3 핵산 서열이다.
서열 번호 40은 예시적인 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 41은 예시적인 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 42는 예시적인 어댑터 핵산 서열이다.
서열 번호 43은 예시적인 어댑터 핵산 서열이다.
게놈 편집은 생식세포계열 돌연변이의 표적화된 교정을 위한 잠재성을 수반한다. 개시된 방법에서, 비자연적으로 발생된 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드를 사용하여 돌연변이체 부계 대립유전자에 이중 가닥 파단을 유도하였고; 이어서, 대개는 합성 DNA 주형 대신 상동성 야생형 모계 유전자를 사용하여 배아에서 상기 파단을 수복시켰다. 세포 주기를 조정함으로써, 모자이크 현상을 피할 수 있었고, 이로써, 오프 타겟 돌연변이 증거 없이, 야생형 유전자를 보유하는 동형접합성 세포, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 배아를 고수율로 수득할 수 있었다.
개시된 방법은 충분한 효율, 정확성, 및 안전성을 가지고 있으며, 이에, 인간 배아에서의 유전 돌연변이의 교정에 적합하다. 따라서, 개시된 방법을 사용하여 생식세포계열 유전자 교정은 착상 전 유전 진단에 대한 대안을 나타내고, 돌연변이체 배아를 구조한다는 이점을 갖는다. 인간 착상 전 배아에서의 이형접합성 돌연변이의 예시적인 CRISPR/Cas9 기반 교정을 개시한다. 본 방법은 내인성, 생식세포계열 특이적 DNA 수복 반응을 활성화시킴으로써 정밀한 표적화 정확도로 및 현저히 높은 상동성 지정 수복(HDR) 효율로 교정을 유도하다.
용어
하기 용어 및 방법에 관한 설명은 본 개시내용을 더욱 잘 기술하기 위해, 및 본 개시내용의 실시에서 당업계의 숙련가를 가이드하기 위해 제공하는 것이다. "한"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 1개 이상의 것을 지칭한다. 예를 들어, "한 세포를 포함하는"이라는 용어는 단일 세포 또는 복수 세포를 포함하고, 이는 "적어도 하나의 세포를 포함하는"이라는 어구와 등가인 것으로 간주된다. "또는"이라는 용어는 문맥상 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 언급된 대안적 요소 중 단일 요소, 또는 2개 이상의 요소의 조합을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "포함한다(comprises)"라는 것은 "포함한다(includes)"는 것을 의미한다. 따라서, "A 또는 B를 포함하는(comprising)"이라는 것은 추가의 요소를 배제하지 않고, "A, B, 또는 A 및 B를 포함하는(including)"이라는 것을 의미한다. 본원에서 언급된 진뱅크(GenBank)® 수탁 번호의 날짜는 2017년 4월 20일자로 이용가능한 서열이다. 본원에서 인용된 모든 참고문헌, 특허 출원 및 공개문헌, 및 진뱅크® 수탁 번호는 참조로 포함된다. 본 개시내용의 다양한 실시양태의 용이한 리뷰를 위해, 하기 구체적인 용어에 관한 설명을 제공한다.
동물: 살아있는 다세포 척추동물 유기체; 예를 들어, 포유동물 및 조류를 포함하는 카테고리. 포유동물이라는 용어는 인간 및 비인간 포유동물, 둘 모두를 포함한다. 유사하게, "피험체"라는 용어는 인간 및 동물 피험체, 둘 모두를 포함한다.
대립유전자: 특정 유전자의 상이한 형태. 포유동물은 2 세트의 염색체를 가지며, 따라서, 이배체이고, 상동성 염색체를 갖는다. 상동성 염색체 상의 유전자의(또는 유전자좌의) 두 대립유전자 모두 동일한 것이라면, 이들 및 유기체는 상기 유전자(또는 유전자좌)와 관련하여 동형접합성인 것이다. 대립유전자가 상이하다면, 이들 및 유기체는 상기 유전자와 관련하여 이형접합성인 것이다. "야생형" 대립유전자라는 용어는 정상적인 (건강한) 유기체에서의 전형적인 표현형 특징에 기여하는 대립유전자를 기술하는 데 사용된다. "변이체" 또는 "돌연변이체" 대립유전자는 보통 열성 또는 우성이고, 집단에서 덜 빈번하게 나타나며, 유기체에게 유해하고, 예컨대, 질환을 유발한다.
세포 배양물: 조절된 조건하에서 성장된 세포. 1차 세포 배양물은 유기체로부터 직접 채취되고, 1차 계대배양 전의 세포, 조직, 또는 기관의 배양물이다. 세포를 세포 성장 및/또는 분열을 촉진시키는 조건하에서 성장 배지 중에 배치시키면, 세포는 확장되고, 그 결과, 더욱 큰 세포 집단이 생성된다. 세포를 배양물 중에서 확장시킬 때, 세포 증식 속도는 전형적으로, 다르게는 배가 시간으로도 공지되어 있는, 세포 개수가 배가되는 데 소요되는 시간량에 의해 측정된다.
클러스터된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복서열 ( CRISPR ) 연관 단백질 9(Cas9): 다른 박테리아들 중 스트렙토코쿠스 파이오진스에서 CRISPR (클러스터된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복서열) 적응 면역계와 연관된 RNA 가이드된 DNA 엔도뉴클레아제 효소. Cas9는 가이드 RNA에 상보적인 임의의 서열에 매우 가까운 위치를 절단할 수 있다. Cas9 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. Cas9 서열은 예를 들어, 진뱅크® 서열 데이터베이스와 같이 공개적으로 이용가능하다(예컨대, 수탁 번호 NP_269215.1 및 AKS40378.1은 예시적인 Cas9 단백질 서열을 제공하는 반면, 수탁 번호 NC_002737.2는 그 안의 예시적인 Cas9 핵산 서열을 제공하고, 이는 모두 참조로 포함된다). 당업계의 숙련가는 Cas9 변이체를 비롯한, 추가의 Cas9 핵산 및 단백질 서열을 확인할 수 있다.
기증자 폴리뉴클레오티드: 게놈 유전자좌 내로 특이적으로 삽입될 수 있는 폴리뉴클레오티드.
(DNA에서) 이중 가닥 파단: 이중 나선의 두 가닥 모두가 절단된 파단. 이중 가닥 파단의 수복을 위해 3가지 기전: 비상동성 말단 연결(NHEJ: non-homologous end joining), 미세상동체 매개 말단 연결(MMEJ: microhomology-mediated end joining), 및 상동성 재조합(HR: homologous recombination, 상동성 지정 수복의 한 예)이 이용가능하다.
하류: "하류" 위치는 참조 지점보다 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 더 가까운 것인 폴리뉴클레오티드 상에서의 상대적인 위치. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 경우, 5' 및 3' 말단 배향은 안티센스 가닥에 반대되는 센스 가닥에 기초한다.
배아: 암컷 내로 착상되었는지 여부와 상관없이 접합체의 1회 이상의 분열에 의해 수득된 세포 덩어리. "일세포" 배아는 난자로부터의 모계 게놈 및 정자로부터의 부계 게놈에 의해 생산된 단일 세포이다. "상실배"는 고형 덩어리일 때, 일반적으로, 12-32개의 세포(난할구)로 구성된, 수정 후 3-4일째의 착상 전 배아이다. "배반포"는 약 30-150개의 세포로 이루어진 태반이 있는 포유동물에서의 (마우스의 경우, 수정 후 약 3일째, 및 인간의 경우, 수정 후 약 5일째의) 착상 전 배아를 지칭한다. 배반포 단계는 상실배 단계 다음이고, 이는 그의 독특한 형태로 구별될 수 있다. 배반포는 일반적으로 세포층(영양외배엽), 유체로 가득찬 체강(포배강 또는 배반포강), 및 내부의 세포 집단(내부 세포 덩어리, ICM: 내부 세포 덩어리)로 구성된 구체이다. 미분화 세포로 구성된 ICM은 배반포가 자궁내 착상되면, 태아로 발달하게 된다.
외인성: 보통은 세포에 존재하지 않지만, 유전적, 생화학적, 또는 다른 방법에 의해 도입될 수 있다는 것이다. 외인성 핵산은 단일 또는 이중 가닥, 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있고, 임의 길이일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함한다. 그에 반해, "내인성" 분자는 보통 특정 환경 조건하에 특정 발생 단계에서 특정 세포에 존재하는 것이다.
FokI 뉴클레아제: 자연적으로 플라보박테리움 오케아노코이테스(Flavobacterium okeanokoites)에 존재하는 비특이적 DNA 뉴클레아제. 상기 용어는 상기 단백질의 재조합 및 돌연변이체 형태, FokI 뉴클레아제 단백질의 단편, 및 DNA 결합 폴리펩티드에 융합되거나, 또는 융합될 수 있는 뉴클레아제 활성을 보유하는, 그의 재조합 및 돌연변이체를 포함한다.
융합 단백질 또는 유사 구성물과 관련하여 사용될 때, "융합" 또는 "융합된"이라는 용어는 유전자 조작에 의한 두 폴리펩티드 생성물(또는 그의 상응하는 폴리뉴클레오티드)의 공유 연결을 의미한다. 융합된 세그먼트는 서로 직접 융합될 수 있을 뿐만 아니라, 관심 세그먼트 사이에 중재 서열을 가지며 서로 간접적으로 융합될 수 있다.
이형접합성: 이배체 유기체는 그의 세포가 유전자의 2개의 상이한 대립유전자를 함유할 때, 유전자 유전자좌에서 이형접합성이다. 세포 또는 유기체는 특이적으로 해당 대립유전자에 이형접합체로서 지칭되고; 따라서, 이형접합성은 특이유전자형을 지칭한다.
상동성 지정 수복( HDR ): 이중 가닥 DNA 병변을 수복시키는 세포에서의 기전. HDR의 가장 일반적인 형태는 상동성 재조합(HR)이다. HDR 수복 기전은 오직 수복 주형으로서 작용하는 DNA의 상동성 조각이 핵 내에 존재할 때에만 세포에 의해 사용될 수 있고, 이는 대개는 세포 주기의 G2 및 S기에서 발생한다. 그에 반해, 비상동성 말단 연결(NHEJ)은, 상동성 주형을 필요로 하지 않으면서, 파단 말단이 직접 라이게이션되는, DNA에서 이중가닥 파단을 수복시키는 경로이다. NHEJ는 전형적으로 수복을 가이드하는 수복 주형으로서 미세상동체로 불리는 짧은 상동성 DNA 서열을 이용한다. 이들 미세상동체는 대개 이중 가닥 파단 말단 상의 단일 가닥 오버행에 존재한다. 오버행이 완변하게 화합성일 때, NHEJ는 보통 정확하게 파단을 수복시킨다. 그러나, 뉴클레오티드 손실을 초래하는 비정밀 수복 또한 발생할 수 있고, 오버행이 화합성을 띠지 않을 때, 더욱 일반적이다.
단리된: "단리된" 생물학적 성분(예컨대, 핵산, 펩티드, 또는 세포)은 상기 성분이 자연적으로 존재하는 유기체의 다른 생물학적 성분 또는 세포(즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 세포, 및 단백질)로부터 실질적으로 분리되거나, 그로부터 분리되어 생산되거나, 또는 그로부터 정제된 것이다. 따라서, "단리된" 핵산, 펩티드, 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 본 용어는 또한 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩티드, 및 단백질 뿐만 아니라, 화학적으로 합성된 핵산도 포함한다. 세포는 또한 예컨대, 다른 세포 또는 세포외 물질로부터도 단리될 수 있다.
마커 또는 표지: 예를 들어,ELISA, 분광광도법, 유세포 분석법, 면역조직화학법, 면역형광, 현미경법, 노던 분석, 또는 써던 분석에 의한 검출이 가능한 작용제. 예를 들어, 마커는 핵산 분자 또는 단백질에 부착될 수 있고, 이로써, 핵산 분자 또는 단백질이 검출될 수 있도록 할 수 있다. 마커의 예로는 방사성 동위원소, 니트로이미다졸, 효소 기질, 보조 인자, 리간드, 화학발광제, 형광단, 합텐, 효소, 및 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 표지화 방법 및 다양한 목적에 적절한 마커 선택에서의 가이드는 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989)] 및 [Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998)]에 논의되어 있다.
일부 실시양태에서, 마커는 형광단("형광성 표지")이다. 형광단은 특정 파장의 광에의 노출에 의해 여기되었을 때, 예를 들어, 상이한 파장에서 광(즉, 형광)을 방출하는 화학 화합물이다. 형광단은 그의 방출 프로파일, 또는 "색상"으로 기술될 수 있다. 녹색 형광단, 예를 들어, Cy3, FITC, 및 오레곤 그린(Oregon Green)은 일반적으로 515-540 λ 범위의 파장에서의 그의 방출을 특징으로 한다. 적색 형광단, 예를 들어, 텍사스 레드(Texas Red), Cy5, 및 테트라메틸로다민은 일반적으로 590-690 λ 범위의 파장에서의 그의 방출을 특징으로 한다.
시험관내 수정: 단세포 배아가 형성되도록 체외 배양물 중에서 수행되는 난모세포와 정자의 융합. 시험관내 수정은 정자를 배양물 중에서 난자와 함께 배양하여 단세포 배아를 형성하는 기술을 포함한다. 세포질내 정자 주입(ICSI: intracytoplamic sperm injection)은 단일 정자를 직접 난자 내로 주입하는 대안적인 시험관내 수정 시술이다. 상기 시술은 미세조작 장치를 이용하여 현미경하에서 수행된다. 미세주입기에 의해 부드럽게 흡입시키면서, 홀딩 피펫을 사용하여 성숙한 난모세포를 안정화시킨다. 반대쪽에서, 정자 꼬리를 미세주입기의 끝 부분과 부딪히게 하여 정자를 고정시키면서, 얇은 중공 유리 미세피펫을 사용하여 단일 정자를 수집한다. 난자세포막을 통해 난모세포 안쪽 부분(세포질) 내로 미세피펫을 피어싱한다. 이어서, 정자를 난모세포 내로 방출시킨다.
유사분열 또는 감수분열 방추체: 세포 분열 동안 염색체를 딸세포로 분리하는 구조물. 이는 진핵 세포에서 세포 골격의 일부분이다. 세포 분열 유형에 의존하여, 이는 또한 감수분열 동안에는 감수분열 방추체로도 지칭된다. 세포 방추체 장치는 방추체 미세소관, 회합된 단백질, 및 방추체 극에 존재하는 임의의 중심체 또는 성상체를 포함한다. 방추체 장치는 약간 타원체 형상이고, 단부에서는 점점 가늘어지지만, 중간부는 넓게 퍼져 있다. 방추체 중간대로 공지된 넓은 중간 부분에서, 역평행 미세소관은 키네신으로 번들링된다. 방추체 극으로 공지된 끝이 뾰족한 단부에서 미세소관은 대부분의 동물 세포에서 중심체에 의해 유핵화된다.
감수분열: 세포당 염색체의 개수가 절반으로 나누어지는 환원 분열 과정. 동물에서, 감수분열 결과로 항상 배우자가 형성된다.
감수분열 동안, 염색체 내로 패키징된 DNA의 긴 세그먼트로 구성된 이배체 생식 세포의 게놈은 DNA 복제된 후, 2 라운드의 분열을 거치게 되고, 그 결과 4개의 반수체 세포가 생성된다. 이들 세포는 각각 하나의 완전한 염색체 세트, 또는 원 세포의 유전 물질 함량의 절반을 함유한다. 감수분열 I은 상동성 염색체를 분리하여 2개의 반수체 세포(23개의 염색체, 인간에서 N)를 생성하는 바, 이에 감수분열 I은 환원 분열로 지칭된다. 일반 이배체 인간 세포는 46개의 염색체를 함유하고, 이는 23개의 상동성 염색체 쌍을 함유하는 바, 2N으로 간주된다. 그러나, 감수분열 I 후, 비록 세포가 46개의 염색체를 함유하더라도, 추후에 후기 I에서, 방추체가 쌍을 새 세포의 극 방향으로 잡아 당김에 따라, 자매 염색분체는 함께 그대로 유지되기 때문에, 오직 N으로만 간주된다. 감수분열 II에서, 유사분열과 유사한 균등 분열이 일어나게 되고, 이로써, 최종적으로 자매 염색분체가 분할되어 제1 분열로부터 딸세포 1개당 총 4개의 반수체 세포(23개의 염색체, N)이 생성된다.
따라서, 감수분열 II는 감수분열 과정의 제2부이다. 상기 과정 대부분은 유사분열과 유사하다. 그 결과로, 감수분열 I에서 생성된 2개의 반수체 세포로부터 4개의 반수체 세포(23개의 염색체, 인간에서 1N)(23개의 염색체, 1N * 2개의 자매 염색분체로 구성된 각각의 염색체)가 생성된다. 감수분열 II의 주요 4 단계는 전기 II, 중기 II, 후기 II, 및 말기 II이다. 중기 II에서, 동원체는 각 극에서 중심체(중심소체)로부터의 방추체 섬유에 부착되어 있는 2개의 방추체부착점을 함유한다. 중기의 새 적도판은 이전 적도판과 수직으로, 감수분열 I과 비교하여 90도 만큼 회전된다.
유사분열 또는 유사 세포 분열: 전형적인 체세포 분열로서, 각각이 모계 핵과 동일한 개수 및 종류의 염색체를 갖는 2개의 딸세포를 생성하게 되는 세포 분열 유형. 유사분열은 전기, 중기, 후기, 및 말기를 포함하고, 그 결과로 염색체 함량이 동일한 2개의 새로운 핵이 형성된다. 세포 주기는 4개의 상이한 기: G1기, S기(합성), G2기(통틀어 간기로 공지), 및 M기(유사분열)로 구성된다. M기는 세포의 염색체가 분열되는 핵분열, 및 세포의 세포질이 분열하여 2개의 딸세포를 형성하는 세포질분열인, 매우 밀접하게 커플링된 두 과정으로 구성된다. DNA가 복제되는 간기의 S 단계는 유사분열(즉, 핵 분열)에 선행하고, 이는 대개 세포질분열을 동반하거나, 또는 후속으로 세포질분열이 일어나게 되며, 여기서, 세포질, 세포 소기관, 및 세포막은 거의 균등하게 할당된 양의 세포 성분을 함유하는 2개의 새로운 세포로 나누어진다. 조합된, 유사분열 및 세포질분열은 동물 세포 주기의 유사분열(M) 기를 포함한다(즉, 모세포의, 유전적으로 동일한 2개의 딸세포로의 분열).
모자이크: 2개의 상이한 세포 유형, 특정 대립유전자에 대해 이형접합성인 세포, 및 특정 대립유전자에 대해 동형접합성인 다른 세포로 구성된 개체.
핵 유전 물질: 개체에 대한 정보를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예컨대, DNA)를 포함하는, 핵에서 발견되는 구조물 및/또는 분자. 핵 유전 물질은 염색체 및 염색질을 포함한다. 상기 용어는 또한 세포 분열, 예컨대, 모세포의 딸세포로의 분열에 의해 생성된 핵 유전 물질(예컨대, 염색체)도 지칭한다. 핵 유전 물질은 미토콘드리아 DNA는 포함하지 않는다.
작동가능하게 연결된: 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계를 가지고 배치되어 있을 때, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 준다면, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결어 있는 것이다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접해 있고, 필요할 경우, 동일 리딩 프레임 내에서 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하도록 되어 있다.
난모세포: 생식에 관여하는 암컷 배우자 또는 생식 세포로서, 이는 또한 난자로도 지칭된다. 성숙한 난자는 단일의 모계 염색체 세포(23, 인간 영장류에서 X)를 가지며, 중기 II에서 중단된다. "하이브리드" 난모세포는 제1 영장류 난모세포("수용자"로 명명)로부터 세포질을 가지지만, 수용자의 핵 유전 물질을 가지지 않고; 이는 "기증자"로 명명되는 또 다른 난모세포로부터의 핵 유전 물질을 갖는다.
약학적으로 허용되는 담체: 본 발명에서 유용한 약학적으로 허용되는 담체는 통상적인 것이다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]에는 본원에 개시된 융합 단백질의 약학적 전달에 적합한 조성물 및 제제가 기술되어 있다.
일반적으로, 담체의 성질은 사용되는 특정 투여 모드에 의존하게 될 것이다. 예를 들어, 비경구적 제제는 일반적으로 비히클로서 약학적으로 및 생리적으로 허용되는 유체, 예컨대, 물, 생리 식염수, 평형 염 용액, 수성 덱스트로서, 글리세롤 등을 포함하는 주사용 유체를 포함한다. 고체 조성물(예컨대, 분제, 환제, 정제, 또는 캡슐 형태)을 위해, 통상의 비독성 고체 담체는 예를 들어, 약학 등급의 만닛톨, 락토스, 전분, 또는 스테아르산 마그네슘을 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체 이외에도, 투여하고자 하는 약학적 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대, 습윤화제 또는 유화제, 보존제, pH 완충화제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.
폴리뉴클레오티드: 임의 길이의 핵산 서열(예컨대, 선형 서열). 그러므로, 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 염색체에서 발견되는 유전자 서열을 포함한다. "올리고뉴클레오티드"는 천연 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 복수의 연결된 뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 6 내지 300개의 뉴클레오티드 길이인 폴리뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드 유사체는 올리고뉴클레오티드와 유사한 기능을 하지만, 비자연적으로 발생된 부분을 갖는 모이어티를 지칭한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 유사체는 비자연적으로 발생된 부분, 예컨대, 변경된 당 모이어티 또는 당간 결합, 예컨대, 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 자연적으로 발생된 폴리뉴클레오티드의 기능적 유사체는 RNA 또는 DNA에 결합할 수 있고, 펩티드 핵산(PNA: peptide nucleic acid) 분자를 포함한다.
출생 전: 출생 전에 존재 또는 발생하는 것. 유사하게, "출생 후"는 출생 후에 존재 또는 발생하는 것.
영장류: 원숭이 및 인간을 비롯한, 영장류 목의 모든 동물. 예시적인 비인간 영장류로는 예를 들어, 침팬지, 레수스 마카크, 다람쥐 원숭이, 및 여우 원숭이를 포함한다. 이는 구세계, 신세계, 및 프로시미안 원숭이를 포함한다.
재조합: 두 폴리뉴클레오티드 사이의 유전 정보 교환 프로세스. "상동성 재조합(HR)"은 예를 들어, 세포에서 이중 가닥 파단의 수복 동안 발생하는 전문화된 형태의 교환을 지칭한다. 뉴클레오티드 서열 상동성은 "표적" 분자(즉, 이중 가닥 파단을 경험한 분자)의 주형 수복에 대한 "기증자" 분자를 사용하는 재조합에서 사용된다. 재조합은 기증자로부터 표적으로 유전 정보를 전달하기 때문에, 이는 "비교차 유전자 전환" 또는 "짧은 tract 유전자 전환"을 포함한다.
서열 동일성: 아미노산 서열 사이의 유사성은, 다르게는 서열 동일성으로도 지칭되는, 서열 사이의 유사성으로 표현된다. 서열 동일성은 빈번하게는 동일성(또는 유사성 또는 상동성) 백분율(%)으로 측정되고; 백분율(%)이 높을수록 두 서열으 더욱 유사하다. FGF 폴리펩티드의 상동체 또는 변이체는 표준 방법을 사용하여 정렬되었을 때, 비교적 높은 서열 동일성 정도를 가질 것이다.
비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 문헌 [Smith and Waterman, Adv . Appl . Math., 2:482, 1981]; [Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol ., 48:443, 1970]; [Pearson and Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA 85:2444, 1988]; [Higgins and Sharp, Gene, 73:237, 1988]; [Higgins and Sharp, CABIOS , 5:151, 1989]; [Corpet et al., Nucleic Acids Research, 16:10881, 1988]; 및 [Pearson and Lipman, Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 85:2444, 1988]에 기술되어 있다. 문헌 [Altschul, et al., Nature Genet., 6:119, 1994]에는 서열 정렬 방법 및 상동성 산출에 관한 상세한 고려 사항이 제시되어 있다.
NCBI 기본 국소 정렬 검색 도구(BLAST: NCBI Basic Local Alignment Search Tool)(문헌 [Altschul, et al., J. Mol . Biol . 215:403, 1990])는 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn, 및 tblastx와 관련된 사용을 위해 미국 국립 생명공학 정보 센터(NCBI: National Center for Biotechnology Information, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재)를 비롯한 여러 공급원으로부터 및 인터넷상에서 이용가능하다.
폴리펩티드의 상동체 및 변이체는 전형적으로 디폴트 파라미터로 설정된 갭이 있는 blastp인 NCBI Blast 2.0을 이용하여 인자의 아미노산 서열과의 전장의 정렬에 대해 계수된 적어도 약 75%, 예를 들어, 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 한다. 약 30개 초과의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열의 비교를 위해, 디폴트 파라미터(갭 존재 코스트 11 및 잔기 1개당 갭 코스트 1)로 설정된 디폴트 BLOSUM62 매트릭스를 이용하는 Blast 2 서열 함수가 사용된다. 짧은 펩티드(약 30개 미만의 아미노산)를 정렬할 때, 정렬은 디폴트 파라미터(개방 갭 9, 연장 갭 1 패널티)로 설정된 PAM30 매트릭스를 이용하면서, Blast 2 서열 함수를 사용하여 수행되어야 한다. 참조 서열에 대하여 유사성이 더욱 큰 단백질은 상기 방법에 의해 사정되었을 때, 증가하는 동일성(%), 예컨대, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 보일 것이다. 전체 서열보다 적은 서열을 서열 동일성에 대해 비교하였을 때, 상동체 및 변이체는 전형적으로 10-20개의 아미노산으로 이루어진 짧은 윈도우에 걸쳐 적어도 80% 서열 동일성을 가질 것이며, 참조 서열과의 그의 유사성에 의존하여 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 상기 짧은 윈도우에 걸쳐 서열 동일성을 측정하는 방법은 인터넷상 NCBI 웹사이트에서 이용가능하다. 이러한 서열 동일성 범위는 단지 가이던스를 위해 제공되는 것이며; 제공된 범위 밖에 포함되어 있는 매우 중요한 상동체가 수득될 수 있다는 것도 전반적으로 가능하다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
단일 가닥 핵산: 오직 단일 중합체 가닥만을 포함하는 핵산(즉, 핵산 중합체 가닥은 또 다른 핵산 중합체와 비공유 결합을 형성하지 않는다), 예컨대, 단일 가닥 DNA(ssDNA: single-stranded DNA). 핵산 분자는 전체적으로(예컨대, 이중 가닥 DNA 분자의 용융을 통해 형성된 ssDNA) 또는 부분적으로(예컨대, 손상 및/또는 효소 활성을 통해 형성된 ssDNA 영역)으로 단일 가닥일 수 있다.
부위 특이적 결합: 정의된 표적, 예컨대, 핵산, 단백질, 효소, 다당류, 또는 소분자, 예를 들어, 대립유전자, 예컨대, 영장류 세포에서 교정을 위한 관심 대립유전자 내의 정의된 표적 핵산 서열에만 실질적으로 또는 우선적으로 결합하는 뉴클레오티드 결합 가이드(예컨대, CRISPR-Cas9 시스템의 가이드 RNA, gRNA; TALEN의 TALE; 또는 ZFN의 아연 핑거)에만 진행되는 실질적 또는 우선적 결합. 특정 작용제가 실질적으로 오직 특이적인 폴리펩티드에만 결합한다는 것은 통상의 절차를 사용하거나, 또는 그를 적합화시킴으로써 쉽게 측정될 수 있다(예컨대, 문헌 [Brazelton et al., GM Crops Food, 6(4): 266-276, 2015] 참조).
