JP2016501512A - 糖化のためにタラロミセス・エメルソニ（ＴＡＬＡＲＯＭＹＣＥＳＥＭＥＲＳＯＮＩＩ）由来のα−アミラーゼを使用する方法 - Google Patents

糖化のためにタラロミセス・エメルソニ（ＴＡＬＡＲＯＭＹＣＥＳＥＭＥＲＳＯＮＩＩ）由来のα−アミラーゼを使用する方法 Download PDF

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Abstract

タラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）由来の真菌α−アミラーゼ（ＴｅＡｍｙ１）、並びにその変異体が提供される。ＴｅＡｍｙ１は、最適ｐＨ ３．５を有し、少なくとも３０〜７５℃の温度範囲で作用可能であり、この酵素は、糖化反応において、グルコアミラーゼと組み合わせて使用できる。これにより、ｐＨ及び温度がα−アミラーゼ又はグルコアミラーゼの使用に最適となるよう再調節されなければならないバッチプロセスとして糖化反応を実施する必要がなくなる。ＴｅＡｍｙ１はまた、デンプン基質の、オリゴ糖組成物への糖化を触媒し、オリゴ糖組成物では、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）由来のα−アミラーゼによって触媒される糖化の産物と比較して、有意にＤＰ２及び（ＤＰ１＋ＤＰ２）が富化される。これにより、例えば、同時糖化発酵プロセスにおける発酵微生物によるオリゴ糖組成物の利用が促進される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１２／０８２６９９号（２０１２年１０月１０日出願）に対する利益を主張し、該特許文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
（配列表）
本明細書には配列番号１〜１４を含む配列表が添付され、その全体が参照により本明細書に援用される。
（発明の分野）
タラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）由来のα−アミラーゼ（ＴｅＡｍｙ１）又はその変異体の使用方法としては、デンプンの糖化（例えば、同時糖化発酵（ＳＳＦ）など）が挙げられる。
デンプンはアミロース（１５〜３０％ ｗ／ｗ）及びアミロペクチン（７０〜８５％ ｗ／ｗ）の混合物からなる。アミロースは、約６０，０００〜約８００，０００の分子量（ＭＷ）を有するα−１，４−結合型グルコース単位の直鎖からなる。アミロペクチンは、２４〜３０グルコース単位毎にα−１，６分岐点を包含する分岐鎖状ポリマーであり、ＭＷは１億にものぼる場合がある。
現在、デンプン由来の糖を濃縮デキストロースシロップ形態で製造する際には、（１）α−アミラーゼによる、固体デンプンのデキストリン（平均重合度約１０〜１２）への液化（又は減粘）、及び（２）アミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ又はＧＡとも呼ばれる）による、得られた液化デンプン（即ち、デンプン加水分解産物）の糖化、を伴う酵素により触媒されるプロセスが用いられる。得られるシロップは高グルコース含量を有する。市販用に製造されるグルコースシロップの多くは、続いて酵素により、イソシロップとして知られるブドウ糖／フルクトース混合物へと異性化される。また、得られたシロップを、酵母菌などの微生物を用いて発酵させ、例えば、エタノール、クエン酸、乳酸、コハク酸、イタコン酸、グルタミン酸ナトリウム、グルコン酸塩、リジン、他の有機酸、他のアミノ酸、及び他のバイオケミカルを含む、商品を生産することができる。発酵及び糖化を同時に実施することで（即ち、ＳＳＦプロセス）、経済性と効率性を向上させることができる。
α−アミラーゼは、分子内のα−１，４−グルコシド結合をランダムに切断することにより、デンプン、グリコーゲン、及び関連する多糖類を加水分解する。特にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）由来のα−アミラーゼは、デンプンの液化及び糖化、織物の糊抜き、紙パルプ工業におけるデンプンの変性、醸造、焼成、食品工業用シロップの生産、発酵プロセス用フィードストックの生産、及び動物用飼料においては消化性の向上などの、多様な異なる目的で使用されてきた。これらの酵素は、食器洗い及び洗濯中にデンプン質の汚れ及び染みを除去するために使用することもできる。
α−アミラーゼは好熱性真菌のタラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）ＣＢＳ ８１４．７０から単離されている。Ｂｕｎｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１１：３７０〜７５。α−アミラーゼをコードするｃＤＮＡはクローン化され、大腸菌（Escherichia coli）で発現されている。Ｂｕｎｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４（１２）：１１０９〜１４。
タラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）由来のα−アミラーゼ（ＴｅＡｍｙ１；配列番号１）及びその変異体は、酸性ｐＨにおいて長期にわたり糖化を触媒する。コード核酸及びポリヌクレオチドを発現する宿主細胞が提供される。ＴｅＡｍｙ１は、酸性の作用範囲を有し、例えば、具体的にはグルコアミラーゼと共に使用されるときの同時糖化発酵（ＳＳＦ）において、高エタノール収率、及び残余デンプンの低減に寄与する。ＴｅＡｍｙ１は、高温かつ低ｐＨにおいて高活性を示す。そのため、ＴｅＡｍｙ１は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ（ＡｎＧＡ）などの、真菌グルコアミラーゼの存在下での糖化プロセスにおいて、効率良く使用することができる。ＴｅＡｍｙ１は、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）α−アミラーゼ（ＡｋＡＡ）により触媒される糖化生成物と比較して、ＤＰ２（即ち、マルトース）に著しく富むオリゴ糖組成物へのデンプン糖化を有利に触媒する。ＴｅＡｍｙ１は、ＡｋＡＡよりも低投入量で使用した場合にも、同程度の濃度のエタノールを生成できる。
ＴｅＡｍｙ１は、植物（例えば、穀草及び穀物）由来の酵素と組み合わせて使用することができる。ＴｅＡｍｙ１はまた、宿主細胞により分泌される、又は宿主細胞にとって内在性の酵素と組み合わせて使用することもできる。例えば、ＴｅＡｍｙ１は、１種類以上のアミラーゼ類、グルコアミラーゼ類、プロテアーゼ類、リパーゼ類、フィターゼ類、エステラーゼ類、酸化還元酵素類、トランスフェラーゼ類、又は他の酵素類が生産宿主によって分泌される、発酵プロセス又はＳＳＦプロセスに添加することができる。ＴｅＡｍｙ１はまた、内在性で非分泌型又は分泌型の生産宿主の酵素と組み合わせて機能させることもできる。他の例においては、ＴｅＡｍｙ１は、発酵又はＳＳＦの間に、他の酵素と共に生産宿主細胞によって分泌されてもよい。ＴｅＡｍｙ１はまた、シロップ剤のためのデンプンの直接加水分解、及び／又はバイオ燃料、有機酸、アミノ酸、及びその他のバイオケミカル（例えば、エタノール、クエン酸、コハク酸、グルタミン酸ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、イタコン酸及びその他のカルボン酸、グルコノデルタラクトン、エリソルビン酸ナトリウム、リシン、オメガ３脂肪酸、ブタノール、イソプレン、１，３−プロパンジオール、及びバイオディーゼル）の生産に有効でもあり、ここで、反応温度は基質の糊化温度を下回る。ＴｅＡｍｙ１は、発酵又はＳＳＦ中に、その他の酵素と共に宿主細胞により分泌され得る。
したがって、デンプンを含む組成物を糖化して、グルコースを含む組成物を生成する方法であって、（ｉ）デンプンを含む組成物を、α−アミラーゼ活性を有し、かつ（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体と接触させる工程と、（ｉｉ）デンプンを含む組成物を糖化して、グルコースを含む組成物を生成する工程と、を含むことができ、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、デンプン組成物のグルコースへの糖化を触媒する、方法が提供される。
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、同一条件下で同量のＤＰ３＋を減少させるために、ＡｋＡＡの投入量の約１７％〜５０％、又は場合により約１７％〜３４％で投入してもよい。
全ＤＰ１〜ＤＰ７の重量％として測定したとき、同一条件下でＡｋＡＡによって生成されたグルコースを含む第２の組成物と比較して、グルコースを含む組成物のＤＰ２又は（ＤＰ１＋ＤＰ２）が富化されていてもよい。ＤＰ２は、約２時間で２〜３倍に富化されてもよい。更に、（ＤＰ１＋ＤＰ２）は、約２時間で約１．９倍に富化されてもよい。
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４６７に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体はまた、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６を含み得る。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなってよい。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体はまた、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６からなってよい。
デンプン組成物は、液化デンプン、糊化デンプン、又は粒状デンプンを含み得る。糖化は、約３０℃〜約７５℃の温度範囲で実施することができる。温度範囲は、更に５５℃〜７４℃であってもよい。糖化は、ｐＨ ２．０〜ｐＨ ７．５のｐＨ範囲で実施することができる。ｐＨ範囲は、更にｐＨ ３．０〜ｐＨ ５．８であってもよい。ｐＨ範囲は、更にｐＨ ３．５〜ｐＨ ４．５であってもよい。
方法は、グルコース組成物を発酵させて最終発酵（ＥＯＦ）産物を生成することを更に含み得る。発酵は同時糖化発酵（ＳＳＦ）反応であり得る。発酵は、ｐＨ ２〜８、かつ２５℃〜７０℃の温度範囲にて、４８〜７０時間実施されてもよい。ＥＯＦ産物は、８％〜１８％（ｖ／ｖ）のエタノールを含んでもよい。ＥＯＦ産物は、代謝産物を含んでもよい。代謝産物は、有機酸、アミノ酸、バイオ燃料、並びに、エタノール、クエン酸、コハク酸、グルタミン酸ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、イタコン酸及びその他のカルボン酸、グルコノデルタラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、リジン、オメガ３脂肪酸、ブタノール、イソプレン、１，３−プロパンジオール、及びバイオディーゼルが挙げられるがこれらに限定されないその他のバイオケミカルであり得る。
また、発酵飲料の生産におけるＴｅＡｍｙ１又はその変異体の使用、並びにマッシュ及び／又は糖化液をＴｅＡｍｙ１又はその変異体と接触させる工程を含むことができる発酵飲料の製造方法が提供される。発酵飲料の製造方法であって、（ａ）マッシュを調製する工程と、（ｂ）マッシュを濾過して、糖化液を得る工程と、（ｃ）糖化液を発酵させて、発酵飲料を得る工程とを含んでよく、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ｉ）工程（ａ）のマッシュ、及び／又は、（ｉｉ）工程（ｂ）の糖化液、及び／又は、（ｉｉｉ）工程（ｃ）の糖化液、に加えられる、方法。本開示の方法により生産される発酵飲料もまた提供される。
発酵飲料又は最終発酵産物は、麦芽のみのビール、「ビール純粋令」下で醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニア・ビール、ライト・ビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボック・ビール、スタウト、モルト・リカー、ノンアルコールビール、及びノンアルコールモルト・リカーなどの選択されたビール；又は果実フレーバーの麦芽飲料、蒸留酒フレーバーの麦芽飲料、及びコーヒーフレーバーの麦芽飲料などの穀草又は麦芽飲料からなる群から選択されてもよい。
方法は、デンプン組成物に、グルコアミラーゼ、トレハラーゼ、イソアミラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、β−アミラーゼ、ＴｅＡｍｙ１ではないα−アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、リアーゼ、若しくは他の加水分解酵素、分岐酵素、又はこれらの組み合わせを加える工程を更に含む。例えばＷＯ ２００９／０９９７８３号を参照されたい。グルコアミラーゼは０．１〜２グルコアミラーゼ単位（ＧＡＵ）／ｇ ｄｓで添加されてもよい。
単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、宿主細胞によって発現され、分泌されてもよい。デンプン組成物を宿主細胞と接触させてもよい。宿主細胞に、更にグルコアミラーゼを発現及び分泌させることもできる。宿主細胞は、更にグルコース組成物の発酵が可能であるものであってもよい。
したがって、デンプンを含む組成物の糖化に使用するための組成物であって、α−アミラーゼ活性を有し、かつ（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含んでもよい、組成物が提供される。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基１〜５９４、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなってよい。
組成物は培養された細胞材料であってよい。組成物は、グルコアミラーゼを更に含み得る。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体はまた、精製されてもよい。
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、宿主細胞によって発現され、分泌されてもよい。宿主細胞は、糸状菌細胞、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、海藻又は藻細胞であってよい。宿主細胞は、アスペルギルス種（Aspergillus sp.）、タラロミセス種（Talaromyces sp.）、又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞であってよい。
したがって、焼成される材料に焼成用組成物を加えること、並びにこの材料を焼成して焼成食品を生産することを含む焼成方法が提供され、焼成用組成物は、α−アミラーゼ活性を有し、かつ（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体を含み、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、材料中に存在するデンプン成分の加水分解を触媒して、デンプン由来のより小さな分子を生成する。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなってよい。焼成用組成物は、穀粉、老化防止アミラーゼ、ホスホリパーゼ、及び／又はリン脂質を更に含み得る。
したがって、食品組成物の生成方法であって、（ｉ）１種類以上の食品原料と、（ｉｉ）α−アミラーゼ活性を有し、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体と、を組み合わせることを含み、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、食品原料中に存在するデンプン成分の加水分解を触媒してグルコースを生成する、方法もまた提供される。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなってよい。方法は、食品組成物を焼成して焼成食品を生産することを更に含み得る。方法は、（ｉ）デンプン培地を提供する工程と、（ｉｉ）デンプン培地にＴｅＡｍｙ１又はその変異体を添加する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｂ）の間、又はその後にデンプン培地に熱を加え、ベーカリー製品を生産する工程とを更に含んでもよい。
全ＤＰ１〜ＤＰ７の重量％として測定したとき、同一条件下でＡｋＡＡによって生成された第２の焼成食品と比較して、食品組成物のＤＰ１、ＤＰ２、又は（ＤＰ１＋ＤＰ２）が富化されていてもよい。食品組成物は、食品製品、焼成用組成物、食品添加物、動物性食品製品、飼料製品、飼料添加物、油、肉、及びラードからなる群から選択され得る。食品組成物は、ドウ又はドウ製品を含んでよく、好ましくは加工されたドウ製品を含み得る。
１種以上の食品原料は、焼成原材料又は添加剤を含み得る。１種以上の食品原料は、穀粉、老化防止アミラーゼ、ホスホリパーゼ、リン脂質、マルトース生成α−アミラーゼ、又はマルトース生成α−アミラーゼ活性を有するその変異体、相同体、若しくは突然変異体、ベーカリー用キシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）、及びリパーゼからなる群から選択されてもよい。１種類以上の食品原料は、（ｉ）バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来のマルトース生成性α−アミラーゼ、（ｉｉ）バチルス（Bacillus）、アスペルギルス（Aspergillus）、サーモミセス（Thermomyces）、又はトリコデルマ（Trichoderma）由来のベーカリー用キシラナーゼ、（ｉｉｉ）フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）由来のグリコリパーゼ、からなる群から更に選択されてもよい。
したがって、食品組成物の生成に使用するための組成物であって、α−アミラーゼ活性を有し、かつ（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体と、１種類以上の食品原料とを含む、組成物もまた提供される。食品組成物の調製における、ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体の使用もまた提供される。食品組成物は、加工されたドウ製品を含む、ドウ又はドウ製品を含み得る。食品組成物はベーカリー組成物であってよい。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体をドウ製品に使用して、ドウ製品の劣化、好ましくは、有害な老化を遅延又は減少させることもできる。
したがって、洗濯物、食器類、又は織物からデンプン質の染みを除去する方法が提供され、方法は、α−アミラーゼ活性を有し、かつ（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を有効量で含む水性組成物の存在下で、洗濯物、食器類、又は織物の表面をインキュベートして、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体に、デンプン質の染みに存在するデンプン成分を加水分解させて、水性組成物中に溶解するデンプン由来のより小さな分子を生成させる工程と、表面をすすぐことによって、デンプン質の染みを表面から取り除く工程と、を含み得る。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなってよい。組成物は、洗濯用洗剤、洗濯用洗剤添加剤、又は手作業での若しくは自動での食器洗浄用洗剤であってもよく、所望により界面活性剤を含有する。
したがって、織物を糊抜きする方法もまた提供され、方法は、糊抜き組成物を、織物を糊抜きに十分な時間にわたって織物に接触させる工程と、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体にデンプン質の染みに存在するデンプン成分を糊抜きさせて、水性組成物中に溶解するデンプン由来のより小さな分子を生成させる工程と、表面をすすぐことによって、デンプン質の染みを表面から取り除く工程と、を含み、糊抜き組成物は、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含み、この単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体はα−アミラーゼ活性を有し、かつ（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなってよい。
したがって、グルコース組成物の生成における、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体の使用も提供される。本開示の方法により生成されるグルコース組成物もまた提供される。液化デンプンの生成における、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体の使用が更に提供される。本開示の方法により調製される液化デンプンも開示される。
更に、織物の糊抜きにおける、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含み得る糊抜き組成物の使用、並びに焼成食品の生産における、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含み得る焼成用組成物の使用が開示される。
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成し、本明細書に開示される多様な方法及び組成物を例示する。図面は次の通りである。
ＴｅＡｍｙ１の触媒コア、推定リンカー領域、並びに 配列番号１（ＴｅＡｍｙ１）； 配列番号４（アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）Ａｆ２９３）； 配列番号５（アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）Ａ１１６３）； 配列番号６（ネオサルトルヤ・フィツエリー（Neosartorya fischeri）ＮＲＲＬ １８１）； 配列番号７（アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）ＮＩＨ２６２４）； 配列番号８（アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii））；及び 配列番号９（アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori））由来のα−アミラーゼの対応する残基を有する推定炭水化物結合ドメインの、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。 図１において、アスタリスクによって指定された残基は、配列番号４〜９における保存残基に対応するＴｅＡｍｙ１残基である。ＴｅＡｍｙ１の触媒コア、推定リンカー、及び推定炭水化物結合ドメインは、各種バーにより示される。 ＴｅＡｍｙ１の触媒コア、推定リンカー領域、並びに 配列番号１（ＴｅＡｍｙ１）； 配列番号４（アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）Ａｆ２９３）； 配列番号５（アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）Ａ１１６３）； 配列番号６（ネオサルトルヤ・フィツエリー（Neosartorya fischeri）ＮＲＲＬ １８１）； 配列番号７（アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）ＮＩＨ２６２４）； 配列番号８（アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii））；及び 配列番号９（アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori））由来のα−アミラーゼの対応する残基を有する推定炭水化物結合ドメインの、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。 図１において、アスタリスクによって指定された残基は、配列番号４〜９における保存残基に対応するＴｅＡｍｙ１残基である。ＴｅＡｍｙ１の触媒コア、推定リンカー、及び推定炭水化物結合ドメインは、各種バーにより示される。 プラスミドマップｐＺＺＨ４２６。このマップは、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクター（米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９７（Ａ１）号）を含み、ＴｅＡｍｙ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。 アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）α−アミラーゼ（ＡｋＡＡ）のα−アミラーゼ活性（相対単位）のｐＨ依存性を示すグラフ。 ＴｅＡｍｙ１のα−アミラーゼ活性（相対単位）のｐＨ依存性を示すグラフ。α−アミラーゼ活性は、２ｐｐｍの酵素に基づくものであり、５０℃で、ジャガイモアミロペクチン基質から還元糖を放出させることによりアッセイした。 ＡｋＡＡのα−アミラーゼ活性（相対単位）の温度依存性を示すグラフ。 ＴｅＡｍｙ１のα−アミラーゼ活性（相対単位）の温度依存性を示すグラフ。α−アミラーゼ活性は、２ｐｐｍの酵素に基づくものであり、ｐＨ ４．０（ＡｋＡＡ）又はｐＨ ４．５（ＴｅＡｍｙ１）でジャガイモアミロペクチン基質から還元糖を放出させることによりアッセイした。 同じ投入量で、記載の期間にわたってｐＨ ４．８でインキュベートした後のＡｋＡＡ及びＴｅＡｍｙ１のＳＳＦ反応の結果を示すグラフ。 同じ投入量で、記載の期間にわたってｐＨ ４．８でインキュベートした後のＡｋＡＡ及びＴｅＡｍｙ１のＳＳＦ反応の結果を示すグラフ。 同じ投入量で、記載の期間にわたってｐＨ ４．８でインキュベートした後のＡｋＡＡ及びＴｅＡｍｙ１のＳＳＦ反応の結果を示すグラフ。 記載の期間にわたってｐＨ ４．８でインキュベートした後のＡｋＡＡ及びＴｅＡｍｙ１のＳＳＦ反応の結果を示すグラフ。ＴｅＡｍｙ１は投入量を減じて投入した（ＡｋＡＡの投入量の約１／２及び約１／６）。 記載の期間にわたってｐＨ ４．８でインキュベートした後のＡｋＡＡ及びＴｅＡｍｙ１のＳＳＦ反応の結果を示すグラフ。ＴｅＡｍｙ１は投入量を減じて投入した（ＡｋＡＡの投入量の約１／２及び約１／６）。 記載の期間にわたってｐＨ ４．８でインキュベートした後のＡｋＡＡ及びＴｅＡｍｙ１のＳＳＦ反応の結果を示すグラフ。ＴｅＡｍｙ１は投入量を減じて投入した（ＡｋＡＡの投入量の約１／２及び約１／６）。
タラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）由来の真菌α−アミラーゼ（ＴｅＡｍｙ１）が提供される。ＴｅＡｍｙ１は、最適ｐＨ ３．５を有し、ｐＨ範囲３〜５．８にわたって、少なくとも７０％の活性を有する。酵素は、ｐＨ ３．５で試験される場合、最適温度７０℃を有し、温度範囲５５〜７４℃にわたって、少なくとも７０％の活性を有する。これらの特性により、酵素は、同一の反応条件下で、グルコアミラーゼと組み合わせて使用することが可能なものとなっている。これにより、ｐＨ及び温度がα−アミラーゼ又はグルコアミラーゼの使用に最適となるよう調節されなければならないバッチプロセスとして糖化反応を実施する必要がなくなる。
ＴｅＡｍｙ１はまた、デンプンを含む組成物のグルコースへの糖化を触媒する。例えば、ＤＰ７、アミロペクチン、又はマルトデキストリン基質を使用し、５０℃、ｐＨ ５．３にて２時間の糖化後、オリゴ糖組成物が生成される。全ＤＰ１〜ＤＰ７の重量％として測定したとき、同一条件下でＡｋＡＡ触媒した糖化生成物と比較して、この組成物のＤＰ２及び（ＤＰ１＋ＤＰ２）は富化されている。例えば、基質に依存して、ＤＰ２は、約２時間で約２〜３倍に富化され、（ＤＰ１＋ＤＰ２）は、約２時間で約１．９倍に富化される。これにより、例えばＳＳＦプロセスにおいて、発酵生物によるオリゴ糖組成物の利用が促進される。この役割において、ＴｅＡｍｙ１は、より少量の酵素添加によりＡｋＡＡと同様のエタノール収率をもたらしつつ、不溶性残留デンプンは減少させ、不溶性残留デンプンが最終製品の品質に及ぼす何らかの悪影響は最小限に抑える。
ＴｅＡｍｙ１及びその変異体アミラーゼの例示的な用途としては、デンプン糖化プロセス（例えば、ＳＳＦなど）における、洗浄用組成物（洗濯物、食器、及び他の表面を洗浄するための洗剤組成物など）の調製、織物加工（例えば、糊抜きなど）がある。
１．用語の定義及び略記
この発明を実施するための形態に従い、以下の略記及び定義を適用する。単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、明らかに他の内容を指し示していない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば「酵素」という場合には、複数のこうした酵素が含まれ、「投入量」という場合には、当業者には周知の１つ以上の投入量及びその等価物などが含まれる。
特に他の内容が定義されない限りは、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はいずれも、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。以下の用語を下記に示す。
１．１．略記及び頭字語
以下の略記／頭字語は、特に内容が指示されない限り、以下の意味を有する。
Figure 2016501512
Figure 2016501512
１．２．用語の定義
用語「アミラーゼ」又は「アミロース分解酵素」は、とりわけデンプンの分解を触媒し得る酵素を指す。α−アミラーゼは、デンプン中のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グルコシド結合を切断する加水分解酵素である。一般的に、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１；α−Ｄ−（１→４）−グルカングルカノヒドロラーゼ）は、デンプン分子内部のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グルコシド結合をランダムに切断して、（１〜４）−α−結合型Ｄ−グルコース単位を３つ以上含有する多糖類を生成するエンド作用型酵素として定義される。対照的に、エキソ作用型アミロース分解酵素、例えば、β−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２；α−Ｄ−（１→４）−グルカンマルトヒドロラーゼ）及びいくつかのマルトース生成α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１３３）のような生成物特異的アミラーゼなどは、基質の非還元末端から多糖分子を切断する。β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２０；α−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３；α−Ｄ−（１→４）−グルカングルコヒドロラーゼ）、及びマルトテトラオシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）及びマルトヘキサオシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．９８）などの生成物特異的アミラーゼは、特定の長さのマルト−オリゴ糖類、又は特定のマルトオリゴ糖類の富化シロップを生成し得る。
本明細書で使用するとき、「酵素単位」は、特定条件のアッセイ下で、時間当たりに生成される生成物量を指す。例えば、「グルコアミラーゼ活性単位」（ＧＡＵ）は、６０℃、ｐＨ ４．２にて、可溶性デンプン基質（４％ ＤＳ）から１時間当たり１ｇのグルコースを生成する酵素量として定義される。「可溶性デンプン単位」（ＳＳＵ）は、ｐＨ ４．５、５０℃にて、可溶性デンプン基質（４％ ＤＳ）から１分間当たり１ｍｇのグルコースを生成する酵素量である。ＤＳは「乾燥固体」を意味する。
本明細書で使用するとき、用語「デンプン」とは、アミロース及びアミロペクチンで構成され、化学式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘを有し、ここでＸが任意の数字であり得る、植物の複合多糖炭水化物で構成される任意の材料を指す。この用語は、穀物、穀草、草、塊茎及び根などの植物性材料を含み、より具体的には、小麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、米、サトウモロコシ、ふすま、キャッサバ、キビ、ジャガイモ、サツマイモ、及びタピオカから得られた材料を含む。用語「デンプン」は、粒状デンプンを含む。用語「粒状デンプン」は、未加工の、即ち加熱調理されていないデンプン、例えば、糊化を受けていないデンプンを指す。
ポリペプチドに関しての用語「野生型」、「親の」、又は「参照」は、１つ以上のアミノ酸位において人工的な置換、挿入、又は欠失を含まない、天然型ポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関し、「野生型」、「親の」、又は「参照」なる用語は、人工的なヌクレオチドの変化を有さない、天然型ポリヌクレオチドを指す。しかしながら、野生型、親の、又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然型ポリヌクレオチドに限定されるわけではなく、野生型、親の、又は参照ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドが包摂されることに留意されたい。
野生型タンパク質の参照には、成熟形態のタンパク質が包含されると解釈される。「成熟」ポリペプチドは、シグナル配列のないＴｅＡｍｙ１ポリペプチド又はこれらの変異体を意味する。例えば、シグナル配列は、ポリペプチドの発現中に切除され得る。成熟ＴｅＡｍｙ１は、配列番号１の、Ｎ末端から数えて１〜６０３番目に当たり、長さにしてアミノ酸６０３残基である。野生型ＴｅＡｍｙ１のシグナル配列は長さにしてアミノ酸１９残基であり、配列番号３に記載の配列を有する。あるいは、成熟ＴｅＡｍｙ１又はこれらの変異体は、異なるタンパク質から取り込まれたシグナル配列を含み得る。成熟タンパク質は、成熟ポリペプチドとシグナル配列ポリペプチドとの融合タンパク質である場合もある。
ＴｅＡｍｙ１の「触媒コア」は、配列番号１の残基１〜４７６にまたがっている。ＴｅＡｍｙ１の推定「リンカー」又は「リンカー領域」（配列番号１１）は、配列番号１の残基４７７〜４９４に及ぶ。ＴｅＡｍｙ１（配列番号１０）推定「炭水化物結合ドメイン」は、配列番号１の残基４９５〜６０３に及ぶ。
ポリペプチドに関して、用語「変異体」は、特定の野生型、親の、又は参照ポリペプチドとは異なっており、天然に生じる又は人工的なアミノ酸置換、挿入、又は欠失を１つ以上含むポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関しての用語「変異体」は、特定の野生型、親の、又は参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列において異なるポリヌクレオチドを指す。野生型、親の、若しくは参照ポリペプチド、又はポリヌクレオチドの同一性（identity）は、文脈から明らかとなるであろう。ＴｅＡｍｙ１の「変異体」及び「α−アミラーゼポリペプチド変異体」は、本明細書では同義である。
親α−アミラーゼの場合、「活性」は本明細書に記載の通りに測定され得るα−アミラーゼ活性を指す。
