JP2701983B2 - 二つの誘導性配列を含む合成真核細胞プロモーター - Google Patents
二つの誘導性配列を含む合成真核細胞プロモーターInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、改良誘導性哺乳動物発現系の作出に関す
る。
る。
発明の背景 哺乳動物発現系は、翻訳後に広範囲に修飾されるタン
パク質の、組み替え技術による生産において広く用いら
れている。これらの系は構成性か誘導性のいずれかであ
る。誘導性系は可能性として細胞毒性のタンパク質の発
現に用いることが適切である。
パク質の、組み替え技術による生産において広く用いら
れている。これらの系は構成性か誘導性のいずれかであ
る。誘導性系は可能性として細胞毒性のタンパク質の発
現に用いることが適切である。
発現系が構成性か誘導性かを決定する鍵となるのが、
プロモーターである。実験系において誘導され得るいく
つかの哺乳動物プロモーターが特徴づけされており、メ
タロチオネイン（MT）遺伝子およびマウス乳癌ウイルス
／末端反復配列（MMTV−LTR）に存在するプロモーター
が広く用いられている。
プロモーターである。実験系において誘導され得るいく
つかの哺乳動物プロモーターが特徴づけされており、メ
タロチオネイン（MT）遺伝子およびマウス乳癌ウイルス
／末端反復配列（MMTV−LTR）に存在するプロモーター
が広く用いられている。
MTプロモーターの最良の誘導物質は、カドミウム（C
d）および亜鉛（Zn）などの重金属である。プロモータ
ーの誘導は、金属による活性化の後にMTプロモーター中
に存在する誘導性金属感受性配列（MRE）に結合する転
写因子によって媒介される。このプロモーターにはま
た、活性化の必要がない転写因子に結合し、遺伝子発現
の基底レベルに関わるいくつかの構成性（非誘導性）配
列が含まれる。これらの構成性配列の存在の結果、MTプ
ロモーターの発現の非誘導性レベルは有意であり、誘導
比（誘導性発現と基底レベル発現との比）は通常５〜10
倍を超えない。MTプロモーターの構成性配列のいくつか
を除去することによって基底レベルの発現を減らす試み
がなされてきた。しかし、これら配列の除去はまた、発
現の誘導性レベルをも低減させる。
d）および亜鉛（Zn）などの重金属である。プロモータ
ーの誘導は、金属による活性化の後にMTプロモーター中
に存在する誘導性金属感受性配列（MRE）に結合する転
写因子によって媒介される。このプロモーターにはま
た、活性化の必要がない転写因子に結合し、遺伝子発現
の基底レベルに関わるいくつかの構成性（非誘導性）配
列が含まれる。これらの構成性配列の存在の結果、MTプ
ロモーターの発現の非誘導性レベルは有意であり、誘導
比（誘導性発現と基底レベル発現との比）は通常５〜10
倍を超えない。MTプロモーターの構成性配列のいくつか
を除去することによって基底レベルの発現を減らす試み
がなされてきた。しかし、これら配列の除去はまた、発
現の誘導性レベルをも低減させる。
天然ヒトMT−IIAプロモーターは、MREおよび構成性配
列の他に、単一の誘導性グルココルチコイド感受性配列
（GRE）を含み、デキサメタゾン（dex）のようなグルコ
コルチコイドはMT−IIAプロモーターからそのままで低
レベル発現を誘導する。
列の他に、単一の誘導性グルココルチコイド感受性配列
（GRE）を含み、デキサメタゾン（dex）のようなグルコ
コルチコイドはMT−IIAプロモーターからそのままで低
レベル発現を誘導する。
天然MMTV−LTRプロモーターは、四つの誘導性GREを含
み、グルココルチコイドによって強く誘導され得る。発
現の基底レベルはヒトMT−IIAプロモーターを用いて得
られるものに較べると低いが、誘導性発現の絶対的レベ
ルは基底レベルほどには高くない。
み、グルココルチコイドによって強く誘導され得る。発
現の基底レベルはヒトMT−IIAプロモーターを用いて得
られるものに較べると低いが、誘導性発現の絶対的レベ
ルは基底レベルほどには高くない。
遺伝子発現調節に関わる誘導性配列などの核酸配列
は、調節される遺伝子の５′側または３′側または調節
される遺伝子内に位置することができる。
は、調節される遺伝子の５′側または３′側または調節
される遺伝子内に位置することができる。
発明の概要 本発明によれば、少なくとも二つの異なるクラスの誘
導性配列からなる遺伝子転写調節のための合成誘導性真
核細胞プロモーターが提供される。本発明に係る誘導性
配列のクラスには、ホルモン感受性配列（GREを含
む）、金属感受性配列（MRE）、熱ショック感受性配
列、インターフェロン感受性配列およびサイトカイン感
受性配列が含まれる。
導性配列からなる遺伝子転写調節のための合成誘導性真
核細胞プロモーターが提供される。本発明に係る誘導性
配列のクラスには、ホルモン感受性配列（GREを含
む）、金属感受性配列（MRE）、熱ショック感受性配
列、インターフェロン感受性配列およびサイトカイン感
受性配列が含まれる。
一つの実施態様において、提供される合成プロモータ
ーは天然プロモーターに由来し、異なるクラスの誘導性
配列の一つは天然誘導性配列であるが、もう一つの異な
るクラスの誘導性配列は例えば天然プロモーターへの挿
入によってまたは天然プロモーター中の通常は不活性な
配列の活性化などによってもたらされる。一般に二つの
異なるクラスの誘導性配列が本発明の新規の合成プロモ
ーター中には存在するが、適宜、三つまたはそれ以上の
組み合わせが存在していてもよい。
ーは天然プロモーターに由来し、異なるクラスの誘導性
配列の一つは天然誘導性配列であるが、もう一つの異な
るクラスの誘導性配列は例えば天然プロモーターへの挿
入によってまたは天然プロモーター中の通常は不活性な
配列の活性化などによってもたらされる。一般に二つの
異なるクラスの誘導性配列が本発明の新規の合成プロモ
ーター中には存在するが、適宜、三つまたはそれ以上の
組み合わせが存在していてもよい。
合成プロモーター中の異なるクラスの誘導性配列を利
用することによって、遺伝子産物の真核生物発現系、と
くに哺乳動物発現系における発現の共働的誘導が可能に
なる。すなわち、複数のクラスの誘導性配列の誘導によ
って得られる遺伝子発現のレベルは、個々のクラスの誘
導性配列の別々の誘導によって達成される個々の遺伝子
発現の総和よりも大きい。加えて、遺伝子発現の総合的
レベルが高まると考えられる。
用することによって、遺伝子産物の真核生物発現系、と
くに哺乳動物発現系における発現の共働的誘導が可能に
なる。すなわち、複数のクラスの誘導性配列の誘導によ
って得られる遺伝子発現のレベルは、個々のクラスの誘
導性配列の別々の誘導によって達成される個々の遺伝子
発現の総和よりも大きい。加えて、遺伝子発現の総合的
