JPH06102022B2 - 組換え体ｄｎａ、その製造法、およびそれを含むバチルス属細菌 - Google Patents
組換え体ｄｎａ、その製造法、およびそれを含むバチルス属細菌Info
- Publication number
- JPH06102022B2 JPH06102022B2 JP60121535A JP12153585A JPH06102022B2 JP H06102022 B2 JPH06102022 B2 JP H06102022B2 JP 60121535 A JP60121535 A JP 60121535A JP 12153585 A JP12153585 A JP 12153585A JP H06102022 B2 JPH06102022 B2 JP H06102022B2
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- bacillus
- dna
- cellulase
- recombinant dna
- bacterium
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、バチルス属由来であり第１図または第２図の
制限酵素地図で示され且つセルラーゼをコードする遺伝
子を組み込んだ組換え体DNA、その製造法、およびそれ
を含むバチルス属細菌に関する。
制限酵素地図で示され且つセルラーゼをコードする遺伝
子を組み込んだ組換え体DNA、その製造法、およびそれ
を含むバチルス属細菌に関する。
セルラーゼはセルロース及びその誘導体を分解する酵素
であり、発酵原料として利用しにくいセルロースおよび
その誘導体から発酵可能な低分子の糖に変換することが
可能な酵素である。このような性質を持つため近年セル
ロース材料の有効利用という観点からセルラーゼが注目
されてきている。
であり、発酵原料として利用しにくいセルロースおよび
その誘導体から発酵可能な低分子の糖に変換することが
可能な酵素である。このような性質を持つため近年セル
ロース材料の有効利用という観点からセルラーゼが注目
されてきている。
従来の技術 多数の細菌、糸状菌類がセルラーゼを産生することが知
られており、その改良のため遺伝子工学的手法が試みら
れている。例えば、Sashiharaらは好アルカリ性のバチ
ルス属細菌のセルラーゼ遺伝子を組換え、宿主大腸菌に
形質転換したと報告している。（J.Bacteriol.,158,503
−506,1984）。
られており、その改良のため遺伝子工学的手法が試みら
れている。例えば、Sashiharaらは好アルカリ性のバチ
ルス属細菌のセルラーゼ遺伝子を組換え、宿主大腸菌に
形質転換したと報告している。（J.Bacteriol.,158,503
−506,1984）。
発明が解決しようとする問題点 本発明の目的はセルラーゼの効率的な製造法を提供する
ことにある。又、本発明の他の目的はセルラーゼの製造
に用いられる組換え体DNAおよび該組換え体DNAを含むバ
チルス属細菌、並びに該組換え体DNAの製造法を提供す
ることにある。
ことにある。又、本発明の他の目的はセルラーゼの製造
に用いられる組換え体DNAおよび該組換え体DNAを含むバ
チルス属細菌、並びに該組換え体DNAの製造法を提供す
ることにある。
即ち、本発明は、バチルス属由来であり第１図または第
２図の制限酵素地図で示され且つセルラーゼをコードす
る遺伝子を、DNA導入ベクターに連結したバチルス属細
菌内で複製可能な組換え体DNA、その製造法、この組換
え体DNAを含むバチルス属細菌、並びにこの組換え体DNA
を含むバチルス属細菌を培養し、その培養物からセルラ
ーゼを採取することを特徴とするセルラーゼの製造法を
提供するものである。
２図の制限酵素地図で示され且つセルラーゼをコードす
る遺伝子を、DNA導入ベクターに連結したバチルス属細
菌内で複製可能な組換え体DNA、その製造法、この組換
え体DNAを含むバチルス属細菌、並びにこの組換え体DNA
を含むバチルス属細菌を培養し、その培養物からセルラ
ーゼを採取することを特徴とするセルラーゼの製造法を
提供するものである。
本発明者らは、本願出願以前にバチルス属由来であり第
１図または第２図の制限酵素地図で示され且つセルラー
ゼをコードする遺伝子を組換え、バチルス属細菌内で形
質転換したという報告を知らない。前述の先行文献に記
載された形質転換した大腸菌を使用した場合は、産生さ
れたセルラーゼは菌体外、ペリプラズムおよび菌体内の
何れにも存在するが、本発明の目的とする形質転換され
たバチルス属細菌の場合は全て菌体外にセルラーゼを産
生するため採取が容易である。
１図または第２図の制限酵素地図で示され且つセルラー
ゼをコードする遺伝子を組換え、バチルス属細菌内で形
