CN109072266B - 改善的颗粒状淀粉转化酶和方法 - Google Patents

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Abstract

描述了涉及颗粒状淀粉‑转化葡糖淀粉酶和α‑淀粉酶的方法和组合物。所述酶可以用于在处于或低于不溶性颗粒状淀粉的糊化温度进行颗粒状淀粉的酶促淀粉水解。

Description

改善的颗粒状淀粉转化酶和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年12月21日提交的国际申请号PCT/CN 2015/098121的优先权，将其以其全文通过引用特此结合。
技术领域
本发明的方法和组合物涉及颗粒状淀粉转化葡糖淀粉酶和α-淀粉酶。所述酶可以用于在处于或低于不溶性颗粒状淀粉的糊化温度进行颗粒状淀粉的酶促淀粉水解。
背景技术
不溶性颗粒状淀粉至葡萄糖或其他可溶性糖类如糊精的转化通常是获得最终产物例如糖甜味剂、特制糖浆、酶、蛋白质、醇(例如乙醇、丁醇)、有机酸(乳酸、琥珀酸、柠檬酸)和特制生物化学品，如氨基酸(赖氨酸、谷氨酸钠)和1-3丙二醇的重要大规模工艺的一部分。淀粉颗粒的部分结晶性赋予了其在冷水中的不溶性。淀粉颗粒在水中的溶解需要大量的热能来破坏结晶结构。用于溶解颗粒的水越多，加热水所需的能量就越多。如果需要从最终产品中蒸发水，还需要更多的能量。
在淀粉-水混合物中淀粉的增溶可以通过直接或间接加热系统进行，例如通过蒸汽注射直接加热(参见，例如，Starch Chemistry and Technology[淀粉化学和技术]，R.L.Whistler等人编辑，第2版，1984，学术出版社公司(Academic Press Inc.)，佛罗里达州奥兰多，以及Starch Conversion Technology[淀粉转化技术]，G.M.A.Van Beynum等人编辑，Food Science and Technology Series[食品科学和技术系列]，马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker Inc.)，纽约)。典型的常规淀粉液化系统在高压下将含水淀粉浆料输送到直接蒸汽注射蒸煮器，其将浆料温度从约35℃-40℃提高到107℃-110℃。该浆料通常含有热稳定的α淀粉酶，在这种情况下，调节pH以利于α-淀粉酶。从湿磨产生的颗粒状淀粉浆料通常具有40％至42％的干固体含量。在糊化温度以上加热之前，通常将浓度稀释至32％至35％干固体。如果不进行这种稀释，高温喷射蒸煮过程中的黏度可能会很高，以至于单元操作系统不能处理浆料。
已经描述了上述常规方法的替代方案，其中通过不在糊化温度以上加热颗粒状淀粉浆料来避免黏度过高的问题(参见例如，US 7,618,795和US 20050136525)。相反，颗粒状淀粉通过在低于糊化温度酶水解溶解。据报道，这种“低温”系统(也称为“不蒸煮”或“冷蒸煮”)能够处理比常规系统更高浓度的干固体(例如高至45％)。然而，不蒸煮系统具有这样的缺点，即为了基本上完全溶解，需要在适度升高的温度进行相对长的约24小时或更长时间的温育。较长时间的温育本身与高能量成本有关。
由于处理颗粒状淀粉的规模很大，因此即使看起来很小的效率改善也可以具有很大的经济优势。然而，转化过程已经被广泛分析以确定和实施这些改善(参见例如，Martin和Brumm，Starch Hydrolysis Products:Worldwide Technology,production andapplications[淀粉水解产物：世界范围内的技术、生产和应用]，第45页-第77页，纽约，VCH出版社有限公司(VCH Publishers,Inc.)，1992和Luenser，Dev.in Ind.Microbiol.[工业微生物学进展]，24.79-96(1993))。
发明内容
本发明的方法和组合物涉及颗粒状淀粉转化葡糖淀粉酶和α-淀粉酶。所述酶可以用于在处于或低于不溶性颗粒状淀粉的糊化温度进行颗粒状淀粉的酶促淀粉水解：
1.在一个方面，提供了用于处理颗粒状淀粉的方法，所述方法包括：使包含颗粒状淀粉的浆料与葡糖淀粉酶和颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶在处于或低于所述颗粒状淀粉的糊化温度的温度接触，以产生可由发酵生物发酵的糖类；其中所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:21-34中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性，或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
2.在如段落1所述的方法的一些实施例中，使所述浆料与所述葡糖淀粉酶和所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与相同的葡糖淀粉酶和来自白曲霉(Aspergillus kawachii)的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的淀粉转化。
3.在如段落1或2所述的方法的一些实施例中，使所述浆料与所述葡糖淀粉酶和所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与相同的葡糖淀粉酶和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的葡萄糖释放。
4.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，使所述浆料与所述葡糖淀粉酶和所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与相同的葡糖淀粉酶和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的总葡萄糖当量。
5.在如段落4所述的方法的一些实施例中，与通过使相同的浆料与所述葡糖淀粉酶和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触产生的量相比，增加的总葡萄糖当量提高至少5％，以及优选地提高至少10％。
6.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，所述方法导致葡萄糖、麦芽糖、寡糖或其混合物任选地以糖浆形式的产生。
7.在一些实施例中，前述段落中任一项所述的方法进一步包括使所述糖类与发酵生物接触以产生发酵终产物；其中与使相同的浆料与所述葡糖淀粉酶和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比，所述接触导致发酵终产物的生产增加。
8.在如段落7所述的方法的一些实施例中，所述发酵终产物是乙醇。
9.在如段落7所述的方法的一些实施例中，所述发酵终产物是非乙醇生物化学品。
10.在如段落1-9中任一项所述的方法的一些实施例中，同时添加葡糖淀粉酶和颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶。
11.在如段落7-9中任一项所述的方法的一些实施例中，同时添加葡糖淀粉酶和/或颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶和发酵生物。
12.在如段落1-11中任一项所述的方法的一些实施例中，所述葡糖淀粉酶和/或颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶由发酵生物产生。
13.在一些实施例中，前述段落中任一项所述的方法进一步包括向浆料中添加另外的酶。
14.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，所述葡糖淀粉酶与选自下组的葡糖淀粉酶或与其活性片段具有至少85％的氨基酸序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1和3-20。
15.在如前述段落中任一项所述的方法的一些实施例中，所述葡糖淀粉酶与选自下组的葡糖淀粉酶或与其活性片段具有至少85％的氨基酸序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、3、4、5、7、8、12、13、16、17、18、19和20。
16.在另一方面，提供了颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，其包含与SEQ ID NO:21-34中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性，或与其活性片段具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；其中所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，当与葡糖淀粉酶组合接触颗粒状淀粉的浆料时，与使相同的浆料与相同的葡糖淀粉酶和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比，能够增加淀粉转化、增加葡萄糖释放、和/或产生增加的总葡萄糖当量。
17.在如段落16所述的淀粉-转化α-淀粉酶的一些实施例中；所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，当与葡糖淀粉酶组合接触颗粒状淀粉的浆料时，与使相同的浆料与相同的葡糖淀粉酶和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比，能够使增加的总葡萄糖当量的产生提高至少5％，以及优选地提高至少10％。
18.在如段落16或17所述的颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶的一些实施例中；所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，当与葡糖淀粉酶和发酵生物组合接触颗粒状淀粉的浆料时，与使相同的浆料与相同的葡糖淀粉酶和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比，能够增加发酵终产物的产生。
19.在另一方面，提供了包含如段落16-18中任一项所述的颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶与葡糖淀粉酶组合的组合物。
20.在如段落19所述的组合物的一些实施例中，所述葡糖淀粉酶与选自下组的α-淀粉酶或与其活性片段具有至少85％的氨基酸序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1和3-20。
21.在如段落19或20所述的组合物的一些实施例中，所述葡糖淀粉酶与选自下组的α-淀粉酶或与其活性片段具有至少85％的氨基酸序列同一性，该组由以下组成：SEQ IDNO:1、3、4、5、7、8、12、13、16、17、18、19和20。
22.在另一方面，提供了能够产生段落16-18中任一项所述的颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶的发酵生物，其任选地与葡糖淀粉酶组合，所述葡糖淀粉酶可以任选地选自段落20或22。
这些以及组合物和方法的其他方面和实施例将从本描述中变得显而易见。
具体实施方式
定义
在详细地描述所述组合物和方法之前，定义以下术语和缩写。
除非另有定义，所用的所有技术和科学术语在相关科学领域具有其通常的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物学和分子生物学词典]，第2版，约翰威利父子公司(John Wiley and Sons)，纽约(1994)，以及Hale和Markham，Harper Collins Dictionary of Biology[哈珀柯林斯生物学词典]，HarperPerennial[哈珀永久出版社]，纽约(1991)提供了本发明中所描述的许多术语的通常的含义。
“淀粉”是指由葡萄糖单元组成的多糖，其以储存颗粒形式广泛存在于植物组织中，其由直链淀粉和支链淀粉组成，其化学式为(C6H10O5)x，其中X是任何数字。特别地，该术语是指任何基于植物的材料，例如比如谷物、谷类、草、块茎、和根，并且更具体地是小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、豆类、木薯、粟、马铃薯、甘薯、和树薯。
