ES2905323T3 - Variantes de alfa-amilasa derivadas de la alfa amilasa de Cytophaga sp. amylasei (CspAmy2) - Google Patents

Variantes de alfa-amilasa derivadas de la alfa amilasa de Cytophaga sp. amylasei (CspAmy2) Download PDF

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Abstract

Polipéptido de variante de α-amilasa derivado de un polipéptido de α-amilasa original, que comprende al menos una mutación combinable en una posición de aminoácido productiva; donde: (i) la o cada mutación combinable es una mutación que mejora al menos una propiedad enzimática y bioquímica deseable de la variante de α-amilasa en comparación con la α-amilasa original, mientras que no disminuye significativamente la expresión, la actividad o la estabilidad de la variante de α-amilasa, en comparación con la α-amilasa original, (ii) la o cada posición productiva es una posición de aminoácido que puede sustituirse por una pluralidad de residuos de aminoácido diferentes, cada una de cuyas sustituciones da lugar a una variante de α-amilasa que cumple los requisitos de (i), y (iii) la o cada mutación combinable se indica en las listas A, B, C, D, E o F, o en la tabla D, que utiliza SEQ ID NO: 1 para la numeración; y donde la variante de α-amilasa tiene al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, donde la variante de amilasa incluye una mutación combinable en la posición productiva correspondiente a la posición 203 de SEQ ID NO: 1 que es sustitución a Tyr.

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de a-amilasa derivadas de la a amilasa de Cytophaga sp. amylasei (CspAmy2)
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] Se describen composiciones y métodos en relación con variantes de a-amilasas. Las variantes de a-amilasas resultan útiles, por ejemplo, para la licuefacción y sacarificación de almidón, la limpieza de manchas de almidón, el desencolado textil, y la elaboración de productos de panadería y cerveza.
ANTECEDENTES
[0002] El almidón consiste en una mezcla de amilosa (15-30 % p/p) y amilopectina (70-85 % p/p). La amilosa consiste en cadenas lineales de unidades de glucosa enlazada a-1,4 que presentan un peso molecular (PM) de aproximadamente 60 000 a aproximadamente 800000. La amilopectina es un polímero ramificado que contiene puntos de ramificación a-1,6 cada 24-30 unidades de glucosa; su PM puede alcanzar 100 millones.
[0003] Actualmente se producen azúcares a partir de almidón en forma de jarabes de dextrosa concentrados por medio de un proceso de catalización enzimática que implica: (1) licuefacción (o reducción de viscosidad) de almidón sólido con una a-amilasa en dextrinas que presentan un grado medio de polimerización de aproximadamente 7-10, y (2) sacarificación del almidón licuado resultante (es decir, hidrolizado de almidón) con amiloglucosidasa (también denominada glucoamilasa o GA). El jarabe resultante presenta un alto contenido de glucosa. Posteriormente, gran parte del jarabe de glucosa que se produce comercialmente se isomeriza enzimáticamente a una mezcla de dextrosa/fructosa conocida como isojarabe. El jarabe resultante también puede fermentarse con microorganismos, como levadura, para producir productos comerciales que incluyen, por ejemplo, etanol, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, ácido itacónico, glutamato monosódico, gluconatos, lisina, otros ácidos orgánicos, otros aminoácidos y otras sustancias bioquímicas. La fermentación y la sacarificación pueden llevarse a cabo simultáneamente (es decir, un proceso SFS) para lograr mayor economía y eficacia.
[0004] Las a-amilasas hidrolizan almidón, glucógeno, y polisacáridos relacionados mediante escisión aleatoria de enlaces internos a-1,4-glucosídicos. Se han utilizado a-amilasas, especialmente de Bacilli, para varios fines distintos, incluidos la licuefacción y sacarificación de almidón, el desencolado textil, la modificación de almidón en la industria del papel y de la pasta de papel, la elaboración de cerveza y productos de panadería, la producción de jarabes para la industria alimentaria, la producción de materias primas para procesos de fermentación, y para aumentar la digestibilidad en la alimentación animal. Estas enzimas pueden emplearse también para eliminar manchas y suciedad de almidón al lavar los platos y al lavar la ropa.
[0005] WO11/80352A1 da a conocer alfa-amilasas, ácidos nucleicos que codifican las alfa-amilasas y métodos para producir y utilizar las alfa-amilasas. US7498158B2 da a conocer variantes (mutantes) de alfa-amilasas originales de tipo Xermamil, que presentan actividad de alfa-amilasa y que muestran propiedades alteradas en relación con la alfaamilasa original. US2011/0033882A1 da a conocer variantes de alfa-amilasa de B. licheniformis. Declerck et al (J. Mol. Biol. 301, 1041-1057) dan a conocer métodos para sondear determinantes estructurales que especifican la alta termoestabilidad de la alfa-amilasa de bacillus licheniformis. WO03/14358A2 da a conocer alfa-amilasas que se obtienen a partir de a-amilasas de las especies de bacterias Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus licheniformis para su uso en limpieza.
SUMARIO
[0006] La presente invención proporciona polipéptidos de variante de a-amilasa derivados de un polipéptido de aamilasa original, comprendiendo al menos una mutación combinable en una posición de aminoácido productiva; donde: (i) la o cada mutación combinable es una mutación que mejora al menos una propiedad enzimática y bioquímica deseable de la variante de a-amilasa en comparación con la a-amilasa original, mientras que no disminuye significativamente la expresión, la actividad o la estabilidad de la variante de a-amilasa, en comparación con la aamilasa original (ii) la o cada posición productiva es una posición de aminoácido que puede sustituirse por una pluralidad de residuos de aminoácido diferentes, cada una de cuyas sustituciones da lugar a una variante de a-amilasa que cumple los requisitos de (i), y (iii) la o cada mutación combinable se indica en las listas A, B, C, D, E o F, o en la tabla D, que utiliza SEQ ID NO: 1 para la numeración, y donde la variante de a-amilasa tiene al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, donde la variante de amilasa incluye una mutación combinable en la posición productiva correspondiente a la posición 203 de SEQ ID NO: 1 que es sustitución a Tyr.
[0007] En algunas formas de realización, la mutación combinable que es sustitución a Tyr en la posición 203 SEQ ID NO: 1 para la numeración produce una variante de amilasa donde los índices de rendimiento (IR) mínimos en relación con la amilasa parental para (i) la expresión de proteína, (ii) la actividad, y (iii) la estabilidad detergente o la termoestabilidad son mayores o iguales a 0,9, y el IR para cualquiera de (i), (ii), o (iii) que es mayor o igual a 1,0, por lo que el IR para la variante se calcula comparando el rendimiento o la estabilidad de la variante (valor medido) y la amilasa original (valor teórico) con la misma concentración de proteína.
[0008] En algunas formas de realización, la mutación combinable que es sustitución a Tyr en la posición 203 SEQ ID NO: 1 para la numeración produce una variante de amilasa donde los índices de rendimiento (IR) mínimos en relación con la amilasa parental para (i) la expresión de proteína, (ii) la actividad, y (iii) la estabilidad detergente o la termoestabilidad son mayores o iguales a 0,8, y el IR para cualquiera de (i), (ii), o (iii) que es mayor o igual a 1,2, por lo que el IR para la variante se calcula comparando el rendimiento o la estabilidad de la variante (valor medido) y la amilasa original (valor teórico) con la misma concentración de proteína.
[0009] En algunas formas de realización, la mutación combinable que es sustitución a Tyr en la posición 203 SEQ ID NO: 1 para la numeración produce una variante de amilasa donde los índices de rendimiento (IR) mínimos en relación con la amilasa original para (i) la expresión de proteína, (ii) la actividad, y (iii) la estabilidad detergente o la termoestabilidad son mayores o iguales a 0,5, y el IR para cualquiera de (i), (ii), o (iii) que es mayor o igual a 1,5, por lo que el IR para la variante se calcula comparando el rendimiento o la estabilidad de la variante (valor medido) y la amilasa original (valor teórico) con la misma concentración de proteína.
[0010] En algunas formas de realización, la o cada mutación combinable tiene una puntuación de idoneidad de ++, +++ o ++++, haciendo referencia a la tabla C.
[0011] En algunas formas de realización, la o cada mutación combinable tiene una puntuación de idoneidad de +++ o ++++, haciendo referencia a la tabla C.
[0012] En algunas formas de realización, la o cada mutación combinable tiene una puntuación de idoneidad de ++++, refiriéndose a la tabla C.
[0013] En algunas formas de realización, la o cada mutación combinable tiene una puntuación de productividad de 1 o 2, refiriéndose a la tabla B.
[0014] En algunas formas de realización, la variante de amilasa tiene una pluralidad de mutaciones combinables.
[0015] En algunas formas de realización, la variante de amilasa comprende también una deleción correspondiente a un residuo seleccionado del grupo que consiste en Arg-178, Gly-179, Thr-180 y Gly-181 utilizando SEQ ID NO: 1 para la numeración.
[0016] En algunas formas de realización, la variante de amilasa también comprende deleciones correspondientes a los residuos Arg-178 y Gly-179, utilizando SEQ ID NO: 1 para la numeración.
[0017] En algunas formas de realización, la variante de amilasa también comprende un tensioactivo, donde la composición es opcionalmente una composición detergente, por ejemplo, un detergente para lavado de ropa o un aditivo detergente para lavado de ropa.
[0018] La presente invención también proporciona métodos de sacarificación de una composición que comprende almidón para producir una composición que comprende glucosa, comprendiendo los métodos:
(i) poner en contacto la solución que comprende almidón con una cantidad efectiva de la variante de amilasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-11; y
(ii) sacarificar la solución que comprende almidón para producir la composición que comprende glucosa; donde la variante de amilasa cataliza la sacarificación de la solución de almidón a glucosa. La composición que comprende almidón puede comprender almidón licuado, almidón gelatinizado o almidón granular.
[0019] En algunas formas de realización, la sacarificación se lleva a cabo en un rango de temperatura de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 75 °C, opcionalmente donde el rango de temperatura es de 47 °C-74 °C; y/o donde la sacarificación se lleva a cabo en un intervalo de pH de 2,0-7,5, opcionalmente donde el intervalo de pH es de 3,5-5,5, además opcionalmente donde el intervalo de pH es de pH 3,5-4,5.
[0020] En algunas formas de realización, los métodos de la invención comprenden la etapa de fermentar la composición de glucosa para producir un producto final de fermentación (EOF, por sus siglas en inglés).
[0021] Otras composiciones y métodos relacionados con polipéptidos de variante de amilasa, y métodos de uso, de los mismos también se divulgan en el presente documento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS
[0022]
SEQ ID NO: 1 establece la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la amilasa de Cytophaga sp. (CspAmy2).
SEQ ID NO: 2 establece la secuencia de aminoácidos de la forma madura de una variante de amilasa de Cytophaga sp. (CspAmy2-v1) que tiene deleciones tanto de Arginina 178 como de Glicina 179.
SEQ ID NO: 3 establece la secuencia de aminoácidos de la forma inmadura/precursora de la forma variante de amilasa de Cytophaga sp. (CspAmy2-v1) que tiene un péptido señal.
SEQ ID NO: 4 establece la secuencia nucleotídica de un fragmento de ADN sintético (ADN CspAmy2-v1) que codifica la amilasa de CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 2).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0023] Se describen composiciones y métodos en relación con enzimas de variante de amilasa. Las variantes se descubrieron mediante una combinación de enfoques experimentales, como se detalla en los ejemplos adjuntos. En los enfoques se incluye el uso de bibliotecas de evaluación de sitio (SEL, por sus siglas en inglés) y de análisis basado en la estructura. Ejemplos de aplicaciones de las enzimas de variante de amilasa se destinan a la licuefacción y sacarificación de almidón, la limpieza de manchas de almidón en la ropa, la limpieza de vajilla, y otras aplicaciones se destinan al procesamiento textil (p. ej., desencolado), a la alimentación animal para mejorar la digestibilidad, y para elaborar productos de panadería y cerveza. A continuación, se describen con detalle estos y otros aspectos de las composiciones y métodos. El alcance de la invención se define en el pliego de reivindicaciones adjuntas.
[0024] Antes de describir los diversos aspectos y formas de realización de las presentes composiciones y métodos, se describen las siguientes definiciones y abreviaturas.
1. Definiciones y abreviaturas
[0025] De conformidad con esta descripción detallada, se aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Cabe observar que las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. En consecuencia, por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de dichas enzimas, y la referencia a "la dosis" incluye la referencia a una o más dosis y a equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, etc.
[0026] El presente documento se organiza en un número de secciones para facilitar la lectura; sin embargo, el lector apreciará que las afirmaciones realizadas en una sección pueden ser aplicables a otras secciones. De esta forma, los encabezamientos utilizados para las distintas secciones de la exposición no deberían interpretarse como limitativos.
[0027] A menos que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia. A continuación, se proporcionan los siguientes términos.
1.1. Abreviaturas y Acrónimos
[0028] Los siguientes acrónimos/abreviaturas tienen los siguientes significados a no ser que se especifique otra cosa: ABTS Ácido 2,2-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico
AE o AEO Etoxilato de alcohol
AES o AEOS Etoxisulfato de alcohol
AkAA a-amilasa de Aspergillus kawachii
AnGA Glucoamilasa de Aspergillus niger
AOS a-olefinsulfonato
AS Sulfato de alquilo
ADNc ADN complementario
CMC Carboximetilcelulosa
DE Dextrosa equivalente
ADN Ácido desoxirribonucleico
DPn Grado de polimerización de sacárido con n subunidades
ds o DS Materia seca
DTMPA Ácido dietilentriaminopentaacético
EC Comisión de Enzimas
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
EO Óxido de etileno (fragmento de polímero)
EOF Fin de fermentación
GA Glucoamilasa
GAU/g de DS Unidad de actividad de glucoamilasa/gramos de materia seca
HFCS Jarabe de maíz de alta fructosa
HgGA Gucoamilasa de Humicola grisea
IPTG Isopropil p-D-tiogalactósido
IRS Almidón residual insoluble
kDa Kilodalton
LAS Sulfonato de alquilbenceno lineal
LAT, BLA Amilasa de B. licheniformis
PM Peso molecular
MWU Unidad Wohlgemuth modificada; 1,6x10-5 mg/MWU = unidad de actividad NCBI Centro Nacional de Información Biotecnológica
NOBS Nonanoiloxibencenosulfonato
NTA Ácido nitriloacético
OxAm Purastar HPAM 5000L (Danisco US Inc.)
