JP2021522799A - マルトデキストリン及び特殊シロップを生成するための簡素化プロセス - Google Patents
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)
-
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- C12Y302/01133—Glucan 1,4-alpha-maltohydrolase (3.2.1.133), i.e. maltogenic alpha-amylase
Abstract
【選択図】図1
Description
1. 一態様では、マルトジェニックアミラーゼ(EC3.2.1.133)、β−アミラーゼ(EC3.2.1.2)、プルラナーゼ(EC3.2.1.41)、グルコアミラーゼ(EC3.2.1.3)、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマルトジェニック酵素の実質的非存在下で、デンプン基質を、マルトジェニック酵素を含む従来の多酵素、酸前処理条件により生成されたDEプロファイルと同等のDEプロファイルを有するシロップを生成することができるα−アミラーゼ(EC3.2.1.1)と接触させることを含む、マルトデキストリン及び/又は特殊シロップを生成するための方法であって、方法が、異なる従来の液化α−アミラーゼを利用すること以外は同一のプロセスにおいて、少なくとも1つのpH調節又は温度調節工程を実質的に排除する、方法が提供される。
2. いくつかの実施形態では、段落1の方法は、マルトジェニックアミラーゼ活性を有し得るα−アミラーゼを除く、マルトジェニック酵素の非存在下で実施される。
3. いくつかの実施形態では、段落2の方法は、マルトジェニックアミラーゼ活性を有し得るα−アミラーゼを除く、任意のマルトジェニック酵素の非存在下で実施される。
4. 段落1〜3のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、プロセス工程は、異なる従来の液化α−アミラーゼを不活性化させるために液化物のpHを低下させること、マルトジェニック酵素の最適化性能を促進するために液化物を冷却すること、マルトジェニック酵素を不活性化させるために糖化液を加熱すること、及び生成物を濃縮するために前記糖化液を冷却することからなる群から選択される。
5. 段落1〜4のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、α−アミラーゼは、サイトファーガ種(Cytophaga sp.)由来である。
6. 段落1〜5のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、α−アミラーゼは、配列番号1又はそのバリアントのアミノ酸配列を有するサイトファーガ種(Cytophaga sp.)由来のα−アミラーゼである。
7. 段落1〜5のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、従来の液化α−アミラーゼは、バチルス(Bacillus)由来である。
現在の酵素的プロセスに必要とされるよりも少ない酵素及びより複雑でない条件を用いる、マルトデキストリン及び特殊シロップを生成するための簡素化プロセスに関する組成物及び方法が記載されている。特定のα−アミラーゼは、マルトデキストリン並びに30〜46の範囲のDEを有する1型及び2型の特殊シロップを生成する能力を有し(図1)、これは、より在来式の酸−酵素プロセス(例えば、Shukla,P.and Pletschke,B.I.(eds.)Advances in Enzyme Biotechnology,Springer Science & Business Media,2013を参照)を使用して生成される商業用シロップのプロファイルに適合することが発見された。改善されたプロセスは、追加のマルトジェニック酵素を必要とせず、はるかに単純なプロセス条件を必要とする。本組成物及び方法の利点としては、(i)より少ない冷却及び加熱工程の結果としての省エネ、(ii)工場のスループットの向上及び円滑な運用、並びに(iii)冷却及び加熱工程の排除に起因する時間の節約が挙げられる。
この詳細な説明によると、以下の略語及び定義が適用される。文脈が明白に他のことを指示していない限り、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、複数の対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「酵素」という言及は、複数のそのような酵素を含み、「用量」という言及は、1つ以上の用量及び当業者であれば公知であるその同等物を含む。
以下の略語/頭字語は、他に特に規定しない限り、以下の意味を有する。
EC 酵素委員会
DE デキストロース当量
DP 重合度
GA グルコアミラーゼ
ppm 百万分の1、例えば乾燥固体1g当たりのタンパク質(μg)
sp. 種
w/v 重量/体積
w/w 重量/重量
v/v 体積/体積
(wt%)重量パーセント
℃ 摂氏度
dH2O又はDI 脱イオン水
dIH2O 脱イオン水、Milli−Q濾過
g又はgm グラム
μg マイクログラム
mg ミリグラム
kg キログラム
μL及びμl マイクロリットル
mL及びml ミリリットル