対象とする細胞、核酸、タンパク質、又はベクターに関し使用する場合、用語「組み換え型」は、対象が天然の状態から改変を受けていることを意味する。それ故、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）形態の中に見られない遺伝子を発現したり、自然界で見られるものと異なるレベル、又は異なる条件下で天然の遺伝子を発現したりする。組み換え核酸は、１つ以上のヌクレオチドが天然の配列とは異なっており、及び／又は異種配列と操作可能に連結されており、例えば、発現ベクターにおいて異種プロモーターと操作可能に連結されている。組み換えタンパク質は、１つ以上のアミノ酸が天然の配列とは異なっていてよく、及び／又は異種配列と融合させることができる。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸を含むベクターは、組み換えベクターである。
用語「回収される」、「単離される」、及び「分離される」は、自然界で見られる通り天然に関連付けられる少なくとも１つの他の物質又は成分からより分けられた、化合物、タンパク質（ポリペプチド）、細胞、核酸、アミノ酸、又は他の特定の物質若しくは成分（例えば、Ｔ．エメルソニ（T. emersonii）の細胞から単離されたＴｅＡｍｙ１など）を指す。「単離された」ＴｅＡｍｙ１又はその変異体としては、分泌されたＴｅＡｍｙ１又は変異体ポリペプチド、及び異種の宿主細胞（即ち、Ｔ．エメルソニ（T. emersonii）でない宿主細胞）において発現されるＴｅＡｍｙ１又は変異体ポリペプチドを含有する培養ブロスなどが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書で使用するとき、用語「精製された」は、物質（例えば、単離されたポリペプチド又はポリヌクレオチド）が、比較的純粋な状態であること、例えば、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、又は更には少なくとも約９９％純粋であることを指す。
酵素に関連して、用語「熱安定性のある」及び「熱安定性」は、高温にさらされた後も活性を保持する酵素の能力を指す。アミラーゼ酵素などの酵素の熱安定性は、定義された条件下で酵素活性の半分が失われる分数、時間数又は日数で与えられる半減期（ｔ１／２）により測定される。半減期は、高温（即ち、負荷）にさらした後に残存α−アミラーゼ活性を測定することによって計算することもできる。
酵素に関連して、「ｐＨ範囲」は、酵素が触媒活性を示すｐＨ値の範囲を指す。
本明細書で使用するとき、酵素に関連し、用語「ｐＨ安定」及び「ｐＨ安定性」は、規定の時間（例えば、１５分間、３０分間、１時間）後に、幅広いｐＨ値にわたって活性を保持する酵素の能力に関する。
本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」に関して同義のものであり、互換的に使用される。このようなアミノ酸配列は活性を示し、これらは「酵素」と呼ばれることもある。アミノ酸残基には一般的な１文字又は３文字表記を使用し、アミノ酸配列は、標準的な、アミノ末端からカルボキシ末端へと向かう配向（即ち、Ｎ→Ｃ）で表される。
用語「核酸」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二重鎖、及びポリペプチドをコードすることが可能な合成分子が包摂される。核酸は１本鎖であっても又は２本鎖であってもよく、化学修飾されていてもよい。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、互換可能に用いられる。遺伝子コードは縮重性であるため、特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンが用いられ得るものであり、本発明の組成物及び方法には、ある特定のアミノ酸配列をコードする複数のヌクレオチド配列が包摂される。特に別内容の指示がない限り、核酸配列は５’から３’末端に向かう方向で示される。
本明細書で使用するとき、「ハイブリッド形成」は、転写ハイブリッド法及びＰＣＲ法の間に生じるものとして、ある１本の核酸鎖が、相補鎖と二本鎖を形成する、即ち、塩基対を生じるプロセスを指す。厳密なハイブリッド形成条件は、次の条件下でのハイブリッド形成により例示される：６５℃及び０．１×ＳＳＣ（ここで、１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ Ｎａ３クエン酸塩、ｐＨ ７．０）。ハイブリッド形成した核酸二本鎖は、ハイブリッド形成させた核酸の半分が相補鎖との塩基対形成から外れる溶解温度（Ｔｍ）により特徴づけられる。二本鎖内でミスマッチしていたヌクレオチドはＴｍが低くなる。α−アミラーゼ変異体をコードする核酸は、配列番号２のヌクレオチドと、その同一の相補鎖との間で形成される二本鎖と比較して、１℃〜３℃以上低下しているＴｍを有し得る。
本明細書で使用するとき、「合成」分子は、生物により生成されるというよりは、生体外での化学的又は酵素学的合成により生成される。
本明細書で使用するとき、ある細胞について使用される用語「形質転換される」、「安定形質転換される」、及び「トランスジェニックの」は、その細胞が、その細胞のゲノムに組み込まれるか、又は複数世代を通して維持されるエピソームとして保有される、天然でない（例えば、異種の）核酸配列を包含することを意味する。
細胞へ核酸配列を挿入するという文脈における用語「導入された」は、当該技術分野において既知の、「トランスフェクション」、「形質転換」、又は「形質導入」を意味する。
「宿主株」又は「宿主細胞」は、発現ベクター、ファージ、ウィルス、あるいは対象とするポリペプチド（例えば、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体）をコードしているポリヌクレオチドなどその他のＤＮＡコンストラクトを導入された生物である。例示的な宿主株としては、所望のポリペプチドの発現、及び／又は糖類の発酵が可能な微生物細胞（例えば、細菌、糸状菌、及び酵母菌など）が挙げられる。用語「宿主細胞」は、細胞から生成されるプロトプラストを含む。
ポリヌクレオチド又はタンパク質についての用語「異種の」は、宿主細胞中では天然には存在しない、ポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。
ポリヌクレオチド又はタンパク質についての用語「内在性の」は、宿主細胞中に天然に存在する、ポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、ポリペプチドが核酸配列に基づいて産生されるプロセスを指す。このプロセスは、転写と翻訳の両方を含む。
「選択マーカー（selective marker又はselectable marker）」とは、宿主において発現可能な遺伝子であって、それによって、その遺伝子を保有する宿主細胞の選択を容易にするものを指す。選択マーカーの例としては、抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）、及び／又は代謝優位性（宿主細胞に対する栄養上の優位性など）を付与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
「ベクター」は、核酸を１つ以上の細胞型に導入するよう設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット及び同様物などが挙げられる。
「発現ベクター」は、所望のポリペプチドをコードする、あるＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトであって、そのコード配列が、好適な宿主において、そのＤＮＡの発現に影響を与えることが可能である好適な制御配列に、操作可能に連結されたＤＮＡコンストラクトを指す。このような制御配列には、転写に作用するプロモーター、転写を制御するための任意選択的なオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボソーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列が包含され得る。
用語「操作可能に連結された」は、特定の複数の構成要素が、意図した態様で機能することを可能にする関係（並置であることが挙げられるが、これに限定されない）にあることを意味する。例えば、コード配列の発現が調節配列の制御下になるよう、調節配列は、操作可能なようにコード配列に連結される。
「シグナル配列」は、タンパク質のＮ末端部分に結合したアミノ酸配列であり、そのタンパク質が細胞外に分泌されるのを促進する。成熟形態の細胞外タンパク質には、分泌プロセス中に切断されるシグナル配列は存在しない。
本明細書で使用するとき、「生物活性のある」は、配列が、酵素活性などの特定の生物活性を有することを指す。
本明細書で使用するとき、「布片」は、染みが付けられた布地などの材料片である。この材料は、例えば、綿、ポリエステル、又は天然繊維と合成繊維との混合物から製造された布地であってよい。布片は、更に、濾紙又はニトロセルロースなどの紙、あるいはセラミック、金属、又はガラスなどの硬質材料片でもあり得る。アミラーゼに関し、染みはデンプン質のものであるものの、血液、乳汁、インク、草類、お茶、ワイン、ホウレンソウ、肉汁、チョコレート、卵、チーズ、クレイ、顔料、油、又はこれら化合物の混合物を含み得る。
本明細書で使用するとき、「小布片」は、一穴パンチ装置により切りだされた、又は特別製造された９６穴パンチ装置により切りだされた布片部分であり、多穴パンチのパターンは標準的な９６ウェルマイクロタイタープレートに合うものであるか、又はこの部分は布片から取り出される。布片は、織物、紙、金属、又はその他の好適な材料であってよい。小布片は、２４、４８、又は９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに配置する前又は後のいずれかに付着させた染みを有し得る。小布片はまた、材料の小片に染みを付着させることによって作製することもできる。例えば、小布片は、染みを付けられた直径１．５９ｃｍ又は０．６４ｃｍ（５／８インチ又は０．２５インチ）の布地の切れ端であってもよい。特別製造されるパンチは、９６枚の布片を９６ウェルプレートの全てのウェルに同時に供給するような方式で設計される。この装置は、同じ９６ウェルプレートに単に複数回装填をすることにより１ウェル当たり２枚以上の布片を供給可能である。多穴パンチ装置は、任意のフォーマットのプレート、限定するものではないが２４ウェル、４８ウェル、及び９６ウェルプレートなどに布片を同時に供給するためのものを着想することができる。別の着想され得る方法では、被汚染試験プラットフォームは、汚れ物質により被覆された、金属、プラスチック、ガラス、セラミック、又は別の好適な材料から作製されたビードであり得る。次に、１つ以上の被覆ビードを、好適な緩衝液及び酵素を含有させた９６、４８、若しくは２４ウェルプレート、又はより大きいフォーマットのウェルに配置する。
本明細書で使用するとき、「ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含む培養された細胞材料」又は類似の表現は、成分としてＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含む細胞可溶化物又は上清（培地を含む）を指す。細胞材料は、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を生成させる目的で培養により増殖させた異種宿主由来のものであってよい。
「配列同一性（％）」とは、デフォルトのパラメータでＣＬＵＳＴＡＬ Ｗのアルゴリズムを使用して整列させたときに、ある変異体が、少なくとも特定の割合で、野生型ＴｅＡｍｙ１と一致するアミノ酸残基を有することを意味する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０を参照されたい。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムのデフォルトパラメータは、次の通りである。
Figure 2016501512
欠失は、参照配列と比較して非同一性である残基として計数される。いずれかの末端に生じた欠失が包含される。例えば、配列番号１の成熟ＴｅＡｍｙ１ポリペプチドのＣ末端に６つのアミノ酸の欠失を有する変異体は、成熟ポリペプチドに対して９９％（５９７／６０３同一残基×１００、整数に四捨五入）の配列同一性（％）を有することになる。このような変異体には、成熟ＴｅＡｍｙ１ポリペプチドに対し「少なくとも９９％配列同一性」を有する変異体により包含される。
「融合」ポリペプチド配列は、２つのポリペプチド配列間のペプチド結合により接続される、即ち、操作可能に連結される。
用語「糸状菌」は、糸状形態の全て真菌類（Eumycotina）亜門を指す。
用語「重合度」（ＤＰ）は、所与の糖中の無水−グルコピラノース単位の数（ｎ）を指す。ＤＰ１の例は、単糖のグルコース及びフルクトースである。ＤＰ２の例は、二糖類のマルトース及びスクロースである。用語「ＤＥ」又は「デキストロース当量」は、シロップ中の総炭水化物画分としての、還元糖、即ち、Ｄ−グルコースの割合として定義される。
本明細書で使用するとき、用語「乾燥固体含量」（ｄｓ）は、乾燥重量（％）で、スラリーの総固体を指す。用語「スラリー」は、不溶性固体を含有する水性混合物を指す。
句「同時糖化発酵（ＳＳＦ）」は、エタノール生成微生物などの微生物と、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体などの少なくとも１種の酵素が同一のプロセス工程中に存在する、バイオケミカルの産生プロセスを指す。ＳＳＦは、同じ反応容器中で、デンプン基質（粒状、液化、又は可溶化）の、糖（グルコースなど）への加水分解と、糖の、アルコール、又はその他のバイオケミカル若しくはバイオマテリアルへの発酵を同時期に包含する。
本明細書で使用するとき、「エタノール生成微生物」は、糖又はオリゴ糖をエタノールへと変換する能力を有する微生物を指す。
用語「発酵飲料」は、微生物発酵、例えば、細菌及び／又は酵母発酵などの発酵プロセスを含む方法により生産される、任意の飲料を指す。
「ビール」はこのような発酵飲料の例であり、及び用語「ビール」は、デンプンを含有する植物材料の発酵／醸造により生成される任意の発酵糖化液を含むことを意味する。多くの場合、ビールは、麦芽若しくは添加剤、又は麦芽及び添加剤の任意の組み合わせのみから生産される。ビールの例には、麦芽のみのビール、「ビール純粋令」下で醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニア・ビール、ライト・ビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボック・ビール、スタウト、モルト・リカー、ノンアルコールビール、ノンアルコールモルト・リカー、及び同様物が包含されるものの、別の穀草及び麦芽飲料、例えば、果実フレーバーの麦芽飲料（例えば、レモン、オレンジ、ライムなどのシトラスフレーバー、若しくはベリーフレーバーの麦芽飲料）、蒸留酒フレーバーの麦芽飲料（例えば、ウォッカ、ラム、又はテキーラフレーバーのモルト・リカー）、又はコーヒーフレーバーの麦芽飲料（カフェインフレーバーのモルト・リカーなど）、及び同様物も包含される。
用語「麦芽」は、麦芽入り大麦又は小麦などの任意の麦芽入り穀物を指す。
用語「添加剤」は、大麦又は小麦麦芽などの麦芽ではない任意のデンプン及び／又は糖含有植物材料を指す。添加剤の例としては、一般的なコーングリッツ、精製コーングリッツ、醸造用粉砕酵母、米、ソルガム、精製コーンデンプン、大麦、大麦デンプン、脱穀された大麦、小麦、小麦デンプン、炒って加熱処理された穀草、穀草フレーク、ライ麦、オーツ麦、ジャガイモ、タピオカ、キャッサバ及びシロップ（コーンシロップ、サトウキビシロップ、反転型糖シロップ、大麦及び／又は小麦シロップ、並びに同様物）が挙げられる。
用語「マッシュ」は、任意のデンプン及び／又は糖含有植物材料、例えば、製粉用穀物（例えば、破砕大麦麦芽、破砕大麦、及び／若しくはその他の添加剤、又はこれらの組み合わせを含む）などの水性スラリーを指し、このスラリーは、水と混合した後に、糖化液及び粕に分離される。
用語「糖化液」は、マッシュ中の製粉用穀物の抽出後に放出される未発酵の液体を指す。
「ヨウ素陽性デンプン」又は「ＩＰＳ」は、（１）液化及び糖化後に加水分解されていないアミロース、又は（２）老化したデンプンポリマーを指す。糖化デンプン又は糖液をヨウ素により試験したとき、高ＤＰｎアミロース又は老化デンプンポリマーはヨウ素と結合し、特徴的な青色をもたらす。したがって、糖蒸留酒は、「ヨウ素陽性糖類」、又は「青色糖類」と呼ばれる。
用語「老化デンプン」又は「デンプンの老化」は、デンプンペースト又はゲルに経時的に自然に生じる変化を指す。
２．タラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）α−アミラーゼ（ＴｅＡｍｙ１）及びその変異体
Ｔ．エメルソニ（T. emersonii）又はその変異体由来の、α−アミラーゼ活性を有する、単離及び／又は精製されたＴｅＡｍｙ１ポリペプチドが提供される。ＴｅＡｍｙ１ポリペプチドは、配列番号１に示されるポリペプチド配列の残基１〜６０３を含む、成熟ＴｅＡｍｙ１ポリペプチドであってもよい。ポリペプチドには、Ｎ末端及び／又はＣ末端にて追加のアミノ酸配列を融合させることもできる。追加のＮ末端配列は、例えば、配列番号３に示される配列を有し得るシグナルペプチドであってよい。いずれかの末端に融合されているその他のアミノ酸配列は、タンパク質の標識又は精製に有用な融合パートナーポリペプチドを含有する。
Ｔ．エメルソニ（T. emersonii）由来のα−アミラーゼには、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するα−アミラーゼを含む。
Figure 2016501512
上記の太字のアミノ酸は、推定Ｃ末端炭水化物結合（ＣＢＭ）ドメイン（配列番号１０）を構成する。推定される、グリコシル化されたリンカー領域（上記ハイライト表示された太字のアミノ酸、配列番号１１）は、推定ＣＢＭドメインへとＮ末端の触媒コアを接続する。ＴｅＡｍｙ１中の推定ＣＢＭドメインは、多数のデンプン分解酵素類（α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼなど）に見られるＣＢＭ２０ドメインと相同である。ＣＢＭ２０は、２つのデンプン結合部位１及び２を備える逆平行β−バレル構造として折りたたまれる。これらの２つの部位は機能的に異なると考えられる：部位１は、初期デンプン認識部位として作用し得るのに対し、部位２は、デンプンの適切な領域を特異的に認識するのに関与し得る。Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒａｎｕｌａｒ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅｔａ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，」Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５（５）：６４７〜６１を参照されたい。デンプン結合部位１及び２によって保存されるＴｅＡｍｙ１の推定ＣＢＭドメイン中の残基を、以下の配列中にそれぞれ数字１及び２によって示す。
Figure 2016501512
変異体ＴｅＡｍｙ１は、配列番号１０の推定ＣＢＭドメイン又は配列番号１１の推定リンカーの、一部のアミノ酸残基を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。あるいは、変異体は、配列番号１０の推定ＣＢＭドメインに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％配列同一性を有するＣＢＭドメインを含んでもよい。変異体は、異種又は遺伝子操作されたＣＢＭ２０ドメインを含んでもよい。
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を、例えば、リンカー配列の適切なグリコシル化を可能にする、例えば、糸状菌細胞などの真核宿主細胞で発現させることもできる。
タラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）から単離されたＴｅＡｍｙ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２として示す。予想されるイントロンをイタリック体かつ小文字で示す。
ＴｅＡｍｙ１のポリペプチド配列は、他の真菌α−アミラーゼと類似している。例えば、ＴｅＡｍｙ１は、次の真菌α−アミラーゼと高い配列同一性を有する：
アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）Ａｆ２９３由来のα−アミラーゼ（配列番号４）に対して７７％配列同一性；
アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）Ａ１１６３（配列番号５）由来の推定α−アミラーゼに対して７７％配列同一性；
ネオサルトルヤ・フィツエリー（Neosartorya fischeri）ＮＲＲＬ １８１（配列番号６）由来の推定α−アミラーゼに対して７７％配列同一性；
アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）ＮＩＨ２６２４（配列番号７）由来のα−アミラーゼに対して７８％配列同一性；
アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）（配列番号８）由来のα−アミラーゼに対して７５％配列同一性；及び
アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）（配列番号９）由来のα−アミラーゼに対して７６％配列同一性。
配列同一性は、配列番号１（即ち、残基１〜６０３）のＴｅＡｍｙ１の成熟形態をクエリー配列として使用するＢＬＡＳＴアラインメントにより決定される。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０を参照されたい。
ＴｅＡｍｙ１ポリペプチドの変異体が提供される。変異体は、配列番号１の残基１〜６０３、又は残基１〜４７６のポリペプチドに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるか、又はこれを含むことができ、変異体は、配列番号４〜９中の１つ以上の対応するアミノ酸の、置換、挿入、又は欠失から選択される、１種以上のアミノ酸修飾を含む。例えば、配列番号１の残基１〜６０３のポリペプチドに対して、少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドからなる変異体は、配列番号１のＴｅＡｍｙ１と比較して、１〜６個のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を有してもよい。比較すると、配列番号１の残基１〜４７６のポリペプチドに対して少なくとも９９％配列同一性を有するポリペプチドからなる変異体は、最大で５つのアミノ酸修飾を有することになる。挿入又は欠失は、例えば、ポリペプチドのいずれかの末端のものであり得る。あるいは、変異体は、配列番号１の残基１〜６０３、又は残基１〜４７６のポリペプチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるポリペプチドを「含み」得る。このような変異体では、追加のアミノ酸残基がポリペプチドのいずれかの末端に融合され得る。例えば、変異体は、配列番号１の残基１〜６０３のポリペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸の置換又は欠失を有するポリペプチドと、高名に（in-fame）、融合した配列番号３のシグナル配列を含んでもよい。変異体は、変異体が所与のアミノ酸配列を「含む」か、又は「これからなる」のいずれかにかかわらず、グリコシル化され得る。
ＴｅＡｍｙ１（配列番号１）と、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）Ａｆ２９３（配列番号４）；アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）Ａ１１６３（配列番号５）；ネオサルトルヤ・フィツエリー（Neosartorya fischeri）ＮＲＲＬ １８１（配列番号６）；アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）ＮＩＨ２６２４（配列番号７）；アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）（配列番号８）；及びアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）（配列番号９）由来のα−アミラーゼとのＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを図１に示す。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０を参照されたい。一般的に、アミノ酸が関連するタンパク質配列のアラインメントに保存される程度は、タンパク質の機能に対するアミノ酸位の相対的な重要性と比例する。即ち、全ての関連する配列において共通のアミノ酸は、機能上重要な役割を果たし、容易には置換できない傾向がある。同様に、配列間で様々である位置は、タンパク質の活性は維持したままその他のアミノ酸により置換できるか、あるいは修正され得る傾向がある。
マルトースが活性部位に結合している酵素複合体を含め、Ａ．ニガー（A. niger）α−アミラーゼの結晶構造は決定されている。例えば、Ｖｕｊｉｃｉｃ−Ｚａｇａｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）「Ｍｏｎｏｃｌｉｎｉｃ ｃｒｙｓｔａｌ ｆｏｒｍ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ α−ａｍｙｌａｓｅ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｍａｌｔｏｓｅ ａｔ １．８Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｆ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６２（８）：７１６〜２１を参照されたい。Ｖｕｊｉｃｉｃ−Ｚａｇａｒ（２００６）に開示されているＡ．ニガー（A. niger）α−アミラーゼはまた、Ａ．オリゼ（A. oryzae）α−アミラーゼ相同体のＴＡＫＡ−アミラーゼとしても既知である。ＴＡＫＡ−アミラーゼのアミノ酸配列（配列番号１２）は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して整列させたとき、ＴｅＡｍｙ１の残基２〜４７８にわたって、ＴｅＡｍｙ１に対して７１％の配列同一性を有する。ＴＡＫＡ−アミラーゼとＴｅＡｍｙ１との間でアミノ酸配列の保存性が相対的に高いことから、ＴｅＡｍｙ１では、多くの二次構造が導入されており、ＴＡＫＡ−アミラーゼと類似する構造／機能関係を保有していることが見込まれる。例えば、ＴｅＡｍｙ１は、ＴＡＫＡ−アミラーゼと類似した高親和性Ｃａ２＋結合部位、及びマルトース結合クレフトを有することが予想される。この予想と矛盾せず、ＴＡＫＡ−アミラーゼ、Ｄ２０６、Ｅ２３０、及びＤ２９７によって触媒される加水分解反応に関与する３つの酸性アミノ酸は、全て野生型ＴｅＡｍｙ１に保存されている。また、結合クレフトの近くに位置する、ＴＡＫＡ−アミラーゼの位置Ｙ１５５、Ｌ１６６、Ｄ２３３、及びＤ２３５もまた、ＴｅＡｍｙ１に保存されている。他の保存されているＴｅＡｍｙ１位置は、ＴＡＫＡ−アミラーゼの、高親和性のＣａ２＋結合部位を構成するＮ１２１、Ｅ１６２、Ｄ１７５、及びＨ２１０に相当する。Ｖｕｊｉｃｉｃ−Ｚａｇａｒ（２００６）を参照されたい。
図１に示されるアラインメント、及び、例えばＴＡＫＡ−アミラーゼ結晶構造から確認される構造の関連性は、α−アミラーゼ活性を有する変異体ＴｅＡｍｙ１ポリペプチドの構築の指針となり得る。変異体ＴｅＡｍｙ１ポリペプチドとしては、配列番号４〜９中の対応するアミノ酸の置換、挿入、又は欠失から選択されるアミノ酸修飾を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。ＴｅＡｍｙ１と、配列番号４〜９のα−アミラーゼとの間における位置の一致は、図１に示されるアラインメントを参照して決定される。例えば、変異体ＴｅＡｍｙ１ポリペプチドは置換Ｅ３４Ｑ／Ｄを有し得るものであり、Ｑ及びＤは、配列番号４〜９における対応するアミノ酸である。変異体ＴｅＡｍｙ１ポリペプチドとしてはまた、１、２、３、又は４つの、ランダムに選択されるアミノ酸修飾を有するものも挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸修飾は、オリゴヌクレオチド指定突然変異導入法などの周知の方法を使用してなすことができる。
ＴｅＡｍｙ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸もまた、提供される。ＴｅＡｍｙ１をコードする核酸はゲノムＤＮＡ、例えば、配列番号２であってよい。当業者には良好に理解される通り、遺伝子コードは縮重し、即ち、場合によっては複数のコドンが同一のアミノ酸をコードし得る。核酸は、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体をコードする全てのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡ配列を含む。
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、「前駆体」、「未熟」、又は「全長」（この場合は、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、シグナル配列を含む）であってもよいし、又は「成熟」（この場合は、シグナル配列を欠く）していてもよい。α−アミラーゼ変異体はまた、得られるポリペプチドがα−アミラーゼ活性を保持する限りは、Ｎ又はＣ末端で切断されていてもよい。
２．１．ＴｅＡｍｙ１変異体の特性
変異体ＴｅＡｍｙ１ポリペプチドは、α−アミラーゼ活性を保持する。それらのポリペプチドは、野生型ＴｅＡｍｙ１ポリペプチドよりも高い又は低い比活性を有し得る。ＴｅＡｍｙ１変異体の更なる特徴としては、例えば、安定性、ｐＨ範囲、酸化安定性、及び熱安定性が挙げられる。例えば、変異体は、ｐＨ ３〜約ｐＨ ７．５、例えば、ｐＨ ３．０〜５．８；ｐＨ ３．５〜５．０；ｐＨ ３．５〜４．５；ｐＨ ３．８〜４．８；ｐＨ ３．５、ｐＨ ３．８、又はｐＨ ４．５にて２４〜６０時間ｐＨ安定であり得る。ＴｅＡｍｙ１変異体は、野生型ＴｅＡｍｙ１の性能特性を保ちつつ野生型ＴｅＡｍｙ１よりも高レベルで発現させることができる。また、ＴｅＡｍｙ１変異体は、親のα−アミラーゼとの比較において、変化した酸化安定性を有する場合がある。例えば、酸化安定性の低下は、デンプン液化用組成物において有利なものであり得る。変異体ＴｅＡｍｙ１は、野生型α−アミラーゼと比較して、変化した熱安定性を有する。このようなＴｅＡｍｙ１変異体は、焼成、又は高温が必要とされるその他のプロセスで使用するのに有利である。発現及び酵素活性レベルは、以下に開示されるものを含む、当業者に既知の標準アッセイ法を使用して評価することができる。
３．ＴｅＡｍｙ１及びその変異体の生成
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、例えば、宿主細胞からＴｅＡｍｙ１又は変異体を分泌させることにより、宿主細胞から単離され得る。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含む培養細胞物質は、宿主細胞からのＴｅＡｍｙ１又は変異体の分泌の後に、得ることができる。ＴｅＡｍｙ１又は変異体は、場合により、使用前に精製される。ＴｅＡｍｙ１遺伝子は、当業者に周知の手法によりクローン化し、発現させることができる。好適な宿主細胞としては、細菌、植物、藻類、海藻、酵母細胞、又は真菌、例えば、糸状菌細胞が挙げられる。特に有用な宿主細胞としては、酵母、タラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）が挙げられる。他の宿主細胞としては、例えば、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）又はＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）などの細菌細胞が挙げられる。
宿主細胞は、同種、又は異種グルコアミラーゼ、即ち、宿主細胞と同一の種のものではないグルコアミラーゼ、又は１種以上のその他の酵素をコードする核酸を更に発現し得る。グルコアミラーゼは、変異体グルコアミラーゼ、例えば、米国特許第８，０５８，０３３号（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．）に開示されるものなどのグルコアミラーゼ変異体などであり得る。加えて、宿主は１種以上のアクセサリー酵素、タンパク質、ペプチドを発現し得る。これらは、液化、糖化、発酵、ＳＳＦなどのプロセスの助けとなり得る。更に、宿主細胞は、各種フィードストック（１種以上）を消化するために使用される酵素、又はバイオケミカル若しくは中間体を生成するために使用される酵素に加えて、バイオケミカルを生成できる。このような宿主細胞は、酵素を加える必要性を低減又は排除するため、発酵又は同時糖化発酵プロセスに有用であり得る。
３．１．ベクター
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸を含むＤＮＡコンストラクトを構築して、宿主細胞で発現させることができる。遺伝子暗号において周知の縮重により、同一のアミノ酸配列をコードする変異体ポリペプチドを常軌の手法により設計及び作製することができる。特定の宿主細胞のためコドンの使用を最適化することもまた、当業界では周知である。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸をベクターに組み込むことができる。以下に記載のものなどの周知の形質転換法を使用し、ベクターを宿主細胞に移入させることができる。
ベクターは、宿主細胞を形質変換させ、細胞内で複製させることのできる任意のベクターであり得る。例えば、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸を含むベクターを形質転換させ、ベクターを増殖及び増幅させる手法により細菌宿主細胞において複製させることができる。コードする核酸が、機能性のＴｅＡｍｙ１又はその変異体として発現され得るよう、ベクターはまた発現宿主に形質転換させることもできる。発現宿主としての役割を果たす宿主細胞としては、例えば、糸状菌を挙げることができる。真菌遺伝子保管管理センター（ＦＧＳＣ）の株カタログには、真菌宿主細胞における発現に好適なベクターが掲載されている。ＦＧＳＣ、株カタログ、ミズーリ大学、ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ（最新改訂版２００７年１月１７日）を参照されたい。代表的なベクターはプラスミドｐＺＺＨ４２６（図２）であり、このプラスミドはｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクター（米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９７（Ａ１）号）を含む。ｐＺＺＨ４２６はまた、真菌宿主細胞において、ｃｂｈ１プロモーターの制御下の、ＴｅＡｍｙ１をコードする核酸を発現させる。ｐＺＺＨ４２６は、通常の技術により、ＴｅＡｍｙ１変異体をコードする核酸を含みかつ発現するよう作製及び改変できる。