質転換したという報告を知らない。前述の先行文献に記
載された形質転換した大腸菌を使用した場合は、産生さ
れたセルラーゼは菌体外、ペリプラズムおよび菌体内の
何れにも存在するが、本発明の目的とする形質転換され
たバチルス属細菌の場合は全て菌体外にセルラーゼを産
生するため採取が容易である。
問題点を解決するための手段 本発明によれば、本発明の組換え体DNAは、バチルス属
由来であり第１図または第２図の制限酵素地図で示され
且つセルラーゼをコードする遺伝子を、DNA導入ベクタ
ーに組み込んだもので、バチルス属細菌内で複製可能な
ものである。本発明の組換え体DNAは次に述べる工程に
より製造することができる。
由来であり第１図または第２図の制限酵素地図で示され
且つセルラーゼをコードする遺伝子を、DNA導入ベクタ
ーに組み込んだもので、バチルス属細菌内で複製可能な
ものである。本発明の組換え体DNAは次に述べる工程に
より製造することができる。
（１）セルラーゼを産生する菌株を用意し、その染色体
DNAを抽出する。用いる菌株はセルラーゼを産生する菌
株であればいかなるものでもよいが、好ましい例として
バチルス・ズブチリスIFO3034株が挙げられる。染色体D
NAの抽出方法としては、広く知られたフエノール法（Bi
ochim.Biophys.Acta,72,619−629,1963）によって行う
ことができる。
DNAを抽出する。用いる菌株はセルラーゼを産生する菌
株であればいかなるものでもよいが、好ましい例として
バチルス・ズブチリスIFO3034株が挙げられる。染色体D
NAの抽出方法としては、広く知られたフエノール法（Bi
ochim.Biophys.Acta,72,619−629,1963）によって行う
ことができる。
（２）上記（１）で得られた染色体DNAを制限酵素で切
断する。制限酵素としては、セルラーゼ遺伝子内に切断
点を持たないものが望ましいが、それ以外のものであっ
ても部分分解をすることにより目的は達成される。例え
ば、EcoRI,PvuII,BalIIなどが用いられる。
断する。制限酵素としては、セルラーゼ遺伝子内に切断
点を持たないものが望ましいが、それ以外のものであっ
ても部分分解をすることにより目的は達成される。例え
ば、EcoRI,PvuII,BalIIなどが用いられる。
（３）一方、別にベクターDNAを制限酵素によって開裂
させる。ここで使用されるベクターは宿主バチルス属細
菌内で複製可能であり、且つ適当な選択マーカーを持つ
ものである。例えば、好ましいベクターとしてはプラミ
スドpBD64およびpUB110が挙げられる（J.Bacteriol.,13
4,318−329,1978;および同，141,246−253,1980）。制
限酵素としては前掲（２）に記載と同じものを用いるこ
とができる。
させる。ここで使用されるベクターは宿主バチルス属細
菌内で複製可能であり、且つ適当な選択マーカーを持つ
ものである。例えば、好ましいベクターとしてはプラミ
スドpBD64およびpUB110が挙げられる（J.Bacteriol.,13
4,318−329,1978;および同，141,246−253,1980）。制
限酵素としては前掲（２）に記載と同じものを用いるこ
とができる。
（４）ベクターDNAの開裂部位に（２）で得られたDNA断
片を組み込み、組換え体DNAを得る。組み込む手段はT4D
NAリガーゼを用いる方法等が利用できる。
片を組み込み、組換え体DNAを得る。組み込む手段はT4D
NAリガーゼを用いる方法等が利用できる。
（５）上記（４）で得られた組換え体DNAを宿主バチル
ス属細菌に導入し形質転換株を得る。好ましい宿主バチ
ルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス168株由来
の変異株、例えばRM125npr-株（hsrM,hsmM,arg15,leuA
8,nprA）が挙げられる。当該菌株は、公知のバチルス・
ズブチリスRM125株（Molec.Gen.Genet.,152,65−69,197
7）にBGSC IA174のnprA変異を導入して調製することが
できる。形質転換の手段は公知のプロトプラスト法、コ
ンピテントセル法、プラスミドレスキュー法などを適用
することにより達成できる（Molec.Gen.Genet.,168,111
−115,1979;J.Bacteriol.,127,817−828,1976;同，154,
1077−1087,1983）。
ス属細菌に導入し形質転換株を得る。好ましい宿主バチ
ルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス168株由来
