JPH0675507B2 - ムコ−ル・レンニン生産性遺伝子 - Google Patents
ムコ−ル・レンニン生産性遺伝子Info
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- JPH0675507B2 JPH0675507B2 JP61108674A JP10867486A JPH0675507B2 JP H0675507 B2 JPH0675507 B2 JP H0675507B2 JP 61108674 A JP61108674 A JP 61108674A JP 10867486 A JP10867486 A JP 10867486A JP H0675507 B2 JPH0675507 B2 JP H0675507B2
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- rennin
- dna
- gene
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ムコール・レンニン（ムコール属に属する凝
乳酵素生産性微生物が生産する微生物（レンニン）生産
性遺伝子に関し、それ自体公知の遺伝子工学的手法を利
用して、たとえば酵母の如き工業的に培養容易な他の微
生物に導入して、ムコール・レンニンを有利に製造する
ことを可能とするムコール・レンニン生産性遺伝子に関
する。
乳酵素生産性微生物が生産する微生物（レンニン）生産
性遺伝子に関し、それ自体公知の遺伝子工学的手法を利
用して、たとえば酵母の如き工業的に培養容易な他の微
生物に導入して、ムコール・レンニンを有利に製造する
ことを可能とするムコール・レンニン生産性遺伝子に関
する。
更に詳しくは、本発明は、下記塩基配列 を有することを特徴とするムコール・レンニン生産性遺
伝子に関する。
伝子に関する。
従来、ムコール（Mucor）属に属する菌体外凝乳酵素生
産性微生物の存在が知られており、現在、微生物レンニ
ンとしてたとえばチーズ製造などに利用されている凝乳
酵素としては、ムコール・プシルス（Mucor pusillus）
の生産するムコール・レンニン及びムコール・ミイハイ
（Mucor miehei）の生産するムコール・レンニンなどが
知られている。
産性微生物の存在が知られており、現在、微生物レンニ
ンとしてたとえばチーズ製造などに利用されている凝乳
酵素としては、ムコール・プシルス（Mucor pusillus）
の生産するムコール・レンニン及びムコール・ミイハイ
（Mucor miehei）の生産するムコール・レンニンなどが
知られている。
本発明者等は、ムコール・レンニンの生産性の改良、凝
乳活性と蛋白の高次構造との相関の解明などを企図して
研究を行つてきたが、今回、遺伝子工学的手法を利用し
て、ムコール・レンニン生産性微生物から抽出されたDN
Aを用い、ムコール・レンニン生産性遺伝子を含むプラ
スミドpCT113を有する大腸菌クローンの単離に成功し、
更に、そのムコール・レンニン生産性遺伝子の塩基配列
の解明に成功した。
乳活性と蛋白の高次構造との相関の解明などを企図して
研究を行つてきたが、今回、遺伝子工学的手法を利用し
て、ムコール・レンニン生産性微生物から抽出されたDN
Aを用い、ムコール・レンニン生産性遺伝子を含むプラ
スミドpCT113を有する大腸菌クローンの単離に成功し、
更に、そのムコール・レンニン生産性遺伝子の塩基配列
の解明に成功した。
本発明者等の研究によれば、前記式に示したように、ム
コール・レンニン生産性遺伝子はＮ末端の66個のアミノ
酸より成るシグナル配列及びプロ配列につづいてムコー
ル・レンニン蛋白のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を有していることがわかった。
コール・レンニン生産性遺伝子はＮ末端の66個のアミノ
酸より成るシグナル配列及びプロ配列につづいてムコー
ル・レンニン蛋白のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を有していることがわかった。
従って、本発明の目的は新規なムコール・レンニン生産
性遺伝子を提供するにある。
性遺伝子を提供するにある。
本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記載から一層明らかとなるであろう。
は、以下の記載から一層明らかとなるであろう。
本発明のムコール・レンニン生産性遺伝子は、たとえ
ば、ムコール属に属する凝乳酵素生産性微生物からその
DNAを抽出し、抽出したDNAを適当な制限酵素で切断して