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸は、好適なプロモーターに操作可能に連結し得、このプロモーターにより、宿主細胞における転写が可能となる。プロモーターは、選択した宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞にとって同種又は異種のいずれかであるタンパク質をコードしている遺伝子に由来し得る。特に細菌宿主における、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を目的とする代表的なプロモーターは、大腸菌（E. coli）のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトミセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡ又はｃｅｌＡプロモーター、バチルス・リケニフォルミスα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンス（bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーターなどである。真菌宿主における転写の際に有用なプロモーターの例としては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（A. niger）酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（A. niger）グルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、Ａ．オリゼ（A. oryzae）アルカリプロテアーゼ、Ａ．オリゼ（A. oryzae）トリオースリン酸異性化酵素、又はＡ．ニデュランス（A. nidulans）アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものが挙げられる。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体をコードする遺伝子が、大腸菌（E. coli）などの細菌種で発現されるとき、好適なプロモーターは、例えば、Ｔ７プロモーター及びファージλプロモーターを含むバクテリオファージプロモーターから選択され得る。酵母種の発現に好適なプロモーターの例としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧａｌ １及びＧａｌ １０プロモーター及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＡＯＸ１又はＡＯＸ２プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、図２に記載のｐＺＺＨ４２６ベクターはＴｅＡｍｙ１に操作可能に連結されたｃｂｈ１プロモーターを含有する。ｃｂｈ１プロモーターは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）由来の内在性誘導型プロモーターである。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｂｙ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｉ ｇｅｎｅ（ｃｂｈ１）ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，」Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）４０（２）：１５８〜６５を参照されたい。
コード配列はシグナル配列に操作可能に連結され得る。シグナル配列をコードするＤＮＡは、発現されるＴｅＡｍｙ１遺伝子と天然に関連付けられるＤＮＡ配列であってよい。例えば、このＤＮＡは、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸に操作可能に連結された配列番号３のＴｅＡｍｙ１シグナル配列をコードしていてもよい。このＤＮＡは、Ｔ．エメルソニ（T. emersonii）以外の種由来のシグナル配列をコードする。ＤＮＡコンストラクト又はベクターを含むシグナル配列及びプロモーター配列は、真菌宿主細胞に導入することができ、同種に由来するものであってもよい。例えば、シグナル配列は、ｃｂｈ１プロモーターに操作可能に連結されたｃｂｈ１シグナル配列であってよい。
発現ベクターはまた、好適な転写終結配列、及び真核細胞においては、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体をコードしているＤＮＡ配列に操作可能に連結されるポリアデニル化配列も含み得る。転写終結及びポリアデニル化配列は、プロモーターと同種から好適に由来し得る。
ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列を更に含有し得る。このような配列例としては、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製起点が挙げられる。
ベクターはまた、選択マーカー、例えば、Ｂ．スブチリス（B. subtilis）若しくはＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）由来のｄａｌ遺伝子、又は例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、若しくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与する遺伝子などの、単離宿主細胞における欠損を補填する産物の遺伝子を含んでもよい。更に、ベクターは、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｓＣなどのアスペルギルス（Aspergillus）選択マーカー、ヒグロマイシン耐性を生じさせるマーカーを含んでいてもよい。また、当該技術分野で既知であるような、同時形質転換によって、選択を行ってもよい。例えば、国際公開第９１／１７２４３号を参照されたい。
細胞内発現はいくつかの態様で有利である場合があり、例えば、特定の細菌又は真菌を宿主細胞として使用するときに、多量のＴｅＡｍｙ１又はその変異体を生成させ、以降で精製することもできる。また、培養培地へのＴｅＡｍｙ１又はその変異体の細胞外分泌を使用して、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含む培養細胞物質を作製することもできる。
発現ベクターは、典型的には、例えば、選択された宿主生物におけるベクターの自律複製を可能にする要素、及び選択目的の、表現形により検出可能な１つ以上のマーカーなどの、クローニングベクター成分を含む。発現ベクターは、通常、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び場合により、リプレッサー遺伝子又は１つ以上の活性化遺伝子などの制御ヌクレオチド配列を含む。加えて、発現ベクターは、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体に、宿主細胞の細胞小器官（ペルオキシソームなどの）、又は特定の宿主細胞区画を標的とさせ得るアミノ酸配列をコードする配列を含むことができる。このような標的配列としては、既知のペルオキシソーム標的シグナルであるセリン−リジン−ロイシン（ＳＫＬ）が挙げられるがこれに限定されない。制御配列の指示の下での発現のために、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体の核酸配列は、制御配列に、発現に関して適切な態様で、操作可能に連結している。
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体、プロモーター、ターミネーター及び他の要素をコードするＤＮＡコンストラクトをそれぞれリゲートするため、及び複製に必要な情報を包含する好適なベクターにそれらを挿入するために使用される手順は、当業者に広く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９、及び３ｒｄ ｅｄ．，２００１を参照されたい）。
３．２．宿主細胞の形質転換及び培養
ＤＮＡコンストラクト又は発現ベクターのどちらかを含む単離した細胞は、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体の組み換え生成において、宿主細胞として有利に使用される。細胞は、宿主染色体にＤＮＡコンストラクト（１つ以上のコピー）を都合よく組み込むことにより、酵素をコードするＤＮＡコンストラクトで形質転換することができる。ＤＮＡ配列がより安定的に細胞に維持される傾向があることから、この組み込みは一般的に有利なものと考えられる。ＤＮＡコンストラクトの宿主染色体への組み込みは、例えば、同種又は異種組み換え法によるものなどの従来法により実施することができる。あるいは、細胞は、異なる種類の宿主細胞に関連して上記される通りに発現ベクターにより形質転換させることができる。
好適な細菌宿主生物の例としては、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、ゲオバチルス（Geobacillu）（旧称バチルス（Bacillus））ステアロサーモフィルス（stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillusalk alophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillusamylolique faciens）、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、及びバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含むバチルス（Bacillaceae）；ストレプトミセス（Streptomyces）種、例えば、ストレプトミセス・ミュリナス（Streptomyces murinus）；ラクトコッカス種（Lactococcus sp.）を含む乳酸細菌種、例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcuslactis）；ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を含むラクトバチルス種（LactoBacillus sp.）；リューコノストック種（Leuconostoc sp.）；ペディオコッカス種（Pediococcus sp.）；及びストレプトコッカス種（Streptococcus sp.）などのグラム陽性細菌種が挙げられる。あるいは、大腸菌（E. coli）を含む、エンテロバクテリアセエ（Enterobacteriaceae）に属する、又はシュードモナダセエ（Pseudomonadaceae）に属するグラム陰性細菌種の株が宿主生物として選択され得る。
好適な酵母宿主生物は、生物工学的に関連のある酵母種、例えば、限定するものではないが、ピキア種（Pichia sp.）、ハンゼヌラ種（Hansenula sp.）、又はクリベロミセス（Kluyveromyces）、ヤロウイア（arrowinia）などの酵母種、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）種又はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces）種、又は例えば、Ｓ．ポンベ（S.pombe）種などのシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）に属する種から選択され得る。メチロトローフ酵母種であるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株を、宿主生物として用いてもよい。あるいは、宿主生物はハンゼヌラ（Hansenula）種であり得る。糸状菌のなかでも好適な宿主生物としては、アスペルギルス（aspergillus）種、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・チュービゲネシス（Aspergillus tubigensis）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、又はアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）が挙げられる。あるいは、フザリウム（Fusarium）種、例えば、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の株、又はリゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）などのリゾムコール（Rhizomucor）種の株を宿主生物として使用することができる。他の好適な株としては、サーモミセス（Thermomyces）及びムコール（Mucor）種が挙げられる。加えて、トリコデルマ種（Trichoderma sp.）を宿主として使用することができる。アスペルギルス（aspergillus）宿主細胞の形質転換に好適な手順としては、例えば、欧州特許第２３８０２３号に記載のものが挙げられる。真菌宿主細胞によって発現されたＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、グリコシル化することができる（即ち、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、グリコシル部分を含むことになる）。グリコシル化パターンは、野生型ＴｅＡｍｙ１で示されるものと同一であってもよい。
形質転換発現ベクターにより遺伝子の欠損が補填され得る場合、発現宿主から遺伝子を欠失させることが有利である。不活性化された遺伝子を１つ以上有する真菌宿主細胞を得るにあたり既知の方法を使用することができる。遺伝子の不活性化は、完全な若しくは部分的な欠失により、挿入による不活性化により、又は遺伝子が機能性タンパク質の発現を阻害されるように意図される目的のために遺伝子を非機能的にする任意の他の手段により、実行できる。クローニングされているトリコデルマ種（Trichoderma sp.）、又はその他の糸状菌宿主に由来する任意の遺伝子、例えば、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、及びｅｇｌ２遺伝子を欠失させることができる。遺伝子の欠失は、不活性化させることが所望される遺伝子の形態を、当該技術分野において既知の方法によりプラスミドに挿入することで実行できる。
宿主細胞へのＤＮＡコンストラクト又はベクターの導入には、形質転換、電気穿孔法、核微量注入法、形質導入、トランスフェクション、（例えば、リポフェクションを介した、及びＤＥＡＥ−デキストリンを介したトランスフェクション）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿を用いたインキュベーション、ＤＮＡコーティングされた微粒子銃による高速導入、及びプロトプラスト融合といった手法が含まれる。一般的な形質転換法が当該技術分野において既知である。例えば、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）を参照されたい。トリコデルマ（trichoderma）における異種タンパク質の発現が、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号に記載されている。同様に、アスペルギルス（aspergillus）株の形質転換に関しては、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：９９１〜１００１も参照される。遺伝的に安定な形質転換体をベクター系で構築することで、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体をコードする核酸を宿主細胞染色体に安定的に組み込むことができる。その後、形質転換体は、既知の手法により選別され、精製される。
形質転換のためのトリコデルマ種（Trichoderma sp.）の調製は、例えば、糸状菌からのプロトプラスト調製を包含し得る。Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６を参照されたい。菌糸は、発芽させた栄養胞子から得ることができる。細胞壁を消化する酵素により菌糸を処理することで、プロトプラストが得られる。懸濁培地に浸透圧安定剤を存在させることでプロトプラストを保護する。これらの安定剤としては、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム及び同様物が挙げられる。通常、これらの安定剤の濃度は、０．８Ｍ〜１．２Ｍの間で様々であり、例えば、１．２Ｍのソルビトール溶液を、懸濁培地において使用することができる。
宿主トリコデルマ種（Trichoderma sp.）株へのＤＮＡ取り込みはカルシウムイオン濃度に依存する。一般的に、約１０〜５０ｍＭ ＣａＣｌ２が取り込み用溶液に使用される。更に好適な化合物としては、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）；１ｍＭ ＥＤＴＡ）又は１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ ６．０）及びポリエチレングリコールなどの緩衝系が挙げられる。ポリエチレングリコールは細胞膜を融合させ、培地の内容物をトリコデルマ種（Trichoderma sp.）株の細胞質へ送達するものと考えられる。この融合は、宿主の染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数のコピーを高頻度に残すことになる。
通常、トリコデルマ種（Trichoderma sp.）の形質転換では、典型的には密度１０５〜１０７／ｍＬ、特に２×１０６／ｍＬにて浸透性処理を受けたプロトプラスト又は細胞を使用する。適切な溶液（例えば、１．２Ｍのソルビトール及び５０ｍＭのＣａＣｌ２）中の、これらのプロトプラスト又は細胞を、１００μＬの体積にて、所望のＤＮＡと混合させてよい。概して、高濃度のＰＥＧが取り込み用溶液に加えられる。０．１〜１容量の２５％ ＰＥＧ ４０００をプロトプラスト懸濁液に加えることができるものの、約０．２５容量をプロトプラスト懸濁液に加えることが有用である。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム、及び同様物などの添加剤もまた、取り込み用溶液に加えて形質転換を促進させることができる。同様の手順が他の真菌宿主細胞についても利用可能である。例えば、米国特許第６，０２２，７２５号を参照のこと。
３．３．発現
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体の生成方法は、酵素の生成を促す条件下で上述したような宿主細胞を培養する工程と、細胞及び／又は培養培地から酵素を回収する工程とを含んでよい。
細胞の培養に使用される培地は、対象とする宿主細胞を増殖させ、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体の発現を得るのに好適な任意の一般的な培地であり得る。好適な培地及び培地成分は市販元から入手可能であり、あるいは公開されている処方に従って調製することもできる（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関のカタログに記載の通り）。
宿主細胞から分泌される酵素は全ブロス製剤で使用することができる。本方法では、組み換え微生物の馴化全発酵ブロス（spent whole fermentation broth）の調製は、α−アミラーゼの発現が得られる、当該技術分野において既知の任意の培養法を使用し実施され得る。したがって、発酵には、アミラーゼの発現又は単離を可能とする好適な培地中及び条件下で行われる、フラスコ振盪培養法、実験用又は工業用発酵槽での小規模又は大規模発酵（連続発酵、回分発酵、流加発酵、又は固体発酵など）が含まれるものと理解され得る。本明細書において、用語「馴化全発酵ブロス」は、培養培地、細胞外タンパク質（例えば、酵素）、及び細胞バイオマスを含有する、発酵材料の未分画成分として定義される。用語「馴化全発酵ブロス」はまた、当該技術分野において周知の方法を用い可溶化又は透過処理された細胞バイオマスを包含することも理解される。
宿主細胞から分泌される酵素は、遠心分離又は濾過による培地からの細胞の分離、及びいくつかの場合では清澄化したブロスの濃縮を含む、周知の手法により、培養培地から都合よく回収される。更に、プロセスは、硫酸アンモニウムなどの塩による手法により培地のタンパク質性成分を沈降させた後、イオン交換クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を使用することを含み得る。
ベクターにおいて、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらし得るよう、制御配列に操作可能に連結させることができ、即ち、ベクターは発現ベクターである。制御配列は、例えば、制御配列により指示される転写のレベルが転写性モジュレーターに対してより応答的になるよう、更なる転写調節要素を付加することにより、改変することもできる。制御配列は、特に、プロモーターを含み得る。
宿主細胞は、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体の発現を可能にする好適な条件下で培養され得る。酵素の発現は、持続的に産生される常時発現型、あるいは発現を開始するための刺激を必要とする誘導型であり得る。発現誘導型の場合、タンパク質産生は、必要とされたときに、例えば、培養培地に誘導物質、例えば、デキサメタゾン又はＩＰＴＧ又はソホロースを加えることにより開始することができる。ポリペプチドはまた、ＴＮＴ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウサギ網状赤血球系などの生体外無細胞系で、組み換えにより産生させることもできる。
発現宿主はまた、好気的条件下で、宿主に適切な培地において培養することもできる。宿主の要求と所望されるＴｅＡｍｙ１又はその変異体の産生とに応じて、宿主に適切な温度下、例えば、約２５℃〜約７５℃（例えば、３０℃〜４５℃）で生じる産生に関し、振盪、又は撹拌と通気との併用を実施することができる。培養は、約１２〜約１００時間又はそれ以上実施することができる（及び、その間の任意の時間数、例えば２４〜７２時間）。典型的には、培養ブロスは、同様にＴｅＡｍｙ１又はその変異体の産生に関連する宿主に必要とされる培養条件に応じて、ｐＨ約４．０〜約８．０である。
３．４．ＴｅＡｍｙ１活性の確認
宿主細胞におけるＴｅＡｍｙ１又はその変異体の発現を評価するために、アッセイを行うことで、発現タンパク質、対応するｍＲＮＡ、又はα−アミラーゼ活性を測定することができる。例えば、好適なアッセイとしては、適切に標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用するノーザンブロット、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、及びインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。好適なアッセイとしてはまた、例えば、培養培地中のグルコースなどの還元糖を直接測定するアッセイによる、サンプル中ＴｅＡｍｙ１活性の測定が挙げられる。例えば、グルコース濃度は、グルコース試薬キット番号１５−ＵＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）又は、Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒなどの装置を使用して測定することもできる。α−アミラーゼ活性はまた、以下に記載のＰＡＨＢＡＨ又はＡＢＴＳアッセイなどの任意の既知の方法により測定することもできる。
３．５．ＴｅＡｍｙ１及びその変異体の精製方法
発酵、分離、及び濃縮法は当該技術分野において周知であり、濃縮ＴｅＡｍｙ１又はα−アミラーゼ変異体ポリペプチド含有溶液を調製するために従来手法を使用することができる。
アミラーゼ溶液を得る目的で、発酵後に発酵ブロスを得て、残存する発酵原材料を含む、微生物細胞及び各種懸濁固体が従来の分離法により除去される。濾過、遠心分離、精密濾過、回転真空ドラム濾過、限外濾過、遠心後限外濾過、抽出、又はクロマトグラフィーなどが一般的に使用される。
回収率を最適化するためには、ＴｅＡｍｙ１又はα−アミラーゼ変異体ポリペプチド含有溶液の濃縮が望ましい。未濃縮の溶液の使用には、精製酵素沈殿物を回収するためのインキュベート時間を延長させる必要がある。
酵素含有溶液は、従来の濃縮法を使用し、所望の酵素濃度が得られるまで濃縮する。酵素含有溶液の濃縮は、本明細書に記載の任意の手法により実施され得る。例示的な精製法としては、回転真空濾過及び／又は限外濾過が挙げられるがこれらに限定されない。
酵素溶液は、濃縮ＴｅＡｍｙ１又はα−アミラーゼ変異体ポリペプチド含有溶液の酵素活性が所望の濃度になるまで濃縮して濃縮酵素溶液とする。
濃縮は、例えば、金属ハロゲン化物沈殿剤などの沈殿剤を使用して実施してもよい。金属ハロゲン化物沈殿剤としては、アルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭化物、及び２種類以上のこれらの金属ハロゲン化物の配合物が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な金属ハロゲン化物としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、及びこれらの金属ハロゲン化物のうちの２種以上の配合物が挙げられる。金属ハロゲン化物沈殿剤、塩化ナトリウムはまた、保存料として使用できる。
金属ハロゲン化物沈殿剤は、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を沈殿させるのに有効な量で使用される。金属ハロゲン化物の、酵素の沈澱をもたらすのに少なくとも有効な量及び最適な量の選定、並びにインキュベート時間、ｐＨ、温度及び酵素濃度を含む回収率を最大にするための沈澱条件は、当業者には常規の試験後に容易に明らかとなろう。
一般的に、少なくとも約５％ ｗ／ｖ（重量／体積）〜約２５％ ｗ／ｖの金属ハロゲン化物を濃縮酵素溶液に加え、通常、少なくとも８５％ ｗ／ｖを加える。一般的に、約２５％ ｗ／ｖ以下の金属ハロゲン化物を濃縮酵素溶液に加え、通常、約２０％ ｗ／ｖ以下を加える。金属ハロゲン化物沈殿剤の最適濃度は、とりわけ、具体的なＴｅＡｍｙ１又はα−アミラーゼ変異体ポリペプチドの性質、及び濃縮酵素溶液中でのＴｅＡｍｙ１又はα−アミラーゼ変異体ポリペプチドの濃度に依存するであろう。
酵素を沈殿させる別の代替法は、有機化合物を使用するものである。例示的な有機化合物沈殿剤としては、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、４−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物が挙げられる。有機化合物沈殿剤の添加は、金属ハロゲン化物沈殿剤の添加に先立って、それと同時に、又はその後に行ってもよく、両沈殿剤（有機化合物及び金属ハロゲン化物）の添加は、順番に又は同時に行われてもよい。
一般的に、有機沈殿剤は、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩（ナトリウム又はカリウム塩など）、及び４−ヒドロキシ安息香酸の線状又は分岐状アルキルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物からなる群から選択され、ここで、アルキル基は、炭素原子を１〜１２個含有する。有機化合物沈殿剤は、例えば、４−ヒドロキシ安息香酸の線状又は分岐状アルキルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物であってよく、ここで、アルキル基は、炭素原子を１〜１０個含有する。例示的な有機化合物は、４−ヒドロキシ安息香酸の線状アルキルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物であり、ここで、アルキル基は、炭素原子を１〜６個含有する。４−ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のブチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のエチルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物もまた、使用することができる。追加の有機化合物としてはまた、４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（名称メチルパラベン）、４−ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル（名称プロピルパラベン）が挙げられ、両方ともアミラーゼ保存剤であるが、これらに限定されない。更なる記載に関しては、例えば、米国特許第５，２８１，５２６号を参照されたい。
有機化合物沈殿剤の添加は、ｐＨ、温度、ＴｅＡｍｙ１又はα−アミラーゼ変異体ポリペプチド濃度、沈殿剤濃度、及びインキュベーション時間に関する沈殿条件に、高い柔軟性という利点を与える。
有機化合物沈殿剤は、金属ハロゲン化物沈殿剤による酵素の沈殿を改善させるのに有効な量で使用できる。有機化合物沈殿剤の少なくとも有効な量及び最適な量の選定、並びにインキュベート時間、ｐＨ、温度及び酵素濃度を含む回収率を最大にするための沈澱条件は、当業者には、常規の試験後に本開示の見地から容易に明らかとなろう。
一般的に、少なくとも約０．０１％ ｗ／ｖの有機化合物沈殿剤を濃縮酵素溶液に加え、通常、少なくとも約０．０２％ ｗ／ｖを加える。一般的に、約０．３％ ｗ／ｖ以下の有機化合物沈殿剤を濃縮酵素溶液に加え、通常、約０．２％ ｗ／ｖ以下を加える。
金属ハロゲン化物沈殿剤及び有機化合物沈殿剤を含有する濃縮ポリペプチド溶液は、精製する酵素に応じて、必要とされるｐＨに調整することができる。一般的に、ｐＨは、アミラーゼの等電点付近のレベルに調整される。ｐＨは、等電点（ｐＩ）からｐＨ単位が約２．５低いｐＨから、等電点（ｐＩ）からｐＨ単位が約２．５高いｐＨまでの範囲のｐＨに調整することができる。
精製酵素の沈殿を得るのに必要とされるインキュベート時間は、具体的な酵素の性質、酵素濃度、及び具体的な沈殿剤、及びその（それらの）濃度に応じて異なる。一般的に、酵素を沈殿させるのに有効な時間は、約１〜約３０時間であり、通常、約２５時間を超過することはない。有機化合物沈殿剤の存在下では、インキュベート時間は、約１０時間未満に短縮させることができ、多くの場合は約６時間に短縮させることができる。
一般的に、インキュベート中の温度は約４℃〜約５０℃である。通常、方法は、約１０℃〜約４５℃の温度（例えば、約２０℃〜約４０℃）で実施される。沈殿を生じさせるのに最適な温度は、溶液条件、及び使用する酵素又は沈殿剤（１つ又は複数）に従い変化する。
精製酵素沈殿物の最終的な回収率、及び実施するプロセスの効率は、酵素を含む溶液を撹拌すること、加える金属ハロゲン化物、及び加える有機化合物により向上される。撹拌工程は、金属ハロゲン化物及び有機化合物を加える間、及び続くインキュベート時間の間の両方に行う。好適な撹拌方法としては、機械的撹拌又は振盪、積極的な通気、又は任意の類似の手法が挙げられる。
インキュベート期間後、精製酵素は、次に、解離した（dissociated）顔料及びその他の不純物から分離し、従来の分離法、例えば濾過、遠心分離、精密濾過、回転真空濾過、限外濾過、加圧濾過、クロス式膜精密濾過、クロスフロー式膜精密濾過、又は同様の方法などにより回収される。精製酵素沈殿物の更なる精製は、沈殿物を水で洗浄することにより得ることができる。例えば、精製した酵素沈殿物は、金属ハロゲン化物沈殿剤を含有する水、又は金属ハロゲン化物及び有機化合物沈殿剤を含有する水を用いて洗浄できる。
発酵中、ＴｅＡｍｙ１又はα−アミラーゼ変異体ポリペプチドは培地ブロス中に蓄積される。所望のＴｅＡｍｙ１又はα−アミラーゼ変異体の単離及び精製の際、培養ブロスを遠心分離又は濾過して細胞を除去し、得られる無細胞液を酵素精製に使用する。一実施形態では、無細胞ブロスに、約７０％飽和硫酸アンモニウムを使用した塩析を行い、次に、７０％飽和沈殿画分を緩衝液に溶解させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラムなどのカラムにかけ、及び溶出した酵素活性化画分を回収する。更なる精製の際、イオン交換クロマトグラフィーなどの従来手法を使用することもできる。
精製酵素は、洗濯及び洗浄用途に有用である。例えば、それらは洗濯用洗剤及び染み抜き剤に使用することができる。精製酵素は、液体（溶液、スラリー）又は固体（顆粒剤、粉末）のいずれかの最終生成物として作製することができる。
より具体的な精製例は、Ｓｕｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）「Ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ：ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．１９５ α−ａｍｙｌａｓｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｒａｗ ｓｔａｒｃｈ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ，」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５０：４７７〜４８４に記載されており、本明細書に簡単に要約される。４リットルのストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）ＴＫ２４培養液の上清から得られた酵素を、飽和度８０％の（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いて処理した。１０，０００×ｇ（２０分かつ４℃）での遠心分離によって沈殿物を回収し、５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）に再溶解させた。溶解させた沈殿物を次に同じ緩衝液に対して透析した。透析したサンプルを、次に予め２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、（ｐＨ ７．０）、５ｍＭ ＣａＣｌ２により平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００カラムに装填し、同じ緩衝液により線流速７ｍＬ／ｈｒで溶出した。カラムからの画分を回収し、酵素アッセイ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥをもとに判定されるものとして活性について評価した。タンパク質は更に次の通りに精製した。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５５カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ；カタログ番号１９８１２）を、５ｍＭ ＣａＣｌ２及び１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）により平衡化した。酵素を、５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）中の（ＮＨ４）２ＳＯ４につき、１．５から０Ｍへの直線グラジエントで、溶出させた。活性画分を回収し、酵素を、飽和度８０％の（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いて沈殿させた。沈殿物を上記の通りに回収し、再溶解し、透析した。透析したサンプルを、次に５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）により予め平衡化したＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ；カタログ番号１７−５１６７−０１）に流速６０ｍＬ／ｈｏｕｒで利用した。活性画分を回収し、１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液に加えた。活性酵素画分を、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５５カラムにおいて前述同様に再度クロマトグラフィー処理を行ない、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判断される通り均質な酵素を得た。方法及びそれらの変法に関する一般的な考察についてはＳｕｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５０：４７７〜４８４を参照されたい。
