JPH07308194A - アシネトバクター・カルコアセチカスからの酵素ムタロターゼの製造のためのｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 アシネトバクター・カルコアセチカスの酵素
ムタロターゼの製造のためのＤＮＡ配列、組換えＤＮＡ
分子および方法の提供。 【構成】 下記ＤＮＡ配列を有するアシネトバクター・
カルコアセチカスの酵素ムタローゼのＤＮＡ分子。 上記ＤＮＡ配列を含むクローニング用組換えＤＮＡ分子
の少なくとも一つで形質転換されている大腸菌宿主。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、酵素ムタロターゼ（ｍｕｔａｒ
ｏｔａｓｅ；変旋光酵素）の生物学的活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子の
製造に関する。更に、本発明は、酵素ムタロターゼの生
物学的活性を有するポリペプチドの製造に用いられる組
換えＤＮＡ分子、すなわちクローニングおよび発現ベク
ター、およびかかるベクターで形質転換されたホスト生
物、例えば細菌、酵母、その他の菌類、および動物また
はヒト細胞に関する。

【０００２】ムタロターゼ（アルドース１−エピメラー
ゼ、ＥＣ５．１．３．３）はアルドヘキソースのα−お
よびβ−アノマーの間、例えばα−およびβ−グルコー
スまたはα−およびβ−ガラクトース間の平衡達成速度
を高めることが知られている。この酵素は主に、分析生
化学において、α−またはβ−型に特異な酵素によるア
ルドースの酵素検出反応（これらにおいてそれら２種類
のアノマー間の平衡達成が律速段階である）の速度を高
めるために用いられており、例えばグルコースデヒドロ
ゲナーゼ、グルコースオキシダーゼまたはガラクトース
デヒドロゲナーゼを用いた測定方法などに用いられてい
る。

【０００３】工業的用途も、例えばグルコアミラーゼ／
グルコースイソメラーゼ法にとって重要であろう。その
理由は、酵素グルコアミラーゼは、変旋光が生起するま
ではグルコースイソメラーゼによりα−型に転化され得
ないβ−グルコースを遊離するからである。ムタロター
ゼは天然に広く分布していて、様々な微生物（細菌、酵
母および線状菌類）、植物および動物組織に存在してい
る。

【０００４】工業的規模でのムタロターゼ単離を可能と
する唯一の相当な酵素含量は今までに哺乳動物（畜牛、
豚）の腎臓に見出されていて；すべての既知の市販品は
腎臓から調製されている。牛腎臓の新鮮重量１ｇあたり
のムタロターゼ活性含量は例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるよりも６０倍以上であ
ることが知られている（Ｂａｉｌｅｙ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．１９７５，４７８）。アスペルギルス・ニ
ガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の菌株か
らのムタロターゼの微生物学的製造方法はＢｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ６６２，２８５（１９
８１）に初めて記載された。これによれば、最良の菌株
から得られたムタロターゼ活性は、４．４ｍＵ／ｍｌ培
養ブロスであり、ミハエリス（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ）定
数は５０ｍＭであり、そして至適ｐＨは５〜７の範囲で
あった。

【０００５】しかしながら、前述の微生物学的方法を用
いた場合、酵素ムタロターゼは、牛腎臓からの製造方法
によるよりも低収率で得られるにすぎない。その上、ア
スペルギルス・ニガー由来の酵素の性質は、アルドース
の酵素的測定の範囲内で平衡を達成する目的には好まし
くない。従って、本発明の目的は、酵素ムタロターゼの
生物学的活性を有するポリペプチドを利用可能とするこ
と、および、このタンパク質の工業的大量生産を可能と
する遺伝子工学的方法を提供することにある。

【０００６】「酵素ムタロターゼの生物学的活性を有す
るポリペプチド」という用語はそのアミノ酸配列がアシ
ネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）よりの天然ム
タロターゼに相当し、このアミノ酸配列に類似し、また
はその一部を含むポリペプチドまたはタンパク質を意味
する。本発明によれば相当する融合タンパク質も「酵素
ムタロターゼの生物学的活性を有するポリペプチド」と
称される。

【０００７】ムタロターゼを形成し、そして好適なもの
として用いられる種はアシネトバクター属の微生物であ
る。これらのうちでも、アシネトバクター・カルコアセ
チカスの菌株ＤＳＭ３０００７、ＤＳＭ３０００８、Ｄ
ＳＭ３００１０またはＤＳＭ３００１１、特にＤＳＭ３
０００８が、適宜の遺伝情報部分が導入されたそれらの
突然変異株または変異株と同様、好ましい。

【０００８】ムタロターゼをコードするＤＮＡを移植で
きる適当なホスト生物は、主として微生物であるが、植
物、動物またはヒト細胞であってもよい。微生物、例え
ば細菌、酵母および線状菌類、特に大腸菌系細菌が好ま
しい。

【０００９】酵素ムタロターゼの生物学的活性を有する
ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法を利用可能とする
ために、本発明によれば次の段階がとられる。まず、例
えば微生物アシネトバクター・カルコアセチカス株Ｎ
ｏ．ＤＳＭ３０００８を適当な培地で培養する。次にそ
の微生物の天然ムタロターゼをこの培養物から単離し、
そして生化学的タンパク質分析にかける。そのムタロタ
ーゼのアミノ酸部配列を確定後、ムタロターゼポリペプ
チドのアミノ酸位１２〜１７および３５３〜３５９に相
当するオリゴヌクレオチドを合成する。遺伝コードは縮
重（退）しているので、これらアミノ酸位の各々に相当
するオリゴヌクレオチドの配列には様々な可能性があ
る。従って、本発明によれば、各々についていくつか異
なるオリゴデオキシヌクレオチドが合成され、またその
後のハイブリッド形成においてオリゴヌクレオチド混合
物ＩおよびＩＩとして用いられる（第ＩＩＩ表参照）。

【００１０】この段階とは別に、適当な培地で培養され
たアシネトバクター・カルコアセチカス微生物（株Ｎ
ｏ．３０００８）から染色体ＤＮＡを単離する。次にそ
の染色体ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢｃｌ Ｉ、
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、ニトロセ
ルロース上にブロットし、そしてオリゴヌクレオチド混
合物ＩおよびＩＩでハイブリダイズさせる。これにより
６４００ｂｐの大きさのＢｃｌ Ｉ ＤＮＡ断片がオリ
ゴヌクレオチド混合物Ｉとハイブリダイズする。この断
片を、次にプラスミドｐＢＲ ３２７のＢａｍＨＩ切断
部位にクローニングする。制限分析とクローン化された
Ｂｃｌ Ｉ断片の部分配列決定との組合わせにより、こ
の断片はムタロターゼポリペプチドのＮ−末端領域をコ
ードしていることが示される。

【００１１】約１５００ｂｐの大きさのアシネトバクタ
ー・カルコアセチカス（株Ｎｏ．３０００８）の染色体
ＤＮＡのＨｉｎｄ ＩＩＩ断片は、オリゴヌクレオチド
混合物ＩＩとハイブリッド形成する。従ってこの断片
は、バクテリオファージＭ １３ ｍｐ １１のＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ切断部位にクローン化される。その後のマッ
ピングおよび部分ヌクレオチド配列決定により、そのク
ローン化されたＨｉｎｄＩＩＩ断片は、ムタロターゼポ
リペプチドのＣ−末端領域をコードしていることが示さ
れる。従って、本発明は、酵素ムタロターゼの生物学的
活性を有するポリペプチドをコードする、図１０に示さ
れたＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子に関する。

【００１２】本発明は、更にまた、ムタロターゼ遺伝子
の全暗号領域がλ−Ｐ_Ｌプロモーターの制御下にあり、
そしてムタロターゼ遺伝子の全ＤＮＡ配列を決定する組
換え発現プラスミドに関する。ムタロターゼポリペプチ
ドのＮ−末端領域をコードするこのＤＮＡ断片は、前述
の組換えｐＢＲ ３２７クローンに由来し、そしてムタ
ロターゼポリペプチドのＣ−末端領域をコードするＤＮ
Ａ断片は、前述のＭ１３ ｍｐ １１クローンに由来す
る。本発明によれば、発現制御配列としてのλ−Ｐ_Ｌプ
ロモーターに代えて、大腸菌プロモーター系例えば大腸
菌ｌａｃ系、大腸菌β−ラクタマーゼ系、大腸菌ｔｒｐ
系または大腸菌リポタンパク質プロモーター、酵母発現
制御配列、または他の真核発現制御配列などを用いるこ
とも等しく可能である。この意味合において唯一の重要
な点は、遺伝子が発現制御配列に機能的に連結されるこ
と、そして選択された発現制御配列が特定のホスト生物
に適していることである。

【００１３】本発明は、特に、本発明に従ってムタロタ
ーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現プ
ラスミドｐＷＨ １３７２に関する。組換え発現ベクタ
ーを構築した後、それは、常法により、形質転換可能な
ホスト生物、例えば大腸菌系細菌例えば大腸菌株Ｎｏ．
６９（Ｅ．Ｃｏｉｌ Ｋ １２ΔＨ１）などに導入され
る。形質転換されたホスト生物は、次いで自体知られた
方法により適当な栄養培地で培養され、そして発現時に
形成される酵素ムタロターゼの生物学的活性を有するポ
リペプチドがそこから標準的方法により得られる。従っ
て、本発明は、前述の条件下での発現時に合成され、ム
タロターゼの生物学的活性を有しそして図１１に示され
るアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。本発明
は、また、本発明によるＤＮＡを含むホスト生物、特に
プラスミドｐＷＨ １３７２で形質転換された大腸菌Ｗ
Ｈ １３７２（ＤＳＭ３４４２）にも関する。

