KR20090019895A - 폴리펩티드 - Google Patents

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KR20090019895A
KR20090019895A KR1020097000165A KR20097000165A KR20090019895A KR 20090019895 A KR20090019895 A KR 20090019895A KR 1020097000165 A KR1020097000165 A KR 1020097000165A KR 20097000165 A KR20097000165 A KR 20097000165A KR 20090019895 A KR20090019895 A KR 20090019895A
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seq
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KR1020097000165A
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패트릭 마리아 프란시스쿠 데르큭스
안야 켈레트-스미스 헤밍센
리에 메즐달
보 스판게 소렌센
카르스텐 마티아스 크라그흐
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대니스코 에이/에스
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Abstract

본발명은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지니는 모 폴리펩티드로부터 유래된 PS4 변이 폴리펩티드에 관한 것으로, 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아(Pseudomonas saccharophilia) 엑소-아밀라아제 서열에서 잔기 307의 리신(K) 또는 아르기닌(R)로의 아미노산 치환을 포함한다. 바람직하게는 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 추가적으로 잔기 70에서 아미노산 치환, 바람직하게는 G70D를 포함한다. 아미노산 서열의 잔기 272 및 303에서의 아미노산은 바람직하게는 히스티딘(H) 및 글리신(G)이다.
Figure 112009000481646-PCT00029
슈도모나스 사카로필리아, 엑소-아밀라제, 아미노산, 돌연변이, 폴리펩티드

Description

폴리펩티드{Polypeptide}
선행기술은 2003년 7월 7일 출원된 미국 잠정특허출원 제60/485,413호, 제60/485,539호 및 제60/485,616호이다. 또한 본 발명의 선행기술은 2004년 7월 7일 출원된 국제출원 PCT/US2004/021723 및 PCT/US2004/021739 및 미국을 지정국(출원자: Genencor International, Inc)으로 하고 있다. 또한 선행기술은 미국 특허출원 제10/866,903호 및 제10/886,905호로 구성되어 있으며 이들 모두 2004년 7월 7일에 출원되었다.
또한 선행기술은 미국 잠정특허출원 제60/608,919호(2004년 7월 7일에 제출된 미국 특허출원 제10/887,056호이나 2004년 9월 15일 잠정특허출원으로 변경되었다)로 구성되어 있다. 또한 참고문헌은 2004년 9월 22일에 제출된 미국 잠정특허출원 제60/612,407호로 구성되어 있다.
더욱이 선행기술은 2003년 7월 7일 출원된 미국 특허 제60/485,539호로 구성되어 있다. 또한 선행기술은 2004년 출원된 국제특허 PCT/IB2004/002487 및 미국 지정국(출원자: Danisco A/S)으로 하고 있다. 또한 선행기술은 2004년 7월 7일 출원된 미국 특허 제10/886,023호로 구성되어 있다.
또한 선행기술은 미국 특허출원 제10/886,504호, 제10/886,505호 및 제10/886,527호로 구성되어 있으며 이들 모두 2004년 7월 7일에 출원되었다. 또한 선행기술은 2004년 9월 22일에 출원된 미국 특허출원 제10/947,612호로 구성되어 있다.
또한 선행기술은 2005년 7월 7일에 출원된 국제특허출원 PCT/GB2005/002675 및 미국 지정국(출원자: Danisco A/S 및 Genencor International, Inc, D Young & Co Attorney Reference: P020161WO)으로 하고 있다. 또한 선행기술은 2005년 7월 7일에 출원된 미국 잠정특허출원 제60/697,302호로 구성되어 있다.
상기 출원, 본 그리고 상기 출원 각각에서 인용되거나 참고된 문서, 상기 출원("출원 및 인용된 문헌") 각각을 포함하고, 상기 출원 및 문헌 및 출원 및 문헌에서 인용된 문헌 각각에서 인용되거나 언급된 생성물에 대한 제작자의 지침서 및 목록은 참고문헌으로 본 명세서에 포함되어 있다. 더욱이 본 명세서에서 인용된 모든 문헌, 본 명세서에서 인용된 모든 문헌에서 인용되거나 참고된 모든 문헌, 본 명세서 또는 본 명세서에 포함된 문헌에서 인용되거나 언급된 생성물에 대한 제작자의 지침서 및 목록은 참고사항으로 본 명세서에 포함되어 있다. 본 명세서 또 는 지침에서 참고사항으로 포함된 문헌은 본 발명의 실행에서 사용된다. 본 선행 기술에 참고사항으로 포함된 문헌은 선행기술로 인정되지는 않는다.
본 발명은 폴리펩티드 명확하게는 아밀라아제 폴리펩티드 및 이것을 암호화하는 핵산에 관한 것이고 식품 제조시 논-말토제닉 엑소-아밀라아제(non-maltogenic exoamylases)로서의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 아밀라아제는 유익한 특징을 지니게끔 되었다. 더욱 상세하게는 본 발명의 아밀라아제는 변형된 엑소-특이성(exospecifity) 및/또는 변형된 열안정성을 나타낸다. 특히 상기 폴리펩티드는 논-말토제틱 엑소-아밀라아제 활성을 지닌, 특히 글루칸-1,4-α-말토테트라하이드로라제(EC 3.2.1.60) 활성을 지닌 폴리펩티드로부터 유래한 것이다.
개선된 아밀라아제는 빵을 굽는 과정에서 내재된 문제를 개선할 수 있다. 빵을 구운 며칠 후 아밀로펙틴의 결정 형성은 전분 입자에서 발생되었고, 이로 인해 빵의 견고성은 증가하고 빵의 노화를 유도한다. 빵이 노화될 때 빵은 크럼(crumb)의 부드러움과 크럼의 수분을 손실한다. 결과적으로 크럼은 탄력성이 줄어들게 되고 빵은 질긴 껍질을 지니게 된다.
아밀로펙틴 측쇄의 효소적 가수분해(예를 들면 아밀라아제에 의한)는 결정 형성을 감소시킬 수 있고 항-스테일링(staling)을 증가시킨다. 결정 작용은 아밀로펙틴의 측쇄의 길이에 따라 달라진다: 측쇄가 길수록, 결정 작용이 커질수록. 대부분 전분 입자는 2개의 폴리머 혼합물로 구성된다: 약 75%는 아밀로펙틴인 아밀로펙틴 및 아밀로오스. 아밀로펙틴은 아주 크고, (1-4) 결합으로 결합된 α-D-글루코피라노실 단위체의 사슬로 구성된 가지형 분자로 사슬은 가지를 형성하기 위해 α-D-(1,6) 결합에 의해 부착된다. 아밀로오스는 α-D-(1,6) 가지를 거의 지니지 않는 α-D-글루코피라노실 단위체에 연결된 (1-4) 선형 사슬이다.
밀가루에 의해 생성된 제품은 화이트 브래드와 같이 되고 호밀분말 또는 밀가루로부터 만들어진 빵은 빵 반죽을 생성시켜 180∼250℃의 범위에서 약 15∼60분 동안 오븐에서 빵 반죽을 구움으로서 완성된다. 급격한 온도 감소(200→120℃)를 통해 베이킹 과정은 반죽 외층 위에서 구워진 생성물의 껍질이 만들어진다. 그러나 증기 때문에 베이킹 과정의 마지막 온도는 크럼(crumb)에서 약 100℃ 정도이다. 약 85℃ 이상에서 효소 불활성화가 발생할 수 있고 효소는 항-스테일링 특징을 가지지 않은 것이다. 따라서 오직 내열성 아밀라아제만이 베이킹하는 동안 전분을 효과적으로 변형시킬 수 있다.
엔도-아밀라아제 활성은 가지형 덱스트린의 축적 때문에 끈적거리거나 점착성 있는 크럼을 생성함으로써 최종 빵 생성물의 질에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 엑소-아밀라아제 활성이 바람직하고 이는 엑소-아밀라아제가 스테일링을 지 연시켜 전분을 바람직하게 변형시킬 수 있기 때문이다. 또한 엔도-아밀라아제 활성의 부정적 효과를 줄일 수 있다. 엔도-아밀라아제 활성의 감소는 엑소-특이성을 유도할 수 있으며, 이는 가지형 덱스트린을 감소시켜 양질의 빵을 생성할 수 있다.
발명의 요약
본 발명에 따라 본 발명자들은 청구항에 개시된 PS4 변이 폴리펩티드를 제공한다. 게다가 본 발명자들은 청구항에 개시된 식품 첨가제, 식품 생성물, 베이커리 생성물, 개선된 조성물, 동물 사료를 포함하는 사료 생성물을 포함하고, 또한 PS4 변이 폴립펩티드의 사용 방법을 제공한다. 본 발명자들은 청구항에 개시된 PS4 변이 폴리펩티드와 관련되고 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 다른 측면에서 이러한 PS4 변이 폴리펩티드를 생성하는 방법이 청구항에 개시되어 있다.
이하, 본 명세서에서 다르게 서술되지 않았다면, PS4 변이 폴리펩티드의 투약 용량은 ppm(파트 퍼 밀리언) 단위이다. 예를 들면 "1 D34"은 중량 대 중량을 기초로 한 pSac-D34의 1ppm을 나타내며 효소의 정량 또는 함량은 순수 효소 단백질의 양으로 우혈청 알부민(BSA)을 표준품으로 하여 활성 에세이에 기초하여 측정하였다. 이 때 브래드포드에 기술된 에세이(1976, A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-150 dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254) 방법을 사용하였다.
본 발명 전반에 걸쳐 지칭되거나 생성된 다양한 PS4 변이 폴리펩티드 변이체는 하기 명명법에 의거 이해함으로써 용이하게 선택될 것이다.
(i) 치환(substitution)은 숫자와 문자로 기재한다. 예를 들면 141P는 [넘버링 시스템에 의한 위치/치환된 아미노산]을 의미한다. 따라서 예를 들면 141P로 지칭된 것은 141 잔기의 아미노산이 프롤린으로 치환된 것이다.
(ii) 치환은 문자, 숫자 및 문자로 기재한다. 예를 들면 A141P는 [원래의 아미노산/ 넘버링 시스템에 의한 위치/ 치환된 아미노산]을 의미한다. 따라서 예를 들면 A141P로 지칭된 것은 141 잔기의 알라닌이 프롤린으로 치환된 것이다.
2 이상의 가능한 치환기가 특정 위치에서 치환가능하고 이것은 연속된 문자에 의해 지칭되며 필요에 따라 슬래쉬(/) 예를 들어 G303ED 또는 G303E/D로 표현될 수 있다. 만약 어느 아미노산도 치한 가능한 경우에는 [넘버링 시스템에 의한 위치/X]로 표시될 수 있으며 예를 들어 121X이다.
다수의 변이는 슬래쉬(/)에 의해 각각 별개로 지정될 수 있다. 예를 들면 A141P/G223A이다. 이 때 141 잔기와 223 잔기의 알라닌과 글리신이 각각 프롤린과 알라닌으로 치환되어 있음을 나타낸다.
한편 본 명세서에서 특별히 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 또는 과학 용어는 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 싱글튼의 사전(Singleton,et al, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994))과 헤일의 사전(Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) )은 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적 의미를 이해하는 데 유용하다. 비록 본 명세서에 기술된 유사한 또는 동등한 방법 및 재료들은 본 발명의 실행 또는 테스트에서 사용될 수 있으나 본 발명에서는 가장 바람직한 방법과 재료가 기재되었다. 숫자의 범위는 범위를 정의한 숫자를 포함한다. 한편 별도로 지시되지 않았다면 핵산은 정방향(orientation) 5'에서 3'으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여진다; 아미노산 배열을 아미노산에서 카르복시 정방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여진다.
한편 당업자가 용이하게 사용할 수 있는 화학의 전통적 기술, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 기술적 사항이 본 발명의 실행이 사용될 것이다. 그런 기술들은 하기 문헌에 개시되어 있다. 예를 들어 Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IrI Press; D. M. J. LiIl ey and J. E. Dahlberg, 1992, Methods ofEn∑ymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson "Immuno cytochemistry: Theory and Practice", CRC Press inc., Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (ed); "Immunochemical Protocols, vol 80", in the series: "Methods in Molecular Biology", Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); and Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3을 참고한다. 개별적인 문헌은 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서와 관련된 특허 및 간행물에 나타난 모든 서열 등은 참고문헌으로 통합되어 언급된다.
PS4 변이 폴리펩티드
본 발명자들은 효소와 관련된 변형된 특성, 더욱 바람직하게는 변형된 엑소특이성 또는 변형된 열안정성 또는 이들 모두를 지닌 모효소(parent enzyme)의 하나 이상의 위치에서 치환된 폴리펩티드를 제공한다. 그러한 변이 폴리펩티드는 본 명세서에서 편의상 "PS4 변이 폴리펩티드"로 나타날 것이다.
상기 PS4 변이 폴리펩티드는 바람직한 효소 활성을 나타낸다. 더욱 바람직하게는 PS4 변이 폴리펩티드는 아밀라아제 활성, 더욱 바람직하게는 엑소-아밀라아제 활성을 포함한다. 바람직한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩티드는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 나타낸다.
더욱이 본 발명자들은 식품 첨가제, 식품 생성물, 베이커리 생성물, 더욱 개선된 조성물, 동물 사료를 포함하는 사료 생성물을 포함하는 조성물에 있어서 변형된 PS4 변이 폴리펩티드를 포함하는 것이다. 바람직하게는 상기 조성물은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지니고 또한 상기 폴리펩티드와 조성물을 이용하여 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 바와 같이 PS4 변이 폴리펩티드는 하나 이상의 개선된 작업성, 특히 개선된 베이킹 특성을 포함한다. 따라서 PS4 변이 폴리펩티드는 이런 식품 생성물이 하나 이상(바람직하게는 모든)의 낮은 견고성(firmness), 높은 복원력(resilience) 또는 응집력(cohesiveness)을 지니도록 처리된다. PS4 변이 폴리펩티드에 의해 나타난 상기 개선된 작업성 또는 베이킹 특징은 하기에서 상세히 기술된다.
본 발명자들은 음식 생성물 특히 반죽 및 상기 폴리펩티드를 지닌 베이커리 생성물의 처리를 제공하고 상기 식품 생성물은 상기에서 개시된 특징을 나타낸다.
본 발명자들은 감미료, 시럽과 같은 디터전트(detergent)의 제조시 조성물의 또 다른 용도를 제공한다. 상기 조성물은 적어도 하나의 다른 성분과 함께 폴리펩티드를 포함한다. 특히 본 발명자들은 폴리펩티드를 포함하는 식품 또는 사료 첨가제를 제공한다.
상기 폴립펩티드 및 핵산은 그들 모 서열로부터 다수 변이되었다. 다시 말하자면 PS4 변이 폴리펩티드 또는 핵산의 서열은 다수의 위치 또는 잔기가 모 서열과 상이하다. 바람직한 실시태양에서 변이는 아미노산 치환을 포함하고 이는 또 다른 아미노산 잔기의 변화이다. 따라서 PS4 변이 폴리펩티드는 모 서열의 하나 이상의 위치에서 다수 아미노산 잔기 특성의 변화를 포함한다.
본 명세서에서 언급된 "변이체(variant)"라는 용어는 모 분자로부터 유래된 분자를 의미한다. 변이체는 핵산뿐만 아니라 폴리펩티드도 포함한다. 변이체는 아미노산 수준에서 결실, 삽입 및 치환을 포함하고 하나 이상의 위치에서, 핵산 수준의 트랜스버전(transversion), 전이(transition) 및 인버전(inversion)을 포함한다. 또한 변이체는 트렁케이션(truncation)을 포함한다. 변이체는 상동체 및 모 분자의 기능적 유도체를 포함한다. 변이체는 본 명세서에 나타난 뉴클레오티드 서열을 혼성화하는 것이 가능한 상보 서열을 포함한다.
307 잔기의 염기성 잔기 변이
본 발명자들은 아밀라아제 서열에서 아미노산 치환, 특히 엑소-아밀라아제 활성, 더욱 바람직하게는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 서열의 치환을 포함하는 PS4 변이 폴리펩티드를 제공한다.
구체적으로는 본 발명자들은 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열에서 307 잔기의 아미노산 변이를 포함하는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 모 폴리펩티드로부터 유래한 PS4 변이 폴리펩티드를 제공한다. 더욱이 307 잔기의 치환은 염기성 또는 양전하를 띠는 아미노산, 바람직하게는 리신(K), 아르기닌(R)으로 치환하는 것이다.
하나의 실시태양에서 본 발명자들은 리신(307K), 바람직하게는 H307K로 치환한 307 잔기에 아미노산 치환 PS4 변이 폴리펩티드를 제공한다. 또 하나의 실시태양에서 본 발명자들은 청구항 1 또는 청구항 2의 PS4 변이 폴리펩티드를 제공하며, 307 잔기에 실시한 아미노산 치환은 아르기닌(307R), 바람직하게는 H307R 치환이다.
더욱이 PS4 변이 폴리펩티드는 아스파르트산(D), 바람직하게는 70D로 70 잔기에 치환한 변이를 포함한다. 바람직한 실시태양에서 상기 치환은 G70D이다. 따라서 몇몇의 실시태양에서 본 발명자들은 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열과 관련하여 G70D, H307K 또는 G70D, H307R 치환을 포함하는 PS4 변이 폴리펩티드를 제공한다.
272 및 303 잔기의 잔기는 "야생형"이거나 변이된 것이다. 바람직한 실시태양에서 272 잔기의 잔기는 야생형 잔기 즉 히스티딘(H)이며, 바람직하게는 303 잔기의 잔기는 야생형 잔기 즉 글리신(G)이다. 그러므로 본 발명자들은 서열번호: 1로서 나타난 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열과 관련하여 H로 치환한 272 잔기의 잔기 및 G로 치환한 303 잔기의 잔기와 G70D 및 H307K 치환을 포함하는 PS4 변이 폴리펩티드를 제공한다.
이러한 변이 폴리펩티드 및 본 명세서에 기술된 것들은 본 명세서 "PS4 변이 폴리펩티드"에 관한 것이다. 또한 이러한 변이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 나타낼 것이며 상기 핵산은 편의상 "PS4 변이 핵산"에 관한 것이다. PS4 변이 폴리펩티드 및 핵산은 하기에 상세히 기술될 것이다.
"모" 서열 즉, PS4 변이 폴리펩티드 및 핵산의 기초 서열은 바람직하게는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 폴리펩티드이다. "모 효소" 및 "모 폴리펩티드"라는 용어는 적절히 이해될 것이며 PS4 변이 폴리펩티드를 기초로 한 효소와 폴리펩티드를 의미한다. 상기 용어들은 하기에서 상세히 기술된다.
변이 및 아미노산 변화는 적절한 폴리펩티드 골격(backbone) 또는 백그라운드, 야생형 또는 변이 상에서 제조될 것이며 하기에서 상세히 기술된다.
특히 바람직한 실시태양에서 모 서열은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 효소이며 바람직하게는 박테리아 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 효소이다. 더 바람직한 실시태양에서 모 서열은 글루칸-1,4-α-말토테트라하이드로라제(EC 3.2.1.60.)을 포함한다. 바람직하게는 모 서열은 슈도모나스 종, 예를 들면 슈도모나스 사카로필리아 또는 슈도모나스 스투제리로부터 유래한다.
하나의 실시태양에서 모 폴리펩티드는 야생형 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 서열 예를 들면 슈도모나스 종을 포함하거나 상동성을 지닌다.
따라서 모 폴리펩티드는 서열번호: 1로 표시되는 서열을 지니는 슈도모나스 사카로필리아 논-말토제닉 엑소-아밀라아제를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서 모 폴리펩티드는 서열번호: 11로 표시되는 서열을 지닌 슈도모나스 스투제리로부터 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 또는 SWISS-PROT 접근번호 P13507을 지닌 슈도모나스 스투제리 논-말토제닉 엑소-아밀라아제를 포함한다.
한편으로는 모 폴리펩티드는 야생형 서열의 변이체일 것이며, 모 폴리펩티드는 그 자체이거나 PS4 변이 폴리펩티드를 포함한다.
바람직한 실시태양에서 변이 및 변화는 이미 변이된 바람직하게는 pMD229(서열번호: 13 또는 14)인 PS4 서열상에서 변이된다.
이미 변이된 서열로부터 유래된 PS4 변이 폴리펩티드인 경우에도 야생형 서열(또는 이와 적합한 서열)로부터 출발하여 이 같은 변이 폴리펩티드를 구축할 수 있다. 또한 출발 서열과 원하는 변이체 간의 차이를 확인할 수 있으며 바람직한 변이체를 얻기 위하여 출발 서열로부터 원하는 변이를 도입할 수 있음을 당업자가 명백하게 인식할 수 있다.
바람직하게는 서열 또는 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 논-말토제닉 엑소-아밀라제 서열 또는 서열번호: 11로 표시되는 서열을 지닌 슈도모나스 스투제리 논-말토제닉 엑소-아밀라아제와 구조적 상동체를 지니는 것과 관련된 단백질 및 핵산은 "PS4 군"의 구성원으로 본 명세서에 나타나 있다. PS4 변이 폴리펩티드 및 핵산 발생시 적절한 사용법에 대한 "PS4 군" 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 효소의 예는 하기에 상세히 나타내었다.
바람직하게는 본 명세서에 기술된 PS4 변이 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 특징을 유지하고 있으며 부가적으로 바람직하게는 추가로 이점 예를 들면 증가된 활성 또는 열안정성 또는 pH 저항성 또는 어떤 조성물(바람직하게는 모두)을 가진다. 이것은 하기에 상세히 기술된다.
본 명세서에 기술된 PS4 치환 변이체는 적절한 용도를 위해 사용되었다. 바람직하게는 모 효소는 용도에 적절하며, 상기 변이체가 용도에 사용되었다. 특히 상기 변이체가 엑소-말토테트라하이드로라제가 사용된 적용에 사용되었다. 더욱 바람직한 실시태양에서 상기 변이체는 더 높은 열안정성 또는 더 높은 엑소-아밀라아제 활성 또는 더 높은 pH 안정성 또는 어떤 조합의 부가된 이점을 가진다.
PS4 변이 폴리펩티드 및 핵산에 대한 적절한 용도의 예는 식품 생성물을 포함하며 특히 식료품의 생성뿐만 아니라 베이킹; 또한 예들은 하기에 상세히 개시된다.
상기에 개시된 잔기에 첨가시 PS4 변이 폴리펩티드는 하나 이상의 변이를 포함한다. 이미 언급한 치환에 덧붙여 하나, 둘 , 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱 또는 그 이상의 변이가 가능하다. 하기 한 바와 같이 아미노산 수준의 결실, 삽입 및 치환과 하나 이상의 위치에서 핵산 수준의 트랜스버전(transversion), 전이(transition) 및 인버전(inversion)과 같은 변이가 포함되었다. 덧붙여, PS4 변이체는 열거된 위치에서 모든 치환을 가질 필요는 없다. 실제로 PS4 변이체는 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 개의 치환 결실 등을 지니며, 즉 야생형 아미노산 잔기의 상기 위치에서 존재한다.
추가 변이
잔기 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 및/또는 334
바람직한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩티드는 상기의 서열에서 다른 사이트 또는 위치에서 하나 또는 그 이상의 추가 변이를 포함한다.
예를 들면 더욱이 PS4 변이 폴리펩티드는 잔기: 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 및/또는 334로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 변이를 포함한다. 바람직하게는 이들 위치의 상기 잔기들은 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K, 309P 또는 334P를 포함한다.
따라서 PS4 변이 폴리펩티드는 추가적으로 잔기 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 및/또는 334에 307K/R/H로 치환된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 변이를 포함한다. 이러한 실시태양에서 잔기 307의 잔기는 히스티딘(H)을 포함하고, 특히 이러한 추가 변이가 존재한다.
따라서 PS4 변이 폴리펩티드는 추가적으로 잔기 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 및/또는 334에 307K/R/H로 치환한 "Annex A: 1 변이"에 나타난 즉 33Y; 34N; 7OD; 121F; 134R; 141P; 146G; 157L; 161A; 178F; 179T; 223E; 229P; 309P; 또는 334P와 같은 하나 이상의 변이를 포함한다.
바꿔 말하면, PS4 변이 폴리펩티드는 하기 중 일부를 포함한다: 33Y, 307K/R/H; 34N, 307K/R/H; 7OD, 307K/R/H; 121F, 307K/R/H; 134R, 307K/R/H; 141P, 307K/R/H; 146G, 307K/R/H, 157L, 307K/R/H; 161A, 307K/R/H; 178F, 307K/R/H; 179T, 307K/R/H; 223E, 307K/R/H; 229P, 307K/R7H; 309P, 307K/R/H; 또는 334P, 307K/R/H.
PS4 변이 폴리펩티드는 추가적으로 잔기 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 및/또는 334에 307K/R/H로 치환한 "Annex A: 2 변이"에 나타난 즉 33Y,34N; 33Y,70D; 33Y,121F; 33Y,134R; 33Y,141P; 33Y,146G; 33Y,157L; 33Y,161A; 33Y,178F; 33Y,179T; 33Y,223E; 33Y,229P; 33Y,309P; 33Y,334P; 34N,70D; 34N,121F; 34N,134R; 34N,141P; 34N,146G; 34N,157L; 34N,161A; 34N,178F; 34N,179T; 34N,223E; 34N,229P; 34N,309P; 34N,334P; 70D,121F; 70D,134R; 70D,141P; 70D,146G; 70D,157L; 70D,161A; 70D,178F; 70D,179T; 70D,223E; 70D,229P; 70D,309P; 70D,334P; 121F,134R; 121F,141P; 121F,146G; 121F,157L; 121F,161A; 121F,178F; 121F,179T; 121F,223E; 121F,229P; 121F,309P; 121F,334P; 134R,141P; 134R,146G; 134R,157L; 134R,161A; 134R,178F; 134R,179T; 134R,223E; 134R,229P; 134R,309P; 134R,334P; 141P,146G; 141P,157L; 141P,161A; 141P,178F; 141P,179T; 141P,223E; 141P,229P; 141P,309P; 141P,334P; 146G,157L; 146G,161A; 146G,178F; 146G,179T; 146G,223E; 146G,229P; 146G,309P; 146G,334P; 157L,161A; 157L,178F; 157L,179T; 157L,223E; 157L,229P; 157L,309P; 157L,334P; 161A,178F; 161A,179T; 161A,223E; 161A,229P; 161A,309P; 161A,334P; 178F,179T; 178F,223E; 178F,229P; 178F,309P; 178F,334P; 179T,223E; 179T,229P; 179T,309P; 179T,334P; 223E,229P; 223E,309P; 223E,334P; 229P,309P; 229P,334P; 또는 309P,334P와 같은 2개 이상의 변이를 포함한다.
바꿔 말하면 PS4 변이 폴리펩티드는 하기 중 일부를 포함한다: 33Y,34N, 307K/R/H; 33Y,70D,307K/R/H; 33Y,121F,307K/R/H; 33Y,134R,307K/R/H; 33Y5141P,307K/R/H; 33Y,146G,307K/R/H; 33Y,157L,307K/R/H; 33Y,161A,307K/R/H; 33Y,178F,307K/R/H; 33Y,179T,307K/R/H; 33Y,223E,307K/R/H; 33Y,229P,307K/R/H; 33Y,309P,307K/R/H; 33Y,334P,307K/R/H; 34N,70D,307K/R/H; 34N,121F,307K/R/H; 34N,134R,307K/R/H; 34N,141P,307K/R/H; 34N,146G,307K/R/H; 34N,157L,307K/R/H; 34N,161A,307K/R/H; 34N,178F,307K/R/H; 34N,179T,307K/R/H; 34N,223E,307K/R/H; 34N,229P,307K/R/H; 34N,309P,307K/R/H; 34N,334P,307K/R/H; 70D,121F,307K/R/H; 70D,134R,307K/R/H; 70D,141P,307K/R/H; 70D,146G,307K/R/H; 70D,157L,307K/R/H; 70D,161A,307K/R/H; 70D,178F,307K/R/H; 70D,179T,307K/R/H; 70D,223E,307K/R/H; 70D,229P,307K/R/H; 70D,309P,307K/R/H; 70D,334P,307K/R/H; 121F,134R,307K/R/H; 121F,141P,307K/R/H; 121F,146G,307K/R/H; 121F,157L,307K/R/H; 121F,161A,307K/R/H; 121F,178F,307K/R/H; 121F,179T,307K/R/H; 121F,223E,307K/R/H; 121F,229P,307K/R/H; 121F,309P,307K/R/H; 121F,334P,307K/R/H; 134R,141P,307K/R/H; 134R,146G,307K/R/H; 134R,157L,307K/R/H; 134R,161A,307K/R/H; 134R,178F,307K/R/H; 134R,179T,307K/R/H; 134R,223E,307K/R/H; 134R,229P,307K/R/H; 134R,309P,307K/R/H; 134R,334P,307K/R/H; 141P,146G,307K/R/H; 141P,157L,307K/R/H; 141P,161A,307K/R/H; 141P,178F,307K/R/H; 141P,179T,307K/R/H; 141P,223E,307K/R/H; 141P,229P,307K/R/H; 141P,309P,307K/R/H; 141P,334P,307K/R/H; 146G,157L,307K/R7H; 146G,161A,307K/R/H; 146G,178F,307K/R/H; 146G,179T,307K/R/H; 146G,223E,307K/R/H; 146G,229P,307K/R/H; 146G,309P,307K/R/H; 146G,334P,307K/R/H; 157L,161A,307K/R/H; 157L,178F,307K/R/H; 157L,179T,307K/R7H; 157L,223E,307K7R/H; 157L,229P,307K/R/H; 157L,309P,307K/R/H; 157L,334P,307K/R/H; 161A,178F,307K/R/H; 161A5179T,307K/R/H; 161A,223E,307K/R/H; 161A,229P,307K/R/H; 161A,309P,307K/R/H; 161A,334P,307K/R/H; 178F,179T,307K/R/H; 178F,223E,307K/R/H; 178F,229P,307K/R/H; 178F,309P,307K/R/H; 178F,334P,307K/R/H; 179T,223E,307K/R/H; 179T,229P,307K/R/H; 179T,309P,307K/R/H; 179T,334P,307K7R/H; 223E,229P,307K/R/H; 223E,309P,307K/R/H; 223E,334P,307K/R/H; 229P,309P,307K/R/H; 229P,334P,307K/R7H; 309P,334P,307K/R/H.
PS4 변이 폴리펩티드는 "Annex A: 3 변이"에 나타난 바와 같이 추가적으로 잔기 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 및/또는 334 중 일부에 3개 이상의 변이를 포함한다.
PS4 변이 폴리펩티드는 "Annex A: 4 변이"에 나타난 바와 같이 추가적으로 잔기 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 및/또는 334 중 일부에 4개 이상의 변이를 포함한다.
PS4 변이 폴리펩티드는 "Annex A: 5 변이"에 나타난 바와 같이 추가적으로 잔기 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 및/또는 334 중 일부에 5개 이상의 변이를 포함한다.
PS4 변이 폴리펩티드는 "Annex A: 6 변이"에 나타난 바와 같이 추가적으로 잔기 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 및/또는 334 중 일부에 6개 이상의 변이를 포함한다.
PS4 변이 폴리펩티드는 "Annex A: 7 변이"에 나타난 바와 같이 추가적으로 잔기 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 및/또는 334 중 일부에 7개 이상의 변이를 포함한다.
PS4 변이 폴리펩티드는 하기의 잔기 33Y, 34N, 7OD, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P 중에서 9개의 변이를 지닌 서열을 포함하지만 "Annex A: 7 변이"에 나타난 7개의 잔기는 포함하지 않는다.
PS4 변이 폴리펩티드는 하기의 잔기 33Y, 34N, 7OD, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P 중에서 10개의 변이를 지닌 서열을 포함하지만 "Annex A: 6 변이"에 나타난 6개의 잔기는 포함하지 않는다.
PS4 변이 폴리펩티드는 하기의 잔기 33Y, 34N, 7OD, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P 중에서 11개의 변이를 지닌 서열을 포함하지만 "Annex A: 5 변이"에 나타난 5개의 잔기는 포함하지 않는다.
PS4 변이 폴리펩티드는 하기의 잔기 33Y, 34N, 7OD, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P 중에서 12개의 변이를 지닌 서열을 포함하지만 "Annex A: 4 변이"에 나타난 4개의 잔기는 포함하지 않는다.
PS4 변이 폴리펩티드는 하기의 잔기 33Y, 34N, 7OD, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P 중에서 13개의 변이를 지닌 서열을 포함하지만 "Annex A: 3 변이"에 나타난 3개의 잔기는 포함하지 않는다.
PS4 변이 폴리펩티드는 하기의 잔기 33Y, 34N, 7OD, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P 중에서 14개의 변이를 지닌 서열을 포함하지만 "Annex A: 2 변이"에 나타난 2개의 잔기는 포함하지 않는다.
PS4 변이 폴리펩티드는 하기의 잔기 33Y, 34N, 7OD, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P 중에서 15개의 변이를 지닌 서열을 포함하지만 "Annex A: 1 변이"에 나타난 1개의 잔기는 포함하지 않는다.
바람직한 PS4 변이 폴리펩티드 서열
그러나 바람직하게 PS4 변이 폴리펩티드는 이들 위치의 각각에 변이를 포함한다.
구체적으로 본 발명자들은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 모 폴리펩티드로부터 유래한 PS4 변이 폴리펩티드를 제공하며 PS4 변이 폴리펩티드는 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열의 위치 넘버링과 관련하여 각각 다음의 잔기 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 307, 309 및 334에서 변이를 포함한다.
바람직한 실시태양에서 잔기 307 변이는 염기성 또는 양전하를 띠는 잔기를 포함한다. 일부 실시태양에서 잔기 307 변이는 307K 또는 307R을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서 잔기 307 잔기는 H이다. 따라서 본 발명자들은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 모 폴리펩티드로부터 유래한 PS4 변이 폴리펩티드를 제공하며 PS4 변이 폴리펩티드는 잔기 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 307, 309 및 334에 각각의 변이와 307 잔기에 K 또는 R을 치환한 변이를 포함하거나 잔기 307 잔기는 H이다.
위치 33 잔기는 Y를 포함하고, 바람직하게는 33Y, 더 바람직하게는 N33Y를 포함한다. 위치 34 잔기는 N을 포함하고, 바람직하게는 34N, 더 바람직하게는 D34N을 포함한다. 위치 70 잔기는 D를 포함하고, 바람직하게는 70D, 더 바람직하게는 G70D를 포함한다. 위치 121 잔기는 F를 포함하고, 바람직하게는 121F, 더 바람직하게는 G121F를 포함한다. 위치 134 잔기는 R을 포함하고, 바람직하게는 134R, 더 바람직하게는 G134R을 포함한다. 위치 141 잔기는 P를 포함하고, 바람직하게는 141P, 더 바람직하게는 A141P를 포함한다. 위치 146 잔기는 G를 포함하고, 바람직하게는 146G, 더 바람직하게는 Y146G를 포함한다. 위치 157 잔기는 L을 포함하고, 바람직하게는 157L, 더 바람직하게는 I157L을 포함한다. 위치 161잔기는 A를 포함하고, 바람직하게는 161A, 더 바람직하게는 S161A를 포함한다. 위치 178 잔기는 F를 포함하고, 바람직하게는 178F, 더 바람직하게는 L178F를 포함한다. 위치 179 잔기는 T를 포함하고, 바람직하게는 179T, 더 바람직하게는 A179T를 포함한다. 위치 223 잔기는 E를 포함하고, 바람직하게는 223E, 더 바람직하게는 G223E를 포함한다. 위치 229 잔기는 P를 포함하고, 바람직하게는 229P, 더 바람직하게는 S229P를 포함한다. 위치 307 잔기는 K를 포함하고, 바람직하게는 307K, 더 바람직하게는 H307K를 포함한다. 위치 309 잔기는 P를 포함하고, 바람직하게는 309P, 더 바람직하게는 A309P를 포함한다. 위치 334 잔기는 P를 포함하고, 바람직하게는 334P, 더 바람직하게는 S334P를 포함한다.
상기에 언급한 바와 같이, 바람직한 실시태양에서 위치 70 변이는 70D, 바람직하게는 G70D이다. 따라서 본 발명자들은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 모 폴리펩티드로부터 유래한 PS4 변이 폴리펩티드를 제공하며 PS4 변이 폴리펩티드는 잔기 33, 34, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 307, 309 및 334에 각각의 변이와 307 잔기에 K 또는 R을 치환한 변이를 포함하거나 위치 307 잔기는 H이며, 70 잔기에 70D로 치환한 변이이다.
바람직한 실시태양에서 272 잔기의 잔기는 "야생형" 즉, 변이되는 않은 것이다. 따라서 바람직하게 위치 272 잔기는 히스티딘(H)이다. 따라서 본 발명자들은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 모 폴리펩티드로부터 유래한 PS4 변이 폴리펩티드를 제공하며 PS4 변이 폴리펩티드는 잔기 33, 34, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 307, 309 및 334에 각각의 변이와 307 잔기에 K 또는 R을 치환한 변이를 포함하거나 307 잔기는 H이며, 70 잔기에 70D로 치환한 변이이며, 272 잔기는 H이다.
유사하게 303 잔기의 잔기는 "야생형" 또는 변이되지 않은 것이며, 바람직한 또 다른 실시태양에서 글리신(G)이다. 따라서 본 발명자들은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 모 폴리펩티드로부터 유래한 PS4 변이 폴리펩티드를 제공하며 PS4 변이 폴리펩티드는 잔기 33, 34, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 307, 309 및 334의 각각에 변이와 307 잔기에 K 또는 R을 치환한 변이를 포함하거나 307 잔기는 H이며, 70 잔기에 70D로 치환한 변이이며, 303 잔기는 G이다.
바람직한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩티드의 상기 실시태양 각각은 잔기 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 및 334에 추가 변이를 포함하며, 바람직하게 33 잔기는 Y, 바람직하게 34 잔기는 N, 바람직하게 70 잔기는 D, 바람직하게 121 잔기는 F, 바람직하게 134 잔기는 R, 바람직하게 141 잔기는 P, 바람직하게 146 잔기는 G, 바람직하게 157 잔기는 L, 바람직하게 161 잔기는 A, 바람직하게 178 잔기는 F, 바람직하게 179 T, 바람직하게 223 잔기는 E, 바람직하게 229 잔기는 P, 바람직하게 309 잔기는 P, 바람직하게 334 잔기는 P이다.
더욱 바람직한 실시태양에서 본 발명자들은 다음의 잔기 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P 및 334P를 포함하는 PS4 변이 폴리펩티드를 제공한다. PS4 변이 폴리펩티드는 다음의 변이 N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307K/R, A309P 및 S334P를 포함한다.
구체적으로 본 발명자들은 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열과 관련하여 다음의 치환 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K, 309P 및 334P 바람직하게는 N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307K, A309P 및 S334P를 포함하는 PS4 변이 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩티드는 서열번호: 21의 서열을 포함한다.
더욱이 본 발명자들은 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열과 관련하여 다음의 치환 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K, 309P 및 334P 바람직하게는 N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307R, A309P 및 S334P를 포함하는 PS4 변이 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩티드는 서열번호: 23의 서열을 포함한다.
더욱이 본 발명자들은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 모 폴리펩티드로부터 유래한 PS4 변이 폴리펩티드를 제공하며, PS4 변이 폴리펩티드는 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열과 관련하여 다음의 치환 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 309P 및 334P 바람직하게는 N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, A309P 및 S334P를 포함한다. 이러한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩티드는 서열번호: 25의 서열을 포함한다.
추가 치환
하기 표에서 개시된 바와 같이 하나 이상의 변이가 본 명세서에 기술된 PS4 변이 폴리펩티드에서 나타난다.
Figure 112009000481646-PCT00001
PS4 변이 핵산
또한 본 발명자들은 PS4 변이 폴리펩티드 서열에서 변이를 암호화거나 변이에 상응되는 서열을 지닌 PS4 핵산을 기술한다. 본 명세서에 기술된 목적을 위해 상기 폴리펩티드를 제조시 용도에 관하여 기술하였다. 따라서 본 발명자들은 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산을 제공한다.
당업자는 핵산과 폴리펩티드 서열, 특히 유전적 코드와 상기 코드의 퇴화(degeneracy) 사이의 관계를 알고 있으며 어려움 없이 상기 PS4 핵산을 제조할 수 있을 것이다. 예를 들면 당업자는 PS4 변이 폴리펩티드 서열에서 각각 아미노산 치환을 알고 있으며 치환 아미노산을 암호화하는 하나 이상이 코돈이 있다. 더욱이 특정 아미노산 잔기에 관해서 유전 코드의 퇴화에 의존하는 것이 명백하며, 하나 이상의 PS4 핵산 서열은 PS4 변이 폴리펩티드 서열에 상응하여 발생한다. 더욱이 PS4 변이 폴리펩티드는 하나 이상의 치환 예를 들면 예를 들면 A141P/G223A를 포함하며, 상응하는 PS4 핵산은 두 개의 아미노산 변화를 각각 암호화하는 코돈의 페어와이즈(pairwise) 조합을 포함한다.
PS4 변이 핵산 서열은 상기에서 기술된 모 폴리펩티드 중에서 어느 하나를 암호화하는 모 핵산으로부터 유래된다. 특히 모 핵산은 야생형 서열 예들 들면 서열번호: 6 또는 서열번호: 12를 포함한다. 따라서 PS4 변이 핵산은 야생형 논-말토제닉 엑소-아밀라아제를 암호화하는 핵산을 포함하나 이는 야생형 아미노산 잔기 대신에 관련된 위치에서 또 다른 아미노산을 암호화한다. 또한 PS4 변이 핵산 서열은 야생형 서열의 하나 이상의 변이를 지닌 서열을 포함한다. 예를 들면 상기 모 폴리펩티드를 암호화하는 변이와 야생형 서열 조합을 포함한다.