生産規模での回収のため、ＴｅＡｍｙ１又はα−アミラーゼ変異体ポリペプチドは、ポリマー類を用いた凝集を介して細胞を取り除くことにより、上で概説したように、部分的に精製することもできる。あるいは、酵素は、精密濾過による精製後に、入手可能な膜及び装置を使用して限外濾過により濃縮することができる。しかしながら、ある種の用途に関しては、酵素を精製する必要はなく、全ブロス培養物を溶解し、更なる処理を行わずに使用することができる。次に、酵素は例えば顆粒へと加工することができる。
４．ＴｅＡｍｙ１及びその変異体の組成物及び使用
ＴｅＡｍｙ１及びその変異体は、多様な工業用途に関し有用である。例えば、ＴｅＡｍｙ１及びその変異体は、デンプン変換プロセスにおいて有用であり、特に、液化を受けたデンプンの糖化プロセスにおいて有用である。所望の最終製品は、酵素によるデンプン基質の変換により生成され得る任意の生成物であってよい。例えば、所望の製品は、ＨＦＣＳの調製などの他のプロセスで使用できる、又はアスコルビン酸中間体類（例えば、グルコン酸；２−ケト−Ｌ−グロン酸；５−ケト−グルコン酸；及び２，５−ジケトグルコン酸など）；１，３−プロパンジオール；芳香族アミノ酸類（例えば、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファンなど）；有機酸類（例えば、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、イソクエン酸、及びオキサロ酢酸など）；アミノ酸類（例えば、セリン及びグリシンなど）；抗生物質類；抗菌剤類；酵素類；ビタミン類；ホルモン類などの、多数の他の有用な製品へと変換できる、グルコース及びマルトースに富むシロップであってよい。
デンプンの変換プロセスは、燃料用アルコール、又は飲むためのアルコール（即ち、飲用アルコール）を生産するように設計された発酵プロセスに先立って、又はそれと同時に行われるプロセスであってもよい。当業者は、これらの最終製品の生産に使用することのできる多様な発酵条件に見当がつくであろう。ＴｅＡｍｙ１及びその変異体もまた食品の調製に関係する組成物及び方法に有用である。ＴｅＡｍｙ１及びその変異体のこれらの多様な用途は、以下により詳細に記載される。
４．１．デンプン基質の調製
一般的な当業者は、本開示のプロセスで使用するためのデンプン基質の調製に使用し得る、利用可能な方法をよく理解している。例えば、有用なデンプン基質は、特に塊茎類、根類、茎類、豆類、穀草類又は未精製の穀物から得ることができる。より具体的には、粒状デンプンは、トウモロコシ、トウモロコシ穂軸、小麦、大麦、ライ麦、ライ小麦、ミロ、サゴ、キビ、キャッサバ、タピオカ、ソルガム、米、さや豆、豆、バナナ、又はジャガイモから得ることができる。トウモロコシは約６０〜６８％のデンプンを含有し、大麦は約５５〜６５％のデンプンを含有し、キビは約７５〜８０％のデンプンを含有し、小麦は約６０〜６５％のデンプンを含有し、精白米は７０〜７２％のデンプンを含有する。具体的に想定されているデンプン基質は、トウモロコシデンプン、及び小麦デンプンである。穀類由来のデンプンは摩砕されていても、未精製でもよく、穀粒、糠、及び／又は穂軸といったトウモロコシ固形分を含む。デンプンは、高精製した生デンプン、又はデンプン精製プロセスで得られるフィードストックであってよい。また、様々なデンプンが市販されている。例えば、トウモロコシデンプンは、Ｃｅｒｅｓｔａｒ、Ｓｉｇｍａ、及びＫａｔａｙａｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．（Ｊａｐａｎ）から、小麦デンプンはＳｉｇｍａから、サツマイモデンプンはＷａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．（Ｊａｐａｎ）から、そしてジャガイモデンプンはＮａｋａａｒｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｊａｐａｎ）から入手可能である。
デンプン基質は、粉砕した未精製穀物から得た粗デンプンであってよく、この粗デンプンは、非デンプン画分（例えば、胚芽の残分及び繊維など）を含有している。粉砕には、湿式若しくは乾式粉砕、又は磨砕のいずれかが含まれ得る。湿式粉砕法では、未精製の穀物を水又は希酸に浸して、穀物をその構成部分（例えば、デンプン、タンパク質、胚芽、油、穀粒繊維）に分離する。湿式粉砕法は胚芽とミール（即ち、デンプン顆粒とタンパク質）を効率的に分離し、シロップの生成に特に好適である。乾式粉砕法又は磨砕法では、未精製の穀粒を挽いて細かい粉末にし、多くの場合、穀物をその構成部分に分画せずに加工する。いくつかの場合では、穀粒由来の油が回収される。そのため、乾式粉砕された穀物は、デンプンに加えて、大量の非デンプン炭水化物化合物を含む。デンプン基質の乾式粉砕を使用して、エタノール及びその他のバイオケミカルを生成することができる。加工するデンプンは、高精製のデンプン品質のものであってよく、例えば、純度が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９．５％であってもよい。
４．２．デンプンの糊化及び液化
本明細書で用いる用語「液化」又は「液化する」は、デンプンを、より粘性が低く、かつ短鎖のデキストリンに転換するプロセスを意味する。一般的に、このプロセスは、α−アミラーゼを加えるのと同時の、又はそれに先立つデンプンの糊化を包含するものの、場合により追加の液化誘導酵素を加えてもよい。幾つかの実施形態では、上述したように調製したデンプン基質を、水と共にスラリー化する。デンプンスラリーは、乾燥固形分重量％として、約１０〜５５％、約２０〜４５％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、又は約３０〜３５％のデンプンを含有し得る。α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）は、例えば定量ポンプによりスラリーに加えることもできる。この用途で典型的に使用されるα−アミラーゼは、熱的に安定な細菌α−アミラーゼであり、例えば、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）α−アミラーゼである。α−アミラーゼは、通常、例えば、デンプン乾燥物質１ｋｇ当たり約１５００単位で供給される。α−アミラーゼの安定性及び活性を最適化するため、スラリーのｐＨは、典型的には約ｐＨ ５．５〜６．５に調整し、及び典型的には、約１ｍＭカルシウム（約４０ｐｐｍ遊離カルシウムイオン）を加える。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）変異体、又はその他のα−アミラーゼには、異なる条件が必要となり得る。液化後にスラリー中に残存する細菌α−アミラーゼは、続く反応工程においてｐＨを低下させることを含む多くの方法を介して、又は酵素がカルシウムに依存する場合に、スラリーからカルシウムを除去することにより、失活させてもよい。
α−アミラーゼが加えられたデンプンスラリーを、蒸気で１０５〜１１０℃に加熱されたジェット式調理器（jet cooker）を連続的に通過させて、汲み上げてもよい。これらの条件下では、糊化が急速に生じ、また酵素活性が有意なせん断力と組み合わされて、デンプン基質の加水分解が始まる。ジェット式調理器内での滞留時間は短時間である。部分的に糊化したデンプンを、１０５〜１１０℃に維持された一連の保持管に注入した後、約５〜８分間保持して、糊化プロセスを完了することができる（「一次液化」）。８５〜９５℃又はそれ以上の温度の保持槽において約１〜２時間かけて、必要とされるＤＥへの加水分解を完了する（「二次液化」）。逆混合を防ぐために、これらの槽にはバッフルを備えてもよい。本明細書で使用するとき、用語「二次液化時間（分）」は、二次液化の開始からデキストロース当量（ＤＥ）が測定された時までに経過した時間を指す。次に、スラリーは室温に冷却させる。この冷却工程は、３０分〜１８０分であってよく、例えば９０分〜１２０分である。
上記のプロセスから得られる液化デンプンは、典型的には、約９７〜９８％オリゴ糖類及び約２％マルトース及び０．３％ Ｄ−グルコースを含有する。液化デンプンは、典型的には、乾燥固体含量（ｗ／ｗ）を約１０〜５０％、約１０〜４５％、約１５〜４０％、約２０〜４０％、約２５〜４０％、又は約２５〜３５％有するスラリーの形態である。
ＴｅＡｍｙ１及びその変異体は、液化プロセスにおいて、細菌性α−アミラーゼの代わりに使用することができる。ＴｅＡｍｙ１及びその変異体による液化は、有利なことに、ｐＨを約ｐＨ ５．５〜６．５に調整する必要なく、低ｐＨで実施することができる。ＴｅＡｍｙ１及びその変異体は、ｐＨ範囲２〜７にて（例えば、ｐＨ ３．０〜７．５、ｐＨ ４．０〜６．０、又はｐＨ ４．５〜５．８にて）、液化に使用することができる。ＴｅＡｍｙ１及びその変異体は、約８５℃〜９５℃の温度範囲（例えば、８５℃、９０℃、又は９５℃など）にて液化活性を維持することができる。例えば、液化は、ｐＨ ５．８、８５℃にて、又はｐＨ ４．５、９５℃にて、１０分間、２５％ ＤＳのトウモロコシデンプンの溶液に、８００μｇのＴｅＡｍｙ１又はその変異体を用いて行うことができる。液化活性は、当該技術分野において既知の任意の多数の粘度アッセイを使用してアッセイすることができる。
４．３．糖化
液化デンプンは、（場合により、他の１種類又は複数種類の酵素の存在下で）ＴｅＡｍｙ１及びその変異体を使用することにより、より低ＤＰ（例えば、ＤＰ１＋ＤＰ２）の糖類に富むシロップへと糖化することができる。糖化生成物の正確な組成は、使用される酵素の組み合わせ、並びに加工される粒状デンプンの種類に依存する。有利に、提供されるＴｅＡｍｙ１及びその変異体を使用して得られるシロップは、糖化デンプンにおける総オリゴ糖類のうち３０重量％超、例えば、４５重量％〜６５重量％又は５５重量％〜６５重量％の重量割合でＤＰ２を含み得る。糖化デンプン中の（ＤＰ１＋ＤＰ２）の重量％は、約７０％超、例えば、７５％〜８５％又は８０％〜８５％であり得る。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体はまた、シロップ生成物中において、グルコースを比較的高い収率（例えば、ＤＰ１＞２０％）で生成する。
液化は、一般的に、連続的なプロセスとして実施されるのに対し、糖化は、多くの場合バッチプロセスとして実施される。糖化は、典型的には、約６０〜６５℃の温度及び約４．０〜４．５のｐＨ、例えば、ｐＨ ４．３で最も効果的であり、液化デンプンの冷却及びｐＨ調整が必要とされる。糖化は、例えば、約４０℃、約５０℃、又は約５５℃〜約６０℃又は約６５℃の温度にて、行われてよい。糖化は、通常、充填又は排出するのに数時間を必要とし得る撹拌槽で実施する。酵素は、典型的には、槽が充填されるに伴い乾燥固形分に対し一定比で加えられるか、又は充填段階の開始時に単回添加物として加えられる。シロップを作製するための糖化反応は、典型的には、約２４〜７３時間、例えば、２４〜４８時間実施する。最大又は所望のＤＥが得られたとき、例えば８５℃で５分間加熱して反応を停止させる。更にインキュベートすることで、酵素による逆転反応により及び／又は熱力学的な平衡作用により堆積したグルコースは、イソマルトース及び／又はその他の元の生成物へと再重合され、低ＤＥとなり、最終的には約９０ＤＥが得られる。ＴｅＡｍｙ１ポリペプチド又はその変異体を使用するとき、糖化は、約３０℃〜約７５℃、例えば、４５℃〜７５℃、又は４７℃〜７４℃の温度範囲で最適に実施される。糖化は、約ｐＨ ３〜約ｐＨ ７例えば、ｐＨ ３．０〜ｐＨ ７．５、ｐＨ ３．０〜ｐＨ ５．８、ｐＨ ３．５、ｐＨ ３．８、又はｐＨ ４．５のｐＨ範囲で実施され得る。
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体はまた、組成物の形態でスラリーに添加されてもよい。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、約０．６〜１０ｐｐｍ ｄｓ（例えば、２ｐｐｍ ｄｓ）の量で、粒状デンプン基質のスラリーへと添加することができる。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、全ブロス、清澄化、部分精製、又は精製酵素として加えることができる。精製ＴｅＡｍｙ１又はその変異体の比活性は、例えば、ＰＡＨＢＡＨアッセイにより測定したとき約１７００Ｕ／ｍｇの酵素であり得る。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を全ブロス産物として加えることもできる。
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、単離された酵素溶液としてスラリーに添加されてもよい。例えば、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を発現する宿主細胞によって生成された培養細胞物質の形態で添加することができる。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体はまた、発酵又はＳＳＦプロセスの間に、酵素が持続的に反応へと供給されるように、宿主細胞から反応培地へと分泌されてもよい。ＴｅＡｍｙ１又は変異体を生成及び分泌する宿主細胞はまた、グルコアミラーゼなどの更なる酵素を発現してもよい。例えば、米国特許第５，４２２，２６７号は、アルコール飲料の生産用の酵母におけるグルコアミラーゼの使用を開示している。例えば、宿主細胞、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）又はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）を、糖化中にＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体、及びグルコアミラーゼ、例えば、変異型ＧＡ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）ＧＡ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）ＧＡ変異体、ＨｇＧＡ、ＨｇＧＡ変異体、ＴｒＧＡ、又はＴｒＧＡ変異体を同時発現するよう遺伝子操作することができる。宿主細胞は、内在性のグルコアミラーゼ、及び／若しくは他の酵素類、タンパク質類、又は他の物質を発現しないように、遺伝的に改変されていてもよい。宿主細胞は、広域スペクトルの各種糖分解性酵素を発現するよう遺伝子操作され得る。例えば、組み換え酵母菌宿主細胞は、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ（ペントース糖を利用する酵素）、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、及び／又はイソプルラナーゼをコードする核酸を含んでもよい。例えば、国際公開第２０１１／１５３５１６（Ａ２）号を参照されたい。
４．４．異性化
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を用いた処理により生成された可溶性デンプン加水分解物は、高フルクトースのトウモロコシシロップ（ＨＦＣＳ）などの、高フルクトースデンプン系シロップ（ＨＦＳＳ）へと変換できる。この変換は、グルコースイソメラーゼ、特に固体支持体上に固定化されたグルコースイソメラーゼを使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、ｐＨを、約６．０〜約８．０（例えば、ｐＨ ７．５）に増加させ、Ｃａ２＋を、イオン交換によって取り除く。好適なイソメラーゼとしては、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）、ＩＴ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）ＩＭＧＩ、及びＧ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３、Ｋｅｔｏｍａｘ（登録商標）、Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３、Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３液体、及びＧｅｎＳｗｅｅｔ（登録商標）ＩＧＩが挙げられる。異性体化後、混合物は、典型的には約４０〜４５％フルクトース、例えば、４２％フルクトースを含有する。
４．５．発酵
可溶性デンプン加水分解物、具体的にはグルコースに富むシロップは、典型的には、約３２℃（例えば３０℃〜３５℃）の温度で、発酵生物とデンプン加水分解物を接触させることによって、発酵させることができる。ＥＯＦ産物は代謝産物を含有する。代謝産物は、有機酸、アミノ酸、バイオ燃料、並びに、エタノール、クエン酸、コハク酸、グルタミン酸ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、イタコン酸及びその他のカルボン酸、グルコノデルタラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、リジン、オメガ３脂肪酸、ブタノール、イソプレン、１，３−プロパンジオール、及びバイオディーゼルが挙げられるがこれらに限定されないその他のバイオケミカルとすることができる。
エタノール生成微生物としては、アルコール脱水素酵素及びピルビン酸脱炭酸酵素を発現する、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母、及び細菌、例えば、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas moblis）が挙げられる。エタノール生成微生物は、キシロースをキシルロースに変換する、キシロース還元酵素及びキシリトール脱水素酵素を発現することができる。エタノール生成微生物の改良株、例えば、より高い温度に耐性を示し得る改良株は、当該技術分野において既知であり、使用することができる。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｇｏｎｇ Ｃｈｅｎｇ Ｘｕｅ Ｂａｏ ２７（７）：１０４９〜５６を参照されたい。市販の酵母としては、ＥＴＨＡＮＯＬ ＲＥＤ（登録商標）（ＬｅＳａｆｆｒｅ）、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）、ＲＥＤ ＳＴＡＲ（登録商標）（Ｒｅｄ Ｓｔａｒ）、ＦＥＲＭＩＯＬ（登録商標）（ＤＳＭ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）、及びＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（登録商標）（Ａｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。有用な微生物はブタノール生成性であり得る。ブタノール生成微生物としては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム・サッカロブチリカム（Clostridium saccharobutylicum）、及びクロストリジウム・サッカロブチルアセトニカム（Clostridium saccharobutylacetonicum）などのブタノール生成クロストリジウム（Clostridia）を挙げることができる。例えば、Ｅｚｅｊｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）「Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｕｔａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｂｉｏｍａｓｓ：ｆｒｏｍ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ，」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（３）：２２０〜２７を参照されたい。発酵により、クエン酸及び乳酸などのその他の代謝産物を生成する微生物もまた当該技術分野において既知である。例えば、Ｐａｐａｇｉａｎｎｉ（２００７）「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ，ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｍｏｄｅｌｉｎｇ，」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２５（３）：２４４〜６３、Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）「Ｄｉｒｅｃｔ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２７（２）：１４５〜５２を参照されたい。
糖化及び発酵プロセスは、ＳＳＦプロセスとして実施してもよい。発酵は、例えば、続いてエタノールの精製及び回収が含まれ得る。発酵中、ブロス又は「ビール」のエタノール含量は、約８〜１８％ ｖ／ｖ、例えば１４〜１５％ ｖ／ｖに達し得る。ブロスを蒸留して、富化された、例えば純度９６％のエタノール溶液を生成することもできる。更に、発酵により生じるＣＯ２は、ＣＯ２気体洗浄装置により回収し、圧縮し、及び他の用途のために、例えば、炭酸飲料、又はドライアイスの生産用に販売することもできる。発酵プロセス由来の固体廃棄物は、富タンパク質製品、例えば、家畜用飼料として使用することもできる。
上述したように、ＳＳＦプロセスは、ＳＳＦの間を通して持続的にＴｅＡｍｙ１又はその変異体を発現し、かつ分泌する真菌細胞によって行うことができる。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を発現する真菌細胞はまた、発酵性の微生物（例えば、エタノール生成微生物）であり得る。したがって、エタノール生成は、外因的な酵素をほとんど又は全く加える必要がなくなるよう、十分にＴｅＡｍｙ１又はその変異体を発現する真菌細胞を使用して実施することができる。真菌宿主細胞は、適切に遺伝子操作した菌株に由来することができる。また、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体に加えて、他の酵素を発現、及び分泌する真菌宿主細胞を使用することもできる。このような細胞は、グルコアミラーゼ及び／又はトレハラーゼ、イソアミラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、β−アミラーゼ、ＴｅＡｍｙ１ではないα−アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、転移酵素、分岐酵素、ペクチナーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、リアーゼ、又はその他の加水分解酵素を発現し得る。
このプロセスの変化形が、「流加発酵」システムであり、このシステムでは、発酵の進行に伴い基質が徐々に加えられる。流加システムは、異化産物抑制によって細胞の代謝が阻害される可能性があり、培地中の基質の量が限定されていることが望ましい場合に有用である。流加システムにおける実際の基質濃度は、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ２などの排出ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ発酵及び流加発酵は一般的なものであり、当該技術分野では周知のものである。
連続発酵は、規定の発酵培地をバイオリアクターに連続的に加え、等量の調整済の培地を加工用に同時に取り出す開放システムである。連続発酵では一般的に培養物は一定の高密度に維持され、細胞は主として対数期増殖する。連続発酵により、細胞成長、及び／又は生成物濃度の調節が可能となる。例えば、炭素源又は窒素源などの律速栄養素が固定速度に維持され、他の全てのパラメータは適度に調節される。増殖は一定に維持されることから、培地が抜き出されることによる細胞の損失は、発酵中の細胞増殖率に対し調整すべきである。連続発酵プロセスを最適化し、生成物の形成速度を最大化する方法は、工業微生物学の技術分野において周知である。
４．６．ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含む組成物
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体と、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）（例えば、トリコデルマ（Trichoderma）グルコアミラーゼ又はその変異体など）とを組み合わせてもよい。例示的なグルコアミラーゼは、優れた比活性及び熱安定性を保有するトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）及びその変異体である。米国特許出願公開第２００６／００９４０８０号、同第２００７／０００４０１８号、及び同第２００７／００１５２６６号（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．）を参照されたい。好適なＴｒＧＡの変異体としては、グルコアミラーゼ活性を有し、野生型ＴｒＧＡに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％配列同一性であるものが挙げられる。ＴｅＡｍｙ１及びその変異体は、ＴｒＧＡによって触媒される糖化プロセスで生成されるグルコースの収率を有利に増加させる。
あるいは、グルコアミラーゼは、植物、菌類、藻類、海藻、又は細菌に由来する別のグルコアミラーゼであってもよい。例えば、グルコアミラーゼは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｇ１若しくはＧ２グルコアミラーゼ又はその変異体（例えば、Ｂｏｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１０９７〜１１０２；国際公開第９２／００３８１号；国際公開第００／０４１３６号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ））、並びにＡ．アワモリ（A. awamori）グルコアミラーゼ（例えば、国際公開第８４／０２９２１号（Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐ．））であってよい。その他の想到されるアスペルギルス（Aspergillus）グルコアミラーゼとしては、熱安定性の増強された変異体、例えば、Ｇ１３７Ａ及びＧ１３９Ａ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：４９９〜５０５）；Ｄ２５７Ｅ及びＤ２９３Ｅ／Ｑ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．８：５７５〜５８２）；Ｎ１８２（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０１：２７５〜２８１）；Ａ２４６Ｃ（Ｆｉｅｒｏｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：８６９８〜８７０４）、及び位置Ａ４３５及びＳ４３６にＰｒｏ残基を有する変異体（（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０：１１９９〜１２０４）が挙げられる。その他の想到されるグルコアミラーゼとしては、タラロミセス（Talaromyces）グルコアミラーゼ、特にＴ．エマーソニイ（T. emersonii）（例えば、国際公開第９９／２８４４８号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）、Ｔ．レイセタヌ（T. leycettanu）（例えば、米国再発行特許第３２，１５３号（ＣＰＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．））、Ｔ．デュポンチ（T. duponti）、又はＴ．サーモフィル（T. thermophilu）（例えば、米国特許第４，５８７，２１５号）由来のものが挙げられる。想到される細菌グルコアミラーゼとしては、クロストリジウム（Clostridium）属、特に、Ｃ．サーモアミロリチカム（Cthermoamylolyticum）（例えば、欧州特許第１３５，１３８号（ＣＰＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）、Ｃ．サーモヒドロスルフリカム（C. thermohydrosulfuricum）（例えば、国際公開第８６／０１８３１号（Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））由来のグルコアミラーゼが挙げられる。好適なグルコアミラーゼとしては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のグルコアミラーゼ（国際公開第００／０４１３６号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）において配列番号２で示されるグルコアミラーゼなど）が挙げられる。また、ＡＭＧ ２００Ｌ；ＡＭＧ ３００Ｌ；ＳＡＮ（商標）ＳＵＰＥＲ及びＡＭＧ（商標）Ｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＯＰＴＩＤＥＸ（登録商標）３００及びＯＰＴＩＤＥＸ Ｌ−４００（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．）；ＡＭＩＧＡＳＥ（商標）及びＡＭＩＧＡＳＥ（商標）ＰＬＵＳ（ＤＳＭ）；Ｇ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９００（Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）；並びにＧ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９０ ＺＲ（プロテアーゼ含有量の低いＡ．ニガー（A. niger）グルコアミラーゼ）などの、市販のグルコアミラーゼ類も好適である。更にその他の好適なグルコアミラーゼとしては、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）グルコアミラーゼ、タラロミセス（Talaromyces）グルコアミラーゼ、チエラビア（Thielavia）グルコアミラーゼ、ホウロクタケ（Trametes）グルコアミラーゼ、サーモミセス（Thermomyces）グルコアミラーゼ、アテリア（Athelia）グルコアミラーゼ、又はフミコラ（Humicola）グルコアミラーゼ（例えば、ＨｇＧＡ）が挙げられる。グルコアミラーゼは、典型的には、約０．１〜２グルコアミラーゼ単位（ＧＡＵ）／ｇ ｄｓ例えば、約０．１６ＧＡＵ／ｇ ｄｓ、０．２３ＧＡＵ／ｇ ｄｓ、又は０．３３ＧＡＵ／ｇ ｄｓの量で加えられる。
ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体と共に使用できる他の好適な酵素としては、トレハラーゼ、イソアミラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、β−アミラーゼ、ＴｅＡｍｙ１ではないα−アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、転移酵素、ペクチナーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、分岐酵素、リアーゼ、若しくはその他の加水分解酵素、又はこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、イソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）などの脱分岐酵素を、当業者には周知の有効量で添加してもよい。プルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）、例えばＰｒｏｍｏｚｙｍｅ（登録商標）もまた好適である。プルラナーゼは、典型的には、１００Ｕ／ｋｇ ｄｓで加えられる。更に好適な酵素類としては、真菌プロテアーゼ、細菌性プロテアーゼなどのプロテアーゼ類が挙げられる。真菌プロテアーゼには、Ａ．ニガー（A. niger）、Ａ．アワモリ（A. awamori）、Ａ．オリゼ（A. oryzae）などのアスペルギルス（Aspergillus）、ムコール（Mucor）（例えば、Ｍ．ミエヘイ（M. miehei））、クモノスカビ（Rhizopus）、及びトリコデルマ（trichoderma）から得られるものが含まれる。
β−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）は、１，４−α−グルコシド結合のアミロペクチン及び関連するグルコースポリマーへの加水分解を触媒することによりマルトースを放出する、エキソ作用型マルトース生成アミラーゼである。β−アミラーゼは、多様な植物及び微生物から単離されている。ＰＲＯＧＲＥＳＳ ＩＮ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１１２〜１１５におけるＦｏｇａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９７９）を参照されたい。これらのβ−アミラーゼは、４０℃〜６５℃の範囲の最適温度、及び約４．５〜約７．０の範囲の最適ｐＨを有する。想定されているβ−アミラーゼとしては、大麦由来のβ−アミラーゼであるＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＢＢＡ １５００、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＤＢＡ、Ｏｐｔｉｍａｌｔ（商標）ＭＥ、Ｏｐｔｉｍａｌｔ（商標）ＢＢＡ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．）、及びＮｏｖｏｚｙｍ（商標）ＷＢＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
５．焼成及び食品調製のための組成物及び方法
本発明は、また、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含む「食品組成物」（食品製品、動物飼料、及び／又は、食品／飼料添加物などが挙げられるが、これらに限定されない）、及びＴｅＡｍｙ１又はその変異体を、１種類以上の食品原料と混合することを含む、そのような食品組成物の調製方法、又は、その使用にも関する。
更に、本発明は、食品組成物が、本発明のポリペプチドの添加の後に焼成される食品組成物の調製における、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体の使用に関する。本明細書で使用するとき、用語「焼成用組成物」は、パン菓子用穀粉、ドウ、焼成添加剤、及び／又は焼成製品が挙げられるがこれらに限定されない、焼成食品製品を提供するプロセスで調製される任意の組成物及び／又は添加剤を意味する。食品組成物又は添加剤は液体又は固体であり得る。
本明細書で使用するとき、用語「穀粉」は、粉砕又は磨砕された穀物を意味する。用語「穀粉」はまた、磨砕又はすり潰されたサゴ又は塊茎製品も意味する。一部の実施形態では、穀粉はまた、粉砕又はすり潰された穀草又は植物材料に加えて構成成分も含有する。追加の構成成分の例としては、膨張剤が挙げられるがこれらに限定されない。穀物としては、小麦、オート麦、ライ麦、及び大麦が挙げられる。塊茎産物としては、製粉タピオカ、製粉キャッサバ、及びカスタード粉末が挙げられる。用語「穀粉」にはまた、磨砕トウモロコシ粉、トウモロコシミール、米粉、全粉粒、ふくらし粉入りの小麦粉、製粉タピオカ、製粉キャッサバ、磨砕米、強化小麦粉、及びカスタード粉末も含まれる。