【００１４】本発明によれば、アシネトバクター・カル
コアセチカスからのムタロターゼをコードする単離ＤＮ
Ａ配列を、ムタロターゼー生成性微生物または哺乳動物
のジーン・バンクにおけるプローブ分子として用いるこ
とにより、関連のムタロターゼ遺伝子を同定し、そして
それをこれらのジーン・バンクから単離することができ
る。このようにして、これら生物のムタロターゼをコー
ドする配列を適当な発現制御配列と機能的に接合するこ
とにより、哺乳動物例えば畜牛および豚、および微生物
例えばアスパージラス属微生物よりの酵素ムタロターゼ
の生物学的活性を有するポリペプチドを任意の所望量で
製造することも可能である。本発明の方法により製造さ
れる酵素ムタロターゼの生物学的活性を有するポリペプ
チドは、例えば、次のような諸性質により特徴付けられ
る。分子量は約４０，０００である。活性至適ｐＨは７
〜８のｐＨ範囲にあり、また至適温度は４２℃〜４６℃
である。グルコースに対するミハエリス定数は６〜８ｍ
Ｍである。その活性は、Ｈｇ^＋＋イオンおよびＦｅ
^＋＋＋イオンにより２ｍＭの濃度で略半減し；Ｃｕ^＋＋
イオン、Ｃｏ^＋＋＋イオンおよびＺｎ^＋＋イオンによる
阻害は、同濃度で完全である。

【００１５】本発明により製造される酵素ムタロターゼ
の生物学的活性を有するポリペプチドは、アルドヘキソ
ースに対して特異的である。その活性は、次のようにし
て測定される。

【化５】

【００１６】ムタロターゼ、グルコースデヒドロゲナー
ゼおよびＮＡＤを、用時調製されたα−グルコース溶液
と反応させ、そして形成されるＮＡＤＨ_２を３６６ｎｍ
における吸光度測定により測定する。基準値に対する、
ムタロターゼによるＮＡＤＨ_２形成速度増加により使用
溶液のムタロターゼ活性を計算することができる。この
ように、ムタロターゼ活性は、自体知られた方法によ
り、グルコースデヒドロゲナーゼ測定を経由して測定さ
れる。後者は、例えば臨床化学における標準的方法の一
つである。

【００１７】ムタロターゼ酵素活性は、ブランク（ムタ
ロターゼを含有しない）と分析値（ムタロターゼを含有
する）の間の差から次式により与えられる： 酵素活性＝ΔΔＥ／分×４．０９Ｕ（ムタロターゼ）／
ｍｌ（使用酵素溶液） （Ｅ＝３６６ｎｍにおける吸光度）導入されるβ−グル
コースはすべてこの試験法を妨害するので粗製ムタロタ
ーゼ検体は、グルコースが存在していないかどうか試験
する必要がある。

【００１８】クローニングに用いられ、また以上および
以下において記載されるすべての制限酵素および出発プ
ラスミド、ファージおよびホスト系は、それらの起源ま
たは製造の詳細が明細書中に与えられていない場合は、
既知であるかまたは参照用文献中に詳述されており、従
って容易に入手しうるものである。これらの、および使
用される標準的方法の一部の詳細なレビューが文献３４
（後掲）にみられる。

【００１９】以下に実施例として本発明の態様を例示的
に示すが、例中では以下の略号が用いられている。 ＡＴＰ アデノシントリホスフェート Ｂｉｓ Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−メチレンビスアクリル
アミド ｂｐ 塩基対 ＢＳＡ 牛血清アルブミン ＣＢ 臭化シアン切断により生成したペプチド ｃｐｍ １分あたりの計数値 Ｄａ ダルトン、ｇ／ｍｏｌ ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド ｄＮＴＰ デオキシヌクレオシド５′−トリホスフェー
ト ＥＤＴＡ エチレンジアミンテトラアセテート Ｅ．Ｃｏｌｉ 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ） ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィ ＩＰＴＧ イソプロピルチオガラクトシド^３２ Ｐ 相対質量３２の燐同位元素 ＰＥＧ ポリエチレングリコール ＰＶＰ ポリビニルピロリドン ＡＲＧ エンドプロティナーゼＡＲＧＣによる切断に
より生成したペプチド ｒｐｍ １分間あたりの回転数

【００２０】ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム Ｆ トリプシンによる切断により生成したペプチ
ド Ｔｒｉｓ トリスヒドロキシメチルアミノメタン Ｔｒｙｐｔｏｎｅ トリプシンで切断されたカゼイン Ｕ 酵素活性の単位 ＵＶ 紫外光 Ｘ−ＧＡＬ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ ヌクレオチド：アデニン（Ａ）、チミ
ン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ） なお、引用した文献番号の各文献は、本明細書の発明の
詳細な説明の項の末尾に、その番号の文献名を列記して
ある。

【００２１】

【実施例】

実施例１アシネトバクター・カルコアセチカスからのムタロター
ゼの単離および精製 発酵槽にまず次の組成の滅菌栄養培地１００リットルを
仕込む： カゼインからのペプトン ０．５％ 酵母エキス １．０％ トウモロコシデンプン粉 ０．３％ 燐酸水素二カリウム ０．８％ 硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０４％ グルコース １．２％ シリコーン消泡剤 １０ｍｌ ｐＨ ６．８

【００２２】このようにして調製された発酵槽に、同じ
栄養溶液中で１８時間インキュベートして調製されたア
シネトバクター・カルコアセチカス株３０００８の深部
培養物１リットルを接種する。この培養物を穏やかに通
気しながら３４℃で１８時間インキュベートする。濁度
として測定される生物量は最初の２〜１０時間増加した
後一定となる。１０時間後に培養物は４３Ｕ／リットル
にて最大ムタロターゼ活性に達する。

【００２３】次の方法を用いて、その細菌からムタロタ
ーゼを遊離させ、そして活性を測定する：発酵槽からの
十分に混合されたグルコース不含のサンプル３ｍｌを
５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして上清を
捨てる。細菌ペレットを３ｍｌの０．１Ｍホスフェート
緩衝液（ｐＨ６．５）および０．１ｍｌのＥＤＴＡ溶液
（１．８ｇ／リットル）に懸濁し、そしてその遠沈管中
のその懸濁液をアセトン／ドライアイス冷浴中で迅速に
凍結し、次いで４０℃の水浴で融解する。１滴の洗剤お
よび２５〜３０ｍｇのリゾチームを添加し（約１５，０
００Ｕ／ｍｇ）、そしてその混合物を２８℃で１５分間
撹拌する。次いでそれを４５℃で５分間加熱してＮＡＤ
Ｈオキシダーゼを失活させ、破砕を行い、そしてその反
応混合物を遠心分離により清澄化する。このようにして
得られた透明上清中の酵素の測定を前述の方法により行
う。

【００２４】培養物が最大活性に達したら粗製ムタロタ
ーゼ抽出液を調製する。０．５％の洗剤と０．１ｍｏｌ
／リットルの塩化カリウムを１００リットルの細菌懸濁
液に添加する。菌体を高圧ホモジナイザーを用いて５０
０バールで破砕する。この間、細菌懸濁液を冷却する必
要がある。３０００×ｇで３時間遠心分離して菌体破片
を除去する。沈殿を捨て、そして２０％のポリエチレン
グリコールを曇った遠心液に添加して随伴物質を沈殿さ
せる。その混合物を次いで３０分間撹拌し、そして沈殿
を遠心分離により除去する。依然として曇った上清は、
約２Ｕ／ｍｌのムタロターゼを含有しそしてこれを３×
１０^−３Ｓの伝導度となるまで水に対する透析濾過（ｄ
ｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）にかける。透析濾過後、ム
タロターゼをバッチ・プロセッサーで、ｐＨ５．５で乾
燥イオン交換体に吸着させる。２０，０００Ｕに対して
は５〜１０ｇのイオン交換体材料が必要である。負荷さ
れたイオン交換体を吸引濾過により取出しそして濾液が
透明となるまで０．０２５Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ
５．５）で洗浄する。次いでその負荷されたイオン交換
体をカラムに詰め、そして０．０２５Ｍ燐酸カリウム緩
衝液（ｐＨ５．５）を用いて吸光度がゼロとなるまで洗
浄し、次いで溶出を塩化カリウム濃度勾配を用いて行
う。酵素含有画分を集め、限外濾過により濃縮し、次い
で凍結乾燥する。このようにして得られた粗製抽出液の
比活性は約１６．１Ｕ／ｍｇ（タンパク質）である。