특이적인 PS4 변이 핵산 서열과 일치하지 않는 핵산 서열도 포함될 수 있다. 그러나 이들은 본 명세서에 기술된 방법 또는 조성물로 유용하게 사용될 수 있으며 예를 들면 변이체, 상동체, 유도체 또는 PS4 변이 핵산 서열의 단편 또는 이를 혼성화시킬 수 있는 상보체 서열 등이다. 한편 본 명세서에 다르게 기술되지 않았다면, "PS4 변이 핵산"이라는 용어는 상기 명시된 각각의 실체를 포함한다.
아미노산 서열 및 핵산 서열에서의 변이는 본 분야에 알려진 다수의 기술 중 하나에 의해 제조된다. 변이 서열은 알려진 변이 생성 기술 중 하나에 의해 용이하게 제조되며 예를 들면 PCR을 이용한 자리 지정 돌연변이(site directed mutagenesis)로 제조할 수 있다. 이 때 사용되는 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5' 부가-돌연변이, 미스매치된 프라이머 돌연변이 등에 사용된다. 한편 부가적으로 PS4 변이 핵산 서열은 새로이 만들어진다.
더욱 선호되는 실시태양에서 실시예에서 지시된 바와 같이, 상기 변이는 적절한 프라이머를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)로 모 서열에 삽입되었다. 따라서 기술된 바와 같이 모 폴리펩티드에 원하는 아미노산 치환을 삽입시킴으로써 바람직하게는 아미노산 또는 핵산 수준에서 슈도모나스 사카로필리아 또는 슈도모나스 스투제리 엑소-아밀라아제 서열과 같이 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 폴리펩티드의 서열을 변경시키는 것이 가능하다. 본 발명자들은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제를 암호화하는 핵산의 서열을 변경시킴으로써 논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 서열을 변경하는 방법을 기술하였다.
그러나 예를 들면 단계적 변이(step by step mutation)를 통해 PS4 변이 폴리펩티드가 실제로는 야생형 폴리펩티드 또는 핵산 서열로부터 반드시 유래할 필요가 없는 것으로 판단된다. 한편 PS4 변이 폴리펩티드의 서열은 당업자는 모든 변이와 당 분야에 알려진 방법으로 예를 들면 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 PCR을 사용하여 야생형 서열로부터 용이하게 제조할 수 있다. 사실 PS4 변이 폴리펩티드는 그것의 변이와 예를 들면 펩티드 합성 방법을 통해 새로이 제조할 수 있다.
그러나 일반적으로 PS4 변이 폴리펩티드 및/또는 핵산은 "전구체" 서열로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "전구체"라는 용어는 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 따라 변형되는 효소보다 선행된 효소를 의미한다. 그러므로 전구체는 변형된 효소를 생성하기 위해서 만들어진 효소를 포함한다. 따라서 전구체는 본 명세서에 기술된 바와 같이 변이 생성에 의해 변형된 효소이다. 한편 전구체는 야생형 효소, 변이 야생형 효소 또는 이미 변이된 효소이다.
PS4 변이 폴리펩티드 및 핵산은 당 분야에 알려진 방법으로 제조된다. 구체적으로는 PS4 변이 폴리펩티드는 발현 체계로부터 발현되며, 이는 사실상 생체 내 또는 실험관 내에서 발현된다. 구체적으로는 본 발명자들은 플라스미드 및 PS4 핵산 서열을 포함하고 바람직하게는 PS4 변이 폴리펩티드의 발현이 가능한 발현 벡터를 포함한다. 바람직하게는 PS4 핵산, 플라스미드 및 벡터로 변형된 세포 및 숙주 세포를 나타내고 또한 이들은 본 명세서에 포함되어 명확하게 제조된다.
예를 들면 PS4 변이 폴리펩티드는 실시예 4A에 기술된 바와 같이 PCR을 이용한 자리 지정 돌연변이 방법으로 제조될 수 있으며 이 때 사용되는 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5' 부가-돌연변이, 미스매치된 프라이머 돌연변이를 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면 307 잔기에 변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩티드를 제조하기 위해서 pSac-pMD229 서열; 녹말 결합 도메인(서열번호: 14)의 17개의 치환 및 결실을 지닌 슈도모나스 사카로필리아 말토테트라하이드로라제 핵산 서열;로 상보적인 핵산 서열이 제조되고, 관련된 변이가 유도된다. 당업자는 적절한 개시 서열이 사용되는 것을 인지할 수 있다. 또한 단일 단계 또는 다른 중간 서열을 통해 원하는 변이 폴리펩티드를 얻기 위해서 야생형 엑소-아밀라아제 서열로부터 개시하는 것이 가능하다는 것을 인지할 수 있다.
바람직한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩티드 서열은 분리형에서 음식 첨가제로서 사용된다. "분리된"이라는 용어는 적어도 하나의 다른 성분으로부터 유리되었다는 의미이고, 이는 자연에서 발견되거나 나타나는 서열이다. 하나의 관점에서 바람직하게는 상기 서열은 정제된 형태이다. "정제된"이라는 용어는 서열이 순수한 상태 예를 들면 적어도 약 90% 순도 또는 적어도 약 95% 순도 또는 적어도 약 98% 순도를 지닌 것이다.
더욱 바람직한 실시태양에서 핵산 서열은 서열번호: 22, 24 및 26으로 표시되는 서열을 포함한다.
위치 넘버링
넘버링에 의해 본 명세서에서 관련된 모든 위치는 하기에 나타난 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아말라아제 참고 서열의 넘버링에 관한 것이다(서열번호: 1)
Figure 112009000481646-PCT00002
참고 서열은 시그널 서열인 MSHILRAAVLAAVLLPFPALA을 제외하고는 SWISS-PROT 접근번호 P22963을 지닌 슈도모나스 사카로필리아 서열로부터 유래한 것이다.
C-말단 녹말 결합 도메인 EGGLVNVNFR CDNGVTQMGD SVYAVGNVSQ LGNWSPASAV RLTDTSSYPT WKGSIALPDG QNVEWKCLIR NEADATLVRQ WQSGGNNQVQ AAAGASTSGS F는 선택적으로 제거되거나 무시될 수 있다. 한편 이는 PS4 변이 폴리펩티드 서열에는 포함된다.
본 명세서에서 PS4 엑소-아밀라아제 효소의 아미노산 잔기의 특이한 넘버링이 채택된다. 이 점에 있어서 다양하게 알려진 엑소-아밀라아제의 아미노산 잔기 배열에 의해 엑소-아밀라아제 효소에서 아미노산 잔기 위치에 엑소-아밀라아제 아미노산 위치 넘버를 명백히 분할하는 것이 가능하다. 예를 들면 슈도모나스 사카로필리아로부터 얻어진 엑소-아밀라아제의 아미노산 서열로부터 이 넘버링 시스템 을 이용하여, 알려진 다수의 엑소-아밀라아제의 아미노산 서열을 배열하여, 엑소-아밀라아제에서 아미노산 잔기의 위치를 지정하는 것이 가능하다.
그러므로 넘버링 시스템은 기본 참고 지점으로 특이적인 서열이 사용되더라도 모든 관련 상동 서열에 적용되는 것이 가능하다. 예를 들면 위치 넘버링은 다른 슈도모나스 종 또는 다른 박테리아의 상동 서열로부터 적용된다. 바람직하게는 이와 같은 상동체는 참고 서열 서열번호: 1 상기 또는 SWISS-PROT 접근번호 P22963 또는 P13507을 갖는 서열 바람직하게는 모든 이들 서열과 60% 또는 더 높은 상동성 예를 들면 70% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상의 상동성을 지닌다. 단백질 사이에서 서열 상동성은 공지된 정렬 프로그램(alignment programs) 및 본 명세서에 기술된 혼성화 기술을 이용하여 확인하였다. 이와 같은 상동 서열은 하기에 기술된 것과 기능적으로 동일할 뿐만 아니라 본 명세서에서 "PS4 군"에 관련된 것이다.
더욱이 상기 내용에 주목한 바 본 명세서에 기술된 넘버링 체계는 참고 서열 서열번호: 1에 언급되어 있으며, 이는 시그널 서열 MSHILRAAVLAAVLLPFPALA을 제외하고는 SWISS-PROT 접근번호 P22963을 지닌 슈도모나스 사카로필리아로부터 유래되었다. 이 시그널 서열은 참고 서열의 N-말단에 위치하고 있으며 21 아미노산 잔기로 구성된다. 따라서 시그널 서열을 포함한 서열 또는 N- 또는 C-말단 연장 또는 제거를 포함한 서열에 상응하는 변이되거나 치환된 특정 잔기를 확인하는 것이 용이하다. N-말단에 첨가 또는 제거에 관하여 요구되는 모든 것은 삽입되거나 제거된 잔기의 수에 의해서 위치 넘버링을 오프셋(offset)하는 것이다. 예를 들면 서열번호: 1에서 위치 1은 시그널 서열의 위치 22에 상응한다.
모 효소/폴리펩티드
PS4 변이 폴리펩티드는 "모 효소" 또는 "모 폴리펩티드" 또는 "모 서열"로 알려진 변이체 또는 다른 서열로부터 유래된다.
본 명세서에서 기술된 "모 효소"라는 용어는 종결(close), 바람직하게는 클로젯(closet), 합성 변이체 즉 PS4 변이 폴리펩티드 또는 핵산의 화학적 구조를 지니는 효소를 의미한다. 모 효소는 전구체 효소(즉 실제로는 변이된 효소)이거나 새로이 제조된 것이다. 모 효소는 야생형 효소이거나 하나 이상의 변이를 포함하는 야생형 효소이다.
본 명세서에서 기술된 "전구체"라는 용어는 효소를 제조하기 위해서 변이된 효소에 선행하는 효소를 의미한다. 따라서 전구체는 돌연변이에 의해서 변이된 효소이다. 한편 전구체는 야생형 효소, 변이 야생형 효소 또는 이미 변이된 효소이다.
"야생형"이라는 용어는 당업자에 의해서 이해될 수 있는 당 분야의 용어이며 자연적으로 발생하는 종의 대부분의 특징적 표현형이며 돌연변이체의 표현형과는 대조적인 표현형을 의미한다. 따라서 본 명세서에서 야생형 효소는 관련된 종의 구성원 대부분에서 발견된 자연적인 효소의 한 형태이다. 일반적으로 본 명세서에 기술된 변이 폴리펩티드와 관련된 야생형 효소는 서열 상동성이라는 점에서 야생형 효소에 상응하여 매우 가깝게 관련되어 있다. 그러나 특정 야생형 서열은 본 명세서에 기술된 바와 같이 변이 PS4 폴리펩티드를 제조시 기본적으로 이용되며 이는 아미노산 서열 상동성이라는 점에서 가까이 관련되어 있는 다른 야생형 서열의 존재에 상관없이 야생형 서열에 상응한다.
모 효소 또는 폴리펩티드는 적절한 출발 폴리펩티드이다. 이는 바람직하게 효소 활성을 지닌다. 바람직하게는 효소 활성은 아밀라아제 활성이다. 더욱 바람직하게는 모 폴리펩티드는 엑소-아밀라아제 활성을 포함한다.
바람직하게는 모 효소는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 나타내는 폴리펩티드다. 바람직하게는 모 효소 그 자체는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제이다. 예를 들면 모 효소는 SWISS-PROT 접근번호 P22963 또는 슈도모나스 스투제리 논-말토제닉 엑소-아밀라아제를 지니는 폴리펩티드, SWISS-PROT 접근번호 P13507을 지니는 폴리펩티드와 같은 슈도모나스 사카로필리아 논-말토제닉 엑소-아밀라아제이다.
PS4 군의 다른 구성원은 모 효소로 사용되었다; 이와 같은 "PS4 군 구성원"은 일반적으로 이 들 두 효소와 유사하거나 상동성을 지니거나 기능적으로 동일하며 프로브를 사용하여 적절한 라이브러리의 혼성화 스크리닝과 같은 표준적인 방법 또는 게놈 서열 분석에 의해서 확인된다.
특히 "PS4 군"의 다른 구성원뿐만 아니라 이들 두 효소의 기능적 균등성은 본 명세서에 기술된 바와 같이 PS4 변이 폴리펩티드의 발생시 출발점 또는 모 폴리펩티드로서 사용되었다.
단백질의 "기능적 균등성"은 하나 이상의 바람직하게는 단백질의 기능의 모두를 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게는 이와 같은 기능은 생물학적 기능 바람직하게는 효소적 기능, 아밀라아제 활성과 같은 바람직하게는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성이다. 이와 같은 기능은 단백질, 엑소-특이성, 열안정성을 포함하며 견고성, 복원력, 응집력, 부스러짐(crumbliness) 및 굴곡성과 같은 개선된 핸들링의 특징을 포함한다(하기에 기술함).
모 효소와 관련해서, "기능적 균등성"이라는 용어는 바람직하게는 모 분자와 유사하거나 동일한 특징을 지니는 분자를 의미한다. 모 분자는 슈도모나스 사카로필리아 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 또는 슈도모나스 스투제리 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 또는 다른 소스로부터 얻어진 폴리펩티드이다.
슈도모나스 사카로필리아 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 SWISS-PROT 접근번호 P22963 또는 슈도모나스 스투제리 논-말토제닉 엑소-아밀라아제를 가지는 폴리펩티드, SWISS-PROT 접근번호 P13507을 가지는 폴리펩티드와 같은 모 효소와 관련해서 "기능적 균등성"이라는 용어는 기능적 균등성이 다른 종으로부터 얻어질 수 있다는 것을 의미한다. 기능적으로 동일한 효소는 상이한 아미노산 서열을 지니나 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌다. 기능을 결정하기 위한 분석의 예는 본 명세서에 기술되어 있고 당분야에 알려져 있다.
더욱 바람직한 실시태양에서 기능적 균등성은 상기 언급한 바와 같이 슈도모나스 사카로필리아 또는 슈도모나스 스투제리 논-말토제닉 엑소-아밀라아제와 바람직하게는 둘 모두와 서열 상동성을 갖는다. 또한 기능적 균등성은 하기 서열번호로서 개시된 서열과 서열 상동성을 지닌다: 서열번호: 1∼14, 바람직하게는 서열번호: 1 또는 서열번호: 7 또는 모두이다. 이와 같은 서열간의 서열 상동성은 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 65% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상이다. 이와 같은 서열 상동성은 당 분야에 공지된 다수의 컴퓨터 프로그램, 예를 들면 BLAST 또는 FASTA 등에서 하나에 의해 확인된다. 이러한 배열의 확인을 수행할 수 있는 적합한 프로그램은 GCG 위스콘신 베스트피트 패키지(University of Wisconsin, U.S.A; Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Research 12:387)가 있다. 이러한 서열의 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 패키지(Ausubel et al, 1999 ibid- Chapter 18 참고), FASTA (Atschul et al, 1990, J. MoI. Biol., 403-410) 및 GENEWORKS 등을 들 수 있다. 그러나 이와 같은 프로그램에 한정하는 것은 아니다. BLAST와 FASTA 모두 오프라인 및 온라인 검색이 가능하다(Ausubel et al, 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60 참고). 그러나 GCG 베스트피트 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다.
다른 하나의 실시태양에서 기능적 균등성은 상기 개시된 서열의 일부를 특이적으로 혼성화하는 것이 가능하다. 또 다른 개시된 서열의 일부를 혼성화하는 것이 가능한지 여부를 결정하는 방법은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어 Sambrook, et al (supra) 및 Ausubel, F. M. et al. (supra)에 기술되어 있다. 더욱 바람직한 실시태양에서 기능적 균등성은 엄격한 조건 예를 들어 65℃ 및 O.lxSSC {lxSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3 Citrate pH 7.0} 하에서 혼성화하는 것이 가능하다.
예를 들어 슈도모나스 사카로필리아 및 슈도모나스 스투제리 논-말토제닉 엑소-아밀라아제에서 서열 상동성을 지닌 기능적 균등성은 모 효소로서 사용하기 위해 적절하다. 이와 같은 서열은 하나 이상의 위치에서 슈도모나스 사카로필리아 서열과는 상이하다. 게다가 ATCC-l7686과 같은 사카로필리아 종의 다른 계통으로부터의 논-말토제닉 엑소-아밀라아제는 모 폴리펩티드로서 사용된다. PS4 변이 폴리펩티드 잔기는 변이 PS4 폴리펩티드 서열을 발생시키기 위해서 이들 모 서열의 한 부분으로 삽입된다.
상기에 개시한 바와 같이 PS4 변이 폴리펩티드가 부가적으로 하나 이상의 변이를 포함하는 것이 바림직하며 본 명세서에서 기술한 바와 같이 PS4 변이 폴리펩티드의 발생시 출발점 또는 모 폴리펩티드로 사용되기 위해서 상응하는 변이는 "PS4 군"의 다른 구성원뿐만 아니라 슈도모나스 종 논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 기능적으로 균등한 핵산 서열에서 만들어진다.
특이적으로 본 명세서에 포함된 "PS4 변이 폴리펩티드"라는 용어는 하기에 기술된 폴리펩티드이다.
미국특허 출원 제60/485,413호, 제60/485,539호 및 제60/485,616호; PCT 국제 출원 PCT/US2004/021723호 및 PCT/US2004/021739호; 미국특허 출원 제 10/886,905호 및 제10/866,903호; 미국특허 출원 제60/608,919호; 미국특허 출원 제60/612,407호; 제60/485,539호; PCT 국제 출원 PCT/IB2004/002487호; 미국특허 출원 제10/886,023호; 제10/886,505호, 제0/886,527호 및 제10/886,504호; 미국특허 출원 제10/947,612호이다. 그러나 상기 문헌은 본 발명의 선행 기술로 인정되지는 않는다.
이와 같은 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 출원의 용도 특히 식품 첨가제, 기술한 바와 같은 녹말의 처리, 식품 생성물의 제조, 베이커리 생성물의 제조, 개선된 조성물의 제형화, 조합의 제형화 등을 위해 적합하다.
모 서열의 변이
모 효소는 본 명세서에 기술된 PS4 변이 서열을 발생시키기 위해서 아미노산 수준 또는 핵산 수준에서 변형된다. 따라서 본 발명자들은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 상응하는 코돈 변화의 도입에 의한 PS4 변이 폴리펩티드의 발생을 제공한다.
상기 핵산 넘버링은 바람직하게는 서열번호: 6로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 뉴클레오티드 서열의 위치 넘버링에 관한 것이다. 한편 부가적으로 참고사항은 GenBank 접근번호 X16732와 서열로 만들어진다. 바람직한 실시태양에서 핵산 넘버링은 서열번호: 6로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 그러나 아미노산 잔기 넘버링과 같이 상기 서열의 잔기 넘버링은 오직 참고 목적으로만 사용된다. 특히 상기 코돈의 변화는 PS4 군 핵산 서열로 만들어질 수 있는 것으로 인식된다. 예를 들면 서열 변화는 슈도모나스 사카로필리아 또는 슈도모나스 스투제리 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 핵산 서열(예를 들면 X16732, 서열번호: 6 또는 M24516, 서열번호: 12)로 만들어진다.
모 효소는 "완전한" 효소로서 즉 자연에 존재하거나(또는 변이된) 그 자체가 분리된 형태로서 완전한 길이를 지닌다. 따라서 이와 같이 유래된 상기 PS4 변이체는 분리되거나 "전체-길이"를 지닌다. 상기 절단은 N-터미널 말단 또는 C-터미널 말단 바람직하게는 C-터미널 말단에서 일어난다. 활성 또는 불활성이든 상기 효소 또는 PS4 변이체는 서브시퀀스, 시그널 서열, 도메인 또는 모이어티(moiety)와 같은 하나 이상의 부분에서 결핍되어 있다. 예를 들면 모 효소 또는 PS4 변이체는 상기 기술한 바와 같이 시그널 서열이 결핍되어 있다. 한편 부가적으로 모 효소 또는 PS4 변이체는 하나 이상의 촉매 또는 결합 도메인이 결핍되어 있다.
더욱 바람직한 실시태양에서 모 효소 또는 PS4 변이체는 녹말 결합 도메인과 같은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제에서 존재하는 하나 이상의 도메인이 결핍되어 있다. 예를 들면 PS4 폴리펩티드는 위치 429까지 서열을 가지고 있으며 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 넘버링과 관련되어 있다. PS4 변이체 pSac-pMS382, pSac-pMS382R 및 pSac-pMS382H에 대한 경우에 주목하라.
또 하나의 실시태양에서 모 효소 또는 PS4 변이체는 "완전한" 효소이고 즉 자연에 존재하거나(또는 변이된) N 터미널 또는 C 터미널에서 하나 이상의 부가적인 아미노산 서열로서 완전한 길이를 지닌다. 예를 들면 모 효소 또는 PS4 변이 폴리펩티드는 N 터미널 또는 C 터미널 예를 들면 M, A, G 등에서 하나의 여분의 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직하게는 부가적인 아미노산 잔기는 N 터미널에 존재한다. 하나 이상의 부가적인 잔기는 포함되거나 첨가된 길이에 의해 오프셋되는 위치 넘버링이다.
아밀라아제
일반적으로 PS4 변이 폴리펩티는 아밀라아제 활성을 지닌다.
"아밀라아제"라는 용어는 당 분야의 통상적인 의미로 사용되었다-예를 들면 녹말의 분해를 촉매화하는 것이 가능한 효소이다. 특히 상기 효소들은 녹말에서 α-D-(1→4)O-글리코시드 결합을 분해시키는 것이 가능한 하이드로라제이다.
아밀라아제는 α-D-(1→4)O-글리코시드 결합을 분해시키는 하이드로라제로 분류된 녹말-분해 효소이다. 일반적으로는 α-아밀라아제(E.G. 3.2.1.1, α-D- (1→4)-글루칸 글루카노하이드로라제)는 임의적인 방법으로 녹말 분자 내에서 α-D-(1→4)O-글리코시드 결합을 분해시키는 엔도-활성 효소로 정의된다. 대조적으로 β-아밀라아제(E.G. 3.2.1.2, α-D-(l→4)-글루칸 말토하이드로라제) 및 말토제닉 α-아밀라아제(E.G. 3.2.1.133)와 같은 생성물-특이적인 아밀라아제와 같은 엑소-활성 아밀라아제 효소는 기질의 논-환원 말단으로부터 녹말 분자를 분해한다. β- 아밀라아제, α-글루코시다아제 (E.G. 3.2.1.20, α-D-글루코시드 글루코하이드로라제), 글루코아밀라아제 (E.C. 3.2.1.3, α-D-(l→4)-글루칸 글루코하이드로라제) 및 생성물-특이적인 아밀라아제는 녹말로부터 특이적인 길이의 말토-올리고당을 생성할 수 있다.
논-말토제닉 엑소-아밀라아제
본 명세서에 기술된 PS4 변이 폴리펩티드는 바람직하게는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 나타내는 폴리펩티드(또는 변이체)로부터 유래된다. 바람직하게는 이들 모 효소는 그 자체가 논-말토제닉 엑소-아밀라아제이다. 더욱 바람직한 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩티드는 그 스스로 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 나타낸다.
더욱 바람직한 실시태양에서 본 명세서에서 사용된 "논-말토제닉 엑소-아밀라아제 효소"라는 용어는 상기효소는 처음부터 녹말을 분해하여 본 명세서에서 기술된 절차에 따른 분석법에 의한 실질적인 양의 말토오즈로 분해하는 것은 아니다.
더욱 바람직한 실시태양에서 논-말토제닉 엑소-아밀라아제는 엑소-말토테트라하이드로라제이다. 엑소-말토테트라하이드로라제(E.C.3.2.1.60)는 통상적으로는 글루칸-1,4-α-말토테트라하이드로라제로 알려져 있다. 상기 효소는 비-환원 사슬 말단으로부터 연속하여 말토테트라로즈 잔기를 제거하기 위해서 녹말 다당류에서 1,4-α-D-글루코시드 결합을 가수분해한다.
논-말토제닉 엑소-아밀라아제는 참고문헌에 포함된 미국 특허 제6,667,065호에 상세하게 기술되어 있다.
논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성에 대한 분석
하기의 시스템은 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 따른 용도에 대해 적절한 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 폴리펩티드의 특성을 기술하기 위해 사용되었다. 예를 들어 상기 시스템은 본 명세서에 기술된 PS4 모 또는 변이 폴리펩티드의 특성을 기술하기 위해 사용되었다.
최초의 배경기술에 의해 왁스화된 옥수수 아밀로펙틴(Roquette로부터 WAXILYS 200으로 얻어짐, 프랑스)은 아주 높은 아밀로펙틴 함유량(90% 이상)을 갖는다. 왁스화된 옥수수 전분 20 mg/ml은 50 mM 755 MES (2-(N-몰포리노)에탄술폰산) 완충용액, 2 mM 염화칼슘, pH 6.0에서 3분 동안 가열하고, 5O℃에서 숙성되며 30분 이내에 사용된다.
논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 1 단위는 1 환원당 μmol/분에 가수분해 생성물 상당량을 생성시키는 효소의 함량으로 정의된다. 상기 기술한 바와 같이 제조시 50 mM MES, 2 mM 염화칼슘, pH 6.0에 10 mg/ml 왁스화된 옥수수 전분 4 ml을 넣은 시험관에서 50℃로 숙성한다. 환원당의 양은 표준품으로 말토오즈를 사용하거나 Bernfeld, Methods Enzymol, (1954), 1, 149-158의 디니트로살리실산 방법 또는 당 분야에 공지된 또 다른 방법을 사용하여 측정된다.
논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 가수분해 생성물의 패턴은 상기 기술한 바와 같이 제조된 완충용액에 10 mg/ml 왁스화된 옥수수 전분 4 ml을 넣은 시험관에서 50℃로 15분 또는 300분 동안 논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 0.7 단위를 숙성시킴으로써 측정된다. 상기 반응은 끓는 물 수조에서 3분 동안 시험관을 침지시킴으로써 중단된다.
상기 가수분해 생성물은 용출액으로 아세트산나트륨, 수산화나트륨 및 물을 사용하고, Dionex PA 100 컬럼을 사용한 이온 교환 HPLC를 사용하여 정량화되고 분석된다. 이 때 포도당부터 말토헵타오즈까지의 선형 말토올리고당의 표준품을 사용하여 펄스 전류법으로 검출한다. 말토옥타오즈 내지 말토데카오즈에 대한 상기 반응 인자는 말토헵토오즈를 사용하여 측정한다.
바람직하게는 PS4 변이 폴리펩티는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지니게 되며 상기 논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 0.7 단위는 50 mM 2-(N-몰포리노)에탄 술폰산 및 2 mM 염화칼슘을 포함한 예비-가열된 왁스화된 옥수수 전분/ml 완충 용액 10 mg의 수용액 4 ml에 pH 6.0, 온도 50℃로 15분 동안 숙성되면 상기 효소는 2∼10 D-글루코피라노실 단위 및 선택적으로 글루코오즈로부터의 하나 이상의 선형 말토-올리고당으로 구성된 가수분해 생성물을 생성한다; 상기 가수분해 생성물의 무게의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 및 더욱 바람직하게는 적어도 85%는 3∼10개의 D-글루코피라노실 단위로부터의 선형 말토올리고당, 바람직하게는 4∼8개의 D-글루코피라노실 단위로 구성된 선형 말토올리고당으로 구성된다.
참고문헌 및 본 발명이 목적의 예를 들면 50 mM 2-(N-몰포리노)에탄 술폰산 및 2 mM 염화칼슘을 포함한 예비-가열된 왁스화된 옥수수 전분/ml 완충 용액 10 mg의 수용액 4 ml에 pH 6.0, 온도 50℃로 15분 동안 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 0.7 단위를 숙성하는 것의 특징은 "왁스화된 옥수수 숙성 테스트"에 나타난다.
따라서 논-말토제닉 엑소-아밀라아제인 선호되는 PS4 변이 폴리펩티드는 2∼10개의 D-글루코피라노실 단위 및 선택적으로 글루코오즈로부터의 하나 이상의 선형 말토-올리고당으로 구성된 가수분해 생성물을 생성하기 위한 왁스화된 옥수수 전분 숙성 테스트에서 활성을 지니는 특징을 갖는다; 상기 가수분해 생성물의 무게의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 및 더욱 바람직하게는 적어도 85%는 3∼10개의 D-글루코피라노실 단위로부터의 선형 말토올리고당, 바람직하게는 4∼8개의 D-글루코피라노실 단위로 구성된 선형 말토올리고당으로 구성된다.
왁스화된 옥수수 전분 숙성 테스트에서 가수분해 생성물은 2∼10 D-글루코피라노실 단위 및 선택적으로 글루코오즈로부터의 하나 이상의 선형 말토-올리고당을 포함한다. 또한 왁스화된 옥수수 전분 숙성 테스트에서 가수분해 생성물은 다른 가수분해 생성물을 포함한다. 그럼에도 불구하고 3∼10개의 D-글루코피라노실 단위의 선형 말토올리고당의 중량%는 2∼10개의 D-글루코피라노실 단위 및 선택적으로 글루코오즈로부터의 하나 이상의 선형 말토-올리고당으로 구성된 가수분해 생성물의 함량을 기초로 한다. 다시 말하자면 3∼10개의 D-글루코피라노실 단위의 선형 말토올리고당의 중량%는 2∼10개의 D-글루코피라노실 단위 및 글루코오즈로부터의 하나 이상의 선형 말토-올리고당 이외에 다른 가수분해 생성물을 근거하지 않는다.
가수분해 생성물은 적절한 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들면 가수분해 생성물은 용출액으로 아세트산나트륨, 수산화나트륨 및 물을 사용하고, Dionex PA 100 컬럼을 사용한 이온 교환 HPLC를 사용하여 정량화되고 분석된다. 이 때 포도당부터 말토헵타오즈까지의 선형 말토올리고당의 표준품을 사용하여 펄스 전류법으로 검출한다.
참고문헌 및 본 발명이 목적의 예를 들면 Dionex PA 100 컬럼과 펄스 전류법 검출 및 표준품으로 사용된 글루코오즈에서 말토오즈까지 공지된 선형 말토올리고당을 이용한 음이온 교환 HPLC를 통한 가수분해 생성물 분석의 특징은 "음이온 교환에 의한 분석"에 나타난다. 물론 지시한 바와 같이 분석 기술은 선택적인 음이온 교환 기술로 가능하다.
따라서 선호되는 PS4 변이 폴리펩티드는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제이며 이것은 2∼10개의 D-글루코피라노실 단위 및 선택적으로 글루코오즈로부터의 하나 이상의 선형 말토-올리고당으로 구성되면, 음이온 교환에 의해 분석되는 것이 가능한 가수분해 생성물을 생성하기 위한 왁스화된 옥수수 전분 숙성 테스트에서 활성을 지닌다; 상기 가수분해 생성물의 중량의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 및 더욱 바람직하게는 적어도 85%는 3∼10개의 D-글루코피라노실 단위로부터의 선형 말토올리고당, 바람직하게는 4∼8개의 D-글루코피라노실 단위로 구성된 선형 말토올리고당으로 구성된다.
본 명세서에 기술한 바와 같이 "선형 말토-올리고당"이라는 용어는 통상적인 의미 즉 α-(1→4) 본드에 의해 결합된 α-D-글루코피라노즈 2∼10개의 단위의 의미로서 사용된다.
더욱 바람직한 실시태양에서 모 폴리펩티드와 비교시, 바람직하게는 동일한 조건에서 테스트시, 본 명세서에 기술된 상기 PS4 폴리펩티드는 개선된 엑소-아밀라아제 활성, 바람직하게는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌다. 특히 더욱 선호되는 실시태양에서 모 효소와 비교시, 바람직하게는 왁스화된 옥수수 전분 테스트에서 측정시 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 10% 그 이상, 바람직하게는 20% 그 이상, 바람직하게는 50% 그 이상의 엑소-아밀라아제 활성을 지닌다.
가수분해 생성물은 적절한 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들면 상기 가수분해 생성물은 Dionex PA 100 컬럼과 펄스 전류법 검출 예를 들면 표준품으로 글루코오즈에서 말토오즈까지 공지된 선형 말토올리고당을 이용한 음이온 교환 HPLC에 의해 분석된다.
본 명세서에서 기술된 "선형 말토-올리고당"이라는 용어는 통상적인 의미 즉 α-(1→4) 본드에 의해 결합된 α-D-글루코피라노즈 2∼20개의 단위의 의미로서 사용된다.
개선된 핸들링 특징
바람직하게는 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 모 효소와 비교시 하나 이상의 개선된 열안정성, 개선된 pH 안정성 또는 개선된 엑소-특이성과 같은 개선된 특징을 지닌다. 또한 바람직하게는 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 개선된 핸들링 특징을 지니며 식품 생성물은 모 효소 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교시 낮은 견고성 높은 복원력 또는 높은 응집력 중 한가지나 모든 특성을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드로 처리시킨 것이다.
특별한 이론에 의해 결합이 생성되지 않으면 본 발명자들은 특정한 위치에서 변이는 개별적이며 변이를 포함하는 폴리펩티드의 특징의 상승적인 효과를 지닌다고 여겨진다.
열안정성 및 pH 안정성
바람직하게는 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 열안정성; 바람직하게는 모 효소보다 더 높은 열안정성을 지닌다.
밀 및 다른 곡물에서 아밀로펙틴의 외부 측쇄는 DP 12∼19개의 범위이다. 따라서 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 본 명세서에 기술된 PS4 변이 폴리펩티드에 의해서 아밀로펙틴 측쇄의 효소 가수분해는 결정화 경향을 현저히 감소시킬 수 있다.
베이킹 목적으로 사용된 밀 및 다른 곡물에서 전분은 통상적으로 아밀라아제에 의한 효소 분해에 저항하는 전분 입자의 형태로 존재한다. 따라서 전분 변형은 주로 손상된 전분으로 제한되며 약 60℃에서 겔화가 시작될 때까지 천천히 반죽 과정 및 초기 빵 굽는 동안 진행된다. 본 발명의 결과로서 높은 온도의 열안정성을 지닌 아밀라아제만이 빵을 굽는 동안 효과적으로 전분을 변형시킬 수 있다. 그리고 통상적으로 아밀라아제의 효과는 열안정성이 증진되면 증가한다. 더 높은 열안정성을 지닐수록 효소는 빵을 굽는 오랜 시간 동안 활성이 유지되며 따라서 더 높은 항-스테일링 효과를 제공하기 때문이다.
따라서 식품 생성물의 제조, 예를 들면 빵을 굽는 동안이나 그 후 단계 중에서 전분을 첨가시 본 명세서에 기술된 PS4 변이 폴리펩티드의 사용은 노화를 지체시키거나 방해하거나 속도를 늦출 수 있다. 상기 용도는 하기에서 상세히 기술된다.
본 명세서에서 기술된 "열안정성"이라는 용어는 증가된 온도에 노출된 후 활성을 유지한 효소의 능력에 관한 것이다. 바람직하게는 PS4 변이 폴리펩티드는 약 55℃∼80℃ 그 이상의 온도에서 전분을 분해하는 것이 가능하다. 적절하게는 상기 효소는 약 95℃까지의 온도에 노출된 후에도 활성을 유지한다.
논-말토제닉 엑소-아밀라아제와 같은 효소의 열안정성은 반감기에 의해 측정된다. 따라서, 본 명세서에 기술된 PS4 변이 폴리펩티드는 바람직하게는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 그 이상 모 효소와 관련하여 확장된 반감기를 지니며, 바람직하게는 55℃∼95℃ 그 이상 바람직하게는 약 80℃의 상승된 온도에서 반감기를 갖는다.
본 명세서에서 기술된 반감기(t1/2)는 효소 활성의 반이 정의된 열 조건에서 불활성되는 동안의 시간(분)이다. 선호되는 실시태양에서 반감기는 80℃에서 분석된다. 바람직하게는 샘플은 80℃ 또는 그 이상에서 1∼10분 동안 가열된다. 그 후 반감기 값은 본 명세서에 기술된 방법 중 하나인 잔류 아밀라아제 활성 측정법으로 측정되었다. 바람직하게는 반감기 분석은 실시예에 더 상세하게 기술된 바와 같이 수행되었다.
바람직하게는 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 약 55℃ 온도에서 시작된 전분 입자의 겔화 후 빵을 굽고 전분을 가수분해하는 동안 활성을 갖는다. 더욱 열안정을 지닌 논-말토제닉 엑소-아밀라아제는 활성화될 수 있는 시간이 길어지고 따라서 더욱 강화된 항-스테일링 효과를 제공한다. 그러나 약 85℃의 온도 이상에서 빵을 굽는 동안 불활성화가 발생할 수 있다. 이와 같은 일이 발생하면 논-말토제닉 엑소-아밀라아제는 최종 베이킹 과정 후 실질적인 활성이 없기 때문에 점차적으로 불활성화된다. 그러므로 우선적으로 본 명세서에 기술된 용도에 적절한 논-말토제닉 엑소-아밀라아제는 50℃ 이상 98℃ 이하에서 최적의 온도 조건을 갖는다.
본 명세서에 기술된 PS4 변이체의 열안정성은 더욱 강화된 열안정성을 지니기 위해서 단백질 엔지니어링을 사용하여 개선될 수 있고 본 명세서에 기술된 용도에 대해 더욱 적합하게 될 수 있다; 따라서 본 발명자들은 단백질 엔지니어링에 의해 더욱 강화된 열안정성을 지니기 위해서 변이된 PS4 변이체의 용도를 포함한다.
바람직하게는 PS4 변이 폴리펩티드는 pH 안정성을 지니고; 더욱 바람직하게는, 동족의 모 폴리펩티드보다 더욱 높은 pH 안정성을 지닌다. 본 명세서에 기술된 "pH 안정성"이라는 용어는 넓은 pH 범위에서 활성화되는 효소의 능력에 관한 것이다. 바람직하게는 PS4 변이 폴리펩티드는 약 5∼약 10.5의 pH에서 전분을 분해하는 것이 가능하다. 하나의 실시태양에서 pH 안정성의 단계는 특정 pH 조건에서 효소의 반감기를 측정함으로써 분석된다. 또 다른 실시태양에서 pH 안정성의 단계는 특정 pH 조건에서 효소의 활성 또는 특정 활성을 측정함으로써 분석될 수 있다. 특정 pH 조건은 pH 5∼ pH 10.5 사이이다.
따라서 PS4 변이 폴리펩티드는 동일한 조건에서 모 폴리펩티드와 비교시 더 긴 반감기를 가지거나 또는 더 높은 활성(분석에 의존하여)을 지닌다. PS4 변이 폴리펩티드는 동일한 pH 조건에서 PS4 변이 폴리펩티드의 모 폴리펩티드와 비교시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 더 긴 반감기를 지닌다. 한편 부가적으로 PS4 변이 폴리펩티드는 동일한 pH 조건에서 모 폴리펩티드와 비교시 더 높은 활성은 지닌다.
엑소-특이성
어떤 논-말토제닉 엑소-아밀라아제는 약간의 엔도-아밀라아제 활성을 지닌다고 알려져 있다. 어떤 경우에는 상기 활성의 유형은 엔도-아밀라아제 활성이 가지형 덱스트린의 축적으로 끈적거리거나 점착성 크럼을 생성함으로써 최종 빵 생성물의 질에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 감소되거나 제거될 필요가 있다.
엑소-특이성은 전체 엔도-아밀라아제 활성에서 전체 아밀라아제 활성의 비율을 측정함으로써 유용하게 측정될 수 있다. 상기 비율은 본 명세서에서 "엑소-특이성 인덱스"로 나타낸다. 선호되는 실시태양에서 효소는 20 또는 이상의 엑소-특이성 인덱스를 지닌다면 즉 효소의 전체 아밀라아제 활성(엑소-아밀라아제 활성을 포함)이 효소의 엔도-아밀라아제 활성보다 20배 또는 그 이상이라고 여겨진다. 더욱 선호되는 실시태양에서, 엑소-아밀라아제의 엑소-특이성 인덱스는 30 또는 그 이상, 40 또는 그 이상, 50 또는 그 이상, 60 또는 그 이상, 70 또는 그 이상, 80 또는 그 이상, 90 또는 그 이상, 100 또는 그 이상이다. 더욱 바람직한 실시태양에서 엑소-특이성 인덱스는 150 또는 그 이상, 200 또는 그 이상, 300 또는 그 이상, 400 또는 그 이상, 500 또는 그 이상, 600 또는 그 이상이다.
전체 아밀라아제 활성 및 엔도-아밀라아제 활성은 당 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면 전체 아밀라아제 활성은 녹말 기질로부터 분해된 환원 말단의 전체 수를 분석함으로써 측정될 수 있다. 한편 베타아밀 에세이 방법은 실시예에 상세하게 기술되며, 편의상 실시예에서 분석된 바와 같이 아밀라아제 활성은 표에서 "베타아밀 단위"로 기술된다.
엔도-아밀라아제 활성은 파데바스(Phadebas) 키트(Pharmacia and Upjohn)의 사용으로 분석된다. 이는 블루 표지된 가교형 전분의 사용으로 측정한다(아조 염료로 라벨링됨); 전분 분자에서 내부 절단만이 표지를 방출시키며 외부 절단은 방출시키지 못한다. 염료의 방출은 분광광도계에 의해 측정된다. 따라서 파데바스 키트는 엔도-아밀라아제 활성을 측정하며 편의상 에세이의 결과(실시예에 기술됨)는 본 명세서에서 "파데바스 단위"로 나타낸다.
그러므로 더욱 바람직한 실시태양에서 엑소-특이성 인덱스는 베타아밀 단위/파데바스 단위로 나타내고 또한 "B/Phad"로 나타낸다.