피험체: 모든 척추동물, 예컨대, 포유동물 및 비포유동물, 예컨대, 비인간 영장류, 마우스, 토끼, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 및 파충류를 비롯한 인간 및 비인간 동물. 기술된 방법의 다수의 실시양태에서, 피험체는 인간이다.
표적화된 뉴클레아제: 핵산 상의 특이적 부위로 지시되는 뉴클레아제. 일부 예에서, 표적화된 뉴클레아제는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다(즉, 예컨대, CRISPR-Cas9, 아연 핑거 뉴클레아제, ZFN, 또는 전사 활성화인자 유사 이펙터, TALEN과 같은 표적화된 뉴클레아제는 인공적인 도움 없이는 자연상에 존재하지 않는다).
전능성 ( 전능성 ( totipotency )): 분열할 수 있고, 궁극적으로는, 생체내에서 모든 배아외 조직을 비롯한 전체 유기체를 생산할 수 있는 세포의 능력. 한 측면에서, "전능성"이라는 용어는 시험관내에서 배반포로의 연속된 분열을 통해 진행될 수 있는 세포의 능력을 지칭한다. 배반포는 내부 세포 덩어리(ICM) 및 영양외배엽을 포함한다. ICM에서 발견되는 세포는 무한 증식할 수 있거나, 또는 적절하게 유도되었다면, 유기체에 기여하는 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 소지한 만능성 줄기 세포(PSC: pluripotent stem cell)를 만들어 낸다. 영양외배엽 세포는 태반 및 양수를 비롯한, 배아외 조직을 생성한다.
본원에서 사용되는 바, "만능성"이라는 용어는 3가지 배엽층: 내배엽(예컨대, 내부 위벽, 위장관, 및 폐), 중배엽(예컨대, 근육, 뼈, 혈액, 비뇨 생식기), 및 외배엽(예컨대, 표피 조직 및 신경계)의 세포로 분화가능한 세포의 잠재능을 지칭한다. 만능성 줄기 세포는 생식 세포를 비롯한, 임의의 태아 또는 성체 세포 유형을 만들어 낼 수 있다. 그러나, PSC는 모든 배아외 조직(예컨대, 생체내 태반 또는 시험관내 영양포)에 기여할 수 있는 잠재능은 부족하기 때문에, 자궁에 이식되었을 때, 그 단독으로는 태아 또는 성체 동물로 발생하지 못한다.
PSC는 자발적 분화를 통한, 또는 시험관내 분화 유도 조건에의 노출에 기인하는 다능성 줄기 세포(MPSC: multipotent stem cell)의 공급원이다. "다능성"이라는 용어는 분화할 수 있고, 제한된 개수의 관련된, 상이한 세포 유형을 만들어 낼 수 있는 세포의 잠재능을 지칭한다. 이들 세포는 그의 다계통 잠재능, 및 자기 재생 능력을 특징으로 한다. 생체내에서 MPSC의 풀은 체내 기능적으로 활성인 성숙한 세포 집단을 보충해준다. 예시적인 MPSC 유형 중에는 조혈, 중간엽, 또는 뉴런 줄기 세포가 있다.
이식가능한 세포로는 MPSC 및 더욱 분화된 세포 유형, 예컨대, 수임된 전구체 뿐만 아니라, 부분적으로 또는 완전히 성숙화되거나, 또는 분화되는, 분화 및/또는 성숙한 경로를 추가로 따르는 세포를 포함한다. "수임된 전구체"는 특정 세포 계통의 완전히 분화된 세포를 만들어 낸다. 예시적인 이식가능한 세포로는 췌장 세포, 상피 세포, 심장 세포, 내피 세포, 간세포, 내분비 세포 등을 포함한다.
전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제( TALEN ): 아미노산 반복서열(예컨대, 33 또는 34개의 아미노산 반복부) 어레이를 포함하는 DNA 결합 단백질. TALEN은 비자연적으로 발생된 것이고, 전사 활성화인자 유사 이펙터(TALE) 도메인에 융합된 뉴클레아제의 DNA 절단 도메인을 포함한다. TALE 도메인은 특정 DNA 서열로 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gaj et al., Trends Biotechnol, 31(7): 397-405, 2013](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)을 참조한다.
치료하는, 치료, 및 요법: 예컨대, 증상의 완화, 관해, 감소, 또는 병태가 환자에게 더욱 큰 내성을 가지도록 만드는 것, 변성 또는 쇠약 속도를 저속화시키는 것, 최종 지점의 변성을 덜 쇠약한 상태로 만드는 것, 피험체의 신체적 또는 정신적 웰빙을 개선시키는 또는 시력을 개선시키는 것과 같이, 임의의 객관적인 또는 주관적인 파라미터를 비롯한, 손상, 병상, 또는 병태의 약화 또는 호전에서의 임의의 성공 또는 성공 징후. 치료는 신체 검사, 신경학적 검사, 또는 정신 감정의 결과를 비롯한, 객관적인 또는 주관적인 파라미터에 의해 사정될 수 있다.
상류: "상류" 위치는 참조 지점보다 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 더 가까운 것인 폴리뉴클레오티드 상에서의 상대적인 위치. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 경우, 5' 및 3' 말단 배향은 안티센스 가닥에 반대되는 센스 가닥에 기초한다.
벡터: 핵산 분자는 숙주 세포 내로 도입되고, 이로써, 형질전환된 숙주 세포를 생성하게 된다. 벡터는 핵산 서열이 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 하게 하는 핵산 서열, 예컨대, 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 치료 유전자 및/또는 선별가능한 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환, 또는 감염시켜 세포가 세포에 대해 천연인 것 이외의 다른 핵산 및/또는 단백질을 발현할 수 있도록 할 수 있다. 벡터는 임의적으로 핵산의 세포 내로의 진입을 달성하는 데 도움을 주는 물질, 예컨대, 바이러스 입자, 리포솜, 단백질 코팅 등을 포함한다.
야생형: 자연상에 존재하는 것과 같은 전형적인 형태의 대립유전자의 표현형. 질환 프로세스에 영향을 주는 유전자와 관련하여, "돌연변이체"인, 질환 프로세스와 연관된 대립유전자와 달리,"야생형"은 유전자좌에서 "정상적인" 대립유전자이다. 돌연변이체 대립유전자는 삽입, 결실, 염기쌍 돌연변이, 및/또는 프레임 시프트 돌연변이의 결과일 수 있다.
아연 핑거 DNA 결합 도메인: 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역으로서, 그의 구조는 아연 이온의 배위결합을 통해 안정화되는 것인 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 폴리펩티드 도메인.
아연 핑거 결합 도메인, 예를 들어, 아연 핑거의 인식 나선은 미리결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 조절되어야 한다. 아연 핑거 결합 도메인의 디자인을 위한 합리적 기준은 치환 법칙 적용 및 현 ZFP 디자인 및 결합 데이터의 정보를 저장하면서 데이터베이스에 정보를 프로세싱하기 위한 전산화 알고리즘을 포함하며, 예를 들어, 미국 특허 제5,789,538호; 미국 특허 제5,925,523호; 미국 특허 제6,007,988호; 미국 특허 제6,013,453호; 미국 특허 제6,140,081; 미국 특허 제6,200,759호; 미국 특허 제6,453,242호; 미국 특허 제6,534,261호; 및 PCT 공개 WO 95/19431, WO 96/06166, WO 98/53057, WO 98/53058, WO 98/53059, WO 98/53060, WO 98/54311, WO 00/27878, WO 01/60970, WO 01/88197, WO 02/016536, WO 02/099084, 및 WO 03/016496(상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)을 참조한다.
아연 핑거 뉴클레아제( ZFN ): 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인과 융합시킴으로써 생성된 비자연적으로 발생된 제한 효소. 예를 들어, 문헌 [Gaj et al., Trends Biotechnol, 31(7): 397-405, 2013](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)을 참조한다.
달리 언급되지 않는 한, 기술 용어는 통상의 용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서의 일반 용어에 관한 정의는 문헌 [Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)]; [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]; 및 [Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 살펴볼 수 있다.
여러 실시양태에 관한 개요
영장류 세포에서 관심 유전자의 돌연변이체 대립유전자를 교정하는 방법을 개시한다. 본 방법은 단계 a) 함께 작용하여 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 파단을 도입하는 비자연적으로 비자연적으로 발생된 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드를 영장류 세포 내로 도입하는 단계로서, 여기서, i) 상기 영장류 세포는 유사 세포 분열 중이고; ii) 상기 영장류 세포는 돌연변이체 대립유전자에 대해 이형접합성인 게놈을 포함하여, 상기 게놈은 돌연변이체 대립유전자 한 카피 및 야생형 대립유전자 한 카피를 포함하고; iii) 상기 야생형 대립유전자에 상동성인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 영장류 세포 내로 도입되지 않는 것인 단계를 포함한다. 표적화된 뉴클레아제는 클러스터된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복서열(CRISPR) 연관(Cas)9, 아연 핑거 단백질(ZNF), 또는 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)일 수 있다. 본 방법은 또한 단계 b) 상기 영장류 세포가 돌연변이체 대립유전자에서 이중 가닥 DNA 파단의 상동성 지정 수복을 활성화하도록 하여 수복 주형으로서 정상 야생형 대립유전자를 사용하여 돌연변이체 대립유전자를 교정하고, 야생형 대립유전자에 대해 동형접합성인 영장류 세포를 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 영장류는 인간이다.
일부 실시양태에서, 영장류 세포는 배아 세포, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 단세포 배아이다. 본 방법은 영장류 종으로부터 관심 유전자의 돌연변이체 대립유전자 또는 야생형 대립유전자를 갖는 게놈을 포함하는 영장류 난모세포를 선택하고, 상기 영장류 난모세포를 동일한 영장류 종으로부터의 정자와 수정시킴으로써 단세포 영장류 배아를 형성하며, 여기서, 상기 정자는 각각 관심 유전자의 야생형 대립유전자 또는 돌연변이체 대립유전자를 포함하고, 상기 영장류 배아는 이형접합성이고 야생형 대립유전자 한 카피 및 돌연변이체 대립유전자 한 카피를 포함하는 것에 의해, 배아, 예컨대, 단세포 배아를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적인 비제한적인 예에서, 영장류 난모세포 수정과 동시에, 영장류 난모세포 내로 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드가 도입된다. 다른 비제한적인 예에서, 영장류 난모세포를 수정시키는 것은 세포질내 정자 주입(ICSI)을 포함한다. 더욱 비제한적인 예에서, 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드가 도입될 때, 영장류 난모세포는 중기 II일 때이다. 추가의 비제한적인 예에서, 본 방법은 시험관내에서 배아를 배양하여 다세포 배아를 형성하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 다세포 배아는 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 세포에 대해 모자이크가 아니다.
추가의 실시양태에서, 본 방법은 예컨대, 생어(Sanger) 시퀀싱을 이용하여 돌연변이체 대립유전자의 성공적인 교정에 대해 검정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 예컨대, 전체 게놈 시퀀싱을 이용하여 오프 타겟 효과에 대해 검정하는 단계를 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 영장류 세포는 체세포, 예를 들어, 중배엽, 내배엽, 또는 외배엽 세포이다. 체세포는 심장 세포, 피부 세포, 백혈구, 간세포, 췌장 세포, 신장 세포, 난소 세포, 고환 세포, 전립선 세포, 유방 세포, 근육 세포, 소화기계 세포, 호흡기계 세포, 또는 골원성 세포일 수 있다.
추가 실시양태에서, 영장류 세포는 만능성 또는 다능성 줄기 세포일 수 있다. 일부 구체적인, 비제한적인 예에서, 영장류 세포는 골수 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 장 줄기 세포, 뉴런 줄기 세포, 또는 치아 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 대립유전자는 야생형 대립유전자와 비교하여 결실 또는 삽입을 포함한다. 추가 실시양태에서, 돌연변이체 대립유전자는 야생형 대립유전자와 비교하여 염기쌍 치환을 포함한다. 추가 실시양태에서, 돌연변이체 대립유전자는 야생형 대립유전자와 비교하여 프레임 시프트 돌연변이를 포함한다. 일부 비제한적인 예에서, 관심 유전자는 미오신 결합 단백질 C(MYBPC3: myosin binding protein C), 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR3: fibroblast growth factor receptor), 세르핀 패밀리 A 구성원 1(SERPINA1: serpin family A member 1), 단백질 키나제 D1(PKD: protein kinase D1), 유방암 1(BRCA1: breast cancer 1), 유방암 2(BRCA2: breast cancer 2), 글리실-tRNA 신테타제(GARS: glycyl-tRNA synthetase), WNT 신호전달 경로 조절인자(APC: signaling pathway regulator), 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자(CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), 키메린 1(CHN1: chimerin 1), 디스트로핀(DMD: 디스트로핀), 응고 인자 V(F5: coagulation factor V), 취약 X 정신 지체 1(FMR1: fragil X mental retardation 1), 글루코실세라미다제 베타(GBA: glucosylceramidase beta), 항상성 철 조절인자(HFE: homeostatic iron regulator), 응고 인자 IX(FIX), 헌팅틴(HD: huntingtin), 피브릴린 1(FBN1: fibrillin 1), 근긴장성 디스트로피 단백질 키나제(DMPK: dystrophia myotonica protein kinase), 세포 핵산 결합 단백질(CNBP: cellular nucleic acid binding protein), 단백질 티로신 포스파타제, 비수용체 타입 11(PTPN11: protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11), Ras/Rac 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 1(SOS1), Raf 프로토온코진 세린/트레오닌 키나제(RAF1), Kras 프로토온코진 GTP아제(KRAS), 콜라겐 타입 알파 1 쇄(COL1A1: collagen type alpha 1 chain), 콜라겐 타입 알파 2 쇄(COL1A2: collagen type alpha 2 chain), 시누클레인 알파(SNCA: synuclein alpha), 유비퀴틴 C 말단 하이드롤라제 L1(UCHL1: ubiquitin C-terminal hydrolase L1), 류신 풍부 반복서열 키나제 2(LRRK2: leucine rich repeat kinase 2), 파킨슨병 3(PARK3: Parkinson disease 3), 파킨 RBR E3 유비퀴틴 단백질 리가제(PARK2), 파킨슨증 연관 데글리카제(PARK7), PTEN 유도성 추정 키나제 1(PARK6), 아포지질단백질 B(APOB: apolipoprotein B), 저밀도 지질단백질 수용체(LDLR: low density lipoprotein receptor), 저밀도 지질단백질 수용체 어댑터 단백질 1(LDLRAP1: low density lipoprotein receptor adaptor protein 1), 프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 타입 9(PCSK9: proprotein convertase subtilisin/kexin type 9), 액틴 알파 심장 근육 1(ACTC1), 액티닌 알파2(ACTN2: actinin alpha2), 칼레티쿨린 3(CALR3: calreticulin 3), 시스테인 및 글리신 풍부 단백질 3(CSRP3: cysteine and glycine rich protein 3), 정토필린2(JPH2: junctophilin 2), 미오신 중쇄 7(MYH7: myosin heavy chain 7), 미오신 경쇄 2(MYL2: myosin light chain 2), 미오신 경쇄 3(MyL3: myosin light chain 3), 마이오제닌 2(MYOZ2: myozenin 2), 넥실린 F-액틴 결합 단백질(NEXN: nexilin F-actin binding protein), 포스포람반(PLN: phospholamban), 단백질 키나제 AMP 활성화 비촉매 서브유닛 감마 2(PRKAG2: protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit gamma 2), 티틴-캡(TCAP: titin-cap), 트로포닌 I3 심장 타입(TNNI3: troponin I3 cardiac type), 트로포닌 T2 심장 타입(TNNT2), 트로포미오신 1(TPM1: tropomyosin 1), 티틴(TTN: titin), 및/또는 빈쿨린(VCL)이다.
다른 구체적인, 비제한적인 예에서, (a) 체세포는 유방암을 앓는 인간 피험체 유래의 것이고, (b) 체세포는 유방 세포이고, (c) 관심 유전자는 BRCA1 또는 BRCA2이다. 추가의 비제한적인 예에서, (a) 체세포는 가족성 심근병증을 앓는 인간 피험체 유래의 것이고, (b) 세포는 심장 세포이고, (c) 관심 유전자는 MYBPC3, ACTC1, ACTN2, CALR3, CSRP3, JPH2, MYH7, MYL2, MyL3, MYOZ2, NEXN, PLN, PRKAG2, TCAP, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTN, 및/또는 VCL이다. 추가의 비제한적인 예에서, (a) 체세포는 가족성 고콜레스테롤혈증을 앓는 인간 피험체 유래의 것이고, (b) 세포는 심장 세포이고, (c) 관심 유전자는 APOB, LDLR, LDLRAP1, 및/또는 PCSK9이다.
CRISPR Cas 및 다른 표적화된 뉴클레아제 시스템
본원에서는 세포(예컨대, 영장류 세포, 예컨대, 배아 또는 체세포)에서 유전자를, 구체적으로, 하나의 돌연변이체 대립유전자 및 하나의 야생형 대립유전자가 존재하는 유전자를 변경시키기 위한 방법 및 조성물을 개시한다. 본원에 기술된 방법 및 조성물은 내인성 상동성 재조합이 세포(예컨대, 영장류 또는 인간 세포, 예컨대, 배아 또는 체세포) 내에서 발생하도록 관심 유전자 부위에 가까운 위치에 하나 이상의 파단을 도입하고, 이로써, 상기 유전자의 야생형 카피가 2개가 생성된다. 영장류 세포는 인간 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포(예컨대, 영장류 또는 인간 세포, 예컨대, 체세포 또는 배아)는 관심 유전자에서 이형접합성이다. 따라서, 세포는 야생형 서열을 갖는 하나의 대립유전자, 및 변이체 서열을 갖는 (교정시키고자 하는) 돌연변이체 대립유전자를 갖는 하나의 대립유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 함께 작용하여 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 파단을 도입하는 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드가 영장류 세포 내에서 사용될 수 있다. 표적 뉴클레아제는 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 DNA 파단을 도입하여 표적화된 돌연변이체 대립유전자가 Cas에 의해 절단되도록 하는 CRISPR-Cas(예컨대, CRISPR-Cas9) 시스템일 수 있다. 그 결과로 이중 가닥 파단이 도입된다. 돌연변이체 대립유전자에서는 야생형 대립유전자에 기초하여 상동성 지정 수복이 이루어지고, 이로써, 돌연변이체 대립유전자는 교정된다. 따라서, 야생형 대립유전자에 대해 동형접합성인 세포가 생성된다. 다른 실시양태에서, 야생형 대립유전자가 아닌, 돌연변이체 대립유전자 이중 가닥 DNA 파단을 유도한다면, 본원에 개시된 방법에서 상이한 폴리뉴클레오티드 결합 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리뉴클레오티드 결합 폴리펩티드는 예컨대, 돌연변이체 대립유전자 내에서 관심 게놈 표적 서열에 특이적으로 결합하는 재조합 DNA 결합 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드는 아연 핑거 도메인 또는 전사 활성화인자 유사 이펙터(TALE) 도메인, 또는 TALE 도메인 또는 아연 핑거 도메인의 DNA 결합 기능을 보유하는, 그의 폴리펩티드 단편을 포함한다. 추가로, 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드는 예컨대, 표적화된 뉴클레아제에 융합된 아연 핑거 도메인 또는 전사 활성화인자 유사 이펙터(TALE) 도메인, 또는 그의 단편과 같이, 표적화된 뉴클레아제와 함께 조합된다. 예시적인 뉴클레아제로는 S1 뉴클레아제, 녹두 뉴클레아제, 췌장 DNA아제 I, 마이크로코쿠스(micrococcal) 뉴클레아제, 및 효모 HO 엔도뉴클레아제; 문헌 [Linn et al. (eds.), Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993] 또한 참조한다.
뉴클레아제는 임의의 관심 뉴클레아제일 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 종에 존재하고, (인식 부위에서) DNA에 서열 특이적으로 결합할 수 있고, 결합 부위에서 또는 그에 가까운 위치에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소 (예컨대, 타입 IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하고, 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들어, 타입 IIS 효소 Fok I는 한 가닥 상의 그의 인식 자리로부터 9개 뉴클레오티드에서 및 나머지 다른 가닥 상의 그의 인식 자리로부터 13개 뉴클레오티드에서, DNA의 이중 가닥 절단을 촉매화한다)예를 들어, 미국 특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호; 문헌 [Li et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4275-4279, 1992]; [Li et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 90:2764-2768, 1993]; [Kim et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 91:883-887, 1994]; [Kim et al., J. Biol . Chem., 269:31, 978-31, 982, 1994] 참조). 따라서, 한 실시양태에서, 적어도 하나의 타입 IIS 제한 효소로부터의 뉴클레아제 도메인이 사용된다. 절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 것인 예시적인 타입 IIS 제한 효소는 Fok1이다. 상기 효소는 이량체로서 활성을 띤다(문헌 [Bitinaite et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 95:10,570-10, 575, 1998]). FokI 뉴클레아제의 추가 형태는 미국 공개 특허 출원 제20110027235호에 기술되어 있다(상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다). TALE 도메인으로부터 제조된 재조합 DNA 결합 폴리펩티드인 경우, 뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드와의 융합을 통해 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)가 형성된다. 이는 함께 작용하여 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 파단을 도입하는 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드로서 유용하다.
함께 작용하여 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 파단을 도입하여 돌연변이체 대립유전자, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 비기능성 유전자 생성물을 코딩하는 대립유전자를 표적화하는 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드. 돌연변이체 대립유전자는 야생형 대립유전자와 비교하여 삽입, 결실, 프레임 시프트 돌연변이, 또는 염기쌍 치환을 가질 수 있다. 간단한 유전자 파괴는 관심 세포(예컨대, 영장류 세포, 예컨대, 배아 또는 체세포)에서 표적 부위의 절단, 이어서, 핵산의 변경, 예컨대, 결실, 및 상동성 지정 수복(HDR)에 의한 수복에 의해 생성될 수 있다. 세포는 인간 세포일 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 구체적인 비제한적인 예에서, 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드는 단세포 배아 내로, 또는 난모세포 수정 동안, 예컨대, ICSI 동안 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 함께 작용하여 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 파단을 도입하는 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드는 CRISPR 시스템이다. 전형적인 CRISPR 시스템은 2가지 성분, CRISPR 연관 뉴클레아제(Cas), 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, Cas9, 및 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA)로 구성되며, 이들은 각각 (1) CRISPR RNA(crRNA: CRISPR RNA) 및 트랜스활성화 CRISPR RNA(tracrRNA: trans-activating CRISPR RNA) 또는 (2) 작은(또는 단일) 가이드 RNA(sgRNA: small(or single) guide RNA)를 함유한다. 임의 유형의 gRNA가 사용될 수 있다.
crRNA에 의한 표적 인식은 표적 DNA와 상보적인 염기쌍 형성을 통해 이루어지며, 이는 Cas 단백질에 의해 외래 서열의 절단을 지시한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA에 의한 DNA 인식, 및 그 결과로 진행되는 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 위해서는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM: protospacer adjacent motif)(예컨대, 5'-NGG-3')와, 및 표적 중의 프로토스페이서 영역과의 상보적인 염기쌍 형성이 요구된다(문헌 [Jinek, M. et al., Science, 337;816-821, 2012]). Cas에 의해 인식되는 PAM 모티프는 상이한 Cas 단백질에 대해서는 달라진다. 당업자는 임의의 Cas 단백질이 본원에 개시된 시스템 및 방법에서 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이는 Cas3, Cas8a, Cas5, Cs 8b, Cas8c, Cas10d, Cse1, Cse2, Csy1, Csy2, Csy3, GSU0054, Cas10, Csm2, Cmr5, Cas10, Csx11, Csn2, Cas4, Cpf1, C2c1, C2c3, C2c2, 및 Cas9를 포함한다. 한 구체적인 비제한적인 예에서, Cas9가 사용된다.
유용한 한 Cas9는 하기 서열 번호 1에 제시된 바와 같은, 스트렙토코쿠스 파이오진스로부터의 것이다.
Figure pct00001
다른 실시양태에서, 스트렙토코쿠스 파이오진스 Cas9 펩티드는 문헌 [Fonfara et al., Nucleic Acids Res.,　42(4):2577-90, 2014]; [Nishimasu H. et al., Cell,　156(5):935-49, 2014]; [Jinek M et al., Science, 17;337(6096):816-21, 2012]; 및 [Jinek M. et al., Science,　343(6176), 2014](상기 문헌은 모두 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 기능성 돌연변이를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 문헌에 기술된 돌연변이 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 시스템 및 방법은 이중 가닥 뉴클레아제 활성을 갖는 야생형 Cas9 단백질, 단일 가닥 닉카제로서 작용하는 Cas9 돌연변이체, 또는 변형된 뉴클레아제 활성을 갖는 다른 돌연변이체와 함께 사용될 수 있다.
Cas9는 촉매 활성 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 뉴클레아제는 HNH 유사 엔도뉴클레아제 및 RuvC 유사 엔도뉴클레아제를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이중 가닥 DNA 파단을 생성하기 위해, HNH 유사 엔도뉴클레아제는 gRNA에 상보성인 DNA 가닥을 절단하고, RuvC 유사 도메인은 비상보성 DNA 가닥을 절단한다. Cas9 엔도뉴클레아제는 특이적인 gRNA를 사용하여 특이적인 게놈 표적으로 가이드될 수 있다(하기 참조).
일부 실시양태에서, CRISPR/Cas9 시스템이 세포 내로 도입된다. 다른 실시양태에서, CRISPR/Cas9 시스템이 제조되고, 예컨대, ICSI에 의한 수정 동안 생체외에서 난모세포의 세포질내로 도입된다.
본원에 개시된 방법의 다른 실시양태에서, Cas9를 코딩하는 핵산이 도입되고, Cas9를 코딩하는 핵산에 프로모터가 작동가능하게 연결된다. 상기 프로모터를 통해 세포는 Cas9를 특이적으로 발현할 수 있다.
Cas9를 코딩하는 핵산이 사용되는 경우, 마커를 코딩하는 핵산 분자 또한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 마커로는 효소 및 형광성 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 구체적인 비제한적인 예에서, 마커는 tdTomato 형광성 단백질이다. 다른 실시양태에서, 마커를 코딩하는 핵산 분자는 로돕신 키나제 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않는다.
