JP2002537311A - ホルモン−ホルモン受容体の複合体および核酸構築物、並びに遺伝子治療におけるそれらの使用 - Google Patents

ホルモン−ホルモン受容体の複合体および核酸構築物、並びに遺伝子治療におけるそれらの使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも１つのホルモン応答配列およびトランシジーンを含有する核酸構築物の、遺伝子転移のための薬物の製造における使用に関する。本発明は更に、少なくとも１つのホルモン応答配列およびトランスジーンを含有する、核酸構築物に関する。ここで、該少なくとも１つのホルモン応答配列の１つはトランスジーン、該核酸構築物を含有するベクターおよび該核酸を含有する物質の組成物とは機能的には結合しない。ここで、該ホルモン応答配列はホルモン−ホルモン受容体の複合体と結合する。本発明の核酸構築物、プラスミドおよび本発明の物質を含有する組成物は遺伝子治療（特に、血友病などのヒトの血液凝固障害の処置）において使用される。それらはまた、標的遺伝子を上方調節するか、または下方調節するのに使用したり、ワクチンの運搬のために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、少なくとも１つのホルモン応答配列（ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｐｏ
ｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）およびトランスジーンを含有する核酸構築物の、
遺伝子転移のための薬物の製造における使用に関する。更に、少なくとも１つの
ホルモン応答配列およびトランスジーン（ここで該少なくとも１つのホルモン応
答配列の１つは、トランスジーンと機能的に結合していない）、該核酸構築物を
含有するベクターおよび該核酸構築物を含有する物質の組成物（ここで、該構築
物のホルモン応答配列は、ホルモン−ホルモン受容体の複合体と結合する）を含
む、核酸構築物に関する。本発明の核酸構築物、プラスミドおよび物質の組成物
を、遺伝子治療、特にヒトの血液凝固障害（例えば、血友病）の処置において用
いる。それらはまた、標的遺伝子を上方に調節したり、または下方に調節するの
に使用することができ、またワクチンの運搬に使用することができる。
【０００２】 （背景技術） 遺伝子治療は多数の疾患および障害に対して大いに有望な方法である。通常、
そのことは、遺伝的欠損を有するタンパク質を置き換えるためであったり、また
は病気の病理学的な進行を妨げるために、組換え遺伝子またはトランスジーンを
体細胞中に転移することに関する。原理的には、遺伝子治療は単純な方法である
。実際には、多数の欠点をなお克服しなければいけない。
【０００３】 遺伝子治療における研究は、患者の細胞にＤＮＡを最も効果的に取りこむ方法
に集中している。ウイルスベクターが、臨床的な遺伝子治療の試みにおいて現在
広く使用されているビヒクルである。遺伝子発現の効能の点では、ウイルス運搬
システムは、ＤＮＡ−脂質製剤を用いる技術よりも、または機械的な方法（例え
ば、遺伝子銃）よりも大きな欠点を有する。遺伝子の治療方法を調べた様々なウ
イルスシステムが存在するが、レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベ
クターが現在最も広く使用されているビヒクルである（Ｓａｌｍｏｎｓ，Ｂおよ
びＧｕｎｚｂｕｒｇ、Ｗ．Ｈ．によるＨｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４巻、１
２９，１９９３；Ｋａｓａｈａｒａ，Ｎ．Ａ．らによるＳｃｉｅｎｃｅ，２６６
巻，１３７３、１９９４；Ａｌｉ，Ｍ．らによるＧｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１巻，
３７６、１９９４）。未だ、これらのシステムは大きな欠点（例えば、潜在的な
ウイルスの混入）を有している。他の安全性に関する懸念が、これらウイルスシ
ステムを用いる遺伝子治療における臨床的な利用の発展を妨害し続けている。例
えば、組換えレトロウイルスは、ランダムな染色体の組込みという欠点を有し、
このためにオンコジーンの活性化、または腫瘍−サプレッサー遺伝子の失活を引
き起こし得る。また、組換えアデノイウルスの反復使用は深刻な免疫学上の問題
を引き起こす（Ｅｌｋｏｎ，Ｋ．Ｂ．らによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．，９４巻、９８１４，１９９７）。ホルモンへの応答により、アデノウイ
ルスタンパ質に対する抗体が産生され、これにより二次感染が防止される。免疫
抑制性の薬物はこれらの効果を改善し得るが、それらは患者に別の負担を与える
（Ｄａｉ，Ｙ．らによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９２巻、１４
０１，１９９５）。
【０００４】 更なる別のウイルス運搬システムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に関する
。ＡＡＶは関連しないヘルパーウイルスとの同時感染を要する。組換えＡＡＶビ
リオンは、宿主細胞中にいくつかの小さな遺伝子配列を導入するのに有用である
ことは分かっているが、これらの粒子を基礎とする遺伝子運搬システムは、比較
的小さいサイズのＡＡＶ粒子に限られる。この特徴により、適当な遺伝子プロト
コールの範囲は大きく減少する。その上、ヘルパーウイルスの使用の要求は、こ
の運搬システムに複雑な要因を加える（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｎ．，によるＣｕｒ
ｒ．Ｔｏｐ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｍｏｌ．，１５８巻、９７、１
９９２）。
【０００５】 より安全であるが、非ウイルス性の遺伝子治療の研究も満足されていない。遺
伝子運搬の効率が悪いことまたは発現の持続性が乏しいことという問題が主な欠
点である。それら適用可能な方法（例えば、細胞コンパートメントへのＤＮＡの
直接的な導入、またはＤＮＡとカチオン性の脂質もしくはポリリシンとの混合物
の利用）により、トランスジーンは細胞膜をより容易に通過することができるが
、未だにそれらの方法はこれらの障害を克服していない（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．
らによる、Ｐｒｏｃ．ＮＡｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻、７４１３
、１９８７；Ｂｅｈｒ，Ｊ．−ＰによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，５巻、３８１，１９９４）。
【０００６】 裸のＤＮＡ（ポリヌクレオチド）配列を（アンチセンスＤＮＡ配列を含む）を
脊椎動物に導入することは、組織（例えば、筋肉、脳または皮膚）に注入するこ
とによって、または血液循環に導入することによって達成されると報告されてい
る（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．等によるＳｃｉｅｎｃｅ，２４７巻，１９９０；Ｌｉ
ｎ，Ｈ．等によるＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８２巻，２２１７，１９９０；Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚ，Ｂ．等によるＧｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３巻，４０５，１９９６）
。また、哺乳動物への直接的な遺伝子転移は、リポソームに被包されたＤＮＡ、
および受容体タンパク質を含有するタンパクリポソームに包括されたＤＮＡの製
剤として報告されている。注入された裸ＤＮＡはトランスジーンの発現を引き起
こすが、その効率はウイルスを基礎とするＤＮＡ運搬システムの効率とははるか
に及ぶものでない。裸ＤＮＡ注入法の限界は、トランスジーンの発現が用量に依
存するという事実である。該遺伝の発現は飽和性であり、注入したＤＮＡの量が
増加すると、プラスミド当りのタンパク質の産生量が減少する。従って、注入し
たＤＮＡの量がある閾値を超えると、タンパク質の発現は劇的に減少し得る。
【０００７】 当業者がこれら先行技術の方法を用いて克服しようとする遺伝的な障害の１つ
は、血液凝固障害に関する障害（特に、血友病）（Ｌｏｚｉｅｒ，Ｊ．Ｎ．およ
びＢｒｉｎｈｏｕｓ，Ｋ．Ｍ．によるＪＡＭＡ，２７１巻，１９９４；Ｈｏｅｂ
ｅｎ，Ｒ．Ｃ．によるＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２３巻，２７，１９９５）であ
る。例えば、血友病ＡおよびＢはＸ−結合しており、それぞれ凝固因子ＶＩＩＩ
およびＩＸの欠損によって生じる劣勢の血液障害である（Ｓａｄｌｅｒ，Ｊ．Ｅ
．等によるｉｎ:Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ
Ｄｉｅｓｅｓ，５７５，１９８７）。血友病の発生率は、５，０００男性の出
生につき約１である。血友病患者は創傷部位での凝固を欠いているために、過剰
量の出血を患っている。十分に凝固することが不能であることにより、関節およ
び内部組織の損害を生じ、並びに切断が適当な処置となる危険性がある。
【０００８】 血友病Ａの処置は、血液凝固因子ＶＩＩＩを投与することによって可能である
。最近まで、因子ＶＩＩＩ製剤は、ドナーからの血液を濃縮することによって製
造しなければならず、感染性の物質（例えば、ＨＩＶおよび肝炎）による混入の
危険性があった。因子ＶＩＩＩについての遺伝子はクローニングされており（例
えば、ＶｅｈａｒらによるＮａｔｕｒｅ，３１２巻、３３７，１９８４）、組換
え産物を製造することが可能である。組換え法は血液濃縮物よりも高い純度の因
子ＶＩＩＩを与えるが、患者への因子ＶＩＩＩの外来的な供給は、不便であり、
高価な液剤を患者の生涯にわたって繰り返して投与することをなお要する。
【０００９】 他の形態の血友病としては血友病Ｂを含み、これは因子ＩＸをコード化した遺
伝子の欠失によって生じる。上記の遺伝子治療システムは、それぞれ因子ＶＩＩ
ＩおよびＩＸを用いた血友病ＡおよびＢの処置について試みている（例えば、Ｗ
Ｏ９４／２９４７１を参照）。しかしながら、これらのシステムは、既に上述す
る欠点を有している。
【００１０】 一方、ホルモンの作用に関する従来のモデルは、ホルモンと細胞内受容体（こ
れは、細胞質または核に存在する）との結合という相互作用の概念を基礎とする
（Ｅｖａｎｓ，Ｒ．によるＳｃｉｅｎｃｅ，２４０巻、８８９、１９８８）。こ
れらの細胞内受容体はそれらの標的ホルモンに曝露されるまで、潜伏性のままで
ある。曝露されると、ホルモンと結合した後、ホルモン受容体は立体配置が変化
し、活性化形態で細胞核に輸送され（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅ）、そこでホルモ
ン調節遺伝子のプロモーター領域中のホルモン応答配列に二量体として結合する
（Ｂｅａｔｏ，Ｍ．，によるＣｅｌｌ、５６巻、３３５、１９８９；Ｏ’Ｍａｌ
ｌｅｙ，Ｂ．らによるＢｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４６巻、１６３、１９９２）
。ホルモン応答配列は、特定のホルモン誘発遺伝子の５’フランキングの領域に
通常は位置するエンハンサー因子であり、すなわち特定のホルモン誘発遺伝子と
機能的に結合する。ホルモン応答配列および目的のタンパク質をコード化した核
酸配列を含有するＤＮＡ構築物については、米国特許第5,688,677号および5,580
,722号に開示されており、目的のタンパク質の発現に適当であると教示されてい
る。
【００１１】 それら細胞内受容体の１例はステロイド受容体である。ステロイド受容体は、
独自の分子構造を特徴とするリガンド依存性の転写因子のスーパーファミリーの
一員である。その中央に位置する保存性の高いＤＮＡ結合ドメインは、このスー
パーファミリーを定義している。第２の重要であり、且つ比較的に不変な領域は
、ＣＯＯＨ−末端リガンド結合ドメインである。該受容体の例としては、ステロ
イドプロゲステロンによって媒介されるプロゲステロン受容体である。プロゲス
テロン受容体の場合には、プロゲステロンは天然の作用物質として作用し、一方
でそのものは分子レベルおよび全身レベルの両方で、強い抗ミネラルコルチコイ
ド性質を示す。子宮に及ぼす従来の効果に加えて、抗てんかん薬、不安緩解薬、
睡眠薬および麻酔薬の性質は、多数の研究によればプロゲステロンに帰されてい
る。
【００１２】 変異体ホルモン受容体（変異体ステロイド受容体を含む）の遺伝子治療におけ
る使用方法が提案されている。例えば、該方法はＷＯ９３／２３４３１、ＷＯ９