또한 엑소-특이성은 선행기술에서 기술된 방법 예를 들면 국제특허 출원 제WO99/50399호에 따라 분석된다. 이는 엔도-아밀라아제 활성과 엑소-아밀라아제 활성간의 비율로서 엑소-특이성을 측정한다. 따라서 선호되는 관점에서 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 0.5 엔도-아밀라아제 단위(EAU)/ 엑소-아밀라아제 활성 단위 보다 작은 값을 지닌다. 바람직하게는 상기 본 발명에 따른 사용법에 대해 적절한 논-말토제닉 엑소-아밀라아제는 0.05 EAU/ 엑소-아밀라아제 활성 단위 보다 작은 값을 지니며 더욱 바람직하게는 0.01 EAU/ 엑소-아밀라아제 활성 단위 보다 작은 값은 지닌다.
본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 예를 들면 엑소-특이성 인덱스에 의해 측정되고, 엑소-아밀라아제을 지니고, 상기에 기술한 바와 같이 엑소-특이성을 지닌다. 더욱이 PS4 변이체는 PS4 변이체로부터 유래된 모 효소 또는 모 폴리펩티드와 비교시 더 높거나 증가된 엑소-특이성을 지닌다. 따라서 예를 들면 PS4 변이 폴리펩티드는 이들의 모 폴리펩티드, 바람직하게는 동일한 조건에서 비교시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 더 높은 엑소-특이성 인덱스를 지닌다. PS4 변이체는 이들의 모 폴리펩티드, 바람직하게는 동일한 조건에서 비교시 1.5x 또는 더 높은, 2x 또는 더 높은, 5x 또는 더 높은, 10x 또는 더 높은, 50x 또는 더 높은, 100x 또는 더 높다.
개선된 핸들링 특성
본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드와 비교시 하나 이상의 개선된 핸들링 특성을 포함한다. 선호되는 실시태양에서 상기 개선된 핸들링 특성은 개선된 베이킹 특성을 포함한다.
따라서 식품 생성물은 PS4 변이 폴리펩티드로 처리되며 PS4 변이체는 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교시 개선된 핸들링 또는 바람직하게는 베이킹 특성을 지닌다. 핸들링 또는 베이킹 특성은 하기의 군으로부터 선택됨을 특징으로 한다: 견고성, 복원력, 응집력, 부스러짐(crumbliness) 및 굴곡성이다.
이 핸들링 특성은 당 분야에 공지된 방법으로 테스트된다. 예를 들면 견고성, 복원력 및 응집력은 실시예에 기술한 바와 같이 예를 들면 Texture Analyser를 사용하여 텍스처 프로필 분석에 의해 빵 조각을 분석하여 측정한다.
견고성
식품 생성물이 낮은 견고성을 지닌 PS4 변이체로 처리되며 바람직하게는 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다.
바람직한 실시태양에서 견고성은 반대로 식품 생성물의 부드러움과 관련된다; 따라서 더 증가된 부드러움은 낮은 견고성을 나타내며 감소된 부드러움은 높은 견고성을 나타낸다.
바람직하게는 견고성은 실시예 13에 개시된 "견고성 평가 프로토콜"에 의해 측정된다.
따라서 식품 생성물은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 그 보다 더 낮은 견고성을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드로 처리되며 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다. 식품 생성물은 1.1x, 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 또는 그 보다 더 낮은 견고성을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드로 처리되며 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다.
복원력
식품 생성물이 높은 복원력을 지닌 PS4 변이체로 처리되며 바람직하게는 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다.
바람직하게는 복원력은 실시예 14에 개시된 "복원력 평가 프로토콜"에 의해 측정된다.
따라서 식품 생성물은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 그 보다 더 높은 복원력을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드로 처리되며 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다. 식품 생성물은 1.1x, 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 또는 그 보다 더 높은 복원력을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드로 처리되며 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다.
응집력
식품 생성물이 높은 응집력을 지닌 PS4 변이체로 처리되며 바람직하게는 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다.
바람직하게는 응집력은 실시예 15에 개시된 "응집력 평가 프로토콜"에 의해 측정된다.
따라서 식품 생성물은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 그 보다 더 높은 응집력을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드로 처리되며 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다. 식품 생성물은 1.1x, 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 또는 그 보다 더 높은 응집력을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드로 처리되며 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다.
부스러짐(Crumbliness)
식품 생성물이 적음 부스러짐을 지닌 PS4 변이체로 처리되며 바람직하게는 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다.
바람직하게는 부스럼짐은 실시예 16에 개시된 "부스러짐 평가 프로토콜"에 의해 측정된다.
따라서 식품 생성물이 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 9%, 100%, 200% 또는 그 보다 적은 부스러짐을 지닌 PS4 변이체로 처리되며 바람직하게는 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다. 식품 생성물은 1.1x, 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 또는 그 보다 더 적은 부스러짐을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드로 처리되며 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다.
굴곡성
식품 생성물이 높은 굴곡성을 지닌 PS4 변이체로 처리되며 바람직하게는 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다.
바람직하게는 응집력은 실시예 17에 개시된 "굴곡성 평가 프로토콜"에 의해 측정된다.
따라서 식품 생성물은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 그 보다 더 높은 굴곡성을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드로 처리되며 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다. 식품 생성물은 1.1x, 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x 또는 그 보다 더 높은 굴곡성을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드로 처리되며 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교된다.
구체적으로 본 발명자들은 개선된 굴곡성을 위해 자일라나제와 결합하여 본 명세서에 기술된 PS4 변이 폴리펩티드의 사용을 기술한다.
PS4 변이 폴리펩티드 및 핵산의 이용
상기 PS4 변이 폴리펩티드, 핵산, 숙주세포, 발현 벡터 등은 아밀라아제가 사용되는 용도에 이용된다. 특히 상기 PS4 변이 폴리펩티드, 핵산, 숙주세포, 발현 벡터 등은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제를 치환하기 위해서 이용된다. 상기 PS4 변이 폴리펩티드, 핵산, 숙주세포, 발현 벡터 등은 단독 또는 공지된 아밀라아제 또는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제와 협력하여 아밀라아제 또는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 보충하기 위해서 사용된다.
본 명세서에 기술된 상기 PS4 변이 서열은 식품 산업- 베이커리 및 음료 생성물과 같은-에서 다양한 용도로 사용되며, 또한 PS4 변이 서열은 제약 조성물 또는 심지어 화학 산업과 같은 다른 용도로도 사용된다. 특히 PS4 변이 폴리펩티드 및 핵산은 베이킹(WO 99/50399에 기술됨) 및 밀가루 표준화(부피 증가 또는 개선)를 포함하는 다양한 산업적인 용도에 유용하다. PS4 변이 폴리펩티드 및 핵산은 전분 및 다른 기질로부터 말토테트라로즈를 생성하기 위해 사용된다.
따라서 본 발명자들은 식품 생성물 제조시 방법, 다음을 포함하는 방법을 기술한다: (a) 논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 수득; (b) 본 명세서에 개시된 논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 하나 이상의 위치에 변이의 도입; (c) 식품 성분으로 유래한 폴리펩티드의 혼합 등이다.
PS4 변이 폴리펩티드는 빵과 같은 베이커리 생성물의 부피를 증가시키기 위해 사용된다. 특정 이론을 기초로 하지 않는다면 본 발명자들은 이는 엑소-아밀라아제 쇼트닝 아밀로오스 분자의 결과로서 가열되는(베이킹과 같은) 동안 반죽의 점도 감소로부터 유래된다고 여긴다. 이는 적은 저해물로 빵의 사이즈를 증가시키는 발효에 의해 이산화탄소 생성을 가능케 한다.
따라서 PS4 변이 폴리펩티드를 포함하거나 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물은 모 폴리펩티드로 처리되거나 처리되지 않은 생성물과 비교시 부피가 증가된다. 바꿔 말하면 식품 생성물은 식품 생성물의 공기/부피의 더 큰 부피를 지닌다. 한편 부가적으로 식품 생성물은 작은 밀도 또는 무게(또는 질량)/부피 비율을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드로 처리된다. 특히 선호되는 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩티드는 빵의 부피를 증가시키기 위해 사용된다. 부피 증가 또는 팽창은 식품의 검성(gumminess) 또는 전분성(starchiness)을 감소시키기 때문에 이점으로 작용한다. 가벼운 식품은 소비자들에게 더 선호되며, 소비자의 경험이 강화된다. 선호되는 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩티드의 사용은 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상으로 부피를 증가시킨다.
식품의 부피를 증가시키기 위한 PS4 변이 폴리펩티드의 사용은 실시예에서 상세하게 기술된다.
식품 사용법
본 명세서에 기술된 PS4 변이 폴리펩티드 핵산은 식품 또는 제조시 사용된다. 특히 PS4 변이 폴리펩티드는 식품에 첨가되고 즉 식품 첨가제이다. "식품"이라는 용어는 밀가루와 같은 식품 성분뿐만 아니라 제조된 식품 모두를 포함하는 것을 의미한다. 선호되는 관점에서 상기 식품은 사람을 위한 것이다. 상기 식품은 용액 또는 고체이다- 이용 및/또는 용도의 방식(mode) 및/또는 투여의 방식에 의존한다.
PS4 변이 폴리펩티드 및 핵산은 식품 성분으로 사용된다. 본 명세서에 기술된 "식품 성분"은 제형을 포함하며 이는 기능성 식품 또는 식료품이거나 기능성 식품 식료품이 첨가될 수 있으며 요구되는 예를 들면 산성화되거나 또는 유화되는 다양한 생성물의 낮은 농도에서 사용될 수 있는 제형을 포함한다. 식품 성분은 용액 또는 고체이다. 이용 및/또는 용도의 방식(mode) 및/또는 투여의 방식에 의존한다.
본 명세서에서 기술된 PS4 변이 폴리펩티드 및 핵산은 식품 보충제이거나 식품 보충제로 첨가된다. 본 명세서에서 기술된 상기 PS4 변이 폴리펩티드 및 핵산은 기능성 식품이거나 기능성 식품에 첨가된다. 본 명세서에 언급된 "기능성 식품"이라는 용어는 영양적인 효과 및/또는 맛의 만족뿐만 아니라 소비자에 배달하는 것에 유리한 이점을 제공하는 것이 가능한 식품을 의미한다. 비록 기능성 식품의 법적인 정의가 없을지라도 당 분야의 대부분 업자는 기능성 식품이 특정한 건강 효과를 지니는 식품이라는 것에 동의한다.
또한 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 식품 생성물 또는 식료품의 제조에 사용되었다. 전형적인 식료품은 유제품, 육류, 닭고기, 어류 및 밀가루 식품을 포함한다. 밀가루 식품은 찐빵 및 떡과 같이 튀기거나 굽거나 베이크하거나 찌는 것을 포함하는 가공 처리한 밀가루 식품이다. 더욱 선호되는 실시태양에서 식품 생성물은 베이커리 생성물이다.
바람직하게는 식료품은 베이커리 생성물이다. 전형적인 베이커리(베이크 된)생성물은 빵- 로우프, 롤, 둥근 빵, 피자, 패스트리, 프레첼, 토르티야, 케이크, 쿠키, 비스킷, 크래커를 포함한다.
바람직하게는 식품 생성물은 본 명세서에 기술된 하나 이상의 PS4 변이 폴리펩티드의 개선된 핸들링 또는 베이킹 특성으로 이익을 얻는다. 개선된 핸들링 또는 베이킹 특성은 다음의 군으로부터 선택됨을 특징으로 한다: 개선된 견고성, 개선된 복원력, 개선된 응집력, 개선된 부스러짐 및 개선된 굴곡성이다.
그러므로 본 발명자들은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제를 포함한 식품 첨가제를 변형시키는 방법, 본 명세서에 개시된 논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 하나 이상의 위치에서 변이를 유발시키는 것을 포함한 방법을 기술한다. 동일한 방법이 식품 성분 또는 식품 보충제, 식품 생성물 또는 식료품을 변형시키는데 사용될 수 있다.
노화/스테일링
본 발명자들은 전분 겔과 같은 전분 배지의 스테일링을 지연시키는 것이 가능한 PS4 변이 단백질의 사용을 기술한다. 특히 PS4 변이 폴리펩티드는 전분의 해로운 노화를 지연시키는 것이 가능하다.
대부분의 전분 입자는 2개의 폴리머의 혼합물로 구성된다: 필수적인 선형 아밀로오스 및 가지형 아밀로펙틴으로 구성된다. 아밀로펙틴은 아주 크고, (1-4) 결합에 의해 결합된 α-D-글루코피라노실 단위 사슬을 구성하는 가지형 분자이고, 이점에서 상기 사슬은 가지형 α-D-(l-6) 결합에 의해서 부착된다. 아밀로펙틴은 자연에 있는 모든 전분에 존재하고 대부분의 일반 전분의 약 75%로 구성된다. 아밀로오스는 α-D-(1-6) 가지를 거의 가지지 않는 α-D-글루코피라노실 단위에 연결된 (1-4)의 선형사슬이다. 대부분 전분은 약 25% 아밀로오스를 함유한다.
전분 입자는 물 존재시 가열하면 규칙-불규칙 상전이가 진행되고 이를 겔화라고 칭한다. 이 때 액체는 팽윤 입자로 투입된다. 겔화 온도는 전분에 따라서 다르다. 1시간 이내에 구운 빵 아밀로오스 단편을 식히는 것은 망상전분의 성장을 노화시킨다. 이 공정은 낮은 견고성 및 개선된 슬라이싱 특성을 지닌 원하는 크럼 구조를 만들 수 있다는 이점이 있다. 더욱이 점차적으로 아밀로펙틱의 결정화는 빵을 굽고 그 날 이내 전분 입자의 겔화를 발생시킨다. 이 과정에서 아밀로펙틴은 전분 입자에 포함된 아밀로오스 망상전분을 강화시키는 것으로 여겨진다. 이 강화는 빵 크럼의 견고성을 강화시킨다. 이 강화는 빵 스테일링의 중요한 요인 중 하나이다.
베이크된 생성물의 품질은 저장하는 동안 점차적으로 악화되는 것으로 여겨진다. 전분 결정화(또한 노화라고 불림)의 결과와 같이, 크럼의 함수능력은 식감 및 음식물의 특성을 특히 변화시킨다. 크럼은 부드러움 및 탄력성을 잃고 딱딱하고 푸석푸석해진다. 크럼의 견고성의 증가는 빵의 스테일링 과정을 측정하는데 사용된다.
아밀로펙틴의 해로운 노화 속도는 아밀로펙틴의 측쇄의 길이에 의존한다. 따라서 아밀로펙틴 측쇄의 효소 가수분해는 예를 들면 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드의 가수분해는 결정화 경향을 현저히 감소시킬 수 있다.
따라서 식품 생성물의 공정 단계 중 어느 한 단계에서 전분을 첨가시 예를 들면 빵을 굽는 동안이나 그 후, 본 명세서에 기술된 PS4 변이 폴리펩티드의 사용은 노화를 지체시키거나 방해하거나 속도를 늦출 수 있다. 이와 같은 사용은 하기에서 상세히 기술된다.
따라서 본 발명자들은 스테일링을 예방하는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 능력을 개선시키는 방법, 바람직하게는 밀가루 생성물의 해로운 노화(retrogradation)를 예방시키는 방법, 본 명세서에 개시된 논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 하나 이상의 위치에서 변이를 유발시키는 것을 포함한 방법에 대해 기술한다.
노화의 측정을 위한 방법(스테일링)
본 명세서에 기술된 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드의 항-스테일링 효과의 평가에 대해, 크럼 견고성이 당 분야에 공지된 Instron 4301 Universal Food Texture Analyzer 또는 이와 유사한 장비로 빵을 구운 후 1, 3, 7일에 측정되었다.
또 다른 당 분야의 전통적이고 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드의 전분 노화의 효과를 측정하는데 사용되는 방법은 DSC(differential scanning calorimetry, 시차주사열계량법)를 기반으로 한다. 본 명세서에서 효소가 없거나(대조군) 베이크된 모델 시스템 반죽으로부터 빵 크럼 또는 크럼에서 노화된 아밀로펙틴의 용융 엔탈피가 측정되었다. 기술된 실시예에서 적용된 DSC 장비는 20℃에서 95℃ 까지의 10℃/분 온도 기울기(gradient)를 지닌 Mettler-Toledo DSC 820 이다. 샘플의 제조시 크럼 10∼20 mg의 무게를 측정하고 이를 밀폐된 Mettler-Toledo 알루미늄 팬으로 이동시켰다.
실시예에서 기술된 모델 시스템 반죽은 표준 밀가루 및 논-말토제닉 PS4 변이 엑소-아밀라아제를 지니거나 지니지 않은 물 또는 완충용액의 최적의 양을 포함한다. 모델 시스템 반죽은 각각 6 또는 7분 동안 10 또는 50g Brabender Farinograph에서 혼합되었다. 반죽 샘플은 뚜껑이 있는 유리 시험관(15＊0.8 cm)에 놓여진다. 상기 시험관은 33℃에서 30분 발효된 후 수조에서 베이킹 과정이 진행되며, 이어 10℃/분 기울기로 33℃에서 95℃ 까지 가열되고 마지막으로 95℃에서 5분 발효시킨다. 그 후 상기 관은 DSC 분석에 앞서 20℃에서 자동온도조절장치에 저장된다.
선호되는 실시태양에서 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 대조군과 비교시 감소된 용융 엔탈피를 지닌다. 더욱 선호되는 실시태양에서 PS4 변이체는 10% 또는 그 이상의 감소된 용융 엔탈피를 지닌다. 바람직하게는 PS4 변이체는 대조군과 비교시 20% 또는 그 이상, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소된 용융 엔탈피를 지닌다.
전분 생성물의 제조
본 발명자들은 식품 생성물, 특히 전분 생성물의 제조시 PS4 변이 폴리펩티드의 사용법을 제공한다. 상기 방법은 전분 배지에 PS4 변이 폴리펩티드와 같은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 효소를 첨가함으로써 전분 생성물을 형성하는 것을 포함한다. 전분 배지가 반죽이라면 반죽은 밀가루, 물, PS4 변이 폴리펩티드 및 최적의 다른 성분 및 첨가제인 논-말토제닉 엑소-아밀라아제를 혼합함으로써 제조된다.
"전분"이라는 용어는 전분 그 자체 또는 전분의 구성성분, 특히 아밀로펙틴을 의미한다. "전분 배지"라는 용어는 전분을 포함하는 적절한 배지 중에서 하나를 의미한다. "전분 생성물"이라는 용어는 전분을 포함하거나 전분을 기초로 하거나 전분으로부터 유래된 생성물 중에서 하나를 의미한다. 바람직하게는 전분 생성물은 밀가루로부터 수득된 전분을 포함하거나 전분을 기초로 하거나 전분으로부터 유래된다. 그러나 바람직하게는 상기 용어는 다른 곡물로부터 수득된 것이 아닌 밀가루 그 자체로부터 수득된 분말을 의미한다. 따라서 달리 나타내지 않으면 본 명세서에서 사용된 "밀가루"에 관련된 용어는 반죽과 같이 배지에 존재하는 밀가루뿐만 아니라 밀가루 그 자체를 의미한다.
선호되는 가루는 밀가루 또는 호밀 또는 밀가루와 호밀의 혼합물이다. 그러나 다른 곡물 예를 들면 쌀, 옥수수, 보리, 수수로부터 유래된 분말을 포함하는 반죽도 가능하다. 바람직하게는 전분 생성물은 베이커리 생성물이다. 더욱 바람직하게는 전분 생성물은 빵 생성물이다. 더욱 바람직하게는 전분 생성물은 베이크된 곡식 분말의 빵 생성물이다. "베이크된 곡식 분말의 빵 생성물"이라는 용어는 밀가루, 물 및 반죽 형성 조건에서 팽윤제를 혼합함으로써 수득된 반죽을 기초로 한 베이크된 생성물 중에서 하나에 관한 것이다. 더욱이 구성성분은 반죽 혼합물에 첨가될 수 있다.
따라서 전분 생성물 베이크된 곡식 분말의 빵 생성물이라면 상기 제조 공정은 혼합물-적절한 절차에서-밀가루, 물, 반죽 형성 조건에서의 팽윤제 및 PS4 변이 폴리펩티드의 첨가, 프리믹스쳐의 형성을 포함한다. 팽윤제는 탄산수소나트륨 또는 사카로마이세스 세레비지에 계통 중 하나와 같은 화학적 팽윤제이다(Baker's Yeast).
PS4 변이 논-말토제닉 엑소-아밀라아제는 물 또는 반죽 성분 혼합물 또는 첨가제 또는 첨가제의 혼합물을 포함하는 반죽 성분과 함께 첨가된다. 상기 반죽은 제빵 산업에서 또는 생성물을 기초로 한 가루 반죽을 만드는 다른 산업에서 통상적인 반죽 제조 방법으로 제조될 수 있다.
곡식 분말의 빵 생성물 예를 들면 흰 빵, 볼트된 호밀 분말 또는 밀가루, 롤 등으로부터 만든 빵의 베이킹은 약 15∼60분 동안 180∼250℃의 범위의 온도에서 오븐에서 빵 반죽을 구움으로써 수행된다. 빵을 굽는 동안 가파른 온도 변화가(200→120℃) 베이크된 생성물의 특징적인 빵 껍질이 형성되는 바깥쪽 반죽 층에서 나타난다. 그러나 열 소비를 위한 증기 생성으로 크럼의 온도는 빵을 굽는 과정의 종료시점에서 약 100℃ 근처이다.
따라서 본 발명자들은 하기의 빵 생성물 제조를 위한 과정을 기술한다: (a) 전분 배지의 제공; (b) 본 명세서에 기술된 PS4 변이 폴리펩티드를 전분 배지에 첨가; 및 (c) 빵 생성물을 제조하기 위한 (b)단계 동안 또는 그 후에 전분 배지를 가열하기이다. 또한 본 발명자들은 본 명세서에 기술된 PS4 변이 폴리펩티드를 전분 배지에 첨가하는 포함하는 빵 생성물 제조를 위한 과정을 기술한다
상기 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 PS4 변이 폴리펩티드는 액상 제조물 또는 단독 활성 조성물로서의 효소 또는 하나 이상의 부가적인 반죽 성분, 반죽 첨가제인 혼합물 중에서 하나를 포함하는 건조 분말 혼합물로서 첨가될 수 있다.
개선 혼합물
본 발명자들은 더욱 개선 혼합물을 기술하며 이는 개선 혼합물 빵 또는 개선 혼합물 반죽을 포함한다. 이는 PS4 변이 폴리펩티드, 또 다른 성분 또는 효소 또는 둘 모두를 포함한다.
또한 본 발명자들은 베이킹시 개선 혼합물 빵 및 반죽의 이용을 제공한다. 또 다른 관점에서 본 발명자들은 베이크된 생성물 또는 개선 혼합물 빵 또는 개선 혼합물 반죽으로부터 수득된 반죽을 제공한다. 또 다른 관점에서 본 발명자들은 베이크된 생성물 또는 개선 혼합물 빵 또는 개선 혼합물 반죽의 이용으로부터 수득된 반죽을 기술한다.
반죽 제조
반죽은 밀가루, 물, PS4 변이 폴리펩티드(상기에 기술됨) 및 바람직하게는 다른 성분 및 첨가제를 포함한 개선 혼합물 반죽을 혼합함으로써 제조된다.
개선 혼합물 반죽은 밀가루, 물 또는 최적의 다른 성분 또는 첨가제를 포함한 반죽 성분 중에서 하나와 함께 첨가될 수 있다. 개선 혼합물 반죽은 밀가루, 물 또는 최적의 다른 성분 및 첨가제 이전에 첨가될 수 있다. 상기 개선 혼합물 반죽은 밀가루, 물 또는 최적의 다른 성분 및 첨가제 다음에 첨가될 수도 있다. 상기 반죽은 제빵 산업에서 또는 생성물을 기초로 한 가루 반죽을 만드는 다른 산업에서 통상적인 반죽 제조 방법으로 제조될 수 있다.
상기 개선 혼합물 반죽은 액상 제제 또는 단독 활성 조성물로서의 혼합물을 포함하거나 하나 이상의 반죽 성분 또는 첨가제인 혼합물에서 하나를 선택하여 건조 가루 혼합물의 형태로 첨가될 수 있다.
첨가된 PS4 변이 폴리펩티드 논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 양은 밀가루 50∼100,000 unit/kg, 바람직하게는 밀가루 100∼50,000 unit/kg의 완성된 반죽의 존재시 유래되는 양이다. 바람직하게는 상기 양은 밀가루 200∼20,000 unit/kg 범위이다. 한편 PS4 변이 폴리펩티드 논-말토제닉 엑소-아밀라아제는 밀가루(밀가루 0.02∼50mg 효소/kg)를 기초로 한 효소 0.02∼50 ppm, 바람직하게는 0.2∼10 ppm의 완성된 반죽 존재시 유래된 양에 첨가된다.
본 명세서에서 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 1 단위는 1μmol 환원당/분과 동일한 양의 가수분해 생성물을 방출시키는 효소의 양으로 정의되며 본 명세서에서 기술한 바와 같이 50 mM MES, 2 mM 염화칼슘, pH 6.0에 10 mg/ml 왁스화된 옥수수 전분 4 ml을 넣은 시험관을 50℃에서 발효시킨다.
본 명세서에 기술된 반죽은 휘트밀 또는 밀가루 및/또는 다른 형태의 곡식, 밀가루, 또는 전분 콘 분말, 콘 전분 , 옥수수 분말, 쌀 분말, 호밀, 호밀 분말, 오트 분말, 오트밀, 콩 분말, 사탕수수, 사탕수수 분말, 포타토밀, 감자 분말, 감자 전분을 포함한다. 상기 반죽은 신선하며, 냉동되거나 부분적으로 구워진다.
상기 반죽은 팽윤된 반죽이거나 팽윤될 반죽이다. 상기 반죽은 화학적 팽윤제 예를 들면 탄산수소나트륨 또는 팽윤제(발효된 반죽)을 첨가하는 것과 같은 다양한 방법을 통해 팽윤될 수 있으나 사카로마이세스 세레비지에(baker's yeast) 예를 들어 사카로마이세스 세레비지에 가능한 계통과 같은 적절한 효모 배지를 첨가함으로써 반죽을 팽윤시키는 것이 선호된다.
상기 반죽은 과립모양의 지방 또는 쇼트닝과 같은 지방을 포함한다. 상기 반죽은 모노 또는 디글리세라이드, 지방산의 당 에스테르, 지방산의 폴리글리세롤 에스테르, 모노글리세라이드의 젖산 에스테르, 모노글리세라이드의 아세트산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트 또는 리소레시틴과 같은 유화제를 포함한다.
또한 본 발명자들은 본 명세서에 기술된 밀가루를 포함하는 프리믹스에 관해서 기술한다. 프리 믹스는 반죽 향상 및/또는 브래드 향상 첨가체를 포함할 수 있다. 이와 같은 첨가제의 예로서는 여기에 기술된 효소를 포함한다.
반죽의 추가 첨가제 또는 성분
베이크된 생성물의 성능을 더욱 향상시키고 베이크된 생성물의 특성을 부여하기 위해서 추가적 반죽 성분 및/또는 반죽 첨가제가 반죽에 함유될 수 있다. 이 같은 반죽 성분으로는 소금, 곡물, 지방 및 오일, 당 또는 감미료, 식이섬유, 분유와 같은 단백질, 콩 그루텐 또는 달걀과 같은 성분을 반죽에 더욱 포함할 수 있다. 또한 유화제와 같은 반죽 첨가제, 다른 효소, 하이드로콜로이드, 향미료, 산화제, 미네랄 및 비타민을 더욱 첨가할 수 있다.
유화제는 반죽 강화제 및 크럼 연화제(softener)로 유용하다. 반죽 강화제로서 유화제는 휴지기에 있어 완충제로 제공되며 저장중의 쇼크에 완충제로 사용될 수 있다. 또한 반죽 강화제는 발효기간 중에 반죽의 변화에 대한 완충제로 효과적이다. 대부분의 반죽 강화제는 베이크된 제품의 저장 중 부피의 증가를 완화시키는 작용을 한다. 마지막으로 반죽 강화제는 레시피 혼합물에 존재하는 지방의 유화를 촉진한다.
적절한 유화제로는 레시틴, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 식용 지방산의 모노- 및 디글리세라이드, 식용 지방산의 모노- 또는 디글리세라이드 아세트산 에스테르, 식용 지방산의 모노- 또는 디글리세라이드 젖산 에스테르, 식용 지방산의 모노- 또는 디글리세라이드 구연산 에스테르, 식용 지방산의 모노- 또는 디글리세라이드 디아세틸 타타르산 에스테르, 식용 지방산의 슈크로오즈 에스테르, 소듐 스테아로일-2-락틸레이트 및 칼슘 스테아로일-2-락틸레이트 등을 들 수 있다.
반죽 추가 첨가제 또는 추가 성분은 밀가루, 물 또는 선택적으로 다른 성분 또는 첨가제 또는 반죽 개선 조성물 등의 반죽 성분과 함께 첨가될 수 있다. 반죽 추가 첨가제 또는 추가 성분은 밀가루, 물 선택적으로 다른 성분 또는 첨가제 반죽 개선 조성물 등의 반죽 성분 이 전에 첨가할 수 있다. 또한 반죽 추가 첨가제 또는 추가 성분은 밀가루, 물 선택적으로 다른 성분 또는 첨가제 반죽 개선 조성물 등의 반죽 성분 이 후에도 첨가할 수 있다.
반죽 추가 첨가제 또는 추가 성분은 액상 제제인 것이 편리하다. 그러나 반죽 추가 첨가제 또는 추가 성분은 건조된 조성물 형태인 것이 편리할 수도 있다.
반죽 추가 첨가제 또는 추가 성분은 바람직하게는 반죽의 밀가루 중량에 적어도 1% 정도이다. 더욱 바람직하게는 반죽 추가 첨가제 또는 추가 성분은 밀가루 중량에 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 가장 바람직하게는 적어도 6%이다. 만약 첨가제가 지방이라면 지방의 적절한 함량은 1 내지 5% 더욱 절절하게는 1 내지 3% 가장 적절하게는 약 2% 정도이다.
추가 효소
PS4 변이 폴리펩티드에 추가하여 하나 또는 그 이상의 추가 효소를 사용할 수 있으며, 예를 들면 식품, 반죽 제조, 식료품 또는 전분 조성물에 첨가할 수 있다.
추가 효소는 예를 들면 하기의 군으로부터 선택될 수 있다: (a) 노바밀 또는 말토제닉 α-아밀라아제 활성을 지닌 변이체, 상동체 및 돌연변이체; (b) GRINDAMYLTMPOWERBake 900(Danisco A/S)과 같은 자일라나제; (c) Max-Life U4(Danisco A/S)와 같은 박테리아 α-아밀라아제; 및 (d) GRINDAMYLTMPOWERBake 4050(Danisco A/S)과 같은 리파아제.
하나의 실시태양에서 본 발명에 따르는 PS4 변이 폴리펩티드는 산화환원효소, 가수분해효소, 리파아제, 에스테라제, 글루코시다제, 아밀라제, 플루라나제, 자일라나제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 전분 분해효소, 프로테아제, 라이포옥시게나아제로 구성된 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 효소와 결합하여 사용된다. 바람직한 실시태양에서 상기 조성물은 적어도 하나의 PS4 변이체 및 WO91/04669에 기술된 바실러스로부터 유래한 말토제닉 아밀라아제를 포함한다. 바람직한 실시태양은 PS4 변이체 및 밀가루를 포함한다.
반죽에 첨가되는 추가 효소는 α-아밀라아제, 플루라나제 및 자일라나제와 같은 글루코시다제뿐만 아니라 에스테라제 및 리파아제와 같은 산화환원효소, 가수분해효소 등을 들 수 있다. 산화환원효소는 예를 들면 글루코오즈 옥시다아제 및 헥소오즈 옥시다아제 등을 들 수 있고 반죽 강화제 및 베이크 생성물의 볼륨 조절제로 사용할 수 있다. 자일라나제와 다른 헤미셀룰라아제는 반죽의 크럼 견고성 및 빵 부피 핸들링 특성을 개선시키기 위해 첨가된다. 리파아제는 반죽 강화제 및 크럼 연화제로 유용하고 α-아밀라아제와 다른 아밀로 효소는 반죽에 첨가되어 빵의 볼륨을 조절하고 크럼의 견고성을 감소시키는데 유용하다.
이와 같은 추가 효소는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 전분분해효소, 프로테아제, 라이포옥시게나아제로 구성된 군에서 선택하여 사용할 수 있다.
유용한 산화환원효소의 예로는 말토오즈 산화 효소, 글루코오즈 옥시다아제(EC 1.1.3.4), 카보하이드레이트 옥시다아제, 글리세롤 옥시다아제, 피라노오즈 옥시다아제, 갈락토오즈 옥시다아제(EC 1.1.3.10) 및 헥소오즈 옥시다아제(EC. 1.1.3.5) 등을 들 수 있다. 상기 효소는 반죽 강화제 및 베이크 생성물의 볼륨 조절을 위해 사용될 수 있다.
전분분해 효소 중에는 아밀라아제가 반죽에 가장 효과적인 첨가제이다. α-아밀라아제는 전분으로부터 덱스트린으로 분해시키고 β-아밀라아제는 이를 말토오즈로 더욱 분해시킨다. 적절한 아밀라아제의 예는 바실러스 스테아로써모필러스(stearothermophilus)(NovamylTM(Novozymes)과 같은)로부터의 글루칸-1,4-α-말토테트라하이드로라제(EC 3.2.1.133)로 불리는 말토제닉 α-아밀라아제, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(amyloliqufaciens)(Max Life U4 (Danisco A/S)와 같은)로부터의 α-아밀라아제, B. flavothermus 아밀라아제(US 2005004861 IAl), 바실러스 스테아로써모필러스(WO2005019443)로부터의 α-아밀라아제(EC 3.2.1.133)가 삽입된 진균 아밀라아제 변이체 , US20060147581A1에 기술된 아밀라아제 혼성체 및 말토제닉 α-아밀라아제 활성을 지니는 그들의 변이체, 상동체, 유도체를 포함한다. 바람직한 실시태양에서 PS3 변이 폴리펩티드는 아밀라아제 특히 말토제닉 아밀라아제와 결합된다. 말토제닉 α-아밀라아제(글루칸 1,4-α-말토테트라하이드로라제, E.C. 3.2.1.133)는 아밀로오스와 아밀로펙틴 내의 알파-컨피규레이션을 가수분해시켜 말토오스로 전환시킬 수 있다. 다른 유용한 전분 분해효소는 효소를 반죽 조성에 첨가할 수 있으며 이는 글루코아밀라아제 및 플루라나제 등이다.
바람직하게, 추가 효소는 적어도 자일라나제 및/또는 적어도 아밀라아제이다. 이 때 "자일라나제"라는 용어는 본 명세서에서 자일로사이딕 결합을 가수분해시키는 자일라나제(EC 3.2.1.32) 효소를 의미한다. 또한 리파아제를 첨가할 수도 있다. 자일라나제의 적절한 예는 바실러스(Bacillus) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 써모마이세스(Thermomyces) 속 또는 트리코데르마(Trichoderma) 속(GRIND AMYL™ POWERBake 900 (Danisco AZS))로부터의 베이커리 자일라나제 및 과(Family) 10 또는 11에 속한 자일라나제 예를 들면 써모마이세스 랑고기노서스(Thermomyces lanoginosus)(이전에는 Humicola insolens라고 불림), 아스퍼질러스 아큐레아투스(Aspergillus aculeatus)(WO 94/21785), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans)(WO 2005/059084), 바실러스 속(EP 0 720 649 Bl), 바실러스 아가데헤렌스(B. agadeherens)(US 5,770,424) 및 이들의 변이체, 상동체 및 유도체를 포함한다.
"아밀라아제"라는 용어는 여기서 α-아밀라아제(EC 3.2.1.1), β-아밀라아제(EC 3.2.1.2) 및 γ-아밀라아제(EC 3.2.1.3)과 같은 아밀라아제 효소를 의미한다.
추가 효소는 밀가루, 물 또는 선택적으로 다른 성분 또는 첨가제 또는 반죽 개선 조성물 등의 반죽 성분과 함께 첨가될 수 있다. 추가 효소는 밀가루, 물 선택적으로 다른 성분 또는 첨가제 반죽 개선 조성물 등의 반죽 성분 이 전에 첨가할 수 있다. 또한 추가 효소는 밀가루, 물 선택적으로 다른 성분 또는 첨가제 반죽 개선 조성물 등의 반죽 성분 이 후에도 첨가할 수 있다. 반죽 추가 첨가제 또는 추가 성분은 액상 제제인 것이 편리하다. 그러나 반죽 추가 첨가제 또는 추가 성분은 건조된 조성물 형태인 것이 편리할 수도 있다.
반죽 개선 조성물의 일부 효소는 밀가루 반죽의 호변변이(rheological) 및/또는 기계적인 특성을 개선시키는 범위 내에서 반죽 조건 하에 서로 상호 작용될 수 있다. 생성물의 품질은 첨가제뿐만 아니라 효소간의 상호작용에 의해 상승 작용되어 품질을 향상시킨다.
반죽(완성된 생성물)으로부터 제조된 생성물의 개선에 관련하여 효소의 조합은 크럼 구조에 관해 실질적인 상승효과를 유래하는 것이 밝혀졌다. 또한 베이크된 생성물의 부피에 관해서도 효소의 조합은 상승효과를 나타내는 것이 가능하다.
추가 효소는 카르복실레이트를 방출시키는 카르복실 에스테르 결합을 가수분해하는 것이 가능한 리파아제이다(EC 3.1.1). 리파아제의 실시예는 트라아실글리세롤 리파아제(EC 3.1.1.3), 갈락토리파아제(EC 3.1.1.26), 포스포리파아제 A1(EC 3.1.1.32), 포스포리파아제 A2(EC 3.1.1.4) 및 리포프로테인 리파아제 A2(EC 3.1.1.34)를 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로는 적절한 리파아제는 뮤코르 미에헤이(Mucor miehei), 푸사리움 베네나텀(F. venenatum), H. lanuginosa, 리조무코 미에헤이(Rhizomucor miehei), 캔디다 안타크티카(Candida antarctica), 푸사리움 옥시포럼(F. oxysporum)으로부터 유래된 리파아제, 푸자리움 헤테로스포럼(Fusarium heterosporum)(GRIND AMYL™ POWERBake 4050 (Danisco A/S)과 같은) 및 이들의 변이체, 상동체 및 유도체로부터 유래된 글루코리파아제를 포함한다.
다른 용도
PS4 변이체는 말토오스 및 고 농도 말토오스 시럽의 제조시 적절하게 사용된다. 이와 같은 생성물은 낮은 흡습성, 낮은 점성, 훌륭한 열 안정성 및 너무 달지 않은 말토오스의 맛 때문에 특정한 제과 제품의 제조에 상당한 이점이 있다. 말토오스 시럽을 제조하는 제조 공정은 용해된 전분, 말토오스를 생성하는 효소를 통한 당화 및 선택적으로 아밀로펙틴의 1,6 분지점을 절단하는 효소 예를 들면 α-1,6-아밀로글루코시다아제 등을 포함한다.
본 명세서에서 PS4 변이체는 세정제(detergent) 혼합물의 구성성분에 첨가되거나 구성성분이 된다. 예를 들면 세정제 조성물은 얼룩진 섬유 및 섬유 유연제 혼합물의 전-처리에 적당한 세탁물 첨가제 혼합물을 포함하는 손 또는 기계 세탁 세정제 조성물로 제형화되거나, 집의 견고한 표면을 청소시 사용하는 세정제 조성물로 제형화되거나, 손 또는 식기세척기 작동에 대해서도 제형화된다. 특이적인 관점에서 본 발명자들은 PS4 변이체를 포함하는 세정제 첨가제를 기술한다. 세정제 조성물뿐만 아니라 세정제 첨가제는 하나 이상의 다른 효소 프로테아제, 리파아제. 큐틴아제, 아밀라아제, 카르복실라아제, 셀룰라아제, 펙틴아제, 만난아제, 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 옥시다아제, 예를 들면 라카아제 및/또는 페르옥시다아제를 포함한다. 선택된 효소의 일반적인 특성은 선택된 세정제(즉 다른 효소 및 비-효소 성분과 공존 가능한 최적-pH)와 공존 가능하며 상기 효소는 유효 양으로 존재한다.
또한 PS4 변이체는 휴지 및 판지를 강화시킨 전분으로부터의 목질 섬유소 물질 예를 들면 펄프, 종이 및 판지의 제조시 사용되며 특히 재-펄프는 pH 7 이상에서 만들어지며 아밀라아제는 강화 전분의 분해를 통해 폐기물의 분해를 유도한다. PS4 변이체는 특히 인쇄된 종이로 코팅된-전분으로부터 제지 펄프를 제조하는 공정에 유용하다. 상기 공정은 하기 단계를 포함하는 WO 95/14807호에 기술된 바와 같이 수행된다: a) 펄프를 제조하기 위한 종이의 분해, b) 단계 a) 이전이나 그 동안이나, 그 이후에 전분-분해 효소로 처리 및 c) 단계 a) 및 단계 b) 이후에 펄프로부터 잉크 입자를 분리하기이다. 또한 PS4 변이체는 변이 전분으로 유용하게 사용할 수 있으며, 이 때 효소적으로 변이된 전분은 탄산칼슘, 고령토 및 점토와 같은 알칼리 충전제와 함께 종이 제조에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 PS4 변이체는 충전제의 존재시 전분의 변형을 가능케 하고 이는 더욱 간단한 통합된 공정으로 사용할 수 있게 한다. 또한 PS4 변이체는 직물의 발호(desizing)에 유용하다. 직물 제조 공정에서, 아밀라아제는 전통적으로 직조(weaving)시 위사(weft yarns)의 보호 코팅으로서 작용하는 전분-함유 사이즈의 제거를 위해 편리한 발호 공정에 보조제로서 사용된다. 직조 후 사이즈 코팅의 완전한 제거는 연속되는 공정의 최적화를 위해 중요하다. 연속되는 공정은 섬유를 닦고 표백하고 염색하는 것이다. 효소 전분 분해는 섬유 물질에 해로운 영향을 끼치지 않기 때문에 선호된다. PS4 변이체는 셀룰로오스-함유 섬유 또는 직물의 발호시 단독 또는 셀룰라아제와 함께 사용할 수 있다.