“颗粒状淀粉”是指未经糊化的未蒸煮的(原)淀粉。
术语“颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶”是指使用实例中描述的测定法，与来自具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的里氏木霉(Trichoderma reesei)的葡糖淀粉酶(TrGA)相比，对颗粒状淀粉具有增加的活性的葡糖淀粉酶。
术语“颗粒状淀粉转化α-淀粉酶”是指与来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)相比，对颗粒状淀粉具有增加的活性的α-淀粉酶，其使用在实例中描述的测定。
关于用于比较目的的酶，术语“相同葡糖淀粉酶”和“相同α-淀粉酶”是指等同浓度和比活性的相同酶(基于氨基酸序列)，使得在条件下其他变化可以通过实验评估。
“淀粉糊化”意指淀粉分子的增溶以形成黏性悬浮液。
“糊化温度”是含底物的淀粉开始糊化的最低温度。糊化的确切温度取决于具体的淀粉，并且可能依赖于诸如植物物种以及环境和生长条件的因素而变化。根据本发明方法可以使用的许多颗粒状淀粉的初始淀粉糊化温度范围包括大麦(52℃-59℃)、小麦(58℃-64℃)、黑麦(57℃-70℃)、玉米(62℃-72℃)、高直链淀粉玉米(67℃-80℃)、稻(68℃-77℃)、高粱(68℃-77℃)、马铃薯(58℃-68℃)、树薯(59℃-69℃)和甘薯(58℃-72℃)(Swinkels，STARCH CONVERSION TECHNOLOGY[淀粉转化技术]，第32-38页，Van Beynum等人编辑，(1985)，马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker Inc.)，纽约和The Alcohol Textbook[酒精教科书]，第3版；A Reference for the Beverage,Fuel and Industrial AlcoholIndustries[饮料、燃料和工业酒精工业的参考文献]，Jacques等人编辑，(1999)英国诺丁汉大学出版社(Nottingham University Press,UK))。糊化包括结晶区域的熔化、分子的水合和颗粒的不可逆的膨胀。糊化温度发生在给定颗粒的一个范围内，其因为结晶区域的尺寸不同和/或分子顺序或结晶完美程度的程度而变化。STARCH HYDROLYSIS PRODUCTSWorldwide Technology,Production,and Applications[淀粉水解产物世界范围内的技术、生产和应用](Shenck和Hebeda编辑，VCH出版社有限公司(VCH Publishers,Inc)，纽约，1992)在第26页。
“DE”或“右旋糖当量”是总还原糖浓度的工业标准，并以干重为基准的％D-葡萄糖表示。未水解的颗粒状淀粉具有基本上为0的DE并且D-葡萄糖具有100的DE。
“葡萄糖糖浆”是指含有葡萄糖固体的含水组合物。葡萄糖糖浆具有大于20的DE。一些葡萄糖糖浆含有不超过21％的水和不少于25％的以葡萄糖计算的还原糖。一些葡萄糖糖浆包括至少90％的D-葡萄糖或至少95％的D-葡萄糖。有时术语葡萄糖和葡萄糖糖浆可互换地使用。
“淀粉水解”是通过添加水分子来裂解淀粉中糖苷键。
“浆料”是在水中含有不溶性淀粉颗粒的含水混合物。
术语“总糖含量”是指存在于包括单糖、寡糖和多糖的淀粉组合物中的总可溶性糖含量。
术语“干固体”(ds)是指溶解于水中的干固体，分散于水中的干固体或两者的组合。因此干固体包括颗粒状淀粉及其水解产物，包括葡萄糖。
“干固体含量”是指相对于其中分散和/或溶解干燥固体的水的溶解和分散的干燥固体的百分比(以重量计)。淀粉的初始干固体含量是颗粒状淀粉的重量，通过颗粒状淀粉重量加水重量的含水量进行校正。随后的干固体含量可以根据添加或丢失的任何水和化学增益调整的初始含量来确定。随后的溶解干固体含量可以从折射率测量，如下所示。
术语“高DS”是指干固体含量大于38％(wt/wt)的含水淀粉浆料。
“干物质淀粉”是指底物(如淀粉浆料)的干淀粉含量，并且可以通过从底物质量中扣除任何非淀粉成分如蛋白质、纤维和水的贡献来确定。例如，如果颗粒状淀粉浆料含水量为20％(wt/wt)，并且蛋白质含量为1％(wt/wt)，则100kg颗粒状淀粉的干淀粉含量为79kg。干物质淀粉可用于确定使用多少单位的酶。
“折射指数干物质”(RIDS)是在已知DE、在受控温度测定淀粉溶液的折射率，然后使用适当关系将RI转化为干物质，例如玉米深加工协会的关键数据表。
“聚合度(DP)”是指给定的糖类中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的实例是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP4+(>DP3)表示聚合度大于3的聚合物。
术语“接触”是指将对照组分(包括但不限于酶、底物和发酵生物)充分靠近例如作用于底物上的酶或发酵生物发酵基质以影响预期结果。本领域技术人员将认识到混合溶液可以引起“接触”。
术语“发酵生物”是指适用于产生期望的发酵终产物(EOF)的任何生物，包括细菌和真菌(包括丝状真菌和酵母)。
术语“发酵终产物(EOF)”或简称“发酵产物”是由发酵生物产生的任何碳源衍生的分子产物，即，能够发酵可发酵糖的生物，并且包括但并不限于代谢产物，例如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、乙酸、谷氨酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡糖酸钾、衣康酸和其他羧酸，葡萄糖酸-δ-内酯、异抗坏血酸钠、谷氨酸、色氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和其他氨基酸，ω-3脂肪酸、异戊二烯、1,3-丙二醇、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、其他醇以及其他生物化学品和生物材料。
“酶活性”是指酶在其底物上的作用。
“α-淀粉酶(EC类别3.2.1.1)”是催化α-1,4-糖苷键水解的酶。这些酶也被描述为催化含有1,4-α-联结的D-葡萄糖单元的多糖中的1,4-α-D-糖苷键的外水解或内水解的那些酶。用于描述这些酶的另一个术语是糖原酶。示例性酶包括α-1,4-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。
“葡糖淀粉酶”是指淀粉葡糖苷酶类的酶(EC.3.2.1.3，葡糖淀粉酶，α-1,4-D-葡聚糖葡糖水解酶)是从淀粉的非还原终产物中去除连续葡萄糖单元的酶。所述酶可水解淀粉、直链淀粉和支链淀粉的直链和支链糖苷键。所述酶也水解α-1,6和α-1,3键，尽管速度比α-1,4键更慢。
“支链淀粉酶”也称脱支酶(EC 3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖水解酶)，能够水解支链淀粉分子中的α-1,6糖苷键。
“产量”是指作为起始颗粒状淀粉干重百分比的所需最终产物/产品(例如葡萄糖)的量。
用语“同时糖化和发酵(SSF)”是指发酵终产物的生产过程中，微生物(例如产乙醇微生物)和至少一种酶(例如一种或多种葡糖淀粉酶)在相同的方法步骤中存在过程。SSF包括(颗粒状的、液化的或溶解的)淀粉底物同时水解成包括葡萄糖在内的糖类，以及糖类在相同反应容器中发酵成醇类或其他生物化学品或生物材料。
序列同一性可以通过使用例如威斯康星州遗传学软件包版本7.0(WisconsinGenetics Software Package Release 7.0)中的BESTFIT、FASTA和TFASTA(威斯康星州麦迪逊市科学路575号遗传学计算机集团(Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI))的算法，使用默认空位参数通过比对或通过检验来测定，以及最佳比对(即导致比较窗口中序列相似性的百分比最高)。序列同一性的百分比可以通过以下方式计算：在较短序列的长度上(如果长度不相等)最佳比对两个序列、确定两个序列中出现相同残基的位置数以产生匹配位置的数、将匹配位置数除以不计数空位的匹配和不匹配位置的总数，并且将结果乘以100而得出序列同一性百分比。除非另有说明，否则本文使用的百分比氨基酸序列同一性是使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算的。参见Thompson等人，(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数为：
Figure BDA0001766873880000101
术语“包含”及其同源词以其包含的含义使用；即，等同于术语“包括”其同源词。
数值范围包括限定范围的数值在内。还列出了一些首选的子范围，但在任何情况下，对范围的引用都包括由范围内包含的整数定义的所有子范围。
术语“总葡萄糖当量”是指计算过程(例如发酵过程)中的淀粉转化的方式，以便可以比较不同过程中的淀粉转化。比较过程可能很困难，因为中间产物和终产物紧接着副产品之后形成。例如，在乙醇发酵过程中，将淀粉转化为糊精，将其转化为葡萄糖，并通过酵母将葡萄糖发酵成乙醇。酵母还将葡萄糖转化为甘油作为主要副产物，并且该过程中存在的细菌可以在生产乙酸和乳酸的同时转化葡萄糖。葡萄糖当量是这样的一种方式，其中所有这些可以通过例如HPLC测量的可溶性成分在数学上转化为葡萄糖，从而可以将它们加起来并形成所有可溶成分的葡萄糖当量。例如，将摩尔重量为342.30g/mol的1摩尔二糖如麦芽糖转化为摩尔重量为180.02g/mol的2摩尔葡萄糖。麦芽糖的数学转换为(2x180.02)/342.30＝1.052，并且每克/升麦芽糖与此1.052相乘以转化为麦芽糖的葡萄糖当量。本领域技术人员将能够为发酵过程中的其他主要组分做到这一点。对于DPn，选择平均聚合度为10的DPn。这样计算乙醇、甘油、乙酸、乳酸、琥珀酸、DP1、DP2、DP3和DPn的葡萄糖当量并添加以形成该方法的总葡萄糖当量。由于仅测量可溶性组分，其中类似量的淀粉转化的过程将显示类似的“总葡萄糖当量”值。如果更多的淀粉溶解，总葡萄糖当量的增加是可见的。
颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和α-淀粉酶
已经描述了低温淀粉水解过程，也称为“不蒸煮”或“冷蒸煮”过程(参见例如US 7,618,795和US 20050136525)。在冷蒸煮过程中，颗粒状淀粉通过在低于糊化温度酶水解溶解。这种低温方法代表了具有某些优点的常规淀粉水解的替代方法，例如避免了通过将颗粒状淀粉加热至糊化温度以上而产生的高淀粉浆料黏度以及这种加热的高操作成本。
由于冷蒸煮过程不需要喷气式蒸煮器，因此可以在最初设计的乙醇生产工厂中使用甘蔗等农业原料。这允许这样的生产设备利用例如玉米或甘蔗，这取决于哪一个更便宜或当时更可用。这些设备可以受益于使用分离装置在引入设备之前移除不可发酵的玉米材料，以避免不设计成处理这种材料的设备污染。分离可以通过离心、过滤或其他常规方法进行。预期安装分离装置的成本将远远低于安装喷气式蒸煮器的成本。
然而，不蒸煮系统具有这样的缺点，即为了基本上完全溶解，需要在适度升高的温度进行相对长的约24小时或更长时间的温育。较长时间的温育本身与高能量成本和降低的通量相关联，并且在适度升高的温度较长的温育时间可能导致污染。
本发明组合物和方法基于观察到某些葡糖淀粉酶(GA)和α-淀粉酶(AA)对颗粒状淀粉显示的高度活性。这些观察结果使用当前商业基准作为参考基于粗淀粉水解测定中的大量GA和AA的广泛经验测试。由于大量的测试的酶，本文只描述了比基准酶即的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)(SEQ ID NO:1)和白曲霉α-氧化淀粉酶(AkAA)(SEQ ID NO:2)表现更好的GA和AA。
TrGA和AkAA的氨基酸序列如下所示：
来自里氏木霉的SEQ ID NO:1(TrGA)
SVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVIASPSTIDPDYYYMWTRDSALVFKNLIDRFTETYDAGLQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLADGSGLGEPKFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQSTVSNVIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGQSGSAYSSVAPQVLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGRTGKDVNSVLTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYGVNKGIPAGAAVAIGRYAEDVYYNGNPWYLATFAAAEQLYDAIYVWKKTGSITVTATSLAFFQELVPGVTAGTYSSSSSTFTNIINAVSTYADGFLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNSGTPLSALHLTWSYASFLTATARRAGIVPPSWANSSASTIPSTCSGASVVGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCATPTSVAVTFHELVSTQFGQTVKVAGNAAALGNWSTSAAVALDAVNYADNHPLWIGTVNLEAGDVVEYKYINVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTQVVKEDTWQS
来自白曲霉的SEQ ID NO:2(AkAA)
LSAAEWRTQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCNTGDQIYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWISPITEQLPQDTSDGEAYHGYWQQKIYNVNSNFGTADDLKSLSDALHARGMYLMVDVVPNHMGYAGNGNDVDYSVFDPFDSSSYFHPYCLITDWDNLTMVQDCWEGDTIVSLPDLNTTETAVRTIWYDWVADLVSNYSVDGLRIDSVEEVEPDFFPGYQEAAGVYCVGEVDNGNPALDCPYQKYLDGVLNYPIYWQLLYAFESSSGSISNLYNMIKSVASDCSDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVLSYIFLSDGIPIVYAGEEQHYSGGDVPYNREATWLSGYDTSAELYTWIATTNAIRKLAISADSDYITYANDPIYTDSNTIAMRKGTSGSQIITVLSNKGSSGSSYTLTLSGSGYTSGTKLIEAYTCTSVTVDSNGDIPVPMASGLPRVLLPASVVDSSSLCGGSGNTTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSSCTATSTTLPITFEELVTTTYGEEVYLSGSISQLGEWDTSDAVKLSADDYTSSNPEWSVTVSLPVGTTFEYKFIKVDEGGSVTWESDPNREYTVPECGSGSGETVVDTWR
下表列出了与AkAA结合使用效果更好的GA，或与不同AA混合使用效果更好的GA：
Figure BDA0001766873880000131
Figure BDA0001766873880000141
氨基酸序列如下所示：
SEQ ID NO:3；来自土曲霉的GA-1805(AteGA1)
APQLAPRATTSLDAWLASETTVALDGILDNVGSSGAYAKSAKSGIVIASPSTSDPDYYYTWTRDAALTVKALIDLFRNGETSLQTVIMEYISSQAYLQTVSNPSGSLSTGGLAEPKYYVDETAYTGSWGRPQRDGPALRATAMIDFGNWLIDNGYSTYASSIVWPIVRNDLSYVAQYWNQTGYDLWEEVNGSSFFTIAVQHRALVEGSTFASKVGASCSWCDSQAPQVLCFLQRFWTGSYIMANFGGGRSGKDANTVLGSIHTFDPNAGCDDTTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSIYSINSGISSGKAVAVGRYPEDSYYNGNPWFLTTLAAAEQLYDAIYQWQKIGSITITDVSLAFFKDLYSSAAVGTYASSSSAFTSIVSAVKTYADGYMSIVQTHAMTNGSLSEQFGKSDGFSLSARDLTWSYAALLTANLRRNSVVPPSWGETTATSVPSVCSATSATGTYSTATNTAWPSTLTSGTGATTTTSKATSSSTTTTSSASSTTVECVVPTAVAVTFDEVATTTYGENVYVVGSISQLGSWDTSKAVALSASKYTSSNNLWYVTVTLPAGTTFQYKFIRVSSSGSVTWESDPNRSYTVPSACGTSTAVVNTTWR
SEQ ID NO:4；来自烟曲霉的GA-2040(AfuHT3)
APQLSARATGSLDSWLGTETTVALNGILANIGADGAYAKSAKPGIIIASPSTSEPDYYYTWTRDAALVTKVLVDLFRNGNLGLQKVITEYVNSQAYLQTVSNPSGGLASGGLAEPKYNVDMTAFTGAWGRPQRDGPALRATALIDFGNWLIDNGYSSYAVNNIWPIVRNDLSYVSQYWSQSGFDLWEEVNSMSFFTVAVQHRALVEGSTFAKRVGASCSWCDSQAPQILCYMQSFWTGSYINANTGGGRSGKDANTVLASIHTFDPEAGCDDTTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSVYAINSGIPQGAAVSAGRYPEDVYYNGNPWFLTTLAAAEQLYDAIYQWKKIGSISITSTSLAFFKDIYSSAAVGTYASSTSTFTDIINAVKTYADGYVSIVQAHAMNNGSLSEQFDKSSGLSLSARDLTWSYAAFLTANMRRNGVVPAPWGAASANSVPSSCSMGSATGTYSTATATSWPSTLTSGSPGSTTTVGTTTSTTSGTAAETACATPTAVAVTFNEIATTTYGENVYIVGSISELGNWDTSKAVALSASKYTSSNNLWYVSVTLPAGTTFEYKYIRKESDGSIVWESDPNRSYTVPAACGVSTATENDTWQ
SEQ ID NO:5；来自费氏新萨托菌的GA-2331(NfiGA1)
APQLSPRATGSLDSWLATESTVSLNGILANIGADGAYAKSAKPGIIIASPSTSDPDYYYTWTRDAALVTKVLVDLFRNGNLGLQKVITEYVNSQAYLQTVSTPSGGLSSGGLAEPKYNVDMTAFTGAWGRPQRDGPALRATALIDFGNWLIDNGYSSYAVNNIWPIVRNDLSYVSQYWSQSGFDLWEEVNSMSFFTVAVQHRALVEGSTFAKRVGASCSWCDSQAPQILCYMQSFWTGSYINANTGGGRSGKDANTVLASIHTFDPEAGCDDTTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSVYAINSGIPQGVAVSAGRYPEDVYYNGNPWFLTTLAAAEQLYDAIYQWKKIGSISITSTSLAFFKDIYSSVAVGTYASSSSTFTAIIDAVKTYADGYVSIVEAHAMTNGSLSEQFDKSSGMSLSARDLTWSYAALLTANMRRNGVVPAPWGAASANSVPSSCSMGSATGTYSTATATSWPSTLTSGSPSDTTSGTTPGTTTTTSACTTPTSVAVTFDEIATTTYGENVYIIGSISQLGSWDTSKAVPLSSSKYTSSNNLWYVTINLPAGTTFEYKYIRKESDGSIEWESDPNRSYTVPSACGVSTATEKDTWR
SEQ ID NO:6；来自富密新萨托菌的GA-2437(AfuGA2)
APQLSARATGSLDSWLGTETTVALNGILANIGADGAYAKSAKPGIIIASPSTSEPDYYYTWTRDAALVTKVLVDLFRNGNLGLQKVITEYVNSQAYLQTVSNPSGGLASGGLAEPKYNVDMTAFTGAWGRPQRDGPALRATALIDFGNWLIDNGYSSYAVNNIWPIVRNDLSYVSQYWSQSGFDLWEEVNSMSFFTVAVQHRALVEGSTFAKRVGASCSWCDSQAPQILCYMQSFWTGSYINANTGGGRSGKDANTVLASIHTFDPEAGCDDTTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSVYAINSGIPQGAAVSAGRYPEDVYYNGNPWFLTTLAAAEQLYDAIYQWKKIGSISITSTSLAFFKDIYSSAAVGTYASSTSTFTDIINAVKTYADGYVSIVQAHAMNNGSLSEQFDKSSGLSLSARDLTWSYAAFLTANMRRNGVVPAPWGAASANSVPSSCSMGSATGTYSTATATSWPSTLTSGSPGSTTTVGTTTSTTSGTATETACATPTAVAVTFNEIATTTYGENVYIVGSISELGNWDTSKAVALSASKYTSSNNLWYVSVTLPAGTTFEYKYIRKESDGSIVWESDPNRSYTVPAACGVSTATENDTWR
SEQ ID NO:7；来自马尔尼菲青霉菌的GA-2439(PmaGA1)
APQFSPRATVGLDAWLASETTFSLNGILANIGSSGAYSASAKPGVVIASPSTNNPNYYYTWTRDSALTLKVLIDLFGNGNLSLQTVIEEYINAQAYLQTVSNPSGDLSSGAGLAEPKYNVDMSPFTGGWGRPQRDGPALRAIALIEFGNWLIDNGYSSYAVNNIWPIVRNDLSYVSQYWSQSGFDLWEEVNSMSFFTVANQHRALVQGSTFAARVGASCSWCDSQAPQILCYMQTFWTGSYINANTGGGRSGKDSNTVLTTIHTFDPEATCDDVTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSIYGVNSGIAQGVAVSVGRYPEDSYYGGNPWFLSNLAAAEQLYDAIYQWNKIGSITITSTSLAFFKDVYSSAAVGTYASGSTAFTSIISAVKTYADGYVSIVQGHAAANGSLSEQFDRNSGVEISARDLTWSYAALLTANLRRNGVMPPSWGAASANSVPSSCSMGSATGTYSTPTATAWPSTLTSATGIPVTTSATASVTKATSATSTTTSATTCTTPTSVAVTFDEIATTTYGENVFIVGSISQLGSWDTSKAIALSASQYTSSNHLWFATLSLPAGTTFQYKYIRKESNGSIVWESDPNRSYTVPSGCGVSTATENDTWR
SEQ ID NO:8；来自柄篮状菌的GA-2441(TstGA2)
APGLSPRASTSLDAWLATETTVSLSGILANIGADGAYSKSAKPGVVIASPSTDNPNYYYTWTRDSALTLKVLIDLFRNGNLGLQTVIEEYVNAQAYLQTVSNPSGDLSSGAGLAEPKFNVDMSAFTGSWGRPQRDGPALRAIALIDFGNWLIENGYTSLAANNIWPIVRNDLSYVAQYWSQSGFDLWEEVNSMSFFTVANQHRSLVEGSTFAAKVGASCSWCDSQAPQILCYMQTFWTGSYMNANTGGGRSGKDANTVLTSIATFDPEATCDDVTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSVYGLNSGIAEGVAVAVGRYPEDSYYNGNPWFLSNLAAAEQLYDAIYQWNKIGSITITSTSLAFFKDVYSSAAVGTYASGSSAFTSIINAVKTYADGYISVVQSHAMNNGSLSEQFDKNTGAELSARDLTWSYAALLTANMRRNGVVPPSWGAASATSIPSSCTTGSAIGTYSTPTATSWPSTLTSGTGSPGSTTSATGSVSTSVSATTTSAGSCTTPTSVAVTFDEIATTSYGENVYIVGSISQLGSWNTANAIALSASKYTTSNNLWYVTINLPAGTTFQYKYIRKESDGTVKWESDPNRSYTVPSACGVSTATENDTWR
