JP5448812B2 - ポリペプチド - Google Patents

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Description

２００３年７月７日に出願された米国仮特許出願第６０／４８５，４１３号、同第６０／４８５，５３９号、および同第６０／４８５，６１６号を参照する。２００４年７月７日に米国を指定して出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２１７２３号および同第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２１７３９号（出願人：Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）もまた参照する。全て２００４年７月７日に出願された米国実用新案出願第１０／８８６，９０５号および同第１０／８６６，９０３号もまた参照する。
米国仮特許出願第６０／６０８，９１９号（２００４年７月７日に米国実用新案出願第１０／８８７，０５６号として出願されたが２００４年９月１５日に仮特許出願に変更された）もまた参照する。２００４年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／６１２，４０７号もまた参照する。
加えて、２００３年７月７日に出願された米国特許出願第６０／４８５，５３９号を参照する。２００４年７月７日に米国を指定して出願された国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２４８７号もまた参照する（出願人：Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ）。２００４年７月７日に出願された米国実用新案出願第１０／８８６，０２３号もまた参照する。
全て２００４年７月７日に出願された米国実用新案出願第１０／８８６，５０５号、同第１０／８６６，５２７号および同第１０／８６６，５０４号もまた参照する。２００４年９月２２日に出願された米国実用新案出願第１０／９４７，６１２号もまた参照する。
２００５年７月７日に米国を指定して出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２６７５号もまた参照する（出願人：Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／ＳおよびＧｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ、Ｄ Ｙｏｕｎｇ ＆ Ｃｏ代理人参照：Ｐ０２０１６１ＷＯ）。２００５年７月７日に出願された米国仮特許出願第６０／６９７，３０２号もまた参照する。
以前の出願、及び以前の出願の各々の訴訟の最中を含む今回及び以前の出願の各々において引用又は参照された各文書（「出願及び文献引用文書」）、及び以前の出願及び文献の各々において、及び出願及び文献引用文書において、引用又は言及された如何なる製品に関する製造元の説明書又はカタログも参照により本明細書に組み込まれる。更に又、本テキスト中で引用した全ての文書、及び本テキストで引用した文書におけるすべての引用文書又は参考文献、及び本テキストにおいて、そして本テキスト内に組み込まれる何れかの文書において引用又は言及された如何なる製品に関する何れの製造元の説明書又はカタログも、参照により本明細書に組み込まれる。本テキスト内に参照により組み込まれた文書又はその如何なる教示内容も本発明の実施において使用してよい。本テキストに参照により組み込まれた文書は従来技術として容認されない。
本発明はポリペプチド、特にアミラーゼポリペプチド、及びこれらをコードする核酸、及び食料品の製造における非マルトース生成性エキソアミラーゼとしてのその使用に関する。本発明のアミラーゼはより多くの有利な性質を有するように操作されている。特に本発明のアミラーゼは改変されたエキソ特異性及び／又は改変された熱安定性を示す。特に、ポリペプチドは非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性、特にグルカン１，４−アルファマルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ．３．２．１．６０）活性を有するポリペプチドから誘導される。
向上したアミラーゼはベーキングのような特定のプロセスにおいて固有の問題点を軽減することができる。ベーキングの数日後には澱粉の顆粒においてアミロペクチンの結晶化が生じ、これはパンの堅固性の増大をもたらし、そしてパンの劣化を誘発する。パンが劣化すると、パンはクランブの軟質性及びクランブの水分を失う。その結果、クランブは低弾力性となり、パンは皮革状のクラストを形成する。
アミロペクチン側鎖の酵素的加水分解（例えばアミラーゼによる）は結晶化を低減し、そして抗劣化性を増大させる。結晶化はアミロペクチン側鎖の長さにより変動し：側鎖が長いほど結晶化が高度になる。大部分の澱粉顆粒は２種の重合体：アミロペクチン及びアミロースの混合物よりなり、その約７５％はアミロペクチンである。アミロペクチンは（１−４）連結部により連結されたα−Ｄ−グルコピラノシル単位の鎖より成る極めて大型の分枝した分子であり、そこでは鎖はα−Ｄ−（１−６）連結部により結合されて分枝を形成している。アミロースはわずかなα−Ｄ−（１−６）分枝部を有する（１−４）連結α−Ｄ−グルコピラノシル単位の直鎖である。
白パン、分篩されたライ麦粉及び小麦粉から作成されたパン、及びロールのような澱粉質のパン製品のベーキングは約１５〜６０分間１８０〜２５０℃の範囲のオーブン温度においてパンのドウをベーキングすることにより達成される。ベーキングプロセスの間、外側のドウの層上に渡って急激な温度勾配（２００→１２０℃）が生じ、そこではベーキングされた製品のクラストが形成される。しかしながら、水蒸気が原因となってクランブ内の温度はベーキングプロセス終了時で僅か約１００℃である。約８５℃超の温度においては酵素の不活性化が起こり、酵素はもはや抗劣化特性は有さなくなる。即ち熱安定性のアミラーゼのみがベーキング中に効率的に澱粉を改質することができる。
エンドアミラーゼ活性は分枝鎖デキストリンの蓄積に起因して粘着性又はガム様のクランブを製造することにより最終的なパン製品の品質に悪影響を及ぼす場合がある。エキソアミラーゼ活性は、それがエキソアミラーゼ活性に関連する悪影響を低減しながら劣化の遅延をもたらす澱粉の所望の改質を達成するために、好ましい。エンドアミラーゼ活性の低減は高値のエキソ特異性をもたらす場合があり、これは分枝鎖デキストリンを低減してより高品質のパンを製造することができる。
本発明者等は本発明により請求項記載のＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。本発明者等は更に、請求項記載の食料品添加物、食料品、ベーカリー製品、向上剤組成物、飼料製品、例えば動物飼料等中、又はそれら自体としての場合を包含するこのようなＰＳ４変異体ポリペプチドの使用を提供する。本発明者等は請求項記載のＰＳ４変異体ポリペプチドをコードし、そしてそれに関連する核酸を提供する。そのようなＰＳ４変異体ポリペプチドを製造するための方法、及び本発明の他の特徴もまた請求項記載されている。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドであって、該ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）への３０７位におけるアミノ酸置換を含む、ＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目２）
エキソアミラーゼ活性、好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能な項目１記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目３）
３０７位におけるアミノ酸置換がリジンへの置換（３０７Ｋ）、好ましくはＨ３０７Ｋ、又はアルギニンへの置換（３０７Ｒ）、好ましくはＨ３０７Ｒである、項目１記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目４）
７０位におけるアミノ酸置換を更に含む項目１、２又は３に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目５）
７０位におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換（７０Ｄ）、好ましくはＧ７０Ｄである前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目６）
ＰＳ４変異体ポリペプチドの配列の２７２位におけるアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）である前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目７）
ＰＳ４変異体ポリペプチドの配列の３０３位におけるアミノ酸がグリシン（Ｇ）である前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目８）
ＰＳ４変異体ポリペプチドが３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、又は３３４位よりなる群から選択される突然変異１つ以上をさらに含む、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目９）
ＰＳ４変異体ポリペプチドにおける追加的突然変異が３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ａ３０９Ｐ及びＳ３３４Ｐよりなる群から選択される、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目１０）
ＰＳ４変異体ポリペプチドが、配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換、即ち：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ｈ３０７Ｋ、Ａ３０９Ｐ及びＳ３３４Ｐを含む、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目１１）
ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号２１（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２）を含む、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目１２）
ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換、即ち：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｒ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ｈ３０７Ｒ、Ａ３０９Ｐ、Ｓ３３４Ｐを含む、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目１３）
ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号２３（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒ）を含む、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目１４）
非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドであって、該ＰＳ４変異体ポリペプチドが、配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換、即ち：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ａ３０９Ｐ、Ｓ３３４Ｐを含む、ＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目１５）
ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号２５（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｈ）を含む、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目１６）
親ポリペプチドが非マルトース生成性エキソアミラーゼ、好ましくはグルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）を含む、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目１７）
親ポリペプチドがシュードモナス種、好ましくはシュードモナス・サッカロフィリア又はシュードモナス・スツッゼリーであるか、又はそれから誘導可能な、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目１８）
親ポリペプチドが配列番号１又は配列番号５に示す配列を有するシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ由来の非マルトース生成性エキソアミラーゼである、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目１９）
配列番号１又は配列番号５に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目２０）
親ポリペプチドが配列番号７又は配列番号１１に示す配列を有するシュードモナス・
スツッゼリー由来の非マルトース生成性エキソアミラーゼである、項目１〜８の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目２１）
配列番号７又は配列番号１１に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する、項目１〜８又は１１の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目２２）
発明の詳細な説明、項目又は図面に記載した配列を含む、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目２３）
配列番号２１（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２）、配列番号２３（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒ）、及び配列番号２５（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｈ）よりなる群から選択される配列を含む、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目２４）
同じ条件下で試験した場合、ＰＳ４変異体ポリペプチドが親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドと比較して、高値の熱安定性を有する、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目２５）
好ましくは６０℃における半減期（ｔ１／２）が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドと相対比較して１５％以上、好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％以上増大している、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目２６）
ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、以下の特性、即ち：（ａ）低値の堅固性；（ｂ）高値の復元力；（ｃ）高値の凝集性；（ｄ）低値の易崩壊性；及び（ｅ）高値の折畳性の何れか１つ以上、好ましくは全てを有する、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目２７）
食料品の復元力、凝集性又は折畳性が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、１５％以上、好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％以上独立して増大している、項目２６記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目２８）
ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理されている食料品の復元力、凝集性及び折畳性が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して増大している、項目２６又は２７記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目２９）
食料品の堅固性又は易崩壊性が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と相対比較して、１５％以上、好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％以上独立して低下している、項目２６記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目３０）
ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理されている食料品の堅固性及び易崩壊性の各々が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して低下している、項目２６又は２９記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
（項目３１）
ポリペプチドが非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの少なくとも２０残基のフラグメントを含む、ポリペプチド。
（項目３２）
ＰＳ４変異体ポリペプチド配列の残基１つ以上における突然変異により前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドから誘導可能なポリペプチドであって、該ポリペプチドが、ＰＳ４変異体ポリペプチドの親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドと比較して高値の熱安定性又は高値のエキソ特異性又は両方を有するか、又は、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、以下の特性、即ち：（ａ）低値の堅固性；（ｂ）高値の復元力；（ｃ）高値の凝集性；（ｄ）低値の易崩壊性；または（ｅ）高値の折畳性の何れか１つ以上、好ましくは全てを有する、ポリペプチド。
（項目３３）
食料品又は飼料添加物としての前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの使用。
（項目３４）
項目１〜３２の何れかに記載のポリペプチドに澱粉を接触させること、及び、該ポリペプチドに澱粉から線状生成物１つ以上を形成させることを含む、澱粉を処理するためのプロセス。
（項目３５）
食料品又は飼料製品の製造における項目１〜３２の何れかに記載のポリペプチドの使用。
（項目３６）
項目１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを食料品又は飼料成分に添加混合することを含む食料品又は飼料製品の製造プロセス。
（項目３７）
食料品がドウ又はドウ製品、好ましくはプロセシングされたドウ製品を含む、項目３５記載の使用又は項目３６記載のプロセス。
（項目３８）
前記食料品がベーカリー製品である項目３５〜３７の何れかに記載の使用またはプロセス。
（項目３９）
（ａ）澱粉媒体を準備すること；（ｂ）澱粉媒体に項目１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを添加すること；及び（ｃ）工程（ｂ）の最中又は後に澱粉媒体に熱を適用することによりベーカリー製品を製造すること、を含むベーカリー製品を作成するためのプロセス。
（項目４０）
項目３５〜３９の何れかに記載のプロセスにより得られる食料品、飼料製品、ドウ製品又はベーカリー製品。
（項目４１）
ドウのための向上剤組成物であって、向上剤組成物が項目１〜３２の何れかに記載のポリペプチド及び少なくとも１つの追加のドウ成分又はドウ添加物を含む上記組成物。
（項目４２）
穀物粉及び項目１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを含む組成物。
（項目４３）
ドウ製品の劣化、好ましくは有害な劣化を遅延又は低減するための、ドウ製品における項目１〜４２の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの使用。
（項目４４）
ドウ製品の堅固性、復元力、凝集性、易崩壊性又は折畳性の何れか１つ以上を向上させるための、ドウ製品における項目１〜４２の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの使用。
（項目４５）
下記成分：
（ａ）バチルス・ステアロサーモフィルス由来の、１，４−α−マルトヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）とも称されるマルトース生成性アルファアミラーゼ、又はマルトース生成性アルファアミラーゼ活性を有するその変異体、相同体、又は突然変異体；
（ｂ）バチルス種、アスペルギルス種、サーモマイセス種、又はトリコデルマ種由来のベーカリーキシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）；
（ｃ）バチルス・アミロリクファシエンス由来のα−アミラーゼ（ＥＣ．３．２．１．１）、又はアルファアミラーゼ活性を有するその変異体、相同体、又は突然変異体；及び、
（ｄ）フサリウム・ヘテロスポラム由来のグリコリパーゼのようなリパーゼ；
の何れか１つ以上との、前記項目の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの複合物。
（項目４６）
前記項目の何れかに記載の用途のための項目４５記載の複合物の使用。
（項目４７）
項目３１記載の複合物を用いた処理により製造される食料品又は飼料製品。
（項目４８）
項目１〜３２の何れかに記載のポリペプチドをコードすることができる核酸。
（項目４９）
配列番号６及び配列番号１２に少なくとも７５％同一である核酸配列を有する、項目４８記載の核酸。
（項目５０）
非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることができる項目４８又は４９記載の核酸の少なくとも６０残基のフラグメントを含む核酸。
（項目５１）
親配列から誘導可能な核酸配列であって、親配列は非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードすることができ、その核酸配列が、３０７位におけるリジン（Ｒ）又はアルギニン（Ｋ）残基を核酸がコードするような残基１つ以上における置換を、場合により配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照して３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０９Ｐ、３３４Ｐよりなる群から選択される残基１つ以上を核酸がコードするような別の突然変異１個以上と共に、含んでいる、核酸配列。
（項目５２）
ヌクレオチド残基１つ以上の置換により非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードする親配列から誘導される、項目４８〜５２の何れかに記載のＰＳ４核酸配列。
（項目５３）
配列番号２２（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２）、配列番号２４（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒ）、及び配列番号２６（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｈ）よりなる群から選択される項目４８〜５２の何れかに記載の核酸配列。
（項目５４）
項目４８〜５３の何れかに記載のＰＳ４核酸を含むプラスミド。
（項目５５）
項目４８〜５４の何れかに記載のＰＳ４核酸を含むか、又は項目１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを発現することができる発現ベクター。
（項目５６）
項目５４記載のプラスミド又は項目５５記載の発現ベクターを含む、好ましくはこれにより形質転換された宿主細胞。
（項目５７）
項目１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを発現することができる細胞。
（項目５８）
細菌、真菌、又は酵母の細胞である項目５６記載の宿主細胞、又は項目５７記載の細胞。
（項目５９）
ＰＳ４変異体ポリペプチドを発現する方法であって、項目５６、５７又は５８記載の宿主細胞又は細胞を得ること、及び細胞又は宿主細胞からポリペプチドを発現させること、及び場合によりポリペプチドを精製することを含む、方法。
（項目６０）
場合により７０位における塩基性又は正荷電の残基へのアミノ酸置換を導入することを、場合により非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内への３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｈ、３０３Ｇ、３０９Ｐ、３３４Ｐ（配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照）よりなる群から選択される追加の突然変異１つ以上とともに行うことにより、ポリペプチド、好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼの配列を改変する方法。
（項目６１）
塩基性又は正荷電の残基がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）を含む、項目６０記載の方法。
（項目６２）
非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードする核酸の配列を改変することにより、非マルトース生成性エキソアミラーゼの配列を改編する、項目６０又は６１記載の方法。
（項目６３）
ＰＳ４ポリペプチド変異体を製造する方法であって、該方法が非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内にアミノ酸置換を導入することを含み、該アミノ酸置換は配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照して３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｋ／Ｒ／Ｈ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｈ、３０３Ｇ、３０９Ｐ、３３４Ｐよりなる群から選択される、方法。
（項目６４）
親ポリペプチドをコードする核酸の配列がアミノ酸置換を導入するように改変されている、項目６２又は６３記載の方法。
（項目６５）
非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードする核酸の配列を改変する方法であって、該方法は配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照して３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｋ／Ｒ／Ｈ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｈ、３０３Ｇ、３０９Ｐ、３３４Ｐよりなる群から選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを配列内に導入することを含む、方法。
（項目６６）
ポリペプチドの熱安定性又はエキソ特異性又は両方を増大させる方法であって、該方法が項目５８〜６５の何れかに記載の工程を含む、方法。
（項目６７）
ポリペプチドが単離又は精製、又は両方に付される項目５８〜６６の何れかに記載の方法。
（項目６８）
項目５８〜６７の何れかに記載の方法により得られるポリペプチド。
（項目６９）
項目５８〜６８の何れかに記載の方法により得られるポリペプチド。
（項目７０）
添付図面を参照しながら、そしてそれに示される通り、実質的に上記において説明されたＰＳ４変異体ポリペプチド、使用、プロセス、食料品、飼料製品、ドウ製品、ベーカリー製品、向上剤組成物、組成物、核酸、ベクター又は宿主細胞。
図１はテクスチャーアナライザーから得られた曲線の例を示す。 図２は本明細書に記載したＰＳ４変異体ポリペプチドの温度安定性を測定するための実験の結果を示す。Ｘ軸：温度、Ｙ軸：半減期（分）。菱形：ｐＳａｃ−Ｄ３４／ｐＭＤ３（配列番号２）、正方形：ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９（配列番号１３）、三角形：ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１）。 図３は種々の濃度のＰＳ４変異体ポリペプチドで処理したパン及び未処理のパンの堅固性を試験したベーキング試行の結果を示す。Ｘ軸は日数を示し、Ｙ軸はｈＰａで示した堅固性を示す（実施例１３参照）。菱形：２０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２のｋｇ数。正方形：４０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２のｋｇ数。三角形：６０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２のｋｇ数。十字型：対照（酵素非存在）。 図４は種々の濃度のＰＳ４変異体ポリペプチドで処理したパン及び未処理のパンの復元力を試験したベーキング試行の結果を示す。Ｘ軸は日数を示し、Ｙ軸は復元力単位で示した復元力を示す（実施例１４参照）。菱形：２０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２のｋｇ数。正方形：４０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２のｋｇ数。三角形：６０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２のｋｇ数。十字型：対照（酵素非存在）。 図５は種々の濃度のＰＳ４変異体ポリペプチドで処理したパン及び未処理のパンの凝集性を試験したベーキング試行の結果を示す。Ｘ軸は日数を示し、Ｙ軸は凝集性単位で示した凝集性を示す（実施例１５参照）。菱形：２０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２のｋｇ数。正方形：４０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２のｋｇ数。三角形：６０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２のｋｇ数。十字型：対照（酵素非存在）。 図６は３０７における置換を有するＰＳ４変異体ポリペプチドで処理したパンの堅固性を試験したベーキング試行の結果を示す。Ｘ軸は日数を示し、Ｙ軸はｈＰａで示した堅固性を示す（実施例１３参照）。菱形：対照（酵素非存在）。正方形：６０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−Ｄ３４／ｐＭＤ３（配列番号２）のｋｇ数。三角形：６０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９のｋｇ数（配列番号１３）。十字型：６０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２のｋｇ数。 図７は３０７における置換を有するＰＳ４変異体ポリペプチドで処理したパンの復元力さを試験したベーキング試行の結果を示す。Ｘ軸は日数を示し、Ｙ軸は復元力単位で示した復元力を示す（実施例１４参照）。菱形：対照（酵素非存在）。正方形：６０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−Ｄ３４／ｐＭＤ３（配列番号２）のｋｇ数。三角形：６０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９のｋｇ数（配列番号１３）。十字型：６０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２のｋｇ数。 図８は３０７における置換を有するＰＳ４変異体ポリペプチドで処理したパンの凝集性さを試験したベーキング試行の結果を示す。Ｘ軸は日数を示し、Ｙ軸は凝集性単位で示した凝集性を示す（実施例１４参照）。菱形：対照（酵素非存在）。正方形：６０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−Ｄ３４／ｐＭＤ３（配列番号２）のｋｇ数。三角形：６０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９のｋｇ数（配列番号１３）。十字型：６０，０００ベタミル単位／ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２のｋｇ数。 図９は４００ｐｐｍＮｏｖａｍｙｌ（ＴＭ）１５００及び５０ＢＭＫ／ｋｇｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１）を用いたトルティーヤのベーキング後第８日の折畳性試験を示す。 図１０は４００ｐｐｍＮｏｖａｍｙｌＴＭ１５００及び５０ＢＭＫ／ｋｇｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１）を用いたトルティーヤのベーキング後第８日の折畳性試験を示す。 図１１はＳＳＭ４７１Ｂ１０（配列番号２７）及びＳＳＭ４７１Ｃ０４（配列番号２９）を用いて製造したＵＳトーストの堅固性試験を示す。 図１２はＳＳＭ４７１Ｂ１０（配列番号２７）及びＳＳＭ４７１Ｃ０４（配列番号２９）を用いて製造したＵＳトーストの復元力試験を示す。 図１３はｐＭＳ３７０（配列番号３１）及びＳＳＭ４７１Ｃ０４（配列番号２９）を用いて製造したＵＳトーストの復元力試験を示す。
（配列表）
配列番号１はシュードモナス・サッカロフィリアマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列から誘導したＰＳ４レファレンス配列を示す。配列番号２はｐＳａｃ−Ｄ３４配列；澱粉結合ドメインの１１の置換及び欠失を有するシュードモナス・サッカロフィリアマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列を示す。配列番号３はｐＳａｃ−Ｄ２０配列；澱粉結合ドメインの１３の置換及び欠失を有するシュードモナス・サッカロフィリアマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列を示す。配列番号４はｐＳａｃ−Ｄ１４配列；澱粉結合ドメインの１４の置換及び欠失を有するシュードモナス・サッカロフィリアマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列を示す。配列番号５はシュードモナス・サッカロフィリアグルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ前駆体（ＥＣ３．２．１．６０）（Ｇ４−アミラーゼ）（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エキソマルトテトラヒドロラーゼ）（マルトテトラオース形成エキソアミラーゼ）を示す。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ２２９６３。配列番号６はマルトテトラヒドロラーゼＥＣ番号＝３．２．１．６０）をコードするＰ・サッカロフィリアｍｔａ遺伝子を示す。ゲンバンクアクセッション番号Ｘ１６７３２。配列番号７はシュードモナス・スツッゼリーマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列から誘導されたＰＳ４レファレンス配列を示す。配列番号８はＰＳｔｕ−Ｄ３４配列；９置換を有するシュードモナス・スツッゼリーマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列を示す。配列番号９はＰＳｔｕ−Ｄ２０配列；１１置換を有するシュードモナス・スツッゼリーマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列を示す。配列番号１０はＰＳｔｕ−Ｄ１４配列；１２置換を有するシュードモナス・スツッゼリーマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列を示す。配列番号１１はシュードモナス・スツッゼリー（シュードモナス・パーフェクトマリーナ）を示す。グルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ前駆体（ＥＣ３．２．１．６０）（Ｇ４−アミラーゼ）（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エキソマルトテトラヒドロラーゼ）（マルトテトラオース形成エキソアミラーゼ）を示す。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ１３５０７。配列番号１２はＰ・スツッゼリーマルトテトラオース形成アミラーゼ（ａｍｙＰ）遺伝子、完全版を示す。ゲンバンクアクセッション番号Ｍ２４５１６。
配列番号１３は突然変異３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｑ、３０３Ｅ、３０７Ｌ、３０９Ｐ、及び３３４Ｐを有するｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９アミノ酸配列を示す。配列番号１４はｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９核酸配列を示す。配列番号１５は突然変異３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４５Ｄ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｑ、３０３Ｅ、３０７Ｌ、及び３３４Ｐを有するｐＳａｃ−ｐＭＤ２４８アミノ酸配列を示す。配列番号１６はｐＳａｃ−ｐＭＤ２４８核酸配列を示す。配列番号１７は突然変異３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｄ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｑ、３０３Ｅ、３０７Ｌ、３０９Ｐ、及び３３４Ｐを有するｐＳａｃ−ｐＭＤ２５３アミノ酸配列を示す。配列番号１８はｐＳａｃ−ｐＭＤ２５３核酸配列を示す。配列番号１９は突然変異３Ｓ、３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｄ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｑ、３０３Ｅ、３０７Ｌ、３０９Ｐ、及び３３４Ｐを有するｐＳａｃ−ｐＭＤ２７１アミノ酸配列を示す。配列番号２０はｐＳａｃ−ｐＭＤ２７１核酸配列を示す。
配列番号２１は突然変異３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ、３０９Ｐ、及び３３４Ｐを有するｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２アミノ酸配列を示す。配列番号２２はｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２ヌクレオチド配列の配列を示す。配列番号２３は突然変異３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｒ、３０９Ｐ、及び３３４Ｐを有するｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒアミノ酸配列を示す。配列番号２４はｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒヌクレオチド配列の配列を示す。配列番号２５は突然変異３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０９Ｐ、及び３３４Ｐを有するｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｈアミノ酸配列を示す。配列番号２６はｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｈヌクレオチド配列の配列を示す。
配列番号２７は突然変異３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｑ、３０３Ｅ、３０７Ｒ、３０９Ｐ、及び３３４Ｐを有するＳＳＭ４７１Ｂ１０アミノ酸配列を示す。配列番号２８はＳＳＭ４７１Ｂ１０核酸配列を示す。配列番号２９は突然変異３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｑ、３０３Ｅ、３０７Ｋ、３０９Ｐ、及び３３４Ｐを有するＳＳＭ４７１Ｃ０４アミノ酸配列を示す。配列番号３０はＳＳＭ４７１Ｃ０４核酸配列を示す。配列番号３１は突然変異３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｑ、３０３Ｅ、３０９Ｐ、及び３３４Ｐを有するＰＭＳ３７０アミノ酸配列を示す。配列番号３２はＰＭＳ３７０核酸配列を示す。
以下の説明及び実施例においては、特段の記載が無い限り、ＰＳ４変異体ポリペプチドの用量は穀物粉のｐｐｍ（グラム当たりマイクログラム）で示す。例えば「１Ｄ３４」とは重量当たり重量に基づいてｐＳａｃ−Ｄ３４の１ｐｐｍを示す。好ましくは酵素の量はＢｒａｄｆｏｒｄの記載した試験を用いながら標準物質としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに計測した純粋な酵素蛋白の等量として活性試験に基づいて求められる（１９７６、Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）。
生産された、又は本文書により包含されることが意図される異なるＰＳ４変異体ポリペプチドを記載するに当たっては、参照を容易にするために以下の命名法を採用することになる。
（ｉ）置換が数及び文字、例えば１４１Ｐを包含する場合、これは［ナンバリングシステムに従った位置／置換されたアミノ酸］を指す。従って、例えば１４１位におけるプロリンへのアミノ酸置換は１４１Ｐと標記される。
（ｉｉ）置換が文字、数及び文字、例えばＡ１４１Ｐを包含する場合、これは［元のアミノ酸／ナンバリングシステムに従った位置／置換されたアミノ酸］を指す。従って、例えば１４１位におけるプロリンによるアラニンの置換はＡ１４１Ｐと標記される。