또한 PS4 변이체는 전분으로부터 감미료를 생성하는 아밀라아제의 하나로 선택될 수 있다. 전분을 과당시럽으로 전환시키는 "전통적인" 공정은 세 개의 효소 반응으로 구성되어 있으며 이는 액화(liquefaction) 공정, 당화(saccharification)공정 및 이성질화(isomerization) 공정이다. 액화 공정 동안 전분은 약 2시간 동안 95∼160℃의 온도, pH 5.5∼6.2 사이에서 아밀라아제에 의해 덱스트린으로 분해된다. 이들 조건에서 최적의 효소 안정화를 유지하기 위해서 칼슘 1 mM이 첨가된다(40 ppm 유리 칼슘 이온). 액화 공정 후 덱스트린은 글루코아밀라아제 및 가지가 제거된 효소 예를 들면 이성질화효소 또는 풀루라나제를 첨가하여 덱스트로즈로 전환된다. 이 단계 전에 pH는 4.5 이하로 감소되고 고온(95℃ 이상) 및 액화가 유지되며, 아밀라아제 활성이 변성된다. 온도는 60℃ 보다 낮아지고 글루코아밀라아제 및 가지가 제거된 효소가 첨가된다. 당화 공정은 24∼72 시간 동안 진행된다.
세탁(laundry) 세제 조성물 및 용도
본 명세서에서 기술된 상기 α-아밀라아제 변이체는 접시 닦기 또는 다른 성분을 세척하기 위한 세정제 조성물로 제형화된다. 이들은 겔, 분말 또는 액체일 수 있다. 상기 조성물은 α-아밀라아제 변이체 단독, 다른 녹말분해성효소, 다른 클리닝 효소 및 다른 클리닝 조성물인 일반적 성분을 포함할 수 있다.
따라서 접시세척 세정제 조성물은 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 음이온, 비-이온성, 양이온, 양쪽성 또는 이들의 혼합물이다. 상기 세정제는 낮은 비-발포 에톡시화, 프로폭시화 직쇄 알코올과 같은 비-이온성 계면활성제 무게로 0% ∼ 약 90% 함유할 수 있다.
세정제 출원에서, α-아밀라아제 변이체는 프로필렌 글리콜을 포함하는 액상 조성물에서 유용하게 사용된다. α-아밀라아제 변이체는 프로필렌 글리콜에 용해되는데 예를 들면 10% CaCl2를 포함하는 25% volume/volume 프로필렌 글리콜 용액에서 회합됨으로써 용해된다.
접시세척 세정제 조성물은 무기 및/또는 유기 타입의 세정제 빌더염(builder salt)을 포함한다. 세정제 빌더는 인(P)-함유 및 비-인(P)-함유 타입으로 나뉜다. 세정제 조성물은 세정제 빌더 1% ∼ 약 90%를 함유한다. 인-함유 무기 알칼리성 세정제 빌더의 예는 가용성 염, 특히 알칼리 금속 피로인산염(pyrophosphates), 오쏘인산염(orthophosphates) 및 폴리인산염(polyphosphates)을 포함한다. 인-함유 유기 알칼리성 세정제 빌더의 예는 phosphonate의 가용성 염을 포함한다. 비-인-함유 무기 알칼리성 세정제 빌더의 예는 불용성 결정 또는 비결정 알루미노규산염(alumino silicate), 대표적으로 잘 알려진 제올라이트 뿐만 아니라 가용성 알칼리 금속 탄산염, 붕산염 및 규산염을 포함한다.
적절한 유기 빌더의 예는 알칼리 금속을 포함한다; 암모늄 및 치환된 암모늄; 시트레이트; 숙신산염; 말로네이트; 지방산 술폰네이트; 카르복시메톡시 숙신산염; 암모늄 폴리아세테이트; 카르복실레이트; 폴리카르복실레이트; 아미노폴리카르복실레이트; 폴리아세틸 카르복실레이트; 및 폴리하이드로술폰네이트.
또 다른 적절한 유기 빌더는 빌더 특성을 지닌 것으로 알려진 더 큰 분자량 폴리머 및 코-폴리머(co-polymer), 예를 들면 적절한 폴리아크릴산, 폴리말레인산 및 폴리아크릴산/폴리말레인산 코-폴리머 및 이들의 염을 포함한다.
클리닝 조성물은 Cl/Br- 타입 또는 산소-타입의 표백제를 포함한다. 무기 Cl/Br- 타입의 표백제의 예는 염화삼인산나트륨(chlorinated trisodium phosphate) 뿐만 아니라 리튬, 나트륨 또는 차아염소산칼슘(calcium hypochlorite) 및 차아브롬산염(hypobromite)이다. 유기 Cl/Br- 타입의 표백제의 예는 트리리클로로이소시아누르산(trichloroisocyanuric acid), 트리리브로모이소시아누르산(tribromoisocyanuric acid), 디브로모이소시아누르산(dibromoisocyanuric acid) 및 디클로로이소시아누르산(dichloroisocyanuric acid)과 같은 N-브로모- 및 N-클로로-이미드, 칼륨 및 나트륨과 같은 가용성 양이온을 지닌 이들의 염이다. 또한 히단토인(hydantoin) 화합물도 사용 가능하다.
클리닝 조성물은 산소 표백제 예를 들면 무기 과산염의 형태로 선택적으로 표백제 전구체 또는 퍼옥시산을 포함한다. 전형적인 적절한 퍼옥시 표백제 화합물의 예는 알칼리 금속 과붕산염, 테트라하이드레이트, 모노하이드레이트, 알칼리 금속 과탄산염, 과규산염 및 과인산염이다. 적절한 활성 물질은 테트라아세틸에틸렌디아민(TAED) 및 글리콜 트리아세테이트를 포함한다. 또한 과붕산염 또는 과탄산염, 글리콜 트리아세테이트 및 과가수분해효소(perhydrolase) 예를 들면 WO 2005/056783에 기술된 바와 같은 효소 표백제 활성 시스템이 존재한다.
클리닝 조성물은 상기 효소 예를 들면 프로필렌 글리콜, 당 또는 당알코올(sugar alcohol), 젖산, 붕산 또는 붕산 유도체(예를 들면 방향족 보레이트에스테르)와 같은 폴리올인 일반적인 안정제를 사용하여 안정화시킨다. 또한 클리닝 조성물은 또 다른 일반적인 세정제 성분 예를 들면 해교제(deflocculant) 물질, 충전제(filler) 물질, 거품 억제제(foam depressors), 부식 방지제, 오염-억제제, 금속이온봉쇄제(sequestering agent), 재오염방지제(anti-soil redeposition agents), 탈수제, 염료, 살균제, 형광물질, 증점제(thickener), 향료를 포함한다.
마지막으로 α-아밀라아제 변이체는 일반적인 접시닦기 세정제 예를 들면 하기의 출원 간행물에 기술된 세정제 중 어느 한 가지로 사용된다. 본 명세서에 기술된 α-아밀라아제 변이체는 특허 및 출원된 출원 목록에 기재된 α-아밀라아제를 대신하거나 첨가되어 사용된다: CA 2006687, GB 2200132, GB 2234980, GB 2228945, DE 3741617, DE 3727911, DE 4212166, DE 4137470, DE 3833047, DE 4205071, WO 93/25651, WO 93/18129, WO 93/04153, WO 92/06157, WO 92/08777, WO 93/21299, WO 93/17089, WO 93/03129, EP 481547, EP 530870, EP 533239, EP 554943, EP 429124, EP 346137, EP 561452, EP 318204, EP 318279, EP 271155, EP 271156, EP 346136, EP 518719, EP 518720, EP 518721, EP 516553, EP 561446, EP 516554, EP 516555, EP 530635, EP 414197 및 미국 특허 제5,112,518호; 미국 특허 제5,141,664호; 및 미국 특허 제5,240,632호.
상기 실시태양에 따르면, 하나 또는 그 이상의 α-아밀라아제 변이체는 전형적으로 세정제 조성물의 성분이며, 그러한 비-분진 과립체(Non-dusting granulate), 안정한 액체 또는 보호된 효소의 형태의 세정제 조성물을 포함한다. 비-분진 과립체는 미국 특허 제4,106,991호 및 제4,661,452호에 기술된 바와 같이 제조되며, 선택적으로 당분야에 공지된 방법에 의해 코팅된다. 왁스 코팅 물질의 예는 폴리(산화에틸렌) 생성물이다;(폴리에틸렌글리콜, PEG) 분자량 약 1,000∼20,000; 16∼50 산화에틸렌 유니트를 지니는 에톡시레이트티드 노닐페놀; 12∼20 개의 탄소 원자를 지니는 알코올 및 15∼80 산화에틸렌 유니트를 지니는 에톡시화 지방 알코올; 지방 알코올; 지방산; 및 모노- 및 디- 및 트리글리세리드 지방산. fluid bed techniques에 의한 방법으로 적용하기 위해 적절한 막-형성 코팅 물질의 예는 예를 들면 영국 특허 제1483591호에 의해 주어진다. 예를 들면 액체 효소 제조는 입증된 방법에 따른 프로필렌 글리콜, 당 또는 당알코올, 젖산 또는 붕산과 같은 폴리올을 첨가함으로써 안정화된다. 또 다른 효소 안정제는 당분야에 잘 공지되어있다. 보호된 효소는 예를 들면 미국 특허 제5,879,920호(Genencor International, Inc.) 또는 EP 238216에 기술된 방법에 따라 제조된다. 폴리올은 단백질의 용해성을 개선시킬 뿐만 아니라 단백질의 안정제로서 인식된다. 예를 들면 Kaushik et al., "왜 트래할로스(trehalose)가 예외적인 단백질 안정제인가? 오스모라이트(osmolyte) 트레할로스의 존재시 단백질의 열적 안정성의 분석" J Biol. Chem. 278: 26458-65 (2003) 및 본 명세서에 인용된 참고문헌 ; 및M. Conti et al., "Capillary isoelectric focusing: the problem of protein solubility," J Chromatography 757: 237-245 (1997)을 참고하라.
상기 세정제 조성물은 예를 들면 겔, 분말, 과립(granule), 반죽(paste) 또는 액체 중에서 편리한 형태로서 존재한다. 액체 세정제는 물과 유사하며 전형적으로 약 70% 물, 0∼30%의 유기용액이며, 또한 약 30%의 물만이 포함된 콤팩트한 겔 타입의 형태이다.
상기 세정제 조성물은 하나 또는 그 이상의 계면활성제를 포함하며, 이들 각각은 음이온, 비-이온성, 양이온 또는 쯔비터이온이다. 상기 세정제는 하기와 같은 0∼50%의 음이온 계면활성제를 포함한다; 선형 알킬벤젠술폰네이트(LAS); α- 올레핀술폰네이트(AOS); 알킬설페이트(지방 알코올 설포네이트)(AS); 알코올 에톡시설포네이트(AEOS 또는 AES); 세컨더리 알칸설포네이트(SAS); α-설포 지방산 메틸에스테르; 알킬- 또는 알케닐 숙신산; 또는 비누. 또한 상기 조성물은 예를 들면 WO 92/06154 기술된 바와 같은 알코올 에톡시레이트(AEO 또는 AE), 카르복실레이트된 알코올 에톡시레이트, 노닐페놀 에톡시레이트, 알킬폴리글리코시드, 에톡시화 지방산 모노에탄올아미드, 지방산 모노에탄올아미드 또는 폴리하이드록시 알킬 지방산아미드와 같은 약 40%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다;
상기 세정제 조성물은 부가적으로 리파아제, 큐틴아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 퍼옥시다아제 및/또는 라카아제와 같은 조합 중에서 하나 또는 그 이상의 또 다른 효소를 포함한다.
상기 세정제는 세정제 빌더 약 1∼65% 또는 제올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산(NTA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA). 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTMPA), 알킬- 또는 알케닐숙신산, 가용성 규산염 또는 층상 규산염(layered silicates)(예를 들면 Hoechst로부터의 SKS-6)과 같은 complexing agent를 포함한다. 또한 상기 세정제는 언빌트(unbuilt)되어 있고, 즉 본래 세정제 빌더는 유리되어있다. 효소는 효소의 안정성과 친화력이 있는 조성물 중 하나로 사용된다. 효소는 일반적으로 피막형성의 공지된 방법으로 예를 들면 수화겔에서 과립형성(granulation) 또는 격리(sequestration)의 방법에 의해서 해로운 성분에 대항하여 보호될 수 있다. 효소 및 구체적으로 녹말 결합 도메인을 지니거나 지니지 않은 α-아밀라아제는 세탁 및 접시세척에 적용시 제한받지 않으나, 녹말 또는 바이오매스로부터의 클리너 및 에탄올 제조시 표면에서 결합되고 사용된다.
상기 세정제는 하나 또는 그 이상의 폴리머를 포함한다. 실시예는 폴리아크릴레이트, 말레인산/아크릴산 코폴리머 및 라우릴 메타아크릴산/아크릴산 코폴리머와 같은 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), 폴리(바이닐피롤리돈)(PVP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리(바이닐 알코올)(PVA), 폴리카르복실레이트를 포함한다.
상기 세정제는 표백 시스템을 지니며, 이는 선택적으로 TAED 또는 노나노일옥시벤젠술폰네이트(NOBS)와 같은 과산-형태의 표백 활성제와 결합된 과붕산염 또는 과탄산염과 같은 H2O2를 포함한다. 부가적으로 표백 시스템은 예를 들면 아미드, 이미드 또는 술폰 형태의 퍼옥시산을 포함한다. 또한 표백 시스템은 효소 표백 시스템을 지니며, 퍼하이드로라제는 WO 2005/056783에 기술된 바와 같이 퍼옥시다제를 활성화시킨다.
상기 세정제 조성물 효소는 일반적인 안정제 예를 들면 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤; 당 또는 당알코올; 젖산; 붕산 또는 붕산 유도체, 방향족 보레이트에스테르와 같은 폴리올을 사용하여 안정화되며, 상기 조성물은 예를 들면 WO 92/19709 및 WO 92/19708에 기술된 바와 같이 제형화된다.
또한 상기 세정제는 점토를 포함하는 섬유유연제, 거품촉진제(foam boosters), 거품억제제(suds suppressor), 부식방지제, 오염-억제제, 재오염방지제(anti-soil redeposition agents), 염료, 살균제, 형광발광제 또는 향료와 같은 또 다른 일반적인 세정제 성분을 포함한다. 상기 pH(사용농도에서 수용액을 측정)는 일반적으로 중성 또는 염기성 예를 들면 pH 약 7.0∼11.0이다.
상기 α-아밀라아제 변이체는 일반적으로 사용된 세정제의 농도에 포함된다. 상기 α-아밀라아제 변이체는 상기 세정제 조성물에 존재할 것으로 여겨지며, 상기 α-아밀라아제 변이체는 0.00001-1.0 mg (순수한 효소 단백질로 측정)α-아밀라아제 변이체/세탁액L 이 첨가되었다. α-아밀라아제 변이체를 포함하는 세정제 조성물의 특정한 형태는 하기를 포함함으로써 제형화된다:
(I) 세정제 조성물은 선형 알킬벤젠술폰산염(산으로 측정됨) 약 7∼12% 적어도 600g/L 부피밀도를 지닌 과립으로서 제형화된다; 알코올 에톡시설페이트(예를 들면, C12-18 알코올, 1-2 산화에틸렌(EO) 또는 알킬설페이트(예를 들면, C16-18) 약 1∼4% ; 알코올 에톡시레이트(예를 들면, C14-15 알코올, 7 EO) 약 5∼9%; 탄산나트륨(예를 들면, Na2CO3) 약 14∼20%; 가용성 규산염, 약 2∼6%; 제올라이트(예를 들면, NaAlSiO4) 약 15∼22%; 황산나트륨(예를 들면, Na2SO4) 0∼6%; 시트르산나트륨/시트르산(예를 들면, C6H5Na3O7/C6H8O7) 약 0∼15%; 과붕산나트륨(예를 들면, NaBO3·H2O) 약 11∼18%; TAED 약 2∼6%; 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 0∼2%; 폴리머(예를 들면, 말레산/아크릴산, 코폴리머, PVP, PEG) 약 0∼3%; 효소(순수한 효소로 측정) 0.0001∼0.1% 단백질; 및 소수 성분(예를 들면, 거품 억제제, 항료, 형광발광제, 광표백) 0∼5%.
(2) 세정제 조성물은 선형 알킬벤젠술폰산염(산으로 측정됨) 약 6∼11% 적어도 600g/L 부피밀도를 지닌 과립으로서 제형화된다; 알코올 에톡시설페이트(예를 들면, C12-18 알코올, 1-2 EO) 또는 알킬설페이트(예를 들면, C16-18) 약 1∼3%; 알코올 에톡시레이트(예를 들면, C14-15 알코올, 7 EO) 약 5∼9%; 탄산나트륨(예를 들면, Na2CO3) 약 15∼21%; 가용성 규산염, 약 1∼4%; 제올라이트(예를 들면, NaAlSiO4) 약 24∼34%; 황산나트륨(예를 들면, Na2SO4) 4∼10%; 시트르산나트륨/시트르산(예를 들면, C6H5Na3O7/C6H8O7) 약 0∼15%; 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 0∼2%; 폴리머(예를 들면, 말레산/아크릴산, 코폴리머, PVP, PEG) 약 1∼6%; 효소(순수한 효소 단백질로 측정) 0.0001∼0.1% ; 및 소수 성분(예를 들면, 거품 억제제, 항료) 0∼5%.
(3) 세정제 조성물은 선형 알킬벤젠술폰산염(산으로 측정됨) 약 5∼9% 적어도 600g/L 부피밀도를 지닌 과립으로서 제형화된다; 알코올 에톡시레이트(예를 들면, C12-15 알코올, 7 EO) 약 7∼14%; 지방산으로서 비누(예를 들면, C16-22 지방산) 약 1∼3%; 탄산나트륨(예를 들면, Na2CO3) 약 10∼17%; 가용성 규산염, 약 3∼9%; 제올라이트(예를 들면, NaAlSiO4) 약 23∼33%; 황산나트륨(예를 들면, Na2SO4) 0∼4%; 과붕산나트륨(예를 들면, NaBO3·H2O) 약 8∼16%; TAED 약 2∼8%; 포스포네이트(예를 들면, EDTMPA) 약 0∼1%; 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 0∼2%; 폴리머(예를 들면, 말레산/아크릴산, 코폴리머, PVP, PEG) 약 0∼3%; 효소(순수한 효소 단백질로 측정) 0.0001∼0.1%; 및 소수 성분(예를 들면, 거품 억제제, 항료, 형광발광제) 0∼5%.
(4) 세정제 조성물은 선형 알킬벤젠술폰산염(산으로 측정됨) 약 8∼12% 적어도 600g/L 부피밀도를 지닌 과립으로서 제형화된다; 알코올 에톡시레이트(예를 들면, C12-15 알코올, 7 EO) 약 10∼25% ; 탄산나트륨(예를 들면, Na2CO3) 약 14∼22%; 가용성 규산염, 약 1∼5%; 제올라이트(예를 들면, NaAlSiO4) 약 25∼35%; 황산나트륨(예를 들면, Na2SO4) 0∼10%; 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 0∼2%; 폴리머(예를 들면, 말레산/아크릴산, 코폴리머, PVP, PEG) 약 1∼3%; 효소(순수한 효소 단백질로 측정) 0.0001∼0.1%; 및 소수 성분(예를 들면, 거품 억제제, 항료) 0∼5%.
(5) 선형 알킬벤젠술폰산염(산으로 측정됨) 약 15∼21%를 포함하는 수성액(aqueous liquid) 세정제; 알코올 에톡시레이트(예를 들면, C12-15 알코올, 7 EO 또는 C12-15 알코올, 5 EO) 약 12∼18%; 지방산으로서 비누(예를 들면, 올레산) 약 3∼13%; 알케닐 숙신산(C12-14) 약 0∼13%; 아미노에탄올 약 8∼18%; 시트르산 약 2∼8%; 포스포네이트 약 0∼3%; 폴리머(예를 들면, PVP, PEG) 약 0∼3%; 붕산(예를 들면, B4O7) 약 0∼2%; 에탄올 약 0∼3%; 프로필렌 글리콜 약 8∼14%; 효소(순수한 효소 단백질로 측정) 0.0001∼0.1%; 및 소수 성분(예를 들면, 분산제, 거품 억제제, 항료, 형광발광제) 0∼5%.
(6) 선형 알킬벤젠술폰산염(산으로 측정됨) 약 15∼21%를 포함하는 aqueous structured 액체 세정제 조성물; 알코올 에톡시레이트(예를 들면, C12-15 알코올, 7 EO 또는 C12-15 알코올, 5 EO) 약 3∼9%; 지방산으로서 비누(예를 들면, 올레산) 약 3∼10%; 제올라이트(예를 들면, NaAlSiO4) 약 14∼22%; 시트르산칼륨 약 9∼18%; 붕산(예를 들면, B4O7) 약 0∼2%; 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 0∼2%; 폴리머(예를 들면, PVP, PEG) 약 0∼3%; 고정 폴리머(anchoring polymer)(예를 들면, 라우릴 메타아크릴산/아크릴산 코폴리머); molar 비율 25:1, MW 3800 약 0∼3%; 글리세롤 약 0∼5%; 효소(순수한 효소 단백질로 측정) 0.0001∼0.1%; 및 소수 성분(예를 들면, 분산제, 거품 억제제, 항료, 형광발광제) 0∼5%.
(7) 세정제 조성물은 선형 알킬벤젠술폰산염(산으로 측정됨) 약 5∼10% 적어도 600g/L 부피밀도를 지닌 과립으로서 제형화된다; 에톡시화 지방산 모노에탄올아미드 약 3∼9%; 지방산 0∼3%로서 비누; 탄산나트륨(예를 들면, Na2CO3) 약 5∼10%; 가용성 규산염, 약 1∼4%; 제올라이트(예를 들면, NaAlSiO4) 약 20∼40%; 황산나트륨(예를 들면, Na2SO4) 2∼8%; 과붕산나트륨(예를 들면, NaBO3·H2O) 약 12∼18%; TAED 약 2∼7%; 폴리머(예를 들면, 말레산/아크릴산 코폴리머, PEG) 약 1∼5%; 효소(순수한 효소 단백질로 측정) 0.0001∼0.1%; 및 소수 성분(예를 들면, 형광발광제, 거품억제제, 항료) 0∼5%.
(8) 세정제 조성물은 선형 알킬벤젠술폰산염(산으로 측정됨) 약 8∼14% 적어도 600g/L 부피밀도를 지닌 과립으로서 제형화된다; 에톡시화 지방산 모노에탄올아미드 약 5∼11%; 지방산 약 0∼3%로서 비누; 탄산나트륨(예를 들면, Na2CO3) 약 4∼10%; 가용성 규산염, 약 1∼4%; 제올라이트(예를 들면, NaAlSiO4) 약 30∼50%; 황산나트륨(예를 들면, Na2SO4) 3∼11%; 시트르산나트륨(예를 들면, C6H5Na3O7) 약 5∼12%; 폴리머(예를 들면, PVP, 말레산/아크릴산 코폴리머, PEG) 약 1∼5%; 효소(순수한 효소 단백질로 측정) 0.0001∼0.1%; 및 소수 성분(예를 들면, 거품 억제제, 항료) 0∼5%.
(9) 세정제 조성물은 선형 알킬벤젠술폰산염(산으로 측정됨) 약 6∼12%를 포함하는 과립으로서 제형화된다; 비-이온성 계면활성제 약 1∼4%; 지방산 약 2∼6%로서 비누; 탄산나트륨(예를 들면, Na2CO3) 약 14∼22%; 제올라이트(예를 들면, NaAlSiO4) 약 18∼32%; 황산나트륨(예를 들면, Na2SO4) 5∼20%; 시트르산나트륨(예를 들면, C6H5Na3O7) 약 3∼8%; 과붕산나트륨(예를 들면, NaBO3·H2O) 약 4∼9%; 표백 활성제(예를 들면, NOBS 또는 TAED) 약 1∼5%; 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 0∼2%; 폴리머(예를 들면, 폴리카르복실레이트 또는 PEG) 약 1∼5%; 효소(순수한 효소 단백질로 측정) 0.0001∼0.1%; 및 소수 성분(예를 들면, 형광발광제, 항료) 0∼5%.
(10) 선형 알킬벤젠술폰산염(산으로 측정됨) 약 15∼23%를 포함하는 수성액(aqueous liquid) 세정제; 알코올 에톡시설페이트(예를 들면, C12-15 알코올, 2-3 EO) 약 8∼15%; 알코올 에톡시레이트(예를 들면, C12-15 알코올, 7 EO 또는 C12-15 알코올, 5 EO) 약 3∼9%; 지방산으로서 비누(예를 들면, 라우르산) 약 0∼3%; 아미노에탄올 약 1∼5%; 시트르산나트륨 약 5∼10%; 하이드로트로프(예를 들면 나트륨 톨루엔설포네이트) 약 2∼6%; 붕산(예를 들면, B4O7) 약 0∼2%; 카르복시메틸셀룰로오스 약 0∼1%; 에탄올 약 0∼3%; 프로필렌 글리콜 약 2∼5%; 효소(순수한 효소 단백질로 측정) 0.0001∼0.1%; 및 소수 성분(예를 들면,폴리머, 분산제, 항료, 형광발광제) 0∼5%.
(11) 선형 알킬벤젠술폰산염(산으로 측정됨) 약 20∼32%를 포함하는 수성액(aqueous liquid) 세정제; 알코올 에톡시레이트(예를 들면, C12-15 알코올, 7 EO 또는 C12-15 알코올, 5 EO) 약 6∼12%; 아미노에탄올 약 2∼6%; 시트르산 약 8∼14%; 붕산(예를 들면, B4O7) 약 1∼3%; 폴리머(예를 들면, 라우릴 메타아크릴산/아크릴산 코폴리머와 같은 말레산/아크릴산 코폴리머, 고정 폴리머(anchoring polymer)) 약 0∼3%; 글리세롤 약 3∼8%; 효소(순수한 효소 단백질로 측정) 0.0001∼0.1%; 및 소수 성분(예를 들면,하이드로트로프, 분산제, 항료, 형광발광제) 0∼5%.
(12) 세정제 조성물은 약 25∼40%의 음이온성 계면활성제(선형 알킬벤젠술폰산염, 알킬설페이트, α-올레핀술폰네이트, α-설포 지방산 메틸에스테르, 알칸술폰네이트, 비누)를 포함하는 적어도 600g/L의 부피밀도를 지닌 과립으로서 제형화된다; 비-이온성 계면활성제(예를 들면 알코올 에톡시레이트) 약 1∼10%; 탄산나트륨(예를 들면, Na2CO3) 약 8∼25%; 가용성 규산염, 약 5∼15%; 황산나트륨(예를 들면, Na2SO4) 0∼5%; 제올라이트(NaAlSiO4) 약 15∼28%; 과붕산나트륨(예를 들면, NaBO3·H2O) 약 0∼20%; 표백 활성제(NOBS 또는 TAED) 약 0∼5%; 효소(순수한 효소 단백질로 측정) 0.0001∼0.1%; 및 소수 성분(예를 들면, 항료, 형광발광제) 0∼3%.
(13) 상기 I)- 12)에 기술된 바와 같이 세정제 조성물은 선형 알킬벤젠술폰산염의 전체 또는 부분이 (C12-C18) 알킬 설페이트에 의해 교체된 것이다.
(14) 세정제 조성물은 선형 알킬벤젠술폰산염(산으로 측정됨) 약 9∼15% (C12-C18) 알킬설페이트를 포함하는 적어도 600 g/L의 부피밀도를 지닌 과립으로 제형화된다; 알코올 에톡시레이트 약 3∼6%; 폴리하이드록시 알킬 지방산 아미드 약 1∼5%; 제올라이트(예를 들면, NaAlSiO4) 약 10∼20%; 층상 디실리케이트(예를 들면, Hoechst로부터의 SK56) 약 10∼20%; 탄산나트륨(예를 들면, Na2CO3) 약 3∼12%; 가용성 규산염, 약 0∼6%; 시트르산나트륨 약 4∼8%; 과탄산나트륨 약 13∼22%; TAED 약 3∼8%; 폴리머(예를 들면, 폴리카르복실레이트 또는 PVP) 약 0∼5%; 효소(순수한 효소 단백질로 측정) 0.0001∼0.1%; 및 소수 성분(예를 들면, 형광발광제, 광표백, 항료, 거품 억제제) 0∼5%.
(15) 세정제 조성물은 선형 알킬벤젠술폰산염(산으로 측정됨) 약 4∼8% (C12-C18) 알킬설페이트를 포함하는 적어도 600 g/L의 부피밀도를 지닌 과립으로 제형화된다; 알코올 에톡시레이트 약 11∼15%; 비누 약 1∼4%; 제올라이트 MAP 또는 제올라이트 A 약 35∼45%; 탄산나트륨(Na2CO3) 약 2∼8%; 가용성 규산염, 약 0∼4%; 과탄산나트륨 약 13∼22%; TAED 1∼8%; 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 약 0∼3%; 폴리머(예를 들면, 폴리카르복실레이트 또는 PVP) 약 0∼3%; 효소(순수한 효소 단백질로 측정) 0.0001∼0.1%; 및 소수 성분(예를 들면, 형광발광제, 광표백, 항료) 0∼3%.
(16) 상기 I)- 15)에 기술된 바와 같이 세정제 제형은 부가적인 성분 또는 상술된 표백 시스템을 위한 치환체로서 안정화된 또는 피막형성된 과산(peracid)을 포함한다.
(17) 상기 1), 3), 7), 9) 및 12)에 기술된 바와 같이 세정제 조성물은 과붕산염이 과탄산염에 의해 교체된 것이다.
(18) 상기 1), 3), 7), 9), 12), 14) 및 15)에 기술된 바와 같이 세정제 조성물은 부가적으로 망간 촉매를 포함한다.
(19) 세정제 조성물은 선형 알콕시레이티드 프라이머리 알코올, 빌더 시스템(예를 들면, 포스페이트), 효소 및 알칼리와 같은 액체 비-이온성 계면활성제를 포함하는 비-수세정제 액체로 제형화된다. 또한 상기 세정제는 음이온 계면활성제 및/또는 표백 시스템을 지닌다.
또 다른 실시태양에서, 상기 2,6-β-D-프록탄 가수분해효소는 세정제 조성물을 포함하며, 가정용 및/또는 산업용 직물/세탁시 바이오필름의 제거/클리닝을 위해 사용된다.
예를 들면 세정제 조성물은 얼룩진 섬유 및 섬유 유연제 혼합물의 전-처리에 적당한 세탁물 첨가제 혼합물을 포함하는 손 또는 기계 세탁 세정제 조성물로 제형화되거나, 집의 견고한 표면을 청소시 사용하는 세정제 조성물로 제형화되거나, 손 또는 식기세척기 작동에 대해서도 제형화된다.
특이적인 관점에서 상기 세정제 조성물은 프로테아제, 리파아제. 큐틴아제, 카르복실라아제, 셀룰라아제, 펙틴아제, 만난아제, 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 옥시다아제, 라카아제 및/또는 페르옥시다아제 및/또는 이들의 혼합물오 k같은 2,6-β-D-프록탄 가수분해효소, 하나 또는 그 이상의 α-아밀라아제 변이체 및 하나 또는 그 이상의 또 다른 클리닝 효소를 포함한다. 선택된 효소의 일반적인 특성은 선택된 세정제(즉 다른 효소 및 비-효소 성분과 공존 가능한 최적-pH)와 공존 가능하며 상기 효소는 유효 양으로 존재한다.
프로테아제 : 적절한 프로테아제는 동물, 식물 또는 미생물 기원인 것을 포함한다. 또한 화학적으로 변형되거나 단백질 조작 돌연변이체가 적절하다. 프로테아제는 세린 프로테아제 또는 메탈로프로테아제 예를 들면, 알칼리성 미생물 프로테아제 또는 트립신-유사 프로타아제이다. 알칼리성 프로테아제의 예는 서브틸리신 특히 바실러스 속, 예를 들면 서브틸리신 노보(Novo), 서브틸리신 칼스버그(Carlsberg), 서브틸리신 309(예를 들면 미국 특허 제6,287,841호를 참고), 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168(예를 들면 WO 89/06279를 참고)이다. 트립신-유사 프로테아제는 트립신(예를 들면 돼지 또는 소(bovine) 기원) 및 푸사리움 프로테아제(WO 89/06270 및 WO 94/25583을 참고)이다. 또한 유용한 프로테아제의 예는 WO 92/19729 및 WO 98/20115에 기술된 상기 변이체를 포함하나, 이것에 제한되는 것은 아니다. 적적한 상업적으로 이용가능한 프로테아제 효소는 Alcalase®, Savinase®, Esperase® 및 Kannase™ (Novozymes, 이전에는 Novo Nordisk A/S); Maxatase®, Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect®, Purafect OxP™, FN2™ 및 FN3 ™ (Genencor International, Inc.)을 포함한다.
리파아제: 적절한 리파아제는 박테리아 또는 균 기원인 것을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작 돌연변이체가 포함된다. 유용한 리파아제의 예는 Humicola (synonym Thermomyces) 예를 들면 H. 라누기노사(lanuginosa)(T. 라누기노사)(EP 258068 및 EP 305216을 참고) 및 H. 인졸렌스(insolens)(WO 96/13580을 참고); 슈도모나스 리파아제(P. 알칼리제네스(alcaligenes) 또는 P. 슈도알칼리제네스(pseudoalcaligenes); EP 218272를 참고), P. 세파시아(cepacia)(EP 331376을 참고), P. 스투제리(stutzeri)(영국 특허 제1,372,034호를 참고), P. 플루오르센스(fluorescens), 슈도모나스 속. 스트레인 SD 705 {WO 95/06720 및 WO 96/27002를 참고), P. 위스콘시넨시스(wisconsinensis)(WO 96/12012를 참고); 바실러스 리파아제(B. 섭틸러스로부터; Dartois et al. Biochemica Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993)을 참고), B. 스테아로써모필러스(stearothermophilus)(일본 특허 제64/744992호를 참고), 또는 B. 푸밀러스(pumilus)(WO 91/16422를 참고)로부터 유래된 리파아제를 포함하나, 이것에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형을 사용하기 위해 고려되는 부가적인 리파아제 변이체는 다음에 기술된 예를 들면 WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 1950 97/07202, EP 407225 및 EP 260105를 포함한다. 일부 상업적으로 이용가능한 리파아제 효소는 Lipolase® 및Lipolase® Ultra (Novozymes, 이전에는 Novo Nordisk A/S)를 포함한다.
폴리에스테라제 : 적절한 폴리에스테라제는 다음에 기술된 WO 01/34899 (Genencor International, Inc.) 및 WO 01/14629 (Genencor International, Inc.)를 포함하나, 이것에 제한되는 것은 아니며, 본 명세서에 기술된 다른 효소와 어떤 조성물로도 사용가능하다.
아밀라아제 : 상기 혼합물은 비-변이체 α-아밀라아제와 같은 다른 α-아밀라아제와 혼합될 수 있다. 이는 상업적으로 이용가능한 효소 Duramyl®, Termamyl™, Fungamyl® 및 BAN™ (Novozymes, 이전에는 Novo Nordisk A/S), Rapidase® 및 Purastar® (Genencor International, Inc.)를 포함하나 이것에 제한되는 것은 아니다.
셀룰라아제 : 셀룰라아제는 상기 혼합물에 첨가된다. 적절한 셀룰라아제는 박테리아 또는 균 기원인 것을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작 변이체가 포함된다. 적절한 셀룰라아제는 미국 특허 제4,435,307호; 제5,648,263호; 제5,691,178호; 제5,776,757호; 및 WO 89/09259에 기술된 후미콜라 인졸렌스(Humicola insolens), 마이세리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila) 및 푸사리움 옥시포럼(Fusarium oxysporum)으로부터 제조된 속(genera) 바실러스, 슈도모나스, 후미콜라(Humicola). 푸사리움, 티엘라비아(Thielavia), 아크레모니움, 예를 들면 상기 진균성 셀룰라아제를 포함한다. 이용이 예상되는 대표적인 셀룰라아제는 직물에 대해 보호색 이점을 지닌 것이다. 이러한 셀룰라아제의 예는 EP 0495257에 기술된 셀룰라아제이다; 예를 들면, EP 531 372; WO 99/25846 (Genencor International, Inc.), WO 96/34108 (Genencor International, Inc.), WO 96/11262; WO 96/29397; 및 WO 98/08940. 또 다른 예는 하기에 기술된 것과 같은 셀룰라아제 변이체이다; WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531315; 미국 특허 제5,457,046호; 제5,686,593호; 및 5,763,254. 상업적으로 이용가능한 셀룰라아제는 Celluzyme® 및Carezyme® (Novozymes, 이전에는 Novo Nordisk A/S); Clazinase™ 및 Puradax® HA (Genencor International, Inc.); 및 KAC-500(B)™ (Kao Corporation)를 포함한다.
퍼옥시다아제/옥시다아제 : 혼합물로 이용이 예상되는 적절한 퍼옥시다아제/옥시다아제는 식물, 박테리아 또는 균 기원인 것을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작 변이체가 포함된다. 유용한 퍼옥시다아제의 예는 WO 93/24618, WO 95/10602 및 WO 98/15257에 기술된 것과 같은 코프리너스(Coprinus) 예를 들면 C. 키네레우스 및 변이체 유도체로부터의 퍼옥시다아제를 포함한다.
상기 세정제 효소(들)는 하나 또는 그 이상의 효소를 포함하는 분리된 첨가제에 첨가됨으로써 또는 이들 효소 전부를 포함하는 결합된 첨가제에 첨가됨으로써 세정제 조성물에 포함된다. 세정제 첨가제 즉 분리되거나 결합된 첨가제는 과립, 액체, 슬러리 형태로 제형화된다. 적절한 과립 세정제 첨가제 제형은 무-분진 과립을 포함한다.
무-분진 과립은 예를 들면 미국 특허 제4,106,991호 및 4,661,452에 기술된 바와 같이 제조되며 선택적으로 당분야에 공지된 방법에 의해서 코팅된다. 왁스 코팅 물질의 예는 약 분자량 1,000∼20,000인 폴리(산화에티렌) 생성물(예를 들면 폴리에틸렌글리콜, PEG)이다; 16∼50 산화 에틸렌 유니트를 지닌 에톡시화 노닐페놀; 12∼20 탄소 원자 및 15∼80 산화에틸렌 유니트를 지닌 에톡시레이티드 지방 알코올; 지방알코올; 지방산; 및 지방산의 모노- 디- 및 트리글리세리드. fluid bed techniques에 의한 적용을 위해 적절한 막-형성 코팅 물질의 예는 영국 특허 제1483591호에 기술되어 있다. 예를 들면 액체 효소 제조는 공지된 방법에 따른 프로필렌글리콜, 당 또는 당알코올, 젖산 또는 붕산과 같은 폴리올을 첨가함으로써 안정화된다. 보호된 효소는 EP 238 216에 기술된 방법에 따라 제조된다.
상기 세정제 조성물은 예를 들면 바, 타블렛, 겔, 분말, 과립, 반죽 또는 액체 중 편리한 형태로 존재한다. 액체 세정제는 물이며, 전형적으로 약 70% 물 및 약 0∼30% 유기 용매를 포함한다. 또한 30% 또는 그 이하의 물을 포함한 콤팩트한 세정제 겔이 고려된다. 상기 세정제 조성물은 하나 또는 그 이상의 계면활성제를 포함하며, 이는 비-이온성이며, 반극성(semi-polar), 음이온, 양이온 또는 쯔비터이온 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 계면활성제는 대체로 0.1%∼60% 중량 정도로 존재한다.
상기 세정제가 포함될 때, 대체로 선형 알킬벤젠술폰네이트, α-오레핀술폰네이트, 알킬설페이트(지방알코올 설페이트), 알코올 에톡시설페이트, 세컨더리 알칸술폰네이트, α-설포 지방산 메틸 에스테르, 알킬- 또는 알킬숙신산 또는 비누와 같은 음이온 계면활성제 약1∼40%를 포함한다.
상기 세정제가 포함될 때, 대체로 알코올 에톡시레이트, 노닐페놀 에톡시레이트, 알킬폴리글리코시드, 알킬디메틸아민옥사이드, 에톡시레이티드 지방산 모노에탄올아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 폴리하이드록시 알킬지방산아미드 또는 글루코싸민(글루카미드)"N-알킬-N-알킬 유도체와 같은 비-이온성 계면활성제 약 0.2∼40%를 포함한다.
상기 세정제는 제올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 탄산염, 시트르산염, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산, 알킬- 또는 알케닐숙신산, 가용성 규산염 또는 층상 규산염(예를 들면, Hoechst로부터의 SKS-6)과 같은 세정제 빌더 또는 혼합제 약 0∼65%를 포함한다.