SEQ ID NO:9；来自蝗绿僵菌的GA-2442(MacGA1)
HRDDLHGFITKQKSISLHGVLANIGSDGSRAQGAAAGAVVASPSKSDPDYWYTWSRDSALTFKVLIELFIGGKKSLQPKIEQYITAQAHLQGVSNPSGGPDTGGLGEPKFHVNLTAFTGSWGRPQRDGPPLRATALTIYANWLIANGGQAEAANTVWPIIAKDLSYTVQYWNRTGFDLWEEINGSSFFTLSASFRALVEGATLAKALGKQCPDCETNAPRILCFLQSFWANGYIDSNINVNDGRTGKDVNSIISSIHTFDPAAACTDATFQPCSSRALANHKAVVDSFRTIYTVNKGRRPGRAAAVGRYSEDVYYNGNPWYLATMAAAEQMYAAVYQWREIGSITVDATSLPFFSDLIPNIAAGTYAKNSATFTSIIKAATAYGDDFVRVVKQYTPADGSLAEQYDRETGSPKSAVHLTWSYASFVGAVERRSGIVPPSWGEPNSNTVPKVCEAPPSCDSTMTFNVKVTTVPGESIYVVGSITELKNWSPADAVPLDASQYTPSNPLWSAKVTIPAGTNFEYKYIKKTSDGTVVWESDPNRSATSSTGCQSNGTLNDQWR
SEQ ID NO:10；来自裂褶菌的GA-2578(ScoGA1)
QTSAADAYVSAESPIAQAGILANIGPSGSKSHGAASGVIIASPSTSNPDYLYTWTRDAALVSRALVDEFIEGESSLQSVIDSYVSSQQKLQRVDNPSGSYTSGGLGEPKFNIDLTAFTGAWGRPQRDGPALRAITLITYGNHLLSSGNTSYVTDTIWPVVKADLDYVVSYWNQTGFDLWEEVSSSSFFTTAEQHTALRLGATFATAVGASASTYLTQADNVLCFLQSYWNSNGGYATANTGGGRSGIDANTVLTSIHTFDIEAGCDSVTFQPCSDRALSNLKVYVDSFRGLYSINPTGATDPILTGRYKEDVYYNGNPWYLTTFAVAEQLYDALNTWDKLGSLDVTSTSLAFFKQFDSSITAGTYASSTSEYATLTSAIRNWADGFLEVLADFTPADGGLTEQIDKSSGNPTSAADLTWSYASAITAFKARGGAIPASWGAAGLTVPATCSTGGGGGSGGDTVAVTLNVQATTVYGENIYVTGSVNQLANWSPDNAIALNADNYPTWSVTVNLPANTQIEYKYIRKNNGQVTWESDPNRSITTSASGSFTQNDTWR
SEQ ID NO:11；来自深绿木霉/深绿肉座菌的GA-2722(Tat GA2)
VPRLRESRHEFDIVKRSASSFLETEVPIALADLLCNIGSAGSCAAGANSGIVIASPSKTNPDYFYTWTRDSALVFKCIVDTFVNSYSASLQTEIENYINAQAIVQGISNPSGSLSNSGTGLGEPKFNVDETAFTGAWGRPQRDGPALRAIALITYSKWLINNGYQSTANSIVWPIIQNDISYVAQYWNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEASALATSLGKSLPNASSQAAQALCFLQSFWSSSQGYIVANINQNNGRSGKDANTLLGSIHTFDPEGNCDASTFQPCSDRTLANHKVVVDSFRSIYTINNGIPAGTAAAVGRYPEDSYQGGNPWYLNTLAAAELLYDALYQWKRIGAITVTSTSLAFFKDLDSSITVGTYSSSSSTYTTLYNAVSNYADGFVNNVATYAPSNGSLAEQYNRNNGQPLSAYDLTWSYAALLTAAARRSGVVPYSWGETSASSVPSVCSYTSAVGSYSSASTGSWPPNQTPTDGSGSTTSKSTSVTVSSTSTSASSTAVATSPVTVTFDEIVTTIFGQTIKIAGNVPVLGNWNTNNAVALSADGYTSSNHLWNVGISFAPGTVIQYKYINVASNGDVTWEADPNHTYTVPATGATAVTVNNSWQS
SEQ ID NO:12；来自烟管菌的GA-3275(BadGA1)
QSSTVDAFIASESPIARTGLLANIGADGSKASGAKSGIVIASPSKSNPDYFYTWTRDAALVFKAIIDRYTSGEDTATRRQIDEYVSGQALLQQVSNPSGTVSTGGLAEPKYNVDMSAFTGGWGRPQRDGPALRATAIIAYANWLVANGNTSYVTSTLWPVLKLDLDYVRDNWNQTGFDLWEEINSSSFFTTAVQHRALREGNALAAKIGQTVSGYTTQADNVLCFLQSYWNPSGGFATSNTGGGRSGKDANSVLTSIHTFDAAAGCDALTFQPCSDRALSNHKVYVDSFRSIYSVNSGIASNAAVATGRYPEDSYYGGNPWYLTTLAAAEQLYDALTVWDAQGSLNVTSVSLAFFQQFAPTVTAGTYPASSATYGTLTAAIRAYADGFVAVVAKYTPSNGGLAEQYTRAGGTPTSAADLTWSYAAALTAFSAREGFTPASWGAKGLTAPAACNTNSGGGSGGGSGNTVAVTFNVQATTVWGENIYLTGSVDALQNWSPDNALLLSSANYPTWSITVNLPPSTAIQYKYIRKNNGAVTWESDPNMSITTPGSGSATLSDTWR
SEQ ID NO:13；来自灵芝属物种的GA-3280(GspGA1)
QSSADAYVASEASIAKAGLLANIGANGSKSEGAKAGIVVASPSTSNPDYLYTWTRDSSLVFKTVIDQFTTGEDTSLRGLIDEFTAAQSILQQTSNPSGSVSTGGLGEPKFNVDETAFTGAWGRPQRDGPALRATAIITYANWLLANGNGTSYVQNTLWPIIKLDLDYVENNWNQSTFDLWEEVNSSSFFTTAVQHRALREGVALASAIGQTSVVSGYSAQADNLLCFLQSYWNSGSGFVTANTGGGRSGRDANTVLTSIHTFDVEAGCDAVTFQPCSDKALSNLKVYVDAFRSIYGINSGIASNAAVATGRYPEDSYYNGNPWYLAVFAVAEQLYDALITWDELGSLNVTSTSLAFFQQFDSSVTAGTYDSSSSTYSTLTSGIKGFADGFLEVNSKYTPSTGALSEQFDKSSGSQLSASDLTWSYAAALTAFAARSGKTYASWGAAGLITTCGGSGGGGGGSGTVSVTFNVQATTVFGENIYITGSVDALQNWSPDNALILSAANYPIWSITVSLPASTVIEYKYIRKFNGQVTWESDPNDSITTPASGSYIENDTWR
SEQ ID NO:14；来自变色栓菌的GA-3283(TveGA3)
QSSVADAYVASESSIAKAGVLANIGPSGSKSQGAKAGIVVASPSTTNPDYLFTWTRDTSLVFKALIDQLTSGEDPSLRGLVDMFTSSQAALQQVSNPSGTVSTGGLGEPKFNIDESAFTGAWGRPQRDGPALRSTAFISYANWLLDNGNTTYVTQTLWPVIKLDLDYVEANWNQTGFDLWEEVNSSSFFTTAVQHRALREGAAFATRIGQTSVVSGYTTQAANVLCFLQSYWNPSGGFVTANTGGGRSGRDANTVLTSIHTFDPAAGCDATTFQPCSDKALSNLKVYVDAFRSIYTINSGIAANAAVATGRYPEDSYQGGNPWYLATIAVAEQLYDALIVWDQLGSINVTTTSLPFFQQFSSTVTTGTFASTSATYTTLTTAVRNFADGFIAVNAQFTPSNGGLAEQFSRSNGQPVSAVDLTWSYAATLTAFHARAGLTYPGWGAAGLTVPAVCSTSGSGSGGGGAGTVAVTFNVQATTFFGENIYITGSVDALQNWSPDNALLLSSANYPIWSITVNLPASTSVQYKFIRKAPGELIWESDPNNQITTPASGTFTQSDTFR
SEQ ID NO:15；来自砖红韧黑伞的GA-3294(HsuGA3)
QSSAVSSYLATESVIAKAGLLANIGPSGSKASGAVSGVVVAAPSTNPDYIFTWTRDSALVFKAIIDSFARGEDATLRTSIDQYVAAQKIQQQVSNPSGTVSSGGLGEPKFNVDLSAFTGAWGRPQRDGPALRATALISYGNSLISASNTSYVLANIWPLVKLDLDYVAANWNQTGFDLWEEVNSSSFFTTAVQHRALRQGAAFATALGQTASVAGYTTQAANVLCFLQSYWNPSQGYITANTGGGRSGKDANTALASIHTFDPTAGCDAATFQPCSDKALSSLKVYVDSFRSIYTVNSAVASPGAVATGRYPEDSYFGGNPWYLATMAVAEQLYDALIVWKAQGSLNVTSTSLAFFQQFSSAVTVGTYASTTATFTTLTTAIANQADGFVAIVQEFTPSTGSLSEQYSRSNGAQLSANDLTWSYASILTAVTARNGLAGDNWGAAGLVVPSSCSTSGTGSSSGGGSSGTVAVTFKVTATTTFGENIYLTGSDDALEDWSPTSTLILSAATYPVWSITVNLPASTALQYKYIRIFNGVTTWESDPNNAFTTVASGTQTLTDTWR
SEQ ID NO:16；来自地中海嗜蓝孢孔菌的GA-3298(FmeGA1)
QTAVDSYVATESPIAKTNLLANIGASGSKSQGAKPGIVIASPSTTNPNYLFTWTRDSSLVFKTIIDQYTNGQDTSLRTLIDEFVSAEATLQQVSNPSGTVSTGGLGEPKFNIDETAFTGAWGRPQRDGPALRATAIINYANYLLANDNSSFVTNTLWPILQLDLDYVAQDWNQTTFDLWEEVDSTSFFTAAVQHRSLREGATLATKIGQTSVVSGYTTQAENILCFMQSFWNAGGNFMTANTGGGRSGKDANTVLASIHTFDSSAGCDAATFQPCSDRALANLKTYVDAFRSIYSINSGIASNAAVATGRYPEDVYFNGNPWYLTTLSVAEQLYDAITVWNAQGSLNVTSVSQPFFALFQSDIAVGTYASSSSTFTSLLSSIKSFADGFVSVVAKYTPSNGGLSEQYSKSDGTPTSAVDLTWSYAAALTAFAARDGFVPASWGAAGLTVPSTCSTSGSGPGSGGTVAVTFNVQATTVFGENIYITGSVDALQNWSPDNAIILSAANYPTWSVTINLPASTTIQYKYIRKFNGAVTWESDPNMQITTPSGGTFIENDVWR
SEQ ID NO:17；来自Punctularia strigosozonata的GA-3301(PstGA2)
QTASAAAYATTEAPIAKAGVLANIGPSGSKSQGAKAGIVIASPSTSNPDYLYTWTRDSSLVFKALIDQYTSGIDTTLRGAIDNFFNAEKILQQVSNPSGTVSTGGLGEPKFNIDETAFTGAWGRPQRDGPALRATALITYANYLYSTGNTTFVSNTLWPVIKLDLDYAANNWNQTTFDLWEEVSSSSFFTTAVQHRSLREGATLATKLGVTSSASTYTSAASSLLCFLQSYWNPAGGYITANTGGGRSGKDANTVLTSIHTFDPAAGCDAVTFQPCSDKALSNLKVYVDSFRSIYGINSGIASNAAVATGRYPEDTYYNGNPWYLTTLAVAEQLYDALIVWNARGSLNVTSTSLAFFQQFSSSVTTGTYPSTSTTFTTLTSAVKTFADGFVAVVAKYTPSSGALSEQFDKSSGSQLSAADLTWSYAAALTAFEARNGTTFASWGAAGLTTSCSSSGSGSGGGSGSSGSVPVNFQETATTVYGENIFIVGSISPLGNWDPNSAIALSAANYPNWQVSISLPASTTFQYKYIRKYNGAVTWESDPNRSFTTPSSGSYNENDTWR
SEQ ID NO:18；来自中曾根白腐菌的GA-3317(PbrGA1)