【００２５】得られた粗製抽出液２４２０ｍｇ（＝３
４，８００Ｕ）をＳｅｐｈａｄｅｘＧ １００分子ふる
いのカラム（２０×８５ｃｍ）にかける。２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を用いて７０ｍｌ／時の
流速で溶出を行い、１４ｍｌ容の画分を集める。それら
溶出液画分にムタロターゼ活性が認められる。それら画
分を、溶出時に重なり合う分子量２１ｋＤａのタンパク
質が排除されるように合一させる。これは、後者が以後
の精製段階によっては除去され得ないためである。

【００２６】合一画分をＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム
（２×２０ｃｍ）にかける。負荷されたカラムを２５０
ｍｌの２０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ
９．０）で洗浄する。流速は２０ｍｌ／時とし、５ｍｌ
容の画分を集める。直線的濃度勾配（３５０ｍｌの２０
ｍＭ、および３５０ｍｌの１７０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４／
ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ９．０）を溶出に用いる。ムタロタ
ーゼは８０ｍＭホスフェートで溶出される。

【００２７】集めたサンプルを１：４希釈し、そしてヒ
ドロキシアパタイト（球状）カラム（４×１０ｃｍ）に
かける。流速は９．２ｍｌ／時とし、２．３ｍｌ容の画
分を集める。そのカラムを１００ｍｌの２０ｍＭ Ｋ_２
ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ９．０）で洗浄する。溶
出は、３００ｍｌの２０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２Ｐ
Ｏ_４（ｐＨ９．０）より３００ｍｌの３００ｍＭ Ｋ_２
ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ９．０）までの直線的濃
度勾配を用いて行われ、ムタロターゼは、カラム材料に
より８５ｍＭにて放出される。次いで精製をＳＤＳゲル
（文献５参照）で行う（図１）。第３カラム段階の後
は、４０ｋＤａの分子量に相当する唯一のバンドを検出
し得るにすぎない。Ｇ１００分子ふるいカラムでの泳動
挙動から、自然条件ではそのタンパク質はオリゴマーの
形態にあるものと推論することができる。

【００２８】

【表１】

【００２９】実施例２ムタロターゼのペプチド配列の部分的決定 後述する方法を用いて、ムタロターゼペプチドの（ＤＮ
Ａよりの可及的少数の異なるコドンによりコードされる
アミノ酸を含む）部分配列を決定する。このタイプの配
列は、後の相当するオリゴヌクレオチドの選択に特に好
適である（実施例３参照）。

【００３０】実施例１における如きカラムクロマトグラ
フィによる最終精製段階の後ホスフェート緩衝液中にあ
るタンパク質をその１／２容の１００％酢酸およびその
１／２容のｎ−プロパノールと混合し、そしてその混合
物を回転蒸発器で蒸発乾涸する。塩類を除去するため
に、残留物をＰ１０分子ふるいカラム（２．５×２５ｃ
ｍ）にかけ、そして７０％酢酸を用いて溶出を行う。個
々の画分中のタンパク質を２８０ｎｍにおける吸収の測
定により検出する。タンパク含有画分を合一し、そして
その溶液を回転蒸発器で蒸発乾涸する。このようして得
られたタンパク質（ムタロターゼ）を、次のＮ−末端ア
ミノ酸の配列決定および、臭化シアンおよびトリプシン
切断に用いた。

【００３１】臭化シアン、トリプシンおよびエンドプロ
ティナーゼＡＲＧＣ切断 臭化シアンによる、および酵素トリプシンおよぴエンド
プロティナーゼＡＲＧＣによる切断を行ってムタロター
ゼ中アミノ酸の部分配列を決定する。臭化シアンによる
切断は、ＧｒｏｓｓおよびＷｉｔｔｋｏｐｐ（文献１２
参照）の手順により行う。前述の如く塩類を除去済みで
蒸発済みの１５ｍｇのタンパク質を３ｍｌの７０％蟻酸
にとり、１００倍モル過剰の臭化シアンを添加し、そし
てその混合物を暗所で７時間インキュベートする。蟻酸
を回転蒸発器で除去し、そして残留物を２ｍｌの７０％
酢酸にとる。次いで、切断生成物を、Ｐ１０およびＰ３
０分子ふるいカラム（２．５×５０ｃｍ）で分離する。
個々の切断生成物（断片）をＣＢ１−５と呼ぶ。図２
は、個々の断片が記載のカラムクロマトグラフィにおい
て溶出されている画分を示している。

【００３２】全タンパク質をトリプシンで消化するため
に、塩を除去してあり、かつ蒸発乾涸させてある２ｍｇ
のタンパク質を２ｍｌの１Ｍ重炭酸アンモニウムに溶解
し、そして１重量％のプロティナーゼを添加する。全タ
ンパク質はこれらの条件下では溶解しないので、その混
合物をＳＤＳ濃度が０．０５％となるように調節する。
トリプシンは全部で４回添加する必要がある。最後の添
加の後一夜インキュベーションする。依然として不溶物
を含有する反応混合物を１００μｌアリコートとしてＨ
ＰＬＣカラムにかける。

【００３３】Ｂｅｃｋｍａｎ ＨＰＬＣ系は、２つの溶
媒ディスペンサ（型式１００Ａおよび１１０Ａ）、可変
波長検出器（型式１６５）および濃度勾配混合器より成
る。溶出は溶液Ａ（水中０．０５％トリフルオロ酢酸）
を１０分間用いることによって開始する。次いで、濃度
勾配を適用し、溶媒Ｂの濃度（アセトニトリル中０．０
２５％トリフルオロ酢酸）を５０分内に５０％まで高め
る。流速は１．６ｍｌ／分とし、そして温度は５０℃と
する。カラム（０．７２×２５ｃｍ）に球状シリカゲル
（Ｎｕｋｌｅｏｓｉｌ ５ Ｃ_１８，Ｍａｃｈｅｒｙ
＆ Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｅｒｅｎ）を詰める。２１６ｎｍ
における吸収の測定によりペプチドを同定する。配列決
定のために、７〜１０クロマトグラフィ実験よりの画分
を集める。このようにして、特に、全ムタロターゼポリ
ペプチドのトリプシン断片Ｆ３８およびＦ４２を単離す
る（図３参照）。

【００３４】全タンパク質のトリプシン消化により、場
合によっては分離困難な切断生成物が得られる。酵素消
化に全タンパク質に代えて臭化シアン断片を用いれば分
離上の問題は、単純化される。タンパク質のＣ−末端領
域に関する更なる情報を得るために、臭化シアン断片Ｃ
Ｂ５をエンドプロティナーゼＡＲＧＣを用いてそのアル
ギニン位で切断した。そのＡＲＧＣ切断もまた、１Ｍ重
炭酸アンモニウム（ｐＨ７〜８）中、１重量％のプロテ
ィナーゼの存在下に３７℃で行われる。

【００３５】消化混合物を回転蒸発器で蒸発させ、残留
物を２ｍｌの９０％蟻酸に溶解し、そしてその溶液を１
ｍｌの水で希釈しそしてＰ１０カラム（２．５×１００
ｃｍ）にかけた。溶出は２０％蟻酸を用いて行った。こ
のようにして３画分Ｉ〜ＩＩＩを溶出し、そしてこれら
のうち、画分Ｉを２．５×５０ｃｍ長のＰ１０カラムで
再度クロマトグラフィにかけた（図３ａ）。

【００３６】アミノ酸分析 全ムタロターゼポリペプチドのアミノ酸分析を最初に行
う。このために、５ｎｍｏｌのタンパク質を、２ｍｌの
６Ｍ ＨＣｌ、０．０５％チオグリコール中１５０℃で
２時間還元条件下に加水分解する。２ｍｌの６Ｍ ＨＣ
ｌ、１．５％ＤＭＳＯ中、１１０℃で２０時間酸化条件
下に加水分解を行う。次にサンプルを回転蒸発器で蒸発
させ、そして、製造元の指示に従ってＬＣ６００（Ｂｉ
ｏｔｒｏｎｉｋ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）アミノ酸分析器
を用い、０．６×２１ｃｍ ＤＣ６Ａ樹脂カラムで分析
する。このようにして測定された全ポリペプチドのアミ
ノ酸組成を第ＩＩ表に示す。ＤＮＡ配列から推論される
アミノ酸組成は「配列」欄に掲げられている。これより
計算されうるムタロターゼの分子量は、３９，５００Ｄ
ａである。

【００３７】

【表２】

【００３８】前述の実験条件下では、トリプトファンは
測定できない。第ＩＩ表から、タンパク質が４個のメチ
オニン残基を含んでいることがわかる。従って臭化シア
ン切断時には５個の断片が期待される。すなわち、前述
の（図２参照）臭化シアン切断およびその後の切断生成
物の分離の結果と、アミノ酸分析の結果（第ＩＩ表参
照）とが合致する。適切な場合には、臭化シアン、トリ
プシンおよびエンドプロティナーゼＡＲＧＣ切断により
得られるペプチドのアミノ酸組成も前述の如くに測定す
る。

【００３９】アミノ酸配列の決定 まず、ムタロターゼのＮ−末端アミノ酸を自動液相配列
決定装置（Ｂｅｃｋｍａｎ型式８９０Ｃ）を用いて測定
する。アミノ酸の２−アニリノ−１，３−チアゾリン−
５−オン誘導体を２０％トリフルオロ酢酸中５５℃で３
０分間インキュベートする。フェニルチオヒダントイン
誘導体をＨＰＬＣ系で同定する（文献８参照）。