상기 언급된 바와 같이, Cas9 RNA 가이드 시스템은 gRNA, 예컨대, (1) 트랜스 활성화 crRNA(tracrRNA)에 염기쌍을 형성하여 2 RNA 구조를 형성하는 성숙한 crRNA, 또는 (2) sgRNA를 포함할 수 있고, 이들은 어느 것이든 Cas9를 표적 DNA 중에, 즉, 돌연변이체 대립유전자, 예컨대, MYBPC3, BRCA1, 및/또는 BRCA2 유전자에 돌연변이를 갖는 대립유전자에 원하는 이중 가닥(ds: double-stranded) 파단의 유전자좌로 유도한다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 및 crRNA gRNA가 사용되고, 염기쌍 형성한 tracrRNA:crRNA 조합은 서열 특이적 Cas9 dsDNA 절단을 지시할 수 있는 능력을 보존하는 가이드 서열(예컨대, gRNA)을 생성하는 단일 RNA 키메라로서 조작된다(문헌 [Jinek, M., et al., Science, 337:816-821, 2012]). 일부 실시양태에서, Cas9-가이드 서열 복합체를 통해 돌연변이체 대립유전자, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, MYBPC3, BRCA1, 및/또는 BRCA2 유전자에 돌연변이를 갖는 대립유전자 내의 표적 서열에서 한 가닥 또는 두 가닥 모두를 절단한다. 따라서, Cas9 엔도뉴클레아제(문헌 [Jinek, M., et. al., Science, 2012]; [Mali, P. et al., Nat Methods, 10(10): 1028-1034, 2013]) 및 gRNA 분자는 돌연변이체 대립유전자, 예컨대, MYBPC3, BRCA1, 및/또는 BRCA2 유전자에 돌연변이를 갖는 대립유전자의 내인성 수복 기전을 이용하는 서열 특이적 표적 인식, 절단, 및 게놈 편집을 위해 사용된다. 절단은 이중 가닥 절단일 수 있다.
일부 실시양태에서, gRNA 분자는 표적 게놈 표적이 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)를 보유하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA에 의한 DNA 인식, 및 그 결과로 진행되는 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 위해서는 표적 바로 뒤에 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)(예컨대, 5'-NGG-3')가 존재하여야 한다.
일부 실시양태에서, 절단은 PAM으로부터 상류쪽으로 대략 3 염기쌍만큼 떨어진 부위에서 발생하게 된다. 일부 실시양태에서, Cas9 뉴클레아제는 이중 가닥 핵산 서열을 절단한다.
일부 실시양태에서, 가이드 서열은 서열 내의 2차 구조의 정도를 감소시키도록 선택된다. 2차 구조는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 일부 프로그램은 최소 깁스 자유 에너지를 산출하는 것을 기반으로 한다. 상기와 같은 한 알고리즘의 예로는 mFold(문헌 [Zuker and Stiegler, Nucleic Acids Res., 9, 133-148, 1981])가 있다. 또 다른 예의 폴딩 알고리즘은 중심 구조 예측 알고리즘을 이용하는, 온라인 웹서버 RNAfold이다(예컨대, 문헌 [A.R. Gruber et al., Cell, 106(1): 23-24, 2008]; 및 [PA Can and GM Church, Nature Biotechnology,　27(12): 1151-62, 2009] 참조). 가이드 서열은 crispr.mit.edu에서 살펴볼 수 있는 MIT CRISPR 디자인 도구, 또는 e-crisp.org 인터넷상에서 살펴볼 수 있는 E-CRISP 도구를 사용하여 디자인될 수 있다. 가이드 서열 디자인을 위한 추가 도구는 문헌 [Naito Y et al., Bioinformatics,　2014], 및 [Ma et al., BioMed Research International, Volume　2013, Article ID　270805, 2013]에 기술되어 있다. sgRNA 중의 crRNA 또는 DNA 인식 서열("표적 서열")의 길이는 18-48개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. crRNA 또는 표적 서열의 길이는 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 68, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개의 뉴클레오티드 길이 또는 약 18-23, 23-28, 28-33, 33-38, 38-43, 또는 43-48개의 뉴클레오티드 길이 또는 약 19 또는 20개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 예에서, crRNA 또는 표적 서열의 길이는 19 또는 20개의 뉴클레오티드 길이이다. 구체적인 예에서, sgRNA가 사용된다. MYBCP를 표적화하는 sgRNA에 대한 예시적인 표적 서열은 하기와 같다:
Figure pct00002
MYBCP를 표적화하는 예시적인 sgRNA 서열열은 하기와 같다:
Figure pct00003
다른 gRNA 서열도 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, BRCA gRNA 서열은 GENSCRIPT 웹사이트(genscript.com, 2018년 4월 15일자로 이용가능한 것으로서, 이는 참조로 포함된다)에서 이용가능하다. 다양한 gRNA 서열이 데이터베이스에서 이용가능하고; 예를 들어, 2018년 4월 15일자로 이용가능한 genscript.com을 참조한다.
영장류 세포에서 관심 돌연변이체 대립유전자를 교정하는 방법
영장류 세포에서 관심 유전자의 돌연변이체 대립유전자를 교정하는 방법. 본 방법은 단계 a) 함께 작용하여 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 파단을 도입하는 비자연적으로 발생된 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드를 영장류 세포 내로 도입하는 단계로서, 여기서, i) 상기 영장류 세포는 유사 세포 분열 중이고; ii) 상기 영장류 세포는 돌연변이체 대립유전자에 대해 이형접합성인 게놈을 포함하여, 상기 게놈은 돌연변이체 대립유전자 한 카피 및 야생형 대립유전자 한 카피를 포함하고; iii) 상기 야생형 대립유전자에 상동성인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 영장류 세포 내로 도입되지 않는 것인 단계를 포함한다. 일부 예에서, 표적화된 뉴클레아제는 클러스터된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 연관(Cas)9, 아연 핑거 단백질(ZNF), 또는 전사 활성화인자 유사 이펙터(TALEN)일 수 있다. 본 방법은 또한 단계 b) 상기 영장류 세포가 돌연변이체 대립유전자에서 이중 가닥 DNA 파단의 상동성 지정 수복을 활성화하도록 하여 수복 주형으로서 정상 야생형 대립유전자를 사용하여 돌연변이체 대립유전자를 교정하고, 야생형 대립유전자에 대해 동형접합성인 영장류 세포를 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 영장류는 인간이다. 적합한 세포는 하기 개시된다.
개시된 방법의 일부 실시양태에서, 단일 가닥 핵산, 예컨대, 수복 주형은 사용되지 않는다. 수복 주형은, DNA 파단이 발생하는 영역에 상동성인 약 40 내지 약 90개의 염기쌍, 예컨대, 약 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 또는 적어도 90 또는 약 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 또는 80-90개의 염기쌍을 포함할 수 있는 단일 가닥 DNA이다. 본 실시양태에서, 야생형 대립유전자에 상동성인 수복 주형은 세포 내로 도입되지 않는다.
본원에 개시된 방법을 사용하여 임의의 돌연변이체 대립유전자가 교정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 대립유전자는 야생형 대립유전자와 비교하여 결실 및/또는 삽입을 포함한다. 다른 실시양태에서 돌연변이체 대립유전자는 야생형 대립유전자와 비교하여 염기쌍 치환을 포함한다. 추가 실시양태에서, 돌연변이체 대립유전자는 야생형 대립유전자와 비교하여 프레임 시프트 돌연변이를 포함한다. 배아가 대립유전자에 대해 이형접합성이라면, 임의의 대립유전자도 본원에 개시된 방법을 사용하여 교정될 수 있음을 이해한다.
본원에서는 영장류 세포(예컨대, 인간 세포 및/또는 배아)에서 관심 유전자의 돌연변이체 대립유전자를 교정하는 방법을 개시한다. 1개 초과의 대립유전자, 예컨대, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 또는 25개 또는 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-10, 10-15, 15-20, 또는 20-25개의 대립유전자가 교정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한다. 1개 초과의 DNA 파단이 1개 초과의 gRNA를 이용하여 1개 초과의 대립유전자에 도입될 수 있다. 예를 들어, 2개의 gRNA가 사용될 수 있고, 이로써, 둘 모두가 세포에 이형접합성 형태로 존재하는 2개의 상이한 대립유전자에서 2개의 파단이 달성된다. 표적 핵산에 2개 이상의 절단 이벤트를 배치시키는 데 2개 이상의 gRNA가 사용될 때, 실시양태에서, 2개 이상의 절단 이벤트는 동일하거나, 또는 상이한 Cas9 단백질에 의해 이루어질 수 있다고 간주된다. 예를 들어, 2개의 이중 가닥 파단을 배치시키는 데 2개의 gRNA가 사용될 때, 두 이중 가닥 파단 모두를 생성하는 데 단일 Cas9 뉴클레아제가 사용될 수 있다.
본 방법은 함께 작용하여 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 파단을 도입하는 비자연적으로 발생된 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드를 영장류 세포 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 영장류 세포는 유사 세포 분열 중인 것이다. 영장류 세포는 돌연변이체 대립유전자에 대해 이형접합성인 게놈을 포함하고, 예를 들어, 이로써, 게놈은 돌연변이체 대립유전자 한 카피 및 야생형 대립유전자 한 카피를 포함한다. 본원의 방법에서, 야생형 대립유전자에 상동성인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 필요가 없고, 따라서, 야생형 대립유전자에 상동성인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 영장류 세포 내로 도입되지 않는 방법이 수행될 수 있다. 본원의 방법은 영장류 세포가 돌연변이체 대립유전자에서 이중 가닥 DNA 파단의 상동성 지정 수복을 활성화하도록 할 수 있다. 이로써, 본 방법은 수복 주형으로서 정상 야생형 대립유전자를 사용하여 돌연변이체 대립유전자를 교정할 수 있고, 야생형 대립유전자에 대해 동형접합성인 영장류 세포를 생산할 수 있다.
함께 작용하여 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 파단을 도입하는 임의의 비자연적으로 발생된 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드가 영장류 세포 내에서 사용될 수 있다. 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드는 별개의 분자일 수 있거나, 또는 함께 융합될 수 있다. 일부 예에서, 뉴클레아제 및 가이드는 함께 작용하여 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 파단을 도입하는 별개의 분자, 예컨대, 클러스터된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복서열(CRISPR) 연관(Cas) 시스템(예컨대, CRISPR-Cas9)이다. 예를 들어, CRISPR-Cas9 시스템은 관심 유전자에 특이적인 가이드 핵산(예컨대, 가이드 RNA, "gRNA")을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드는 예컨대, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)과 같이 함께 융합될 수 있다. 예를 들어, ZFN 또는 TALEN은 관심 유전자에 특이적인 아연 핑거 도메인 또는 전사 활성화인자 유사 이펙터(TALE) 도메인을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 본 방법은 추가로 돌연변이체 대립유전자의 성공적인 교정에 대하여 검정하는 단계를 포함할 수 있다. 대립유전자의 성공적인 교정은 성공적인 교정, 예컨대, 돌연변이체 대립유전자의 교정 중 하나 이상의 측면에 대해 검정하고, 오프 타겟 효과를 회피하는 것을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 성공적인 교정은 돌연변이체 대립유전자의 교정에 대하여 검정하는 것(즉, 온 타겟 검증)포함할 수 있다. 온 타겟 검증 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 온 타겟 검증 검정법이 사용될 수 있다. 돌연변이체 대립유전자의 교정을 위한 예시적인 검정법으로는 생어 시퀀싱, 미스매치 시퀀싱, 및 표적화된 심층 시퀀싱을 포함한다(예컨대, 문헌 [Brinkman et al., Nucleic Acids Res., 42(22): e168, 2014], 및 [Tycko et al., Mol Cell, 63(3): 355-370, 2016](상기 두 문헌 모두 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 일부 예에서, 돌연변이체 대립유전자의 성공적인 교정은 오프 타겟 효과, 예컨대, 예측가능한 또는 예측이 불가능한, 비특이적 및/또는 비의도된 점 돌연변이, 결실, 삽입, 역위, 및 전좌에 대해 검정하는 것을 포함한다. 오프 타겟 검증 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 오프 타겟 검증 검정법이 사용될 수 있다. 예시적인 오프 타겟 검증 검정법으로는 편향 방법(즉, 예측가능한 오프 타겟 효과에 대한 방법), 예컨대, 생어 시퀀싱, 미스매치 시퀀싱, 및 표적화된 심층 시퀀싱(예컨대, 문헌 [Brinkman et al., Nucleic Acids Res., 42(22): e168, 2014], 및 [Tycko et al., Mol Cell, 63(3): 355-370, 2016](상기 두 문헌 모두 본원에서 참조로 포함된다) 참조), 및 비편향 방법(즉, 예측이 불가능한 오프 타겟 효과에 대한 방법), 예컨대, 전체 엑손 시퀀싱(WES: whole-exon sequencing; 예컨대, 전체 게놈 시퀀싱 및/또는 마이크로어레이 유전자형분석 이용), 전체 게놈 시퀀싱(WGS: whole-genome sequencing), 직접 동소 파단 표지화, 스트렙트아비딘 증강, 및 차세대 시퀀싱(BLESS), 고처리량 게놈와이드 전좌 시퀀싱(HTGTS: high-throughput, genome-wide translocation sequencing), 시퀀싱으로 수행이 가능한, 이중 가닥 파단(DSB: double-strand break)의 게놈 와이드 비편향 확인(GUIDE-seq), 통합 결함 렌티바이러스 벡터(IDLV: integration-deficient lentiviral vector) 포착, Digenome-seq, 및 시퀀싱에 의한, 시험관내에서의 절단 효과를 기록하기 위한 원형화(CIRCLE-Seq; 예컨대, 비편형 오프 타겟 검증 검정법을 상세히 설명하는 문헌 [Tycko et al., Mol Cell, 63(3): 355-370, 2016]; [Zhang et al., Mol Ther Nucleic Acids, 4:e264, 2015]; [Tsai et al., Nat Methods, 14(6):607-614, 2017](이들 문헌들은 모두 본원에서 참조로 포함된다) 참조).
본 방법은 유사분열이 가능한 임의의 영장류 세포에서 임의의 돌연변이체 대립유전자를 교정하는 데 사용될 수 있다(본원에 열거된 모든 진뱅크® 수탁 번호는 2017년 4월 20일자로 이용가능한 것으로서, 참조로 포함된다). 일부 예에서, 본 방법은 영장류에서 장애 및/또는 질환(즉, 유전 장애 및/또는 유전 질환)을 유발하거나, 또는 유발하는 데 중요한 역할을 하는 돌연변이체 대립유전자를 영장류 세포에서 교정하는 것을 포함한다. 유전 장애 및 유전 질환 뿐만 아니라, 관련 돌연변이체 대립유전자는 당업계에 공지되어 있고, 2018년 4월 15일자로 이용가능한 것으로서 인터넷 rarediseases.info.nih.gov를 참조할 수 있다(이는 본원에서 참조로 포함된다). 개시된 방법을 사용하여 이들 돌연변이체 대립유전자 중 임의의 것이 교정될 수 있다. 일부 예에서, 유전 장애 및/또는 유전 질환은 심근병증, 예컨대, 가족성 심근병증을 유도하고/거나, 그에서 중요한 역할을 한다. 돌연변이체 대립유전자가 심근병증(예컨대, 가족성 심근병증)을 유도할 수 있고/거나, 그에서 중요한 역할을 할 수 있는 것인 예시적인 유전자로는 미오신 결합 단백질 C(MYBPC3, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007667.1), 액틴 알파 심장 근육 1(ACTC1, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007553.1), 액티닌 알파2(ACTN2, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_009081.1), 칼레티쿨린 3(CALR3, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_031959.2), 시스테인 및 글리신 풍부 단백질 3(CSRP3, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_011932.2), 정토필린2(JPH2, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_031867.1), 미오신 중쇄 7(MYH7, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007884.1), 미오신 경쇄 2(MYL2, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007554.1), 미오신 경쇄 3(MyL3, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007555.2), 마이오제닌 2(MYOZ2, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_029747.1), 넥실린 F-액틴 결합 단백질(NEXN, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_016625.1), 포스포람반(PLN, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_009082.1), 단백질 키나제 AMP 활성화 비촉매 서브유닛 감마 2(PRKAG2, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007486.1), 티틴-캡(TCAP, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_008892.1), 트로포닌 I3 심장 타입(TNNI3, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007866.2), 트로포닌 T2 심장 타입(TNNT2, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007556.1), 트로포미오신 1(TPM1, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007557.1), 티틴(TTN, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_011618.3), 및 빈쿨린(VCL, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_008868.1)을 포함한다. 모든 진뱅크® 수탁 번호는 2017년 4월 20일자로 이용가능한 것으로서, 참조로 포함된다.
하기 개시되는 연구에서, MYBPC3 유전자는 표적으로서 사용된다. 그러나, 배아가 대립유전자에 대해 이형접합성이라면, 임의의 대립유전자도 본원에 개시된 방법을 사용하여 교정될 수 있음을 이해한다. 심근병증을 유발하는 다른 돌연변이체 유전자로는 MYH7, TNNT2, 및 TNNI3을 포함한다. 따라서, 일부 비제한적인 예에서, MYH7, TNNT2, 및/또는 TNNI3의 돌연변이체 대립유전자는 개시된 방법을 사용하여 교정된다.
일부 예에서, 유전 장애 및/또는 유전 질환은 고콜레스테롤혈증, 예컨대, 가족성 고콜레스테롤혈증을 유발하고/거나, 그에서 중요한 역할을 할 수 있다. 돌연변이체 대립유전자가 고콜레스테롤혈증(예컨대, 가족성 고콜레스테롤혈증)을 유도할 수 있는 예시적인 유전자로는 아포지질단백질 B(APOB, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_011793.1), 저밀도 지질단백질 수용체(LDLR, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_009060.1), 저밀도 지질단백질 수용체 어댑터 단백질 1(LDLRAP1, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_008932.1), 및 프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 타입 9(PCSK9, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_009061.1)를 포함한다.
일부 예에서, 돌연변이체 대립유전자, 예컨대, 하기 유전자에서의 돌연변이체 대립유전자는 다른 유전 장애 및/또는 유전 질환을 유발하고/거나, 그에서 중요한 역할을 할 수 있다: 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR3, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_012632.1), 세르핀 패밀리 A 구성원 1(SERPINA1, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_008290.1), 단백질 키나제 D1(PKD, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_052879.1), 유방암 1(BRCA1, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_005905.2), 유방암 2(BRCA2, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_012772.3), 글리실-tRNA 신테타제(GARS, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007942.1), WNT 신호전달 경로 조절인자(APC, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_008481.4), 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자(CFTR, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_016465.4), 키메린 1(CHN1, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_012642.1), 디스트로핀(DMD, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_012232.1), 응고 인자 V(F5, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_011806.1), 취약 X 정신 지체 1(FMR1, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007529.2), 글루코실세라미다제 베타(GBA, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_009783.1), 항상성 철 조절인자(HFE, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_008720.2), 응고 인자 IX(FIX, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007994.1), 헌팅틴(HD, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_009378.1), 피브릴린 1(FBN1, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_008805.2), 근긴장성 디스트로피 단백질 키나제(DMPK, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_009784.1), 세포 핵산 결합 단백질(CNBP, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_011902.1), 단백질 티로신 포스파타제, 비수용체 타입 11(PTPN11, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007459.1), Ras/Rac 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 1(SOS1, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007530.1), Raf 프로토온코진 세린/트레오닌 키나제(RAF1, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007467.1), Kras 프로토온코진 GTP아제(KRAS, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007524.1), 콜라겐 타입 알파 1 쇄(COL1A1, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007400.1), 콜라겐 타입 알파 2 쇄(COL1A2, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_007405.1), 시누클레인 알파(SNCA, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_011851.1), 유비퀴틴 C 말단 하이드롤라제 L1(UCHL1, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_012931.1), 류신 풍부 반복서열 키나제 2(LRRK2, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_011709.1), 파킨슨병 3(PARK3, 예를 들어, 유전자 ID 5072, 위치 2p13, 2017년 4월 20일자로 이용가능(이는 본원에서 참조로 포함된다)), 파킨 RBR E3 유비퀴틴 단백질 리가제(PARK2, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_008289.2), 파킨슨증 연관 데글리카제(PARK7, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_008271.1), 또는 PTEN 유도성 추정 키나제 1(PARK6, 예를 들어, 진뱅크® 수탁 번호 NG_008164.1). 모든 진뱅크® 수탁 번호는 2017년 4월 20일자로 이용가능한 것으로서, 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 대립유전자는 유전 유방암에 관여하다. 구체적인 비제한적인 예에서, BRCA1 또는 BRCA2 유전자는 표적으로서 사용된다.
일부 예에서, 영장류 세포는 접합체, 난모세포, 또는 줄기 세포이고, 돌연변이체 대립유전자는 MYBPC3, FGFR3, SERPINA1, PKD, BRCA1, BRCA2, GARS, APC, CFTR, CHN1, DMD, F5, FMR1, GBA, HFE, FIX, HD, FBN1, DMPK, CNBP, PTPN11, SOS1, RAF1, KRAS, COL1A1, COL1A2, SNCA, UCHL1, LRRK2, PARK3, PARK2, PARK7, PARK6, LDLR, LDLRAP1, ACTC1, ACTN2, CALR3, CSRP3, JPH2, MYH7, MYL2, MyL3, MYOZ2, NEXN, PLN, PRKAG2, TCAP, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTN, VCL, APOB, LDLR, LDLRAP1, 및/또는 PCSK9 중 적어도 하나이다. 일부 예에서, 영장류 세포는 심장 줄기 세포 또는 심장 체세포이고, 돌연변이체 대립유전자는 MYBPC3, ACTC1, ACTN2, CALR3, CSRP3, JPH2, MYH7, MYL2, MyL3, MYOZ2, NEXN, PLN, PRKAG2, TCAP, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTN, VCL, APOB, LDLR, LDLRAP1, 및/또는 PCSK9 중 적어도 하나이다. 구체적인 예에서, 본 방법은 심근병증을 앓는 피험체를 선택하는 단계를 포함하고, 여기서, 영장류 세포는 인간 체성 심장 세포이고, 돌연변이체 대립유전자는 MYBPC3, ACTC1, ACTN2, CALR3, CSRP3, JPH2, MYH7, MYL2, MyL3, MYOZ2, NEXN, PLN, PRKAG2, TCAP, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTN, 및/또는 VCL 중 적어도 하나이다. 구체적인 예에서, 본 방법은 고콜레스테롤혈증을 앓는 피험체를 선택하는 단계를 포함하고, 여기서, 영장류 세포는 인간 체세포이고, 돌연변이체 대립유전자는 APOB, LDLR, LDLRAP1, 및/또는 PCSK9 중 적어도 하나이다.
본원에 기술된 방법은 일반적으로 세포, 예컨대, 영장류 세포(비인간 영장류 및 인간 세포, 둘 모두)에 적용가능하다. 세포는 체세포일 수 있다. 세포는 단세포 배아를 포함하나, 이에 제한되지 않는 배아의 세포일 수 있다.
일반적으로, 본원의 방법은 유사분열 중인 임의의 세포에 적용될 수 있다. 예시적인 세포로는 체세포, 예컨대, 중배엽, 내배엽, 및 외배엽 세포를 포함한다. 예시적인 세포는 또한 심장, 피부, 백혈구, 간, 췌장, 신장, 난소, 고환 , 전립선, 유방, 근육, 및 골원성 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 조직 또는 기관으로부터의 세포이다. 유용한 세포로는 소화기계 세포 또는 호흡기계 세포를 포함한다. 세포는 줄기 세포, 예컨대, 만능성 또는 다능성 줄기 세포일 수 있다. 예시적인 줄기 세포는 골수, 조혈, 중간엽, 장 , 뉴런, 및 치아 줄기 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 단세포 배아이다. 배아는 수의과적 포유동물, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 가축 포유동물, 야생 동물, 애완 포유동물, 모델 동물 포유동물, 동물원 포유동물, 및 인간 또는 비인간 영장류를 비롯한, 매우 다양한 포유동물 동물로부터의 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 바 "가축 포유동물"은 농업 또는 축산 환경에서 유용한 임의의 포유동물 동물, 예컨대, 돼지(돼지과), 소(소과), 양(양과), 염소, 말, 또는 버팔로를 지칭한다. 본원에서 "애완 포유동물"은 순하고, 생존을 위해 사람에 의존하도록 인간에 의해 길들여진 임의의 포유동물, 예컨대, 고양이(고양이과), 개(개과), 토끼, 기니아 피그, 및 햄스터를 지칭한다. "야생" 포유동물은 야생 환경에서 발견되는 포유동물, 예컨대, 야생 고양이를 지칭한다. 본원에서"모델 동물 포유동물"은 과학 및 건강 관련 연구를 위해 사용되는 임의의 포유동물, 예컨대, 마우스, 토끼, 및 래트를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상기 포유동물 카테고리는 중복될 수 있고; 예를 들어, 애완 포유동물, 예컨대, 개는 또한 모델 동물 포유동물로도 분류될 수 있다. 개시된 방법은 임의의 포유동물 종에서 효과적이다.
포유동물은 영장류, 예컨대, 인간일 수 있거나, 또는 비인간 영장류일 수 있다. 실시양태에서, 영장류 세포는 배아(예컨대, 단세포 배아)일 수 있다. 영장류 세포는 체세포일 수 있다.
일부 예에서, 본 방법은 비자연적으로 발생된 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드 핵산 분자를 도입하기 전에, 배아를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 배아를 생성하는 단계는 영장류로부터 관심 유전자의 돌연변이체 대립유전자 또는 야생형 대립유전자를 갖는 게놈을 포함하는 영장류 난모세포를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 배아를 생성하는 단계 또한 영장류 난모세포를 동일한 영장류 종으로부터의 정자와 수정시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 정자는 관심 유전자의 야생형 대립유전자 또는 돌연변이체 대립유전자를 포함할 수 있다. 이로써, 본 방법은 이형접합성인 (예컨대, 야생형 대립유전자 한 카피 및 돌연변이체 대립유전자 한 카피를 포함하는) 단세포 영장류 배아를 형성하는 데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 표적화된 뉴클레아제 및 가이드는 영장류 난모세포 수정과 동시에 영장류 난모세포 내로 도입된다. 세포질내 정자 주입(ICSI) 또는 시험관내 수정(IVF)을 비롯한, 임의의 수정 방법이 사용될 수 있다. 구체적인 예에서, 수정을 위해 ICSI가 사용된다. 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드는 예를 들어, 중기 II의 예컨대, 영장류 난모세포와 같이, 유사분열이 가능한 임의의 단계에서 임의의 세포에 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 예컨대, CRISPR/Cas 시스템 중의 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드(또는 이중 가닥 DNA 파단을 도입하는 또 다른 시스템 중의 것, 예컨대, TALEN 또는 ZFN)를 난모세포 내로 도입하는 방법을 개시한다. 암컷(예컨대, 영장류, 예컨대, 인간)을 모의하는 프로토콜을 사용하여 영장류 난모세포, 예컨대, 인간 난모세포를 수득하여 다수의 생존가능한 난모세포를 생산할 수 있다. 상기 모의 프로토콜의 예는 하기 실시예 섹션 및 문헌 [Zelinski-Wooten, et al., Hum. Reprod ., 10:1658-1666, 1995]에 개시되어 있다. 수확 방법 또한 고품질의 난모세포를 수득하는 데 중요할 수 있다. 한 예에서, 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 여포성 흡인을 사용하여 영장류 난모세포를 수확한 후, 이어서, 오염 혈액 세포로부터 분리시킬 수 있다. 대안으로서, 시험관내에서 만능성 줄기 세포로부터 영장류 난모세포를 생성할 수 있다.
한 측면에서, 영장류를 모의시켜 난모세포를 생산하고(예컨대, 호르몬 방식으로), 상기 난모세포를 수확할 때, 수집된 난모세포는 상이한 단계의 세포일 수 있다. 일부 난모세포는 중기 I에 있는 반면, 다른 난모세포는 중기 II에 있다. 상기 경우, 중기 I인 난모세포를 상기 세포가 중기 II에 도달할 때까지 배양시킨 후, 본원에 개시된 방법에서 사용할 수 있다. 추가 사용을 위해 난모세포를 냉동시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 난모세포를 냉동보존하였다.