レベルが高まると考えられる。
そのようなプロモーターはまた合成によって得てもよ
いが、一般にここで提供される合成プロモーターはここ
に詳述するように天然のプロモーターに由来する修飾に
よって得られるものである。
いが、一般にここで提供される合成プロモーターはここ
に詳述するように天然のプロモーターに由来する修飾に
よって得られるものである。
上記したように、誘導性プロモーターは少なくとも一
つの構成性配列を含むことができるが、これは誘導の存
在なしで基底遺伝子発現レベルをもたらすことができ
る。本発明の実施例において、少なくとも一つの構成性
配列を機能的に無能にして、その結果、非修飾プロモー
ターと比較して一般に遺伝子発現の基底レベルが低下
し、誘導された遺伝子発現対基底遺伝子発現の比が高ま
る。少なくとも一つの構成性配列のそのような機能的無
能は、天然プロモーターから除去することによっておよ
び／または誘導性配列などをそこに挿入することによっ
て達成することができる。
つの構成性配列を含むことができるが、これは誘導の存
在なしで基底遺伝子発現レベルをもたらすことができ
る。本発明の実施例において、少なくとも一つの構成性
配列を機能的に無能にして、その結果、非修飾プロモー
ターと比較して一般に遺伝子発現の基底レベルが低下
し、誘導された遺伝子発現対基底遺伝子発現の比が高ま
る。少なくとも一つの構成性配列のそのような機能的無
能は、天然プロモーターから除去することによっておよ
び／または誘導性配列などをそこに挿入することによっ
て達成することができる。
したがって、本発明は好ましい実施態様において、天
然GREおよび／またはMREだけではなく追加のGREおよび
／またはMREを含む改良誘導性真核生物プロモーターを
提供する。天然プロモーターの構成性配列は改良プロモ
ーター中で除去されていてもいなくてもよい。改良プロ
モーターは、重金属イオンおよびグルココルチコイド
（デキサメタゾンなど）の両者が同時に用いられて少な
くとも一つのMREおよび少なくとも一つのGREの両者が存
在する場合には、共働的に誘導され得る。共働的誘導の
結果、ヒトMT−IIAまたはMMTV−LTRプロモーターなどの
非修飾プロモーターで観察されるよりもはるかに高い遺
伝子発現レベルが認められる。新規のプロモーターはま
た非修飾プロモーターよりも少ない構成性配列を含んで
いてもよく、これはより低い基底レベルの遺伝子発現を
もたらす。
然GREおよび／またはMREだけではなく追加のGREおよび
／またはMREを含む改良誘導性真核生物プロモーターを
提供する。天然プロモーターの構成性配列は改良プロモ
ーター中で除去されていてもいなくてもよい。改良プロ
モーターは、重金属イオンおよびグルココルチコイド
（デキサメタゾンなど）の両者が同時に用いられて少な
くとも一つのMREおよび少なくとも一つのGREの両者が存
在する場合には、共働的に誘導され得る。共働的誘導の
結果、ヒトMT−IIAまたはMMTV−LTRプロモーターなどの
非修飾プロモーターで観察されるよりもはるかに高い遺
伝子発現レベルが認められる。新規のプロモーターはま
た非修飾プロモーターよりも少ない構成性配列を含んで
いてもよく、これはより低い基底レベルの遺伝子発現を
もたらす。
適宜、非修飾プロモーターはヒトMT−IIAまたはMMTV
−LTRプロモーターが用いられる。感受性配列は適宜、
そのような配列のための共通配列を含んでいてもよく、
例えば はMRE共通配列を含み、そして は本発明の実施例において用いられるGRE共通配列を含
む。
−LTRプロモーターが用いられる。感受性配列は適宜、
そのような配列のための共通配列を含んでいてもよく、
例えば はMRE共通配列を含み、そして は本発明の実施例において用いられるGRE共通配列を含
む。
本発明の効果には次のようなものがあげられる。
ａ）高い総合的レベルの遺伝子発現 ｂ）基底遺伝子発現レベルの低減 ｃ）遺伝子発現の共働的誘導 ｄ）誘導比および／または適切な誘導物質に対する感受
性に関して修飾されたプロモーター 図面の簡単な説明 第１図は、hMT−IIAプロモーターおよび本発明の一つ
の実施態様に従ってhMT−IIAプロモーターに施した種々
の修飾を有する修飾されたプロモーターの遺伝子地図で
ある。
性に関して修飾されたプロモーター 図面の簡単な説明 第１図は、hMT−IIAプロモーターおよび本発明の一つ
の実施態様に従ってhMT−IIAプロモーターに施した種々
の修飾を有する修飾されたプロモーターの遺伝子地図で
ある。
発明の具体的説明 上記したように、ここに提供される新規のプロモータ
ーは天然プロモーターに由来するものが用い得る。本発
明の一つの好ましい実施態様において、プロモーターは
少なくとも一つの天然誘導性配列および少なくとも一つ
の異なる誘導性配列を含み、前者はMREであり、後者は
ホルモン感受性配列、とくに天然プロモーター中に挿入
によって導入されたグルココルチコイド感受性配列（GR
E）である そのような挿入GREは、GRE共通配列を含む一対の相補
的オリゴヌクレオチドからなる合成分子でもよい。複数
のGREを天然プロモーター中に多量体直列自己連結配列
物のかたちで挿入してもよい。
ーは天然プロモーターに由来するものが用い得る。本発
明の一つの好ましい実施態様において、プロモーターは
少なくとも一つの天然誘導性配列および少なくとも一つ
の異なる誘導性配列を含み、前者はMREであり、後者は
ホルモン感受性配列、とくに天然プロモーター中に挿入
によって導入されたグルココルチコイド感受性配列（GR
E）である そのような挿入GREは、GRE共通配列を含む一対の相補
的オリゴヌクレオチドからなる合成分子でもよい。複数
のGREを天然プロモーター中に多量体直列自己連結配列
物のかたちで挿入してもよい。
本発明のとくに好ましい実施態様は、真核生物発現
系、とくに哺乳動物発現系において誘導性MREおよびGRE
の誘導時に遺伝子発現の共働作用が達成されるように、
少なくとも一つの誘導性GREを含むように修飾した、そ
して好ましくは増強された総合レベルの遺伝子産物発現
を伴う、ヒトメタロチオネイン遺伝子（hMT−IIA）プロ
モーターを提供する。このとくに好ましい実施態様にお
いては、多量体直列GREを天然hMT−IIAプロモーターに
挿入することができる。
系、とくに哺乳動物発現系において誘導性MREおよびGRE
の誘導時に遺伝子発現の共働作用が達成されるように、
少なくとも一つの誘導性GREを含むように修飾した、そ
して好ましくは増強された総合レベルの遺伝子産物発現
を伴う、ヒトメタロチオネイン遺伝子（hMT−IIA）プロ
モーターを提供する。このとくに好ましい実施態様にお
いては、多量体直列GREを天然hMT−IIAプロモーターに
挿入することができる。
天然hMT−IIAプロモーターの少なくとも一つの構成性