PAHBAH Hidracida de ácido p-hidroxibenzoico
PEG Polietilenglicol
pI Punto isoeléctrico
IR Índice de rendimiento
ppm Partes por millón, p. ej., pg de proteína por gramo de materia seca PVA Poli(alcohol vinílico)
PVP Poli(vinilpirrolidona)
RCF Fuerza centrífuga/centrípeta relativa (es decir, x gravedad)
ARN Ácido ribonucleico
SAS Alcanosulfonato
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio SFS Sacarificación y fermentación simultáneas
SSU/g sólido Unidad de almidón soluble/gramo de materia seca
sp. Especie
TAED Tetraacetilendiamina
Tm Temperatura de fusión
TrGA Glucoamilasa de Trichoderma reesei
p/v Peso/volumen
p/p Peso/peso
v/v Volumen/volumen
%p Porcentaje en peso
°C Grados centígrados
H2O Agua
dH2O o DI Agua desionizada
dIH2O Agua desionizada, filtración Milli-Q
g o gm Gramos
pg Microgramos
mg Miligramos
kg Kilogramos
pL y pl Microlitros
mL y ml Mililitros
mm Milímetros
|jm Micrómetro
M Molar
Mm Milimolar
jM Micromolar
U Unidades
s Segundos
min Minuto/minutos
h Hora/horas
DO Oxígeno disuelto
Ncm Newton centímetro
ETOH etanol
eq. Equivalentes
N Normal
uPWA Variante de a-amilasa derivada de Pyrococcus woesei
PWA a-amilasa de Pyrococcus woesei
MWCO Límite de peso molecular
SSRL Fuente de luz de radiación sincrotrón de Stanford
PDB Base de datos de proteínas
CAZy Base de datos de enzimas activas en carbohidratos
Tris-HCl Tris(hidroximetil)aminometano clorhidrato
HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico
1.2. Definiciones
[0029] Los términos «amilasa» o «enzima amilolítica» se refieren a una enzima que, entre otras cosas, es capaz de catalizar la degradación de almidón. Las a-amilasas son hidrolasas que escinden los enlaces glucosídicos a-D -(1^4) 0 en almidón. Por lo general, las a-amilasas (EC 3.2.1.1; glucanohidrolasa a-D-(1^4)-glucano) se definen como enzimas endoactivas que escinden enlaces a-D -(1^4) O-glucosídicos en la molécula de almidón de manera aleatoria produciendo polisacáridos que contienen tres o más unidades de D-glucosa con enlaces (1-4)-a. En cambio, las enzimas amilolíticas exoactivas, como p-amilasas (EC 3.2.1.2; maltohidrolasa a-D-(1^4)-glucano) y algunas amilasas específicas del producto, como a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133), escinden la molécula de polisacárido desde el extremo no reductor del sustrato. Las p-amilasas, a-glucosidasas (EC 3.2.1.20; glucohidrolasa a-D-glucósido), glucoamilasa (EC 3.2.1.3; glucohidrolasa a-D-(1^4)-glucano) y amilasas específicas del producto, como las maltotetraosidasas (EC 3.2.1.60) y las maltohexaosidasas (EC 3.2.1.98) pueden producir maltooligosacáridos de una longitud concreta o jarabes enriquecidos de maltooligosacáridos concretos.
[0030] En el presente documento, el término «unidades enzimáticas» se refiere a la cantidad de producto formado por unidad de tiempo en las condiciones específicas del ensayo. Por ejemplo, una «unidad de actividad glucoamilasa» (GAU) se define como la cantidad de enzima que produce 1 g de glucosa por hora a partir de sustrato de almidón soluble (4 % DS) a 60 °C con pH 4,2. Una «unidad de almidón soluble» (SSU) es la cantidad de enzima que produce 1 mg de glucosa por minuto a partir de sustrato de almidón soluble (4 % DS) con pH 4,5 a 50 °C. DS hace referencia a «materia seca».
[0031] El término «almidón» se refiere a cualquier material formado por los carbohidratos de polisacáridos complejos de plantas, formado por amilosa y amilopectina con la fórmula (C6H10O5)x, donde «X» puede ser cualquier número. El término incluye materiales de procedencia vegetal como granos, cereales, hierbas, tubérculos y raíces, y más concretamente materiales obtenidos a partir de trigo, cebada, maíz, centeno, arroz, sorgo, salvados, mandioca, mijo, milo, patata, boniato y tapioca. El término "almidón" incluye almidón granular. El término "almidón granular" se refiere a almidón crudo, es decir, no cocido, por ejemplo, almidón que no se ha sometido a gelatinización.
[0032] Los términos «natural», «original» o «de referencia», con respecto a un polipéptido, se refieren a un polipéptido de origen natural que no incluye una sustitución, inserción o deleción artificial en una o más posiciones de aminoácidos. De forma similar, los términos «natural», «original» o «de referencia», con respecto a un polinucleótido, se refieren a un polinucleótido de origen natural que no incluye un cambio de nucleósidos artificial. No obstante, cabe observar que un polinucleótido que codifica un polipéptido natural, original o de referencia no está limitado a un polinucleótido de origen natural, y abarca cualquier polinucleótido que codifique el polipéptido natural, original o de referencia.
[0033] Se entiende que las referencias al polipéptido natural incluyen la forma madura del polipéptido. Un polipéptido «maduro» o una variante del mismo es uno en el cual una secuencia señal está ausente, por ejemplo, escindida de una forma inmadura del polipéptido durante o tras la expresión del polipéptido.
[0034] El término «variante», con respecto a un polipéptido, se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido concreto natural, original o de referencia en cuanto a que este incluye una o más sustituciones, inserciones o deleciones de origen natural o artificial de un aminoácido. Del mismo modo, el término «variante», con respecto a un polinucleótido, se refiere a un polinucleótido que difiere en cuanto a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido específico natural, original o de referencia. La identidad del polipéptido o polinucleótido natural, original o de referencia resultará evidente a partir del contexto.
[0035] En el caso de las presentes a-amilasas, la «actividad» se refiere a actividad a-amilasa, que puede medirse según se describe en el presente documento.
[0036] El término "recombinante", cuando se utiliza en referencia a una célula, un ácido nucleico, una proteína o un vector objetos, indica que el objeto ha sido modificado de su estado nativo. En consecuencia, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos a distintos niveles o en distintas condiciones de las que se hallan en la naturaleza. Los ácidos nucleicos recombinantes difieren de una secuencia nativa en uno o más nucleótidos, y/o están ligados de forma operativa a secuencias heterólogas, p. ej., un promotor heterólogo en un vector de expresión. Las proteínas recombinantes se pueden distinguir de una secuencia nativa por uno o más aminoácidos, y/o están fusionados con secuencias heterólogas. Un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una amilasa un vector recombinante.
[0037] Las «variantes combinatorias» son variantes que comprenden dos o más mutaciones, p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones, deleciones y/o inserciones.
[0038] Las «mutaciones combinables» son mutaciones en cualquier posición de aminoácido que pueden utilizarse para realizar variantes combinatorias. Las mutaciones combinables mejoran al menos una propiedad deseada de la molécula (en este caso, una amilasa), mientras que no reducen significativamente la expresión, actividad ni estabilidad. Las mutaciones combinables pueden agruparse de la siguiente manera:
Grupo A: Una mutación que produce una variante donde los índices de rendimiento (IR) mínimos relativos a una proteína original definida para: (i) la expresión de proteína, (ii) la actividad de micromuestra CS-28 a pH 8 (25 °C) o pH10 (50 °C), o la actividad en el ensayo Ceralpha, o la actividad en los ensayos de aplicación de harina de maíz o almidón de maíz, y (iii) la estabilidad detergente o la termoestabilidad a pH 5,0 o pH 5,7 es mayor o igual a 0,9, y además tiene un IR para cualquiera de estas pruebas que es mayor o igual a 1,0.
Grupo B: Una mutación que produce una variante donde los índices de rendimiento (IR) mínimos relativos a una proteína original definida para: (i) la expresión de proteína, (ii) la actividad de micromuestra CS-28 a pH 8 (25 °C) o pH10 (50 °C), o la actividad en el ensayo Ceralpha, o la actividad en los ensayos de aplicación de harina de maíz o almidón de maíz, y (iii) la estabilidad detergente o la termoestabilidad a pH 5,0 o pH 5,7 es mayor o igual a 0,8, y además tiene un IR para cualquiera de estas pruebas que es mayor o igual a 1,2.
Grupo C: Una mutación que produce una variante donde los índices de rendimiento (IR) mínimos relativos a una proteína original definida para: (i) la expresión de proteína, (ii) la actividad de micromuestra CS-28 a pH 8 (25 °C) o pH10 (50 °C), o la actividad en el ensayo Ceralpha, o la actividad en los ensayos de aplicación de harina de maíz o almidón de maíz, y (iii) la estabilidad detergente o la termoestabilidad a pH 5,0 o pH 5,7 es mayor o igual a 0,5, y además tiene un IR para cualquiera de estas pruebas que es mayor o igual a 1,5.
[0039] Las propiedades y los perfiles de las mutaciones combinables se resumen en la siguiente tabla.
Tabla A. Propiedades y perfiles de rendimiento para cada grupo de mutaciones combinables
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[0040] Las mutaciones combinables preferidas se encuentran en «posiciones productivas», tal como se describe a continuación. En el caso de las presentes amilasas, la «actividad» se refiere a actividad amilasa, que puede medirse según se ha descrito en el presente documento.
[0041] Las posiciones productivas son posiciones de aminoácido que son tolerantes a la sustitución con distintos residuos de aminoácidos, donde las variantes resultantes cumplen un conjunto de criterios de rendimiento para la combinabilidad, tal como se ha expuesto anteriormente. Puede asignarse una Puntuación de productividad a las posiciones productivas de la siguiente manera: a las posiciones donde menos del 15 % de las sustituciones en una posición determinada pertenecen a los grupos A, B o C se les da una Puntuación de productividad de «1». A las posiciones donde menos del 30 %, pero más de o el 15 % de las sustituciones en una posición determinada pertenecen a los grupos A, B o C, se les da una puntuación de productividad de "2". A las posiciones donde menos del 50 %, pero más de o el 30 % de las sustituciones en una posición determinada pertenecen a los grupos A, B o C, se les da una puntuación de productividad de "3". A las posiciones donde el 50 % o más de las sustituciones en una posición determinada pertenecen a los grupos A, B o C se les da una puntuación de productividad de "4". En la siguiente tabla, se describen las puntuaciones de productividad.
Tabla B. Criterios de rendimiento asociados a puntuaciones de productividad
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0042] Las posiciones productivas preferidas son mutaciones combinables.
[0043] La puntuación de idoneidad se refiere a la capacidad para que una o más mutaciones combinables se utilice para hacer variantes combinatorias, en función de los criterios de rendimiento para la combinabilidad (es decir, A, B y C, tal como se ha expuesto anteriormente) en los que se incluye cada una de las mutaciones. Una puntuación de idoneidad más alta indica una mutación o mutaciones que son más adecuadas para su utilización en la fabricación de variantes combinatorias. En la tabla siguiente, se describen las puntuaciones de idoneidad.
Tabla C. Definiciones de las puntuaciones de idoneidad
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[0044] Los términos «recuperado/a(s)», «aislado/a(s)» y «separado/a(s)» se refieren a un compuesto, proteína (polipéptidos), célula, ácido nucleico, aminoácido u otro material o componente especificado que se elimina de al menos un otro material o componente al que se asocia de forma natural como se puede encontrar en la naturaleza. Un polipéptido «aislado» incluye, sin carácter limitativo, un caldo de cultivo que contiene el polipéptido secretado expresado en una célula huésped heteróloga.
[0045] El término «purificado/a(s)» se refiere al material (p. ej., un polipéptido o polinucleótido aislado) que se encuentra en un estado relativamente puro, por ejemplo, al menos aproximadamente un 90 % puro, al menos aproximadamente un 95 % puro, al menos aproximadamente un 98 % puro, o incluso al menos aproximadamente un 99 % puro.
[0046] El término «enriquecido/a(s)» se refiere al material (p. ej., un polipéptido o polinucleótido aislado) que es al menos aproximadamente un 50 % puro, al menos aproximadamente un 60 % puro, al menos aproximadamente un 70 % puro, o incluso al menos aproximadamente un 70 % puro.
[0047] Los términos «termoestable(s)» y «termoestabilidad», en relación con una enzima, se refieren a la capacidad de la enzima para retener actividad tras una exposición a una temperatura elevada. La termoestabilidad de una enzima, tal como una enzima amilasa, se mide por medio de su semivida (t1/2) dada en minutos, horas o días, durante la cual la mitad de la actividad enzimática se pierde en condiciones definidas. La semivida se puede calcular midiendo la actividad de a-amilasa residual tras una exposición (es decir, tras hacer frente) a una temperatura elevada.
[0048] Un «intervalo de pH», en lo relativo a una enzima, se refiere al intervalo de valores de pH en los que la enzima muestra actividad catalítica.
[0049] Los términos «pH estable» y «estabilidad de pH», en lo relativo a una enzima, están relacionados con la capacidad de la enzima para retener actividad en un intervalo amplio de valores de pH para un período de tiempo predeterminado (p. ej., 15 min, 30 min, 1 h).
[0050] El término «secuencia de aminoácidos» es sinónimo de los términos «polipéptido», «proteína» y «péptido», y se utilizan indistintamente. En los casos en los que dichas secuencias de aminoácidos muestran actividad, se puede hacer referencia a estas como una «enzima». Se emplean los códigos convencionales de una letra o de tres letras para los residuos de aminoácidos, estando presentes las secuencias de aminoácido en la orientación habitual aminocarboxi terminal (es decir, N^-C).
[0051] El término «ácido nucleico» abarca ADN, ARN, heterodúplex, y moléculas sintéticas capaces de codificar un polipéptido. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, y pueden ser modificaciones químicas. Los términos «ácido nucleico» y «polinucleótido» se utilizan indistintamente. Dado que el código genético está degenerado, se puede utilizar más de un codón para codificar un aminoácido concreto, y las presentes composiciones y métodos abarcan secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos concreta. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de ácido nucleico se presentan en orientación 5' a 3'.
[0052] La "hibridación" se refiere al proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico forma un dúplex, es decir, pares de bases con una cadena complementaria, como sucede durante las técnicas de hibridación blot y las técnicas de PCR. Como ejemplo de condiciones rigurosas de hibridación, se puede mencionar la hibridación en las siguientes condiciones: 65 °C y 0,1X SSC (donde IX SSC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de Na3 , pH 7,0). Los ácidos nucleicos dúplex hibridados se caracterizan por una temperatura de fusión (Tm), donde una mitad de los ácidos nucleicos hibridados están mal emparejados con la cadena complementaria. Los nucleótidos mal emparejados en el dúplex reducen la Tm. Un ácido nucleico que codifica una variante de a-amilasa puede presentar una Tm reducida en 1 °C - 3 °C o más en comparación con un dúplex formado entre el nucleótido de SEQ ID NO: 2 y su complemento idéntico.
[0053] Una molécula «sintética» se produce mediante síntesis química o enzimática in vitro en lugar de mediante un organismo.
[0054] Los términos «transformado/a(s)», «transformado/a(s) de forma estable» y «transgénico/a(s)», utilizados en referencia a una célula, significan que la célula contiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (p. ej., heteróloga) integrada en su genoma o portada como un episoma que se mantiene a través de múltiples generaciones.
[0055] El término «introducido/a(s)» en el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula significa «transfección», «transformación» o «transducción», como se conoce en la técnica.
[0056] Una «cepa huésped» o «célula huésped» es un organismo en el que se ha introducido un vector de expresión, fago, virus, u otro constructo de ADN, incluyendo un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés (p. ej., una amilasa). Ejemplos de cepas huésped son las células de microorganismos (p. ej., bacterias, hongos filamentosos, y levaduras) capaces de expresar el polipéptido de interés y/o de fermentar sacáridos. El término «célula huésped» incluye protoplastos creados a partir de células.
