JPS62265985A - ムコ−ル・レンニン生産性遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ムコール・レンニン（ムフール属に属する凝
乳酵素生産性微生物が生産する微生物レンニン）生産性
遺伝子に関し、それ自体公知の遺伝子工学的手法を利用
して、たとえば酵母の如き工業的に培！容易な他の微生
物に導入して、ムコール・レンニンを有利に製造するこ
とを可能とするムコール・レンニン生産性遺伝子に関す
る。

更に詳しくは、本発明は、下記塩基配列νＪ　　Ｉ−Ｉ
龜　　Ｑ−りり　　（ｊ（（哨　　くり　　Ｑくを有す
ることを特徴とするムコール・レンニン生産性遺伝子に
関する。

従来、ムコール（Ｍ　ｕｃｏｒ）属に属する菌体外凝乳
酵素生産性微生物の存在が知られており、現在、微生物
レンニンとしてたとえばチーズ製造などに利用されてい
る凝乳酵素としては、ムコール・プシルス（Ｍｕｃｏｒ
　　ｐｕｓｉｌｌｕｓ）の生産するムコール・レンニン
及びムコール・ミイハイ（Ｍｕｃｏｒ　　ｌｌ１ｉｅｈ
ｅｉ）の生産するムコール・レンニンなどが知られてい
る。

本発明者等は、ムコール・レンニンの生産性の改良、凝
乳活性と蛋白の高次構造との相関の解明などを企図して
研究を行ってきたが、今回、遺伝子工学的手法を利用し
て、ムコール・レンニン生産性微生物から抽出されたＤ
　Ｎ　Ａを用い、ムコール・レンニン生産性遺伝子を含
むプラスミドｐｃＴ１１３を有する大腸菌クローンの単
離に成功し、更に、そのムコール・レンニン生産性遺伝
子の塩基配列の解明に成功した。

木登１１７１者等の研を！二１：れげ、茄＝ｐ、　−、
ｓ：　Ｌｍ示１デ・トうに、ムコール・レンニン生産性
遺伝子はＮ末端の６６個のアミノ酸より成るシグナル配
列及びプロ配列につづいてムコール・レンニン蛋白、の
７４ノ酸配列をコードする塩基配列を有していることが
わかった。

従って、本発明の目的は新規なムコール・レンニン生産
性遺伝子を提供するにある。

本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記載から一層明らかとなるであろう。

本発明のムコール・レンニン生産性遺伝子は、たとえば
、ムコール属に属する凝乳ｖｌｌ上生産微生物からその
ＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを適当な制限酵素で切
断してそのＤＮＡ断片を得、これを例えば大腸菌にクロ
ーン化して遺伝子ライブラリィを作製した後、適当なプ
ローブを用いてムコール・レンニン生産性遺伝子を含む
プラスミドを有する大腸菌クローンを選択単離すること
によって、該微生物から分離採取することができる。

ムコール属に属する凝乳酵素生産性微生物の例としては
、たとえば、ムコール・プシルスＩＦ０４５７８、ムコ
ール・ミイハイＩＦＯ９７４０（いずれも公知の自由分
譲菌株）などを挙げることができる。このようなムコー
ル・レンニン生産性微生物からそのＤＮＡを抽出する手
法それ自体は知られており、例えば、菌体破砕抽出液を
適当量のＥＤＴＡ及びドテシル硫酸ナトリウムの存在下
にプロテアーゼ処理した後、フェノール法により抽出す
ることができ、さらに、例えば塩化セシウム平衡密度勾
配遠心法により精製できる。抽出されたＤＮＡを適当な
制限酵素で切断してそのＤＮＡ断片を得る手法それ自体
も、公知の手法を利用して行なうことかできるが、例え
ば、上述のようにして抽出精製されたＤＮＡ約２０μｇ
を、６０μ２の標準反応液中５単位の制限酵素５ａｕ３
ＡＩを用いて、約３７℃で１５秒乃至２分間部分分解す
ることにより、ＤＮＡ断片を得ることができる。