난모세포를 시험관내에서 수정시킬 수 있다. 시험관내 수정(IVF) 수행 프로토콜은 예를 들어, 미국 특허 제4,589,402호 및 제4,725,579호 및 문헌 [The Handbook of in vitro Fertilization, eds. Trouson and Gardner, Informa Health Care Publ., 2000] 뿐만 아니라, [In vitro Fertilization and Embryo Culture: A Manual of Basic Techniques, ed. Wolf, Springer Publ., 1988](상기 문헌은 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다. IVF 수행 성공 여부와 연관된 쟁점이 몇 가지 존재한다. 상기 쟁점은 정자 침투를 감소시키는 투명대 경화, 난자, 정자 및 배아의 수정 및 유지 온도, pH, 본 프로세스에 해를 끼칠 수 있는, 실험실 공기에서 발견된 휘발성 유기 화합물의 존재, 및 다른 환경 인자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 수정은 동일한 종으로부터의 난모세포 및 정자를 이용한다.
예시적인 수정 프로토콜은 하이브리드 난모세포를 정자와 함께 배양 배지 중에서 약 4-12시간, 예컨대, 약 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 적어도 12시간 또는 약 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-11, 또는 11-12시간 또는 약 5-11시간, 예컨대, 약 8시간 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 수정은 배아 중 2개의 전핵이 관찰되면, 이로써, 완료된다. 그러나, 예를 들어, 난모세포 조작의 결과에 기인하여 통상의 IVF가 실현되지 않는다면, 세포질내 정자 주입(ICSI)을 사용하여 단일 정자를 직접 난모세포 내로 주입할 수 있다. ICSI는 보통은 유리 피펫을 통해 정자를 하이브리드 난모세포 내로 주입하는 것을 포함한다. 본원에 개시된 방법은 정자를 ICSI 배지 중에 배치시키는 단계, 정자를 함유하는 배지를 피펫 내로 흡입하여 정자를 포획하는 단계, 배지 및 정자를 함유하는 피펫을 하이브리드 난모세포 내로 삽입하는 단계, 및 하이브리드 난모세포 내로의 삽입 후, 정자를 함유하는 배지를 피펫으로부터 하이브리드 난모세포 내로 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 영장류에서 사용하기 위한 ICSI 방법은 이종성 DNA를 포함하는, 배아를 생산하는 "트랜스ICSI" 방법 또한 개시하는 미국 특허 공개 제20030221206호에 개시되어 있다.
표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드, 예컨대, CRISPR/Cas9 또는 특이적인 이중 가닥 DNA 파단을 도입하는 임의의 다른 시스템, 예컨대, TALEN 또는 ZFN은 ICSI 수정 시술 동안 그를 정자와 함께 포함시킴으로써 난모세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 도입은 수정과 함께 동시에 진행되고, 이로써 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드는 단세포 배아 내로 도입된다. 대안적으로, CRISPR/Cas9, TALEN, 또는 ZFN은 상기 개시된 바와 같이, 수정 후에 별개의 시술로서 단세포 접합체 내로 도입될 수 있다. 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드는 예를 들어, 수정 후 약 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 또는 적어도 60분 후에 도입될 수 있다. 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드는 수정 후 약 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5시간 이내에 도입될 수 있다.
ICSI가 사용된다면, ICSI 배지는 일반적으로 구성 성분인 물, 이온성 구성 성분, 및 완충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 포스페이트를 함유하지 않는다. 배지에서 사용된 완충제는 MOPS 또는 HEPES일 수 있다. 추가로, ICSI 배지는 탄수화물 락테이트 및 피루베이트로 보충될 수 있고, 배지는 추가로 난모세포 중에 가장 풍부한 비필수 산: 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린, 및 타우린 중 하나 이상의 것으로 보충될 수 있다. 한 제제에서, 정자를 저속화시키거나, 또는 부동화시켜 정자가 ICSI 프로세스를 위해 피펫으로 포획될 수 있도록 하기 위해 사용되는 ICSI 배지는 하이알루로네이트 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)으로 보충된다. 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드, 예컨대, CRISPR/Cas9, TALEN, 또는 ZFN이 상기 ICSI 배지에 포함될 수 있다.
ICSI가 수행될 때, 단세포 배아가 형성된다. 상기 단세포 배아는 전능성이고, (i) 4회 이상 세포 분열을 할 수 있고; (ii) 배양 동안 정상적인 핵형을 유지하고; (iii) 임신 및 건강한 자손을 생산할 수 있다.
일세포 배아가 분열하도록 시험관내에서 그를 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 8 세포 배아 생산율은 약 5% 초과, 예컨대, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 초과, 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과, 또는 약 95% 초과이다. 상기 문맥에서, "약"이란, 1% 이내임을 나타낸다.
실시양태에서, 본 방법은 시험관내에서 배아를 배양하여 다세포 배아를 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 단세포 배아를 시험관내에서 배양할 수 있고, 여기서, 단세포 배아는 분열을 하며, 이로써, 2 세포, 4 세포, 8 세포 배아; 상실배; 또는 배반포가 생산될 수 있다. 일부 예에서, 다세포 배아는 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 세포에 대해 모자이크가 아니다. 배아 배양 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2009/0004740호를 참조한다(상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다). 일부 실시양태에서, 배아는 돌연변이체 대립유전자에 대해 이형접합성인 세포에 대해 모자이크가 아니다.
개시된 방법에 의해 생산된 세포의 용도
본원에 개시된 방법을 사용하여 생산된 배아 및 세포는 다양한 용도를 갖는다. 개시된 방법에서 단세포 배아가 사용될 때, 임신이 확립될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 4, 또는 8 세포 배아; 상실배; 또는 배반포는 수용자 난모세포의 단리 기점이 된 수용자 내로 도입될 수 있다. 한 예에서, 수용자는 영장류이다. 또 다른 예에서, 1, 2, 4, 또는 8 세포 배아; 상실배; 또는 배반포는 대리 수용자, 예컨대, 동일한 종의 영장류 내로 도입될 수 있고, 여기서, 대리 동물은 제1 및/또는 제2 영장류와는 상이한 것이다. 일반적으로, 임신은 난모세포 기증자와 동일한 종의 동물에서 확립된다.
배아는 출산할 때까지 발생이 허용될 수 있다. 배아를 암컷 내로 도입하는 방법 및 대리모 암컷을 사용하여 자손 생산하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 한 예에서, 기증자 난모세포, 수용자 난모세포, 및 대리 영장류는 인간이다. 그러나, 다른 예에서, 기증자 난모세포, 수용자 난모세포, 및 대리 영장류는 비인간 영장류, 예컨대, 레수스 원숭이 또는 마카크이다. 일부 실시양태에서, 생성된 자손은 돌연변이체 대립유전자에 대해 이형접합성인 세포에 대해 모자이크가 아니다.
배아는 줄기 세포 생산에 사용될 수 있다. 수정 후, 생성된 배아는 수용자 내로 이식되지 않지만, 시험관내에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 배아 세포는 배아로부터 제거되고, 상기 세포에 대해 본원에 개시된 방법이 수행된다. 배아는 생존가능하기 때문에, 파괴시켜야 할 필요는 없고, 암컷 내로 이식될 수 있거나, 또는 냉동보존될 수 있다. 제거된 배아의 단일 세포는 개시된 방법을 사용하여 처리될 수 있다.
본 주장하는 방법의 용도에 따라, 배아(또는 배아 세포)를 배양하고, 이를 사용하여 동형접합성 세포, 예컨대, 줄기 세포를 생산할 수 있다. 영장류 배아 및 줄기 세포 배양 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 인간 또는 비인간 영장류 배아 줄기 세포의 성장 및 분화를 지지할 수 있는 임의의 세포 배양 배지가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 만능성 줄기 세포는 피더층, 예컨대, 뮤린 또는 영장류 배아 섬유아세포의 층 상에서 배양된다. 그러나, 피더층은 배아 줄기 세포(ESC: embryonic stem cell)의 성장을 지지하는 임의의 세포일 수 있다. 이러한 접근법을 통해 완전한 자가 조직 배양 시스템을 제조할 수 있고, 이로써, 종간의 오염 위험을 제거할 수 있다. 치료적 사용을 위해, 배양 방법은 다른 유기체로부터 유래된 물질은 함유하지 않을 수 있고(이종발생성 세포 또는 성분 무함유), 추가로, 배양 배지 중 혈청(예컨대, 우태아 혈청, FBS: fetal bovine serum) 사용은 피한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 사용으로 동형접합성 비인간 또는 인간 영장류 전능성 줄기 세포(TSC) 또는 만능성 줄기 세포(PSC)가 제조된다. 이들 줄기 세포는 다양한 용도를 갖는다. TSC 또는 PSC는 인간 및 비인간 영장류 배아로부터 쉽게 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 영장류 TSC 또는 PSC를 단리시킨 후, 이어서, 배아 줄기 세포의 성장을 지지하는 "ES 배지"에서 배양한다. PSC는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81을 발현한다. 예를 들어, ES 배지는 20% 우태아 혈청(FBS; Hyclone), 0.1 mM β-메르캡토에탄올(Sigma), 및 1% 비필수 아미노산 스톡(Gibco BRL)과 함께 80% 둘베코스 변형 이글즈 배지(DMEM: Dulbecco's modified Eagle's medium; 피루베이트 무함유, 고 글루코스 제제, Gibco BRL)를 포함한다.
한 예에서, 본원에 기술된 바와 같이, 수용자 영장류로부터의 영장류 난모세포를 유핵화하고, 기증자 영장류 난모세포로부터의 염색체를 비롯한, 핵 물질을 유핵화된 난모세포 내로 삽입한다. 이어서, 생성된 하이브리드 난모세포를, 동일한 종의 수컷으로부터의 정자를 사용하여 수정시키고, 단세포 배아가 형성되고, 이를 개시된 방법을 사용하여 처리한다.
개시된 방법을 사용하여 처리한 후, 생성된 동형접합성 TSC를 배지, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 단백질 무함유 HECM-9 배지 중에서 배양할 수 있고, 사용할 때까지 약 5-6% CO2 중 37℃에서 배양할 수 있다. 상기 배양물을 파라핀 오일하에 유지시킬 수 있다. 일단 TSC가 약 2 세포기 또는 그 이후 단계, 4, 8, 16세포기에 도달하고 나면, 추가 배양 또는 이식을 위해 세포를 전달할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 TSC를 배양 배지, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, HECM-9 배지 중에서 배반포 단계까지 배양한다.
일부 실시양태에서, 선택된 확장된 배반포의 투명대를 TH3 배지 중 0.5% 프로나제에 잠깐 동안(45-60초) 노출시킴으로써 제거할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역수술에 의해 영양외배엽 세포로부터 내부 세포 덩어리(ICM)를 단리시킬 수 있고, 여기서, 투명대가 없는 배반포를 약 37℃에서 약 30분 동안 토끼 항레수스 비장 혈청에 노출시킨다. (예컨대, TH3 배지를 사용하여) 광범위하게 세척한 후, 배아를 HECM-9(1:2, v/v)로 재구성된 기니아 피그 보체 중에서 약 37℃에서 추가로 약 30분 동안 인큐베이션시킨다. 부분적으로 용해된 영양외배엽 세포를 예컨대, 작은 보어 피펫(예를 들어, 내경이 약 125 ㎛; Stripper 피펫, Midatlantic Diagnostics Inc., 미국 뉴저지주 말튼 소재)을 이용하여 온화하게 피펫팅함으로꺼 기계적으로 분산시킨 후, 예컨대, TH3 배지를 사용하여 ICM을 3회에 걸쳐 세정한다. 단리된 ICM을 예컨대, 마우스 배아 섬유아세포(mEF: mouse embryonic fibroblast)로 구성된, 유사분열 불활성화 피더층을 함유하는, 눈크(Nunc) 4웰 디쉬와 같은 고체 기판 상에 플레이팅하고; 예컨대, 1% 비필수 아미노산s(Invitrogen), 2 mM L-글루타민(Invitrogen), 0.1 mM β-메르캡토에탄올, 및 15% FBS로 보충된, 글루코스를 함유하고, 피루브산 나트륨은 함유하지 않는 DMEM/F12 배지(Invitrogen) 중에서 배양하고; 약 3% CO2, 약 5% O2, 및 약 92% N2 기체하에 37℃ 조건하에서 유지시킨다. 대안적으로, 전체 무손상 배반포를 ESC 단리를 위해 mEF 상에 직접 플레이팅할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 레이저 보조 절개 또는 마이크로스칼펠을 사용하여 영양외배엽을 기계적으로 제거할 수 있다.
약 1 내지 약 7일 후, 피더층에 부착되고, 증식하기 시작한 배반포 또는 ICM과 같은 세포를 작은 세포 클럼프로 해리시키고, 예컨대, 마이크로스칼펠을 사용하여 수동으로 해리시키고, 새 기판, 예컨대, 새 배아 섬유아세포(mEF) 상에 플레이팅할 수 있다. 제1 계대 후, 추가 증식, 특징화, 및 저온 저장을 위해, 배아 줄기 세포(ESC) 유사 형태를 갖는 콜로니를 선별한다. 일반적으로, ESC 형태는 높은 핵 대 세포질 비, 돌출된 핵인, 날카로운 아다지(adage) 및 평편한 콜로니를 갖는 조밀한 콜로니이다. 일부 예에서, 배지를 매일 교체하고, ESC 콜로니를 약 매 5-7일마다 수동으로 또는 콜라게나제 IV(예를 들어, 약 1 mg/ml, 및 37℃에서 약 2-3분 동안; Invitrogen) 중에서 분해함으로써 분할하고, 수집된 세포를 신선한 피더층이 있는 디쉬 상에 재플레이팅한다. 배양물을 약 3% CO2, 약 5% O2, 및 약 92% N2하에 약 37℃에서 유지시킨다. 또 다른 대안으로, 무혈청 배지를 사용하였다.
이어서, 동형접합성 PSC를 단리시킬 수 있고, 표준 방법을 사용하여 PSC를 시험관내에서 유지시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 영장류 PSC를 ESC 배지의 존재하에 섬유아세포의 전면생장층 상에서 단리시킨다. 한 예에서, 피더층을 생산하기 위해, 이종발생성 배아 섬유아세포를 이계 교배된 마우스(예컨대, CF1, SASCO로부터 이용가능)로부터의 14-16일된 태아로부터 수득하지만, 다른 계통도 대안으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 성인 피부로부터 수득된 인간 섬유아세포, 또는 TSC 유래 섬유아세포로부터 수득된 세포도 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 약 0.1% 젤라틴(타입 I; Sigma)으로 처리된 조직 배양용 디쉬가 사용될 수 있다. 마우스 PSC와 달리, 인간 PSC(hPSC: human PSC)는 단계 특이적 배아 항원 단계 특이적 배아 항원(SSEA: stage-specific embryonic antigen)-1을 발현하지 않지만, 특이적 단일클론 항체에 의해 인식되는 또 다른 당지질 세포 표면 항원인 SSEA-4를 발현한다(예를 들어, 문헌 [Amit et al., Devel. Biol. 227:271-278, 2000] 참조).
ICM에 의해 해리된 세포를 신선한 배지 중 피더층 상에 플레이팅할 수 있고, 콜로니 형성에 대해 관찰할 수 있다. ESC 형태를 보이는 콜로니를 개별적으로 선택하고 상기 기술된 바와 같이 다시 분할한다. 이어서, 배양물이 조밀해짐에 따라 매 6일마다 생성된 PSC를 기계적 방법에 의해 통상적으로 분할한다. 조기 계대 세포를 또한 냉동시키고, 액체 질소에서 보관한다.
동형접합성 PSC 뿐만 아니라, 이식가능한 세포를 생산할 수 있고, 예를 들어, 표준 G 밴딩 기술(예컨대, 통상의 핵형분석 서비스를 제공하는, Cytogenetics Laboratory of the University of Wisconsin State Hygiene Laboratory에 의한 것)을 사용하여 핵형을 분석할 수 있고, 영장류 종에 대하여 공개된 핵형과 비교할 수 있다.
다른 실시양태에서, ICM의 면역수술 단리가 사용되지 않는다. 따라서, 어떤 면역수술 기술도 사용되지 않고, 배반포는 직접 배양된다. 인간을 비롯한, 영장류 PSC의 배반포로부터의 단리는 유사한 방법을 따라 진행될 것이며, 단, 예외적으로, TSC에서 배반포로의 발생 속도는 종마다 몇일 차이가 날 수 있고, 배양된 ICM의 발생 속도는 종 사이에 차이가 있을 수 있다. 예를 들어, 수정 후 8일째, 레수스 원숭이 배아는 확장된 배반포 단계인 반면, 인간 배아는 수정 후 5-6일째 동일 단계에 도달하게 된다. 다른 영장류 또한 그의 발생 속도에서 차이가 나기 때문에, 초기 ICM 분할 시기는 영장류 종 사이에 차이가 나지만, ESC 단리를 위해 동일한 기술 및 배양 조건이 허용될 것이다(영장류 ES 세포 및 그의 생산에 관한 완전한 논의를 위해 미국 특허 제6,200,806호(상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 상기 기술된 배양 조건 또한 배반포로부터의 PSC의 배양을 위해 사용될 수 있다.
통상의 프로토콜에 의해 수득된 인간 TSC를 수정된 난모세포에서 배반포까지 배양하기 위한 조건은 기술되어 있다(문헌 [Bongso et al., Hum Reprod. 4:706-713, 1989] 참조). 일부 실시양태에서, 인간 TSC를 인간 난관 세포와 함께 공동 배양함으로써 고품질의 배반포를 생산할 수 있다. 세포 공동 배양물 중에서, 또는 피더 세포층 요건을 제거하는 배지 중에서 성장된 배반포로부터의 인간 ICM은 비인간 영장류에 대해 상기 기술된 것과 동일한 방법을 사용하여 인간 PSC가 단리될 수 있도록 허용한다.
TSC는 세포 배양에서 유용한 배아외 세포, 예컨대, 영양외배엽을 생성하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 피더 세포로서 자가 조직 세포(예컨대, 영양외배엽)를 사용하는 것은 결국은 분화된 기관 특이적 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 줄기 세포를 생성하는 데 도움을 줄 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 피더층 성분의 생성을 허용하는 방식으로 전능성 줄기 세포를 배양하는 것을 사용함으로써 수득된 동종이계 피더 세포를 사용하는 것은 이종 오염을 막는 데 유용하고, 이로써, 치료 목적으로 그 위에서 배양된 분화된 세포에 대해 FDA 승인을 받는 것으로 더욱 용이할 수 있다.
동형접합성 만능성 줄기 세포(PSC) 또한 생산될 수 있다. 이어서, TSC를 상기 기술된 바와 같이 배양하여 PSC 및 다능성 줄기 세포(MPSC)를 생산할 수 있다. 대안적으로, 개시된 방법을 사용하여 (피험체로부터 또는 세포주로부터 단리된) 다능성 줄기 세포를 처리할 수 있다. 처리 후, 치료 유효량의 생성된 동형접합성 다능성 세포를 관심 피험체 내로의 이식을 위해 사용할 수 있다.
본원에 개시된 방법을 사용하여 생산된 동형접합성 영장류 PSC는 원하는 세포 유형이 세포를 생성하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, PSC는 중간엽, 신경, 및/또는 조혈 줄기 세포를 유도하는 데 사용된다. 다른 실시양태에서, PSC는 췌장, 간, 골, 상피, 내피, 건, 연골, 및 근육 세포 및 그의 전구체 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는 세포를 생성하는 데 사용된다. 대안적 실시양태에서, 중간엽, 신경, 및/또는 조혈 줄기 세포가 사용된다.
본원에 개시된 방법을 사용하여 생산된 동형접합성 세포가 피험체 내로 이식될 수 있다. 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 MHC 유전자좌에서 치료되는 개체에 매칭된다. 실시양태에서, 세포는 무혈청 배지 중에서 배양된다. 실시양태에서, 세포는 이종발생성 세포(예컨대, 비인간 섬유아세포, 예컨대, 마우스 배아 섬유아세포)와 함께 배양되지 않는다. PSC로부터 유래된 동형접합성 세포를 이식하는 단계, 또는 개시된 방법을 사용하여 직접 제조된 동형접합성 체세포를 사용하는 단계를 포함하는, 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
따라서, 이식가능한 동형접합성 세포는 질환, 장애, 또는 병태 치료를 위해 하나 이상의 세포 유형을 필요로 하는 개체에게 투여될 수 있다. 치료 또는 예방될 수 있는 질환, 장애, 또는 병태의 예로는 신경, 내분비, 구조, 골격, 혈관, 비뇨계, 소화계, 외피계, 혈액, 면역, 자가면역, 염증성, 신장, 방광, 심혈관, 암, 순환, 조혈, 대사, 생식계, 및 근육 질환, 장애, 및 병태를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조혈 줄기 세포는 암 치료에 사용된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 재건 적용을 위해, 예컨대, 조직 또는 기관의 수복 또는 대체를 위해 사용된다.
본원에 기술된 TSC 및 PSC는 다능성 줄기 세포 또는 이식가능한 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. 다능성 줄기 세포는 본 주장하는 방법을 사용하여 직접 처리될 수 있다. 세포는 골수 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 장 줄기 세포, 뉴런 줄기 세포, 또는 치아 줄기 세포일 수 있다.
한 예에서, 동형접합성 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 중간엽 줄기 세포는 매우 많은 상이한 조직을 만들어 낸다(문헌 [Caplan, J. Orth . Res 641-650, 1991]). 골, 근육, 건, 지방 조직, 기질 세포, 및 연골로 분화될 수 있는 중간엽 줄기 세포 또한 골수로부터 단리된다(문헌 [Caplan, J. Orth . Res., 641-650, 1991]). 미국 특허 제5,226,914호에는 골수로부터 중간엽 줄기 세포를 단리시키는 예시적인 방법이 기술되어 있다. 일부 예에서, 동형접합성 상피 전구체 세포 또는 각질형성세포는 피부 및 장의 내벽의 병태를 치료하는 데 사용하기 위하여 생성될 수 있다(문헌 [Rheinwald, Meth . Cell Bio. 21A:229, 1980]). 본 방법은 또한 간 전구체 세포(PCT 공개 WO 94/08598 참조) 또는 신장 전구체 세포(문헌 [Karp et al., Dev . Biol . 91:5286-5290, 1994] 참조)를 생산하는 데에도 사용될 수 있다. 본 방법은 동형접합성 내이 전구체 세포를 생산하는 데에도 사용될 수 있다(문헌 [Li et al., TRENDS Mol . Med . 10: 309, 2004] 참조).
실시양태에서, 본 방법은 시험관내에서 개시된 방법을 사용하여 생산된 세포를 증식시킴으로써 생산된 하나 이상의 세포(예컨대, 동형접합성 이식가능한 세포, 예컨대, 만능성 또는 다능성 줄기 세포)를 피험체(예컨대, 영장류 또는 인간 피험체)에게 투여하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 치료 유효량의 동형접합성 세포가 개체에게 투여된다. 세포는 약학 담체 중에서 투여될 수 있다. 유용한 약학적으로 허용되는 담체는 통상의 것이다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition, 1975]에는 본원에 개시된 세포의 약학적 전달에 적합한 조성물 및 제제가 기술되어 있다. 일반적으로, 담체의 성질은 사용되는 특정 투여 모드에 의존할 것이다. 예를 들어, 비경구용 제제는 일반적으로 비히클로서 약학적으로 및 생리적으로 허용되는 유체, 예컨대, 물, 생리 식염수, 평형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등을 포함하는 주사용 유체를 포함한다. 고체 조성물(예컨대, 분제, 환제, 정제, 또는 캡슐 형태)을 위해, 통상의 비독성 고체 담체는 예를 들어, 약학 등급의 만닛톨, 락토스, 전분, 또는 스테아르산 마그네슘을 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체 이외에도, 투여하고자 하는 약학적 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대, 습윤화제 또는 유화제, 보존제, pH 완충화제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.
개체는 관심의 대상이 되는 임의의 피험체일 수 있다. 적합한 피험체로는 줄기 세포 또는 전구체 세포로부터 유래된 세포의 증식이 도움이 되는 피험체(예컨대, 요법을 필요로 하는 영장류 또는 인간 피험체)를 포함한다. 일부 예에서, 피험체는 심장 세포의 증식을 필요로 하는 피험체이다. 예를 들어, 개체는 심근병증 및/또는 고콜레스테롤혈증을 앓는 개체이다. 일부 예에서, 개체는 뉴런 전구체 세포 및/또는 신경교 전구체 세포의 증식을 필요로 하는 개체이다.
일부 실시양태에서, 개체는 신경변성 장애 또는 허혈성 이벤트, 예컨대, 뇌졸중을 앓는 개체이다. 신경변성 장애의 구체적인 비제한적인 예로는 알츠하이머병, 판토테네이트 키나제 연관 신경변성, 파킨슨병, 헌팅턴병(문헌 [Dexter et al., Brain 114:1953-1975, 1991]), HIV 뇌병증(문헌 [Miszkziel et al., Magnetic Res. Imag . 15:1113-1119, 1997]), 및 근위축성 측삭 경화증이 있다. 적합한 개체로는 또한 연세가 있는 피험체, 예컨대, 적어도 약 65세, 적어도 약 70세, 적어도 약 75세, 적어도 약 80세, 또는 적어도 약 85세의 개체를 포함한다. 추가 예에서, 개체는 을 앓는 개체일 수 있다. 추가 예에서, 개체는 척수 손상, 바텐병(Batten's disease), 또는 척추 이분증을 앓는 개체일 수 있다. 추가 예에서, 개체는 청력을 상실한 개체, 예컨대, 청각 장애가 있거나, 또는 청령 상실을 예방하기 위해 내이로부터의 줄기 세포의 증식을 필요로 할 수 있는 피험체일 수 있다.
일부 예에서, 동형접합성 세포는 (예컨대, 예를 들어, 뉴런 줄기 세포를 사용하여 본원에 개시된 방법을 사용하여 생산된 뉴런 세포일 수 있다. 피험체에게 투여되는 세포 현탁액, 예컨대, 뉴런 세포 현탁액의 부피는 이식 부위, 치료 목표 및 용액 중 세포의 양에 의존하여 달라질 것이다. 전형적으로, 피험체에게 투여되는 세포의 양은 치료 유효량이 될 것이다. 예를 들어, 파킨슨병 치료 목적인 경우, 치료 유효량의 세포를 이식하면, 전형적으로 상기 장애와 연관된 증상(예컨대, 강직, 운동불능, 및 보행 장애)의 양 및/또는 중증도는 감소하게 것이다. 한 예에서, 중증의 파킨슨병 환자는 이식으로부터 상당한 유익한 효과를 얻기 위해 이식 부위당 적어도 약 100,000개의 살아있는 도파민 세포를 필요로 한다. 세포 생존은 일반적으로 뇌 조직 이식에서는 낮기 때문에(5-10%), 적어도 100만 개의 세포가 투여되고, 예컨대, 약 100만 개 내지 약 400만 개의 도파민성 뉴런이 이식된다. 한 실시양태에서, 세포는 피험체의 뇌에 투여된다. 세포는 뇌척수액을 함유하는 공간, 예컨대, 지주막하 공간 또는 뇌실에서 뇌의 실질부 내에, 또는 신경 밖에 이식될 수 있다. 따라서, 한 예에서, 세포는 중추 신경계 또는 말초 신경계 내부가 아닌 피험체의 영역, 예컨대, 복강 신경절 또는 좌골 신경에 이식된다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 경뇌막 내에 모든 구조를 포함하는 중추 신경계 내로 이식된다. 뉴런 세포 주입은 일반적으로 18-21 게이지 니들이 있는 멸균된 시린지로 이루어질 수 있다. 니들의 정확한 크기는 치료되는 종에 의존하기는 하지만, 니들의 직경은 어느 종에서도 1 mm보다 크지 않아야 한다. 당업자는 세포를 피험체의 뇌로 투여하는 기술에 대해 잘 알고 있다.