２つ以上の可能な置換が特定の位置において可能である場合は、これは場合によりスラッシュマーク「／」により分離されていてよい隣接した文字、例えばＧ３０３ＥＤ又はＧ３０３Ｅ／Ｄにより標記されることになる。ある位置における該当するアミノ酸が何れのアミノ酸によっても置換され得る場合は、これは［ナンバリングシステムに従った位置／Ｘ］、例えば１２１Ｘにより標記される。
多数の突然変異は、それぞれプロリンでアラニンを、そしてアラニンでグリシンを置換している１４１及び２２３位における突然変異を示す、Ａ１４１Ｐ／Ｇ２２３Ａの場合のスラッシュマーク「／」、又はＡ１４１Ｐ，Ｇ２２３Ａの場合のコンマ「，」により分離することにより表記してよい。
特段の記載が無い限り、本明細書で使用する全ての専門的学術的用語は本発明が属する技術分野の当業者の一般的に理解するものと同様の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ等、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は本発明において使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書に記載したものと同様又は等価ないかなる方法及び材料も本発明の実施又は試験において使用できるが、好ましい方法及び材料を記載する。数滴範囲は範囲を定義する数字を包含する。特段の記載が無い限り、それぞれ、核酸は５’から３’の方向に左から右に表記し；アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向に左から右に表記する。
本発明の実施は特段の記載が無い限り化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ及び免疫学の従来の手法を使用することになり、これらは当業者の能力の範囲内である。そのような手法は文献において説明されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等（１９９５年及び定期的補遺；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ １６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ．Ｉ、Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｈａｒｌｏｗ編（１９９９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ（編），Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編）（１９８８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３１４−２），１８５５，Ｌａｒｓ−Ｉｎｇｅ Ｌａｒｓｓｏｎ“Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ”，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ｉｎｃ．，Ｂａｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８８，ＩＳＢＮ０−８４９３−６０７８−１，Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｐｏｕｎｄ（編）；“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ８０”，シリーズ“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９８，ＩＳＢＮ０−８９６０３−４９３−３，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ編（２００１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ０−８２４７−０５６２−９）；及び Ｌａｂ Ｒｅｆ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｅｎｃｈ，Ｊａｎｅ Ｒｏｓｋａｍｓ ａｎｄ Ｌｉｎｄａ Ｒｏｄｇｅｒｓ編，２００２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−６３０−３を参照できる。これらの一般的テキストの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において言及する全ての特許及び公開物は、そのような特許及び公開物内で開示されている全ての配列を含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
ＰＳ４変異体ポリペプチド
本発明者等は親酵素と相対比較して改変されたエキソ特異性又は改変された熱安定性、又は改変された取扱特性の何れかの組み合わせであってよい、改変された特性を発揮する１つ以上の位置における置換を有するポリペプチドを提供する。そのような変異体ポリペプチドは本明細書においては簡便のために「ＰＳ４変異体ポリペプチド」と称する。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは好ましくは酵素活性を示す。より好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドはアミラーゼ活性、好ましくはエキソアミラーゼ活性を含む。高度に好ましい実施形態においては、ＰＳ４変異体ポリペプチドは非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を示す。
本発明者等はこのような改変されたＰＳ４変異体ポリペプチド、好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有するものを含む食料品添加物、食料品、ベーカリー製品、向上剤組成物、飼料製品、例えば動物用飼料等を包含する組成物、並びにそのようなポリペプチド及び組成物を製造及び使用する方法を提供する。
上記した通り、ＰＳ４変異体ポリペプチドは１つ以上の向上した取扱特性、好ましくは向上したベーキング特性を含んでよい。即ち、ＰＳ４変異体ポリペプチドはそのように処理された食料品が低値の堅固性、高値の復元力、高値の凝集性、低値の易崩壊性、又は高値の折畳性の何れか１つ以上（好ましくは全て）を有するようなものである。ＰＳ４変異体ポリペプチドにより示されるそのような向上した取扱又はベーキングの特性は以下により詳細に説明する。
本発明者等はそのようなポリペプチドによる、そして食料品が上記した所望の品質を示すような、食料品、特にドウ及びパン食料品の処理を提供する。
本発明者等はそのような組成物の他の使用、例えば洗剤の製造における、甘味料、シロップ等としての使用を提供する。組成物は他の成分少なくとも１つとともにポリペプチドを包含する。特に本発明者等はポリペプチドを含む食料品又は飼料添加物を提供する。
そのようなポリペプチド及び核酸は多くの突然変異を包含することによりそれらの親配列から変動する。換言すれば、ＰＳ４変異体ポリペプチド又は核酸の配列は多くの位置又は残基においてその親のものとは異なる。好ましい実施形態においては、突然変異はアミノ酸置換、即ちあるアミノ酸残基と別のものへの変化を含む。即ち、ＰＳ４変異体ポリペプチドは親配列の位置１つ以上におけるアミノ酸残基の性質において多くの変化を含む。
本明細書においては、「変異体」という用語は分枝が親分子から誘導可能であることを意味するものと解釈しなければならない。変異体はポリペプチド並びに核酸を包含する。変異体は特に１つ以上の場所における、アミノ酸レベルでの欠失、挿入及び置換、及び核酸レベルでの転換、遷移及び逆位を包含する。変異体は又トランケーションも包含する。変異体は親分子の相同及び機能的な誘導体を包含する。変異体は本明細書に記載するヌクレオチド配列にハイブリダイズできる配列に相補である配列を包含する。
３０７位塩基性残基突然変異体
本発明者等はアミラーゼ配列、好ましくはエキソアミラーゼ活性、より好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼ配列におけるアミノ酸置換を含む配列改変を有するＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。
特に、本発明者等は配列１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照して３０７位におけるアミノ酸突然変異を含む非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。３０７位置換は好ましくは塩基性又は正荷電のアミノ酸、好ましくはリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）への置換である。
１つの実施形態において本発明者等は３０７位におけるアミノ酸置換がリジンへの置換（３０７Ｋ）、好ましくはＨ３０７ＫであるＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。別の実施形態においては、本発明者等は３０７位におけるアミノ酸置換がアルギニンへの置換（３０７Ｒ）、好ましくはＨ３０７Ｒである請求項１又は２記載のＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは更にアスパラギン酸（Ｄ）への７０位における突然変異、好ましくは７０Ｄを包含してよい。好ましい実施形態においては、置換はＧ７０Ｄである。従って、一部の実施形態においては、本発明者等は配列１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、置換Ｇ７０Ｄ、Ｈ３０７Ｋ又はＧ７０Ｄ、Ｈ３０７Ｒを含むＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。
２７２及び３０３位における残基は「野生型」であってよく、或いは突然変異していてよい。好ましい実施形態においては、２７２位の残基は野生型残基、即ちヒスチジン（Ｈ）である。好ましくは、３０３位の残基もまた野生型残基、即ちグリシン（Ｇ）である。従って本発明者等は配列１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して置換Ｇ７０Ｄ及びＨ３０７Ｋを含み２７２位の残基がＨであり３０３位の残基がＧであるか、又は置換Ｇ７０Ｄ及びＨ３０７Ｒを含２７２位の残基がＨであり３０３位の残基がＧであるようなＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。
そのような変異体ポリペプチド、及び本明細書に記載する他のものは本明細書においては「ＰＳ４変異体ポリペプチド」と称する。そのような変異体ポリペプチドをコードする核酸もまた開示し、そして簡便のために「ＰＳ４変異体核酸」と称することになる。ＰＳ４変異体ポリペプチド及び核酸は以下により詳細に説明する。
「親」配列、即ちＰＳ４変異体ポリペプチド及び核酸の基礎となる配列は好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドである。「親酵素」及び「親ポリペプチド」という用語は相応に解釈されるべきであり、そしてＰＳ４変異体ポリペプチドの基礎となる酵素及びポリペプチドを意味する。それらは以下により詳細に説明する。
突然変異及びアミノ酸の変化は以下により詳細に説明する通り野生型又は突然変異した何れかの適当なポリペプチド骨格又はバックグラウンド上に生じてよい。
特に好ましい実施形態においては、親配列は非マルトース生成性エキソアミラーゼ酵素、好ましくは細菌性の非マルトース生成性エキソアミラーゼ酵素である。高度に好ましい実施形態においては、親配列はグルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）を含む。好ましくは、親配列はシュードモナス種、例えばシュードモナス・サッカロフィリア又はシュードモナス・スツッゼリーから誘導可能である。
一部の実施形態においては、親ポリペプチドは例えばシュードモナス種に由来する野生型非マルトース生成性エキソアミラーゼ配列を含むかそれに相同である。
即ち、親ポリペプチドは配列番号１に示す配列を有するシュードモナス・サッカロフィリア非マルトース生成性エキソアミラーゼを含んでよい。別の好ましい実施形態においては、親ポリペプチドは配列番号１１に示す配列を有するシュードモナス・スツッゼリー由来の非マルトース生成性エキソアミラーゼ、又はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ１３５０７を有するシュードモナス・スツッゼリー非マルトース生成性エキソアミラーゼを含む。
一方、親ポリペプチドは野生型配列の何れかの変異体であってよく、即ち、親ポリペプチドは自身が操作されるか、又はＰＳ４変異体ポリペプチドを含んでよい。
好ましい実施形態においては、突然変異又は変化は既に突然変異しているＰＳ４配列、好ましくはｐＭＤ２２９（配列番号１３又は１４）に対して生じる。
しかしながら、当業者の知る通り、ＰＳ４変異体ポリペプチドはすでに突然変異した配列を突然変異させることにより誘導してよいが、そのような変異体ポリペプチドを、野生型配列（又は実際は何れかの適当な配列）を原料とし、原料配列と所望の変異体との間の相違を発見し、そして所望の変異体を達成するために原料配列内に必要な突然変異を導入することにより構築することも可能である。
配列番号１に示されるシュードモナス・サッカロフィリア非マルトース生成性エキソアミラーゼ配列、又は配列番号１１に示す配列を有するシュードモナス・スツッゼリー非マルトース生成性エキソアミラーゼに関連する、好ましくは配列又は機能的相同性を有する蛋白及び核酸は本明細書においては「ＰＳファミリー」のメンバーと称する。ＰＳ４変異体ポリペプチド及び核酸を形成する場合の使用に適している「ＰＳ４ファミリー」非マルトース生成性エキソアミラーゼ酵素の例は以下により詳細に開示する。
本明細書に記載したＰＳ４変異体ポリペプチドは好ましくは親ポリペプチドの特徴を保持しており、そして追加的に好ましくは追加的な有利な特性、例えば増強された活性又は熱安定性、又はｐＨ抵抗性、又は何れかの組み合わせ（好ましくは全て）を有する。これは以下により詳細に説明する。
本明細書に記載したＰＳ４置換突然変異体は何れかの適当な目的のために使用してよい。それらは好ましくは親酵素が適している目的のために使用してよい。特にそれらはエキソマルトテトラヒドロラーゼが使用されるいずれかの用途において使用してよい。高度に好ましい実施形態においては、それらは高値の熱安定性、又は高値のエキソアミラーゼ活性又は高値のｐＨ安定性又は何れかの組み合わせの追加的利点を有する。ＰＳ４変異体ポリペプチド及び核酸の適当な使用の例は、食料品製造、特にベーキング、並びに食糧の生産を包含し；その他の例は以下に詳細に説明する。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは上記した位置に追加して別の突然変異１つ以上を含んでよい。上記したものに追加して１、２、３、４、５、６、７以上の突然変異があってよい。他の突然変異、例えばアミノ酸レベルでの欠失、挿入及び置換、及び核酸レベルでの転換、遷移及び逆位も、他の位置１つ以上において以下に記載する通り包含されてよい。更にまたＰＳ４変異体は記載した位置における置換の全てを有する必要はない。実際には、それらは１、２、３、４、又は５つの置換が欠如していてもよく、即ち野生型アミノ酸残基がそのような位置に存在する。
その他の突然変異
３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、及び／又は３３４位
好ましい実施形態においては、ＰＳ４変異体ポリペプチドはその配列内の他の部位又は一に別の突然変異１つ以上を含んでよい。
例えばＰＳ４変異体ポリペプチドは３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、又は３３４位よりなる群から選択される突然変異１つ以上を更に含んでよい。これらの位置における残基は好ましくは３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ、３０９Ｐ、又は３３４Ｐを含んでよい。
従ってＰＳ４変異体ポリペプチドは３０７Ｋ／Ｒ／Ｈの他に、３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、又は３３４位における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５全ての突然変異を含んでよい。そのような実施形態における３０７位残基は、特にそのような他の突然変異が存在する場合にはヒスチジン（Ｈ）を含んでよい。
従ってＰＳ４変異体ポリペプチドは３０７Ｋ／Ｒ／Ｈの他に、「添付資料Ａ：１突然変異」に示す通り、３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、又は３３４位の何れかにおける１つの他の突然変異、即ち３３Ｙ；３４Ｎ；７０Ｄ；１２１Ｆ；１３４Ｒ；１４１Ｐ；１４６Ｇ；１５７Ｌ；１６１Ａ；１７８Ｆ；１７９Ｔ；２２３Ｅ；２２９Ｐ；３０９Ｐ；又は３３４Ｐを含んでよい。
換言すれば、ＰＳ４変異体ポリペプチドは下記：
Figure 0005448812
 の何れかを含んでよい。
或いは、ＰＳ４変異体ポリペプチドは３０７Ｋ／Ｒ／Ｈの他に、「添付資料Ａ：２突然変異」に示す通り、３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、又は３３４位の何れかにおける２つの他の突然変異、即ち、
Figure 0005448812
Figure 0005448812
 を含んでよい。
換言すれば、ＰＳ４変異体ポリペプチドは下記：
Figure 0005448812
 の何れかを含んでよい。
或いは、ＰＳ４変異体ポリペプチドは３０７Ｋ／Ｒ／Ｈの他に、「添付資料Ａ：３突然変異」に示す通り、３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、又は３３４位の何れかにおける３つの他の突然変異を含んでよい。
或いは、ＰＳ４変異体ポリペプチドは３０７Ｋ／Ｒ／Ｈの他に、「添付資料Ａ：４突然変異」に示す通り、３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、又は３３４位の何れかにおける４つの他の突然変異を含んでよい。
或いは、ＰＳ４変異体ポリペプチドは３０７Ｋ／Ｒ／Ｈの他に、「添付資料Ａ：５突然変異」に示す通り、３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、又は３３４位の何れかにおける５つの他の突然変異を含んでよい。
或いは、ＰＳ４変異体ポリペプチドは３０７Ｋ／Ｒ／Ｈの他に、「添付資料Ａ：６突然変異」に示す通り、３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、又は３３４位の何れかにおける６つの他の突然変異を含んでよい。
或いは、ＰＳ４変異体ポリペプチドは３０７Ｋ／Ｒ／Ｈの他に、「添付資料Ａ：７突然変異」に示す通り、３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、又は３３４位の何れかにおける７つの他の突然変異を含んでよい。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは９突然変異、即ち以下の残基：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ／Ｒ／Ｈ、３０９Ｐ、３３４Ｐの各々であるが「添付資料Ａ：７突然変異」に示した残基の７個組みを包含しないものを含んでよい。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは１０突然変異、即ち以下の残基：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ／Ｒ／Ｈ、３０９Ｐ、３３４Ｐの各々であるが「添付資料Ａ：６突然変異」に示した残基の６個組みを包含しないものを含んでよい。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは１１突然変異、即ち以下の残基：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ／Ｒ／Ｈ、３０９Ｐ、３３４Ｐの各々であるが「添付資料Ａ：５突然変異」に示した残基の５個組みを包含しないものを含んでよい。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは１２突然変異、即ち以下の残基：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ／Ｒ／Ｈ、３０９Ｐ、３３４Ｐの各々であるが「添付資料Ａ：４突然変異」に示した残基の４個組みを包含しないものを含んでよい。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは１３突然変異、即ち以下の残基：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ／Ｒ／Ｈ、３０９Ｐ、３３４Ｐの各々であるが「添付資料Ａ：３突然変異」に示した残基の３個組みを包含しないものを含んでよい。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは１４突然変異、即ち以下の残基：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ／Ｒ／Ｈ、３０９Ｐ、３３４Ｐの各々であるが「添付資料Ａ：２突然変異」に示した残基の対を包含しないものを含んでよい。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは１５突然変異、即ち以下の残基：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ／Ｒ／Ｈ、３０９Ｐ、３３４Ｐの各々であるが「添付資料Ａ：１突然変異」に示した単一の残基を包含しないものを含んでよい。
好ましいＰＳ４変異体ポリペプチド配列
しかしながら、好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドは更にこれらの位置の各々において突然変異を含む。
本発明者等は、ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照して以下：３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０７、３０９、３３４位の各々において突然変異を含んでいる、非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。
好ましい実施形態においては、３０７位の突然変異は塩基性又は正荷電残基を含む。一部の実施形態においては、３０７位の突然変異は３０７Ｋ又は３０７Ｒを含む。別の好ましい実施形態においては、３０７位はＨである。従って本発明者等はＰＳ４変異体ポリペプチドがＫ又はＲへの３０７位の突然変異を含むか、又は３０７位残基がＨであり、そして３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０７、３０９、３３４位の各々の突然変異を伴った非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。
好ましくは、３３位残基はＹを含んでよく、好ましくは３３Ｙ、より好ましくはＮ３３Ｙである。好ましくは、３４位残基はＮを含んでよく、好ましくは３４Ｎ、より好ましくはＤ３４Ｎである。好ましくは、７０位残基はＤを含んでよく、好ましくは７０Ｄ、より好ましくはＧ７０Ｄである。好ましくは、１２１位残基はＦを含んでよく、好ましくは１２１Ｆ、より好ましくはＧ１２１Ｆである。好ましくは、１３４位残基はＲを含んでよく、好ましくは１３４Ｒ、より好ましくはＧ１３４Ｒである。好ましくは、１４１位残基はＰを含んでよく、好ましくは１４１Ｐ、より好ましくはＡ１４１Ｐである。好ましくは、１４６位残基はＧを含んでよく、好ましくは１４６Ｇ、より好ましくはＹ１４６Ｇである。好ましくは、１５７位残基はＬを含んでよく、好ましくは１５７Ｌ、より好ましくはＩ１５７Ｌである。好ましくは、１６１位残基はＡを含んでよく、好ましくは１６１Ａ、より好ましくはＳ１６１Ａである。好ましくは、１７８位残基はＦを含んでよく、好ましくは１７８Ｆ、より好ましくはＬ１７８Ｆである。好ましくは、１７９位残基はＴを含んでよく、好ましくは１７９Ｙ、より好ましくはＡ１７９Ｔである。好ましくは、２２３位残基はＥを含んでよく、好ましくは２２３Ｅ、より好ましくはＧ２２３Ｅである。好ましくは、２２９位残基はＰを含んでよく、好ましくは２２９Ｐ、より好ましくはＳ２２９Ｐである。好ましくは、３０７位残基はＫを含んでよく、好ましくは３０７Ｋ、より好ましくはＨ３０９Ｋである。好ましくは、３０９位残基はＰを含んでよく、好ましくは３０９Ｐ、より好ましくはＡ３０９Ｐである。好ましくは、３３４位残基はＰを含んでよく、好ましくは３３４Ｐ、より好ましくはＳ３３４Ｐである。
上記した通り、好ましい実施形態においては、７０位の突然変異は７０Ｄ、好ましくはＧ７０Ｄである。従って本発明者等は、ＰＳ４変異体ポリペプチドがＫ又はＲへの３０７位の突然変異を含むか、又は３０７位残基がＨであり、そして７０位の７０Ｄへの突然変異、及び３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０７、３０９、３３４位の各々の突然変異を伴った非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。
好ましい実施形態においては、２７２位における残基は「野生型」、即ち未突然変異である。従って２７２位残基は好ましくはヒスチジン（Ｈ）である。従って本発明者等は、ＰＳ４変異体ポリペプチドがＫ又はＲへの３０７位の突然変異を含むか、又は３０７位残基がＨであり、そして７０位に７０Ｄへの突然変異、２７２位残基がＨであり、そして３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０７、３０９、３３４位の各々の突然変異を伴った非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。
同様に、別の好ましい実施形態において、３０３位における残基は「野生型」、又は未突然変異であり、そして好ましくはグリシン（Ｇ）である。従って本発明者等は、ＰＳ４変異体ポリペプチドがＫ又はＲへの３０７位の突然変異を含むか、又は３０７位残基がＨであり、そして７０位に７０Ｄへの突然変異、３０３位残基がＧであり、そして３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０７、３０９、３３４位の各々の突然変異を伴った非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。
好ましい実施形態においては、３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、３３４位において更に突然変異を含むＰＳ４変異体ポリペプチドの上記実施形態の各々において、３３位残基は好ましくはＹであり、３４位残基は好ましくはＮであり、７０位残基は好ましくはＤであり、１２１位残基は好ましくはＦであり、１３４位残基は好ましくはＲであり、１４１位残基は好ましくはＰであり、１４６位残基は好ましくはＧであり、１５７位残基は好ましくはＬであり、１６１位残基は好ましくはＡであり、１７８位残基は好ましくはＦであり、１７９位残基は好ましくはＴであり、２２３位残基は好ましくはＥであり、２２９位残基は好ましくはＰであり、３０９位残基は好ましくはＰであり、そして３３４位残基は好ましくはＰである。
高度に好ましい実施形態においては、本発明者等は以下の残基：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ／Ｒ／Ｈ、３０９Ｐ、３３４Ｐを含むＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。ＰＳ４変異体ポリペプチドは以下の突然変異：Ｎ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ｈ３０７Ｋ／Ｒ、Ａ３０９Ｐ及びＳ３３４Ｐの各々を含んでよい。
本発明者等は特に、配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ｈ３０７Ｋ、Ａ３０９Ｐ、Ｓ３３４Ｐを含むＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。そのような実施形態において、ＰＳ４変異体ポリペプチドは配列番号２１の配列を含んでよい。
本発明者等は更に、配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｒ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ｈ３０７Ｒ、Ａ３０９Ｐ、Ｓ３３４Ｐを含むＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。そのような実施形態において、ＰＳ４変異体ポリペプチドは配列番号２３の配列を含んでよい。
本発明者等は更に、ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ａ３０９Ｐ、Ｓ３３４Ｐを含む、非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドを提供する。そのような実施形態において、ＰＳ４変異体ポリペプチドは配列番号２５の配列を含んでよい。
別の置換
以下の表に示す他の突然変異１つ以上が更に本明細書に記載したＰＳ４変異体ポリペプチド内に存在してよい。
Figure 0005448812
Figure 0005448812
 ＰＳ４変異体核酸
本発明者等は又、」ＰＳ４変異体ポリペプチド配列における改変に相当するかそれをコードする配列を有するＰＳ４核酸を、本明細書に記載した目的のためのそのようなポリペプチドの製造における使用に関して、記載している。即ち、本発明者等は本明細書に記載した何れかのポリペプチド配列をコードすることができる核酸を提供する。
当業者の知る通り、核酸配列とポリペプチド配列、特に、遺伝子コードとこのコードの縮重度の間には関係が存在し、そしてそのようなＰＳ４核酸は困難を伴うことなく構築される。例えば当業者の知る通り、ＰＳ４変異体ポリペプチド配列内の各アミノ酸置換につき、置換アミノ酸をコードするコドン１つ以上が存在してよい。従って、当然ながら、その特定のアミノ酸残基に関する遺伝子コードの縮重度に応じて、１つ以上のＰＳ４核酸配列がＰＳ４変異体ポリペプチド配列に相当するように形成されてよい。更に又、ＰＳ４変異体ポリペプチドが１つ以上の置換、例えばＨ３０７Ｋ／Ｇ７０Ｄを含む場合、相当するＰＳ４核酸は２つのアミノ酸変化をそれぞれコードするコドンの対となる組み合わせを含んでよい。
ＰＳ４変異体核酸配列は本明細書に記載した親ポリペプチドの何れかをコードする親核酸から誘導可能であってよい。特に、親核酸は野生型配列、例えば配列番号６又は配列番号１２を含んでよい。従ってＰＳ４変異体核酸は野生型の非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードするが、該当する位置において野生型アミノ酸残基の代わりに他のアミノ酸をコードする核酸を含んでよい。ＰＳ４変異体核酸配列は又、例えば「複合物」の下に上記した親ポリペプチドをコードする突然変異１つ以上を伴った野生型配列を包含してよい。
当然ながら、特定のＰＳ４変異体核酸配列と同一ではないが、それらに関連している核酸配列、例えばＰＳ４変異体核酸配列の変異体、相同体、誘導体又はフラグメント、又はそれとハイブリダイズできる相補体又は配列も又、本明細書に記載した方法及び組成物のために有用となることが理解される。文脈により別様に指定されない限り、「ＰＳ４変異体核酸」という用語は上記した実体の各々を包含するものとみなさなければならない。
アミノ酸配列及び核酸配列における突然変異は当該分野で知られた多くの手法の何れかにより生じさせてよい。変異体配列は知られた突然変異誘発手法、例えば適切なオリゴヌクレオチドプライマーと共にＰＣＲを用いた部位指向性突然変異誘発、５’アドオン突然変異誘発、ミスマッチプライマー突然変異誘発等の何れかを用いて容易に作成される。或いは、又は追加的に、ＰＳ４変異体核酸配列は新規に作成してよい。
特に好ましい実施形態においては、突然変異は実施例に記載する通り適切なプライマーを用いながらＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖リア）を用いることにより親配列内に導入する。従って、記載した通りアミノ酸又は核酸のレベルにおいて、シュードモナス・サッカロフィリア又はシュードモナス・スツッゼリーエキソアミラーゼ配列内部のような好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内部に、何れかの所望のアミノ酸置換を導入することにより、ポリペプチドの配列を改変することが可能である。本発明者等は非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードする核酸の配列を改変することにより、非マルトース生成性エキソアミラーゼの配列を改変する方法を説明する。
しかしながら、ＰＳ４変異体ポリペプチドは現実には例えば段階的突然変異により野生型のポリペプチド又は核酸配列から実際に誘導される必要はないことは当然である。むしろ、ＰＳ４変異体ポリペプチドの配列が一旦樹立されれば、当業者は、例えば適切なオリゴヌクレオチドプライマー及びＰＣＲを用いながら、当該分野で知られた手段を介して全ての突然変異を伴った状態で野生型からその配列を容易に形成できる。実際、ＰＳ４変異体ポリペプチドは例えばペプチド合成法を介して、全てのその突然変異を伴った状態で新規に作成できる。
しかしながら一般的には、ＰＳ４変異体ポリペプチド及び／又は核酸は「前駆体」配列から誘導されるか、誘導可能である。「前駆体」という用語は本明細書においては、本明細書に記載した方法及び組成物により修飾された酵素に先立つ酵素を意味する。従って前駆体は修飾された酵素を製造するために使用される酵素を包含する。即ち、前駆体は本明細書に別途記載した突然変異誘発により修飾された酵素であってよい。同様に、前期待は野生型酵素、変異体野生型酵素、又はすでに突然変異した酵素であってよい。
ＰＳ４変異体ポリペプチド及び核酸は当該分野で知られた何れかの手段により製造してよい。特に、それらは性質においてインビトロ又はインビボであってよい発現系から発現させてよい。特に本発明者等は好ましくはＰＳ４変異体ポリペプチドを発現することができるＰＳ４核酸配列を含むプラスミド及び発現ベクターを記載する。そのようなＰＳ４核酸、プラスミド及びベクターを含み、そして好ましくはそれで形質転換される細胞及び宿主細胞も開示し、そしてそれらが本明細書に包含されることも明確化されなければならない。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは例えば適切なオリゴヌクレオチドプライマーと共にＰＣＲを用いる部位指向性突然変異誘発、５’−アドオン突然変異誘発、ミスマッチプライマー突然変異誘発等を用いながら、実施例４Ａに記載する通り作成してよい。例えば３０７位に突然変異を有するＰＳ４変異体ポリペプチドを製造するためには、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９配列に相当する核酸配列；澱粉結合ドメインの１７置換及び欠失を伴ったシュードモナス・サッカロフィリアマルトテトラヒドロラーゼヌクレオチド配列（配列番号１４）を作成し、該当する変化を導入してよい。しかしながら、当業者の知る通り、何れかの適当な原料配列を使用することができ、そして実際は野生型のエキソアミラーゼ配列を原料とし、所望の変異体ポリペプチドを、単一の工程において、又は他の中間体配列を経由して得ることも可能である。
好ましい実施形態においては、ＰＳ４変異体ポリペプチド配列は単離された形態において食料品添加物として使用される。「単離された」という用語は配列が自然界において天然に会合しており、そして自然界において共に存在している他の成分少なくとも１つを配列が少なくとも実質的に含まないことを意味する。１つの特徴において、好ましくは配列は精製された形態である。「精製された」という用語は、配列が相対的に純粋な状態にあること、例えば少なくとも約９０％純粋、又は少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも約９８％純粋であることを意味する。
高度に好ましい実施形態においては、核酸配列は配列番号２２、２４又は２６に示す配列を含む。
位置ナンバリング
ナンバリングにより本明細書において言及する全ての位置は下記のシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼレファレンス配列（配列番号１）：
Figure 0005448812
 のナンバリングを指す。
レファレンス配列はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ２２９６３を有するがシグナル配列：
Figure 0005448812
 を有さないシュードモナス・サッカロフィリア配列から誘導される。
Ｃ末端澱粉結合ドメイン：
Figure 0005448812
 は場合により欠失又は無視されてよい。或いは、それはＰＳ４変異体ポリペプチド配列内に包含されてよい。
本明細書の内容において、ＰＳ４エキソアミラーゼ酵素におけるアミノ酸残基位置の特定のナンバリングを用いる。この点に関し、種々の知られたエキソアミラーゼのアミノ酸配列のアライメントにより、エキソアミラーゼアミノ酸位置番号をアミノ酸配列が既知である何れかのエキソアミラーゼ酵素の何れかのアミノ酸残基部分に明確に割り当てることができる。多くの他の既知エキソアミラーゼのアミノ酸配列とアラインしたシュードモナス・サッカロフィリアから得られたエキソアミラーゼのアミノ酸配列を例えば起源とするこのナンバリングシステムを用いながら、エキソアミラーゼ内のアミノ酸残基の位置を明確に示すことができる。
従って、ナンバリングシステムは、それが特定の配列を基本レファレンスポイントとして使用する場合であっても、全ての該当する相同配列に適用される。例えば、位置ナンバリングは他のシュードモナス種に由来する相同配列、又は他の細菌に由来する相同配列に適用してよい。好ましくは、そのような相同体は上記したレファレンス配列である配列番号１、又はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ２２９６３又はＰ１３５０７を有する配列、好ましくはこれら配列の全てと、６０％以上の相同性、例えば７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上の相同性を有する。蛋白間の配列の相同性は本明細書に記載するよく知られたアライメントプログラム及びハイブリダイゼーション手法を用いて確認してよい。そのような相同配列、並びに後述する機能的等価物は本明細書においては「ＰＳ４ファミリー」と称することになる。
更に又、そして上記した通り、本明細書において使用するナンバリングシステムはＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ２２９６３を有するがシグナル配列：ＭＳＨＩＬＲＡＡＶＬＡＡＶＬＬＰＦＰＡＬＡを伴わないシュードモナス・サッカロフィリア配列から誘導されるレファレンス配列の配列番号１を参照している。このシグナル配列はレファレンス配列のＮ末端に位置し、そして２１アミノ酸残基よりなる。従って、シグナル配列を含む相当する配列、又は実際は、何れかの他のＮ又はＣ末端の伸長又は欠失を含む相当する配列において、突然変異又は置換されるべき特定の残基を発見することは簡単なことである。Ｎ末端の付加又は欠失に関連して、必要なことは挿入又は欠失した残基の数だけ位置ナンバリングを補うことのみである。例えば配列番号１の１位はシグナル配列を有する配列における２２位に相当する。
親酵素／ポリペプチド
ＰＳ４変異体ポリペプチドは「親酵素」、「親ポリペプチド」、又は「親配列」として知られる別の配列から誘導されるか、その変異体である。
「親酵素」という用語は本明細書においては、結果として生じる変異体、即ちＰＳ４変異体ポリペプチド又は核酸に対して緊密な、好ましくは最も緊密な化学構造を有する酵素を意味する。親酵素は前駆体酵素（即ち実際に突然変異される酵素）であってよく、或いは、それは新規に製造してよい。親酵素は野生型酵素であってよく、或いはそれは突然変異１つ以上を含む野生型酵素であってよい。
「前駆体」という用語は本明細書においては、酵素を生産するように修飾された酵素に先行する酵素を意味する。即ち、前駆体は突然変異誘発により修飾される酵素であってよい。同様に、前駆体は野生型酵素、変異体野生型酵素、又は既に突然変異した酵素であってよい。
「野生型」という用語は当業者の理解する当該分野の用語であり、そして天然に存在し、突然変異体の表現型とは対象的な種のメンバーの大半に特徴的な表現方を意味する。即ち、本発明の関連においては、野生型酵素は該当する種の大半のメンバーにおいて天然に観察される酵素の形態である。一般的に本明細書に記載した変異体ポリペプチドに関連する該当する野生型酵素は配列相同性の点において最も緊密に関連する相当する野生型酵素である。しかしながら本明細書に記載した変異体ＰＳ４ポリペプチドを製造するための基礎として特定の野生型配列が使用されている場合においては、これはアミノ酸配列相同性の点において最も緊密に関連している別の野生型配列の存在とは無関係に、相当する野生型配列となる。
親酵素又はポリペプチドは何れかの適当な原料ポリペプチドであることができる。それは好ましくは何らかの酵素活性を有してよい。好ましくはこの酵素活性はアミラーゼ活性である。より好ましくは、親ポリペプチドはエキソアミラーゼ活性を有する。
親酵素は好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を示すポリペプチドが好ましい。好ましくは親酵素は非マルトース生成性エキソアミラーゼそのものである。例えば、親酵素はシュードモナス・サッカロフィリア非マルトース生成性エキソアミラーゼ、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ２２９６３を有するポリペプチド、又はシュードモナス・スツッゼリー非マルトース生成性エキソアミラーゼ、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ１３５０７を有するポリペプチドであってよい。
ＰＳ４ファミリーの他のメンバーを親酵素として使用してよく；そのような「ＰＳ４ファミリーメンバー」は一般的にこれらの２酵素の何れかと同様、相同、又は機能的に等価であることになり、そして標準的な方法、例えばプローブを使用した適当なライブラリのハイブリダイゼーションスクリーニングによるか、又はゲノム配列分析により発見される。
特に、これら２酵素の何れかの機能的等価物並びに他の「ＰＳ４ファミリー」のメンバーも又、本明細書に記載したＰＳ４変異体ポリペプチドの作成のための出発点又は親ポリペプチドとして使用してよい。
蛋白の「機能的等価物」とは、その蛋白の機能の輪も、好ましくは実質的に全てを共有している何かを意味する。好ましくはそのような機能は生物学的機能。好ましくは酵素機能、例えばアミラーゼ活性、好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性である。そのような機能は蛋白の何れかの特性、例えばエキソ特異性、熱安定性、及び向上した取扱性、例えば堅固性、復元力、凝集性、易崩壊性、及び折畳性を包含してよい（後述）。
親酵素に関連して、「機能的等価物」という用語は好ましくは親分子と同様又は同一の機能を有する分子を意味する。親分子はシュードモナス・サッカロフィリア非マルトース生成性エキソアミラーゼ又はシュードモナス・スツッゼリー非マルトース生成性エキソアミラーゼ又は他の原料から得られるポリペプチドであってよい。