[0057] El término "heterólogo/a(s)", en referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína que no está presente de forma natural en una célula huésped.
[0058] El término «endógeno/a(s)», en referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína que está presente de forma natural en la célula huésped.
[0059] El término «expresión» se refiere al proceso mediante el que se produce un polipéptido sobre la base de una secuencia de ácido nucleico. El proceso incluye tanto transcripción como traducción.
[0060] Un «marcador selectivo» o «marcador de selección» se refiere a un gen capaz de ser expresado en un huésped para facilitar la selección de células huésped que portan el gen. Entre los ejemplos de marcadores de selección se incluyen, sin carácter limitativo, sustancias antimicrobianas (p. ej., higromicina, bleomicina o cloranfenicol) y/o genes que confieren una ventaja metabólica, como una ventaja nutricional, en la célula huésped.
[0061] Un «vector» se refiere a una secuencia de polinucleótidos diseñada para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de células. Entre los vectores se incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores de transporte, plásmidos, partículas de fago, casetes y similares.
[0062] Un «vector de expresión» se refiere a un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés, cuya secuencia de codificación está ligada de forma operativa a una secuencia de control apropiada capaz de efectuar la expresión del ADN en un huésped adecuado. Dichas secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifique sitios de unión del ribosoma en el ARNm, intensificadores y secuencias que controlen la conclusión de la transcripción y la traducción.
[0063] El término «ligado/a(s) de forma operativa» significa que los componentes específicos se encuentran relacionados (incluyendo, sin carácter limitativo, mediante yuxtaposición), permitiéndoles funcionar de una forma prevista. Por ejemplo, una secuencia reguladora está ligada de forma operativa a una secuencia de codificación de forma que la expresión de la secuencia de codificación está controlada por las secuencias reguladoras.
[0064] Una «secuencia de señal» es una secuencia de aminoácidos adjunta a la parte N-terminal de una proteína, que facilita la secreción de la proteína fuera de la célula. La forma madura de la proteína extracelular carece de la secuencia de señal, que se escinde durante el proceso de secreción.
[0065] «Biológicamente activo/a(s)» se refiere a una secuencia que presenta una actividad biológica específica, como una actividad enzimática.
[0066] El término «actividad específica» se refiere al número de moles de sustrato que pueden convertirse en producto mediante una enzima o preparación de enzima por unidad de tiempo en condiciones específicas. La actividad específica se expresa por lo general en unidades (U)/mg de proteína.
[0067] Según se utiliza en el presente documento, la «dureza del agua» es una medida de los minerales (p. ej., calcio y magnesio) presentes en agua.
[0068] Una «muestra» es una pieza de material como un tejido al que se le ha aplicado una mancha. El material puede ser, por ejemplo, tejido hecho de algodón, poliéster o mezclas de fibras naturales y sintéticas. La muestra puede ser además papel, como papel de filtro o nitrocelulosa, o una pieza de un material duro como cerámica, metal o vidrio. En el caso de las amilasas, la mancha tiene como base almidón, pero puede incluir sangre, leche, tinta, hierba, té, vino, espinacas, salsa, chocolate, huevo, queso, barro, pigmento, aceite, o mezclas de estos compuestos.
[0069] Una «muestra más pequeña» es una sección de la muestra que se ha cortado con un dispositivo perforador de un solo agujero, o que se ha cortado con un dispositivo perforador de 96 agujeros fabricado a medida, donde el patrón de la perforación de múltiples agujeros se empareja con microplacas de 96 pocillos convencionales, o la sección se ha extraído de la muestra de otro modo. La muestra puede ser de textil, papel, metal u otro material adecuado. La mancha puede haberse aplicado a la muestra más pequeña antes o después de que se coloque en el pocillo de una placa de microtitulación de 24, 48 o 96 pocillos. La muestra más pequeña puede realizarse también aplicando una mancha a una parte pequeña de material. Por ejemplo, la muestra más pequeña puede ser una pieza de tejido manchada de 5/8" o 0,25" de diámetro. El perforador fabricado a medida está diseñado de tal forma que reparte simultáneamente 96 muestras a la totalidad de los pocillos de una placa de 96 pocillos. El dispositivo permite el reparto de más de una muestra por pocillo simplemente cargando la misma placa de 96 pocillos varias veces. El dispositivo perforador de múltiples agujeros puede estar diseñado para repartir muestras simultáneamente en una placa de cualquier formato, incluidas, sin carácter limitativo, placas de 24, 48 o 96 pocillos. En otro método posible, la plataforma de ensayo sucia puede ser una perla hecha de metal, plástico, vidrio, cerámica u otro material adecuado que se recubre con el sustrato de suciedad. La una o más perlas recubiertas se colocan entonces en placas de 96, 48 o 24 pocillos o en formatos más grandes, que contienen tampón y enzima adecuados.
[0070] «Un material celular cultivado que comprende una amilasa» u otras expresiones similares, se refieren a un lisado o sobrenadante celular (incluyendo medios) que incluye una amilasa como componente. El material celular puede ser de un huésped heterólogo que prolifera en cultivo con el fin de producir la amilasa.
[0071] Un «porcentaje de identidad de secuencia» significa que una secuencia concreta presenta al menos un cierto porcentaje de residuos de aminoácidos idénticos a los que se encuentran en una secuencia de referencia específica, al alinearse empleando el algoritmo CLUSTAL W con parámetros por defecto. Véase Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680. Los parámetros por defecto para el algoritmo CLUSTAL W son:
Penalización por apertura de hueco: 10,0
Penalización por extensión de hueco: 0,05
Matriz de peso de proteína: BLOSUM
series
Matriz de peso de ADN: IUB
% de retraso de secuencias divergentes: 40
Distancia de separación de hueco: 8
Peso de transiciones de ADN: 0,50
Listar residuos hidrofílicos: GPSNDQEKR
Usar matriz negativa: OFF
Alternar penalizaciones específicas por residuos: ON
Alternar penalizaciones hidrofílicas: ON
Alternar penalización por separación de extremo de OFF.
hueco
[0072] Las deleciones se cuentan como residuos no idénticos, en comparación con una secuencia de referencia. Se incluyen las deleciones que se producen en cualquier terminal. Por ejemplo, una variante con cinco deleciones de aminoácido del C-terminal del polipéptido maduro de CspAmy2 de SEQ ID NO: 1 presentaría un porcentaje de identidad de secuencia del 99 % (612/617 residuos idénticos x 100, redondeado al número entero más próximo) en relación con el polipéptido maduro. 1 tendría un porcentaje de identidad de secuencia de un 99 % (612/617 residuos idénticos x 100, redondeado al número entero más próximo) en relación con el polipéptido maduro. Dicha variante estaría abarcada por una variante que presenta «al menos un 99 % de identidad de secuencia» con un polipéptido de amilasa maduro.
[0073] Las secuencias polipeptídicas "fusionadas" están conectadas, esto es, ligadas de forma operativa, por medio de un enlace peptídico entre dos secuencias de polipéptidos principales.
[0074] El término "hongos filamentosos" se refiere a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina, especialmente la especie Pezizomycotina.
[0075] El término «grado de polimerización» (DP) se refiere al número (n) de unidades de anhidroglucopiranosa en un sacárido determinado. Ejemplos de DP1 son los monosacáridos glucosa y fructosa. Ejemplos de DP2 son los disacáridos maltosa y sacarosa. El término «DE» o «dextrosa equivalente» se define como el porcentaje de azúcar reductor, esto es, D-glucosa, como una fracción de los carbohidratos totales presentes en un jarabe.
[0076] El término «contenido de materia seca» (ds) se refiere a los sólidos totales de una suspensión expresados en porcentaje en peso seco. El término «suspensión» se refiere a una mezcla acuosa que contiene sólidos insolubles.
[0077] La expresión «sacarificación y fermentación simultánea (SFS)» se refiere a un proceso en la producción de sustancias bioquímicas en las que está presente un organismo microbiano, como un microorganismo etanologénico, y al menos una enzima, como una amilasa, durante la misma etapa del proceso. La SFS incluye la hidrólisis simultánea de sustratos de almidón (granular, licuado o solubilizado) a sacáridos, incluida la glucosa, y la fermentación de los sacáridos en alcohol u otro compuesto bioquímico o biomaterial en el mismo recipiente de reacción.
[0078] Un «microorganismo etanologénico» se refiere a un microorganismo con la capacidad de convertir un azúcar u oligosacárido en etanol.
[0079] El término «bebida fermentada» se refiere a cualquier bebida producida por un método que comprende un proceso de fermentación, como una fermentación microbiana, p. ej., una fermentación bacteriana y/o fúngica. La «cerveza» es un ejemplo de dicha bebida fermentada, y se considera que el término «cerveza» comprende cualquier mosto fermentado que se ha producido mediante fermentación/destilación de un material vegetal que contiene almidón. A menudo, la cerveza se produce exclusivamente a partir de malta o adjunto, o cualquier combinación de malta y adjunto. Ejemplos de cervezas incluyen: cerveza de pura malta, cerveza elaborada de acuerdo con el Reinheitsgebot o ley de pureza de 1516, cerveza de fermentación alta o ale, India pale ale, cerveza de fermentación baja o lager, rubia o pilsner, cerveza amarga o bitter, Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, bebida afín a la cerveza, cerveza ligera, cerveza de bajo contenido alcohólico, cerveza baja en calorías, porter, bock, dopplebock, cerveza negra, porter, licor de malta, cerveza sin alcohol, licor de malta sin alcohol y similares, pero también bebidas a base de malta y cereales alternativas, tales como bebidas de malta con sabor a fruta, por ejemplo, bebidas de malta con sabor a cítrico, tales como con sabor a limón, naranja, lima o bayas, bebidas a base de malta con sabor a licor, por ejemplo, licor de malta con sabor a vodka, ron o tequila o bebidas de malta con sabor a café, tales como licor de malta con sabor a cafeína, y similares.
[0080] El término «malta» se refiere a cualquier grano de cereal malteado, como cebada malteada o trigo malteado.
[0081] El término "adjunto" se refiere a cualquier material vegetal que contiene almidón y/o azúcar que no sea malta, tal como la malta de cebada o trigo. Entre los ejemplos de adjuntos, se incluye la sémola de maíz común, la sémola de maíz refinada, la levadura de cerveza molida, el arroz, el sorgo, el almidón de maíz refinado, la cebada, el almidón de cebada, la cebada descascarillada, el trigo, el almidón de trigo, el cereal torrefacto, los copos de cereal, el centeno, la avena, la patata, la tapioca, la mandioca y jarabes, tales como el jarabe de maíz, el jarabe de caña de azúcar, el jarabe de azúcar invertido, jarabes de cebada y/o de trigo y similares.
[0082] El término «pulpa» se refiere a una suspensión acuosa de cualquier material vegetal que contiene almidón y/o azúcar, como malta molida, por ejemplo, que comprende malta de cebada triturada, cebada triturada, y/u otro adjunto o una combinación de los mismos, que se mezcla con agua más adelante para separarse en mosto y bagazos.
[0083] El término «mosto» se refiere al extracto de licor no fermentado tras la extracción de la malta molida durante la molienda.
[0084] El «almidón positivo al yodo» o «IPS», se refiere a (1) amilosa no hidrolizada tras la licuefacción y la sacarificación, o (2) un polímero de almidón retrogradado. Al analizar con yodo el almidón sacarificado o el licor sacarificado, la amilosa con un DPn alto o el polímero de almidón retrogradado se une al yodo y produce un característico color azul. Se denomina por tanto al licor de sacárido «sacárido positivo al yodo», «sacárido azul» o «sac. azul».
[0085] Los términos «almidón retrogradado» o «retrogradación del almidón» se refieren a cambios que ocurren de forma espontánea en una pasta o gel de almidón al envejecer.
[0086] El término «aproximadamente» se refiere a ± 15 % con respecto al valor de referencia.
2. Variantes de a-amilasa
[0087] Un aspecto de las presentes composiciones y métodos son las variantes de enzimas amilasas que son exclusivamente como se definen en las reivindicaciones adjuntas y que se han descubierto utilizando una combinación de enfoques experimentales, incluyendo el uso de bibliotecas de evaluación de sitios (SEL, por sus siglas en inglés) y el análisis basado en la estructura.
2.1 Variantes de a-amilasa basadas en una biblioteca SEL de a-amilasa de Cytophaga sp.
[0088] Una a-amilasa de Cytophaga sp. (en la presente memoria, amilasa CspAmy2") ha sido descrita anteriormente (Jeang,C-L et al. (2002) Applied and Environmental Microbiology, 68:3651-54). La secuencia de aminoácidos de la forma madura del polipéptido de amilasa CspAmy2 se muestra a continuación (SEQ ID NO: 1):
AATNGTMMQY FEWYVPNDGQ QWNRLRTDAP YLSSVGITAV WTPPAYKGTS
QADVGYGPYD LYDLGEFNQK GTVRTKYGTK GELKSAVNTL HSNGIQVYGD
VVMNHKAGAD YTENVTAVEV NPSNRNQETS GEYNIQAWTG FNFPGRGTTY
SNFKWQWFHF DGTDWDQSRS LSRIFKFRGT GKAWDWEVSS ENGNYDYLMY
ADIDYDHPDV VNEMKKWGVW YANEVGLDGY RLDAVKHIKF SFLKDWVDNA
RAATGKEMFT VGEYWQNDLG ALNNYLAKVN YNQSLFDAPL HYNFYAASTG
GGYYDMRNIL NNTLVASNPT KAVTLVENHD TQPGQSLEST VQPWFKPLAY
AFILTRSGGY PSVFYGDMYG TKGTTTREIP ALKSKIEPLL KARKDYAYGT
QRDYIDNPDV IGWTREGDST KAKSGLATVI TDGPGGSKRM YVGTSNAGEI
WYDLTGNRTD KITIGSDGYA TFPVNGGSVS VWVQQ
[0089] En SEQ ID NO: 1, la Arginina 178 y la Glicina 179 están subrayadas. Se ha descrito también una variante de la a-amilasa de Cytophaga sp. que presenta una deleción tanto de Arginina 178 como de Glicina 179 (en el presente documento, CspAmy2-v1) (Shiau, R-J. et al. (2003) Applied and Environmental Microbiology, 69:2383-85). La secuencia de aminoácidos de la forma madura del polipéptido de amilasa CspAmy2-v1 se muestra a continuación como SEQ ID NO: 2:
AATNGTMMQY FEWYVPNDGQ QWNRLRTDAP YLSSVGITAV WTPPAYKGTS
QADVGYGPYD LYDLGEFNQK GTVRTKYGTK GELKSAVNTL HSNGIQVYGD
VVMNHKAGAD YTENVTAVEV NPSNRNQETS GEYNIQAWTG FNFPGRGTTY
SNFKWQWFHF DGTDWDQSRS LSRIFKFTGK AWDWEVSSEN GNYDYLMYAD
IDYDHPDVVN EMKKWGVWYA NEVGLDGYRL DAVKHIKFSF LKDWVDNARA
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DYIDNPDVIG WTREGDSTKA KSGLATVITD GPGGSKRMYV GTSNAGEIWY
DLTGNRTDKI TIGSDGYATF PVNGGSVSVW VQQ
[0090] Las variantes de a-amilasa que incluyen mutaciones combinables se identificaron haciendo una biblioteca de evaluación de sitios (SEL) basada en CspAmy2-v1 y analizando las variantes resultantes para la hidrólisis de harina de maíz y almidón de maíz, el ensayo de termoestabilidad, el rendimiento de limpieza, la estabilidad detergente, la actividad en un ensayo de amilasas estandarizado y los niveles de expresión, cuyos procedimientos detallados se describen en los ejemplos o se conocen de otra manera. Se analizaron las diferentes propiedades enzimáticas y bioquímicas de cada variante y se caracterizaron mediante un valor de índice de rendimiento (IR), que comparaba el rendimiento relativo de la variante con la amilasa CspAmy2-v1 para cada criterio de rendimiento. Un IR que sea superior a 1 (es decir, IR >1) indicaba un rendimiento mejorado por parte de una variante en comparación con CspAmy2-v1, mientras que un IR de 1 (es decir, IR = 1) indicaba una variante con el mismo rendimiento que CspAmy2-v1, y un IR inferior a 1 (es decir, IR <1) indicaba una variante con un rendimiento peor que el de CspAmy2-v1. A continuación, se utilizaron los valores de IR para identificar mutaciones combinables y posiciones productivas.
