JPS59162874A - 微生物の培養方法 - Google Patents

微生物の培養方法

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JPS59162874A
JPS59162874A JP58038087A JP3808783A JPS59162874A JP S59162874 A JPS59162874 A JP S59162874A JP 58038087 A JP58038087 A JP 58038087A JP 3808783 A JP3808783 A JP 3808783A JP S59162874 A JPS59162874 A JP S59162874A
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俊章 工藤
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、宿主の微生物細胞内に、代謝産物である高分
子物質の菌体外選択生産に関与する特定の遺伝情報を担
うデオキシリポ核酸（ＤＮＡ）を組み込んだプラスミド
を含有させてこれを培養せしめ、この特定の遺伝情報に
よって高分子物質を菌体外に生成、蓄積させて著量の生
産物質を採取することを目的とするものである。特定の
？に、低情報を担うＤＮＡを組み込んだプラスミドを宿
主の微生物に導入し、この微生物を培養することによっ
てアミノ酸、ペグチド等の比較的低分子物質を生産する
方法が提案されているが、高分子物質の生産能をもつプ
ラスミドは宿主の微生物によって増殖の程変が異なり、
且つプラスミドの十分な発現機能を実現することができ
ず１寸だその有効な培養方法も確立されていない。
従来、微生物の代謝産物である高分子物質を菌体外に生
産する遺伝情報を和うＤＮＡを組み込んだプラスミドに
よって他の属に属する微生物を宿主として形質転換させ
た場合、特定の生産物のみを菌体外に著ｉｋＫ生産せし
めることができず、宿主として通常用い得るエシェリヒ
ア属の微生物ではプラスミドによる形質転換によっても
これを達成することができなかった。
これに対し、本発明者は、バチルス属に践する微生物の
代謝産物である高分子物質の菌体外選択生産に関与する
遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだプラスミドをエシェ
リヒア属に楓する微生物に導入し、この微生物の培養方
法を見出してその菌体外に、酵素蛋白によって代表され
る高分子物質を著量に生産せしめ得ることに成功し、前
記の目的の達成を初めて可能とした。
以下１本発明方法について詳細に説明する。
本発明方法において用いられる微生物は、エシェリヒア
属の染色体外遺伝子（プラスミド）として知られるフリ
シンＥ１　　因子等の、培養された細胞内で増殖し得る
形式をとるプラスミド（染色体外ＤＮＡすなわちベクタ
ーＤＮＡ）に、外来の遺伝子ＤＮＡを組み込んだプラス
ミドを含Ｗする、エシェリヒア−コリによって代表され
るエシェリヒア属に棺する微生物である。
前記ベクターＤＮＡに組み込まれる外来遺伝子ＤＮＡ（
染色体ＤＮＡ断片）は、バチルス属の微生物の特定の代
謝産物の菌体外選択生産に関与する情報を担うＤＮＡで
あり、高分子物質、例えばペニシリナーゼ、アミラーゼ
、プロテアーゼ、β−グルカナーゼ等の酵素蛋白を菌体
外に生産せしめる情報を担うＤ　Ｎ　Ａ’が挙げられる
。
前記ベクターＤＮＡとしては、天然に存在する本のを抽
出したもの＼他、増殖に必須な部分以外のＤＮＡの部分
が一部欠落しているものでもよく、例えばＣｏ　Ｉ　Ｅ
　Ｈの系統ｓ　ｏＭＢ９の系統、ρＳＣｉ　ａ　ｉの系
統、Ｒ６にの系統、ラムダーファーソの系統等が絡げら
れる。
また、前記ベクターＤＮＡに前記外来遺伝子ＤＮＡを組
み込む方法は％既知のいずれの方法も適用し得る。例え