８／１８９２５、ＷＯ９６／４０９１１に開示されている。その上、ＷＯ９８／
３３９０３は、組織特異的遺伝子に由来のステロイド応答配列、コード配列およ
びＳＶ４０エンハンサーを含有する遺伝子構築物について開示している。
【００１３】 （本発明の簡単な記載） 本発明の目的は、従来の遺伝子治療運搬システムの欠点を克服することである
。ホルモン−ホルモン受容体の複合体が１つ以上のホルモン応答配列を有する核
酸構築物を、細胞膜を通って細胞にまで運ぶ（ｄｒａｇ）能力を有することを見
出した。該構築物がホルモン応答配列以外の機能的な配列（以下、「トランスジ
ーン」と呼ぶ」）を更に含むならば、該機能的な配列はそれらの機能を発揮する
ことも見出した。ホルモン応答配列は、トランシジーンの発現をも増大し得る。
その上、ステロイドホルモンは、核酸構築物を細胞膜から細胞にまで輸送する非
常に効果的なメディエーターであることを見出した。従って、本発明は、 （１）少なくとも１つのホルモン応答配列（これは、以下「ＨＲＥ」と呼ぶ）
およびトランスジーンを含有する核酸構築物の、遺伝子転移のための薬物の製造
における使用（ここで、該少なくとも１つのＨＲＥはトランスジーンと機能的に
結合しているか、またしていない）； （２）薬物がホルモン−ホルモン受容体の複合体を更に含む、上記（１）の好
ましい実施態様； （３）少なくとも１つのＨＲＥおよびトランスジーンを含有する核酸構築物（
ここで、該少なくとも１つのＨＲＥのうちの１つはトランスジーンと機能的に結
合しない）； （４）上記（３）の核酸構築物を含有するベクター； （５）上記（３）に定義する核酸構築物または上記（４）に定義するベクター
を含有する、形質転換した細胞またはトランスジェニックな生物； （６）上記（３）に定義する少なくとも１つのＨＲＥおよびトランスジーンを
含有する核酸構築物を含有する物質の組成物（該少なくとも１つのＨＲＥはホル
モン−ホルモン受容体の複合体と結合している）； （７）トランスジーンは血液凝固因子をコード化した遺伝子である、上記（６
）の好ましい実施態様； （８）血液凝固因子は因子ＩＸである、上記（７）の好ましい実施態様； （９）血液凝固因子は因子ＶＩＩＩである、上記（７）の好ましい実施態様； （１０）上記（３）で定義する核酸構築物および／または上記（６）〜（９）
で定義する物質の組成物を含有する、医薬組成物； （１１）上記（６）に定義する物質の組成物の製造法であって、該方法は核酸
構築物をホルモン受容体およびホルモンと混合すること含む方法； （１２）上記（１）および（２）に定義する薬物または上記（６）〜（９）に
定義する物質の組成物を、生物または細胞系に投与することを含む、遺伝子転移
の方法； （１３）生物の細胞または細胞系の細胞中で発現させるべきトランスジーンを
コード化した核酸を生物または細胞系に運搬する方法であって、該方法は上記（
１）に定義する薬物、または上記（６）〜（９）に定義する物質の組成物を生物
または細胞系に投与し、その結果、組成物中のホルモンは細胞膜と相互作用し、
該相互作用により、ホルモン−ホルモン受容体の複合体と結合する核酸を膜を横
切って細胞に分散し、且つ輸送することが増大する方法； （１４）血液凝固障害の処置法であって、該方法は上記（７）に定義する物質
の組成物の治療学的に有効な量を、生物または細胞系に投与することを含む方法
； （１５）血友病Ｂの処置法であって、該方法は上記（８）に定義する物質の組
成物の治療学的に有効な量を、生物または細胞系に投与することを含む方法； （１６）血友病Ａの処置法であって、該方法は上記（９）に定義する物質の組
成物の治療学的に有効な量を、生物または細胞系に投与することを含む方法； （１７）遺伝子転移のための薬物の製造におけるステロイドホルモンの使用； （１８）遺伝子治療のための方法であって、該方法は核酸構築物を生物または
細胞系に投与することを含み、ここで該核酸構築物はトランスジーンを含有し、
ステロイドホルモン中に被包される方法 を提供する。
【００１４】 上記（１）〜（１６）の好ましい実施態様において、ホルモン応答配列はステ
ロイド応答配列（ＳＲＥ）であり、プロゲステロン応答配列（ＰＲＥ）が最も好
ましい。（２）および（６）〜（１６）の実施態様において、受容体はステロイ
ド受容体が好ましく、プロゲステロン受容体が最も好ましい。同様に、ホルモン
はステロイドが好ましく、プロゲステロンが最も好ましい。
【００１５】 従って、本発明は先行技術の欠点を克服する遺伝子治療のための運搬システム
を提供する。トランスジーンを有する、核酸上のホルモン応答配列が存在するこ
とにより、ホルモン−ホルモン受容体の複合体の結合が促進される。従って、本
発明はトランスジーンを有する核酸と、細胞膜と相互作用することが知られてい
るホルモンとの間の結合物（ｌｉｎｋ）（または結合している化合物）として、
活性化ホルモン受容体を使用する。ＨＲＥによって媒介される通常に知られる生
物学的な活性は、本発明において使用する主な効果ではないが、トランスジーン
の調節を望む場合には、付加的な効果となり得る。一般的な原理を図１に示す。
ホルモン応答配列は、核酸の二量体配列または核酸の多量体配列として存在する
ことが好ましい。逆配向の場合でも、該ホルモン応答配列はその適当な機能を発
揮するであろう。ホルモン−ホルモン受容体の複合体はホルモン受容体を含み、
このものはその特異的なホルモンと結合した後に活性化される。活性化状態にあ
るホルモン受容体は、その特異的なホルモン応答配列を認識し、且つそれと結合
することができ、本発明におけるその配列は目的のトランスジーン（例えば、ヒ
ト血液凝固因子）を含有する核酸中に存在する。
【００１６】 ワクチン処置は、上記（１２）の実施態様の別態様である。抗原の遺伝子を含
んだり、ウイルス配列を含有する本発明の物質の核酸構築物または組成物を上記
の方法を用いて細胞中に導入すること（ＤＮＡワクチン）は、細胞による免疫応
答を刺激する方法をも提供し得る。
【００１７】 （発明の詳細な記載） １．定義 「核酸」とは、ＤＮＡ，ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｒＲＮＡを意味する
。核酸は、直鎖状、環状、２本鎖または１本鎖であり得る。
【００１８】 「核酸構築物」とは、互いに関連する核酸要素の組み合わせを意味する。目的
の遺伝子を転写することができ、望むならば目的のタンパク質を発現することが
できる配向で、該構築物中の核酸要素をベクター中に取り込むことができる。
【００１９】 「トランスジーン」とは、転写活性である機能的な核酸の配列（調節配列を有
しまたは有しない）を意味する。
【００２０】 「遺伝子転移」とは「遺伝子治療」を含む。
【００２１】 「ホルモン応答配列（ＨＲＥ）」とは、ホルモンによる活性化に応答する遺伝
子の転写を調節する、核酸（特に、ＤＮＡ）の領域を意味する。ＨＲＥは典型的
に、約１０〜４０ヌクレオチド鎖であり、より通常は約１３〜２０ヌクレオチド
鎖である。上で説明する通り、ホルモンがそれに対応する細胞内受容体と結合し
た場合、ＨＲＥは活性化され、立体配置を変化させ、その結果、該受容体はＨＲ
Ｅに対する親和性が増大し、ＨＲＥと結合する。ＨＲＥは次に、転写を刺激する
。「ステロイド応答配列（ＳＲＥ）」とは、ステロイドによる活性化に応答して
、遺伝子の転写を調節するＨＲＥである。「プロゲステロン応答配列（ＰＲＥ）
」とは、プロゲステロンによる活性化に応答して、遺伝子の転写を調節するＨＲ
Ｅ／ＳＲＥである。
【００２２】 「ホルモン受容体」とは、ホルモンと結合し、且つホルモンによって活性化さ
れる受容体を意味する。「ステロイド受容体」とは、ステロイドホルモンと結合
し、且つステロイドホルモンによって活性化される受容体を意味する。「プロゲ
ステロン受容体」とは、ステロイドホルモンであるプロゲステロンと結合し、且
つプロゲステロンによって活性化される受容体を意味する。
【００２３】 「機能的に連結した」とは、ＨＲＥ（またはＳＲＥ／またはＰＲＥ）がトラン
スジーンの転写を刺激することができるようにそれら構築物中に位置している核
酸構築物の立体配置を意味する。「機能的に連結していない」とは、ＨＲＥがト
ランスジーンから非常に離れて位置しているので、その転写を刺激することがで
きない立体配置を意味する。
【００２４】 「遺伝子」とは、ポリペプチドをコード化したＤＮＡ配列を意味し、このもの
は場合によりリーダー配列、トレーラー配列、イントロンおよびエキソンを含む
。
【００２５】 「ベクター」とは、適当なコントロール因子（ｅｌｅｍｅｎｔ）と一緒になっ
て複製することができたり、遺伝子配列を細胞間で転移させることができるよう
な、いずれかの遺伝子的な構築物（例えば、プラスミド、ファージ、コスミドな
ど）を意味する。該用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクルを含む。
【００２６】 「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合する、遺伝子の転写のコン
トロールのための調節ＤＮＡ配列の領域を意味する。プロモーターは、転写活性
を開始し、駆動するＲＮＡポリメラーゼと一緒に開始複合体を形成する。「エン
ハンサー」はその複合体を活性化することができ、「サイレンサー」はその複合
体を阻害することができる。「組織特異的なプロモータ−」とは、特異的な組織
中で発現する遺伝子の転写のための該組織中のＤＮＡに存在するプロモーターで
ある。
【００２７】 「生物」とは、多細胞生体（ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｉｖｉｎｇ ｅ
ｎｔｉｔｙ）を意味し、脊椎動物（例えば、哺乳動物であり、特にヒト、ウシ、
げっ歯類、イヌである）および無脊椎動物を含む。
【００２８】 「細胞系」とは、細胞培養物を含み、例えば一次細胞培養物（特に、再移植に
適当な細胞培養物）、幹細胞、血液細胞、組織試料、全器官、および不死化した
細胞培養物を含む。
【００２９】 本発明の産物の「治療学的に有効な量」とは、治療または予防に有効な用量を
意味し、例えば血友病の症状の有効な治療または予防を与える用量を意味する。
それは、標的タンパク質のレベルを測定することによって決定される、標的遺伝
子の発現を測定可能に活性化する用量であるか、またはインビトロもしくはイン
ビボのデータから推定することによって治療もしくは予防に有効であると予想で
きる用量を意味する。治療学的に有効な用量の決定は、当業者にとっての常識の
範囲内である。
【００３０】 「コード化する」または「コード化した」とは、適当な調節配列のコントロー
ル下に置いた場合に、インビボまたはインビトロでポリペプチドに転写されたり
（ＤＮＡの場合）、または翻訳された（ｍＲＮＡの場合）核酸の性質を意味する
。
【００３１】 本実施の目的のために、「発現する」「発現した」または「発現」は、タン
パク質をコード化した遺伝子の転写および翻訳を意味する。
【００３２】 ２．詳細な記載および詳細な例 上で記載の通り、本発明の目的は、遺伝子治療のための新規で且つ改善された
運搬システムを提供することである。従って、本発明は少なくとも１つのＨＲＥ
およびトランスジーンを含有する核酸構築物を提供することである。ここで、該
少なくとも１つのＨＲＥの１つはトランスジーンおよび該核酸構築物を含有する
物質の組成物と機能的には結合せず、また該少なくとも１つのＨＲＥはホルモン
−ホルモン受容体の複合体と結合する（上で定義する実施態様（３）および６）
）。本発明の核酸構築物および本発明の物質の組成物の好ましい実施態様は、ホ
ルモン応答配列がステロイド応答配列（ＳＲＥ）であり、受容体がステロイド受
容体である実施態様である。ホルモン応答配列がプロゲステロン応答配列（ＰＲ
Ｅ）であり、受容体がプロゲステロン受容体である実施態様最も好ましい。
【００３３】 本発明において使用の可能性があるＨＲＥは既に記載されている。例えば、Ｇ
ＲＥ（Ｓｃｈｅｉｄｅｒｉｔ，Ｃ．等によるＮａｔｕｒｅ，３０４巻，７４９，
１９８３；Ａｈｅ，Ｄ．等によるＰｒｏｃ．ＮＡｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８３巻，２８１７，１９８６）、ＥＲＥもしくはＰＲＥ（Ｃｈａｍｂｏｎ，
Ｐ等によるＲｅｃ．Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．，４０巻，１，１９８４；Ｋ
ｌｏｃｋ，Ｇ．等によるＮａｔｕｒｅ，３２９巻，７３４，１９８７）である。
既に上記の通り、本発明の最も好ましいＨＲＥはＰＲＥである。具体的には、好
ましいＰＲＥは実施例１に記載されており、すなわち配列番号３および４を含む
２本鎖ＤＮＡである。本発明で使用する核酸は、少なくとも１つのホルモン応答
配列を含む。１つ以上のＨＲＥを含有する核酸が好ましい。例えば、核酸は３〜
１０個（３〜５個が好ましい）のＨＲＥを含むことができる。最も好ましい実施
態様は、３〜５個のＰＲＥを含有する核酸である。
【００３４】 本発明において使用の可能性があるホルモン受容体は、例えばエステロゲン受