そのDNA断片を得、これを例えば大腸菌にクローン化し
て遺伝子ライブラリイを作製した後、適当なプローブを
用いてムコール・レンニン生産性遺伝子を含むプラスミ
ドを有する大腸菌クローンを選択単離することによつ
て、該微生物から分離採取することができる。
ば、ムコール属に属する凝乳酵素生産性微生物からその
DNAを抽出し、抽出したDNAを適当な制限酵素で切断して
そのDNA断片を得、これを例えば大腸菌にクローン化し
て遺伝子ライブラリイを作製した後、適当なプローブを
用いてムコール・レンニン生産性遺伝子を含むプラスミ
ドを有する大腸菌クローンを選択単離することによつ
て、該微生物から分離採取することができる。
ムコール属に属する凝乳酵素生産性微生物の例として
は、たとえば、ムコール・プシルスIFO4578、ムコール
・ミイハイIFO9740（いずれも公知の自由分譲菌株）な
どを挙げることができる。このようなムコール・レンニ
ン生産性微生物からそのDNAを抽出する手法それ自体は
知られており、例えば、菌体破砕抽出液を適当量のEDTA
及びドテシル硫酸ナトリウムの存在下にプロテアーゼ処
理した後、フエノール法により抽出することができ、さ
らに、例えば塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により精
製できる。抽出されたDNAを適当な制限酵素で切断して
そのDNA断片を得る手法それ自体も、公知の手法を利用
して行なうことができるが、例えば、上述のようにして
抽出精製されたDNA約20μｇを、60μｌの標準反応液中
５単位の制限酵素Sau3AIを用いて、約37℃で15秒乃至２
分間部分分解することにより、DNA断片を得ることがで
きる。
は、たとえば、ムコール・プシルスIFO4578、ムコール
・ミイハイIFO9740（いずれも公知の自由分譲菌株）な
どを挙げることができる。このようなムコール・レンニ
ン生産性微生物からそのDNAを抽出する手法それ自体は
知られており、例えば、菌体破砕抽出液を適当量のEDTA
及びドテシル硫酸ナトリウムの存在下にプロテアーゼ処
理した後、フエノール法により抽出することができ、さ
らに、例えば塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により精
製できる。抽出されたDNAを適当な制限酵素で切断して
そのDNA断片を得る手法それ自体も、公知の手法を利用
して行なうことができるが、例えば、上述のようにして
抽出精製されたDNA約20μｇを、60μｌの標準反応液中
５単位の制限酵素Sau3AIを用いて、約37℃で15秒乃至２
分間部分分解することにより、DNA断片を得ることがで
きる。
上述のようにして得ることのできるムコール・レンニン
生産性微生物のDNA断片を大腸菌にクローン化して遺伝
子ライブラリイを作製する手法も、DNA断片を大腸菌に
クローン化する公知手法を利用して行なうことができ
る。例えば、コスミドベクターpJB8を、制限酵素HindII
IあるいはSalIで切断して左右両腕DNA断片を調製し、上
述のムコール・レンニン生産性微生物のDNA断片とT4リ
ガーゼを用いて結合した後、大腸菌E.coliHB101にイン
ビトロパツケージングの手法により導入して、アンピシ
リン抵抗性コロニーを選択することにより遺伝子ライブ
ラリイを作製することができる。このようにして作製で
きる遺伝子ライブラリイからムコール・レンニン生産性
遺伝子を含むプラスミドを持つ大腸菌クローンを選択す
るのに利用するプローブ（探針子）として、ムコール・
レンニンの部分アミノ酸配列に基いて合成した下記４種
のオリゴDNA（14T−１、17T−２、14T−３及び17T−
４）を利用することができ、好ましい。
生産性微生物のDNA断片を大腸菌にクローン化して遺伝
子ライブラリイを作製する手法も、DNA断片を大腸菌に
クローン化する公知手法を利用して行なうことができ
る。例えば、コスミドベクターpJB8を、制限酵素HindII
IあるいはSalIで切断して左右両腕DNA断片を調製し、上
述のムコール・レンニン生産性微生物のDNA断片とT4リ
ガーゼを用いて結合した後、大腸菌E.coliHB101にイン
ビトロパツケージングの手法により導入して、アンピシ
リン抵抗性コロニーを選択することにより遺伝子ライブ
ラリイを作製することができる。このようにして作製で
きる遺伝子ライブラリイからムコール・レンニン生産性
遺伝子を含むプラスミドを持つ大腸菌クローンを選択す
るのに利用するプローブ（探針子）として、ムコール・
レンニンの部分アミノ酸配列に基いて合成した下記４種