焼成及び食品調製用の、商用及び家庭用穀粉に関し、穀粉中で適切なレベルのα−アミラーゼ活性を維持することは重要である。活性レベルが高過ぎると、粘着性になり及び／又は締まりがなくなり、したがって商品にならない恐れがある。α−アミラーゼ活性が不十分な穀粉では、適切に酵母を機能させるのに十分な糖が含有されず、乾燥した、ぼろぼろと砕けやすいパン類又は焼成食品となる恐れがある。したがって、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を、それらそのままで、又はその他のα−アミラーゼ（１種又は複数種）と組み合わせて穀粉に加え、穀粉中の内因性のα−アミラーゼ活性レベルを増加させることもできる。
更に、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を、単独で、又はその他のアミラーゼと組み合わせて加えて、劣化、すなわち、焼成製品の硬化を予防又は遅延させることができる。老化防止アミラーゼの量は、典型的には、穀粉１ｋｇ当たり０．０１〜１０ｍｇの酵素タンパク質の範囲であり、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓである。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体と組み合わせて使用できる追加の老化防止アミラーゼとしては、エンドアミラーゼ、例えば、バチルス（Bacillus）由来の細菌エンドアミラーゼが挙げられる。追加のアミラーゼは、例えば、バチルス（Bacillus）由来のその他のマルトース生成α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１３３）であってもよい。Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）は、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）株ＮＣＩＢ １１８３７由来の例示的なマルトース生成α−アミラーゼであり、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｔａｒｃｈ ５０：３９〜４５に記載される。その他の老化防止エンドアミラーゼの例としては、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）又はＢ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）などのバチルス（Bacillus）由来の細菌α−アミラーゼが挙げられる。老化防止アミラーゼは、β−アミラーゼなどの、エキソ型アミラーゼでもよく、例えば、β−アミラーゼは、大豆などの植物原料由来、又は、バチルス（Bacillus）などの細菌原料由来でもよい。
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含む焼成用組成物は、ホスホリパーゼ又はホスホリパーゼ活性を有する酵素を更に含むことができる。ホスホリパーゼ活性を有する酵素は、リパーゼ単位（ＬＵ）で測定することのできる活性を有する。ホスホリパーゼは、リン脂質類から脂肪酸を取り除き、リゾリン脂質を形成させる、Ａ１又はＡ２活性を有していてもよい。ホスホリパーゼは、リパーゼ活性、即ち、トリグリセリド基質に対する活性を有しても有さなくてもよい。ホスホリパーゼは、典型的には３０〜９０℃（例えば、３０〜７０℃）の範囲に最適温度を有する。加えるホスホリパーゼは、動物由来、例えば、膵臓由来（例えば、ウシ又はブタ膵臓由来）、ヘビ毒液又は蜂毒液由来であり得る。あるいは、ホスホリパーゼは、微生物由来、例えば、糸状菌、酵母、又は細菌由来であってもよい。
ホスホリパーゼは、焼成後しばらくの間、特に焼成後最初の２４時間の間のパンの柔らかさを向上させる量で加えられる。ホスホリパーゼの量は、典型的には、穀粉１ｋｇ当たり０．０１〜１０ｍｇの範囲の酵素タンパク質、例えば、０．１〜５ｍｇ／ｋｇであり得る。即ち、ホスホリパーゼ活性は、一般的に、穀粉１ｋｇ当たり２０〜１０００ＬＵの範囲であり、ここでリパーゼ単位は、アラビアゴムを乳化剤とし、トリブチリンを基質とし、３０℃、ｐＨ ７．０にて１分間当たり１μｍｏｌの酪酸を放出させるのに必要とされる酵素量として定義される。
ドウ組成物は、一般的に、小麦全粒粉又は小麦粉、及び／又はその他種類のミール、穀粉、又はデンプン（トウモロコシ粉、トウモロコシデンプン、ライ麦ミール、ライ麦粉、オート麦粉、オートミール、大豆粉、ソルガムミール、ソルガム粉、ジャガイモミール、ジャガイモ粉、又はジャガイモデンプンを含む。ドウは、新鮮、凍結、又は半焼成のものであってよい。ドウは、発酵させたドウ、又は発酵させるドウであってよい。ドウは、化学的な発酵剤（例えば、重炭酸ナトリウム）を加えること、あるいは発酵を加えること（即ちドウを発酵させることにより）などの、多様な方法により発酵させることができる。ドウはまた、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）（パン菓子用酵母）、例えば、Ｓ．セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）の市販株の培養など、好適な酵母培養物を加え、発酵させることもできる。
ドウにはまた、その他の一般的なドウ原材料、例えば、タンパク質（乳汁粉末、グルテン、及び大豆、卵（例えば、全卵、卵黄、又は卵白））、酸化剤（アスコルビン酸、臭素酸カリウム、ヨウ素酸カリウム、アゾジカーボンアミド（ＡＤＡ）、又はアンモニウム過硫酸塩）、Ｌ−システインなどのアミノ酸、糖、又は塩類（塩化ナトリウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウム、又は硫酸カルシウムなど）を含ませることもできる。ドウには、更に脂肪、例えば、トリグリセリド（顆粒状脂肪又はショートニングなど）を含ませることもできる。ドウには、更に乳化剤、例えばモノ又はジグリセリド、モノ又はジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ステアリン酸ポリオキシエチレン、又はリゾレシチンなどを含ませることもできる。特に、ドウは乳化剤を加えずに作製することができる。
ドウ製品は、炒めた、揚げた、焼いた、焼成した、蒸した、茹でたドウ（例えば、蒸しパン及び餅など）を含む、任意の加工されたドウ製品であってよい。一実施形態では、食品製品はベーカリー製品である。典型的なベーカリー（焼成）製品としては、ローフ類、ロール類、丸パン類、ベーグル類、ピザ生地などのパン類、ペストリー、プレッツェル類、トルティーヤ類、ケーキ類、クッキー類、ビスケット類、クラッカー類などが挙げられる。
所望により、追加の酵素を老化防止アミラーゼ及びホスホリパーゼと共に使用してもよい。追加の酵素は、第２のアミラーゼ、即ちアミログルコシダーゼ、β−アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼであってよく、あるいは追加の酵素は、ペプチダーゼ、特に、エキソペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、例えば、国際公開第９５／００６３６号に開示されるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、分岐酵素（１，４−α−グルカン分岐酵素）、４−α−グルカノトランスフェラーゼ（デキストリングリコシルトランスフェラーゼ）、又は酸化還元酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルコース酸化酵素、ピラノース酸化酵素、リポオキシゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸酸化酵素、又はカルボヒドレートオキシダーゼであってよい。追加の酵素（１種又は複数種）は、哺乳類及び植物を含む任意の由来であってよく、特に微生物（細菌、酵母、又は真菌）由来であってよく、当該技術分野で一般に使用される手法により得ることができる。
キシラナーゼは、典型的には微生物由来であり、例えば、バクテリア、又は真菌（アスペルギルス（Aspergillus）株など）由来である。哺乳類又は植物由来のキシラナーゼもまた想定される。キシラナーゼには、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）から製造された市販のキシラナーゼ製剤であるＰｅｎｔｏｐａｎ（登録商標）及びＮｏｖｏｚｙｍ ３８４（登録商標）が含まれる。アミログルコシダーゼはＡ．ニガー（A. niger）アミログルコシダーゼ（ＡＭＧ（登録商標））であってよい。その他の有用アミラーゼ製品としては、Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ（登録商標）Ａ １０００又はＡ ５０００（Ｇｒｉｎｄｓｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）及びＡｍｙｌａｓｅ（登録商標）Ｈ又はＡｍｙｌａｓｅ（登録商標）Ｐ（ＤＳＭ）が挙げられる。グルコース酸化酵素は、真菌グルコース酸化酵素、特に、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコース酸化酵素（Ｇｌｕｚｙｍｅ（登録商標）など）であってよい。例示的なプロテアーゼはＮｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）である。
やわらかい又はクリスピー様の特徴のいずれかであり、精白、色白又は色黒のいずれかであるドウから調製されるあらゆる種類の焼成製品のためにプロセスを使用することができる。例は、パン、特に、典型的には、ローフ類又はロール類の形態の精白パン、全粒粉パン又はライ麦パンであり、例えば、フレンチバゲット式のパン、ピタパン、トルティーヤ類、ケーキ類、パンケーキ類、ビスケット類、クッキー類、パイ生地、クリスピーパン、蒸しパン、及びピザなどであるがこれらに限定されない。
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、老化防止アミラーゼ、ホスホリパーゼ、及び／又はリン脂質と共に穀粉を含むプレミックスで使用されてもよい。プレミックスには、その他のドウを改良する及び／又はパンを改良する添加剤、例えば、上記の酵素を含む任意の添加剤を含有させることができる。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、焼成用添加物として使用される、老化防止アミラーゼと、ホスホリパーゼとを含む酵素調製物の成分であってもよい。
酵素製剤は、場合により、顆粒状又は凝集粉末の形態である。製剤は、粒子の９５％（重量％）超が２５〜５００μｍの範囲内にある狭い粒度分布を有してよい。顆粒と凝集粉末は従来法（例えば、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を流動層造粒機内で担体上へ噴霧すること）により調製されてよい。担体は、好適な粒径を有する粒子コアからなってよい。担体は、可溶性又は不溶性の、例えば、塩（ＮａＣｌ又は硫酸ナトリウムなど）、糖（スクロース又はラクトースなど）、糖アルコール（ソルビトールなど）、デンプン、米、コーングリッツ、又は大豆であってよい。
封入粒子、即ち、α−アミラーゼ粒子は、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含み得る。封入α−アミラーゼ粒子を調製するために、酵素を、全てのα−アミラーゼ粒子を懸濁させるのに十分な量の食品グレードの脂質と接触させる。本明細書で使用するとき食品グレードの脂質とは、水には不溶性であるものの炭化水素又はジエチルエーテルなどの無極性有機溶媒には可溶性である任意の天然の有機化合物である。好適な食品グレードの脂質としては、飽和又は不飽和である脂肪又は油のいずれかの形態のトリグリセリドが挙げられるがこれらに限定されない。脂肪酸、及び飽和トリグリセリドを構成するこれらの組み合わせの例としては、酪酸（乳汁脂肪由来）、パルミチン酸（動物及び植物性脂肪由来）、及び／又はステアリン酸（動物及び植物性脂肪由来）が挙げられるがこれらに限定されない。脂肪酸、及び不飽和トリグリセリドを構成するこれらの組み合わせ例としては、パルミトレイン酸（動物及び植物性脂肪由来）、オレイン酸（動物及び植物性脂肪由来）、リノール酸（植物油由来）、及び／又はリノレン酸（亜麻仁油由来）が挙げられるがこれらに限定されない。その他の好適な食品グレードの脂質としては、上記のトリグリセリド、リン脂質、及び糖脂質に由来するモノグリセリド及びジグリセリドが挙げられるがこれらに限定されない。
食品グレードの脂質、特に液体形態のものを、脂質材料が、少なくとも大部分、例えば、１００％のα−アミラーゼ粒子の表面の少なくとも一部分を覆うような様式で、粉末形態のα−アミラーゼ粒子と接触させることができる。したがって、各α−アミラーゼ粒子はそれぞれ脂質に封入される。例えば、全て又は実質的に全てのα−アミラーゼ粒子には、脂質の、薄く連続的な封入フィルムが備わっている。これは、最初に大量の脂質を容器に注ぎ入れ、次に脂質が各α−アミラーゼ粒子の表面を十分に濡らすようα−アミラーゼ粒子をスラリーにすることによりなすことができる。短時間撹拌した後、相当量の脂質を表面上に保持する封入α−アミラーゼ粒子を回収する。このようにしてα−アミラーゼ粒子に塗布されるコーティングの厚みは、使用する脂質の種類を選択することにより、及び所望される場合には、より厚みのあるフィルムが形成されるよう操作を繰り返すことにより調節することができる。
装填される送達分散媒の保管、取り扱い、及び組み込みは、パッケージ化ミックス法を用いて実施できる。パッケージ化ミックスには封入α−アミラーゼを含ませることができる。しかしながら、パッケージ化ミックスには、製造元又は焼成者により必要とされる通りの追加の原材料を更に含有させることができる。封入α−アミラーゼをドウに組み込んだ後、焼成者は、製品のための通常の生産プロセスを続ける。
α−アミラーゼ粒子の封入による利点は２要素からなる。第１に、食品グレードの脂質は、熱に不安定な酵素の焼成プロセス中に、これらの酵素を熱分解から保護する。結果的に、準備及び焼成段階でα−アミラーゼは安定化されかつ保護される一方、最終焼成食品製品において保護コーティングから放出され、ポリグルカン中のグルコシド結合を加水分解する。装填される送達分散媒はまた、活性酵素の焼成食品への持続放出性をもたらす。即ち、焼成プロセス後、活性α−アミラーゼは、劣化機序に対抗し、したがってその速度を減じる速度で、保護コーティングから持続的に放出される。
一般的に、α−アミラーゼ粒子に塗布される脂質量は、脂質の性質、α−アミラーゼ粒子への塗布方法、処理するドウ混合物の組成、及び行われるドウ混合操作の厳格さに応じ、α−アミラーゼの総重量の数％から重量の数倍まで様々に変更できる。
装填される送達分散媒、即ち、脂質封入酵素を、焼成食品調製に使用される原材料に有効量で加えて、焼成食品の貯蔵寿命を延長する。焼成者は、所望の老化防止効果を得るのに必要とされる、上記の通りに調製された封入α−アミラーゼの量を計算する。必要とされる封入α−アミラーゼ量は、封入される酵素濃度、及び特定の穀粉に対するα−アミラーゼの割合を元に算出する。幅広い濃度が有効であることが見出されているものの、これまでに議論されている通り、老化防止において観察可能な改良はα−アミラーゼ濃度と直線的には一致せず、但し特定の最低濃度を超えると、α−アミラーゼ濃度が大幅に上昇するためほとんど追加の改良はない。具体的なベーカリー製品で実際に使用されるα−アミラーゼ濃度は、焼成者に対し、焼成者による故意ではない測定誤差へのある程度の保障を提供するのに必要とされる最低濃度よりも十分に高いものであり得る。酵素濃度の下限は、焼成者が得ることを望む最低限の老化防止効果をもとに決定する。
焼成食品の調製方法は、ａ）脂質により被覆されたα−アミラーゼ粒子を調製すること（ここで実質的に全てのα−アミラーゼ粒子が被覆されている）、ｂ）穀粉を含有するドウを混合すること、ｃ）混合が完了する前に、脂質により被覆されたα−アミラーゼをドウに加え、脂質の被覆がα−アミラーゼから剥がれ始める前に混合を終了させること、ｄ）ドウに防腐処理すること、並びにｅ）ドウを焼成して焼成食品を生成すること、を含んでよく、α−アミラーゼは混合、防腐、及び焼成段階において不活性であり、焼成食品中で活性である。
封入α−アミラーゼは、混合サイクル中、例えば、混合サイクルの終了付近でドウに加えることができる。封入α−アミラーゼは、ドウ中に封入α−アミラーゼを十分に分散させる混合段階で加えるが、しかしながら、混合段階は、アミラーゼ粒子（１種又は複数）から保護コーティングが剥がれ始める前に終了させる。ドウの種類及び体積、並びに混合様式及び速度に応じ、封入α−アミラーゼのドウへの混合に必要とされる時間は１〜６分又はそれ以上となるものの、２〜４分が平均である。したがって、いくつかの変数が正確な手順を決定し得る。第１に、封入α−アミラーゼの量は、封入α−アミラーゼをドウミックス中に行き渡らせるのに十分な合計量を有する必要がある。封入α−アミラーゼ製剤が高濃度である場合、プレミックスには、封入α−アミラーゼをドウに加える前に、追加の油を加える必要がある場合がある。レシピ及び生産プロセスは、個別に変更する必要があるものの、一般的に、パン生地の配合においては油を２５％に指定したときにドウが提供され、このドウは、混合サイクルの終了付近で濃縮封入α−アミラーゼが加えられるときに、この酵素の担体として使用され、良好な結果が得られる。パン、又はその他の焼成食品、特に低脂肪含量を有する、例えば、フランスパンにおいて、封入α−アミラーゼを適切にドウに混合するには、封入α−アミラーゼ混合物は乾燥穀粉重量の約１％で十分である。好適な割合の範囲は広く、配合、最終製品、及び個々の焼成者に必要とされる生産方法によって異なる。第２に、封入α−アミラーゼ懸濁液は、加えた後、混合物を完全にドウにするのに十分な時間にわたって、但し、過剰な機械作用により封入α−アミラーゼ粒子から保護脂質コーティングが剥がされるようものではない時間にわたって混合する必要がある。
本発明の更なる態様では、食品組成物は、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含む、油組成物、肉組成物、ラード組成物である。この文脈で、用語「油／肉／ラード組成物」は、それぞれ、油、肉、又はラードをもとにする、これからなる及び／又はこれを含有する任意の組成物を意味する。本発明の他の側面は、本発明のポリペプチドを油／肉／ラード組成物、及び／又は添加成分と混合することを含む、油、肉、又はラード組成物、及び／又はＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含む添加物の調製方法に関する。
本発明の更なる態様では、食品組成物は、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含む、動物飼料組成物、動物飼料添加物、及び／又はペットフードである。更に、本発明は、１種類以上の動物飼料材料、及び／又は動物飼料添加物成分、及び／又はペットフード原料に、ＴｅＡｍｙ１及びその変異体を混合することを含む、このような動物飼料組成物、動物飼料添加組成物、及び／又はペットフードの調製方法に関する。更に、本発明は、動物飼料組成物、及び／又は動物飼料添加組成物、及び／又はペットフードの調製における、ＴｅＡｍｙ１及びその変異体の使用に関する。
用語「動物」は、全ての非反芻及び反芻動物を含む。特定の実施形態では、動物は、馬及び単胃動物などの非反芻動物である。単胃動物の例としては、豚及び家畜豚（子豚、育成豚、雌豚など）、家禽（七面鳥、アヒル、鶏、ブロイラー、産卵鶏など）、魚（鮭、鱒、テラピア、ナマズ、及び鯉）、及び甲殻類（海老及び車海老）が挙げられるがこれらに限定されない。更なる実施形態では、動物は反芻動物であり、畜牛、幼若牛、ヤギ、羊、キリン、バイソン、ヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、リャマ、レイヨウ、エダツノレイヨウ、及びニルガイが挙げられるがこれらに限定されない。
この文脈において、用語「ペットフード」は、イヌ、ネコ、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、高級ラット、モルモット、飼育用鳥類（カナリア、インコ、及びオウムなど）、飼育用爬虫類（亀、とかげ、及びヘビなど）、及び飼育用水生生物（熱帯魚、及び蛙など）、これらに限定されない家庭内飼育用動物のための飼料を意味するものと理解されることが意図される。
用語「動物用飼料組成物」、「飼料」及び「飼葉」は互換的に使用され、かつａ）穀草類、例えば、小粒穀物（例えば、小麦、大麦、ライ麦、エンバク、及びこれらの組み合わせ）、及び／又は大粒穀物（例えば、コーン又はサトウモロコシなど）など、ｂ）穀草類からの副生成物、例えば、コーングルテンミール、蒸留粕（ＤＤＧＳ）（特にコーン系の蒸留粕（ｃＤＤＧＳ）、小麦ふすま、粗びき小麦粉、小麦ショート（wheat shorts）、米ぬか、もみ殻、オーツ麦のもみ殻、パーム核、及びシトラスパルプ、ｃ）タンパク質類、例えば、大豆、ヒマワリ、落花生、ルピナス、エンドウ豆、ソラマメ、綿、セイヨウアブラナ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉飼料、ポテトタンパク質、乳清、コプラ、ゴマなどの供給源から得られるタンパク質など、ｄ）野菜源及び動物源から得られる油類及び脂肪類、ｅ）ミネラル類及びビタミン類、からなる群から選択される１種以上の飼料材料を含み得る。
６．織物糊抜き組成物及び使用
また、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を使用した、布地を処理する（例えば、織物の糊抜きなど）組成物及び方法も、想定されている。布地の処理方法は当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，０７７，３１６号を参照されたい）。例えば、布地の感触及び外観は、その布地を溶液中のＴｅＡｍｙ１又はその変異体と接触させる工程を含む方法により改善させることができる。布地は、圧力下で溶液により処理され得る。
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、織物の製織の間に若しくはその後に、又は糊抜き段階、若しくは１つ以上の追加の布地加工工程の間に、適用することができる。織物の製織中、織り糸は相当な機械的な歪にさらされる。機械式織機での製織前、縦糸は、しばしば糊付けデンプン又はデンプン誘導体により被覆され、引張り強度が向上され、断裂が予防される。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、これらの糊付け用デンプン又はデンプン誘導体を取り除くために、製織の間又はその後に適用することができる。製織後、同種の、かつ耐洗浄的な効果を確保するために、布地を更に加工する前に、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を使用して、糊付け用コーティングを取り除くことができる。
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、単体で使用して、又は他の糊抜き用化学試薬、及び／若しくは糊抜き用酵素と共に、（例えば、水性組成物中の）洗剤添加剤として使用して、綿含有布地などの布地の糊抜きを行うことができる。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体はまた、インディゴ染色デニム布地及び衣類のストーンウォッシュ加工したような見た目を作り出すための組成物及び方法において使用することもできる。衣服の製造に際し、布地を裁断し、衣服又は衣類に縫製し、その後仕上げることができる。特にデニムジーンズの製造に関し、異なる酵素による仕上げ方法が開発されている。デニム衣類の仕上げは、通常、酵素による糊抜き工程により開始され、この間、衣類はアミロース分解酵素による作用を受け、布地には柔軟性がもたらされ、木綿は以降の酵素による仕上げ工程における作用を受けやすくなる。ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、デニム衣類の仕上げ方法（例えば、「バイオストーン加工」）、酵素による糊抜き方法及び、布地への柔らかさの付与方法、並びに／又は仕上げ加工にて使用することができる。
７．洗浄用組成物
本組成物及び本方法の１つの態様は、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を成分として含む洗浄用組成物である。アミラーゼポリペプチドは、手洗い、洗濯物洗浄、食器洗浄、及び他の硬質表面の洗浄のための洗剤組成物の成分として使用することができる。
７．１．概略
好ましくは、本ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、洗剤中のアミラーゼに対して従来使用されている濃度にて、又はそれに近い濃度にて、洗剤に組み込まれる。例えば、アミラーゼポリペプチドは、洗浄／食器洗い液１Ｌ当たりアミラーゼ０．００００１〜１ｍｇ（高純度酵素タンパク質として計算）に相当する量で加えることができる。次に例示する通り、配合例を本明細書において提供する。
アミラーゼポリペプチドは、唯一の酵素として、又はその他のアミロース分解酵素を含むその他の酵素と共に洗剤組成物の構成成分としてもよい。そのため、非散布顆粒、安定化液体、又は保護化酵素の形態で洗剤組成物に含有させることもできる。非散布顆粒は、米国特許第４，１０６，９９１号及び同第４，６６１，４５２号に開示される通りに作製されてもよく、場合により、当該技術分野において既知の方法により、コーティングされてもよい。ワックスコーティング材料の例としては、平均分子量１，０００〜２０，０００を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、エトキシ化脂肪アルコール（ここで、アルコールは、１２〜２０個の炭素原子を含有し、１５〜８０個のエチレンオキシド単位が存在する）、脂肪アルコール、脂肪酸、並びに脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドである。流動層技術による適用に適当なフィルム形成コーティング材料の例は、例えば、英国特許第１４８３５９１号に記載されている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従い、ポリオール（プロピレングリコールなど）、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより、安定化させてもよい。その他の酵素安定剤は、技術分野において既知である。保護化酵素は、例えば、欧州特許第２３８ ２１６号に開示される方法に従って調製することができる。ポリオールは、長きにわたりタンパク質安定剤として、並びにタンパク質溶解度を改良するとして認識されてきた。
洗剤組成物は、例えば、粉末、顆粒、ペースト、又は液体などの任意の有用な形態であってよい。液体洗剤は水性であってよく、典型的には、最大約７０％の水及び０％〜約３０％の有機溶媒を含み得る。液体洗剤はまた、水をわずか約３０％含有するコンパクトジェルタイプの形態であってもよい。
洗剤組成物は、１種以上の界面活性剤を含み、それぞれアニオン性、非イオン性、カチオン性、又は双極性であり得る。洗剤は、通常、０％〜約５０％のアニオン性界面活性剤、例えば、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、α−オレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、アルキル硫酸塩（脂肪族アルコール硫酸塩）（ＡＳ）、アルコールエトキシ硫酸塩（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）、第ニ級アルカンスルホン酸塩（ＳＡＳ）、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル又はアルケニルコハク酸、又は石鹸を含有し得る。組成物はまた、０％〜約４０％の非イオン性界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート（ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、国際公開第９２／０６１５４号に記載のものなど）を含有することもできる。
洗剤組成物には、追加して、１つ以上のその他の酵素、例えば、任意の組み合わせでプロテアーゼ、その他のアミロース分解酵素、クチナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペルヒドロラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、及び／又はラッカーゼなどを含ませることもできる。
洗剤には、約１％〜約６５％の洗剤ビルダー、又は錯化剤、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキル−又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例えば、ＨｏｅｃｈｓｔのＳＫＳ−６）を含有させてもよい。洗剤は無ビルダー系であってよく、即ち、本質的に洗剤ビルダーを含有しない。酵素は、酵素の安定性に適合性のある任意の組成物に使用することができる。酵素は、一般的に、既知の形態の封入により、例えば、造粒又はヒドロゲル中への隔離により、有害な成分から保護することができる。酵素、及び具体的にはデンプン結合ドメインを有するか又は有さないアミラーゼを、洗濯及び食器洗い用途、表面クリーナー、並びにデンプン又はバイオマスからのエタノール生成用組成物を含む、多様な組成物に使用することができる。
洗剤は、１種類以上のポリマーを含み得る。例としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリカルボキシラート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー類、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー類が挙げられる。
洗剤は、Ｈ２Ｏ２供給源、例えば、過ホウ酸塩又は過炭酸塩（過酸を形成する漂白活性化剤、例えば、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）又はノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（ＮＯＢＳ）と組み合わせてもよい）を含む漂白系を含有し得る。あるいは、漂白系は、ペルオキシ酸（例えば、アミド、イミド、又はスルホン型ペルオキシ酸）を含んでもよい。漂白系はまた、酵素系漂白系、例えば、国際公開第２００５／０５６７８３号に記載されるものなどのペルヒドロラーゼであってもよい。
洗剤組成物の酵素は、通常の安定化剤、例えば、プロピレングリコール又はグリセロールなどのポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸又はホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸塩エステルを用いて安定化されてもよく、組成物は、例えば、国際公開第９２／１９７０９号及び国際公開第９２／１９７０８号に記載される通り、配合することもできる。
洗剤はまた、他の通常の洗剤成分、例えば、クレイを含む布地コンディショナ、起泡促進剤、抑泡剤、防食剤、汚れ懸濁化剤、汚れ再付着防止剤、染料、殺菌剤、変色防止剤、光学的光沢剤、又は香料を含有し得る。
ｐＨ（使用濃度の水溶液で測定）は通常中性又はアルカリ性であり、例えば、ｐＨ約７．０〜約１１．０である。
本明細書のα−アミラーゼを含有させるための特定の形態の洗剤組成物を以下に記載する。
７．２．重質液体（ＨＤＬ）洗濯用洗剤組成物
例示的なＨＤＬ洗濯用洗剤組成物としては、アニオン性洗浄界面活性剤（線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシ化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、及び／又はこれらの混合物の群から選択される）、及び場合により非イオン性界面活性剤（線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキルアルコキシ化アルコール、例えば、Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシ化アルコール及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートの群から選択される）を含有する洗浄界面活性剤（１０％〜４０％ ｗｔ／ｗｔ）が挙げられ、非イオン性洗浄界面活性剤に対するアニオン性洗浄界面活性剤（６．０〜９の親水性指数（ＨＩｃ）を有する）の重量比は１：１超である。好適な洗浄界面活性剤としてはまた、カチオン性洗浄界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物、及び／又はこれらの混合物の群から選択される）、双極性及び／又は両性洗浄界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインの群から選択される）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、並びにこれらの混合物が挙げられる。
組成物には、場合により、両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマー（アルコキシル化ポリアルキレンイミンなどの、分岐状親水及び疎水特性を有するアルコキシル化ポリマーの群から０．０５重量％〜１０重量％の範囲で選択される）、及び／又はランダムグラフトポリマー（典型的には、不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、マレイン酸無水物、グリセロールなどの飽和多価アルコール、及びこれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む、親水性主鎖、Ｃ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ１〜Ｃ６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリル酸又はメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル、及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖（１種又は複数種）、を含む）からなる界面活性増強ポリマーを含ませることもできる。
組成物は、汚れ分離ポリマー（陰イオン性のエンドキャップされたポリエステル類、例えば、ＳＲＰ１、糖、ジカルボン酸、ポリオール、から選択される少なくとも１種類のモノマー単位を含むポリマー及び、ランダム又はブロックな構成のこれらの組み合わせを含むポリマー、エチレンテレフタラート系ポリマー及びランダム又はブロックな構成のそれらのコポリマー（例えば、Ｒｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ ＳＦ、ＳＦ−２及びＳＲＰ６、Ｔｅｘｃａｒｅ ＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００、及びＳＲＮ３２５、Ｍａｒｌｏｑｕｅｓｔ ＳＬなど）、再付着防止ポリマー（０．１重量％〜１０重量％、アクリル酸、マレイン酸（又は無水マレイン酸）、フマル酸、イタコン酸、アコニット酸、メサコン酸、シトラコン酸、メチレンマロン酸、及びこれらの任意の混合物から選択される少なくとも１つのモノマーを含むポリマー類などのカルボン酸塩ポリマー、ビニルピロリドンホモポリマー、及び／又はポリエチレングリコールなど、分子量５００〜１００，０００Ｄａの範囲）；セルロース系ポリマー（アルキルセルロース、アルキルアルコキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、アルキルカルボキシアルキルセルロースから選択されるもの（例としては、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロース、及びそれらの混合物が挙げられる）など）、及びポリマー性カルボン酸塩（マレイン酸塩／アクリル酸塩ランダムコポリマー、又はポリアクリル酸塩ホモポリマーなど）などの追加のポリマーを含んでもよい。