[0091] Las mutaciones combinables son mutaciones en cualquier posición de aminoácido que mejoran al menos una propiedad deseada de la molécula, mientras que no reducen significativamente la expresión, la actividad ni la estabilidad. Las mutaciones combinables son asignadas a uno de los tres grupos (es decir, A, B o C), como se establece en la presente memoria. Las mutaciones combinables preferidas se encuentran en posiciones productivas. Las posiciones productivas son posiciones de aminoácido que son tolerantes a la sustitución con distintos residuos de aminoácidos, donde las variantes resultantes cumplen un conjunto de criterios de rendimiento para la combinabilidad, tal como se establece en la presente memoria.
[0092] Las mutaciones combinables y las posiciones productivas no deben confundirse con las mutaciones de sitio único previamente identificadas, algunas de las cuales se han encontrado posteriormente mediante ensayo y error para funcionar en combinación con otras mutaciones. Las mutaciones de sitio único previamente identificadas son invariablemente "ganadoras" con respecto a la mejora de cualquier característica de rendimiento o estabilidad. Aunque esto las convierte en mutaciones atractivas para incluirlas en las variantes de amilasas, estas "ganadoras" tienden a afectar negativamente a otras características de rendimiento o estabilidad de las variantes, lo que a menudo requiere realizar mutaciones adicionales para corregir los defectos.
[0093] Por el contrario, las mutaciones combinables pueden ser sólo progresivamente beneficiosas para mejorar cualquier característica de rendimiento o estabilidad de una variante de amilasa. Sin embargo, se seleccionan cuidadosamente para que sean mínimamente perjudiciales para otras características de rendimiento o estabilidad deseadas, lo que las hace muy adecuadas para su uso en combinación con otras mutaciones combinables para construir variantes de amilasas con propiedades enzimáticas y bioquímicas mejoradas deseadas sin que se vean perjudicadas en otras, lo que da lugar a variantes robustas que tienen un buen equilibrio de rendimiento, estabilidad y potencial de expresión.
[0094] Además, basándose en las propiedades enzimáticas y bioquímicas medidas de las variantes de amilasas, se determinaron las puntuaciones de idoneidad de las diferentes mutaciones para hacer variantes combinatorias. La puntuación de idoneidad se refiere a la capacidad para que una o más mutaciones altamente combinables se utilice para hacer variantes combinatorias, en función de los criterios de rendimiento para la combinabilidad (es decir, A, B y C, tal como se ha expuesto anteriormente) en los que se incluye cada una de las mutaciones.
[0095] En la tabla D, se muestran las puntuaciones de idoneidad de sustituciones individuales en CspAmy2-v1. La numeración de posición se basa en la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de CspAmy2 (SEQ ID NO: 1). Los residuos de tipo salvaje en las posiciones indicadas reciben una puntuación de idoneidad de ++. Las sustituciones con mayor probabilidad de ser combinadas con otras mutaciones reciben una puntuación de idoneidad de +++ o, incluso, de ++++. En general, las puntuaciones de idoneidad preferidas son ++, +++ o ++++, +++ o ++++ o, incluso, ++++.
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[0096] Mientras que la evaluación de las mutaciones basada en la puntuación de idoneidad representa un aspecto perfeccionado de las presentes composiciones y métodos, la identificación de las posiciones productivas, que son tolerantes a la sustitución con diferentes residuos de aminoácido, representa una serie de formas de realización significativas.
[0097] Cada posición productiva identificada en las siguientes listas con criterios especificados, y cada sustitución identificada entre paréntesis tras el identificador de posición numérico en cada una de estas listas, representa una mutación, identificada por datos experimentales, que o bien contribuye directamente al rendimiento de una variante de amilasa, o bien se determina que es combinable con otras mutaciones para producir una variante de amilasa con un rendimiento mejorado.
[0098] Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que entran en las puntuaciones de productividad descritas anteriormente de «1», «2», «3» y «4» y las sustituciones en esas posiciones que son combinables se indican a continuación. La numeración de posición se basa en el polipéptido maduro de CspAmy2 (SEQ ID NO: 1).
Lista A:
[0099]
1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P,Q,R,S); 4(N,Q,T);
5(G,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 7(M,I); 8(M,F); 11 (F,Y); 15(V,C,I,L,N,S,T);
20(Q,E); 21(Q,L,T,W); 23(N,A,D,E,F,H,K,M,Q,S,T,V,W,Y); 26(R,K);
27(T,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,W,Y); 28(D,A,E,N);
30(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y); 31(Y,E,F,H,K,M,R,W); 33(S,D,E,G,H,K,N,Q,R);
35(V,H,I,M,N); 38(T,D,N,S); 39(A,S); 40(V,I); 42(T,A,C,I,L,M,V); 45(A,P,S); 46(Y,F,M,T);
48(G,A); 49(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 50(S,D,E,K); 51(Q,S);
52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W); 54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 57(G,K); 58(P,C);
68(N,A,C,E,F,M,S,Y); 70(K,N,R,W); 71(G,A,N); 72(T,G,H,S); 73(V,T); 75(T,C);
81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 82(E,Q); 83(L,F); 84(K,I,Q,V);
85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R); 87(V,I); 88(N,A,D,E,H,Q,R,T); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V);
92(S,A,L,M,R,V); 93(N,D,M,T); 94(G,N); 96(Q,I); 97(V,I); 98(Y,F,W); 101(V,I); 103(M,I,V);
(N,D); 106(K,A,I,V); 107(A,G); 108(G,A,K,R,S); 109(A,P);
(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W); 112(T,A,C,D,E,F,G,I,L,M,P,Q,R,V,W,Y);
(E,D,Y); 114(N,G); 115(V,A,I,M); 116(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W); 117(A,C,S); (V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 119(E,S); 120(V,C); 121(N,K,R,S); 122(P,A,K,Q,R,T);
(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 124(N,D); 126(N,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y);
(E,G,I,K,S,V,Y); 129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y); 130(S,A,G,H,I,R,T,V);
(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W); 132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y);
(Y,A,D,E,F,H,K,L,N,T,V); 134(N,C,D,F,G,H,M,P,Q,S,T,Y); 135(I,H,M,R,V);
(Q,A,F,G,H,I,K,N,T,W,Y); 137(A,V); 138(W,A,D,F,G,H,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y);
(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,S,T,V,Y); 141(F,H,W);
(N,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y); 144(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y); (G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y); 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V);
(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y);
(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W); 151(S,D); 152(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W);
(F,H,W,Y); 154(K,A,E,F,H,N,R,S,T); 156(Q,D,F,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 157(W,N);
(F,A,C,D,E,G,H,I,L,N,P,R,S,T,V,W,Y); 160(F,C); 163(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 164(D,F,N); (W,F,H,P); 166(D,A,C,G,K,M); 167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y);
(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R,T,V,W); 169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y);
(S,C,G,H,N,R,T); 171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T); (R,K,W); 174(I,L); 175(F,A,D,H,L,M,S,V,W,Y); 176(K,L); 177(F,G,H); 182(K,H);
(A,E,K,R); 187(E,P,V); 189(S,A,C,D); 190(S,P); 191(E,A,C,I,L,M,N,T);
(N,F,H,M,R,S,Y); 193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 195(Y,D); 198(L,A,C,G); 200(Y,E,L); (A,L); 203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 206(D,A,C,I,M,Q,Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y); (P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 209(D,C,G,I,K); 210(V,S); 211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T); (N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y); 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 216(K,R); 219(V,E,I,L); (A,T); 225(V,L); 226(G,C,E,K,Q); 227(L,Y); 232(L,R,V); 235(V,A,C,L,T);
(I,L,M,P,Q,R); 239(K,C,M,Q); 240(F,D); 241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y); (F,E,I,V,Y); 243(L,A,I,M,S,T); 244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y); 245(D,E); 246(W,F);
(D,A,N,Q); 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W); 250(A,S); 251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T); (A,C,D,F,H,M,R); 253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V); 254(T,F,I,L,M); 256(K,R);
(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y); 258(M,C,F,I,L,Y); 259(F,P); 260(T,A,L,S,Y); 262(G,A); (Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W); 267(N,D); 269(L,A,I,V);
(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y); 271(A,C,S); 273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 275(Y,F); (L,M); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y); 280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y);
(Y,A,D,G); 283(Q,H,T,V); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 285(L,A); 286(F,L,M); 288(A,V); (Y,H,L,Q); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T); 299(T,E,I,R); 300(G,A,K,L,Q,R);
(G,A,F,H,K,M,Q,R,S,T,Y); 302(G,S); 303(Y,A,F,I,R,T,V,W); 307(R,Q,S);
(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,Y); 310(L,D,E,T); 311(N,D,E,H,K,Q,S,V); 312(N,D,G); (T,A,S); 316(A,K,Q,S); 317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y);
(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y); 320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y);
(K,H,R); 325(L,F,I,M,V); 327(E,D); 335(Q,G); 336(S,A,D); 339(S,Q); 342(Q,E,L);
(P,A,M,W); 348(L,C,G,Q,S); 349(A,G,S,W); 357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y);
(G,D,E,Q,S); 360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 362(S,A,C,E,I,Q,T,V); 363(V,I,L); 368(M,L,W,Y); (K,A,D,H,M,N,R); 374(T,A,K,N,P,Q,S); 375(T,S); 376(T,A,G,H,K,N,Q,S,Y);
(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 378(E,Q); 384(S,D,E,G,H,N,P); 385(K,A,E);
(P,C,D,I,K,L,R,S); 390(L,C,I); 391(K,E,F,L,T,V,Y); 392(A,G); 394(K,E,H,M);
(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 396(Y,C,F,K); 397(A,S);
(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 401(Q,M); 402(R,F,K,L,Q,S,T,V,W,Y); 403(D,S); (Y,W); 405(I,L); 407(N,A,C,D,E,G,H,Q,S); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y); 409(D,N); (V,E,I,K,L,M,R,S,Y); 414(T,A,S); 416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V);
(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y); 419(S,A,E,G,K,P,Q,R,T,V,Y);
(T,A,C,D,E,F,G,H,I,L,P,Q,R,S,V,W,Y); 421(K,A,C,F,G,H,I,L,N,R,S,W,Y);
(A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y);
(S,A); 426(L,C); 427(A,C,G,S); 429(V,C,L,M); 430(I,C,E,L,M); 431(T,A,D);
(G,A,H,N,S); 434(P,D,M,N,Q,R,S); 435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y);
(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 441(Y,C,K,L,N,Q,R,S,W); 442(V,A,I,L,T);
(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W); 447(A,G,K,Q,R,S,T,V); (G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 449(E,Q); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V);
(Y,A,I,L,M,S,V,W); 454(L,A,C,E,F,H,I,K,M,Q,S,T,V,Y); 455(T,A,C,I,L,M,S,V);
(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y); 458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y);
(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W); 460(DE,H,N); 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y); 462(I,V);
(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y); 464(I,V); 465(G,A,M,N,P,Q);
(S,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,R,T,V,W,Y); 467(D,N); 469(Y,C,F,I,L,S,V); 470(A,G);
(T,A,D,E,F,G,H,I,K,N,P,Q,W); 474(V,C); 475(N,A,D,F,G,H,I,K,L,M,P,S,T,V);
(G,A,C,D,E,H,K,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 477(G,A,D,E,H,I,K,P,Q,R,S,T,V,Y); 479(V,C,H,W); (S,G); 481(VA,C,I,L); 482(W,Y); 483(V,I); 484(Q,A,H,K); y
485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
[0100] Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que entran en las puntuaciones de productividad descritas anteriormente «2», «3», y «4» y las sustituciones en esas posiciones que son combinables se indican a continuación. La numeración de posición se basa en la proteína CspAmy2 madura indicada en SEQ ID NO: 1.