シュードモナス・サッカロフィリア非マルトース生成性エキソアミラーゼ、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ２２９６３を有するポリペプチド、又はシュードモナス・スツッゼリー非マルトース生成性エキソアミラーゼ、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ１３５０７を有するポリペプチドである親酵素に関連する場合の「機能的等価物」という用語は、機能的等価物が他の原料から得ることができることを意味する。機能的に等価な酵素は異なるアミノ酸配列を有してよいが、非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有することになる。機能を測定するための試験の例は本明細書に記載する通りであり、そして当業者の知る通りである。
高度に好ましい実施形態においては、機能的等価物は上記したシュードモナス・サッカロフィリア及びシュードモナス・スツッゼリーの非マルトース生成性エキソアミラーゼの何れか、好ましくは両方に対する配列相同性を有することになる。機能的等価物はまた配列番号１〜１４に記載した配列の何れか、好ましくは配列番号１又は配列番号７、又は両方と配列相同性を有してよい。そのような配列の間の配列相同性は好ましくは少なくとも６０％、好ましくは６０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上である。そのような配列相同性は当該分野で知られた多くのコンピュータープログラムの何れか、例えばＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡ等により作成してよい。そのようなアライメントを実施するための適当なコンピュータープログラムはＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ等、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１２：３８７）である。配列比較を実施できる他のソフトウエアの例は、限定しないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９９９、前出、８章）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ等、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ組を包含する。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの両方とも、オフライン及びオンライン検索で入手できる（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９９９、前出、ｐ７−５８〜７−６０）。しかしながら、ＧＣＧベストフィットプログラムを使用することが好ましい。
別の実施形態において、機能的等価物は上記した配列の何れかに特異的にハイブリダイズすることができる。ある配列が別のものにハイブリダイズすることができるかどうかを調べる方法は、当該分野で知られており、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等（上出）及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等（上出）に記載されている。高度に好ましい実施形態においては、機能的等価物はストリンジェントな条件下、例えば６５℃及び０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５ＭＮａ３クエン酸塩ｐＨ７．０｝でハイブリダイズすることができる。
例えばシュードモナス・サッカロフィリア及びシュードモナス・スツッゼリーの非マルトース生成性エキソアミラーゼに対して配列相同性を有する機能的等価物は親酵素としての使用に適している。そのような配列は何れかの１つ以上の位置においてシュードモナス・サッカロフィリアの配列とは異なる場合がある。更に又、ＡＴＣＣ１７６８６のようなシュードモナス種の別の菌株に由来する非マルトース生成性エキソアミラーゼもまた親ポリペプチドとして使用してよい。ＰＳ４変異体ポリペプチド残基をこれらの親配列の何れかに挿入することにより変異体ＰＳ４ポリペプチド配列を形成してよい。
当然ながら、ＰＳ４変異体ポリペプチドが上記した通り突然変異１つ以上を更に含むことが望まれる場合は、相当する突然変異をシュードモナス種非マルトース生成性エキソアミラーゼの機能的等価物、並びに「ＰＳ４ファミリー」の他のメンバーの核酸配列において生じさせることにより、それらを本明細書に記載したＰＳ４変異体ポリペプチドの形成のための出発点又は親ポリペプチドとして使用してよい。
「ＰＳ４変異体ポリペプチドという用語に特に包含されるものは、ＵＳ６０／４８５，４１３、６０／４８５，５３９及び６０／４８５，６１６；ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２１７２３及びＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２１７３９；ＵＳ１０／８８６，９０５及び１０／８８６，９０３；ＵＳ６０／６０８，９１９；ＵＳ６０／６１２，４０７；ＵＳ６０／４８５，５３９；ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２４８７；ＵＳ１０／８８６，０２３；ＵＳ１０／８８６，５０５；ＵＳ１０／８８６，５２７及びＵＳ１０／８８６，５０４；ＵＳ１０／９４７，６１２に開示されるポリペプチドである。しかしながらこれらの文献は従来技術として容認されない。
そのようなポリペプチドは本明細書に記載した用途における特に記載した通り澱粉を処理するため、食料品を製造するため、ベーカリー製品を製造するための食料品添加物としての使用、向上剤組成物の調製、複合物の調製等に適している。
親配列の修飾
親配列は本明細書に記載したＰＳ４変異体配列を形成するためにアミノ酸レベル又は核酸レベルにおいて修飾してよい。従って、本発明者等は非マルトース生成性エキソアミラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列内に１つ以上の相当するコドン変化を導入することによるＰＳ４変異体ポリペプチドの形成を可能にする。
核酸のナンバリングは好ましくは配列番号６に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼヌクレオチド配列の位置ナンバリングを参照しなければならない。或いは、又は追加的にゲンバンクアクセッション番号Ｘ１６７３２を有する配列を作成するために参照してよい。好ましい実施形態においては、核酸ナンバリングは配列番号６に示すヌクレオチド配列を参照しなければならない。しかしながら、アミノ酸残基ナンバリングの場合と同様、この配列の残基のナンバリングは参照目的のみに使用されなければならない。特に、何れかのＰＳ４ファミリー核酸配列において上記コドンの変化を生じさせることができることは当然である。例えば、配列の変化はシュードモナス・サッカロフィリア又はシュードモナス・スツッゼリーの非マルトース生成性エキソアミラーゼ核酸配列に対して生じさせることができる（例えばＸ１６７３２、配列番号６、又はＭ２４５１６、配列番号１２）。
親酵素は「完全な」酵素、即ち天然に存在する通りの（又は突然変異している）その完全長におけるものを含んでよく、或いはそれはそのトランケーションされた形態を含んでよい。それらより誘導されたＰＳ４変異体は、相応に、そのようにトランケーションされているか、又は「完全長」であってよい。トランケーションはＮ末端又はＣ末端、好ましくはＣ末端におけるものであってよい。親酵素又はＰＳ４変異体は１つ以上の部分、例えばサブ配列、シグナル配列、ドメイン又は部分を活性であるか否かに関わらず欠いていてよい。例えば親酵素又はＰＳ４変異体ポリペプチドは本明細書に記載したシグナル配列を欠いていてよい。或いは、又は追加的に、親酵素又はＰＳ４変異体は１つ以上の触媒性の、又は結合ドメインを欠いていてよい。
高度に好ましい実施形態においては、親酵素又はＰＳ４変異体は澱粉結合ドメインのような非マルトース生成性エキソアミラーゼ内に存在するドメイン１個以上を欠いていてよい。例えばＰＳ４ポリペプチドは配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアの非マルトース生成性エキソアミラーゼのナンバリングと相対比較して、４２９位までの配列のみを有してよい。当然ながら、これはＰＳ４変異体ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２、ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒ、及びｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｈの場合である。
他の実施形態において、親酵素又はＰＳ４変異体は「完全な」酵素、即ち天然に存在する通りの（又は突然変異している）その完全長におけるものを、Ｎ末端又はＣ末端における１つ以上の追加的アミノ酸配列を伴いながら含んでよい。例えば親酵素又はＰＳ４変異体ポリペプチドはＣ末端又はＮ末端における単一の余剰なアミノ酸残基、例えばＭ、Ａ、Ｇなどを含んでよい。好ましくは追加的アミノ酸残基はＮ末端に存在する。追加的残基１つ以上が包含される場合は、位置ナンバリングは付加部分の長さだけ補われることになる。
アミラーゼ
ＰＳ４変異体ポリペプチドは一般的にアミラーゼ活性を含む。
「アミラーゼ」という用語は本明細書においては、その通常の意味において使用され、例えばとりわけ澱粉の分解を触媒することができる酵素である。特に、それらは澱粉におけるα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グリコシド連結部を切断することができるヒドロラーゼである。
アミラーゼは澱粉におけるα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グリコシド連結部を切断するヒドロラーゼに分類される澱粉依存性酵素である。一般的に、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１，α−Ｄ−（１→４）Ｏ−グルカングルカノヒドロラーゼ）はランダムな態様において澱粉分子内部のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グリコシド連結部を切断するエンド作用性の酵素として定義される。これとは対照的に、エキソ作用性のアミロース分解性酵素、例えばβ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２，α−Ｄ−（１→４）Ｏ−グルカンマルトヒドロラーゼ）及び一部の生成物特異的なアミラーゼ、例えばマルトース生成性アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）は基質の非還元性の末端から澱粉分子を切断する。β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２０、α−Ｄ−グリコシドグルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３，α−Ｄ−（１→４）Ｏ−グルカングルコヒドロラーゼ）、及び生成物特異的なアミラーゼは澱粉から特定の長さのマルトオリゴ糖を生成することができる。
非マルトース生成性エキソアミラーゼ
本明細書に記載したＰＳ４変異体ポリペプチドは好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を示すポリペプチドから誘導される（又はその変異体である）。好ましくは、これらの親酵素はそれら自体非マルトース生成性エキソアミラーゼである。ＰＳ４変異体ポリペプチド自体も高度に好ましい実施形態においては非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を示す。
高度に好ましい実施形態においては、「非マルトース生成性エキソアミラーゼ酵素」という用語は本明細書においては本明細書に記載した生成物測定操作法に従って分析した場合に酵素が当初は澱粉を実質的な量のマルトースには分解しないことを意味するものと捉えなければならない。
高度に好ましい実施形態においては、非マルトース生成性エキソアミラーゼはエキソマルトテトラヒドロラーゼを含む。エキソマルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）はより正式にはグルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼとして知られている。この酵素は非還元性の鎖末端から連続したマルトテトラオース残基を除去するようにアミロース様の多糖類中の１，４−アルファ−Ｄ−グルコシド連結部を加水分解する。
非マルトース生成性エキソアミラーゼは参照により本明細書に組み込まれる米国特許６，６６７，０６５に記載されている。
非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性に関する試験
以下のシステムを用いて本明細書に記載した方法及び組成物による使用に適する非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドを特性化した。このシステムは例えば本明細書に記載したＰＳ４親又は変異体ポリペプチドを特性化するために使用してよい。
初期の背景となる情報として、ワックス状のトウモロコシアミロペクチン（ＷＡＸＩＬＹＳ２００としてＲｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅより入手可能）は極めて高値のアミロペクチン含有量（９０％超）を有する澱粉である。２０ｍｇ／ｍｌのワックス状トウモロコシ澱粉を３分間、５０ｍＭＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、２ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ６．０の緩衝液中で煮沸し、その後５０℃でインキュベートし、そして３０分以内に使用する。
非マルトース生成性エキソアミラーゼの１単位は、上記した通り製造した５０ｍＭＭＥＳ、２ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ６．０中で１０ｍｇ／ｍｌのワックス状トウモロコシ澱粉４ｍｌとともに試験管中５０℃でインキュベートした場合に分あたり還元糖１μｍｏｌと等しい加水分解産物を放出する酵素の量として定義される。還元糖は標準物質としてのマルトースを用いながら、そしてＢｅｒｎｆｅｌｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９５４），Ｉ，１４９−１５８のジニトロサリチル酸法、又は還元糖の定量のための当該分野で知られた別の方法を用いながら測定される。
非マルトース生成性エキソアミラーゼの加水分解生成物のパターンは上記した通り製造された緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌのワックス状トウモロコシ澱粉４ｍｌと共に試験管中５０℃で１５又は３００分間非マルトース生成性エキソアミラーゼ０．７単位をインキュベートすることにより測定される。反応は煮沸ウォーターバス中に３分間試験管を浸積することにより停止する。
加水分解生成物は、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、及び水を溶離剤としたＤｉｏｎｅｘＰＡ１００カラムを用いたアニオン交換ＨＰＬＣにより、パルス電流計検出により、そして標準物質としてのグルコースからマルトヘプタオースへの既知の線状マルトオリゴ糖により、分析及び定量する。マルトオクタオースからマルトデカオースに関して使用されるレスポンスファクターはマルトヘプタオースに関して観察されるレスポンスファクターである。
好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドは、該非マルトース生成性エキソアミラーゼ０．７単位の量を５０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸及び２ｍＭの塩化カルシウムを含有する緩衝液ｍｌ当たり１０ｍｇの予備煮沸ワックス状トウモロコシ澱粉の水溶液４ｍｌ中ｐＨ６．０において５０℃の温度で１５分間インキュベートした場合に酵素が２〜１０Ｄ−グルコピラノシル単位の１つ以上の線状マルトオリゴ糖及び場合によりグルコースよりなる加水分解生成物をもたらすような；該加水分解生成物の少なくとも６０重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、より好ましくは少なくとも８０重量％、そして最も好ましくは少なくとも８５重量％が３〜１０Ｄ−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖、好ましくは４〜８Ｄ−グルコピラノシル単位よりなる線状マルトオリゴ糖よりなるような、非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する。
参照を容易にするために、非マルトース生成性エキソアミラーゼ０．７単位の量を５０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸及び２ｍＭの塩化カルシウムを含有する緩衝液ｍｌ当たり１０ｍｇの予備煮沸ワックス状トウモロコシ澱粉の水溶液４ｍｌ中ｐＨ６．０において５０℃の温度で１５分間インキュベートするという特徴は、「ワックス状トウモロコシ澱粉インキュベーション試験」と称する場合がある。
即ち、別様に表現すれば、非マルトース生成性エキソアミラーゼである好ましいＰＳ４変異体ポリペプチドは２〜１０Ｄ−グルコピラノシル単位の１つ以上の線状マルトオリゴ糖及び場合によりグルコースよりなる加水分解生成物をもたらし；該加水分解生成物の少なくとも６０重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、より好ましくは少なくとも８０重量％、そして最も好ましくは少なくとも８５重量％が３〜１０Ｄ−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖、好ましくは４〜８Ｄ−グルコピラノシル単位よりなる線状マルトオリゴ糖よりなるような、ワックス状トウモロコシ澱粉インキュベーション試験における能力を有するものとして特性化される。
ワックス状トウモロコシ澱粉インキュベーション試験における加水分解生成物は２〜１０Ｄ−グルコピラノシル単位の１つ以上の線状マルトオリゴ糖及び場合によりグルコースを包含してよい。ワックス状トウモロコシ澱粉インキュベーション試験における加水分解生成物はまた他の加水分解生成物を包含してよい。しかしなお、３〜１０Ｄ−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖の重量％は、２〜１０Ｄ−グルコピラノシル単位の１つ以上の線状マルトオリゴ糖及び場合によりグルコースよりなる加水分解生成物の量に基づくものである。換言すれば、３〜１０Ｄ−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖の重量％は、２〜１０Ｄ−グルコピラノシル単位の１つ以上の線状マルトオリゴ糖及びグルコース以外の加水分解生成物の量には基づかない。
加水分解生成物は何れかの適当な手段により分析できる。例えば、加水分解生成物は、パルス電流計検出及び例えば標準物質としてのグルコースからマルトヘプタオースへの既知の線状マルトオリゴ糖を用いながらＤｉｏｎｅｘＰＡ１００カラムを用いたアニオン交換ＨＰＬＣにより分析してよい。
参照を容易にするために、パルス電流計検出及び標準物質としてのグルコースからマルトヘプタオースへの既知の線状マルトオリゴ糖を用いながらＤｉｏｎｅｘＰＡ１００カラムを用いたアニオン交換ＨＰＬＣを用いて加水分解生成物を分析するという特徴は、「アニオン交換により分析する」と称する場合がある。当然ながら、そして記載した通り、他の分析手法、並びに他の特定のアニオン交換手法で充足される場合もある。
即ち、別様に表現すれば、好ましいＰＳ４変異体ポリペプチドは、それが非マルトース生成性エキソアミラーゼである好ましいＰＳ４変異体ポリペプチドは２〜１０Ｄ−グルコピラノシル単位の１つ以上の線状マルトオリゴ糖及び場合によりグルコースよりなる加水分解生成物をもたらすようなワックス状トウモロコシ澱粉インキュベーション試験における能力を有し；該加水分解生成物はアニオン交換により分析されることが可能であり；該加水分解生成物の少なくとも６０重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、より好ましくは少なくとも８０重量％、そして最も好ましくは少なくとも８５重量％が３〜１０Ｄ−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖、好ましくは４〜８Ｄ−グルコピラノシル単位よりなる線状マルトオリゴ糖よりなるような、非マルトース生成性エキソアミラーゼを有するものである。
本明細書においては、「線状マルトオリゴ糖」という用語はα−（１→４）結合により連結されたα−Ｄ−グルコピラノースの２〜１０単位を意味するものとしての通常の意味において使用される。
高度に好ましい実施形態においては、本明細書に記載したＰＳ４ポリペプチドは好ましくは同じ条件下で試験した場合に親ポリペプチドと比較して、向上したエキソアミラーゼ活性、好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する。特に、高度に好ましい実施形態においては、ＰＳ４変異体ポリペプチドはワックス状トウモロコシ澱粉試験において測定した場合にそれらの親と比較して１０％以上、好ましくは２０％以上、好ましくは５０％以上のエキソアミラーゼ活性を有する。
加水分解生成物は何れかの適当な手段により分析できる。例えば、加水分解生成物は、パルス電流計検出及び例えば標準物質としてのグルコースからマルトヘプタオースへの既知の線状マルトオリゴ糖を用いながらＤｉｏｎｅｘＰＡ１００カラムを用いたアニオン交換ＨＰＬＣにより分析してよい。
本明細書においては、「線状マルトオリゴ糖」という用語はα−（１→４）結合により連結されたα−Ｄ−グルコピラノースの２〜２０単位を意味するものとしての通常の意味において使用される。
向上した取扱性
本明細書に記載したＰＳ４変異体は好ましくはそれらの親酵素と比較して向上した特性、例えば向上した熱安定性、向上したｐＨ安定性、又は向上したエキソ特異性の何れか１つ以上を有する。本明細書に記載したＰＳ４変異体は又、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、低値の堅固性、高値の復元力、高値の凝集性、低値の易崩壊性、又は高値の折畳性の何れか１つ又は全てを有するように、向上した取扱性を有する。
如何なる特定の理論にも制約されないが、本発明者等は特定の位置における突然変異がそのような突然変異を含むポリペプチドの特性に対して個々の、そして累積的な作用を有すると考える。
熱安定性及びｐＨ安定性
好ましくはＰＳ４変異体ポリペプチドは熱安定性であり；好ましくはそれはその親酵素よりも高値の熱安定性を有する。
小麦及び他の穀物において、アミロペクチンにおける外部の側鎖はＤＰ１２〜１９の範囲にある。即ち、例えば非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有するものとして記載したＰＳ４変異体ポリペプチドによるアミロペクチン側鎖の酵素的加水分解は、その結晶化傾向を顕著に低減することができる。
ベーキング目的のために使用される小麦及び他の穀物中の澱粉はアミラーゼによる酵素的攻撃に対しては一般的に抵抗性である澱粉顆粒の形態で存在する。即ち澱粉の修飾は損傷を受けた澱粉に主に限定され、そしてドウのプロセシング及び約６０℃のゼラチン化開始までの初期ベーキングの間は極めて緩徐に進行する。その結果として、より高度な熱安定性を有するアミラーゼのみがベーキングの間に効率的に澱粉を修飾することができる。そして一般的に、アミラーゼの効率は熱安定性が増大するに従って上昇する。これは熱安定性が高いほど、酵素はベーキング中に活性であり得る時間が長くなり、即ちそれが与える抗劣化作用が大きくなるためである。
従って、本明細書に記載したＰＳ４変異体ポリペプチドの使用は、食料品へのそのプロセシングの何れかの段階において、例えばパンにするためのベーキングの前、最中又は後に澱粉に添加される場合、逆行を遅延、又は妨害、又は緩徐化することができる。そのような使用は以下により詳細に説明する。
本明細書においては、「熱安定性」という用語は上昇した温度への曝露の後に活性を保持している酵素の能力に関する。好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドは約５５℃〜約８０℃以上の温度において澱粉を分解することができる。酵素は約９５℃までの温度への曝露の後にその活性を保持していることが適当である。
非マルトース生成性エキソアミラーゼのような酵素の熱安定性はその半減期により計測される。即ち、本明細書に記載したＰＳ４変異体ポリペプチドは、好ましくは５５℃から約９５℃以上の上昇した温度において、好ましくは約８０℃において、好ましくは１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上、親酵素と相対比較して延長された半減期を有する。
本明細書においては、半減期（ｔ１／２）は所定の熱条件下において酵素活性の半分が不活性化される時間（分単位）である。好ましい実施形態においては、半減期は８０℃において試験される。好ましくは、試料を８０℃以上で１〜１０分間加熱する。次に本明細書に記載した方法の何れかにより残存アミラーゼ活性を測定することにより半減期の値を計算する。好ましくは、半減期試験は実施例においてより詳細に説明する通り実施する。
好ましくは、本明細書に記載したＰＳ４変異体はベーキング中には活性であり、そして約５５℃の温度で開始される澱粉顆粒のゼラチン化の最中及び後に澱粉を加水分解する。非マルトース生成性エキソアミラーゼがより熱安定性であるほど、それが活性であり得る時間が長くなり、そしてこれにそれが与える抗劣化作用が大きくなる。しかしながら、約８５℃の温度より高温でベーキングする間に、酵素の不活性化が起こる場合がある。これが起これば、非マルトース生成性エキソアミラーゼは、最終的なパンにおけるベーキングプロセスの後には実質的には活性がなくなってしまうように、徐々に不活性化される。従って、優先的には上記した使用に適する非マルトース生成性エキソアミラーゼは５０℃超及び９８℃未満の最適温度を有する。
本明細書に記載したＰＳ４変異体の熱安定性は蛋白操作を用いて向上させることにより更に熱安定性とすることができ、そしてこれにより本明細書に記載した使用のためにより良好に適合するようになり；従って本発明者等は蛋白操作により更に熱安定性となるように修飾されたＰＳ４変異体の使用を包含する。
好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドはｐＨ安定性であり；より好ましくはそれはその同族隊親ポリペプチドよりも高値のｐＨ安定性を有する。本明細書においては、「ｐＨ安定性」という用語は、広範なｐＨに渡って活性を保持する酵素の能力に関する。好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドは約５〜約１０．４のｐＨにおいて澱粉を分解することができる。１つの実施形態において、ｐＨ安定性の程度は、特定のｐＨ条件における酵素の半減期を計測することにより試験してよい。別の実施形態においては、ｐＨ安定性の程度は、特定のｐＨ条件における酵素の活性又は特異的活性を計測することにより試験してよい。特定のｐＨ条件はｐＨ５〜ｐＨ１０．５の何れかのｐＨであってよい。
即ち、ＰＳ４変異体ポリペプチドは同一の条件下において親ポリペプチドと比較してより長い半減期、又は高値の活性（試験に応じて）を有してよい。ＰＳ４変異体ポリペプチドは同一の条件下において親ポリペプチドと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上のより長い半減期を有してよい。或いは、又は追加的に、それらは同一のｐＨ条件下において親ポリペプチドと比較した場合にそのような高値の活性を有してよい。
エキソ特異性
一部の非マルトース生成性エキソアミラーゼはある程度のエンドアミラーゼ活性を有する場合があることが知られている。一部の場合において、この型の活性は、エンドアミラーゼ活性が分枝鎖デキストリンの蓄積に起因する粘着性又はガム状のクランブを形成することにより最終パン製品に恐らくは悪影響を与える場合があるため、低減又は排除する必要がある場合がある。
エキソ特異性は総エンドアミラーゼ活性に対する総アミラーゼ活性の比を求めることにより計測することが有用である場合がある。この比は本明細書においては「エキソ特異性指数」と称する。好ましい実施形態においては、酵素はそれが２０以上のエキソ特異性指数を有する場合、即ち、その総アミラーゼ活性（エキソアミラーゼ活性を含む）がそのエンドアミラーゼ活性よりも２０倍以上高値である場合に、エキソアミラーゼとみなされる。高度に好ましい実施形態においてはエキソアミラーゼのエキソ特異性指数は３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、又は１００以上である。高度に好ましい実施形態においては、エキソ特異性指数は１５０以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、又は６００以上である。
総アミラーゼ活性及びエンドアミラーゼ活性は当該分野で知られた何れかの手段により計測してよい。例えば、総アミラーゼ活性は澱粉基質から放出された還元末端の総数を試験することにより計測してよい。或いは、ベタミル試験の使用は実施例においてさらに詳細に説明されており、そして簡便のために実施例で試験されたものとしてのアミラーゼ活性を表において「ベタミル単位」の項目に記載されている。
エンドアミラーゼ活性はファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ａｎｄ Ｕｐｊｏｈｎ）を使用することにより試験してよい。これは青色標識交差結合澱粉（アゾ染料で標識）を使用しており；澱粉分子の内部の切断のみが標識を放出し、外部の切断は放出しない。染料の放出は分光光度計で計測してよい。従ってファデバスキットはエンドアミラーゼ活性を測定し、そして簡便のために、そのような試験（実施例に記載）の結果は本明細書においては「ファデバス単位」と称する。
従って高度に好ましい実施形態においては、エキソ特異性指数はベタミル単位／ファデバス単位の項目で表示し、これは「Ｂ／Ｐｈａｄ」とも称する。
エキソ特異性は又、例えば本発明者等の国際特許公開番号ＷＯ９９／５０３９９において、従来技術に記載した方法により試験してもよい。これはエキソアミラーゼ活性に対するエンドアミラーゼ活性との比を用いることによりエキソ特異性を計測する。即ち、好ましい特長において、本明細書に記載したＰＳ４変異体はエキソアミラーゼ活性単位当たり０．５未満のエンドアミラーゼ単位（ＥＡＵ）を有することになる。好ましくは、本発明による使用に適する非マルトース生成性エキソアミラーゼはエキソアミラーゼ活性単位当たり０．０５未満のＥＡＵ、より好ましくはエキソアミラーゼ活性単位当たり０．０１未満のＥＡＵを有する。
本明細書に記載したＰＳ４変異体は好ましくは、それらがエキソアミラーゼであることと合致して、上記した通りエキソ特異性指数により例えば計測されるエキソ特異性を有することになる。更に、それらは好ましくは、それらの誘導元である親酵素又はポリペプチドと比較した場合に、高値、又は増大したエキソ特異性を有する。即ち、例えば、ＰＳ４変異体ポリペプチドは好ましくは同一条件下においてそれらの親ポリペプチドと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上のエキソ特異性指数を有してよい。それらは好ましくは同一条件下においてそれらの親ポリペプチドと比較して、１．５ｘ以上、２ｘ以上、５ｘ以上、１０ｘ以上、５０ｘ以上、１００ｘ以上を有する。
向上した取扱性
本明細書に記載したＰＳ４変異体は好ましくは親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドと比較して向上した取扱性を含む。向上した取扱性は好ましい実施形態においては向上したベーキング特性を含む。
即ち、ＰＳ４変異体は、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して向上した取扱性又は好ましくはベーキング特性を有するようなものである。取扱性又はベーキング特性は堅固性、復元力、凝集性、易崩壊性及び折畳性よりなる群から選択してよい。
これらの取扱性は当該分野で知られた何れかの手段により試験してよい。例えば、堅固性、復元力及び凝集性は実施例に記載する通り、例えばテクスチャーアナライザーを用いたテクスチャープロファイル分析によりパンのスライスを分析することにより測定してよい。
堅固性
本明細書に記載したＰＳ４変異体は、好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して低値の堅固性を有するようなものである。
堅固性は好ましい実施形態においては食料品の軟質性とは逆の相関を有しており；即ち、高値の軟質性は低値の堅固性を反映しており、その逆も正しい。
堅固性は好ましくは実施例１３に記載する「堅固性評価プロトコル」により計測する。
即ち、本明細書に記載したＰＳ４変異体は、好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上の低値の堅固性を有するようなものである。ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品は親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、１．１ｘ、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ以上の低値の堅固性を有してよい。
復元力
本明細書に記載したＰＳ４変異体は、好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して高値の復元力を有するようなものである。
復元力は好ましくは実施例１４に記載する「復元力評価プロトコル」により計測する。
即ち、本明細書に記載したＰＳ４変異体は、好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上の高値の復元力を有するようなものである。ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品は親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、１．１ｘ、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ以上の高値の復元力を有してよい。
凝集性
本明細書に記載したＰＳ４変異体は、好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して高値の凝集性を有するようなものである。
凝集性は好ましくは実施例１５に記載する「凝集性評価プロトコル」により計測する。
即ち、本明細書に記載したＰＳ４変異体は、好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上の高値の凝集性を有するようなものである。ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品は親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、１．１ｘ、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ以上の高値の凝集性を有してよい。
易崩壊性
本明細書に記載したＰＳ４変異体は、好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して低値の易崩壊性を有するようなものである。
易崩壊性は好ましくは実施例１６に記載する「易崩壊性評価プロトコル」により計測する。
即ち、本明細書に記載したＰＳ４変異体は、好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上の低値の易崩壊性を有するようなものである。ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品は親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、１．１ｘ、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ以上の低値の易崩壊性を有してよい。
折畳性
本明細書に記載したＰＳ４変異体は、好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して高値の折畳性を有するようなものである。
折畳性は好ましくは実施例１４に記載する「折畳性評価プロトコル」により計測する。
即ち、本明細書に記載したＰＳ４変異体は、好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上の高値の折畳性を有するようなものである。ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品は親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、１．１ｘ、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ以上の高値の折畳性を有してよい。
本発明者等は特に折畳性を向上させるためにキシラナーゼと組み合わせた本明細書に記載したＰＳ４変異体ポリペプチドの使用を説明する。
ＰＳ４変異体ポリペプチド及び核酸の使用
ＰＳ４変異体ポリペプチド、核酸、宿主細胞、発現ベクター等はアミラーゼを使用してよい何れかの用途において使用してよい。特に、それらは何れかの非マルトース生成性エキソアミラーゼを置換するために使用してよい。それらは単独又は他の既知のアミラーゼ又は非マルトース生成性エキソアミラーゼと組み合わせて、アミラーゼ又は非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を補充するために使用してよい。
本明細書に記載したＰＳ４変異体配列はベーカリー及び飲料製品のような食料品産業における種々の用途において使用してよく；それらは又医薬品のような他の用途において、或いは更に化学工業において使用してよい。特に、ＰＳ４変異体ポリペプチド及び核酸は種々の産業用途、例えばベーキング（ＷＯ９９／５０３９９に開示）及び穀物粉の企画化（容量の増強又は向上）のために有用である。それらは澱粉及び他の基質からマルトテトラオースを製造するために使用してよい。
従って本発明者等は食料品を製造するための方法を記載し、方法は（ａ）非マルトース生成性エキソアミラーゼを得ること；（ｂ）本明細書に記載した非マルトース生成性エキソアミラーゼの位置の何れか１つ以上において突然変異を導入すること；（ｃ）得られたポリペプチドを食料成分に添加混合することを含む。
ＰＳ４変異体ポリペプチドはパンのようなベーカリー製品の体積を増大するために使用してよい。如何なる特定の理論にも制約されないが、本発明者等はこれは、エキソアミラーゼがアミロース分子を短鎖化する結果として、加熱（例えばベーキング）中にドウの粘度が低減することに起因すると考えられる。これにより発酵により生成した二酸化炭素は少ない妨害でパンの大きさを増大させることができるようになる。
即ち、ＰＳ４変異体ポリペプチドを含むかそれで処理されている食料品はそのように処理されてはいない、又は親ポリペプチドで処理されている製品と比較して、容量が膨大している。換言すれば、食料品は食料品の体積当たりより多くの体積の空気を有する。或いは、又は追加的に、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品は低値の密度、又は重量（質量）の体積に対する比率を有する。特に好ましい実施形態においては、ＰＳ４変異体ポリペプチドはパンの体積を増大させるために使用される。体積の増大又は膨大はそれが食料のガム質又は澱粉質の特性を低減するために有益である。軽い食料が消費者に好まれ、そして顧客の経験は増大している。好ましい実施形態においては、ＰＳ４変異体ポリペプチドの使用は体積を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上増大させる。
食料の体積を増大させるためのＰＳ４変異体ポリペプチドの使用は実施例において詳細に説明する。
食料用途
本明細書に記載したＰＳ４変異体ポリペプチド及び核酸は食料として、又はその製造において使用してよい。特にそれらは食料に、即ち食品添加物として添加してよい。「食料」という用語は製造された食料、並びに食料の成分、例えば穀物粉の両方を包含する。好ましい特長においては、食料は人間の消費のためのものである。食料は用途及び／又は適用様式及び／又は投与様式に応じて溶液又は固体の形態であってよい。
ＰＳ４変異体ポリペプチド及び核酸は食料成分として使用してよい。本明細書においては、「食料成分」という用語は調整品を包含し、これは機能性食料又は食糧であるかそれに添加することができ、そして例えば酸性化又は乳化を必要とする広範囲の製品中に低レベルで使用できる調整品を包含する。食料成分は用途及び／又は適用様式及び／又は投与様式に応じて溶液又は固体の形態であってよい。
本明細書に開示するＰＳ４変異体ポリペプチド及び核酸は食料補給物であってよく、又はそれに添加してよい。本明細書に開示するＰＳ４変異体ポリペプチド及び核酸は機能性食料であってよく、又はそれに添加してよい。本明細書においては、「機能性食料」という用語は栄養効果及び／又は味覚充足を与えることができるのみならず、消費者に別に有利な作用を送達することができる食料を意味する。機能性食料の法的定義は無いが、この分野で利害関係を有する団体の大半は特定の健康上の効果を有するものとして販売される食料であることに合意している。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは又、食料品又は食糧の製造において使用してよい。典型的な食糧は乳製品、畜肉製品、家禽製品、魚肉製品、及びドウ製品を包含する。ドウ製品は何れかのプロセシングされたドウ製品、例えばフライされた、ディープフライされた、ローストされた、ベーキングされた、蒸された、及び茹でられたドウ、例えば蒸しパン及び餅であってよい。高度に好ましい実施形態においては、食料品はベーカリー製品である。
好ましくは、食糧はベーカリー製品である。典型的なベーカリー（ベーキングされた）製品は、パン、例えばローフ、ロール、バンズ、ピザ生地等、ペストリー、プレッツエル、トルティーヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット、クラッカー等を包含する。
食料品は好ましくは本明細書に記載したＰＳ４変異体ポリペプチドの向上した取扱性又はベーキング特性の１つ以上から利益をこうむる。向上した取扱性又はベーキング特性は向上した堅固性、向上した復元力、向上した凝集性、向上した易崩壊性、及び向上した折畳性よりなる群から選択してよい。
従って本発明者等は非マルトース生成性エキソアミラーゼを含む食品添加物を修飾する方法を記載し、方法は本明細書に記載する非マルトース生成性エキソアミラーゼの位置１つ以上において突然変異を導入することを包含する。同様の方法を用いて食料成分、又は食料補給物、食料品又は食糧を修飾することができる。
逆行／劣化
本発明者等は澱粉ゲルのような澱粉媒体の劣化を遅延させることができるＰＳ４可変領域蛋白の使用を説明する。ＰＳ４変異体ポリペプチドは特に澱粉の有害逆行を遅延させることができる。