のオリゴDNA（14T−１、17T−２、14T−３及び17T−
４）を利用することができ、好ましい。
上述のようにして選択単離できるムコール・レンニン生
産性遺伝子を含むプラスミドpCT113を有する大腸菌クロ
ーンについて、そのpCT113の制限酵素地図を作成し、プ
ローブがハイブリダイズする場所の塩基配列を決定して
プローブと完全に一致する配列が得られ、しかも、その
周囲はムコールプシルス・レンニン蛋白の決定したアミ
ノ酸配列から推定される塩基配列とほとんど完全に一致
する結果が得られ、更にその前後のついても塩基配列を
決定して、前記式の塩基配列を有するムコール・レンニ
ン生産性遺伝子であることが判明した。
産性遺伝子を含むプラスミドpCT113を有する大腸菌クロ
ーンについて、そのpCT113の制限酵素地図を作成し、プ
ローブがハイブリダイズする場所の塩基配列を決定して
プローブと完全に一致する配列が得られ、しかも、その
周囲はムコールプシルス・レンニン蛋白の決定したアミ
ノ酸配列から推定される塩基配列とほとんど完全に一致
する結果が得られ、更にその前後のついても塩基配列を
決定して、前記式の塩基配列を有するムコール・レンニ
ン生産性遺伝子であることが判明した。
本発明のムコール・レンニン生産性遺伝子は、Ｎ末端の
66個のアミノ酸よりなるシグナル配列及びプロ配列につ
づいて67個目よりのムコール・レンニン蛋白のアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有する。
66個のアミノ酸よりなるシグナル配列及びプロ配列につ
づいて67個目よりのムコール・レンニン蛋白のアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有する。
かくして得られたムコール・レンニン遺伝子は、それを
適当なベクターにつなぎ換えて例えばサツカロミセス属
酵母等の培養容易な微生物宿主に導入することにより、
凝乳酵素ムコール・レンニンを容易に生産するのに用い
ることが出来る。また、本遺伝子の５′末端側シグナル
配列をコードする塩基配列から、サツカロミセス属酵母
等において異種蛋白を菌体外に分泌生産させるための分
泌ベクターを構築するために利用することができる。
適当なベクターにつなぎ換えて例えばサツカロミセス属
酵母等の培養容易な微生物宿主に導入することにより、
凝乳酵素ムコール・レンニンを容易に生産するのに用い
ることが出来る。また、本遺伝子の５′末端側シグナル
配列をコードする塩基配列から、サツカロミセス属酵母
等において異種蛋白を菌体外に分泌生産させるための分
泌ベクターを構築するために利用することができる。
以下、実施例により本発明のムコール・レンニン生産性
遺伝子及びその塩基配列の決定について更に詳しく例示
する。
遺伝子及びその塩基配列の決定について更に詳しく例示
する。
［実施例］ 1.Mucor DNAの調製M.pusillus IF578（＋）又はM.mieheiIFO 9740のスラ
ント（ジヤガイモ抽出物0.4％、ブドウ糖２％、チアミ
ン2mg/ml、pH7.0）１本分の胞子を、１のYPG培地（酵
母抽出物0.3％、バクトペプトン１％、ブドウ糖２％、p
H7.0）に接種し、30℃で３〜４日間振盪培養する。約10
0g湿重量の菌体が得られる。これを液体窒素存在下にパ
ワーホモジナイザー（日本精機社製）にて破砕したの
ち、この半量を300mlの0.5M EDTA（pH8.0）0.5％ドデシ
ル硫酸ナトリウム中で、50℃で３時間、プロテイナーゼ
Ｋ処理（100mg/l）する。ガーゼ過後の液にフエノ
ール処理を２回施して蛋白を除去する。エタノール沈殿
により濃縮したのち、塩化セシウム平衡密度勾配遠心に
より、多糖やRNAを除去する。10mMトリス塩酸（pH8.
0）、1mM EDTAに対して透析し、約1mgのDNA標品を得
る。
ント（ジヤガイモ抽出物0.4％、ブドウ糖２％、チアミ
ン2mg/ml、pH7.0）１本分の胞子を、１のYPG培地（酵
母抽出物0.3％、バクトペプトン１％、ブドウ糖２％、p
H7.0）に接種し、30℃で３〜４日間振盪培養する。約10
0g湿重量の菌体が得られる。これを液体窒素存在下にパ
ワーホモジナイザー（日本精機社製）にて破砕したの
ち、この半量を300mlの0.5M EDTA（pH8.0）0.5％ドデシ
ル硫酸ナトリウム中で、50℃で３時間、プロテイナーゼ
Ｋ処理（100mg/l）する。ガーゼ過後の液にフエノ
ール処理を２回施して蛋白を除去する。エタノール沈殿
により濃縮したのち、塩化セシウム平衡密度勾配遠心に
より、多糖やRNAを除去する。10mMトリス塩酸（pH8.