容体、ミネラルコルチコイド受容体、糖質コルチコイド受容体、レチン酸受容体
、アンドロゲン、カルシトリオール、甲状腺ホルモン受容体、プロゲステロン受
容体およびオーファン受容体である。それら受容体については既に記載されてい
る（Ｇｒｅｅｎ，Ｓ．等によるＮａｔｕｒｅ，３２０巻，１３４，１９８６；Ｇ
ｒｅｅｎ，Ｇ．Ｌ．等によるＳｃｉｅｎｃｅ，２３１巻，１１５０，１９８６；
Ａｒｒｚａ，Ｊ．Ｌ．等によるＳｃｉｅｎｃｅ，２３７巻，２６８，１９８７；
Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．等によるＮａｔｕｒｅ，３１８巻，６３５，１
９８５；Ｐｅｔｋｏｖｉｔｈ，Ｍ．等によるＮａｔｕｒｅ，３３０巻，４４４，
１９８７；Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．等によるＮａｔｕｒｅ，３３０巻，６２４，１
９８７；Ｔｉｌｌｅｙ，Ｗ．等によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８６巻，３２７，１９８９；Ｂａｋｅｒ，Ａ．Ｒ．等によるＰｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５巻，３２９４，１９８８；Ｗｅｉｎ
ｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．等によるＮａｔｕｒｅ，３２４巻，６４１，１９８６；Ｓａ
ｐ．ｊ．等によるＮａｔｕｒｅ，３２４巻，６４１，１９８６；Ｍｉｓｒａｉ，
Ｍ．等によるＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４
３巻，７４０，１９８７；Ｋａｓｔｎｅｒ，Ｐ．等によるＣｅｌｌ，８３巻，８
５９，１９９５）。これらの受容体はヒトまたは他の哺乳動物源からのものであ
るが、ヒトが好ましい。ヒトステロイド受容体のヌクレオチド配列および／また
はアミノ酸配列は、遺伝子バンクで入手することができる。ミネラルコルチコイ
ド受容体としてはＭ１６８０１であり；糖質コルチコイド受容体αとしてはＭ１
０９０１であり；糖質コルチコイド受容体α２としてはＵ０１３５１であり；糖
質コルチコイド受容体βとしてはＭ１１０５０であり；レチン酸受容体αとして
はＡＦ０８８８８８（エキソン１）、ＡＦ０８８８８９（エキソン２）、ＡＦ０
８８８９０（エキソン３）、ＡＦ０８８８９１（エキソン４）、ＡＦ０８８８９
２（エキソンおよび６）、ＡＦ０８８８９３（エキソン７）、ＡＦ０８８８９４
（エキソン８）およびＡＦ０８８８９５（エキソン９および完全ｃＤＮＡ）であ
り；レチン酸受容体γとしてはＭ２４８５７であり；アンドロゲン受容体として
はＭ２７４２３（エキソン１）、Ｍ２７４２４（エキソン２）、Ｍ２７４２５（
エキソン３）、Ｍ２７４２６（エキソン４）、Ｍ２７４２７（エキソン５）、Ｍ
２７４２８（エキソン６）、Ｍ２７４２９（エキソン７）およびＭ２７４３０（
エキソン８）であり；甲状腺ホルモン受容体α１としてはＭ２４７４８であり；
甲状腺ホルモン受容体α２としてはＪ０３２３９であり；プロゲステロン受容体
としてはＡＦ０１６３８１であり；ソマトトロピン受容体としてはＪ００１４８
であり；ビタミンＤ受容体（カルシトリオール受容体）としてはＪ０３２５８で
ある。
【００３５】 当業者は、受容体タンパク質の発現が通常の方法によって達成することができ
ると理解するであろう。ここで、該通常の方法とは、例えばｃＤＮＡライブラリ
ーからの公知のｃＤＮＡのＰＣＲ−クローニング、および適当な宿主細胞（例え
ば、ＣＯＳ細胞）中での適当な発現ベクター（例えば、本発明のベクター）の対
応するタンパク質の過剰発現である。従って、続くサイトゾル画分の精製は、通
常の方法（例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる精製）によって達
成することができる。この目的のために、目的の受容体に対する多数の適当な抗
体を商業的に入手することができる。例えば、マウスプロゲステロン受容体に対
するポリクローナル抗体（このものは、ヒトタンパク質との十分に高い交差反応
性を有する）をＤｉａｎｏｖａ（ハンブルグ、独国）から入手することができる
。同様に、更なる精製は、標準的な方法（例えば、イオン交換クロマトグラフィ
ーおよび／またはＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィー法）によって達成するこ
とができる。
【００３６】 最も好ましい受容体はプロゲステロン受容体である。該受容体はヒトプロゲス
テロン受容体であることが好ましい。該ヒトプロゲステロン受容体（Ｔ４７Ｄヒ
ト乳癌細胞に由来）については、米国特許第4,742,000号に開示されており、こ
の受容体を発現する細胞は寄託されている（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＴＢ，１３３）
。既に上記の通り、受容体に特異的な抗体を用いて、サイトゾル由来のそれら受
容体を精製することは日常的であろう。加えて、米国特許第4,742,000号では、
特定のステロイドアフィニティー樹脂を用いて、ヒトプロゲステロン受容体の精
製法について開示している（例えば、ＧｒａｎｄｉｃｓらによるＥｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ、１１０巻、１０８８、１９８２）。
【００３７】 簡単に言えば、Ｔ４７細胞のサイトゾル画分を、プロゲステロン受容体と選択
的に結合するＳｔｅｒｏｇｅｌ（これは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）２Ｂ
に結合しているデオキシコルチコステロンの商品である）を通す。ローディング
緩衝液で洗浄した後、結合した受容体を、プロゲステロンを含有する緩衝液を用
いて溶出する。次いで、該溶出されたステロイド−受容体複合体を、ＤＥＡＥ−
バイオゲルでクロマトグラフィーし、０．２Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液を用
いて徐々に溶出させる。引き続いて、該結合したプロゲステロンを容易に交換す
ることができる。上記の通り、更なる精製は、当業者にとってよく知られている
通常の方法によって達成することができる。
【００３８】 別法については、実施例５に開示する。ｈＰＲポリペプチドの構造は図１６に
示す。ｈＰＲポリペプチドは別個の構造ドメインを含む。天然には、ヒトプロゲ
ステロン受容体（ｈＰＲ）は、２つの異なる大きさのタンパク質（これらは、ｈ
ＰＲ−Ｂ（１２０キロダルトン）およびｈＰＲ−Ａ（９４キロダルトン）と呼ば
れる）として発現する。ＨＰＲ−Ａは、切断されている以外はｈＰＲ−Ｂと同一
の形態であり、すなわち１６５位のＮ−末端アミノ酸がない（図２０の、配列番
号１８を参照）。両方の形態は、プロゲステロンとの結合性、またはＤＮＡとの
結合性という性質の点では区別できないようである。ヒト細胞において、ｈＰＲ
のＡ形およびＢ形は、同一のＲＮＡ転写物中の２つの異なるＡＵＧ開始部位で別
々に翻訳を開始することによって、同一の遺伝子から製造することができる。以
前に報告されている通り、ｈＰＲ−Ａおよび−Ｂ形を、生物学的に十分に活性な
ポリペプチドとして、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）
細胞中で発現させることができる（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等によるＭｏｌ．Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５，１７５５ｆｆ（１９９１）；Ｅｌｌｉｓｔｏｎ等によ
るＪＢＣ２６７，５１９３−５１９８（１９９２））
【００３９】 図１６に示すｈＰＲポリペチドのカルボキシ末端は、プロゲステロン結合ドメ
イン（ＰＢＤ）を含むが、熱性ショックタンパク質との会合および受容体の二量
化に関与する配列をも含む。ヒンジ領域は、ＤＮＡ−結合ドメイン（ＤＢＤ）と
ＰＢＤとの間のフレキシブルな結合部分を与えるが、受容体の二量化並びに核局
在化のための要素を含むとも考えられている。ｈＰＲと染色体ＤＮＡ上でのそれ
に対応する標的部位（ＰＲＥ、ピロゲステロン応答配列）との結合は、ＤＢＤに
よって媒介されることが知られている。残りのＮ−末端トランス−活性化ドメイ
ン（ＴＡＤ）は、転写遺伝子活性化因子としてｈＰＲのインビボ機能に特異的な
領域からなる。
【００４０】 Ｎ−末端はプロゲストステロンとの結合後、ｈＰＲのホモ二量化に直接的に寄
与するように考えられてもいるが、１つだけのヒンジ領域およびＰＢＤを含有す
るフラグメントはプロゲステロン依存性のｈＰＲ−ｈＰＲ−相互作用を媒介する
ための最小のＣ−末端フラグメントであることが示されている（Ｔｅｔｅｌらに
よる、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１，１１１４ｆｆ．（１９９７））。
遺伝子工学的に操作されたｈＰＲポリペプチド（このものは、ＴＡＤ（１〜５５
６のアミノ酸）を部分的に、または完全に欠落している）は、プロゲステロンの
存在下で、構造的に安定で、十分に可溶性である二量体として発現し得ると考え
られている。該切断されたｈＰＲとの複合体（但し、該切断されたｈＰＲはＤＮ
Ａとの結合活性、並びにプロゲステロンとの活性を示す）は上記の組換えｈＰＲ
−ＡまたはｈＰＲ−Ｂタンパク質の完全鎖形態との複合体と機能的におきかえる
ことができる。その理由は、プラスミドＤＮＡとプロゲステロンとの接触をなお
媒介するからである。従って、本発明の実施態様（２）および（６）〜（１６）
におけるｈＰＲは、配列番号１８に示す天然のｈＰＲの５５７〜９３３位の核酸
を含有するＰＲであることが好ましい。
【００４１】 それらｈＰＲの切断された型の有効な発現は、バキュロウイルス系中で可能で
あるが、他の真核生物（例えば、培養した哺乳動物の細胞または酵母菌の細胞）
中でも可能である。その上、大腸菌の過剰発現菌株は、これらのペプチドの産生
が可能な系である。この場合には、それら切断されたｈＰＲ体と適当なポリペプ
チド配列（例えば、ヒスチジン含有配列またはＧＳＴ（グルタチオンＳトランス
フェラーゼ）タンパク質）との融合は、不溶であるという問題を克服するのに、
並びに発現したタンパク質の単離および精製を促進するのに役立ち得る。
【００４２】 これら受容体の変異体およびそれらの誘導体（これらは、受容体がリガンドと
結合するという機能をなお保持しており、その結果、ＤＮＡを活性し、結合し、
転写を調節する）をも本発明で使用することができる。該誘導体としては、化学
的な誘導体、変異体、キメラ、ハイブリッド、アナログまたは融合体であり得る
。
【００４３】 本発明の遺伝子転移システムの第３番目の成分はホルモンである。実施態様（
２）における薬物中および、実施態様（６）における物質の組成物中のホルモン
としては合成または天然のホルモンを含み、ステロイドホルモン（例えば、エス
トロゲン、テストステロン、糖質コルチコイド、アンドロゲン、甲状腺ホルモン
およびプロゲステロン、またはそれらの誘導体）が好ましい。これらは広く用い
ることができる。プロゲステロンが最も好ましい。例えば、天然の微粉化したプ
ロゲステロンは好ましいプロゲステロンであり、これはＵＴＲＯＧＥＳＴＡＮ（
登録商標）で１９０８年以来、仏国で市販されており、ＵＴＲＯＧＥＳＴ（登録
商標）で現在もなお独国で入手することができる。その性質は、内因性プロゲス
テロンの性質と同じである。特に、抗エストロゲン、ゲスタゲン、わずかに抗ア
ンドロゲンおよび抗ミネラルコルチコイド性を有する。それら市販物中の天然の
微粉化したプロゲステロンは以下に記載の通り、マトリックス中に分散される。
【００４４】 上記の微粉化したプロゲステロンは、遺伝子または核酸構築物についての、標
的遺伝子への適当な担体となり得るという利点を有する。具体的には、油の長鎖
の脂肪酸残基中で微粉化し、且つ懸濁化するという２つの工程の相乗効果により
、プロゲステロンの吸収は増大する。ＵＴＲＯＧＥＳＴＡＮ（登録商標）（１０
０ｍｇ）を経口投与した後、プロゲステロンの血漿中レベルのピークが、ほとん
どの場合に１〜４時間後に得られた（Ｐａｄｗｉｃｋ，Ｍ．Ｌ．らによるＦｅｒ
ｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．，４６巻、４０２，１９８６）。その後、該レベルは１
２時間時には更に上昇するが、該レベルは実質的には減衰した。８４時間後でさ
えも、該レベルはベースラインよりもわずかに高かった。米国の速度研究は、経
口用の微粉化したプロゲステロンのバイオアベイラビリティーを示す初期の研究
を調べた。それらは、２時間でピーク効果を示し、続いて血漿中プロゲステロン
レベルが急速に低下した（Ｓｉｍｏｎ,Ｊ．Ａ．らによる、Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔ
ｅｒｉｌ．，６０巻、２６，１９９３）。