【００４０】次に、断片ＣＢ１、ＣＢ２、Ｆ４２、ＣＢ
３、ＣＢ４、ＣＢ５、Ｆ３８、ＡＲＧ１、ＡＲＧ２およ
びＡＲＧ３のアミノ酸配列を決定する（図４参照）。こ
れら断片を固相法により５０℃でＬＫＢ型式４０２０装
置を用いて配列させる。それら断片のＣ−末端をＥＤＣ
（１−エチル−３−（３−ジエチルアミノ−プロピル）
カルボジイミド、ＨＣｌ）を用いて３−アミノプロピル
−グラスに結合させる（文献９参照）。次にＥｄｍａｎ
分解をＬａｕｒｓｏｎ法により行う（文献１０参照）。
アミノ酸のフェニルヒダントン誘導体をＭｅｒｃｋ Ｈ
ＰＴＬＣプレート（シリカゲル６０Ｆ Ｇ ２５４）で
の薄層クロマトグラフィにより同定する（文献１１参
照）。このようにして得られる前記ムタロターゼ断片の
アミノ酸配列に対しムタロターゼの全体のアミノ酸配列
における相対的位置を付与する。

【００４１】これは、次のようにして行われる。臭化シ
アン断片ＣＢ１およびＣＢ２の位置は、それらのアミノ
酸配列と全ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸配列とが合
致するところから明白である（図４参照）。臭化シアン
断片ＣＢ３の最初の５個のアミノ酸を測定する。臭化シ
アン切断後のクロマトグラフィよりの、第１吸収極大の
物質をＰ６０カラム（２．５×５０ｃｍ）を用いて再度
クロマトグラフィにかける。配列決定は、Ｎ−末端配列
（すなわち前記極大は未切断物質を含有した）および臭
化シアン断片ＣＢ２の最初の６個のアミノ酸を並行的に
示す。ムタロターゼポリペプチド中のＣＢ３の相対位置
は、相当する構造遺伝子のＤＮＡ配列が決定されるまで
確定できない（図４参照）。

【００４２】臭化シアン断片ＣＢ４の配列はトリプシン
切断よりの断片Ｆ３８中に完全に保持されている。それ
は１１個のアミノ酸より成る（図４参照）。臭化シアン
断片ＣＢ５は、臭化シアン断片ＣＢ３から、２．５×５
０ｃｍ大のＰ３０カラムでのクロマトグラフィに再度か
けることにより分離することができる。ホモセリンはア
ミノ酸分析で認められないので、臭化シアン断片ＣＢ５
はＣ−末端断片でなければならない。ＣＢ５の４２個の
アミノ酸の配列を決定する（図４参照）。臭化シアン断
片ＣＢ４およびＣＢ５の確立された配列のムタロターゼ
の全ポリペプチドにおける相対的帰属は、ムタロターゼ
ポリペプチドのトリプシン切断よりの断片の配列決定お
よびムタロターゼポリペプチドの臭化シアン断片ＣＢ５
のトリプシン切断よりの断片の配列決定により決定す
る。

【００４３】臭化シアン断片ＣＢ５を更に細かく断片化
することにより得られる画分Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（図
３ａ）の配列決定を行った。画分ＩＩのペプチドの配列
は、ＣＢ５の最初の２０個のアミノ酸と一致する。臭化
シアン断片内のそれらの配列に従って、ペプチドにＡＲ
Ｇ１〜ＡＲＧ３の番号を付与した。画分ＩＩ（ＡＲＧ
１）のペプチドの配列は、ＣＢ５の最初の２０個のアミ
ノ酸と一致した。画分Ｉよりのペプチドは、その配列が
ＣＢ５の位置２１〜４２と重複したため、ＡＲＧ２とし
て同定された。それは、この配列のほかにアミノ酸Ｓｅ
ｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇを有していた。ＡＲＧ３は、ＣＢ５
のＣ−末端配列である。ＡＲＧ１、ＡＲＧ２およびＡＲ
Ｇ３の配列は図４に示されている。

【００４４】臭化シアン断片ＣＢ５は、ムタロターゼの
Ｃ−末端ペプチド断片であるので、これによりムタロタ
ーゼポリペプチドのＣ−末端アミノ酸配列が確定する
（図４参照）。全タンパク質のトリプシン切断よりの断
片Ｆ３８の２５個のアミノ酸の配列決定により、臭化シ
アン断片ＣＢ４およびＣＢ５の相対的位置が与えられ
る。Ｆ３８がＣＢ４およびＣＢ５と重複するところか
ら、ＣＢ４とＣＢ５は直接に隣接しているはずである
（図４参照）。最後に、全ムタロターゼポリペプチドの
トリプシン切断に由来する断片Ｆ４２のアミノ酸配列を
決定する。２５アミノ酸鎖長であるその配列の相対的位
置は、ムタロターゼ構造遺伝子のヌクレオチド部分配列
が決定されるまで確定することはできない（第Ｖ表参
照）。

【００４５】実施例３オリゴヌクレオチドの合成 ムタロターゼをコードする遺伝子は、実施例５に記載さ
れるようなジーン・バンクから単離する。オリゴデオキ
シヌクレオチド（オリゴヌクレオチドと略記される）
は、このジーン・バンクをスキャニングするためのプロ
ーブ分子として働かせるために、化学合成により製造す
る。

【００４６】これらのオリゴヌクレオチドの配列は、実
施例２における如く決定されたムタロターゼポリペプチ
ドの部分アミノ酸配列のアミノ酸１２〜１７、および３
５３〜３５９（最後の７個のアミノ酸）から推定する。
遺伝暗号は縮重しているので、同じアミノ酸配列をコー
ドする様々なオリゴヌクレオチドを合成する必要があ
る。各場合につき関連するオリゴヌクレオチドを第ＩＩ
Ｉ表に掲げる。

【００４７】

【表３】

【００４８】前記三文字コードおよび一文字コードは、
天然に存在する２０個の生物アミノ酸について通常使用
される省略形である。第ＩＩＩ表に示されるオリゴヌク
レオチド配列のすべての組合わせを用時に合成する。そ
の合成は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（文献１
４、１５参照）により開発されたホスホルアミダイト法
を用い、官能性ｎ−プロピルアミノ基を備えたシリカゲ
ルより成る担体で行われる。個々のトリプレットの第３
位に、相互に水素結合を形成し得ない２個のヌクレオチ
ドを持たせることが可能なときは、等モル量のホスホル
アミダイトをカップリングに利用可能とする。挿入され
る二者択一物がＧとＣ、またはＡとＴである場合には、
この特定のカップリング段階に対しては担体材料を分け
る。合成終了時に、脱トリチル段階は行われない。何故
ならば、目的とするオリゴヌクレオチドはその方が、
５′−末端のトリチル保護基により副生物からより明瞭
に区別され得るからである。ホスフェート保護基を除い
た後、担体材料に対する共有結合を加水分解し、そして
塩基保護基を除去する。次いで溶液を回転蒸発器で蒸発
乾涸し、そして残留物を緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．
ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）にとる。懸濁
液および担体残留物を、このようにして得られたオリゴ
ヌクレオチドの粗製混合物から、遠心分離によって除去
する。各実験において、５〜１５Ａ_２６０単位をＨＰＬ
Ｃカラムを通して精製する。このカラムクロマトグラフ
ィにおける溶出は、５分間溶液Ａ（０．１Ｍトリエチル
アンモニウムアセテート中２０％アセトニトリル）を用
いることから開始される。次に、濃度勾配を適用し、ア
セトニトリル濃度を３０分間内に３０％まで高める。流
速は１５ｍｌ／分とし、そして温度は４５℃とする。オ
リゴヌクレオチド含有溶出液を合一し、そして蒸発乾涸
し、４００μｌの８０％（ｖ／ｖ）酢酸を添加し、そし
て室温で５分後に、その混合物を蒸発乾涸する。残留物
を５００μｌの水に再懸濁し、そして５％から２０％ア
セトニトリルの勾配を用いて再びクロマトグラフィにか
ける。このクロマトグラフィにおいて、脱トリチルされ
たオリゴヌクレオチドは１３〜１７％のアセトニトリル
濃度で溶出される。

【００４９】最後に、最終的収率をＨＰＬＣ緩衝液を基
準として用いて、２６０ｎｍで測定し、そして得られた
２つのオリゴヌクレオチド混合物ＩおよびＩＩを水から
２度凍結乾燥し、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液に懸濁す
る。

【００５０】実施例４アシネトバクター・カルコアセチカスからの染色体ＤＮ
Ａの調製 アシネトバクター・カルコアセチカス（ＤＳＭ３０００
８）の菌体を実施例１における如く培養する。５ｇの菌
体を５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．９）に懸濁し、そして
２００ｍｇのリソチームと共に３７℃で３０分間インキ
ュベートする。懸濁液をＳＤＳ濃度が１％となるまで調
整し、そして５ｍｇのプロティナーゼＫ（Ｍｅｒｃｋ）
と共に３７℃で更に３０分間インキュベートする。次に
その混合物を（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８・
０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡した）フェノールで
６回、次いでクロロホルム／イソアミルアルコール（２
０：１）で４回、注意深く抽出する。