配列を、例えばそのような配列を除去することによって
および／または少なくとも一つのGREをそこに挿入する
ことによって、無能にすることもまた好ましい。一つの
具体的な実施例において、構成性配列の除去および単一
または複数のGREの挿入の両方を適用して構成性配列を
無能にする。
配列を、例えばそのような配列を除去することによって
および／または少なくとも一つのGREをそこに挿入する
ことによって、無能にすることもまた好ましい。一つの
具体的な実施例において、構成性配列の除去および単一
または複数のGREの挿入の両方を適用して構成性配列を
無能にする。
本発明の他の好ましい実施態様において、プロモータ
ーは、少なくとも一つの天然誘導性配列すなわちHRE、
とくにグルココルチコイド感受性配列（GRE）、および
少なくとも一つの異なる誘導性配列すなわち挿入によっ
て導入されたMREを含む。
ーは、少なくとも一つの天然誘導性配列すなわちHRE、
とくにグルココルチコイド感受性配列（GRE）、および
少なくとも一つの異なる誘導性配列すなわち挿入によっ
て導入されたMREを含む。
そのような挿入MREは、MRE共通配列を含む一対の相補
的オリゴヌクレオチドからなる合成分子でもよい。複数
のMREを天然プロモーター中に多量体直列自己連結配列
物のかたちで挿入してもよい。
的オリゴヌクレオチドからなる合成分子でもよい。複数
のMREを天然プロモーター中に多量体直列自己連結配列
物のかたちで挿入してもよい。
本発明のとくに好ましい実施態様は、真核生物発現系
において誘導性GREおよびMREの誘導時に遺伝子発現の共
働作用が達成されるように少なくとも一つの誘導性GRE
を含むように修飾して、そして好ましくは増強された総
合レベルの遺伝子発現を伴う、マウス乳ガンウイルス／
末端反復（MMTV−LTR）プロモーターを提供する。この
とくに好ましい実施態様においては、多量体直列MREを
天然MMTV−LTRプロモーター中に挿入することができ
る。
において誘導性GREおよびMREの誘導時に遺伝子発現の共
働作用が達成されるように少なくとも一つの誘導性GRE
を含むように修飾して、そして好ましくは増強された総
合レベルの遺伝子発現を伴う、マウス乳ガンウイルス／
末端反復（MMTV−LTR）プロモーターを提供する。この
とくに好ましい実施態様においては、多量体直列MREを
天然MMTV−LTRプロモーター中に挿入することができ
る。
新規の合成誘導性真核生物プロモーターは、とくに発
現系によって発現されるべき遺伝子に作動的に連結され
ている場合は、遺伝子産物の真核生物発現のためのベク
ター中に組み込んでもよい。そのような発現系には、ベ
クターを含む真核細胞、とくに哺乳動物細胞、例えばVe
ra、CHO、HeLa、Rat II繊維芽細胞および消化管上皮細
胞などがある。
現系によって発現されるべき遺伝子に作動的に連結され
ている場合は、遺伝子産物の真核生物発現のためのベク
ター中に組み込んでもよい。そのような発現系には、ベ
クターを含む真核細胞、とくに哺乳動物細胞、例えばVe
ra、CHO、HeLa、Rat II繊維芽細胞および消化管上皮細
胞などがある。
好ましい実施態様の説明 第１図には、本発明の実施態様による多様な修飾を組
み入れた新規のプロモーターの種々の型が示されてい
る。新規の一連のプロモーターは、次のような方法で作
出される。ヒトMT−IIA遺伝子の800bpの５′プロモータ
ー領域を含むKsP I−DNAフラグメント（塩基−740〜＋6
0）を、ヒトMT−IIA遺伝子を含むプラスミド（Karin
ら、1982、Nature、299、797−802を参照されたい）か
ら単離した。平滑末端を作出した後、Hind IIIリンカー
を加えて、フラグメントをレポーター遺伝子として用い
られるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（CAT）遺伝子を含むプラスミドであるpSVOATCAT中に
HInd III部位でCAT遺伝子の５′側に挿入した。オリジ
ナルMT−IIAプロモーターの二つの構成性配列（AP1およ
びAP2、第１図上部地図参照）をXma IIIフラグメント
（塩基−79〜−129）を除去することによって欠失させ
た。
み入れた新規のプロモーターの種々の型が示されてい
る。新規の一連のプロモーターは、次のような方法で作
出される。ヒトMT−IIA遺伝子の800bpの５′プロモータ
ー領域を含むKsP I−DNAフラグメント（塩基−740〜＋6
0）を、ヒトMT−IIA遺伝子を含むプラスミド（Karin
ら、1982、Nature、299、797−802を参照されたい）か
ら単離した。平滑末端を作出した後、Hind IIIリンカー
を加えて、フラグメントをレポーター遺伝子として用い
られるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（CAT）遺伝子を含むプラスミドであるpSVOATCAT中に
HInd III部位でCAT遺伝子の５′側に挿入した。オリジ
ナルMT−IIAプロモーターの二つの構成性配列（AP1およ
びAP2、第１図上部地図参照）をXma IIIフラグメント
（塩基−79〜−129）を除去することによって欠失させ
た。
GRE共通配列、５′BamH I部位および３′Bgl II部位
を含む一対の相補的オリゴヌクレオチドを合成した。正
鎖オリゴヌクレオチド配列は下記のようであった。
を含む一対の相補的オリゴヌクレオチドを合成した。正
鎖オリゴヌクレオチド配列は下記のようであった。
多量体直列GREを、BamH IおよびBgl IIの存在下で合
成GREオリゴヌクレオチドを自己結合させることによっ
て調製した。単一および多量体のGREをプロモーターのS
ac II部位（塩基−175で）またはプロモーターのXma II
I部位（塩基−129）中に挿入した（第１図下部地図参
照）。Sac II配列での挿入は二つ目のAP2部位を破壊す
る。
成GREオリゴヌクレオチドを自己結合させることによっ
て調製した。単一および多量体のGREをプロモーターのS
ac II部位（塩基−175で）またはプロモーターのXma II
I部位（塩基−129）中に挿入した（第１図下部地図参
照）。Sac II配列での挿入は二つ目のAP2部位を破壊す
る。
MRE共通配列、５′BamH I部位および３′Bgl II部位
を含む一対の相補的オリゴヌクレオチドを合成した。正
鎖オリゴヌクレオチド配列は下記のようであった。
を含む一対の相補的オリゴヌクレオチドを合成した。正
鎖オリゴヌクレオチド配列は下記のようであった。
そのようなオリゴヌクレオチドを多量体直列配列の合
成に用いてもよく、単一または複数のMREをGREの場合と
同様にしてhMT−IIAプロモーター中に挿入してもよい。