【００４５】 担体として、プロゲステロンを用いる更なる利点は、不都合な副作用が低レベ
ルであることである。経口投与したプロゲステロンは、血漿中脂質（Ｊｅｎｓｅ
ｎ，Ｊ．等によるＡｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，１５６巻，６６
，１９８７）に対しても、炭水化物の代謝（Ｍｏｓｎｉｅｒ−Ｐｕｄａｒ，Ｈ．
等によるＡｒｃｈ．Ｍａｌ．Ｃｏｅｕｒ，８４巻，１１１１，１９９１）に対し
ても有害な影響を及ぼす。更に、プロゲステロンは１日用量が２００ｍおよび３
００ｍｇの場合には、腎臓の酵素（ＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ、ＡＦＯＳ）、６つのホ
ルモンが結合したグロブリン（ＳＨＢＧ）合成、またはＨＤＬ−コレステロール
レベルには影響を及ぼさない。デオキシコルチコステロンの血漿中レベルは、Ｕ
ＲＴＲＯＧＥＳＴＡＮ（登録商標）での処置の間に実質的に増加し得るが、この
プロゲステロン代謝物のミネラルコルチコイド効果が、プロゲステロン自身の反
ミネラルコルチコイド効果によって完全に相殺されるということを強く示唆し得
る。このことは、比較研究（Ｃｏｒｖｏｌ，Ｐ．らによるＩｎ：Ｐｒｏｇｓｔｅ
ｒｏｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｓｔｉｎｓ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１７９，１９８３）から明白である。該比較研究では、経口ＵＲＴＲ
ＯＧＥＳＴＡＮ（登録商標）は９−α−フルオロヒドロコルチソンのミネラルコ
ルチコイド効果に拮抗する。
【００４６】 本発明の実施態様（２）の薬物および実施態様（６）の物質の組成物において
、核酸構築物中のＨＲＥ（または、ＳＲＥ／またはＰＲＥ）とホルモン受容体と
のモル比は１：１〜１：１０であり、１：２〜１：５がより好ましい。一方、ホ
ルモンとホルモン受容体とのモル比は少なくとも１０００：１であることが好ま
しく、少なくとも１００００：１であることがより好ましい。従って、ホルモン
はホルモン受容体およびＨＲＥに対して大過剰に存在する。このことはホルモン
が核酸構築物を細胞膜を通って転移させる能力の観点から望ましい。
【００４７】 当業者は、遺伝子治療の目的で、実施態様（１）および（２）の薬物および実
施態様（１０）の医薬組成物が、核酸を細胞中に導入する際に補助することがで
きる他の成分（マトリックス化合物）を含むことができる。具体的には、該薬物
および該組成物、特にそれらのホルモン成分は、以下のマトリックス化合物：グ
ルコースおよびその関連化合物（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール
）；可溶化のための補助剤（例えば、エタノールなどのアルコール）；多水酸基
化合物（例えば、グリセリン、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレング
リコール）；非イオン性界面活性化合物、イオン性界面活性化合物（例えば、レ
シチン）；油状化合物（例えば、ゴマ油、ピーナッツ油、大豆油、コーン油など
）；デンプンおよびそれらの誘導体（例えば、シクロデキストリンおよびヒドロ
キシアルキル化デンプン）；安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）；保存剤（
例えば、ベンジルアルコールおよびフェノール）などを含み得る。好ましいマト
リックスはβ−シクロデキストリン、グリセリン、レシチンおよび／またはコー
ン油を含む。例えば、本発明のホルモン−ホルモン受容体の核酸複合体の医薬組
成物は、ゼラチンカプセル剤としてヒトまたは動物に経口的に与えることができ
る。それらにおけるプロゲステロン（微粉形態が好ましい）は、５０〜１０００
ｍｇ（２００〜３００ｍｇが好ましい）を、レシチンと一緒に、３５％もしくは
４０％のβ−シクロデキストリン溶液中に、またはコーン油もしくはグリセリン
中に溶解する濃度で与えることができる。
【００４８】 あるいは、適当なマトリックス成分を選択することで、医薬組成物が糊状の、
ゲル様形態となるならば、それを局所的に与えることができる。
【００４９】 既に上記したトランスジーンおよびＨＲＥ、ＳＲＥまたはＰＲＥとは別に、本
発明の実施態様（１）〜（１６）の核酸構築物は、更にプロモーター配列、エン
ハンサー配列および／またはサイレンサー配列を含み得る。該プロモーターは、
遍在性であったり、または組織特異的であり得る。遍在性プロモーターとしては
、ＣＭＶプロモーターが最も好ましい。しかしながら、組織特異的プロモーター
は遍在性プロモーターよりも好ましい。例えば、本発明で構想する組織特異的プ
ロモーターとしては、α１−アンチトリプシン（更なるプロモーター）を含む。
【００５０】 核酸構築物は別の配列（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）を更に含み得る。
当業者によって知られる他のレポーター配列（例えば、緑色蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））をも含み得る。エンハンサー配列として
は、ＳＶ４０イントロンおよびＳＶ４０ポリＡが最も好ましい。核酸構築物は、
誘導性プロモーター（例えば、糖質コルチコイドによって誘導され得るＭＭＴＶ
（マウス乳癌ウイルス）プロモーターおよびエクジソン誘導性の昆虫プロモータ
ー）を更に含み得る。
【００５１】 好ましい核酸構築物は、５'末端から３'末端に順に、ＰＲＥ、ＣＭＶプロモー
ター、関心のある遺伝子、ＳＶ４０イントロンおよびＳＶ４０ポリＡエンハンサ
ー配列およびアンピシリン耐性遺伝子を含む。更にＰＲＥは、ベクター骨格上で
均一に分布する。
【００５２】 核酸構築物は、複製配列の起点（特に、複製配列の真核起点）、遺伝子を標的
とする要素、組込み配列（例えば、ＡＡＶ−ＩＴＲ、トランスポゾンＩＳ）、３
'−ＵＴＲ、「スイッチ」システム（例えば、ＴＥＴシステム、Ｃｒｅ／ｌｏｘ
ＰまたはＦｌｐ／ｆｔｒシステム）を更に含み得る。
【００５３】 トランスジーンは、様々な遺伝的障害を欠いたタンパク質、またはホルモンに
対する不適当な応答に関連する病気（例えば、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌および
精巣癌などのホルモン依存性の癌）に関与するタンパク質をコード化したトラン
スジーンから選択することができる。該トランスジーンを、遺伝的障害（例えば
、血友病、フォンウィルブランド病および嚢胞性線維症）などを引き起こす欠陥
遺伝子を置き換えるのに使用することができる。該トランスジーンは、それらの
遺伝子または融合産物をコード化した遺伝子の変異体を含む。本発明の核酸構築
物は、１つ以上のトランスジーンを含有し得る。
【００５４】 特に、トランスジーンは、血液凝固因子（ヒト血液凝固因子が好ましい）につ
いての遺伝子と置き換えることができる。因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＶをコード
化した遺伝子（図２の配列番号２に示し、これらはそれぞれ血友病ＡおよびＢに
関与する）は本発明にとってよい候補である。他の候補としては、フォンウィル
ブランド因子、因子ＩＶ、因子ＸまたはプロテインＣをコード化した遺伝子を含
む。
【００５５】 他の有用なトランスジーンとしては、例えばホルモン遺伝子（例えば、インス
リン、甲状腺ホルモン、黄体形成ホルモン放出因子（ＬＨＲＨ）、αおよびβ精
液インヒビンおよびヒト成長ホルモンをコード化した遺伝子）；ホルモン受容体
遺伝子（例えば、糖質コルチコイド受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロ
ン受容体、レチン酸受容体をコード化した遺伝子）；血管内皮成長因子（ＶＥＧ
Ｆ）、神経成長因子、上皮成長因子）；酵素遺伝子；サイトカインまたはリンフ
ォカイン（例えば、インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
（ＧＭ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ
）およびエリスロピエチン（ＥＰＯ））をコード化した遺伝子；阻害性物質（例
えば、α１−アンチトリプシン）をコード化した遺伝子；薬物として機能する物
質をコード化した遺伝子（例えば、ジフテリア毒素およびコレラ毒素、ヒマ毒液
の因子またはコブラ毒液の因子をコード化した遺伝子）を含むが、これらに限定
しない。また、アンチセンス配列を、遺伝物質として投与することができる。
【００５６】 本発明の別の態様は、本発明の実施態様（３）の核酸構築物を含有するベクタ
ーである。これらのベクターを、本発明の実施態様（６）の組成物質中で使用す
ることができる。しかしながら、本発明で使用する核酸配列は直鎖状よりも環状
であることが好ましい。該ベクターは、核酸構築物中で、核酸を一時的にであっ
たり、または永久的に（エピソーム的を含む）発現することができる。上記の通
り、それら核酸構築物は更に別の要素を含むことができる。
【００５７】 本発明の実施態様（６）の物質の組成物は、核酸構築物をホルモン受容体やホ
ルモンと混合することによって製造することができる。核酸構築物の水溶液を、
ホルモンを含有する油状の懸濁液に周囲温度で撹拌しながら加えることが好まし
い。
【００５８】 本発明の実施態様は、これらのベクターおよび／または核酸構築物を含有し、
トランスフェクトされるか、または形質転換された細胞もしくはトランスジェニ
ックな生物に関する。本発明の範囲内において、トランスフェクトされた細胞と
は、外来性のＤＮＡを取りこまれたＤＮＡである。トランシフェクションの方法
としては、例えばマイクロインジェクション、ＣａＰＯ４による沈降、エレクト
ロポレーション、リポソーム融合または遺伝子銃を含み得る。
【００５９】 形質転換とは、遺伝子物質（例えば、本発明のベクターまたは核酸構築物）を
細胞中に導入し、細胞が特定の遺伝子産物を発現したり、さもなければその発現
を改変するように該細胞を一時的に、もしくは永久に改変することを意味する。
形質転換はインビボまたはインビトロで達成することができるが、インビボでの
形質転換が好ましい。
【００６０】 本発明の更なる態様は、本発明の核酸構築物およびホルモンの治療学的に有効
な用量を含有する医薬組成物である。上記の通り、ホルモンはステロイドが好ま
しく、プロゲステロンが最も好ましい。用量は、処置する病気、患者の特性、お
よび達成しようとする結果に依存する。用量を決定することは、当業者にとって
常識の範囲内である。
【００６１】 本発明の医薬組成物（或いは、物質の組成物、核酸構築物またはベクター）は
、経口、静脈内、筋肉内、皮下、粘膜を通して局所的に（例えば、頬側スプレー
、鼻腔スプレーを含む）、または遺伝子銃によって投与することができる。経口
投与（微粉化したホルモン分散物）が好ましい。運搬は全身的にであったり、ま
たは特定の組織を目指すことができる。
【００６２】 本発明は、細胞中で血液凝固因子を発現するために、目的の遺伝子（例えば、
ヒト血液凝固因子）をコード化した核酸構築物を細胞中に導入する方法を含む。
本方法においては、ヒト血液凝固因子をコード化した核酸を、少なくとも１つの
ホルモン応答配列（ＨＲＥ）（プロゲステロン応答配列が好ましい）を含有する
核酸構築物と組み合わせる。
【００６３】 ホルモン−ホルモン受容体の複合体と結合した核酸と過剰量のホルモン（プロ
ゲステロンが好ましい）との混合物は、当業者にとって知られる様々な方法また
は上記の方法によって、該核酸を細胞中に導入するのに使用される。細胞の取り
こみは、ホルモンと細胞膜との相互作用によって刺激されるであろう。ホルモン
またはステロイドは、膜の摂動によってだけではなく、または特定のホルモンも
しくはステロイドに感受性である膜受容体の活性化によって、細胞膜の脂質二重
層と相互作用する。このことは、プロゲステロンまたは他のステロイドの場合に
ついて立証されている。最後に述べるが決して軽んじられないこととして、ホル
モンが分散によって細胞膜を通過することができることが知られている。本発明
において、ホルモン−ホルモン受容体の複合体に結合している核酸は、分散また
は取りこみのプロセスの間に、膜を通って運搬される。
【００６４】 本発明の別の態様は、本発明の物質の組成物の治療学的に有効な量を生物に投
与することによって、血液凝固障害を処置する方法である。本方法は、既に記載
の投与および用量に関する考察を含む。
【００６５】 本発明の実施態様（１７）および（１８）は、遺伝子治療および／または遺伝
子転移のための薬物の製造におけるステロイドホルモンの使用、および遺伝子治
療および／または遺伝子転移の方法に関係し、該方法は核酸構築物を生物または
細胞系に投与することを含む。ここで、核酸構築物はトランスジーンを含んだり
、ステロイドホルモンに被包される。適当なステロイドホルモンについては以下