QTNVNSYVASESAFAKAGLLANIGPSGSKSSGADPGIVIASPSTTNPDYLYTWVRDSSLVFKVLIDQYTTGVDTSLRTLIDEFVSAEAILQQVTNPSGSVTTGGLGEPKFNIDETAFTGSWGRPQRDGPALRSTAIITYANWLLDNGNTSYVTETLWPVLELDLNYVMNNWNQSTYDLWEEIDSSSFWTTAVQHRALRQGSALATRIGQTSMVSGYNTQAANVLCFLQSFWNPSGNYVTANTGGGRSGIDANTVLTSIHTFDPSAGCDATTFQPCSDKALANLKVYTDSFRSIYSVNTGIASNAAVATGRYPEDVYMGGNPWYLATMAAAEQLYDALSVWESQGSLTVTPTSLAFFQMFDSGVQAGTYASSSSTFSSLTSAIQSLADGFVAIHAEYTPSDGSLSEQFSRSNGSPTSAADLTWSYAAALTGFAARNGTQVASWGAAGLTVPATCQGSPGPTVSVTFNVDATTVWGENIYITGSVDALENWSTTTALLLSSANYPIWSITVSLPANTNIQYKYIRIDNGAVTWESDPNNSLTTPASGSYTVNDTWR
SEQ ID NO:19；来自玉米帚枝霉的GA-4686(SzeGA2)
RPGPAKVQLSTRAVGDFINSETPIALEQLLCNIGANGCNSAGVSSGLVIASPSKQDPDYWYTWTRDSALVFKSIVDRFTNSYDAGLQRHITDYIVAQARLQGVSNPSGGFSDGSGLAEPKYNVDGSAFTGAWGRPQRDGPALRAIAIMSYGEWLLDNSYTDTAKNIVWPVVRNDLEYVAQYWNQTGFDLWEEVRGSSFFTIASQHQALVQGYRFAARVGASGAHYQATAPSVLCFLQSFWNPSKGYIDSNINVNDGRTGLDANSILASIHTFDASIGCDSTTFQPCSDKALSNLKAVVDSFRFYNINNGIPKGTALAVGRYAEDVYYNGNPWYLNTLAAAEQLYDAVYVWKQQGSVTVTATSRAFFADLIPNIAVGTYQSGSSTYNSIIQAVSQYGDGFVNVVATYAQSNGSLAEQFSKQDGTPLSARDLTWSYASFLTAAARRAGVIPRPWSGGVEALPGTCSAVSFTGSYTSATATNFPASQTPVTGTGTATGTSPPTTSTTAQPPSTTTACAIAPQVTVNFVARVVTNYGDTVKLVGNVDKLGNWNPGSGVVFSASDYQANNPVWKGSVVLSAGQSIQYKYVKVLSDGTVKWEADPNRTYSVPRSCATAVTRSDTWQT
SEQ ID NO:20；来自草酸青霉的GA-4688(PoxGA5)
APQLSPRATASLDAWLATETTFSLNGILNNIGASGAYAKSAKNGVVIASPSTSSPNYYYTWSRDSALTLKVLIDLFRNGNLDLQTVIEEYINAQATLQTVSNPSGDLSSGAGLGEPKFNVDLSAFTDGWGRPQRDGPALRAISLIEFGNWLIDNGYSSYAINNVWPIVRNDLSYVAQYWSQTGFDLWEEVNSMSFFTVASQHRSLVEGSAFAKRVGASCSWCDSQAPQILCYMQTFWTGSYMNANTGGGRSGKDANTVLASIHTFDPEATCDDITFQPCSPRALANHKVYTDSFRSVYSINSGIAQGVAVAVGRYPEDSYYNGNPWFLSNLAAAEQLYDAIYQWNKIGSITITSTSLAFFKDIYSSAAVGTYASGSSTFTAIISAVKTYADGYVSIVQAHSYTNGSLSEQYDKSTGLSLSARDLTWSYAALLTANMRRNGVVPPSWGASSANTVPSSCSMGSAAGTYATPTATSWPSTLTSGTPGSTTSTPATSTTSTTSTSACTTPTSVAVTFDEIATTTYGENVYIVGSISQLGSWNTANAIALSASQYTSSKHLWYVTINLPAGTTFQYKYIRKESDGSIVWESDPNRSYTVPATCGTTTATENDTWR
下表列出了与TrGA结合使用效果更好的AA，或与不同GA混合使用效果更好的AA：
Figure BDA0001766873880000231
Figure BDA0001766873880000241
氨基酸序列如下所示：
SEQ ID NO:21；来自棒曲霉的AA-1704(AcAA)
LTPAEWRGQSIYFLITDRFARTDGSTTAPCDLSQRAYCGGSWQGIIKQLDYIQGMGFTAIWITPITEQIPQDTAEGSAFHGYWQKDIYNVNSHFGTADDIRALSKALHDRGMYLMIDVVANHMGYNGPGASTDFSTFTPFNSASYFHSYCPINNYNDQSQVENCWLGDNTVALADLYTQHSDVRNIWYSWIKEIVGNYSADGLRIDTVKHVEKDFWTGYTQAAGVYTVGEVLDGDPAYTCPYQGYVDGVLNYPIYYPLLRAFESSSGSMGDLYNMINSVASDCKDPTVLGSFIENHDNPRFASYTKDMSQAKAVISYVILSDGIPIIYSGQEQHYSGGNDPYNREAIWLSGYSTTSELYKFIATTNKIRQLAISKDSSYLTSRNNPFYTDSNTIAMRKGSGGSQVITVLSNSGSNGGSYTLNLGNSGYSSGANLVEVYTCSSVTVGSDGKIPVPMASGLPRVLVPASWMSGSGLCGSSSTTTLVTATTTPTGSSSSTTLATAVTTPTGSCKTATTVPVVLEESVRTSYGENIFISGSIPQLGSWNPDKAVALSSSQYTSSNPLWAVTLDLPVGTSFEYKFLKKEQNGGVAWENDPNRSYTVPEACAGTSQKVDSSWR
SEQ ID NO:22；来自土曲霉的AA-1708(AtAA)
LTPAEWRSQSIYFLLTDRFGRTDNSTTAACDTSDRVYCGGSWQGIINQLDYIQGMGFTAIWITPVTGQFYENTGDGTSYHGYWQQDIYDLNYNYGTAQDLKNLANALHERGMYLMVDVVANHMGYDGAGNTVDYSVFNPFSSSSYFHPYCLISNYDNQTNVEDCWLGDTTVSLPDLDTTSTAVRNIWYDWVADLVANYSIDGLRVDTVKHVEKDFWPGYNSAAGVYCVGEVYSGDPAYTCPYQNYMDGVLNYPIYYQLLYAFESSSGSISDLYNMISSVASSCKDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVITFIFLSDGIPIVYAGQEQHYSGGSDPANREATWLSGYSTSATLYTWIATTNQIRSLAISKDAGYVQAKNNPFYSDSNTIAMRKGTTAGAQVITVLSNKGASGSSYTLSLSGTGYSAGATLVETYTCTTVTVDSSGNLPVPMTSGLPRVFVPSSWVNGSALCNTECTAATSISVLFEELVTTTYGENIYLSGSISQLGSWNTASAVALSASQYTSSNPEWYVSVTLPVGTSFQYKFIKKGSDGSVVWESDPNRSYTVPAGCEGATVTVADTWR
SEQ ID NO:23；来自烟曲霉Af293的AA-2115(AfuAmy1)
LTPAEWRSQSIYFLLTDRFGREDNSTTAACDVTQRLYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWITPVTEQFYENTGDGTSYHGYWQQNIHEVNANYGTAQDLRDLANALHARGMYLMVDVVANHMGYNGAGNSVNYGVFTPFDSATYFHPYCLITDYNNQTAVEDCWLGDTTVSLPDLDTTSTAVRSIWYDWVKGLVANYSIDGLRIDTVKHVEKDFWPGYNDAAGVYCVGEVFSGDPQYTCPYQNYLDGVLNYPIYYQLLYAFQSTSGSISNLYNMISSVASDCADPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVISFMFFSDGIPIVYAGQEQHYSGGADPANREAVWLSGYSTSATLYSWIASTNKIRKLAISKDSAYITSKNNPFYYDSNTLAMRKGSVAGSQVITVLSNKGSSGSSYTLSLSGTGYSAGATLVEMYTCTTLTVDSSGNLAVPMVSGLPRVFVPSSWVSGSGLCGDSISTTATAPSATTSATATRTACAAATAIPILFEELVTTTYGESIYLTGSISQLGNWDTSSAIALSASKYTSSNPEWYVTVTLPVGTSFEYKFVKKGSDGSIAWESDPNRSYTVPTGCAGTTVTVSDTWR
SEQ ID NO:24；来自费氏新萨托菌的AA-2205(NfiAmy1)
LTPAEWRSQSIYFLLTDRFGREDNSTTAACDVTQRLYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWITPVTQQFYENTGDGTSYHGYWQQNIYEVNSNYGTAQDLRKLADALHARGMYLMVDVVANHMGYDGAGNSVDYSVFTPFDSSTYFHTYCLISDYNNQNNVEDCWLGDTTVSLPDLDTTNTAVRTIWYDWVKGLVANYSIDGLRIDTVKHVEKDFWPDYNDAAGVYCVGEVFSGDPSYTCPYQNYMDGVLNYPIYYQLLYAFQSTSGSISNLYNMISSVDSDCADPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVISFMFFSDGIPIVYAGQEQHYSGGADPANREAVWLSGYSTSATLYSWIASTNKIRKLAISKDSAYITSKNNPFYYDSNTLAMRKGSVAGSQVITVLSNKGSSGSSYTLSLSGTGYSAGATLVEMYTCTTLTVDSSGNLAVPMASGLPRVLVPSSWVSGSGLCGDSISTIATTTTSTTKTTTVATTTACASATALPILFEELVTTTYGETIYLTGSISQLGNWDTSSAIALSASKYTSSNPEWYATVTLPVGTSFQYKFFKKESDGSIVWESDPNRSYTVPAGCAGTTVTVSDTWR
SEQ ID NO:25；来自埃默森篮状菌的AA-2285(TemAmy1)
LTPAEWRKQSIYFLLTDRFGRADNSTTAACDVTERIYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWISPVTEQLPQNTGEGEAYHGYWQQEIYTVNSNFGTSDDLLALSKALHDRGMYLMVDVVANHMGYDGDGDSVDYSVFNPFNSSSYFHPYCLITDYSNQTDVEDCWLGDTTVSLPDLNTTETVVRTIWYDWVADLVSNYSIDGLRIDTVKHVEKSFWPGYNSAAGVYCVGEVLDGDPSYTCPYQDYLDGVLNYPIYYQLLYAFESSSGSISNLYNMINSVASECSDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSLAKNVIAFIFFSDGIPIVYAGQEQHYNGGNDPYNREATWLSGYSTTAELYTFIATTNAIRSLAISVDSEYLTYKNDPFYYDSNTLAMRKGSDGLQVITVLSNLGADGSSYTLTLSGSGYSSGTELVEAYTCTTVTVDSNGDIPVPMESGLPRVFLPASSFSGSSLCSSSPSPTTTTSTSTSTTSTACTTATAVAVLFEELVTTTYGENVYLSGSISQLGDWNTDDAVALSAANYTSSNPLWYVTVTLPVGTSFEYKFIKKEENGDVEWESDPNRSYTVPTACTGATETIVDTWR
SEQ ID NO:26；来自绳状青霉的AA-2301(PfuAmy1)