ば、適当な制限酵素（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｓ　）　
　を選択、処理してＤＮＡ’ｉ切断し１次いで同様に処
理した。ベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガー
ゼによって再結合する方法が用いられる。
このように得らねだ外来の染色体ＤＮＡ＠片とベクター
ＤＮＡの結合物を、形質転換法によって受容菌であるエ
シェリヒア属の微生物の菌体に導入し、遺伝形質として
安定するまで増殖すると、所望の染色体上の遺伝形質と
ベクターＤＮＡの形質を併せもつ形質転換株が得られる
。このようにして得られた微生物を培養するには、特定
の遺伝情報によって生成される物質の生産に適した培地
であって且つ宿主のエシェリヒア属の微生物の生育に適
した培地を用い得るが、本発明方法では、使用培地の組
成として、生育のために要求される無機塩を必須に含有
する培地で生育、増殖させ、同一培地で菌体量が最大に
達したときから実質的に前記培地中に代謝産物である高
分子物質の生成、蓄積が停止するまでの時間中、そのま
ま培養を継−続することが必要でるる。無機塩としては
、特に塩化ナトリウムが有効であり、また塩化カリウム
も用い得る。無機塩を、含有する培地としては、グルコ
ース、シュークロース、ラクトース、マルト−ス、グリ
セロール等の炭素源、アンモニア水、アンモニウム塩等
の窒素源、無機イオンの他に、必要に応じてアミノ酸、
ピメミン等の栄讐素を含有させることができ、通常、エ
シェリヒア。コリの生育培地として用いられるＬＢ培地
（トリプトン、酵母エキス、食塩）、ＢＰＢ培地（Ｄｌ
ｆｃｏ　：４リベデトン、酵母エキス、リン酸カリウム
）、栄養、寒天培地（Ｄｌｆｃｏ　ＯＱ　Ｏ１）、トリ
プトン。
食塩培地等を基本培地として調製したものを用いればよ
い。
無機塩を含まない前記の培地では、８０％以上の物質が
菌体内で生産されるので、生成物質のほとんどを菌体外
に生産させるためには無機塩の存在は必須である。また
、無機塩の使用量は、培地組成に対してり、５〜２．０
％が適当である。
炭素源の影響け、前記ＬＢ培地にグルコースを、又更に
グリセロールを加えたときに特にすぐれた結果が得られ
、培地組成に対してそれぞれ０．１チ及び０．２チ量の
添加が望ましい。
培養方法は、ｐＨ１温度、酸素供給量等の条件としてエ
シェリヒア属の微生物の生育に逸した条件を採り得るが
、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が生育し
てその菌体量が最大に達したとき、即ち対数増殖後期か
ら実質的に培地中に高分子物質の生成、蓄積が停止する
までの時間中、同一培地で培養をそのまま継続すること
が必要である。
エシェリヒア属の微生物の前記菌体量が最大に達したと
きから実質的に培地中に高分子物質の生成、蓄積が停止
するまでの時間は、はぼ１６〜４８時間の範囲である。
なお、ｐＨ条件は特に影響されないが、ｐＨ６〜８が適
当である。かくして、培養中に生育のために要求される
無機塩その他の成分を培地に更に添加することなく、前
記微生物の菌体外に高分子物質が著量に生産され、有利
に採取し得る。
本発明の培養方法により、１．＃索蛋白の他、抗生ｖＩ
Ｊ實、多糖類その他の高分子発酵生産物を著量に生産す
ることができ、また史に、外来の生産物の遺伝情報を担
うＤＮＡとバチルス属に属する微生物の菌体外選択生産
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡとを併せもつプラスミ
ドを利用することによって、インシュリン等のホルモン
ペプチドやインターフェロン抗体等の生理活性蛋白の大
量生産法にも適用し？ｅるので、高分子物質の工業的発
酵生産に寄与するところ極めて大でろる１゜以下に、本
発明方法の一例として、酵素蛋白のペニンリナーゼの場
合について説明する。まずその菌体外選択生産遺伝情報
を担うＤＮＡを組み込んだプラスミドによるエシェリヒ