본원에 개시된 방법에 의해 생산된 세포, 예컨대, 동형접합성 TSC 및 PSC는 또한 예컨대, 작용제가 분화 또는 세포 증식에 영향을 주는지 여부를 측정하기 위해 관심 작용제를 시험하는 데 유용하다. 예를 들어, 동형접합성 TSC 또는 PSC를 작용제와 접촉시키고, 작용제의 존재 및 부재하에서 세포의 분화 또는 증식 능력을 사정한다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 세포는 또한 약학 제제를 스크리닝하여 특정 인간 세포 유형에 영향을 미치는 작용제, 예컨대, 뉴런 세포에 영향을 미치는 작용제를 선별하는 데에도 사용될 수 있다. 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 세포는 또한 하나 이상의 작용제를 스크리닝하여 분화에 영향을 미치는 작용제를 선별하는 데에도 사용될 수 있다. 시험 화합물은 화학 화합물, 소분자, 폴리펩티드, 또는 다른 생물학적 작용제(예를 들어 항체 또는 시토카인)를 비롯한, 관심의 대상이 되는 임의의 화합물일 수 있다. 여러 예에서, 잠재적 작용제 패널, 예컨대, 시토카인 또는 성장 인자 패널이 스크리닝된다.
원하는 활성에 대해 시험될 수 있는 분자로 이루어진 조합 라이브러리를 제조하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 구속성 펩티드일 수 있는, 펩티드의 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는 방법(예를 들어, 미국 특허 제5,622,699호; 미국 특허 제5,206,347호; 문헌 [Scott and Smith, Science, 249:386-390, 1992]; [Markland et al., Gene, 109:13-19, 1991] 참조); 펩티드 라이브러리를 제조하는 방법(미국 특허 제5,264,563호); 펩티도모방체 라이브러리를 제조하는 방법(문헌 [Blondelle et al., Trends Anal Chem., 14:83-92, 1995]); 핵산 라이브러리를 제조하는 방법(문헌 [O'Connell et al., Proc . Natl Acad . Sci., USA 93:5883-5887, 1996]; [Tuerk and Gold, Science 249:505-510, 1990]; [Gold et al., Ann. Rev. Biochem. 64:763-797, 1995]); 올리고당 라이브러리를 제조하는 방법(문헌 [York et al., Carb . Res. 285:99-128, 1996]; [Liang et al., Science 274:1520-1522, 1996]; [Ding et al., Adv . Expt . Med . Biol . 376:261-269, 1995]); 지질단백질 라이브러리를 제조하는 방법(문헌 [de Kruif et al., FEBS Lett . 3 99:23 2-23 6, 1996]); 당단백질 또는 당지질 라이브러리를 제조하는 방법(문헌 [Karaoglu et al., J Cell Biol . 130.567-577, 1995]); 또는 예를 들어,약물 또는 다른 약학 제제를 함유하는 화학물질 라이브러리를 제조하는 방법(문헌 [Gordon et al., J Med . Chem. 37.1385-1401, 1994]; [Ecker and Crooke, BioTechnology 13:351-360, 1995])을 포함한다. 세포 폴리펩티드를 비롯한, 세포 표적에 대해 결합 특이성을 갖는 핵산 분자가 자연적으로 존재하기 때문에, 그리고, 상기 특이성을 갖는 핵산 분자가 쉽게 제조되고, 확인될 수 있기 때문에, 폴리뉴클레오티드는 만능성 또는 전능성 세포에서 기능을 변경시킬 수 있는 작용제로서 특히 유용할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,750,342호 참조).
한 실시양태에서, 고처리량 포맷을 위해, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동형접합성 TSC, PSC, 또는 MPSC를 다중웰 플레이트의, 또는 유리 슬라이드 또는 마이크로칩의 웰 내로 도입할 수 있고, 시험 작용제와 접촉시킬 수 있다. 일반적으로, 세포는 어레이에, 특히, 어드레스가능 어레이에 조직화되고, 이로써, 로보틱스는 세포 및 용액을 조작하는 데 뿐만 아니라, 특히, 조사되는 기능과 관련하여 세포를 모니터링하는 데 편리하게 사용될 수 있다. 고처리량 포맷 사용의 장점은 다수의 시험 작용제를 동시에 조사할 수 있고, 원하는 경우, 대조군 반응 또한 시험 조건과 동일한 조건하에서 수행될 수 있다는 점이다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 1개, 소수, 또는 다수의 시험 작용제를 스크리닝하여 세포의 기능을 변경시킬 수 있는 작용제, 예를 들어, 세포가 원하는 세포로 분화하도록 유도하거나, 또는 예를 들어, 조절 분자의 발현을 고수준으로 유지시킴으로써 자발적 분화를 막는 작용제를 확인할 수 있는 수단을 포함한다.
시험 화합물이 세포와 상호작용하는 데 충분하도록 세포를 시험 화합물과 접촉시킨다. 화합물이 별개의 수용체에 결합할 때, 작용제가 그의 수용체에 결합하는 데 충분한 시간 동안 세포와 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 기질의 인산화에 영향을 주는 데 충분한 시간량 동안 시험 화합물과 세포를 인큐베이션시킨다. 일부 실시양태에서, 세포를 시험관내에서 5% CO2 습윤 대기하에 37℃에서 시험 화합물로 처리한다. 시험 화합물로 처리한 후, 세포를 및 Ca2+ 및 Mg2+ 무함유 PBS로 세척하고, 전체 단백질을 기술된 바와 같이 추출한다(문헌 [Haldar et al., Cell Death Diff. 1:109-115, 1994]; [Haldar et al., Nature 342:195-198, 1989]; [Haldar et al., Cancer Res. 54:2095-2097, 1994]). 추가의 실시양태에서, 시험 화합물의 연속 희석액이 사용된다.
본 개시내용은 하기 비제한적인 실시예에 의해 예시된다.
실시예
CRISPR/Cas는 특이적인 게놈 서열을 인식하고, 이중 가닥 파단(DSB)을 유도하는 다용도 도구이다(문헌 [Hsu et al., Cell, 157:1262-1278, 2014]; [Mali et al., Science, 339:823-826, 2013]; [Kim et al., Genome research, 24:1012-1019, 2014]; [Cong et al., Science, 339:819-823, 2013]). 이어서, DSB는 내인성 DNA 수복 기전에 의해, 우선적으로는 비상동성 말단 연결(NHEJ) 경로를 사용하여 해결된다. NHEJ는, 일반적으로 indel로 지칭되는, 삽입 또는 결실 형태의 추가의 돌연변이를 DSB 부위에 도입하기 때문에, 유전자 교정 적용에는 부적절하다. 그러나, 일부 경우에서, 표적화된 세포는, 비돌연변이체 상동성 염색체 또는 공급된 외인성 DNA 분자를 주형으로서 사용하여 DSB 부위를 재구축하여 실제로 돌연변이체 대립유전자를 교정하는, 상동성 지정 수복(HDR)으로 불리는 대안적 DNA 수복 경로를 활성화시킨다(문헌 [Lin et al., Elife, 3:e04766, 2014]; [Wu et al., Cell stem cell, 13:659-662, 2013]). 현재, 돌연변이를 도입하는 데, 및 내인성 NHEJ를 사용하여 유전자 넉아웃을 생성하는 데 CRISPR/Cas9가 지배적으로 사용된다. HDR 효율이 비교적 낮기 때문에, 유전자 요법을 위한 게놈 편집 적용은 제한되어 왔다(문헌 [Mali et al., 2013]; 예컨대, 문헌 [Suzuki et al., Nature Scientific Reports, 4:7621, 2014], 및 WO 2016/097751 A1(비수정 마우스 중기 II(MII) 난모세포에 Cas9 cRNA, gRNA, 및 정자를 주입하여 트랜스제닉 및 천연 대립유전자의 편집이 이루어질 수 있도록 함), 및 [Hashimoto et al., Developmental Biology, 418: 1-9, 2016](제1 복제 전에 전기천공을 이용하여 Cas9 단백질 및 sgRNA를 마우스 접합체 내로 도입하여 비모자이크 돌연변이체를 가능하게 함)).
CRISPR/Cas9 유도 DSB에 대한 반응으로 활성화된 인간 배우자 및 배아 DNA 수복 기전을 조사하였다. 건강한 기증자로부터 수집된 난모세포는 야생형 대립유전자를 제공한 반면, 이형접합성 캐리어 정자에 의해 도입된, 인간 접합체에서 MYBPC3 유전자 중의 이형접합성 4 염기쌍(bp: base-pair) 결실을 표적화하는 실험을 수행하였다. 단일 세포 수준에서의 난할 배아의 정확한 분석에 의해, 미리 선택된 CRISPR/Cas9 구축물에서의 높은 표적화 효율 및 특이성이 제시되었다. 또한, 돌연변이체 부계 MYBPC3 유전자에서의 DSB가 주형으로서 야생형 난모세포 대립유전자를 사용하여 우선적으로 수복되었으며, 이는 대안적인 생식세포계열 특이적 DNA 수복 반응을 제안하는 것이다. 정자 및 CRISPR/Cas9 성분의 중기 2(MII) 난모세포 내로의 공동 주입으로 명명되는, 모자이크 현상의 발생을 최소화시키기 위해 제안된 해결안을 이용하여 배아에서 모자이크 현상의 원인이 되는 기전에 대해서도 또한 조사하였다.
내인성, 생식세포계열 특이적 DNA 수복 반응을 활성화시킴으로써 정밀한 표적화 정확도로 및 현저히 높은 상동성 지정 수복(HDR) 효율로 인간 착상 전 배아에서 예시적인 이형접합성 MYBPC3 돌연변이를 교정하기 위해 CRISPR/Cas9를 사용하였다. 돌연변이체 부계 대립유전자에서 유도된 이중 가닥 파단은 합성 DNA 주형 대신 상동성 야생형 모계 유전자를 사용하여 우선적으로 수복되었다. CRISPR/Cas9가 도입된 세포 주기 단계를 조정함으로써, 난할 배아에어스이 모자이크 현상을 피할 수 있었고, 이로써, 오프 타겟 돌연변이 증거 없이, 야생형 MYBPC3 유전자를 보유하는 동형접합성 배아를 고수율로 수득할 수 있었다. 상기 결과는 인간 생식세포계열 유전자 편집에서의 수많은 장벽을 극복할 수 있다는 것을 보여주며, 인간 배아에서의 유전 돌연변이의 효율적이고, 정확하며, 안전한 교정을 지지한다. 생식세포계열 유전자 교정은 착상 전 유전 진단에 대한 대안을 나타내며, 돌연변이체 인간 배아의 상당부를 구조하며, 이로써, 전달에 이용가능한 배아의 개수를 증가시킨다는 이점을 갖는다.
실시예 1
방법
본 실시예는 실시예 1-6에서 사용된 방법 및 물질을 기술한다.
인간 배우자 및 배아에 관한 연구에 관한 규제: 본 연구를 위한 인간 배우자 및 배아 사용을 둘러싼 규제 체계는 오레곤 보건 과학 대학교(OHSU: Oregon Health & Science University) 줄기 세포 연구 감독 위원회(OSCRO: OHSU Stem Cell Research Oversight Committee)에 의해 설정된 가이드라인을 기반으로 하였다. OSCRO는 OHSU에서 인간 배아 및 그의 유도체의 사용을 공식으로 정의하는 정책 및 절차상 가이드라인을 (2008년에) 확립하였고, 이는 미국 국립 과학원의 가이드라인(National Academy of Sciences' Guidelines)에 의해 통지되었다. 상기 정책 및 가이드라인은 연구 목적의 배우자 및 배아 조달, 구체적으로 연구를 위한 인간 배아의 생성, 인간 배우자/배아의 유전적 조작, 인간 배아 줄기 세포주 생성, 및 분자적 분석을 허용하였다. 동시에, OSCRO 및 OHSU 생명 윤리 위원회(IRB: Institutional Review Board)는 공동으로 OHSU에서의 인간 배아를 포함하는 조사 연구에 대한 적용을 검토하고, 모니터링하는 작업을 수행하였다.
OHSU에서의 인간 배아 및 배아 줄기 세포 연구 정책 및 원리는 10년 간에 걸쳐 조사되었고, NAS 가이드라인에 의해 통지되었고, 이어서, 2015년 힝스턴 그룹(Hinxton Group) 및 국제 줄기 세포 연구 학회(ISSCR: International Society for Stem Cell Research)에 의해 발표된 새 가이드라인 뿐만 아니라, 2017년 NAS 및 미국 국립 의학 아카데미(National Academy of Medicine) 합동 패널에 의해 발표된 인간 게놈 편집에 관한 권고사항에 의해 확인되었다.
검토 과정의 일부로서, OHSU는 제안된 연구의 과학적 장점 및 윤리적 정당화를 평가하기 위해 추가의 특별 위원회: OHSU 혁신 연구 자문 패널(IRAP: Innovative Research Advisory Panel) 및 과학 검토 위원회(SRC: Scientific Review Committee)를 소집하였다.
윤리적 검토: 국제 논의는 그의 유아기에서 이루어졌지만, OHSU 혁신 연구 자문 패널(IRAP) 위원회는 OHSU에서의 기초 연구를 위해 인간 배아에서 유전자 교정 기술을 사용하는 것에 관한 윤리적 고려 사항을 심의하는 임무를 맡게 되었다. 위원회는 내부 및 외부 공급처로부터의 11명의 구성원으로 구성되었다: 비전문가 구성원, 임상 ObGyn 의료진, 3명의 생명 윤리학자, OHSU 기관 윤리 위원회(Institutional Ethics committee) 구성원, 3명의 전 OSCRO 구성원, 임상 유전학자, 및 임상의. 검토 완료시, IRAP는 "중대한 감독과 지속적인 대화하에, 인간 모델에서 사용하기 전 생식세포계열 유전자 교정을 평가하는 데 요구되는 기초 과학 문제들에 답변하기 위한 목적으로 인간 배아에서 유전자 교정 기술을 사용하는 것"인 OHSU에서의 본 연구를 허용한다고 권고하였다.
연구 감독: 엄격한 비밀유지 및 규제 요건을 지지하는 본 연구팀의 확립된 실적이 2016년 완전한 OHSU IRB 연구 승인의 계기를 마련해 주었으며, 이는 엄격한 지속적인 감독 여하에 달린 것으로, 인간 착상 전 배아에서 생식세포계열 유전자 교정의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 단계적인 과학적 접근법, 연 2회의 인간 피험체에 관한 모든 규제 문서의 외부 모니터링, 연 2회의 데이터 안전성 모니터링 위원회(DSMC: Data Safety Monitoring Committee)의 검토, 및 매년 OHSU IRB에 의한 지속적인 검토를 포함하였다. DSMC는 4명의 구성원: 비전문가 구성원, 윤리학자, 유전학자, 및 생식 내분비학자로 구성되며, 그들의 권한은 이러한 프로토콜에 의해 생성되는 물질의 모든 장래 사용도 모니터링하는 것을 포함한다.
사전 동의: 유망한 기증자가 본 연구의 감수성 성질을 이해하였다면, 사전 동의를 하여야 한다고 OHSU가 제시한 강력한 규제 체계에는 명확하게 명시되어 있다. 이러한 상기 동의서로부터의 인용물에는 본 연구의 과학적 근거가 명확하게 제시되어 있다. 추가로, 동의서 용어에서는 착상 전 배아 및 배아 줄기 세포주를 생성하는 것 이외에도, 시험관내 분석을 위해 유전자 검사가 수행될 수 있고, 추후 사용을 위해 보관될 수 있다고 명확하게 언급되었다. 이러한 유형의 연구에 고용되었을 때에는 잠재적으로 기증자의 건강 관리에 중요한 유전 정보인 부수적 발견도 가능한 결과이다. 사전 동의 서류는 기증자에게 이러한 정보 수신 여부에 관한 옵션을 제공하였다. 작성된 사전 동의서는 모든 연구 관련 절차 전에 얻었다.
연구 참가자: 인쇄 및 웹 기반 광고를 통해 지방에서 건강한 배우자 기증자를 동원하였다. 이형접합성 MYBPC3 돌연변이를 갖는 정자 기증자는 OHSU 나이트 심혈관 연구소(OHSU Knight Cardiovascular Institute) 의료진이 확인하였고, 이는 연구팀으로 지칭되었다.
제어 난소 자극: 앞서 보고된 바와 같이, 연구 포함 전에 연구 난모세포 기증자를 평가하였고; 난소 자극을 위한 표준 IVF 프로토콜 및 절차는 앞서 기술된 바와 같다(문헌 [Tachibana et al., Nature, 493:627-631, 2013]). 난모세포 기증 주기를 OHSU 불임 의료진이 관리하였다. 난모세포 회수 후 즉시, 회수된 배우자를 연구 실험실로 전달하였다. 모든 연구 관련 절차는 배아 세포 및 유전자 요법을 위한 OHSU 센터(OHSU Center for Embryonic Cell and Gene Therapy)에서 진행되었다. 난모세포 회수 후, 난구-난모세포 복합체(COC: cumulus-oocyte complex)를 하이알루로니다제로 처리하여 난구 및 과립막 세포를 분해시켰다. 성숙한 중기 II(MII) 난모세포를 6% CO2하에 37℃에서 10% SSS(Global 10%)로 보충된 글로벌 배지(Global Medium)(LifeGlobal, IVFonline) 중에 배치시키고, 조직 배양 오일(Sage IVF, Cooper Surgical)로 덮었다.
보상: 연구 기증자들은 모두 불임 목적의 배우자 기증과 유사한 비율로 기증 프로세스와 연관된 기증자들의 시간, 노력, 및 가벼운 통증에 대해 보상을 받았다.
세포질내 정자 주입( ICSI ): MII 난모세포를 HEPES 10% 배지를 포함하는 50 ㎕의 HTF의 미세조작 소적 내로 배치하였다. 소적을 조직 배양 오일로 덮었다. 이어서, 스테이지 워머(tokaihit.com 참조) 및 나리시게(Narishige) 미세조작장치가 장착된 도립 현미경(Olympus IX71)의 스테이지 상에 디쉬를 탑재하였다. 냉동/해동된 정자를 사용하여 세포질내 정자 주입(ICSI)에 의해 난모세포를 수정시켰다. 2개의 전핵 및 제2 극체 압출의 존재를 기록함으로써 ICSI 후 대략 18시간째에 수정을 측정하였다.
접합체 또는 난모세포 내로의 CRISPR / Cas9 주입: S기 주입을 위해, ICSI 후 18시간째에 접합체를 수집하고, 미세조작 소적 내로 배치하고, Cas9 단백질(200 ng/㎕), sgRNA(100 ng/㎕), 및 ssODN(200 ng/㎕)을 함유하는 CRISPR/Cas9 혼합물과 함께 세포질 내로 주입하였다. 주입된 접합체를 6% CO2, 5% O2, 및 89% N2하에 37℃에서 최대 3일 동안 4-8 세포기까지 글로벌 10% 배지 중에 배양하였다. M기 주입을 위해, CRISPR/Cas9를 ICSI 동안 정자와 함께 공동 주입하였다. 먼저, 단일 정자를 상기 기술된 바와 같이, Cas9 단백질, sgRNA, 및 ssODN을 함유하는 혼합물의 소적 4 ㎕ 중에서 세척하였다.
난할구 단리, 전체 게놈 증폭, 및 생어 시퀀싱: 4-8 세포 단계 배아로부터의 투명대를 산성 타이로드(Tyrode) 용액(NaCl 8 mg/mL, KCl 0.2 mg/mL, CaCl2.2H2O 2.4 mg/mL, MgCl2.6H2O 0.1 mg/mL, 글루코스 1 mg/mL, PVP 0.04 mg/mL)에 잠깐 동안 노출시킴으로써 제거하였다. 투명대가 없는 배아를 트립신 용액(Ca 및 Mg 무함유 PBS를 함유하는 EDTA 중 0.15%)에 짧게(30 sec) 노출시킨 후, 작은 보어 피펫을 이용하여 수동으로 단일 난할구로 분해시켰다. 대조군으로부터 19개, 접합체 주입군으로부터 54개, 및 M기 주입군으로부터 58개를 포함하는 131개의 배아로부터 총 830개의 난할구를 단리시켰다. 개별 난할구를 4 ㎕ PBS를 함유하는 0.2 ml PCR 튜브 내로 옮겨 놓고, 추가 사용시까지 -80℃ 냉동고에 배치시켰다. REPLI-s 단일 세포 키트(REPLI-s Single Cell Kit)(Qiagen)를 사용하여 개별 난할구로부터의 전체 게놈 증폭을 수행하였다. 증폭된 DNA를 1/100으로 희석시키고, 프라이머 세트 F 5'-CCCCCACCCAGGTACATCTT-3'(서열 번호 40) 및 R 5'-CTAGTGCACAGTGCATAGTG-3'(서열 번호 41)과 함께 PCR 플래티넘 슈퍼믹스 하이 피델리티 키트(PCR Platinum SuperMix High Fidelity Kit)(Life Technologies)를 이용하여 온 타겟 영역을 증폭시켰다. 534 bp의 PCR 생성물을 정제하고, 생어 시퀀싱하고, 시퀀서(Sequencher) v5.0(GeneCodes)에 의해 분석하였다. 830개의 난할구 중 730개(88%)가 성공적인 라이브러리를 생성하였고, MYBPC3에 대한 PCR 생성물을 생산한 반면, 나머지 100개의 난할구(12%)는 PCR 생성물을 생성하지 못했고, 본 연구로부터 배제되었다.
iPSC 유도 및 CRISPR / Cas9 형질감염: 제조사의 프로토콜에 따라 시토튠-iPS 리프로그래밍 키트(CytoTune-iPS Reprogramming Kit)(Life Technologies)를 사용하여 피부 섬유아세포로부터 환자 iPSC를 유도하였다. 세포주를 5% CO2를 함유하는 습윤 대기하에 37℃에서 mTeSR1 배지(STEMCELL technology) 중에서 배양하였다. CRISPR/Cas9를 시험하기 위해, 2x105개의 iPSC를 단일 세포로 해리시켰다(STEMCELL technology로부터의 Accutase, 또는 Invitrogen으로부터의 TrypLe). CRISPR/Cas9-1 구성을 위해, Cas9 발현 플라스미드(p3 s-Cas9HC, 2.4 ㎍), sgRNA 발현 플라스미드(pU6-sgRNA, 1.6 ㎍), 및 ssODN-1(100 pmol, IDT)를 제조사의 프로토콜에 따라 아막사 P3 프라이머리 셀 4D-뉴클레오펙터 키트(Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector Kit)(Program CB-150)를 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 후 3일째, 대략 5,000개의 세포를 마트리겔(Matrigel) 코팅된 배양 디쉬 상에 플레이팅하고, 클론 증식 및 개별 클론 선별을 위해 배양하였다. CRISPR/Cas9-2 구성을 위해, 15 ㎍의 Cas9 발현 플라스미드(pCAG-1BPNLS-Cas9-1BPNLS), 15 ㎍의 sgRNA 발현 플라스미드(pCAGmCherry-MYBPC3gRNA), 및 30 ㎍의 ssODN-2를 0.4 cm 갭 큐베트가 장착된 바이오래드 진 펄서 II(BioRad Gene Pulser II)(실온에서 단일 320 V, 200 μF 펄스)를 사용하여 전기천공에 의해 공동 형질감염시켰다. 세포를 마트리겔로 코팅된 6웰 플레이트 상에 고밀도로 플레이팅하였다. 전기천공 후 2 내지 3일째에 iPSC를 수확하고, 클론 선별을 수행하였다. 모든 세포주는 마이코플라스마 오염에 대하여 음성이었다. CRISPR-Cas9-1과 CRISPR-Cas9-2를 직접 비교하기 위해, 재조합 Cas9 단백질(15 ㎍) 및 sgRNA(20 ㎍)로 구성된 Cas9 RNP 복합체를 상기 기술된 바와 같이 전기천공에 의해 ssODN-1(50-200 pmol, IDT)과 함께 iPSC(2x105개의 세포) 내로 공동 형질감염시켰다. 형질감염 후 3일째, 표적화된 심층 시퀀싱에 의해 indel 및 HDR 효율을 분석하였다.
재조합 Cas9 단백질 및 sgRNA의 시험관내 전사: 재조합 Cas9 단백질을 툴젠, 인크.(ToolGen, Inc.)로부터 구입하였다. sgRNA를 앞서 기술된 바와 같이 T7 폴리머라제(New England Biolabs)를 이용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다(문헌 [Kim et al., Nature communications, 5:3157, 2014]). 간략하면, 두 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 연장에 의해 sgRNA 주형을 생성하였다. 이어서, NTP(Jena Bioscience) 및 RN아제 억제제(New England Biolabs)로 보충된 T7 RNA 폴리머라제와 함께 sgRNA 주형을 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켜 시험관내 전사를 수행하였다. 이어서, 시험관내 전사된 RNA를 37℃에서 30 min 동안 DN아제 I(New England Biolabs)로 처리하고, 민엘루트 클린업 키트(MinElute Cleanup kit)(Qiagen)를 이용하여 정제하였다.