大部分の澱粉顆粒は２種の重合体：本質的に直鎖のアミロース及び高度に分枝したアミロペクチンの混合物よりなる。アミロペクチンは（１−４）連結部により連結されたα−Ｄ−グルコピラノシル単位の鎖より成る極めて大型の分枝した分子であり、そこでは該鎖はα−Ｄ−（１−６）連結部により結合されて分枝を形成している。アミロペクチンは全ての天然の澱粉内に存在し、大部分の一般的澱粉の約７５％を構成する。アミロースは本質的には僅かなα−Ｄ−（１−６）分枝部を有する（１−４）連結α−Ｄ−グルコピラノシル単位の直鎖である。大部分の澱粉は約２５％アミロースを含有する。
水の存在下に加熱された澱粉顆粒はゼラチン化と称される秩序−無秩序相転移を起こし、その場合、液体は膨潤した顆粒に取り込まれる。ゼラチン化温度は種々の澱粉で変動する。新しくベーキングされたパンを冷却すると、数時間以内にアミロース画分が逆行してネットワークを形成する。このプロセスはそれが低い程度の堅固性及び向上したスライシング特性を伴った望ましいクランブ構造を創生する点において有益である。アミロペクチンのより段階的な結晶化はベーキング後数日の間にゼラチン化した澱粉顆粒内部でおこる。このプロセスにおいて、アミロペクチンは澱粉顆粒が包埋されるアミロースネットワークを強化すると考えられている。この強化はパンのクランブの増大した堅固性をもたらす。この強化はパンの劣化の主因の１つである。
ベーキングされた製品の品質は保存中に徐々に悪化する。澱粉の再結晶（逆行とも称される）の結果としてクランブの水保持能力が変化し、食感及び栄養特性に対して重要な影響を伴う。クランブは軟質性及び弾力性を喪失し、堅固で屑っぽくなる。クランブの堅固性の増大はパンの劣化プロセスの尺度として使用される場合が多い。
アミロペクチンの有害逆行の速度はアミロペクチンの側鎖の長さに依存している。即ち、例えば非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有するＰＳ４変異体ポリペプチドによるアミロペクチン側鎖の酵素的加水分解は、その結晶化傾向を顕著に低減することができる。
従って、本明細書に記載したＰＳ４変異体ポリペプチドの使用は、それをプロセシングして食料品とする何れかの段階において、例えばベーキングしてパンにする前、最中又は後において澱粉に添加する場合、逆行を遅延、又は妨害、又は緩徐化できる。そのような使用は以下により詳細に説明する。
従って本発明者等はドウ製品の劣化、好ましくは有害逆行を防止する非マルトース生成性エキソアミラーゼの能力を向上させる方法を記載し、方法は本明細書に記載する非マルトース生成性エキソアミラーゼの位置の何れか１つ以上において突然変異を導入することを含む。
逆行（劣化を包含する）の計測のための試験
本明細書に記載する非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有するＰＳ４変異体ポリペプチドの抗劣化作用を評価するためには、クランブの堅固性をインストロン４３０１ユニバーサルフードテクスチャーアナライザー又は当該分野で知られた同様の機材を用いながらベーキング後１、３及び７日に計測することができる。
当該分野で伝統的に使用され、そして非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有するＰＳ４変異体ポリペプチドの澱粉逆行に対する作用を評価するために使用されている別の方法は、ＤＳＣ（示差走査熱量計）に基づくものである。ここでは、パンのクランブ又は酵素存在下又は非存在下（対照）においてベーキングされたモデル系ドウ由来のクランブ中の逆行したアミロペクチンの融解エンタルピーを計測する。記載した例において適用されたＤＳＣ機材はＭｅｔｔｌｅｒ−ＴｏｌｅｄｏＤＳＣ８２０であり、温度勾配１０℃／分において２０〜９５℃で作動させる、試料調製のために、クランブ１０〜２０ｍｇを計量し、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏアルミニウムパン内に移し、次にこれを密封する。
上記した例において使用するモデル系ドウは、標準的な穀物粉及び最適な量の水又は緩衝液を、非マルトース生成性ＰＳ４変異体エキソアミラーゼの存在下又は非存在下において含有する。それらをそれぞれ６又は７分間、１０又は５０ｇのＢｒａｂｅｎｄｅｒ Ｆａｒｉｎｏｇｒａｐｈと混合する。ドウの試料を蓋つきのガラス試験管（１５＊０．８ｃｍ）に入れる。これらの試験管を、開始時３３℃で３０分インキュベーション、その後分あたり１．１℃の勾配で３３〜９５℃に加熱、そして最後に９５℃で５分間インキュベーションとしたウォーターバス中のベーキングプロセスに付す。その後、試験管を２０℃において恒温槽中に保存し、ＤＳＣ分析に備える。
好ましい実施形態においては、本明細書に記載したＰＳ４変異体は対照と比較して低減された溶融エンタルピーを有する。高度に好ましい実施形態においてはＰＳ４変異体は１０％以上低減された溶融エンタルピーを有する。好ましくは、それらは対照と比較して２０％以上、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上低減された溶融エンタルピーを有する。
澱粉製品の製造
本発明者等は食料品、特に澱粉製品の製造におけるＰＳ４変異体ポリペプチドの使用を提供する。方法は非マルトース生成性エキソアミラーゼ酵素、例えばＰＳ４変異体ポリペプチドを澱粉媒体に添加することにより澱粉製品を形成することを含む。澱粉媒体がドウの場合は、ドウは穀物粉、水、ＰＳ４変異体ポリペプチドである非マルトース生成性エキソアミラーゼ、及び場合により他の可能な成分及び添加物を共に混合することにより製造する。
「澱粉」という用語は、澱粉自体、又はその成分、特にアミロペクチンを意味するものと捉えなければならない。「澱粉媒体」という用語は澱粉を含む何れかの適当な媒体を意味する。「澱粉製品」という用語は澱粉を含有するか、それを基材とするか、又はそれより誘導された何れかの製品を意味する。好ましくは、澱粉製品は小麦粉から得られた澱粉を含有するか、それを基材とするか、又はそれより誘導される。「穀物粉」という用語は本明細書においては、小麦又は他の穀物の微細粉砕粒と同義語である。しかしながら好ましくは用語は小麦自体から得られ、他の穀物に由来しない穀物粉を意味する。即ち、そして特段の記載が無い限り、本明細書において「小麦粉」に言及する場合は好ましくは小麦粉自体、並びにドウの様な媒体中に存在する場合の小麦粉に言及している意味を有する。
好ましい穀物粉は、小麦粉又はライ麦粉、又は小麦及びライ麦の穀物粉の混合物である。しかしながら例えばコメ、トウモロコシ、オオムギ、及びアズキモロコシ由来のような他の型の穀物から誘導された穀物粉を含むドウも意図される。好ましくは澱粉製品はベーカリー製品である。より好ましくは、澱粉製品はパン製品である。さらに好ましくは、澱粉製品はベーキングされた澱粉質のパン製品である。「ベーキングされた澱粉質のパン製品」という用語はドウ形成条件下に穀物粉、水、及び発酵種を混合することにより得られるドウを基材とする何れかのベーキングされた製品をさす。他の成分も当然ながらドウ混合物に添加することができる。
即ち、澱粉製品がベーキングされた澱粉質のパン製品である場合、プロセスはドウ形成条件下に穀物粉、水、及び発酵種を何れかの適当な順序で混合すること、及び、さらに場合によりプレミックスの形態におけるＰＳ４変異体ポリペプチドを添加することを含む。発酵種は化学的な発酵種、例えば重炭酸ナトリウム、又はサッカロマイセス・セレビシアエ（パン酵母）の何れかの菌株であってよい。
ＰＳ４変異体非マルトース生成性エキソアミラーゼは何れかのドウ成分、例えば水又はドウ成分の混合物と、又は何れかの添加物又は添加物混合物とともに添加することができる。ドウはベーキング産業において、又は穀物粉ドウ系製品を製造している何れかの他の産業で一般的な何れかの従来のドウ製造方法により製造できる。
白パン、分篩されたライ麦粉及び小麦粉から作成されたパン、ロール等のような澱粉質のパン製品のベーキングは約１５〜６０分間１８０〜２５０℃の範囲のオーブン温度においてパンのドウをベーキングすることにより達成される。ベーキングプロセスの間、急激な温度勾配（２００→１２０℃）が外側のドウの層で全体的に生じ、そこではベーキングされた製品の特徴的クラストが形成される。しかしながら、水蒸気の発生による熱の消費により、クランブ内の温度はベーキングプロセス終了時で僅か約１００℃近傍である。
従って本発明者等は（ａ）澱粉媒体を準備すること；（ｂ）澱粉媒体に本明細書に記載するＰＳ４変異体ポリペプチドを添加すること；及び（ｃ）工程（ｂ）の最中又は後に澱粉媒体に熱を適用することによりパン製品を製造することを含むパン製品を作成するためのプロセスを記載する。本発明者等は又、記載した通りＰＳ４変異体ポリペプチドを澱粉媒体に添加することを含むパン製品を製造するためのプロセスを記載する。
非マルトース生成性エキソアミラーゼＰＳ４変異体ポリペプチドは液体調製品の状態で、又は乾燥粉末組成物の状態で、酵素を唯一の活性成分としてか又は別のドウ成分又はドウ添加物１つ以上との添加混合物としての何れかにおいて含む状態で添加できる。
向上剤組成物
本発明者等はパン向上化組成物及びドウ向上化組成物を包含する向上剤組成物を記載する。これらは場合により別の成分、又は別の酵素、又は両方とともにＰＳ４変異体ポリペプチドを含む。
本発明者等はこのようなパン及びドウ向上化組成物のベーキングにおける使用を提供する。別の特徴において、本発明者等はパン向上化組成物又はドウ向上化組成物から得られるベーキングされた製品又はドウを提供する。別の特長において本発明者等は、パン向上化組成物及びドウ向上化組成物の使用により得られるベーキングされた製品又はドウを記載する。
ドウの製造
ドウは穀物粉、水、ＰＳ４変異体ポリペプチド（上記）を含むドウ向上剤組成物及び場合により他の成分及び添加物を添加混合することにより製造してよい。
ドウ向上化組成物は穀物粉、水、又は任意の他の成分又は添加物を包含する何れかのドウ成分と共に添加できる。ドウ向上化組成物は穀物粉又は水又は任意の他の成分及び添加物の前に添加することができる。ドウ向上化組成物は穀物粉又は水又は任意の他の成分及び添加物の後に添加することができる。ドウはベーキング産業において、又は穀物粉ドウ系製品を製造している何れかの他の産業で一般的な何れかの従来のドウ製造方法により製造できる。
ドウ向上化組成物は液体調製品の状態で、又は乾燥粉末組成物の状態で、組成物を唯一の活性成分としてか又は別のドウ成分又はドウ添加物１つ以上との添加混合物としての何れかにおいて含む状態で添加できる。
添加されるＰＳ４変異体ポリペプチド非マルトース生成性エキソアミラーゼの量は通常は最終ドウ中の存在が、穀物粉ｋｇ当たり５０〜１００，０００単位、好ましくは穀物粉ｋｇ当たり１００〜５０，０００単位となるような量である。好ましくは、量は穀物粉ｋｇ当たり２００〜２０，０００単位の範囲である。或いは、ＰＳ４変異体ポリペプチド非マルトース生成性エキソアミラーゼは最終ドウ中の存在が、穀物粉を基にして酵素０．０２〜５０ｐｐｍ（穀物粉ｋｇ当たり０．０２〜５０ｍｇ酵素）、好ましくは０．２〜１０ｐｐｍとなる量で添加される。
この観点において、非マルトース生成性エキソアミラーゼ１単位とは後述する通り、５０ｍＭＭＥＳ、２ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ６．０中で１０ｍｇ／ｍｌのワックス状トウモロコシ澱粉４ｍｌとともに試験管中５０℃でインキュベートした場合に分あたり還元糖１μｍｏｌと等しい加水分解産物を放出する酵素の量として定義される。
本明細書に記載するドウは一般的に小麦粒又は小麦粉及び／又は他の型の穀物粒、穀物粉又は澱粉、トウモロコシ粉、トウモロコシ澱粉、トウキビ粉、コメ粉、ライ麦粒、ライ麦粉、エンバク粉、エンバク粒、ダイズ粉、キビ粒、キビ粉、バレイショ粒、バレイショ粉又はバレイショ澱粉を含む。ドウは新鮮状態、凍結状態、又は部分的にベーキングされた状態であってよい。
ドウは発酵されたドウであってよく、或いはドウは発酵に付されてよい。ドウは種々の方法により、例えば化学的な発酵種、例えば重炭酸ナトリウムを添加することにより、又は発酵物（発酵中のドウ）を添加することにより醗酵させてよいが、安定な酵母培養物、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ（パン酵母）の培養物、例えばＳ・セレビシアエの市販菌株を添加することによりドウを発酵させることが好ましい。
ドウは顆粒化脂肪又はショートニングのような脂肪を含んでよい。ドウは又、別の乳化剤、例えばモノ又はジグリセリド、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ポリオキシエチレンステアレート、又はリソレシチンを含んでよい。
本発明者等は本明細書に記載する複合物とともに穀物粉を含むプレミックスも記載する。プレミックスは他のドウを向上させる、及び／又はパンを向上させる添加物、例えば添加物の何れか、例えば本明細書において言及した酵素を含有してよい。
別のドウ添加物又は成分
ベーキングされた製品の特性をさらに向上させ、そしてベーキングされた製品に特有の特性を付与するために、別のドウ成分及び／又はドウ添加物をドウに配合してよい。典型的にはそのような更に添加される成分は、ドウ成分、例えば塩、粒、脂肪及び油脂、糖類又は甘味料、食物繊維、蛋白源、例えば粉乳、グルテンソイ、又は卵、及びドウ添加物、例えば乳化剤、他の酵素、ヒドロコロイド、フレーバー剤、酸化剤、ミネラル及びビタミンを包含してよい。
乳化剤はドウ強化剤及びクランブ軟化剤として有用である。ドウ強化剤としては、乳化剤はレスティング時に関する耐容性、及びプルーフィング中のショックに対する耐容性を付与できる。更に又、ドウ強化剤は発酵時間の変動に対する所定のドウの耐容性を向上させることになる。大部分のドウ強化剤は又、プルーフィングされた状態からベーキング後の商品への体積の増大を意味する窯のびも向上させる。最後に、ドウ強化剤はレシピ混合物中に存在する如何なる脂肪も乳化することになる。
適当な乳化剤は、レシチン、ポリオキシエチレンステアレート、食用脂肪酸のモノ−及びジグリセリド、食用脂肪酸のモノ−及びジグリセリドの酢酸エステル、食用脂肪酸のモノ−及びジグリセリドの乳酸エステル、食用脂肪酸のモノ−及びジグリセリドのクエン酸エステル、食用脂肪酸のモノ−及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、食用脂肪酸のスクロースエステル、ナトリウムステアロイル−２−ラクチレート、及びカルシウムステアロイル−２−ラクチレートを包含する。
別のドウ添加物又は成分は何れかのドウ成分、例えば穀物粉、水又は任意の他の成分又は添加物、又はドウ向上化組成物と共に添加できる。別のドウ添加物又は成分は、穀物粉、水、任意の他の成分及び添加物、又はドウ向上化組成物の前に添加できる。別のドウ添加物又は成分は、穀物粉、水、任意の他の成分及び添加物、又はドウ向上化組成物の後に添加できる。
別のドウ添加物又は成分は、好都合には液体調製品である。しかしながら、別のドウ添加物又は成分は好都合には乾燥組成物の形態にあってよい。
好ましくは別のドウ添加物又は成分はドウの穀物粉成分の少なくとも１重量％である。より好ましくは、別のドウ添加物又は成分は少なくとも２％、好ましくは少なくとも３％、好ましくは少なくとも４％、好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも６％である。添加物が脂肪である場合は、典型的には、脂肪は１〜５％、典型的には１〜３％、より典型的には約２％の量で存在してよい。
別の酵素
１つ以上の別の酵素をＰＳ４変異体ポリペプチドと組み合わせて使用してよい。そのような複合物は、例えば食料、ドウ調製品、食糧又は澱粉組成物に添加してよい。
別の酵素は例えば以下のもの、即ち：（ａ）ノバミル、又はマルトース生成性アルファ−アミラーゼ活性を有する変異体、相同体、又は突然変異体；（ｂ）キシラナーゼ、例えばＧＲＩＮＤＡＭＹＬＴＭＰＯＷＥＲＢａｋｅ９００（ＤａｎｉｓｃｏＡ／Ｓ）；（ｃ）細菌性のα−アミラーゼ、例えばＭａｘ−ＬｉｆｅＵ４（ＤａｎｉｓｃｏＡ／Ｓ）；及び（ｄ）リパーゼ、例えばＧＲＩＮＤＡＭＹＬＴＭＰＯＷＥＲＢａｋｅ４０５０（ＤａｎｉｓｃｏＡ／Ｓ）の何れかの組み合わせから選択してよい。
１つの実施形態において、本発明のＰＳ４変異体ポリペプチドはオキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、澱粉分解酵素、プロテアーゼ及びリポキシゲナーゼよりなる群から選択される酵素少なくとも１つと組み合わせて使用される。好ましい実施形態においては、組成物は少なくとも１つのＰＳ４変異体及びＷＯ９１／０４６６９に開示されているようなバチルス由来のマルトース生成性アミラーゼを含む。好ましい実施形態はＰＳ４変異体及び穀物粉を服務。
ドウに添加してよい別の酵素はオキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、例えばリパーゼ及びエステラーゼ、並びにグリコシダーゼ、例えばα−アミラーゼ、プルラナーゼ、及びキシラナーゼを包含する。オキシドレダクターゼ、例えばグルコースオキシダーゼ及びヘキソースオキシダーゼはドウの強化及びベーキングされた製品の体積の制御のために使用でき、そして他のヘミセルラーゼはドウの取扱性、クランブの堅固性及びパンの体積を向上させるために添加してよい。リパーゼはドウ強化剤及びクランブ軟化剤として有用であり、そしてα−アミラーゼ及び他のアミロース分解性の酵素をドウに配合することにより、パンの体積を制御し、そしてクランブの堅固性をさらに低減してよい。
使用してよい他の酵素はセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、澱粉分解酵素、プロテアーゼ、リポキシゲナーゼよりなる群から選択してよい。
有用なオキシドレダクターゼの例は、マルトース酸化酵素、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４）、炭水化物オキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１０）、及びヘキソースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．５）のような酸化酵素を包含する。これらの酵素はドウの強化及びベーキングされた製品の体積の制御のために使用できる。
澱粉分解酵素のうち、アミラーゼはドウ向上化添加物として特に有用である。α−アミラーゼは澱粉を分解してデキストリンとし、これがさらにβ−アミラーゼで分解されてマルトースとなる。適当なアミラーゼの例はバチルス・ステアロサーモフィルス由来の１，４−α−マルトヒドロラーゼとも称されるマルトース生成性アルファアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）（例えばＮｏｖａｍｙｌＴＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ））、バチルス・アミロリクファシエンス由来のα−アミラーゼ（ＥＣ．３．２．１．１）（例えばＭａｘＬｉｆｅＵ４（ＤａｎｉｓｃｏＡ／Ｓ））、Ｂ・フラボサームスアミラーゼ（ＵＳ２００５００４８６１１Ａ１）、バチルス・ステアロサーモフィルス由来のアルファ−アミラーゼの挿入を伴った真菌アミラーゼ変異体（ＥＣ３．２．１．１３３）（ＷＯ２００５０１９４４３）、ＵＳ２００６０１４７５８１Ａ１に記載のアミラーゼのハイブリッド、及びマルトース生成性α−アミラーゼ活性を有するこれらの変異体、相同体及び誘導体を包含する。好ましい実施形態においては、ＰＳ４変異体ポリペプチドはアミラーゼ、特にマルトース生成性アミラーゼと組み合わせてよい。マルトース生成性α−アミラーゼ（グルカン１，４−ａ−マルトヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．１３３）はアミロース及びアミロペクチンを加水分解してアルファ配置のマルトースとすることができる。ドウ組成物に添加してよい他の有用な澱粉分解酵素はグルコアミラーゼ及びプルラナーゼを包含する。
好ましくは、別の酵素は少なくともキシラナーゼ及び／又は少なくともアミラーゼである。「キシラナーゼ」という用語は本明細書においては、キシリシド連結部を加水分解するキシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．３２）を指す。リパーゼもまた添加してよい。適当なキシラナーゼの例は、例えばバチルス種、アスペルギルス種、サーモマイセス種、又はトリコデルマ種由来のベーカリーキシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）（例えばＧＲＩＮＤＡＭＹＬＴＭＰＯＷＥＲＢａｋｅ９００（ＤａｎｉｓｃｏＡ／Ｓ））、及び例えばサーモマイセス・ラノギノサス（以前はフミコーラ・インソレンスと称されていた）、アスペルギルス・アキュレアタス（ＷＯ９４／２１７８５）、バチルス・ハロズランス（ＷＯ２００５／０５９０８４）、バチルス種（ＥＰ０７２０６４９Ｂ１）、Ｂ・アガデヘレンス（ＵＳ５，７７０，４２４）由来のファミリー１０又は１１に関連するキシラナーゼ、及びこれらの変異体、相同体、及び誘導体を包含する。
「アミラーゼ」という用語は本明細書においてはα−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）及びγ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）のようなアミラーゼを指す。
別の酵素を何れかのドウ成分、例えば穀物粉、水、又は任意の他の成分又は添加物、又はドウ向上化組成物と共に添加することができる。別の酵素は穀物粉、水、又は任意の他の成分及び添加物、又はドウ向上化組成物の前に添加することができる。別の酵素は穀物粉、水、又は任意の他の成分及び添加物、又はドウ向上化組成物の後に添加することができる。別の酵素は好都合には液体調製品であってよい。しかしながら組成物は好都合には乾燥組成物の形態であってよい。
ドウ向上化組成物の一部の酵素は穀物粉ドウのレオロジー及び／又は機械工作の特性及び／又は酵素によりドウから製造される製品の品質の向上に対する作用が相加的のみならず、作用が相乗的である程度まで、ドウ条件下において互いに相互作用することができる。
ドウから製造された製品（最終製品）の向上に関連して、クランブの構造に関しては複合物が実質的相乗作用をもたらすことが観察される場合がある。更に又、ベーキングされた製品の比堆積に関しても、相乗作用が観察される場合がある。
別の酵素はカルボキシルエステル結合を加水分解してカルボキシレートを放出することができるリパーゼ（ＥＣ３．１．１）であってよい。リパーゼの例は限定しないが、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）、ガラクトリパーゼ（ＥＣ３．１．１．２６）、ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）、ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ３．１．１．４）、及びリポ蛋白リパーゼＡ２（ＥＣ３．１．１．３４）を包含する。より特定すれば、適当なリパーゼはムコ・ミエヘイ、Ｆ・ベネナタム、Ｈ・ラヌギノーサ、リゾムコ・ミヘイ・カンジダ・アンタルクチカ、Ｆ・オキシスポラム由来のリパーゼ、フサリウム・ヘテロスポラム由来のグリコリパーゼ（例えばＧＲＩＮＤＡＭＹＬＴＭＰＯＷＥＲＢａｋｅ４０５０（ＤａｎｉｓｃｏＡ／Ｓ）及びこれらの変異体、相同体及び誘導体を包含する。
他の用途
ＰＳ４変異体はマルトース及び高マルトースシロップの製造のために適している。そのような製品は、低吸湿性、低粘度、良好な熱安定性、及びマルトースのマイルドで甘すぎない味のために、特定の菓子の製造においてかなり有利なものである。マルトースシロップを製造する工業的なプロセスは、澱粉を液化すること、次にマルトース生産酵素による、そして場合によりアミロペクチンにおいて１，６−分枝点を切断する酵素、例えばアルファ−１，６−アミログルコシダーゼによる糖化を含む。
本明細書に記載したＰＳ４変異体は洗剤組成物に添加してよく、そしてこれによりその成分となってよい。洗剤組成物は例えば手洗い又は洗濯機用の洗剤組成物、例えば汚染生地の前処理用に適する洗濯用添加物組成物、及びリンス添加生地柔軟剤組成物として製剤してよく、又は、一般家庭硬質表面洗浄作業において使用するための洗剤組成物として製剤してよく、又は、手洗い又は機械による皿洗い操作のために製剤してよい。特定の特長において、本発明者等はＰＳ４変異体を含む潜在添加物を記載する。洗剤添加物並びに洗剤組成物は１つ以上の他の酵素、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、及び／又はパーオキシダーゼを含んでよい。一般的に、選択された酵素の特性は選択された洗剤（即ち、ｐＨ適性、他の酵素及び非酵素の成分等）と適合しなければならず、そして酵素は有効量で存在しなければならない。
ＰＳ４変異体は又、特に再パルプ化が７より高値のｐＨにおいて行われる場合、そしてアミラーゼが強化澱粉の分解を介して廃材の崩壊を促進することができる場合に、澱粉強化された古紙及び古段ボールからのパルプ、紙、及び段ボールのようなリグノセルロース材料の製造において使用してよい。ＰＳ４変異体は澱粉コーティング印刷紙から製紙用パルプを製造するためのプロセスにおいて特に有用である場合がある。プロセスはＷＯ９５／１４８０７に記載されているとおり実施してよく、以下の工程、即ち：ａ）紙を崩壊させてパルプを形成すること、ｂ）工程ａ）の前、最中、又は後において澱粉分解酵素で処理すること、及びｃ）工程ａ）及びｂ）の後にパルプからインク粒子を分離すること、を含んでいる。ＰＳ４変異体はまた酵素的に修飾された澱粉が炭酸カルシウム、カオリン及び粘土のようなアルカリ性充填剤と共に製紙において使用されている場合において、澱粉を修飾する場合に極めて有用である。本明細書に記載したＰＳ４変異体を用いれば、充填剤の存在下において澱粉を修飾することが可能となり、これにより、より簡素で集約されたプロセスが可能となる。ＰＳ４変異体は又、織物の脱サイジングにおいても極めて有用である。織物プロセシング産業においては、アミラーゼは編製の間に横糸上の保護コーティングとして機能してきた澱粉含有サイジング剤の除去を容易にするために脱サイジングプロセスにおいて補助剤として伝統的に使用されている。編製後にサイジング剤のコーティングを完全に除去することは、布地を洗浄、漂白、及び染色する後のプロセスにおいて最適な結果を確保するために重要である。酵素的な澱粉の分解は、それが繊維材料に対して如何なる有害な作用も含まないことから、好ましいものである。ＰＳ４変異体はセルロース含有の布地又は織物を脱サイジング処理する場合に単独又はセルラーゼと組み合わせて使用してよい。
ＰＳ４変異体は又、澱粉からの甘味料の製造のために選択すべきアミラーゼである場合がある。澱粉からフラクトースシロップへの変換のための「伝統的な」プロセスは通常は３つの連続した酵素的プロセス、即ち、液化プロセス、次いで糖化プロセス、及び異性化プロセスよりなる。液化プロセスの間、澱粉は約２時間、５．５〜６．２のｐＨ及び９５〜１６０℃の温度においてアミラーゼによりデキストリンに分解される。これらの条件下で最適な酵素の安定性を確保するためには、１ｍＭのカルシウムを添加する（４０ｐｐｍの遊離カルシウムイオン）。液化プロセスの後、グルコアミラーゼ及び脱分枝酵素、例えばイソアミラーゼ及びプルラナーゼを添加することによりデキストリンをデキストロースに変換する。この工程の前に、ｐＨを４．５未満の値まで低減し、高温（９５℃超）に維持し、そして液化しているアミラーゼの活性を変成させる。温度を６０℃にまで低下させ、そしてグルコアミラーゼ及び脱分枝酵素を添加する。糖化プロセスは２４〜７２時間進行させる。
洗濯用洗剤組成物及び使用
本明細書に記載したα−アミラーゼ変異体は例えば食器洗浄において使用するための洗剤組成物又は他の洗浄用組成物として製剤できる。これらはゲル、粉末又は液体であることができる。組成物はα−アミラーゼ単独、他のアミロース分解性酵素、他の洗浄用酵素、及び洗浄用組成物で一般的な他の成分を含むことができる。
即ち、食器洗浄用の洗剤組成物は界面活性剤を含むことができる。界面活性剤はアニオン系、ノニノン系、カチオン系、両親媒性、又はこれらの型の混合物であってよい。洗剤は低〜非発泡性のエトキシル化プロポキシル化直鎖アルコールのようなノニオン系界面活性剤０〜９０重量％を含有できる。
洗剤用途においては、α−アミラーゼ変異体は通常はプロピレングリコール含有液体組成物中において使用される。α−アミラーゼ変異体は例えば１０％塩化カルシウムを含有する２５％ｖ／ｖのプロピレングリコール溶液中で循環させることによりプロピレングリコール中に可溶化できる。
食器洗浄用の洗剤組成物は無機及び／又は有機の型の洗剤ビルダー塩を含有してよい。洗剤ビルダーはリン含有及び非リン含有型に細分してよい。洗剤組成物は通常は洗剤ビルダー約１％〜約９０％を含有する。リン含有無機アルカリ性洗剤ビルダーを使用する場合、その例は、水溶性の塩、特にアルカリ金属のピロリン酸塩、オルトリン酸塩、及びポリリン酸塩を包含する。リン含有有機アルカリ性洗剤ビルダーを使用する場合、その例は、ホスホネートの水溶性の塩を包含する。非リン含有無機ビルダーを使用する場合、その例は、水溶性のアルカリ金属の炭酸塩、ホウ酸塩、及びケイ酸塩、並びに種々の水不溶性の結晶性又は不定形のアルミノシリケートを包含し、そのうち、ゼオライトが最もよく知られた代表である。
適当な有機のビルダーの例は、アルカリ金属；アンモニウム及び置換されたアンモニウム；クエン酸塩；コハク酸塩；マロン酸塩；脂肪酸スルホネート；カルボキシメトキシスクシネート；アンモニウムポリアセテート；カルボキシレート；ポリカルボキシレート；アミノポリカルボキシレート；ポリアセチルカルボキシレート；及びポリヒドロキシスルホネートを包含する。
他の適当な有機のビルダーはビルダー特性を有することが知られている高分子量の重合体及び共重合体、例えば適切なポリアクリル酸、ポリマレイン酸、及びポリアクリル／ポリマレイン酸共重合体、及びそれらの塩を包含する。
洗浄用組成物は塩素／臭素型又は酸素型の漂白剤を含有してよい。無機の塩素／臭素型の漂白剤の例は、リチウム、ナトリウム、又はカルシウムの次亜塩素酸塩、並びに塩素化リン酸３ナトリウムである。有機の塩素／臭素型の漂白剤の例は、複素環Ｎ−ブロモ−及びＮ−クロロ−イミド、例えばトリクロロイソシアヌール酸、トリブロモイソシアヌール酸、ジブロモイソシアヌール酸、及びジクロロイソシアヌール酸、及びこれらの水溶性カチオン、例えばカリウム及びナトリウムとの塩である。ヒダントイン化合物もまた適している。
洗浄用組成物は酸素漂白剤、例えば無機の過塩の形態において場合により漂白剤前駆体と共に、又は、過酸化合物として含有してよい。適当なパーオキシ漂白剤化合物の典型的な例は、アルカリ金属の過ホウ酸塩の４水和物及び１水和物の両方、アルカリ金属の過炭酸塩、過ケイ酸塩、及び過リン酸塩である。適当な活性化剤物質はテトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）及びグリセロールトリアセテートを包含する。酵素的な漂白剤活性化系もまた存在してよく、例えばＷＯ２００５／０５６７８３に開示されている通り、過ホウ酸塩又は過炭酸塩、グリセロールトリアセテート及びパーヒドロラーゼが挙げられる。
洗浄用組成物は酵素に対する従来の安定化剤、例えばポリオール、例えばポリエチレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸の誘導体（例えば芳香族ボレートエステル）を用いて安定化してよい。洗浄用組成物は又、他の従来の洗剤成分、例えば脱凝集物質、充填剤物質、泡沫形成抑制剤。抗腐食剤、土壌懸濁剤、封鎖剤、抗土壌再付着剤、脱水剤、染料、殺菌剤、蛍光剤、濃厚化剤、及び香料を含有してよい。
最後に、α−アミラーゼ変異体は従来の食器洗浄用洗剤中、例えば以下の親公開物：
Figure 0005448812
 に記載されている洗剤の何れかにおいて使用してよいが、本明細書に記載したα−アミラーゼ変異体は列挙した特許及び公開出願に開示されているα−アミラーゼの代わりに、又はそれに追加して使用されることを念頭に置くものとする。
実施形態によれば、１つ以上のα−アミラーゼ変異体は典型的には洗剤組成物の成分であってよい。即ち、それは非散粉性顆粒、安定化された液体、又は保護された酵素の形態において洗剤組成物内に包含されてよい。非散粉性顆粒は、例えば米国特許４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２に開示されているとおり製造してよく、そして場合により当該分野で知られた方法によりコーティングされてよい。ワックス状コーティング物質の例は、ポリ（エチレンオキシド）生成物；平均分子量１，０００〜２０，０００の（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０エチレン酸化度単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；１２〜２０炭素原子を含有し、１５〜８０エチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、及びジ−及びトリグリセリドである。流動床手法による適用に適する膜形成性のコーティング物質の例は例えば英国特許１４８３５９１に記載されている。液体酵素調製品は、例えばポリオール、例えばポリエチレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸、又はホウ酸を添加することにより、樹立された方法に従って安定化してよい。他の酵素安定化剤は当該分野で良く知られている。保護された酵素は例えばＵＳ５，８７９，９２０（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｔｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）又はＥＰ２３８２１６に開示されている方法に従って製造してよい。ポリオールは蛋白の安定剤として、並びに蛋白の妖怪度を向上させるものとして長年認知されているものである。例えばＫａｕｓｈｉｋ等、”Ｗｈｙ ｉｓ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ａｎ ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ？Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｏｓｍｏｌｙｔｅ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２６４５８−６５（２００３）及びその引用文献；及びＭ．Ｃｏｎｔｉ等、“Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ：ｔｈｅ ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７５７：２３７−２４５（１９９７）を参照できる。
洗剤組成物は何れかの好都合な形態において、例えばゲル、粉末、顆粒、ペースト、又は液体として存在してよい。液体洗剤は、水性であり、典型的には水約７０％まで、そして有機溶媒０％〜約３０％を含有してよく、それは又僅か約３０％の水を含有するコンパクトゲル型の形態であってよい。
洗剤組成物は界面活性剤１つ以上を含み、その各々はアニオン系、ノニオン系、カチオン系、又は両性イオン系であってよい。洗剤は通常は０％〜約５０％のアニオン系界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）；α−オレフィンスルホネート（ＡＯＳ）；アルキルスルフェート（脂肪族アルコールスルフェート）（ＡＳ）；アルコールエトキシスルフェート（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）；第２アルカンスルホネート（ＳＡＳ）；α−スルホ脂肪酸メチルエステル；アルキル−又はアルケニルコハク酸；又は石鹸を含有することになる。組成物は又０％〜約４０％のノニオン系界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート（ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミドを例えばＷＯ９２／０６１５４に記載の通り含有してよい。
洗剤組成物は更に１つ以上の他の酵素、例えばリパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、パーオキシダーゼ、及び／又はラッカーゼを何れかの組み合わせにおいて含んでよい。
洗剤は約１％〜約６５％の洗剤ビルダー又は複合体化剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は層化シリケート（例えばＨｏｅｃｈｓｔのＳＫＳ−６）を含有してよい。洗剤は未ビルダー添加であってもよく、即ち本質的に洗剤ビルダーを含有しなくてもよい。酵素は酵素の安定性に適合する何れかの組成物中で使用してよい。酵素は例えばヒドロゲル中の顆粒化又は封鎖によるなど、カプセル化の知られた形態により一般的に不都合な成分から保護することができる。澱粉結合ドメインを有するか有さない酵素及び特にα−アミラーゼは選択及び食器洗浄の用途に限定されず、表面洗浄剤及び澱粉又はバイオマスからのエタノール製造においても使用してよい。
洗剤は１つ以上の重合体を含んでよい。例示されるものはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン／アクリル酸共重合体、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸共重合体を包含する。
洗剤は漂泊系を含有してよく、これは、ＴＡＥＤ又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）のような過酸形成漂白活性化剤と場合により組み合わせられた過ホウ酸塩又は過炭酸塩のようなＨ２Ｏ２源を含んでよい。或いは、漂泊系は例えばアミド、イミド、又はスルホン型のパーオキシ酸を含んでよい。漂泊系は又、ＷＯ２００５／０５６７８３に記載のもののような、パーヒドロラーゼがパーオキシドを活性化させる酵素的漂泊系であることもできる。
洗剤組成物の酵素は従来の安定化剤、例えばポリオール、例えばポリエチレングリコール又はグリセロール；糖又は糖アルコール；乳酸；ホウ酸、又はホウ酸の誘導体、例えば芳香族ボレートエステルを用いて安定化してよく；そして組成物はＷＯ９２／１９７０９及びＷＯ９２／１９７０８に記載の通り製剤してよい。
洗剤は又、他の従来の洗剤成分、例えば布地コンディショナー、例えば粘土、フォームブースター、泡抑制剤、抗腐食剤、土壌懸濁剤、抗土壌再付着剤、染料、殺菌剤、光学的漂白剤、又は香料を含有してよい。ｐＨ（使用濃度における水溶液中で測定）は通常は中性又はアルカリ性、例えばｐＨ約７．０〜約１１．０である。
α−アミラーゼ変異体は洗剤において従来使用されている農奴において配合してよい。現時点では、洗剤組成物中、α−アミラーゼ変異体は、洗浄液リットル当たりα−アミラーゼ変異体０．００００１〜１．０ｍｇ（純粋な酵素蛋白として計算）に相当する量で添加してよいことを意図している。α−アミラーゼ変異体を含む洗剤組成物の特定の形態は以下を包含するように製剤できる。
（１）直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）約７％〜約１２％；
アルコールエトキシスルフェート（例えばＣ１２−１８アルコール、１〜２エチレンオキシド（ＥＯ））、又はアルキルスルフェート（例えばＣ１６−１８）約１〜約４％；
アルコールエトキシレート（例えばＣ１４−１５アルコール、７ＥＯ）約５％〜約９％；
炭酸ナトリウム（例えばＮａ２ＣＯ３）約１４％〜約２０％；
可溶性シリケート、約２〜約６％；
ゼオライト（例えばＮａＡｌＳｉＯ４）約１５％〜約２２％；
硫酸ナトリウム（例えばＮａ２ＳＯ４）０％〜約６％；
クエン酸ナトリウム／クエン酸（例えばＣ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）約０％〜約１５％；
過ホウ酸ナトリウム（例えばＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）約１１％〜約１８％；
ＴＡＥＤ約２％〜約６％；
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及び０％〜約２％；
重合体（例えばマレイン酸／アクリル酸、共重合体、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０〜３％；
酵素（純粋な酵素として計算）０．０００１〜０．１％蛋白；
及び微量成分（例えば泡抑制剤、香料、光学的漂白剤、フォトブリーチ）０〜５％、
を含む少なくとも６００ｇ／Ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤された洗剤組成物。
（２）直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）約６％〜約１１％；
アルコールエトキシスルフェート（例えばＣ１２−１８アルコール、１〜２ＥＯ）、又はアルキルスルフェート（例えばＣ１６−１８）約１〜約３％；
アルコールエトキシレート（例えばＣ１４−１５アルコール、７ＥＯ）約５％〜約９％；
炭酸ナトリウム（例えばＮａ２ＣＯ３）約１５％〜約２１％；
可溶性シリケート、約１〜約４％；
ゼオライト（例えばＮａＡｌＳｉＯ４）約２４％〜約３４％；
硫酸ナトリウム（例えばＮａ２ＳＯ４）約４％〜約１０％；
クエン酸ナトリウム／クエン酸（例えばＣ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）０％〜約１５％；
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及び０％〜約２％；
重合体（例えばマレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＶＰ、ＰＥＧ）１〜６％；
酵素（純粋な酵素蛋白として計算）０．０００１〜０．１％；
微量成分（例えば泡抑制剤、香料）０〜５％、
を含む少なくとも６００ｇ／Ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤された洗剤組成物。
（３）直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）約５％〜約９％；
アルコールエトキシレート（例えばＣ１２−１５アルコール、７ＥＯ）約７〜約１４％；
脂肪酸としての石鹸（例えばＣ１６−２２脂肪酸）約１〜約３％；
炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）約１０％〜約１７％；
可溶性シリケート、約３〜約９％；
ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ４として）約２３％〜約３３％；
硫酸ナトリウム（例えばＮａ２ＳＯ４）０％〜約４％；
過ホウ酸ナトリウム（例えばＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）約８％〜約１６％；
ＴＡＥＤ約２％〜約８％；
ホスホネート（例えばＥＤＴＭＰＡ）０％〜約１％；
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及び０％〜約２％；
重合体（例えばマレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０〜３％；
酵素（純粋な酵素蛋白として計算）０．０００１〜０．１％；
微量成分（例えば泡抑制剤、香料、光学的漂白剤）０〜５％、
を含む少なくとも６００ｇ／Ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤された洗剤組成物。
（４）直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）約８％〜約１２％；
アルコールエトキシレート（例えばＣ１２−１５アルコール、７ＥＯ）約１０〜約２５％；
炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）約１４％〜約２２％；