上述のようにして得ることのできるムコール・レンニン
生産性微生物のＤＮＡ断片を大腸菌にクローン化して遺
伝子ライブラリィを作製する手法も、ＤＮＡ断片を大腸
菌にクローン化する公知手法を利用して行なうことがで
きる。例えば、コスミドベクターｐＪＢ８を、制限酵素
±１ｎｄｌｌ［あるいはＳａｔ　　Ｉで切断して左右両
腕ＤＮＡ断片を調製し、上述のムコール・レンニン生産
性微生物のＤＮＡ断片とＴ４す〃−ゼを用いて結合した
後、大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１にインビトロ
バツケーノングの手法により導入して、アンピシリン抵
抗性コロニーを選択することにより遺伝子ライブラリィ
を作製することができる。このようにして作製できる遺
伝子ライブラリィからムコール・レンニン生産性遺伝子
を含むプラスミドを持つ大腸菌クローンを選択するのに
利用するプローブ（探針子）として、ムコール・レンニ
ンのｇ分７ミ／酸配列に基いて合成した下記４種のオリ
ゴＤＮＡ（１４Ｔ−１，１７Ｔ−２，１４Ｔ−３及び１
７Ｔ−４）を利用することができ、好ましい。

ＣＮ−３ ＴＲ−２１Ｍｅｔ　Ｇｌｕ＾Ｉａ　にＩｕ　ＴｙｒｍＲ
Ｎ＾５′　＾ＵＧ　ＧΔ＾ＧＣＮ　Ｇ＾＾　ＵＡＵ　３
’Ｇ　　　　　Ｇ　　Ｃ Ｐｒｏｂｅ　３’　　ＴＡＣＣＴＴ　ＣＧＮ　ＣＴＴ　
ＡＴ　　５’Ｃ １４Ｔ−１（１４＋ｅｒ） ＴＲ−１７Ｔｙｒ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ｔｒｐ　　
Ａｓｐ　　八ｌａ１７Ｔ−２（１７ｍｅｒ） ＣＮ−８＾ｓｎ　Ｇｌｎ　　Ｐｈｅ　　ＩＬｅ　　Ｖａ
ｌＣＧＣＩＩ Ｐｒｏｂｅ　　３’　　ＴＴＡ　ＣＴＴ　＾＾＾Ｔ＾＾
Ｃ＾　５′にＣにＴ １４Ｔ−３（１４＋ａｅｒ） ＣＮ−７Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　　Ｉｌｅ　
ＶａｌＣＣＩＪ １７Ｔ−４（１７ｍｅｒ） アニン生産性遺伝子を含むプラスミドｐｃＴ１１３を有
する大腸菌クローンについて、そのｐＣＴ１１３の制限
酵素地図を作成し、プローブがハイブリダイズする場所
の塩基配列を決定してプローブと完全に一致する配列が
得られ、しかも、その周囲はムコールプシルス・レンニ
ン蛋白の決定シたアミノ酸配列から推定される塩基配列
とほとんど完全に一致する結果が得られ、更にその前後
についても塩基配列を決定して、前記式の塩基配列を有
するムコール・レンニン生産性遺伝子であることが判明
した。

本発明のムコール・レンニン生産性遺伝子は、Ｎ末端の
６６個の７ミ／酸よｉ）なるシグナル配列及びプロ配列
につづいて６７個目よりのムコール・レンニン蛋白の７
ミ／酸配列をコードする塩基配列を有する。

かくして得られたムコール・レンニン遺伝子は、それを
適当なベクターにつなぎ換えて例えばサツカロミセス属
酵母等の培養容易な微生物宿主に導を容易に生産するの
に用いることが出来る。また、本遺伝子の５′末端側シ
グナル配列をコードする塩基配列から、サツカロミセス
属酵母等において異種蛋白を菌体外に分泌生産させるた
めの分泌ベクターを構築するために利用することができ
る。

以下、実施例により本発明ムコール・レンニン生産性遺
伝子及びその塩基配列の決定について更に詳しく例示す
る。

〔実施例］ １、Ｍｕｃｏｒ　　ＤＮＡの調製 Ｍ　　ｕｓｉｌｌｕｓ　Ｉ　ＦＯ４５７８（＋）又はＭ
。

ｍ１ｅｌ＋ｅｉ　　Ｉ　ＦＯ９７４０のスラント（ジャ
ガイモ抽出物０．４％、ブドウ糖２％、チアミン２　ｔ
ｔｒｇ／ｍ１ＳｐＨ７、０）１本分の胞子を、１１のＹ
ＰＧ培地（酵母抽出物０．３％、バシトペプトン１％、
ブドウ糖２％、ｐＨ７，０）に接種し、３０℃で３〜４
日間振盪培養する。約１００８湿重量の菌体が得られる
。これを液体窒素存在下にパワー　ホモジナイザ−（日
本精機社Ｓ！りにて破砕したのち、この半量を３００＋
ｅｉの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）０．５％ド
デシル硫酸ナトリウム中で、５０℃で３時間、プロテイ
ナーゼに処Ｊ！（１００ｍｇ／４２）する。〃−ゼ濾過
後の炉液に７エ／−ル処理を２回施して蛋白を除去する
。エタ／−ル沈殿により濃縮したのち、塩化セシウム平
衡密度勾配遠心により、多糖やＲＮＡを除去する。１０
ｍＭ）リス塩ｒＲ（ｐＨ８，０）、１ｍＭＥＤＴＡｌ：
討して透析し、約ｌｌ１ｇのＤＮＡ標品を得る。