成に用いてもよく、単一または複数のMREをGREの場合と
同様にしてhMT−IIAプロモーター中に挿入してもよい。
同様のGREおよび／またはMREのMMTV−LTRプロモータ
ーへの挿入および同プロモーターからの任意の構成性配
列除去を達成するためのMMTV−CATベクターを、プラス
ミドp201（Majorsら、1981、Nature、283、253−258）
からPst Iを用いて除去し、平滑末端を作出した後、pSV
OATCATのHind III部位に挿入した。
ーへの挿入および同プロモーターからの任意の構成性配
列除去を達成するためのMMTV−CATベクターを、プラス
ミドp201（Majorsら、1981、Nature、283、253−258）
からPst Iを用いて除去し、平滑末端を作出した後、pSV
OATCATのHind III部位に挿入した。
新規のプロモーターをRAT II繊維芽細胞、CHO（チャ
イニーズハムスター卵巣細胞）、Vero（サル繊維芽細
胞）およびHela（ヒト子宮頚管腫瘍細胞）を用いる暫時
CAT発現アッセイにおいてグルココルチコイド受容体を
発現させて試験した。以下の実施例で再現した結果は、
これら新規のプロモーターによって、グルココルチコイ
ド受容体を通常発現しているかグルココルチコイド受容
体遺伝子でトランスフェクトされた細胞が同時に重金属
イオンおよびデキサメタゾンで誘導された場合に極めて
高いレベルの発現がもたらされることを示した。これら
のプロモーターを用いて得られる発現の誘導レベルは、
野生型ヒトMT−IIAまたはMMTV−LTRプロモーターを用い
て得られるものよりも有意に高い。同時に、発現の基底
レベルは、野生型ヒトMT−IIAプロモーターで観察され
るものよりも有意に低かった。
イニーズハムスター卵巣細胞）、Vero（サル繊維芽細
胞）およびHela（ヒト子宮頚管腫瘍細胞）を用いる暫時
CAT発現アッセイにおいてグルココルチコイド受容体を
発現させて試験した。以下の実施例で再現した結果は、
これら新規のプロモーターによって、グルココルチコイ
ド受容体を通常発現しているかグルココルチコイド受容
体遺伝子でトランスフェクトされた細胞が同時に重金属
イオンおよびデキサメタゾンで誘導された場合に極めて
高いレベルの発現がもたらされることを示した。これら
のプロモーターを用いて得られる発現の誘導レベルは、
野生型ヒトMT−IIAまたはMMTV−LTRプロモーターを用い
て得られるものよりも有意に高い。同時に、発現の基底
レベルは、野生型ヒトMT−IIAプロモーターで観察され
るものよりも有意に低かった。
［実施例］ 上記の開示は本発明の一般的記述である。以下の詳細
な実施例を参照することによってより完全な理解が得ら
れる。これらの実施例はもっぱら説明を目的とするもの
であって、発明の範囲の限定を意図するものではない。
状況の示唆または提示から形状の変更および相当物との
代替は当然予想されるものである。特定の用語をここで
適用するが、そのような用語は説明を意図するものであ
って、限定を目的とするものではない。
な実施例を参照することによってより完全な理解が得ら
れる。これらの実施例はもっぱら説明を目的とするもの
であって、発明の範囲の限定を意図するものではない。
状況の示唆または提示から形状の変更および相当物との
代替は当然予想されるものである。特定の用語をここで
適用するが、そのような用語は説明を意図するものであ
って、限定を目的とするものではない。
［実施例１］ 本実施例は、追加のGREを含む修飾されたhMT−IIAプ
ロモーターの構築を説明するものである。
ロモーターの構築を説明するものである。
MT発現ベクターはすべて、いかなる調節配列をも有し
ないクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（CAT）遺伝子を含むプラスミドpSVOATCAT（Gormanら、
Mol.Cell.Biol.２、1044、1982）に由来した。CAT遺伝
子が野生型ヒトMT−IIAプロモーター（hMT−IIA）の制
御下にある調節プラスミドであるMT−CATを、下記のよ
うにして作出した。hMT−IIAのプロモーター領域の800b
pのKsp Iフラグメント（（塩基−740〜＋60、第１図）
を単離した。平滑末端を作出した後、Hind IIIリンカー
を加えて、フラグメントをpSVOATCATのCAT遺伝子５′側
のHind III部位に挿入した。プラスミドMT−CAT−ΔＸ
を、構成性AP1−AP2を含むMT−CATのMTプロモーターか
らXma IIIフラグメント（塩基−79〜−129）を除去する
ことによって作出した。追加のGREを挿入するために、G
RE共通配列、５′BamH I部位および３′Bgl II部位を含
む一対の相補的オリゴヌクレオチドを合成して、これら
合成配列物をBamH IおよびBgl IIの存在下で自己連結す
ることによって多量体直列配列を作出した。正鎖ヌクレ
オチド配列は、上記ような配列番号１であった。次いで
単量体または多量体のGREを、平滑末端を作出した後にM
T−CAT−ΔＸベクターのSac II部位またはXma III部位
のいずれかに挿入した（第１図）。挿入されたGREの数
を、DNA配列決定によって確認した。
ないクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（CAT）遺伝子を含むプラスミドpSVOATCAT（Gormanら、
Mol.Cell.Biol.２、1044、1982）に由来した。CAT遺伝
子が野生型ヒトMT−IIAプロモーター（hMT−IIA）の制
御下にある調節プラスミドであるMT−CATを、下記のよ
うにして作出した。hMT−IIAのプロモーター領域の800b
pのKsp Iフラグメント（（塩基−740〜＋60、第１図）
を単離した。平滑末端を作出した後、Hind IIIリンカー
を加えて、フラグメントをpSVOATCATのCAT遺伝子５′側
のHind III部位に挿入した。プラスミドMT−CAT−ΔＸ
を、構成性AP1−AP2を含むMT−CATのMTプロモーターか
らXma IIIフラグメント（塩基−79〜−129）を除去する
ことによって作出した。追加のGREを挿入するために、G
RE共通配列、５′BamH I部位および３′Bgl II部位を含
む一対の相補的オリゴヌクレオチドを合成して、これら
合成配列物をBamH IおよびBgl IIの存在下で自己連結す
ることによって多量体直列配列を作出した。正鎖ヌクレ
オチド配列は、上記ような配列番号１であった。次いで
単量体または多量体のGREを、平滑末端を作出した後にM
T−CAT−ΔＸベクターのSac II部位またはXma III部位
のいずれかに挿入した（第１図）。挿入されたGREの数