可溶性シリケート、約１〜約５％；
ゼオライト（例えばＮａＡｌＳｉＯ４）約２５％〜約３５％；
硫酸ナトリウム（例えばＮａ２ＳＯ４）０％〜約１０％；
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及び０％〜約２％；
重合体（例えばマレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＶＰ、ＰＥＧ）１〜３％；
酵素（純粋な酵素蛋白として計算）０．０００１〜０．１％；
及び微量成分（例えば泡抑制剤、香料）０〜５％、
を含む少なくとも６００ｇ／Ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤された洗剤組成物。
（５）直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）約１５％〜約２１％；
アルコールエトキシレート（例えばＣ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）約１２〜約１８％；
脂肪酸としての石鹸（例えばオレイン酸）約３〜約１３％；
アルケニルコハク酸（Ｃ１２−１４）０％〜約１３％；
アミノエタノール約８％〜約１８％；
クエン酸約２％〜約８％；
ホスホネート０％〜約３％；
重合体（例えばＰＶＰ、ＰＥＧ）０〜約３％；
ホウ酸塩（例えばＢ４Ｏ７）０％〜約２％；
エタノール０％〜約３％；
プロピレングリコール約８％〜約１４％；
酵素（純粋な酵素蛋白として計算）０．０００１〜０．１％；
及び微量成分（例えば泡抑制剤、香料、光学的漂白剤）０〜５％、
を含む水性液体洗剤組成物。
（６）直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）約１５％〜約２１％；
アルコールエトキシレート（例えばＣ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）３〜９％；
脂肪酸としての石鹸（例えばオレイン酸）約３〜約１０％；
ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ４として）約１４％〜約２２％；
クエン酸カルシウム約９％〜約１８％；
ホウ酸塩（例えばＢ４Ｏ７）０％〜約２％；
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及び０％〜約２％；
重合体（例えばＰＶＰ、ＰＥＧ）０％〜約３％；
アンカリング重合体（例えばラウリルメタクリレート／アクリル酸共重合体）；モル）比２５：１、ＭＷ３８００）０％〜約３％；
グリセロール０％〜約５％；
酵素（純粋な酵素蛋白として計算）０．０００１〜０．１％；
及び微量成分（例えば分散剤、泡抑制剤、香料、光学的漂白剤）０〜５％、
を含む水性構造化液体洗剤組成物。
（７）脂肪族アルコールスルフェート約５％〜約１０％；
エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド約３％〜約９％；
脂肪酸としての石鹸０〜３％；
炭酸ナトリウム（例えばＮａ２ＣＯ３）約５％〜約１０％；
可溶性シリケート、約１〜約４％；
ゼオライト（例えばＮａＡｌＳｉＯ４）約２０％〜約４０％；
硫酸ナトリウム（例えばＮａ２ＳＯ４）約２％〜約８％；
過ホウ酸ナトリウム（例えばＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）約１２％〜約１８％；
ＴＡＥＤ約２％〜約７％；
重合体（例えばマレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＥＧ）約１％〜約５％；
酵素（純粋な酵素蛋白として計算）０．０００１〜０．１％；
及び微量成分（例えば光学的漂白剤、泡抑制剤、香料）０〜５％、
を含む少なくとも６００ｇ／Ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤された洗剤組成物。
（８）直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）約８％〜約１４％；
エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド約５％〜約１１％；
脂肪酸としての石鹸０〜約３％；
炭酸ナトリウム（例えばＮａ２ＣＯ３）約４％〜約１０％；
可溶性シリケート、約１〜約４％；
ゼオライト（例えばＮａＡｌＳｉＯ４）約３０％〜約５０％；
硫酸ナトリウム（例えばＮａ２ＳＯ４）約３％〜約１１％；
クエン酸ナトリウム（例えばＣ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）約５％〜約１２％；
重合体（例えばＰＶＰ、マレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＥＧ）約１％〜約５％；
酵素（純粋な酵素蛋白として計算）０．０００１〜０．１％；
及び微量成分（例えば泡抑制剤、香料）０〜５％、
を含む顆粒として製剤された洗剤組成物。
（９）直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）約６％〜約１２％；
ノニオン系界面活性剤約１％〜約４％；
脂肪酸としての石鹸約２％〜約６％；
炭酸ナトリウム（例えばＮａ２ＣＯ３）約１４％〜約２２％；
ゼオライト（例えばＮａＡｌＳｉＯ４）約１８％〜約３２％；
硫酸ナトリウム（例えばＮａ２ＳＯ４）約５％〜約２０％；
クエン酸ナトリウム（例えばＣ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）約３％〜約８％；
過ホウ酸ナトリウム（例えばＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）約４％〜約９％；
漂白活性化剤（例えばＮＯＢＳ又はＴＡＥＤ）約１％〜約５％；
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％；
重合体（例えばポリカルボキシレート又はＰＥＧ）約１％〜約５％；
酵素（純粋な酵素蛋白として計算）０．０００１〜０．１％；
及び微量成分（例えば光学的漂白剤、香料）０〜５％、
を含む顆粒として製剤された洗剤組成物。
（１０）直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）約１５％〜約２３％；
アルコールエトキシスルフェート（例えばＣ１２−１５アルコール、２〜３ＥＯ）約８〜約１５％；
アルコールエトキシレート（例えばＣ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）約３〜約９％；
脂肪酸としての石鹸（例えばラウリン酸）０〜約３％；
アミノエタノール約１％〜約５％；
クエン酸ナトリウム約５％〜約１０％；
ヒドロトロープ（例えばトルエンスルホン酸ナトリウム）約２％〜約６％；
ホウ酸塩（例えばＢ４Ｏ７）０％〜約２％；
カルボキシメチルセルロース０％〜約１％；
エタノール約１％〜約３％；
プロピレングリコール約２％〜約５％；
酵素（純粋な酵素蛋白として計算）０．０００１〜０．１％；
及び微量成分（例えば重合体、分散剤、香料、光学的漂白剤）０〜５％、
を含む水性液体洗剤組成物。
（１１）直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）約２０％〜約３２％；
アルコールエトキシレート（例えばＣ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）６〜１２％；
アミノエタノール約２％〜約６％；
クエン酸約８％〜約１４％；
ホウ酸塩（例えばＢ４Ｏ７）約１％〜約３％；
重合体（例えばマレイン酸／アクリル酸共重合体、アンカリング重合体、例えばラウリルメタクリレート／アクリル酸共重合体）０％〜約３％；
グリセロール約３％〜約８％；
酵素（純粋な酵素蛋白として計算）０．０００１〜０．１％；
及び微量成分（例えばヒドロトロープ、分散剤、香料、光学的漂白剤）０〜５％、
を含む水性液体洗剤組成物。
（１２）アニオン性界面活性剤（直鎖アルキルベンゼンスルホネート、アルキルスルフェート、α−オレフィンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホネート、石鹸）約２５％〜約４０％；
ノニオン系界面活性剤（例えばアルコールエトキシレート）約１％〜約１０％；
炭酸ナトリウム（例えばＮａ２ＣＯ３）約８％〜約２５％；
可溶性シリケート、約５〜約１５％；
硫酸ナトリウム（例えばＮａ２ＳＯ４）０％〜約５％；
ゼオライト（例えばＮａＡｌＳｉＯ４）約１５％〜約２８％；
過ホウ酸ナトリウム（例えばＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）０％〜約２０％；
漂白活性化剤（ＴＡＥＤ又はＮＯＢＳ）約０％〜約５％；
酵素（純粋な酵素蛋白として計算）０．０００１〜０．１％蛋白；
及び微量成分（例えば香料、光学的漂白剤）０〜３％、
を含む少なくとも６００ｇ／Ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤された洗剤組成物。
（１３）上記組成物１）〜１２）に記載した洗剤組成物、ただし、直鎖アルキルベンゼンスルホネートの全て又は部分が（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキルスルフェートで置き換えられているもの。
（１４）（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキルスルフェート約９％〜約１５％；
アルコールエトキシレート約３％〜約６％；
ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド約１％〜約５％；
ゼオライト（例えばＮａＡｌＳｉＯ４）約１０％〜約２０％；
層化ジシリケート（例えばＨｏｅｃｈｓｔのＳＫ５６）約１０％〜約２０％；
炭酸ナトリウム（例えばＮａ２ＣＯ３）約３％〜約１２％；
可溶性シリケート０％〜約６％；
クエン酸ナトリウム約４％〜約８％；
過炭酸ナトリウム約１３％〜約２２％；
ＴＥＡＤ約３％〜約８％；
重合体（例えばポリカルボキシレート及びＰＶＰ）０％〜約５％；
酵素（純粋な酵素蛋白として計算）０．０００１〜０．１％；
及び微量成分（例えば光学的漂白剤、フォトブリーチ、香料、泡抑制剤）０〜５％、
を含む少なくとも６００ｇ／Ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤された洗剤組成物。
（１５）（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキルスルフェート約４％〜約８％；
アルコールエトキシレート約１１％〜約１５％；
石鹸約１％〜約４％；
ゼオライトＭＡＰ又はゼオライトＡ約３５％〜約４５％；
炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）約２％〜約８％；
可溶性シリケート、０％〜約４％；
過炭酸ナトリウム約１３％〜約２２％；
ＴＡＥＤ１〜８％；
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約３％；
重合体（例えばポリカルボキシレート及びＰＶＰ）０％〜約３％；
酵素（純粋な酵素蛋白として計算）０．０００１〜０．１％；
及び微量成分（例えば光学的漂白剤、ホスホネート、香料）０〜３％、
を含む少なくとも６００ｇ／Ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤された洗剤組成物。
（１６）上記１）〜１５）に記載した洗剤製剤、ただし、安定化された、又はカプセル化された過酸を、追加的成分として、又は、既に特定した漂白剤系の代替として含有するもの。
（１７）１）、３）、７）、９）、及び１２）において上記した洗剤組成物、ただし過ホウ酸塩が過炭酸塩により置き換えられているもの。
（１８）１）、３）、７）、９）、１２）、１４）、及び１５）において上記した洗剤組成物、ただし更にマンガン触媒を含有するもの。
（１９）液体ノニオン系界面活性剤、例えば直鎖アルコキシル化第１アルコール、ビルダー系（例えばホスフェート）、酵素、及びアルカリを含む非水性の洗剤液として製剤された洗剤組成物。洗剤は又、アニオン系界面活性剤及び／又は漂白剤系を含んでよい。
別の実施形態においては、２，６−β−Ｄ−フラクタンヒドロラーゼを洗剤組成物に配合し、日用品及び／又は産業用織物／洗濯物の上に存在するバイオフィルムの除去／洗浄のために使用することができる。
洗剤組成物は例えば手洗い又は機械洗濯用の洗剤組成物、例えば汚れた布地の前処理に適する洗濯用添加物組成物、及びリンス添加布地柔軟剤組成物として製剤してよく、又は、一般的な日用品の硬質表面の洗浄操作において使用するための洗剤組成物として製剤してよく、又は手洗い又は機械による食器洗浄操作のために製剤してよい。
特定の特徴において、洗剤組成物は２，６−β−Ｄ−フラクタンヒドロラーゼ、１つ以上のα−アミラーゼ変異体、及び１つ以上の他の洗浄用酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、及び／又はパーオキシダーゼ、及び／又はこれらの組み合わせを含むことができる。一般的に選択された酵素の特性は選択された洗剤と適合しなければならず（即ち、ｐＨ適性、他の酵素及び非酵素の成分との適合性等）、そして酵素は有効量で存在しなければならない。
プロテアーゼ：適当なプロテアーゼは動物、植物、又は微生物起源のものを包含する。化学修飾された、又は蛋白操作された突然変異体も適している。プロテアーゼはセリンプロテアーゼ又はメタロプロテイナーゼ、例えばアルカリ性微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであってよい。アルカリ性プロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバチルス種より誘導されたもの、例えばスブチリシンノボ、スブチリシンカールスバーグ、スブチリシン３０９（例えば米国特許６，２８７，８４１参照）、スブチリシン１４７、及びスブチリシン１６８（例えばＷＯ８９／０６２７９参照）である。トリプシン様プロテアーゼはトリプシン（例えばブタ又はウシ起源）、及びフサリウムプロテアーゼ（例えばＷＯ８９／０６２７０及びＷＯ９４／２５５８３参照）。有用なプロテアーゼの例は又、限定しないが、ＷＯ９２／１９７２９及びＷＯ９８／２０１１５に記載の変異体を包含する。適当な市販のプロテアーゼ酵素はＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）、及びＫａｎｎａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、以前のＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）；Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、ＭａｘａｃａｌＴＭ、ＭａｘａｐｅｍＴＭ、ＰｒｏｐｅｒａｓｅＴＭ、ＰｕｒａｆｅｃｔＴＭ、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ＯｘＰＴＭ、ＦＮ２ＴＭ、及びＦＮ３ＴＭ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）を包含する。
リパーゼ：適当なリパーゼは細菌又は真菌起源のものを包含する。化学修飾された、又はプロテアーゼ操作された突然変異体も包含される。有用なリパーゼの例は、限定しないが、フミコーラ（サーモマイセスと同義）、例えばＨ・ラヌギノーサ（Ｔ・ラヌギノサス）（例えばＥＰ２５８０６８及びＥＰ３０５２１６参照）及びＨ・インソレンス（例えばＷＯ９６／１３５８０参照）由来のリパーゼ；シュードモナスリパーゼ（例えばＰ・アルカリゲネス又はＰ・シュードアルカリゲネス由来；例えばＥＰ２１８２７２参照）Ｐ・セパシア（例えばＥＰ ３３１ ３７６参照）、Ｐ・スツッゼリー（例えばＧＢ １，３７２，０３４参照）、Ｐ・フルオレセンス、シュードモナス種ＳＤ ７０５株（例えばＷＯ９５／０６７２０及びＷＯ９６／２７００２参照）、Ｐ・ウイスコンシネンシス（例えばＷＯ９６／１２０１２参照）、バチルスリパーゼ、例えばＢ・スブチルス由来のもの（例えばＤａｒｔｏｉｓ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１３１，２５３−３６０（１９９３）参照）、Ｂ・ステアロサーモフィルス（例えばＪＰ ６４／７４４９９２）又はＢ・プミルス例えばＷＯ９１／１６４２２）を包含する。製剤中の使用を意図するその他のリパーゼ変異体は例えばＷＯ９２／０５２４９、ＷＯ９４／０１５４１，ＷＯ ９５／３５３８１、ＷＯ９６／００２９２、ＷＯ９５／３０７４４、ＷＯ９４／２５５７８，ＷＯ ９５／１４７８３、ＷＯ９５／２２６１５、ＷＯ９７／０４０７９、ＷＯ ９７／０７２０２、ＥＰ ４０７２２５及びＥＰ ２６０１０５に記載のものを包含する。一部の市販のリパーゼ酵素はＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）及びＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、以前のＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）を包含する。
ポリエステラーゼ：適当なポリエステラーゼは限定しないがＷＯ０１／３４８９９（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）及びＷＯ０１／１４６２９（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）に記載のものを包含し、そして本明細書に記載した他の酵素との何れかの組み合わせ中に包含することができる。
アミラーゼ：組成物は他のα−アミラーゼ、例えば非変異体α−アミラーゼと組み合わせることができる。これらは市販のアミラーゼ、例えば限定しないがＤｕｒａｍｙｌ（登録商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（登録商標）及びＢＡＮＴＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、以前のＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）、Ｒａｐｉｄａｓｅ（登録商標） 及びＰｕｒａｓｔａｒ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）を包含できる。
セルラーゼ：セルラーゼを組成物に添加することができる。適当なセルラーゼは細菌又は真菌起源ものを包含する。化学修飾された、又は蛋白操作された突然変異体も包含される。適当なセルラーゼはバチルス、シュードモナス、フミコーラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム属に由来するセルラーゼ、例えば米国特許４，４３５，３０７、５，６４８，２６３、５，６９１，１７８、５，７７６，７５７及びＷＯ８９／０９２５９に開示されているフミコーラ・インソレンス、マイセリオフソラ・サーモフィリア及びフサリウム・オキシスポラムから生産される真菌セルラーゼを包含する。使用に意図される例示されるセルラーゼは織物用の色調保護利点を有するものである。そのようなセルラーゼの例はＥＰ０４９５２５７；ＥＰ５３１３７２；ＷＯ９９／２５８４６（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）、ＷＯ９６／３４１０８（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）、ＷＯ９６／１１２６２；ＷＯ９６／２９３９７；及びＷＯ ９８／０８９４０に記載されているセルラーゼである。他の例はセルラーゼの変異体、例えばＷＯ９４／０７９９８；ＷＯ９８／１２３０７；ＷＯ９５／２４４７１；ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９；ＥＰ５３１３１５；米国特許５，４５７，０４６；５，６８６，５９３；及び５，７６３，２５４に記載のもののようなセルラーゼ変異体である。市販のセルラーゼはＣｅｌｌｕｚｙｍｅ（登録商標）及びＣａｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、以前のＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）；ＣｌａｚｉｎａｓｅＴＭ、及びＰｕｒａｄａｘ（登録商標）ＨＡ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）；及びＫＡＣ−５００（Ｂ）ＴＭ（Ｋａｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を包含する。
パーオキシダーゼ／オキシダーゼ：組成物中の使用を意図する適当なパーオキシダーゼ／オキシダーゼは植物、細菌、又は真菌起源のものを包含する。化学修飾された、又は蛋白操作された突然変異体も包含される。有用なパーオキシダーゼの例はＷＯ９３／２４６１８、ＷＯ９５／１０６０２、及びＷＯ９８／１５２５７に記載のもののようなコプリヌス由来、例えばＣ・シネレウス由来のパーオキシダーゼ、及びその変異体を包含する。
潜在酵素は控訴１つ以上を含有する別個の添加物を添加することにより、又はこれらすべての酵素を含む複合添加物を添加することにより洗剤組成物中に包含させてよい。潜在添加物、即ち別個の添加物又は複合添加物は、顆粒、液体、スラリーなどとして製剤できる。適当な顆粒洗剤添加物処方は非散粉性顆粒を包含する。
非散粉性顆粒は例えば米国特許４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２に開示されている通り製造してよく、そして場合により当該分野で知られた方法によりコーティングしてよい。ワックス状のコーティング物質の例は平均分子量１，０００〜２０，０００のポリ（エチレンオキシド）生成物（例えばポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２〜２０炭素原子を含有し、１５〜８０エチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−、及びトリグリセリドである。流動床手法による適用に適している膜形成コーティング物質の例は例えばＧＢ１４８３５９１に記載されている。液体酵素調製品は、例えばポリオール、例えばポリエチレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸、又はホウ酸を添加することにより、樹立された方法に従って安定化してよい。保護された酵素は例えばＥＰ２３８２１６に開示されている方法に従って製造してよい。
洗剤組成物は何れかの従来の形態、例えば棒状、錠剤、ゲル、粉末、顆粒、ペースト、又は液体であってよい。液体洗剤は、水性であり、典型的には水約７０％まで、そして有機溶媒０％〜約３０％を含有してよい。約３０％以下の水を含有するコンパクト洗剤ゲルも又意図される。洗剤組成物は界面活性剤１つ以上を含み、それはノニオン系、例えば半極性、アニオン系、カチオン系、又は両性イオン系、又はそれらの何れかの組み合わせであってよい。界面活性剤は典型的には０．１〜６０重量％のレベルで存在する。
含有される場合は、洗剤は典型的には約１％〜約４０％のアニオン系界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪族アルコールスルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、第２アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニルコハク酸、又は石鹸を含有することになる。
含有される場合は、洗剤は典型的には約０．２％〜約４０％のノニオン系界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシル−Ｎ−アルキル誘導体（グルカミド）を含有することになる。
洗剤は０％〜約６５％の洗剤ビルダー又は複合体化剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトリロトリ酢酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は層化シリケート（例えばＨｏｅｃｈｓｔのＳＫＳ−６）を含有してよい。
洗剤は１つ以上の重合体を含んでよい。例示されるものはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン／アクリル酸共重合体、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸共重合体を包含する。
洗剤は漂泊系を含有してよく、これは、過酸形成漂白活性化剤（例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート）と組み合わせてよい過ホウ酸塩又は過炭酸塩のようなＨ２Ｏ２源を含んでよい。或いは、漂泊系はパーオキシ酸（例えばアミド、イミド、又はスルホン型のパーオキシ酸）を含んでよい。漂泊系は又、酵素的漂泊系であることもできる。
洗剤組成物の酵素は従来の安定化剤、例えばポリオール（例えばプロピレングリコール又はグリセロール）、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、ホウ酸の誘導体（例えば芳香族ボレートエステル）又はフェニルボロン酸誘導体（例えば４−ホルミルボロン酸）を用いて安定化してよい。組成物はＷＯ９２／１９７０９及びＷＯ９２／１９７０８に記載の通り製剤してよい。
洗剤は又、他の従来の洗剤成分、例えば布地コンディショナー、例えば粘土、フォームブースター、泡抑制剤、抗腐食剤、土壌懸濁剤、抗土壌再付着剤、染料、殺菌剤、光学的漂白剤、ヒドロトープ、日焼け防止剤、又は香料を含有してよい。
洗剤組成物内においては、酵素変異体は洗浄液リットル当たり酵素蛋白約０．０１〜約１００ｍｇ、特に洗浄液リットル当たり酵素蛋白約０．０５〜約５．０ｍｇ、又は更により特定すれば洗浄液リットル当たり酵素蛋白０．１〜約１．０ｍｇに相当する量で添加してよい。
澱粉プロセシング組成物及び使用
別の特徴において、開示したα−アミラーゼ変異体の組成物は澱粉の液化及び／又は糖化のために利用できる。澱粉のプロセシングは甘味料を製造すること、燃料又は飲用のアルコールを生産すること（即ちポータブルアルコール）、飲料を製造すること、サトウキビをプロセシングすること、又は所望の有機化合物、例えばクエン酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、ケトン、アミノ酸、抗体、酵素、ビタミン、及びホルモンを製造することのために有用である。澱粉からフラクトースシロップへの変換は通常は３つの連続した酵素的プロセス、即ち、液化プロセス、糖化プロセス、及び異性化プロセスよりなる。液化プロセスの間、変異体α−アミラーゼは約２時間、約５．５〜約６．２のｐＨ及び約９５℃〜約１６０℃の温度において澱粉をデキストリンに分解する。これらの条件下で酵素の安定性を最適とするために、約１ｍＭのカルシウムを添加する（４０ｐｐｍの遊離カルシウムイオン）。他のα−アミラーゼ変異体は異なる条件を必要とする場合がある。
液化プロセスの後、グルコアミラーゼ（例えばＡＭＧＴＭ）及び場合により脱分枝酵素、例えばイソアミラーゼ及びプルラナーゼを添加することによりデキストリンをデキストロースに変換することができる。この工程の前に、ｐＨを４．５未満の値まで低減し、高温（９５℃超）に維持し、そして液化しているα−アミラーゼ変異体の活性を変成させる。温度を６０℃にまで低下させ、そしてグルコアミラーゼ及び脱分枝酵素を添加することができる。糖化プロセスは典型的には２４〜７２時間進行させる。
糖化プロセスの後、ｐＨを約６．０〜約８．０の範囲の値、例えばｐＨ７．５まで上昇させ、そしてカルシウムをイオン交換により除去する。次にデキストロースシロップを例えば固定化グルコースイソメラーゼ（例えばＳｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標））をもちいて高フラクトースシロップに変換する。
α−アミラーゼ変異体は液化のプロセスを実施するための少なくとも１つの向上した酵素特性を提供する場合がある。例えば、変異体α−アミラーゼはより高い活性を有するか、又はカルシウム要求性が低減されている場合がある。α−アミラーゼの十分高い安定性を確保するためには遊離のカルシウムの添加が必要であるが；遊離のカルシウムはグルコースイソメラーゼの活性を強力に抑制する。従って、遊離のカルシウムのレベルを３〜５ｐｐｍ未満まで低減する程度にまで、高価な装置の作動により、異性化工程よりも前にカルシウムを除去する必要がある。そのような作動が回避され、そして液化プロセスが遊離カルシウムイオンを添加することなく実施されれば、コストの節約が可能になる。即ち、カルシウムイオンを必要としないか、又はカルシウムイオンの必要性が低減されているα−アミラーゼ変異体は特に好都合である。例えば、遊離カルシウム低濃度（＜４０ｐｐｍ）において安定であり、高度に活性な低カルシウム依存性α−アミラーゼ変異体は組成物及び操作法において利用できる。そのようなα−アミラーゼ変異体は約４．５〜約６．５、例えば約４．５〜約５．５の範囲に最適ｐＨを有さなければならない。α−アミラーゼ変異体は特定の加水分解を行うために単独で使用でき、又は、他のアミラーゼと組み合わせることにより広範な活性スペクトルを有する「カクテル」とすることができる。
プロセシングすべき澱粉は高度に精製された澱粉の品質、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９．５％純粋であってよい。或いは澱粉は粉砕全粒、例えば非澱粉画分、例えば胚芽残分及び繊維を含んだより粗製の澱粉含有材料であることもできる。生原料、例えば全粒を粉砕して構造を開放し、その後のプロセシングに付す。２つの粉砕プロセス、即ち湿式及び乾式粉砕が適している。更に又、コーングリッツ及び粉砕されたコーングリッツも適用してよい。乾燥粉砕粒はかなりの量の非澱粉炭水化物化合物を澱粉以外に含むことになる。そのような不均質な材料をジェットクッキングでプロセシングする場合、澱粉の部分的ゼラチン化のみが達成される場合が多い。従って、未ゼラチン化澱粉に対して高い活性を有するα−アミラーゼ変異体はジェットクッキングされた乾燥粉砕澱粉の液化及び／又は糖化を含むプロセスにおいて好都合に適用される。
液化プロセスの間に優れた加水分解活性を有する変異体α−アミラーゼは糖化工程の効率（ＷＯ９８／２２６１３参照）及び糖化工程におけるグルコアミラーゼの必要性を好都合に上昇させる。グルコアミラーゼは好都合には０．５グルコアミラーゼ活性単位（ＡＧＵ）／ｇＤＳ（即ち乾燥固体グラム当たりのグルコアミラーゼ活性単位）以下、又は未満の量で好都合に存在する。グルコアミラーゼはアスペルギルス種、タラロマイセス種、パキキトスポラ種、又はトラメテス種に属する菌株から誘導してよく、例示されるものはアスペルギルス・ニガー、タラロマイセス・エメルソニ、トラメテス・チングラタ、又はパキキトスポラ・パピラセアである。１つの実施形態において、プロセスは又、ＷＯ９８／２２６１３に開示されている型の炭水化物結合ドメインの使用を含む。
さらに別の実施形態において、プロセスはゼラチン化された又は顆粒状の澱粉のスラリーの加水分解、特に顆粒状澱粉の初期ゼラチン化温度より低温における顆粒状澱粉の可溶性澱粉加水分解物への加水分解を含んでよい。α−アミラーゼ変異体と接触させることのほかに、澱粉は真菌α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．２．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）及びグルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）よりなる群から選択される酵素１つ以上と接触させてよい。ある実施形態においては、更に別のアミロース分解性の酵素、又は脱分枝酵素、例えばイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）及びプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）をα−アミラーゼ変異体に添加してよい。
１つの実施形態において、プロセスは初期ゼラチン化温度より低温において実施する。そのようなプロセスは頻繁には少なくとも３０℃、少なくとも３１℃、少なくとも３２℃、少なくとも３３℃、少なくとも３４３℃、少なくとも３５℃、少なくとも３６℃、少なくとも３７℃、少なくとも３８℃、少なくとも３９℃、少なくとも４０℃、少なくとも４１℃、少なくとも４２℃、少なくとも４３℃、少なくとも４４℃、少なくとも４５℃、少なくとも４６℃、少なくとも４７℃、少なくとも４８℃、少なくとも４９℃、少なくとも５０℃、少なくとも５１℃、少なくとも５２℃、少なくとも５３℃、少なくとも５４℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５７℃、少なくとも５８℃、少なくとも５９℃、又は少なくとも６０℃で実施される。プロセスを実施するｐＨは約３．０〜約７．０、約３．５〜約６．０、又は約４．０〜約５．０の範囲であってよい。１つの特徴は例えばエタノールを約３２℃、例えば３０℃〜３５℃の温度で製造するためのコウボを用いた発酵を含むプロセスを意図する。別の特徴においては、プロセスは例えば３０℃〜３５℃、例えば約３２℃の温度における、エタノールを製造するためのコウボを用いた、又は所望の有機化合物を製造するための別の適当な発酵生物を用いた、同時糖化及び発酵を含む。上記発酵プロセスにおいて、エタノール含有量は少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、又は少なくとも約１６％エタノールに達する。
上記特徴の何れかにおいて使用すべき澱粉スラリーは約２０％〜約５５％乾燥固体顆粒澱粉、約２５％〜約４０％乾燥固体顆粒澱粉、又は約３０％〜約３５％乾燥固体顆粒澱粉を有してよい。酵素変異体は少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の量で顆粒澱粉の可溶性澱粉加水分解物に可溶性澱粉を変換する。
別の実施形態において、例えば限定しないがジェットクッキングを包含するゼラチン化澱粉の液化又は糖化のためのプロセスにおいてα−アミラーゼ変異体を使用する。プロセスは発酵産物、例えばエタノールを生産するための発酵を含んでよい。発酵による澱粉含有材料からエタノールを生産するためのそのような方法は、（ｉ）α−アミラーゼ変異体を用いた澱粉含有材料の液化；（ｉｉ）得られた液化マッシュの糖化；及び（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた材料を発酵生物存在下に発酵すること、を含む。場合により、プロセスは更にエタノールの回収を含む。糖化及び発酵のプロセスは同時糖化及び発酵（ＳＳＦ）プロセスとして実施してよい。発酵の間、エタノール含有量は少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、又は少なくとも約１６％エタノールに達する。
上記特徴においてプロセシングされるべき澱粉は、塊茎、根、幹、莢、穀物、又は全粒から得てよい。より特定すれば、顆粒澱粉はトウモロコシ、トウモロコシの穂軸、コムギ、オオムギ、ライムギ、マイロ、サゴ、キャッサバ、タピオカ、ソルガム、コメ、エンドウマメ、インゲンマメ、バナナ、又はバレイショから得てよい。特に意図されるものはワックス状及び非ワックス状の両方の型のトウモロコシ及びオオムギである。
本明細書においては、「液化」又は「液化する」という用語は澱粉がより低粘稠性でより短鎖のデキストリンに変換されるプロセスを意味する。一般的に、このプロセスは澱粉のゼラチン化、及びそれと同時かそれに引き続いて行うα−アミラーゼ変異体の添加を包含する。追加的な液化誘導酵素もまた場合により添加してよい。本明細書においては、「一次液化」という用語はスラリー温度がそのゼラチン化温度又はその近傍まで上昇した時点における液化の工程を指す。温度上昇の後、スラリーは熱交換機又はジェットを経由して約９０〜１５０℃、例えば１００〜１１０℃の温度とされる。熱交換機又はジェット温度への適用の後、スラリーをその温度に３〜１０分間保持する。この９０〜１５０℃にスラリーを保持する工程は一次液化と称される。
本明細書においては、「二次液化」という用語は、スラリーを室温にまで冷却する一次液化（９０〜１５０℃に加熱）の後に行う液化工程を指す。この冷却工程は３０分〜１８０分、例えば９０分〜１２０分であることができる。本明細書においては、「二次液化の分数」とは二次液化の開始からデキストロース等量（ＤＥ）を測定する時間までに経過した時間を指す。
別の特徴はα−アミラーゼ変異体を含む組成物におけるβ−アミラーゼの追加的使用を意図している。β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）はエキソ作用性のマルトース生成性アミラーゼであり、１，４−α−グルコシド連結部からアミロース、アミロペクチン、及び関連のグルコース重合体への加水分解を触媒し、これによりマルトースを放出する。β−アミラーゼは種々の植物及び微生物から単離されている（Ｆｏｇａｒｔｙ等、ＰＲＯＧＲＥＳＳ ＩＮ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１１２−１１５，１９７９）。これらのβ−アミラーゼは４０℃〜６５℃の範囲の最適温度及び約４．５〜約７．０の範囲の最適ｐＨを有することを特徴としている。意図されるβ−アミラーゼは限定しないがオオムギ由来β−アミラーゼＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＢＢＡ１５００、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＤＢＡ、ＯｐｔｉｍａｌｔＴＭＭＥ、ＯｐｔｉｍａｌｔＴＭＢＢＡ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）；及びＮｏｖｏｚｙｍＴＭＷＢＡ（ＮｏｖｏｚｙｍｅｓＡ／Ｓ）を包含する。
組成物中の使用に関して意図される別の酵素はグルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）である。グルコアミラーゼは微生物又は植物から誘導される。例えば、グルコアミラーゼは真菌又は細菌起源であることができる。例示される細菌グルコアミラーゼはアスペルギルスグルコアミラーゼ、特にＡ・ニガーＧ１又はＧ２グルコアミラーゼ（Ｂｏｅｌ等（１９８４）、ＥＭＢＯＪ．３（５）：１０９７−１１０２）、又はその変異体、例えばＷＯ９２／００３８１及びＷＯ００／０４１３６に開示されているもの；Ａ・アワモリグルコアミラーゼ（ＷＯ８４／０２９２１）；Ａ・オリザエグルコアミラーゼ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１），５５（４）：９４１−９４９）、又はその変異体又はフラグメントである。
他の意図されるアスペルギルスグルコアミラーゼ変異体は、熱安定性：Ｇ１３７Ａ及びＧ１３９Ａ（Ｃｈｅｎ等（１９９６）、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：４９９−５０５）；Ｄ２５７Ｅ及びＤ２９３Ｅ／Ｑ（Ｃｈｅｎ等（１９９５）、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．８：５７５−５８２）；Ｎ１８２（Ｃｈｅｎ等（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０１：２７５−２８１）；ジスルフィド結合、Ａ２４６Ｃ（Ｆｉｅｒｏｂｅ等（１９９６）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：８６９８−８７０４）；及びＡ４３５ｏｙｏｂｉ Ａ４３６位へのＰｒｏ残基の導入（Ｌｉ等（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０：１１９９−１２０４）を増強する変異体を包含する。他の意図されるグルコアミラーゼはタラロマイセスグルコアミラーゼ、特にＴ・エメルソニ（ＷＯ９９／２８４４８）、Ｔ・レイセタヌス（米国特許ＲＥ３２，１５３）、Ｔ・デュポンチ又はＴ・サーモフィルス（米国特許４，５８７，２１５）から誘導されたものを包含する。意図される細菌グルコアミラーゼはクロストリジウム属、特にＣ・サーモアミロリチカム（ＥＰ１３５１３８）、及びＣ・サーモヒドロスルフリカム（ＷＯ８６／０１８３１）由来のグルコアミラーゼを包含する。適当なグルコアミラーゼはアスペルギルス・オリザエから誘導されたグルコアミラーゼ、例えばＷＯ００／０４１３６の配列番号２に示すアミノ酸配列に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は更には９０％の相同性を有するグルコアミラーゼを包含する。同様に適しているものは市販のグルコアミラーゼ、例えばＡＭＧ２００Ｌ；ＡＭＧ３００Ｌ；ＳＡＮＴＭＳＵＰＥＲ及びＡＭＧＴＭＥ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＯＰＴＩＤＥＸ（登録商標）３００（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）；ＡＭＩＧＡＳＥＴＭ及びＡＭＩＧＡＳＥＴＭＰＬＵＳ（ＤＳＭより）；Ｇ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９００（Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏ−Ｓｙｓｔｅｍ）；及びＧ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９００ＺＲ（Ａ・ニガーグルコアミラーゼ及び低プロテアーゼ含有量）である。グルコアミラーゼは０．０２〜２．０ＡＵＧ／ｇＤＳ又は０．１〜１．０ＡＵＧ／ｇＤＳ、例えば０．２ＡＵＧ／ｇＤＳの量で添加してよい。
別の酵素変異体を組成物中に包含させることができる。２つ以上のα−アミラーゼ変異体を単独又は本明細書に記載する他の酵素と組み合わせて使用できる。例えば、第３の酵素は別のα−アミラーゼ、例えばコウボα−アミラーゼ、又は別のα−アミラーゼ変異体であってよい。これらはバチルスα−アミラーゼ又は非バチルスα−アミラーゼであることができる。
場合により添加できる別の酵素は、脱分枝酵素、例えばイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）又はプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）である。イソアミラーゼはアミロペクチン及びβ−限界デキストリンにおけるα−１，６−Ｄ−グルコシドの分枝連結部を加水分解し、そしてイソアミラーゼはプルランを攻撃できないことにより、そして、α−限界デキストリンに対してイソアミラーゼは限定された作用を有することにより、プルラナーゼとは区別できる。脱分枝酵素は当該分野で良く知られている有効量において添加してよい。
プロセスの生成物の厳密な組成は適用する酵素の組み合わせ、ならびにプロセシングされる顆粒澱粉の型に応じたものとなる。可溶性加水分解物は純度が少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５．０％、少なくとも約９５．５％、少なくとも約９６．０％、少なくとも約９６．５％、少なくとも約９７．０％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８．０％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９．０％、又は少なくとも約９９．５％のマルトースであってよい。或いは、可溶性澱粉加水分解物はグルコースであるか、又は澱粉加水分解物は少なくとも約９４．５％、少なくとも約９５．０％、少なくとも約９５．５％、少なくとも約９６．０％、少なくとも約９６．５％、少なくとも約９７．０％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８．０％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９．０％、又は少なくとも約９９．５％のＤＥ（総可溶化乾燥固体のグルコースパーセント）を有する。１つの実施形態において、アイスクリーム、ケーキ、キャンディー、フルーツ缶を製造するプロセスはグルコース、マルトース、ＤＰ３及びＤＰｎの混合物を含有する専用シロップを使用する。