２、コスミド　ライブラリーの作製 ４０ｋｂ程度の大きなりＮＡ断片を挿入可能であり且つ
インビトロ　パッケージングにより効率よく大腸菌を形
質転換できるコスミド　ｐＪＢ８（Ａ　ｆｆ１ｅｒｓｈ
ａｎ＋社　Ｎ、３４１）をベクターとして用い、遺伝子
ライブラリーを作製した。約５μｇのｐＪＢ８を１００
．ｌｔの反応溶液中、２０ｕｎｉｔの制限酵素Ｈｉｎｄ
ｎｌあるいはＳａｌ　　Ｉで切断後、自己再結合を防ぐ
ため、７オス７７ターゼ処理により末端のリン酸を除去
した。これらを７エノール処理、エーテル処理及びエタ
ノール沈殿処理した後、５０μ２の画然溜水に溶解し、
１００μｌの反応溶液中２０ｕｎｉｔの制限酵素Ｂａｍ
ＨＩで切断してベクターの左右両腕ＤＮＡ断片を得る。

被挿入断片は、上で得たＭｕｃｏｒ　Ｄ　Ｎ　Ａ約２０
μｇを６０μ！の反応溶液中５ｕｎｉｔの制限酵素５ａ
ｕ３Ａｌを加えて３７°１５秒乃至２分間の処理により
部分消化したのち７オス７アターゼ処理を加え、０．６
％の７がロースデルに流し、２５ｋｂ以上の長さを持つ
断片をデルより回収したものを用いた。約５μｇの部分
消化ＤＮＡ断片と０．３μｇずつの左右両腕ＤＮＡ断片
を、２０μ！の反応液中１０００ｕｎｉｔのＴ４す〃−
ゼを用いて繋ぎ、インビトロパッケージング（パッケー
ジング　キット　Ａｍｅｒｓｈａｍ　　Ｎ、　　３３４
　　Ｚを使用）に供した。生成するファージをＥ、　ｃ
ｏｌｉ　［（Ｂ　１０１に感染させ約２万個のアンピシ
リン抵抗性コロニーを得た。

３、ｐＣＴ１１３およびｐＭＭ１１４の作製これらのコ
ロニーを、ニトロセルロースフィルターにレプリカし、
アルカリ溶菌、中和、ついでｆｌｒ６１で１ｌＩｎ’／
’−ｒｈ９１１−’、朋ａｆ＋ｔ＋Ａｉ、ｌ−１−ｌ−
１−ｎｎ〕Ｊルターに固定した。約１０００万ｅｐＨ１
のプローブ（１４Ｔ−１，１７Ｔ−２，１４Ｔ−３及び
１７Ｔ−４）を加えた、０．９Ｍ食塩、９０ｍＭ）リス
塩酸（ｐＨ７，５）、６曽Ｍ　　ＥＤＴＡ、０．５％ノ
ニデットＰ４０．２５０　ｕｇ／ｍｌ　ｔＲＮ　Ａ溶ｆ
ｉｔ、：フィルターを浸漬し、ハイブリダイゼーション
を行った。温度はプローブ毎に異り、１４Ｔ−３で３６
℃、１７Ｔ−２で４４°Ｃなどであり、Ｍ。

ｍ１ｅｈｅｉ　　Ｉ　Ｆ　Ｏ９７４０がらのクローニン
グに用いたＭＰＲ遺伝子全長を含む約４ｋｂのＤＮＡ断
片では４２°Ｃである。そののち０，９Ｍ　食塩、９０
ｍＭ　　クエン酸ナトリウム溶液中で１時間、ハイブリ
ダイゼーションと同じ温度で洗浄し、さらに０℃で数回
洗った０次にオートラジオグラムによりプローブの結合
した株を特定した。屹工匹蛙比ｕｓ　　ＩＦＯ４５７８
（＋）のＤＮＡを持つ株に関しては、３個のプローブの
いずれでも陽性な株のみが真正なハイブリダイズをして
いると考え、この株のもつコスミドをｐｃＴｌｌと命名
した。