상기 세정제는 하나 또는 그 이상의 폴리머를 포함한다. 예는 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), 폴리(바이닐피롤리돈)(PVP), 폴리(에틸렌글리콜)(PEG), 폴리(바이닐 알코올)(PVA), 폴리(바이닐피리딘-N-옥사이드), 폴리(바이닐이미다졸), 폴리카르복실레이트 예를 들면, 폴리아크릴레이트, 말레산/아크릴산 코폴리머) 및 라우릴 메타아크릴산/아크릴산 코폴리머이다.
상기 세정제는 과붕산염 또는 과탄산염과 같은 H2O2를 포함하는 표백 시스템을 포함하며, 이는 과산-형성 표백 활성제와 결합된다(예를 들면, 테트라아세틸에티렌디아민 또는 노나노일옥시벤젠술폰네이트). 더욱이 상기 표백 시스템은 퍼옥시산(예를 들면, 아미드-, 이미드- 또는 술폰-타입 퍼옥시산)을 포함한다. 또한 상기 표백 시스템은 효소 표백 시스템이다.
상기 세정제 조성물의 효소(들)는 일반적인 안정제 예를 들면, 폴리올(예를 들면, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤), 당 또는 당알코올, 젖산, 붕산, 붕산 유도체(예를 들면, 방향족 보레이트 에스테르) 또는 페닐 보론산(boronic acid) 유도체(예를 들면, 4-포르밀페닐 보론산)를 사용하여 안정화된다. 상기 조성물은 WO 92/19709 및 WO 92/19708에 기술된 바와 같이 제형화된다.
또한 상기 세정제는 점토를 포함하는 섬유유연제, 거품촉진제(foam boosters), 거품억제제(suds suppressor), 부식방지제, 오염-억제제, 재오염방지제(anti-soil redeposition agents), 염료, 살균제, 형광발광제, 하이드로트로프, 변색 억제제 또는 향료와 같은 또 다른 일반적인 세정제 성분을 포함한다.
상기 세정제 조성물에서 상기 효소 변이체는 약 0.01∼100 mg 효소 단백질/세탁액L, 특히 0.05∼5.0 mg 효소 단백질/세탁액L, 더욱 더 0.1∼1.0 mg 효소 단백질/세탁액L에 상응하는 양에 첨가되는 것으로 여겨진다.
녹말 제조 조성물 및 용도
또 다른 관점에서, 기술된 α-아밀라아제 변이체를 지닌 조성물은 녹말 액화 및/또는 당화를 위해 이용된다. 녹말 제조는 감미료, 알코올, 연료 또는 음료(drinking)(즉, 본류(potable alcohol)), 음료(beverage), 사탕수수 설탕 또는 원하는 유기 화합물 예를 들면, 시트르산, 이타콘산, 젖산, 글루콘산, 케톤, 아미노산, 항생제, 효소, 비타민 및 호르몬을 제조하기 위해 유용하다. 녹말을 과당시럽으로의 전환은 보통 세 개의 연속적인 효소 공정으로 구성되어 있다; 액화(liquefaction) 공정, 당화(saccharification) 공정 및 이성질화(isomerization) 공정이다. 액화 공정 동안 변이 α-아밀라아제는 약 2시간 동안 95∼160℃의 온도, pH 5.5∼6.2 사이에서 녹말을 덱스트린으로 분해한다. 약 1 mM의 칼슘(40 ppm 유리 칼슘 이온)은 이들 조건에서 최적의 효소 안정화를 유지하기 위해서 첨가된다. 다른 α-아밀라아제 변이체는 다른 조건이 요구된다.
액화 공정 후 덱스트린은 글루코아밀라아제(예를 들면, AMG™) 및 선택적으로 가지가 제거된 효소 예를 들면 이성질화효소 또는 풀루라나제(예를 들면, Promozyme®)를 첨가하여 덱스트로즈로 전환된다. 이 단계 전에 pH는 4.5 이하로 감소되고 고온(95℃ 이상) 및 액화가 유지되며, 액화 α-아밀라아제 변이체 활성이 변성된다. 온도는 60℃ 보다 낮아지고 글루코아밀라아제 및 가지가 제거된 효소가 첨가된다. 당화 공정은 24∼72 시간 동안 진행된다.
당화 공정 후, 상기 pH는 6.0∼8.0의 범위 예를 들면 pH 7.5로 상승되며, 칼슘은 이온교환에 의해 제거된다. 그리고나서 상기 덱스트로즈 시럽은 고정된 글루코오즈 이성질화효소(immobilized glucose isomerase)(Sweetzyme® 같은)를 사용하여 과당 시럽으로 전환된다.
상기 α-아밀라아제 변이체는 적어도 하나의 액화 공정을 수행하기 위한 개선된 효소 특성을 제공한다. 예를 들면 상기 변이 α-아밀라아제는 더 증가된 활성을 지니거나 칼슘에 대한 요구가 줄어든다. 유리 칼슘의 첨가는 α-아밀라아제의 충분히 증가된 안정성을 보장해야 한다; 그러나 유리 칼슘은 강하게 글루코오즈 이성질화효소의 활성을 저해한다. 따라서 상기 칼슘은 이성화 단계 이전에 비싼 단위 조작의 방법으로 제거되어야 하며 유리 칼슘의 농도를 3∼5 ppm 이하로 감소시켜야 한다. 비용 절감은 이러한 조작을 생략할 수 있거나 액화 공정이 유리 칼슘 이온의 첨가 없이 수행된다면 얻을 수 있다. 따라서 칼슘 이온을 필요로 하지 않거나 칼슘에 대한 요구가 감소된α-아밀라아제 변이체는 매우 이롭다. 예를 들면 적은 칼슘-의존성 α-아밀라아제 변이체는 안정하며 낮은 유리 칼슘 농도(<40 ppm)에서도 큰 활성을 나타내며, 유리 칼슘은 상기 조성물 및 상기 공정에서 이용될 수 있다. 이러한 α-아밀라아제 변이체는 약 pH 4.5∼6.5, 예를 들면 약 pH 4.5∼5.5의 범위에서 최적의 pH 활성을 나타낸다. 상기 α-아밀라아제 변이체는 특이적인 가수분해를 제공하기 위해 단독으로 사용되거나 광범위한 활성을 지닌 "칵테일"을 제공하기 위해 다른 아밀라아제와 결합될 수 있다.
제조된 상기 녹말은 고도로 정제된 녹말 특성을 지니며, 예를 들면 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99.5% 순도를 지닌다. 더욱이 상기 녹말은 제분한 전곡(whole grain)을 포함하는 물질을 지닌 정제하지 않은 녹말이며 세균 잔기 및 섬유(fiber)와 같은 비-녹말 분획(fractions)을 포함한다. 전곡과 같은 상기 원료는 상기 구조로 만들기 위해서, 추가 공정을 허용하기 위해 제분된다. 2가지의 제분 공정이 적절하다: 습식 및 건조 제분. 또한 옥수수 가루(corn grit) 및 제분된 옥수수 가루(corn grit)가 적용된다. 건조한 제분된 곡물은 비-녹말 카르복실레이트 성분, 더욱이 녹말의 상당한 양을 포함한다. 이러한 불균일 물질( heterogeneous material)이 제트-쿠킹(jet cooking)에 의해 제조될 때, 종종 전분의 부분적인 젤라틴화가 발생한다. 따라서 비-젤라틴화 전분에 대한 높은 활성을 지닌 α-아밀라아제 변이체는 액화 및/또는 당화 제트 쿠크된 건조한 제분된 녹말을 포함하는 공정에 이롭게 적용된다.
액화 공정이 진행되는 동안 뛰어난 가수분해 활성을 지닌 변이 α-아밀라아제는 당화 공정(WO 98/22613을 참고)의 효율성 및 당화 공정 동안 글루코아밀라아제에 대한 요구도를 증가시킨다. 상기 글루코아밀라아제는 0.5 글루코아밀라아제 활성 단위 (AGU)/g DS(즉 글루코아밀라아제 활성 단위/건조한 고체의 그램)만이거나, 이보다 적은 양으로 존재한다. 상기 글루코아밀라아제는 대표적인 예로 아스퍼질러스 니가, 탈라로미케스 이메르조니, 트라메테스 신굴라타 또는 파치키토스포라 파피라세아를 지닌 아스퍼질러스 속, 탈라로미케스(Talaromyces) 속, 파치키토스포라 속 또는 트라메테스 속의 계통으로부터 유도된다. 하나의 실시태양에서 또한 상기 상기 공정은 WO 98/22613에 기술된 타입의 카르복실레이트-결합 도메인의 사용을 포함한다.
그러나 또 다른 관점에서, 상기 공정은 젤라틴화 또는 입상 전분의 슬러리의 가수분해, 특히 입상전분(granular starch)의 초기 젤라틴화 온도 이하의 온도에서 입상전분(granular starch)을 가용성 녹말 가수분해물로의 가수분해를 포함한다. 더욱이 α-아밀라아제 변이체와 접하고 있을 시, 상기 녹말은 진균 α-아밀라아제(EC 3.2.1.1), β-아밀라아제(EC 3.2.1.2) 및 글루코아밀라아제(EC 3.2.1.3)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 효소와 접하고 있게 된다. 하나의 실시태양에서 이성질화효소(EC 3.2.1.68) 또는 풀루라나제(EC 3.2.1.41)와 같은 추가 녹말분해성효소 또는 가지가 제거된 효소가 α-아밀라아제 변이체에 첨가된다.
하나의 실시태양에서 상기 공정은 초기 젤라틴화 온도 이하의 온도에서 수행된다. 이러한 공정은 종종 적어도 30℃, 적어도 31℃, 적어도 32℃, 적어도 33℃, 적어도 34℃, 적어도 35℃, 적어도 36℃, 적어도 37℃, 적어도 38℃, 적어도 39℃, 적어도 40℃, 적어도 41℃, 적어도 42℃, 적어도 43℃, 적어도 44℃, 적어도 45℃, 적어도 46℃, 적어도 47℃, 적어도 48℃, 적어도 49℃, 적어도 50℃, 적어도 51℃, 적어도 52℃, 적어도 53℃, 적어도 54℃, 적어도 55℃, 적어도 56℃, 적어도 57℃, 적어도 58℃, 적어도 59℃ 또는 적어도 60℃의 온도에서 수행된다. 상기 공정이 수행되는 pH는 약 pH 3.0∼7.0, 약 pH 3.5∼6.0 또는 약 pH 4.0∼5.0의 범위에서 수행된다. 하나의 양상은 효모와의 발효를 포함하는 공정, 예를 들면 30℃∼35℃와 같은 32℃ 온도 근처에서 에탄올 제조를 계획한다. 또 다른 관점에서 상기 공정은 에탄올을 제조하기 위해서 효모 또는 원하는 유기 화합물을 제조하기 위해서 적절한 발효유기체에 의한 동시 당화 및 발효를 포함하며 이 때 온도는 30∼35℃, 예를 들면 32℃ 근처이다. 상기 발효 공정에서, 상기 에탄올 함량은 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15% 또는 적어도 약 16% 에탄올에 도달한다.
상기 관점에서 사용되고 있는 상기 녹말 슬러리는 약 20∼55% 건조한 고체 입상전분(granular starch), 약 25∼40% 건조한 고체 입상전분, 약 30∼35% 건조한 고체 입상전분을 지닌다. 상기 효소 변이체는 가용성 녹말을 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91 %, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 양인 입상전분의 가용성 녹말 가수분해물로 전환시킨다.
또 다른 실시태양에서 상기 α-아밀라아제 변이체는 젤라틴화 녹말의 액화 또는 당화를 위한 공정에서 사용되나, 이것에 제한되는 것은 아니며 제트 쿠킹에 의해 젤라틴화된다. 상기 공정은 발효 생성물 예를 들면 에탄올을 제조하기 위한 발효를 포함한다. 발효에 의해 녹말-함유 물질로부터 에탄올을 제조하기 위한 이러한 공정은 다음 하기를 포함한다: α-아밀라아제 변이체로 녹말-함유 물질을 액화; (ii) 액화된 매쉬(mash)를 당화시켜 수득함; 및 (iii) 발효유기체의 존재시 단계(ii)에서 수득된 물질을 발효. 더욱이 선택적으로 상기 공정은 에탄올의 재생을 포함한다. 상기 당화 및 발효 공정은 동시당화발효법(SSF)으로 수행된다. 상기 발효가 진행되는 동안, 상기 에탄올 함량은 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10% , 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15% 또는 적어도 약 16% 에탄올에 도달한다.
상기 관점에서 제조된 상기 녹말은 덩이줄기(tubers), 뿌리(roots), 줄기(stems), 콩과식물(legumes), 곡물(cereals) 또는 전분(whole grain)으로부터 수득된다. 더욱 구체적으로 상기 입상전분(granular starch)은 콘, 옥수수(cobs), 밀, 보리, 호밀, 마일로(milo), 사고(sago), 카사바(cassava), 타피오카(tapioca), 사탕수수(sorghum), 벼, 완두, 콩, 바나나 또는 감자로부터 수득된다. 구체적으로 이들은 콘 및 보리의 왁스 및 비-왁스 타입이다.
본 명세서에 기술된 "액화" 또는 "액화하다"라는 용어는 녹말이 적은 점성 및 더 짧은 사슬 덱스트린으로 전환되는 공정을 의미한다. 일반적으로 이 공정은 전분의 젤라틴화 또는 동시에 뒤이어 α-아밀라아제의 변이체의 첨가와 관련된다. 부가적인 액화-유도 효소는 선택적으로 첨가된다. 본 명세서에 기술된 "프라이머리 액화"라는 용어는 슬러리의 온도가 상승하거나 젤라틴화 온도에 근접시 액화 단계에 관한 것이다. 이어서 일어나는 온도의 상승은 상기 슬러리가 열교환기를 통해 전달되거나, 약 90∼150℃ 예를 들면 100∼110℃의 온도에서 분사됨을 특징으로 한다. 이어서 일어나는 열교환기 또는 제트 온도(jet temperature)의 적용은 상기 슬러리가 상기 온도에서 3∼10분 동안 유지되는 것을 특징으로 한다. 90∼150℃의 온도 에서 상기 슬러리가 유지되는 단계는 프라이머리 액화라고 불린다.
본 명세서에 기술된 "세컨더리 액화"라는 용어는 프라이머리 액화 다음에 일어나는 액화 단계에 관한 것이며, 이 때 상기 슬러리는 실온에서 차갑게 유지된다. 이 냉각단계는 30∼180분 예를 들면, 90∼120분 동안 계속된다. 본 명세서에 기술된 "세컨더리 액화의 분"이라는 용어는 세컨더리 액화의 시작으로부터 경과된 시간과 포도당 당량(DE)이 측정되는 시간에 관한 것이다.
또 다른 관점은 α-아밀라아제 변이체, 엑소-활성 말토제닉 아밀라아제인 β-아밀라아제(EC 3.2.1.2)를 포함하는 상기 조성물에서 β-아밀라아제의 부가적인 용도를 나타내며, 이는 아밀로오스, 아밀로펙틴 및 관련된 글루코오즈 폴리머로 1,4-glucosidic linkages의 가수분해를 촉매화하며, 그 때문에 분비된 말토오즈, β-아밀라아제는 다양한 식물 및 미생물로부터 분리된다(Fogarty et al., PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol. 15, pp. 112-115, 1979). 이들 β-아밀라아제는 40∼65℃의 범위에서 최적의 온도, 약 pH 4.5∼7.0의 범위에서 최적의 pH 활성을 지니는 것을 특징으로 한다. 예상되는 β-아밀라아제에는 보리 Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA, 2180 Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA (Genencor International, Inc.); 및 Novozym™ WBA (Novozymes AJS)로부터의 β-아밀라아제가 포함되나, 이것에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물의 용도에 관한 예상되는 또 다른 효소는 글루코아밀라아제(EC 3.2.1.3)이다. 글루코아밀라아제는 미생물 또는 식물로부터 유래된다. 예를 들면 글루코아밀라아제는 진균성 또는 박테리아 기원이다. 대표적인 WO 92/00381 및 WO 00/04136에 기술된 바와 같은 박테리아 글루코아밀라아제는 아스퍼러질러스 글루코아밀라아제, 특히 A. 니가 G1 또는 G2 글루코아밀라아제(Boel et al. (1984), EMBO J. 3(5): 1097-1102) 또는 이들의 유도체이다; A. 아와모리(awamori) 글루코아밀라아제(WO 84/02921); A. 오리자에(oryzae) 글루코아밀라아제(Agric. Biol. Chem. (1991), 55(4): 941-949), 또는 이들의 변이체 또는 단편(fragment).
또 다른 예상되는 아스퍼리질러스 글루코아밀라아제 변이체는 열안정성을 증진시킨 변이체를 포함한다: G137A 및 G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9: 499-505); D257E 및 D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8: 575-582); Nl 82 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301: 275-281); 이황화 결합, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35: 8698-8704); 및 A435 및 S436 잔기에 프로-잔기의 도입 (Li et al. (1997) Protein Eng. 10: 1199-1204). 또 다른 예상되는 글루코아밀라아제는 탈라로미케스 글루코아밀라아제, 특히 T. 이메르조니(WO 99/28448), T. 레이세타누스(leycettanus)(미국 특허 제RE32,153호), T. 두폰티(duponti) 또는 T. 써모필러스 (미국 특허 제4,587,215호)로부터 유도된 것을 포함한다. 예상되는 박테리아 글루코아밀라아제는 속 클로스트리듐(genus Clostridium), 특히 C. 써모아밀로리티쿰(thermoamylolyticum)(EP 135138) 및 C. 써모하이드로설퍼리쿰(thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)으로부터 유래된 글루코아밀라아제를 포함한다. 적절한 글루코아밀라아제는 WO 00/04136의 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일성을 지닌 글루코아밀라아제와 같은 아스퍼러질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)로부터 유래된다. 또한 적절한 글루코아밀라아제는 AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER 및 AMG™E (Novozymes); OPTIDEX® 300 (Genencor International, Inc.); AMIGASE™ 및 AMIGASE™ PLUS (from DSM); G-ZYME® G900 (Enzyme Bio-Systems); 및 G-ZYME® G990 ZR (A. 니가 글루코아밀라아제 및 낮은 프로테아제 함량)와 같은 상업적인 글루코아밀라아제이다. 글루코아밀라아제는 0.02∼2.0 AGU/g DS 또는 0.1∼1.0 AGU/g DS 예를 들면, 0.2 AGU/g DS의 양에 첨가된다.
부가적인 효소 변이체는 상기 조성물에 포함된다. 2가지 또는 그 이상의 α-변이체는 단독으로 또는 본 명세서에 기술된 다른 효소들과의 조성물로 사용된다. 예를 들면 세 번째 효소는 또 다른 α-아밀라아제 예를 들면, 효모 α-아밀라아제 또는 또 다른 α-아밀라아제 변이체이다. 이들은 바실러스 α-아밀라아제 또는 비-바실러스 α-아밀라아제일 수도 있다.
선택적으로 첨가되는 또 다른 효소는 이성질화효소(EC 3.2.1.68) 또는 풀루라나제(EC 3.2.1.41)와 같은 가지가 제거된 효소이다. 이성질화효소는 아밀로펙틴 및 β-리미트 덱스트린에서 α-l,6-D-glucosidic 가지 결합을 가수분해시키며, 풀루란(pullulan)을 공격하는 이성질화효소의 무능력 및 α-리미트 덱스트린 상에서 이성질화효소의 제한된 작용에 의해 풀루라나제와는 구별된다. 가지가 제거된 효소는 당업자에 의해 공지된 효율적인 양만큼 첨가된다.
상기 공정 생성물의 정확한 상기 조성물은 제조된 입상전분(granular starch)의 타입뿐만 아니라 적용된 효소의 조합에 의존적이다. 상기 가용성 가수분해물은 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95.0%, 적어도 약 95.5%, 적어도 약 96.0%, 적어도 약 96.5%, 적어도 약 97.0%, 적어도 약 97.5%, 적어도 약 98.0%, 적어도 약 98.5%, 적어도 약 99.0% 또는 적어도 약 99.5%의 순도를 지닌 말토오즈이다. 더욱이 상기 가용성 녹말 가수분해물은 글루코오즈이거나 상기 녹말 가수분해물은 적어도 94.5%, 적어도 95.0%, 적어도 95.5%, 적어도 96.0%, 적어도 96.5%, 적어도 97.0%, 적어도 97.5%, 적어도 98.0%, 적어도 98.5%, 적어도 99.0% 또는 적어도 99.5%의 DE(전체 용해된 건조한 고체의 글루코오즈 퍼센트)를 가진다. 하나의 실시태양에서 아이스크림, 케이크, 사탕, 통조림한 과일을 제조하는 공정은 글루코오즈, 말토오즈, DP3 및 DPn을 포함하는 특수한 시럽을 사용한다.
2가지의 제분 공정은 하기를 포함하는 것이 적절하다: 습식 제분 및 건조 제분. 건조 제분시, 상기 홀 커널(whole kernel)이 제분되고 사용된다. 습식 제분은 배아(germ)와 밀(meal)(녹말 과립 및 단백질)을 분리시키며, 일반적으로 상기 녹말 가수분해물이 시럽의 생성에 사용될 때 적용된다. 건조 및 습식 제분 모두 녹말을 제조하는 당분야에 잘 공지되어있으며, 또한 상기 조성물 및 기술된 방법과 사용에 관하여 예상할 수 있다. 상기 공정은 한외여과(ultrafiltration) 시스템으로 수행되며, 보전수(retentate)는 효소, 생풀(raw starch) 및 물 존재시 재순환의 통제를 받고 반면에 여과수(permeate)는 가용성 녹말 가수분해물이다. 또 다른 방법은 한외여과막으로 연속적인 막 리액터에서 수행되는 상기 공정이며, 보전수(retentate)는 효소, 생풀(raw starch) 및 물 존재시 재순환의 통제를 받고 반면에 여과수(permeate)는 가용성 녹말 가수분해물이다. 또한 상기 공정은 정밀여과막(microfiltration)으로 연속적인 막 리액터에서 수행되는 것으로 고려되며, 보전수(retentate)는 효소, 생풀(raw starch) 및 물 존재시 재순환의 통제를 받고 반면에 여과수(permeate)는 가용성 녹말 가수분해물이다.
한 가지 점에 있어서, 상기 공정의 가용성 녹말 가수분해물은 고과당 콘 시럼(high fructose corn syrup, HFCS)와 같은 고과당 녹말-기본 시럽(high fructose starch-based syrup, HFSS)으로 전환되는 것으로 여겨진다. 이 전환은 글루코오즈 이성질화효소 특히, 고체 지지체 상에 고정된 글루코오즈 이성질화효소를 사용하여 수행된다. 고려되는 이성질화효소는 Sweetzyme®, IT (Novozymes AJS); G-zyme® IMGI, and G-zyme® G993, Ketomax®, G-zyme® G993, G-zyme® G993 liquid 및 GenSweet® IGI와 같은 상업적인 제품을 포함한다.
또 다른 관점에서, 제조된 가용성 녹말 가수분해물은 연료 또는 식용 에탄올의 생성물을 산출시킨다. 상기 3번째 공정의 관점에서, 발효는 입상전분(granular starch) 슬러리의 가수분해를 동시에 또는 개별적으로/연속적으로 수행시킨다. 상기 발효가 가수분해와 동시에 수행될 때, 상기 온도는 30∼35℃, 특히 31∼34℃ 사이이다. 상기 공정은 한외여과(ultrafiltration) 시스템으로 수행되며, 보전수(retentate)는 효소, 생풀(raw starch), 효모, 효모 영양분(yeast nutrient) 및 물 존재시 재순환의 통제를 받고 반면에 여과수(permeate)는 액체를 포함한 에탄올이다. 또한 상기 공정은 한외여과막으로 연속적인 막 리액터에서 수행되는 것으로 고려되며, 보전수(retentate)는 효소, 생풀(raw starch), 효모, 효모 영양분(yeast nutrient) 및 물 존재시 재순환의 통제를 받고 반면에 여과수(permeate)는 액체를 포함한 에탄올이다.
또한 상기 공정의 가용성 녹말 가수분해물은 시트르산, 모노글루타민산나트륨(MSG), 글루콘산, 글루콘산나트륨, 글루콘산칼슘, 글루콘산칼륨, 글루코노 델타-락톤 또는 에리소르빈산 나트륨과 같은 발효 제품으로 처리된 녹말을 발효시키는 과정을 포함한 발효 제품의 생성물을 위해 사용된다.
상기 α-아밀라아제 변이체의 녹말분해 활성은 기질처럼 감자녹말(전분)을 사용하여 측정된다. 이 방법은 효소에 의해 변형된 감자녹말의 파괴(break-down)을 기초로 하며, 상기 반응은 요오드 용액과 녹말/효소 용액의 혼합 샘플에 의해 수행된다. 초기에 거무스름한-파란색이 형성되나, 전분이 파괴되는 동안 파란색은 점점 엷어지고 점차적으로 적갈색으로 변화되며, 이는 색유리 기준과 비교된다.
에탄올 제조
일반적으로 본 발명의 PS4 변이 폴리펩티드는 녹말을 에탄올 또는 다른 고 과당 콘 감미료와 같은 부가-가치 생성물로 진행되는 당으로 전환시키기 위해서 사용된다. 따라서 본 발명자들은 바이오에탄올 제조시 PS4 변이 폴리펩티드의 사용에 대해 기술하며 본 명세서에서 이는 바이오매스 발효에 의해 생성된 에탄올로 여겨진다.
이렇게 생성된 에탄올은 연료 또는 음료로서 사용되거나 시트르산, 아스코르브산, 라이신, 글루타민산과 같은 유기 화합물의 생성시 발효 과정에서 사용된다. 추가적인 첨부사항은 하기에 기술되어 있다.
에탄올(또는 에틸 알코올)은 스피릿(spirit), 맥주 및 포도주와 같은 알코올 음료로 알려져 있다. 또한 에탄올은 화학, 제약 산업의 제품 및 운송 수단의 연료서 사용된다.
에탄올은 당 및 탄수화물을 함유한 원료로부터 제조된다. 이와 같이 에탄올은 많은 생물학적 물질로부터 제조된다. 바이오매스 공급원료의 주요한 3가지 유형이 하기의 사탕수수와 같은 당 농작물을 포함하는 에탄올을 생성하기 위해서 사용된다; 녹말 농작물, 밀 및 콘 및 셀룰로오즈 물질을 포함, 농작물 부산물(짚 등) 및 와 같은 임산가공 폐기물 등이 있다. 셀룰로오즈와 같은 원료로부터 에탄올의 제조는 안정하고 재사용이 가능한 연료 자원을 제공한다.
흔히 사용되는 대부분의 공정 기술은 건조 곡물 제분이다. 이 공정에서 곡물은 균일한 곡물 입자로 먼저 절삭된다. 곡식은 물 및 아밀라아제에 혼합되고 곡물에서 전분이 용해되는 쿠커(cooker)를 통과한다. 글루코-아밀라아제를 첨가한 후 용해된 전분은 발효가능한 당으로 전화된다. 효모는 당을 에탄올로 발효시키는 매쉬(mash)에 첨가된다. 발효 후 매쉬는 알코올이 고체 및 물로부터 제거되는 증류 및 탈수과정을 거친다. 특히 곡물의 양의 약 2/3은 연료 에탄올로 전환된다. 잔여 생성물-스틸리지 및 젖은 증류 입자-은 특히 소 또는 양과 같은 동물에 적절한 고 단백질 가축 사료이다.
또한 에탄올은 목재 펄프와 같은 원료를 포함한 셀룰로오즈로부터 제조된다. 공급원료를 기반으로 한 셀룰로오즈는 농업폐기물, 유리 및 목재 및 다른 저급한 도시 쓰레기(예를 들면, 재활용 종이, 야드 클리핑, 등)와 같은 바이오매스를 포함한다. 그러나 셀룰로오즈는 셀룰라아제와 같은 적절한 효소로 처리함으로써 에탄올로 전환되기 전에 먼저 당으로 전환된다.
에탄올이 한번 가공된 후 에탄올은 그 자체로 자동차용 연료로 이론적으로 사용할 수 있다. 또는 가솔린과 85 대 15 비율로 혼합하여 사용할 수 있다. 이를 "깨끗한 에탄올 연료"라고 칭한다. 그러나 대체로 에탄올은 가솔린에 대해 7∼10%의 중량으로 혼합된다. 에탄올은 옥탄 증가제로서 사용된다. 연료로서 에탄올은 석유로부터 유래된 제품보다 친환경적이다. 에탄올의 사용은 공기 중에 오존의 함량과 스모그를 감소시켜 공기의 질을 더욱 향상시킨다. 또한 가솔린에 비해 에탄올의 사용은 석유화학 공급이 중단되는 급격한 변화에 충격으로부터 완충시킬 수 있는 전략적 중요성이 있다.
양조 적용
에탄올(또는 에틸알코올)은 스피릿(spirit), 맥주 및 포도주와 같은 알코올 음료로 알려져 있다. 따라서 본 명세서에 기술된 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 양조주(brewing), 특히 양조 맥주에 사용된다. 모든 맥주는 간단한 방법을 기초로 한 공정을 이용하여 양조된다.
상기 양조 공정은 맥아 곡물(malted grain)의 사용에 관한 것이며, 지역에 따라서 전통적으로 보리, 밀 또는 때때로 호밀이 사용된다. 맥아(malt)는 발아한 곡물을 사용하여 제조되며, 그리고 나서 가마(kiln)에서 건조되며 때때로 구워진다. 상기 발아 공정은 얼마 정도의 효소, 특히 α-아밀라아제 및 β-아밀라아제를 생성하며, 이는 곡물의 녹말을 당으로 전환하는데 사용된다. 구워지는 양에 의존적으로, 상기 맥아는 어두운 색을 띠며, 강하게 상기 색과 맥주의 풍미(flavour)에 영향을 끼친다.
상기 맥아(malt)는 곡물 씨(grain kernels)를 부스며 표면 영역을 증가시키며, 껍질로부터 조금 더 작은 조각들로 분리시킨다. 이렇게 만들어진 제분용 곡식은 "매슁"으로 알려진 공정을 위해 "엿기름물을 넣는 통(mash tun)"이라고 불리는 큰 통에서 온수와 혼합된다. 이 공정 동안, 상기 맥아 내의 천연 효소는 많은 양의 녹말을 발효 공정에서 중요한 역할을 하는 당으로 분해시킨다. 일반적으로 매슁은 1∼2 시간 정도 소요되며, 이 시간 동안 다양한 온도 휴지기(대기 기간)는 맥아에 사용되는 타입, 변형 정도, 맥주양조기술자의 요구에 따라 다양한 효소를 활성화시킨다. 이들 효소의 활성은 상기 곡물의 녹말을 덱스트린으로 전환시키며, 그리고 나서 말토오즈와 같은 발효 가능한 당으로 전환시킨다. 엿기름물을 넣는 통은 일반적으로 홈이 있는 "덧바닥(false bottom)" 또는 곡물로부터 액체의 분리를 위해 허용되는 여과기(strainer)로 작용하는 다른 형태의 다양체(manifold)를 포함한다.
120∼130 ℉(49∼55℃)의 매쉬 휴지기는 다양한 단백질가수분해효소를 활성화시키며, 이는 뿌연 맥주의 원인이 되는 단백질을 분해한다. 그러나 이러한 주의는 주로 단백질로 구성되는 맥주거품 때문에 가장 중요하며, 따라서 지나친 단백질 나머지는 거품이 별로 발생하지 않는 맥주가 제조되는 원인이 된다. 이 나머지는 일반적으로 독일 및 체코에서 인기가 감소되고 있는 under-변형된(즉,under-몰트된) 맥아만을 위해 사용되거나, 콘 및 벼와 같은 비-몰트된 곡물에 사용되며, 이는 북미 맥주 산업에서 폭넓게 사용되고 있다. 60∼140℉에서의 매쉬 휴지기는 β-글루카나제를 활성화시키며, 이는 매쉬에서 점착성의 β-글루칸을 파괴하며, 상기 공정 후 더욱 자유롭게 흘러나오는 당을 생성한다. 현대적인 매슁 공정에서 상업적인 진균성에 기초한 β-글루카나제는 보충물(supplement)로서 첨가된다. 마지막으로, 149∼160℉(65∼71℃)의 매쉬 휴지기 온도는 맥아에서 녹말을 당으로 전화시키는데 사용되며, 이는 양조 공정 후에 효모에 의해 사용가능 해진다. 상기 범위 하부의 휴지기 말에는 효모에 의해 발효 가능한 많은 저차(low-order) 당이 생성된다. 이는 차례대로 농도가 낮은 맥주와 알코올 도수가 높은 맥주를 제조한다. 상기 범위의 상부에 가까운 휴지기에는 효모에 의해 조금만 발효되는 고차(higher-order) 당이 생성되고 따라서, 알코올이 적은 fuller-bodied 맥주가 제조된다.
매슁 후, 이렇게 만들어진 액체는 맥즙여과(lautering)와 같이 공지된 공정에서 곡물로부터 걸러진다. 맥즙여과 이전에, 상기 매쉬 온도는 효소를 비활성화 시키기 위해서 165∼170℉(약 75℉)으로 상승시킨다. 첨가하는 물은 부가적인 당을 추출하기 위해서 곡물상에 뿌려진다(분사로 알려진 공정).
현 시점에서, 상기 액체는 맥아즙으로 알려져 있다. 맥아즙은 홉(hops)과 때때로 허브 또는 당과 같은 다른 성분을 끓이는 "구리" 또는 쇠주전자로 알려진 큰 탱크로 옮겨진다. 가열 공정은 효소 공정을 종결, 단백질을 침전, 홉 수지를 이성질화, 맥아즙을 농축 및 살균하기 위해서 수행된다. 홉은 맥주에 풍미, 향 및 쓴맛을 첨가한다. 상기 가열 말기에, hopped 맥즙은 "월-풀(whirl-pool)"이라고 불리는 그릇에서 가라앉혀서 맑게 되고 그리고 나서 맑아진 맥즙은 냉각된다.
그 후, 상기 맥즙은 "발효 용기"로 이동되고 여기서 효모가 첨가되거나, 맥즙에 "투척된다". 상기 효모는 해당작용이라고 불리는 과정을 통해 맥아로부터의 당을 알코올, 이산화탄소 및 다른 성분으로 전환시킨다. 3주 후, 상기 신선한(또는 "미숙성") 맥주를 교반조에 첨가한다. 몇 달 동안 조건화 후, 상기 맥주는 효모 및 입자를 제거하기 위해서 여과된다. 상기 "브라이트(bright) 맥주"는 공급 또는 포장할 준비가 된다.
따라서 본 명세서에 기술된 하나 또는 그 이상의 PS4 변이 폴립펩티드는 양조 공정의 어느 단계에서나 보충물에 첨가되며 자연적으로 아밀라아제 활성이 생기게 된다.
사료 적용
하나의 실시태양에서 PS4 변이 폴리펩티드는 견고한 전분의 분해를 가능케 한다.
여기에서 기술한 용어 "분해"는 견고한 전분을 완전히 또는 부분적으로 가수분해시켜 분해시키는 것을 의미하며 전분을 포도당 및/또는 올리고당 예를 들면 말토오즈 및/또는 덱스트린으로 분해하는 것이다.
PS4 변이 폴리펩티드는 통상 동물의 아밀라아제에 의해 완전히 분해되지 않는 잔여 견고한 전분을 분해시킬 수 있다. 이러한 예로서 PS4 변이 폴리펩티드가 동물 아밀라아제(판크레아틱 아밀라아제)의 증강제로 사용할 수 있으며 이는 견고한 전분의 분해를 촉진시킨다. 판크레아틱 α-아밀라아제는 동물의 소화기관에서 분비되는 것이다. 판크레아틱 아밀라아제는 사료 내 전분을 분해시킨다. 그러나 전분의 일부 즉 견고한 전분은 이러한 판크레아틱 α-아밀라아제에 의해 충분히 분해되지 않으며 따라서 소장 내에서 흡수되지 않는다. PS4 변이 폴리펩티드는 이 경우 판크레아틱 α-아밀라아제와 협력하여 소화기 내에서 전분을 분해시키며 따라서 동물은 전분을 충분히 흡수할 수 있다.
견고한 전분을 분해시키는 효소의 능력은 Megazyme International Ireland Ltd에 의해 개시된 방법에 의해 분석할 수 있다. 견고한 전분의 측정, 전분의 용해 및 총 전분의 함량 등은 Resistant Starch Assay Procedure, AOAC Method 2002.02, AACC Method 32-40에 개시된 방법에 따라 분석 가능하다.
따라서 PS4 변이 폴리펩티드는 동물에 있어서 소화에 매우 중요하고 동물 사료와 결합하여 사용할 수 있다.
본 발명자들은 사료의 용도와 성분에 관련하여 PS4 변이 폴리펩티드의 용도에 관해 기술한다. 사료의 조성 개선을 위해서도 견고한 전분을 분해시킬 수 있는 PS4 변이 폴리펩티드의 사용이 매우 중요하다. 본 발명자들은 전분과 PS4 변이 폴리펩티드를 포함하는 사료 조성물을 개시한다. 또한 본 발명자들은 PS4 변이 폴리펩티드와 견고한 전분을 함유하는 사료에 있어서 견고한 전분의 분해방법에 대해 개시한다.
또한 본 발명자들은 전분을 포함하는 사료 제제에 있어서 견고한 전분을 분해시키는 PS4 변이 폴리펩티드의 용도에 관해 기술한다. 또한 본 발명자들은 상기 사료의 칼로리치를 개선시킬 수 있는 사료 제제에 있어서 PS4 변이 폴리펩티드의 용도에 관해 기술한다. 또한 동물의 활력을 개선시킬 수 있는 사료 제제에 있어서 효소의 역할을 기술한다. 또 다른 실시태양에 있어서, 전분과 PS4 변이 폴리펩티드 효소를 포함하는 사료의 제조 방법에 대해 기술한다.
하나의 예로서 견고한 전분을 분해시킬 수 있는 PS4 변이 폴리펩티드를 포함하는 성분은 전분 및/또는 전분을 포함하는 동물 사료에 있어서 분해를 대단히 증진시킬 수 있기 때문에 매우 유용하다. 또한 전분 또는 동물에 의해 견고한 전분을 소화시킬 수 있는 이점에서 이러한 사료는 매우 유용하다. 또한 이러한 사료는 동물의 의해 충분한 에너지를 발산할 수 있도록 효율적인 수단으로 사용할 수 있기 때문에 매우 유용하다. 또한 견고한 전분의 생체 이용률을 증가시키는 수단으로 매우 유용하다.
동물 사료
PS4 변이 폴리펩티드를 포함하는 동물 사료는 특정한 동물에 특정한 요구를 만족시킬 수 있는 사료 제제로 매우 적합하다. 이러한 사료 제제는 동물의 대사에 중요한 탄수화물, 지방, 단백질 및 다른 영양 성분을 적절히 공급할 수 있다.
바람직하게는 동물 사료는 돼지 또는 가금류의 사료로 유용하다.
여기에서 기술되는 '돼지'는 피그, 호그, 보알즈와 같은 돼지류를 총칭하는 것이다. 통상적으로 돼지용 사료는 약 50%의 탄수화물, 약 20%의 단백질 및 약 5%의 지방을 포함한다. 고 에너지 돼지용 사료의 예로는 다른 사료 첨가제와 결합하여 사용하는 콘에 기반을 두고 단백질, 미네랄, 비타민 및 라이신 또는 트리프토판과 같은 아미노산을 포함한다. 돼지 사료의 예는 동물 단백질 제품, 수산물 제품, 유제품, 곡물 제품 및 식물성 단백질 제품을 포함한다. 필요에 따라 천연 향료, 인공향료, 마이크로 및 매크로 미네랄, 동물 지방, 식물 지방, 비타민, 보존제 또는 항생제와 같은 의약품을 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서 '돼지 사료'는 후술하는 청구범위에 포함되어 있으며 이는 '성장기'또는 '초기' 사료(어린 돼지에게 사용하는)와 '성숙된' 사료(성장기를 지난 숙성된 돼지 또는 시장에서 판매하기 적합한 돼지에게 사용되는)를 포함한다.
본 명세서에 있어서 "가금류"는 닭, 브로일러(broilers), 암탉, 수탉, 케이폰(capons), 칠면조, 오리, 싸움닭(game fowl), 어린암탉(pullets) 또는 병아리 등을 의미한다. 가름류용 사료는 완전한 사료이며 이는 단백질, 에너지, 비타민, 미네랄, 성장을 위한 적합한 영양 성분, 달걀 생산 및 건강을 위한 적합한 영양 성분이 필요하기 때문이다. 그러나 가금류용 사료는 비타민, 미네랄 및 항콕시디움제제(예를 들면 모넨신 나트륨, 라살로시드, 앰프롤리움, 살리노마이신 및 술파퀴녹살린) 및/또는 항생제제(예를 들면 페니실린, 바시트라신, 클로로테트라사이클린 또는 옥시테트라사이클린) 등의 성분을 더욱 요구한다.
어린닭 또는 브로일러, 칠면조 및 오리 등과 같이 식용 가금류는 달걀 생산을 위한 가금류와는 다른 사료를 요구한다. 브로일러, 오리 및 칠면조는 달걀을 생산하는 가금류에 비해 더욱 빠른 체중 증가를 요구하기 때문이다. 그러므로 이와 같은 가금류는 고단백질, 고에너지 사료를 섭취하여야 한다.
본 명세서에서 사용되고 있는 '가금류용 사료'는 어린 가금류용 사료, 성장한 가금류용 사료, 성장기 가금류용 사료(생후 6∼8주용 가금류용 사료) 및 달걀 생성 가금류용 사료 등을 포함하는 것으로 이해된다.