Lista B:
[0101]
1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P,Q,R,S);
5(G,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 15(V,C,I,L,N,S,T); 21(Q,L,T,W);
23(N,A,D,E,F,H,K,M,Q,S,T,V,W,Y); 27(T,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,W,Y); 28(D,A,E,N);
30(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y); 31(Y,E,F,H,K,M,R,W); 33(S,D,E,G,H,K,N,Q,R);
35(V,H,I,M,N); 38(T,D,N,S); 42(T,A,C,I,L,M,V); 46(Y,F,M,T);
49(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 50(S,D,E,K); 52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W);
54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y); 70(K,N,R,W); 72(T,G,H,S);
81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 84(K,I,Q,V); 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R);
88(N,A,D,E,H,Q,R,T); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 92(S,A,L,M,R,V); 93(N,D,M,T);
106(K,A,I,V); 108(G,A,K,R,S); 111(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W);
112(T,A,C,D,E,F,G,I,L,M,P,Q,R,V,W,Y); 115(V,A,I,M);
116(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W); 118(V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 121(N,K,R,S);
122(P,A,K,Q,R,T); 123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y);
128(E,G,I,K,S,V,Y); 129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y); 130(S,A,G,H,I,R,T,V);
131(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W); 132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y);
133(Y,A,D,E,F,H,K,L,N,T,V); 134(N,C,D,F,G,H,M,P,Q,S,T,Y); 135(I,H,M,R,V);
136(Q,A,F,G,H,I,K,N,T,W,Y); 138(W,A,D,F,G,H,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y);
140(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,S,T,V,Y); 142(N,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y);
144(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y); 145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y);
147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V); 148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y);
149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y); 150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W);
152(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W); 153(F,H,W,Y); 154(K,A,E,F,H,N,R,S,T);
156(Q,D,F,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 158(F,A,C,D,E,G,H,I,L,N,P,R,S,T,V,W,Y);
163(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 165(W,F,H,P); 166(D,A,C,G,K,M);
167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y); 168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R,T,V,W);
169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 170(S,C,G,H,N,R,T);
171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T);
175(F,A,D,H,L,M,S,V,W,Y); 183(A,E,K,R); 189(S,A,C,D); 191(E,A,C,I,L,M,N,T);
192(N,F,H,M,R,S,Y); 193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 198(L,A,C,G);
203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 206(D,A,C,I,M,Q,Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y);
208(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 209(D,C,G,I,K); 211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T);
212(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y); 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 219(V,E,I,L);
226(G,C,E,K,Q); 235(V,A,C,L,T); 238(I,L,M,P,Q,R); 239(K,C,M,Q);
241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y); 242(F,E,I,V,Y); 243(L,A,I,M,S,T);
244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y); 248(D,A,N,Q); 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W);
251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T); 252(A,C,D,F,H,M,R); 253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V);
254(T,F,I,L,M); 257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y); 258(M,C,F,I,L,Y); 260(T,A,L,S,Y);
266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W); 269(L,A,I,V);
270(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y); 273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S);
277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y); 280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y); 281(Y,A,D,G);
283(Q,H,T,V); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 295(Y,H,L,Q); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T);
299(T,E,I,R); 300(G,A,K,L,Q,R); 301(G,A,F,H,K,M,Q,R,S,T,Y); 303(Y,A,F,I,R,T,V,W);
308(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,Y); 310(L,D,E,T); 311(N,D,E,H,K,Q,S,V);
316(A,K,Q,S); 317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y);
318(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y); 320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y);
321(K,H,R); 325(L,F,I,M,V); 343(P,A,M,W); 348(L,C,G,Q,S); 349(A,G,S,W);
357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y); 358(G,D,E,Q,S); 360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 362(S,A,C,E,I,Q,T,V);
368(M,L,W,Y); 372(K,A,D,H,M,N,R); 374(T,A,K,N,P,Q,S); 376(T,A,G,H,K,N,Q,S,Y);
377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 384(S,D,E,G,H,N,P); 385(K,A,E); 388(P,C,D,I,K,L,R,S);
391(K,E,F,L,T,V,Y); 394(K,E,H,M); 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 396(Y,C,F,K);
400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 402(R,F,K,L,Q,S,T,V,W,Y);
407(N,A,C,D,E,G,H,Q,S); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y); 410(V,E,I,K,L,M,R,S,Y);
416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V); 418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y);
419(S,A,E,G,K,P,Q,R,T,V,Y); 420(T,A,C,D,E,F,G,H,I,L,P,Q,R,S,V,W,Y);
421(K,A,C,F,G,H,I,L,N,R,S,W,Y); 422(A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y);
423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y); 427(A,C,G,S); 429(V,C,L,M); 430(I,C,E,L,M);
433(G,A,H,N,S); 434(P,D,M,N,Q,R,S); 435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y);
437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 441(Y,C,K,L,N,Q,R,S,W); 442(V,A,I,L,T);
444(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W); 447(A,G,K,Q,R,S,T,V);
448(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V);
452(Y,A,I,L,M,S,V,W); 454(L,A,C,E,F,H,I,K,M,Q,S,T,V,Y); 455(T,A,C,I,L,M,S,V);
456(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y); 458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y);
459(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W); 460(DE,H,N); 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y);
463(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y); 465(G,A,M,N,P,Q); 466(S,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,R,T,V,W,Y);
469(Y,C,F,I,L,S,V); 471(T,A,D,E,F,G,H,I,K,N,P,Q,W); 475(N,A,D,F,G,H,I,K,L,M,P,S,T,V);
476(G,A,C,D,E,H,K,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 477(G,A,D,E,H,I,K,P,Q,R,S,T,V,Y); 479(V,C,H,W);
481(VA,C,I,L); 484(Q,A,H,K); y 485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
[0102] Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que entran en las puntuaciones de productividad descritas anteriormente «3» y «4» y las sustituciones en esas posiciones que son combinables, se indican a continuación. La numeración de posición se basa en la proteína CspAmy2 madura indicada en SEQ ID NO: 1.
Lista C:
[0103]
1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P,Q,R,S);
5(G,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 15(V,C,I,L,N,S,T);
23(N,A,D,E,F,H,K,M,Q,S,T,V,W,Y); 27(T,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,W,Y);
30(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y); 31(Y,E,F,H,K,M,R,W); 33(S,D,E,G,H,K,N,Q,R);
42(T,A,C,I,L,M,V); 49(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W);
54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y);
81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R);
88(N,A,D,E,H,Q,R,T); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 92(S,A,L,M,R,V);
111(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W); 112(T,A,C,D,E,F,G,I,L,M,P,Q,R,V,W,Y);
116(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W); 118(V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 122(P,A,K,Q,R,T);
123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y); 128(E,G,I,K,S,V,Y);
129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y); 130(S,A,G,H,I,R,T,V); 131(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W);
132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 133(Y,A,D,E,F,H,K,L,N,T,V);
134(N,C,D,F,G,H,M,P,Q,S,T,Y); 136(Q,A,F,G,H,I,K,N,T,W,Y);
138(W,A,D,F,G,H,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 140(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,S,T,V,Y);
142(N,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y); 144(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y);
145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y); 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V);
148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y);
150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W); 152(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W);
154(K,A,E,F,H,N,R,S,T); 156(Q,D,F,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y);
158(F,A,C,D,E,G,H,I,L,N,P,R,S,T,V,W,Y); 163(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 166(D,A,C,G,K,M);
167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y); 168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R,T,V,W);
169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 170(S,C,G,H,N,R,T);
171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T);
175(F,A,D,H,L,M,S,V,W,Y); 191(E,A,C,I,L,M,N,T); 192(N,F,H,M,R,S,Y);
193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 206(D,A,C,I,M,Q,Y);
207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y); 208(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 209(D,C,G,I,K);
211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T); 212(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y);
215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y);
244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y); 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W);
251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T); 252(A,C,D,F,H,M,R); 253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V);
257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y); 258(M,C,F,I,L,Y);
266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W); 270(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y);
273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y);
280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T);
301(G,A,F,H,K,M,Q,R,S,T,Y); 303(Y,A,F,I,R,T,V,W);
308(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,Y); 311(N,D,E,H,K,Q,S,V);
317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 318(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y);
320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y); 357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y);
360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 362(S,A,C,E,I,Q,T,V); 372(K,A,D,H,M,N,R); 374(T,A,K,N,P,Q,S);
376(T,A,G,H,K,N,Q,S,Y); 377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 384(S,D,E,G,H,N,P);
388(P,C,D,I,K,L,R,S); 391(K,E,F,L,T,V,Y); 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 396(Y,C,F,K);
400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 402(R,F,K,L,Q,S,T,V,W,Y);
407(N,A,C,D,E,G,H,Q,S); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y); 410(V,E,I,K,L,M,R,S,Y);
416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V); 418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y);
419(S,A,E,G,K,P,Q,R,T,V,Y); 420(T,A,C,D,E,F,G,H,I,L,P,Q,R,S,V,W,Y);
421(K,A,C,F,G,H,I,L,N,R,S,W,Y); 422(A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y);
423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y); 434(P,D,M,N,Q,R,S);
435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 441(Y,C,K,L,N,Q,R,S,W);
444(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W); 447(A,G,K,Q,R,S,T,V);
448(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V);
452(Y,A,I,L,M,S,V,W); 454(L,A,C,E,F,H,I,K,M,Q,S,T,V,Y); 455(T,A,C,I,L,M,S,V);
456(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y); 458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y);
459(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W); 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y); 463(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y);
465(G,A,M,N,P,Q); 466(S,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,R,T,V,W,Y); 469(Y,C,F,I,L,S,V);
471(T,A,D,E,F,G,H,I,K,N,P,Q,W); 475(N,A,D,F,G,H,I,K,L,M,P,S,T,V);
476(G,A,C,D,E,H,K,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 477(G,A,D,E,H,I,K,P,Q,R,S,T,V,Y); y 485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
[0104] Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que entran en las puntuaciones de productividad descritas anteriormente «4» y las sustituciones en esas posiciones que son combinables, se indican a continuación. La numeración de posición se basa en la proteína CspAmy2 madura indicada en SEQ ID NO: 1.
Lista D:
[0105]
1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P,Q,R,S);
5(G,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 23(N,A,D,E,F,H,K,M,Q,S,T,V,W,Y);
27(T,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,W,Y); 30(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y);
49(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W);
54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y);
81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R);
89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 111(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W);
112(T,A,C,D,E,F,G,I,L,M,P,Q,R,V,W,Y); 116(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W);
118(V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y);
127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y); 128(E,G,I,K,S,V,Y); 129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y);
131(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W); 132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y);
133(Y,A,D,E,F,H,K,L,N,T,V); 134(N,C,D,F,G,H,M,P,Q,S,T,Y); 136(Q,A,F,G,H,I,K,N,T,W,Y);
138(W,A,D,F,G,H,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 140(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,S,T,V,Y);
142(N,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y); 144(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y);
145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y); 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V);
148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y);
150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W); 152(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W);
156(Q,D,F,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 158(F,A,C,D,E,G,H,I,L,N,P,R,S,T,V,W,Y);
163(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y);
168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R,T,V,W); 169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y);
171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T);
193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y);
208(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T);
212(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y); 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y);
241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y); 244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y);
249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W); 251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T);
253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V); 257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y);
266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W); 270(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y);
273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y);
280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T);
301(G,A,F,H,K,M,Q,R,S,T,Y); 308(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,Y);
317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 318(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y);
320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y); 357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y);
360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 384(S,D,E,G,H,N,P);
388(P,C,D,I,K,L,R,S); 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y);
400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y);
416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V); 418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y);
419(S,A,E,G,K,P,Q,R,T,V,Y); 420(T,A,C,D,E,F,G,H,I,L,P,Q,R,S,V,W,Y);
421(K,A,C,F,G,H,I,L,N,R,S,W,Y); 422(A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y);
423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y); 434(P,D,M,N,Q,R,S);
435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y);
444(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W);
448(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V);
454(L,A,C,E,F,H,I,K,M,Q,S,T,V,Y); 456(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y);
458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y); 459(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W); 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y);
463(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y); 466(S,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,R,T,V,W,Y);
471(T,A,D,E,F,G,H,I,K,N,P,Q,W); 475(N,A,D,F,G,H,I,K,L,M,P,S,T,V);
476(G,A,C,D,E,H,K,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 477(G,A,D,E,H,I,K,P,Q,R,S,T,V,Y); y
485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
[0106] A continuación, se indican posiciones productivas en CspAmy2-v1 adecuadas para modificaciones de carga o hidrofobicidad. La numeración de posición se basa en la proteína CspAmy2 madura indicada en SEQ ID NO: 1. Lista E:
[0107] 1, 5, 15, 23, 30, 31, 49, 68, 111, 112, 116, 123, 127, 128, 129, 131, 132, 134, 140, 142, 144, 147, 150, 152, 153, 168, 170, 171, 183, 187, 192, 203, 207, 209, 211, 212, 232, 241, 243, 244, 253, 266, 277, 280, 300, 301, 308, 320, 357, 362, 377, 388, 400, 402, 408, 416, 420, 423, 448, 450, 454, 455, 456, 458, 466, 475 y 485
[0108] A continuación, se indican las posiciones productivas y las sustituciones en esas posiciones en CspAmy2-v1 adecuadas para modificaciones de carga o hidrofobicidad. La numeración de posición se basa en la proteína CspAmy2 madura indicada en SEQ ID NO: 1.
Lista F:
[0109]
1(A,K,V,Y); 5(G,F,V); 15(V,S); 23(N,K); 30(P,E,K,L,W); 31(Y,F,K,W); 49(T,I); 68(N,Y);
111(Y,D,Q,S,T,W); 112(T,I,W); 116(T,L); 123(S,K); 127(Q,I); 128(E,I,V); 129(T,I);
131(G,H,K); 132(E,G,H,I,M,P,R,T,V,Y); 134(N,D,F,M,Y); 140(G,E,F,H,K); 142(N,D,I,R);
144(P,G,K,L); 147(G,C,E,H,L,R,V); 150(Y,W); 152(N,D,E,L,R); 153(F,H,Y); 168(S,L);
170(S,R); 171(L,H,N,Q,R); 183(A,K); 187(E,P); 192(N,F,Y); 203(I,C); 207(H,E,F); 209(D,G);
211(V,D,E,N,Q); 212(N,D,E); 232(L,R); 241(S,D,E,I,L,W,Y); 243(L,S); 244(K,C); 253(A,R);
266(Q,I,R,W); 277(A,F,L,Y); 280(N,L); 300(G,R); 301(G,H); 308(N,D,E,F,L,R,V,Y);
320(T,E,W); 357(S,E); 362(S,I,V); 377(R,G,H); 388(P,K); 400(T,E,K,L,W,Y); 402(R,F);
408(P,E,R,W); 416(E,C,F,G,H,K,L,N,R,S,V); 420(T,D,E,I,L,R,W);
423(K,E,F,G,M,N,Q,S,V,Y); 448(G,F,H,K,W); 450(I,K,R,T); 454(L,C); 455(T,L,M);
456(G,F,W); 458(R,A,C,D,E,F,I,S); 466(S,I,L); 475(N,D); and 485(Q,E,K,L,Y,Y)
[0110] Aunque las mutaciones anteriores fueron identificadas utilizando una biblioteca SEL basada en CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 2), se sabe que muchas a-amilasas bacterianas (y otras) comparten el mismo pliegue y, a menudo, comparten identidad de secuencia de aminoácidos significativa y, en ocasiones, se benefician de las mismas mutaciones. En el presente caso, las posiciones de aminoácidos correspondientes en otras a-amilasas pueden identificarse fácilmente mediante alineamiento de secuencias de aminoácidos empleando CspAmy2 (SEQ ID NO: 1) o CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 2), utilizando Clustal W con parámetros por defecto. Entre las a-amilasas en las que es posible que las mutaciones expuestas anteriormente produzcan un beneficio de rendimiento se incluyen aquellas que presentan un pliegue similar y/o que presentan un 60 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las amilasas conocidas de Bacillus (p. ej., de B. lichenifomis, B. stearothermophilus, y B. amyloliquifaciens), las amilasas de la familia 13 de la base de datos de enzimas activas en carbohidratos (CAZy), o cualquier amilasa a la que se haya hecho referencia hasta el momento con el término descriptivo «de tipo Termamyl». El lector observará que, en los casos en los que una a-amilasa presenta una mutación de forma natural indicada anteriormente (es decir, en los casos en los que la a-amilasa natural ya comprendía un residuo identificado como una mutación), esta mutación concreta no se aplica, por tanto, a esa a-amilasa. No obstante, otras mutaciones descritas pueden funcionar en combinación con el residuo producido de forma natural en esa posición.