組成物は、飽和又は不飽和脂肪酸、好ましくは飽和又は不飽和Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸（０重量％〜１０重量％）；付着補助剤（例としては、多糖類、好ましくはセルロース系ポリマー、ポリジアリルジメチルアンモニウムハロゲン化物（ＤＡＤＭＡＣ）、及びランダム又はブロックな構成の、ＤＡＤ ＭＡＣのビニルピロリドン、アクリルアミド、イミダゾール、ハロゲン化イミダゾリニウム、及びそれらの混合物とのコポリマー、カチオン性グアーガム、カチオン性セルロース（カチオン性ヒドロキシエチル（hydoxyethyl）セルロースなど）、カチオン性デンプン、カチオン性ポリアシルアミド、及びそれらの混合物を更に含んでもよい。
組成物は、移染防止剤、例えば、マンガンフタロシアニン、ペルオキシダーゼ、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドン及びＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール、及び／又はこれらの混合物、キレート剤、例えば、エチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）、ヒドロキシ−エタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンＮ，Ｎ’−二コハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴ Ａ）、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ二酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸テトラナトリウム塩（ＧＬＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、４，５−ジヒドロキシ−ｍ−ベンゼンジスルホン酸、クエン酸及び任意のそれらの塩、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノジ酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミンテトラプロピオン酸（ＥＤＴＰ）、及びこれらの誘導体を更に含んでもよい。
組成物は、好ましくは、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクタートリアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びそれらの任意の混合物から選択される酵素（概して、約０．０１重量％の活性酵素〜０．０３重量％の活性酵素）を含む。組成物は酵素安定剤を含んでもよい（例えば、プロピレングリコール又はグリセロールなどのポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、可逆性プロテアーゼ阻害剤、ホウ酸、若しくはホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸エステル、又はフェニルボロン酸誘導体、例えば、４−ホルミルフェニルボロン酸などを含む）。
組成物は、場合により、シリコーン又は脂肪酸系抑泡剤、色相染料、カルシウム及びマグネシウムカチオン、視覚的シグナル成分、消泡剤（０．００１重量％〜約４．０重量％）、及び／又は構造剤／増粘剤（０．０１重量％〜５重量％、ジグリセリド及びトリグリセリド、エチレングリコールジステアレート、微小結晶セルロース、セルロース系材料、微小繊維セルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガム、及びこれらの混合物からなる群から選択される）を含む。
組成物は任意の液体形態であってよく、例えば、液体若しくはジェル形態、又はこれらの組み合わせてあってよい。組成物は、任意の単回用量形態であってよく、例えば、パウチであってもよい。
７．３．重質乾燥／固体（ＨＤＤ）洗濯用洗剤組成物
例示的なＨＤＤ洗濯用洗剤組成物には、アニオン性洗浄界面活性剤（例えば、線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシ化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩及び／又はこれらの混合物）、非イオン性洗浄界面活性剤（例えば、線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシレート、及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレート）、カチオン性洗浄界面活性剤（例えば、アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物、及びこれらの混合物）、双極性及び／又は両性洗浄界面活性剤（例えば、アルカノールアミンスルホベタイン）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びこれらの混合物を含む洗浄界面活性剤；無リン酸ビルダー（例えば、ゼオライトＡ、ゼオライトＸ、ゼオライトＰ、及びゼオライトＭＡＰなどのゼオライトビルダー例を０重量％〜１０重量％未満の範囲）、リン酸塩ビルダー（例えば、ナトリウム三ポリホスフェートを０重量％〜１０重量％未満の範囲）、クエン酸、クエン酸塩及びニトリロ三酢酸、ケイ酸塩（例えば、ケイ酸ナトリウム若しくはケイ酸カリウム、又はメタケイ酸ナトリウムを０重量％〜１０重量％未満の範囲、又は層状ケイ酸塩（ＳＫＳ−６））を含むビルダー；炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム及び／又は重炭酸ナトリウムを０重量％〜８０重量％未満の範囲）；及び光漂白剤（例えば、スルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、キサンテン染料、及びこれらの混合物）、疎水性又は親水性漂白活性化剤（例えば、ドデカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシ安息香酸又はそれらの塩、３，５，５−トリメチ（trimethy）ヘキサノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、テトラアセチルエチレンジアミン−ＴＡＥＤ、ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩−ＮＯＢＳ、ニトリルクァット（nitrile quats）、及びこれらの混合物）、過酸化水素源（例えば、過ホウ酸ナトリウムの一又は四水和物、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、又は過ケイ酸塩などの無機過水和物塩）、予形成親水性及び／又は疎水性過酸（例えば、過カルボン酸及び塩、過炭酸及び塩、過イミド酸及び塩、ペルオキシ一硫酸及び塩、及びこれらの混合物）、及び／又は漂白触媒（例えば、イミン系漂白増進剤（イミニウムカチオン及びポリイオンを含む）、イミニウム両性イオン、変性アミン、変性アミンオキシド、Ｎ−スルホニルイミン、Ｎ−ホスホニルイミン、Ｎ−アシルイミン、チアジアゾールジオキシド、ペルフルオロイミン、環状糖ケトン、及びこれらの混合物、並びに金属含有漂白触媒（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又は亜鉛若しくはアルミニウムなどの補助金属カチオンと共にマンガンカチオン、及びエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）などの金属イオン封鎖剤、及びこれらの水溶性塩）を含む漂白剤、が挙げられる。
組成物は、好ましくは酵素、例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、アシル基転移酵素、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びこれらの任意の混合物を含む。
組成物は、任意選択で、追加の洗剤成分（香料マイクロカプセル、デンプンカプセル化香料調和化物（perfume accord）、色調剤など）、追加のポリマー（布地一体性（fabric integrity）かつ陽イオン性のポリマーなど）、染料固定成分（dye-lock ingredient）、布地柔軟化剤、光沢剤（例えば、Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤）、凝集剤、キレート剤、アルコキシル化ポリアミン、布地付着補助剤、及び／又はシクロデキストリンを含んでもよい。
７．４．自動食器洗い（ＡＤＷ）洗剤組成物
例示的なＡＤＷ洗剤組成物は、０〜１０重量％の量で存在する非イオン性界面活性剤（エトキシル化非イオン性界面活性剤、アルコールアルコキシル化界面活性剤、エポキシキャップされたポリ（オキシアルキル化）アルコール、又はアミンオキシド界面活性剤など）；５〜６０％の範囲のビルダー（リン酸塩ビルダー（例えば、一リン酸塩、二リン酸塩、トリポリリン酸塩、他のオリゴマー性ポリリン酸塩（oligomeric-poylphosphate）、トリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ））、及びリン酸塩非含有ビルダー（例えば、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）及び塩並びにそれらの誘導体、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＧＬＤＡ）及び塩並びにそれらの誘導体、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）及び塩並びにそれらの誘導体、カルボキシメチルイヌリン及び塩並びにそれらの誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｂ−アラニン二酢酸（Ｂ−ＡＤＡ）及びそれらの塩などのアミノ酸系化合物、０．５％〜５０重量％の範囲のポリカルボン酸のホモポリマー及びコポリマー並びにそれらの部分中和した又は完全中和した塩、単量体ポリカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸及びそれらの塩など）；寸法安定性を付与するための、約０．１重量％〜約５０重量％の範囲のスルホン化／カルボキシル化ポリマー；約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の乾燥補助剤（例えば、ポリエステル、特に陰イオン性ポリエステルであって、任意選択で３〜６個の官能基（典型的には、重縮合を促す酸、アルコール又はエステル官能基）を有する更なるモノマーを伴うもの、ポリカーボネート−、ポリウレタン−、及び／又はポリ尿素−ポリオルガノシロキサン化合物又はそれらの前駆化合物（特に反応性環状カーボネート及び尿素タイプのもの）；約１重量％〜約２０重量％の範囲のケイ酸塩（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム及び結晶質フィロケイ酸塩などのケイ酸ナトリウム又はケイ酸カリウム）；無機漂白剤（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩などの過水和物塩）及び有機漂白剤（例えば、過酸化ジアシル及び過酸化テトラアシル、特に、ジペルオキシドデカン二酸（diperoxydodecanedioc acid）、ジペルオキシテトラデカン二酸（diperoxytetradecanedioc acid）、及びジペルオキシヘキサデカン二酸（diperoxyhexadecanedioc acid）などの有機過酸）；漂白活性剤（即ち、約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の有機過酸前駆物質）；漂白触媒（例えば、マンガン−トリアザシクロノナン及び関連する錯体、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、及びＦｅビスピリジルアミン及び関連する錯体、並びにペンタミンアセタートコバルト（ＩＩＩ）及び関連する錯体）；約０．１重量％〜５重量％の範囲の金属処理剤（例えば、ベンゾトリアゾール（benzatriazole）、金属塩及び錯体、及び／又はケイ酸塩）；自動食器洗浄用洗剤組成物１グラム当たり活性酵素約０．０１〜５．０ｍｇの範囲の酵素（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクタートリアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びそれらの混合物など）；並びに酵素安定剤成分（例えば、オリゴ糖、多糖類、及び無機二価金属塩など）を含む。
７．５．追加の洗剤組成物
本発明のアミラーゼを加えることができる追加の例示的な洗剤配合物を、以下の付番した段落に記載する。
１）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約７％〜約１２％と；アルコールエトキシ硫酸塩（例えば、Ｃ１２〜１８アルコール、１〜２エチレンオキシド（ＥＯ））又はアルキル硫酸塩（例えば、Ｃ１６〜１８）約１％〜約４と；アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１４〜１５アルコール、７ＥＯ）約５％〜約９％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約１４％〜約２０％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約２〜約６％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）約１５％〜約２２％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）０％〜約６％と；クエン酸ナトリウム／クエン酸（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）約０％〜約１５％と；ナトリウム過ホウ酸塩（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）約１１％〜約１８％と；ＴＡＥＤ約２％〜約６％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及び（and）０％〜約２％と；ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸、コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０〜３％と；酵素（純粋な酵素として計算）０．０００１〜０．１％タンパク質と；微量成分（例えば、抑泡剤、香料、光学的光沢剤、光漂白剤）０〜５％と、を含む洗剤組成物。
２）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約６％〜約１１％と；アルコールエトキシ硫酸塩（例えば、Ｃ１２〜１８アルコール、１〜２ＥＯ）又はアルキル硫酸塩（例えば、Ｃ１６〜１８）約１％〜約３％と；アルコールエトキシラート（例えば、Ｃ１４〜１５アルコール、７ＥＯ）約５％〜約９％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約１５％〜約２１％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約１〜約４％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）約２４％〜約３４％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）約４％〜約１０％と；クエン酸ナトリウム／クエン酸（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）０％〜約１５％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％と；ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）１〜６％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、抑泡剤、香料）０〜５％と、を含む洗剤組成物。
３）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約５％〜約９％と；アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ）約７％〜約１４％と；脂肪酸としての石鹸（例えば、Ｃ１６〜２２脂肪酸）約１〜約３％と；炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）約１０％〜約１７％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約３％〜約９％と；ゼオライト（ＮａＡ１ＳｉＯ４として）約２３％〜約３３％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）０％〜約４％と；過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）約８％〜約１６％と；ＴＡＥＤ約２％〜約８％と；ホスホン酸塩（例えば、ＥＤＴＭＰＡ）０％〜約１％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％と；ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０〜３％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、抑泡剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％と、を含む洗剤組成物。
４）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約８％〜約１２％と；アルコールエトキシラート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ）約１０％〜約２５％と；炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）約１４％〜約２２％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約１％〜約５％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）約２５％〜約３５％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）０％〜約１０％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％と；ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）１〜３％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、抑泡剤、香料）０〜５％と、を含む洗剤組成物。
５）直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約１５％〜約２１％と；アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）約１２％〜約１８％と；脂肪酸としての石鹸（例えば、オレイン酸）約３％〜約１３％と；アルケニルコハク酸（Ｃ１２−１４）０％〜約１３％と；アミノエタノール約８％〜約１８％と；クエン酸約２％〜約８％と；ホスホン酸塩０％〜約３％と；ポリマー（例えば、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０％〜約３％と；ホウ酸（例えば、Ｂ４Ｏ７）０％〜約２％と；エタノール０％〜約３％と；プロピレングリコール約８％〜約１４％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、懸濁剤、抑泡剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％と、を含む水性液体洗剤組成物。
６）直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約１５％〜約２１％と；アルコールエトキシラート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ、又はＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）３〜９％と；脂肪酸としての石鹸（例えば、オレイン酸）約３％〜約１０％と；ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ４として）約１４％〜約２２％と；クエン酸カリウム約９％〜約１８％と；ホウ酸（例えば、Ｂ４Ｏ７）０％〜約２％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％と；ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＰＶＰ）０％〜約３％と；固着ポリマー（例えば、ラウリルメタクリラート／アクリル酸コポリマー；モル比２５：１、ＭＷ ３８００など）０％〜約３％と；グリセロール０％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、分散剤、抑泡剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％と、を含む水性構成液体洗剤組成物。
７）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、脂肪アルコール硫酸塩約５％〜約１０％と；エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド約３％〜約９％と；脂肪酸としての石鹸０〜３％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約５％〜約１０％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約１％〜約４％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）約２０％〜約４０％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）約２％〜約８％と；過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）約１２％〜約１８％と；ＴＡＥＤ約２％〜約７％と；ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）約１％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、光学的光沢剤、抑泡剤、香料）０〜５％と、を含む洗剤組成物。
８）顆粒として配合される洗剤組成物であって、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約８％〜約１４％と；エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド約５％〜約１１％と；脂肪酸としての石鹸０％〜約３％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約４％〜約１０％と；可溶性ケイ酸塩（Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約１％〜約４％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）約３０％〜約５０％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）約３％〜約１１％と；クエン酸ナトリウム（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）約５％〜約１２％と；ポリマー（例えば、ＰＶＰ、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）約１％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、抑泡剤、香料）０〜５％と、を含む洗剤組成物。
９）顆粒剤として配合される洗剤組成物であって、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約６％〜約１２％と；非イオン性界面活性剤約１％〜約４％と；脂肪酸としての石鹸約２％〜約６％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約１４％〜約２２％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）約１８％〜約３２％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）約５％〜約２０％と；クエン酸ナトリウム（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）約３％〜約８％と；過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）約４％〜約９％と；漂白活性化剤（例えば、ＮＯＢＳ、又はＴＡＥＤ）約１％〜約５％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％と；ポリマー（例えば、ポリカルボキシレート、又はＰＥＧ）約１％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、光学的光沢剤、香料）０〜５％と、を含む洗剤組成物。
１０）直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約１５％〜約２３％と；アルコールエトキシ硫酸塩（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、２〜３ＥＯ）約８％〜約１５％と；アルコールエトキシラート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ、又はＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）約３％〜約９％と；脂肪酸としての石鹸（例えば、ラウリン酸）０％〜約３％と；アミノエタノール約１％〜約５％と；クエン酸ナトリウム約５％〜約１０％と；ヒドロトロープ（例えば、トルエンスルホン酸ナトリウム）約２％〜約６％と；ホウ酸（例えば、Ｂ４Ｏ７）０％〜約２％と；カルボキシメチルセルロース０％〜約１％と；エタノール約１％〜約３％と；プロピレングリコール約２％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、ポリマー、分散剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％と、を含む水性液体洗剤組成物。
１１）直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約２０％〜約３２％と；アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ、又はＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）６〜１２％と；アミノエタノール約２％〜約６％と；クエン酸約８％〜約１４％と；ホウ酸（例えば、Ｂ４Ｏ７）約１％〜約３％と；ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、固着ポリマー、例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー）０％〜約３％と；グリセロール約３％〜約８％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、ヒドロトロープ、分散剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％と、を含む水性液体洗剤組成物。
１２）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒剤として配合される洗剤組成物であって、アニオン性界面活性剤（直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホン酸塩、石鹸）約２５％〜約４０％と；非イオン性界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート）約１％〜約１０％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約８％〜約２５％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約５％〜約１５％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）０％〜約５％と；ゼオライト（ＮａＡ１ＳｉＯ４）約１５％〜約２８％と；過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３・４Ｈ２Ｏ）０％〜約２０％と；漂白活性化剤（ＴＡＥＤ又はＮＯＢＳ）約０％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、香料、光学的光沢剤）０〜３％と、を含む洗剤組成物。
１３）直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩の全て、又は一部が、（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩によって置換されている、上記組成物１）〜１２）に記載した、洗剤組成物。
１４）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩約９％〜約１５％と；アルコールエトキシラート約３％〜約６％と；ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド約１％〜約５％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）約１０％〜約２０％と；層状二ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製ＳＫ５６）約１０％〜約２０％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約３％〜約１２％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）０％〜約６％と；クエン酸ナトリウム約４％〜約８％と；過炭酸ナトリウム約１３％〜約２２％と；ＴＡＥＤ約３％〜約８％と；ポリマー（例えば、ポリカルボン酸塩及びＰＶＰ）０％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、光学的光沢剤、光漂白剤、香料、抑泡剤）０〜５％と、を含む洗剤組成物。
１５）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩約４％〜約８％と；アルコールエトキシラート約１１％〜約１５％と；石鹸約１％〜約４％と；ゼオライトＭＡＰ又はゼオライトＡ約３５％〜約４５％と；炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）約２％〜約８％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）０％〜約４％と；過炭酸ナトリウム約１３％〜約２２％と；ＴＡＥＤ １〜８％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約３％と；ポリマー（例えば、ポリカルボン酸塩及びＰＶＰ）０％〜約３％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、光学的光沢剤、ホスホン酸塩、香料）０〜３％と、を含む洗剤組成物。
１６）上記１）〜１５）に記載される通りの洗剤配合物であって、追加成分として、又はすでに記載されている漂白系の代替として安定化又は封入された過酸を含有する、洗剤配合物。
１７）上記１）、３）、７）、９）、及び１２）に記載される通りの洗剤組成物であって、過ホウ酸塩が過炭酸塩により置き換えられている、洗剤組成物。
１８）上記１）、３）、７）、９）、１２）、１４）、及び１５）に記載される通りの洗剤組成物であって、マンガン触媒を更に含有する、洗剤組成物。マンガン触媒は、例えば、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ ｌｏｗ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ，」Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６３７〜６３９（１９９４）に記載の化合物のうちの１つである。
１９）液体非イオン性界面活性剤、例えば、線状アルコキシル化一級アルコールなど、ビルダー系（例えば、リン酸）、酵素（１種又は複数種）、及びアルカリを含む非水性洗剤液体として配合された洗剤組成物。洗剤は、アニオン性界面活性剤及び／又は漂白系を含んでもよい。
上記の通り、本発明のアミラーゼポリペプチドは、従来洗剤において採用されていた濃度で組み込むことができる。本発明では、洗剤組成物において、酵素は、洗浄液１Ｌ当たり０．００００１〜１．０ｍｇ（純粋な酵素タンパク質として計算）のアミラーゼポリペプチドに相当する量で添加され得ることが想到される。
洗剤組成物はまた、その他の従来の洗剤原材料、例えば、解膠剤、充填材、消泡剤、抗腐食剤、汚れ懸濁剤、金属イオン封鎖剤、汚れ再付着防止剤、脱水剤、染料、殺菌剤、蛍光剤、増粘剤、及び香料を含有し得る。
洗剤組成物は、染みの付着した布地の前処理剤、及びすすぎ時添加型布地柔軟剤組成物に好適な洗濯添加剤組成物を含む、手洗い（手動）若しくは機械（自動）洗濯用洗剤組成物として配合することもでき、又は一般的な家庭用硬質表面洗浄作業で使用するための洗剤組成物として配合することもでき、又は手動若しくは自動食器洗い作業向けに配合することもできる。
本明細書に記載の任意の洗浄用組成物には任意の数の追加の酵素を含有させることもできる。一般的には、酵素（１種又は複数種）は選択された洗剤と適合する必要があり（例えば、最適ｐＨが適合する、かつその他の酵素及び非酵素成分と適合するなど）、酵素（１種又は複数種）は有効な量で存在させる必要がある。次の酵素が例として提供される。