바람직한 실시태양에서 동물 사료는 땅콩, 콩 또는 시리얼과 같은 콩과식물, 밀, 콘(옥수수), 호밀 또는 보리 등과 같은 곡류를 포함하는 것이다. 필요에 따라 감자를 포함할 수 있다.
사료 스터프(stuff)
PS4 변이 폴리펩티드는 사료 단독 또는 식품 성분과 같은 다른 사료 성분과 결합하여 동물의 사료 흡수에 직접 또는 간접으로 유용하게 적용할 수 있다.
통상적인 식품 성분은 동물 또는 식물 지방, 자연 또는 합성 감미료, 항산화제, 점도 조절제, 에센셜 오일 및/또는 향료, 염료 및/또는 색소, 비타민, 미네랄, 천연 또는 비천연 아미노산, 영양제, 추가 효소(유전적으로 조작된 효소를 포함함), 구아검 또는 산탄검과 같은 결합제, 완충액, 유화제, 활제, 증강제, 현탁제, 보존료, 코팅제 또는 용해제 등의 부가 성분을 하나 또는 그 이상 포함할 수 있다.
이러한 첨가제의 예로서 PS4 변이 폴리펩티드를 포함하는 물질로 사료를 코팅할 수 있다. 필요에 따라서는 사료와 PS4 변이 폴리펩티드를 직접 혼합시켜 적용할 수 있고, 사료의 표면에 PS4 변이 폴리펩티드를 스프레이 시킬 수도 있으며 사료를 PS4 변이 폴리펩티드 제제에 침지시켜 포함시키는 것도 가능하다.
PS4 변이 폴리펩티드는 사료에 혼합하여 적용하거나 동물 흡수를 위해 사료의 표면에 스프레이시켜 적용할 수 있다. 특히 PS4 변이 폴리펩티드는 사료의 유화제에 첨가시킬 수 있고 이를 주입시킨 고형성분으로 제조할 수 있다.
PS4 변이 폴리펩티드는 사료에 산재, 코팅 및/또는 함침시켜 적용할 수 있다. 다른 성분의 혼합물과 함께 적용할 수도 있고 별도로 동시에 또는 연속하여 적용할 수도 있다. 킬레이트화제, 결합제, 유화제 및 마이크로 및 매크로 미네랄과 같은 다른 첨가제, 아미노산, 비타민, 동물 지방, 식물 지방, 보존제, 향료, 색소 등은 사료에 동시에 혼합하여 또는 연속하여 적용하는 것이 가능하다.
PS4 변이 폴리펩티드의 함량
PS4 변이 폴리펩티드의 적절한 함량은 첨가하려는 사료 및 PS4 변이 폴리펩티드를 적용하려는 방법 또는 PS4 변이 폴리펩티드를 사용하려는 목적에 따라 변경될 수 있다. PS4 변이 폴리펩티드의 함량은 사료 내의 견고한 전분을 실질적으로 분해시키기에 충분한 양으로 사료의 소화에 적합하여야 한다.
선택적으로 PS4 변이 폴리펩티드가 동물의 사료 흡수 후에도 유용하게 잔존할 수 있으며 이 때 사료가 충분히 소화될 수 있도록 즉 사료 내의 칼로리치를 충분히 증가시킬 수 있도록 함유하는 것이 바람직하다.
아밀라아제 콤비네이션
본 발명자들은 PS4 변이 폴리펩티드와 아밀라아제의 결합을 개시한다. 특히 말토제닉 아밀라아제와 결합을 개시한다. 말토제닉 α-아밀라아제(글루칸 1 ,4-a-말토하이드로라제, E.C. 3.2.1.133)는 아밀로오스와 아밀로펙틴 내의 알파-컨피규레이션을 가수분해시켜 말토오스로 전환시키는 효소이다.
바실러스 속의 미생물로부터 유래한 말토제닉 α-아밀라아제(EP 120 693)는 Novamyl(Novo Nordisk A/S, Denmark) 이라는 상품명으로 상용화되고 있다. 또한 상기 효소는 전분의 노화를 감소할 수 있기 때문에 항-스테일링 효소로서 제빵 산업에서 널리 사용하고 있다. Novamyl은 국제 특허 WO 91/04669에 상세히 개시되어 있다. 말토제닉 α-아밀라아제인 Novamyl은 사이크로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제(CGTase)와 일정한 특성을 공유하고 있으며 이는 서열의 상동성(Henrissat B, Bairoch A; Biochem. J., 316, 695-696 (1996)) 과 트랜스글루코실레이션의 형성(Christophersen, C, et al, 1997, Starch, vol. 50, No. 1, 39-45)에 관련되어 있다.
바람직한 실시태양에서 본 발명자들은 PS4 변이 폴리펩티드와 Novamyl 또는 이의 변이체를 포함하는 것을 개시한다. 이러한 결합은 제빵과 같은 식료품 생성에 매우 유용하다. Novamyl은 특히 Novamyl 1500 MG를 포함하는 것이다.
Novamyl 및 이의 용도를 나타내는 다른 문헌은 Christophersen, C, Pedersen, S., 및 Christensen, T., (1993)의 논문 '리미트 덱스트린으로부터 말토오스의 생성 방법, 리미트 덱스트린, 리미트 덱스트린의 용도' 및 WO 95/10627에 개시되어 있다. 또한 이는 미국특허 제4,598,048호 및 미국특허 제4,604,355호에 개시되어 있다. 상기 문헌들은 본 발명에 참고문헌으로 사용될 수 있으며 상기에서 기재된 어느 Novamyl 펩티드 역시 본말명의 PS4 변이 폴리펩티드와 함께 사용할 수 있다.
Novamyl의 변이체, 상동체, 돌연변이체도 α-아밀라아제 활성을 지닌 것이라면 함께 사용할 수 있다. 예를 들면 미국특허 제6,162,628호에 개시된 Novamyl 변이체를 사용할 수 있고 본 명세서에 참고문헌으로 사용할 수 있다. 상기 문헌에 개시되어 있는 폴리펩티드 특히 미국특허 제6,162,628호에 개시된 서열번호: 1 의 변이체 또는 상기 변이체의 하나 또는 그 이상의 잔기에 변이체를 포함할 수 있다. 즉 Q13, 116, D17, N26, N28, P29, A30, S32, Y33, G34, L35, K40, M45, P73, V74, D76 N77, D79, N86, R95, N99, 1100, H103, Ql19, N120, N131, S141, T142, A148, N152, A163, H169, N171, G172, 1174, N176, N187, F188, A192, Q201, N203, H220, N234, G236, Q247, K249, D261, N266, L268, R272, N275, N276, V279, N280, V281, D285, N287, F297, Q299, N305, K316, N320, L321, N327, A341, N342, A348, Q365, N371, N375, M378, G397, A381, F389, N401, A403, K425, N436, S442, N454, N468, N474, S479, A483, A486, V487, S493, T494, S495, A496, S497, A498, Q500, N507, 1510, N513, K520, Q526, A555, A564, S573, N575, Q581, S583, F586, K589, N595, G618, N621, Q624, A629, F636, K645, N664 및/또는 T681의 변이체를 사용할 수 있다.
아미노산 서열
본 발명은 PS4 변이 핵산의 용도 및 상기 PS4 변이 핵산에 따른 아미노산 서열 등에 관련하여 다음과 같은 방법 및 조성을 포함한다.
본 명세서 내에서 "아미노산 서열"이라는 용어는 "폴리펩티드" 및/또는 "단백질" 용어와 동일한 의미이다. 어떤 경우에 "아미노산 서열"이라는 용어는 "펩티드"와 동일한 용어이며 어떤 경우에 "아미노산 서열"이라는 용어는 "효소"와 동일한 용어이다.
아미노산 서열은 적당한 기원으로부터 제조/분리될 수 있다. 또는 아미노산 서열은 합성할 수 있으며 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
PS4 변이 효소는 다른 효소와 결합하여 사용할 수 있다. 그러므로 본 발명자들은 본 명세서에서 설명하는 PS4 변이 폴리펩티드 효소와 다른 효소의 결합을 더욱 개시한다. 이는 그 자체로 또 다른 PS4 변이 폴리펩티드 효소일 수 있다.
PS4 변이 뉴클레오티드 서열
상기에서 언급한 바와 같이 본 발명은 특별한 성질을 지니는 PS4 변이 효소를 코드화하는 핵산 서열을 개시한다.
"뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"이라는 용어는 올리고뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 언급하는 것이며 이의 변이체, 동족체 단편 및 유도체 또는 그의 일부를 의미할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 게놈 서열이거나 재조합 기원 또는 합성 서열일 수 있으며 이들은 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있고 센스 또는 안티-센스 스트랜드를 의미할 수 있다.
통상 PS4 변이 뉴클레오티드 서열은 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된다. 그러나 또 다른 실시태양에서 뉴클레오티드 서열은 당업자에게 알려진 화학적 방법으로 전체 또는 부분적으로 합성될 수 있다(Caruthers MH et al, (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T et al, (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232를 참조).
핵산 서열의 제조
본 명세서에서 정의하는 특정한 성격을 지닌 효소(예를 들면 PS4 변이 폴리펩티드) 또는 이 효소의 적합한 모디피케이션을 코드화하는 핵산 서열이 개시되어 있다. 이 때 모 효소로부터 모디피케이션된 서열은 상기 효소를 생성하는 세포 또는 기관으로부터 확인될 수 있고 분리될 수 있으며 정제될 수 있다. 핵산 서열을 확인하거나 분리하거나 정제하는 방법이 이미 공지되어 있다. 예를 들면 PCR 증폭 기술은 적합한 서열로 확인되거나 분리되거나 정제되는 서열을 다수 제조할 수 있다.
예를 들면 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리가 염색체 DNA 또는 메신저 RNA를 사용하여 생물체로부터 효소를 생성하도록 구축될 수 있다. 만약 효소의 전체 아미노산 서열 또는 일부 아미노산 서열이 알려지면 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 합성할 수도 있고 생물체로부터 게놈 라이브러리를 통해 효소를 코드화하는 클론을 확인할 수도 있다. 한편 또 다른 공지된 효소 유전자와 상동 서열을 포함하는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브는 효소-코드화 클론을 확인할 수 있는 용도로 사용할 수 있다. 이 때 혼성화 및 세척 조건은 낮은 조건에서도 가능하다.
한편 효소-코드화 클론은 게놈 DNA를 예를 들면 플라스미드와 같은 발현 벡터에 삽입할 수 있으며 효소 음성 박테리아를 게놈 DNA 라이브러리로 형질전환시키고 상기 형질전환된 박테리아를 아가 플레이트 위에서 효소의 적절한 기질(예를 들면 말토오스) 상에 성장시킬 수 있고 이에 따라 클론은 확인된 효소를 발현시킬 수 있다.
또 다른 대안으로 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 이미 확립된 표준화 방법을 통해 합성될 수 있다. 예를 들면 Beucage S.L. et al, (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869에 의한 포스포로아미디트 방법 또는 Matthes et al, (1984) EMBO J. 3, p 801-805에 의한 방법 등이다. 포스포로아미디트 방법에 따르면 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 자동 DNA 합성기에 의해 합성될 수 있고 정제, 어닐링, 라이게이팅 및 적절한 벡터로 클로닝될 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 혼합 게놈 및 합성 기원일 수 있고 혼합 합성 및 cDNA 기원 또는 혼합 게놈 및 cDNA 기원일 수 있으며 합성 게놈 또는 cDNA 기원으로부터 된 단편을 표준화된 방법에 의해 적절히 라이게이트시켜 제조할 수 있다. 각각의 라이게이트 단편은 전체 뉴클레오티드 서열의 여러 부분에 상응한다. DNA 서열은 특정한 프라이머 예를 들면 미국특허 제4,683,202호 또는 Saiki R K et al, {Science (1988) 239, pp 487-491에 개시된 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 제조될 수 있다.
변이체/상동체/유도체
본 발명자들은 PS4 변이 폴리펩티드 또는 PS4 변이 핵산과 같은 효소를 암호화하는 효소 또는 뉴클레오티드 서열의 아미노산 서열의 변이체, 상동체 및 유도체의 용도에 대해 기술한다. 그러나 본 명세서에서 나타내지 않으면 "PS4 변이 핵산"이라는 용어는 하기에 기술된 각각의 핵산의 실체를 포함하며 한편 "PS4 변이 폴리펩티드"라는 용어는 하기에 기술된 각각의 폴리펩티드 또는 아미노산의 실체를 포함한다.
본 명세서에서 "상동체"라는 용어는 실제 아미노산 서열 및 실제 뉴클레오티드 서열과 어느 정도 상동성을 지닌 실체를 의미한다. 본 명세서에서 "상동성"이라는 용어는 "동일성"과 같은 의미로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 상동체 서열은 아미노산 서열에 있어서 적어도 75, 80, 85 또는 90% 이상의 동일성을 지니는 서열이며 바람직하게는 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상의 동일성을 지니는 서열이다. 통상 상동체는 객체 아미노산 서열에 대해 동일한 활성 부위를 지닌다. 상동성이라는 용어는 유사성으로 인식되기도 하지만 즉 예를 들면 유사한 화학적 특성 및 기능을 지닌 아미노산 잔기로 인식되기도 하지만 본 명세서에 있어서 상동성은 서열의 동일성을 의미하는 것으로 해석된다.
본 명세서에 있어서 핵산 서열의 상동성 서열은 적어도 75, 80, 85 또는 90% 이상의 동일성을 지니는 서열이며 바람직하게는 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상의 동일성을 지니는 PS4 변이 폴리펩티드 효소를 암호화하는 서열이다(PS4 변이 핵산 서열). 통상 상동성은 객체 서열에 대해 동일한 활성을 코드화하는 동일 서열을 포함한다. 상동성이라는 용어는 유사성으로 인식되기도 하지만 즉 예를 들면 유사한 화학적 특성 및 기능을 지닌 아미노산 잔기로 인식되기도 하지만 본 명세서에 있어서 상동성은 서열의 동일성을 의미하는 것으로 해석된다.
상동성의 비교는 눈으로 행할 수도 있고 서열 비교를 위한 프로그램의 도움을 받아 행할 수 있다. 상용화되는 컴퓨터 프로그램은 둘 또는 그 이상간의 서열간에 상동성을 %로 계산할 수 있다.
% 상동성은 인접하는 서열과의 비교를 통해 계산될 수 있다. 예를 들면 하나의 서열은 또 다른 아미노산 서열과 함께 배열되고 상응하는 아미노산 서열에 대해 직접적으로 비교된다. 잔기는 하나씩 동시에 비교된다. 이를 "언갭트" 배열이라 칭하고 통상 언갭트 배열은 상대적으로 작은 몇 개의 잔기를 비교하는데 사용된다.
이러한 서열 비교법은 매우 간단하고 편리하지만 예를 들면 하나의 아미노산 잔기의 삽입 또는 결실이 아미노산 잔기의 배열을 해석하는데 많은 영향을 줄 수 있어 전체적인 배열의 % 상동성을 계산하는데 큰 차이를 나타나게 할 수도 있다. 결과적으로 대부분의 서열 비교법은 가능한 삽입 또는 결실을 함께 고려한 최적의 배열에 따라 계산되고 따라서 상동성의 정도를 더욱 정확히 계산할 수 있다. 이와 같은 "갭"을 삽입하여 얻어지는 서열은 서열 비교의 상동성을 최대화시킬 수 있다.
그러나 더욱 복잡한 방법인 "갭 패널티"가 배열상에 존재하는 각각의 갭에 적용된다. 즉 몇 개의 갭이 존재하면서 동일한 서열 배열을 지니는 아미노산 서열에 있어서 비교되는 2개의 서열의 비교에 더 높은 관련성을 부여하기 위해서 다수의 갭을 지니는 서열에 패널티를 부여하는 것이다. 갭의 존재에 따라 상대적으로 높은 패널티를 부과하기 때문에 갭의 수가 적은 연속적인 잔기는 적은 패널티를 부여하게 된다. 이는 통상적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 패널티는 배열의 최적화를 위해 더 많은 갭을 지니는 것을 의미한다. 대부분의 배열 프로그램은 모디파이된 갭 패널티를 허용하고 있다. 그러나 서열 비교를 위해 이와 같은 소프트웨어를 사용할 때 디폴트 밸류를 사용하는 것이 바람직하다. GCG Wisconsin Bestfit 패키지를 사용할 경우에는 디폴트 갭 패널티가 아미노산 서열의 하나의 갭에 -12이고 각각의 연장은 -4이다.
따라서 최대 % 상동성은 최적의 배열의 생성시 적절한 갭 패널티의 고려가 필요하다. 이와 같은 배열을 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지(Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387)이다. 또 다른 소프트웨어의 예로는 BLAST 패키지(1720 Ausubel et al, 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18 참고)와 FASTA 패키지(Altschul et al, 1990 J. MoI. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS 등을 들 수 있으며 이에 한정하는 것은 아니다. BLAST와 FASTA 패키지를 오프라인 및 온라인 상에서 모두 활용할 수 있다(Ausubel et al, 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 to 7-60 참고).
그러나 필요에 따라 GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 BLAST 2 Sequences 라고 불리는 새로운 프로그램이 단백질과 핵산 서열 비교에 유용하다(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 and tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참고).
비록 최종 % 상동성은 동일성의 개념으로 측정되지만 배열 과정 그 자체는 반드시 서열 비교에 의해서만 확립되는 것은 아니다. 한편 스케일 유사 스코어 매트릭스는 화학적 유사성 또는 진화의 간격을 기초로 하여 각각의 상응하는 비교를 일반적으로 행할 수 있도록 고안되어 졌다. 이와 같이 통용되는 매트릭스의 예로는 BLOSUM 62 매트릭스를 들 수 있으며 BLAST 프로그램의 보강된 매트릭스이다. GCG Wisconsin 프로그램이 공급 가능하다면 일반적 디폴트 밸류 또는 관습적 심볼 비교 테이블을 위해 사용된다(사용자 매뉴얼을 참조바람). 또 다른 경우에는 GCG 패키지의 공공 디폴트를 사용하거나 BLOSUM 62와 같은 디폴트 매트릭스 소프트웨어를 사용하는 것이 바람직하다.
한편 % 상동성은 알고리즘에 기초를 둔 DNASIS™ (Hitachi Software) 다중 배열 형태를 사용하여 계산할 수 있으며 이는 CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244)와 유사한 것이다.
소프트웨어가 최적의 배열을 생성하면 % 상동성을 계산할 수 있고 바람직하게는 % 서열 동일성을 계산할 수 있다. 일반적인 소프트웨어는 서열 비교의 일부로서 이와 같은 기능을 행하고 그 결과를 나타낼 수 있다.
서열은 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 등을 통해 아미노산 서열의 변화를 야기할 수 있으나 이들은 기능적으로 균등한 물질이다. 아미노산 잔기의 치환은 아미노산의 특성(예를 들면 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 잔기의 양친용매성)의 유사에 근거하여 이루어진다. 따라서 기능성 아미노산 그룹은 함께 치환되는 것이 바람직하다. 아미노산은 그들의 사슬의 특성에 근거하여 그룹화될 수 있다. 그러나 또한 변이 데이터를 포함하는 것이 유용하다. 따라서 유래된 아미노산의 세트는 구조적 이유로 보존적이다. 이러한 아미노산 세트는 밴다이어그램(Livingstone CD. 및 Barton GJ. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" ComputAppl Biosci. 9: 745-756)(Taylor W.R. (1986) "The classification of 1755 amino acid conservation" J.Theor.Biol. 119; 205-218)의 형태로 나타낼 수 있다. 보존적 치환은 예를 들면 하기 표에 나타난 바와 같이 이루어질 수 있으며 밴다이어그램으로 일반적으로 알려진 아미노산 그룹화이다.
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상동적 치환(현존하는 아미노산 잔기의 치환과 대치가 함께 일어나는 것을 의미한다)을 지닌 서열에 대해 더욱 기술한다. 상동적 치환은 유사성 치환으로 염기성은 염기성으로, 산성은 산성으로 또는 극성은 극성으로 치환하는 것을 의미한다. 비-상동적 치환도 발생할 수 있으며 어느 한 클래스의 잔기로부터 오르니틴(이하 Z로 표기함), 디아미노부틸산 오르니틴(이하 B로 표기함), 노르루신 오르니틴(이하 O로 표기함), 피릴알라닌, 티에닐알라닌, 나프탈알라닌과 페닐글리신 등과 같은 아미노산 잔기의 선택적 삽입을 포함하는 것이다.
변이 아미노산 서열은 적절한 스페이서 그룹을 포함할 수 있다. 이 때 2개의 아미노산 잔기 사이에 삽입되는 스페이서는 메틸, 에틸 또는 프로필 그룹과 같은 알킬 그룹을 포함할 수 있으며, 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서를 포함할 수 있다. 또한 변이의 한 형태로서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 펩토이드 형태로 포함될 수 있으며 이는 당업자간에 잘 알려진 기술이다. 이 때 "펩토이드 형태"란 변이 아미노산 잔기를 의미하는 것으로 α-탄소 치환 그룹이 α-탄소가 아닌 질소 원자 잔기에 존재하는 경우이다. 펩토이드 형태의 아미노산을 제조하는 방법은 당업자간에 이미 공지되어 있으며 예를 들면 Simon RJ et al, PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 및 Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134에 개시되어 있다.
여기서 기술하는 뉴클레오티드 서열은 합성 또는 모디파이된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며 여기서 기술하는(예를 들면 PS4 변이 핵산) 방법 및 조성에 적절한 용도를 지닌다. 올리고뉴클레오티드에 대한 다양한 모디피케이션 형태가 알려져 있다. 이 들은 메틸포스포네이트, 포스포티오에이트 골격 및/또는 분자의 3' 및/또는 5' 말단에 아크리딘 또는 폴리라이신 사슬을 추가할 수 있다. 본 명세서에서는 사용 가능한 적절한 방법으로 모디파이된 핵산 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 상기 모디피케이션은 생체 내 활성의 증진 또는 뉴클레오티드 서열의 생존기를 증가하기 위해 수행된다.
여기에 기술한 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열에 용도에 관해서도 기술한다. 또한 이의 유도체 단편, 단편의 유도체에 관해서도 기술한다. 만약 서열이 단편에 상보적이라면 다른 생체 내에서 유사한 서열을 코딩하는 것을 확인할 수 있는 프로브로 사용할 수 있다.
PS4 변이 서열과 100% 상동성을 지니지 않는 폴리뉴클레오티드는 다양한 방법으로 수득될 수 있다. 여기서 기술하는 다른 변이체는 개체로부터 얻어진 DNA 라이브러리를 프로빙함으로써 수득될 수 있다. 덧붙여 다른 상동체가 수득될 수 있으며 이러한 상동체 및 단편은 여기에 기술된 서열에 대해 선택적으로 혼성화될 수 있다. 상기 서열은 cDNA 라이브러리를 프로빙하거나 다른 종의 게놈 DNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 이러한 라이브러리를 프로빙하는 것은 높은 엄격도를 지닌 매체 조건하에서 첨부된 서열목록 내의 하나 또는 그 이상의 서열을 포함할 수 있다. 동일한 방법이 종 상동성 및 대립형질 변이를 지닌 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열을 얻는데 적용할 수 있다.
변이체 및 스트레인/종 상동체는 보존된 아미노산 서열을 암호화하는 변이체 및 상동체 내의 목적 서열을 디자인시킨 프라이머를 사용하여 PCR 방법으로 수득할 수 있다. 보존적 서열은 예를 들면 몇 개의 변이체/상동체로부터 정렬시킴에 의해 추론될 수 있다. 서열 정렬은 당업자가에게 알려진 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 수행한다. 예를 들면 GCG Wisconsin PileUp 프로그램이 널리 이용된다.
PCR을 수행하기 위한 프라이머는 하나 또는 그 이상의 노화된 잔기를 지니고 엄격한 조건하에서 알려진 방법에 의해 단일 서열 프라이머와 클로닝되는 서열을 이용한다.
한편 폴리뉴클레오티드가 특정 서열의 자리 지정 돌연변이에 의해 수득될 수 있다. 이는 침묵하는 코돈 서열을 변화시키기에 유용한 것이다. 또한 발현하려는 폴리뉴클레오티드 서열에 특정한 숙주 세포를 위한 코돈 선호성을 최적화시킬 수 있다. 다른 서열의 변화는 제한효소 인식 잔기를 도입하거나 폴리뉴클레오티드에 의해 코드화되는 폴리펩티드의 기능을 변화시키기 위해 도입될 수 있다.
PS4 변이 핵산과 같은 폴리뉴클레오티드(뉴클레오티드 서열) 서열이 PCR 프라이머와 같은 프라이머를 생성하기 위해 사용된다. 또한 선택적 증폭 반응, 프로브 예를 들면 방사선 또는 비방사선 표지를 이용한 전통적인 표지로 라벨링시킨 프로브를 위해 사용된다. 또한 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에 클로닝 될 수 있다. 이와 같은 프라이머, 프로브 및 다른 단편은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 20, 더욱 바람직하게는 적어도 25, 30 또는 40 개의 뉴클레오티드 길이를 지니고 이 역시 폴리뉴클레이티드로 통칭된다.
DNA 폴리뉴클레오티드 및 프로브와 같은 폴리뉴클레오티드는 재조합, 합성 또는 당업자가 사용 가능한 방법에 의해서 생산된다. 또한 이들은 표준 기술에 의해 클로닝된다. 일반적으로 프라이머는 합성적 수단에 의해 생성되며 원하는 핵산 서열의 뉴클레오티드를 하나씩 단계적으로 합성하여 제조된다. 자동화된 기술을 사용하여 제조하는 방법이 이미 상용화되어 있다.
긴 길이의 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 재조합 기술을 이용하여 생성된다. 예를 들면 중합효소 연쇄 반응(PCR) 클로닝 기술에 의해 생성된다. 프라이머는 적정한 제한 효소 인식 부위를 함유하도록 제조되어지고 적합한 클로닝 벡터에 증폭된 DNA를 클로닝시킨다. 바람직하게는 여기에 기술된 서열과 같은 생물학적으로 활성을 지니는 서열을 함유하는 변이체이다.
"생물학적 활성"이라는 용어는 유사한 구조 기능을 지닌 서열을 의미하나 반드시 동일한 정도일 필요는 없다. 또는 반드시 동일한 정도일 필요는 없으나 서열에서 자연적으로 발생하는 유사한 조절 기능 및/또는 반드시 동일한 정도일 필요는 없으나 유사한 생화학적 기능을 의미한다.
혼성화
본 발명자들은 PS4 변이 핵산 서열에 상보적인 서열을 더욱 기술한다. 이 서열은 PS4 변이 서열에 혼성화할 수 있거나 상보적인 서열을 의미한다.
"혼성화"라는 용어는 "염기쌍을 통해 한 가닥의 핵산으로부터 상보적인 가닥에 결합하는 과정"을 의미한다. 또한 중합효소 연쇄반응(PCR) 기술을 수행하기 위해 필요한 증폭 과정을 의미한다. 따라서 본 발명의 서열 또는 그 유도체, 단편 또는 유도체의 단편에 상보적인 서열은 혼성화되는 핵산 서열로 기술한다.
"변이체"라는 용어는 본 발명의 핵산 서열에 혼성화할 수 있는 상보적인 서열을 포함하는 것이다.
바람직하게는 "변이체"라는 용어는 엄격한 조건 하에서 예를 들면 5O℃ 및 0.2xSSC {lxSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3시트레이트, pH 7.0}인 조건 하에서 혼성화할 수 있는 상보적인 서열을 포함하는 것이다. 더욱 바람직하게는 "변이체"라는 용어는 더욱 엄격한 조건 하에서 예를 들면 65℃ 및 0.IxSSC {lxSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3시트레이트, pH 7.0}인 조건 하에서 혼성화할 수 있는 상보적인 서열을 포함하는 것이다.
본 발명자들은 PS4 변이 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 상보적인 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 PS4 변이 핵산 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 서열을 개시한다. 또한 여기에는 상보적인 핵산 서열 및 상보적인 뉴클레오티드 서열도 포함된다. 또한 본 발명자들은 최대한 엄격한 조건 하에서 뉴클레오티드 서열과 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 기술한다.
바람직한 실시태양에서 엄격한 조건 하에서(예를 들면 5O℃ 및 0.2xSSC) PS4 변이 핵산의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열이다. 더욱 바람직하게는 더욱 엄격한 조건 하에서(예를 들면 65℃ 및 0.IxSSC) PS4 변이 핵산의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열이다.
자리 지정 돌연변이
효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 분리되거나 반복적으로 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 확인된다면 효소를 생성하기 위해 서열을 변이시키는 것이 바람직하다. 따라서 PS4 변이 서열은 현존하는 서열로부터 제조된다. 변이는 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 도입된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 원하는 변이 부위를 치환시킨 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
적절한 방법이 Morinaga et al, {Biotechnology (1984) 2, p646-649)에 개시되어 있다. 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 도입하여 변이시키는 또 다른 방법이 Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147- 151)에 개시되어 있다. 한편 Sarkar and Sommer (Biotechniques (1990), 8, p404-407 - "The megaprimer method of site directed mutagenesis")에도 방법이 기재되어 있다.
본 명세서에 이러한 방법과 조성을 이용하여 제조된 서열은 재조합 서열이다. 예를 들면 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된 서열이다. 이러한 재조합 DNA 기술은 당업자에게 널리 알려진 기술이다. 이와 같은 기술은 예를 들면 J. Sambrook, E. F. Fritsch, 및 T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A, Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 등에 상세히 설명되어 있다.
또 다른 측면에서 본 명세서에는 이러한 방법과 조성을 이용하여 제조된 서열은 합성 서열이다. 예를 들면 시험관 내에서 화학 또는 효소 합성에 의해 제조된 서열이다. 이러한 서열은 메틸로트로픽 효모인 피키아와 한센룰라와 같은 숙주 생물체의 적절한 코돈을 포함하는 서열일 수 있다.
또 다른 측면에서 본 명세서에는 이러한 방법과 조성을 이용하여 제조된 서열은 재조합 전사 벡터 내에 통합될 수 있다. 벡터는 효소 형태로 및/또는 적합한 숙주 세포 내에서 뉴클레오티드 서열을 전사하고 발현시킬 수 있다. 발현은 예를 들면 조절 서열과 같은 제어 서열을 이용하여 제어된다. 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 재조합 숙주 세포로부터 생성되는 효소는 서열의 종류에 따라 세포로부터 분비되거나 세포 내에 함유될 수 있다. 특정한 원핵 세포 또는 진핵 세포 막으로부터 물질을 분비시키기 위해 적절한 시그널 서열이 고안되어 서열에 포함될 수 있다.
PS4 핵산 및 폴리펩티드의 발현
PS4 폴리뉴클레오티드 및 핵산은 DNA 및 RNA 형태로서 천연 또는 합성일 수 있으며 상기 DNA 또는 RNA는 모디파이되거나 모디파이되지 않은 형태를 포함할 수 있다. 또한 데옥시- 또는 디데옥시- 형태이거나 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 그의 동족체 형태일 수 있다. PS4 핵산은 DNA 또는 RNA의 단일 또는 이중가닥일 수 있으며 RNA/DNA의 헤테로듀플렉스 형태이거나 RNA/DNA 공중합체 형태일 수 있다. 여기서 "공중합체"라는 용어의 의미는 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드 모두를 포함하는 단일가닥의 핵산을 의미한다. PS4 핵산은 증가된 발현을 위해 적합한 코돈일 수 있다.
"합성"이라는 용어는 시험관 내에서 화학 또는 효소 합성에 의해 생성되는 것을 정의한다. PS4 핵산과 피키아 및 한센룰라와 같은 메틸로트로픽 효모의 숙주 생물체의 용도에 따라 적합한 코돈을 생성할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 예를 들면 본 명세서 내의 변이 PS4 폴리뉴클레오티드는 재조합 전사 벡터에 통합될 수 있다. 벡터는 적합한 숙주 세포 내에서 핵산을 전사시킨다. 폴리뉴클레오티드 서열을 지닌 벡터는 적합한 숙주 세포를 형질전환시킨다. 적합한 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 및 진균세포이다.
"형질전환된 세포"라는 용어는 재조합 DNA 기술에 의해 형질전환된 세포를 의미하는 것이다. 세포 내에 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열을 삽입함으로써 통상 형질전환이 발생한다. 삽입된 뉴클레오티드 서열은 헤테로로거스 핵산 서열일 수 있다. 예를 들면 형질전환된 세포에 비-자연적 서열이다. 또한 삽입된 뉴클레오티드 서열은 호모로거스 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들면 형질전환된 세포에 자연적인 서열이다. 세포는 이미 존재하는 핵산 서열이외에도 하나 또는 그 이상의 추가 서열 카피를 수령할 수 있다.
또 다른 실시태양에서 폴리뉴클레오티드를 전사 벡터에 도입하고 벡터를 다시 적합한 숙주 세포에 도입한 후 벡터의 전사를 위한 조건 하에 숙주 세포를 성장시키는 방법에 따라 PS4 변이 폴리텝티드 및 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 개시한다. 벡터는 숙주세포로부터 회수될 수 있다.
발현 컨스트럭트
PS4 핵산은 숙주 세포 내에서 전사 및 해독을 조절할 수 있는 활성적 요소와 결합될 수 있다. PS4 핵산은 시그널 서열을 포함하는 융합단백질을 코드화할 수 있다. 예를 들면 슈와니오마이세스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)로부터 유래된 글루코아밀라아제 유전자, 사카로마이세스 세리비지에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 유래된 α-팩터 메이팅 타입 유전자, 아스퍼러질러스 오리제(Aspergillus oryzae)로부터 유래된 TAKA-아밀라아제 등이다. 또한 PS4 핵산은 멤브레인 결합 도메인을 지니는 융합 단백질을 코드화할 수 있다.
발현 벡터
PS4 핵산은 발현 벡터를 사용하여 숙주 생물체 내에서 원하는 수준으로 발현될 수 있다.
PS4 핵산을 포함하는 발현 벡터는 선택된 숙주 생물체 내에서 PS4 핵산을 코드화하는 유전자를 발현시킬 수 있다면 어느 벡터나 가능하다. 벡터의 선택은 이를 삽입하려는 숙주 세포의 종류에 따라 결정된다. 그러므로 전사 벡터는 자동적으로 에피소멀 엔티티로서 존재할 수 있고 염색체 전사와 관계없이 전사할 수 있는 것으로 예를 들면 플라스미드, 박테리오파지 또는 에피소멀 요소, 미니크로모좀 또는 인공 염색체 등이다. 선택적으로 벡터는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈과 합체되어 염색체와 함께 전사될 수 있다.
발현 벡터의 성분
발현 벡터는 선택된 숙주 생물체 내에서 벡터의 자동적 전사를 허용하는 요소와 같은 클로닝 벡터와 선택적으로 페노 타입을 감지할 수 있는 표지를 하나 또는 그 이상 포함할 수 있다. 발현 벡터는 뉴클레오티드 서열의 조절을 위한 요소를 포함할 수 있으며 예를 들면 프로모터, 보퍼레이터, 리보좀 결합 부위, 해독 개시 시그널 및 선택적으로 억제 유전자 또는 하나 또는 그 이상의 활성화 유전자 등이다. 또한 발현 벡터는 PS4 변이 폴리펩티드를 숙주 세포의 소기관 예를 들면 페록시좀 또는 다른 컴파트먼트로 타겟팅할 수 있는 아미노산 서열을 코드화하는 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서 내에서 "발현 시그널"은 상기 조절 서열, 억제 또는 활성화 서열을 포함할 수 있다. 서열의 제어를 통한 발현을 위해 PS4 변이 폴리펩티드 핵산 서열은 적절한 발현을 위해 조절 서열과 결합되어 있다.
바람직하게는 벡터 내의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 발현 벡터와 같은 숙주 세포에 의해 암호화된 서열을 발현시킬 수 있는 조절 서열과 결합되어 있다. "결합"이라는 의미는 성분들이 그들의 기능을 허용할 수 있도록 결합된 상태를 의미한다. 조절 서열은 코딩 서열과 결합되어 있으며 조절 서열과 양립할 수 있는 조건 하에서 코딩 서열이 발현되는 것이다.
조절 서열은 모디파이될 수 있으며 예를 들면 추가 조절 요소의 첨가로 전사 조절에 더욱 직접적으로 응답할 수 있는 수준으로 전사시키는 것이다. 조절 서열은 특히 프로모터를 포함할 수 있다.
프로모터
벡터 내에서 변이 PS4 폴리펩티드를 코드화하는 서열은 적합한 프로모터 서열에 결합되어 있다. 프로모터는 숙주 생물체 내에서 전사 능력을 지니는 DNA 서열이다. 또한 숙주 생물체 내에 호모로거스 또는 헤테로로거스 유전자 형태로 유래될 수 있다.
박테리아 프로모터
PS4 핵산과 같은 모디파이된 뉴클레오티드 서열을 직접 전사시키기 위한 적합한 프로모터의 예로서 박테리아 숙주 세포 내에 포함되어 있는 대장균의 lac 오페론 프로모터, Streptomyces coelicolor 아가라제 유전자 dagA 프로모터, Bacillus licheniformis α-아밀라아제 유전자(amyL) 프로모터, Bacillus stearothermophilus 말토제닉 아밀라아제 유전자(amyM) 프로모터, Bacillus amyloliquefaciens α-아말라아제 유전자(amyQ) 프로모터, Bacillus subtilis xylA 및 xylB 유전자 프로모터, Bacillus subtilis aprE 유전자 프로모터, Lactococcus sp.로부터 유래된 P170 프로모터 등의 프로모터 등을 들 수 있다. 대장균과 같은 박테리아류에서 PS4 변이 폴리펩티드를 코드화하는 유전자를 발현시킬 때 적합한 프로모터를 선택할 수 있으며 예를 들면 T7 프로모터와 파지 람다 프로모터를 포함하는 박테리아파지 프로모터 등도 선택할 수 있다.
진균 프로모터
진균류 내에서 전사를 위해 유용한 프로모터의 예로는 다음과 같은 효소를 코드화하는 유전자로부터 유래된 프로모터 등을 들 수 있다. 즉 Aspergillus oryzae TAKA 아밀라아제, Rhizomucor miehei 아스파틱 프로테인아제, Aspergillus niger 중성 α-아밀라아제, 아스퍼러질러스 나이거 산 안정 α-아밀라아제, 아스퍼러질러스 나이거 글루코아밀라아제, 리조무코 미에헤이 리파아제, 아스퍼러질러스 오리제 알칼리 프로테아제, 아스퍼러질러스 오리제 트리오스 포스페이트 이성화제 또는 Aspergillus nidulans 아세트아미다제 등이다.
효모 프로모터
효모류 내에서 발현을 위한 적합한 프로모터의 예로는 특히 한정하는 것은 아니나 Saccharomyces cerevisiae의 Gal 1 및 Gal 10 프로모터와 Pichia pastoris 의 AOXl 또는 A0X2 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 생물체
(1) 박테리아 숙주 생물체
적합한 숙주 생물체의 예로서는 그람양성 박테리아류를 들 수 있다. 특히 Bacillaceae속의 Bacillus clausii, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium 및 Bacillus thuringiensis 등을 들 수 있으며 스트렙토마이세스 뮤리너스와 같은 스트렙토마이세스속의 숙주세포와 락토코코스 락티스와 같은 락토코코스속 숙주 세포, 락토바실러스 루테리와 같은 락토바실러스속 숙주세포, 피디오코코스속, 스트렙토코코스속 숙주세포 등을 들 수 있다. 또한 선택적으로 대장균을 포함하는 엔테로박테리아세 또는 수도모나다세와 같은 그람음성 박테리아도 숙주 생물체로 선택될 수 있다.
(2) 효모 숙주 생물체
적절한 효모 숙주 생물체로는 효모와 관련된 것이면 예를 들어 피키아속, 한센룰라속 또는 Kluyveromyces속, Yarrowinia속 또는 사카로마이세스 세레비지에를 포함하는 사카로마이세스속 효모 또는 스키조사카로마이세스 폼베를 포함하는 스키조사카로마이세스속 효모인 경우에는 선택적으로 사용할 수 있으며 특별히 제한하는 것은 아니다.
바람직하게는 숙주 생물체로 피키아 파스토리스와 같은 메틸로트로픽 효모 속의 균주가 사용된다. 또한 바람직하게는 한센룰라속의 숙주 생물체이다.
(3) 진균 숙주 생물체
필라멘트 진균 숙주 생물체로 적합한 예로는 예를 들면 아스퍼르질러스 나이거, 아스퍼르질러스 오리제, 아스퍼르질러스 튜비젠시스, 아스퍼르질러스 아와모리 또는 아스퍼르질러스 니둘란스와 같은 아스퍼르질러스속의 진균류이다. 선택적으로 푸사리움 옥시스포럼과 같은 푸사리움속 균주, 리조뮤코르 미에헤이와 같은 리조뮤코르속 균주가 숙주 생물체로 사용될 수 있으며 또 다른 적합한 균주로는 테르모마이세스와 뮤코르속 진균류이다.
적합한 진균 숙주 생물체로 예를 들면 트리코더르마 레세이 또는 트리코더르마 론기브라키아텀 또는 히포크레아 제코리나와 같은 트리코더르마속 균주를 사용할 수 있다.
단백질 발현 및 정제
폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포는 PS4 폴리펩티드, 그의 단편, 동족체, 변이체 또는 유도체와 같은 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 숙주 세포는 단백질을 발현하기에 적합한 조건하에서 배양된다. 폴리펩티드의 발현은 연속적으로 생산될 수 있는 것이며 필요에 따라 발현 개시를 위한 자극을 요하는 경우도 있다. 유도되는 발현의 경우 예를 들면 덱사메타손 또는 IPTG와 같은 발현 유도제를 배양 배지에 첨가하여 발현을 개시할 수 있다.