0）、1mM EDTAに対して透析し、約1mgのDNA標品を得
る。
2.コスミド ライブラリーの作製 40kb程度の大きなDNA断片を挿入可能であり且つインビ
トロ パツケージングにより効率よく大腸菌を形質転換
できるコスミド pJB8（Amersham社 N.341）をベクタ
ーとして用い、遺伝子ライブラリーを作製した。約５μ
ｇのpJB8を100μｌの反応溶液中、20unitの制限酵素Hin
dIIIあるいはSalIで切断後、自己再結合を防ぐため、フ
オスフアターゼ処理により末端のリン酸を除去した。こ
れらをフエノール処理、エーテル処理及びエタノール沈
殿処理した後、50μｌの再蒸留水に溶解し、100μｌの
反応溶液中20unitの制限酵素BamHIで切断してベクター
の左右両腕DNA断片を得る。
トロ パツケージングにより効率よく大腸菌を形質転換
できるコスミド pJB8（Amersham社 N.341）をベクタ
ーとして用い、遺伝子ライブラリーを作製した。約５μ
ｇのpJB8を100μｌの反応溶液中、20unitの制限酵素Hin
dIIIあるいはSalIで切断後、自己再結合を防ぐため、フ
オスフアターゼ処理により末端のリン酸を除去した。こ
れらをフエノール処理、エーテル処理及びエタノール沈
殿処理した後、50μｌの再蒸留水に溶解し、100μｌの
反応溶液中20unitの制限酵素BamHIで切断してベクター
の左右両腕DNA断片を得る。
被挿入断片は、上で得たMucorDNA約20μｇを60μｌの反
応溶液中5unitの制限酵素Sau3AIを加えて37°15秒乃至
２分間の処理により部分消化したのちフオスフアターゼ
処理を加え、0.6％のアガロースゲルに流し、25kb以上
の長さを持つ断片をゲルより回収したものを用いた。約
５μｇの部分消化DNA断片と0.3μｇずつの左右両腕DNA
断片を、20μｌの反応液中1000unitのT4リガーゼを用い
て繋ぎ、インビトロ パツケージング（パツケージング
キツト Amersham N.334 Zを使用）に供した。精製す
るフアージをE.coliHB101に感染させ約２万個のアンピ
シリン抵抗性コロニーを得た。
応溶液中5unitの制限酵素Sau3AIを加えて37°15秒乃至
２分間の処理により部分消化したのちフオスフアターゼ
処理を加え、0.6％のアガロースゲルに流し、25kb以上
の長さを持つ断片をゲルより回収したものを用いた。約
５μｇの部分消化DNA断片と0.3μｇずつの左右両腕DNA
断片を、20μｌの反応液中1000unitのT4リガーゼを用い
て繋ぎ、インビトロ パツケージング（パツケージング
キツト Amersham N.334 Zを使用）に供した。精製す
るフアージをE.coliHB101に感染させ約２万個のアンピ
シリン抵抗性コロニーを得た。
3.pCT113およびpMM114の作製 これらのコロニーを、ニトロセルロースフイルターにレ
プリカし、アルカリ溶菌、中和、ついで真空下80℃で２
時間の加熱によりDNAをフイルターに固定した。約1000
万cpmのプローブ（14T−１、17T−２、14T−３及び17T
−４）を加えた、0.9M食塩、90mMトリス塩酸（pH7.
5）、6mM EDTA、0.5％ノニデツトP40、250μg/ml tRNA
溶液にフイルターを浸漬し、ハイブリダイゼーシヨンを
行つた。温度はプローブ毎に異り、14T−３で36℃、17T
−２で44℃などであり、M.mieheiIF9740からのクロー
ニングに用いたMPR遺伝子全長を含む約4kbのDNA断片で
は42℃である。そののち0.9M食塩、90mMクエン酸ナトリ
ウム溶液中で１時間、ハイブリダイゼーシヨンと同じ温
度で洗浄し、さらに０℃で数回洗つた。次にオートラジ
オグラムによりプローブの結合した株を特定した。M.pu
sillusIF4578（＋）のDNAを持つ株に関しては、３個
のプローブのいずれでも陽性な株のみが真正はハイブリ
ダイズをしていると考え、この株のもつコスミドをpCT1
1と命名した。
プリカし、アルカリ溶菌、中和、ついで真空下80℃で２
時間の加熱によりDNAをフイルターに固定した。約1000
万cpmのプローブ（14T−１、17T−２、14T−３及び17T
−４）を加えた、0.9M食塩、90mMトリス塩酸（pH7.