に列挙する。本発明のこれら実施態様において好ましいステロイドホルモンは、
天然の微粉化したステロイドホルモン（特に、天然の微粉化したプロゲステロン
）である。好ましい態様において、該微粉化したホルモンを以下に記載する通り
、親油性のマトリックス中に溶解したり、分散する。
【００６６】 本発明の技術的な態様を例示する目的で、実験を行なった。これらの実験につ
いては、以下の実施例１〜９に記載する。当業者は、本発明がこれらの実施例に
限定されないことを容易に認めるであろう。
【００６７】 実施例 実施例１：ベクターの構築ベクターｐＴＧＦＧ１の製造 ベクターｐＵＣ１９（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）をＸｂａＩを用いて消化
し、クレノー酵素を用いて消化し、再びライゲートした。次いで、該ＸｂａＩが
欠失したベクターを、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、クレノー酵素を用いて処理し
、ＥｃｏＲＩ部位を欠失させるために再びライゲートさせた。このベクターのＳ
ａｃＩ部位にＸｂａＩ部位を挿入するために、ＳａｃＩを用いて消化し、Ｔ４−
ポリメラーゼを用いて処理し、アルカリ性ホスファターゼを用いて脱リン酸し、
ＸｂａＩ−リンカーＣＴＣＴＡＧＡＧ（Ｂｉｏｌａｂｓ １０３２番）を用いて
ライゲートした。新たに製造したベクターを、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、
クレノーを用いて処理し、アルカリ性ホスファターゼを用いて脱リン酸し、Ｘｂ
ａＩ−リンカーＣＴＣＴＡＧＡＧ（Ｂｉｏｌａｂｓ １０３２番）を用いてライ
ゲートすることによって、別のＸｂａＩ−部位を挿入した。このベクターを、ｐ
ＵＣ１９／Ｘと命名した。
【００６８】 ベクターｐｈＧＦＰ−Ｓ６５Ｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＸｂａＩ−部
位を破壊するために、このベクターをＸｂａＩを用いて消化し、クレノー酵素を
用いて処理し、再びライゲートして、ベクターｐＧＦＰ／０を得た。ｐＧＦＰ／
０をＭｌｕＩを用いて消化し、クレノー酵素を用いて処理し、ＢａｍＨＩを用い
て消化後に、２．３ｋｂフラグメントを含有するＧＦＰ遺伝子を単離した。この
フラグメントをベクターｐＵＣ１９／Ｘの多重クローニング部位に挿入し、この
ものをＳａｌＩを用いて消化し、クレノー酵素を用いて処理し、ＢａｍＨＩを用
いて処理した。得られたベクターを、ｐＴＧＦＧ１と命名した（図２）。
【００６９】 このベクターを出発として、表１に記載の全てのベクターを得た。ＰｓｔＩ、
ＫｐｎＩ、ＥｈｅＩ、ＥｃｏＯ１０９および／またはＳａｐＩについての制限部
位で、ＰＲＥを挿入して、ＧＦＰ遺伝子および５個までのＰＲＥを有するプラス
ミドを得た。ＧＦＰ遺伝子をＦＩＸ遺伝子と交換することによって、一連のＦＩ
Ｘ発現プラスミドを得た。ＧＦＰ遺伝子を切除することによって、トランスジー
ンを有しないクローニングベクターを得た。
【００７０】インサートＰＲＥ（ｄｓ）の製造 オリゴヌクレオチド（Ｍｅｔａｂｉｏｎ）
【化１】 をハイブリダイズし、キナーゼによる反応によってリン酸化して、インサートＰ
ＲＥ（ｄｓ）を得た。
【００７１】ベクターｐＴＧＦＧ５の製造 ベクターｐＴＧＦＧ１をＥｃｏＯ１０９Ｉを用いて消化し、クレノー酵素を用
いて処理し、アルカリ性ホスファターゼを用いて脱リン酸した。次いで、そのも
のをＰＲＥ（ｄｓ）インサートを用いてライゲートしてベクターｐＴＧＦＧ５（
図３）（すなわち、図２のＣ位にＰＲＥを運搬するベクター）を得た。
【００７２】ベクターｐＴＧＦＧ２０の製造 ベクターｐＴＧＦＧ１をＫｐｎＩを用いて消化し、Ｔ４−ポリメラーゼを用い
て処理し、アルカリ性ホスファターゼを用いて脱リン酸した。次いで、ＰＲＥ（
ｄｓ）インサートを用いてライゲートし、ベクターｐＴＧＦＧ７を得た。このベ
クターｐＴＧＦＧ７をＰｓｔＩを用いて消化し、Ｔ４−ポリメラーゼを用いて処
理し、アルカリ性ホスファターゼを用いて脱リン酸した。次いで、ＰＲＥ（ｄｓ
）インサートを用いてライゲートして、ベクターｐＴＧＦＧ１１を得た。引き続
いて、ｐＴＧＦＧ１１をＥｃｏＯ１０９Ｉを用いて消化し、クレノー酵素を用い
て処理し、アルカリ性ホスファターゼを用いて脱リン酸した。次いで、ＰＲＥ（
ｄｓ）インサートを用いてライゲートして、ベクターｐＴＧＦＧ２０（図４）を
得た。このベクターは図２のＡ、ＢおよびＤ位にＰＲＥを有する。
【００７３】ベクターｐＴＧＦＧ３３の製造 同様な方法で、ベクターｐＴＧＦＧ１中のＰｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＥｈｅＩ、Ｅ
ｃｏＯ１０９およびＳａｐＩについての制限部位にＰＲＥ（ｄｓ）を挿入して、
ピラスミドｐＴＧＦＧ３３を得た（図５）。ここで、該ベクターはＡ、Ｂ、Ｃ、
ＤおよびＥの各位置にＧＦＰ遺伝子および５つのＰＲＥを有するベクターである
（図２）。
【００７４】ベクターｐＴＧＦＧ３６、ｐＴＧＦＧ５３およびｐＴＧＦＧ６４の製造 ベクターｐＵＣ１９（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）をＳａｌＩを用いて消化
し、クレノー酵素を用いて処理し、アルカリ性ホスファターゼを用いて脱リン酸
した。そのものをＮｏｔＩ−リンカーＧＣＧＧＣＣＧＣ（バイオマス １０４５
番）にライゲートして、ベクターｐＵＣ１９／Ｎを得た。
【００７５】 ヒト凝固因子ＩＸのオープンリーディングフレームを含有する１．４ｋｂフラ
グメント（これは、ヒトｃＤＮＡライブラリーから単離する、実施例２を参照）
をベクターｐＵＣ１９／ＮのＰｓｔＩ−位置に挿入し、このものをＰｓｔＩを用
いて消化し、Ｔ４−ポリメラーゼを用いて処理し、アルカリ性ホスファターゼを
用いて脱リン酸した。得られたベクターｐＵＣ１９／Ｎ−ＦＩＸから、ヒト凝固
因子ＩＸのオープンリーディングフレームを含有する１．４ｋｂフラグメントを
、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いる二重消化によって切徐した。このフラ
グメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩによって二重消化したベクターｐＴ
ＧＦＧ５の４．３ｋｂフラグメントにライゲートして、図６に示すベクターｐＴ
ＧＦＧ３６を得た。このベクターは、細胞中への因子ＩＸの運搬に好ましいベク
ターであり、そのＤＮＡ配列を図９に示す（配列番号１）。
【００７６】 同様な方法で、プラスミドｐＴＧＦＧ２０およびｐＴＧＦＧ３３中のＧＦＰ遺
伝子をＦＩＸ遺伝子で交換することによって、プラスミドｐＴＧＦＧ５３および
ｐＴＧＦＧ６４（図７および図８に示す）を得た。
【００７７】インサートＡＬＬＧ（ｄｓ）の製造 オリゴヌクレオチド（Ｍｅｔａｂｉｏｎ）
【化２】 をハイブリダイズし、キナーゼによる反応によってリン酸化して、インサートＡ
ＬＬＧ（ｄｓ）を得た。他のトランスジーンの導入が可能となるような多重クロ
ーニング部位を有する配列を選択する（ｃｈｏｉｃｅ）ベクターに導入するため
に、インサートＡＬＬＧ（ｄｓ）を構築した。
【００７８】 表１は、様々な位置に異なるトランスジーンおよび異なる数のＰＲＥを有する
、利用可能なベクターの概観を示す。ＰＲＥの位置については図２に従って示す
。下線で示したベクターについては、マップを示す（図３〜８）。
【表１】
【表２】
【００７９】 ｐＴＧＦＧ３６、ｐＴＧＦＧ５３、ｐＴＧＦＧ６４、ｐＴＧＦＧ６７、ｐＴＧ
ＦＧ８２およびｐＴＧＦＧ９５のＤＮＡ配列については、それぞれ配列番号１お
よび１３〜１７を参照。
【００８０】 実施例２：ヒト因子ＩＸｃＤＮＡの単離 因子ＩＸオープンリーディングフレームの開始コドンおよび終結コドンに重な
る２つのプライマーを用いて、ヒト腎臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、因
子ＩＸｃＤＮＡを増幅させて、完全なオープンリーディングフレームを含有する
１３８７ｂｐのフラグメントを得た。クローニングを促進するために、ＥｃｏＲ
Ｉ（上流）およびＢａｍＨＩ（下流）の制限部位を各プライマーの末端に含めた
。５０ｍＬの反応容量（これは、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨが８．８５、２
５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの(ＮＨ４)２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む）中で
、３０インキュベーションサイクル（９６℃で１分、６０℃で１分、７２℃で２
分、最後に７２℃で１０分という長い工程）で、Ｐｗｏポリメラーゼ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、増幅を行なった。
【００８１】 反応産物を、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にライゲート
し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ−５ａ中に形質転換した。正のクローンを選択した。配
列は、標識化したプライマー（ＩＲ−７００）を用いた両末端からのサイクルシ
ークエンシング（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、およびＬｉＣｏｒシークエンシングシス
テム（ＭＷＧ、Ｂｉｏｔｅｃｈ）による自動分析によって、配列を確認した。
【００８２】 以下のプライマー：
【化３】 を使用した。
【００８３】 実施例３：マーカータンパク質ＧＦＰの発現および定量化 方法１： ヒーラ細胞を、プラスミドｐＴＧＦＧ５またはｐＴＧＦＧ２０を用いたエレク
トロポレーションによってトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を
収集し、該細胞ペレットをホモジナイズし、緩衝液（これは、リン酸で緩衝化し
たサリン（ｐＨ７．５）および１０ｍＭのＰＭＳＦを含有する）中に溶解した。
細胞ホモジナート中での緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の濃度を、競合的なＥＬ
ＩＳＡ法によって決定した。
【００８４】 この目的のために、ＧＦＰをマイクロタイタープレート上で、一定の濃度でコ
ーティングした。次いで、ＧＦＰ試料を反ＧＦＰ抗体の存在下で加えた。数回洗
浄した後、第１の抗体をトレースするために、標識した第２の抗体を加えた。比
色反応を、側光的に（吸光度）測定した。一般に、より多くのＧＦＰを加えると
、該コーティングしたＧＦＰと結合する抗体は減少した。従って、吸光度の低下
は、試料中のＧＦＰの高濃度に対応する。
【００８５】 ＧＦＰ濃度の曲線は、参照物質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いる
直線回帰式（図１１）によって決定した。ｐＴＧＦＧ５（１ＰＲＥ）の場合には
２．４ｍｇ ＧＦＰ／ｍＬ、およびｐＴＧＦＧ２０（３ＰＲＥ）の場合には５．
２ｍｇ ＧＦＰ／ｍＬという平均値が得られた。
【００８６】 図１２ａ−ｄは、それぞれ、ｐＴＧＦＧ５（図１２ａおよびｂ）およびｐＴＧ
ＦＧ２０（図１２ｃおよびｄ）を用いてトランスフェクトしたヒーラ細胞培養物
の顕微鏡写真を示す。図１２ａおよびｃは、コントロールとしての光学顕微鏡写
真を示し、図１２ｂおよびｄは、蛍光方法でのそれに対応する細胞パッチを示す
。通常は、ＧＦＰを発現した細胞の５０％より多くは非常に効率的なトランシフ
ェクションを示し、１つだけのＰＲＥが存在することにより、より効率的な発現
を示す。
【００８７】 方法２： ｐＴＧＦＧ５、２０および３３を用いたリン酸カルシウム法を用いて、Ｔ細胞
をトランスフェクトし、蛍光を蛍光計（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、吸光４８５ｎｍ
、発光５２０ｎｍ）を用いて検出した。ニセトランスフェクションの場合には、
非−ＧＦＰ発現ＤＮＡを使用した。バックグラウンドは、空のプレート（９６ウ
ェルプレート、Ｄｙｎｅｘ、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４）の蛍光を示す。その結果を図
１３にまとめる。全く１個のＰＲＥを有するベクター（ｐＴＧＦＧ５）は、再び
最も高い発現を示す。
【００８８】 実施例４：ＥＬＩＳＡアッセイによるヒト因子ＩＸの定量化 ヒーラ細胞を、プラスミドｐＴＧＦＧ３６、ｐＴＧＦＧ５３およびｐＴＧＦＧ
６４を用いた、エレクトロポレーションまたはリポソーム試薬ＤＯＴＡＰ（Ｂｏ
ｅｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いることによってトランスフェクトし
た。これらのプラスミドは、ヒト凝固因子ＩＸのｃＤＮＡを含む。組換えヒト因