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼとしては、動物、野菜又は微生物由来のものが挙げられる。化学修飾されたか、又はタンパク質操作による変異体、並びに天然にプロセシングを受けたタンパク質が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ若しくはメタロプロテアーゼ、アルカリ性微生物プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、又はキモトリプシン様プロテアーゼであってよい。アルカリプロテアーゼの例としては、サブチリシン、特に、例えば、バチルス（Bacillus）由来のサブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８（例えば、米国特許第６，２８７，８４１号を参照されたい）が挙げられる。トリプシン様プロテアーゼの例としては、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ由来のもの）、フサリウム（Fusarium）プロテアーゼ（例えば、国際公開第８９／０６２７０号及び国際公開第９４／２５５８３号を参照）が挙げられる。有用プロテアーゼの例としてはまた、国際公開第９２／１９７２９号、国際公開第９８／２０１１５号、国際公開第９８／２０１１６号、及び国際公開第９８／３４９４６号に記載の変異体も挙げられるがこれらに限定されない。市販のプロテアーゼ酵素としては、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＬＡＳＥ（商標）、ＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（商標）、及びＢＬＡＺＥ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）；ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ ＯＸＰ（商標）、ＦＮ２（商標）、及びＦＮ３（商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．）が挙げられるがこれらに限定されない。その他の例示的なプロテアーゼとしては、バチルス・アミロリキファシエンス（Bacillus amylo liquifaciens）由来のＮｐｒＥ、及びセルロモナス種（Cellulomonas sp.）株６９Ｂ４由来のＡＳＰが挙げられる。
リパーゼ：好適なリパーゼとしては、細菌、植物、動物、又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾されたか、タンパク質の分解により改質されたか、又はタンパク質操作による変異体が含まれる。有用なリパーゼの例としては、フミコラ（Humicola）（異名：サーモマイセス（Thermomyces））由来のリパーゼ、例えば、Ｈ．ラヌギノーサ（H. lanuginosa）（Ｔ．ラヌギノサス（T. lanuginosus））由来（例えば、欧州特許第２５８０６８号及び欧州特許第３０５２１６号を参照されたい）、Ｈ．インソレン（H. insolen）由来（例えば、国際公開第９６／１３５８０号を参照されたい）；シュードモナス（Pseudomonas）リパーゼ（例えば、Ｐ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）又はＰ．シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）由来、例えば、欧州特許第２１８２７２号を参照されたい）、Ｐ．セパシア（P. cepacia）（例えば、欧州特許第３３１３７６号を参照されたい）、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号を参照されたい）、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）株ＳＤ７０５（例えば、国際公開第９５／０６７２０号及び国際公開第９６／２７００２号を参照されたい）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（P. wisconsinensi）（例えば、国際公開第９６／１２０１２号を参照されたい）；バチルス（Bacillus）リパーゼ（例えば、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）、例えば、Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１３１：２５３〜３６０（１９９３）を参照されたい）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）（例えば、日本特許第６４／７４４９９２号を参照されたい）、又はＢ．プミルス（B. pumilus）（例えば、国際公開第９１／１６４２２号を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。配合物における使用が想到される追加のリパーゼ変異体としては、例えば、国際公開第９２／０５２４９号、国際公開第９４／０１５４１号、国際公開第９５／３５３８１号、国際公開第９６／００２９２号、国際公開第９５／３０７４４号、国際公開第９４／２５５７８号、国際公開第９５／１４７８３号、国際公開第９５／２２６１５号、国際公開第９７／０４０７９号、国際公開第９７／０７２０２号、欧州特許第４０７２２５号、及び欧州特許第２６０１０５号、に記載のものが挙げられる。いくつかの市販のリパーゼ酵素としては、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ ＵＬＴＲＡ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられる。
ポリエステラーゼ：好適なポリエステラーゼは、例えば、国際公開第０１／３４８９９号、国際公開第０１／１４６２９号、及び米国特許第６，９３３，１４０号に記載されているものなどの組成物に含まれ得る。
アミラーゼ：組成物は、生産性を増強させるものではないアミラーゼなどの、その他のアミラーゼと組み合わせることができる。これらとしては、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）；ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）、及びＰＵＲＡＳＴＡＲ（登録商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．製）などの市販のアミラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
セルラーゼ：セルラーゼを組成物に加えることができる。好適なセルラーゼには、細菌又は真菌由来のものが含まれる。哺乳類又は植物由来のセルラーゼもまた想定される。化学修飾された突然変異体又はタンパク質工学による変異体が含まれる。好適なセルラーゼとしては、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ヒュミコラ（Humicola）属、フザリウム（Fusarium）属、チエラビア（Thielavia）属、アクレモニウム（Acremonium）属由来のセルラーゼ（例えば、米国特許第４，４３５，３０７号；第５，６４８，２６３号；第５，６９１，１７８号；第５，７７６，７５７号；及び国際公開第８９／０９２５９号などに開示される、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）及びフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）から生成される真菌セルラーゼなど）が挙げられる。用いるために企図された例示的なセルラーゼは、織物に対し有益な色ケア効果を有するものである。このようなセルラーゼの例は、例えば、欧州特許第０４９５２５７号、欧州特許第０５３１３７２号、国際公開第９６／１１２６２号、国際公開第９６／２９３９７号、及び国際公開第９８／０８９４０号に記載のセルラーゼである。その他の例は、国際公開第９４／０７９９８号、国際公開第９８／１２３０７号、国際公開第９５／２４４７１号、国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号、欧州特許第５３１３１５号、米国特許第５，４５７，０４６号、同第５，６８６，５９３号、及び同第５，７６３，２５４号に記載のものなどのセルラーゼ変異体である。市販のセルラーゼとしては、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）及びＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、ＣＬＡＺＩＮＡＳＥ（登録商標）及びＰＵＲＡＤＡＸＨＡ（登録商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．）、及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（Ｋａｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：組成物における使用が想定されている好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼには、植物、細菌又は真菌由来のものが含まれる。化学修飾された突然変異体又はタンパク質工学による突然変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、国際公開第９３／２４６１８号、国際公開第９５／１０６０２号、及び国際公開第９８／１５２５７号に記載される、コプリナス（Coprinus）由来、例えば、Ｃ．シネレウス（C. cinereus）由来のペルオキシダーゼ、及びそれらの変異体が挙げられる。市販のペルオキシダーゼとしては、例えば、ＧＵＡＲＤＺＹＭＥ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられる。
洗剤組成物はまた、２，６−β−Ｄ−フルクタン加水分解酵素を含んでもよく、これは、本発明の家庭用及び／又は工業用織物／洗濯物上に存在するバイオフィルムの除去／洗浄に有効である。
洗剤酵素（１種又は複数種）は、１つ以上の酵素を含有する別個の添加剤を加えることにより、又はこれらの酵素の全てを含む組み合わせた添加剤を加えることにより、洗剤組成物に含有させることもできる。洗剤添加剤、即ち、別個の添加剤又は組み合わせた添加剤は、例えば、顆粒剤、液体、及びスラリーなどとして配合することができる。例示的な洗剤添加剤配合物としては、顆粒剤、特に非散布顆粒顆粒剤、液体、特に安定化された液体又はスラリーが挙げられるがこれらに限定されない。
非散布顆粒は、米国特許第４，１０６，９９１号及び同第４，６６１，４５２号に開示される通りに作製されてよく、場合により、当該技術分野において既知の方法により、コーティングされてもよい。ワックスコーティング材料の例としては、平均分子量１，０００〜２０，０００を有するポリ（エチレンオキシド）製品（例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、エトキシ化脂肪アルコール（ここで、アルコールは、１２〜２０個の炭素原子を含有し、１５〜８０個のエチレンオキシド単位が存在する）；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ及びジ及びトリグリセリドである。流動層技術による適用に適当なフィルム形成コーティング材料の例は、例えば、英国特許第１４８３５９１号において与えられる。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従い、ポリオール（プロピレングリコールなど）、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより、安定化させてもよい。保護化酵素（Protected enzyme）を、欧州公開公報第２３８，２１６号に開示される方法に従い調製してもよい。
洗剤組成物は、任意の便利な形態であってよく、例えば、バー、錠剤、粉末、顆粒、ペースト、又は液体であってよい。液体洗剤は水性であってよく、典型的には、最大で約７０％の水及び０％〜約３０の有機溶媒を含有し得る。約３０％以下の水を含有するコンパクト洗剤ジェルもまた想到される。洗剤組成物には、場合により１つ以上の界面活性剤を含ませることができ、界面活性剤は、半極性などの非イオン性及び／又はアニオン性及び／又はカチオン性及び／又は双極性であってよい。界面活性剤は、約０．１重量％〜約６０重量％の広範な範囲で存在させることができる。
含有させる際、洗剤には、典型的には、約１％〜約４０％でアニオン性界面活性剤、例えば、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪族アルコール硫酸塩）、アルコールエトキシ硫酸塩、第二級アルカンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニルコハク酸、又は石鹸などが含有される。
含有させる際、洗剤には、通常、約０．２％〜約４０％で非イオン性界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシル−Ｎ−アルキル誘導体（「グルカミド」）が含有される。
洗剤は、０％〜約６５％洗剤ビルダー、又は錯化剤、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル−又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例えば、ＨｏｅｃｈｓｔのＳＫＳ−６）を含有してもよい。
洗剤は、１種類以上のポリマーを含んでいてもよい。例示的なポリマーとしては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー類）、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー類が挙げられる。
洗剤組成物の酵素（１種又は複数種）は、従来の安定化剤、例えば、ポリオール（例えば、プロピレングリコール又はグリセロール）、糖若しくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸若しくはホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステル）、又はフェニルボロン酸誘導体（例えば、４−ホルミルフェニルボロン酸）を使用し安定化することもできる。組成物は、国際公開第９２／１９７０９号及び国際公開第９２／１９７０８号に記載の通りに配合することができる。
洗剤組成物には、特に酵素変異体を、洗浄液１Ｌ当たり酵素タンパク質約０．０１〜約１００ｍｇに相当する量で加えることができるものと想到される（例えば、洗浄液１Ｌ当たり約０．０５〜約５．０ｍｇの酵素タンパク質、又は洗浄液１Ｌ当たり０．１〜約１．０ｍｇの酵素タンパク質）。
本発明の組成物及び方法は以下の詳細を参照して記載されているものの、多様な変更をなすことができることを理解されたい。
７．６．洗剤組成物中のアミラーゼ活性を評価する方法
布片及び微小布片アッセイを含む、数多くのα−アミラーゼ洗浄アッセイが当該技術分野において既知である。添付の実施例は、このようなアッセイをいくつかのみ記載する。
本組成物及び方法、並びにそれらの利点を更に例示するために、後述の具体的な実施例が、これらの実施例が限定的なものではなく例示的なものであるとの理解の下に提供される。
８．醸造組成物
ＴｅＡｍｙ１又はその変異体は、醸造物などの発酵飲料を提供するプロセスにおいて使用される醸造組成物の成分であってもよい。非発酵性炭水化物は、最終的なビール中に溶解している固体の大部分を占めると考えられる。この残留物は、デンプンのα−１，６結合を加水分解する麦芽アミラーゼが作用しないために残留する。非発酵性炭水化物は、ビール１２オンス（約３４０グラム）当たり約５０カロリーをもたらす。通常、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を、グルコアミラーゼ、並びに任意選択で、プルラナーゼ、及び／又はイソアミラーゼと組み合わせることで、デンプンのデキストリン及び発酵性の糖への変換が補助され、最終的なビール中の残余非発酵性炭水化物が減少する。
これらの飲料の製造に使用される主要な原材料は、水、ホップ、及び麦芽である。加えて、限定するものではないが、一般的なコーングリッツ、精製コーングリッツ、醸造者により粉砕された酵母、米、ソルガム、精製コーンデンプン、大麦、大麦デンプン、脱穀された大麦、小麦、小麦デンプン、炒って加熱処理された穀草、穀草フレーク、ライ麦、オーツ麦、ジャガイモ、タピオカ、及びシロップ、例えばトウモロコシシロップ、サトウキビシロップ、反転型糖シロップ、大麦及び／又は小麦シロップ、及び同様物、などの添加剤をデンプン源として使用することもできる。
数多くの理由により、選別された大麦品種から主として生産される麦芽は、ビールの最終的な特徴及び品質に重要な影響を与える。第１に、麦芽はビールにおける主要な矯味矯臭剤である。第２に、麦芽は発酵性糖の大部分を提供する。第３に、麦芽はビールのボディ及び泡の特徴に関係するタンパク質を提供する。第４に、麦芽はマッシュ中に必要な酵素活性を提供する。ホップもまたビールの芳香を含む品質の大部分に関係する。具体的には、ホップ（又はホップ構成成分）は、好ましい苦味物質をビールに加える。加えて、ホップはタンパク質沈殿剤として作用し、防腐剤となり、泡の形成及び安定化を補助し得る。
工業醸造のため、及び家庭内醸造のための両方の醸造に関し、大麦、オーツ麦、小麦などの穀草（穀物）だけでなく、多くの場合、トウモロコシ及び米もまた使用され、その他の植物成分、多くの場合はホップなどもまた加えられる。醸造に使用される成分は、麦芽生成されていなくてもよく、あるいは麦芽生成されていてよく、即ち、部分的に発芽させ、結果として、α−アミラーゼを含む酵素濃度を上昇させることもできる。首尾よく醸造するため、発酵に適切な濃度の糖を保証するため、α−アミラーゼ酵素の活性レベルは適切である必要がある。したがって、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体単独で、又は他の１種類若しくは複数種類のα−アミラーゼと組み合わせて、醸造で使用される成分に添加してよい。
本明細書で使用するとき、用語「ストック」は、圧搾又は破壊された穀物及び植物成分を意味する。例えば、ビールの生産に使用される大麦は、発酵用マッシュの生成に適切な稠度を得るため、粗く磨砕又は破砕した穀粒である。本明細書で使用するとき、用語「ストック」は、破砕又は粗く磨砕された形態の、前述の任意の種類の植物又は穀物を含む。本明細書に記載の方法を使用して、穀粉及びストックの両方におけるα−アミラーゼ活性のレベルを判定することもできる。
ビールの製造プロセスは当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｋｕｎｚｅ（２００４）「Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｒｅｗｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｌｔｉｎｇ，」Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅａｃｈｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（ＶＬＢ），３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎを参照されたい。簡潔に述べると、プロセスは、（ａ）マッシュを調製すること、（ｂ）マッシュを濾過して、糖化液を調製すること、及び（ｃ）糖化液を発酵させて、ビールなどの発酵飲料を得ること、を包含する。典型的には、粉砕若しくは破砕麦芽、麦芽及び添加剤、又は添加剤を水と混合し、調節温度下で一定時間保持して、麦芽中に存在する酵素及び／又は添加剤に、麦芽中に存在するデンプンを発酵性糖類に変換させる。次にマッシュをマッシュフィルタに移し、穀物残渣から液体を分離する。この甘みのある液体を「糖化液」と呼び、後に残った穀物残渣を「粕」と呼ぶ。マッシュは、典型的には抽出され、抽出は、残留可溶性抽出物を粕から回収する目的で水をマッシュに加えることを伴う。次に糖化液を激しく沸騰させて糖化液を滅菌し、色、香り及び匂いの展開を補助する。沸騰中のどこかの時点でホップを加える。糖化液を冷却し、発酵槽に移す。
次に、発酵槽内で糖化液を酵母と接触させる。発酵槽を冷却し、発酵を停止させてもよい。凝集し得る酵母は除去する。最後に、ビールを冷却し、ビールを清澄化させ芳香を展開させる間に一定時間貯蔵し、ビールの見た目、芳香及び貯蔵寿命を損なうなんらかの物質を沈降させる。ビールは、通常、約２％〜約１０％ ｖ／ｖのアルコールを含有するものの、高アルコール含量、例えば、１８％ ｖ／ｖを得ることもできる。充填前、ビールには炭酸を加え、所望により、濾過及び低温殺菌する。
多くの場合、但し必須ではないものの、ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体と組み合わせて１種以上のグルコアミラーゼ（１種以上）、プルラナーゼ（１種以上）、及び／又はイソアミラーゼ（１種以上）、並びにこれらの任意の組み合わせなどの外来性酵素を含む、醸造組成物を、上記工程（ａ）のマッシュに（マッシュの調製中などに）加えることができる。あるいは、又は加えて、醸造組成物を上記工程（ｂ）のマッシュに、即ち、マッシュの濾過中に加えることもできる。あるいは、又は加えて、醸造組成物を、上記工程（ｃ）の糖化液に（糖化液の発酵中などに）、加えることもできる。
本発明の一態様は、ビールなどの発酵飲料の生産における、本発明によるＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体の使用に関する。
別の態様は、マッシュ及び／又は糖化液をＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体と接触させる工程を含む、発酵飲料を提供する方法に関する。
更なる態様は、発酵飲料を提供する方法であって、（ａ）マッシュを調製する工程、（ｂ）マッシュを濾過して、糖化液を得る工程、及び（ｃ）糖化液を発酵させてビールなどの発酵飲料を得る工程、を含む方法に関し、ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体は、（ｉ）工程（ａ）のマッシュ、及び／又は（ｉｉ）工程（ｂ）の糖化液、及び／又は（ｉｉｉ）工程（ｃ）の糖化液に加えられる。
更に別の態様によると、（１）マッシュ及び／又は糖化液をＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体と接触させる工程、及び／又は（２）（ａ）マッシュを調製する工程、（ｂ）マッシュを濾過して、糖化液を得る工程、及び（ｃ）糖化液を発酵させてビールなどの発酵飲料を得る工程、を含む方法により、ビールなどの発酵飲料が生産又は提供され、ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体が、（ｉ）工程（ａ）のマッシュ、及び／又は（ｉｉ）工程（ｂ）の糖化液、及び／又は（ｉｉｉ）工程（ｃ）の糖化液に加えられる。
個々の実施形態は、上記の任意の使用、方法、又は発酵飲料に関係し、発酵飲料は、麦芽のみのビール（full malted beer）、「ビール純粋令」下で醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニア・ビール、ライト・ビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボック・ビール、スタウト、モルト・リカー、ノンアルコールビール、及びノンアルコールモルト・リカーなどのビールだけでなく、別の穀草及び麦芽飲料、例えば、果実フレーバーの麦芽飲料（例えば、レモン、オレンジ、ライムなどのシトラスフレーバー、若しくはベリーフレーバーの麦芽飲料）、蒸留酒フレーバーの麦芽飲料（例えば、ウォッカ、ラム、又はテキーラフレーバーのモルト・リカー）、又はコーヒーフレーバーの麦芽飲料（カフェインフレーバーのモルト・リカーなど）、及び同様物などである。
９．ヨウ素陽性デンプンの減少
ＴｅＡｍｙ１及びその変異体は、液化、及び／又は糖化方法において使用されたとき、ヨウ素陽性デンプン（ＩＰＳ）を減少させ得る。ＩＰＳの供給源の１つは、加水分解を逃れたアミロースに由来し、及び／又はデンプンポリマーの老化に由来する。デンプン分子には、別の分子に結合し、結晶化度を増加させる傾向があるため、時間経過と共に、デンプンの老化はデンプンペースト、又はジェルにおいて自然に生じる。低濃度の溶液は、デンプン分子が積極的により大きな物体へと会合するため、濁度が増加する。沈澱が自然発生した場合、沈殿したデンプンは、その元来の冷水不溶性の状態を取り戻しているように思われる。高濃度のペーストは、冷却によりジェルに変化し、時間経過と共に、デンプン分子の会合が増加することにより着実に堅固さを増す。これは、近接するデンプン分子上のヒドロキシ基間に水素結合が形成される傾向が強くあることから生じる。ｊ．Ａ．ｒａｄｌｅｙ，ｅｄ．，ＳＴＡＲＣＨ ＡＮＤ ＩＴＳ ＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥＳ １９４〜２０１（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９６８））を参照されたい。
糖液中にＩＰＳが存在すると、最終生成物の品質に悪影響が生じ、下流の加工で重要な問題となる。ＩＰＳは濾過系に詰まり又は減速させ、精製に使用される炭素カラムを塞ぐ。ＩＰＳが十分な高濃度に達すると、ＩＰＳは炭素カラムを通過して漏れだし、生産効率を低下させる。加えて貯蔵時に、最終生成物に、最終生成物の品質に望ましくない濁りを生じさせる恐れがある。ＩＰＳの量は、糖化槽を隔離し、内容物を戻し混合することにより減少させることができる。それでも尚、ＩＰＳは、とりわけ炭素カラム及び濾過系に蓄積する。したがって、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体の使用は、ＩＰＳの量を減少させることによりプロセスの性能を全体として改良するものと見込まれる。
実施例１：ＴｅＡｍｙ１のクローニング
タラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）株ＡＴＣＣ１６４７９のゲノムＤＮＡは、ＢＬＡＳＴ検索により決定される通りにその他の真菌α−アミラーゼと相同性を有するグリコシル加水分解酵素をコードする。図１を参照されたい。８個のイントロンを含むＴｅＡｍｙ１遺伝子のヌクレオチド配列を、次の配列番号２に示す。イントロン配列は小文字とし、かつイタリック体とした。
Figure 2016501512
ＴｅＡｍｙ１遺伝子は、次のプライマー：プライマー１（Ｎｏｔ Ｉ）５’−ｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃａｃｃＡＴＧＡＣＧＣＣＴＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣ−３’（配列番号１３）、及びプライマー２（Ａｓｃ Ｉ）５’−ｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃｃｔｔａＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＴＣＧＡＣＡＡＴ−３’（配列番号１４）を使用して、タラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）のゲノムＤＮＡから増幅した。Ｎｏｔ Ｉ及びＡｓｃ Ｉによる消化後、ＰＣＲ産物を、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクター（米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９７（Ａ１）号に記載）にクローン化し、同様の制限酵素により消化し、ｐＺＺＨ４２６と標識した。ｐＺＺＨ４２６のプラスミドマップは、図２に提供される。ＴｅＡｍｙ１遺伝子の配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
実施例２：ＴｅＡｍｙ１の発現及び精製
遺伝子銃法（Ｔｅ’ｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５１：３９３〜９９）を使用して、プラスミドｐＺＺＨ４２６を、４つの遺伝子を欠失させたトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）株（国際公開第０５／００１０３６号に記載）に形質転換させた。このタンパク質を、細胞外培地へと分泌させ、酵素の発現を確認するために、濾過した培養培地を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びα−アミラーゼ活性アッセイを行った。
ＣＢＭ２０ドメインの利点を利用し、β−シクロデキストリン（ｂＣＤ）をカップリングしたセファロース６Ｂクロマトグラフィーを使用して、ＴｅＡｍｙ１を精製した。振盪フラスコから約７００ｍＬブロスを取り、ｐＨ ４．３に調整し、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ ４．３）（緩衝液Ａ）により予め平衡化した１０ｍＬ ｂＣＤ−セファロースカラムに装填した。サンプルの装填後、カラムはカラムの２倍量の同一の緩衝液により洗浄した。カラムの２倍量の緩衝液Ａ／１０ｍＭ α−シクロデキストリン（緩衝液Ｂ）により標的タンパク質を溶出した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、α−アミラーゼ活性についてアッセイした。標的タンパク質を含有する画分をプールし、脱塩してα−シクロデキストリンを除去した。サンプルの純度は９５％超であった。このサンプルを、１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５装置で濃縮後、４０％グリセロールに入れ、−８０℃で保存した。
実施例３：ＴｅＡｍｙ１α−アミラーゼ活性の測定
α−アミラーゼ活性を、ジャガイモアミロペクチン基質からの還元糖の放出に基づいてアッセイした。ＰＡＨＢＡＨアッセイによる比色測定で還元糖の生成をモニターした。活性数は、１分間当たりのグルコース放出当量として記録する。
５０ｇの水／０．００５％ Ｔｗｅｅｎ中に、全部で１．２５ｇ ｄｓの２．５％のジャガイモアミロペクチン（ＡＰ、Ｆｌｕｋａカタログ番号１０１１８）基質を調製し、続いてマイクロ波を用いて１５秒間隔で１分間加熱し、撹拌した。０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．８）５ｍＬ、１Ｍ ＮａＣｌ ２．５ｍＬ、０．５Ｍ ＣａＣｌ２ ０．２ｍＬ、及び水／Ｔｗｅｅｎ（１６７ｍＭ酢酸ナトリウム、１６７ｍＭ ＮａＣｌ、６．６７ｍＭ ＣａＣｌ２）７．３ｍＬを混合することにより緩衝液カクテルを調製した。
精製酵素を水／Ｔｗｅｅｎにより０．４ｍｇ／ｍＬ（４００ｐｐｍ）に希釈し原液とした。非結合性マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６４１）の第１列において、１９５μＬの水を添加し、残りのウェルの全てに、１００μＬの水／Ｔｗｅｅｎを入れた。４００ｐｐｍ酵素５μＬを第１列に加え、ウェル中酵素濃度を１０ｐｐｍとし、反応中の最終酵素濃度を２ｐｐｍとした。７つめのウェルを通して２倍連続希釈を実施し（４０μＬ＋４０μＬ）、８つめのウェルは酵素不含有のブランクとして残した。自動ピペットを使用し、緩衝液カクテル１５μＬと、その次にアミロペクチン２５μＬをＰＣＲプレートに分注した。酵素希釈系列１０μＬをＰＣＲプレートに分注し、ボルテックスミキサーにより手早く混合し、加熱蓋（８０℃）を乗せて５０℃のＰＣＲヒートブロックにより１０分間インキュベートを行い、反応を開始した。正確に１０分後、２０μＬの０．５Ｎ ＮａＯＨをプレートに添加し、続いてボルテックス処理して反応を終了させた。
チューブ内に存在する総還元糖をＰＡＨＢＡＨ法によりアッセイした：０．５Ｎ ＮａＯＨ ８０μＬをＰＣＲマイクロチューブプレートに分注した後、ＰＡＨＢＡＨ試薬（０．５Ｎ ＨＣｌ中５％ ｗ／ｖの４−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）２０μＬを分注した。マルチチャンネルピペットを使用して、各列に、反応を終了させたサンプル１０μＬを加え、ピペッティングを行い簡単に上下に混合した。装填したプレートを錫箔で密閉し、９５℃で２分間インキュベートした。反応展開液８０μＬをポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ９０１７）に移し入れ、４１０ｎｍでＯＤを測定した。得られるＯＤ値を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用し酵素濃度に対しプロットした。線形回帰を使用してプロットの線状部分のスロープを求めた。アミラーゼ活性は、式１を使用して定量化した：
比活性（Ｕｎｉｔ／ｍｇ）＝スロープ（酵素）／スロープ（ｓｔｄ）×１００ （１）、
式中、１Ｕｎｉｔ＝１μｍｏｌグルコース当量／分
ＴｅＡｍｙ１及び基準アミラーゼＡｋＡＡの代表的な比活性を表１に示す。
Figure 2016501512
実施例４：ＴｅＡｍｙ１ α−アミラーゼ活性へのｐＨの影響
ＴｅＡｍｙ１アミラーゼ活性へのｐＨの影響を、３．０〜１０．０のｐＨ範囲において、実施例３に記載されたα−アミラーゼ・アッセイ・プロトコールを使用して、モニタリングした。１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ストック（ｐＨ ３．０〜６．０）、１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液ストック（ｐＨ ６．０〜ｐＨ ９．０）、及び１Ｍ ＣＡＰＳ緩衝液ストック（ｐＨ １０．０）として緩衝液ストックを調製した。作業用緩衝液は、最終的な酵素反応混合物が、５０ｍＭの各緩衝液とＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２を含有するように、各半ｐＨ単位毎に、２．５ｍＬの１Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ ３．５〜６．５）又は１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７〜９）を、２．５ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌ及び５０μＬの２Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＬの水／Ｔｗｅｅｎと共に、含有する（１６７ｍＭの各緩衝液、及びＮａＣｌ、６．６７ｍＭのＣａＣｌ２）。
ＰＡＨＢＡＨアッセイの線形範囲の濃度で水／０．００５％ Ｔｗｅｅｎにより酵素ストックを調製した。自動ピペットを使用して、作業用緩衝液（酢酸ナトリウムを使用してｐＨ ３．５〜７．０、ＨＥＰＥＳを使用してｐＨ ６．０〜９．０）１５μＬ、続いてアミロペクチン２５μＬをＰＣＲプレートに分注した。酢酸ナトリウム及びＨＥＰＥＳ緩衝液をｐＨ値６．０、６．５、及び７．０で別個に使用して、酵素活性に対し緩衝液による影響がないことを確認した。酵素ストック１０μＬをＰＣＲプレートに分注し、ボルテックスミキサーにより手早く混合し、加熱蓋（８０℃）を乗せて５０℃のＰＣＲヒートブロックにより１０分インキュベートを行い、反応を開始した。反応を３回再現して実施した。異なるｐＨ緩衝液のみを使用したブランクサンプルが包まれた。正確に１０分後、０．５Ｎ ＮａＯＨ ２０μＬをプレートに加え、ボルテックス処理して反応を終了させた。上記のＰＡＨＢＡＨ法により、ウェル中に存在する総還元糖をアッセイした。最適ｐＨを１００％活性と定義し、得られるＯＤ値を相対活性率（％）に変換した。ｐＨの関数としてプロットされたパーセント相対活性が、図３Ａ（基準ＡｋＡＡ）及び図３Ｂ（ＴｅＡｍｙ１）に示されている。加水分解を５０℃にて測定した場合の、最適ｐＨ及び最大活性の＞７０％でのｐＨ範囲を、表２に掲載する。
Figure 2016501512
実施例５：ＴｅＡｍｙ１ α−アミラーゼ活性への温度の影響
温度範囲３０℃〜９５℃で実施例４に記載の通りのα−アミラーゼアッセイプロトコルを使用し、真菌α−アミラーゼ活性をモニターした。各酵素の最適ｐＨの緩衝液ストックは、最終反応混合物が、５０ｍＭの各緩衝液及びＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２を含有するように、２．５ｍＬの１Ｍ緩衝液（酵素の最適ｐＨに応じて、酢酸ナトリウム又はＨＥＰＥＳ）、２．５ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌ及び５０μＬの２Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＬの水／Ｔｗｅｅｎ（１６７ｍＭの各緩衝液とＮａＣｌ、６．６７ｍＭのＣａＣｌ２）として調製する。