표적화된 심층 시퀀싱, 게놈 DNA 절단, 전체 게놈, 및 디게놈 시퀀싱: HDR 및 NHEJ 빈도를 분석하기 위해, 퓨전(Phusion) 폴리머라제(New England Biolabs)를 사용하여 온 타겟 및 오프 타겟 영역을 증폭시켰다. 일루미나 미니seq(Illumina Miniseq)를 사용하여 PCR 앰플리콘에 대해 쌍형성 말단 시퀀싱을 수행하였다. indel 및 HDR 빈도를 분석하기 위해 Cas-분석기를 사용하였다(문헌 [Bae et al., Bioinformatics, 30:1473-1475, 2014]; [Park et al., Bioinformatics, 33:286-288, 2017]). DN이지 티슈 키트(DNeasy Tissue Kit)(Qiagen)를 이용하여 게놈 DNA를 환자 iPSC로부터 단리시켰다. 이전 공개문헌에 따라 Digenome-seq를 수행하였다(문헌 [Kim et al., Nature methods, 12:237-243, 231 p following 243, 2015]; [Kim et al., Genome research, 26:406-415, 2016]). 간략하면, 1X NEB 완충제 3.1(100 mM NaCl, 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 100 ㎍/ml BSA, pH 7.9) 중에서 재조합 Cas9 단백질(16.7 ㎍) 및 시험관내 전사된 sgRNA(12.5 ㎍)를 37℃에서 3 hr 동안 인큐베이션시켜 20 ㎍의 게놈 DNA를 절단하였다. Cas9 및 sgRNA 처리된 게놈 DNA를 37℃에서 30 min 동안 50 ㎍/ml의 RN아제 A(Sigma Aldrich)로 처리하고, DN이지 티슈 키트(Qiagen)를 정제하였다. 앞서 기술된 바와 같이 전체 게놈 및 디게놈 시퀀싱을 수행하였다(상기 동일). 간략하면, 1 ug의 게놈 DNA를 단편화하고, TruSeq DNA 라이브러리를 사용하여 어댑터와 라이게이션시켰다. 마크로젠(Macrogen)에서 일루미나 HiSeq X 텐 시퀀서(Illumina HiSeq X Ten Sequencer)(30X 내지 40X)를 이용하여 DNA 라이브러리에 대해 전체 게놈 시퀀싱을 수행하였다. 이삭(Isaac) 얼라이너를 이용하여 서열 파일을 하기 맵핑 프로그램 및 파라미터를 이용하여 인간 참조 게놈 hg19에 대해 정렬하였다: 염기 품질 컷오프, 15; 중복 리드 유지 여부, 예; 가변 리드 길이 지원 여부, 예; 갭 재정렬 여부, 아니오; 및 어댑터 클립핑 여부, 예(어댑터: AGATCGGAAGAGC*(서열 번호 42), *GCTCTTCCGATCT(서열 번호 43). 앞서 기술된 DNA 절단 점수화 체계를 사용하여 컴퓨터 방식으로 시험관내 DNA 절단 부위를 확인하였다(문헌 [Raczy et al., Bioinformatics, 29:2041-2043, 2013]; [Kim et al., 2016]). DNA 절단 점수가 0.1 컷오프 값을 초과하는 23개의 게놈 유전자좌의 Indel 빈도를 표적화된 심층 시퀀싱에 의해 개별 난할구에서 개별적으로 조사하였다.
WGS에 의한 CRISPR - Cas9 주입된 인간 배아에서의 오프 타겟 효과 분석: 30Х 내지 40Х의 시퀀싱 심도로 일루미나 HiSeq X 텐 시퀀서(Macrogen, 한국 소재)를 이용하여 WGS를 수행하였다. 각 난할구로부터의 서열을 프로세싱하여 이삭 변이체 해독 프로그램을 이용하여 전체 변이체를 측정하였다(문헌 [Raczy et al., 2013]). dbSNP 및 모든 신규의 SNP(치환 변이)를 비롯한, 주석달린 변이체를 여과하고, 신규 indel 부위를 확인하였다. Cas-OFFinder(문헌 [Bae et al., 2014])를 사용하여 최대 2개의 뉴클레오티드로 이루어진 DNA 벌지(bulge)와 최대 7개의 뉴클레오티드 미스매치 또는 최대 5개의 뉴클레오티드 미스매치에 의해 온 타겟 서열과 상이한 잠재적인 오프 타겟 서열을 추출하였다. 각 난할구에서 발견된 Indel 부위를 Cas-OFFinder에 의해 확인된 상동성 부위와 비교하였고, 잠재적인 오프 타겟 부위를 확인하였다. 이어서, 잠재적인 오프 타겟 부위를 배제시켰고; 잠재적인 오프 타겟 부위를 무손상 대조군 배아에서 발견하였다. 최종적으로, 통합 게노믹스 뷰어를 이용하여 서열을 검사함으로써 CRISPR-Cas9가 상기 잠재적인 오프 타겟 부위 중 임의의 것을 유발하였는지 여부를 검정하였다(문헌 [Robinson et al., 2011]).
전체 엑솜 시퀀싱 및 데이터 분석: 정자 기증자 및 2명의 난자 기증자(난자 기증자 1 및 난자 기증자 2)의 말초 혈액, 및 개별 인간 배아로부터 유래된 ES 세포로부터 단리된 게놈 DNA를 사용하여 전체 엑솜 시퀀싱(WES: whole-exome sequencing)을 수행하였다(ES-WT1, ES-Mut1, 및 ES-C1은 난자 기증자 1로부터의 것이고; ES-WT2 및 ES-WT3은 난자 기증자 2로부터의 것이었다). ES-WT1, ES-WT2 및 ES-WT3은 처리된 야생형 배아로부터의 것이었다. ES-C1은 비처리된 야생형 배아로부터의 것이었다. ES-Mut1은 처리된 이형접합성 돌연변이체 배아로부터의 것이었다. 일루미나 라이브러리 제조용 설명서에 따라 시퀀싱 라이브러리를 제조하였다. 애질런트 V5(Agilent V5) 칩을 이용하여 엑솜을 포획하였다. 쌍형성 말단 101(PE101: paired-end 101) 전략법을 이용하여 100Х의 시퀀싱 심도로 일루미나 HiSeq 4000 플랫폼을 이용함으로써 시퀀싱을 수행하였다. 먼저, 어댑터 서열을 여과하고, BGI에 의해 개발된 SOAPnuke(1.5.2) 소프트웨어(soap.genomics.org.cn)를 이용하여 품질이 낮은 리드, 또는 N 염기 비율이 높은 리드를 제거함으로써 모든 시퀀싱 데이터를 프로세싱하고, 각 라이브러리에 대해 순수 리드를 생성하였다. 브로우스-휠러 얼라이너(BWA: Burrows-Wheeler Aligner) 프로그램 버전 0.7.12를 사용하여 순수 데이터를 인간 게놈 어셈블리 hg19에 대해 쌍형성 말단 정렬하였다. 피카드(Picard)(1.54) 중 마크듀플리케이츠(MarkDuplicates)를 이용하여 정렬 BAM 파일 중 중복 리드를 확인하였다. GATK(3.3.0)에서 리얼라이너타겟크리에이터(RealignerTargetCreator), Indel리얼라이너(IndelRealigner) 및 베이스리캘리브레이터(BaseRecalibrator) 모듈을 이용하여 정렬 결과를 프로세싱하였다. GATK에서 하플롯타입콜러(HaplotypeCaller) 도구를 이용하여 변이체 검출을 수행하였다. SNV 및 indel 정보를 추출하고, GATK에서 VQSR에 의해 여과하고, AnnoDB(v3)에 의해 주석을 달았다. 가이드 서열(GGGTGGAGTTTGTGAAGTAT, 서열 번호 3)을 인간 게놈 어셈블리 hg19에 대해 정렬하여, 전반적으로 최대 5개의 미스매치 및 코어 영역(PAM 부위에 인접한 12 bp)에서 최대 2개의 미스매치를 허용하면서, 완전 고감도 얼라이너 배트미스(Batmis)(V3.00)를 이용하여 잠재적인 오프 타겟 부위를 확인하였다. 부모로부터 유전된 변이체 및 모든 신규 SNP(치환 변이)를 여과하고, 오프 타겟 부위 + 측면에 위치하는 20 bp 영역 내에 위치하는 신규 indel을 오프 타겟 변이체로서 정의하였다.
통계 분석: 도 2f, 도 3c, 및 도 5e에서는 비교를 위해 단측 피셔 검정이 사용되었다. 도 1f 및 2c-2d에서의 비교를 위해서는 분할표가 사용되었다. 0.05 미만인 P 값을 유의적인 것으로 간주하였다.
실시예 2
이형접합성 MYBPC3 ΔGAGT 결실을 갖는 피험체 및 CRISPR / Cas9 구성물 선정
MYBPC3 유전자의 엑손 16에서의 이형접합성 우성 4 bp GAGT 결실(g.9836_9839 del)에 의해 유발된, 문서에 의해 충분히 입증된 HCM을 앓고 있고, 현재 삽입형 심장제세동기로 관리를 받고 있는 성인 남성 환자는 피부 및 정액 샘플을 기증하는 것에 동의하였다. 앞서 기술된 바와 같이, 피부 섬유아세포 배양물을 확장시키고, 이를 사용하여 이형접합성 환자 iPSC를 생성하였다(문헌 [Kang et al., Cell Stem Cell, 18:625-636, 2016]). 2개의 작은 가이드 RNA(sgRNA)-Cas9 구성물을 디자인하고, 표적화된 영역에 대한 상동성 아암을 코딩하는 2개의 외인성 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN) 주형과 함께 상기 특이적인 MYBPC3ΔGAGT 결실(도 5a-5b)을 표적화하였다(도 5a-5f; 문헌 [Cho et al., Nature biotechnology, 31:230-232, 2013]; [Kim and Kim, Nat Rev Genet, 15:321-334, 2014]; [Jinek et al., Science, 337:816-821, 2012]). WT 대립유전자와 구별하기 위해, 2개의 동의 단일 뉴클레오티드 치환을 각 ssODN 주형 내로 도입하였다. ssODN-2 뉴클레오티드 치환은 추가의 제한 효소(BstBI) 인식 부위를 제공하였다(도 5a-5b).
환자 iPSC를 형질감염시켜 각 구성물의 효능 및 특이성을 시험하였다. ssODN, Cas9, 및 sgRNA 발현 플라스미드로 함께 세포를 전기천공시켰다. 이어서, 세포를 서브클로닝하고, 각 클론의 표적화된 영역을 시퀀싱에 의해 분석하였다(도 5c). 무손상 WT 및 무손상 돌연변이체(Mut) 대립유전자, 둘 모두가 존재하는 것을 입증되는 바와 같이(도 5d-5f), CRISPR/Cas9-1로 형질감염된 61개의 iPSC 클론 중 44개(72.1%, 44/61)가 표적화되지 않았다. 표적화된 클론 중에서 17개 중 10개(58.8%)가 NHEJ에 의해 수복되었고, 돌연변이 부위에 인접한 위치에 다양한 indel을 함유하였다. 마커 뉴클레오티드 치환의 존재로 입증되는 바와 같이, 남은 7개의 클론은 ssODN-1을 사용하여 HDR에 의해 수복되었다. 따라서, CRISPR/Cas9-1에 대한 전체 표적화 효율은 27.9%(17/61)였다. 표적화된 클론 중에서 단지 41.2%(7/17)만이 HDR에 의해 수복되었다(도 5e). CRISPR/Cas9-2(13.1%; 23/175) 및 HDR의 경우, 표적화 효율은 13%(3/23)로 상당히 더 낮았다. 특히, 3개의 HDR 수복 iPSC 클론 중에서 2개는 ssODN-2 주형을 사용하여 수복된 반면, 3번째 클론은 두 대립유전자 모두에 무손상 WT 서열을 함유하였는데(도 5d-5e), 이는 WT 대립유전자를 이용하여 HDR이 이루어졌음을 시사하는 것이다.
어느 구성물이든 그러한 구성물로 형질감염된 모든 iPSC 클론에서, WT 대립유전자는 무손상 상태 그대로 유지되었고, 이는 sgRNA의 충실도도 높다는 것을 입증하는 것이다. 미리 어셈블리된 Cas9 리보뉴클레오단백질(RNP)로 형질감염된 환자 iPSC에서의 CRISPR-Cas9-1 및 CRISPR-Cas9-2의 직접적인 비교도 또한 수행하였다. 표적화된 심층 시퀀싱 결과, CRISPR-Cas9-1의 HDR 효율이 더 높았다는 것이 입증되었다(도 5f). 야생형 MYBPC3 대립유전자, 둘 모두를 보유하는 야생형 배아 줄기(ES: embryonic stem) 세포(H9)에서는 온 타겟 돌연변이가 검출되지 않았고, 이는 CRISPR-Cas9-1에 대한 높은 특이성을 입증하는 것이다. 상기 결과에 기초하여, HDR 기반 유전자 교정 효율이 더 높은 CRISPR/Cas9-1(이하, CRISPR/Cas9로 지칭)을 후속 연구를 위해 선택하였다.
실시예 3
CRISPR / Cas9 구성물 주입된 인간 이형접합성 MYBPC3 ΔGAGT 접합체에서의 HDR 효율
인간 접합체에서 표적화 결과를 평가하였다. 건강한 기증자 난모세포를 이형접합성 MYBPC3 돌연변이를 보유하는 환자로부터의 정자와 수정시켜 접합체를 생산하였다. 플라스미드를 사용하는 것보다 Cas9 단백질을 직접 도입하는 것이 더 효율적이기 때문에, sgRNA, Cas9 단백질, 및 ssODN DNA의 혼합물을 사용하여 수정 후 18 hr째 전핵 단계 접합체의 세포질 내로 수행하는, 재조합 Cas9 단백질 미세주사를 채택하였다(문헌 [Kim et al., 2014]; [Aida et al., Genome biology, 16:87, 2015]). 무손상 대조군과 함께 주입된 접합체를 3일 동안 배양한 후, 각 배아 난할구를 단리시키고, 시퀀싱에 의해 개별적으로 분석하였다(도 1). Cas9-sgRNA의 세포질 미세주사를 시각적으로 확인하였고, 대조군과 유사한 97%의 접합체 생존율(68/70) 및 발생률을 보이며, 효율적인 것으로 나타났다.
수정 후 3일째 19개의 대조군 난할 배아로부터 수집된 83개의 개별 난할구의 생어 시퀀싱 결과, 9개의 배아(47.4%, 9/19)가 동형접합성 WT(MYBPC3WT/WT)이고, 10개(52.6%. 10/19)가 WT 모계 및 돌연변이체 부계 대립유전자를 보유하는 이형접합성(MYBPC3WT/ΔGAGT; 도 2a)인 것으로 밝혀졌고, 이는 이형접합성 환자 정자 샘플이 이동성 및 수정률이 유사한 돌연변이체 및 WT 정충을 동일한 개수로 함유한다고 가정하였을 때, 예상되는 분포이다.
CRISPR/Cas9 주입된 인간 배아 중, 36개(66.7%, 36/54)가 WT 대립유전자에 대하여 균일하게 동형접합성이었고, 각 난할구는 MYBPC3WT /WT를 보유한 반면, 18개(33.3%, 18/54)는 균일하거나, 또는 모자이크 이형접합성이었다(도 2a). 상기 18개 군에서, 5개의 배아는 균일하게 이형접합성이었고, 각 난할구는 무손상 WT 및 무손상 돌연변이체 대립유전자를 함유한 반면(MYBPC3WT / ΔGAGT), 13개는 모자이크였고, 각각은 1개 초과의 유전자형을 보유하는 난할구를 함유하였다(도 2a). 각 모자이크 배아는 WT, 및 무손상 GAGT 결실 또는 GAGT 결실 + 추가의 indel을 포함하는 적어도 하나의 이형접합성 난할구를 함유하였으며, 이는 상기 배아가 돌연변이체 정자에 의한 수정으로부터 생성된 이형접합성 접합체(MYBPC3WT / ΔGAGT)로부터 기원한 것임을 제안하는 것이다(도 2b). 놀랍게도, 거의 8개의 모자이크 배아(도 2b에서 1, 2, 4, 6, 7, 10, 11, 및 12번)에서 남은 자매 난할구 중 대다수는 WT 대립유전자에 대해 동형접합성(MYBPC3WT /WT)이었다. 전반적으로, 모자이크 배아 내에서 52.2%(35/67)의 개별 난할구가 동형접합성 MYBPC3WT / WT이었다(도 2b-2c). 상기 배아는 MYBPC3WT / Δ GAGT 접합체로부터 기원하였기 때문에, 그의 난할구는 가능하게는, 주입된 ssODN 대신, 주형으로서 모계 WT 대립유전자를 사용하여 HDR에 의해 MYBPC3ΔGAGT 결실을 회복하였다. 이러한 결론은, ssODN 주입되지 않은 모자이크 배아의 난할구에서 교정이 일어났다는 관찰결과에 의해 입증되었다(도 2b). 다른 유전자형 중에서 4개의 모자이크 배아(도 2b에서 5, 8, 10, 및 13번)는 무손상, 돌연변이체 대립유전자(MYBPC3WT/ΔGAGT)를 포함하는 난할구를 함유하였지만, 대부분은(29.9%) 또한 NHEJ의 특징인, DSB 부위에 인접한 위치에 추가의 작은 결실(1-20 bp 길이, n=16) 또는 삽입(1 bp; n=3)을 함유하였다(MYBPC3WT / ΔGAGT - indel). 한 난할구는 10 bp 결실 및 5 bp 삽입을 보유한 반면, 모자이크 배아 #9는 그의 난할구에서 4개의 다양한 NHEJ 유전자형을 보였으며, 이는 아마도 제1 접합체 분열 후 독립적으로 다회에 걸쳐 표적화 및 NHEJ 수복이 이루어졌을 것이라고 제안하는 것이다.
상기 결과에 기초하여, 인간 배아에서의 CRISPR/Cas9 표적화 효율은 72.2%(13/18)로, 동일한 구성물에 노출된 iPSC에서 27.9%(17/61)인 것보다 유의적으로 더 높았는데(도 1e 및 2d-2e), 이는 가능하게는 iPSC에서의 형질감염과 비교하였을 때, 접합체 미세주입에 의한 CRISPR/Cas9 구성물 전달이 더 효율적인 것에 기인하는 것일 수 있다. 더욱더 놀랍게도, 대다수의 표적화된 난할구(63.6%, 35/55)는 WT 대립유전자를 사용하여 HDR에 의해 DSB를 해결하였는데, 이 또한 iPSC에서의 관찰결과와 크게 상이한 것이다(도 1e 및 2d). 외인성 ssODN을 이용한 HDR의 증거는 없었고, 이는 HDR이 배타적으로 WT 모계 대립유전자에 의해 가이드되었다는 것을 제안하는 것이다.
상기 표적화 효율 및 HDR 산출은 오직 모자이크 배아에만 기초한 것이고; 일부 표적화된 이형접합성 접합체(MYBPC3WT / ΔGAGT)는 가능하게는 그의 모든 난할구에서 WT 주형(MYBPC3WT /WT)을 사용하여 돌연변이체 대립유전자를 수복하였다. 상기 HDR 수복 균일한 배아는 WT 동형접합성 대응물과 구별되지 않고, 가능하게는 CRISPR/Cas9 주입군 중 MYBPC3WT /WT 배아의 부분을 증가시킨다. 실제로, 66.7%(36/54)의 주입된 배아가 동형접합성 WT/WT였고, 이는 대조군인 비주입된 배아에서의 WT/WT 수율(47.4%, 9/19)에 비해 유의적으로 증가된 것이다(도 2f). iPSC에서의 관찰결과와 유사하게, WT 대립유전자를 포함하는 온 타겟 돌연변이는 인간 배아에서 검출되지 않았으며, 이는 sgRNA의 특이성을 입증하는 것이다.
요약하면, 본 결과를 통해, CRISPR/Cas9에 의한 인간 접합체에서의 유전자 표적화 효율은 매우 높고, 돌연변이체 부계 대립유전자에서의 DSB는 주로 HDR을 통해 수복되었다는 것이 명확하게 입증되었다. 추가로, HDR은 배타적으로 모계 염색체에 존재하는 상동성 WT 대립유전자에 의해 지시되었다. 이론으로 제한하지 않으면서, 상기 데이터는 인간 배아가 체세포 또는 만능성 세포보다는 상이한 DNA 수복 기전을 사용한다는 것을 제안하며, 가능하게는 생식세포계열에서의 게놈 충실도에 관한 엄격한 제어를 위한 진화적 요건을 반영한다.
실시예 4
MII 난모세포 내로의 CRISPR / Cas9 주입이 모자이크 현상을 제거한다
유전자 표적화된 인간 배아에서 모자이크 현상은 임상 적용에서는 허용되지 않는다. 모자이크 배아 내의 단일 돌연변이체 난할구의 존재도 PGD에 의한 검출에서 문제를 일으킬 수 있고; 이에, 모자이크 현상의 원인이 되는 분자 기전을 조사하였다. 대다수의 모자이크에서의 표적화 결과 분석에서, 접합체 주입된 인간 배아는 단 2개의 상이한 유전자형을 나타내었다(MYBPC3WT / HDR 및 MYBPC3WT / ΔGAGT - indel 또는 MYBPC3WT/HDR 및 MYBPC3WT / ΔGAGT; 도 2b). 배아 #5 및 #9는 예외적으로 3개 이상의 유전자형을 함유하였다. 이는 CRISPR/Cas9가 접합체 내로의 주입에도 불구하고 적어도 2개의 돌연변이체 정자 대립유전자를 표적화하였다는 것을 제안한다. 이론으로 제한하지 않으면서, 1) 주입 당시 접합체가 DNA 복제와 함께 세포 주기 중 S기를 완료하였고, 이미 2개의 돌연변이체 대립유전자를 생산하였다는 가능성, 또는 2) CRISPR/Cas9가 도입 후에도 활성 상태 그대로 유지되었고, 이로써, 접합체 분열 후에도 계속해서 표적화하였다는 가능성, 이 두가지 다른 가능성으로 상기 결과를 설명할 수 있다(문헌 [Capmany et al., Mol Hum Reprod, 2:299-306, 1996]).
의심할 것도 없이 정자가 여전히 단일 돌연변이체 카피를 함유할 때, 게놈 편집이 일어날 수 있도록 허용하면서, 세포질내 정자 주입(ICSI) 수정 동안 CRISPR/Cas9를 정자와 함께 M기 난모세포 내로 공동 주입한다면, 두 정황은 모두 폐기될 수 있다. 추가로, MII 세포질에의 노출 시간을 연장시키면, DNA 복제로 2개 이상의 돌연변이체 대립유전자가 생성되기 전에 CRISPR/Cas9 성분은 분해될 수 있다(도 3a). 그러므로, CRISPR/Cas9를 정자 현탁액과 혼합하였고, ICSI 시술 동안 75개의 MII 난모세포 내로 공동 주입하였고, CRISPR/Cas9 주입된 난모세포와 무손상 대조군 난모세포 사이에 생존율, 수정률, 및 절단율에 있어서 어떤 차이도 관찰되지 않았다. 수정 후 3일째, 4-8 세포기의 배아를 분해하였고, 각 개별 난할구를 S기 주입된 접합체에 대해 상기 기술된 바와 같이 분석하였다. 58개의 M기 주입된 배아 중 16개로부터의 난할구(27.6%)는 모든 세포에서 다양한 indel을 보유하는 NHEJ 수복 돌연변이체 부계 서열과 함께 무손상 WT 모계 대립유전자를 보유하며, 균일하게 이형접합성이었다(MYBPC3WT/ΔGAGT-indel)(도 3b). 남은 42개(72.4%)는 MYBPC3WT / WT였다. 이중 대부분(41/42)은 구별되지 않는 MYBPC3WT /WT 대립유전자를 보유하는 난할구로 구성된, 균일하게 동형접합성인 배아였다. 흥미롭게도, 남은 배아 M2-WT42는 MYBPC3WT / WT이되, ssODN을 이용한 HDR 수복이 이루어진 4개의 난할구를 함유한 반면, 다른 3개의 자매 난할구는 구별이 되지 않는 MYBPC3WT / WT였고, 이는 모계 WT 대립유전자를 이용한 HDR임을 입증하는 것이다. 무손상 돌연변이체 대립유전자를 갖는 이형접합성 난할구(MYBPC3WT/ΔGAGT)는 검출되지 않았고, 이는 S기 주입된 접합체에서의 표적화 효율이 72.2%인 것과 비교하여 M기 주입군에서 표적화 효율이 100%라는 것을 시사하는 것이다(도 2d 및 도 3b). 더욱 중요하게는, 거의 한 배아에서 모든 자매 난할구는 동일한 유전자형을 보유하였고, 이는 M기 주입된 배아에서 모자이크 현상이 현저히 감소하였다는 것을 시사하는 것이다. 오직 모자이크 배아에서만 모든 난할구가 HDR(주형으로서 WT 또는 ssODN)에 의해 수복되었다. 따라서, 모든 난할구가 수복된 MYBPC3WT/WT를 보유하는 상기 배아가 전달 자격이 있을 것이다.
비처리된 대조군(47.4%, 9/19)과 비교하여 M기 주입군에서의 MYBPC3WT /WT 배아의 수율(72.4%, 42/58)은 유의적으로 더 높았으며(도 3c, P<0.05), 이는 심지어 ssODN의 존재하에서 주형으로서 WT 상동성 염색체를 이용하여 DSB 수복이 이루어졌을 때, 돌연변이체 부계 대립유전자의 표적화된 교정이 증진되었음을 반영하는 것이다(도 3d). CRISPR-Cas9 주입된 접합체 및 난모세포에서 WT/WT 배아의 증가가 관찰되는 것은 PCR 및 생어 시퀀싱 동안의 대립유전자의 드롭 아웃에 기인하였을 것이라는 가능성을 배제시키기 위해, 독립 온 타겟 심층 시퀀싱에 의해 유전자형을 입증하였다. S기 및 M기 주입군에 대한 추정된 HDR 기반 수복 및 WT/WT 배아 증가는 각각 16.7%(9/54) 및 22.4%(13/58)였다(도 3e). 요약하면, 접합체 주입과 비교하였을 때, MII 난모세포 내로의 CRISPR/Cas9의 전달이 더욱 효율적으로 표적화하고, 모자기크 현상을 제거한다.
실시예 5
본 실시예는 수복된 배아의 발생 및 세포유전적 특징을 기술한다. 유전자 교정이 착상 전 발생에 미치는 효과를 조사하기 위해, CRISPR-Cas9 주입된 배아를 배반포까지 배양하였다. 무손상 대조군과 유사하게, 72.7%(16/22)의 M기 주입된 배아가 8 세포기까지 발생하였고, 50.0%(11/22)는 배반포까지 진행하였다(스튜던츠 t 검정, P > 0.05; 도 10a-10b). 유전자 교정된 배반포의 발생 능력에 대한 추가 식견을 제공하고, 상세한 세포유전적 연구를 위해 충분한 세포 물질을 수득하기 위해 세포주를 확립하였으며, 이는 CRISPR-Cas9 주입된 배반포로부터 6개의 ES 세포주 및 대조군으로부터 하나를 포함한다. 온 타겟 분석 결과, 4개의 CRISPR-Cas9 처리된 ES 세포주(ES-WT1, ES-WT2, ES-WT3, 및 ES-WT4) 및 하나의 대조군 세포주(ES-C1)는 MYBPC3WT / WT인 반면, 남은 2개의 CRISPR-Cas9 주입된 세포주(ES-Mut1 및 ES-Mut2)는 MYBPC3WT / ΔGAGT - indel인 것으로 나타났다. 상기 결과는 M기 주입된 인간 배아에서의 CRISPR-Cas9의 표적화 효율이 매우 높다는 것을 입증한다.
세포유전적 G 밴딩 분석 결과, ES-WT1, ES-WT4, ES-Mut1, 및 ES-Mut2는 정상적인 이배체 핵형을 보유하였고, 검출가능한 수적 또는 구조적 염색체 재배열의 증가는 없는 것으로 나타났다. 특히, ES-WT2, ES-WT3, 및 대조군 세포주 ES-C1은 염색체 10에서 함동원체 역위를 보였다. 따라서, 처리된 ES 세포 및 대조군 ES 세포, 둘 모두 상기 염색체 재배열을 보였기 때문에, 재배열은 정자에 기인하는 것이었고, 이는 유전될 수 있다. 환자의 피부 섬유아세포 유래 iPSC의 분석 결과, 동일한 역위가 나타났고, 이는 상기 역위가 균형을 이루었다는 것을 시사하는 것이다. 요약하면, CRISPR-Cas9 처리된 인간 배아는 세포유전적 이상 없이 배반포 및 ES 세포까지 정상적으로 발생한 것으로 나타났다.