子ＩＸは細胞培養物の上清に分泌され、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡ法を用いて定
量化した。
【００８９】 ヒト因子ＩＸの分解を防止するために、０．１１Ｍ クエン酸ナトリウムおよ
び１０ｍＭ ＰＭＳＦを加えた。発現したヒト凝固因子ＩＸの濃度を決定するた
めに、酵素−免疫学的なインビトロアッセイ「Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ ＩＸ：
ＡＧ」（Ｂｏｅｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用した。因子ＩＸ標準（
Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ ＡＧ）を、標準物質として２８ＩＵ／ｍＬの水溶液中で
使用した。
【００９０】 ６つの異なるトランスフェクション実験（ここで、ヒーラ細胞を、因子ＩＸ−
ｃＤＮＡを含有するプラスミド（ｐＴＧＦＧ３６、５３および６４）と一緒に、
エレクトロポレーションまたは脂質−トランスフェクション試薬（ＤＯＴＡＰ、
Ｂｏｅｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてトランスフェクトした）では
、ヒト凝固因子ＩＸの濃度範囲は３〜２５ｎｇ／ｍＬに達した。
【００９１】 実施例５：ｈＰＲ（Ａ体）の製造および精製１．ヒトプロゲステロン受容体のクローニング クローニングは以下の通り行なった。全ヒトＲＮＡを、グアニジン塩酸緩衝液
の細胞溶解液またはＣｓＣｌ−比重遠心分離を用いて、ヒト白血球または肝臓細
胞から単離した。
【００９２】 ｈＰＲコード配列のクローニングのために、ｈＰＲ特異的ｃＤＮＡを製造し、
２つのフラグメント中のｈＰＲコード配列をＰＣＲによって増幅するのに使用し
た。
【００９３】 以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、公知のｍＲＮＡ配列（遺伝子バンク
：ＮＭ ０００９２６およびＸ５１７３０）に基づいて選択した。用いたオリゴ
ヌクレオチドは、ＭＷＧ、ＥｂｅｒｓｂｅｒｇまたはＭｅｔａｂｉｏｎ，Ｍｕｎ
ｃｈｅｎから得た。使用した全てのプライマーを５'から３'に並べた。ここで、
制限部位に導入するのに使用した塩基を大文字で示し、クローニングに使用した
制限部位を下線で示した。
【化４】
【００９４】 ｃＤＮＡの合成は、全ＲＮＡ（３μｇ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆
転写酵素トランスクリプターゼ（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）と共に３'−プライマー
（２００ｐｍｏｌ）を用いて行なった。反応容量は５０μＬとし、緩衝液を推奨
されている通りに使用し、ＲＮアーゼインヒビターおよび１０ｍＭ ＤＴＴおよ
び１ｍＭ ｄＮＴＰｓを補足した。酵素を加える前に、試料を８０℃で１０分間
、続いて７２℃で１０分間、４２℃で１０間加熱した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ
ＩＩ ＲＴを４２℃で加え、反応を４２℃で１５分間、５０℃で１５分間および
５８℃で１時間行なった。
【００９５】 この合成反応液から得られたｃＤＮＡを、２つのフラグメントでのｈＰＧＲコ
ード配列をＰＣＲによって増幅するのに使用した。１フラグメント（５'）は５'
−プライマーおよび内部プライマー２を有し、１フラグメント（３’）は３'プ
ライマーおよび内部プライマー１を有する。反応液（５０μＬ）の構成は、Ｐｗ
ｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、緩衝液（これは、Ｒ
ｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによって供給され、ＤＭＳＯを補足している
）、各プライマー（５０ｐｍｏｌ）および０．２ｍＭ ｄＮＰＴｓとした。反応
条件は、９６℃で１０分間、続いて３５サイクル（９６℃で１分、５９℃で２分
、７２℃で２分および最終的に７２℃で１０分という長い工程）とした。
【００９６】 ＰＣＲ産物をゲル電気泳動によって精製し、ＳａＩを用いて消化した。プライ
マー中に導入されたＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位は使用せず、ｈＰＲコ
ード配列中の２つの内部制限部位で切断されるのを避けた。両方のフラグメント
を、ＥｃｏＲＶを用いて該ベクターに平滑末端連結により、および内部Ｓａｌ
Ｉ部位により粘着末端連結を切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ベクター
中にライゲートとした。適当なインサートを含有するベクターを、ミニプレップ
、制限消化および配列決定によって同定した。得られたベクターを、ｐＴＧｈＰ
Ｒ１と示す。
【００９７】２．ｈＰＲ（Ａ−体）の製造 最初に、３'−ＵＴＲを含むｈＰＲ−Ｂについての遺伝子を、ｐＴＧｈ ＰＲ
１から切断し、発現プラスミドｐＦＡＳＴＢＡＣ ＨＴｃ（ＢＡＣ−ｔｏ−ＢＡ
Ｃ バキュロウイルス発現システム、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の
多重クローニング部位にインフレームでクローニングした。このことにより、以
下に示す通り、ウイルスポリヒドリンの発現コントロール下で、ｈＰＲ−ＢのＮ
−末端のヒスチジン標識形の発現カセットを得た。ｒＴＥＶプロテアーゼ解裂部
位は、６個のヒスチジン残基およびｈＰＲ−Ｂリーディングフレームの内部メチ
オニン間に位置する。このために、発現タンパク質からヒスチジン残基の除去が
可能となる。発現カセットのＮ−末端領域を以下に示す。
【化５】 アミノ酸を１文字コードで示す。ｒＴＥＶプロテアーゼの制限部位を＊＊で示
す。
【００９８】 切断されたｈＰＲ−Ａ体についての発現カセットを得るために、ｈＰＲ−Ｂ体
のＭｅｔ １およびＭｅｔ １６５間でのアミノ酸をコード化したＤＮＡ配列を
、ＰＣＲに基づく方法を用いて除去した。２つのプライマー対を設計したが、こ
れらはそれぞれｈＰＲ−Ｂ遺伝子の開始ＡＵＧの下流にあるＤＮＡフラグメント
、またはＭｅｔ１６５をコード化したＡＵＧの上流にあるＤＮＡ−フラグメント
を増幅することが可能である。次のＰＣＲ法において、これら２つのＤＮＡフラ
グメントをそれらのホモローガスな３'−末端で互いにアニーリングし、最外側
の増幅プライマーを用いて増幅した。得られたＤＮＡ−フラグメントを、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＭｌｕＩによって消化し、該切断産物をｐＦＡＳＴＢＡＣ ＨＴｃベ
クターのｈＰＲ−Ｂ発現カセットの対応するフラグメントと交換した。そのこと
によって、ｈＰＲ−Ａポリペプチド（９４ｋＤＡ）のＮ−末端ヒスチジン標識形
をコード化したリーディングフレームを回復させた。
【００９９】 この６×Ｈｉｓ−標識を、ＴＡＬＯＮ（登録商標）樹脂を用いて固定化コバル
ト（２＋）アフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質をアフィニテ
ィー精製するのに使用した。ＢｏｏｎｙｒａｔａｎａｋｏｒｎｋｉｔらによるＭ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８，４４７１（１９９８）の方法による製法は、
以下の通りである（全工程を０〜８０℃で行なった）。
【０１００】 Ｓｆ９細胞を、血清のないＳＦ９００媒地の単層培養で培養した。細胞のウイ
ルス感染は、感染多重度（ＭＯＩ）が５〜８で行なった。
【０１０１】 ｈＰＲ発現カセットを含有するバキュロウイルスを用いた感染の４８時間後に
、収集を行ない、緩衝液Ａ（これは、２０ｍＭ トリス−Ｃｌ、ｐＨ ８．０，
３５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、５％ グリセロール、プロテ
イナーゼインヒビターのカクテル（Ｃｏｍｐｌｔｅｔｅ（登録商標）、ＥＤＴＡ
なし、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、独国）を含有
する）中で機械的に溶解した。１０分間遠心分離（１００００×ｇ）後、１０８ 細胞から得られた上清を、緩衝液Ａ中で平衡化させた沈降したＴＡＬＯＮ（登録
商標）樹脂（０．５ｍＬ）と一緒に１時間インキュベートした。ＴＡＬＯＮ（登
録商標）を２０倍容量の緩衝液Ａを用いて洗浄した。ｈＰＲ−Ａを、１０倍容量
の緩衝液ＶＢ（これは、緩衝液Ａの全ての成分を含有するが、１００ｍＭのイミ
ダゾールである）を用いて溶出した。該溶出液を５０倍に濃縮し、分子排除サイ
ズが１０キロダルトンの遠心限外ろ過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−２０
ＰＬ−１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、独国）によって、１００
倍量の緩衝液Ｃ（ＰＢＳ＋１００ｎＭのプロゲステロン）に対して透析した。
【０１０２】３．ｈＰＲ−Ａの同一性、純度および収量 生成物の純度および収量は、変性性−低下性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．らによる２２７，６８０−６８５（１９７０）に記載）
を用いることによって決定し、続いてクーマシー（登録商標）ブルーＲ２５０を
用いて染色した。この１工程の方法によって、ｈＰＲ−Ａは、最終的なｈＰＲの
比含有量が０．２〜０．５ｍｇのｈＰＲ／ｍｇタンパク質にまで濃縮された。図
１５のレーンＡに示す通り、最終的な製造物は、見かけの分子量が９４および７
４キロダルトンである２つの別個なタンパク質種から優先して構成されていた（
図１５の矢印）。
【０１０３】 収量は、標準化したタンパク質製造物の平行分離によって見積もった。３つの
別々な実験の組から得たデータは、１０８細胞当り、濃縮されたｈＰＲ Ａ受容
体の典型的な収量が３０μｇであることを暗示している。
【０１０４】 ｈＰＲの同一性は、組換えｈＰＲを目指したマウスモノクローナル抗体（ＰＲ
Ａｂ−１、オンコジーン、Ｃａｍｂｒｉｄｅ，ＭＡ，米国）を用いたウェスタ
ンブロットによって、ニトロセルロースに移された生成物の免疫検出によって決
定した。
【０１０５】 最終的な産物をニトロセルロースＢＡ−８３に移し、上記の通り免疫染色した
。図１５のレーンＣに示す通り、３つの主なタンパク質のバンドを検出し、これ
らは上記の２つの別々のタンパク質を含有する。より小さいサイズのバンドは、
ｈＰＲの一緒に精製したタンパク質分解によるフラグメントを示し得る。
【０１０６】 培地を除き、ＰＢＳ（無色）を加えた後に、接着性細胞由来の細胞内ＧＦＰを
、蛍光計によって検出した。その結果を図１３に示す。
【０１０７】 実施例６：トランスフェクトした２９３Ｔ細胞由来のヒト凝固因子ＩＸの凝固活
性 ヒト凝固因子ＩＸの５５〜９５ｎｇ／ｍＬという濃度範囲は、ＥＬＩＳＡ法を
用いる１１個の異なる実験（実施例４）において、２９３Ｔ細胞をプラスミド（
これは、ヒト因子ＩＸ−ｃＤＮＡ（ｐＴＧＦＧ３６、５３，６４および２）を含
有する）を用いてトランスフェクトすることによって得られた。
【０１０８】 凝固活性を、手動の凝集装置（ＭＬ−２、Ｉｎｓｒｔｕｍａｎｔａｔｉｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）による、ケファリン（ホスファチジルエタノールア
ミン）の活性化を用いる部分的トロンボプラスチン時間アッセイを用いて決定し
た。該研究のために、トランスフェクトした２９３Ｔ−細胞由来の希釈していな
い上清（１００μＬ）、欠失血漿（Ｐｒｏｇｅｎ）（１００μＬ）およびケファ
リン（Ｉｎｓｒｔｕｍａｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１００
μＬ）を、３７℃で５分間インキュベートした。凝固は、ＣａＣｌ２（１００μ
Ｌ）を加えることで開始した。試料の凝集時間を正常な血漿の場合の凝集時間と
比較した。
【表３】 正常な血漿の場合は、３７〜３９秒である。 因子ＩＸが欠損している血漿に場合は、１３７〜１４０秒である。
【０１０９】 実施例７：マウス血液の凝固時間に及ぼす、ヒト凝固因子ＩＸの添加効果の分析
１．凝固時間： 凝固活性を、手動の凝集装置（ＫＣ４Ａ、Ａｍｅｌｕｎｇ）によるケファリン
（ホスファチジルエタノールアミン）を用いた部分的トロンボプラスチン時間ア
ッセイを用いて決定した。
【０１１０】 該研究のために、マウス血液（５μＬ）、欠失血漿（Ｐｒｏｇｅｎ）（２０μ
Ｌ）、生理的ＮａＣｌ（１００μＬ）およびＤａＰＰＴＴｉｎ（Ｐｒｏｇｅｎ）
（１００μＬ）を３７℃で２分間インキュベートした。凝固は、ＣａＣｌ２（１
００μＬ）を加えることによって開始した。