【００５１】得られたＤＮＡを次に、三倍容のエタノー
ルを添加することにより沈殿させる。ＤＮＡを遠心分離
により沈殿させ、そして沈降物を乾燥させ、そして５ｍ
ｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．
１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁する。次いで５０μｇのＤＮ
アーゼ不含ＲＮアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）を添加する。Ｄ
Ｎアーゼは、１００ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）中
で１０分間沸騰することにより前もって失活させてあ
る。ＲＮアーゼＡで３０分間インキュベーション後、２
５０μｇのプロティナーゼＫを添加し、そしてその混合
物を更に３０分間インキュベートする。次にそれを再
び、やはりフェノールと共に６回、そしてジエチルエー
テルと共に３回振盪することにより抽出する。次いで１
／２容の１．５Ｍ ＮａＣｌ中３０％ＰＥＧ溶液を添加
することにより沈殿させ、エタノールで洗浄しそしてデ
シケータ中で乾燥させる。

【００５２】実施例５ゲノム・ムタロターゼ（ｇｅｎｏｍｉｃ ｍｕｔａｒｏ
ｔａｓｅ）配列のクローニング 材料と方法 酵 素： 制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびＥ．ｃ
ｏｌｉポリメラーゼおよび、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼ
のＫｌｅｎｏｗ断片をＢｏｅｈｒｉｎｇ，ＢＲＬまたは
Ｂｉｏｌａｂｓ社から購入し、そして製造元の指示に従
って使用した。ＥｃｏＲＩはＧｒｅｅｎｅ ｅｔ ａ
ｌ．（文献１６参照）の手順により調製する。

【００５３】ゲル電気泳動：制限分析のために、１，０
００ｂｐまでの鎖長のＤＮＡ断片を、ＴＥＢ緩衝液（６
０ｍＭ Ｔｒｉｓ，６０ｍＭ ホウ酸、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．３）および１０％グリセロール（文献１７
参照）中５％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド
／ビスアクリルアミド２０：１）で分画する（文献１７
参照）。５００ｂｐ〜９，０００ｂｐの鎖長のＤＮＡ断
片の分画には、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１
５ｍＭ ＮａＯＡｃ、１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．３）中１％アガロースゲルを用いる（文献１８参
照）。垂直アガロースゲル電気泳動には、高さ３ｃｍの
８％ポリアクリルアミド支持ブロックを装置の下側部分
に設定（ｃａｓｔ）する。アガロースゲルから単離され
たＤＮＡは、クローニング実験には適していないので、
分取する目的には、グリセロールの添加されていない３
％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド／ビスアク
リルアミド５０：１）を用いる。ゲル電気泳動後、ゲル
を装置から取り出し、そして０．００１％臭化エチジウ
ム溶液中で１０分間染色する。これによってＤＮＡ含有
バンドはＵＶ光下に可視となる。

【００５４】ＤＮＡの調製：アシネトバクター・カルコ
アセチカスからの染色体ＤＮＡの調製は実施例４に記載
されている。プラスミドＤＮＡ、およびＭ１３ファージ
の複製型のＤＮＡの単離をＨａｒｄｉｅｓ ｅｔ ａ
ｌ．の方法（文献１９参照）により行う。単鎖Ｍ１３
ＤＮＡはＭｅｓｓｉｎｇ（文献２０参照）の記載すると
ころに従って調製する。ゲル電気泳動による分画または
ハイブリダイゼーション分析には、ファージ上清を、１
／４容の２．５Ｍ ＮａＣｌ中２０％ＰＥＧ６０００溶
液を用いて４℃で１５分間沈殿させることにより５倍濃
縮する。

【００５５】プラスミドＤＮＡの分取目的での単離は、
次のような形質転換体の迅速分析方法によって行われ
る。単一の細菌コロニーを選抜プレートに拡げる。接種
用白金耳を用いて約１ｍｍ^３の細菌集塊を取り出し、そ
して８０μｌのＴｒｉｔｏｎ緩衝液（８％シュークロー
ス、５％Ｔｒｉｔｏｎ×１００、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁す
る。７μｌのリソチーム緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ中１０ｍｇ
／ｍｌリソチーム）の添加後、サンプルを室温で５分間
インキュベートする。次にそれらを１００℃で４０秒間
加熱し、次いで氷上に２分間置く。微量遠心分離器で１
５分間遠心分離後、細菌の粘着性残留物を接種用白金耳
で除去する。次に８０μｌのイソプロパノールを上清に
添加し、そして混合物を２０分間氷浴中に置く。これに
よって生じる沈殿を、１５分間遠心分離することにより
沈降させ、そして、上清を捨てた後、それを２回６００
μｌのエタノールで洗浄し、そして真空乾燥する。得ら
れたプラスミドＤＮＡを４０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）に溶解し、そしてアガロースゲルで分析する。

【００５６】ゲルの溶出：ポリアクリルアミドゲルから
のＤＮＡ断片の溶出をＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ
の方法（文献２１参照）によって行う。５％および２０
％ポリアクリルアミドゲル片をまずＴｅｆｌｏｎ杆を用
いて機械的に粉砕する。３％ポリアクリルアミドゲル片
を使い捨て２０ｍｌシリンジを用いて直径０．８ｍｍの
カニューレに押し通す。溶出されたＤＮＡを、２００μ
ｌ容のカラム材料を有するＤＥ５２カラムにかけ、そし
て４００μｌの２Ｍ ＮａＣｌで溶出する（文献２０参
照）。オリゴヌクレオチドを１Ｍ ＮａＣｌで溶出し、
次いで直接ハイブリダイゼーションに用いる。そのＤＥ
５２カラムから溶出後、二本鎖ＤＮＡをエタノールで２
回沈殿させる。

【００５７】形質転換：Ｅ．ｃｏｌｉ株をＣａＣｌ_２法
（文献１７参照）により形質転換する。 ＤＮＡの放射性標識：オリゴヌクレオチドの５′−末端
をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼおよび〔γ−
^３２Ｐ〕−ＡＴＰを用いて放射性標識する（文献２１参
照）。これに要する８，０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活
性を有する〔γ−^３２Ｐ〕−ＡＴＰはＷａｌｓｅｔｈお
よびＪｏｈｏｎｓｏｎの方法（文献２３参照）により合
成する。得られる標識オリゴヌクレオチドの比活性を、
４０ｃｍ長 ２０％ ８Ｍ尿素ゲルで非ホスホリル化オ
リゴヌクレオチドを除去することにより増大させる。こ
のゲル電気泳動は遊離ＡＴＰおよび無機ホスフェートを
も除去する。プラスミドＤＮＡはＷｅｉｎｓｔｏｃｋ
（文献２４参照）のニック・トランスレーション法によ
り放射性標識される。次に、反応混合物中に残存する過
剰のトリホスフェートをＰａｓｔｅｕｒピペット中Ｇ５
０分子ふるいカラムを用いて除去する。

【００５８】ハイブリダイゼーション： サザーンブロット分析：染色体ＤＮＡの、または組換え
プラスミドのＤＮＡの切断により得られた制限断片をア
ガロースゲルで分離しそしてＳｏｕｔｈｅｒｎ（文献２
５参照）法によりニトロセルロース上にブロットする。
ニトロセルロースフィルタを台所用フィルム内にシール
し、そしてフィルタ表面積４０ｃｍ^２あたり１ｍｌのハ
イブリダイゼーション溶液１ｍｌを用いて６０℃で４時
間予備的にハイブリッド形成させる（６×ＮＥＴ、１０
×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳ；１×ＮＥＴ
＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．３、１ｍＭ ＥＤＴＡ；１×Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ溶液＝０．０２％牛血清アルブミン、０．０２％ポ
リビニルピロリドン４０、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ）。
次に、標識オリゴヌクレオチド（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ計数
により約１〜２×１０^６ｃｐｍ）を添加する。両オリゴ
ヌクレオチド混合物に対し選択されるハイブリッド形成
温度は４０℃である。３〜５時間ハイブリッド形成後、
フィルタを１５分間４℃で２回洗浄する。次にそれらを
４０℃で１分間洗浄する。次にオートラジオグラフィを
−７０℃で１２時間行う。非特異的ハイブリッド形成信
号は高められた温度でもう１分間洗浄手順をふむことに
より除去することができる。次に、関連のニトロセルロ
ースフィルタをもう一度前述の如く露出させる。

【００５９】ドット−ブロット分析：前述の如く調製さ
れた組換えプラスミドのＤＮＡ、３％ポリアクリルアミ
ドゲルから溶出された染色体ＤＮＡ、および単鎖ファー
ジ上清をドット−ブロット分析にかける。このために、
５μｌのＤＮＡをニトロセルロースフィルタ上にピペッ
トで移し、そして送風機を用いて乾燥させる。二本鎖Ｄ
ＮＡの場合には、そのフィルタを湿らせたクロマトグラ
フィ紙上で室温にて処理する。クロマトグラフィ紙の含
浸に用いられた以下の溶液を順次用いる：