5）、6mM EDTA、0.5％ノニデツトP40、250μg/ml tRNA
溶液にフイルターを浸漬し、ハイブリダイゼーシヨンを
行つた。温度はプローブ毎に異り、14T−３で36℃、17T
−２で44℃などであり、M.mieheiIF9740からのクロー
ニングに用いたMPR遺伝子全長を含む約4kbのDNA断片で
は42℃である。そののち0.9M食塩、90mMクエン酸ナトリ
ウム溶液中で１時間、ハイブリダイゼーシヨンと同じ温
度で洗浄し、さらに０℃で数回洗つた。次にオートラジ
オグラムによりプローブの結合した株を特定した。M.pu
sillusIF4578（＋）のDNAを持つ株に関しては、３個
のプローブのいずれでも陽性な株のみが真正はハイブリ
ダイズをしていると考え、この株のもつコスミドをpCT1
1と命名した。
この株から、コスミドDNAを調製し、制限酵素Hin dIII
で切断後アガロースゲルに流した。約15本のバンドが現
れたので、このDNAをゲルごとアルカリ処理することに
より変性させたのち、ニトロセルロースフイルターに転
写した。常法通り固定したのち、前述の３プローブ約10
0万CPmと、0.6M食塩、60mMクエン酸ナトリウム、１％ド
デシル硫酸ナトリウム中でハイブリダイズさせたとこ
ろ、いずれも約4.5kbの同一の断片にハイブリダイズし
たので改めてこの断片を調製し、pBM322のHin dIII部位
に挿入してpCT113を得た。
で切断後アガロースゲルに流した。約15本のバンドが現
れたので、このDNAをゲルごとアルカリ処理することに
より変性させたのち、ニトロセルロースフイルターに転
写した。常法通り固定したのち、前述の３プローブ約10
0万CPmと、0.6M食塩、60mMクエン酸ナトリウム、１％ド
デシル硫酸ナトリウム中でハイブリダイズさせたとこ
ろ、いずれも約4.5kbの同一の断片にハイブリダイズし
たので改めてこの断片を調製し、pBM322のHin dIII部位
に挿入してpCT113を得た。
同様にして得たM.mieheiIF9740のDNAを持つ、ハイブ
リダイゼーシヨン陽性株のコスミドをpMM11と命名し
た。pCT11と同様の処理をしたところ、やはり約4.5kbの
Hin dIII断片とハイブリダイズしたので、この断片をpB
R322のHin dIII部位に再クローンしpMM114とした。
リダイゼーシヨン陽性株のコスミドをpMM11と命名し
た。pCT11と同様の処理をしたところ、やはり約4.5kbの
Hin dIII断片とハイブリダイズしたので、この断片をpB
R322のHin dIII部位に再クローンしpMM114とした。
4.塩基配列の決定 pCT113又はpMM114のMucor由来DNA部分を制限酵素HaeIII
またはHin cIIで切断して得られる種々の断片約20ng
を、１本鎖フアージM13mp10の複製型２本鎖DNA20ngの、
予め脱リン酸した制限酵素SmaI切断部位に繋ぎ込んだ。
因みにこれらの制限酵素は、いずれも平滑末端を与える
ため、T4 DNAリガーゼで接続可能である。リガーゼ反応
は、30μｌ反応液中４℃または12℃で酵素約300unitを
用いて行つた。
またはHin cIIで切断して得られる種々の断片約20ng
を、１本鎖フアージM13mp10の複製型２本鎖DNA20ngの、
予め脱リン酸した制限酵素SmaI切断部位に繋ぎ込んだ。
因みにこれらの制限酵素は、いずれも平滑末端を与える
ため、T4 DNAリガーゼで接続可能である。リガーゼ反応
は、30μｌ反応液中４℃または12℃で酵素約300unitを
用いて行つた。
次いで、M13クローニングシステム（Amersham N.4503）
の指示に従い塩基配列決定用１本鎖DNAを得た。概要
は、組換えDNAを塩化カルシウム法によりE.coliJM105に
形質転換し、５ブロモ−４クロロ−３インドリル−β−
Ｄガラクトシド含有寒天平板上に無色の溶菌斑を生じさ
せる。次いでこの溶菌斑より単離したフアージをJM105
に再感染させて増幅し、培養上清から食塩、ポリエチレ
ングリコール溶液によりフアージ粒子を沈殿させる。こ
の粒子によりフエノール処理により一本鎖DNAを取出
し、エタノール沈殿によつて濃縮して塩基配列決定に用
いる。
の指示に従い塩基配列決定用１本鎖DNAを得た。概要
は、組換えDNAを塩化カルシウム法によりE.coliJM105に
形質転換し、５ブロモ−４クロロ−３インドリル−β−
Ｄガラクトシド含有寒天平板上に無色の溶菌斑を生じさ
せる。次いでこの溶菌斑より単離したフアージをJM105
に再感染させて増幅し、培養上清から食塩、ポリエチレ
ングリコール溶液によりフアージ粒子を沈殿させる。こ
の粒子によりフエノール処理により一本鎖DNAを取出