【０１１１】 添加の効果を分析するために、ヒト凝固因子ＩＸ（ｈｏｕｓｅｓｔａｎｄａｒ
ｄ，Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）をマウス血液に加えて、該系中で１：１０に希釈し
た。図１５に示す通り、凝固活性に及ぼすヒト凝固因子ＩＸの添加効果は、限界
濃度が０．０７ミＵ ｈＦＩＸ／ｍＬ（＝３１．５ｎｇ／ｍＬ）まで検出するこ
とができる。
【０１１２】 ２．ＥＬＩＳＡ法： ヒト凝固因子ＩＸのマウス血液への添加を、実施例４に記載した、ＥＬＩＳＡ
法によって追跡した。クエン酸血漿はマウス血液から調製し、ヒト凝固因子ＩＸ
を異なる濃度で加えた。
【表４】
【０１１３】 ヒト凝固因子ＩＸを添加していないマウス血漿は、４０５ｎｍのバックグラウ
ンドで吸光度が０．０９９を示した。濃度が２ｍＩＵ／ｍＬのヒト因子ＩＸ（＝
９ｎｇ／ｍＬのヒト凝固因子）を加えると、検出の限界に達した。ＥＬＩＳＡ法
で使用される抗ヒト因子ＩＸ抗体はマウス凝固因子ＩＸと交差反応しないと推定
することができる。
【０１１４】 実施例８：ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）のクローニングおよび活性試験
２．活性試験： プラスミドｐＴＧｈＰＲ１中にコード化されているヒトプロゲステロン受容体
（上記実施例８．１）について、生理学的な活性を調べた。機能的な形態で、且
つプロゲスチン様Ｒ５０２０を用いて活性化後の場合には、該受容体は、マウス
乳癌ウイルス（ＭＴＶ）プロモーターからのルシフェラーゼの発現を誘発するこ
とができるはずである。
【０１１５】 このことを調べるために、６ウェルプレートの２９３細胞をフェノールレッド
がないＤＭＥＭ（１０％の活性炭でろ過した胎児ウシ血清を補充し、且つ１０ｎ
ＭのＲ５０２０（ＮＥＮ）を補充し、または補充しない）中で増殖させた。トラ
ンスフェクションは、ウェル当り、２μｇのｐＳＧ−ｈＰＲ１構築物およびｐＭ
ＴＶ−ｌｕｃ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇらによる１９８５、Ｃｅｌｌ ５５、ｐ８
８９−９０６）を用いるリン酸カルシウム法によって行なった。トランスフェク
ションの１日後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ルシフェラーゼ発現について、蛍光
計で商業主による指示に従ってＢｅｒｔｈｏｌｄ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｋｉ
ｔを用いてアッセイした。コントロールは以下の通りである。Ｒ５０２０を除き
、（ＰＲ ＋ ＭＴＶ）、および両プラスミドだけを（ＰＲ ＋ Ｒ５０２０、
ＭＴＶ ＋ Ｒ５０２０）を用いて、且つＲ５０２０（ＰＲ、ＭＴＶ）を用いず
にトランスフェクトした。正のコントロールとして、ＣＭＶで駆動されるルシフ
ェラーゼ遺伝子を有するプラスミドでトランスフェクトした（ｐＣＭＶ−ｌｕｃ
）。
【０１１６】 図１９に示すとおり、全ての必要な要素（すなわち、ヒトプロゲステロン受容
体、プロゲスチンＲ５０２０およびＭＴＶで操作されたルシフェラーゼ遺伝子（
ＰＲ ＋ ＭＴＶ ＋ Ｒ５０２０））が存在する場合には、ルシフェラーゼ発
現の明白な誘発が存在する。誤差バーは３回の実験の標準偏差を示し、読み出し
は比光度単位（ＲＬＵ）を示す。
【０１１７】 実施例９：インビトロ動物実験における経口による遺伝子転移実験の目的： 本パイロット研究の目的は、インビボ動物実験における経口による遺伝子転移
を立証することである。十分な遺伝子転移が、凝集測定によって確立される。健
康なマウスの白血球の凝固時間に及ぼす、発現されたヒト因子ＩＸの添加効果が
予期される。マウスの血液中のヒト因子ＩＸの発現の存在を、ＥＬＩＳＡ法によ
って定量化した。
【０１１８】 動物： 使用した動物は、開始年齢が９週で体重が２３〜３３ｇである「Ｉｆｆａ Ｃ
ｒｅｄｏ，仏国」からの３５雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスである。該マウスは、
「ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｌｌｅ Ｏｎｋ
ｏｌｏｇｉｅ ｕｎｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ｄｅｒ Ｔｅｃ
ｈｎｉｓｃｈｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ｍｕｎｃｈｅｎ」の木製チップを
備えた従来の試験動物ゲージ中で、各７匹の動物の群で保つ。
【０１１９】 該動物に「Ａｌｔｒｕｍ Ｒａｔｔｅｎ ｕｎｄ Ｍａｕｓｅ Ｈａｌｔｕｎ
ｇ」を自由に与え、および水道水をも自由に与える。
【０１２０】 該試験動物のゲージを、１９〜２４℃の周囲温度で、湿度を５５ ５％に保つ
。その部屋には更にオートマチックに光を供給し、それを１２時間リズムで保つ
【０１２１】 該試験を専門のスタッフによって監督する。 基質の混合物：
【表５】
【０１２２】 プラスミドおよびｈＰＲ： トランスジーンＧｍｂＨ ホルモン： Utrogest.（登録商標）、Dr. Kade/Besins Pharma GmbH, Rigistr. 2, D-12277 Berlin Ａｑｕａ ｄｅｓｔ．： Aqua ad injectabilia Delta0-Pharma GmbH, 71793 Pfullingen 食道ゾンデ： 静脈カテーテル、直径0.5×0.9 mm Lot 7077 G2221, B.Braun Melsungen AG, 西独 筋肉内注入： Micro-Fine 12.7mm, Becton Dickinson GmbH, Tullastr. 8-12, D-69126 Heidelberg
【０１２３】 実験の経過： ３５マウスを各々７匹のマウスの５つの群に分けた。１つの群はコントロール
として機能させ、第２の群はホルモンとプラスミドとの総量１００μＬを食道ゾ
ンデを用いて胃腸管からの経口投与し、第３の群はプラスミドとａｑｕａ ｄｅ
ｓｔ．との総量１００μＬを食道ゾンデを用いて経口投与し、第４の群はプラス
ミドとａｑｕａ ｄｅｓｔ．との総量５０μＬを大腿四頭筋中に筋肉内投与し、
第５の群はホルモン、ホルモン受容体およびプラスミドとの総量１００μＬを食
道ゾンデを用いて経口投与した。
【０１２４】 操作の約２〜３時間前に、マウスを赤色光の下で予め温めた。操作の直前、操
作の間、および操作後に、マウスを検査し、獣医によって管理した。
【０１２５】 マウスからの採血は、吸入麻酔法によっていくらか落ち着かせた動物の尾側の
動脈から毎日行なった。この目的のために、静脈を処分可能な注入用カニューレ
（０.９０×４０ｍｍ）を用いて穿刺した。穿刺部位から出た全ての血液（５μ
ｌ）を、エペンドルフピペットを用いて直ちに採取した。更に遅れずに、血液凝
固時間（単位は秒）をａＰＴＴアッセイの方法（活性化部分トロンボプラスチン
時間）によって、Ａｍｅｌｕｎｇ−Ｋｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ ＫＣ ４Ａを用
いて測定した。血液凝固分析は、常に同一人物によって行なった。採血の直後、
圧迫することによって、出血を止めた。
【０１２６】 マウスの鎮静は、全身チャンバー中で、吸入麻酔法（活性物質としては、Ｆｏ
ｒｅｎｅ，Ａｂｏｔｔ ＧｍｂＨ、６５２０５、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，西独）に
よって達成した。
【０１２７】 毎日の操作は総計７日間行なった。その後、いかなる操作をも行なわない日（
実験の８日目）があり、実験の９日目には麻酔下で再び総量５μＬを前尾側動脈
から回収し、上記の通り、凝集時間を測定した。更に、血液（０．５〜０．７５
ｍＬ）をＵ−４０インスリンシリンジ（Ｍｉｋｒｏ−Ｆｉｎｅ，１２．４ｍｍ）
を用いて心臓内で採取し、このものをクエン酸ナトリウム（３．１％）（５０〜
７５μＬ）を用いて満たし、エッペンドルフキュベット中に移した。クエン酸ナ
トリウムと合わせた血液（約１００μＬ）をＰＣＲ実験用に残し、冷却した環境
で保存した。残りのクエン酸の血液を、遠心分離機６０００ｒｐｍを用いて、４
℃、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行なった。因子ＩＸの濃度についての
ＥＬＩＳＡ測定法のために、血漿を回収した。
【０１２８】 次いで、動物をＮａｒｋｏｅｎ ｊ．ｐ．を用いて殺した。殺した直後に、動
物を解剖した。器官：脳、脾臓、腎臓、肝臓、精巣、配、大腿四頭筋、心臓、虫
垂を、免疫組織化学実験のためにマウスから取り出し、これらを−８０℃で凍結
した。
【０１２９】スケジュールを立てた実験経過からの偏差 長期にわたる一連の投与期間中、マウスの一般的状態がよくないので、投与を
３日目に（１匹のマウスを除いて）および、試験群２（ホルモンおよびプラスミ
ド）については５日目に、５群（ホルモン、ホルモン受容体およびプラスミド）
については３日および５日目に中断しなければならず、加えて２匹のマウスは、
実験の２日および７日目に試薬の投与を控えた。
【０１３０】 一般的状態がよくない理由としては、ホルモンプロゲステロンの睡眠効果によ
って説明される。そのことにより、マウスは食べたり、飲んだりする以外には２
４時間寝る。このために、再び、マウスの水のバランスに悪影響を与え、脱水現
象および拒食症を引き起こす。従って、ホルモンを経口投与する時に、マウスに
５％グルコース溶液（１ｍＬ）（Ｄｅｌｔａ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ，７２２
９３ Ｐｆｕｌｌｉｎｇｅｎ）およびリンガー液（１ｍＬ）（Ｄｅｌｔａ Ｐｈ
ａｒｍａ ＧｍｂＨ，７２２９３ Ｐｆｕｌｌｉｎｇｅｎ）を皮下投与すること
によって予防学的に処置した。ホルモン、ホルモン受容体およびプラスミドを経
口投与したマウスの場合には、２匹のマウスがそれぞれ３日目および６日目に死
亡した。それらを解剖した。
【０１３１】 ホルモンをプラスミドと一緒に経口投与した場合には、１匹のマウスが実験の
８日目にゲージ中で死亡していることがわかった。そのものについても解剖した
。
【０１３２】 該結果を図１７および図１８に示す。統計学上の評価は、反復測定した一般化
した直線モデル（反復測定したＭＡＮＯＶＡ）にしたがって行なった。いずれの
試験群についても、非線形的な経過は観察されなかった。従って、経過は、線形
的な増加、または減少を単に示すことによって、すなわちマウス当り、初期値か
ら最終値を引くことによって評価した。コントロールと「ホルモンおよびホルモ
ン受容体中のプラスミド」（群５）間の特に興味ある差異は、独立したランダム
な試料についてＴ検定を用いて調べた。
【０１３３】 図１７は、算出した差の平均値を示す。例えば、コントロールの場合には、こ
の差は約５０秒である。垂直の線は、これらの値から１つの標準偏差を足したり
、引いたものを示す。Ｔ検定は、平均値の間の差およびこれらの直線から見られ
る重なりの程度の両方を基礎とする。重なりが大きくなると、平均値の差分の有
意性は低下する。従って、「コントロール」群および「プラスミドおよび水を筋
肉内投与した」群（それぞれ、群１および群５）は、平均値における単なる数値
的方法で区別されるが、重なりの程度が大きいので、これらの群は有意には異な
るものではない。
【０１３４】 唯一の有意性の差異は、群１と群５との間であった。後者の減少は、コントロ
ールの減少よりも有意に大きい（Ｔ＝−２．３５７;ｄ．ｆ．＝１２；ｐ＜０．
０５）。
【０１３５】 以下の表は、結論的な統計量および統計学的な試験（Ｔ検定）の結果（これは
、試験の経過において得られる平均値の間での差異について行なったものである
）を含む。 群の統計量
【表６】 独立したランダムな試料についての試験
【表７】
【０１３６】 「ホルモン−ホルモン受容体およびプラスミドを経口投与した群」における処
置したマウスにおいて、実施例４に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて、ヒトＦＩＸを
も検出することができた。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の遺伝子転移の概念図である（該図中、ＨＲＥは
ホルモン応答配列であり、ＨＲはホルモン受容体であり、Ｈはホルモンであり、
白色円は親油性マトリックスである）。
【図２】 図２は、ベクターｐＴＧＦＧ１の図である。
【図３】 図３は、ベクターｐＴＧＦＧ５の図である。
【図４】 図４は、ベクターｐＴＧＦＧ２０の図である。
【図５】 図５は、ベクターｐＴＧＦＧ３３の図である。
【図６】 図６は、ベクターｐＴＧＦＧ３６の図である。
【図７】 図７は、ベクターｐＴＧＦＧ５３の図である。
【図８】 図８は、ベクターｐＴＧＦＧ６４の図である。
【図９】 図９は、ベクターｐＴＧＦＧ３６のＤＮＡ配列（配列番号１）を
示す図である。