【００６０】２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）を５分間；５００ｍＭ ＮａＯＨを５分間；５００
ｍＭ ＮａＯＨ／１．５ＭＮａＣｌを５分間；１Ｍ Ｔ
ｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を２×２分間；５００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌを４分間；６×ＳＳＣ緩衝液（１×ＳＳＣ＝１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸トリナトリウム）
を５分間。次にそのフィルタを減圧下に２時間オーブン
中８０℃で焼き付ける。それらフィルタと放射性標識オ
リゴヌクレオチド混合物ＩおよびＩＩとのハイブリッド
形成を前述の如く行う。フィルタとニック・トランスレ
ーションを施したプラスミドとのハイブリッド形成はＷ
ａｈｌ ｅｔ ａｌ．の方法（文献２６参照）により行
う。

【００６１】コロニーハイブリダイゼーション：２個の
寒天プレート（４０ｍｇ／リットルアンピシリンで富
化）（２４．３×２４．３ｃｍ、Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒ
ｍｅｄ、スクリーニング用プレート）の各々にニトロセ
ルロースフィルタ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓ
ｃｈｕｅｌｌ ＢＡ−８５）を被せる。次に１，０００
個の細菌コロニーを滅菌つまようじを用いて同じパター
ンで、一方のプレートのニトロセルロースフィルタおよ
び他方のプレートの寒天に移し、そして３７℃で１８時
間インキュベートする。次にそれらコロニーを有するフ
ィルタをドット−ブロット分析法（前記参照）と同様に
処理する。それらフィルタを減圧下に２時間８０℃で焼
き付けた後、それらを６×ＮＥＴ、１０×Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳで３回洗浄し、そして同じ緩
衝液中４０℃で５時間、２４×１０^６ｃｐｍの標識オリ
ゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる。それらフィ
ルタを次いで２回６×ＳＳＣを用いて４℃で１５分間、
次に４０℃で５〜８分間、そして最後に４２℃で１分間
洗浄する。Ｘ線フィルムの最初の感光の後、それらフィ
ルタを再び６×ＳＳＣを用いて４４℃で２分間洗浄し、
そして別のＸ線フィルムの感光に用いる。最後に、それ
らフィルタを６×ＳＳＣ中４６℃で１分間洗浄し、そし
て再びＸ線フィルムの感光に用いる。

【００６２】配列分析：大体において、ＤＮＡ配列はＭ
ａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（文献２１参照）の方法
により決定される。適切な場合、例えば適当な制限切断
部位が存在しない場合には、ＤＮＡ断片はｐＵＲ ２５
０中にサブクローン化される（文献２８参照）。Ｍ１３
クローンの同定には、Ｍ１３法（文献２７参照）による
配列決定を行う。前述の諸方法は、本質的に分子生物学
の標準的方法であり、また実験室マニュアル例えば“Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ．著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２年などに記載されてい
る。

【００６３】ゲノム・ムタロターゼ配列のクローニング アシネトバクター・カルコアセチカス（ＤＳＭ３０００
８）よりの染色体ＤＮＡサンプル４００μｇを制限エン
ドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢ
ｃｌ Ｉで切断する。次に２０μｇを１％アガロースゲ
ルでの電気泳動にかけ、そしてニトロセルロース上にブ
ロットする（いわゆるトータルＤＮＡブロット）。前述
の如くハイブリッド形成を行った後、オリゴヌクレオチ
ド混合物Ｉに対しては４４℃で短時間、そしてオリゴヌ
クレオチド混合物ＩＩに対しては４６℃で短時間、洗浄
を行う。Ｂｃｌ Ｉ切断をオリゴヌクレオチド混合物Ｉ
とハイブリッド形成すると６４００ｂｐの大きさの領域
に再現性のある信号が得られる。ＥｃｏＲＩ切断をオリ
ゴヌクレオチド混合物Ｉとハイブリッド形成させると２
０００ｂｐの大きさの領域に、そしてＨｉｎｄ ＩＩＩ
切断の場合には１５００ｂｐの大きさの領域に再現性の
ある信号が生じる。

【００６４】約１５００ｂｐの大きさのＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ断片はオリゴヌクレオチド混合物ＩＩとハイブリッド
形成する。次に、アシネトバクター・カルコアセチカス
ＤＮＡのＢｃｌ Ｉ断片とプラスミドｐＢＲ３２７（Ａ
ＴＣＣ３１３４４）のＢａｍＨＩ切断ＤＮＡを用いてジ
ーン・バンクを構成する。このために、アシネトバクタ
ー・カルコアセチカスのＢｃｌ Ｉ切断染色体ＤＮＡ１
２０μｇを、３８００ｂｐ長の断片がゲルの下端に達す
るまで、３％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にか
ける。３８００ｂｐより上方のアクリルアミドを９個の
幅狭の帯状片に切断し、そして各個のゲル画分からＤＮ
Ａを溶出する。溶出されたＤＮＡの各々の１／４をドッ
ト−ブロット分析でハイブリッド形成させる。

【００６５】二番目に大きな断片を有するゲル帯状片よ
りの画分が最強の信号を与える。それ故に、この画分の
溶出ＤＮＡの１／１０を、ＢａｍＨＩで切断されそして
脱ホスホリル化された（文献２９参照）ｐＢＲ３２７プ
ラスミドＤＮＡ ２００ｎｇと連結する。続くＥ．ｃｏ
ｌｉ ＲＲＩの形質転換（文献３０参照）により３００
０個のテトラサイクリン感受性コロニーが得られる。こ
れらのコロニーのうち１０００個について前述のコロニ
ーハイブリダイゼーション法により調べる。

【００６６】次いで、コロニーハイブリダイゼーション
で最強の信号を与えた２５個のコロニーからのプラスミ
ドＤＮＡを前述の如く単離し、そしてドット−ブロット
分析にかける。調べた２５個のプラスミドのうち１０個
は、陽性信号を与える。そこで、以後の実験のために、
陽性信号を与えるプラスミドのうち６個からのＤＮＡを
２５０ｍｌの培養物から単離する。それらプラスミドの
各々についてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ切断を
行い、アガロースゲルで分画する。

【００６７】そのＤＮＡをサザーン法によりニトロセル
ロースに固定し、そして放射性標識オリゴヌクレオチド
混合物Ｉとハイブリダイズさせる。３つの１分段階にお
ける洗浄温度は５２℃に上げる。この温度ではｐＷＨ１
３１８と称されるプラスミドのＥｃｏＲＩ断片（２００
０ｂｐの大きさ）およびＨｉｎｄ ＩＩＩ断片（１５０
０ｂｐの大きさ）のハイブリッド形成があるのみであ
る。これらの断片の大きさは全染色体ＤＮＡを用いたハ
イブリダイズした結果と合致する。オリゴヌクレオチド
混合物ＩＩとハイブリッド形成させても陽性信号は存在
しない。

【００６８】図５ａは、適宜の制限ヌクレアーゼによる
切断によって得られた組換えプラスミドｐＷＨ１３１８
の制限地図を示している。組換えプラスミドｐＷＨ１３
１９は、ｐＷＨ１３１８よりのＨｉｎｄ ＩＩＩ断片
（１５００ｂｐの大きさ）をプラスミドｐＢＲ３２２の
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ切断部位にクローニングする（文献３
１参照）ことにより得られる（図５参照）。プラスミド
ｐＷＨ１３１９のＮｄｅ Ｉ切断部位から出発して、挿
入部の最初の配列決定をＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒ
ｔ法（文献２１参照）により行う。このようにして得ら
れたＤＮＡ配列はムタロターゼポリペプチドの最初の１
８個のアミノ酸と完全に一致する（第ＩＶ表および図４
参照）：

【００６９】

【表４】

【００７０】このように、配列決定結果は、前記ジーン
バンクから単離された組換えプラスミドｐＷＨ１３１８
が、ムタロターゼポリペプチドのＮ−末端領域をコード
するＤＮＡ配列を含有することを示している。プラスミ
ドｐＷＨ１３１８は、ムタロターゼポリペプチドのＣ−
末端領域をコードするＤＮＡ配列を含み得ない。何故な
らこのプラスミドはオリゴヌクレオチド混合物ＩＩとハ
イブリダイズしないからである。それ故、アシネトバク
ター・カルコアセチカスの全ＤＮＡから、Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩ断片（これは１５００ｂｐの大きさであり、そして
オリゴヌクレオチド混合物ＩＩとも、また約１２５ｂｐ
長であって組換えプラスミドｐＷＨ１３１８のＨｉｎｄ
ＩＩＩとＢｃｌ Ｉ切断部位の間に含まれている領域
ともハイブリダイズする）がクローンされる（図６ａお
よび図６ｂ参照）。

【００７１】２００μｇのＨｉｎｄ ＩＩＩ切断染色体
ＤＮＡを３％ポリアクリルアミドゲルで分画する。１５
００ｂｐあたりの大きさの領域にあるＤＮＡを溶出す
る。そのＤＮＡの１／４を前述の如くニトロセルロース
に固定する。この画分は、オリゴヌクレオチド混合物Ｉ
Ｉとも、またプラスミドｐＷＨ１３１８のＤＮＡともハ
イブリダイズする。単離された画分よりのＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩ切断染色体ＤＮＡ２００ｎｇを、２００ｎｇの、Ｈ
ｉｎｄ ＩＩＩ切断され脱ホスホリル化されたＭ １３
ｍｐ １１ ＲＦ ＤＮＡと連結する。得られる連結
生成物を用いてＩＰＴＧおよびＸ−ＧＡＬを含有する軟
寒天中にプレートされたコンピタントな（受容能を有す
る）Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＭＨ ７１−１８を形質転換す
る。この形質転換を数回繰り返す。最終的には５４１個
の組換えファージ（白色プラーク）が存在する。