を、DNA配列決定によって確認した。
［実施例２］ 本実施例は追加のGREを含む発現ベクターの使用を説
明するものである。
明するものである。
本実施例に用いられる発現ベクターはSG2であって、
これは二つの追加のGREをMT−CAT−ΔＸのSac II部位に
挿入した修飾MT−IIAプロモーターを含むpSVOATCAT由来
CAT発現ベクターである（第１図）。15μｇのプラスミ
ドDNAをCHO細胞に燐酸カルシウム工程（Grahamら、197
3、Virology、52、456−467）を用いてトランスフェク
トさせた。37℃で５時間インキュベートした後、細胞を
PBS中で15％グリセロールを用いて３分間衝撃処理し
た。次いで単層細胞を異なる誘導物質（CdCl2および／
またはデキサメタゾン）とともに16時間インキュベート
して、細胞抽出物を調製した。次いでCAT活性を14C−ク
ロラムフェニコールを基質として用いて測定し、放射性
アセチル化産生物をキシレンを用いて抽出した。放射性
カウントをシンチレーションカウンター中で測定した。
これは二つの追加のGREをMT−CAT−ΔＸのSac II部位に
挿入した修飾MT−IIAプロモーターを含むpSVOATCAT由来
CAT発現ベクターである（第１図）。15μｇのプラスミ
ドDNAをCHO細胞に燐酸カルシウム工程（Grahamら、197
3、Virology、52、456−467）を用いてトランスフェク
トさせた。37℃で５時間インキュベートした後、細胞を
PBS中で15％グリセロールを用いて３分間衝撃処理し
た。次いで単層細胞を異なる誘導物質（CdCl2および／
またはデキサメタゾン）とともに16時間インキュベート
して、細胞抽出物を調製した。次いでCAT活性を14C−ク
ロラムフェニコールを基質として用いて測定し、放射性
アセチル化産生物をキシレンを用いて抽出した。放射性
カウントをシンチレーションカウンター中で測定した。
加えて、SG2ベクターを、野生型MT−IIAプロモーター
およびMMTV−LTRプロモーターをpSVOATCATプラスミドの
Hind III部位に挿入することによって構築した二つの他
のベクターと比較した。CHO細胞がグルココルチコイド
受容体を有しないことから、細胞を10μｇのグルココル
チコイド受容体発現ベクター（Giguereら、1986、Cel
l、46、645−652）で共トランスフェクトさせた。CAT発
現アッセイを各四重に行ったが、標準偏差は10％を超え
なかった。タンパク質濃度を各細胞溶解物について測定
し、CAT活性を等量のタンパク質について算出した。こ
れらの実験の結果を下記の表１に要約する。（諸表は明
細書の最後尾に付す。） 表１の結果は、金属とデキサメタゾンによるSG2プロ
モーターの共働的誘導が野生型MT−IIAおよびMMTV−LTR
プロモーターの場合よりも高レベルのCAT遺伝子発現を
もたらしたことを示している。同時に、誘導比もまた有
意に改良された。
およびMMTV−LTRプロモーターをpSVOATCATプラスミドの
Hind III部位に挿入することによって構築した二つの他
のベクターと比較した。CHO細胞がグルココルチコイド
受容体を有しないことから、細胞を10μｇのグルココル
チコイド受容体発現ベクター（Giguereら、1986、Cel
l、46、645−652）で共トランスフェクトさせた。CAT発
現アッセイを各四重に行ったが、標準偏差は10％を超え
なかった。タンパク質濃度を各細胞溶解物について測定
し、CAT活性を等量のタンパク質について算出した。こ
れらの実験の結果を下記の表１に要約する。（諸表は明
細書の最後尾に付す。） 表１の結果は、金属とデキサメタゾンによるSG2プロ
モーターの共働的誘導が野生型MT−IIAおよびMMTV−LTR
プロモーターの場合よりも高レベルのCAT遺伝子発現を
もたらしたことを示している。同時に、誘導比もまた有
意に改良された。
［実施例３］ 本実施例はさらに、追加のGREを含むベクターの使用
を説明するものである。
を説明するものである。
実施例１と同様の方法を用いて、SG2プロモーターの
活性を、グルココルチコイド受容体を発現するように作
出したVero細胞中の天然MT−IIAプロモーター（Giguere
ら、1986、Cell、46、645−652）の活性と比較した。本
実施例においては、細胞をまた、β−ガラクトシダーゼ
遺伝子がプロモーターによって制御されていてその活性
が本実験条件下で重金属またはグルココルチコイドの影
響を受けないような発現ベクターを用いて共トランスフ
ェクトさせた。トランスフェクションおよび誘導の後、
細胞抽出物の一部をβ−ガラクトシダーゼ（β−Gal）
活性の測定に用いた。この活性を、トランスフェクショ
ンの効率を考慮してCAT活性測定値を標準化するために
用いた。
活性を、グルココルチコイド受容体を発現するように作
出したVero細胞中の天然MT−IIAプロモーター（Giguere
ら、1986、Cell、46、645−652）の活性と比較した。本
実施例においては、細胞をまた、β−ガラクトシダーゼ
遺伝子がプロモーターによって制御されていてその活性
が本実験条件下で重金属またはグルココルチコイドの影
響を受けないような発現ベクターを用いて共トランスフ
ェクトさせた。トランスフェクションおよび誘導の後、
細胞抽出物の一部をβ−ガラクトシダーゼ（β−Gal）
活性の測定に用いた。この活性を、トランスフェクショ
ンの効率を考慮してCAT活性測定値を標準化するために
用いた。
得られた結果を下記の表２に示すが、これらはCHO細
胞で得られたもの（表１）と非常に相似しており、修飾
されたMT−IIA（SG2）プロモーター上でデキサメタゾン
が金属イオンと共働的に作用することを示している。
胞で得られたもの（表１）と非常に相似しており、修飾
されたMT−IIA（SG2）プロモーター上でデキサメタゾン
が金属イオンと共働的に作用することを示している。
［実施例４］ 本実施例は、発現ベクターへのさらなる修飾およびそ
れによって得られる結果を説明するものである。
れによって得られる結果を説明するものである。
第１図に示すように、追加の修飾は、hMT−IIAプロモ
ーターのSac II部位に追加数のGREおよび複数のMREを導
入し、またXma III部位に複数のGREを導入することによ
って行った。
ーターのSac II部位に追加数のGREおよび複数のMREを導
入し、またXma III部位に複数のGREを導入することによ
って行った。
得られた修飾プラスミドDNAを、Vero細胞に実施例３
と同様にして導入して、CAT遺伝子発現を上記のように
して決定した。得られる結果を下記の表３に示す。
と同様にして導入して、CAT遺伝子発現を上記のように
して決定した。得られる結果を下記の表３に示す。