の変異株、例えばRM125npr-株（hsrM,hsmM,arg15,leuA
8,nprA）が挙げられる。当該菌株は、公知のバチルス・
ズブチリスRM125株（Molec.Gen.Genet.,152,65−69,197
7）にBGSC IA174のnprA変異を導入して調製することが
できる。形質転換の手段は公知のプロトプラスト法、コ
ンピテントセル法、プラスミドレスキュー法などを適用
することにより達成できる（Molec.Gen.Genet.,168,111
−115,1979;J.Bacteriol.,127,817−828,1976;同，154,
1077−1087,1983）。
（６）上記（５）で得られた形質転換株からセルラーゼ
産生能の上昇した株を分離する。分離する方法は、例え
ばカルボキシメチルセルロースを含むプレート培地に形
質転換株を培養したのち、セルラーゼを産生する株のコ
ロニーの周囲にハローを形成せしめる処理を施し、大き
なハローを有する株を釣菌することによりセルラーゼを
産生するクローンが得られる。
産生能の上昇した株を分離する。分離する方法は、例え
ばカルボキシメチルセルロースを含むプレート培地に形
質転換株を培養したのち、セルラーゼを産生する株のコ
ロニーの周囲にハローを形成せしめる処理を施し、大き
なハローを有する株を釣菌することによりセルラーゼを
産生するクローンが得られる。
（７）上記（６）で得られたクローンを培養し、その菌
体から目的の組換え体DNAを得る。菌体から組換え体DNA
を抽出するにはGryczanらの方法により行われる（J.Bac
teriol.,134,318−329,1978）。
体から目的の組換え体DNAを得る。菌体から組換え体DNA
を抽出するにはGryczanらの方法により行われる（J.Bac
teriol.,134,318−329,1978）。
上記の（１）の工程において、染色体DNA供与株として
宿主バチルス属細菌の染色体DNAと相同性の高い染色体D
NAを持つバチルス属細菌を用いた場合には、（６）で得
られた形質転換株から直ちにプラスミドを分離し、得ら
れたセルラーゼをコードする組換え体DNAを染色体DNAと
の組換え能力の低下した第二の宿主バチルス属細菌、好
ましくはバチルス・ズブチリス168株由来のrec株、例え
ばバチルス・ズブチリスRM141株（hsrM,hsmM,hisA,leu
B,argA5,recE4）（Agric.Biol.Chem.,48,307−316,198
4）に導入することが望ましい。これは染色体の相同的
配列による再組換えを防ぐために行うもので、バチルス
属細菌を宿主として、バチルス属細菌由来のDNAあるい
はバチルス属細菌の接触体DNAと相同性の高いDNAを用い
て組換え体DNAを得る場合には、得られた組換え体DNAを
安定に保持させるために必要である（Molec.Gen.Gene
t.,165,269−276,1978）。又、プラスミドレスキュー法
により組換え体DNAを得た場合にはプラスミドを純化さ
せるために上記の操作が必要である。
宿主バチルス属細菌の染色体DNAと相同性の高い染色体D
NAを持つバチルス属細菌を用いた場合には、（６）で得
られた形質転換株から直ちにプラスミドを分離し、得ら
れたセルラーゼをコードする組換え体DNAを染色体DNAと
の組換え能力の低下した第二の宿主バチルス属細菌、好
ましくはバチルス・ズブチリス168株由来のrec株、例え
ばバチルス・ズブチリスRM141株（hsrM,hsmM,hisA,leu
B,argA5,recE4）（Agric.Biol.Chem.,48,307−316,198
4）に導入することが望ましい。これは染色体の相同的
配列による再組換えを防ぐために行うもので、バチルス
属細菌を宿主として、バチルス属細菌由来のDNAあるい
はバチルス属細菌の接触体DNAと相同性の高いDNAを用い
て組換え体DNAを得る場合には、得られた組換え体DNAを
安定に保持させるために必要である（Molec.Gen.Gene
t.,165,269−276,1978）。又、プラスミドレスキュー法
により組換え体DNAを得た場合にはプラスミドを純化さ
せるために上記の操作が必要である。
上述のように、本発明の組換え体DNAは宿主バチルス属
細菌内で複製されるが、宿主としてバチルス属以外の微
生物を用いることもできる。即ち、前記（６）で得られ
た形質転換株よりプラスミドを分離し、これを制限酵素
処理してセルラーゼ遺伝子を含むDNA断片を得、これを
ベクターに連結しバチルス属細菌以外の微生物に組み込
むことも可能である。例えば、セルラーゼ遺伝子を含む
DNA断片にプラスミドpBR322に連結し、大腸菌C600 r
k-，mk-株（rk-，mk-,thi,thr,leuB）（Proc.Nat.Acad.