LSAAEWRSQSIYFLLTDRFARTDGSTSAACDLSQRIQAYCGGSWQGIIDHLDYIQGMGFTAVWITPITKQMPQTTSEGTGFHGYWQQDIYSVNPNFGTADDIKALSKAIHDRGMYLMIDVVANHMGYNGAGSSTDFSVFNPFNSASYFHSYCSISDYNNQNQVENCWLGDDTVSLTDLNTQSDQVRTIWYSWVKDLVANYTVDGLRIDTVKHVEKDFWTGYSQAAGVYTLGEVLHGDPAYTCPYQGYVDGVFNYPIYYPLLNAFKSSSGSISSLVSMINSVSSDCKDPTLLGSFIENHDNPRFPSYTSDMSQAKSVIGYVFFADGIPTIYSGQEQHYAGANDPYNREAIWLSGYATDSELYKFIATANEIRKLAISKDSSYLTTRNNAFYTDSNTIAMRKGTSGSQVITVLSNSGSSGGSYTLNLNNHGYSSGAQLVELYTCASVQVDSSGNMPVPMASGLPRVLVPGSWATGSGLCGTSSGTPSKTTTLITTTSQVSSSTSSTCVAATSLPIAFTEKVTTSYGESVFITGSISQLGNWNAANAVALSASQYTSANPVWTVSLDLPVGTTFQYKYIKKEQDGSVVWESDPNRSYTVSSGCTGVKQAVSDSWR
SEQ ID NO:27；来自绳状青霉的AA-2303(PfuAmy3)
LTADEWRSQSIYFLLTDRFGLTSNSTTASCDVADGLYCGGSWQGVINHLDYIQGMGFTAIWITPVTENFEGDTSDGEAYHGYWQQNAYATNSHYGASSDLLKLSEALHARGMYLMVDIVVNNMAYDGAGTSVDYSIFNPFPSESYYHSYCLINYNTYNATDWDDCWEGDTIVSLPDLDTTQTYVKDTWNTWVKSFVANYSIDGLRIDSALHIQQDFFTAFEEAAGVYCIGELDYGDPAVVCPYQSVLSGVLNYPIYWQLLYAFESSSGSISNLYNMINTVKSDCADTSLLGNFIENHDNPRFAYYTSDYSEAKNVISFIFLTDGIPILYYGQEQHYSGGNIPLNREPLWTSDYSTDAQLYTYTKTSNAIRSLAIAKDSAYLTYQNYPIYQDSNTIAMRKGTTGLQLVTVLSNLGANGSSYTLTLSGSGYTSGTVVTELYTCTNVTVSSSGTIAVPMASGSPRAFLPWSSVSGSSLCNSVSSGCTAASTVAVTFEEVVTTTYGQEVYLTGSISQLGSWSTSSAVLLSAAQYTSSDPVWTVTVNLPAGESFEYKFIIVNSDGTVTWESDPNRSYTVPTGCQGLTATVDDTWR
SEQ ID NO:28；来自出芽短梗霉的AA-2506(ApuAmy1)
LTPAQWRSQSIYQVLTDRFARTDGSTTASCDVNKYCGGSFQGIIKKLDYIQQMGFTAIWISPVVKNIYSSGQDGDSYHGYWAQDIYQVNTNFGSAADLVSLSKALHDRGMYLMVDIVTNHMGYNGCGNCVDYSIYNPFNSQSYYHPFCLINYNDQTSVEQCWAGDNTVSLPDLRTEDSNVLSMWNTWIKQLVFNYTIDGLRIDSAKSVDKAFYQPFQQAASVYAVGEVYDGDPNYFCDYQNYLDGMLNYPTYYWITQAFQSTSGSISNLYNGINTMKSTCKDTTLLGSFMENHDVARFASLTSDYALAKNAIAFTMLADGIPIIYQGQEQHFSGSSVPNNREALWLSGYPTSSQLYPFIATVNKIRKQAIKQDTGYLTYKAYPVYSDASTIVMRKGTTGSQVIGVFTNKGSSGSSSFTLSSSASGFTAGQAVTDVLSCTSYTADSNGNIAININAGAPRVLYPTSKLTGSGLCSGSSSTSGTPTTIKTSAVSGGCSTPTAVAVTFTDKVTTQYGQTIKLAGSIPQLGSWNAANAVTLSSAGYTASNPVWSGTVNIPAGQAFSYKFIKVNSDGSVTWESDPNHSYTVPASCGVTTASVSNTWQG
SEQ ID NO:29；来自斯达氏油脂酵母的AA-2522(LstAmy1)
YILRRDCTTVTVLSSPESVTSSNHVQLASHEMCDSTLSASLYIYNDDYDKIVTLYYLTSSGTTGSVTASYSSSLSNNWELWSLSAPAADAVEITGASYVDSDASATYATSFDIPLTTTTTSSSSASATSTSSLTTTSSVSISVSVPTGTAANWRGRAIYQIVTDRFARTDGSTTYLCDVTDRVYCGGSYQGIINMLDYIQGMGFTAIWISPIVENIPDDTGYGYAYHGYWMKDIFALNTNFGTADDLIALATELHNRGMYLMVDIVVNHFAFSGSHADVDYSEYFPYSSQDYFHSFCWITDYSNQTNVEQCWLGDDTVPLVDVNTQLDTVKSEYQSWVQELIANYSIDGLRIDTVKHVQMDFWAPFQEAAGIYAVGEVFDGDPSYTCPYQENLDGVLNYPVYYPVVSAFESVSGSVSSLVDMIDTLKSECTDTTLLGSFLENQDNPRFPSYTSDESLIKNAIAFTMLSDGIPIIYYGQEQGLNGGNDPYNREALWLTGYSTTSTFYKYIASLNQIRNQAIYKDDTYLTYQNWVIYSDSTTIAMRKGFTGNQIITVLSNLGTSGSSYTLTLSNTGYTASSVVYEILTCTAVTVDSSGNLAVPMSSGLPKVFYQESQLVGSGICSM
SEQ ID NO:30；来自稻粳稻群的AA-2676(OsaAmy2)
DKILFQGFNWESWRQSGGWYNLLMGKVDDIVAAGVTHVWLPPPSHSVSTQGYMPGRLYDLDASRYGTSMELKSLISALHGKGIQAIADVVINHRCADYKDSRGIYCIFEGGTPDGRLDWGPHMICRDDTQFSDGTGNLDTGADFAAAPDIDHLNGVVQRELTDWLLWLKSDEVGFDAWRLDFARGYSPEVAKVYIEGTTPVGLAVAELWDSMAYGGDGKPEYNQDAHRQALVDWVDRVGGTASAGMVFDFTTKGIMNTAVEGELWRLIDQQGKAPGVIGWWPAKAVTFVDNHDTGSTQQMWPFPSDKVMQGYAYILTHPGNPCIFYDHFFDWGLKEQIAALVAVRQRNGVTATSSLKIMLHDADAYVAEIDGKVVMKIGSRYDVSSLIPPGFHLAAHGNGYAVWEKSAAAAADHRTSSSASL
SEQ ID NO:31；来自棘孢曲霉的AA-2940(AacAmy2)
AEWRTQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCNTGDQVYCGGTWQGIINHLDYIQGMGFTAVWISPVTEQLSANTADGESYHGYWQQKIYSLNSNFGTADDLKALSAALHERDMYLMVDVVPNHMGYAGSGDSVDYSVFDAFDSSSYFHSYCLITDWDDIDQVRTCWEGDTIVSLPDLYTTQSDVRTIWYDWIEQLVANYSIDGLRIDSALEVEPDFFTGYVSAAGVYSVGEIFNGDPATACPYQGYLDGVLNYPIYFQLLYAFESSSGSISDLYNMINSVASDCSDPTLLGNFIENHDNARFAYYTSDYSQAKNVLSFLFLSDGIPIVYAGEEQHYSGSGVPYNREATWLSGYSTTAELYQWIATTNAIRKLAISLDSNYITYKNNPFYTDSNTIAMRKGSDNLQVITILSNRGSSSSSYTLTLTGTGYAAGTTLIEAYTCTTLTVSSSGSIAVPMASGLPRVYLPASSVNKGSLCGGGTSATTATTTTTLKTTTTTTSTKTTTTSCTATTTSLPITFIELVTTTYGEEIYLTGSIAALGNWATTASGRIALSAANYSASYPEWSATVSVPVGTSFEYKFFKVGTDGSTITWESDPNRVYTVTATACAGATATVVDSWR
SEQ ID NO:32；来自雷塞特纳斯篮状菌的AA-3238(TleAmy1)
LAPAEWRKQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCNVSDRVYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAVWISPVTEQLPQDTGDGAAYHGYWQQRIYELNANFGTESDLKALATALHDRGMYLMLDVVANHMGYAGAGNTVDYSVFDPFDSSSYFHPYCLISDYSNQTNVEDCWLGDTTVSLPDLNTTETAVQNIWYNWVAGLVANYSVDGLRIDTVKHVQKPFWPGYNKAAGVYCVGEVLNGDPSYTCDYQNYLDAVLNYPIYFQLLYAFESSSGSIANLYNMINSVASVCVDPTLLGNFIENHDNPRFAYYTSDYSQAKNVIAYIFLADGIPIVYAGQEQHYSGGNDPYNREATWLSGYSTSAELYTFIATTNQIRKLAISRDSNYLTSRNNPFYYDSNTLAMRKGSSGSQVITVLSNLGSSGSSYTLTLSNTGYSSGTSLTELHTCTSVTVDSSGNIAVPMASGSPRVLVPSSWINGSGLCSGSGTTGCTAATSVPVLFEETVTTTYGENIFISGSISQLGDWDTSQAVALSASQYTASDPLWEVTIDLPVGTSFEYKFIKVEPSGTVVWESDPNRQYTVPTACTGTTETVVATWR
SEQ ID NO:33；来自金黄色嗜热子囊菌的AA-3239(TauAmy1)
ATPAQWRSRSVYFLLTDRFARSDGSTTAACDTSARLDYIQGMGFTAIWISPVTEQLPQDTGDGTAYHGYWQQDIYSLNPNFGTADDLRALADALHARGMYLMVDVVANHMGYAGPGNSVDYSVFNPFNKQEYFHPYCEITNYDDQSNVEDCWLGDTIVSLPDLNTTRSDVEDIWYSWVRALVSNYSVDGLRIDTVKHVQKDFWPGYNDAAGVYCVGEVFDGDPSYTCDYQNYLDGVLNYPMYYPLLRAFSSTSGSISDLYNMINTVKAQCADSTLLGTFVENHDVPRFASYTSDIALAKNAIAFTILSDGIPIIYAGQEQHYSGGNDPANREAVWLSGYSTTSELYQFIAVSNQIRNYAIYVDEGYLTYKAWPIYQDSHTLAIRKGFDGNQVITVLSNLGSSGSSYTLSLSGTGYAAGQQVTEIYSCTDVTADSNGNIAVSMGGGLPKAFFPTAKLAGSGICWKSEQ ID NO:34；来自耐盐短杆菌菌株XFB-BI的AA-3937(BhaAmy3)
GPAAANAETQNTSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTAIQTSPINQVKEGNQGNKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGVKVIVDAVINHTTSDYAAISNEIKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLERALNDGADGFRYDAAKHIELPDDGNYGSQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMNVTASNYGHSIRSALKNRNLSVSNISHYASEVSADKLVTWVESHDTYANDEEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNVMDGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVTINTSTKLPDGRYDNKAGNGSFQVTDGKLTGTINARSVAVLYSDDIANAPHVFLENVKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGQETVFKDGDQLTIGKGDPFGTTYTITLTGTNSDGVTRTQEYSFVKREPSAAKTIGYQNPNHWGQVNAYIYKHDGGRALELTGSWPGKAMIKNADGIYTLTLPADTDTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVQNGLYNDSGLSGSLPH
下表中列出了比TrGA/AkAA进行的更好的GA/AA组合：
Figure BDA0001766873880000311
/>
Figure BDA0001766873880000321
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶或其活性片段，所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶或其活性片段包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:20具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶或其活性片段，所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶或其活性片段包含与SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、或SEQ ID NO:34具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶与SEQ ID NO:22或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:18、16、4、13、8、3、7、19、17、5或12中任一项或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶与SEQ ID NO:32或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:18、13、16、20、8、19、或4中任一项或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶与SEQ ID NO:25或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:18、8、16或13中任一项或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶与SEQ ID NO:29或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:18、16或7中任一项或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶与SEQ ID NO:33或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:16、3、18或7中任一项或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶与SEQ ID NO:27或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:16、18、7、17、8或13中任一项或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶与SEQ ID NO:31或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:18或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶，所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶与SEQ ID NO:21或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:16或其活性片段具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述组合物和方法包括本文描述的多种颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一些实施例中，所述组合物和方法进一步包括其他酶，例如其他α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，包括其他颗粒状淀粉粉水解酶。在一些实施例中，另外的酶选自纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、植酸酶、蛋白酶、海藻糖酶和支链淀粉酶。
在一些实施例中，所述颗粒状淀粉具有5％-60％之间的；10％-50％之间的；15％-45％之间的；15％-30％之间的；20％-45％之间的；20％-30％并且还25％-40％之间的DS。与糖淀粉酶和/或α-淀粉酶接触的步骤在如下pH范围内进行：3.0至7.0；3.0至6.5；3至5.5；3.5至4.5；3.5至7.0；3.5至6.5；4.0至6.0或4.5至5.5。浆料在处于或低于颗粒状淀粉的淀粉糊化温度的温度保持接触。在一些实施例中，所述保持的温度在45℃和70℃之间；在其他实施例中，所述保持的温度在50℃和70℃之间；在55℃和70℃之间；在60℃和70℃之间；在60℃和65℃之间；在55℃和65℃之间和在55℃和68℃之间。在另外的实施例中，所述温度为至少45℃、48℃、50℃、53℃、55℃、58℃、60℃、63℃、65℃和68℃。在其他实施例中，所述温度不超过65℃、68℃、70℃、73℃、75℃和80℃。
根据本文的方法使用的许多颗粒状淀粉的初始淀粉糊化温度范围可以包括但不限于大麦(52℃至59℃)、小麦(58℃至64℃)、黑麦(57℃至70℃)、玉米(62℃至72℃)、高直链淀粉玉米(67℃至80℃)、稻(68℃至77℃)、高粱(68℃至77℃)、马铃薯(58℃至68℃)、树薯/木薯(59℃至69℃)和甘薯(58℃至72℃)。(J.J.M.Swinkels，Starch ConversionTechnology[淀粉转化技术]，第32-38页，Van Beynum等人编辑，(1985)，马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker Inc.)，纽约和The Alcohol Textbook[酒精教科书]，第3版；A Referencefor the Beverage,Fuel and Industrial Alcohol Industries[饮料、燃料和工业酒精工业的参考文献]，Jacques等人编辑，(1999)英国诺丁汉大学出版社(NottinghamUniversity Press,UK))。
在接触步骤中，所述浆料可以保持与本发明的酶接触5分钟至48小时的一段时间；并且还可以是5分钟至24小时的一段时间。在一些实施例中，该时间段在15分钟至12小时之间、15分钟至6小时之间、15分钟至4小时之间以及30分钟至2小时之间。总的乙醇发酵时间通常需要30小时-70小时，例如40小时-70小时、30小时-60小时、50小时-70小时、30小时-50小时或相似。
在接触步骤中，将在25％-90％之间或更多的颗粒状淀粉溶解以产生包含糊精、寡糖和较小的糖如葡萄糖的糖类。在一些实施例中，溶解大于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％和90％的颗粒状淀粉。
在使颗粒状淀粉与α-淀粉酶和葡糖淀粉酶接触一段如上所述的时间之后，获得包含大于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％和97％的葡萄糖的可溶性淀粉底物(醪液)。
在导致产生包含葡萄糖的醪液的接触步骤之后，醪液通常用发酵微生物(例如产乙醇微生物)进行发酵。发酵可以与接触步骤同时进行，在此期间产生的葡萄糖可以通过发酵微生物立即转化成终产物。在这种情况下，在醪液中积累的葡萄糖量将低得多，因为它迅速转化为发酵终产物。
在一些实施例中，发酵生物是酵母，任选地为重组酵母。所述酵母的实例包括但不限于酵母属物种、假丝酵母属物种、毕赤酵母属物种、德克酵母属物种、有孢汉逊酵母属物种、南极假丝酵母属物种、类酵母属物种、结合酵母属物种、囊酵母属物种、伊萨酵母属物种、拟威尔酵母属物种和酒香酵母属物种。具体的酵母包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces baili)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)和鲁氏结合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)。
在一些实施例中，发酵生物是丝状真菌，任选地是重组丝状真菌。丝状真菌的实例包括但不限于木霉属物种、曲霉属物种、青霉属物种和毁丝霉属物种(Myceliopthora sp.)(如来自Dyadic的C1)。
在一些实施例中，所述发酵生物是细菌，任选地是重组细菌。优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属物种、发酵单胞菌属物种、芽孢杆菌属物种、棒状杆菌属物种、短杆菌属物种、链霉菌属物种和克雷伯氏菌属物种。在一些实施例中，细菌能够产生醇，例如乙醇、丁醇、甲醇、丙醇等。
改善的产乙醇微生物的菌株，例如其可以耐受较高的温度，在本领域中是已知的并且可以使用。参见Liu等人(2011)生物工程学报27(7):1049-56。酵母的商业来源包括ETHANOL
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(乐斯福公司(LeSaffre))；/>
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(拉勒曼德公司(Lallemand))；RED/>
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(红星公司(Red Star))；/>
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(帝斯曼配料部(DSMSpecialties))；和/>
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(阿尔泰克公司(Alltech))。
在一些实施例中，发酵生物表达例如本文所述的颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和/或转化α-淀粉酶的酶，其他葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶或淀粉降解酶，例如支链淀粉酶和/或海藻糖酶。其他酶包括植酸酶、纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、木糖还原酶，木糖醇脱氢酶、蛋白酶等。
使用本发明的颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和α-淀粉酶不限于生产特定的发酵终(EOF)产物。在一些实施例中，EOF可以是但并不限于代谢产物，例如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、乙酸、谷氨酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡糖酸钾、衣康酸和其他羧酸，葡萄糖酸-δ-内酯、异抗坏血酸钠、谷氨酸、色氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和其他氨基酸，ω-3脂肪酸、异戊二烯、1,3-丙二醇、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、其他醇以及其他生物化学品和生物材料。
在将醪液进行发酵之前，可将醪液进一步暴露于包含例如回流和/或玉米芯的水溶液中，并将pH调节至pH 3.0至6.0；pH 3.5至5.5或pH4.0至5.5。在本发明的这个实施例中，醪液的％DS可以被稀释。例如，在接触步骤中稀释醪液的DS可能比浆料的％DS少5％至35％之间；5％至30％之间；5％至25％之间；5％至20％之间；5％至20％之间；5％至15％之间；5％至10％之间。在一个非限制性实例中，如果接触步骤中浆料的％DS约为32％，并且醪液进一步暴露于稀释DS为5％至10％的稀释水溶液中，发酵的醪液的DS将在22％至27％之间。在一些具体实施例中，如果接触浆料的DS在30％至35％之间，则稀释浆料的DS将为约20％至30％。