［実施例５］ 本実施例は追加のGREを含む修飾MMTV−LTRプロモータ
ーの構築および使用を説明するものである。
ーの構築および使用を説明するものである。
上記の実施例と同様の工程を用いて、四つのGREを含
むがMREを全く有しないMMTV−LTRプロモーター（Majors
およびVarmus、Nature、283、253−258）のBfr I部位に
二つのMREを挿入した。表４は、非修飾MMTV−LTRプロモ
ーターはZn＋Cdによって誘導できなかったのに対して、
修飾プロモーター（BM2−MMTV）は10倍の誘導をもたら
したことを示している。BM2−MMTVがデキサメタゾン＋Z
n＋Cdによって誘導された場合には、CAT発現において２
倍の共働作用が認められた。
むがMREを全く有しないMMTV−LTRプロモーター（Majors
およびVarmus、Nature、283、253−258）のBfr I部位に
二つのMREを挿入した。表４は、非修飾MMTV−LTRプロモ
ーターはZn＋Cdによって誘導できなかったのに対して、
修飾プロモーター（BM2−MMTV）は10倍の誘導をもたら
したことを示している。BM2−MMTVがデキサメタゾン＋Z
n＋Cdによって誘導された場合には、CAT発現において２
倍の共働作用が認められた。
実施例１〜５および表１〜４に示された実験結果は、
転写の共働的活性化が、修飾hMT−IIAプロモーターにお
いては追加の誘導性配列をGREのかたちで挿入すること
によって、修飾MMTVプロモーターにおいては追加の誘導
性配列をMREのかたちで挿入することによって、それぞ
れ達成され得ることを示す。hMT−IIAプロモーターへの
GREの追加およびMMTVプロモーターへのMREの追加はレポ
ーター遺伝子発現の基底レベルを上げず、修飾プロモー
ターの誘導性および転写力はそれらの野生型対応物と比
較して有意に改良された。これに対して、hMT−IIAプロ
モーターに四つのMREのみを付加（ベクターSM4）した結
果は中位のMTプロモーター転写力改良をもたらしただけ
であり、この改良は基底発現の有意の増加を伴った。
転写の共働的活性化が、修飾hMT−IIAプロモーターにお
いては追加の誘導性配列をGREのかたちで挿入すること
によって、修飾MMTVプロモーターにおいては追加の誘導
性配列をMREのかたちで挿入することによって、それぞ
れ達成され得ることを示す。hMT−IIAプロモーターへの
GREの追加およびMMTVプロモーターへのMREの追加はレポ
ーター遺伝子発現の基底レベルを上げず、修飾プロモー
ターの誘導性および転写力はそれらの野生型対応物と比
較して有意に改良された。これに対して、hMT−IIAプロ
モーターに四つのMREのみを付加（ベクターSM4）した結
果は中位のMTプロモーター転写力改良をもたらしただけ
であり、この改良は基底発現の有意の増加を伴った。
MT−CATベクター中の非修飾hMT−IIAプロモーターは
グルココルチコイド受容体遺伝子でトランスフェクトさ
れたVero細胞においてデキサメタゾンによって誘導され
なかった。しかし、プロモーターへの少なくとも一つの
追加GREの挿入がグルココルチコイド感受性および遺伝
子発現をもたらすに十分であった。
グルココルチコイド受容体遺伝子でトランスフェクトさ
れたVero細胞においてデキサメタゾンによって誘導され
なかった。しかし、プロモーターへの少なくとも一つの
追加GREの挿入がグルココルチコイド感受性および遺伝
子発現をもたらすに十分であった。
挿入された追加GREの数および挿入部位の影響を分析
するために、実施例において一つまたはそれ以上のGRE
をMT−CAT−ΔＸのSac II部位（SG系列）またはXma III
部位（XG系列）に付加することによって二系列の修飾プ
ロモーターを作出した。全てのベクターはCdCl2および
グルココルチコイドによって誘導された。しかし、挿入
部位に関係なく、トランスフェクトされたVero細胞のCd
Cl2およびデキサメタゾンによる同時処理によって共働
的誘導性を得るには最少二つの隣接したGREが必要であ
った。
するために、実施例において一つまたはそれ以上のGRE
をMT−CAT−ΔＸのSac II部位（SG系列）またはXma III
部位（XG系列）に付加することによって二系列の修飾プ
ロモーターを作出した。全てのベクターはCdCl2および
グルココルチコイドによって誘導された。しかし、挿入
部位に関係なく、トランスフェクトされたVero細胞のCd
Cl2およびデキサメタゾンによる同時処理によって共働
的誘導性を得るには最少二つの隣接したGREが必要であ
った。
修飾hMT−IIAプロモーターについて算出した誘導比
は、野生型プロモーターに比較して６倍まで増加した。
追加GREの挿入によって遺伝子発現の基底レベルが例え
ばSG3において増加しなかったという事実はこの比の改
良において重要である。これは、本発明によって、共働
的転写活性化を異なるクラスの構成性ではなく誘導性の
配列を付加することによって起こさせる利点の一つを強
調するものである。
は、野生型プロモーターに比較して６倍まで増加した。
追加GREの挿入によって遺伝子発現の基底レベルが例え
ばSG3において増加しなかったという事実はこの比の改
良において重要である。これは、本発明によって、共働
的転写活性化を異なるクラスの構成性ではなく誘導性の
配列を付加することによって起こさせる利点の一つを強
調するものである。
開示の概要 本開示の概要において、発明者は新規のそして改良さ
れた誘導性哺乳動物発現系の工学的作出および使用、と
くに、低レベルの基底遺伝子発現を維持しながらグルコ
コルチコイドおよび金属イオンによって共働的に誘導さ
れる一つまたは数個の追加のグルココルチコイド感受性
配列を含む修飾されたヒトMT−IIAプロモーターの調製
および使用を提示する。誘導比はさらに構成性配列を除
去することによって増加させることができる。同様の方
法を、追加の金属感受性配列の挿入による改良マウス乳
ガンウイルス（MMTV）プロモーターの作出に用いてもよ
い。諸修飾が本発明の範囲内で可能である。
れた誘導性哺乳動物発現系の工学的作出および使用、と
くに、低レベルの基底遺伝子発現を維持しながらグルコ
コルチコイドおよび金属イオンによって共働的に誘導さ
れる一つまたは数個の追加のグルココルチコイド感受性
配列を含む修飾されたヒトMT−IIAプロモーターの調製
および使用を提示する。誘導比はさらに構成性配列を除
去することによって増加させることができる。同様の方
法を、追加の金属感受性配列の挿入による改良マウス乳
ガンウイルス（MMTV）プロモーターの作出に用いてもよ
い。諸修飾が本発明の範囲内で可能である。
Claims (22)
- 【請求項１】天然プロモーターに由来して、少なくとも