２つの粉砕プロセス、即ち湿式及び乾式粉砕が適している。乾燥粉砕においては、全種子仁を粉砕して使用する。湿式粉砕は胚芽と穀粉（澱粉顆粒及び蛋白）の良好な分離をもたらし、そして通常は、澱粉加水分解物がシロップの製造において使用される場合に使用される。乾式及び湿式粉砕の両方とも澱粉プロセシングの分野で良く知られており、そして本明細書に開示した組成物及び方法と共に使用することを意図している。プロセスは限外濾過系において実施してよく、その場合、保持物質は酵素、生澱粉及び水の存在下の再循環下に保持され、透過物は可溶性澱粉加水分解物となる。別の方法は限外濾過膜を有する連続膜反応器において実施されるプロセスであり、その場合、保持物質は酵素、生澱粉及び水の存在下の再循環下に保持され、透過物は可溶性澱粉加水分解物となる。同様に意図されるものは、マイクロ濾過膜を有する連続膜反応器において実施されるプロセスであり、その場合、保持物質は酵素、生澱粉及び水の存在下の再循環下に保持され、透過物は可溶性澱粉加水分解物となる。
１つの点において、本発明の可溶性澱粉加水分解物は高フラクトース澱粉系シロップ（ＨＦＳＳ）、例えば高フラクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）への変換に付される。この変換はグルコースイソメラーゼ、特に固相に固定化されたグルコースイソメラーゼを用いて達成できる。意図されるイソメラーゼは市販品Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）、ＩＴ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ Ａ／Ｓ）；Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）ＩＭＧＩ、及びＧ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３、」
Ｋｅｔｏｍａｘ（登録商標）ＩＧＩ、Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３、Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３液体、及びＧｅｎＳｗｅｅｔ（登録商標）を包含する。
別の特徴において、製造された可溶性澱粉加水分解物は燃料又はポータブルエタノールの製造を可能にする。第３の特徴のプロセスにおいて、発酵は顆粒澱粉スラリーの加水分解と同時又は別個／逐次的に実施してよい。発酵を加水分解と同時に実施する場合は、温度は３０℃〜３５℃、特に３１℃〜３４℃であることができる。プロセスは限外濾過系において実施してよく、その場合、保持物質は酵素、生澱粉、コウボ、コウボ栄養物、及び水の存在下の再循環下に保持され、透過物はエタノール含有液体となる。同様に意図されるものは限外濾過膜を有する連続膜反応器において実施されるプロセスであり、その場合、保持物質は酵素、生澱粉、コウボ、コウボ栄養物、及び水の存在下の再循環下に保持され、透過物はエタノール含有液体となる。
プロセスの可溶性澱粉加水分解物はまた処理された澱粉を発酵して発酵生成物、例えばクエン酸、グルタミン酸１ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタラクトン、又はエリソルビン酸ナトリウムとすることを含む発酵生成物の製造のために使用してよい。
α−アミラーゼ変異体のアミロース分解活性は基質としてバレイショ澱粉を用いながら測定してよい。この方法は酵素による修飾されたバレイショ澱粉の分解に基づいており、そして反応の後にヨウ素溶液に澱粉／酵素溶液の試料を混合する。まず黒色味を帯びた青色が生じるが、澱粉の分解の間に青色は弱まり、そして徐々に赤色味を帯びた茶色に変わり、これを着色ガラス標準品と比較する。
エタノール製造
ＰＳ４変異体ポリペプチドは一般的に澱粉を糖に変換するために使用してよく、そしてこれが次にプロセシングされることによりエタノール又は他の付加価値を有する生成物、例えば高フラクトースコーン甘味料となることができる。即ち、本発明者等はエタノール及び特に本明細書においてはバイオマス発酵により生産される何れかのエタノールとみなされるバイオエタノールの製造におけるＰＳ４変異体ポリペプチドの使用を開示する。
このようにして製造されたエタノールは燃料又は飲料として使用してよく、又は、有機化合物、例えばクエン酸、アスコルビン酸、リジン、グルタミン酸を製造するための発酵プロセスにおいて使用してよい。これらは以下により詳細に説明する。
エタノール（即ちエチルアルコール）はスピリッツ、ビール、及びワインのようなアルコール飲料の基礎として最も良く知られたものである。更に又、エタノールは工業用化成品、医薬品の製造において、そして輸送用燃料として多くの用途を有する。
エタノールは糖又は炭水化物を含有するほぼ如何なる生原料からも製造できる。即ち、エタノールは広範な種類の生物学的材料から製造できる。エタノールの製造のために使用されるバイオマス供給原料の３種の主要な型は糖作物、例えばサトウキビ；澱粉作物、例えばコムギ及びトウモロコシ、及びセルロース性材料、例えば作物残渣（藁等）、及び森林廃棄物を包含する。セルロースの容易に入手できる原料からのエタノールの製造は安定で継続使用可能な燃料源を与える。
最も頻繁に使用されているプロセシング技術は乾燥穀粒粉砕である。このプロセスにおいては、穀粒を先ず粉砕して穀粒穀粉コンシステンシーとする。次に穀粉を水及びアミラーゼと混合し、そしてクッカーを通過させ、そこで穀粒内の澱粉を液化する。グルコアミラーゼの添加下において、液化した澱粉は発酵可能な糖に変換される。次に酵母をマッシュに添加することにより糖を発酵してエタノールとする。発酵の後、マッシュを蒸留及び脱水プロセスを通過させ、そこでアルコールを固体及び水から分離する。実際は穀粒の各トンの約３分の２が燃料エタノールに変換される。残余の副生成物、即ち希薄な蒸留物及び湿潤した蒸留穀粒は、高蛋白の家畜用飼料であり、これは特にウシ又はヒツジのような動物に最適である。
エタノールは又、セルロース含有原料、例えば木材パルプから製造してよい。セルロース系供給原料は農業廃棄物、雑草、及び木材及び他の低価値のバイオマス、例えば自治体ゴミ（例えばリサイクル用紙、草刈ゴミ）を包含する。エタノールはこれらのセルロース性の供給原料の何れかの発酵により製造してよい。しかしながら、セルロースはエタノールに変換される前にセルラーゼのような適当な酵素による処理により先ず糖に変換されなければならない。
エタノールがプロセシングプラントを離れた後は、それは理論的にはそれ自体自動車燃料として使用でき、或いはそれは８５対１５の比でガソリンと混合することにより「」と称されるものを形成できる。しかしながら、最も一般的には、エタノールは７〜１０体積％の濃度でガソリンとブレンドされる。エタノールはオクタン増強剤として使用してよい。燃料原料としてのエタノールは石油誘導製品よりも環境重視型である。エタノールの使用は空気の質を向上させ、そして恐らくは地域のオゾンレベル及びスモッグを低減することが知られている。更に又、ガソリンの代わりとしてエタノールを利用することは継続使用不可能なエネルギー及び石油化学品の供給における急激な変化の影響を緩衝する場合において戦略的な重要性を有することができる。
醸造用途
エタノール（即ちエチルアルコール）はスピリッツ、ビール、及びワインのようなアルコール飲料の基礎として最も良く知られたものである。即ち、本明細書に記載したＰＳ４変異体ポリペプチドは醸造、特にビール醸造において使用してよい。全てのビールは単純な様式に基づいたプロセスを用いて醸造されている。
醸造プロセスは麦芽穀粒を使用し、これは地域に応じて伝統的にはオオムギ、コムギ、又は場合によりライムギである場合がある。麦芽は穀粒を発芽させ、その後、かまで乾燥させ、場合により焙焼することにより作成される。発芽のプロセスは多くの酵素、注目すべきはα−アミラーゼ及びβ−アミラーゼを生成し、これは粒内の澱粉を糖に変換するために使用されることになる。焙焼の程度に応じて、麦芽は暗色化し、ビールの色及びフレーバーに強力に影響することになる。
麦芽を粉砕して穀粒の種子仁を分解し、その表面積を増大させ、そして種皮からより細かい小片を分離する。得られた粗挽粉を「マッシング」として知られたプロセス用の「マッシュタン」と称されるバット中で熱水と混合する。このプロセスの間、麦芽内部の天然の酵素が澱粉の大部分を分解して糖とし、これが発酵プロセスにおける重要な役割を果たす。マッシングは通常は１〜２時間を要し、そしてこの時間の間、種々の温度レスト（待機時間）が使用麦芽の型、その変性レベル、及び醸造マスターに応じて異なる種々の酵素を活性化する。これらの酵素の活性は穀粒の澱粉をデキストリンに、そして次にマルトースのような発酵可能な糖に変換する。マッシュタンは一般的にスロットを有する「疑似底部」又は他の形態のマニホールドを含んでおり、これがストレイナーとして機能することにより穀粒からの液体の分離を可能とする。
１２０°Ｆ〜１３０°Ｆ（４９℃〜５５℃）のマッシュレストは種々のプロテイナーゼを活性化し、これが、別様にはビールを白濁化させる原因となる蛋白を分解する。しかしながらビール泡も同様に主に蛋白を含んでおり蛋白のレストが過剰であれば泡を維持できないビールとなってしまうため、注意が必要である。このレストは一般的には、ドイツ及びチェコでは人気が低下している過少変性（即ち過少発芽）の麦芽、又は北米のビールにおいて広範に使用されているトウモロコシやコメのような非麦芽穀粒のみを用いて使用される。６０℃又は１４０°Ｆにおけるマッシュレストはベータ−グルカナーゼを活性化し、これがマッシュ内のガム質のベータ−グルカンを分解し、プロセスの後期においてより円滑に糖が流出するようにする。近代的なマッシングプロセスにおいては市販の真菌系のベータ−グルカナーゼを補給物として添加してよい。最終的に、１４９〜１６０°Ｆ（６５〜７１℃）のマッシュレスト温度を用いて麦芽中の澱粉を変換して糖とし、次にこれが醸造プロセスの後期においてコウボにより使用されることになる。後者のレストを範囲の下端で行うことにより、コウボによる発酵性がより高い低次の糖が生産される。そしてこれが次に低ボディ感、高アルコールのビールを生成する。範囲の上端により近接するレストはコウボによる発酵性がより低い高次の糖を生産し、そのためよりフルボディの低アルコールのビールが生じる。
マッシングの後、得られた液体をロイタリングとして知られているプロセスにおいて穀粒から分離する。ロイタリングの前に、マッシュ温度を１６５°Ｆ〜１７０°Ｆ（約７５℃）まで上昇させること（マッシュアウトとして知られている）により酵素を不活性化してよい。追加の水を穀粒に散布することにより追加的に糖分を抽出してよい（スパージングとして知られたプロセス）。
この時点において液体は麦芽汁として知られている。麦芽汁を「コッパー」又はケトルとして知られているより大型のタンクに移動し、そこでホップ及び場合により他の成分、例えばハーブ又は糖類と共に煮沸する。煮沸プロセスは酵素的プロセスを終了させ、蛋白を沈殿させ、ホップ樹脂を異性体化し、麦芽汁を濃縮して滅菌する作用を有する。ホップは風味、芳香、及び苦味をビールに与える。煮沸終了時に「ホイールプール」と称される容器内でホップ添加麦芽汁を沈降させて清澄化し、そして次に清澄化した麦芽汁を冷却する。
次に麦芽汁を取り出して「発酵容器」内に入れ、そこでコウボを添加するか、それと共に「ピッチ」する。コウボは麦芽由来の糖類を、解糖系と称されるプロセスを通じてアルコール、二酸化炭素及び他の成分に変換する。１〜３週間の後、新鮮（又は「グリーンな」）ビールをコンディショニングタンク内に流出させる。１週間〜数ヶ月間コンディショニングした後、ビールを濾過してコウボ及び粒状物質を除去することが頻繁である。次に「ブライトなビール」は提供又はパッケージ可能となる。
従って本明細書に記載するＰＳ４変異体ポリペプチドの１つ以上を醸造プロセスのいずれかの段階において添加することにより天然に生じたアミラーゼ活性を補給してよい。
飼料用途
１つの実施形態において、ＰＳ４変異体ポリペプチドは抵抗性の澱粉を分解することができる。
本明細書においては、「分解する」という用語はグルコース及び／又はオリゴ糖、例えばマルトース及び／又はデキストリンへの抵抗性澱粉の部分的又は完全な加水分解又は分解に関する。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは動物性のアミラーゼにより完全には分解されていない残留抵抗性澱粉を分解する場合がある。例示すれば、ＰＳ４変異体ポリペプチドは抵抗性澱粉の分解を向上させる場合に動物性アミラーゼ（例えば膵臓アミラーゼ）を支援するために使用してよい。膵臓α−アミラーゼは動物により消化系において分泌される。膵臓α−アミラーゼは飼料中の澱粉を分解する。しかしながら、澱粉の一部分である抵抗性澱粉は膵臓α−アミラーゼにより完全には分解されず、従って、小腸において吸収されない（抵抗性澱粉の定義参照）。一部の実施形態においてはＰＳ４変異体ポリペプチドは消化系における澱粉の分解において膵臓α−アミラーゼを支援することができ、これにより動物による澱粉の利用を増大させる。
酵素が抵抗性澱粉を分解する能力は、例えば試料中の抵抗性澱粉、可溶化澱粉、及び全澱粉含有量の測定に関するＭｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｔｄ．により開発され、開示されている方法により分析してよい（Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｒｃｈ Ａｓｓａｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ＡＯＡＣ Ｍｅｔｈｏｄ ２００２．０２，ＡＡＣＣ Ｍｅｔｈｏｄ ３２−４０）。
従って、ＰＳ４変異体ポリペプチドは有利な目的のために動物により摂取されてよく、そしてこのため、動物飼料に配合してよい。
従って本発明者等は、澱粉を含む飼料における使用のため、又は飼料向上組成物中における使用のための成分としてのＰＳ４変異体ポリペプチドの使用を開示し、ここではＰＳ４変異体ポリペプチドが抵抗性澱粉を分解することができる。本発明者等は又、澱粉及びＰＳ４変異体ポリペプチドを含む飼料を開示する。本発明者等は更に、ＰＳ４変異体ポリペプチドに該抵抗性澱粉を接触させることを含む飼料における抵抗性澱粉を分解する方法を開示する。
本発明者等は更に、抵抗性澱粉を分解するための、澱粉を含む飼料の製造におけるＰＳ４変異体ポリペプチドの使用を記載する。更に又、本発明者等は該飼料のカロリー値を向上させるための飼料製造におけるＰＳ４変異体ポリペプチドの使用を開示する。本発明者等は動物の性能を向上させるための飼料の製造における酵素の使用を開示する。別の実施形態においては、本発明者等は澱粉及びＰＳ４変異体ポリペプチド酵素を添加混合することを含む飼料の製造のためのプロセスを記載する。
例示すれば、ＰＳ４変異体ポリペプチドを含み、そして抵抗性澱粉を分解することができる成分は、動物における澱粉及び／又は澱粉分解生成物の分解を顕著に増大させるため、有利である。更に又、そのような使用は、動物による澱粉及び／又は澱粉分解生成物の消化性を顕著に増大させるため、有利である。更に又、そのような使用は動物により飼料からのエネルギーを誘導する効率を増強する手段を提供するため、有利である。更に又、そのような使用は抵抗性澱粉の生体利用性を増強する手段を提供するため、有利である。
動物飼料
ＰＳ４変異体ポリペプチドが使用に適する動物飼料は特定の動物群の特定の必要性に合致するように、そして動物により代謝されることができる形態において必要な炭水化物、脂肪、蛋白及び他の栄養を定容するように、製剤してよい。
好ましくは、動物飼料はブタ又は家禽用の飼料である。
本明細書においては、「ブタ」という用語は豚、虚勢豚、又は未虚勢豚のような非反芻動物の雑食動物を指す。典型的には、ブタ飼料は約５０パーセントの炭水化物、約２０パーセントの蛋白及び約５％の脂肪を含む。高エネルギーブタ飼料の例は、飼料補給物、例えば蛋白、ミネラル、ビタミン及びアミノ酸、例えばリジン及びトリプトファンと組み合わせられている場合が多いトウモロコシ系のものである。ブタ飼料の例は動物蛋白製品、水産品、乳製品、穀粒製品、及び植物蛋白製品を包含し、これら全ては更に天然フレーバー、人工フレーバー、マイクロ及びマクロのミネラル、動物性脂肪、植物性脂肪、ビタミン、保存料、又は医薬品、例えば抗生物質を含んでよい。
当然ながら、「ブタ飼料」と本明細書及び添付請求項において言及する場合は、そのような言及は、「過渡的」又は「スターター」の飼料（幼弱豚の離乳に使用）及び「フィニッシング」又は「生育用」（販売に適する齢及び／又は体格までの豚の飼育のために過渡的段階の後に使用）の飼料を包含する意味を有する。
本明細書においては、「家禽」という用語はニワトリ、ブロイラー、雌鶏、ルースター、虚勢雄鶏、シチメンチョウ、アヒル、闘鶏用シャモ、若雌鶏又は雛鳥のような鳥獣に関する。家禽用飼料は、それらが蛋白、エネルギー、ビタミン、ミネラル、及び、鳥類の適正な生育、産卵、及び健康状態のために必要な他の栄養分の全てを含有することから「完全」飼料と称される場合がある。しかしながら、家禽用飼料は更にビタミン、ミネラル又は医薬品、例えばコクシジウム抑制剤（例えばモネンシンナトリウム、ラサロシド、アムプロリウム、サリノマイシン、及びスルファキノキサリン）及び／又は抗生物質（例えばペニシリン、バシトラシン、クロルテトラサイクリン、及びオキシテトラサイクリン）を含んでよい。
畜肉生産のために飼育されている幼弱なニワトリ及びブロイラー、シチメンチョウ及びアヒルは産卵のために温存されている若雌鶏とは異なって給餌される。ブロイラー、アヒル及びシチメンチョウはより大型の体格を有し、そして産卵型のニワトリよりも急速に体重が増加する。従って、これらの鳥類はより高値の蛋白及びエネルギーレベルを有する飼料で給餌される。
当然ながら、「家禽用飼料」と本明細書及び添付請求項において言及する場合は、そのような言及は、「スターター」の飼料（孵化後）、「フィニッシャー」、「生育用」又は「発達用」の飼料（６〜８週齢から屠殺体格に到達するまで）及び「産卵用」飼料（産卵時に給餌）を包含する意味を有する。
動物飼料は例えば畜肉生産、乳汁生産、卵生産、繁殖及びストレスへの応答の観点から動物の栄養要求性に合致するように処方してよい。更に又、飼料は肥料用排泄物の品質を向上させるために処方される。
好ましい特徴において、動物用飼料は生原料、例えば豆類、例えばエンドウマメ又はダイズ、又は穀物、例えばコムギ、コーン（トウモロコシ）、ライムギ又はオオムギを含有する。生原料はバレイショであることも適当である。
家畜飼料
ＰＳ４変異体ポリペプチドは単独又は他の成分、例えば食料成分と組み合わせてＰＳ４変異体ポリペプチドを直接又は間接的に適用することによる動物消費のための飼料中で使用してよい。
典型的な食料成分は何れかの１つ以上の添加物、例えば動物性又は植物性の脂肪、天然又は合成の調味料、抗生物質、粘度調整剤、エッセンシャルオイル及び／又はフレーバー、染料及び／又は着色料、ビタミン、ミネラル、天然及び／又は非天然のアミノ酸、栄養物、追加的控訴（例えば遺伝子操作された酵素）、結合剤、例えばグアガム又はキサンタンガム、緩衝物質、乳化剤、潤滑剤、補助剤、懸濁剤、保存料、コーティング剤、又は可溶化剤等を包含してよい。
適用方法の例は、限定しないが、ＰＳ４変異体ポリペプチドを含む材料中で飼料をコーティングすること、飼料にＰＳ４変異体ポリペプチドを混合することによる直接の適用。ＰＳ４変異体ポリペプチドを飼料表面に噴霧するか、又は飼料をＰＳ４変異体ポリペプチド調製品に浸積することを包含する。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは好ましくはそれを飼料と混合することによるか、又は、動物消費用の飼料粒子上に噴霧することにより適用される。或いは、ＰＳ４変異体ポリペプチドは飼料の乳液又は固体製品の内部に、注入又はタンブリングにより包含させてよい。
ＰＳ４変異体ポリペプチドは飼料を点在させるため、コーティングするため、及び／又は含浸するために適用してよい。他の成分との混合物も又使用してよく、そして別個に、同時に、又は逐次的に適用してよい。キレート剤、結合剤、乳化剤及び他の添加物、例えばマイクロ及びマクロのミネラル、アミノ酸、ビタミン、動物性脂肪、植物性脂肪、保存料、フレーバー、着色料も同様に飼料に同時に（混合物として又は別個に）適用、又は逐次的に適用してよい。
ＰＳ４変異体ポリペプチドの量
使用すべきＰＳ４変異体ポリペプチドの最適な量は処理すべき飼料及び／又はＰＳ４変異体ポリペプチドに飼料を接触させる方法、及び／又はこれらの意図される用途により変動することになる。ＰＳ４変異体ポリペプチドの量は飼料の摂取後、及び摂取中の抵抗性澱粉を実質的に分解するために有効な十分な量でなければならない。
好都合には、ＰＳ４変異体ポリペプチドは、動物消費用の飼料の摂取の後、そして飼料の消化の間、飼料のより完全な消化が達成されるまで、即ち飼料の増大したカロリー値が放出されるまで有効であり続ける。
アミラーゼ複合物
本発明者等はアミラーゼ、特にマルトース生成性アミラーゼとのＰＳ４変異体ポリペプチドの特定の複合物を開示する。マルトース生成性アルファ−アミラーゼ（グルカン１，４−マルトヒドロラーゼ、ＥＣ．３．２．１．１３３）はアミロース及びアミロペクチンを加水分解してアルファ配置のマルトースにする。
バチルス由来のマルトース生成性アルファ−アミラーゼ（ＥＰ１２０６９３）はノバミル（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の商品目の下に市販されており、そして澱粉の逆行を低減するその能力のために、抗劣化剤としてベーキング産業において広範に使用されている。ノバミルは国際特許公開ＷＯ９１／０４６６９において詳細に説明されている。マルトース生成性アルファ−アミラーゼノバミルはシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）と幾つかの特徴、例えば配列相同性（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ，Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１６，６９５−６９６（１９９６））及びトランスグリコシル化産物の形成（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｅｎ，Ｃ．等、１９９７、Ｓｔａｒｃｈ，ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．１，３９−４５）を共有している。
高度に好ましい実施形態においては、本発明者等はノバミル又は何れかのその変異体と共にＰＳ４変異体ポリペプチドを含む複合物を開示する。そのような複合物はベーキングのような食品製造のために有用である。ノバミルは特にノバミル１５００ＭＧを含んでよい。
ノバミル及びその使用を記載している他の文献は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｅｎ，Ｃ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｔ．，（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｔｏｓｅ ａｎ ａ ｌｉｍｉｔ ｄｅｘｔｒｉｎ， ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ， ｄｅｘｔｒｉｎ， ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｄｅｘｔｒｉｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ及びＷＯ９１／１０６２７を包含する。これは又米国特許４，５９８，０４８及び４，６０４，３５５に記載されている。これらの文献の各は参照により本明細書に組み込まれ、そしてそこに記載されているノバミルポリペプチドは本明細書に記載するＰＳ４変異体ポリペプチドの何れかと組み合わせて使用してよい。
ノバミルの変異体、相同体、及び突然変異体は、それらがアルファアミラーゼ活性を保有していれば複合物のために使用してよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許６，１６２，６２８に開示されているノバミル変異体の何れかを本明細書に記載するＰＳ４変異体ポリペプチドと組み合わせて使用してよい。特に、その文献に記載されているポリペプチドのいずれか、特記すれば下記：
Figure 0005448812
 に相当する位置の何れか１つ以上における米国特許６，１６２，６２８の配列番号１の変異体を使用してよい。
アミノ酸配列
本発明はＰＳ４変異体ポリペプチドの使用を行い、そしてそのようなＰＳ４変異体核酸のアミノ酸配列は本明細書に記載する方法及び組成物により包含される。
本明細書においては、「アミノ酸配列」という用語は「ポリペプチド」という用語及び／又は「蛋白」という用語と同義である。一部の場合において、「アミノ酸配列」という用語は「ペプチド」という用語と同義である。一部の場合において「アミノ酸配列」という用語は「酵素」という用語と同義である。
アミノ酸配列は適当な原料から製造／単離してよく、或いはそれは合成により製造してよく、或いはそれは組み換えＤＮＡ手法を用いて製造してよい。
本明細書に記載したＰＳ４変異体酵素は他の酵素と組み合わせて使用してよい。即ち本発明者等は酵素の複合物を開示し、その場合複合物は本明細書に記載するＰＳ４変異体ポリペプチド酵素、及び自体別のＰＳ４変異体ポリペプチド酵素であってよい他の酵素を含む。
ＰＳ４変異体ヌクレオチド配列
上記した通り、本発明者等は記載した特定の性質を有するＰＳ４変異体酵素をコードするヌクレオチド配列を開示する。
「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」という用語は本明細書においてはオリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、及びその変異体、相同体、フラグメント及び誘導体（例えばその部分）を指す。ヌクレオチド配列はゲノム又は合成又は組み換えを起源とするものであってよく、これは２本鎖又は１本鎖であってよく、センス又はアンチセンスの鎖を示す。
「ヌクレオチド配列」という用語は本明細書においては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡを包含する。好ましくは、それはＤＮＡ、より好ましくはＰＳ４変異体ポリペプチドに関してコーディングしているｃＤＮＡ配列を意味する。
典型的にはＰＳ４変異体ヌクレオチド配列は組み換えＤＮＡ手法（即ち組み換えＤＮＡ）を用いて製造する。しかしながら代替の実施形態においては、ヌクレオチド配列は当該分野で良く知られている化学的方法を用いて全体又は部分的に合成される（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ等、（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２１５−２３及びＨｏｒｎ Ｔ等、（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ２２５−２３２）。
核酸配列の製造
本明細書に記載した特定の性質を有する何れかの酵素（例えばＰＳ４変異体ポリペプチド）、又は修飾に適する酵素、例えば親酵素をコードするヌクレオチド配列は、そのような酵素を生産する何れかの細胞又は生物から発見、及び／又は単離、及び／又は精製してよい。ヌクレオチド配列の発見、及び／又は単離、及び／又は精製のための種々の方法が当該分野で良く知られている。例示すれば、適当な配列が発見、及び／又は単離、及び／又は精製された後に、配列などを製造するためのＰＣＲ増幅手法を使用してよい。
更に例示すれば、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリを、酵素産生生物由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築してよい。酵素のアミノ酸配列又は酵素のアミノ酸配列の一部分が既知である場合、標識したオリゴヌクレオチドプローブを合成して使用することにより、生物から製造したゲノムライブラリに由来する酵素をコードするクローンを発見してよい。或いは、別の既知酵素に相同な配列を含有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて酵素をコードするクローンを発見してよい。後者の場合は、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件を使用する。
或いは、酵素をコードするクローンは、プラスミドのような発現ベクター内にゲノムＤＮＡのフラグメントを挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリで酵素陰性細菌を形質転換し、そして次に形質転換された細菌を酵素に対する基質（即ちマルトース）を含有する寒天プレート上にプレーティングし、これにより酵素を発現しているクローンを発見できるようにすることにより、発見する。
更に別の代替においては、酵素をコードするヌクレオチド配列を確立された標準的方法、例えばＢｅｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．等、（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２．ｐ１８５９−１８６９により記載されたホスホロアミダイト法、又は、Ｍａｔｔｈｅｓ等、（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３，ｐ８０１−８０５により記載された方法により合成製造してよい。ホスホロアミダイト法においては、オリゴヌクレオチドを例えば自動ＤＮＡ合成装置において合成し、精製し、アニーリングし、そして適切なベクターにクローニングする。
ヌクレオチド配列は、標準的な手法に従って合成、ゲノム、又はｃＤＮＡ起源（適宜）のフラグメントをライゲーションすることにより製造された、ゲノムと合成の混合型の起源、合成とｃＤＮＡの混合型の起源、又はゲノムとｃＤＮＡの混合型の起源であってよい。各々のライゲーションされたフラグメントは全ヌクレオチド配列の種々の部分に相当する。ＤＮＡ配列は又、例えば米国特許４，６８３，２０２又はＳａｉｋｉ Ｒ Ｋ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐｐ４８７−４９１）に記載の通り、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により製造してよい。
変異体／相同体／誘導体
本発明者等は更に、ＰＳ４変異体ポリペプチド又はＰＳ４変異体核酸のような、酵素の何れかのアミノ酸配列の変異体、相同体、及び誘導体、又は、そのような酵素をコードする何れかの核酸配列の使用を記載する。文脈により別様に指定されない限り、「ＰＳ４変異体核酸」という用語は後述する核酸の実体の各々を包含するように解釈すべきであり、そして「ＰＳ４変異体ポリペプチド」という用語も同様に後述するポリペプチド又はアミノ酸の実体の各々を包含するように解釈すべきである。
ここでは、「相同体」という用語は要件アミノ酸配列及び要件ヌクレオチド配列と特定の相同性を有する実体を意味する。ここでは、「相同性」という用語は「同一性」と等しいものであることができる。
本明細書の文脈において、相同な配列とは要件配列に対して少なくとも７５、８０、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％同一であってよいアミノ酸配列を包含するものとしてとらえる。典型的には、相同体は要件アミノ酸配列と同じ活性部位などを含むことになる。相同性は又同様性（即ち同様な化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の点から考えることができるが、本明細書の文脈においては相同性は配列同一性の点において表現することが好ましい。
本明細書の文脈において、相同な配列とはＰＳ４変異体ポリペプチド酵素（例えばＰＳ４変異体核酸）をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも７５、８０、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％同一であってよいヌクレオチド配列を包含するものとしてとらえる。典型的には、相同体は要件配列と同じ活性部位等に対してコードする配列を含むことになる。相同性は又同様性（即ち同様な化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の点から考えることができるが、本明細書の文脈においては相同性は配列同一性の点において表現することが好ましい。
相同性比較は目視により行うことができ、又はより通常では容易に入手できる配列比較プログラムを用いて実施できる。これらの市販のコンピュータープログラムは２つ以上の配列の間の％相同性を計算することができる。
％相同性は隣接する配列に渡って計算してよく、即ち１つの配列をもう１つの配列とアラインし、そして１つの配列における各アミノ酸をもう１つの配列における相当するアミノ酸と、一回に１残基ずつ直接比較する。これを「ギャップ無し」アライメントと称する。典型的には、このようなギャップ無しアライメントは比較的少数の残基に渡ってのみ行われる。
これは極めて簡素で一貫した方法であるが、例えば他の面では同一である配列対において、１つの挿入又は欠失がその後のアミノ酸残基をアライメントから外すことになり、即ち、全般的なアライメントを実施した場合に％相同性の大きな低下をもたらす可能性がある。その結果、大部分の配列比較方法は全体的な相同性の評点に不当なペナルティーを科すことなく、可能な挿入及び欠失を考慮した最適なアライメントがなされるように設計されている。これは配列アライメントに「ギャップ」を挿入して局所的相同性を最大限とする試みにより達成される。
しかしながら、これらのより複雑な方法はアライメント内に生じる各ギャップに対して「ギャップペナルティー」を割り付けることにより、同数の同一アミノ酸の場合にギャップが可能な限り小さい配列アライメント、即ち２つの比較される配列の間のより高い関連性を反映しているものが、ギャップを多くもつものよりも高値の評点を達成することになる。ギャップの存在に対して相対的に高いコストを、そしてギャップ内の各後続残基に対してより小さいペナルティーを科す「アフターギャップコスト」を典型的には使用する。これは最も一般的に使用されているギャップ採点システムである。高いギャップペナルティーは当然ながらより少ないギャップで最適化されたアライメントをもたらすことになる。大部分のアライメントプログラムはギャップペナルティーを変更できるようにしている。しかしながら、配列比較にそのようなソフトウエアを使用する場合はデフォルト値の使用が好ましい。例えばＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合は、アミノ酸配列に対するデフォルトギャップペナルティーは１ギャップにつき−１２、そして各エクステンションにつき−４である。
従って最大％相同性の計算は第１にギャップペナルティーを考慮した最適アライメントの作成を必要とする。そのようなアライメントを実施するために適しているコンピュータープログラムはＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ等、１９８４、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ｐ３８７）。配列比較を実施できる他のソフトウエアの例は、限定しないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈＥｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ１８）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳセットを包含する。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは両方ともオフライン及びオンライン検索により入手できる（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９９９、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．７−５８〜７−６０参照）。
しかしながら、一部の用途においては、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ２シーケンスと称される新しいツールもまた蛋白及びヌクレオチドの配列を比較するために使用できる（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７７（１）：１８７−８及びｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
最終％相同性は同一性の観点において測定できるが、アライメントのプロセス自体は典型的にはオールオアナッシングの対比較には基づいていない。むしろ、化学的同様性又は進化上の距離に基づいて各対比較に評点を割り付ける尺度付けされた同様性の評点のマトリックスを一般的には使用する。一般的に使用されているそのようなマトリックスの例はＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、即ちプログラムのＢＬＡＳＴセットに対するデフォルトマトリックスである。ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは一般的にはパブリックのデフォルト値、又はカスタムシンボル比較テーブルが供給される場合はそれの何れかを使用する（詳細はユーザーマニュアル参照）。一部の用途においては、ＧＣＧパッケージのためのパブリックデフォルト値を、或いは、別のソフトウエアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。
或いは、パーセント相同性はＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ＆Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ７３（１），２３７−２４４）と類似のアルゴリズムに基づいたＤＮＡＳＩＳＴＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における多重アライメント特徴を用いて計算してよい。
ソフトウエアが最適アライメントを与えた後、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能になる。ソフトウエアは典型的にはこれを配列比較の一部として実行し、そして数値結果を発生させる。
配列は又、サイレントな変化をもたらし、機能的には等価な物質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有してもよい。意図的なアミノ酸置換をアミノ酸特性における同様性（例えば残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の特徴）に基づいて行ってよく、従って、官能基においてアミノ酸を分類することが有用である。アミノ酸はその側鎖のみの特性に基づいて分類できる。しかしながら、突然変異のデータも包含させることがより有用である。このようにして誘導されたアミノ酸のセットは構造的な理由から保存されていると考えられる。これらのセットはベン図の形態で記載されている（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ Ｇ．Ｊ．（１９９３）“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．（１９８６）“Ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｃｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）。保存的置換は例えば一般的に受け入れられているアミノ酸のベン図分類を示す下記表：
Figure 0005448812
 に従って行ってよい。
本発明者等は更に、生じてよい相同置換（置換と置き換えは両方とも本明細書においては既存のアミノ酸残基の代替残基との相互交換を意味する）、即ち同類対同類の置換、例えば、塩基性対塩基性、酸性対酸性、極性対極性等を含む配列を開示する。非相同置換、即ちあるクラスの残基から別のものへ、或いは非天然のアミノ酸、例えばオルニチン（本明細書においてはＺと記載）、ジアミノ酪酸オルニチン（本明細書においてはＢと記載）、ノルロイシンオルニチン（本明細書においてはＯと記載）、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンが関与してくるものも起こってよい。
変異体アミノ酸配列は配列の何れかの２つのアミノ酸残基の間に挿入されてよい適当なスペーサー基、例えばアミノ酸スペーサー、例えばグリシン又はβ−アラニン残基の他にアルキル基、例えばメチル、エチル、又はプロピル基を包含してよい。変異の他の形態はペプトイド形態におけるアミノ酸残基１つ以上の存在を包含し、これは当業者のよく知る通りである。疑問回避のために、「ペプトイド形態」とはα−炭素置換基がα−炭素ではなく残基の窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を指す。ペプトイド形態のペプチドを製造するためのプロセスは当該分野で知られており、Ｓｉｍｏｎ ＲＪ等、ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１及びＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４に記載されている．
本明細書に記載した、そして本明細書に記載した方法及び組成物における使用に適するヌクレオチド配列（例えばＰＳ４変異体核酸）はその内部に合成又は修飾されたヌクレオチドを包含してよい。多くの種類の異なる型のオリゴヌクレオチド修飾が当該分野で知られている。これらにはメチルホスホネート及びホスホロチオエート骨格、及び／又は分子の３’及び／又は５’末端におけるアクリジン又はポリリジンの付加が包含される。本明細書の目的のためには、本明細書に記載したヌクレオチド配列は当該分野で使用可能な何れかの方法により修飾してよいと理解されなければならない。そのような修飾はヌクレオチド配列のインビボの活性又は寿命を増強するために実施してよい。
本発明者等は更に、本明細書に提示した配列、又は何れかの誘導体に相補であるヌクレオチド配列、そのフラグメント又は誘導体の使用を記載する。配列がそのあるフラグメントに相補である場合は、その配列は他の生物等における同様のコーディング配列を発見するためのプローブとして使用できる。
ＰＳ４変異体配列に１００％相同ではないポリヌクレオチドは多くの方法において得てよい。本明細書に記載した配列の他の変異体は例えばある範囲の個体、例えば異なる集団に由来する個体から作製したＤＮＡライブラリをプローブすることにより得てよい。更に又、他の相同体を得てよく、そしてそのような相同体及びそのフラグメントは一般的には本明細書の配列表に示す配列に選択的にハイブリダイズできることになる。そのような配列は他の種から作製したｃＤＮＡライブラリ又はそれに由来するゲノムＤＮＡライブラリをプローブすること、及び中〜高ストリンジェンシーの条件下に添付配列表中の配列の何れか１つの全て又は部分を含むプローブを用いてそのようなライブラリをプローブすることにより得てよい。同様の考え方は本明細書に記載するポリペプチド又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体を得る場合にも適用される。