ア・コリの形萬転換株の調製を例示する。
（１）ペニシリナーゼ生産能の遺伝情報をもつ染色体ｐ
ＮＡのＡ製 、２ニシリナーゼを菌体外に生成、蓄積する能力を有す
る好アルカリ性のバチルス・煮１７０菌（微工研菌寄第
３２２１号）を培地〔（２／−ｅ）：グリセロール２゜
０、酵母エキス５゜０、ポリペプトン５゜０、Ｋ２ＨＰ
Ｏ４１、０１ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ｏ０．２をＮａＨＣＯ
３１０でｐＨ９，０に調整したもの〕中、３０℃で１９
時間振盪培養を行ない、対数増殖後期の菌体を集菌後、
フェノール法によるＤＮＡ抽出法によって染色体ＤＮＡ
を抽出、ｆｆ製し、染色体ＤＮＡ５１ｉ’１９を得た。
（２）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体ＤＮＡ　１０μｍ　をとり、制限エンドヌクレ
アービＨ１ｎｄｌＩＩ　　ｉＪｊ口え、６７℃で５分、
１０分、２０分、３０分、６０分反応させて部分的に切
断した。一方、ベクターとして用いるテトラサイクリン
抵抗４４　（Ｔｅｔ’　）のｐＭＢ９プラスミドＤ　Ｎ
　Ａ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈしａｂｏ
ｒａｔｏｒ　ｉｅｓ　社（米国）製）をＨｉｎｄ　ｉｌ
ｌ　で完全に切断して６５℃、５分の熱処理後、前者と
混合し、Ｔ４　　ファージ由来のＤＮＡリガーゼによっ
て１０℃、２４時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行ない、６５
℃、５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを加
えて染色体ＤＮＡを組み込んだシラスミドＤＮＡを沈澱
、採取した。
（３）ペニシリナーゼの菌体外選択生産遺伝子を担うプ
ラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリに一１２株とエシエリヒア・３９８
株のハイブリッド株であるエシェリヒア・コリＨ８１０
１株［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｌｎｇＡ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　ｐ、　　５０４　（１９
８２）参照〕（遺伝形ｗ：Ｆ″″、ｈ＝ｄＳ２０　（ｒ
−Ｂ　、ｒｎ’″８）、ｒｏｅ　Ａ　１３、ａｒａ−１
４、ｐｒｏ　Ａ　２、ｌａｃ　Ｙ　ｉ、ｇａｔ　Ｋ　２
、ｒｐｓ　Ｌ２１１　（Ｓｍ’　）、ｘｙｌ　−５、ｍ
ｔｌ−１、ｓｕｐ　Ｅ　４４　Ｊ−）　　をＬＢ培地（
純水ｉ　　ｅ　−’Ｍ　　リ　ト　リ　ゾ　ト　ｙ（Ｄ
ｌｆｃｏ　　）１　０　　ｆ　　、　酵母エキス５　Ｐ
％　グｎ、コ−ｘ　１　ｙ、　ＮａＣｇ　１０Ｐ？　ｐ
Ｈ７，０に調製したもの）　１０　ｒｒ、ｌに接種し、
３７℃で振盪培養を行ない、対数増殖後期まで生育させ
た後に果菌した。これを水冷下、最終浸度で０−０３　
ＭＣａＣ６２の溶液に順次ｇｔｉさせてコンピテントな
細胞とした。この細胞懸濁液に（２）で得たプラスミド
ＤＮＡの溶解液をカリえて水冷下で６０分反応させ、４
２℃、１〜２分間ヒートショックを与えて前記プラスミ
ドＤ　Ｎ　Ａ　ヲ扇胞内に取り込ませた。次いで、この
細胞懸濁液を別途、前記ＬＢ培地に接種し、３７℃、３
〜５時間振盪培養して形質転換反応を行なった後、集菌
、洗滌して形質転換株、エシェリヒア・コリＨＢ１０１
　（Ｔ）ＥＡＰ２　）（微工研菌寄第６９３９号）（Ｆ
ＥＲＭＰ−６９３９）を得た。
この形質転換株のプラスミド（ｐＥＡＰ２）の制限酵素
切断地図は第４図に示すとおりである。
以下、本発明方法を実施例により説明する。
実施例１ 前記（３）で得られた形質転換株、エシェリヒア・コリ
ＨＢ　１０１　（＋）ＥＡＰ２　）（微工研菌寄第６９