【００７２】Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＭＨ ７１−１８の培養
物１ｍｌずつを用いて各々を５個のプラークで感染させ
る。沈殿するファージ上清をオリゴヌクレオチド混合物
ＩＩと、また組換えプラスミドｐＷＨ１３１８のＤＮＡ
とハイブリダイズさせる。１３１個のファージ上清のう
ち２個が両方のプローブ分子に対し陽性信号を示す。そ
れらファージを、２リットル容の培養液からそれらの複
製型（二本鎖ＤＮＡ）として個別に調製する。それら組
換えファージＤＮＡの制限分析は、いずれの陽性Ｍ１３
クローンとも同じ挿入部を有しＥｃｏＲＩ切断部位を予
測された位置に有することを示している（図７参照）。
これら２個のＭ１３クローンの一方を以後の実験に用
い、そしてｐＷＨ１３０１と称する。Ｍ１３法（文献２
７参照）によるｐＷＨ１３０１のＤＮＡ配列決定は、ト
リプシン切断よりの断片Ｆ４２のペプチド配列と合致す
る転写解読枠を示す（第Ｖ表）。

【００７３】

【表５】

【００７４】これら配列決定結果は、図６ａおよび図６
ｂのムタロターゼ遺伝子について仮定された制限地図を
確認するものである。何故なら見出された配列は事実Ｂ
ｃｌＩ切断部位を含んでいるからである（第Ｖ表参
照）。すなわち、クローンｐＷＨ１３１８およびｐＷＨ
１３１９、およびｐＷＨ１３０１は全体として、アシネ
トバクター・カルコアセチカス（ＤＳＭ３０００８）よ
りの完全なムタロターゼを含有する（図５、図６および
図７参照）。

【００７５】実施例６ムタロターゼ遺伝子の全配列を含む発現プラスミドの構
築 使用発現プラスミドはプラスミドｐＷＨ７０１である。
これは、プラスミドｐＵＲ２５０（文献２８参照）より
のポリリンカーがＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断
部位間に挿入されたプラスミドｐＰＬｃ２３６（文献３
２参照）の容易に入手しうる誘導体である。プラスミド
ｐＷＨ７０１は強力なλ−Ｐ_Ｌプロモーターを含有する
（図８、黒矢印参照）。以後のクローニング工程は、す
べて、λ−Ｐ_ＬプロモーターがＣ_Ｉリプレッサーにより
抑制されているホスト細菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ６（文献３
２参照）で行われる。ｐＰＬｃ２３６、λ−Ｐ_Ｌプロモ
ーターおよびホスト微生物Ｅ．ｃｏｌｉＷ６はヨーロッ
パ特許出願第０，０４１，７６７号明細書にも開示され
ている。組換えプラスミドｐＷＨ１３１９よりのＤＮＡ
２０μｇを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩお
よびＳｃａ Ｉで切断し、そして５％ポリアクリルアミ
ドゲルでの電気泳動にかける。次いでそのポリアクリル
アミドゲルから５７４ｂｐの大きさの断片を溶出する。

【００７６】発現プラスミドｐＷＨ７０１よりのＤＮＡ
１０μｇを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断
し、そして突出末端をｄＡＴＰおよびｄＴＴＰの存在下
にＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで埋める。そのＫｌｅｎｏ
ｗポリメラーゼを反応混合物を９０℃で５分間加熱する
ことにより失活させ、次いでエタノール沈殿を行った
後、かく得られたＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨｉ
ｎｄ ＩＩＩで切断する。この切断で得られた３１ｂｐ
の大きさの断片を３％ポリアクリルアミドゲルでの電気
泳動により除去する。このようにして調製されたプラス
ミドＤＮＡ２００ｎｇ、および前述の如く単離された５
７４ｂｐの大きさのＤＮＡ断片２００ｎｇを共に連結し
そしてＥ．ｃｏｌｉ Ｗ６の形質転換に用いる。このよ
うにして得られた形質転換体のプラスミドを前述の如き
アガロースゲルでの迅速分析により調べる。これによ
り、組換え発現プラスミド分子は、挿入のない発現プラ
スミドよりも大きい分子量を有していることがわかる。

【００７７】組換え発現プラスミドの一方を以後の実験
に用い、またｐＷＨ１３０７と称する。それを制限エン
ドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＳａｌ Ｉで切
断しそして前述の如くゲルから溶出する。次に、組換え
ファージＤＮＡ ｐＷＨ１３０１を同じく制限エンドヌ
クレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＳａｌ Ｉで切断す
る。これにより得られる１４００ｂｐの大きさのＤＮＡ
断片を前述の如くゲルから溶出する。次いで、ｐＷＨ１
３０１よりの１４００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を、発
現プラスミドｐＷＨ１３０７の大きなＨｉｎｄ ＩＩＩ
−Ｓａｌ Ｉ断片に挿入する。連結、形質転換および所
望の連結生成物の同定は、組換え発現プラスミドｐＷＨ
１３０７の構築に従って行われる。このようにして得ら
れる本発明の新しい組換え発現プラスミドはｐＷＨ１３
７２と称され、そして以後の発現に用いられる。図８
は、組換え発現プラスミドの構築概略図を示す。

【００７８】実施例７ムタロターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の決定 この遺伝子の配列をＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの
方法により決定した。配列決定手法を第ＶＩ表に示す。

【表６】

【００７９】図中の垂直線は、配列決定のために放射性
標識の置かれた制限部位を示す。矢印は、配列を読み得
る範囲を示す。Ｓｃａ Ｉ およびＨｉｎｄ ＩＩＩ部
位間の配列はｐＷＨ１３１８およびｐＷＨ１３７２で決
定した。２個のＲｓａ Ｉ部位間の配列は、ｐＵＲ２５
０（文献２８参照）にクローニング後決定した。そのヌ
クレオチド配列は、図１０に示されたＤＮＡ配列に相当
する。そのＤＮＡ配列は、Ｎ−末端アミノ酸配列により
決定されるコドンの上流にシグナル配列が存在すること
を示している。従って、組換え発現プラスミドｐＷＨ１
３７２より形成され、そして酵素ムタロターゼの生物学
的活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は図１１に
示されるものである。

【００８０】実施例８Ｅ．ｃｏｌｉ ６９中の発現プラスミドｐＷＨ１３７２
によるムタロターゼ遺伝子の発現 Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｎｏ．６９（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ΔＨ
１）を本発明による新しい組換えプラスミドｐＷＨ１３
７２で形質転換する。ホスト細菌のこの株は熱不安定リ
プレッサーＣＩ８５７をコードする座位をその染色体上
に含む。従って、この菌株では、λ−Ｐ_Ｌプロモーター
により制御される転写は、３２℃では完全に抑制される
が４０℃では、熱不安定リプレッサーＣＩ８５７がこの
温度では不活性な形にあるために、抑制されない。典型
的な発現手順では、２００ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／リ
ットルのＴｒｙｐｔｏｎｅ、８ｇ／リットルのＮａＣ
ｌ、５ｇ／リットルの酵母エキス、ｐＨ７．８）を、
Ｅ．ｃｏｌｉ ６９／ｐＷＨ１３７２の一夜培養液３ｍ
ｌで接種し、そして、菌体密度が０．６８ＯＤとなるま
で２８℃で培養を続ける。次いで培養液を水浴中４０℃
で振盪器中で更に振盪する。次いで菌体を破砕した後
に、ムタロターゼ活性を検出する。

【００８１】１ｍｌの菌体培養液を遠心分離し、そして
菌体を１００μｌの破砕緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５〜８％ｔｒ
ｉｔｏｎ）に再懸濁する。１０μｌのリソチーム（２５
ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．
０、１ｍＭ ＥＤＴＡ中）を添加後、菌体を２８℃で１
０分間、および４５℃で５分間インキュベートする。次
に菌体を遠心分離し、そして上清のムタロターゼ活性を
調べる。測定される６０００Ｕ／リットル（培地）とい
う発現は、振盪フラスコ中での細菌アシネトバクターの
発現の約６０倍を超える。菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｏ．６
９／ｐＷＨ１３７２（ＤＳＮ３４４２）は培地１リット
ルあたり約２０ｍｇのムタロターゼを形成する。工業的
規模での発酵に至適化すれば、発現ムタロターゼの収量
は、上記の値に比べ３〜５０倍に設定することができ
る。

【００８２】実施例９Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたムタロターゼの精製および分
析 図９に示されるように、産生ムタロターゼの約９０％は
培地中に存在する。培地１リットル中のタンパク質を９
０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、再懸濁し、２０ｍＭ
ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｋ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ９．０）に対し透
析し、そしてＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（１ｃｍ×
２０ｃｍ）に吸着する。実施例１に記載されているもの
と同じ塩条件を用いて溶出を行い、ムタロターゼを５０
ｍＭＫ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ９．０）でカラ
ム材料から放出される。第ＶＩＩ表は精製スキームをま
とめたものである。精製工程の前および後でのムタロタ
ーゼの純度は、ＳＤＳゲルのトラックＭＵＴおよびＰか
ら明白である（図９）。ここではタンパク質の測定にＢ
ｒａｄｆｏｒｄ法を用いた。