変異体及び系統／種の相同体は又保存されたアミノ酸配列をコードする変異体及び相同体内部の配列をターゲティングするように設計されたプライマーを使用することになる縮重ＰＣＲを用いて得てもよい。保存された配列は例えば数種の変異体／相同体に由来するアミノ酸配列をアラインすることにより予測することができる。配列アライメントは当該分野で知られたコンピューターソフトウエアを用いて実施できる。例えばＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広範に使用されている。
縮重ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは縮重一１つ以上を含有することになり、そして、既知配列に対する単一の配列プライマーにより配列をクローニングするために使用されているものよりも低いストリンジェンシー条件において使用されることになる。
或いは、そのようなポリヌクレオチドは特性化された配列の部位指向性突然変異誘発により得てもよい。これは例えばポリヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞に対するコドンの好適性を最適とするためにサイレントなコドン配列の変化が必要な場合に有用となる。制限酵素認識部位を導入するため、又はポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの特性又は機能を改変するために他の配列の変化が望ましい場合がある。
本明細書に記載したＰＳ４変異体核酸のようなポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）を用いることにより、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、オルタナティブ増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば放射性又は非放射性標識を用いて従来の手段により顕在化標識で標識されたものを製造してよく、或いは、ポリヌクレオチドはベクター内にクローニングしてよい。そのようなプライマー、プローブ及び他のフラグメントは少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチド長であることになり、そして又ポリヌクレオチドという用語に包含される。
ＤＮＡポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチド及びプローブは組み換えにより、合成により、又は当業者の使用可能な何れかの手段により製造してよい。それらは又標準的な手法によりクローニングしてよい。一般的に、プライマーは１回１ヌクレオチドで所望の核酸配列を段階的に製造することを包含する合成手段により製造されることになる。自動化された手法を用いてこれを達成するための手法は当業者が容易に使用できる。
より長いポリヌクレオチドは一般的に組み換え手段を用いて、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング手法を用いて製造されることになる。プライマーは増幅されたＤＮＡが適当なクローニングベクター内にクローニングできるように適当な制限酵素認識部位を含むように設計してよい。配列などは、少なくとも本明細書の配列と同じぐらい生物学的に活性であることが望ましい。
本明細書においては、「生物学的に活性な」とは天然に存在する配列の同様の構造的機能（ただし必ずしも同じ程度である必要はない）、及び／又は同様の調節機能（ただし必ずしも同じ程度である必要はない）、及び／又は同様の生化学的機能（ただし必ずしも同じ程度である必要はない）を有する配列を指す。
ハイブリダイゼーション
本発明者等はＰＳ４変異体の核酸配列に相補である配列、又は、ＰＳ４変異体配列に、又はそれに相補である配列にハイブリダイズできる配列を記載する。
「ハイブリダイゼーション」という用語は本明細書においては、「塩基対形成を介して相補鎖に核酸鎖が連結するプロセス」並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において実施されるような増幅のプロセスを包含する。従って本発明者等は本明細書に示した配列又は何れかの誘導体に相補である配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列、又はそのフラグメント又は誘導体の使用を開示する。
「変異体」という用語もまた本明細書に提示するヌクレオチド配列にハイブリダイズできる配列に相補である配列を包含する。
好ましくは、「変異体」という用語は本明細書に提示したヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下（例えば５０℃及び０．２ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５ＭＮａ３シトレートｐＨ７．０｝）でハイブリダイズできる配列に相補である配列を包含する。より好ましくは、「変異体」という用語は本明細書に提示したヌクレオチド配列に高ストリンジェントな条件下（例えば６５℃及び０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５ＭＮａ３シトレートｐＨ７．０｝）でハイブリダイズできる配列に相補である配列を包含する。
本発明者等は更に、ＰＳ４変異体のヌクレオチド配列（本明細書に提示したものの相補配列を包含する）にハイブリダイズできるヌクレオチド配列、並びにＰＳ４変異体のヌクレオチド配列（本明細書に提示したものの相補配列を包含する）にハイブリダイズできる配列に相補であるヌクレオチド配列を開示する。本発明者等は更に中程度〜最高のストリンジェンシーの条件下に本明細書に提示したヌクレオチド配列にハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列を記載する。
好ましい特長において、本発明者等はストリンジェントな条件下（例えば５０℃及び０．２ｘＳＳＣ）でＰＳ４変異体核酸又はその相補体のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を開示する。より好ましくは、ヌクレオチド配列は高ストリンジェント条件下（例えば６５℃及び０．１ｘＳＳＣ）でＰＳ４変異体核酸又はその相補体のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる。
部位指向性突然変異誘発
酵素コードヌクレオチド配列が単離されるか、又は、推定酵素コードヌクレオチド配列が発見された後、酵素を製造するために配列を突然変異させることが望ましい場合がある。従ってＰＳ４変異体配列を親配列から製造してよい。突然変異は合成オリゴヌクレオチドを用いて導入してよい。これらのオリゴヌクレオチドは所望の突然変異部位にフランキングするヌクレオチド配列を含有する。
適当な方法はＭｏｒｉｎａｇａ等（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２，ｐ６４６−６４９）において開示されている。酵素コードヌクレオチド配列内に突然変異を導入する別の方法はＮｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９），１８０，ｐ１４７−１５１）に記載されている。別の方法はＳａｒｋａｒ ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９０），８，ｐ４０４−４０７−“Ｔｈｅ ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”）に記載されている。
１つの特徴において、本明細書に記載した方法及び組成物における使用のための配列は組み換え配列、即ち組み換えＤＮＡ手法を用いて製造されている配列である。これらの組み換えＤＮＡ手法は当業者の知る通りである。そのような手法は文献、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ， ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓにおいて説明されている。
１つの特徴において、本明細書に記載した方法及び組成物における使用のための配列は合成配列、即ちインビトロの化学的又は酵素的な合成により製造されている配列である。それは限定しないが、メチル栄養性のコウボであるピチア及びハンセヌラのような宿主生物に対する最適なコドンの使用により作成された配列を包含する。
本明細書に記載した方法及び組成物における使用のためのヌクレオチド配列は、組み換え複製可能なベクター内に組み込んでよい。ベクターは、適合性のある宿主細胞の内において、及び／又はそれから、酵素の形態においてヌクレオチド配列を複製して発現させるために使用してよい。発現は制御配列、例えば調節配列を用いて制御してよい。ヌクレオチド配列の発現により宿主組み換え細胞により生産された酵素は、使用される配列及び／又はベクターに応じて、分泌させるか、又は細胞内に含有させてよい。コーディング配列は特定の原核生物又は真核生物の細胞膜を通過する物質コーディング配列の分泌を指向するシグナル配列を用いて設計してよい。
ＰＳ４核酸及びポリペプチドの発現
ＰＳ４ポリヌクレオチド及び核酸は合成及び天然起源の両方のＤＮＡ及びＲＮＡを包含してよく、そのＤＮＡ又はＲＮＡは修飾された、又は未修飾のデオキシ、又はジデオキシヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はそれらの類縁体を含有してよい。ＰＳ４核酸は１本鎖又は２本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュプレックス又はＲＮＡ／ＤＮＡ共重合体として存在してよく、ここで「共重合体」という用語はリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの両方を含む単一の核酸鎖を指す。ＰＳ４核酸は更に発現を増大させるために最適化されたコドンであってもよい。
「合成」という用語は本明細書においては、インビトロの化学的又は酵素的合成により製造されるものとして定義される。それには限定しないがメチル栄養性のコウボであるピチア及びハンセヌラのような宿主生物に対する最適なコドンの使用により作成されたＰＳ４核酸が包含される。
ポリヌクレオチド、例えば本明細書に記載した変異体ＰＳ４ポリヌクレオチドは組み換え複製可能なベクター内に組み込むことができる。ベクターは、適合性のある宿主細胞内において核酸を複製するために使用してよい。ポリヌクレオチド配列を含むベクターは適当な宿主細胞内に形質転換してよい。適当な宿主は細菌、コウボ、昆虫及び真菌の細胞を包含してよい。
「形質転換された細胞」という用語は組み換えＤＮＡ手法を用いて形質転換されている細胞を包含する。形質転換は典型的には形質転換すべき細胞内へのヌクレオチド配列１つ以上の挿入により行う。挿入されたヌクレオチド配列は非相同のヌクレオチド配列であってよい（即ち形質転換すべき細胞にとって天然ではない配列である）。更に又、え又は代替として、挿入されたヌクレオチド配列は相同ヌクレオチド配列であってよく（即ち形質転換すべき細胞にとって天然である配列であり）、これにより細胞はそれに既に存在しているヌクレオチド配列の余剰コピー１つ以上を受け取ることになる。
即ち、別の実施形態において、本発明者等は、複製可能なベクター内にポリヌクレオチドを導入すること、適合する宿主細胞内にベクターを導入すること、及びベクターの複製をもたらす条件下に宿主細胞を生育させることにより、ＰＳ４変異体ポリペプチド及びポリヌクレオチドを製造する方法を提供する。ベクターは宿主細胞から回収してよい。
発現コンストラクト
ＰＳ４核酸は目的の宿主細胞内で活性である転写及び翻訳調節エレメントに作動可能に連結してよい。ＰＳ４核酸は例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス由来のグルコアミラーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビシアエのα−因子接合型遺伝子、及びアスペルギルス・オリザエ由来のＴＡＫＡ−アミラーゼから誘導されたもののようなシグナル配列を含む融合蛋白をコードしてよい。或いは、ＰＳ４核酸は膜結合ドメインを含む融合蛋白をコードしてよい。
発現ベクター
ＰＳ４核酸は発現ベクターを用いて宿主生物中で所望のレベルにおいて発現させてよい。
ＰＳ４核酸を含む発現ベクターは選択された宿主生物中でＰＳ４核酸をコードする遺伝子を発現できる何れかのベクターであることができ、そしてベクターの選択はそれが導入されるべき宿主細胞に応じたものとなる。即ち、ベクターは自律複製するベクター、即ち例えばプラスミド、バクテリオファージ、又はエピソームの要素、ミニ染色体又は人工染色体のような染色体複製から自身の複製が独立しているエピソーム実体として存在するベクターであることができる。或いは、ベクターは宿主細胞内に導入されれば宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、そして染色体と共に複製されるものであってよい。
発現ベクターの成分
発現ベクターは典型的には例えば選択された宿主生物内でのベクターの自律複製を可能にするエレメント及び選択目的のための表現型的に選択可能なマーカー１つ以上のようなクローニングベクターの成分を包含する。発現ベクターは通常はプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルをコードする制御ヌクレオチド配列、及び場合によりリプレッサー遺伝子又は１つ以上の活性化遺伝子を含む。更に又、発現ベクターはパーオキシソームのような宿主細胞の小器官に、又は特定の宿主細胞コンパートメントにＰＳ４変異体ポリペプチドをターゲティングできるアミノ酸配列に対してコードしている配列を含んでよい。そのようなターゲティング配列は限定しないが配列ＳＫＬを包含する。本明細書の文脈においては、「発現シグナル」という用語は上記制御配列、リプレッサー又は活性化配列の何れかを包含する。制御配列の指向下の発現のためには、核酸配列、ＰＳ４変異体ポリペプチドは発現に関連して適切な態様において制御配列に作動可能に連結している。
好ましくは、ベクター内のポリヌクレオチドは宿主細胞によるコーディング配列の発現をもたらすことができる制御配列に作動可能に連結しており、即ち、ベクターは発現ベクターである。「作動可能に連結」という用語は、記載した成分がそれらの意図する態様においてそれらが機能することを可能にする関係にあることを意味する。コーディング配列に「作動可能に連結」した調節配列は、制御配列と合致した条件下にコーディング配列の発現が達成されるような方法でライゲーションされる。
制御配列は、制御配列により指向される転写のレベルを転写モジュレーターに対して更に高応答性とするために、例えば別の転写調節エレメントの付加により修飾してよい。制御配列は特にプロモーターを含んでよい。
プロモーター
ベクター内において、変異体ＰＳ４ポリペプチドに対してコードしている核酸配列は適当なプロモーター配列と作動可能に組み合わせられる。プロモーターは選択された宿主生物内において転写活性を有する何れかのＤＮＡ配列であることができ、そして宿主生物に対して相同又は非相同である遺伝子から誘導できる。
細菌プロモーター
細菌宿主中のＰＳ４核酸のような修飾されたヌクレオチド配列の転写を指向するための適当なプロモーターの例は、Ｅ・コリのｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・コエリカラーアガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモーター、バチルス・リチェニフォルミスα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルスマルトース生成性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンスアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルス・サブチルスｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター、バチルス・サブチルスａｐｒＥ遺伝子のプロモーター、及びＰ１７０プロモーターを包含するラクトコッカス種誘導プロモーターから誘導されたプロモーターを包含する。ＰＳ４変異体ポリペプチドをコードする遺伝子をＥ・コリのような細菌種において発現させる場合、例えばＴ７プロモーター及びファージラムダプロモーターを包含するバクテリオファージプロモーターから適当なプロモーターを選択できる。
真菌プロモーター
真菌種における転写のためには、有用なプロモーターの例はアスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコ・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、Ａ・ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコ・ミエヘイリパーゼ、アスペルギルス・オリザエアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエトリオースホスフェートイソメラーゼ、又はアスペルギルス・ニヅランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子から誘導されたものである。
コウボプロモーター
コウボ種における発現のための適当なプロモーターの例は、限定しないがサッカロマイセス・セレビシアエのＧａｌ１及びＧａｌ１０プロモーター及びピチア・パストリスＡＯＸ１又はＡＯＸ２プロモーターを包含する。
宿主生物
（Ｉ）細菌宿主生物
適当な細菌宿主生物の例はグラム陽性細菌種、例えばバチルス科、例えばバチルス・クラウジ、バチルス・サブチルス、バチルス・リチェニフォルミス、バチルス・レンツス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・ラウツス、バチルス・メガテリウム及びバチルス・ツリンゲンシス、ストレプトマイセス種、例えばストレプトマイセス・ムリヌム、乳酸菌種、例えばラクトコッカス種、例えばラクトコッカス・ラクチス、ラクトバチルス種、例えばラクトバチルス・レウテリ、ロイコノストック種、ペディオコッカスパーゼ−種、及びストレプトコッカス種である。或いは、Ｅ・コリを包含する腸内細菌科に属する、又はシュードモナス科に属するグラム陰性細菌種の菌株を宿主生物として選択できる。
（ＩＩ）コウボ宿主生物
適当なコウボ宿主生物は生物工学的に該当するコウボの種、例えば限定しないがコウボ種、例えばピチア種、ハンセヌラ種又はクルイベロマイセス、ヤロウイニア種、又はサッカロマイセス類、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ、又はスキゾサッカロマイセス類に属する種、例えばＳ・ポンベ種から選択できる。
好ましくはメチル栄養性のコウボ種、ピチア・パストリスを宿主生物として使用する。好ましくは宿主生物はハンセヌラ種である。
（ＩＩＩ）真菌宿主生物
糸状真菌に属する適当な宿主生物はアスペルギルス類、例えばアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ツビゲンシス、アスペルギルス・アワモリ、又はアスペルギルス・ニヅランスを包含する。或いは、フサリウム種、例えばフサリウム・オキシスポラムの、又はリゾムコ種、例えばリゾムコ・ミエヘイの菌株を宿主生物として使用できる。他の適当な菌株はサーモマイセス及びムコの種を包含する。
適当な真菌宿主生物は又トリコデルマ種（特にトリコデルマ・リーセイ、すなわち以前のトリコデルマ・ロンジブラキアタム；別名ヒポクレア・ジェコリナ）も包含してよい。
蛋白の発現及び精製
ポリヌクレオチドを含む宿主細胞はポリヌクレオチド、例えば変異体ＰＳ４ポリペプチド、そのフラグメント、相同体、変異体又は誘導体を発現するために使用してよい。宿主細胞は蛋白の発現を可能にする適当な条件下に培養してよい。ポリペプチドの発現は、それらが連続的に生産されるように構成性であるか、又は発現を開始するために刺激を必要とする誘導性であってよい。誘導性の発現の場合は、蛋白の生産は、例えばインデューサー物質例えばデキサメタゾン又はＩＰＴＧの培地への添加により必要時に開始できる。
ポリペプチドは当該分野で知られた種々の手法、例えば酵素的、化学的及び／又は浸透圧による溶解、及び物理的分解によりにより宿主細胞から抽出できる。ポリペプチドは又ＴｎＴＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウサギ網状赤血球のようなインビトロの無細胞系において組み換え生産してよい。
実施例１．ＰＳ４のクローニング
シュードモナス・サッカロフィリアをＬＢ培地上で一夜生育させ、そして染色体ＤＮＡを標準的な方法により単離する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，１９８９）。ＰＳ４オープンリーディングフレームを含有する２１９０ｂｐのフラグメント（Ｚｈｏｕ等、１９８９）はプライマーＰ１及びＰ２（表３参照）を用いるＰＣＲによりＰ・サッカロフィリア染色体ＤＮＡから増幅する。得られたフラグメントをプライマーＰ３及びＰ４を用いたネステッドＰＣＲにおいて鋳型として使用し、自身のシグナル配列を有さないＰＳ４のオープンリーディングフレームを増幅し、そして遺伝子の５’末端にＮｃｏＩ部位を、そして３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。ＮｃｏＩ部位と一緒になってＮ末端メチオニンに関するコドンが導入され、ＰＳ４の細胞内発現が可能となる。１６０５ｂｐのフラグメントをｐＣＲＢＬＵＮＴＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、そしてコンストラクトの完全性を配列決定により分析する。Ｅ．ｃｏｌｉバチルスシャトルベクターｐＤＰ６６Ｋ（Ｐｅｎｎｉｎｇａ等、１９９６）を修飾することによりＰ３２プロモーター及びｃｔｇａｓｅシグナル配列の制御下のＰＳ４の発現を可能とする。得られたプラスミドｐＣＳｍｔａをＢ・サブチルス内に形質転換する。
第２の発現コンストラクトは、ＰＳ４の澱粉結合ドメインが除去されたものとして作成する。ｐＣＳｍｔａ上のプライマーＰ３及びＰ６（表３）によるＰＣＲにおいて、ｍｔａ遺伝子のトランケーションされた型を作成する。ｐＣＳｍｔａ内の完全長ｍｔａ遺伝子をトランケーションされた型と交換し、プラスミドｐＣＳｍｔａ−ＳＢＤを得る。
実施例２．ＰＳ４の部位指向性突然変異誘発
突然変異は２つの方法によりｍｔａ遺伝子に導入する。２工程のＰＣＲ系の方法によるか、又は、クイックエクスチェンジ法（ＱＥ）の何れかによる。簡便のために、ｍｔａ遺伝子を３部分、即ちＰｖｕＩ−ＦｓｐＩフラグメント、ＦｓｐＩ−ＰｓｔＩフラグメント、及びＰｓｔＩ−ＡｓｐＩフラグメントに分割し、以降、それぞれフラグメント１、２及び３と称する。
２工程ＰＣＲ系の方法において、突然変異はＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて導入する。第１のＰＣＲはコーディング鎖に関する突然変異誘発プライマー（表４）及び下方の鎖の上の下流のプライマーを用いて実施する（表３の２Ｒ又は３Ｒの何れか）。反応産物を第２のＰＣＲにおけるプライマーとしてコーディング配列上の上流のプライマーとともに使用する。最終反応の産物をｐＣＲＢＬＵＮＴｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、そして配列決定の後、フラグメントをｐＣＳｍｔａ内の相当するフラグメントと交換する。
クイックエクスチェンジ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いながら、ｍｔａ遺伝子又はｍｔａ遺伝子の部分を含有するプラスミド上のＰＣＲにおいて２つの相補プライマーを用いながら突然変異を導入する。
この目的のために、３ＳＤＭプラスミド及び３ｐＣＳΔプラスミドを含むプラスミドの好都合なセットを構築する。ＳＤＭプラスミドは各々、ＱＥにより所望の突然変異が導入された上記ｍｔａ遺伝子のフラグメントの１つを担持している。配列決定による確認の後、フラグメントを相当するレシピエントｐＣＳΔプラスミド内にクローニングする。ｐＣＳΔプラスミドはｐＣＳｍｔａ由来の不活性誘導体である。活性はＳＤＭプラスミド由来の相当するフラグメントをクローニングすることにより回復され、簡単なスクリーニングを可能にする。
Figure 0005448812
Figure 0005448812
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 実施例３．多重ＳＤＭ
ＰＳ４変異体はＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）多重部位指向性突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いながら製造元のプロトコルに従って多少の変更を加えながら記載した通り作成した。
工程１：突然変異体鎖合成反応（ＰＣＲ）
１０ｍｌ容のＦａｌｃｏｎ試験管中３ｍｌのＬＢ（２２ｇ／ｌＬｅｎｎｏｘ Ｌブロスベース、Ｓｉｇｍａ）＋抗生物質（０．０５μｇ／ｍｌカナマイシン、Ｓｉｇｍａ）に植菌
−３７℃、約２００ｒｐｍでｏ／ｎインキュベート
−遠心分離により細胞を沈殿（５０００ｒｐｍ／５分）
−培地注ぎ出し
−ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニ精製プロトコルを用いてｄｓ−ＤＮＡ鋳型を製造
１．サーマルサイクリング用の突然変異体鎖合成反応を以下のとおり調整した。
ＰＣＲミックス：
２．５μｌ １０ｘＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）マルチ反応緩衝液
０．７５μｌ ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ
Ｘμｌ プライマー：プライマー長２８−３５ｂｐ→１０ｐｍｏｌ
：プライマー長２４−２７ｂｐ→７ｐｍｏｌ
：プライマー長２０−２３ｂｐ→５ｐｍｏｌ
１μｌ ｄＮＴＰミックス
Ｘμｌ ｄｓ−ＤＮＡ鋳型（２００ｎｇ）
１μｌ ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）マルチ酵素ブレンド（２．５Ｕ／μｌ）（ＰｆｕＴｕｒｂｏＩ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ）
Ｘμｌ ｄＨ２Ｏ（最終容量２５μｌまで）
ピペッティングにより全成分を混合し、反応混合物を短時間遠心分離。
２．以下のパラメーターを用いて反応をサイクル
３５サイクル 変性（９６℃／１分）
プライマーアニーリング（６２．８℃／１分）
伸長（６５℃／１５分）
次に４℃維持
ＰＣＲ機材の蓋は１０５℃にまで、そしてプレートは９５℃にまで予備加熱した後にＰＣＲ試験管を機材（エッペンドルフサーマルサイクラー）に入れる。
工程２：ＤｐｎＩ消化
１．２μｌのＤｐｎＩ制限酵素（１０Ｕ／μｌ）を各増幅反応混合物に添加し、ピペッティングにより混合し、そして混合物を遠心分離する。
２．３７℃で約３時間インキュベートする。
工程３：ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（登録商標）ウルトラコンピテント細胞の形質転換
１．ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞を氷上で解凍する。突然変異誘発反応当たり細胞４５μｌを予備冷却されたファルコン試験管に分注する。
２．ウォーターバス（４２℃）を作動させ、ＮＺＹ＋ブロスの入った試験管をバスに入れて予備加熱する。
３．２μｌのβ−メルカプトエタノール混合物を各試験官に添加する。回転攪拌して穏やかに叩き、そして氷上で１０分間インキュベートし、２分毎に回転攪拌する。
４．１．５μｌのＤｐｎＩ処理ＤＮＡを細胞の各細分量に添加し、回転攪拌し、そして氷上で３０分間インキュベートする。
５．３０秒間４２℃のウォーターバス中で試験管を熱パルス処理し、２分間氷上に置く。
６．０．５ｍｌの予備加熱されたＮＺＹ＋ブロスを各試験官に添加し、そして２２５〜２５０ｒｐｍで振とうしながら１時間３７℃においてインキュベートする。
７．１％澱粉及び０．０５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢプレート（３３．６ｇ／ｌＬｅｎｎｏｘ Ｌ Ａｇａｒ、Ｓｉｇｍａ）上に各形質転換反応混合物２００μｌをプレーティングする。
８．形質転換プレートを３７℃で一夜インキュベートする。
Figure 0005448812
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Figure 0005448812
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 ｐＤ７７系のベクター系
ｐＰＤ７７に関して使用したベクター系はｐＣＲｂｌｕｎｔＴＯＰＯＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をもとにしている。ゾシン耐性カセットはｐｍｌＩにより除去されており、３９３ｂｐフラグメントが除去されている。ｐＣＣベクター由来の発現カセット（Ｐ３２−ｓｓＣＧＴａｓｅ−ＰＳ４−ｔｔ）をベクター内に挿入してある。
ｐＣＣＭｉｎｉへのＰＳ４変異体のライゲーション
該当する突然変異を含有するプラスミド（ＭＳＤＭにより作成）を制限酵素Ｎｃｏ１及びＨｉｎｄＩＩＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断する。
３μｇのプラスミドＤＮＡ、Ｘμｌの１０ｘ緩衝液２、１０単位のＮｃｏ１、２０単位のＨｉｎｄＩＩＩ
２時間３７℃でインキュベート。
１％アガロースゲル上で消化を実施する。１２９３ｂｐの大きさのフラグメント（ＰＳ４遺伝子）をゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて精製する。
次にベクターｐＣＣＭｉｎｉを制限酵素Ｎｃｏ１及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、次に消化を１％アガロースゲル上で実施する。３５６９ｂｐのフラグメントをゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて精製する。
ライゲーション：ラピッドＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用する。
ベクターと比較して二倍量のインサートを使用する。
例えば、２μｌインサート（ＰＳ４遺伝子）
１μｌベクター
５μｌＴ４ＤＮＡライゲーション緩衝液２ｘ濃度
１μｌｄＨ２Ｏ
１μｌＴ４ＤＮＡリガーゼ
５分／ＲＴでライゲーションする。
ライゲーション物をワンショットＴＯＰＯコンピテント細胞内に製造元のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って形質転換する。形質転換あたり５μｌのライゲーション物を使用する。
１％澱粉及び０．０５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢプレート（３３．６ｇ／ｌＬｅｎｎｏｘ Ｌ Ａｇａｒ、Ｓｉｇｍａ）上に形質転換混合物５０μｌをプレーティングする。インサート（ＰＳ４変異体）を含有するベクターは澱粉プレート上のハロの形成により認識できる。
実施例３．３０７位における置換を有するＰＳ４変異体ポリペプチドの製造
ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９
野生型非マルトース生成性エキソアミラーゼと比較してＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ｈ２７２Ｑ、Ｇ３０３Ｅ、Ｈ３０７Ｌ、Ａ３０９Ｐ、Ｓ３３４Ｐにおいて突然変異を含むｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９（配列番号１４）は、以下の表に記載するプライマーと共に部位指向性突然変異誘発（実施例２において上記した通り）又は多重部位指向性突然変異誘発（実施例３において上記した通り）を用いながら野生型配列から作成する。
Figure 0005448812
Figure 0005448812
 ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２
３０７Ｋを含む配列ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２２）は、以下の表に記載するプライマーと共に多重部位指向性突然変異誘発（実施例３において上記した通り）を用いながらｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９から作成する。
Figure 0005448812
３０７位において別の残基を有するＰＳ４変異体ポリペプチドは以下の表に記載するプライマーと共に多重部位指向性突然変異誘発（実施例３において上記した通り）を用いながら作成する。
Figure 0005448812
Figure 0005448812
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 実施例４．バチルス・サブチルス内への形質転換（プロトプラスト形質転換）
バチルス・サブチルス（菌株ＤＢ１０４Ａ；Ｓｍｉｔｈ等、１９８８；Ｇｅｎｅ ７０，３５１−３６１）を以下のプロトコルに従って突然変異したプラスミドを用いて形質転換する。
Ａ．プロトプラスト化及び形質転換のための培地
２ｘＳＭＭ リットル当たり：３４２ｇスクロース（１Ｍ）；４．７２ｇマレイン酸ナトリウム（０．０４Ｍ）；８．１２ｇＭｇＣｌ２，６Ｈ２Ｏ（０．０４Ｍ）；濃ＮａＯＨでｐＨ６．５とする。５０ｍｌずつ分配し、１０分間オートクレーブする。
４ｘＹＴ（１／２ＮａＣｌ） １００ｍｌ当たり２ｇコウボエキス＋３．２ｇトリプトン＋０．５ｇＮａＣｌ。
ＳＭＭＰ 等容量の２ｘＳＭＭ及び４ｘＹＴを混合する。
ＰＥＧ ２５ｍｌの１ｘＳＭＭ中１０ｇポリエチレングリコール６０００（ＢＤＨ）又は８０００（Ｓｉｇｍａ）（オートクレー部１０分間）。
Ｂ．プレーティング／再生のための培地
寒天 ４％Ｄｉｆｃｏミネラル寒天。１５分間オートクレーブ。
コハク酸ナトリウム ２７０ｇ／ｌ（１Ｍ）、ＨＣｌでｐＨ７．３。１５分間オートクレーブ。
リン酸塩緩衝液 １００ｍｌ当たり３．５ｇＫ２ＨＰＯ４＋１．５ｇＫＨ２ＰＯ４。１５分間オートクレーブ。
ＭｇＣｌ２ １００ｍｌ当たり２０．３ｇＭｇＣｌ２、６Ｈ２Ｏ（１Ｍ）
カザミノ酸 ５％溶液。１５分間オートクレーブ。
コウボエキス １００ｍｌ当たり１０ｇ；１５分間オートクレーブ。
グルコース ２０％（ｗ／ｖ）溶液。１０分間オートクレーブ。
ＤＭ３再生培地：下記を６０℃で混合（ウォーターバス；５００ｍｌビン）：
２５０ｍｌコハク酸ナトリウム
５０ｍｌカザミノ酸
２５ｍｌコウボエキス
５０ｍｌリン酸塩緩衝液
１５ｍｌグルコース
１０ｍｌＭｇＣｌ２
１００ｍｌ溶融寒天
適切な抗生物質：クロラムフェニコール及びテトラサイクリン、５ｕｇ／ｍｌ；エリストマイシン、１ｕｇ／ｍｌを添加する。カナマイシン上の選択はＤＭ３中では問題を含む：２５０ｕｇ／ｍｌの濃度が必要となる場合がある。
Ｃ．プロトプラストの作成
１．洗剤非付着のプラスチック又はガラス容器を常時使用する。
２．単コロニーから１００ｍｌ容フラスコ中２ｘＹＴ培地１０ｍｌに植菌する。振とう器中（２００ｒｅｖ／ｍｉｎ）で２５〜３０℃において一夜培養により生育させる。
３．一夜培養物を新鮮２ｘＹＴ培地１００ｍｌ中（２５０ｍｌ容フラスコ）に２０倍希釈し、振とう器中（２００〜２５０ｒｅｖ／ｍｉｎ）３７℃でＯＤ６００＝０．４〜０．５となるまで（約２時間）生育させる。
４．遠心分離により細胞を採取する（９０００ｇ、２０分、４℃）。
５．ピペットで上澄みを除去し、細胞を５ｍｌのＳＭＭＰ＋５ｍｇリソザイム中に再懸濁し、滅菌濾過する。
６．ウォーターバス振とう器中３７℃でインキュベートする（１００ｒｅｖ／ｍｉｎ）。
３０分後以降は１５分間隔で２５ｕＬ試料を顕微鏡観察する。細胞の９９％がプロトプラスト化するまでインキュベーションを継続する（球状の外観）。プロトプラストを遠心分離（４０００ｇ、２０分、ＲＴ）により採取し、上澄みをピペットで除去する。１〜２ｍｌのＳＭＭＰ中に穏やかに沈殿物を再懸濁する。
プロトプラストはこの時点で使用可能である。（一部分（例えば０．１５ｍｌ）を将来の使用のために−８０℃で凍結することができる（グリセロールの添加は必要ない）。これは形質転換性のある程度の低下をもたらす場合があるが、ＤＮＡｕｇ当たり１０６形質転換体を凍結プロトプラストとともに得ることができる）。
Ｄ．形質転換
１．ＰＥＧ４５０ｕｌをマイクロ試験管に移す。
２．ＤＮＡ１〜１０ｕＬ（０．２ｕｇ）を１５０ｕＬのプロトプラストと混合し、混合物をＰＥＧの入ったマイクロ試験管に添加する。即座に、ただし穏やかに混合する。
３．室温で２分間放置し、次にＳＭＭＰ１．５ｍｌを添加し、混合する。
４．マイクロ遠心分離（１０分間、１３，０００ｒｅｖ／ｍｉｎ（１０〜１２，０００ｇ））によりプロトプラストを採取し、上澄みを注ぎ出す。残存する液滴はティシュで除去する。
ＳＭＭＰ３００ｕＬを添加し（回転させない）、ウォーターバス振とう器（１００ｒｅｖ／ｍｉｎ）中３７℃で６０〜９０分インキュベートすることにより、抗生物質抵抗性マーカーを発現させる。（ウォーターバスの振とう運動によりプロトプラストは充分再懸濁される）。適宜１ｘＳＳＭで希釈し、０．１ｍｌをＤＭ３プレートにプレーティングする。
実施例５．振とうフラスコ中のＰＳ４変異体の発酵
振とうフラスコ基質は以下の通り作成する。
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 基質は４Ｎ硫酸又は水酸化ナトリウムでｐＨ６．８に調節した後にオートクレーブする。基質１００ｍｌを１整流装置の付いた５００ｍｌ容フラスコに入れ、そして３０分間オートクレーブする。その後、滅菌デキストロースシロップ６ｍｌを添加する。デキストロースシロップは、１容量の５０％ｗ／ｖデキストロースを１容量の水と混合し、その後２０分間オートクレーブすることにより製造する。
振とうフラスコに変異体を植菌し、インキュベーター中で３５℃／１８０ｒｐｍにおいて２４時間インキュベートする。インキュベーションの後、遠心分離（１０，０００ｘｇ、１０分間）によりブロスから細胞を分離し、最終的に０．２μｍでマイクロ濾過することにより上澄みを無細胞とする。無細胞上澄みを検定及び適用試験に使用する。
実施例６．アミラーゼ活性
ベタミル活性
１ベタミル単位は検定混合物中の過剰のａ−グルコシダーゼにより１分当たり０．０３５１ミリモルのＰＮＰが放出されえるようにＰＮＰカップリングマルトペンタオースを１分当たり０．０３５１ミリモル分解する活性として定義される。検定混合物は５０ｕＬの５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ６．５、並びに２５ｕＬの酵素試料及びＭｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄより入手した２５ｕＬのベタミル基質（Ｇｌｃ５−ＰＮＰ及びａ−グルコシダーゼ）（１バイアルを１０ｍｌ水に溶解）を含有する。検定混合物を３０分間４０℃でインキュベートし、次に１５０ｕＬの４％トリスを添加することにより停止する。４２０ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡリーダーを用いて計測し、そしてベタミル活性を、活性＝Ａ４２０＊ｄに基づいて、ベタミル単位／ｍｌ検定酵素試料として計算する。
エンドアミラーゼ検定
エンドアミラーゼ検定は製造元（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ）の従って実施したファデバス検定と同一である。
エキソ特異性
ファデバス活性に対するエキソアミラーゼ活性の比を用いてエキソ特異性を評価する。
実施例７．半減期測定
ｔ１／２は所定の熱条件下における酵素活性の半分が不活性化される時間（分）として定義される。酵素の半減期を求めるためには、試料を６０℃〜９０℃の一定温度で１〜４０分間加熱する。半減期は残存ベタミル検定に基づいて計算する。
操作法：エッペンドルフバイアル中、１０００μｌの緩衝液を６０℃以上で少なくとも１０分間予備加熱する。この試料の熱処理は加熱インキュベーター中のエッペンドルフバイアルの連続混合（８００ｒｐｍ）下に予備加熱した緩衝液に試料１００μｌを添加することにより開始する（エッペンドルフサーモミキサー）。インキュベーション０、２、４、６、８及び９分の後、２０℃で平衡化されている緩衝液１０００μｌに試料４５μｌを移し、そして１５００ｒｐｍ及び２０℃で１分間インキュベートすることにより処理を停止する。
計算：ｔ１／２の計算はインキュベーション時間に対する残存ベタミル活性のｌｏｇ１０（底１０の対数）の傾きに基づく。ｔ１／２は傾き／０．３０１＝ｔ１／２として計算する。
実施例８．モデル系のベーキング試験
３０．０℃においてＦａｒｉｎｏｇｒａｐｈ中にドウを作成する。１０．００ｇの改質穀物粉を計量し、Ｆａｒｉｎｏｇｒａｐｈ中に添加し；１分混合した後、レファレンス／試料（レファレンス＝緩衝液又は水、試料＝酵素＋緩衝液又は水）を滅菌ピペットを用いて混練バットの孔部を経由して添加する。３０秒後、穀物粉をやはり混練バットの孔部を経由して端部から掻き出す。試料は７分間混練する。
緩衝液又は水を用いた試験をＦａｒｉｎｏｇｒａｐｈ上で実施した後、最終レファレンスを実施する。ＦＵはレファレンスでは４００であることが必要であり、そうでない場合、これは例えば液体の量により調節しなければならない。レファレンス／試料をスパーテルで取り出し、手（使い捨て手袋使用）にとり、その後小型ガラス試験管（長さ約４．５ｃｍ）に充填し、これをＮＭＲ試験管内に入れ、栓をする。ドウ当たり７試験管を作成する。
全試料を作成した時点で、試験管を２５分間３３℃の（プログラム可能）ウォーターバスに入れ、その後、ウォーターバスの設定を５分間３３℃保持、次に５６分かけて９８℃まで加熱（分当たり１．１℃）、そして最後に５分間９６℃保持とする。
試験管をサーモカバード中２０．０年において保存する。クランブの固体含有量は図２において０．０５、１及び２ｐｐｍのＰＳａｃＤ３４を用いて製造したクランブ試料に関して示す通り第１、３及び７日にＢｒｕｋｅｒＮＭＳ１２０ＭｉｎｉｓｐｅｃＮＭＲ分析器を用いてプロトンＮＭＲにより計測した。経時的に固体含有量の増大が低値であるほどアミロペクチンの逆行が低減していることを表す。サーモカバード中２０．０℃で７日間保存した後、クランブ試料１０〜２０ｍｇを計量し、４０μｌのアルミニウム標準ＤＳＣカプセルに入れ、２０℃で保存する。
カプセルを−Ｍｅｔｔｌｅｒ−ＴｏｌｅｄｏＤＳＣ８２０基剤上の示差操作熱量分析に対して使用する。パラメーターとして加熱サイクル２０〜９５℃、１０℃／分、及びガス／流量：Ｎ２／８０ｍｌ／分を用いる。結果を分析し逆行アミロペクチンの溶融に関するエンタルピーをＪ／ｇで計算する。
実施例９．抗劣化作用
モデルのパンクランブを作成し、実施例８に従って測定する。ＰＳ４変異体は対照と比較して示差操作熱量分析で測定した場合にベーキング後のアミロペクチン逆行の強力な低減を示す。ＰＳ４変異体は明確な用量作用を示す。
実施例１０．ベーキング試行のためのレシピ
ＵＳトーストに関する標準的な白パンスポンジ及びドウのレシピを用いてベーキング試行を実施した。スポンジドウをＧｅｎｅｒａｌ Ｍｉｌｌｓ，ＵＳＡより入手した穀物粉「Ｇｏｌｄ Ｍｅｄａｌ」１４００ｇ、水８００ｇ、ナタネ油４０ｇ、ＧＲＩＮＳＴＥＤＴＭＳＳＬＰ５５Ｖｅｇ ７．５ｇ、乳化剤ＤＩＭＯＤＡＮＴＭＰＨ２００ １０ｇ及び圧縮コウボ６０ｇから製造する。スポンジを低速で１分間、その後３分間スピード２においてＨｏｂａｒｔスパイラルミキサー上で混合する。スポンジはその後２５℃８５％ＲＨで３時間発酵させる。