二つの異なるクラスの誘導性配列を含んでなる遺伝子転
写調節のための合成誘導性真核生物プロモーターであっ
て下記により特徴づけられるもの。 （ａ）該異なるクラスの誘導性配列の一つが天然誘導性
配列であり、金属感受性配列（MRE）またはグルココル
チコイド感受性配列（GRE）のいずれかである。 （ｂ）他の該異なるクラスの誘導性配列は、前記誘導性
配列がMREである場合にはGRE、前記誘導性配列がGREで
ある場合にはMREのいずれかであって前記天然プロモー
ター中に誘導性配列の多重挿入によって（by insertio
n of multiple inducible elements）導入されてい
る。 （ｃ）該異なるクラスの誘導性配列が真核生物発現系に
おいて共働的レベルの遺伝子産物の発現をもたらすよう
に選択されている。 - 【請求項２】該少なくとも一つの天然誘導性配列がMRE
であることを特徴とする請求項１に記載のプロモータ
ー。 - 【請求項３】複数の連結されたGREが天然プロモーター
にBamH IおよびBgl IIの存在下で頭尾自己連結多量体直
列配列（multimeric head−to−tail element self
−ligated）のかたちで挿入されていることを特徴とす
る請求項２に記載のプロモーター。 - 【請求項４】該挿入されているGREがGRE共通配列を含
み、ヌクレオチド配列： で表される正鎖を有する合成分子であることを特徴とす
る請求項２または３のいずれか１項に記載のプロモータ
ー。 - 【請求項５】該天然プロモーターがhMT−IIAプロモータ
ーである請求項２から４のいずれか１項に記載のプロモ
ーター。 - 【請求項６】該少なくとも一つの天然誘導性配列がホル
モン感受性配列（GRE）であることを特徴とする請求項
１に記載のプロモーター。 - 【請求項７】少なくとも二つの連結されたMREはBamH I
およびBgl IIの存在下で頭尾自己連結多量体直列配列の
かたちで天然プロモーター中に挿入されていることを特
徴とする請求項６に記載のプロモーター。 - 【請求項８】該挿入されたMREがMRE共通配列を含み、ヌ
クレオチド配列： で表される正鎖を有する合成分子であることを特徴とす
る請求項６または７のいずれか１項に記載のプロモータ
ー。 - 【請求項９】該天然プロモーターがMMTV−LTRプロモー
ターであることを特徴とする請求項６から８のいずれか
１項に記載のプロモーター。 - 【請求項１０】少なくとも一つの構成性配列を含む天然
プロモーターに由来するプロモーターであって、該少な
くとも一つの構成性配列を機能的に無能にしたことを特
徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載のプロモ
ーター。 - 【請求項１１】天然プロモーターと比較して基底遺伝子
発現レベルの低下および誘導遺伝子発現の基底遺伝子発
現に対する比の増加を十分にもたらすほどに該少なくと
も一つの構成性配列を機能的に無能にしたことを特徴と
する請求項10に記載のプロモーター。 - 【請求項１２】該少なくとも一つの構成性配列が誘導性
配列の天然プロモーターからの除去および／またはそこ
への挿入によって無能にしたことを特徴とする請求項10
または11に記載のプロモーター。 - 【請求項１３】該構成性配列からの除去および／または
そこへの挿入により無能にすることが少なくとも一つの
GREによりなされていることを特徴とする請求項12に記
載のプロモーター。 - 【請求項１４】天然hMT−IIAプロモーターの塩基−79〜
−129に位置する天然構成性配列AP1およびAP2を除去し
たことを特徴する請求項12に記載のプロモーター。 - 【請求項１５】少なくとも一つのGRE配列を天然hMT−II
AプロモーターのSac II部位（塩基−175）に挿入するこ
とによってその位置のAP2構成性配列を無能にしたこと
を特徴する請求項11に記載のプロモーター。 - 【請求項１６】該少なくとも一つのGREを天然hMT−IIA
プロモーターのSac II部位（塩基−175）およびXma III
部位（塩基−129）の少なくとも一つに挿入したことを
特徴とする請求項11に記載のプロモーター。 - 【請求項１７】二つの連結したGRE配列をXma III部位に
挿入したことを特徴とする請求項15または16に記載のプ
ロモーター。 - 【請求項１８】三つの連結したGRE配列をSac II部位に
挿入したことを特徴とする請求項15または16に記載のプ
ロモーター。 - 【請求項１９】請求項１から18のいずれか１項に記載の
合成誘導性真核生物プロモーターによって特徴づけられ
る遺伝子産物の真核生物的発現のためのベクター。 - 【請求項２０】該プロモーターを作動できるように遺伝
子に連結したことを特徴とする請求項19に記載のベクタ
ー。 - 【請求項２１】誘導された遺伝子発現を達成するための
請求項19または20に記載のベクターを含む真核細胞によ
って特徴づけられる真核生物発現系。 - 【請求項２２】該真核細胞がVero,CHO,HeLa,Rat IIおよ
び上皮細胞から選択された哺乳動物細胞であることを特
徴とする請求項21に記載の発現系。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB929206874A GB9206874D0 (en) | 1992-03-30 | 1992-03-30 | Generation of improved inducible mammalian expression vectors |
| GB9206874.1 | 1992-03-30 | ||
| PCT/CA1993/000130 WO1993020218A1 (en) | 1992-03-30 | 1993-03-30 | Synthetic eukaryotic promoters containing two inducible elements |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07501456A JPH07501456A (ja) | 1995-02-16 |
| JP2701983B2 true JP2701983B2 (ja) | 1998-01-21 |
Family
ID=10713085
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5516926A Expired - Lifetime JP2701983B2 (ja) | 1992-03-30 | 1993-03-30 | 二つの誘導性配列を含む合成真核細胞プロモーター |
Country Status (17)