실시예 6
CRISPR / Cas9 주입된 인간 배아에서의 잠재적인 오프 타겟 결과
전반적인 표적화 및 HDR 효율 및 모자이크 현상 이외에도, 인간 배아에서의 유전자 교정의 임상적 적용과 관련하여 안전상 우려되는 사항 중 하나는 표적화된 서열에 고도로 상동성이 게놈 영역에 바람직하지 못한 오프 타겟 돌연변이를 유도할 수 있다는 점이다(문헌 [Hsu et al., 2014; Mali et al., 2013]; [Fu et al., Nature biotechnology, 31:822-826, 2013]; [Hsu et al., Nature biotechnology, 31:827-832, 2013]; [Cho et al., Genome research, 24:132-141, 2014]). 그러므로, 분해된 게놈 시퀀싱(Digenome-seq) 접근법을 이용하여 환자의 게놈 DNA에 관한 복합 전체 게놈 시퀀싱(WSG) 분석을 수행하였다(문헌 [Kim et al., 2015]; [Kim et al., 2016]). iPSC 유래, 무세포 게놈 DNA를 CRISPR/Cas9로 분해한 후, WGS를 수행하여 잠재적인 오프 타겟 서열을 확인하였다. CRISPR/Cas9 분해된 게놈 DNA의 시퀀싱 리드는 IGV 뷰어에서 온/오프 타겟 부위에 수직으로 정렬된다(문헌 [Kim et al., 2015]; [Robinson et al., Nature biotechnology, 29:24-26, 2011]). 그에 반해, 분해되지 않은 게놈 부위는 상기 유전자좌에서 엇갈린 방식으로 정렬된다. 추가로, 개선된 Digenome-seq는 서열 리드의 정렬 패턴에 기초하여 잠재적인 오프 타겟 부위에 대한 DNA 절단 점수를 제공한다(문헌 [Kim et al., 2016]). 분해된 iPSC DNA는 온 타겟 부위 및 잠재적인 오프 타겟 부위, 둘 모두에서 균일한 절단 패턴을 생성하였다(도 6a-6b). 상기 분석에서, DNA 절단 점수가 2.5 초과인 16개의 잠재적인 오프 타겟 부위가 확인되었다(도 4a). 웹 로고(weblogo.berkeley.edu 참조)를 이용하여 상기 16개의 부위를 시퀀싱으로 분석한 결과, 이는 실제로 온 타겟 MYBPC3 돌연변이체 대립유전자에 대하여 고도로 상동성인 것으로 확인되었다(도 4b; 문헌 [Kim et al., 2016]; [Schneider and Stephens, Nucleic acids research, 18:6097-6100, 1990]). 추가로, DNA 절단 점수가 0.1 이상이고, 인간 게놈에서 10개 이하의 뉴클레오티드가 미스매칭되는 7개의 추가 부위가 확인되었다. 이어서, 상기 부위를 모두 시퀀싱하였고, 2개의 비처리된 대조군 배아(보충 표 2로부터의 C2 및 C10); 2개의 모자이크 S기 주입된 배아(Mos1 및 Mos7); 하나의 비균일한 비모자이크 S기 주입된 배아(WT15); 및 2개의 M기 주입된 배아(M2-WT10 및 M2-Mut7)로부터의 각각의 개별 난할구에서 분석하였다. 각 난할구에서의 모든 온 타겟 indel이 입증되었고, 그 결과는 생어 시퀀싱 결과와 동일하였다. 추가로, 표적 부위에 무손상 WT/WT 또는 WT/Mut 대립유전자를 보유하는 것으로 공지된 난할구에서는 indel이 검출되지 않았다(도 4c). 더욱 중요하게는, 28개의 스크리닝된 난할구에서 조사된 23개의 오프 타겟 유전자좌에서도 또한 indel이 검출되지 않았다(도 4d).
선정된 난할구(도 4c)에서, 확장된 오프 타겟 스크리닝을 WGS으로 확장시켰다. 무손상 대조군 배아에서 발견된 게놈 변이체를 CRISPR-Cas9 주입된 배아에서의 것(Mos1.1, W15.4, Mos7.2, M2-WT10.1, 및 M2-Mut7.1)과 비교하여 잠재적인 오프 타겟 부위를 조사하였다. dbSNP 데이터베이스에서 주석달린 변이체를 여과한 후, CRISPR-Cas9 주입된 배아로부터 수득된 각 난할구에서 indel을 포함하는 19-71개의 잠재적인 오프 타겟 부위가 발견되었다. 상기 부위 모두 반복된 서열, 예컨대, 폴리A 또는 폴리GT 반복부를 함유하였고, 이는 상기 부위에서 발견되는 indel이 Cas9 촉매화된, 오프 타겟 DNA 절단보다는 시퀀싱 오류에 의해 유발되었다는 것을 제안한다. 상기 WGS 결과는, 유전자 교정이 선정된 난할구에서 검출가능한 오프 타겟 돌연변이를 유도하지 않았다는 Digenome-seq 결과를 뒷받침한다.
CRISPR-Cas9 처리된 ES 세포에서 전체 엑솜 시퀀싱(WES)을 사용하고, 그 결과를 대조군 ES 세포 및 상응하는 난자 및 정자 기증자 혈액 DNA의 것과 비교함으로써, CRISPR-Cas9 표적화가 전체 오프 타겟 유전자 변이 및 게놈 불안정성을 유도하였는지 여부를 검정하였다. WES 분석 결과, hg19 참조 게놈과 비교하였을 때, 모든 샘플에서 다수의 변이체가 나타났다. 이들 변이체 대다수는 또한 난자 또는 정자 기증자에도 존재하였고, dbSNP 및 1000개의 게놈 데이터베이스에서도 발견되었다. ES 세포에서 발견된 일부 변이체는 집단 핫스폿과 매칭되는 감소된 분율을 보였고, 이는 배아 배양 및 ES 세포 유도화 및 배양을 포함하는 실험 방법의 잠재적 효과를 나타내는 것이다. 3개의 처리된 ES 세포주 및 대조군 세포주(ES-Mut1, ES-WT1, ES-WT2, 및 ES-C1)는 모든 변이체 카테고리에서 유사한 통계치를 보였고, 배우자 기증자 프로파일(난자 기증자 1 및 2, 정자 기증자)과 유사하였다. ES-WT3은 변이체 수가 증가한 것으로 나타났지만, 상기 샘플은 비교를 위한 대조군 자매 ES 세포주는 없었다. 이어서, ES 세포에서 잠재적인 오프 타겟 효과를 조사하였고, 완전 고감도 얼라이너 배트미스(V3.00; 문헌 [Tennakoon, Bioinformatics, 28:2122-2128, 2012])를 이용하여 총 685개의 잠재적인 오프 타겟 부위를 확인하였다. 배우자 기증자에도 존재한 변이체는 유전되는 것으로서 여과되었다. 특히, 상기 부위에 대한 분석에서는 어떤 변이체도 나타나지 않았다. 종합해 보면, 상기 Digenome-seq, WGS, 및 WES 결과는 어떤 오프 타겟 효과도 없는, 인간 배아에서의 CRISPR-Cas9의 높은 온 타겟팅 특이성을 입증한다.
게놈 편집에 의해 유도된 DSB은 주로 오류 빈발 NHEJ를 해결되고, 상기 수복 접근법은 세포 및 유기체에서 유전자 넉아웃을 생성하는 데 지배적으로 사용된다(문헌 [Richardson et al., Nature biotechnology, 34:339-344, 2016]; [Doudna and Charpentier, Science, 346, 2014]). 그에 반해, 비록 실질적으로 더 낮은 효율이 이루어지기는 하지만, HDR은 유전자 교정을 위해, 특히, 인간 생식세포계열 유전자 요법에서의 적용을 위해서는 필요하다. 인간 배우자 및 접합체에서 Cas9 매개 DSB는 우선적으로, 수복 주형으로서 야생형 대립유전자에 의해 배타적으로 지시되는 내인성 HDR 기전을 사용하여 해결된다는 것이 발견되었다. 그에 반해, iPSC에서, HDR 효율은 유의적으로 더 낮았고, 이는 주로 외인성 DNA 주형을 통해 달성되었다. 이러한 놀라운 차이는 인간 배우자/배아가 상이한 DNA 손상 반응 시스템을 사용한다는 것을 나타내고, 이는 아마도 생식세포계열 게놈 무결성을 유지하는 진화의 중요성을 반영하는 것이다(문헌 [Luo et al., PLoS genetics, 10:e1004471, 2014]). 감수분열 재조합 및 분리 동안 DSB 수가 증가한 것을 참고 인내한 배우자 및 접합체는 효율적인 게놈 수복 능력을 가지며, 고유의 접합체 DNA 수복 기구는, 접합체가 전사적으로 침묵 상태이기 때문에, 성숙 과정에서 축적되고 저장된 모계 난모세포 인자에 전적으로 의존할 수 있다(문헌 [Lange et al., Cell, 167:695-708, e616, 2016]). 최근의 연구에 따르면, 난모세포는 상동성 재조합 기전을 통해 DSB의 수복을 조절하는 실조증-모세혈관 확장 돌연변이(ATM: ataxia-telangiectasia mutated) 매개 DNA 손상 신호전달(DDS: DNA damage signaling) 경로를 이용할 수도 있다고 제안하고 있다(문헌 [Titus et al., Sci Transl Med, 5:172ra121, 2013]). 따라서, 본원에 개시된 연구에서, Cas9 유도 DNA 파단은 감수분열 재조합 유도된 DSB의 수복을 위해 예비된 기존의 천연 난모세포 기구를 동원한다. 따라서, 이형접합성 인간 배아에서 유전자 교정을 위해 외인성 올리고 주형을 제공할 필요는 없다.
최근 유전 형태의 백내장의 원인이 되는 Crygc 유전자에서 이형접합성 우성 돌연변이를 포함하는 마우스 연구에서 CRISPR/Cas9의 효율을 평가하였다. 일부 HDR 수복 이벤트는 상동성 염색체로부터의 WT 대립유전자로부터의 서열을 이용한 반면, 일부 HDR은 외인성 올리고 주형을 통해 더욱 큰 빈도로 이루어졌으며, 여기서, 4마리 새끼 중 3마리는 외인성 올리고로부터의 DNA 서열로 교정된 Crygc 유전자를 보유하였고, 단 1마리만이 WT 대립유전자로부터의 것으로 교정된 Crygc 유전자를 보유하였다(문헌 [Wu et al., 2013]). 인간 이형접합성 배아를 포함하는 연구에서, HDR은 WT 대립유전자 기반 수복의 증거 없이, 외인성 DNA 주형에 의해 배타적으로 지시되었다(문헌 [Tang et al., Mol Genet Genomics, 292(3):525-533, 2017]). 상기 결과는 개별 난할구보다는 전체 배아로부터의 대량의 DNA 사용으로 유도되었는 바, WT 대립유전자를 통한 HDR 사례가 간과되었을 수 있다.
주목할만한 표적화 효율 및 높은 HDR 빈도에도 불구하고, 일부 CRISPR/Cas9 처리된 인간 배아는 NHEJ 유도 indel을 보였는 바, 이는 전달에는 적합하지 않을 것이다. 그러므로, 게놈 편집 접근법은 생식세포계열 교정의 임상 적용에 앞서 더욱 최적화되어야 한다. HDR 경로를 증진시킴과 동시에, NHEJ 기전을 억제시킴으로써 진행되는 게놈 편집의 수정안이 보고되었다(문헌 [Chu et al., Nat Biotechnol, 33:543-548, 2015]; [Maruyama et al., Nat Biotechnol, 33:538-542, 2015]). 다른 접근법은 세포주기를 조작하거나, 기증자 ssDNA 디자인을 변형시키는 데 초점을 맞추고 있다(문헌 [Lin et al., 2014]; [Richardson et al., 2016]). 이러한 개발 중 일부는 배양된 세포와 관련하여 HDR 결과를 현저히 개선시켰지만, 그와 배아 유전자 교정에 대한 관련성은 아직 알려지지 않은 채로 남아있다. 추가로, 인간 배우자 또는 배아를 소분자 및/또는 억제제에 보충적으로 노출시키는 것은 배아 발생에 대한 잠재적인 악영향에 부차적으로 바람직하지 못할 수 있다.
원숭이 접합체 내로의 CRISPR/Cas9 주입이 WT 유전자를 파괴할 수 있으며, 여기서, 생성된 만기 자손은 돌연변이 및 관련 표현형을 보유할 수 있다는 것이 비인간 영장류 연구를 통해 입증된다(문헌 [Niu et al., Cell, 156:836-843, 2014]; [Kang et al., Human molecular genetics, 24:7255-7264, 2015]). 마우스 및 다른 동물에서 관찰된 결과와 유사하게, 게놈 편집된 인간 착상 전 배아 및 신생 아기 원숭이는 그의 세포 및 조직에서 모자이크 표적화 유전자형을 보이고 있는데, 이는 DSB 및 후속 수복이 단일 돌연변이체 대립유전자 단계에서는 일어나지 않는다는 것을 시사하는 것이다(문헌 [Tang et al., 2017]; [Liang et al., Protein & cell, 6:363-372, 2015]; [Tu et al., Sci Rep, 7:42081, 2017]). 상기 논의된 바와 같이, 유전자 교정된 인간 배아에서의 모자이크 현상은 생검 및 PGD에 의해서는 검출하기가 어려운 바, 이에, 임상 적용에 심각한 안전 문제를 제기한다. Cas9 활성의 반감기를 단축시키는 것과 관련된 변형이 원숭이 배아에서의 모자이크 현상 발현을 감소시키기는 하였지만, 완전히 제거하지는 못했다(문헌 [Tu et al., 2017]).
추가로, CRISPR/Cas9의 M기 난모세포로의 전달이 난할 배아에서 모자이크 현상을 폐기시켰고, 이는 유전자 표적화 및 및 편집 효율이 DNA 합성 및 세포 주기 단계와 밀접하게 관련되어 있음을 입증하는 것이다. 이론으로 제한하지 않으면서, DSB 수복에서 NHEJ 또는 HDR의 선택은 세포 주기 단계에 의존할 수 있고, 여기서, HDR은 DNA 복제가 완료되고, 자매 염색분체가 수복 주형으로서 이용가능할 때인, 후기 S 및 G2 기로 제한된다(문헌 [Lin et al., 2014]). 특히, HDR 기전은 M 및 초기 G1기에서 하향 조절되었고, 따라서, NHEJ 유도 게놈 편집이 선호된다(문헌 [Orthwein et al., Science, 344:189-193, 2014]). 그러나, ICSI 시점에 CRISPR/Cas9를 MII 난모세포 내로 전달하였을 때에도 조차, HDR 효율 감소는 관찰되지 않았다. 이론으로 제한하지 않으면서, 한 설명은 배양된 세포에서의 유사분열 M기와 비교하였을 때, 생식 세포 감수분열 M기에서의 DNA 수복 반응이 상이하다는 것이다. 대안적으로, DSB는 M기 또는 G1기에서 일어날 수 있으며, 반면, HDR 수복은 그 이후에 세포 주기 중 S기 또는 G2기에서 수행될 수 있다.
의도된 표적화 영역을 벗어난 CRISPR/Cas9에 의해 유도된 잠재적인 오프 타겟 DNA 손상에 관한 광범위한 보고서가 발표되었다. 특히, 플라스미드 형질감염 및 후속되는 높은 효소 농도를 통한 Cas9의 과다발현은 오프 사이트 타겟팅을 증가시킨 것으로 보고되었다(문헌 [Kim et al., 2014)]. 인간 난모세포 및 접합체에서, 플라스미드 대신, 정제된 재조합 Cas9 단백질이 사용되었고, 이는 이론으로 제한하지 않으면서, 효소 노출 시간을 단축시킴과 동시에 특이성을 증진시킬 수 있고, 이로써, 오프 타겟팅 효과는 감소시킬 수 있다. Digenome-seq에 의한 스크리닝은 CRISPR/Cas9 주입된 인간 배아로부터의 다중의 개별 난할구에서 오프 타겟 돌연변이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 CRISPR/Cas9 표적화가 인간 배아에서 유전자 교정과 관련된 안전 문제에 대한 확신을 제공하면서, 정확하다는 것을 시사한다.
PGD는 영향을 받은 자손을 생산할 수 있는 위험이 있는 이형접합성 커플에게는 실행가능한 하나의 옵션일 수 있다. 부모 중 한 명만이 이형접합성 돌연변이를 보유하는 경우, 배아의 50%가 돌연변이화되어야 하고, 폐기될 것이다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 표적화된 유전자 교정이 돌연변이체 인간 배아 중 상당부를 구조할 수 있고, 이로써, 전달에 이용가능한 배아의 개수를 증가시킬 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 7-12
실시예 7-12는 인간 배아가 비감수분열 상동성 염색체 기반 DNA 수복의 능력을 가지고 있다는 것을 보여주는 것이다. 2개의 부계 상동체가 부모가 원인이 되는 유전적 다양성을 더 많이 제공한다는 것을 제안하는 증거가 증가하고 있다(문헌 [Joyce et al., Current opinion in genetics & development, 37:119-128, 2016]). 2개의 부계 대립유전자 중 하나의 선택적 표적화를 허용하는 주문 디자인된 뉴클레아제에서의 최근의 발전은 염색체간 쌍형성, 상호작용, 및 식물 및 동물 종 간의 DNA 수복에의 기여를 보여준다. 상기 상호작용은 유사분열 재조합에 의해 지배되는 DNA DSB 수복 또는 LOH에 기여하는 상동체 주형 기반 수복을 포함한다(문헌 [Rong and Golic, Genetics, 165:1831-1842, 2003]). 과실 색상이 상이한 돌연변이체 토마토 식물을 이용한 한 연구에서는 이형접합성 식물에서 표적화된 대립유전자에서의 CRISPR-Cas9 유도 DSB가 주형으로서 무손상 대립유전자를 사용하여 최대 14%의 빈도로 수복되었고, 감수분열 기구의 부재하에서 상동체 사이의 HDR이 이루어졌다고 결론지었다(문헌 [Filler Hayut et al., Nature communications, 8:15605, 2017]). 이형접합성 마우스에서 돌연변이체 부계 대립유전자의 특이적인 표적화 또한 WT 모계 대립유전자를 이용하는 HDR을 통한 DSB 수복을 통해서는 생존가능한 WT/WT 자손이 출생하였다는 것을 입증하였다(문헌 [Wu et al., 2013]). 두 부계 대립유전자 모두에서의 동시의 DSB 유도는 또한 가까운 상동성 유전자 패밀리로부터의 내인성 게놈 서열을 이용하는 주형 매개 수복을 유도할 수 있다. 인간 접합체에서, β-글로빈 유전자(HBB)의 CRISPR-Cas9 기반 이대립유전자 표적화 결과, 내인성 델타-글로빈 유전자(HBD)를 이용하는 HDR이 이루어졌다(문헌 [Liang et al., 2015]).
실시예 7
본 실시예는 실시예 7-12에서 사용된 방법 및 물질을 기술한다.
롱 레인지 PCR 및 생어 시퀀싱
제조사의 방법에 따라, 롱 레인지 PCR(PCR1, PCR2, 및 PCR4-7)은 PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라제를 사용하여 수행된 반면, 롱 레인지 PCR3 및 PCR8은 다카라(TaKaRa) LA Taq DNA 폴리머라제(Clontech)를 사용하여 수행되었다. 간략하면, PCR 조건은 98℃에서 10 sec, 60℃에서 15 sec, 및 68℃에서 1 min/kb(30-35 사이클)이었다. PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, EtBr 염색으로 시각화하였다.
생어 시퀀싱을 위해, PCR 플래티넘 슈퍼믹스 하이 피델리티 키트(Life Technologies)를 이용하여 각 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)에 대한 표적화된 영역 PCR을 수행하였다. PCR 생성물을 생어 시퀀싱하고, 시퀀서 v5.0(GeneCodes)에 의해 분석하였다.
짧은 연쇄 반복서열( STR : short tandem repeat) 검정법에 의한 혈통 분석
시판용 키트(Gentra)를 사용하여 난자 및 정자 기증자의 혈액 및 개별 ESC 세포주로부터 DNA를 추출하였다. 기술된 바와 같이, 캘리포니아, 데이비스 대학 유전학 연구소(Genetics Laboratory at University of California, Davis)에 의해 STR 미세위성 혈통 분석을 수행하였다(문헌 [Tachibana et al., 2013]).
전체 엑솜 시퀀싱( WES ) 및 전체 게놈 시퀀싱( WGS )을 이용한 SNP 검색 및 해독
먼저, 어댑터 서열을 여과하고, BGI에 의해 개발된 SOAPnuke(1.5.2) 소프트웨어(soap.genomics.org.cn 참조)를 이용하여 품질이 낮은 리드, 또는 N 염기 비율이 높은 리드를 제거함으로써 WES 시퀀싱 데이터를 프로세싱하였다. 각 라이브러리에 대해 순수 리드를 생성하였다. 브로우스-휠러 얼라이너14(BWA) 프로그램 버전 0.7.12를 사용하여 순수 데이터를 인간 게놈 어셈블리 hg19에 대해 쌍형성 말단 정렬하였다. 피카드 v1.54 중 마크듀플리케이츠를 이용하여 정렬 BAM 파일 중 중복 리드를 확인하였다(broadinstitute.github.io/picard 참조). GATK 베스트 프랙티시스(GATK Best Practices) 권고에 따라 GATK15(3.3.0) 리얼라이너타겟크리에이터, Indel리얼라이너 및 베이스리캘리브레이터 모듈에 의해 정렬 결과를 프로세싱하고, GATK에서 하플롯타입콜러 도구를 이용하여 변이체 검출을 수행하였다(문헌 [Van der Auwera et al., Current protocols in bioinformatics, 43:11.10.11-33, 2013]; [DePristo et al., Nature genetics, 43:491-498, 2011]). SNV 및 InDel 정보를 추출하고, GATK에서 VQSR에 의해 여과하였을 뿐만 아니라, AnnoDB v3(igm.columbia.edu 참조)에 의해 주석을 달았다.
실시예 8
본 실시예는 CRISPR-Cas9에 의해 유도된 표적화된 영역에서의 큰 결실에 대한 검정을 기술한다. 이론으로 제한하지 않으면서, 조기 접합체에서 부계 게놈은 부계 및 모계 전핵에서 물리적으로 분리되어 있기 때문에, 모계-상동성 서열을 이용한 돌연변이체 부계 대립유전자의 수복은 가능성이 없다. 이러한 일시적인 단리는 HDR을 위해 요구되는 상동성 염색체 상호작용을 막는다. 그러나, 실시예 1-6에서는 돌연변이체 부계 대립유전자에 특이적인 CRISPR-Cas9 리보뉴클레오단백질(RNP)을 전핵 단계 접합체 내로 또는 심지어는 수정 동안에 더 일찍 전달하였고, 후속하여, 3일 후 다세포 배아에서 표적화 및 수복 결과의 판독 결과를 측정하였다(문헌 [Antoniou et al., Am J Hum Genet, 72:1117-1130, 2003]). 후기 포유동물 접합체에서, 부계 및 모계 전핵은 서로를 향해 이동하고, 이어서, 핵 피막은 파괴되고, 이배체 유사분열 방추체가 형성된다(문헌 [Capmany et al., 1996]; [Lemmen et al., Reprod Biomed Online, 17:385-391, 2008]). 따라서, 상기 시점부터 부계 상동체는 물리적으로 상호작용하고, 재조합할 수 있는 기회를 얻게 된다. 추가로, 각각의 모자이크 4-8 세포 배아는 2개 이상의 상이한 수복 결과를 보이는 난할구를 함유하였고, 이는 CRISPR-Cas9가 전핵 단계를 벗어난 경우에도 우수한 활성을 그대로 유지한다는 것을 보여주는 것이다.
특히, 두 부계 대립유전자 모두를 동시에 파괴시켰을 때, 표적화된 영역에서 CRISPR-Cas9에 의해 유도된 임의의 큰 결실(>100 bp)에 대해 검정하기 위해, 환자 iPSC에서 상이한 sgRNA를 디자인하고, 돌연변이체 서열에 대해 고도의 특이성을 가지고, 큰 결실 증거는 없는 sgRNA를 선정하였다. 따라서, 선정된 sgRNA는 HDR에 대해 관찰되는 빈도로 큰 결실을 유도하지는 않을 것이다. 선행 연구에서는 인간 ES 세포에서 다중 후보 sgRNA를 시험한 결과, 인간 배아에서 POU5F1의 두 카피 모두를 파괴시키는 편집 효능을 예측하는 데 효과적인 것으로 나타났다(문헌 [Fogarty et al., Nature, 550:67-73, 2017]). 상기 연구에서, CRISPR-Cas9 미세주입된 인간 배아에서 가장 빈번하게 관찰되는 온 타겟 편집은 작은 (2-3 bp) indel을 포함하였다. 단 1개의 배아만이 흔치 않게 큰(330 bp) 결실을 포함하는 수개의 난할구를 함유하였다(상기 동일). 종 차이가 편집 결과에 영향을 줄 수는 있지만, (Adikusuma et al.)은 후보 sgRNA를 사전 시험한 것에 관해서는 보고하지 않았다. 추가로, 본원의 실시예는 CRISPR-Cas9 리보뉴클레오단백질(RNP)을 이용하는 반면, (Adikusuma et al.)은 큰 결실의 원인이 될 수 있는 Cas9 mRNA를 사용하였다.
본 실시예는 실시예 1-6으로부터의 모든 배아 난할구 샘플을 대규모로 재시험하는 것을 기술한다. 실시예 1-6에서는, PCR 증폭을 사용한 후, 이어서, MYBPC3Δ GAGT 돌연변이 부위로부터 각 방향으로 대략 250 bp에 이르는 534 bp 단편의 생어 시퀀싱을 수행하였다. 본 실시예에서는, 493 bp 내지 10,160 bp 범위의, MYBPC3ΔGAGT 돌연변이 유전자좌를 둘러싼 다양한 길이의 단편을 증폭시키기 위해, 추가의 8개의 롱 레인지 PCR 프라이머 쌍을 디자인하였다(도 7a에서 PCR1-PCR8). 먼저, 비주입 대조군 배아로부터의 4개의 WT/WT 및 4개의 WT/Mut 난할구와 함께, S기에서 CRISPR-Cas9가 주입된 4개의 모자이크 배아로부터의 WT/WT 유전자형을 갖는 8개의 난할구를 재시험하였다. PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 분리시켰다. 16개 샘플 모두에서, 프라이머 PCR1, PCR2, PCR4, 및 PCR5는 예상된 크기의 단일 밴드를 증폭시켰다(도 7b-7e). PCR6 및 PCR7의 경우, 일부 교정된 난할구 및 대조군 난할구에서는 더 작은 크기의 수개의 희미한 밴드도 또한 검출가능하였다(도 7f 및 7g). 그러나, 상기 희미한 밴드의 생어 시퀀싱으로는 판독가능한 생성물을 얻지 못했고, 이를 통해 비특이적인 PCR 프라이머 결합이 입증되었다. 이어서, 대조군과 함께 13개의 모자이크 배아로부터의 남은 모든 WT/WT 난할구(n=35)에 대하여 PCR3 및 PCR8 프라이머를 사용하여 2회의 추가 롱 레인지 PCR 증폭을 수행하였다. PCR3을 사용하여 증폭하였을 때, 모든 실험 난할구 및 대조군 난할구에서 1,742 bp의 예상된 크기의 단일 밴드가 생성되었다(도 7h). PCR8의 경우, 일부 표적화된 샘플 및 대조군 샘플에서 10,160 bp의 예상된 크기에 매칭되는 주요 밴드 이외에도, 더 작은 크기의 수개의 희미한 밴드 또한 관찰할 수 있지만, 역시 생어 시퀀싱에서 비특이적인 PCR 프라이머 결합을 보였다(도 7i).