３９号）（ＦＥＲＭＰ−６９５９）を、ＬＢ培地（１β
当りトリプトン１０？％酵母工Φス５？５グルコース１
１、グリセロール２１、ＮａＣａ１０ｐ）１０Ｏｄを含
む５００ｄ容のフラスコで３７℃にて振盪培養した。細
胞の生育（菌体−°の測定）は、波長６６０　ｎｍ　に
おける吸光度（００）を測定し、菌体外及び菌体内生産
のベニシリナー゛ゼ活性をサージェント（Ｓａｒｇｅｎ
ｔ　）の変法〔Ｓａｗａｌ　ｅｔ　ａｌ　：　Ａｎｔｌ
ｍｌｃｒｏｂ、　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ。
１３．９１０（１９７Ｂ）参照〕で測定し、３０’Ｃ，
１分ＭＫ１マイクロモル（μｍｏｌｅ　）　（Ｚ）ベン
ジルペニシリンを水解する酵素量をペニシリナーゼ１単
位（Ｕ）とした。
前記形質転換株の菌体量は接種後、１６時間で最大に達
し、第１図に示すとおり、菌体外ペニシリナーゼの活性
はほぼ２０時間後から増大しはじめ、２８時間後に最大
に達した（＋−２０Ｕ／＋ｄ）。
生産されたベニシリナーゼは非常に安定であり、第１図
（ａ）に示されるように、更にそのまま培養を４８時間
まで継続しても生産量は減少せず、全酵素活性の８０チ
以上に達した。こねに対して、菌体内ペニシリナーゼは
、培養初期（接種後８〜２０時間）において認められた
が、その生産は全酵素活性の１０％程度であり、最高で
８　Ｕ　／ｍｅに過ぎず、しかもその活性は急速に減少
し、４８時間後では全く認められなかった。第１図（ｂ
）は、全酵素活性に対する菌体外ペニシリナーゼと菌体
内ヘニシリナーゼの生成の割合を示すものである。
比較として、ＤＮＡ供与菌め前記バチルス・屋１７０菌
（微工研菌寄第６２２１号）及びＤＮＡ受容菌の公知の
エシェリヒア・コＩＪ　ＨＢ　１０１（ｐＢＲ３２２）
株（−１！ニシリナーゼ生産能の遺伝情報を担うρＢＲ
３２２プラスミドを含有する菌ｐ　）　（Ｂｏｙｅｒ　
ａｔ　ａｌ　：　Ｇｏｎｏ　％ｖｏｌ　２、ｐ、９５−
１１３（１９７７）参照〕を、それぞれ培養してペニシ
リナーゼ活性を測定した。
前記バチルス・＆１７０菌の場合は、使用培地ＣＣｆ／
ｌ））ニゲルコース（又はグリセロール）２゜０、酵母
エキス５゜０、ポリペプトン５．０、に２ＨＰＯ４１，
０、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０，２をＮａＨＣＯ３１Ｄ
でｐＨ９゜０に調整したもの〕１００−ヲ含む５００ゴ
容のフラスコに接種し、５７℃で振盪培養した。
培養液の菌体外ペニシリナーゼ活性を４時間毎に測定し
た。接種後、１２時間で活性は最高（１９ｔＪ／−）に
達し、以後急速に減少して４０時間では全く認められな
かった（第２図参照）。
、一方、エシェリヒア・コリＨ８１０１（ｐＢＲ３２２
）の場合は、前記エシェリヒア・コリＨ８１０１（ｐＥ
ＡＰ２）株の培養に用いたＬＢ培゛地のＩＱＯｍを５０
ロゴ容のフラスコに人ねて接植し、３７℃で振盪培養し
た。輔５図（、）に示されるように、接種後、２０時間
で全活性の８０−以上が菌体内ベニシリナーゼとして認
められたが（最高５５Ｕ／ｍｇ）、以後急速に減少し、
菌体外ベニシリナーゼ活性は１０％以下が認められるに
過ぎなかった。第３図（ｂ）は、全酵累活性に対する菌
体外ヘニシリナーゼと菌体内に；シリナーゼの生成の割
合を示すものである。
実施例２ 前記エシェリヒア・コ！ＪＨＢ　１’０１　（ｐＥＡＰ
２）（微工研菌椿第６９６９号）（ＦＥＲＭＰ−６９５
９）の菌体外ペニシリナーゼ生産について、各培地を用
いてその影響を比較した。なお、培養条件は実施例１と
同様である。
第　　　１　　　衣 前記ＬＢ培地の成分による影響をみた結果を第２表に示
す。
第　　　２　　　弐 なお、トリプトン、トリデトーズ、４１３４１１２４度
はそれぞれ１チ、Ｎａリ　も１チでめる。
更に、ＬＢ培地中の炭素源の影響の結果ｆ第６衣に示す
。
ナオ、クルコース、スターチ、シュークロース、マルト