Sci.USA,71,4579−4588,1974）に導入して形質転換する
ことにより、大腸菌においても組換え体DNAを得ること
ができる。
細菌内で複製されるが、宿主としてバチルス属以外の微
生物を用いることもできる。即ち、前記（６）で得られ
た形質転換株よりプラスミドを分離し、これを制限酵素
処理してセルラーゼ遺伝子を含むDNA断片を得、これを
ベクターに連結しバチルス属細菌以外の微生物に組み込
むことも可能である。例えば、セルラーゼ遺伝子を含む
DNA断片にプラスミドpBR322に連結し、大腸菌C600 r
k-，mk-株（rk-，mk-,thi,thr,leuB）（Proc.Nat.Acad.
Sci.USA,71,4579−4588,1974）に導入して形質転換する
ことにより、大腸菌においても組換え体DNAを得ること
ができる。
以上の方法で得られた本発明の組換え体DNAは第１図ま
たは第２図に示される制限酵素地図を有する。第１図に
示される組換え体DNAのpBC5は、プラスミドpBD64にセル
ラーゼをコードする遺伝子を含む4.8kbのDNA断片が連結
されており、第２図に示される組換え体DNAのpBC51は、
プラスミドpUB110に挿入DNA断片として実質的にセルラ
ーゼをコードする遺伝子からなる2.8kbのDNA断片が連結
されたものである。
たは第２図に示される制限酵素地図を有する。第１図に
示される組換え体DNAのpBC5は、プラスミドpBD64にセル
ラーゼをコードする遺伝子を含む4.8kbのDNA断片が連結
されており、第２図に示される組換え体DNAのpBC51は、
プラスミドpUB110に挿入DNA断片として実質的にセルラ
ーゼをコードする遺伝子からなる2.8kbのDNA断片が連結
されたものである。
本発明の組換え体DNAを含むバチルス属細菌は、上記の
組換え体DNA pBC5またはpBC51を宿主バチルス属細菌に
導入し、形質転換したものである。宿主としては、好ま
しくは前述のバチルス・ズブチリスRM141株が用いられ
る。
組換え体DNA pBC5またはpBC51を宿主バチルス属細菌に
導入し、形質転換したものである。宿主としては、好ま
しくは前述のバチルス・ズブチリスRM141株が用いられ
る。
本発明によれば、本発明の組換え体DNAを含むバチルス
属細菌を培養し、その培養物よりセルラーゼを採取する
ことができる。培養に用いられる培地としては、炭素
源、窒素源および無機塩を含み、バチルス属細菌が生育
可能な培地が用いられる。培地のpHは6.5〜7.5、培養温
度は30〜42℃が好ましい。
属細菌を培養し、その培養物よりセルラーゼを採取する
ことができる。培養に用いられる培地としては、炭素
源、窒素源および無機塩を含み、バチルス属細菌が生育
可能な培地が用いられる。培地のpHは6.5〜7.5、培養温
度は30〜42℃が好ましい。
本発明法で得られたセルラーゼは化の性質を有する。
（１）作用・基質特異性 セルロース類を分解、可溶化する。本酵素を基質カルボ
キシメチルセルロースに作用せしめたとき、その反応時
間と粘度低下並びに還元糖の生成との関係を第３図に示
す。同図より、本発明で得られたセルラーゼは粘度低下
の作用の方が還元糖の生成力よりも相対的に強いことが
分かる。
キシメチルセルロースに作用せしめたとき、その反応時
間と粘度低下並びに還元糖の生成との関係を第３図に示
す。同図より、本発明で得られたセルラーゼは粘度低下
の作用の方が還元糖の生成力よりも相対的に強いことが
分かる。
なお、上記の操作は、0.5％カルボキシメチルセルロー
スを含む0.1Mトリス−マレート緩衝液（pH6.5）に本発
明で得られた酵素を添加し、経時的に反応液の粘度およ