mm ミリメートル
μm マイクロメートル
M モル濃度
mM ミリモル濃度
μM マイクロモル濃度
U 単位
min 分
hr 時間
N 規定
T メートルトン
本明細書で使用する場合、用語「デンプン」は、式(C6H10O5)X[式中、Xは任意の数であり得る]を有するアミロース及びアミロペクチンから構成される植物の複合多糖炭水化物から構成される、任意の物質を指す。この用語には、植物系物質、例えば穀物、穀草類、草類、塊茎及び根、並びにより具体的には、小麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、米、ソルガム、フスマ、キャッサバ、キビ、ミロ、ジャガイモ、サツマイモ及びタピオカから得られた物質が含まれる。用語「デンプン」には、粒状デンプンが含まれる。用語「粒状デンプン」は、生の、すなわち未調理デンプン、例えば糊化を受けていないデンプンを指す。
ギャップ開始ペナルティ:10.0
ギャップ伸長ペナルティ:0.05
タンパク質重量マトリックス:BLOSUMシリーズ
DNA重量マトリックス:IUB
ディレイ発散配列(%):40
ギャップ分離距離:8
DNA遷移重量:0.50
親水性残基のリスト:GPSNDQEKR
負のマトリックスの使用:オフ
トグル残基特異的ペナルティ:オン
トグル親水性ペナルティ:オン
トグル末端ギャップ分離ペナルティ:オフ。
本組成物及び方法の1つの態様は、マルトジェニックアミラーゼ活性を有する追加の酵素の実質的又は完全な非存在下で使用することができるα−アミラーゼ酵素である。例示的なα−アミラーゼは、Jeang,C−L et al.((2002)Applied and Environmental Microbiology,68:3651−54)によって前述されたサイトファーガ種(Cytophaga sp.)由来の野生型α−アミラーゼ(本明細書では「CspAmy2アミラーゼ」と呼ばれる)である。CspAmy2α−アミラーゼポリペプチドの成熟形態のアミノ酸配列は、下記に配列番号1として示した。
マルトデキストリン粉末及び特殊シロップを生成するために使用される現代の酵素的プロセス条件で使用される酵素は、本明細書に概して記載されている。酵素としては、マルトジェニックアミラーゼ(EC3.2.1.133)、β−アミラーゼ(EC3.2.1.2)、プルラナーゼ(EC3.2.1.41)、及びグルコアミラーゼ(EC3.2.1.3)が挙げられる。本組成物及び方法は、これらの酵素のうちの1つ以上の必要性を低減又は排除する。
マルトデキストリン粉末及び特殊シロップを生成するために使用される現代のプロセス条件で使用される酵素は、本明細書に概して記載されている。本組成物及び方法は、特殊シロップの酵素的調製に現在必要とされている1つ以上のプロセス工程の必要性を排除する。例えば、様々な実施形態では、本組成物及び方法は、特殊シロップの生成プロセス中、従来の液化α−アミラーゼ(これは、存在するα−アミラーゼとは異なるα−アミラーゼである)を不活性化するために、液化物のpHを90℃で4.50未満、4.40未満、4.30未満、又は更には4.20未満まで下げる必要性を排除する。他の実施形態では、本組成物及び方法は、液化を実行するために従来のα−アミラーゼを使用した後、グルコアミラーゼ又は他のマルトジェニック酵素の最適化性能のために液化物を55〜65℃まで冷却する必要性を排除する。他の実施形態では、本組成物及び方法は、グルコアミラーゼ又は他のマルトジェニック酵素を不活性化させるために、糖化液を85〜90℃、例えば、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、又は90℃まで加熱する必要性を排除する。他の実施形態では、本組成物及び方法は、生成物を所望水準のDSまで濃縮するために糖化液を55〜60℃まで冷却する必要性を排除する。
単一の酵素的プロセスを使用した特殊シロップ
デンプンスラリーは、60gのコーンスターチ(Sigma Aldrichカタログ番号S4126)を計量し、続いて500mLの三角フラスコに132gの水を添加することによって調製した。スラリーのpHは、1NのHClを使用して、5.60±0.10に調節し、続いて、SPEZYME(登録商標)HT TG(N126Y、F153W、T180H、E187P、I203Y、Y303A、S362A、R377Yの置換、並びにR178及びG179の欠失を有するサイトファーガ種(Cytophaga sp.)からのα−アミラーゼのバリアント)を、デンプンの0.45、0.75、1.00、1.50、2.00、及び2.50kg/Tの量で添加した。最終スラリー容量は、水で200mLまで調節した。液化は、水浴中で、350rpmにて4時間混合を続けて、92℃で実施した。フラスコを4時間でサンプリングし、HPLCを用いてDPプロファイル決定し、還元力(reducing power)に関するLane−Eynon法を用いてDEを決定した(この方法では、混合フェーリング溶液をメチレンブルーを指示薬として使用して、サンプルで滴定する)。フェーリング溶液は、1w/v%のグルコース溶液を用いて標準化した。結果を表1に示す。
様々なDPプロファイルを有する特殊シロップの生成にかかる時間及び用量の影響