し、エタノール沈殿によつて濃縮して塩基配列決定に用
いる。
塩基配列決定法は宝酒造のM13シークエンシングキツト
（6010B）によつた。この決定法においては、DNAポリメ
ラーゼラージフラグメントによりフアージDNAの相補鎖
を合成する際に、放射性同位体（実際にはα−32Ｐ−dC
TP）を含む４種のデオキシヌクレオチド３燐酸と共に、
４種のうち１種類のデオキシヌクレオチド３燐酸類縁体
（ジデオキシNTP）を加えて反応させると、この類縁体
を取込んだ分子はそこで伸長反応が停止する。類縁体の
取込みは無作為に起こるので、実際にはその類縁体が取
込まれる可能性のあるすべての箇所で伸長反応が止まつ
た種々の長さの相補鎖が合成される。４種の類縁体のそ
れぞれについて同様の反応を行い、合成された相補鎖の
長さをオートラジオグラム上で比較することにより塩基
の配列を知ることができる。
（6010B）によつた。この決定法においては、DNAポリメ
ラーゼラージフラグメントによりフアージDNAの相補鎖
を合成する際に、放射性同位体（実際にはα−32Ｐ−dC
TP）を含む４種のデオキシヌクレオチド３燐酸と共に、
４種のうち１種類のデオキシヌクレオチド３燐酸類縁体
（ジデオキシNTP）を加えて反応させると、この類縁体
を取込んだ分子はそこで伸長反応が停止する。類縁体の
取込みは無作為に起こるので、実際にはその類縁体が取
込まれる可能性のあるすべての箇所で伸長反応が止まつ
た種々の長さの相補鎖が合成される。４種の類縁体のそ
れぞれについて同様の反応を行い、合成された相補鎖の
長さをオートラジオグラム上で比較することにより塩基
の配列を知ることができる。
２種の制限酵素による断片からでは、重なり合わなかつ
た部分に関しては、配列から確認された制限酵素Bgl II
認識部位で切断した断片を、新たにM13のBam HI部位に
組込み塩基配列を決定した。
た部分に関しては、配列から確認された制限酵素Bgl II
認識部位で切断した断片を、新たにM13のBam HI部位に
組込み塩基配列を決定した。
上述のようにして、得られたムコール・レンニン生産性
遺伝子は、前記塩基配列を有する従来未知の遺伝子であ
ることが確認された。
遺伝子は、前記塩基配列を有する従来未知の遺伝子であ
ることが確認された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/58 Ｃ１２Ｒ 1:785）
Claims (1)
- 【請求項１】下記塩基配列 を有することを特徴とする、ムコール属に属する凝乳酵
素生産性微生物が生産する微生物レンニンをコードする
DNA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61108674A JPH0675507B2 (ja) | 1986-05-14 | 1986-05-14 | ムコ−ル・レンニン生産性遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61108674A JPH0675507B2 (ja) | 1986-05-14 | 1986-05-14 | ムコ−ル・レンニン生産性遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62265985A JPS62265985A (ja) | 1987-11-18 |
| JPH0675507B2 true JPH0675507B2 (ja) | 1994-09-28 |
Family
ID=14490795
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61108674A Expired - Lifetime JPH0675507B2 (ja) | 1986-05-14 | 1986-05-14 | ムコ−ル・レンニン生産性遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0675507B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3012377B2 (ja) * | 1991-10-11 | 2000-02-21 | 名糖産業株式会社 | 低耐熱性プロテアーゼとその関連物及びその生産法 |
-
1986
- 1986-05-14 JP JP61108674A patent/JPH0675507B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62265985A (ja) | 1987-11-18 |
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