ースｒａ度はそれぞれ０゜１％、グリセロールは０．２
％、Ｎａ（Ｊ　は１％である。
次に、トリプトン（１％）、、グルコース（０゜１チ）
、グリセロール（０，２％）、酵母エキス（１チ）を含
む培地にＮａＣβ　を添加して２０時間培養し、ＮａＣ
召の影響を調べた。結果を第４表に示すＯ 参考例 実施例１の形質転換株の培養液を１０分間、ｉｎ、ＯＯ
ＯＸｇで超遠心してアンモニウム硫酸塩で８０％飽和溶
液とした。この沈澱物を水に溶解し、−夜、０゜Ｉ　Ｍ
　Ｎａ（Ｊ　を含む［１，［１５Ｍｔｎ’ｉ酸緩衝液（
ｐＨ７，０）で透析した。この透、折物を同一の緩衝液
で平衡化したセファデックスＧ−７５（５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　Ｇ　−７５）　　に通じて精製ペニシリナーゼを痔
た。
また、前記バチルス・７ｆ１１７０菌（微工研菌寄第３
２２１号）の培養液を同様に処理して精製べ二シリナー
ゼを得た。
両者のベニシリナーゼの同一性をみるために、酵素活性
におけるｐＨの影響、熱安定性、分子量等を測定した。
その結果、次のとおり両者の同一性が確認された。
（８）酵素の安定性は各ｐＨ値の緩衝液を用い、５０℃
で４５分間インキュベートした後、調べた。その結果、
両酵素は、いずれもｐＨ７〜１０で安定でらり、至適ｐ
ＨはＰＨ７Ｓ、［１〜７．０であった。
（ｂ）　　酵素の熱安定性は、酵素ｆ、［］、００５Ｍ
燐酸緩衝液ｐＨ７，０）　　に溶解し、その溶液を１０
分間、所定の温度で熱処理し、残存活性をｐＨ７，０で
測定することにより調べた。その結果、いずれの酵素も
５０℃まで安定であった。
（Ｃ）　　酵素の分子量の測定は、ｒル濾過法で行なっ
た。両酵素の分子量はいずれも２７．ｎｏｎ〜２２．０
００と推定された。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明方法で用いたエシェリヒア・コリＨＢ
１０１（ｐＥＡＰ２）によるベニシリナーゼの活性を、
第２図は、バチルス°Ａ１７０菌によるペニシリナーゼ
の活性を、第３図は、公知のエシェリヒア・コリＨＢ１
０１　（ｐＢＲ３２２）によるペニシリナーゼの活性を
それぞれ示すグラフである。第４図は、エシェリヒア・
コリＨＢ１０１　（ｐＥＡＰ２　）のプラスミド（ｐＥ
ＡＰ　２）の制限酵素切断地図である。 特許出願人　　理化学研究所 第１図（ａ） 第１図（ｂ） 第２図 第３図（ａ） 第　３　図　（ｂ） 第　４　図 ＋　　ｐＭＢ９７’クスミト’ＤＮＡ ￥Ｆ−＠　？ｔ１４　ｉＥ”　　５．９．１６特許庁長
官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５８年　特許願　第３８０８７号 ２、発明の名称　　　　微生物の培養方法３補正をする
者 事件との関係　　　出願人 名称　（６７９）理化学研究所 ／１代理人 ５、補正命令の日付　　自　　　発 （ハ　明細書箱ｇ頁、第１乙行と第１７行の間に、次の
文を挿入する。 「本発明方法によって、生産物質は目的とする単一の高
分子物質のみならず、複数の酵素蛋白類がそれぞれ菌体
外に著量に生産（分泌）され、併せて採取することがで
きる。即ち、エシェリヒア・コＩＪ　ＨＢ　／θ／株の
培養に、ｌニジ、従来、菌体内にのみ検出されていたア
ルカリホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼ並びに
約７０種の蛋白質から成る蛋白質群が、後述の実施例に
記載の如く、それぞれ菌体外に著量に分泌されることが
明らかにされた。これは、本発明によって得られる後述
のシラスミド（１）ＥＡＰ、２　）に含まれる約２．０
００の塩基対のＤＮＡが、代謝産物の菌体外選択生産（
分泌）能を宿主に附与していることを意味するものであ
る。」に）　同第１２頁、第グ〜Ｓ行の“この形質転換
株の・・・とおシである。′ヲ、次のとお９訂正する。 「この形質転換株のプラスミド（ｐＥＡＰ、２　）は、