び生成還元糖量を測定したものである。第３図におい
て、−○−、−△−および−□−は粘度を、−●−、−
▲−および−■−は生成還元糖量（グルコースに換算し
て表示）をそれぞれ表し、形の同じシンボルは同一の酵
素量の添加を意味する。
スを含む0.1Mトリス−マレート緩衝液（pH6.5）に本発
明で得られた酵素を添加し、経時的に反応液の粘度およ
び生成還元糖量を測定したものである。第３図におい
て、−○−、−△−および−□−は粘度を、−●−、−
▲−および−■−は生成還元糖量（グルコースに換算し
て表示）をそれぞれ表し、形の同じシンボルは同一の酵
素量の添加を意味する。
（２）至適pH:6.0〜6.5 （３）至適温度：約55℃ （４）pH安定性:pH4.5〜10.0（55℃、１時間） （５）熱安定性:60℃、１時間では100％残存、 65℃、１時間では65％残存 実施例１ バチルス・ズブチリスIFO3034株を、バクトペプトン１
％、酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.5％、グルコー
ス0.1％および残部精製水より成る培地（以下Ｌ−培地
という）400ml中で対数増殖期まで成育させた後、生成
した菌体を熱めTES（20mMトリス−塩酸、100mM塩化ナト
リウムおよび5mMエチレンジアミン四酢酸を含むpH8.0の
溶液）で１回洗浄した。得られた洗浄菌体をフエノール
法に付し、約8.7mgの染色体DNAを抽出した。この染色体
DNA5μｇを制限酵素EcoRIで10分間処理した後、アガロ
ースゲル電気泳動に付し、3kb〜9kbの断片を分取した。
一方、プラスミドベクターpBD64 1μｇをEcoRIで完全分
解した後、上記染色体DNA断片と混合し、T4DNAリガーゼ
を加え、４℃で16時間処理し、両者を連結し組換え体DN
Aを得た。
％、酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.5％、グルコー
ス0.1％および残部精製水より成る培地（以下Ｌ−培地
という）400ml中で対数増殖期まで成育させた後、生成
した菌体を熱めTES（20mMトリス−塩酸、100mM塩化ナト
リウムおよび5mMエチレンジアミン四酢酸を含むpH8.0の
溶液）で１回洗浄した。得られた洗浄菌体をフエノール
法に付し、約8.7mgの染色体DNAを抽出した。この染色体
DNA5μｇを制限酵素EcoRIで10分間処理した後、アガロ
ースゲル電気泳動に付し、3kb〜9kbの断片を分取した。
一方、プラスミドベクターpBD64 1μｇをEcoRIで完全分
解した後、上記染色体DNA断片と混合し、T4DNAリガーゼ
を加え、４℃で16時間処理し、両者を連結し組換え体DN
Aを得た。
プラスミドpUB110を保持するバチルス・ズブチリスRM12
5npr-株を、10μg/mlのカナマイシンを含有するＬ−培
地で一晩培養後、得られた培養液をスピゼゼン最小培地
（リン酸二カリウム14g、リン酸一カリウム6g、硫酸ア
ンモニア2g、クエン酸二ナトリウム1g、硫酸マグネシウ
ム・７水塩0.2g、グルコース5g、水１より成る培地）
にさらに50μg/mlロイシン、50μg/mlアルギニンおよび
10μg/mlカナマイシンを加えた培地に10％接種し、37℃
で４時間培養した。次いで、1g/l硫酸マグネシウム・７
水塩、10μg/mlロイシン、50μg/mlアルギニン、10μg/
mlカナマイシンおよび0.5mM塩化カルシウムを添加した
スピゼゼン最小培地に上記で得られた培養液を10％接種
し、37℃で90分間培養してコンピテントセルを得た。
5npr-株を、10μg/mlのカナマイシンを含有するＬ−培