【図１０】 図１０は、ベクターｐＴＧＦＧ３６によってコード化された因
子ＩＸのタンパク質配列（配列番号２）を示す図である。
【図１１】 図１１、はそれぞれｐＴＧＦＧ５およびｐＴＧＦＧ２０を用い
てトランスフェクトした後の、細胞ホモジネートについてのＧＦＰ濃度の曲線を
示す図である。
【図１２】 図１２は、それぞれｐＴＧＦＧ５（ａおよびｂ）およびｐＴＧ
ＦＧ２０（ｃおよびｄ）でトランスフェクトしたヒーラ細胞に対応する光学顕微
鏡写真（ａおよびｃ）および蛍光顕微鏡写真（ａおよびｄ）である。
【図１３】 図１３は、トランスフェクション実験において、本発明の好ま
しいベクターを用いることによって発現するＧＦＰの量を示す図である。ニセお
よびバックグラウンドからの比蛍光単位は明確に区別することができる。
【図１４】 図１４は、マウスの血液の凝固活性に及ぼす、ヒト凝固因子Ｉ
Ｘの添加効果を示す図である。
【図１５】 実施例５に記載の通り、ｈＰＲ（Ａ体）を昆虫細胞中で発現し
、コバルト（２＋）アフィニティークロマトグラフィーによって精製した結果を
示す図である。最終的な製造物（８５μｇのタンパク質）を、変性７．５％ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、続いてクーマシー（登録商標）Ｒ２５
０を用いて染色するか（レーンＡ）、またはｈＰＲに特異的な染色（レーンＣ）
と合わせたウェスタンブロットを行なった（レーンＣ）。レーンＢは標準物質の
分子量である。矢印は、免疫検出に利用することができる２つの非常に高濃度な
タンパク質種（９４および７４キロダルトン）を示す。
【図１６】 図１６は、ｈＰＲ−Ｂのドメイン構造を示す図である（バーの
上の数字は、ポリペプチド配列中のアミノ酸位置を示す）。
【図１７】 図１７は、実施例９の凝固時間における差異の平均値を示す図
である。
【図１８】 図１８は、実施例９で検出した凝固時間を示す図である。
【図１９】 図１９は、実施例８で測定する、ヒトプロゲステロン受容体の
活性を示す図である。
【図２０】 図２０は、ｈＰＲ Ｂ体のアミノ酸配列を示す図である。ｈＰ
Ｒ Ａ体中の開始メチオニンを下線で示す（配列番号１８）。
【図２１】 図２１は、ｈＰＲをコード化したｍＲＮＡの核酸配列を示す図
である。ｈＰＲ Ｂ体のリーディングフレームは１７６位で開始し、ｈＰＲ Ａ
体のリーディングフレームは６６８位で開始する。それぞれ出発コドンＡＴＧを
下線で示す（配列番号１９）。図２０および図２１の配列は、遺伝子バンク（Ａ
Ｆ０１６３８１番）から入手する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/43 Ａ６１Ｐ 7/04 47/46 11/00 Ａ６１Ｐ 7/04 35/00 11/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 35/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 15/00 ＺＮＡＡ 1/21 5/00 Ａ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 15/09 ＺＮＡ 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 BA63 BA80 CA04 CA11 DA02 DA03 GA11 HA17 4B065 AA90X AA93X AA93Y AC14 BA02 CA44 4C076 AA09 AA14 AA17 AA19 AA22 AA24 AA53 AA55 BB01 BB13 BB15 BB16 BB22 BB25 CC14 CC15 CC27 DD70N FF34 FF67 4C084 AA01 AA02 AA03 AA13 AA17 BA05 BA35 DA01 DB01 DB53 DB54 DB55 DB63 DC01 DC15 DC16 MA05 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA37 MA52 MA57 MA59 MA63 MA66 NA06 NA11 ZA532 ZA592 ZB262 4C086 AA01 AA02 EA16 MA02 MA03 MA05 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA37 MA52 MA57 MA59 MA63 MA66 NA06 NA11 ZA53 ZA59 ZB26

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１つのホルモン応答配列（ＨＲＥ）およびトラン
    スジーンを含有する核酸構築物の、遺伝子転移のための薬物の製造における使用
    。
  2. 【請求項２】 少なくとも１つのＨＲＥがトランスジーンと機能的に結合し
    ているかまたは結合していない、請求項１に記載の使用。
  3. 【請求項３】 トランスジーンは、血液凝固因子をコード化した遺伝子、ホ
    ルモン遺伝子、ホルモン受容体遺伝子、増殖因子、酵素遺伝子、サイトカインま
    たはリンフォカインをコード化した遺伝子、阻害物質をコード化した遺伝子、薬
    物またはワクチンとして機能する物質をコード化した遺伝子およびアンチセンス
    配列からなる群から選ばれる、請求項１または２に記載の使用。
  4. 【請求項４】 トランスジーンは血液凝固因子をコード化した遺伝子および
    血友病を処置するのに適当な薬物である、請求項３に記載の使用。
  5. 【請求項５】 ヒト血液凝固因子は、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびフォン
    ・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）からなる群から選ばれる、請求項４に記載の使
    用。
  6. 【請求項６】 核酸構築物は、１〜２０（３〜１０が好ましい）のＨＲＥを
    含む、請求項１〜５に記載の使用。
  7. 【請求項７】 少なくとも１つのＨＲＥがステロイド応答要素（プロゲステ
    ロン応答要素（ＰＲＥ）であることが好ましい）である、請求項１〜５に記載の
    使用。
  8. 【請求項８】 ＨＲＥがＰＲＥであり、血液凝固因子が因子ＩＸであって、
    該因子ＩＸは配列番号１の６８９〜２０７１のヌクレオチド配列を有することが
    好ましい、請求項５に記載の使用。
  9. 【請求項９】 ＨＲＥがＰＲＥであり、血液凝固因子が因子ＶＩＩＩである
    、請求項５に記載の使用。
  10. 【請求項１０】 ＰＲＥが配列番号３および４のＤＮＡ配列を含む二本鎖Ｄ
    ＮＡ配列である、請求項７〜９に記載の使用。
  11. 【請求項１１】 構築物は、プロモーター配列、エンハンサー配列、サイレ
    ンサー配列、配列の複製起点、組込み配列、マーカー遺伝子およびスウィッチ配
    列からなる群から選ばれる機能性ＤＮＡ配列を更に含む、請求項１〜１０に記載
    の使用。
  12. 【請求項１２】 構築物は、組織特異的プロモーター（α−アンチトリプシ
    ンプロモーターであることが好ましい）を更に含む、請求項１１に記載の使用。
  13. 【請求項１３】 薬物は更に、ホルモン−ホルモン受容体複合体（ステロイ
    ド−ステロイド受容体の複合体が好ましい）を含む、請求項１〜１２のいずれか
    に記載の使用。
  14. 【請求項１４】 ホルモン受容体に対する核酸構築物中のＨＲＥのモル比が
    １：１〜１：１０であり、１：２〜１：５であることが好ましく、および／また
    はホルモン受容体に対するホルモンのモル比が少なくとも１０００：１であり、
    少なくとも１００００：１であることが好ましい、請求項１３に記載の使用。
  15. 【請求項１５】 受容体はプロゲステロン受容体であり、ステロイドはプロ
    ゲステロンまたはプロゲステロン誘導体である、請求項１３または１４に記載の
    使用。
  16. 【請求項１６】 プロゲステロンは親油性マトリックス系中に溶解した天然
    の微粉化したプロゲステロンであり、および／またはプロゲステロン受容体はｈ
    ＰＲ−Ａ、ｈＰＲ−Ｂであるか、または配列番号９の５５７〜９３３のヌクレオ
    チド配列を含む、請求項１５に記載の使用。
  17. 【請求項１７】 少なくとも１つのＨＲＥおよびトランスジーンを含有する
    核酸構築物であって、ここで該少なくとも１つのＨＲＥの１つはトランスジーン
    と機能的に結合していない、核酸構築物。
  18. 【請求項１８】 請求項３〜１２に定義する通りである、請求項１７に記載
    の核酸構築物。
  19. 【請求項１９】 請求項１７または１８に記載の核酸構築物を含有する、ベ
    クター。
  20. 【請求項２０】 請求項１７もしくは１８に記載の核酸構築物または請求項
    １９に記載のベクターを含有する、形質転換細胞またはトランスジェニックな生
    物。
  21. 【請求項２１】 請求項１７もしくは１８に記載の少なくとも１つのＨＲＥ
    およびトランスジーンを含有する核酸構築物および／または請求項１９に記載の
    ベクターを含有する、物質の組成物であって、該少なくとも１つのＨＲＥはホル
    モン−ホルモン受容体の複合体と結合している組成物。
  22. 【請求項２２】 ホルモン−ホルモン受容体の複合体は請求項１３〜１６に
    記載する通りである、請求項２１に記載の物質の組成物。
  23. 【請求項２３】 トランスジーンは血液凝固因子をコード化した遺伝子であ
    る、請求項２１に記載の物質の組成物。
  24. 【請求項２４】 血液凝固因子は因子ＩＸである、請求項２１に記載の物質
    の組成物。
  25. 【請求項２５】 血液凝固因子は因子ＶＩＩＩである、請求項２１に記載の
    物質の組成物。
  26. 【請求項２６】 請求項２１に記載の物質の組成物の製造法であって、該方
    法は核酸構築物をホルモン受容体およびホルモンと混合することを含む方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１７もしくは１８に記載の核酸構築物、請求項１９
    に記載のベクターおよび／または請求項２１〜２５に記載の物質の組成物を含有
    する医薬組成物。
  28. 【請求項２８】 遺伝子転移（血友病の処置が好ましい）に適当である、請
    求項２７に記載の医薬組成物。
  29. 【請求項２９】 請求項１〜１６に記載の薬物または請求項２１〜２５に記
    載の物質の組成物を、生物または細胞系に投与することを含む、遺伝子転移の方
    法。
  30. 【請求項３０】 生物の細胞または細胞系の細胞中で発現させるために、ト
    ランスジーンをコード化した核酸を、生物中または細胞系中に運搬する方法であ
    って、該方法は請求項１〜１６に記載の薬物または請求項２１〜２５に記載の物
    質の組成物を投与することを含み、その結果、組成物中のホルモンが細胞膜と相
    互作用し、該相互作用により、ホルモン−ホルモン受容体の複合体と結合する核
    酸が膜を横切って細胞中にまで分散し、輸送されることが増大する方法。
  31. 【請求項３１】 ヒト因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸをコード化した核酸を細
    胞中にまで運搬する、請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 血液凝固障害の処置法であって、該方法は請求項２３に記
    載の物質の組成物の治療学的に有効な量を生物または細胞系に投与することを含
    む方法。
  33. 【請求項３３】 血友病Ｂの処置法であって、該方法は請求項２４に記載の
    物質の組成物の治療学的に有効な量を生物または細胞系に投与することを含む方
    法。
  34. 【請求項３４】 血友病Ａの処置法であって、該方法は請求項２５に記載の
    物質の組成物の治療学的に有効な量を生物または細胞系に投与することを含む方
    法。
  35. 【請求項３５】 遺伝子転移のための薬物の製造におけるステロイドホルモ
    ンの使用。
  36. 【請求項３６】 ステロイドホルモンは天然の微粉化したステロイドホルモ
    ンであり、天然の微粉化したプロゲステロンであることが好ましい、請求項３５
    に記載の使用。
  37. 【請求項３７】 天然の微粉化したステロイドホルモンを親油性マトリック
    ス系中に溶解する、請求項３６に記載の使用。
  38. 【請求項３８】 遺伝子転移の方法であって、該方法は核酸構築物を生物ま
    たは細胞系に投与することを含み、ここで該核酸構築物はトランスジーンを含み
    、ステロイドホルモンに被包される方法。
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