その後、「Ｇｏｌｄ Ｍｅｄａｌ」穀物粉６００ｇ、圧縮コウボ１８ｇ、プロピオン酸カルシウム５ｇ、スクロース１６０ｇ、プロピオン酸カルシウム５ｇ、水４３２ｇ、及びアスコルビン酸（６０ｐｐｍ終濃度）及びＡＤＡ（アゾジカルボンアミド；４０ｐｐｍ終濃度）をスポンジに添加する。得られたドウを１分間低速で、そして次に２分間高速で、Ｄｉｏｓｎａミキサー上で混合する。次に塩３０ｇをドウに添加する。
ドウを周囲温度で５分間レストさせ、次にドウ片５５０ｇを計量し、Ｇｌｉｍｅｋシーター上に搭載し、１：４、２：４、３：１５、４：１２及び両側幅８に設定し、焼き型に移す。４３℃９５％ＲＨにおいて６５分間プルーフィングした後、ドウを２６分間２００℃でＭＩＷＥオーブン中ベーキングする。
実施例１１．デニッシュロールの体積の制御
デニッシュロールはデニッシュ改質穀物粉（Ｃｅｒｅａｌｉａより入手）２０００ｇ、圧縮コウボ１２０ｇ、塩３２ｇ、及びスクロース３２ｇを基にしたドウから製造する。以前の水最適化に従ってドウに水を添加する。
ドウをＤｉｏｓｎａミキサー上で混合する（２分間低速、及び５分間高速）。混合後のドウ温度は２６℃に維持する。ドウ１３５０ｇを計量し３０℃において加熱キャビネット注１０分間レストさせる。ロールをＦｏｒｔｕｎａモルダー上に搭載し、４５分間３４℃８５％ＲＨでプルーフィングする。その後、ロールをＢａｇｏ２オーブン内で１８分間２５０℃において、最初の１３秒はスチームを用いながらベーキングする。ベーキング後、ロールを２５分間冷却した後に計量し、体積を計測する。
ロールはクラスト外観、クランブ均質性、クラストのキャッピング、アウスブンド及び比体積（菜種置き換え法により体積を計測）に関して評価する。
これらの基準に基づけば、ＰＳ４変異体はデニッシュロールの比体積を増大させ、そして品質のパラメーターを向上させることがわかった。即ち、ＰＳ４変異体はベーキングされた製品の体積を制御することができる。
実施例１２．堅固性、復元力、及び凝集性の評価のためのプロトコル
パンのテクスチャープロファイル分析
堅固性、復元力、及び凝集性はＳｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫのテクスチャーアナライザーを用いながらテクスチャープロファイル分析によりパンのスライスを分析することにより測定する。堅固性及び復元力の計算はＳｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫにより供与されたプリセットスタンダードに従って行う。使用プローブはアルミニウム５０ｍｍラウンド型とする。
パンを１２．５ｍｍの厚みにスライスする。スライスを型抜きして直径４５ｍｍの円形小片とし、個別に計測する。
以下の設定を用いる。
前試験速度：２ｍｍ／ｓ
試験速度：２ｍｍ／ｓ
後試験速度：１０ｍｍ／ｓ
破裂試験距離：１％
距離：４０％
力：０．０９８Ｎ
時間：５．００秒
回数：５
ロードセル：５ｋｇ
トリガータイム：自動−０．０１Ｎ
圧縮のモードはスタンダード表ＡＡＣＣ７４−０９において使用されているものを変更した。試料は試験中２回圧縮した。図１はテクスチャーアナライザーから得た曲線の例を示す。
実施例１３．堅固性の評価のためのプロトコル
堅固性は初回の圧縮の間に４０％圧縮において測定した。数値は全厚みの４０％までスライスを圧縮するために必要な力である。低値であるほど、パンは軟質である。堅固性は例えばｈＰａのような圧力で表示する。
本検定は「堅固性評価プロトコル」と称する場合がある。
実施例１４．復元力の評価のためのプロトコル
曲線下部面積が試験の間に適用される仕事量の尺度である。初回の圧縮の間の圧縮部（Ａ１）及び撤退部（Ａ２）の曲線下部面積を図１に示す。
Ａ１及びＡ２の間の比は試料の復元力として定義され、そして復元力単位として表される。真の弾性材料は、初回の部分の間に適用される力が２回目の部分における力と等しくなるはずであるため、対称な曲線を示すはずである。パン及びパン様の材料に関しては、Ａ２は通常は圧縮の間の構造の撹乱に起因してＡ２よりも小さくなる。従って復元力は常時１より低値となる。
この検定は「復元力評価プロトコル」と称する場合がある。
実施例１５．凝集性の評価のためのプロトコル
凝集性は初回の圧縮下の面積に対する２回目の圧縮下の面積の比（Ａ３／Ａ１＋Ａ２）として定義され、そして凝集性単位として表される。これは圧縮の間の試料の崩壊の尺度である。試料が初回の圧縮の後にその形状を再獲得する能力が高値であるほど値は１に近づく。パン及びパン様材料に関しては凝集性は常時１より低値である。
この検定は「凝集性評価プロトコル」と称する場合がある。
実施例１６．易崩壊性の評価のためのプロトコル
パンのスライス２枚を紙の上に置く。スライスを先ず垂直に、そして次に水平に引き裂くことにより、各スライスを４つの正方形に分割する。
引き裂き操作は指によりクランブを引き離すことにより行う。先ずスライスを上側のパン表面の中央から下側のパン表面の中央に向けて引き裂く。その後、元のスライスの半量各々をクラスト側からスライスの内部に向けて引き裂く。４つの正方形から分離した小型のクランブ片は、引き裂き操作後に手を上下に少なくとも３回動かすことにより各小片を振り動かして除去する。
分離したクランブ小片の重量を易崩壊性の尺度として測定する。この検定は「易崩壊性評価プロトコル」と称する場合がある。
実施例１７．折畳性の評価のためのプロトコル
トーストパンを１５ｍｍのセットスライス厚みで自動パンスライサーを用いてスライスする。折り目の方向が横から横となるように、スライスをスライス上側から下側に向けて手で折り畳む。
折畳性を以下の採点システムを用いて目視により評価する。
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 この検定は「折畳性評価プロトコル」と称する場合がある。
実施例１８．ＰＳ４変異体ポリペプチドの向上した熱安定性
アミラーゼｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２の熱安定性を上記した通り計測し、そしてｐＳａｃ−Ｄ３４／ｐＭＤ３（配列番号２）及びｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９（配列番号１３）のものと比較する。
熱不活性化の後には一次反応が起こるため、５０％不活性化のための時間（分）として定義される半減期は５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ６．５において７５、８０及び８５℃（それぞれ１６７、１７６及び１８５°Ｆ）で１〜４０分間インキュベートした後にベタミル試験を用いて残存活性に基づいて測定する。
結果は図２に示す通りである。この図は塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を含むＰＳ４変異体ポリペプチドの熱安定性（半減期）がそのような突然変異を伴わないポリペプチドと比較して向上していることを示している。
実施例１９．ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品の向上した取扱特性：堅固性
塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を含むｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１）の種々の量、即ち２０，０００、４０，０００及び６０，０００ベタミル単位／ｋｇのｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２を用いてパンを焼く。
パンの堅固性はベーキング後の種々の時間において実施例１３に記載するプロトコルに従って試験する。対照として、酵素を使用しないで焼いたパンの堅固性も計測する。
図３はパンの堅固性を試験したベーキング試行の結果を示す。
実施例２０．ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品の向上した取扱特性：復元力
塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を含むｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１）の種々の量、即ち２０，０００、４０，０００及び６０，０００ベタミル単位／ｋｇのｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２を用いてパンを焼く。
パンの復元力はベーキング後の種々の時間において実施例１４に記載するプロトコルに従って試験する。対照として、酵素を使用しないで焼いたパンの復元力も計測する。
図４はパンの復元力を試験したベーキング試行の結果を示す。
実施例２１．ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品の向上した取扱特性：凝集性
塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を含むｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１）の種々の量、即ち２０，０００、４０，０００及び６０，０００ベタミル単位／ｋｇのｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２を用いてパンを焼く。
パンの凝集性はベーキング後の種々の時間において実施例１５に記載するプロトコルに従って試験する。対照として、酵素を使用しないで焼いたパンの凝集性も計測する。
図５はパンの凝集性を試験したベーキング試行の結果を示す。
実施例２２．ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品の向上した取扱特性：堅固性
塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を含むｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１）６０，０００ベタミル単位／ｋｇを用いてパンを焼き、パンの堅固性をベーキング後の種々の時間において実施例１３に記載するプロトコルに従って試験する。
更に、塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を各々含まないｐＳａｃ−Ｄ３４／ｐＭＤ３（配列番号２）６０，０００ベタミル単位／ｋｇ及びｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９（配列番号１３）６０，０００ベタミル単位／ｋｇを用いてパンを焼く。パンの堅固性を試験する。
対照として、酵素を使用しないで焼いたパンの堅固性も計測する。
図６は３０７位の置換を伴った又は伴わないＰＳ４変異体ポリペプチドで処理したパンの堅固性を試験したベーキング試行の結果を示す。
実施例２３．ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品の向上した取扱特性：堅固性、復元力及び凝集性
塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を含むｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１）６０，０００ベタミル単位／ｋｇを用いてパンを焼き、パンの復元力をベーキング後の種々の時間において実施例１４に記載するプロトコルに従って試験する。
更に、塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を各々含まないｐＳａｃ−Ｄ３４／ｐＭＤ３（配列番号２）６０，０００ベタミル単位／ｋｇ及びｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９（配列番号１３）６０，０００ベタミル単位／ｋｇを用いてパンを焼く。パンの復元力を試験する。
対照として、酵素を使用しないで焼いたパンの復元力も計測する。
図７は３０７位の置換を伴った又は伴わないＰＳ４変異体ポリペプチドで処理したパンの復元力を試験したベーキング試行の結果を示す。
実施例２４．ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品の向上した取扱特性：凝集性
塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を含むｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１）６０，０００ベタミル単位／ｋｇを用いてパンを焼き、パンの凝集性をベーキング後の種々の時間において実施例１５に記載するプロトコルに従って試験する。
更に、塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を各々含まないｐＳａｃ−Ｄ３４／ｐＭＤ３（配列番号２）６０，０００ベタミル単位／ｋｇ及びｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９（配列番号１３）６０，０００ベタミル単位／ｋｇを用いてパンを焼く。パンの凝集性を試験する。
対照として、酵素を使用しないで焼いたパンの凝集性も計測する。
図８は３０７位の置換を伴った又は伴わないＰＳ４変異体ポリペプチドで処理したパンの凝集性を試験したベーキング試行の結果を示す。
実施例２５．ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品の向上した取扱特性：折畳性
４ｐｐｍのｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１、Ｈ３０７Ｋ置換）で処理したスポンジ及びドウのトーストパンを焼き、得られたパンの折畳性を上記の通り試験して採点する。
対照として、酵素で処理しないスポンジ及びドウのトーストパンを焼き、折畳性を試験して採点する。
試験はベーキング後第１３日に３つのスライスに対して実施する。
Figure 0005448812
 上記の表及び図に示される通り、折畳性は未処理のトーストパンと比較して塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を各々含むＰＳ４変異体ポリペプチドで処理したスポンジ及びドウのトーストパンにおいて向上している。
実施例２６．ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品の向上した取扱特性：折畳性
４ｐｐｍのｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１、Ｈ３０７Ｋ置換）で処理したスポンジ及びドウのトーストパンを焼き、得られたパンの折畳性を上記の通り試験して採点する。
対照として、酵素で処理しないスポンジ及びドウのトーストパンを焼き、折畳性を試験して採点する。下記に示す他の酵素で処理したスポンジ及びドウのトーストパンの折畳性も試験する。
ｐＳａｃ−Ｄ３４（ｐＭＤ３としても知られている）は野生型の非マルトース生成性エキソアミラーゼと相対比較して突然変異Ｎ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ１２１Ｄ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７Ｌ、Ｓ３３４Ｐを含み、そしてその配列は配列番号２に示す通りである。
ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９は野生型の非マルトース生成性エキソアミラーゼと相対比較して突然変異Ｎ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ｈ２７２Ｑ、Ｇ３０３Ｅ、Ｈ３０７Ｌ、Ａ３０９Ｐ、Ｓ３３４Ｐを含み、そしてその配列は配列番号１３に示す通りである。
試験はベーキング後第８日に３つのスライスに対して実施する。
Figure 0005448812
 上記の表に示される通り、塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を各々含むＰＳ４変異体ポリペプチドで処理したスポンジ及びドウのトーストパンにおいては、折畳性がこの置換を有さない酵素と比較して向上している。
実施例２７．ＰＳ４変異体ポリペプチド及び他の酵素の複合物で処理した食料品の向上した取扱特性：折畳性
６ｐｐｍのｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１、３０７Ｋ置換）単独で、又は以下に示す他の酵素と組み合わせて処理したスポンジ及びドウのトーストパンを焼き、得られたパンの折畳性を上記の通り試験して採点する。
複合物１：６ｐｐｍｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２＋５０ｐｐｍＧＲＩＮＤＡＭＹＬＴＭＰＯＷＥＲＢａｋｅ９００＋１５ｐｐｍＧＲＩＮＤＡＭＹＬＴＭＭａｘ−ＬｉｆｅＵ４
複合物２：６ｐｐｍｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２＋５０ｐｐｍＧＲＩＮＤＡＭＹＬＴＭＰＯＷＥＲＢａｋｅ９００
複合物３：６ｐｐｍｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２＋５０ｐｐｍＧＲＩＮＤＡＭＹＬＴＭＰＯＷＥＲＢａｋｅ９００＋１５０ｐｐｍＧＲＩＮＤＡＭＹＬＴＭＰＯＷＥＲＢａｋｅ４０５０
ＧＲＩＮＤＡＭＹＬＴＭＰＯＷＥＲＢａｋｅ９００はＤａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓより市販されているキシラナーゼである。ＧＲＩＮＤＡＭＹＬＴＭＭａｘ−ＬｉｆｅＵ４はＤａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓより市販されている細菌α−アミラーゼである。ＧＲＩＮＤＡＭＹＬＴＭＰＯＷＥＲＢａｋｅ４０５０はＤａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから市販されているリパーゼである
対照として、酵素で処理しないスポンジ及びドウのトーストパンを焼き、折畳性を試験して採点する。
試験はベーキング後第５日に３つのスライスに対して実施する。
Figure 0005448812
 上記の表に示される通り、折畳性は単独又は細菌性α−アミラーゼ、リパーゼ又はキシラナーゼのような他の酵素との組み合わせた塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を各々含むＰＳ４変異体ポリペプチドで処理したスポンジ及びドウのトーストパンにおいて向上している。
実施例２８．ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品の向上した取扱特性：易崩壊性
４ｐｐｍのｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１、３０７Ｋ置換）で処理したスポンジ及びドウのトーストパンを焼き、得られたパンの易崩壊性を上記の通り試験して採点する。
対照として、酵素で処理しないスポンジ及びドウのトーストパンを焼き、折畳性を試験して採点する。
試験はベーキング後第１３日に実施する。
Figure 0005448812
 上記の表に示される通り、易崩壊性は塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を各々含むＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した１３日後のスポンジ及びドウのトーストパンにおいて低減している。
実施例２９．ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した食料品の向上した取扱特性：易崩壊性
４ｐｐｍのｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１、３０７Ｋ置換）で処理したスポンジ及びドウのトーストパンを焼き、得られたパンの易崩壊性を上記の通り試験して採点する。
対照として、酵素で処理しないスポンジ及びドウのトーストパンを焼き、折畳性を試験して採点する。
試験はベーキング後第１５日に実施する。
Figure 0005448812
 上記の表に示される通り、易崩壊性は塩基性又は正荷電のアミノ酸への３０７位における置換を各々含むＰＳ４変異体ポリペプチドで処理した１５日後のスポンジ及びドウのトーストパンにおいて低減している。
実施例３０．位置３０７Ｋ置換を有するＰＳ４変異体ポリペプチド
リジンへの３０７位における置換を有する以下のポリペプチドを作成し、それらの特性を上記した通り試験する。ポリペプチドの配列は特定した置換と共に配列番号２の配列を含む。
Figure 0005448812
Figure 0005448812
Figure 0005448812
Figure 0005448812
 実施例３１．位置３０７Ｈを有するＰＳ４変異体ポリペプチド
３０７位におけるヒスチジンを他の突然変異と共に有する以下のポリペプチドを作成し、それらの特性を上記した通り試験する。ポリペプチドの配列は特定した置換と共に配列番号２の配列を含む。
Figure 0005448812
 実施例３２．Ｌ３０７Ｒ及びＬ３０７Ｋ突然変異を有するＰＳ４ポリペプチドの作成
３０７位において他の残基（Ｌ３０７Ｒ、Ｌ３０７Ｋ）を有するＳＳＭ４７１Ｂ１０及びＳＳＭ４７１Ｃ０４は、以下の表に示すプライマーと共に多重部位指向性突然変異誘発（実施例３において上記）を用いて作成する。
Figure 0005448812
 部位スキャンライブラリ由来の９６クローンを配列決定し、そして３０７位にそれぞれアミノ酸Ｒ及びＫを含有する２変異体ＳＳＭ４７１Ｂ１０及びＳＳＭ４７１Ｃ０４を発見する。
ＳＳＭ４７１Ｂ１０のアミノ酸配列は配列番号２７に示す通りであり、ＳＳＭ４７１Ｂ１０の核酸配列は配列番号２８に示す通りである。
ＳＳＭ４７１Ｃ０４のアミノ酸配列は配列番号２９に示す通りであり、ＳＳＭ４７１Ｃ０４の核酸配列は配列番号３０に示す通りである。
親ペプチドから誘導され、そして突然変異Ｌ３０７Ｒ及びＬ３０７Ｋを伴った他のＰＳ４変異体ポリペプチドも同様に、以下の表に示すプライマーと共に多重部位指向性突然変異誘発（実施例３において上記）を用いて作成する。
３０７位における部位スキャンのために使用したプライマー
Figure 0005448812
 ３０１〜３０６及び３０８〜３１３の範囲に追加的突然変異を有するポリペプチドに関しては、追加的突然変異は多重部位指向性突然変異誘発（実施例３において上記）により作成する。
部位スキャンライブラリ由来の９６クローンを配列決定し、そしてこれにより３０７位にそれぞれアミノ酸Ｒ及びＫを含有する変異体を発見する。
実施例３３．トルティーヤの試行
トルティーヤを以下のレシピでベーキングする。
Figure 0005448812
Figure 0005448812
 操作法
ドウの温度は３０℃としなければならない。全ての乾燥成分をａＫエンパーミキサーに入れ、緩徐に１時間混合する。水を添加し、緩徐に１２分混合する。スケーリング：１３５０ｇ。モールディング：Ｇｌｉｍｅｋ：プレス時間３、０−ラウンディング時間：３．０。３０℃で１０分間ドウをレスト。ＣＦＯ４０トルティーヤマシーンにドウボールを通過させる。
設定：
プレシング：ドウボールをホットプレス
上プレート：２０５℃、下プレート：２００℃
コンベヤ：
上：２３０℃、中：２２５℃、下：１６０℃
ベーキング時間：約３０秒
冷却：２０℃８０％ＲＨで１２分
パッキング：ＣＯ２でバキューム
セッティング：バキューム：４０；ＣＯ２；４１；温度：８２℃
実施例３４．ベーキング後第８日の折畳性試験の結果
ベーキング後第８日に実施例１７に従って折畳性試験を実施する。
図９は４００ｐｐｍＮｏｖａｍｙｌ（ＴＭ）１５００及び５０ＢＭＫ／ｋｇｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１）を用いたトルティーヤのベーキング後第８日の折畳性試験の結果を示す。図１０は４００ｐｐｍＮｏｖａｍｙｌＴＭ１５００及び５０ＢＭＫ／ｋｇｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１）を用いたトルティーヤのベーキング後第８日の折畳性試験の結果を示す。
４００ｐｐｍのＮｏｖａｍｙｌＴＭ１５００を用いた１０トルティーヤを折畳んだところ、図９及び１０に示す通り折畳中に全てが割れる。
５０ＢＭＫ／ｋｇｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２（配列番号２１）を用いた１０トルティーヤを折畳んだところ、図９及び１０に示す通り何れも折畳中に割れない。
実施例３５．ＳＳＭ４７１Ｂ１０（配列番号２７，３０７Ｒ）及びＳＳＭ４７１Ｃ０４（配列番号２９，３０７Ｋ）を用いたベーキング試行
実施例１０に記載したスポンジ及びドウの操作法により製造したＵＳトーストを用いて４０ＢＭＫ／ｋｇの用量で変異体である３０７Ｒを有するＳＳＭ４７１Ｂ１０（配列番号２７）及び３０７Ｋを有するＳＳＭ４７１Ｃ０４（配列番号２９）を試験する。
トーストは実施例１２〜１４に記載する通り堅固性及び復元力に関して評価する。
図１１はＳＳＭ４７１Ｂ１０（配列番号２７）及びＳＳＭ４７１Ｃ０４（配列番号２９）を用いて製造したＵＳトーストの堅固性試験の結果を示す。図１２はＳＳＭ４７１Ｂ１０（配列番号２７）及びＳＳＭ４７１Ｃ０４（配列番号２９）を用いて製造したＵＳトーストの復元力試験の結果を示す。
両方の変異体は堅固性の有意な低下（図１１）及び復元力の有意な増大（図１２）をもたらしたことがわかり、３０７Ｒ及び３０７Ｋ変異体は有意な抗劣化作用を有することが示される。
実施例３６．ＰＭＳ３７０（配列番号３１、３０７Ｈ）及びＳＳＭ４７１Ｃ０４（配列番号２９、３０７Ｋ）を用いたベーキング試行
ＰＭＳ３７０は実施例３において上記した通り多重部位指向性突然変異誘発を用いて作成する。ＰＭＳ３７０の配列は配列番号３１に示す。
実施例１０に記載したスポンジ及びドウの操作法によりＵＳトーストを製造する。トーストを用いて変異体である３０７Ｈを有するＰＭＳ３７０及び３０７Ｋを有するＳＳＭ４７１Ｃ０４を２０、４０及び６０ＢＭＫ／ｋｇ用量において試験する。
トーストは実施例１２及び１４に記載したとおり復元力に関して評価する。
図１３はｐＭＳ３７０（配列番号３１）及びＳＳＭ４７１Ｃ０４（配列番号２９）を用いて製造したＵＳトーストの復元力試験の結果を示す。
両方の変異体は用量の増大に伴って復元力の有意な増大（図１３）をもたらしたことがわかり、３０７Ｒ及び３０７Ｋ変異体は用量の関数として有意に向上した復元力を与えることが示されている。しかしながら、３０７Ｋ変異体の用量の影響は対応する３０７Ｈ変異体の用量の影響よりも実質的により強力である。
引用文献
Figure 0005448812
 本明細書において言及した出願及び特許の各々、及び上記した出願及び特許の各々において引用又は参照される各明細書は、出願及び特許の各々（「出願引用明細書」）の実施の間を含めて、そして出願及び特許の各々において引用又は言及した何れかの製品の何れかの製造元の説明書又はカタログもまた、参照により本明細書に組み込まれる。更に又本テキストにおいて引用した全ての明細書及び本テキストにおいて引用した明細書において引用又は参照される全ての明細書、及び本テキストで引用又は言及した何れかの製品の何れかの製造元の説明書又はカタログもまた、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の記載した方法及び系の種々の変更及び変形は本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかとなることである。本発明は特定の好ましい実施形態との関連において記載したが、請求項記載の本発明はこのような特定の実施形態に非合理に限定してはならない。実際、分子生物学又は関連の分野における当業者には自明である本発明の実施のための記載した様式の種々の変更は請求項の範囲内に属することを意図される。

Claims (57)

  1. アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドであって、該ＰＳ４変異体ポリペプチドが、配列番号２１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）への３０７位におけるアミノ酸置換を含み、同じ条件下で試験した場合、該ＰＳ４変異体ポリペプチドが親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドと比較して、高値の熱安定性を有する、ＰＳ４変異体ポリペプチド。
  2. エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能な請求項１記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  3. ７０位におけるアミノ酸置換を更に含む請求項１又は２に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  4. ７０位におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換（７０Ｄ）である、請求項１〜３の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  5. ＰＳ４変異体ポリペプチドの配列の２７２位におけるアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）である、請求項１〜４の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  6. ＰＳ４変異体ポリペプチドの配列の３０３位におけるアミノ酸がグリシン（Ｇ）である請求項１〜５の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  7. ＰＳ４変異体ポリペプチドが３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、又は３３４位よりなる群から選択される突然変異１つ以上をさらに含む、請求項１〜６の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  8. ＰＳ４変異体ポリペプチドにおける追加的突然変異が３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０９Ｐ、３３４Ｐよりなる群から選択される、請求項１〜７の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  9. ＰＳ４変異体ポリペプチドが、配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換、即ち：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ、３０９Ｐ、３３４Ｐを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  10. ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号２１（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２）の配列を含む、請求項１〜９の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  11. ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換、即ち：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｒ、３０９Ｐ、３３４Ｐを含む、請求項１〜１０の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  12. ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号２３（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒ）の配列を含む、請求項１〜１１の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  13. 親ポリペプチドが非マルトース生成性エキソアミラーゼを含む、請求項１〜１２の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  14. 親ポリペプチドがシュードモナス種であるか、又はそれから誘導可能な、請求項１〜１３の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  15. 親ポリペプチドが配列番号１又は配列番号５に示す配列を有するシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ由来の非マルトース生成性エキソアミラーゼである、請求項１〜１４の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  16. 配列番号１又は配列番号５に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜１５の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  17. 親ポリペプチドが配列番号７又は配列番号１１に示す配列を有するシュードモナス・
    スツッゼリー由来の非マルトース生成性エキソアミラーゼである、請求項１〜１４の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  18. 配列番号７又は配列番号１１に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜１４の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  19. 配列番号２１（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２）、及び配列番号２３（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒ）よりなる群から選択される配列を含む、請求項１〜１８の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  20. 非マルトース生成性エキソアミラーゼ中に存在するドメインの１または複数を欠失する、請求項１〜１８の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  21. 澱粉結合ドメインを欠失する請求項１〜１８の何れか１項に記載の変異体ポリペプチドであって、該澱粉結合ドメインが、配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリア配列の位置ナンバリングを参照して４２９位の後のアミノ酸に対応する、ＰＳ４変異体ポリペプチド。
  22. ６０℃における半減期（ｔ１／２）が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドと相対比較して１５％以上増大している、請求項１〜２１の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  23. ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、以下の特性、即ち：（ａ）低値の堅固性；（ｂ）高値の復元力；（ｃ）高値の凝集性；（ｄ）低値の易崩壊性；及び（ｅ）高値の折畳性の何れか１つ以上、または全てを有する、請求項１〜２２の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  24. 食料品の復元力、凝集性又は折畳性が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、１５％以上独立して増大している、請求項２３記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  25. ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理されている食料品の復元力、凝集性及び折畳性の各々が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して増大している、請求項２３又は２４記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  26. 食料品の堅固性又は易崩壊性が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と相対比較して、１５％以上独立して低下している、請求項２３記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  27. ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理されている食料品の堅固性及び易崩壊性の各々が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して低下している、請求項２３又は２６記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
  28. 食料品又は飼料添加物としての、請求項１〜２７の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの使用。
  29. 請求項１〜２７の何れか１項に記載のポリペプチドに澱粉を接触させること、及び、該ポリペプチドに澱粉から線状生成物１つ以上を形成させることを含む、澱粉を処理するための方法。
  30. 食料品又は飼料製品の製造における請求項１〜２７の何れか１項に記載のポリペプチドの使用。
  31. 請求項１〜２７の何れか１項に記載のポリペプチドを食料品又は飼料成分に添加混合することを含む食料品又は飼料製品の製造方法。
  32. 食料品がドウ又はドウ製品を含む、請求項３０記載の使用又は請求項３２記載の方法。
  33. 前記食料品がベーカリー製品である請求項３０〜３２の何れか１項に記載の使用または方法。
  34. 前記食料品がトルティーヤである、請求項３０〜３２の何れか１項に記載の使用または方法。
  35. （ａ）澱粉媒体を準備すること；（ｂ）澱粉媒体に請求項１〜２７の何れか１項に記載のポリペプチドを添加すること；及び（ｃ）工程（ｂ）の最中又は後に澱粉媒体に熱を適用することによりベーカリー製品を製造すること、を含むベーカリー製品を作成するための方法。
  36. 請求項３０〜３５の何れか１項に記載の使用またはプロセスにより得られる食料品、飼料製品、ドウ製品又はベーカリー製品。
  37. 前記産生されたベーカリー製品がトルティーヤである、請求項３５に記載の方法。
  38. ドウのための向上剤組成物であって、向上剤組成物が請求項１〜２７の何れか１項に記載のポリペプチド及び少なくとも１つの追加のドウ成分又はドウ添加物を含む上記組成物。
  39. 穀物粉及び請求項１〜２７の何れか１項に記載のポリペプチドを含む組成物。
  40. ドウ製品の劣化を遅延又は低減するか、或いは有害な劣化を低減するための、ドウ製品における請求項１〜２７の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの使用。
  41. ドウ製品の堅固性、復元力、凝集性、易崩壊性又は折畳性の何れか１つ以上を向上させるための、ドウ製品における請求項１〜２７の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの使用。
  42. 下記成分：
    （ａ）バチルス・ステアロサーモフィルス由来の、グルカン１，４−α−マルトヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）とも称されるマルトース生成性アルファアミラーゼ、又はマルトース生成性アルファアミラーゼ活性を有するその変異体、相同体、又は突然変異体；
    （ｂ）バチルス種、アスペルギルス種、サーモマイセス種、又はトリコデルマ種由来のベーカリーキシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）；
    （ｃ）バチルス・アミロリクファシエンス由来のα−アミラーゼ（ＥＣ．３．２．１．１）、又はアルファアミラーゼ活性を有するその変異体、相同体、又は突然変異体；及び、（ｄ）フサリウム・ヘテロスポラム由来のグリコリパーゼのようなリパーゼ；
    の何れか１つ以上との、請求項１〜２７の何れか１項に記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの複合物。
  43. 請求項２９、３１、３２、３３、３４、３５または３７の何れか１項に記載の方法のための請求項４２記載の複合物の使用。
  44. 請求項４２記載の複合物を用いた処理により製造される食料品又は飼料製品。
  45. 請求項１〜２７の何れか１項に記載のポリペプチドをコードすることができる核酸。
  46. 配列番号６及び配列番号１２に少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項４５記載の核酸。
  47. 親配列から誘導可能な核酸であって、親配列は非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードすることができ、該非マルトース生成性エキソアミラーゼは、配列番号２１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、その核酸配列が、配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照して３０７位におけるリジン（Ｒ）又はアルギニン（Ｋ）残基を核酸がコードするような残基１つ以上における置換を含み、該非マルトース生成性エキソアミラーゼは、配列番号２１に示すアミノ酸配列からなる親ポリペプチドと比較して、高値の熱安定性を有する、核酸。
  48. ヌクレオチド残基１つ以上の置換により非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードする親配列から誘導される、請求項４５〜４７の何れか１項に記載の核酸。
  49. 配列番号２２（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２）、及び配列番号２４（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒ）よりなる群から選択される請求項４５〜４８の何れか１項に記載の核酸。
  50. 請求項４５〜４９の何れか１項に記載のＰＳ４核酸を含むプラスミド。
  51. 請求項４５〜５０の何れか１項に記載のＰＳ４核酸を含むか、又は請求項１〜３０の何れか１項に記載のポリペプチドを発現することができる発現ベクター。
  52. 請求項５０記載のプラスミド又は請求項５１記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  53. 細菌、真菌、又は酵母の細胞である請求項５２記載の宿主細胞。
  54. ＰＳ４変異体ポリペプチドを発現する方法であって、請求項５２、又は５３記載の宿主細胞を得ること、及び該宿主細胞からポリペプチドを発現させることを含む、方法。
  55. ＰＳ４変異体ポリペプチドを発現する方法であって、請求項５２、又は５３記載の宿主細胞を得ること、及び該宿主細胞からポリペプチドを発現させることを含む、ポリペプチドの熱安定性又はエキソ特異性又は両方を増大させる方法。
  56. ポリペプチドが単離又は精製、又は両方に付される請求項５４又は５５に記載の方法。
  57. 請求項５４〜５６の何れか１項に記載の方法により得られるポリペプチド。
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