この株から、フスミドＤＮＡを調製し、制限酵素Ｈｉｎ
ｄＤＩで切断後アガロースゲルに流した。約１５本のバ
ンドが現れたので、このＤＮＡをゲルごとアルカリ処理
することにより変性させたのち、ニトロセルロースフィ
ルターに転写した。常法通り固定したのち、前述の３プ
ローブ約１００万ｃｐＩＩｌと、０．６Ｍ食塩、６０ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム中
マハイプリダイズさせたところ、いずれも約４．５ｋｂ
の同一の断片にハイブリダイズしたので改めてこの断片
を調製し、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄｌ［部位に挿入して
ｐｃＴｌｌ３を得た。

同様にして得たＭ　　ｍ１ｅｈｅｉ　　ＩＦＯ９７４０
のＤＮＡを持つ、ハイブリダイゼーション陽性株のコス
ミドをｐＭＭｌｌと命名した。ｐｃＴｌｌと同様の処理
をしたところ、やはり約４．５ｋｂのＨｉｎｄＪＩＪ断
片とハイブリダイズしたので、この断片をｐＢＲ３２２
のＨｉｎｄｌｌｒ部位に再クローンしｐＭＭｌｌ４とし
た。

４、塩基配列の決定 ｐｃＴｌｌ３又はｐＭＭｌｌ４のＭｕｃｏｒ　　由来Ｄ
ＮＡ部分を制限酵素Ｈａｅｌ［［またはＨｉｎａｌｌで
切断して得られる種々の断片的２０ｎｇを、１本鎖７ア
ーノＭ１３＋＋＋ｐｌＯの複製型２本鎖ＤＮＡ２０１１
１１の、予め脱リン酸した制限酵素Ｓａ＋ａｌ切断部位
に繋ぎ込んだ。因みにこれらの制限酵素は、いずれも平
滑末端を与えるため、Ｔ　４−Ｄ　Ｎ　Ａす〃−ゼで接
続可能である。す〃−ゼ反応は、３０μ２反応液中４°
Ｃ又は１２°Ｃで酵素約３００　ｕｎｉｔを用いて行っ
た。

次いで、Ｍ１３クローニングシステム（Ａ　ｍｅｒｓｈ
ＪｌｌｌＩ　　Ｎ、４５０３）の指示に従い塩基配列決
定用１本鎖ＤＮＡを得た。概要は、組換えＤＮＡを塩化
カルシウム法によりＥ、　ｃｏｌｉ　　ＪＭＩ　Ｏ５に
形質転換し、５プロモー４クロロ−３インドリル−β−
Ｄ〃ラクトシシト有寒天平板上に無色の溶菌斑を生じさ
せる。次いでこの溶菌斑より単離した７アーノをＪＭ１
０５に再感染させて増幅し、培養上清から食塩、ポリエ
チレングリコール溶液により７ア一ノ粒子を沈殿させる
。この粒子より７エノール処理により一重鎖ＤＮＡを取
出し、エタノール沈殿によって濃縮して塩基配列決定に
用いる。

塩基配列決定法は宝酒造のＭ１３シークエンシングキッ
）（６０１０Ｂ）によった、この決定法においては、Ｄ
ＮＡポリメラーゼラージ７ラグメントにより７７−ジＤ
ＮＡの相−？ｌ１１鎖を合成する際に、放射性同位体く
実際にはα−３２Ｐ　−ｄＣＴ　Ｐ　）を含む４種のデ
オキシヌクレオチド３燐陵と共に、４種のうち１種類の
デオキシヌクレオチド３燐ｉ’！２Ｍ緑体（ノブオキシ
ＮＴＰ）を加えて反応させると、この類縁体を取込んだ
分子はそこで伸長反応グ停止する。類縁体の取込みは無
作為に起こるので、実際にはその類縁体が取込まれる可
能性のあるすべての筒所で伸長反応が止まった種々の長
さの相補鎖が合成される。４種のＭ縁体のそれぞれにつ
いて同様の反応を行い、合成された相補鎖の長さをオー
トラフォグラム上で比較することにより塩基の配列を知
ることができる。

２種の制限酵素による断片がらでは、重なり合わなかっ
た部分に関しては、配列から確認された制限酵素Ｂｇｌ
　ｌｌ　認識部位で切断した断片を、新タニＭ　１３　
ノＢａａ＋　ＨＩ部位に組込み塩基配列を決定した。

上述のようにして、４Ｐられなムコール・レンニン生産
性遺伝子は、前記塩基配列を有する従来未知の遺伝子で
あることが確認された。

外１名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記塩基配列 【塩基配列があります】 を有することを特徴とするムコール・レンニン生産性遺
   伝子。