在具体的实施例中，然后使用如上所述的发酵微生物对包含至少10％葡萄糖的醪液进行发酵过程。这些发酵过程描述于The Alcohol Textbook[酒精教科书]，第3版，AReference for the Beverage,Fuel and Industrial Alcohol Industries[饮料、燃料和工业酒精工业的参考文献]，Jacques等人编辑，(1999)英国诺丁汉大学出版社(NottinghamUniversity Press,UK)。
在一些实施例中，使颗粒状淀粉与α-淀粉酶和葡糖淀粉酶接触与通过发酵微生物的发酵同时进行。在此过程中，葡萄糖含量(或其他可发酵糖的葡萄糖含量)保持较低，因为它通过如上所述发酵微生物同时转化成终产物。
如上所述，可以使用本发明组合物和方法生产的一种EOF产品是醇产品，例如乙醇。根据该方法生产的终产物可以从发酵培养基中分离和/或纯化的。分离和纯化方法是已知的，例如通过使介质经受萃取、蒸馏和柱色谱。
在进一步的实施方案中，可以在发酵的任何时间，但优选在发酵结束时，甚至更优选在通过蒸馏除去终产物乙醇之后，通过例如离心分离成液相和固相来分离醪液。该醇可以通过例如蒸馏等方法回收，并可以通过分子筛脱水或超滤进一步纯化。
在一些实施例中，乙醇的产率将大于8％、10％、12％、14％、16％和18％(按体积计)。根据本发明的方法所获得的乙醇可被用作，如燃料乙醇、饮用乙醇或工业乙醇。
除了EOF产物之外，本发明的颗粒状淀粉-转化葡糖淀粉酶和α-淀粉酶可以在发酵副产品如可用作动物饲料或其他应用的干酒糟(DDG)和干酒糟谷物可溶物(DDGS)的生产或品质方面提供优势。
实例
实例1
GA/AA共混物在同步糖化和发酵中的评价
许多葡糖淀粉酶(GA)和α-淀粉酶(AA)作为酶共混物进行组合测试，用于使用玉米面粉底物同时糖化和发酵。
使用的GA在下表列出：
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使用的AA在下表列出：
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为了分析，通过将50％/50％自来水/软化水添加到玉米面粉底物(Azure农场玉米面粉有机(FL131)-Azure标准，美国俄勒冈州达弗)中制备29.4％干固体(wt/wt)的浆料。指定H2SO4调节pH值，然后添加尿素至最终浓度为500ppm。最后，添加0.001％w/w FERMGEN2.5xTM蛋白酶(杜邦公司(DuPont))和0.1％w/w活性干酵母(富酶泰斯公司(Fermentis)，法国-Ethanol Red)。将包含蛋白酶和酵母的底物分成SSF容器，并向每个容器中添加选定的GA/AA酶共混物(0.107mg/g ds的GA和0.016mg/g ds的AA)。将容器在32℃温育，并在三个不同时间点(即24小时、48小时和96小时)收集样品以使用HPLC分析糖、甘油和乙醇含量。
对于实例2和3，用于模型系统筛选的底物是在50mM乙酸钠缓冲液中的1％(w/w)玉米淀粉(西格玛公司(Sigma)，目录号S4126)。α-淀粉酶和葡糖淀粉酶以与STARGENTM002相同的蛋白质比例(即，AkAA:TrGA＝1:6.6)组合。对于α-淀粉酶(AA)的筛选，将里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA；SEQ ID NO:1)用作葡糖淀粉酶组分，并将白曲霉α-淀粉酶(AkAA)(SEQ ID NO:2)用作基准AA。对于葡糖淀粉酶的筛选，使用AkAA作为AA组分，TrGA作为基准GA。通过向150μL的底物添加10μL的葡糖淀粉酶和10μL的α-淀粉酶来开始反应，对于GA和AA，最终剂量分别为10ppm和1.5ppm。在iEMS中分别进行6小时、20小时和28小时完成所述温育(32℃；900rpm)。为了猝灭反应，添加50μL 0.5M NaOH并剧烈混合。然后将板用BioRad密封件密封并以2500rpm离心3分钟。对于HPLC分析，使用5mM H2SO4将上清液以10倍因子稀释。过滤稀释的上清液，并将20μL溶液注入安装有折射率检测器的安捷伦1200系列HPLC中。所使用的分离柱是具有Phenomenex Rezex ROA有机酸保护柱(目录号03B-0138-K0)的PhenomenexRezex-RFQ Fast Fruit柱(目录号00D-0223-K0)。流动相为5mM H2SO4，在85℃流速为1.0mL/min。使用释放的葡萄糖的量计算对于基准AkAA/TrGA组合的性能指数(PI)比率。
对于实例4，HPLC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1200系列)运行条件如下。A PHENOMENEX REZEXTMRFQ-Fast Acid H+(8％)色谱柱在80℃保存。溶剂为0.01NH2SO4，等度流速为1.0ml/min。注入体积10μl。运行时间为5.3分钟。使用折射率检测来检测DP4+、DP3、DP2、DP1、甘油和乙醇。使用适当的校准标准来定量存在的组分。
在所有情况下，相对于对照共混物的性能指数(PI)是相对于葡萄糖释放和/或乙醇产量进行计算。等于对照共混物的性能被指定为1.0的PI。在任何分析时间点或pH下，具有大于1.0的PI的共混物在如下实例中的表中列出并且表示相对于当前组合和方法的改善。除非另外指明，否则本文中使用的所有测量均为重量/重量(wt/wt；w/w)。
实例2
使用不同的GA获得的结果
如实例1中所述，在白曲霉α-淀粉酶(AkAA；SEQ ID NO:2)共混物中单独测试许多不同的GA。在pH 3.5和4.5，测量温育6、20和28小时释放的葡萄糖的量，并除以通过里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA；SEQ ID NO:1)和AkAA的对照组合释放的葡萄糖的浓度。PI值大于1.0的GA结果在下表示出。在与AkAA结合时18GA证明了优越的TrGA性能，在某些情况下显著地提高了两倍。
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实例3
使用不同的AA获得的结果
如实例1所述，在TrGA共混物中单独测试许多不同的AA。在pH 3.5和4.5，测量温育6、20和28小时释放的葡萄糖的量，并除以由TrGA和AkAA的对照组合释放的葡萄糖。PI值大于1.0的AA结果在下表示出。虽然改善不如在实例2中使用不同的GA的情况下显著，但是当与TrGA结合时，十九证明了AkAA的优越的性能。
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实例4
鉴定高性能GA/AA共混物
如在实例1中所述测试许多不同的AA/GA共混物。在pH 3.5，测量温育24、48和96小时后乙醇的浓度，计算平均值并除以TrGA和AkAA参照组合产生的乙醇浓度。
PI大于1.0的共混物在下表列出。
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在此引用的所有专利和出版物，包括在此类专利和出版物中公开的所有序列，出于所有目的以其全文通过引用清楚地结合在此。在产品涉及商标名随时间变化情况下，在申请的有效申请日期之前可以从制造商处获得具有相关产品文献(包括网站)中描述的特征的产品。出于所有目的，这些产品文献也通过引用以其全文结合在此。本文提供的标题并不是对本发明的不同方面或实施例的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面与实施例。尽管优选描述的方法和材料，本公开不受本文所公开的示例性方法和材料的限制，与本文所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本公开的实施方案的实践或测试中。除非从上下文另外说明，否则可以将任何实施例、方面、步骤、特征、要素或限制与任何其他结合使用。
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Claims (14)

1.一种用于处理颗粒状淀粉的方法，所述方法包括：
使包含颗粒状淀粉的浆料与葡糖淀粉酶和颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶在处于或低于所述颗粒状淀粉的糊化温度的温度接触，以产生糖类；其中所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶来自土曲霉(Aspergillus terreus)且氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，并且其中所述葡糖淀粉酶来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)且氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.如权利要求1所述的方法，其中使所述浆料与所述葡糖淀粉酶和所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与相同的葡糖淀粉酶和来自白曲霉(Aspergilluskawachii)的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的淀粉转化。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中使所述浆料与所述葡糖淀粉酶和所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与相同的葡糖淀粉酶和来自白曲霉的、具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的葡萄糖释放。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中使所述浆料与所述葡糖淀粉酶和所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶接触与使相同的浆料与相同的葡糖淀粉酶和来自白曲霉的、具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比导致增加的总葡萄糖当量。
5.如权利要求4所述的方法，其中与通过使相同的浆料与所述葡糖淀粉酶和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触产生的量相比，所述增加的总葡萄糖当量提高至少5％。
6.如权利要求4所述的方法，其中与通过使相同的浆料与所述葡糖淀粉酶和来自白曲霉的、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触产生的量相比，所述增加的总葡萄糖当量提高至少10％。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法导致葡萄糖、麦芽糖、寡糖或其混合物任选地以糖浆的形式产生。
8.如权利要求1或2所述的方法，所述方法进一步包括使所述糖类与发酵生物接触，以产生发酵终产物；其中与使相同的浆料与所述葡糖淀粉酶和来自白曲霉的、具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的α-淀粉酶(AkAA)接触相比，所述接触导致发酵终产物的生产增加。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述发酵终产物是乙醇。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述发酵终产物是非乙醇生物化学品。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中同时添加所述葡糖淀粉酶和所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶。
12.如权利要求8所述的方法，其中同时添加所述葡糖淀粉酶和/或所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶和所述发酵生物。
13.如权利要求1或2所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶和/或所述颗粒状淀粉-转化α-淀粉酶由发酵生物产生。
14.如权利要求1或2所述的方法，所述方法进一步包括向所述浆料中添加另外的酶。
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