デンプンスラリーは、60gのコーンスターチ(Sigma Aldrichカタログ番号S4126)を計量し、続いて500mLの三角フラスコに132gの水を添加することによって調製した。スラリーのpHは、1NのHClを使用して、5.60±0.10に調節し、続いて、SPEZYME(登録商標)HT TGを、デンプンの2.40及び2.90kg/Tの量で添加した。最終スラリー容量は、水で200mLまで調節した。液化は、水浴中で、350rpmにて24時間混合を続けながら、92℃で実施した。フラスコを6、8、10、及び24時間でサンプリングし、HPLCを用いてDPプロファイル決定し、Lane−Eynon法を用いてDEを決定した。結果を表2に示す。
特殊シロップ生成におけるDPプロファイルの進行に対する高固形分の影響
デンプンスラリーは、80gのコーンスターチ(Sigma Aldrichカタログ番号S4126)を計量し、続いて500mLの三角フラスコに132gの水を添加することによって調製した。スラリーのpHは、1NのHClを使用して、5.60±0.10に調節し、続いて、SPEZYME(登録商標)HT TGを、デンプンの1.00、1.50、2.00、2.50、及び2.90kg/Tの量で添加した。最終スラリー容量は、水で200mLまで調節した。液化は、水浴中で、350rpmにて24時間混合を続けながら、92℃で実施した。フラスコを6、8、10、及び24時間でサンプリングし、HPLCを用いてDPプロファイル決定した。結果を表4に示す。
特殊シロップ生成における異なるα−アミラーゼの影響
デンプンスラリーは、80gのコーンスターチ(Sigma Aldrichカタログ番号S4126)を計量し、続いて500mLの三角フラスコに132gの水を添加することによって調製した。スラリーのpHは、1NのHClを使用して、5.60±0.10に調節し、続いて、SPEZYME(登録商標)HT TG、SPEZYME(登録商標)ΑLPHA、SPEZYME(登録商標)RSL、SPEZYME(登録商標)FREDを、デンプンの1.00kg/Tの量で添加した。最終スラリー容量は、水で200mLまで調節した。液化は、水浴中で、350rpmにて24時間混合を続けながら、92℃で実施した。フラスコを6及び24時間でサンプリングし、HPLCを用いてDPプロファイル決定した。結果を表5に示す。
特殊シロップ生成におけるDPプロファイルの進行に対するpH4.50の影響
デンプンスラリーは、80gのコーンスターチ(Sigma Aldrichカタログ番号S4126)を計量し、続いて500mLの三角フラスコに132gの水を添加することによって調製した。スラリーのpHは、1NのHClを使用して、4.50±0.10に調節し、続いて、SPEZYME(登録商標)HT TGを、デンプンの2.00kg/Tで添加した。最終スラリー容量は、水で200mLまで調節した。液化は、水浴中で、350rpmにて24時間混合を続けながら、92℃で実施した。フラスコを6及び24時間でサンプリングし、HPLCを用いてDPプロファイル決定した。結果を表6に示す。
Claims (7)
- マルトジェニックアミラーゼ(EC3.2.1.133)、β−アミラーゼ(EC3.2.1.2)、プルラナーゼ(EC3.2.1.41)、グルコアミラーゼ(EC3.2.1.3)、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマルトジェニック酵素の実質的非存在下で、デンプン基質を、マルトジェニック酵素を含む従来の多酵素、酸前処理条件により生成されたDEプロファイルと同等のDEプロファイルを有するシロップを生成することができるα−アミラーゼ(EC3.2.1.1)と接触させることを含む、マルトデキストリン及び/又は特殊シロップを生成するための方法であって、前記方法が、異なる従来の液化α−アミラーゼを利用すること以外は同一のプロセスにおいて、少なくとも1つのpH調節又は温度調節工程を実質的に排除する、方法。
- マルトジェニックアミラーゼ活性を有し得る前記α−アミラーゼを除く、マルトジェニック酵素の非存在下で実施される、請求項1に記載の方法。
- マルトジェニックアミラーゼ活性を有し得る前記α−アミラーゼを除く、任意のマルトジェニック酵素の非存在下で実施される、請求項2に記載の方法。
- 前記プロセス工程が、異なる従来の液化α−アミラーゼを不活性化させるために液化物のpHを低下させること、マルトジェニック酵素の最適化性能を促進するために前記液化物を冷却すること、前記マルトジェニック酵素を不活性化させるために糖化液を加熱すること、及び前記生成物を濃縮するために前記糖化液を冷却することからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記α−アミラーゼが、サイトファーガ種(Cytophaga sp.)由来である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記α−アミラーゼが、配列番号1又はそのバリアントのアミノ酸配列を有するサイトファーガ種(Cytophaga sp.)由来のα−アミラーゼである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記従来の液化α−アミラーゼが、バチルス(Bacillus)由来である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
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