地で一晩培養後、得られた培養液をスピゼゼン最小培地
（リン酸二カリウム14g、リン酸一カリウム6g、硫酸ア
ンモニア2g、クエン酸二ナトリウム1g、硫酸マグネシウ
ム・７水塩0.2g、グルコース5g、水１より成る培地）
にさらに50μg/mlロイシン、50μg/mlアルギニンおよび
10μg/mlカナマイシンを加えた培地に10％接種し、37℃
で４時間培養した。次いで、1g/l硫酸マグネシウム・７
水塩、10μg/mlロイシン、50μg/mlアルギニン、10μg/
mlカナマイシンおよび0.5mM塩化カルシウムを添加した
スピゼゼン最小培地に上記で得られた培養液を10％接種
し、37℃で90分間培養してコンピテントセルを得た。
このコンピテントセルに上述の組換え体DNAを含む溶液5
0μｌを加え、37℃で45分間静かに振盪後、Ｌ−培地2ml
を加えて37℃で90分間振盪培養した。この培養液を、１
％カゼイン、0.5％カザミノ酸および５μg/mlクロラム
フエニコールを含むスピゼゼン最小培地に接種し、寒天
平板上で、37℃、一晩培養した。平板上に生じたコロニ
ーをセルラーゼ検出用培地〔バクトペナセイブロス（デ
イフコ社製）に１％カルボキシメチルセルロースおよび
５μg/mlクロラムフエニコールを加えた寒天培地〕にレ
プリカし、37℃で一晩培養した。１％コンゴーレツド溶
液に寒天培地を浸漬させ室温で15分間放置後、1M塩化ナ
トリウム溶液で洗浄し、生成したコロニー周辺のハロー
の大きな形質転換株７株得た。これらの形質転換株から
アルカリリシス法（Recombinant DNA Techniques:An In
troduction,164〜165頁,Addison−Wesley社発行,1983
年）によりプラスミドを調製し、バチルス・ズブチリス
RM141株（hsrM,hsmM,hisA,leuB,argA5,recE4）にプロト
プラスト法により導入した。このプラスミドの調製、導
入の操作を３回繰り返すことにより混在するプラスミド
pUB110を除くことができた。ここで得られた組換え体DN
Aはすべて同一であり、その制限酵素地図は第１図に示
すように、プラスミドベクターpBD64にセルラーゼをコ
ードする遺伝子を含む4.8kbの挿入DNA断片が組み込まれ
ていた。この組換え体DNAをpBC5と命名した。
0μｌを加え、37℃で45分間静かに振盪後、Ｌ−培地2ml
を加えて37℃で90分間振盪培養した。この培養液を、１
％カゼイン、0.5％カザミノ酸および５μg/mlクロラム
フエニコールを含むスピゼゼン最小培地に接種し、寒天
平板上で、37℃、一晩培養した。平板上に生じたコロニ
ーをセルラーゼ検出用培地〔バクトペナセイブロス（デ
イフコ社製）に１％カルボキシメチルセルロースおよび
５μg/mlクロラムフエニコールを加えた寒天培地〕にレ
プリカし、37℃で一晩培養した。１％コンゴーレツド溶
液に寒天培地を浸漬させ室温で15分間放置後、1M塩化ナ
トリウム溶液で洗浄し、生成したコロニー周辺のハロー
の大きな形質転換株７株得た。これらの形質転換株から
アルカリリシス法（Recombinant DNA Techniques:An In
troduction,164〜165頁,Addison−Wesley社発行,1983
年）によりプラスミドを調製し、バチルス・ズブチリス
RM141株（hsrM,hsmM,hisA,leuB,argA5,recE4）にプロト
プラスト法により導入した。このプラスミドの調製、導
入の操作を３回繰り返すことにより混在するプラスミド
pUB110を除くことができた。ここで得られた組換え体DN
Aはすべて同一であり、その制限酵素地図は第１図に示
すように、プラスミドベクターpBD64にセルラーゼをコ