[0111] En algunas formas de realización, las presentes variantes de a-amilasa presentan al menos una mutación combinable en una posición productiva correspondiente a las mutaciones combinables en las posiciones productivas descritas anteriormente en las listas A, B, C, D, E y/o F, y/o una mutación combinable descrita en la tabla D (que utilizan SEQ ID NO: 1 para la numeración) y un grado definido de homología/identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1 o s Eq ID NO: 2, por ejemplo, de al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % de homología/identidad de secuencia de aminoácidos, y presentan al menos la mutación combinable establecida anteriormente. En algunas formas de realización, la puntuación de idoneidad de la al menos una mutación es ++, +++ o ++++. En algunas formas de realización, la puntuación de idoneidad de la al menos una mutación es +++ o ++++. En algunas formas de realización, la puntuación de idoneidad de la al menos una mutación es ++++. En algunas formas de realización, las variantes tienen una pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más) de mutaciones combinables.
[0112] En algunas formas de realización, las presentes variantes de a-amilasa presentan al menos una mutación combinable en una posición productiva correspondiente a las mutaciones combinables en las posiciones productivas descritas anteriormente en las listas A, B, C, D, E y/o F, y/o una mutación combinable descrita en la tabla D (que utilizan SEQ ID NO: 1 para la numeración) y se obtienen de una amilasa original que presenta un grado definido de homología/identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, por ejemplo, de al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % de homología/identidad de secuencia de aminoácidos. En algunas formas de realización, la puntuación de idoneidad de la al menos una mutación es ++, +++ o ++++. En algunas formas de realización, la puntuación de idoneidad de la al menos una mutación es +++ o ++++. En algunas formas de realización, la puntuación de idoneidad de la al menos una mutación es ++++. En algunas formas de realización, las variantes presentan 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más mutaciones combinables.
[0113] En algunas formas de realización, las presentes variantes de a-amilasa presentan una mutación en el bucle ligador de calcio basándose en el trabajo de Suzuki et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:18933-938. Entre los ejemplos de mutaciones, se incluye una deleción o sustitución en uno o más residuos correspondientes a Arg-178, Gly-179, Thr-180 o Gly-181 en SEQ ID NO: 1. En formas de realización concretas, la mutación corresponde a la deleción de Arg-178 y Gly-179 o Thr-180 y Gly-181 (empleando SEQ ID NO: 1 para la numeración). Pueden determinarse residuos homólogos en otras amilasas mediante alineamiento estructural o mediante alineamiento de la estructura primaria, como se ilustra en la Figura 6. En algunas formas de realización, la(s) mutación(es) en el bucle ligador de calcio se combina(n) con cualquiera de las mutaciones combinables mencionadas anteriormente y con mutaciones en posiciones productivas.
2.2 Mutaciones adicionales
[0114] En algunas formas de realización, además de una o más de las mutaciones descritas anteriormente (p. ej., en las secciones 2.1, 2.2 y 2.3), las presentes amilasas incluyen además una o más mutaciones que proporcionan un beneficio de rendimiento o estabilidad adicional. Entre los ejemplos de beneficios de rendimiento se incluyen, sin carácter limitativo, un aumento de la hidrólisis de un sustrato de almidón, un aumento del rendimiento de licuefacción de un grano, cereal u otro sustrato de almidón, un aumento del rendimiento de limpieza, un aumento de la termoestabilidad, un aumento de la estabilidad de almacenamiento, un aumento de la solubilidad, una alteración del perfil de pH, una reducción de la dependencia al calcio, un aumento de la actividad específica, una modificación de la especificidad de sustrato, una modificación de la unión al sustrato, una modificación de la actividad dependiente del pH, una modificación de la estabilidad dependiente del pH, un aumento de la estabilidad oxidativa, y un aumento de la expresión. En algunos casos, el beneficio de rendimiento se lleva a cabo a una temperatura relativamente baja. En algunos casos, el beneficio de rendimiento se lleva a cabo a una temperatura relativamente alta.
[0115] Además, las presentes amilasas pueden incluir cualquier cantidad de sustituciones de aminoácidos conservadoras. En la tabla E, se indican ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadoras.
Tabla E. Sustituciones de aminoácidos conservadoras
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[0116] Como observará el lector, algunas de las mutaciones conservadoras mencionadas anteriormente se pueden producir mediante manipulación genética, mientras que otros se producen mediante la introducción de aminoácidos sintéticos en un polipéptido por medios genéticos o de otro tipo.
[0117] La presente amilasa puede ser «precursora», «inmadura», o «de longitud completa», en cuyo caso incluye una secuencia de señal, o «madura», en cuyo caso carece de una secuencia de señal. Por lo general, las formas maduras de los polipéptidos son las más útiles. A menos que se indique lo contrario, la numeración de residuos de aminoácidos empleada en el presente documento se refiere a las formas maduras de los respectivos polipéptidos de amilasa. Los presentes polipéptidos de amilasa también pueden truncarse para eliminar los N o C-terminales, siempre que los polipéptidos resultantes retengan actividad amilasa.
[0118] La presente amilasa puede ser un polipéptido «quimérico» o «híbrido», en cuanto a que incluye al menos una porción de un primer polipéptido de amilasa y al menos una porción de un segundo polipéptido de amilasa (tales amilasas quiméricas se han «redescubierto» recientemente como amilasas de dominio swap). Las presentes amilasas pueden incluir además secuencias de señal heterólogas, un epítopo para permitir el seguimiento o la purificación, o similares. Los ejemplos de secuencias de señal heterólogas son de amilasa de B. licheniformis (LAT), B. subtilis (AmyE o AprE), y CelA de Streptomyces.
2.3. Nucleótidos que codifican polipéptidos de variantes de amilasa
[0119] En otro aspecto, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de variante de amilasa, como se define en las reivindicaciones adjuntas. El ácido nucleico puede codificar un polipéptido de amilasa concreto, o una amilasa que presenta un grado específico de identidad de secuencia de aminoácidos con la amilasa concreta.
[0120] En un ejemplo, el ácido nucleico codifica una amilasa que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un
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87%, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o incluso al menos un 99 % de identidad/homología con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 (excluyendo la porción del ácido nucleico que codifica la secuencia de señal). Se podrá apreciar que, debido a la degeneración del código genético, una pluralidad de ácidos nucleicos puede codificar el mismo polipéptido.
[0121] En otro ejemplo, el ácido nucleico hibrida en condiciones rigurosas o muy rigurosas a un ácido nucleico que codifica (o complementario a un ácido nucleico que codifica) una amilasa que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos
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86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % de homología/identidad con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO: 2 (excluyendo la porción del ácido nucleico que codifica la secuencia de señal). Dichas condiciones de hibridación se describen en la presente memoria, pero también son conocidas en la técnica.
[0122] Los ácidos nucleicos pueden codificar una amilasa «de longitud completa» («fl» o «FL»), que incluye una secuencia de señal, únicamente la forma madura de una amilasa, que carece de la secuencia de señal, o una forma truncada de una amilasa, que carece del N o C-terminal de la forma madura.
[0123] Un ácido nucleico que codifica una a-amilasa puede estar ligado de forma operativa a varios promotores y reguladores en un vector adecuado para la expresión de la a-amilasa en células huésped. Entre los ejemplos de promotores se incluyen amilasa de B. licheniformis (LAT), B. subtilis (AmyE o AprE), y CelA de Streptomyces. Dicho ácido nucleico también puede encontrarse ligado a otras secuencias de codificación, por ejemplo, para codificar un polipéptido quimérico.
3. Producción de variantes de amilasas
[0124] Las presentes variantes de amilasas pueden producirse en células huésped, por ejemplo, mediante la secreción o la expresión intracelular. Se puede obtener un material de células cultivadas (por ejemplo, un caldo de cultivo de células enteras) que comprende una variante de amilasa tras la secreción de la variante de amilasa en el medio celular.
Opcionalmente, la variante de amilasa puede aislarse de las células huésped, o incluso aislarse del caldo celular, dependiendo de la pureza deseada de la variante de amilasa final. Puede clonarse un gen que codifica una variante de amilasa y expresarse conforme a métodos que se conocen en la técnica. Entre las células huésped adecuadas, se incluyen células bacterianas, fúngicas (incluidas levaduras y hongos filamentosos) y células vegetales (incluidas algas). Entre las células huésped especialmente útiles se incluyen las de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae o Trichoderma reesei. Otras células huésped incluyen células bacterianas, por ejemplo, Bacillus subtilis o B. licheniformis, así como Streptomyces.
[0125] La célula huésped puede expresar además un ácido nucleico que codifica una glucoamilasa homóloga o heteróloga, esto es, una glucoamilasa que no pertenece a la misma especie que la célula huésped, o una o más enzimas distintas. La glucoamilasa puede ser una variante de glucoamilasa, tal como una de las variantes de glucoamilasa expuestas en la patente estadounidense n.° 8,058,033 (Danisco US Inc.), por ejemplo. Asimismo, el huésped puede expresar una o más enzimas, péptidos o proteínas accesorias. Estos pueden favorecer los procesos de licuefacción, sacarificación, fermentación, SFS, etc. Además, la célula huésped puede producir sustancias bioquímicas, además de enzimas utilizadas para digerir la(s) diversa(s) materia(s) prima(s). Dichas células huésped pueden resultar útiles para la fermentación o los procesos simultáneos de fermentación y sacarificación, con el fin de reducir o eliminar la necesidad de añadir enzimas.
3.1. Vectores
[0126] Se puede construir un constructo de ADN que comprende un ácido nucleico que codifica variantes de amilasa para que se exprese en una célula huésped. Los ácidos nucleicos representativos que codifican variantes de amilasas incluyen la SEQ ID NO: 4. Debido a la conocida degeneración del código genético, las variantes de polinucleótidos que codifican una secuencia de aminoácido idéntica pueden diseñarse y realizarse mediante procesos rutinarios. La optimización del uso de codones para una célula huésped concreta también se conoce en la técnica. Los ácidos nucleicos que codifican variantes de amilasas pueden incorporarse en un vector. Los vectores pueden trasladarse a una célula huésped empleando técnicas de transformación conocidas, como las que se exponen más adelante.
[0127] El vector puede ser cualquier vector que pueda transformarse y replicarse en una célula huésped. Por ejemplo, un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una variante de amilasa puede transformarse y replicarse en una célula huésped bacteriana como medio de propagación y amplificación del vector. El vector también puede transformarse en un huésped de expresión, de forma que los ácidos nucleicos codificantes pueden expresarse como una amilasa funcional. Las células huésped que actúan como huéspedes de expresión pueden incluir, por ejemplo, hongos filamentosos. El catálogo de cepas del Fungal Genetics Stock Center (FGSC) indica vectores adecuados para la expresión de células huésped fúngicas. Véase FGSC, Catalogue of Strains, Universidad de Missouri, en www.fgsc.net (última modificación, 17 de enero de 2007)). Un vector representativo es pJG153, un vector de expresión Cre sin promotor que puede replicarse en un huésped bacteriano. Véase Harrison et al. (junio de 2011), Applied Environ. Microbiol. 77: 3916-22. pJG153 puede modificarse empleando técnicas rutinarias para comprender y expresar un ácido nucleico que codifica una variante de amilasa.
[0128] Un ácido nucleico que codifica una variante de amilasa puede estar ligado de forma operativa a un promotor adecuado, lo cual permite la transcripción en la célula huésped. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra actividad transcripcional en la célula huésped elegida y puede derivarse de genes que codifican proteínas homólogas o heterólogas a la célula huésped. Entre los ejemplos de promotores para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de amilasa, especialmente en un huésped bacteriano, se encuentran el promotor del operón lac de E. coli, los promotores del gen de agarasa dagA o celA de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen a-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, los promotores del gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, los promotores de la a-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, los ejemplos de promotores útiles son aquellos que derivan del gen que codifica la tAkA amilasa en Aspergillus oryzae, la proteinasa aspártica en Rhizomucor miehei, la a-amilasa neutra en Aspergillus niger, la a-amilasa estable en ácido de A. niger, la glucoamilasa de A. niger, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa de A. oryzae, o la acetamidasa de A. nidulans. Cuando se expresa un gen que codifica una amilasa en una especie bacteriana como E. coli, se puede seleccionar un promotor adecuado, por ejemplo, de entre un promotor bacteriófago, incluyendo un promotor t 7 y un promotor fago lambda. Entre los ejemplos de promotores adecuados para la expresión en una especie de levadura se incluyen, sin carácter limitativo, los promotores Gal 1 y Gal 10 de Saccharomyces cerevisiae y los promotores AOX1 o AOX2 de Pichia pastoris. cbhl es un promotor endógeno e inducible de T. reesei. Véase Liu et al. (2008) "Improved heterologous gene expression in Trichoderma reesei by cellobiohydrolase I gene (cbh1) promoter optimization," Acta Biochim. Biophys. Sin (Shanghái) 40(2): 158-65.
[0129] La secuencia de codificación puede estar ligada de forma operativa a una secuencia de señal. El ADN que codifica la secuencia de señal puede ser la secuencia de ADN asociada de forma natural con el gen de amilasa que va a expresarse o de un género o especie distinta. Se puede introducir una secuencia de señal y una secuencia promotora que comprenden un constructo de ADN o un vector en una célula huésped fúngica, y pueden derivar de la misma fuente. Por ejemplo, la secuencia de señal es la secuencia de señal cbh1 que está ligada de forma operativa a un promotor cbh1.
[0130] Un vector de expresión puede comprender también un terminador de transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación ligadas de forma operativa a la secuencia de ADN que codifica una variante de amilasa. Las secuencias de terminación y de poliadenilación pueden derivar de forma adecuada de las mismas fuentes que el promotor.
[0131] El vector puede comprender además una secuencia de ADN que permita que el vector se replique en la célula huésped. Entre los ejemplos de tales secuencias se encuentran los orígenes de la replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, y pIJ702.
[0132] El vector puede comprender también un marcador de selección, por ejemplo, un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped aislada, como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o un gen que confiere resistencia antibiótica, como, por ejemplo, resistencia a la amplicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Asimismo, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus, como amdS, argB, niaD y xxsC, un marcador que produzca resistencia a la higromicina, o la selección puede llevarse a cabo mediante cotransformación, como se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, la solicitud internacional PCT WO 91/17243.
[0133] En ciertos aspectos, la expresión intracelular puede resultar ventajosa, por ejemplo, al utilizar algunas bacterias u hongos como células huésped para producir grandes cantidades de amilasa para el enriquecimiento o purificación posterior. La secreción extracelular de amilasa en el medio de cultivo puede utilizarse también para realizar un material de cultivo celular que comprenda la amilasa aislada.
[0134] Normalmente, el vector de expresión incluye los componentes de un vector de clonación, como, por ejemplo, un elemento que permita la replicación autónoma del vector en el organismo huésped seleccionado y uno o más marcadores fenotípicamente detectables para fines de selección. Normalmente, el vector de expresión comprende secuencias de nucleótidos de control, como un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma, señal de inicio de la traducción y, opcionalmente, un gen represor o uno o más genes activadores. Asimismo, el vector de expresión puede comprender una secuencia que codifique una secuencia de aminoácido capaz de dirigir la amilasa a un orgánulo de la célula huésped, como un peroxisoma, o a un compartimento concreto de la célula huésped. Dicha secuencia diana incluye sin carácter limitativo la secuencia SKL. Para la expresión en la dirección de secuencias de control, la secuencia de ácido nucleico de la amilasa se encuentra ligada de forma operativa a las secuencias de control de una forma adecuada en relación con la expresión.