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|---|---|
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| EP (1) | EP0633941B1 (ja) |
| JP (1) | JP2701983B2 (ja) |
| KR (1) | KR100208311B1 (ja) |
| AT (1) | ATE217649T1 (ja) |
| AU (1) | AU667532B2 (ja) |
| BR (1) | BR9306167A (ja) |
| CA (1) | CA2128602C (ja) |
| DE (1) | DE69331931T2 (ja) |
| DK (1) | DK0633941T3 (ja) |
| ES (1) | ES2176202T3 (ja) |
| FI (1) | FI113548B (ja) |
| GB (1) | GB9206874D0 (ja) |
| NO (1) | NO316451B1 (ja) |
| PT (1) | PT633941E (ja) |
| RU (1) | RU2128225C1 (ja) |
| WO (1) | WO1993020218A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5512483A (en) * | 1993-05-21 | 1996-04-30 | Mcgill University | Expression vectors responsive to steroid hormones |
| JPH07163368A (ja) * | 1993-12-15 | 1995-06-27 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 組換えｄｎａとその組換えｄｎａを含む形質転換体 |
| AU703445B2 (en) * | 1994-06-07 | 1999-03-25 | Stryker Corporation | Methods and compositions for modulating morphogenic protein expression |
| JP2001509395A (ja) | 1997-07-14 | 2001-07-24 | バレンティス・インコーポレーテッド | 細胞又は組織特異的な人工転写調節領域の同定方法 |
| WO1999019471A1 (en) | 1997-10-16 | 1999-04-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Models and treatments for cardiac hypertrophy in relation with nf-at3 function |
| FR2772786A1 (fr) * | 1997-12-18 | 1999-06-25 | Inst Nat Sante Rech Med | Sequences nucleotidiques chevauchantes, et leur utilisation dans le cadre de la detection de xenohormones ainsi que dans des compositions pharmaceutiques |
| NZ513595A (en) * | 1999-02-19 | 2001-09-28 | Octagene Gmbh | Hormone-hormone receptor complexes and nucleic acid constructs and their use in gene therapy |
| US8008459B2 (en) * | 2001-01-25 | 2011-08-30 | Evolva Sa | Concatemers of differentially expressed multiple genes |
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| US7951532B2 (en) | 2003-11-12 | 2011-05-31 | Children's Hospital Medical Center | Method of screening a midkine modulating agent |
| KR100647490B1 (ko) * | 2004-10-04 | 2006-11-23 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 저산소 조건 및 다른 스트레스에 특이적으로 반응할 수있는 키메라 인핸서 요소를 포함하는 벡터, 상기 벡터를포함하는 약제학적 조성물 및 상기 조성물을 이용하는 방법 |
| CA2623106C (en) | 2005-09-19 | 2013-12-24 | Histogenics Corporation | Cell-support matrix having narrowly defined uniformly vertically and non-randomly organized porosity and pore density and a method for preparation thereof |
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| RU2370280C2 (ru) * | 2007-10-08 | 2009-10-20 | Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского | СПОСОБ СУПЕРПРОДУКЦИИ В РАСТЕНИИ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ОНКОГЕНА HER2/neu |
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| EP2571991A1 (en) | 2010-05-20 | 2013-03-27 | Evolva SA | Method of producing isoprenoid compounds in yeast |
| US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
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-
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