【００８３】

【表７】

【００８４】１回の沈殿工程および１回のカラムクロマ
トグラフィによる精製工程により１リットルの培地から
１２ｍｇのタンパク質が単離される。比活性は、アシネ
トバクター・カルコアセチカスから単離されたムタロタ
ーゼのそれよりも約１４％低い。Ｅ．ｃｏｌｉから単離
された産生物は、変性ポリアクリルアミドゲルで測定し
た場合、４０ｋＤａの分子量を有する。この分子量は、
アシネトバクター・カルコアセチカスから単離されたタ
ンパク質のそれに合致する。

【００８５】Ｅ．ｃｏｌｉ培地から単離されたムタロタ
ーゼのＮ−末端アミノ酸の配列決定により、この調製に
よりＮ−末端配列が、次のとおり、すなわち、 Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓ
ｅｒ ＴｙｒＧｌｙ である均質生成物が得られたことがわかった。それら２
つの生成物のＮ−末端アミノ酸は一致する。しかしなが
ら７位にはセリンがあるのに対し、アシネトバクター・
カルコアセチカスからのムタロターゼは、この位置にプ
ロリンを有する。

【００８６】次の性質は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたム
タロターゼおよびアシネトバクター・カルコアセチカス
で発現されたムタロターゼについて類似している。 １．比活性の相違はわずか約１４％にすぎない。 ２．それら２種類のタンパク質は、変性ポリアクリルア
ミドゲルにおいて同じ分子量を有する。 ３．いずれのタンパク質も２０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４／Ｋ
Ｈ_２ＰＯ_４（ｐＨ９．０）でＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘイ
オン交換体材料に結合する。 ４．それら２種類のタンパク質は、同じアミノ酸組成を
有する。 ５．それら２種類のタンパク質は、同じＮ−末端配列を
有する。 ６．いずれのタンパク質も内膜を通過する。しかしなが
ら、ムタロターゼは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてのみ培地中
に放出される。

【００８７】このことは、目的生成物がＥ．ｃｏｌｉに
おいて発現されうることを実証するものである。比較可
能な条件下において、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株は、最初に用い
られたアシネトバクター・カルコアセチカスより５０〜
１００倍も多くのムタロターゼを産生する。Ｅ．ｃｏｌ
ｉからは、生成物を精製工程をより少なくして調製する
ことができる。

【００８８】

【外１】

【００８９】

【外２】

【００９０】

【外３】

【００９１】

【外４】

【図面の簡単な説明】

【図１】ムタロターゼの精製において、ＳＤＳゲル電気
泳動による図である。 レーン１：粗製抽出液； レーン２：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００でのクロマトグ
ラフィ後； レーン３：ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘでのクロマトグラフ
ィ後； レーン４：ヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフィ
後； レーンＳ：分子量標準

【図２】Ｂｉｏｇｅｌ−Ｂ１０および−Ｐ３０を通して
のゲル濾過による臭化シアン断片の分離を示すグラフで
あり、Ｍｕｔは未切断物質を示し、またＣＢ１−５は、
タンパク質内臭化シアン断片の配列を示し、ＣＢ４は、
１１個のアミノ酸を有し（図４参照）、従って小さすぎ
て溶出時には検出されない。

【図３】逆相高速液体クロマトグラフィによるトリプシ
ン切断よりのペプチドの分離を示すグラフである。

【図３ａ】Ｐ１０カラムでのＣＢ５のＡＲＧＣ断片の溶
出クロマトグラムを示す。

【図４】ムタロターゼポリペプチドおよび部分ポリペプ
チド配列の配列決定手法を表わす図であり、アミノ酸は
一文字コードで示されている。“★”はアミノ酸が未規
定の位置を示している。臭化シアン、トリプシンまたは
エンドプロティナーゼＡＲＧＣによる切断によって生成
させたペプチドをＣＢ、ＦまたはＡＲＧと称した。Ｆ４
２の位置は構造遺伝子の配列が決定されるまでは決まら
なかった。

【図５】組換えプラスミドｐＷＨ１３１８およびｐＷＨ
１３１９の制限地図である。組換えプラスミドｐＷＨ１
３１９は、１５００ｂｐの大きさで構造遺伝子のＮ末端
部分を含むｐＷＨ１３１８よりのＨｉｎｄ ＩＩＩ断片
をｐＢＲ３２２に挿入することにより得た。

【図６ａ】ムタロターゼ遺伝子およびその側部の制限地
図を示す図であり、白抜き（ｕｎｓｈａｄｅｄ）ゾーン
は、図５ａ（プラスミドｐＷＨ１３１９）における白抜
きゾーンと同じ領域を示す。矢印は、ムタロターゼ遺伝
子の５′−３′方向を示している。この領域は、１５０
０ｂｐの大きさのＨｉｎｄ ＩＩＩ断片を含み、そして
オリゴヌクレオチド混合物Ｉとハイブリッド形成する。

【図６ｂ】１５００ｂｐの大きさを有し、Ｂｃｌ Ｉ切
断部位の近位に位置するＨｉｎｄＩＩＩ切断部位の下流
にあり、そしてゲノムＤＮＡの分析（トータルＤＮＡブ
ロット）の際にオリゴヌクレオチド混合物ＩＩとハイブ
リッド形成するＨｉｎｄＩＩＩ断片を示す図である。下
線を施した領域は、図６ａに示されるＤＮＡ断片との重
複部を示す。図示された２個のＤＮＡ断片は、この重複
領域のために相互にハイブリダイズする。

【図７】Ｍ１３ｍｐ１１クローンｐＷＨ１３０１の制限
地図を示す図である。

【図８】組換え発現プラスミドｐＷＨ１３７２の構築概
略図を示す。

【図９】培地からの酵素ムタロターゼの生物活性を有す
るポリペプチドの後処理の結果を示す図である。単一の
クロマトグラフィ工程で、ＳＤＳゲル上、ムタロターゼ
中に不純物が全く検出され得ない程の純度が得られる。 レーン「Ｍｕｔ」：培地より（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４で沈殿
させた後； レーン「Ｐ」：ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘでのクロマトグ
ラフィ後； レーン「Ｓ」：標準の目盛定め用タンパク質。

【図１０】アシネトバクター・カルコアセチカス（ＤＳ
Ｍ３０００８）よりのムタロターゼ遺伝子のＤＮＡ配列
を示す図である。

【図１１】ｐＷＨ１３７２の発現産生物のアミノ酸配列
を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ヨアヒム・アルトシュミート ドイツ連邦共和国Ｄ−6100ダルムシュタッ ト、フランクフルテル、シュトラーセ250 (72)発明者 ハンス＝ギュンター・ガッセン ドイツ連邦共和国Ｄ−6100ダルムシュタッ ト、フランクフルテル、シュトラーセ250 (72)発明者 ウォルフガング・ヒレン ドイツ連邦共和国Ｄ−6100ダルムシュタッ ト、フランクフルテル、シュトラーセ250

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素ムタロターゼの生物学的活性を有す
   るポリペプチドをコードする 【化１】 よりなるＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子。
2. 【請求項２】 ムタロターゼー生成性微生物または哺乳
   動物のゲノムに由来しそして酵素ムタロターゼの生物学
   的活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴と
   する請求項１に記載のＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａ
   ｃｔｅｒ）属の微生物のゲノムに由来することを特徴と
   する、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
4. 【請求項４】 アシネトバクター・カルコアセチカス
   （Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉ
   ｃｕｓ）ＤＳＭ ３０００７、ＤＳＭ ３０００８、Ｄ
   ＳＭ ３００１０またはＤＳＭ ３００１１の株のいず
   れかのゲノムに由来することを特徴とする、請求項３に
   記載のＤＮＡ分子。
5. 【請求項５】 酵素ムタロターゼの生物学的活性を有す
   るポリペプチドをコードする 【化２】 よりなるＤＮＡ配列を含むクローニング用組換えＤＮＡ
   分子。
6. 【請求項６】 発現制御配列に機能的に接続されてお
   り、そして酵素ムタロターゼの生物学的活性を有するポ
   リペプチドをコードする 【化３】 よりなるＤＮＡ配列を含むことを特徴とする組換えＤＮ
   Ａ分子。
7. 【請求項７】 発現制御配列が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
   プロモーターシステムである請求項６に記載の組換えＤ
   ＮＡ分子。
8. 【請求項８】 寄託番号ＤＳＭ ３４４３Ｐを有するｐ
   ＷＨ １３７２と称されるプラスミド。
9. 【請求項９】 酵素ムタロターゼの生物学的活性を有す
   るポリペプチドをコードする 【化４】 よりなるＤＮＡ配列を含むクローニング用組換えＤＮＡ
   分子の少なくとも一つで形質転換されていることを特徴
   とするホスト生物。
10. 【請求項１０】 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることを
    特徴とする、請求項９に記載のホスト生物。
11. 【請求項１１】 寄託番号ＤＳＭ ３４４２を有する大
    腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＨ １３７２と称される請求項
    ９または１０に記載のホスト生物およびその突然変異
    体。