[0135] Los procedimientos empleados para ligar el constructo de ADN que codifica una amilasa, el promotor, el terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a Ed., Cold Spring Harbor, 1989. y 3a Ed., 2001).
3.2. Transformación y cultivo de células huésped
[0136] Una célula aislada que comprende, bien un constructo de ADN, bien un vector de expresión se utiliza ventajosamente como célula huésped en la producción recombinante de una amilasa. La célula puede transformarse con el constructo de ADN que codifica la enzima, integrando de manera conveniente el constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Por lo general, se considera que esta integración supone una ventaja, ya que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped puede llevarse a cabo conforme a métodos habituales, por ejemplo, mediante recombinación homóloga o heteróloga. De forma alternativa, la célula puede transformarse con un vector de expresión según se ha descrito anteriormente en relación con los distintos tipos de células huésped.
[0137] Entre los ejemplos de organismos huésped bacterianos adecuados se encuentran especies de bacterias Grampositivas, como Bacillaceae, incluidas Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus (anteriormente Bacillus) stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, y Bacillus thuringiensis; especies de Streptomyces, como Streptomyces murinus; especies de bacterias ácido-lácticas, incluyendo Lactococcus sp. como Lactococcus lactis; Lactobacillus sp, incluidas Lactobacillus reuteri; Leuconostoc sp.; Pediococcus sp.; y Streptococcus sp. De forma alternativa, se pueden seleccionar como organismo huésped cepas de especies de bacterias Gramnegativas que pertenecen a Enterobacteriaceae, incluida E. coli, o a Pseudomonadaceae.
[0138] Se puede seleccionar un organismo huésped de levadura apropiado de especies de levaduras relevantes desde el punto de vista biotecnológico, entre las que se incluyen, sin carácter limitativo, especies de levaduras como Pichia sp., Hansenula sp., o Kluyveromyces, Yarrowinia, especies de Schizosaccharomyces o una especie de Saccharomyces, incluidas Saccharomyces cerevisiae o una especie que pertenezca a Schizosaccharomyces, como, por ejemplo, la especie S. pombe. Se puede utilizar como organismo huésped una cepa de la especie de levaduras metilotróficas Pichia pastoris. De forma alternativa, el organismo huésped puede ser una especie de Hansenula. Entre los organismos huésped de hongos filamentosos adecuados se incluyen especies de Aspergillus, p. ej., Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori, o Aspergillus nidulans. De forma alternativa, pueden utilizarse como organismo huésped cepas de una especie de Fusarium, p. ej., Fusarium oxysporum, o de una especie de Rhizomucor, como Rhizomucor miehei. Otras cepas adecuadas incluyen las especies Thermomyces y Mucor. Asimismo, puede utilizarse Trichoderma sp. como huésped. En el documento EP 238023, por ejemplo, se describe un procedimiento adecuado para la transformación de células huésped de Aspergillus. Una amilasa expresada por una célula huésped fúngica puede ser glicosilada, esto es, comprenderá un grupo glicosil. El patrón de glicosilación puede ser el mismo o distinto al que presenta la amilasa natural. El tipo y/o grado de glicosilación puede proporcionar cambios en las propiedades enzimáticas y/o bioquímicas.
[0139] Resulta ventajoso eliminar genes de huéspedes de expresión, donde la deficiencia genética puede curarse mediante el vector de expresión transformado. Se pueden emplear métodos conocidos para obtener una célula huésped fúngica que presente uno o más genes inactivados. La inactivación génica puede lograrse mediante la deleción completa o parcial, la inactivación por inserción o a través de cualquier otro medio que provoque que un gen no sea funcional para su finalidad prevista, de forma que se impide que el gen exprese una proteína funcional. Cualquier gen de una especie de T richo de rm a sp. u otro huésped fúngico filamentoso que se ha clonado se puede eliminar; por ejemplo, los genes c b h l, cbh2, e g l l y e g l2. La deleción de genes se puede conseguir insertando una forma del gen que se desea inactivar en un plásmido mediante métodos conocidos en la técnica.
[0140] La introducción de un constructo o vector de ADN en una célula huésped incluye técnicas como la transformación; la electroporación; la microinyección nuclear; la transducción; la transfección, por ejemplo, transfección mediada por lipofección y transfección mediada por DEAE-dextrano; la incubación con precipitado de ADN de fosfato de calcio; el bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos de ADN; y la fusión de protoplastos. En la técnica se conocen métodos generales de transformación. Véase, p. ej., Sambrook e t al. (2001), s u p ra . La expresión de proteína heteróloga en T richo de rm a se describe, por ejemplo, en el documento de patente estadounidense U.S. 6,022,725. Asimismo, se hace referencia a Cao e t a l. (2000) Science 9:991-1001 para la transformación de cepas de A sp e rg illu s . Se pueden construir transformantes genéticamente estables con sistemas de vectores a través de los cuales se integra de forma estable el ácido nucleico que codifica una amilasa en un cromosoma de célula huésped. A continuación, los transformantes se seleccionan y purifican empleando técnicas conocidas.
[0141] La preparación de T rich o d e rm a sp. para la transformación, por ejemplo, puede implicar la preparación de protoplastos de micelios fúngicos. Véase Campbell e t a l. (1989) Curr. Genet. 16: 53-56. Los micelios se pueden obtener a partir de esporas vegetativas germinadas. Los micelios se tratan con una enzima que digiere la pared celular, dando lugar a protoplastos. Los protoplastos se protegen mediante la presencia de un estabilizador osmótico en el medio de suspensión. Estos estabilizadores incluyen sorbitol, manitol, cloruro de potasio, sulfato de magnesio y similares. Normalmente, la concentración de estos estabilizadores varía entre 0,8 M y 1,2 M; por ejemplo, se puede utilizar una solución de 1,2 M de sorbitol en el medio de suspensión.
[0142] La absorción de ADN en la cepa huésped de T richo de rm a sp. depende de la concentración de ion calcio. En general, se utilizan entre aproximadamente 10-50 mM de CaCl2 en una solución de absorción. Otros compuestos adecuados incluyen un sistema tampón, como tampón TE (10 mM de T ris, pH 7,4; 1 mM de EDTA) o 10 Mm de MOPS, pH 6,0 y polietilenglicol. Se cree que el polietilenglicol fusiona las membranas celulares, permitiendo así que los contenidos del medio se liberen en el citoplasma de la cepa de T rich o d e rm a sp. Esta fusión deja frecuentemente múltiples copias del ADN plasmídico integradas en el cromosoma huésped.
[0143] Normalmente, la transformación de T rich o d e rm a sp. emplea protoplastos o células que han sido sometidas a un tratamiento de permeabilidad, normalmente con una densidad de 105 a 107/ml, especialmente 2x106/ml. Se puede mezclar un volumen de 100 pl de estos protoplastos o células en una solución adecuada (p. ej., 1,2 M de sorbitol y 50 mM de CaCh) con el ADN deseado. En general, se añade una concentración alta de PEG a la solución de absorción. Se puede añadir de 0,1 a 1 volumen de 25 % PEG 4000 a la suspensión de protoplastos; no obstante, resulta útil añadir aproximadamente 0,25 volúmenes a la suspensión de protoplastos. También se pueden añadir aditivos, tales como dimetilsulfóxido, heparina, espermidina, cloruro de potasio y similares, a la solución de absorción para facilitar la transformación. Existen procedimientos similares disponibles para otras células huésped fúngicas. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense U.S. 6,022,725.
3.3. Expresión
[0144] Un método para producir una amilasa puede comprender el cultivo de una célula huésped según se ha descrito anteriormente en condiciones propicias para la producción de la enzima, y la recuperación de la enzima de las células y/o del medio de cultivo.
[0145] El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio habitual apropiado para el cultivo de la célula huésped en cuestión y la obtención de la expresión de una amilasa. Los medios apropiados y los componentes de los medios pueden adquirirse gracias a proveedores comerciales, o se pueden preparar conforme a recetas publicadas (p. ej., según se describe en los catálogos de la American Type Culture Collection).
[0146] Una enzima secretada de las células huésped se puede utilizar en una preparación de caldo de cultivo completo. En los presentes métodos, se puede conseguir la preparación de un caldo de fermentación completo gastado de un microorganismo recombinante utilizando cualquier método de cultivo conocido en la técnica que dé como resultado la expresión de una a-amilasa. Puede entenderse, por lo tanto, que la fermentación comprende cultivo en matraz de agitación, fermentación a pequeña o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lotes, por lote alimentado, o en medio sólido) en laboratorios o fermentadores industriales realizada en un medio adecuado y en condiciones que permitan que la amilasa se exprese o se aísle. El término «caldo de fermentación completo gastado» se define en el presente documento como contenido no fraccionado de material de fermentación que incluye medio de cultivo, proteínas extracelulares (p. ej., enzimas), y biomasa celular. Se entiende que el término «caldo de fermentación completo gastado» abarca también la biomasa celular que se ha lisado o permeabilizado empleando métodos conocidos en la técnica.
[0147] Una enzima secretada de las células huésped puede recuperarse convenientemente del medio de cultivo mediante procedimientos conocidos, incluyendo la separación de las células del medio mediante centrifugación o filtración, y la precipitación de componentes proteicos del medio por medio de una sal como sulfato de amonio, y a continuación, empleando procesos cromatográficos, como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares.
[0148] El polinucleótido que codifica una amilasa en un vector puede estar ligado de forma operativa a una secuencia de control capaz de posibilitar la expresión de la secuencia de codificación mediante la célula huésped, es decir, el vector es un vector de expresión. Las secuencias de control pueden modificarse; por ejemplo, mediante la adición de otros elementos reguladores transcripcionales para provocar que el nivel de transcripción dirigida por las secuencias de control sea más sensible a moduladores transcripcionales. Las secuencias de control pueden comprender, en concreto, promotores.
[0149] Las células huésped pueden cultivarse en condiciones adecuadas que permitan la expresión de una amilasa. La expresión de las enzimas puede ser constitutiva, de tal forma que se produzcan continuamente, o inducible, lo cual requiere de un estímulo para iniciar la expresión. En el caso de la expresión inducible, la producción de proteínas se puede iniciar cuando sea conveniente mediante, por ejemplo, la adición de una sustancia inductora al medio de cultivo, como dexametasona, IPTG o soforosa. Los polipéptidos también se pueden producir de forma recombinante en un sistema libre de células in vitro, como el sistema de reticulocitos de conejo TNT™ (Promega).
[0150] Un huésped de expresión también puede cultivarse en el medio apropiado para el huésped, en condiciones aerobias. Se puede proporcionar agitación o una combinación de agitación y aireación, teniendo lugar la producción a la temperatura adecuada para ese huésped, p. ej., desde aproximadamente 25 °C a aproximadamente 75 °C (p. ej., de 30 °C a 45 °C), dependiendo de las necesidades del huésped y de la producción de la variante de amilasa deseada. El cultivo puede llevarse a cabo desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 100 horas o más (y cualquier valor de horas comprendido en ese período, p. ej., de 24 a 72 horas). Normalmente, el caldo de cultivo presenta un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,0, dependiendo una vez más de las condiciones de cultivo necesarias para el huésped en relación con la producción de una amilasa.
3.4. identificación de actividad de amilasa
[0151] Para evaluar la expresión de una amilasa en una célula huésped, se puede medir la proteína expresada, el correspondiente ARNm, o la actividad de a-amilasa mediante ensayos. Por ejemplo, entre los análisis apropiados se incluye la transferencia de Northern, la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, y la hibridación in situ, empleando una sonda de hibridación debidamente etiquetada. Entre los análisis adecuados también se incluye la medición de actividad de amilasa en una muestra, por ejemplo, mediante análisis que midan directamente los azúcares reductores, como glucosa, en los medios de cultivo. Por ejemplo, se puede determinar la concentración de glucosa empleando el kit de reactivo de glucosa n.° 15-UV (Sigma Chemical Co.) o un instrumento, como el autoanalizador Technicon. La actividad de a-amilasa también se puede medir mediante cualquier método conocido, como los ensayos de PAHBAH o ABTS, descritos más adelante.
3.5. Métodos para enriquecer y purificar variantes de amilasas
[0152] En la técnica, se conocen técnicas de fermentación, separación y concentración, y se pueden utilizar métodos convencionales para preparar una solución concentrada que contenga polipéptidos de una variante de a-amilasa.
[0153] Tras la fermentación, se obtiene un caldo de fermentación, se eliminan las células microbianas y varios sólidos suspendidos, incluidas materias primas de fermentación, mediante técnicas de separación convencionales con el fin de obtener una solución de amilasa. Por lo general, se emplea la filtración, centrifugación, microfiltración, filtración rotativa al vacío, ultrafiltración, centrifugación seguida de ultrafiltración, extracción, o cromatografía, o similares.
[0154] Es conveniente concentrar una solución que contenga polipéptidos de una variante de a-amilasa con el fin de optimizar la recuperación. El uso de soluciones no concentradas requiere de un mayor tiempo de incubación con el fin de recoger el precipitado enzimático enriquecido o purificado.
[0155] La solución que contiene enzimas se concentra utilizando técnicas de concentración convencionales hasta que se obtiene el nivel de enzimas deseado. Se puede lograr la concentración de la solución que contiene enzimas mediante cualquiera de las técnicas expuestas en el presente documento. Entre los ejemplos de métodos de enriquecimiento y purificación se incluyen, sin carácter limitativo, la filtración rotativa al vacío y/o la ultrafiltración.
[0156] La solución de enzimas se concentra en una solución de enzimas concentrada hasta que la actividad enzimática de la solución concentrada que contiene polipéptidos de una variante de a-amilasa alcanza un nivel deseado.
[0157] La concentración se puede llevar a cabo empleando, p. ej., un agente de precipitación, como un agente de precipitación de haluro de metal. Los agentes de precipitación de haluro de metal incluyen, sin carácter limitativo, cloruros de metal alcalino, bromuros de metal alcalino y mezclas de dos o más de estos haluros de metal. Entre los ejemplos de haluros de metal se incluyen el cloruro de sodio, cloruro de potasio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y mezclas de dos o más de estos haluros de metal. El agente de precipitación de haluro de metal, cloruro de sodio, también puede utilizarse como conservante.
[0158] El agente de precipitación de haluro de metal se utiliza en una cantidad efectiva para precipitar una amilasa. La selección de al menos una cantidad efectiva y una cantidad óptima de haluro de metal eficaz para provocar la precipitación de la enzima, así como las condiciones de la precipitación para la recuperación máxima, incluyendo el tiempo de incubación, pH, temperatura y concentración de enzima, resultará evidente a primera vista para un experto en la técnica, tras análisis rutinarios.
[0159] En general, se añade al menos aproximadamente entre un 5 % p/v (peso/volumen) y aproximadamente un 25 % p/v de haluro de metal a la solución concentrada de enzimas, y normalmente al menos un 8 % p/v. Por lo general, se añade no más de aproximadamente un 25 % p/v de haluro de metal a la solución concentrada de enzimas y, normalmente, no más de aproximadamente un 20 % p/v. La concentración óptima del agente de precipitación de haluro de metal dependerá, entre otras cosas, de la naturaleza del polipéptido de variante de a-amilasa concreto y de su concentración en la solución concentrada de enzimas.