ードする遺伝子を含む4.8kbの挿入DNA断片が組み込まれ
ていた。この組換え体DNAをpBC5と命名した。
実施例２ 実施例１で得られた組換え体DNA pBC5を制限酵素PvuII
で部分分解した後、BalIIリンカーをT4DNAリガーゼで連
結し、再度制限酵素EcoRIおよびBglIIで処理した後、ア
ガロースゲル電気泳動法による分離に付し、約2.8kbのD
NA断片を得た。このDNA断片とプラスミドpUB110の制限
酵素EcoRIおよびBamHI消化物の大断片とをT4DNAリガー
ゼで連結し組換え体DNA pBC51を得た。組換え体DNA pBC
51は、プラスミドベクターpUB110に実質的にセルラーゼ
をコードする遺伝子からなる2.8kbのDNA断片が連結され
ていた（第２図に示す）。
で部分分解した後、BalIIリンカーをT4DNAリガーゼで連
結し、再度制限酵素EcoRIおよびBglIIで処理した後、ア
ガロースゲル電気泳動法による分離に付し、約2.8kbのD
NA断片を得た。このDNA断片とプラスミドpUB110の制限
酵素EcoRIおよびBamHI消化物の大断片とをT4DNAリガー
ゼで連結し組換え体DNA pBC51を得た。組換え体DNA pBC
51は、プラスミドベクターpUB110に実質的にセルラーゼ
をコードする遺伝子からなる2.8kbのDNA断片が連結され
ていた（第２図に示す）。
この組換え体DNA pBC51を、実施例１と同じプロトプラ
スト法によりバチルス・ズブチリスRM141株に導入し、
形質転換株バチルス・ズブチリスRM141/pBC51株を得
た。本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第8268号（FERM P−8268）なる受託番号で寄託され
ている。
スト法によりバチルス・ズブチリスRM141株に導入し、
形質転換株バチルス・ズブチリスRM141/pBC51株を得
た。本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第8268号（FERM P−8268）なる受託番号で寄託され
ている。
実施例３ 実施例１で得られた組換え体DNA pBC5を含むバチルス・
ズブチリスRM141/pBC5株、実施例２で得られた組換え体
DNA pBC51を含むバチルス・ズブチリスRM141/pBC51株お
よび染色体DNAの供与株バチルス・ズブチリスIFO3034株
並びに宿主として使用したバチルス・ズブチリスRM141
にプラスミドベクターpBD64を組み込んだバチルス・ズ
ブチリスRM141/pBD64株をＬ−培地100mlに接種し、37℃
で20時間培養した。各菌株の培養液のセルラーゼの活性
を第１表に示す。なお、ここでセルラーゼ活性とは、0.
2％カルボキシメチルセルロースを含む0.1Mトリス−マ
レート緩衝液（pH6.5）と酵素試料を混合し、37℃にお
いて30分間反応せしめたとき、１μモルのグルコースに
相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。
ズブチリスRM141/pBC5株、実施例２で得られた組換え体
DNA pBC51を含むバチルス・ズブチリスRM141/pBC51株お
よび染色体DNAの供与株バチルス・ズブチリスIFO3034株
並びに宿主として使用したバチルス・ズブチリスRM141
にプラスミドベクターpBD64を組み込んだバチルス・ズ
ブチリスRM141/pBD64株をＬ−培地100mlに接種し、37℃
で20時間培養した。各菌株の培養液のセルラーゼの活性
を第１表に示す。なお、ここでセルラーゼ活性とは、0.