숙주 세포로부터 폴리펩티드를 추출하는 것은 이미 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면 효소적, 화학적 및/또는 오스모라이시스 및 물리적 파괴를 통해 추출할 수 있다. 폴리펩티드는 시험관 내에서 세포로부터 유리된 시스템하에 생성될 수 있으며 예를 들면 TnT(프로메가) 래빗 레티큘로사이트 시스템이다.
도 1은 Texture Analyser로부터 분석 곡선의 예를 나타낸다.
도 2는 상기에 기술된 PS4 변이 폴리펩티드의 온도 안정도를 측정한 실험 결과를 나타낸다. X 축: 온도를 나타내고, Y 축: 반감기(분)를 나타낸다. ◆: pSac-D34/pMD3(서열번호: 2), ■: pSac-pMD229(서열번호: 13), ▲: pSac-pMS382(서열번호: 21).
도 3은 다양한 농도의 PS4 변이 폴리펩티드 및 아무것도 처리하지 않은 빵으로 처리된 빵의 견고성을 시험한 베이킹 시험의 결과를 나타낸다. X 축은 날짜를 나타내고, Y 축은 hPa(도 13을 보아라)로 표현된 견고성을 나타낸다. ◆: pSac-pMS382의 20,000 Betamyl units/kg 처리군. ■: pSac-pMS382의 40,000 Betamyl units/kg 처리군. ▲: pSac-pMS382의 60,000 Betamyl units/kg 처리군. X: 대조군(효소를 처리하지 않음).
도 4는 다양한 농도의 PS4 변이 폴리펩티드 및 아무것도 처리하지 않은 빵으로 처리된 빵의 복원력을 시험한 베이킹 시험의 결과를 나타낸다. X 축은 날짜를 나타내고, Y 축은 복원력 단위(도 14를 보아라)로 표현된 복원력을 나타낸다. ◆: pSac-pMS382의 20,000 Betamyl units/kg 처리군. ■: pSac-pMS382의 40,000 Betamyl units/kg 처리군. ▲: pSac-pMS382의 60,000 Betamyl units/kg 처리군. X: 대조군(효소를 처리하지 않음).
도 5는 다양한 농도의 PS4 변이 폴리펩티드 및 아무것도 처리하지 않은 빵으로 처리된 빵의 응집력을 시험한 베이킹 시험의 결과를 나타낸다. X 축은 날짜를 나타내고, Y 축은 응집력 단위(도 15를 보아라)로 표현된 응집력을 나타낸다. ◆: pSac-pMS382의 20,000 Betamyl units/kg 처리군. ■: pSac-pMS382의 40,000 Betamyl units/kg 처리군. ▲: pSac-pMS382의 60,000 Betamyl units/kg 처리군. X: 대조군(효소를 처리하지 않음).
도 6은 307에 치환된 PS4 변이 폴리펩티드로 처리된 빵의 견고성을 시험한 베이킹 시험을 결과를 나타낸다. X 축은 날짜를 나타내고, Y 축은 hPa(도 13을 보아라)로 표현된 견고성을 나타낸다. ◆: 대조군(효소를 처리하지 않음). ■: pSac-D34/pMD3(서열번호: 2)의 60,000 Betamyl units/kg 처리군. ▲: pSac-pMD229(서열번호: 13)의 60,000 Betamyl units/kg 처리군. X: pSac-pMS382의 60,000 Betamyl units/kg 처리군.
도 7은 307에 치환된 PS4 변이 폴리펩티드로 처리된 빵의 복원력을 시험한 베이킹 시험을 결과를 나타낸다. X 축은 날짜를 나타내고, Y 축은 복원력 단위(도 14를 보아라)로 표현된 복원력을 나타낸다. ◆: 대조군(효소를 처리하지 않음). ■: pSac-D34/pMD3(서열번호: 2)의 60,000 Betamyl units/kg 처리군. ▲: pSac-pMD229(서열번호: 13)의 60,000 Betamyl units/kg 처리군. X: pSac-pMS382 의 60,000 Betamyl units/kg 처리군.
도 8은 307에 치환된 PS4 변이 폴리펩티드로 처리된 빵의 응집력을 시험한 베이킹 시험을 결과를 나타낸다. X 축은 날짜를 나타내고, Y 축은 응집력 단위(도 15를 보아라)로 표현된 응집력을 나타낸다. ◆: 대조군(효소를 처리하지 않음). ■: pSac-D34/pMD3(서열번호: 2)의 60,000 Betamyl units/kg 처리군. ▲: pSac-pMD229(서열번호: 13)의 60,000 Betamyl units/kg 처리군. X: pSac-pMS382의 60,000 Betamyl units/kg 처리군.
도 9는 노바밀(NovamylTM) 400 ppm, pSac-pMS382(서열번호: 21) 1500 및 50 BMK/kg으로 처리한 토르티야를 구운 후 실험 8일 째에 굴곡성(foldability) 시험.
도 10은 노바밀(NovamylTM) 400 ppm, pSac-pMS382(서열번호: 21) 1500 및 50 BMK/kg으로 처리한 토르티야를 구운 후 실험 8일 째에 굴곡성(foldability) 시험.
도 11은 SSM 471 B10(서열번호: 27) 및 SSM 471 C04(서열번호: 29)로 제조된 미국 토스트의 견고성 시험.
도 12는 SSM 471 B10(서열번호: 27) 및 SSM 471 C04(서열번호: 29)로 제조된 미국 토스트의 복원력 시험.
도 13은 SSM 471 B10(서열번호: 27) 및 SSM 471 C04(서열번호: 29)로 제조된 미국 토스트의 복원력 시험.
서열목록
서열번호: 1은 슈도모나스 사카로필리아(Pseudomonas saccharophila) 말토테트라하이드로라제 아미노산 서열로부터 유래된 PS4 참고 서열을 나타낸다. 서열번호: 2는 슈도모나스 사카로필리아 말토테트라하이드로라제 아미노산 서열로부터 유래된 pSac-D34 서열을 나타낸다. 이는 전분 결합 도메인의 11 군데 치환 또는 결실이 이루어진 것이다. 서열번호: 3은 슈도모나스 사카로필리아 말토테트라하이드로라제 아미노산 서열로부터 유래된 pSac-D20 서열을 나타낸다. 이는 전분 결합 도메인의 13 군데 치환 또는 결실이 이루어진 것이다. 서열번호: 4는 슈도모나스 사카로필리아 말토테트라하이드로라제 아미노산 서열로부터 유래된 pSac-D14 서열을 나타낸다. 이는 전분 결합 도메인의 14 군데 치환 또는 결실이 이루어진 것이다. 서열번호: 5는 슈도모나스 사카로필리아 글루칸 1,4-α-말토테트라하이드로라제 전구체(EC 3.2.1.60) (G4-아밀라아제) (말토테트라오즈-형성 아밀라아제) (엑소-말토테트라하이드로라제) (말토테트라오즈-형성 엑소-아밀라아제)를 나타낸다. SWISS-PROT 접근번호는 P22963이다. 서열번호: 6은 말토테트라하이 드로라제(EC 번호 = 3.2.1.60)를 암호화하는 슈도모나스 사카로필리아 말토테트라하이드로라제 유전자를 나타낸다. GenBank 접근번호는 Xl 6732이다. 서열번호: 7은 슈도모나스 스투제리(Pseudomonas stutzeri) 말토테트라하이드로라제 아미노산 서열로부터 유래된 PS4 참고 서열을 나타낸다. 서열번호: 8은 슈도모나스 스투제리 말토테트라하이드로라제 아미노산 서열로부터 유래된 PStu-D34 서열을 나타낸다. 이는 9 군데 치환이 이루어진 것이다. 서열번호: 9는 슈도모나스 스투제리 말토테트라하이드로라제 아미노산 서열로부터 유래된 PStu-D20 서열을 나타낸다. 이는 11 군데 치환이 이루어진 것이다. 서열번호: 10은 슈도모나스 스투제리 말토테트라하이드로라제 아미노산 서열로부터 유래된 PStu-D14 서열을 나타낸다. 이는 12 군데 치환이 이루어진 것이다. 서열번호: 11은 슈도모나스 스투제리를 나타낸다. 글루칸 1,4-α-말토테트라하이드로라제 전구체(EC 3.2.1.60) (G4-아밀라아제) (말토테트라오즈- 형성 아밀라아제) (엑소-말토테트라하이드로라제)(말토테트라오즈-형성 엑소-아밀라아제). SWISS-PROT 접근번호는 P13507이다. 서열번호: 12는 슈도모나스 스투제리 말토테트라오즈-형성 아밀라아제(amyP) 유전자, 완전한 코드를 나타낸다. GenBank 접근번호는 M24516이다.
서열번호: 13은 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P 및 334P에 변이를 지니는 pSac-pMD229 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 14는 pSac-pMD229 핵산 서열을 나타낸다. 서열번호: 15는 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 145D, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L 및 334P에 변이를 지니는 pSac-pMD248 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 16은 pSac-pMD248 핵산 서열을 나타낸다. 서열번호: 17은 33Y, 34N, 121D, 134R, 141P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P 및 334P에 변이를 지니는 pSac-pMD253 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 18은 pSac-pMD253 핵산 서열을 나타낸다. 서열번호: 19는 3S, 33Y, 34N, 7OD, 121D, 134R, 141P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P 및 334P에 변이를 지니는 pSac-pMD271 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 20은 pSac-pMD271 핵산 서열을 나타낸다.
서열번호: 21은 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K, 309P 및 334P에 변이를 지니는 pSac-pMS382 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 22는 pSac-pMS382 핵산 서열을 나타낸다. 서열번호 23은 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307R, 309P 및 334P에 변이를 지니는 pSac-pMS382R 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 24는 pSac-pMS382R 핵산 서열을 나타낸다. 서열번호: 25는 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 309P 및 334P에 변이를 지니는 pSac-pMS382H 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 26은 pSac-pMS382H 핵산 서열을 나타낸다.
서열번호: 27은 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 303E, 307R, 309P 및 334P에 변이를 지니는 SSM471 B10 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 28은 SSM471 B10 핵산 서열을 나타낸다. 서열번호: 29는 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 303E, 307K, 309P 및 334P에 변이를 지니는 SSM471 C04 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 30은 SSM471 C04 핵산 서열을 나타낸다. 서열번호 31은 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 303E, 309P 및 334P에 변이를 지니는 PMS 370 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 32는 PMS 370 핵산 서열을 나타낸다.
(실시예 1) PS4의 클로닝
슈도모나스 사카로필라(Pseudomonas sacharophila)는 LB 배지 상에서 밤새 성장되며 염색체 DNA는 표준방법(Sambrook J, 1989)에 의해 분리된다. PS4 해독틀(open reading frame)을 지닌 2190 bp 단편(Zhou et αl, 1989)은 상기 프라이머 Pl 및 P2를 사용하여 PCR에 의해 P. 사카로필라 염색체 DNA로부터 증폭되었다(표 3을 참고). 상기 만들어진 단편은 프라이머 P3 및 P4를 사용한 PCR에서 주형으로서 사용되며, 신호 서열 없이 PS4의 해독틀을 확장시키며, 유전자의 5' 말단의 NcoI 자리 및 3' 말단의 BamHI 자리를 유도한다. N-터미널 메티오닌에 대한 코돈 은 NcoI 자리와 함께 유도되며, PS4의 세포내 발현이 허용된다. 상기 1605 단편은 pCRBLUNT TOPO(인비트로젠)으로 클로닝되며, 상기 컨스트럭트의 통합성(integrity)은 서열에 의해 분석된다. 상기 대장균(E.coli) 바실러스 셔틀벡터 pDP66K(Penninga et al, 1996)는 P32 프로모터 및 ctgase 신호 서열의 통제 하에서 PS4의 발현을 허용하기 위해 변형된다. 상기 만들어진 플라스미드, pCSmta는 B. 섭틸러스로 형질전환된다.
두 번째 발현 컨스트럭트는 PS4 녹말 결합 도메인이 제거된 곳에서 제조된다. 또한 pCSmta 상에서 프라이머 P3 및 P6(표 3)을 사용한 PCR에서, mta 유전자의 절단 형태(truncated version)가 제조된다. pCSmta에서 상기 완전한 길이를 지닌 mta 유전자는 상기 플라스미드 pCSmta-SBD를 만드는 절단형태로 교환된다.
(실시예 2) PS4의 자리 지정 돌연변이
변이는 2 step PCR을 기초로 한 방법이나 Quick Exchange method(QE)에 의한 2가지 방법에 의해 mta 유전자에 유도된다. 편의상 mta 유전자는 세 부분으로 분리된다; PvuI-FspI 단편, FspI-PstI 단편 및 PstI-AspI 단편으로 더욱이 각각 이를 단편 1, 2 및 3으로 할 수 있다.
2 step PCR을 기초로 한 방법에서, 변이는 Pfu DNA 폴리머라제를 이용하여 유도된다(Stratagene). 첫 번째 PCR은 스트랜드 플러스를 코딩하기 위한 돌연변이 프라이머(표 4)와 하부 스트랜드 상의 프라이머 다운스트림(표 3의 2R 또는 3R)과 함께 수행된다. 상기 반응 생성물은 코딩 스트랜드 상의 프라이머 업스트림과 함께 두 번째 PCR에서 프라이머로 사용된다. 상기 마지막 반응의 생성물은 pCRBLUNT topo (인비트로젠)으로 클로닝되고, 서열화 후 상기 단편은 pCSmta에서 대응하는 단편으로 교환된다.
Quick Exchange method (Stratagene)를 사용하여, 변이는 mta 유전자 또는 mta 유전자 일부를 포함하는 플라스미드 상에서 PCR시 두 가지 상보적인 프라이머를 사용하여 유도된다.
이러한 목적으로 편리한 플라스미드 세트가 구성되며, 이는 3 SDM 플라스미드 및 3 pCSΔ 플라스미드를 포함한다. 상기 SDM 플라스미드 각각은 상술한 바와 같이 mta 유전자 단편 1을 지니며, 여기서 QE에 의해서 원하는 변이가 유도된다. 서열화에 의한 검정 후, 상기 단편은 대응하는 피절달자(recipient) pCSΔ 플라스미드로 클로닝된다. 상기 pCSΔ 플라스미드는 pCSmta로부터의 유도체를 불활성화시킨다. 활성은 상기 SDM 플라스미드로부터의 대응하는 단편을 클로닝함으로써 복원되며, 이지 스크리닝을 가능케 한다.
Figure 112009000481646-PCT00004
: mta 유전자의 클로닝시 사용되는 프라이머, 2 step PCR 방법으로 자리 지정 돌연변이의 컨스트럭션에 사용되는 표준 프라이머
Figure 112009000481646-PCT00005
: mta에서 자리 지정 돌연변이를 유도하기 위해 사용되는 프라이머
Figure 112009000481646-PCT00006
: SDM 및 pCSΔ 플라스미드의 특징
(실시예 3) 다중 SDM
PS4 변이는 QuikChange® 다중 자리 지정 돌연변이 키트(Stratagene)를 이용하여 생성시키며 제조자 프로토콜의 방법에 따라 모디피케이션을 행한다.
단계 1: 변이 스트랜드 합성 반응(PCR)
10ml Falcon 튜브 내에 3ml의 LB 접종(22g/l Lennox L 배지 베이스, 시그마) + 항생제(0,05 μg/ml 가나마이신, 시그마).
- 37℃에서 200 rpm으로 인큐베이션.
- 원심분리에 의해 세포를 침전시킴(5000 rpm/5 분)
- 배지의 제거
- QIAGEN Plasmid Mini 정제 프로토콜에 의해 이중 가닥 DNA 주형의 제조.
1. 다음 방법에 의해 열변화 사이클링을 행하여 변이 스트랜드를 합성함.
PCR Mix:
2,5 μl의 10X QuickChange® 다중 반응 완충액; 0,75 μl의 QuickSolution; X μl의 프라이머, 프라이머 길이 28-35 bp → 10 pmol, 프라이머 길이 24-27 bp → 7 pmol, 370 프라이머 길이 20-23 bp → 5 pmol; 1 μl의 dNTP 혼합물; X μl의 이중 가닥 DNA 주형(200 ng); 1 μl의 QuickChange® 다중 효소 혼합물(2,5 U/μl) (PfuTurbo® DNA 중합효소); 375 X μl의 dH2O (최종 함량: 25 μl).
피펫트를 이용하여 모든 성분을 혼합시키고 반응 혼합물을 간단히 회전침지시킨다.
2. 다음 파라미터를 이용하여 사이클 반응을 행한다: 35 사이클의 변성(96°C/l분) 프라이머 어닐링(62,8°C/l분) 엘론게이션(65°C/15분) 그 후 4℃유지.
PCR 기계를 105℃로 예열시키고 PCR 튜브를 95℃ 플레이트에 넣어 기계 속에 삽입시킨다.
단계 2: Dpn I 분해
1. 2 μl의 Dpn I 제한효소(10 U/μl)를 각각의 증폭 반응에 가하고 혼합하며 피펫팅 및 스핀다운시킨다.
2. 37℃에서 최대 3 시간 인큐베이션 시킨다.
단계 3: XLIO-Gold® 울트라콤퍼넌트 세포의 형질전환
1. XL 10-Gold 세포를 얼음 속에 넣는다. 냉각된 펠콘 튜브에 45 μl 세포를 변이 반응을 위해 투입.
2. 수욕(42℃)을 가동시켜 예열된 수조 내에 NZY 브로스를 첨가한 튜브를 넣는다.
3. 각각의 튜브에 2 μl의 β-머캅토에탄올 혼합액을 첨가한다. 천천히 교반시키고 얼음 속에서 10분간 인큐베이션 시킨 후 2분간 회전시킨다.
4. 각각의 세포 알리코트에 1.5 μl의 Dpn I-처리 DNA를 첨가한다. 회전하면서 혼합시키고 얼음 속에서 30분간 인큐베이션시킨다.
5. 42℃ 수욕 하에 튜브를 30초간 열-자극을 가하고 2분간 얼음 속에 넣는다.
6. 0.5 ml의 예열된 각각의 튜브에 NZY+ 브로스를 가하고 37℃에서 1시간 225-250 rpm으로 교반하면서 인큐베이션 시킨다.
7. 1 %의 전분과 0,05 μg/ml 의 가나마이신을 함유하는 LB 플레이트(33,6 g/1 Lennox L Agar, Sigma) 위에서 200 μl의 형질전환 반응을 행한다.
8. 형질전환된 플레이트를 37℃에서 하룻밤 인큐베이션 시킨다.
"SDM" 프라이머는 특정 부위를 모디파이시켜 사용하고 이러한 방법은 WO 2005/003339호의 실시예 2에 개시되어 있다. 사용된 "MSDM" -프라이머는 상기 문헌의 실시예 3에 다음과 같이 기재되어 있다.
Figure 112009000481646-PCT00007
: pPD77d14에 관한 프라이머 표
Figure 112009000481646-PCT00008
: pPD77d20에 관한 프라이머 표
Figure 112009000481646-PCT00009
: pPD77d34에 관한 프라이머 표
pPD77을 기초로 한 벡터 시스템
pPD77을 위해 사용되는 상기 벡터 시스템은 pCRbluntTOPOⅡ(인비트로젠) 상에서 기초로 된다. 상기 지오신 저항 카세트는 pmlI, 제거된 393 bp 단편에 의해 제거된다. 상기 pCC 벡터 (P32-ssCGTase-PS4-tt)로부터의 발현 카세트는 상기 벡터로 삽입된다.
pCCMini로 PS4 변이체의 결찰(ligation)
상기 상응하는 변이(MSDM에 의한)를 포함하는 플라스미드는 제한효소 Nco 1 및 Hind Ⅲ로 절단된다(Biolabs):
3 μg 플라스미드 DNA, X μl 10x 완충용액 2, 10 units Ncol, 20 units Hindlll,
37℃에서 2시간 동안 배양
1% 아가로즈 겔 상에서 분해. 1293 bp(PS4 유전자) 크기의 단편이 겔로부터 제거되며 Qiagen 겔 정제 키트를 사용하여 정제된다.
상기 벡터 pCCMini는 제한효소 Nco 1 및 Hind Ⅲ로 절단되며, 상기 분해는 1% 아가로즈 겔 사에서 실행된다. 상기 3569 bp 크기의 단편이 겔로부터 제거되며 Qiagen 겔 정제 키트를 사용하여 정제된다.
결찰 : Rapid DNA ligation kit(Roche)를 사용
벡터와 비교되는 삽입물 양의 두 배를 사용
Use the double amount of insert compared to vector
예를 들면 2 μl 삽입물(PS4 유전자)
1 μl 벡터
5 μl T4 DNA 결찰 완충용액 2xconc
1 μl dH2O
1 μl T4 DNA 리가아제
5 min/RT 동안 결찰시킨다.
제조자 프로토콜에 따라서 One Shot TOPO 적격세포(competent cells)로 상기 결찰을 형질전환. 5 μl 결찰/형질전환을 사용.
1% 녹말 및 0,05 μg/ml 카나마이신을 포함하는 LB 접시(3,6 g/1 Lennox L Agar, Sigma) 상에 50 μl 형질전환 혼합물을 놓는다. 삽입물(PS4 변이체)을 포함하는 벡터는 녹말 접시상에서 할로(halo) 형성에 의해 인식된다.
(실시예 3A) 307 잔기에 치환을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드의 제조
pSac-pMD229
논-말토제닉 엑소-아밀라아제 야생형과 관련된 N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H272Q, G303E, H307L, A309P, S334P에 변이를 포함하는 서열 pSac-pMD229(서열번호: 14)는 하기 표에 프라이머와 자리 지정 돌연변이(상기 실시예 2에 기술됨) 또는 다중 자리 지정 돌연변이(상기 실시예 3에 기술됨)를 사용하여 야생형 서열로부터 제조된다:
Figure 112009000481646-PCT00010
: pMD229에 관한 프라이머
pSac-pMS382
307K를 포함한 서열 pSac-pMS382(서열번호: 22)는 하기 표의 프라이머와 다중 자리 지정 돌연변이(상기 실시예 3에 기술됨)를 사용하여 pSac-pMD229로부터 제조된다:
Figure 112009000481646-PCT00011
: pMD229->pMS382에 관한 프라이머
잔기 307에 다른 잔기를 지닌 PS4 변이 폴리펩티드는 하기 표의 프라이머와 다중 자리 지정 돌연변이(상기 실시예 3에 기술됨)를 사용하여 제조된다:
Figure 112009000481646-PCT00012
Figure 112009000481646-PCT00013
: 잔기 307에서 사이트 스캔을 위해 사용된 프라이머
(실시예 4) 바실러스 섭틸리스 내로 형질전환(프로토플라스트 형질전환)
바실러스 섭틸리스(균주 DB104A; Smith et al. 1988; Gene 70, 351-361)은 다음과 같은 프로토콜에 의해 형질전환된 플라스미드와 함께 형질전화시킨다.
A. 프로토플라스팅 및 형질전환을 위한 배지
2 x SMM : 리터당, 342 g의 설탕(1 M), 4.72 g 말레인산나트륨 (0.04 M), 8:12 g MgCl2,6H20 (0.04 M), 농축 NaOH, pH 6.5. 50-ml 분량을 분주시킨 후 10분간 오토클레이브에서 보관.
4 x YT (1/2 NaCl) : 100 ml 당 2 g의 효모 추출물 + 3.2 g의 트립톤 + 0.5 g NaCl.
SMMP : 2 x SMM 와 4 x YT의 동일 용량을 혼합.
PEG : 25 ml 1 x SMM내의 10 g의 폴리에틸렌글리콜 6000 (BDH) 또는 8000 (Sigma)(10분간 오토클레이브).
B. 플레이팅/재생성 배지
한천 : 4% Difco minimal 한천. 15분간 오토클레이브.
숙신산나트륨 : 270 g/1 (1 M), pH 7.3 HCl. 15분간 오토클레이브.
인산 완충액 : 100ml 당 3.5 g K2HPO4 + 1.5 g KH2PO4. 15분간 오토클레이브.
MgCl2 : 100 ml 당 20.3 g MgCl2, 6H2O(1 M).
카즈아미노산 : 5% (w/v) 용액. 15분간 오토클레이브.
효모 추출물 : 100 ml 당 1O g, 15분간 오토클레이브.
포도당 : 20% (w/v) 용액. 10분간 오토클레이브.
DM3 재생 배지 : 60℃에서 혼합 (수욕; 500-ml 병): 250 ml의 숙신산나트륨, 50 ml의 카즈아미노산, 25 ml의 효모 추출물, 50 ml의 인산 완충액, 15 ml의 포도당,1O mI의 MgCl2 , 100 ml의 몰텐 한천.
적량의 항생제 첨가 : 5 ug/ml의 클로람페니콜 및 테트라사이클린, 1 ug/ ml의 에리트로마이신. 문제가 있는 DM3 배지에는 가나마이신 선택 ; 250 ug/ml의 농도 요구.
C. 프로토플라스트의 제조
1. 세정제 없는 플라스틱 또는 글라스웨어를 사용.
2. 100-ml 플라스크 내의 싱글 콜로니 10 ml의 2 x YT 배지. 25-30℃의 쉐이커 내에서 하룻밤 배양 성장(200 rev/분).
3. 하룻밤 성장된 배지를 20배로 희석, 100 ml의 신선한 2 x YT 배지 (250-ml 플라스크)로 교체, 37℃ 쉐이커 내에서 OD600 = 0.4-0.5 (약 2시간)될 때까지 성장(200-250 rev/min).
4. 원심분리에 의한 균주 회수(900Og, 20분, 4℃).
5. 피펫으로 상등액 제거 후 5 ml의 SMMP + 5 mg 리소자임내에 재현탁시킨 후 살균여과.
6. 37℃의 수욕 쉐이커 내에서(100 rev/분) 인큐베이션.
30분 후에 그리고 15 분간 간격으로 25 ul의 샘플을 현미경으로 검사한다. 99%의 세포가 프로토플레이트 될 때까지 계속 인큐베이션 시킨다(구형 형상). 원심분리 후 프로토플라스트를 회수한다(4000g, 20 분, RT). 피펫으로 상등액을 제거한다. 1-2 ml의 SMMP를 펠레트로 재현탁시킨다.
프로토플라스트는 사용할 수 있게 준비된다(예를 들면 0.15 ml의 분량을 그 후 사용할 수 있도록 -80℃로 냉동시킨다. 글리세롤의 첨가는 요구되지 않는다. 비록 약간의 형질전환의 감소가 야기되었으나 DNA 1μg 당 106개의 형질전환체를 냉동 프로토플라스트 내에서 수득할 수 있었다.
D. 형질전환
1. 450 ul의 PEG를 마이크로튜브로 이송시킨다.
2. 1-10 ul의 DNA(0.2 ug)와 150 ul의 프로스토플라스트를 혼합하고 PEG를 마이크로튜브를 이용하여 혼합물 내에 첨가한다. 잔잔히 혼합시킨다.
3. 2분간 RT시킨 후, 1.5 ml의 SMMP를 첨가하고 혼합한다.
4. 마이크로퓨징에 의해 프로토플라스트를 회수한다(10분, 13.000 rev/분 (10-12.000 g)). 상등액을 제거하고 남아있는 방울을 티슈로 제거한다.
300 ul의 SMMP를 가하고 교반할 필요는 없으며 60-90분간 37℃로 수욕 쉐이커(100 rev/분) 내에서 인큐베이션 시킨다. 항생제 내성 표지를 발현시키도록 한다. 프로토플라스트는 수욕의 쉐이킹 동작에 따라 충분히 재현탁된다. 1 x SSM로 적절히 희석시키고 DM3 플레이트 위에 0.1 ml을 놓는다.
(실시예 5) 쉐이크 플라스크 내에서 PS4 변이의 발효
쉐이크 플라스크의 기질은 다음과 같은 조성으로 제조된다.
Figure 112009000481646-PCT00014
기질을 4N 황산 또는 수산화나트륨으로 오토클레이빙 전에 pH를 6.8로 조정한다. 100 ml의 기질을 하나의 바플을 지닌 500 ml 플라스크에 넣고 30분간 오토클레이브 시킨다. 이어서 6 ml의 살균 덱스트로오즈 시럽을 가한다. 상기 덱스트로오즈 시럽은 50 w/v%의 덱스트로오즈와 물을 혼합시켜 제조한 후 20분간 오토클레이브 시킨다.
쉐이크 플라스크에 변이체를 접종하고 35℃에서 180 rpm으로 인큐베이터 내에서 24시간 인큐베이션 시킨다. 균주를 인큐베이션 시킨 후 원심분리에 의해(10,000x g, 10분간) 균체 덩어리로부터 분리시킨다. 상등액은 0.2 μm의 마이크로 여과를 통해 균주를 제거시킨다. 균주가 제거된 상등액은 본 발명의 에세이 적용 시험에 사용한다.
(실시예 6) 아밀라제 에세이
베타아밀 에세이
1 베타아밀 유니트는 1분간 PNP-커플링된 말토펜타오즈 0.0351 mmole을 1분간 0.0351 mmole의 PNP로 분해시키고 여분의 알파-글루코시다아제를 에세이 혼합물 중에서 방출시키는 활성을 의미한다. 이 에세이 혼합물은 50 ul의 50 mM Na-시트레이트, 5 mM CaC12, pH 6.5, 25 ul의 효소 샘플과 25 ul의 Megazyme, Ireland(10 ml 물을 1 바이알 내에 용해시킨)로부터 유래된 베타아밀 기질(Glc5-PNP 및 알파-글루코시다아제)을 포함한다. 이 에세이 혼합물은 4O℃에서 30분간 인큐베이션 시킨다. 150 ul 4%의 트리스를 첨가하여 중단시킨다. 420 nm에서의 흡광도는 ELISA-판독기를 통하여 측정한다. 베타아밀 활성은 420 nm에서의 흡광도에 의거 계산되고 효소 샘플의 베타아밀 units/ml이 측정된다.
엔도-아밀라아제 에세이
엔도-아밀라아제 에세이는 제조자(Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB)에 따른 Phadebas 에세이와 동일한 것이다.
엑소-특이성
Phadebas 활성에 대한 엑소-아밀라아제 활성의 비율이 엑소-특이성으로 사용된다.
특이 활성
pSac-D14, pSac-D20 및 pSac-D34 변이체들은 Bradford(1976; Anal. Biochem. 72, 248) 방법에 의해 측정된 정제 단백질 1 마이크로그램 당 평균 10 베타아밀 유니트의 특이적 활성을 지님을 발견하였다. 이 특이적 활성은 본 발명의 적용을 위한 용량의 계산에 기초로 사용될 수 있다.
(실시예 7) 반감기 측정
tl/2은 특정 열 조건 하에서 효소의 반이 불활성화되는 시간을 정의한다. 효소의 반감기를 측정하기 위해서는 시료는 60℃∼90℃의 일정한 온도에서 1-40 분간 가열시킨다. 반감기는 잔류 베타아밀 에세이를 통해 계산된다.
방법 : 에펜도르프 바이알 내에 1000 μl의 완충액을 60℃ 보다 높은 온도에서 약 10 분간 예열시킨다. 시료의 열처리는 가열 인큐베이터 내에서(써머믹서 ) 에펜도르프 바이알의 연속적 혼합(800 rpm) 하에서 예열된 완충액에 100 μl의 시료를 첨가하여 시작된다. 0, 2, 4, 6, 8 및 9 분 인큐베이션 후에 처리를 중단하고 45 μl의 시료를 2O℃에서 1000 μl의 균등 완충액으로 이송시키고 20℃에서 1500 rpm으로 1분간 인큐베이션 시킨다. 잔류 활성은 베타아밀 에세이로 측정된다.
계산 : tl/2는 잔류 베타아밀 활성과 인큐베이션 시간간의 loglO의 기울기에 의해 계산된다. tl/2은 Slope/0.301=tl/2로 계산된다.
(실시예 8) 베이킹 시험의 모델 시스템
반죽이 30.0℃에서 파리노그라프 내에서 제조되었다. 파리노그라프 내에 개질된 밀가루의 무게를 측정한 후 1분 후에 첨가한다. 완충액 또는 물로 된 참조물과 효소에 완충액 또는 물을 첨가시킨 시료를 혼합시켜 살균된 피펫의 구멍을 통해 첨가시킨다. 30초 후에 밀가루는 반죽 배트의 구멍을 통해 스크래핑 시킨 다. 시료는 7분 동안 반죽화시킨다.
최종 참조물이 진행되기 전에 파리노그라프 상의 완충액 또는 물의 시험을 행한다. 참조물 상에 FU는 400이 되도록 한다. 만약 그렇지 않다면 액체의 함량을 조절하여야 한다. 참조물/시료는 스패튤라로 제거시키고, NMR 튜브에 넣어 마개를 닫을 수 있도록 작은 유리 튜브(약 4.5 cm의 길이)에 넣기 전에 손으로 취한다.
모든 시료가 준비되었을 때 튜브는 33℃에서 25분간 수욕 상에 넣는다. 그 후 다시 33℃에서 5분간 더 머무른 후 1.1℃/분 속도로 56분 이상 가열하여 98℃ 까지 가열시킨다. 최종적으로 96℃에서 5분간 머무르게 한다.
튜브는 20.0℃에서 써모 컵 보드에 저장한다. 크럼의 고형분은 Bruker NMS 120 Minispec NMR 분석기를 사용하여 양성자 NMR을 측정한다. 1, 3 및 7일째에 크럼 샘플은 도 2의 pSac-D34의 0.05, 1 및 2 ppm을 준비하여 측정한다. 고형분 함량의 낮은 증가는 아밀로펙틴의 노화가 둔화되고 있는 것을 나타낸다. 20.0℃의 써머 컵 보드 내에서 7일간 보관시킨 후 10-20 mg 크럼 시료를 무게를 측정하고 40 μl의 알루미늄 표준 DSC 캡슐에 넣어 20℃에서 보관한다.
캡슐은 Mettler Toledo DSC 820 기기로 불리는 시차 주사 열량계(Differential Scanning Calorimetry)에 사용하기 위한 것이다. 파라미터에 사용하는 열 주기는 10℃/분으로 20-95℃까지이며 기체 유동은 질소를 분당 80 ml로 유동시킨다. 그 결과는 분석되었고 노화된 아밀로펙틴의 융점 엔탈피는 J/g 단위로 계산한다.
(실시예 9) 항-스테일링 효과
실시예 7의 방법에 따라 빵 크럼 모형이 제조되었고 측정되었다. PS4 변이체는 대조군에 비해 시차 주사 열량계로 측정한 아밀로펙틴의 노화가 베이킹 후에 급속히 감소됨을 나타낸다. PS4 변이체는 확실한 용량 효과를 나타낸다.
(실시예 10) 베이킹 시험용 레시피
베이킹 시험이 미국 토스트에 적합한 표준 빵 스펀지와 반죽 레시피를 통해 수행되었다. 미국 General Mills사의 "Gold Medal" 밀가루 1400 g에 800 g의 물, 40 g의 유채유, 7,5 g의 GRINDSTED™ SSL P55 Veg, 1O g의 DIMOD AN™ PH200 유화제 및 60 g의 압착효모를 사용하여 반죽 스펀지를 제조한다. 스펀지를 낮은 속도로 1분간 혼합시키고 계속하여 호바트 믹서를 사용하여 스피드 2로 3분간 혼합시킨다. 스펀지는 연이어 25℃에서 85% RH 습도 조건 하에 3시간 발효시킨다.
그 후 600 g의 "Gold Medal" 밀가루, 18 g의 압축효모, 5 g의 프로피온산 칼슘, 16O g의 설탕, 432 g의 물 및 아스코르브산(최종 농도 60 ppm) 및 ADA (아조디카본아미드; 최종 농도 40 ppm)을 스펀지에 가한다. 얻어진 반죽은 1분간 늦은 속도로 혼합시키고 계속해서 빠른 속도로 디오스나 믹서로 2분간 혼합한다. 30 g의 소금을 반죽에 첨가한다.
반죽은 실온에서 5분간 휴지시킨 후 550 g의 반죽을 정확히 잘라 Glimek 쉬터로 1:4, 2:4, 3:15, 4:12 비율로 몰드화 시킨 후 모든 면을 구울 수 있도록 형태화 시킨다. 43℃, 95% RH 조건 하에서 65분간 프루핑시킨 후 MIWE 오븐에서 200℃로 26분간 베이킹한다.
(실시예 11) 대니쉬롤의 볼륨 조정
2000 g의 대니쉬 개질 밀가루(Cerealia사 제조), 12O g의 압착효모, 32 g의 소금 및 32 g의 설탕을 혼합하여 대니쉬롤을 위한 반죽을 제조하였다. 물을 최적화시키기 위해 적량 첨가하여 반죽을 제조한다.
반죽은 Diosna 믹서(낮은 속도 2분, 빠른 속도 5분)로 반죽을 혼합한다. 혼합 후 반죽을 26℃에서 보관한다. 1350 g의 반죽을 측정하여 30℃ 가열 캐비넷 내에서 10분간 휴지시킨다. 롤은 Fortuna 몰더로 몰딩시키고 34℃에서 45분간 상대 습도 85% 하에서 프루핑시킨다. 롤은 13초간 증기를 분사하는 Bago 2 오븐에서 250℃로 18분간 베이킹시킨다. 롤을 베이킹한 후 25분간 냉각시키고 그 양과 무게를 측정한다.
롤의 평가는 크러스트 형상, 크럼 동질성, 크러스트의 캐핑, 특정 양을 유채 배치법에 의해 측정한다. 상기한 기준에 의거 PS4 변이체는 대니쉬롤의 양과 질의 파라미터를 개선시킴을 발견하였다. PS4 변이체는 제빵 제품의 양을 조절할 수 있다.
(실시예 12) 견고성, 복원력 및 응집력의 평가 방법
빵의 질감 프로파일 분석
견고성, 복원력 및 응집력은 Stable Micro Systems사의 Texture Analyser에 의해 질감 프로파일 분석법에 의해 슬라이스된 빵을 통해 측정한다. 견고성과 복원력의 계산은 Stable Micro System사에 의해 공급되는 표준 방법을 통해 실시한다. 프로브는 50 mm 원형의 알루미늄을 사용하였다.
빵은 12.5 mm 두께로 슬라이스시킨다. 슬라이스된 빵을 45 mm 직경으로 원형 조각으로 만든 후 그 후 각각의 특성을 측정한다.
다음과 같은 세팅이 사용된다. 전시험 속도 : 2 mrn/초; 시험 속도 : 2 mm/초; 후시험 속도 : 10 mm/초; 럽쳐시험 거리 : 1%; 거리 : 40%; 힘 : 0.098 N; 시간 : 5.00 초; 카운트 : 5; 셀 로딩 : 5 kg; 트리거형 : Auto - 0.01 N
압착 모드는 AACC 74-09 표준 방법을 모디피케이션하여 사용한다. 시료는 시험시 2번 압착된다. 도 1은 Texture Analyser에 의해 측정된 곡선을 나타내는 예이다.
(실시예 13) 견고성 평가 방법
견고성은 첫 번째 압착 동안 40% 압착시에 측정된다. 도면은 총 두께의 40% 압착시 필요한 힘을 나타내는 것이다. 그 수치가 낮을수록 부드러운 빵이다. 견고성은 예를 들면 hPa와 같은 압력으로 표시된다. 이와 같은 에세이는 "견고성 평가 시험 방법"에 의해 측정된다.
(실시예 14) 복원력 평가 방법
도 1의 곡선 밑의 면적은 시험 동안에 적용되는 일을 측정한 것이다. 첫 번째 압착시 압착 부분(Al)과 탈착부분(A2) 내의 곡선 면적은 도 1을 통해 알 수 있다.
Al과 A2간의 비율은 시료의 복원력으로 정의된다. 이는 복원 유니트로 표시된다. 완벽한 탄성 물질은 첫 번째 부분에 적용하는 힘과 두 번째 부분에 적용하는 힘이 동일할 경우 대칭적인 곡선을 나타낸다. 빵 또는 빵과 같은 물질은 일반적으로 A2가 적고 이는 압착시 구조 변화에 의한 것이다. 따라서 복원력은 항상 1보다 작다. 이와 같은 에세이는 "복원력 평가 시험 방법"에 의해 측정된다.
(실시예 15) 응집력 평가 방법
응집력은 첫 번째 압착시 면적에 대한 두 번째 압착시 면적의 비(A3/A1+A2)로 정의된다. 이는 응집력 단위로 표시한다. 압착시 시료의 붕괴를 측정하는 것이다. 첫 번째 압착 후 시료가 완전히 그 형상을 복원할 수 있다면 그 수치는 1에 가까울 것이다. 빵 또는 빵과 같은 물질의 응집력은 항상 1보다 작다. 이와 같은 에세이는 "응집력 평가 시험 방법"에 의해 측정된다.
(실시예 16) 부스럼짐(crumbliness)의 평가에 관한 프로토콜(부스러짐에 저항)
두 조각의 빵은 한 장의 종이에 놓여진다. 각 조각은 조각에 수직 및 수평적 단편으로 4개의 사각형으로 나누었다.
이러한 찢음은 손으로 크럼을 잡아당김으로써 수행된다. 첫 번째 조각은 빵의 상부 표면의 중앙에서부터 빵의 바닥 표면의 중앙까지 찢어진다. 그에 따라 각각의 원래 조각의 반은 껍질쪽에서부터 조각의 안쪽까지 찢어진다. 상기 작은 크럼 조각은, 즉 4개의 사각형으로 나뉜 조각은 적어도 3번 정도 손으로 위 아래로 이동시킨 후 각 조각을 교반시켜서 제거한다.