上記の通り酵素ストックを調製した。自動ピペットを使用して、緩衝液ストック１５μＬ（所定の最適ｐＨ）、続いてアミロペクチン２５μＬをＰＣＲプレートに分注した。酵素１０μＬをＰＣＲプレートに分注し、ボルテックスミキサーで手早く混合し、インキュベート温度以上に加熱した蓋を乗せ３０〜９５℃（５〜１０℃毎）ＰＣＲヒートブロックで１０分間インキュベートを行い、反応を開始した。反応を３回再現して実施した。異なるｐＨ緩衝液のみを使用したブランクサンプルが包まれた。正確に１０分後、０．５Ｎ ＮａＯＨ ２０μＬをプレートに加え、ボルテックス処理して反応を終了させた。チューブ中に存在する総還元糖を上記のＰＡＨＢＡＨ法によりアッセイした。最適温度を１００％活性と定義し、得られるＯＤ値を相対活性率（％）に変換した。真菌α−アミラーゼの温度プロファイルを図４Ａ（ＡｋＡＡ基準）及び図４Ｂ（ＴｅＡｍｙ１）に示す。開示された酵素の最適ｐＨにて測定したときの、最適温度、及び最大活性の＞７０％での温度範囲を、表３に掲載する。
Figure 2016501512
実施例６：ＴｅＡｍｙ１生成物プロファイル分析
多糖類に対する真菌α−アミラーゼの触媒作用による生成物をアッセイするために、アミラーゼを３種の異なる基質、ＤＰ７、アミロペクチン、及び液状マルトデキストリンＤＥ１０について、５０℃、ｐＨ ５．３にて２時間インキュベートした。酵素により放出されるオリゴ糖類をＨＰＬＣにより分析した。
５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．３）に最終濃度１０ｐｐｍのアミラーゼ及び０．５％（ｗ／ｖ）基質を入れ、５０℃で１２０分間インキュベートした。次に同量のエタノールを加えて反応を停止させ、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を、ＭｉｌｌｉＱ水を使用して１０倍に希釈し、１０μＬを、屈折率検出器を備えたＨＰＬＣカラムＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−４２Ａ、３００ｍｍ×７．８ｍｍに装填した。移動相はミリＱ水とし、流量は８５℃にて０．６ｍＬ／分とした。
表４は、様々な基質に対してＴｅＡｍｙ１及びＡｋＡＡ基準によって糖化されたオリゴ糖のプロファイルを示す。ＤＰ１〜ＤＰ７を有するオリゴ糖類のみを示す。表中の数字は、ＤＰ１〜ＤＰ７の合計に対する割合として各ＤＰｎの重量パーセントを反映する。ＴｅＡｍｙ１は、試験した全ての基質に関し、主要な生成物として主にＤＰ２を生成した。ＴｅＡｍｙ１は、ＤＰ１〜ＤＰ７を合わせた量に対して、少なくとも５５％ ｗ／ｗのＤＰ２を含有する糖組成物を生成した。それに対し、ＡｋＡＡはＤＰ１からＤＰ４へと、より均一に分布する、生成物プロファイルを生成した。
Figure 2016501512
実施例７：ＳＳＦエタノール発酵
ＴｅＡｍｙ１のエタノール生産能をＳＳＦで試験した。結果により、ＴｅＡｍｙ１は、より少ない投入量でＡｋＡＡと同程度の効果を達成することができることが見て取れる（図５〜６）。
以下に記載の手順によりＦＰＬＣ（米国特許第８，０５８，０３３（Ｂ２）号，Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．を参照されたい）を使用して測定したときに少なくとも１．１５のＤＰ７性能指数を有するトリコデルマ（trichoderma）グルコアミラーゼ変異体の存在下で、ｐＨ ４．８で、ＡｋＡＡ又はＴｅＡｍｙ１によりＳＳＦを実施した。ＨＰＬＣを用い、ＳＳＦ中の様々な時点の（ｉ）エタノール収率、（２）ＤＰ３＋還元、及び（３）ＤＰ２生成についてサンプルを分析した。最大空隙容量の一部として、ＤＰ３＋濃度をモニターした。この濃度の低下は、一般的に液化糖化効率を反映するものと解釈される。
液化調製：凍結液化（３０％乾燥固体）を４℃で一晩インキュベートした後、完全に解凍されるまで７０℃の水浴に置いた（１〜３時間）。液化温度を３２℃に調整した。液化を計量し、６００ｐｐｍになるよう固体尿素を加えた。液化ｐＨは６Ｎ硫酸又は２８％水酸化アンモニウムを使用して調整した。
発酵：ＥＴＨＡＮＯＬ ＲＥＤ（登録商標）（ＬｅＳａｆｆｒｅ）酵母を使用して、グルコースをエタノールへ変換した。乾燥酵母を液化バッチに０．１％ ｗ／ｗになるように加え、組成物をよく混合し、室温で３０分間インキュベートした。別個にラベルを付けた１５０ｍＬ三角フラスコに１００ｇ＋／−０．２ｇ液化（３２％乾燥固体）を計量した。投入量を０．３２５ＧＡＵ／ｇ（固体）、０．２２７５ＧＡＵ／ｇ（固体）、及び０．１６２５ＧＡＵ／ｇ（固体）と変えて、各フラスコにグルコアミラーゼを加えた。最高投入量を２０μｇタンパク質／ｇ（固体）（１００％投入量）とし、投入量を変えて各フラスコにＡｋＡＡ又はＴｅＡｍｙ１ α−アミラーゼを加えた。２００ｒｐｍで混合しながら、混合物を、ｐＨ ４．８にて３２℃で約７０時間にわたって強制対流式インキュベータ内でインキュベートした。およそｔ＝０、３、１９、２７、４３、５２、及び／又は７０時間の時点でＥＯＦトウモロコシスラリーサンプル約１ｍＬを回収し、凍結保存した。エタノール収率及びＤＰ３＋減少度、及びＤＰ２収率についてＥＯＦサンプルをアッセイした。
エタノール収率及びＤＰ３＋減少度を測定するため、各時点のサンプルを４℃で解凍し、１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。個々の微量遠心チューブ内でサンプル上清１００μＬを１．１Ｎ硫酸１０μＬと混合し、室温で５分間インキュベートした。各チューブに１ｍＬの水を加え、チューブを１５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。２００μＬを、ＨＰＬＣプレートに濾過した。このプレートを、Ｒｅｚｅｘ Ｆａｓｔ Ｆｒｕｉｔ ＲＦＱカラムを使用したＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣにて、８分間の溶出で、分析した。上記した成分の較正曲線は、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｆｕｅｌ Ｅｔｈａｎｏｌ（Ｓｉｇｍａカタログ４８４６８−Ｕ）を使用して作成した。ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３＋、グリセロール、酢酸、乳酸、及びエタノールの濃度（ｇ／Ｌ）を求めた。エタノールの生成量は、反応混合物のパーセントｖ／ｖに変換した。
図５Ａ〜Ｃに示す通り、ＴｅＡｍｙ１及びＡｋＡＡを同一濃度（２０μｇタンパク質／ｇ固体）で投入したところ、ＴｅＡｍｙ１とグルコアミラーゼとにより得られたエタノール生成速度は、ＡｋＡＡとグルコアミラーゼとにより得られたものと同程度であった。いずれも、２０時間経過付近で約８％ ｖ／ｖエタノールを達成した（図５Ａ）。７０時間の時点で、対照及びＴｅＡｍｙ１（α−アミラーゼ）のエタノール収率は約１２％ ｖ／ｖであった（図５Ａ）。ＤＰ３＋加水分解速度についても同様の結果が得られた（図５Ｂ）。実際のところ、最初の１５時間以内では、ＴｅＡｍｙ１によるＤＰ３＋加水分解では、ＤＰ３＋濃度はわずかに低かった。加えて、最初の２０時間以内では、ＴｅＡｍｙ１によるＤＰ２収率は、より効率的であり、１０時間経過付近では約４％ ｗ／ｖに達した（図５Ｃ）。約３０時間後、ＡｋＡＡ及びＴｅＡｍｙ１で同様のＤＰ２濃度が観察された（図５Ｃ）。
図６Ａ〜Ｂに示す通り、ＴｅＡｍｙ１は濃度を減じて投入したところ（ＡｋＡＡの投入量の５０％又は１７％）、エタノール生成及びＤＰ３＋加水分解速度は、ＴｅＡｍｙ１とＡｋＡＡ（１００％投入量）とで同程度であった。例えば、１７％及び５０％ ＴｅＡｍｙ１では、いずれも約７０時間の時点で約１２％ ｖ／ｖエタノールが得られ、かつ最初の２７時間以内のエタノール生成速度はほぼ同一であった（図６Ａ）。同様にして、ＴｅＡｍｙ１（ＡｋＡＡの投入量の５０％又は１７％）の投入量を減じた場合のＤＰ３＋加水分解は、最終ＤＰ３＋濃度及びＤＰ３＋減少速度に関しＡｋＡＡ（１００％投入量）と同程度であった（図６Ｂ）。ＤＰ２収率に関しては、５０％投入量のＴｅＡｍｙ１で、ＡｋＡＡ（１００％投入量）と同程度のＤＰ２生成が認められた（図６Ｃ）。ＡｋＡＡを、１００％投入量から５０％及び１７％投入量に減じた場合、エタノール生成、ＤＰ２形成、及びＤＰ３＋加水分解速度は著しく低下し、最終エタノール量は１００％投入量のＡｋＡＡよりも少なかった（データ非掲載）。
これらの結果から、ＴｅＡｍｙ１は（１）ＡｋＡＡと比較して最大で６倍も高効率にエタノールを生成し、ＤＰ３＋を加水分解すること、及び（２）ＡｋＡＡと比較して少なくとも２倍以上効率的にＤＰ２を生成することが示される。したがって、ＴｅＡｍｙ１は、ＡｋＡＡと比較して少ない投入量（約１７％又は５０％）で使用しても同程度の結果を得ることができる。
配列表
配列番号１
野生型成熟ＴｅＡｍｙ１のタンパク質配列：
Figure 2016501512
配列番号２
ＴｅＡｍｙ１遺伝子のヌクレオチド配列：
Figure 2016501512
配列番号３
天然型ＴｅＡｍｙ１シグナルペプチドのアミノ酸配列：
ＭＴＰＦＶＬＴＡＶＬＦＬＬＧＮＡＶＬＡ
配列番号４
＞ｇｉ｜７０９８８７０３｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿７４９２０８．１｜α−アミラーゼ［アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）Ａｆ２９３］
Figure 2016501512
配列番号５
＞ｇｉ｜１５９１２８６２２｜ｇｂ｜ＥＤＰ５３７３６．１｜α−アミラーゼ、推定［アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）Ａ１１６３］
Figure 2016501512
配列番号６
＞ｇｉ｜１１９４９７７４１｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００１２６５６２８．１｜α−アミラーゼ、推定［ネオサルトリア・フィシェリ（Neosartorya fischeri）ＮＲＲＬ １８１］
Figure 2016501512
配列番号７
＞ｇｉ｜１１５３８５７１７｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００１２０９４０５．１｜α−アミラーゼ前駆体［アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）ＮＩＨ２６２４］
Figure 2016501512
配列番号８
＞ｇｉ｜２５７０１５０｜ｄｂｊ｜ＢＡＡ２２９９３．１｜酸安定性α−アミラーゼ［アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）］
Figure 2016501512
配列番号９
＞ｇｉ｜４０３１３２７８｜ｄｂｊ｜ＢＡＤ０６００３．１｜α−アミラーゼ［アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）］
Figure 2016501512
配列番号１０
ＴｅＡｍｙ１の推定炭水化物結合ドメイン
ＡＣＴＴＡＴＡＶＡＶＬＦＥＥＬＶＴＴＴＹＧＥＮＶＹＬＳＧＳＩＳＱＬＧＤＷＮＴＤＤＡＶＡＬＳＡＡＮＹＴＳＳＮＰＬＷＹＶＴＶＴＬＰＶＧＴＳＦＥＹＫＦＩＫＫＥＥＮＧＤＶＥＷＥＳＤＰＮＲＳＹＴＶＰＴＡＣＴＧＡＴＥＴＩＶＤＴＷＲ
配列番号１１
ＴｅＡｍｙ１の推定リンカー（リンカー領域）
ＳＳＰＳＰＴＴＴＴＳＴＳＴＳＴＴＳＴ
配列番号１２
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のα−アミラーゼ（タンパク質データベースエントリー２ＧＵＹ｜Ａ）
Figure 2016501512
配列番号１３
プライマー１
５’−ｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃａｃｃＡＴＧＡＣＧＣＣＴＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣ−３’
配列番号１４
プライマー２
５’−ｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃｃｔｔａＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＴＣＧＡＣＡＡＴ−３’

Claims (107)

  1. （ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、タラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）由来の単離α−アミラーゼ又はそれらの変異体であって、前記変異体はα−アミラーゼ活性を有する、単離α−アミラーゼ。
  2. 前記ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のα−アミラーゼ変異体。
  3. 前記ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６を含む、請求項１又は２に記載のα−アミラーゼ変異体。
  4. 前記ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載のα−アミラーゼ変異体。
  5. 前記ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６からなる、請求項４に記載のα−アミラーゼ変異体。
  6. デンプンを含む組成物を糖化して、グルコースを含む組成物を生成する方法であって、
    （ｉ）前記デンプンを含む組成物を、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体と接触させる工程と、
    （ｉｉ）前記デンプンを含む組成物を糖化して、グルコースを含む前記組成物を生成する工程と、を含み、前記単離ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体が、前記デンプン組成物のグルコースへの糖化を触媒する、方法。
  7. 同一条件下で同量のＤＰ３＋を減少させるために、前記ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体を、ＡｋＡＡ投入量の約１７％〜５０％にて投入する、請求項６に記載の方法。
  8. 同一条件下で同量のＤＰ３＋を減少させるために、前記ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体を、ＡｋＡＡ投入量の約１７％〜３４％にて投入する、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 全ＤＰ１〜ＤＰ７の重量％として測定したとき、同一条件下でＡｋＡＡにより生成されたグルコースを含む第２の組成物と比較して、前記グルコースを含む組成物のＤＰ２又は（ＤＰ１＋ＤＰ２）が富化されている、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. ＤＰ２が、約２時間で２〜３倍に富化される、請求項９に記載の方法。
  11. （ＤＰ１＋ＤＰ２）が、約２時間で約１．９倍に富化される、請求項９に記載の方法。
  12. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６からなる、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記デンプンを含む組成物が、液化デンプン、糊化デンプン、又は粒状デンプンを含む、請求項６〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 約３０℃〜約７５℃の温度範囲にて糖化が行われる、請求項６〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記温度範囲が５５℃〜７４℃である、請求項１７に記載の方法。
  19. 糖化がｐＨ ２．０〜ｐＨ ７．５のｐＨ範囲にわたって行われる、請求項６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ｐＨ範囲がｐＨ ３．０〜ｐＨ ５．８である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ｐＨ範囲がｐＨ ３．５〜ｐＨ ４．５である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記グルコース組成物を発酵させて、最終発酵（ＥＯＦ）産物を生成することを更に含む、請求項６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記発酵が同時糖化発酵（ＳＳＦ）反応である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記発酵が、ｐＨ ２〜８、かつ２５℃〜７０℃の温度範囲にて４８〜７０時間実施される、請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. 前記ＥＯＦ産物がエタノールを含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ＥＯＦ産物が８％〜１８％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. ビールなどの発酵飲料を提供する方法であって、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法を任意に含み、前記方法が、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体の使用を含む、方法。
  28. 前記方法が、
    （ａ）マッシュを調製する工程と、
    （ｂ）前記マッシュを濾過して、糖化液を得る工程と、
    （ｃ）前記糖化液を発酵させて、ビールなどの発酵飲料を得る工程と、を更に含み、
    ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体が、
    （ｉ）工程（ａ）の前記マッシュ、及び／又は、
    （ｉｉ）工程（ｂ）の前記糖化液、及び／又は、
    （ｉｉｉ）工程（ｃ）の前記糖化液、に加えられる、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ＥＯＦ産物が代謝産物を含む、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記代謝産物が、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタラクトン、エリソルビン酸ナトリウム、オメガ３脂肪酸、ブタノール、アミノ酸、リジン、イタコン酸、１，３−プロパンジオール、イソプレン、又はバイオディーゼルである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記デンプン組成物に、グルコアミラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、β−アミラーゼ、ＴｅＡｍｙ１ではないα−アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、転移酵素、ペクチナーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、リアーゼ、トレハラーゼ、分岐酵素、加水分解酵素又はこれらの組み合わせを加える工程を更に含む、請求項６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記グルコアミラーゼが０．１〜２グルコアミラーゼ単位（ＧＡＵ）／ｇ ｄｓで添加される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が宿主細胞によって発現され、分泌される、請求項６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記デンプンを含む組成物を前記宿主細胞と接触させる、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記宿主細胞が、更にグルコアミラーゼを発現し、かつ該グルコアミラーゼを分泌する、請求項３３又は３４に記載の方法。
  36. 前記宿主細胞は前記グルコース組成物の発酵が可能である、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 請求項６に記載の方法により生成されたグルコースを含む組成物。
  38. 請求項６に記載の方法により生成された液化デンプン。
  39. 請求項２２〜３６のいずれか一項に記載の方法により生産された、ビールなどの発酵飲料。
  40. デンプンを含む組成物の糖化に使用するための組成物であって、α−アミラーゼ活性を有し、かつ（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含む、組成物。
  41. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６を含む、請求項４０又は４１に記載の組成物。
  43. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項４０又は４１に記載の組成物。
  44. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６からなる、請求項４３に記載の組成物。
  45. 前記組成物が培養された細胞材料である、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
  46. 前記組成物がグルコアミラーゼを更に含む、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の組成物。
  47. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が精製される、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の組成物。
  48. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、宿主細胞によって発現され、分泌される、請求項４０〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
  49. 前記宿主細胞が糸状菌細胞である、請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記宿主細胞が、アスペルギルス種（Aspergillus sp.）又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞である、請求項４９に記載の組成物。
  51. グルコースを含む組成物の前記生成における、請求項１〜５０のいずれか一項に記載のＴｅＡｍｙ１又はその変異体の使用。
  52. 液化デンプンの前記生成における、請求項１〜５０のいずれか一項に記載のＴｅＡｍｙ１又はその変異体の使用。
  53. 発酵飲料の前記生成における、請求項１〜５０のいずれか一項に記載のＴｅＡｍｙ１又はその変異体の使用。
  54. 前記発酵飲料又は最終発酵産物が、
    ｉ）麦芽のみのビール、「ビール純粋令」下で醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニア・ビール、ライト・ビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボック・ビール、スタウト、モルト・リカー、ノンアルコールビール、及びノンアルコールモルト・リカーからなる群から選択されるビール、及び／又は
    ｉｉ）果実フレーバーの麦芽飲料、蒸留酒フレーバーの麦芽飲料、及びコーヒーフレーバーの麦芽飲料からなる群から選択される穀草又は麦芽飲料、からなる群から選択される、請求項２２〜３６のいずれか一項に記載の方法、請求項３９に記載の発酵飲料、又は請求項５３に記載の使用。
  55. 食品組成物の生成方法であって、
    （ｉ）１種以上の食品原料と、
    （ｉｉ）α−アミラーゼ活性を有し、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体とを組み合わせることを含み、
    前記単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、前記食品原料中に存在するデンプン成分の前記加水分解を触媒してグルコースを生成する、方法。
  56. 同一条件下で同量のＤＰ３＋を減少させるために、前記ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体を、ＡｋＡＡ投入量の約１７％〜５０％にて投入する、請求項５５に記載の方法。
  57. 同一条件下で同量のＤＰ３＋を減少させるために、前記ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体を、ＡｋＡＡ投入量の約１７％〜３４％にて投入する、請求項５５又は５６に記載の方法。
  58. 全ＤＰ１〜ＤＰ７の重量％として測定したとき、同一条件下でＡｋＡＡによって生成された第２の焼成食品と比較して、前記食品組成物のＤＰ２又は（ＤＰ１＋ＤＰ２）が富化されている、請求項５５に記載の方法。
  59. ＤＰ２が、約２時間で２〜３倍に富化される、請求項５８に記載の方法。
  60. （ＤＰ１＋ＤＰ２）が、約２時間で約１．９倍に富化される、請求項５８に記載の方法。
  61. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６を含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６からなる、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記食品組成物が、食品製品、焼成用組成物、食品添加物、動物性食品製品、飼料製品、飼料添加物、油、肉、及び、及びラードからなる群から選択される、請求項５８〜６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記１種類以上の食品原料が、焼成原材料又は添加物を含む、請求項５８〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記１種類以上の食品原料が、穀粉、老化防止アミラーゼ、ホスホリパーゼ、リン脂質、マルトース生成αアミラーゼ、又は、マルトース生成αアミラーゼ活性を有するその変異体、相同体、若しくは突然変異体、ベーカリー用キシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）、及びリパーゼからなる群から選択される、請求項５５〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記１種類以上の食品原料が、
    （ｉ）バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来のマルトース生成性α−アミラーゼ、
    （ｉｉ）バチルス（Bacillus）、アスペルギルス（Aspergillus）、サーモミセス（Thermomyces）又はトリコデルマ（Trichoderma）由来のベーカリー用キシラナーゼ、
    （ｉｉｉ）フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）由来のグリコリパーゼ、からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記食品組成物が、ドウ又はドウ製品を含み、好ましくは、加工されたドウ製品を含む、請求項５５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記食品組成物を焼成して焼成食品を生産することを含む、請求項５５〜６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記方法が、
    （ｉ）デンプン培地を提供する工程と、
    （ｉｉ）前記デンプン培地に前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を添加する工程と、
    （ｉｉｉ）工程（ｂ）の間、又はその後に前記デンプン培地に熱を加え、ベーカリー製品を生産する工程と、を更に含む、請求項５５〜７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 食品組成物の生成に使用するための組成物であって、α−アミラーゼ活性を有し、かつ（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体と、１種類以上の食品原料とを含む、組成物。
  73. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の組成物。
  74. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６を含む、請求項７３に記載の組成物。
  75. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項７２に記載の組成物。
  76. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６からなる、請求項７２に記載の組成物。
  77. 食品組成物の調製における、請求項７２〜７６のいずれか一項に記載のＴｅＡｍｙ１又はその変異体の使用。
  78. 前記食品組成物が、ドウ、又はドウ製品、を含み、好ましくは、加工されたドウ製品を含む、請求項７７に記載の使用。
  79. 前記食品組成物が、ベーカリー組成物である、請求項７７又は７８に記載の使用。
  80. 前記ドウ製品の劣化、好ましくは、前記ドウ製品の有害な老化を遅延又は減少させるための、ドウ製品における請求項７２〜７６のいずれか一項に記載のＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体の使用。
  81. 洗濯物、食器、又は織物からデンプン質の染みを除去する方法であって、α−アミラーゼ活性を有し、かつ（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を有効量で含む水性組成物の存在下で、前記洗濯物、食器、又は織物の表面をインキュベートして、前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体に、前記デンプン質の染みに存在するデンプン成分を加水分解させて、前記水性組成物中に溶解するデンプン由来のより小さな分子を生成させる工程と、前記表面をすすぐことによって、前記デンプン質の染みを前記表面から取り除く工程と、を含む、方法。
  82. 同一条件下で同量のＤＰ３＋を減少させるために、前記ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体を、ＡｋＡＡ投入量の約１７％〜５０％にて投入する、請求項８１に記載の方法。
  83. 同一条件下で同量のＤＰ３＋を減少させるために、前記ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体を、ＡｋＡＡ投入量の約１７％〜３４％にて投入する、請求項８１又は８２に記載の方法。
  84. 全ＤＰ１〜ＤＰ７の重量％として測定したとき、同一条件下でＡｋＡＡによって生成されたデンプン由来分子と比較して、前記デンプン由来分子のＤＰ２又は（ＤＰ１＋ＤＰ２）が富化されている、請求項８１に記載の方法。
  85. ＤＰ２が約２時間で２〜３倍に富化される、請求項８４に記載の方法。
  86. （ＤＰ１＋ＤＰ２）が、約２時間で約１．９倍に富化される、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６を含む、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項８１〜８７のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６からなる、請求項８９に記載の方法。
  91. 洗濯物、食器、又は織物からのデンプン質の染みの除去に使用するための組成物であって、α−アミラーゼ活性を有し、かつ（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体と、界面活性剤と、を含む、組成物。
  92. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の組成物。
  93. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６を含む、請求項９１又は９２に記載の組成物。
  94. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項９１又は９２に記載の組成物。
  95. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６からなる、請求項９４に記載の組成物。
  96. 前記組成物が、洗濯用洗剤、洗濯用洗剤添加剤、又は手作業での若しくは自動での食器洗浄用洗剤である、請求項９１〜９５のいずれか一項に記載の組成物。
  97. 織物の糊抜き方法であって、糊抜き組成物を、織物の糊抜きに十分な時間にわたって前記織物に接触させる工程と、前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体に、前記デンプン質の染みに存在するデンプン成分を糊抜きさせて、前記水性組成物中に溶解するデンプン由来のより小さな分子を生成させる工程と、表面をすすぐことによって、前記デンプン質の染みを前記表面から取り除く工程と、を含み、前記糊抜き組成物は、単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含み、該単離ＴｅＡｍｙ１又はその変異体はα−アミラーゼ活性を有しかつ（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法。
  98. 同一条件下で同量のＤＰ３＋を減少させるために、前記ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体を、ＡｋＡＡ投入量の約１７％〜５０％にて投入する、請求項９７に記載の方法。
  99. 同一条件下で同量のＤＰ３＋を減少させるために、前記ＴｅＡｍｙ１又はそれらの変異体を、ＡｋＡＡ投入量の約１７％〜３４％にて投入する、請求項９７又は９８に記載の方法。
  100. 全ＤＰ１〜ＤＰ７の重量％として測定したとき、同一条件下でＡｋＡＡによって生成されたデンプン由来分子と比較して、前記デンプン由来分子のＤＰ２又は（ＤＰ１＋ＤＰ２）が富化されている、請求項９７に記載の方法。
  101. ＤＰ２が、約２時間で２〜３倍に富化される、請求項１００に記載の方法。
  102. （ＤＰ１＋ＤＰ２）が、約２時間で約１．９倍に富化される、請求項１００に記載の方法。
  103. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９７〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６を含む、請求項９７〜１０３に記載の方法。
  105. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項９７〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記ＴｅＡｍｙ１又はその変異体が、（ａ）配列番号１の残基１〜６０３、又は（ｂ）配列番号１の残基１〜４７６からなる、請求項１０５に記載の方法。
  107. 織物の糊抜きにおける、ＴｅＡｍｙ１又はその変異体を含む糊抜き組成物の使用。
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