M기 주입된 배아에서의 더욱 큰 결실을 스크리닝하였고, 상기 군 중의 각 배아 내의 개별 난할구들은 모두 동일한 MYBPC3 유전자형을 보유하고 있기 때문에, 모든 WT/WT 배아(n = 41)로부터 1개의 난할구를 무작위로 선택하였다. WT/WT 유전자형을 갖는 3개의 난할구 및 WT/ssODN을 갖는 4개의 난할구를 함유하고 있는, 상기 군 중의 유일의 모자이크 배아(M2-WT42) 또한 시험하였다. 추가로, 프라이머 PCR3 및 PCR8을 이용하여 모든 샘플에 대해 롱 레인지 PCR 스크리닝하여 1,742 bp 또는 10,160 bp의 예상된 크기의 단일 밴드를 얻었다(즉, 큰 결실을 검출하는 데 실패하였다; 도 7j 및 7k).
M기 주입된 배아로부터 유래된 6개의 인간 ES 세포주에서의 큰 결실에 대한 전체 엑솜 시퀀싱(WES) 결과 또한 조사하였다. ES 세포 및 상응하는 난자 및 정자 기증자에서의 돌연변이 부위로부터의 하류쪽 5 kbp 부위 및 상류쪽 5 kbp를 비교한 결과, 시퀀싱 심도에서는 차이가 없었고, 이는 큰 결실의 부재와도 일치하는 것이다.
요약하면, 본 실시예에서의 결과는 모두 CRISPR-Cas9 처리된 인간 배아에서 돌연변이 부위로부터 최대 ±5 kbp까지 큰 결실의 존재를 검출하는 데 실패하였음을 입증한다. 본 실시예에서 사용된 PCR 프라이머는 더욱 큰 결실을 확인하지 못했고, CRISPR-Cas9에 의해 유도된 결실은 본 발명자들의 검정법으로 검출되었어야 한다. 수개 부위를 표적화하는 다중 sgRNA를 사용하는 것은 최대 24-kbp의 DNA 세그먼트의 큰 결실을 생성할 수 있지만; 단일 sgRNA는 마우스 배아에서 <600-bp DNA의 더 작은 결실을 생성한다(문헌 [Shin et al., Nature communications, 8:15464, 2017]).
실시예 9
실시예 1-6에는 모계 상동체 기반 HDR에 의해 지배되는 부계 대립유전자에서의 DSB 수복이 인접한 ΔGAGT 결실 부위까지 확장되고, 그 결과, 부계 서열이 전환된다고 제시되어 있다. 그러므로, HDR에 관여하는 DNA 프루프리딩 및 미스매치 수복 기전 또한 중성 부계 SNP를 전환시켜 MYBPC3 유전자좌 내에서의 이형접합성 상실(LOH: loss-of-heterozygosity)을 초래하는 원인이 되는지 여부를 검정하였다. 표적화된 DSB 유전자좌에 인접한 부계 SNP는 전환되어 모계에 유사한 것이 된 반면, 더 먼거리에 위치하는 다형성 부위는 보존된다. 전체 엑솜 시퀀싱(WES) 및 전체 게놈 시퀀싱(WGS) 데이터세트를 검색하였고, 난자 기증자 1과 정자 기증자와 구별하면서, MYBPC3 유전자 내에서 3개의 유용한 정보를 제공하는 부계 SNP를 확인하였다. SNP#1(rs2071304) 및 SNP#2(rs2856650)는 ΔGAGT 결실 부위로부터 하류쪽에 위치한 반면(-7,959 bp 및 -781 bp), SNP#3(rs2856653)은 상기 유전자좌로부터 상류쪽 +3,335 bp에 위치하였다(도 8a). 이어서, 상기 부모 조합으로부터의 2개의 CRISPR-Cas9 주입된 모자이크 배아(하기 표 1에서 Mos2 및 Mos3)의 개별 난할구의 유전자형을 분석하였다. 동일한 부모 조합으로부터의 대조군 비주입 배반포로부터 유래된 ES 세포주(ES-C1) 또한 유전자형을 분석하였다. 돌연변이 유전자좌에 WT/WT 유전자형을 갖는 ES-C1, 및 WT/NHEJ 유전자형을 가지는, 모자이크 배아로부터의 2개의 난할구, Mos2.3 및 Mos3.2는 3개의 다형성 부위 모두에서 이형접합성이었고, 이는 예상된 모계 및 부계 SNP를 나타낸다(SNP#1, #2, 및 #3에 대해 각각 G/C, T/C, 및 G/A)(표 1 및 도 8b). 그에 반해, 동일한 모자이크 배아로부터의, WT/HDR 유전자형을 갖는 2개의 난할구, Mos2.1 및 Mos3.1은 3개의 SNP 부위 모두에서 동형접합성으로, 배타적으로 모계 뉴클레오티드를 보유하였다. 흥미롭게도, WT/HDR 유전자형을 갖는 또 다른 난할구, Mos2.2 또한 SNP#2 유전자좌에서는 동형접합성으로, 모계 뉴클레오티드를 보유하였지만, SNP#1(G/C) 및 SNP#3(G/A), 둘 모두에서는 이형접합성이었고, 이는 상기 부계 SNP 부위의 보존을 입증하는 것이다(표 1 및 도 8b). 본 결과는 HDR 기반 전환이 표적화된 돌연변이체 유전자좌 범위 너머로 확장할 수 있고, MYBPC3 영역 전역에 걸친 중성 부계 SNP 상실을 초래할 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure pct00004
실시예 10
모자이크 대응물과는 달리, CRISPR-Cas9 처리된 접합체 또는 난모세포로부터 생산된 균일한 WT/WT 배아에서의 원래의 정자의 MYBPC3 유전자형은 측정될 수 없다. 그럼에도 불구하고, 비처리 대조군과 비교하여 CRISPR-Cas9 처리군에서 WT/WT 배아의 비율이 현저히 증가한 것으로 관찰되었기 때문에(문헌 [Antoniou et al., 2003]), MYBPC3WT /WT 유전자형을 갖는 일부 배아는 돌연변이체 MYBPC3ΔGAGT 정자로부터 기원하고, 후속하여 결실의 HDR 교정이 이루어진 것일 수 있다. 이들 WT/WT 배아 중 일부에서의 중성 부계 SNP 상실은 돌연변이체 MYBPC3ΔGAGT의 수복을 입증한다. 42개의 WT/WT M기 주입된 배아 중 6개(표 1에서 M2-WT28부터 M2-WT33까지)는 난자 기증자 1 및 정자 기증자로부터 유래되었고, 따라서, SNP#1, #2, 및 #3 부위에서 이형접합성이어야 한다. 각각의 상기 6개의 배아로부터의 2개의 자매 난할구를 무작위로 유전자형을 분석하였고, 4개의 배아에서는 상기 다형성 부위 중 적어도 하나에서 LOH가 관찰되었다. 예상대로, 상기 유전자좌에서 부계 SNP는 상실되었고, 그 결과, 동형접합성 모계 뉴클레오티드가 되었다(표 1 및 도 9). 동일한 배아로부터의 2개의 자매 난할구의 유전자형은 서로 상이하였고, 이는 비의존적 HDR 이벤트가 2 세포기 또는 그 이후에 발생하였다는 것을 보여주는 것이다. 예를 들어, 배아 M2-WT29에서의 한 난할구(M2-WT29.3)는 3개의 SNP 유전자좌 모두에서 동형접합성으로, 배타적으로 모계 뉴클레오티드를 보유한 반면, 다른 자매 난할구(M2-WT29.2)는 3개의 SNP 부위 모두에서 이형접합성이었다(표 1 및 도 9). 배아 M2-WT 30 및 32에서도 또한 유사한 패턴이 관찰되었다. 그에 반해, 배아 M2-WT31의 한 난할구(M2-WT31.1)는 동형접합성으로, SNP#2 및 SNP#3에서 모계 대립유전자를 함유한 반면(각각 T/T 및 G/G), 더 먼거리에 위치하는 SNP#1은 이형접합성(G/C)이었다. 자매 난할구 M2-WT31.2는 상기 3개의 SNP 위치에서 이형접합성이었다.
상기 명시된 바와 같이, 상기 4개의 균일한 WT/WT 배아에서의 부계 SNP의 삭제와 연관된 LOH는 CRISPR-Cas9 처리 후 돌연변이체 정자 MYBPC3ΔGAGT 결실의 수복을 나타낸다. 남은 배아, M2-WT28 및 33에서 조사된 모든 난할구들은 3개의 SNP 부위 모두에서 이형접합성이었으며, 이는 상기 배아가 WT 정자에 의해 수정되었음을 보여주는 것이다.
동일한 부모 조합의 S기 주입군으로부터의 4개의 WT/WT 배아로 SNP 분석을 확장시켰다. 3개의 배아(WT4, WT5, 및 WT6)가 3개의 SNP 모두에서 이형접합성인 반면, WT3 배아로부터 조사된 두 난할구는 모두 SNP#1 및 #3에서는 이형접합성이었고, SNP#2에서는 동형접합성이었다(표 1 및 도 9). 따라서, 상기 배아는 가능하게는 돌연변이체 정자로부터 생성되었지만, 후속하여 WT 모계 대립유전자를 이용하여 HDR에 의해 교정되었을 수 있다.
실시예 11
HDR을 위한 추가의 유전적 증거를 제공하기 위해, 난자 기증자 2를 스크리닝하고, 부계 기여와는 구별되는 MYBPC3 유전자 내의 2개의 유용한 정보를 제공하는 SNP를 확인하였다. 난자 기증자 2는 SNP#4 부위(ΔGAGT 돌연변이로부터 하류쪽으로 -6,189 bp 위치, rs2697920)에서 동형접합성(G/G)인 반면, 정자 기증자는 상기 유전자좌에서 이형접합성(A/G)이었다. SNP#5(+9,514 bp, rs4733354)에서, 두 부모 모두 이형접합성 A/G였다. 초기에, 상기 부모 조합으로부터 유래된 7개의 모자이크 배아(Mos1, Mos7, Mos8, Mos10, Mos11, Mos12, 및 Mos13)로부터의 WT/NHEJ 또는 WT/Mut 유전자형을 갖는 난할구를 유전자형을 분석하였고, 6개는 NP#4 유전자좌에서 이형접합성 A/G인 것으로 나타났고(하기 표 2에서 이탤릭체), 이는 상기 배아에서 돌연변이체 정자가 상기 유전자좌에서의 "A" 대립유전자에 기여하였다는 것을 입증하는 것이다. 상기 6개의 배아로부터의 WT/HDR 유전자형을 갖는 자매 난할구 모두 시퀀싱하였고, 5개(Mos1, Mos7, Mos8, Mos10, 및 Mos13)는 부계 대립유전자를 상실하였고, SNP#4에서 동형접합성 G/G가 되었으며, 모계 대립유전자로부터의 유전자 전환을 보인 하나 이상의 난할구를 함유하는 것으로 확인되었다(표 2). 상기 배아 중 남은 WT/HDR 난할구는 부계 대립유전자를 유지하였고, SNP#4에서 이형접합성 A/G였고, 이는 전환 트랙이 더 짧았다는 것을 보여주는 것이다. Mos11 배아로부터의 두 WT/HDR 난할구 모두 SNP#4에서 이형접합성 A/G였다. Mos12 배아로부터의 WT/Mut 난할구는 SNP#4에서 동형접합성 G/G였고; 따라서, 추가의 유전자형분석은 필요하지 않았다(표 2).
이어서, 난자 기증자 2 및 정자 기증자로부터 생성된 각각의 7개의 균일한 WT/WT M기 주입된 배아로부터 무작위로 선택한 한 난할구를 시퀀싱하였다. 7개의 난할구 모두 SNP#4에서 동형접합성 G/G였다(표 2). 비교로, 동일한 부모 조합으로부터 생성된 7개의 S기 주입된 모자이크 배아 중 6개는 이형접합성 A/G였다(표 2). 그러므로, M기 주입군에서 상기 G/G 동형접합성 배아 중 일부는 또한 유전자 전환에 기인하여 부계 SNP를 상실하였다. SNP#5 유전자좌에 대한 유전자형 분석 결과, 2개의 모자이크 S기 주입된 배아(Mos1 및 Mos8)는 이형접합성 A/G였고, 전환 분석에 대해 유용한 정보를 제공해 주는 것으로 나타났다(표 2). Mos1 배아에서 WT/HDR 유전자형을 갖는 5개의 자매 난할구 모두 SNP#5에서 동형접합성 G/G였고, 이는 부계 SNP의 상실을 보여주는 것이다. Mos8 배아에서 2개의 WT/HDR 난할구의 경우, 하나는 동형접합성 G/G였고, 하나는 SNP#5에서 이형접합성 A/G였다. M기 주입된 배아 중, 7개 중 1개는 이형접합성 A/G인 반면, 남은 6개는 SNP#5에서 동형접합성 G/G였다(표 2).
본 결과는 HDR에 의해 유도되는 유전자 전환이 인간 배아에서 이루어지고, 원 표적 부위로부터 양 방향 모두로 상당 거리까지 확장되며, 그 결과로 중성 부계 SNP의 삭제와 연관된 LOH가 발생한다는 것을 보여준다. 전환 트랙의 길이는 개별 난할구마다 다르며, 심지어는 동일한 배아에서도 상이하다. 일부 교정된 난할구 상의 다형성 부위의 존재 및 부계 SNP의 유지 또한 돌연변이체 부계 MYPBC3 유전자좌가 S기 및 M기 주입된 배아에서 수복되었다는 것을 보여주는 것이다.
Figure pct00005
실시예 12
본 실시예는 단위생식 발생에 대한 검정을 기술한다. 실시예 1-6에는 수정(M기) 동안 CRISPR-Cas9 RNP에의 조기 노출이 난할 배아에서 모자이크 현상을 유의적으로 감소시키거나, 또는 완전히 제거한다고 제시되어 있다. 이러한 결과는 수복이 HDR 또는 NHEJ를 통해 이루어졌는지와는 무관한데, 그 이유는 모자이크 배아는 상이한 NHEJ 유래 indel 유전자형을 갖는 난할구를 포함할 수 있기 때문이다. M기 주입에 의해 생산된 총 58개 중 단 하나(1.7%)의 난할 배아만이 모자이크였고, 58개 중 16개(27.6%)는 균일하게 이형접합성으로, 돌연변이체 부계 대립유전자에 NHEJ 유래 indel을 보유하였다(MYBPC3WT/ΔGAGT-indel; 도 3B)(문헌 [Antoniou et al., 2003]). 상기 이형접합성 배아는 모두 부계 MYBPC3 결실을 보유하는 바, 단위생식으로부터 기원하는 것이 아닐 수 있다. 그에 반해, 수정 후 1일째 후기 S기 접합체 내로 CRISPR-Cas9를 주입하였을 때, 54개 중 13개(24%)의 배아는 모자이크였다(도 2A; 상기 동일). 75개의 M기 주입된 난모세포 중 2개는 ICSI 동안 용해되었고, 10개는 수정에 실패하였다. 남은 63개(84%)는 2개의 전핵 및 제2 극체를 갖는 정상적인 수정 형태를 보였는데, 이는 단위생식 활성화와는 상반되는 것이다. 비주입 대조군 및 S기 주입된 배아로부터 유사한 결과를 얻었다(상기 동일). 또한, 표 1 및 2에서 제공된, M기 주입군 중 WT/WT 배아에 대한 SNP 분석을 통해 부계 SNP의 유지가 명확하게 입증된다.
단위생식 발생을 검정하기 위해, M기 주입된 배아로부터 유래된 WT/WT ES 세포주에서의 부계 기여를 짧은 연쇄 반복서열(STR) 검정법을 이용하여 확인하였다. M기 주입에 의해 유래된 6개의 ES 세포주 모두 및 1개의 비주입 대조군은 모계 및 부계 STR 대립유전자, 둘 모두를 함유하였다. 따라서, 분석된 모든 샘플에서, 부계 기여가 검출되었고, 단위생식은 제거되었다.
본 개시내용의 원리가 적용될 수 있는 다수의 가능한 실시양태를 고려하여, 예시된 실시양태는 단지 본 개시내용의 예라는 것을 인지하여야 하고, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주하지 않아야 한다. 오히려, 본 발명의 범주는 하기 청구범위에 의해 정의된다. 그러므로, 본 발명자들은 이러한 청구범위의 범주 및 정신 내에 포함되는 모든 것들을 본 발명자들의 발명으로서 청구한다.
SEQUENCE LISTING <110> Oregon Health & Science University Mitalipov, Shoukhrat Gutierrez, Nuria <120> HUMAN GENE CORRECTION <130> 899-98807-02 <150> 62/487,989 <151> 2017-04-20 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 1 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example targeting sequence <400> 2 ggtggagttt gtgaagtat 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example targeting sequence <400> 3 gggtggagtt tgtgaagtat 20 <210> 4 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example sgRNA sequence <400> 4 ggtggagttt gtgaagtatg uuuuagagcu agaaauagcu uaaaauaagg cuaguccguu 60 aucaacuuga aaaaguggca ccgaucggug cuuuuuu 97 <210> 5 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example sgRNA sequence <400> 5 gggtggagtt tgtgaagtat guuuuagagc uagaaauagc uuaaaauaag gcuaguccgu 60 uaucaacuug aaaaaguggc accgaucggu gcuuuuuu 98 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> on-target sequence <400> 6 gggtggagtt tgtgaagtat cgg 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gggaggagct tgtgaagtaa ggg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tggggaagtt tgtaaagtat tgg 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tgaaagagtt tgtgaagtat tgg 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tggaggagtt tgtgaagaat tgg 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 aggaaggaga tgtgaagtat ggg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 tggtaaagtt tctgaagtat ggg 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gggaagagtt agtaaagtat agg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 caggtggaga tgtggagtat ggg 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tagaagagtt tgtgaagtat tgg 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 atgtgaagtt tgtgaagaat tgg 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 gggaagagtt tgtgaaggat tgg 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tggaagagtt tgtgaagtat tgg 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tggaagagtt tgtgaagtat tgg 23 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tagtagagtt tgtgaagaat tgg 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tgggagagtt tgtgaagtat tgg 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gggcagagtt tgtgaagtct agg 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gggaggtgtt tatgaagtat agg 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 tgaaggagtt tgtgaagtat tgg 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 acttggagtt tgtgaagtct ggg 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 ttgtggagtt ggtgaagtat ggg 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gtgtggagtt ggtgaagtat tgg 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 gggaagagtt tgtgaagaat tgg 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 ggatgaagtt tgtggagtat ggg 23 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 ggtggagttt gtgaagtatc gg 22 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 agcgggtgga gtttgagtgt gaagtatcgg agg 33 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (15)..(18) <223> n is a, c, g, t or u <400> 32 agcgggtgga gtttnnnngt gaagtatcgg agg 33 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODN-1 <400> 33 ggagtttgag tgcgaggtat cg 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODN-2 <400> 34 ggagttcgaa tgtgaagtat cg 22 <210> 35 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 tggagtttga gtgtgaa 17 <210> 36 <211> 11 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 cgggtggagt t 11 <210> 37 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 tggagtttga gtgtgaa 17 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 tggagttcga atgtgaa 17 <210> 39 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 tggagtttga gtgtgaa 17 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer F <400> 40 cccccaccca ggtacatctt 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer R <400> 41 ctagtgcaca gtgcatagtg 20 <210> 42 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor sequence <400> 42 agatcggaag agc 13 <210> 43 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor sequence <400> 43 gctcttccga tct 13

Claims (28)

  1. a) 함께 작용하여 돌연변이체 대립유전자에 이중 가닥 파단을 도입하는 비자연적으로 발생된 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드를 영장류 세포 내로 도입하는 단계로서,
    i) 상기 영장류 세포는 유사 세포 분열 중이고;
    ii) 상기 영장류 세포는 돌연변이체 대립유전자에 대해 이형접합성인 게놈을 포함하여, 상기 게놈은 돌연변이체 대립유전자 한 카피 및 야생형 대립유전자 한 카피를 포함하고;
    iii) 야생형 대립유전자에 상동성인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 영장류 세포 내로 도입되지 않는 것인 단계; 및
    b) 상기 영장류 세포가 돌연변이체 대립유전자에서 이중 가닥 DNA 파단의 상동성 지정 수복을 활성화하도록 하여,
    수복 주형으로서 정상 야생형 대립유전자를 사용하여 돌연변이체 대립유전자를 교정하고, 야생형 대립유전자에 대해 동형접합성인 영장류 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 영장류 세포에서 관심 유전자의 돌연변이체 대립유전자를 교정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 영장류 세포가 배아인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 단계 (a) 전에 배아를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 배아가 단세포 배아인 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    영장류 종으로부터 관심 유전자의 돌연변이체 대립유전자 또는 야생형 대립유전자를 갖는 게놈을 포함하는 영장류 난모세포를 선택하는 단계;
    상기 영장류 난모세포를 동일한 영장류 종으로부터의 정자와 수정시킴으로써, 단세포 영장류 배아를 형성하는 단계로서, 상기 정자는 각각 관심 유전자의 야생형 대립유전자 또는 돌연변이체 대립유전자를 포함하고, 상기 영장류 배아는 이형접합성이고 야생형 대립유전자 한 카피 및 돌연변이체 대립유전자 한 카피를 포함하는 것인 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드를, 영장류 난모세포를 수정시킴과 동시에 영장류 난모세포 내로 도입하는 것인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 영장류 난모세포를 수정시키는 단계가 세포질내 정자 주입(ICSI)을 포함하는 것인 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화된 뉴클레아제 및 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드가 도입될 때, 영장류 난모세포가 중기 II에 있는 것인 방법.
  9. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내에서 배아를 배양하여 다세포 배아를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 다세포 배아가 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 세포에 대해 모자이크가 아닌 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화된 뉴클레아제가 클러스터된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복서열(CRISPR) 연관(Cas)9, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 또는 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 표적화된 뉴클레아제가 CRISPR-Cas9이고, 부위 특이적 뉴클레오티드 결합 가이드가 핵산 가이드 RNA인 방법.
    [청구항 12]
    제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    c) 돌연변이체 대립유전자의 성공적인 교정에 대해 검정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 성공적인 교정에 대해 검정하는 단계가 생어(Sanger) 시퀀싱의 이용을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 오프 타겟 효과에 대해 검정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 오프 타겟 효과에 대해 검정하는 단계가 전체 게놈 시퀀싱을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 및 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 영장류 세포가 체세포인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 체세포가 중배엽, 내배엽, 또는 외배엽 세포인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 체세포가 심장 세포, 피부 세포, 백혈구, 간세포, 췌장 세포, 신장 세포, 난소 세포, 고환 세포, 전립선 세포, 유방 세포, 근육 세포, 소화기계 세포, 호흡기계 세포, 또는 골원성 세포인 방법.
  19. 제1항 및 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 영장류 세포가 만능성 또는 다능성 줄기 세포인 방법.
  20. 제11항 또는 제12항에 있어서, 줄기 세포가 골수 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 장 줄기 세포, 뉴런 줄기 세포, 또는 치아 줄기 세포인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 영장류가 인간인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 대립유전자가 야생형 대립유전자와 비교하여 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 대립유전자가 야생형 대립유전자와 비교하여 염기쌍 치환을 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 대립유전자가 야생형 대립유전자와 비교하여 프레임 시프트 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 유전자가 미오신 결합 단백질 C(MYBPC3), 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR3), 세르핀 패밀리 A 구성원 1(SERPINA1), 단백질 키나제 D1(PKD), 유방암 1(BRCA1), 유방암 2(BRCA2), 글리실-tRNA 신테타제(GARS), WNT 신호전달 경로 조절인자(APC), 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자(CFTR), 키메린 1(CHN1), 디스트로핀(DMD), 응고 인자 V(F5), 취약 X 정신 지체 1(FMR1), 글루코실세라미다제 베타(GBA), 항상성 철 조절인자(HFE), 응고 인자 IX(FIX), 헌팅틴(HD), 피브릴린 1(FBN1), 근긴장성 디스트로피 단백질 키나제(DMPK), 세포 핵산 결합 단백질(CNBP), 단백질 티로신 포스파타제, 비수용체 타입 11(PTPN11), Ras/Rac 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 1(SOS1), Raf 프로토온코진 세린/트레오닌 키나제(RAF1), Kras 프로토온코진 GTP아제(KRAS), 콜라겐 타입 알파 1 쇄(COL1A1), 콜라겐 타입 알파 2 쇄(COL1A2), 시누클레인 알파(SNCA), 유비퀴틴 C 말단 하이드롤라제 L1(UCHL1), 류신 풍부 반복서열 키나제 2(LRRK2), 파킨슨병 3(PARK3), 파킨 RBR E3 유비퀴틴 단백질 리가제(PARK2), 파킨슨증 연관 데글리카제(PARK7), PTEN 유도성 추정 키나제 1(PARK6), 아포지질단백질 B(APOB), 저밀도 지질단백질 수용체(LDLR), 저밀도 지질단백질 수용체 어댑터 단백질 1(LDLRAP1), 프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 타입 9(PCSK9), 액틴 알파 심장 근육 1(ACTC1), 액티닌 알파2(ACTN2), 칼레티쿨린 3(CALR3), 시스테인 및 글리신 풍부 단백질 3(CSRP3), 정토필린2(JPH2), 미오신 중쇄 7(MYH7), 미오신 경쇄 2(MYL2), 미오신 경쇄 3(MyL3), 마이오제닌 2(MYOZ2), 넥실린 F-액틴 결합 단백질(NEXN), 포스포람반(PLN), 단백질 키나제 AMP 활성화 비촉매 서브유닛 감마 2(PRKAG2), 티틴-캡(TCAP), 트로포닌 I3 심장 타입(TNNI3), 트로포닌 T2 심장 타입(TNNT2), 트로포미오신 1(TPM1), 티틴(TTN), 및/또는 빈쿨린(VCL)인 방법.
  26. 제18항에 있어서, (a) 체세포가 유방암을 앓는 인간 피험체 유래의 것이고, (b) 체세포가 유방 세포이고, (c) 여기서, 관심 유전자가 BRCA1 또는 BRCA2인 방법.
  27. 제18항에 있어서,
    (a) 체세포가 가족성 심근병증을 앓는 인간 피험체 유래의 것이고,
    (b) 세포가 심장 세포이고,
    (c) 관심 유전자가 MYBPC3, ACTC1, ACTN2, CALR3, CSRP3, JPH2, MYH7, MYL2, MyL3, MYOZ2, NEXN, PLN, PRKAG2, TCAP, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTN, 및/또는 VCL인 방법.
  28. 제18항에 있어서,
    (a) 체세포가 가족성 고콜레스테롤혈증을 앓는 인간 피험체 유래의 것,
    (b) 세포가 심장 세포, 및/또는
    (c) 관심 유전자가 APOB, LDLR, LDLRAP1, 및/또는 PCSK9인 방법.
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