2％カルボキシメチルセルロースを含む0.1Mトリス−マ
レート緩衝液（pH6.5）と酵素試料を混合し、37℃にお
いて30分間反応せしめたとき、１μモルのグルコースに
相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。
発明の効果 本発明に従えば、セルラーゼをコードする遺伝子をバチ
ルス属細菌内で形質転換することが可能になり、セルラ
ーゼの生産性を飛躍的に高めることができた。一例とし
て、バチルス・ズブチリスIFO3034株の染色体DNA中のセ
ルラーゼをコードする遺伝子をベクターに連結し、宿主
バチルス・ズブチリスRM141株に導入したところ約４倍
にセルラーゼの生産性が高まった。
ルス属細菌内で形質転換することが可能になり、セルラ
ーゼの生産性を飛躍的に高めることができた。一例とし
て、バチルス・ズブチリスIFO3034株の染色体DNA中のセ
ルラーゼをコードする遺伝子をベクターに連結し、宿主
バチルス・ズブチリスRM141株に導入したところ約４倍
にセルラーゼの生産性が高まった。
第１図および第２図は、それぞれ本発明の組換え体DNA
pBC5およびpBC51の制限酵素地図を表す図である。 第３図は、本発明で得られたセルラーゼをカルボキシメ
チルセルロースに作用せしめたときの粘度と生成還元糖
の変化を表す図である。
pBC5およびpBC51の制限酵素地図を表す図である。 第３図は、本発明で得られたセルラーゼをカルボキシメ
チルセルロースに作用せしめたときの粘度と生成還元糖
の変化を表す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:125） (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌｏｇｙ，158［２］（1984）Ｐ．503〜 506 斉藤等著「ライフサイエンスシリーズ遺 伝子組換え実用化技術第２集」（昭和56− ３−15）株式会社サイエンスフォーラムＰ 147〜154
Claims (8)
- 【請求項１】バチルス属由来であり下記のＡまたはＢの
制限酵素地図で示され且つセルラーゼをコードする遺伝
子を、DNA導入ベクターに組み込んだ宿主バチルス（Bac
illus）属細菌内で複製可能な組換え体DNA。 - 【請求項２】セルラーゼをコードする遺伝子がバチルス
・ズブチリス（Bacillus subtills）IFO 3034株の染色
体中に存在する遺伝子である特許請求の範囲第１項記載
の組換え体DNA。 - 【請求項３】バチルス属由来であり下記のＡまたはＢの
制限酵素地図で示され且つセルラーゼをコードする遺伝
子を含む染色体DNAを制限酵素で断片化する工程、得ら
れたDNA断片をDNA導入ベクターに組み込んで組換え体DN
Aを作成する工程、該組換え体DNAを宿主バチルス属細菌
に導入して形質転換する工程、形質転換されたバチルス
属細菌のうち菌体外にセルラーゼを産生する菌株を選択
する工程および選択された菌株からセルラーゼをコード
する遺伝子が連結された組換え体DNAを回収する工程を
含むことを特徴とする下記のＡまたはＢの制限酵素地図
で示され且つセルラーゼをコードする遺伝子を組み込ん
だ組換え体DNAの製造法。 - 【請求項４】染色体DNAを供与するバチルス属細菌がバ
チルス・ズブチリス（Bacillus subtills）IFO 3034株
である特許請求の範囲第３項記載の組換え体DNAの製造
法。 - 【請求項５】組換え体DNAを第一の宿主バチルス属細菌
に導入して該菌株を形質転換し、得られた形質転換株よ
りセルラーゼをコードする遺伝子が含まれるプラスミド
を取り出し、染色体DNAとの組換え能力の低下した第二
の宿主バチルス属細菌に再度導入して形質転換する特許
請求の範囲第３項記載の組換え体DNAの製造法。 - 【請求項６】バチルス属由来であり下記のＡまたはＢの
制限酵素地図で示され且つセルラーゼをコードする遺伝
子を、DNA導入ベクターに組み込んだバチルス属細菌内
で複製可能な組換え体DNAを含むバチルス属細菌。 - 【請求項７】バチルス・ズブチリスRM141/pBC5株である
特許請求の範囲第６項記載の組換え体DNAを含むバチル
ス属細菌。 - 【請求項８】バチルス・ズブチリスRM141/pBC51株であ
る特許請求の範囲第６項記載の組換え体DNAを含むバチ
ルス属細菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60121535A JPH06102022B2 (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | 組換え体ｄｎａ、その製造法、およびそれを含むバチルス属細菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60121535A JPH06102022B2 (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | 組換え体ｄｎａ、その製造法、およびそれを含むバチルス属細菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61280284A JPS61280284A (ja) | 1986-12-10 |
| JPH06102022B2 true JPH06102022B2 (ja) | 1994-12-14 |
Family
ID=14813646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60121535A Expired - Lifetime JPH06102022B2 (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | 組換え体ｄｎａ、その製造法、およびそれを含むバチルス属細菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06102022B2 (ja) |
-
1985
- 1985-06-06 JP JP60121535A patent/JPH06102022B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５８［２（１９８４）Ｐ．５０３〜５０６ |
| 斉藤等著「ライフサイエンスシリーズ遺伝子組換え実用化技術第２集」（昭和５６−３−１５）株式会社サイエンスフォーラムＰ１４７〜１５４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61280284A (ja) | 1986-12-10 |
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