ペニシリナーゼの菌体外選択生産（分泌）に関与する遺
伝情報を担うペニシリナーゼＤＮＡ断片が組み込まれて
いるＤＮＡ円形分子、即ちｐＭＢワプラスミドＤＮＡと
約ユ０００の塩基対のＤＮＡから成る７、７ＫｂのＤＮ
Ａ円形分子であシ、その制限酵素切断地図は第９図に示
すとおりである。」 （３）　　同第ユＯ頁、第１１行と第１Ｓ行の間に、次
の文を挿入する。 「実施例３ °前記エシェリヒア・コリＨＢ　／　０　／　（ｐＥＡ
Ｐ、２）（微工研菌寄第乙９３９号）　（ＦＥＲＭ　　
Ｐ−ｌ、９３９）の菌体外生産物質について、プラスミ
ド（ｐＥＡＰ、２）を導入しないエシェリヒア争コリＨ
Ｂ１０／株及びｐＭＢ９プラスミドを導入したエシェリ
ヒア・コＩＪ　ＨＢ　／　０　／株の生産物質と比較し
て、ペニシリナーゼ以外の酵素蛋白類を調べた結果を第
５表に示す。 なお、培養条件は、実施例／のＬＢ培地で、３７℃にて
２０時間振盪培養し、また生産酵素蛋白の内、アルカリ
ホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼの酵素活性は
、波長’Ｉ　２０　ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定
して表わしたものであシ、蛋白質濃度は、培地／ゴ当り
の■とじて表わし、その他の条件は実施例／、と同様で
ある。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）　　バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　　属に属
    する微生物の代謝産物である高分子物質の菌体外選択生
    産に関与する遺伝情報を担うデオキシリ？核酸（ＤＮＡ
    ）を組み込んだプラスミドを含有するエシェリヒア（Ｅ
    ｓｃｈｅｒｌｃｈｌａ　）属に属する微生物を、生育の
    ために要求される無機塩を含有する培地に接種し、接種
    後、前記微生物の菌体量が最大に達したときから実質的
    に前記培地中に前記高分子物質の生成、蓄積が停止する
    までの時間中培養をそのま＼継婢することによって前記
    微生物の菌体外に前記高分子物質を生産せしめることを
    特徴とする微生物の培養方法。 （２）　　無機塩が塩化ナトリウ、ｏム又は塩化カリウ
    ムである特許請求の範囲第１項記載の培養方法。 （３）　　塩化ナトリウム又は塩化カリウムが培地組成
    の０．５〜２．０係である特許請求の範囲第２項記載の
    培養方法〇 （４）培養時間が１６〜４８時間である特許請求の範囲
    第１項記載の培養方法。 （５）　エシェリヒア夙に属する微生物がエシェリヒア
    ・コリ＋−＋ｓｉ　Ｑｌ　（ＤＥＡＰ２　）　（微工研
    菌寄第６９３９号）　［Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｌａ　ｃｏ
    ｌｉ　ＨＢｌ［１１（ｐＥＡＰ２　）　］である特許請
    求の範囲第１項記載の培養方法。 （６）　　バチルス属に誼する微生物がノくチルス（Ｂ
    ａｃｉｌｌｕｓ　）ａ　Ａ　１７０菌（微工研菌寄第３
    ２２１号）である特許請求の範囲第１項記載の培養方法
    Ｏ （カ　プラスミドのベクターとしてＤＭＢ９シラスミド
    のＤＮＡを用いる特許請求の範囲第１項記載の培養方法
    。 （８）高分子物質が酵素蛋白である特許請求の範囲第１
    項記載の培養方法。
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JPS5519092A (en) * 1978-06-08 1980-02-09 Harvard College Selected protein producing method
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