분리된 작은 크럼 조각의 무게는 부스럼짐 측정으로서 측정된다. 이 에세이는 "부스러짐 평가 프로토톨"에 관한 것이다.
(실시예 17) 굴곡성 평가에 관한 프로토콜
상기 토스트 빵은 두께가 15 ㎜로 셋팅된 자동 빵 슬라이서를 사용하여 절단된다. 상기 조각은 손으로 조각의 맨 위에서 맨 아래를 향하여 접히며, 접힌 자국의 방향은 옆으로 생긴다.
상기 굴곡성은 하기의 스코어링 시스템(scoring system)을 사용하여 시각적으로 측정된다:
Figure 112009000481646-PCT00015
이 에세이는 "굴곡성 평가에 관한 프로토콜"에 관한 것이다.
(실시예 18) PS4 변이 폴리펩티드의 개선된 열안정성
아밀라아제 pSac-pMS382의 열안정성은 상술한 바와 같이 측정되며, pSac-D34 /pMD3(서열번호: 2) 및 pSac-pMD229(서열번호: 13)과 비교된다.
열불활성화는 1차 반응을 따르기 때문에, 50% 불활성화되는 시점(분)으로 정의되는 반감기는 50 mM 시트르산나트륨, 5 mM 염화칼슘, pH 6.5에서 온도 75, 80 및 85℃(167, 176 및 185℉)에서 1∼40분 동안 배양한 후 Betamyl assay를 사용하여 잔여활성(residual activity)을 기초로 하여 측정되었다.
상기 결과는 도 2에 나타내었다. 이 수치는 잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 아미노산의 치환을 포함한 PS4 변이 폴리펩티드의 열안정성이 이러한 변이가 없는 폴리텝티드와 비교시 개선된다는 것을 나타낸 것이다.
(실시예 19) PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 식료품의 핸들링 특성 개선: 견고성
잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 잔기의 치환을 포함한 pSac-pMS382(서열번호: 21)로 빵을 제조한다. 이 때 pSac-pMS382의 양은 20,000, 40,000 및 60,000 베타아밀 units/kg이다.
상기 빵의 견고성은 실시예 13에 개시된 프로토콜에 따라 베이킹 후 수 차례에 걸쳐 측정된다. 또한 대조군으로서 어떤 효소도 첨가하지 않고 제조한 빵의 견고성이 측정된다.
도 3은 빵의 견고성이 측정된 베이킹 실험의 결과를 나타낸 것이다.
(실시예 20) PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 식료품의 핸들링 특성 개선: 복원력
잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 잔기의 치환을 포함한 pSac-pMS382(서열번호: 21)로 빵을 제조한다. 이 때 pSac-pMS382의 양은 20,000, 40,000 및 60,000 베타아밀 units/kg이다.
상기 빵의 복원력은 실시예 14에 개시된 프로토콜에 따라 베이킹 후 수 차례에 걸쳐 측정된다. 또한 대조군으로서 어떤 효소도 첨가하지 않고 제조한 빵의 복원력이 측정된다.
도 4는 빵의 복원력이 측정된 베이킹 실험의 결과를 나타낸 것이다.
(실시예 21) PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 식료품의 핸들링 특성 개선: 응집력
잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 잔기의 치환을 포함한 pSac-pMS382(서열번호: 21)로 빵을 제조한다. 이 때 pSac-pMS382의 양은 20,000, 40,000 및 60,000 베타아밀 units/kg이다.
상기 빵의 응집력은 실시예 15에 개시된 프로토콜에 따라 베이킹 후 수 차례에 걸쳐 측정된다. 또한 대조군으로서 어떤 효소도 첨가하지 않고 제조한 빵의 응집력이 측정된다.
도 5는 빵의 응집력이 측정된 베이킹 실험의 결과를 나타낸 것이다.
(실시예 22) PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 식료품의 핸들링 특성 개선: 견고성
잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 잔기의 치환을 포함한 pSac-pMS382(서열번호: 21) 60,000 베타아밀 units/kg로 빵을 제조하고, 베이킹 후 수 차례에 걸쳐 실시예 13에 개시된 프로토콜에 따라 빵의 견고성을 측정한다.
또한 각각 잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 잔기로 치환되지 않은 pSac-D34/pMD3(서열번호: 2) 60,000 베타아밀 units/kg 및 pSac-pMD229(서열번호: 13) 60,000 베타아밀 units/kg로 빵을 제조하고 상기 빵의 견고성을 측정한다.
또한 대조군으로서 어떤 효소도 첨가하지 않고 제조한 빵의 견고성을 측정한다.
도 6은 PS4 변이 폴리펩티드로 처리하고, 잔기 307에 치환되거나 치환되지 않은 빵의 견고성을 측정한 베이킹 실험의 결과를 나타낸 것이다.
(실시예 23) PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 식료품의 핸들링 특성 개선: 견고성, 복원력 및 응집력
잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 잔기의 치환을 포함한 pSac-pMS382(서열번호: 21) 60,000 베타아밀 units/kg로 빵을 제조하고, 베이킹 후 수 차례에 걸쳐 실시예 14에 개시된 프로토콜에 따라 빵의 복원력을 측정한다.
또한 각각 잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 잔기로 치환되지 않은 pSac-D34/pMD3(서열번호: 2) 60,000 베타아밀 units/kg 및 pSac-pMD229(서열번호: 13) 60,000 베타아밀 units/kg로 빵을 제조하고 상기 빵의 복원력을 측정한다.
또한 대조군으로서 어떤 효소도 첨가하지 않고 제조한 빵의 복원력을 측정한다.
도 7은 PS4 변이 폴리펩티드로 처리하고, 잔기 307에 치환되거나 치환되지 않은 빵의 복원력을 측정한 베이킹 실험의 결과를 나타낸 것이다.
(실시예 24) PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 식료품의 핸들링 특성 개선: 응집력
잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 잔기의 치환을 포함한 pSac-pMS382(서열번호: 21) 60,000 베타아밀 units/kg로 빵을 제조하고, 베이킹 후 수 차례에 걸쳐 실시예 15에 개시된 프로토콜에 따라 빵의 응집력을 측정한다.
또한 각각 잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 잔기로 치환되지 않은 pSac-D34/pMD3(서열번호: 2) 60,000 베타아밀 units/kg 및 pSac-pMD229(서열번호: 13) 60,000 베타아밀 units/kg로 빵을 제조하고 상기 빵의 응집력을 측정한다.
또한 대조군으로서 어떤 효소도 첨가하지 않고 제조한 빵의 응집력을 측정한다.
도 8은 PS4 변이 폴리펩티드로 처리하고, 잔기 307에 치환되거나 치환되지 않은 빵의 응집력을 측정한 베이킹 실험의 결과를 나타낸 것이다.
(실시예 25) PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 식료품의 핸들링 특성 개선: 굴곡성
pSac-pMS382(서열번호: 21, H307K 치환) 4 ppm으로 처리한 스펀지 및 반죽 토스트 빵을 제조하고, 제조된 빵의 굴곡성을 테스트하고, 상술한 바와 같이 점수로 산출한다.
대조군으로서, 효소를 처리하지 않은 스펀지 및 반죽 토스트 빵을 제조하고, 굴곡성을 테스트하고, 점수로 산출한다.
테스트는 베이킹 후 13일째 되는 날에 3조각에 실시된다.
Figure 112009000481646-PCT00016
상기 표 및 수치에 나타난 바와 같이, 잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 아미노산의 치환을 포함한 PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 스펀지 및 반죽 토스트 빵의 굴곡성이 처리하지 않은 토스트 빵과의 비교시 개선된다.
(실시예 26) PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 식료품의 핸들링 특성 개선: 굴곡성
pSac-pMS382(서열번호: 21, H307K 치환) 4 ppm으로 처리한 스펀지 및 반죽 토스트 빵을 제조하고, 제조된 빵의 굴곡성을 테스트하고, 상술한 바와 같이 점수로 산출한다.
대조군으로서, 효소를 처리하지 않은 스펀지 및 반죽 토스트 빵을 제조하고, 굴곡성을 테스트하고, 점수로 산출한다. 또한 다른 효소로 처리한 스펀지 및 반죽 토스트 빵의 굴곡성이 하기에 나타난 바와 같이 테스트된다.
효소 pSac-D34(또한 pMD3로 알려짐)는 야생형 논-말토제닉 엑소-아밀라아제와 관련된 변이 N33Y, D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L, S334P를 포함하며, 이들의 서열은 서열번호: 2에 나타난 것이다.
효소 pSac-pMD229는 야생형 논-말토제닉 엑소-아밀라아제와 관련된 변이 N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H272Q, G303E, H307L, A309P, S334P를 포함하며, 이들의 서열은 서열번호: 13에 나타난 것이다.
테스트는 베이킹 후 8일째 되는 날에 3조각에 실시된다.
Figure 112009000481646-PCT00017
상기 표 및 수치에 나타난 바와 같이, 잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 아미노산의 치환을 포함한 PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 스펀지 및 반죽 토스트 빵의 굴곡성이 상기 치환이 되지 않은 효소와 비교시 개선된다.
(실시예 27) PS4 변이 폴리펩티드 및 다른 효소의 조합으로 처리한 식료품의 핸들링 특성 개선: 굴곡성
pSac-pMS382(서열번호: 21, 307K 치환) 6 ppm 단독으로 또는 하기에 나타난 다른 효소와의 조합으로 처리한 스펀지 및 반죽 토스트 빵을 제조하고, 제조된 빵의 굴곡성을 테스트하고 상술한 바와 같이 점수로 산출한다.
조합 1: 6 ppm pSac-pMS382 + 50 ppm GRINDAMYL™ POWERBake 900 + 15 ppm GRINDAMYL™ Max-Life U4.
조합 2: 6 ppm pSac-pMS382 + 50 ppm GRINDAMYL™ POWERBake 900
조합 3: 6 ppm pSac-pMS382 + 50 ppm GRINDAMYL™ POWERBake 900 + 150 ppm GRINDAMYL™ POWERBake
GRINDAMYL™ POWERBake 900은 Danisco A/S의 상업적으로 사용 가능한 자일라나제이다. GRINDAMYL™ Max-Life U4는 Danisco A/S의 상업적으로 사용 가능한 박테리아 α-아밀라아제이다. GRINDAMYL™ POWERBake 4050은 Danisco A/S의 상업적으로 사용 가능한 리파아제이다.
대조군으로서 효소를 처리하지 않은 스펀지 및 반죽 토스트 빵을 제조하고, 굴곡성을 테스트하고 점수로 산출한다.
테스트는 베이킹 후 5일째 되는 날에 3조각에 실시된다.
Figure 112009000481646-PCT00018
상기 표에 나타난 바와 같이, 잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 아미노산단독으로 또는 박테리아 α-아밀라아제, 리파아제 및 자일라나제와 같은 다른 효소와 조합의 치환을 포함한 PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 스펀지 및 반죽 토스트 빵의 굴곡성이 개선된다.
(실시예 28) PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 식료품의 핸들링 특성 개선: 부스러짐 테스트
pSac-pMS382(서열번호: 21, 307K 치환) 4 ppm을 처리한 스펀지 및 반죽 토스트 빵을 제조하고, 제조된 빵의 부스러짐을 테스트하고 상술한 바와 같이 점수로 산출한다.
대조군으로서 효소를 처리하지 않은 스펀지 및 반죽 토스트 빵을 제조하고, 굴곡성을 테스트하고 점수로 산출한다.
테스트는 베이킹 후 13일째 되는 날에 실시된다.
Figure 112009000481646-PCT00019
13일 후, 상기 표에 나타난 바와 같이 잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 아미노산의 치환을 포함한 PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 스펀지 및 반죽 토스트 빵의 부스러짐이 감소된다.
(실시예 29) PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 식료품의 핸들링 특성 개선: 부스러짐 테스트
pSac-pMS382(서열번호: 21, 307K 치환) 4 ppm을 처리한 스펀지 및 반죽 토스트 빵을 제조하고, 제조된 빵의 부스러짐을 테스트하고 상술한 바와 같이 점수로 산출한다.
대조군으로서 효소를 처리하지 않은 스펀지 및 반죽 토스트 빵을 제조하고, 굴곡성을 테스트하고 점수로 산출한다.
테스트는 베이킹 후 15일째 되는 날에 실시된다.
Figure 112009000481646-PCT00020
15일 후, 상기 표에 나타난 바와 같이 잔기 307에 중성 또는 양전하를 띠는 아미노산의 치환을 포함한 PS4 변이 폴리펩티드로 처리한 스펀지 및 반죽 토스트 빵의 부스러짐이 감소된다.
(실시예 30) 잔기 307K 치환을 지닌 PS4 변이 폴리펩티드
잔기 307에 리신으로의 치환을 지닌 하기의 폴리펩티드가 제조되며, 이들의 특성이 상술한 바와 같이 테스트된다. 상기 폴리펩티드의 서열은 상술된 치환과 함께 서열번호: 2의 서열을 포함한다.
Figure 112009000481646-PCT00021
Figure 112009000481646-PCT00022
Figure 112009000481646-PCT00023
Figure 112009000481646-PCT00024
(실시예 31) 잔기 307H를 지닌 PS4 변이 폴리펩티드
다른 변이와 함께 잔기 307에 히스티딘을 지닌 하기의 폴리펩티드가 제조되며, 이들의 특성이 상술한 바와 같이 테스트된다. 상기 폴리펩티드의 서열은 상술된 치환과 함께 서열번호: 2의 서열을 포함한다.
Figure 112009000481646-PCT00025
(실시예 32) L307R 및 L307K 변이를 지닌 PS4 변이 폴리펩티드의 생성
잔기 307(L307R, L307K)에 다른 잔기를 지닌 SSM 471 BlO 및 SSM 471 C04은 다중 자리 지정 돌연변이(실시예 3에 기술됨)를 사용하여 하기표의 프라이머와 함께 생성된다:
Figure 112009000481646-PCT00026
: 잔기 307에 사이트 스캔에 대해 사용되는 프라이머
사이트 스캔 라이브러리로부터의 96개의 클론이 서열화되며, 잔기 307에 각각 아미노산 R 및 K를 포함한 2개의 변이체 SSM 471 3565 BlO 및 SSM 471 C04이 식별된다.
SSM471 BlO의 아미노산 서열이 서열번호: 27과 같이 개시되며, 반면에 SSM471 BlO의 핵산 서열은 서열번호: 28과 같이 개시된다.
SSM471 C04의 아미노산 서열이 서열번호: 29와 같이 개시되며, 반면에 SSM471 C04의 핵산 서열은 서열번호: 30과 같이 개시된다.
또한 모 폴리펩티드로부터 유도되거나 변이 L307R 또는 L307K를 지닌 다른 PS4 변이 폴리펩티드는 다중 자리 지정 돌연변이(실시예 3에 기술됨)를 사용하여 하기 표의 프라이머와 함께 생성된다.
잔기 307에 사이트 스캔에 대해 사용되는 프라이머
Figure 112009000481646-PCT00027
: 잔기 307에 사이트 스캔에 대해 사용되는 프라이머
301∼306 또는 308∼313의 잔기에 추가 변이를 지닌 폴리펩티드에 대해, 상기 추가 변이는 다중 자리 지정 돌연변이(실시예 3에 기술된 방법에 따르는)에 의해 생성된다.
상기 사이트 스캔 라이브러리로부터의 96개의 클론이 서열화되며, 이에 따라 각각 잔기 307에 아미노산 R 및 K를 포함하는 변이체가 식별된다.
(실시예 33) 토르티야(tortilla) 실험
토르티야가 하기와 같은 레시피를 통해 제조된다:
Figure 112009000481646-PCT00028
절차
반죽 온도는 30℃이다. aK emper 믹서에 성분을 놓고 전부 건조시키고 1분 동안 천천히 혼합한다. 물 첨가 - 12분 동안 천천히 혼합. 무게: 1350 g. 몰딩: Glimek: 프레스 타임 3,0 - 라운딩 xdkla 3.0. 30℃에서 10분 동안 반죽을 휴지시킴. CFO 40 토르티야 기계를 통해 반죽 볼을 통과 시킴.
셋팅:
프레싱: 반죽 볼을 세게 누름:
접시 맨 위: 205℃; 접시 바닥: 200℃
컨베이어:
맨 위: 230℃; 중간: 225℃; 바닥: 160℃
베이킹 시간: 약 30초
냉각: 12분. 20℃에서 80% RH
포장: CO2로 진공포장
셋팅: 진공: 40; CO2: 41; 온도: 82℃
(실시예 34) 베이킹 8일 후 굴곡성 테스트의 결과
베이킹 8일 후, 굴곡성 테스트가 실시예 17에 따라 수행되었다.
도 9는 400 ppm의 노바밀(TM) 1500 및 50 BMK/kg pSac-pMS382(서열번호: 21)를 지닌 토르티야의 베이킹 8일 후, 굴곡성 테스트의 결과를 나타낸 것이다. 도 10은 400 ppm의 NovamylTM 1500 및 50 BMK/kg pSac-pMS382(서열번호: 21)를 지닌 토르티야의 베이킹 8일 후, 굴곡성 테스트의 결과를 나타낸 것이다.
400 ppm Novamyl™ 1500을 지닌 10개의 토르티야가 접힐 때, 접히는 동안의 모든 갈라짐을 도 9 및 도10에 나타내었다.
50 BMK/kg pSac-pMS382(서열번호: 21)을 지닌 10개의 토르티야가 접힐 때, 접히는 동안 아무런 갈라짐도 발생하지 않은 것을 도 9 및 도 10에 나타내었다.
(실시예 35) SSM 471 BlO(서열번호: 27, 307R) 및 SSM 471 C04(서열번호: 29, 307K)를 지닌 베이킹 실험
실시예 10에 기술된 바와 같은 스펀지 및 반죽 절차에 의해 제조된 미국 토스트는 307R을 지닌 SSM 471 BlO(서열번호: 27) 및 307K를 지닌 SSM 471 C04(서열번호: 29) 변이체를 테스트하기 위해서 40 BMK/kg 양을 사용하였다.
상기 토스트는 실시예 12 및 14에 기술된 바와 같이 견고성 및 복원력에 대해 평가된다.
도 11은 SSM 471 BlO (서열번호: 27) 및 SSM 471 C04 (서열번호: 29)로 제조된 미국 토스트의 견고성 테스트 결과를 나타낸 것이다. 도 12는 SSM 471 BlO(서열번호: 27) 및 SSM 471 C04(서열번호: 29)로 제조된 미국 토스트의 복원력 테스트 결과를 나타낸 것이다.
변이체는 유의미한 견고성의 감소(도 11) 및 유의미한 복원력의 증가(도 12)를 부여하는 것으로 보여지며, 307R 및 307K 변이체는 유의미한 노화방지(antistaling) 효과를 부여하는 것으로 보인다.
(실시예 36) PMS 370(서열번호: 31, 307H) 및 SSM 471 C04(서열번호: 29, 307K)를 지닌 베이킹 실험
PMS 370은 실시예 3에 상술한 바와 같이 다중 자리 지정 돌연변이를 사용하여 생성된다. PMS 370의 서열은 서열번호: 31과 같이 개시된다.
미국 토스트는 실시예 10에 기술된 바와 같이 스펀지 및 반죽 절찰에 의해 제조된다. 상기 토스트는 307H을 지닌 PMS 370 및 307K를 지닌 SSM 471 C04 변이체를 테스트하기 위해서 20, 40 및 60 BMK/kg 양을 사용하였다.
상기 토스트는 실시예 12 및 14에 기술된 바와 같이 복원력에 대해 평가되었다.
도 13은 pMS 370(서열번호: 31) 및 SSM 471 C04(서열번호: 29)로 제조된 미국 토스트의 복원력 테스트 결과를 나타낸 것이다.
변이체는 증가한 투여량 유의미한 복원력의 증가(도 13)를 부여하는 것으로 보여지며, 307H 및 307K 변이체는 투여량의 함수로서 유의미한 개선된 복원력을 부여한다. 그러나 307K 변이체 투여량의 효과는 각각의 307H 변이체 투여량의 효과보다 대체로 더 강력하다.
참고문헌
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Zhou,J.H.5 Baba,T., Takano,T., Kobayashi,S., Arai,Y. (1989). Nucleotide sequence of the maltotetraohydrolase gene from Pseudomonas saccharophila. FEBS Lett. 255, 37- 41.
이 문헌들은 본 발명의 각각의 적용에 참고문헌으로 사용된다. 또한 본 발명의 실시를 위해 제조자 지침서, 카다로그 등은 선행 기술로서 본 발명의 실시를 위해 참고문헌으로 통합될 수 있다. 또한 본 명세서에서 언급된 모든 문헌 및 이 문헌과 관련된 문헌 또는 인용된 문헌 제조자 지침서, 카다로그, 제품 등이 본 발명의 실시를 위해 참고문헌으로 통합될 수 있다.
본 발명의 범위와 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 변형과 모디피케이션이 당업자에 의해 행해질 수 있다. 비록 본 발명의 특정한 실시태양에 관해서만 기술하였지만 청구범위와 같은 발명은 이와 같은 특정한 실시태양으로 한정하는 것은 아닌 것으로 인식된다. 또한 본 발명의 수행을 위한 여러 가지 변형 또는 모드의 변화가 본 발명의 청구 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 분자 생물학의 통상적인 지식을 가진 자에 의해 명백히 행해질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> DANISCO A/S <120> POLYPEPTIDE <130> P026334WO <140> PCT/IB2007/002056 <141> 2007-06-19 <150> US 60/814,851 <151> 2006-06-19 <160> 82 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 530 <212> PRT <213> Pseudomonas saccharophila <400> 1 Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp 1 5 10 15 Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro 20 25 30 Asn Asp Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala 35 40 45 Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser 50 55 60 Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp 65 70 75 80 His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg 85 90 95 Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp 100 105 110 Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Gly Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn 115 120 125 Leu Pro Ala Gly Gln Gly Phe Trp Arg Asn Asp Cys Ala Asp Pro Gly 130 135 140 Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Ile Gly Gly Glu 145 150 155 160 Ser Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg Asp 165 170 175 Glu Leu Ala Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe 180 185 190 Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser 195 200 205 Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Gly Pro 210 215 220 Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln 225 230 235 240 Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe 245 250 255 Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys His 260 265 270 Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr 275 280 285 Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly 290 295 300 Gln His His Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala 305 310 315 320 Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Ser His Met 325 330 335 Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg 340 345 350 Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly 355 360 365 Tyr 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agatatcatg gcggcgatga aatcatcctt 60 cagggctttc attggaacgt cgtcagagaa gcgccgtata actggtataa catcctgaga 120 caacaagcga gcacaattgc cgctgatggc ttttccgcaa tctggatgcc ggttccgtgg 180 agagatttta gcagctggac ggatggagat aaaagcggag gcggcgaagg atatttttgg 240 catgacttta acaaaaacgg ccgctatgga agcgatgctc aactgagaca agcagcagga 300 gcacttggag gagcaggagt caaagtcctg tacgatgtcg tcccgaacca tatgaaccgc 360 ttttatccgg acaaagaaat caatctgccg gcaggccaaa gattttggag aaacgattgc 420 ccggacccgg gaaatggacc gaatgattgc gatgatggcg atagatttct gggcggcgaa 480 gcggatctga atacaggcca tccgcaaatc tatggcatgt ttcgggacga atttacgaat 540 ctgagaagcg gatatggagc gggcggattt cgctttgatt ttgtcagagg ctatgccccg 600 gaaagagttg atagctggat gagcgattca gcggatagca gcttttgcgt cggcgaactt 660 tggaaagaac cgagcgaata tccgccgtgg gattggagaa atacagcgag ctggcagcag 720 atcatcaaag attggagcga tagagcaaaa tgcccggtct ttgactttgc cctgaaagaa 780 cgcatgcaaa atggaagcgt cgccgattgg aaacatggcc tgaacggaaa tccggacccg 840 agatggagag aagtcgccgt cacgtttgtc gataaccatg acacaggata tagcccggga 900 caaaatggag gacaacatca ctggccgctt caagatggcc ttatcagaca ggcgtatgcc 960 tatatcctta catcaccggg aacaccggtt gtttattggc cgcatatgta tgattggggc 1020 tatggcgatt tcatccgcca actgatccag gttagaagaa cagcaggagt cagagcggat 1080 agcgccatta gctttcatag cggctatagc ggacttgtcg ctacagttag cggcagccaa 1140 caaacactgg tcgtcgccct gaatagcgat ctggcaaatc cgggacaagt tgctagcggc 1200 agctttagcg aagcagtcaa tgccagcaat ggccaagtca gagtctggag aagcggaagc 1260 ggagatggag gaggaaatga cggaggataa 1290 <210> 27 <211> 429 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant polypeptide sequence <400> 27 Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp 1 5 10 15 Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro 20 25 30 Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala 35 40 45 Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser 50 55 60 Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp 65 70 75 80 His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln 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gaattcagcc gccgtcattc ccgcc 25 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 40 agatttacgg catgtttcgc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 41 tagccgctat ggaagctgat 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 42 tgaccttcgt cgacaaccac 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 43 gatagctgct ggtgacggtc 20 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 44 ctgccggccg gccagcgctt ctggcg 26 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 45 cgccagaagc gctggccggc cggcag 26 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 46 gacggtgacc gcttcctggg cggcgagtcg 30 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 47 cgactcgccg cccaggaagc ggtcaccgtc 30 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 48 ggcgagctgt ggaaagcccc ttctgaatat ccg 33 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 49 cggatattca gaaggggctt tccacagctc gcc 33 <210> 50 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 50 gaacggcggc cagcacctgt gggcgctgca g 31 <210> 51 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 51 ctgcagcgcc cacaggtgct ggccgccgtt c 31 <210> 52 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 52 gtactggccg cacatgtacg actggggcta cggcgaattc atc 43 <210> 53 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 53 gatgaattcg ccgtagcccc agtcgtacat gtgcggccag tac 43 <210> 54 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 54 gcgaagcgcc ctacaactgg tacaac 26 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 55 ccgacggcgg caggtccggc g 21 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 56 caagaacagc cgctacggca gcgac 25 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 57 cacatgaacc gcgactaccc ggacaag 27 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 58 cgcaacgact gcgccgaccc ggg 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 59 cgcgacgagt ttaccaacct gcg 23 <210> 60 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 60 gtactggccg cacatgtacg actggggcta cggc 34 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 61 ccaatcacat gaaccgcttc tacccggaca aggag 35 <210> 62 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 62 gatccgggca acggccccaa cgactgcg 28 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 63 gggcggcgag gcggacctga aca 23 <210> 64 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 64 ggcgagctgt ggaaagdncc ttctgaatat ccgag 35 <210> 65 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 65 gccttctgaa tatccgccgt gggactggcg caac 34 <210> 66 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 66 ccgactggaa gcagggcctc aatggc 26 <210> 67 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 67 ccgggcagaa cgaaggccag cacctgtg 28 <210> 68 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 68 gcacctgtgg ccgctgcagg acg 23 <210> 69 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 69 ctggacggat ggagataaaa gcggaggcgg c 31 <210> 70 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 70 cgtcgccgat tggaaacatg gcctgaacgg aaatc 35 <210> 71 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 71 ccgggacaaa atggaggaca acatctttgg c 31 <210> 72 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 72 caaaatgaag gacaacataa atggccgctt caagatggcc 40 <210> 73 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 73 ggacccggga aatggaccga atgattgcg 29 <210> 74 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 74 gaaggacaac atcagtggcc gcttcaagat ggcc 34 <210> 75 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 75 gaaggacaac atgtctggcc gcttcaagat ggcc 34 <210> 76 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 76 caaaatgaag gacaacattg gtggccgctt caagatggcc 40 <210> 77 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 77 caaaatgaag gacaacatta ttggccgctt caagatggcc 40 <210> 78 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 78 caaaatgaag gacaacattg ctggccgctt caagatggcc 40 <210> 79 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 79 caaaatgaag gacaacatga atggccgctt caagatggcc 40 <210> 80 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 80 gaaggacaac atttttggcc gcttcaagat gg 32 <210> 81 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 81 gaaggacaac atcattggcc gcttcaagat gg 32 <210> 82 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 82 caaaatgaag gacaacatnn stggccgctt caagatggcc 40

Claims (70)

  1. PS4 변이 폴리펩티드는 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 아미노산 서열의 307번째 잔기가 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로 치환된 아미노산임을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드는 아밀라아제 활성을 지닌 모 폴리펩티드로부터 유래된 PS4 변이 폴리펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 변이 폴리펩티드는 엑소-아밀라아제 활성, 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지니는 모 폴리펩티드로부터 유래된 PS4 변이 폴리펩티드.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 변이 폴리펩티드는 307 잔기의 아미노산 치환은 리신(307K), H307K 또는 아르기닌(307R), H307R임을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  4. 제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 변이 폴리펩티드는 잔기 70에 아미노산 치환을 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이 폴리펩티드는 잔기 70의 아미노산 치환은 아스파르트산(70D), G70D임을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이 폴리펩티드는 PS4 변이 폴리펩티드 서열의 잔기 272의 아미노산은 히스티딘(H)임을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이 폴리펩티드는 PS4 변이 폴리펩티드 서열의 잔기 272의 아미노산은 글리신(G)임을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 잔기 33, 34, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 또는 334로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 변이를 추가적으로 포함함을 특징 으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 309P, 334P, 바람직하게는 N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, A309P 및 S334P로 구성된 군으로부터 선택된 추가 변이를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열에서 33Y, 34N, 7OD, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K, 309P, 334P, 바람직하게는 N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307K, A309P, S334P의 치환을 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 서열번호: 21(pSac-pMS382)로 표시되는 서열을 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열에서 33Y, 34N, 7OD, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307R, 309P, 334P, 바람직하게는 N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307R, A309P, S334P의 치환을 더욱 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 서열번호: 23(pSac-pMS382R)로 표시되는 서열을 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  14. 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열에서 33Y, 34N, 7OD, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A5 178F, 179T, 223E, 229P, 309P, 334P, preferably N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, A309P, S334P 의 치환을 더욱 포함하며, 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지닌 모 폴리펩티드로부터 유래됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 서열번호: 25(pSac-pMS382H)로 표시되는 서열을 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모 폴리펩티드는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제, 글루칸-1,4-α-말토테트라하이드로라제(EC 3.2.1.60)를 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드16.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모 폴리펩티드는 슈도모나스 속에서 슈도모나스 사카로필리아 또는 슈도모나스 스투제리로부터 유래됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모 폴리펩티드는 서열번 호: 1 또는 서열번호: 5로 표시되는 서열을 지닌 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제로부터 유래된 논-말토제닉 엑소-아밀라아제임을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이 폴리펩티드는 서열번호:1 또는 서열번호: 5와 적어도 75%의 상동성을 지닌 아미노산 서열을 지님을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  20. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모 폴리펩티드는 서열번호: 7 또는 서열번호: 11로 표시되는 서열을 지닌 슈도모나스 스투제리로부터 유래된 논-말토제닉 엑소-아밀라아제임을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  21. 제 1항 내지 제 8항 또는 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모 폴리펩티드는 서열번호:7 또는 서열번호: 11과 적어도 75%의 상동성을 지닌 아미노산 서열을 지님을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 본 명세서, 청구항 또는 도면에 개시된 서열을 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이 폴리펩티드는 서열번호: 21(pSac-pMS382), 서열번호: 23(pSac-pMS382R) 및 서열번호: 25(pSac-pMS382H)로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함함을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PS4 변이 폴리펩티드는 상기와 동일한 조건에서 실험시 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드와 비교시 더 높은 열안정성을 지님을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  25. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 반감기(t1/2)는 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드와 관련하여 60℃에서 15% 또는 그 이상, 바람직하게는 50% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 100% 또는 그 이상 증가됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, PS4 변이 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물은 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교시 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 하기에 기술된 특징:(a) 낮은 견고성; (b) 높은 복원력; (c) 높은 응집력; (d) 낮은 부스러짐; 및 (e) 높은 굴곡성 모두를 지님을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 식품 생성물의 복원력, 응집력 또는 굴곡성은 독립적으로 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 관련하여 15% 또는 그 이상, 바람직하게는 50% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 100% 또는 그 이상 증가됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  28. 제 26항 또는 제 27항에 있어서, PS4 변이 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물의 복원력, 응집력 및 굴곡성 각각은 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교시 증가됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  29. 제 26항에 있어서, 식품 생성물의 견고성 또는 부스러짐은 독립적으로 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 관련하여 15% 또는 그 이상, 바람직하게는 50% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 100% 또는 그 이상 감소됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  30. 제 26항 또는 제 29항에 있어서, PS4 변이 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물의 견고성 및 부스러짐 각각은 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물과 비교시 감소됨을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드.
  31. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, PS4 변이 폴리펩티드의 적어도 20개 잔기의 단편을 포함하며 상기 폴리펩티드는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지님을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 PS4 변이 폴리펩티드의 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드와 비교시 더 높은 열안정성 또는 더 높은 엑소-특이성 또는 둘 모두를 지니거나, PS4 변이 폴리펩티드로 처리된 식품 생성물은 모 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드로 처리된 식품생성물과 비교시 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 하기에 기술된 특징:(a) 낮은 견고성; (b) 높은 복원력; (c) 높은 응집력; (d) 낮은 부스러짐; 또는 (e) 높은 굴곡성 모두를 지니며, 상기 PS4 변이 폴리펩티드 서열의 하나 또는 그 이상의 잔기의 변이에 의한 PS4 변이 폴리펩티드로부터 유래됨을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  33. 식품 또는 사료 첨가제로서 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 개시된 PS4 변이 폴리펩티드의 용도.
  34. 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 개시된 폴리펩티드와 함께 녹말을 결합시키는 것을 포함하며 하나 또는 그 이상의 선형 생성물인 녹말로부터 생성하기 위한 폴리펩티드를 허용하는 녹말을 처리하기 위한 단계.
  35. 식품 또는 사료 생성물 제조시 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 개시된 PS4 변이 폴리펩티드의 용도.
  36. 식품 또는 사료 성분으로 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 개시된 폴리 펩티드를 혼합하는 것을 포함하는 식품 또는 사료 생성물을 제조하는 방법.
  37. 상기 식품 생성물은 반죽 또는 반죽 생성물, 바람직하게는 제조된 반죽 생성물을 포함함을 특징으로 하는 제 35항에 따르는 용도 또는 제 36항에 따르는 방법.
  38. 제 35항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식품 생성물은 베이커리 생성물임을 특징으로 하는 용도 또는 방법.
  39. (a) 녹말 배지 제공; (b) 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 개시된 폴리펩티드를 녹말 배지에 첨가; 및 (c) 베이커리 생성물을 제조하기 위해 단계(b) 동안 또는 그 후에 녹말 배지를 가열을 포함하는 베이커리 생성물을 제조하기 위한 방법.
  40. 제 35항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 수득됨을 특징으로 하는 식품 생성물, 사료 생성물, 반죽 생성물 또는 베이커리 생성물.
  41. 개선된 조성물은 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 개시된 폴리펩티드 및 적어도 하나의 추가 반죽 성분 또는 반죽 첨가제를 포함함을 특징으로 하는 반죽에 관한 개선된 조성물.
  42. 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 개시된 밀가루 및 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  43. 반죽 생성물의 스테일링(staling), 바람직하게는 해로운 노화를 지연 또는 감소시키는 반죽 생성물에서 제 1항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 개시된 PS4 변이 폴리펩티드의 용도.
  44. 반죽 생성물의 하나 또는 그 이상의 견고성, 복원력, 응집력, 부스러짐 또는 굴곡성을 개선시킨 반죽 생성물에서 제 1항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 개시된 PS4 변이 폴리펩티드의 용도.
  45. 하기의 하나 또는 그 이상 중 어느 하나와 함께 제 1항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 개시된 PS4 변이 폴리펩티드의 조성물:
    (a) 바실러스 스테아로써모필러스(stearothermophilus) 또는 말토제닉 α-아밀라아제 활성을 지니는 이들의 변이체, 상동체 또는 돌연변이체로부터의 글루칸-1,4-α-말토하이드로라제(EC 3.2.1.133)라고 칭하는 말토제닉 α-아밀라아제;
    (b) 예를 들면 바실러스 속, 아스퍼질러스 속, 써모마이세스 속 또는 트리코데르마 속으로부터의 베이커리 자일라나제(EC 3.2.1.8);
    (c) 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(amyloliqufaciens) 또는 α-아밀라아제 활성을 지니는 이들의 변이체, 상동체 또는 돌연변이체로부터의 α-아밀라아제(EC 3.2.1.1); 및
    (d) 푸사리움 헤테로스포룸로부터의 글리코 리파아제와 같은 리파아제.
  46. 제 1항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 따르는 발명의 적용을 위한 제 45항에 따르는 조성물의 용도.
  47. 제 31항에 따르는 조성물로 처리되어 생성됨을 특징으로 하는 식품 또는 사료 생성물.
  48. 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드를 코드화하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  49. 제 48항에 있어서, 서열번호: 6 또는 서열번호: 12와 적어도 75%의 상동성을 지닌 염기서열을 지님을 특징으로 하는 핵산.
  50. 제 48항 또는 제 49항에 있어서, 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지니는 폴리펩티드를 코드화하는 것이 가능한 핵산의 적어도 60개의 염기 단편을 포함함을 특징으로 하는 핵산.
  51. 핵산 서열은 하기의 치환을 포함하며:
    상기 핵산은 잔기 307에서 리신(R) 또는 아르기닌(K) 잔기를 코드화하기 위해서 하나 또는 그 이상의 잔기에서 치환; 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열에서 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 309P, 334P로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 잔기를 코드화하기 위해서 선택적으로 하나 또는 그 이상의 추가적인 변 이에서의 치환, 모 서열, 논-말토제닉 엑소-아밀라아제를 코드화하는 것이 가능한 모 서열로부터 유래됨을 특징으로 하는 핵산 서열.
  52. 제 48항 내지 제 52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기의 치환을 지닌 논-말토제닉 엑소-아밀라아제를 코드화하는 모 서열로부터 유래됨을 특징으로 하는 PS4 변이 핵산 서열.
  53. 제 48항 내지 제 52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호: 22(pSac-pMS382), 서열번호: 24(pSac-pMS382R) 및 서열번호: 26(pSac-pMS382H)으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 핵산 서열.
  54. 제 48항 내지 제 53항 중 어느 한 항의 PS4 핵산 서열을 포함함을 특징으로 하는 플라스미드.
  55. 제 48항 내지 제 54항 중 어느 한 항의 PS4 핵산 서열을 포함하거나, 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 발현을 가능케 함을 특징으로 하는 발 현 벡터.
  56. 제 54항의 플라스미드 또는 제 55항의 발현 벡터로 형질전환된 것을 포함함을 특징으로 하는 숙주세포.
  57. 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 발현을 가능케 함을 특징으로 하는 세포.
  58. 제 56항 또는 제 57항에 있어서, 박테리아, 균류 또는 효모 세포임을 특징으로 하는 숙주세포 또는 세포.
  59. 제 56항, 제 57항 또는 제 58항의 숙주 세포 또는 세포를 수득하는 단계;
    세포 또는 숙주세포로부터의 폴리펩티드를 발현하는 단계; 및
    선택적으로 폴리펩티드를 정제하는 단계
    를 포함하는 방법을 특징으로 하는 PS4 변이 폴리펩티드의 발현 방법.
  60. 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지니는 모 폴리펩티드로부터 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열에서 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272H, 303G, 309P, 334P에서 선택된 하나 또는 그 이상의 추가 변이와 함께 잔기 70에서 중성 또는 양전하를 띠는 잔기로의 아미노산 치환을 유도함으로써, 폴리펩티드, 바람직하게는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 서열을 변이시키는 방법.
  61. 제 60항에 있어서, 상기 중성 또는 양전하를 띠는 잔기는 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 60항 또는 제 61항에 있어서, 논-말토제닉 엑소-아밀라아제의 서열은 논-말토제닉 엑소-아밀라아제를 코드화하는 핵산의 서열을 변이시킴을 특징으로 하는 방법.
  63. 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열에서 33Y, 34N, 70K/R/H, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272H, 303G, 309P, 334P에서 선택된 모 폴리펩티드로부터 아미노산 치환과 아미노산을 치환시키는 단계를 포함하는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제 활성을 지니는 PS4 폴리펩티드 변이체의 생성 방법.
  64. 제 62항 또는 제 63항에 있어서, 모 폴리펩티드를 코드화하는 핵산의 서열은 아미노산 치환을 유도하여 변이됨을 특징으로 하는 방법.
  65. 서열번호: 1로 표시되는 슈도모나스 사카로필리아 엑소-아밀라아제 서열에서 33Y, 34N, 70K/R/H, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272H, 303G, 309P, 334P에서 선택된 아미노산 잔기를 코드화하는 코돈을 서열로 유도하는 단계를 포함하는 논-말토제닉 엑소-아밀라아제를 코드화하는 핵산의 서열을 변이시키는 방법.
  66. 제 58항 내지 제 65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 폴리펩티드의 열안정성 또는 상기 엑소-특이성 또는 2가지 모두를 증가시키는 방법.
  67. 제 58항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 분리되거나, 정제되거나, 2가지 모두 임을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 58항 내지 제 67항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 수득될 수 있는 폴리펩티드.
  69. 제58항 내지 제68항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 수득된 폴리펩티드.
  70. 본 명세서에 기술되고, 도면로 표시되는 것과 같이 PS4 변이 폴리펩티드, 용도, 단계, 식품 생성물, 사료 생성물, 반죽 생성물, 베이커리 생성물, 개선된 조성물, 조성물, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포.
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