[0160] Otra forma alternativa de precipitar la enzima consiste en utilizar compuestos orgánicos. Entre los ejemplos de agentes de precipitación de compuesto orgánico se incluyen: ácido 4-hidroxibenzoico, sales de metal alcalino de ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres de alquilo de ácido 4-hidroxibenzoico, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. La adición de los agentes de precipitación de compuesto orgánico puede tener lugar con anterioridad, simultánea o posteriormente a la adición del agente de precipitación de haluro de metal, y la adición de ambos agentes de precipitación, el compuesto orgánico y el haluro de metal, se puede llevar a cabo de forma secuencial o simultánea.
[0161] Por lo general, los agentes de precipitación orgánicos se seleccionan de entre el grupo que consiste en sales de metal alcalino de ácido 4-hidroxibenzoico, como sales de sodio o de potasio, y ésteres de alquilo de ácido 4-hidroxibenzoico lineales o ramificados, donde el grupo alquilo contiene de 1 a 12 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los agentes de precipitación de compuesto orgánico pueden ser, por ejemplo, ésteres de alquilo de ácido 4-hidroxibenzoico lineales o ramificados, donde el grupo alquilo contiene de 1 a 10 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los ejemplos de compuestos orgánicos son ésteres de alquilo de ácido 4-hidroxibenzoico lineales, donde el grupo alquilo contiene de 1 a 6 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Asimismo, se pueden utilizar ésteres de metilo de ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres de propilo de ácido 4-hidroxibenzoico, éster de butilo de ácido 4-hidroxibenzoico, éster de etilo de ácido 4-hidroxibenzoico y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Entre otros compuestos orgánicos también se incluye, sin carácter limitativo, éster de metilo de ácido 4-hidroxibenzoico (llamado metilparabeno), éster de propilo de ácido 4-hidroxibenzoico (llamado propilparabeno), que son también ambos agentes conservantes de amilasa. Para más descripciones, véase, p. ej., el documento de patente estadounidense n.° 5,281,526.
[0162] La adición del agente de precipitación de compuesto orgánico ofrece la ventaja de presentar una alta flexibilidad en las condiciones de precipitación con respecto al pH, la temperatura, la concentración de variante de amilasa, la concentración de agente de precipitación y el tiempo de incubación.
[0163] El agente de precipitación de compuesto orgánico se utiliza en una cantidad efectiva para mejorar la precipitación de la enzima por medio del agente de precipitación de haluro de metal. La selección de al menos una cantidad efectiva y una cantidad óptima de agente de precipitación de compuesto orgánico, así como las condiciones de la precipitación para la recuperación máxima, incluyendo el tiempo de incubación, el pH, la temperatura y la concentración de enzima, resultará evidente a primera vista para un experto en la materia, en virtud de la presente descripción, tras los análisis rutinarios.
[0164] Por lo general, se añade al menos aproximadamente un 0,01 % p/v de agente de precipitación de compuesto orgánico a la solución concentrada de enzimas, y normalmente al menos aproximadamente un 0,02 % p/v. Por lo general, no se añade más de aproximadamente un 0,3 % p/v de agente de precipitación de compuesto orgánico a la solución concentrada de enzimas, y normalmente no más de aproximadamente un 0,2 % p/v.
[0165] La solución concentrada de polipéptidos, que contiene el agente de precipitación de haluro de metal, y el agente de precipitación de compuesto orgánico, puede ajustarse a un pH que, necesariamente, dependerá de la enzima que va a ser enriquecida o purificada. En general, el pH se ajusta a un nivel cercano al punto isoeléctrico de la amilasa. El pH puede ajustarse a un pH comprendido en un rango que va desde aproximadamente 2,5 unidades de pH por debajo del punto isoeléctrico (pl) hasta aproximadamente 2,5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico.
[0166] El tiempo de incubación necesario para obtener un precipitado enzimático enriquecido o purificado depende de la naturaleza de la enzima concreta, la concentración de enzimas, y el/los agente(s) de precipitación específico(s) y su concentración. Por lo general, el tiempo efectivo para precipitar la enzima está comprendido entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 30 horas; normalmente, no sobrepasa aproximadamente 25 horas. En presencia del agente de precipitación de compuesto orgánico, el tiempo de incubación puede reducirse aún más hasta menos de aproximadamente 10 horas, y en la mayoría de los casos, incluso hasta aproximadamente 6 horas.
[0167] En general, la temperatura durante la incubación oscila entre aproximadamente 4 °C y aproximadamente 50 °C. Normalmente, el método se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 45 °C (p. ej., entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 40 °C). La temperatura óptima para inducir la precipitación varía conforme a las condiciones de la solución y a la enzima o el/los agente(s) de precipitación utilizado/a(s).
[0168] La recuperación global del precipitado enzimático enriquecido o purificado, y la eficacia con la que se realiza el proceso, mejora al agitar la solución que comprende la enzima, el haluro de metal incorporado y el compuesto orgánico añadido. La etapa de agitación se lleva a cabo tanto durante la incorporación del haluro de metal y del compuesto orgánico, como durante el período de incubación posterior. Entre los métodos de agitación adecuados se incluyen la mezcla o agitación mecánica, la aireación intensa, o cualquier técnica parecida.
[0169] Tras el período de incubación, la enzima enriquecida o purificada se separa entonces del pigmento disociado y de otras impurezas y se recoge mediante técnicas de separación convencionales, como la filtración, la centrifugación, la microfiltración, la filtración rotativa al vacío, la ultrafiltración, la filtración de prensa, la microfiltración por membranas cruzadas, la microfiltración con membranas de flujo cruzado, o similares. Se puede obtener un enriquecimiento o purificación posterior del precipitado enzimático lavando el precipitado con agua. Por ejemplo, se lava el precipitado enzimático enriquecido o purificado con agua que contiene el agente de precipitación de haluro de metal, o con agua que contiene los agentes de precipitación de haluro de metal y de compuesto orgánico.
[0170] Durante la fermentación, se acumula un polipéptido de variante de a-amilasa en el caldo de cultivo. Para el aislamiento, enriquecimiento o purificación de la variante de a-amilasa deseada, se centrifuga o se filtra el caldo de cultivo para eliminar células, y el líquido resultante sin células se emplea para el enriquecimiento o la purificación de enzima. En una forma de realización, el caldo libre de células se somete a precipitación salina empleando sulfato de amonio a una saturación de aproximadamente un 70 %; la fracción de precipitación saturada al 70 % se disuelve entonces en un tampón y se aplica a una columna, como una columna Sephadex G-100, y se eluye para recuperar la fracción activa de enzimas. Para un enriquecimiento o purificación adicional, se puede utilizar un procedimiento convencional, como cromatografía de intercambio iónico.
[0171] Las enzimas enriquecidas o purificadas resultan útiles para aplicaciones de lavado de ropa y de limpieza. Por ejemplo, se pueden utilizar en detergentes para ropa y en quitamanchas. Pueden transformarse en un producto final que puede ser líquido (solución, suspensión) o sólido (granulado, polvo).
[0172] En Sumitani et al. (2000) "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp. 195 a-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading," Biochem. J. 350: 477-484, se describe un ejemplo más específico de enriquecimiento o purificación, y se resume brevemente en el presente documento. La enzima obtenida a partir de 4 litros de un sobrenadante de cultivo de Streptomyces lividans TK24 se trató con (NH4)2SÜ4 a un 80 % de saturación. El precipitado se recuperó mediante centrifugación a 10000 * g (20 min a 4 °C) y se volvió a disolver en 20 Mm de tampón Tris/HCl (pH 7,0) conteniendo 5 mM de CaCl2. El precipitado solubilizado se dializó a continuación frente al mismo tampón. La muestra dializada se aplicó entonces a una columna de Sephacryl S-200, que previamente se había equilibrado con 20 mM de tampón Tris/HCl, (pH 7,0), 5 mM de CaCl2, y se había eluido a una velocidad de flujo lineal de 7 ml/h con el mismo tampón. Se recogieron fracciones de la columna y se analizaron para determinar si existía actividad, con arreglo al ensayo enzimático y al SDS-PAGE. Posteriormente, se purificó la proteína según se expone a continuación. Se equilibró una columna de Toyopear1HW55 (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, Pensilvania; Cat. n.° 19812) con 20 mM de tampón Tris/HCl (pH 7,0) conteniendo 5 mM de CaCl2 y 1,5 M de (n H4)2SÜ4. La enzima se eluyó con un gradiente lineal de 1,5 a 0 M de (NH4)2SÜ4 en 20 mM de tampón Tris/HCL, pH 7,0 que contenía 5 mM de CaCl2. Se recogieron las fracciones activas, y la enzima precipitó con (NH4)2SÜ4 a una saturación del 80 %. El precipitado se recuperó, se volvió a disolver y se dializó según se ha descrito anteriormente. A continuación, la muestra dializada se aplicó a una columna Mono Q HR5/5 (Amersham Pharmacia, Cat. n.° 17-5167-01) previamente equilibrada con 20 mM de tampón Tris/HCl (pH 7,0) que contenía 5 mM de CaCl2, a una velocidad de flujo de 60 ml/h. Las fracciones activas se recogieron y se añadieron a una solución de 1,5 M de (NH4)2SÜ4. Las fracciones de enzimas activas se recromatografiaron en una columna de Toyopear1HW55, al igual que antes, para conseguir una enzima homogénea, según lo determinado mediante SDS-PAGE. Véase Sumitani et al. (2000) Biochem. J. 350: 477-484, para un análisis general sobre el método y variaciones al respecto.
[0173] Para la recuperación de la escala de producción, se pueden enriquecer o purificar parcialmente polipéptidos de variante de a-amilasa, tal como se ha descrito en general anteriormente, mediante la eliminación de células mediante floculación con polímeros. De forma alternativa, la enzima puede enriquecerse o purificarse mediante microfiltración, seguida de concentración mediante ultrafiltración utilizando membranas y equipamiento disponibles. No obstante, para algunas aplicaciones, la enzima no necesita enriquecerse ni purificarse, y el caldo de cultivo completo puede lisarse y utilizarse sin un tratamiento posterior. A continuación, la enzima puede transformarse, por ejemplo, en gránulos.
4. Composiciones y usos de variantes de amilasa
[0174] Las variantes de amilasas resultan útiles para varias aplicaciones industriales. Por ejemplo, las variantes de amilasas resultan útiles en un proceso de conversión de almidón, especialmente en un proceso de sacarificación de un almidón que ha sido sometido a licuefacción. El producto final deseado puede ser cualquier producto que pueda producirse mediante la conversión enzimática del sustrato de almidón. Por ejemplo, el producto deseado puede ser un jarabe rico en glucosa y maltosa, que puede utilizarse en otros procesos, como en la preparación de HFCS, o que puede convertirse en una serie de otros productos útiles, como intermedios de ácido ascórbico (p. ej., gluconato; ácido 2-ceto-L-gulónico; 5-ceto-gluconato; y 2,5-dicetogluconato); 1,3-propanediol; aminoácidos aromáticos (p. ej., tirosina, fenilalanina y triptófano); ácidos orgánicos (p. ej., lactato, piruvato, succinato, isocitrato y oxalacetato); aminoácidos (p. ej., serina y glicina); antibióticos; antimicrobianos; enzimas; vitaminas; y hormonas.
[0175] El proceso de conversión del almidón puede ser un precursor, o realizarse de forma simultánea, de un proceso de fermentación diseñado para producir alcohol para combustible o para beber (es decir, alcohol de boca). Un experto en la materia es consciente de las diversas condiciones de fermentación que se pueden emplear en la producción de estos productos finales. Las variantes de amilasas también resultan útiles en composiciones y métodos de elaboración de alimentos. Estos distintos usos de variantes de amilasas se describen con más detalle a continuación.
4.1. Preparación de sustratos de almidón
[0176] Los expertos en la materia tendrán conocimiento de los métodos disponibles que se pueden emplear para preparar sustratos de almidón para su uso en los procesos descritos en el presente documento. Por ejemplo, un sustrato de almidón útil se puede obtener a partir de tubérculos, raíces, tallos, legumbres, cereales o granos enteros. Más concretamente, el almidón granular se puede obtener a partir de maíz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, triticale, milo, sagú, mijo, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, judías, plátanos o patatas. El maíz contiene aproximadamente un 60-68 % de almidón; la cebada contiene aproximadamente un 55-65 % de almidón; el mijo contiene aproximadamente un 75-80 % de almidón, el trigo contiene aproximadamente un 60-65 % de almidón; y el arroz pulido contiene un 70-72 % de almidón. Los sustratos de almidón que se contemplan especialmente son el almidón de maíz y el almidón de trigo. El almidón de un grano puede estar molido o entero, e incluye partes sólidas del maíz, como granos, salvado y/o mazorcas. El almidón puede ser almidón crudo altamente refinado o materia prima de procesos de refinería de almidón. Varios almidones también están disponibles comercialmente. Por ejemplo, el almidón de maíz está disponible en Cerestar, Sigma, y Katayama Chemical Industry Co. (Japón); el almidón de trigo está disponible en Sigma; el almidón de boniato está disponible en Wako Pure Chemical Industry Co. (Japón); y el almidón de patata está disponible en Nakaari Chemical Pharmaceutical Co. (Japón).
[0177] El sustrato de almidón puede ser un almidón crudo de grano entero molido, que contiene fracciones sin almidón, por ejemplo, residuos de germen y fibras. La molienda puede comprender molienda húmeda, molienda en seco o triturado. En el caso de la molienda húmeda, el grano entero se empapa en agua o ácido diluido para separar el grano en sus elementos constitutivos, p. ej., almidón, proteína, germen, aceite, grano o fibras. La molienda húmeda separa eficazmente el germen y la harina (esto es, gránulos de almidón y proteína), y es especialmente adecuada para la producción de jarabes. En la molienda en seco o en el triturado, los granos enteros se trituran hasta formar un polvo fino y, a menudo, se procesa sin fraccionar el grano en sus elementos constitutivos. En algunos casos, se recuperan los aceites de los granos. El grano molido en seco comprenderá, por tanto, cantidades significativas de compuestos de carbohidratos no amiláceos, además de almidón. La molienda en seco del sustrato de almidón puede emplearse para la producción de etanol y otras sustancias bioquímicas. El almidón que se quiere procesar puede ser un almidón de calidad altamente refinado, por ejemplo, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99,5 % puro.
4.2. Gelatinización y licuefacción de almidón
[0178] Según se utiliza en el presente documento, el término «licuefacción» o «licuar» hace referencia a un proceso mediante el cual se convierte el almidón en dextrinas de cadena más corta y menos viscosas. Por lo general, este proceso implica la gelatinización de almidón de forma simultánea o con posterioridad a la adición de una a -amilasa, aunque opcionalmente pueden añadirse otras enzimas que inducen la licuefacción. En algunas formas de realización, el sustrato de almidón preparado según se ha descrito previamente se suspende en agua. La suspensión de almidón puede contener almidón como un porcentaje en peso de materia seca de aproximadamente un 10-55 %, aproximadamente un 20-45 %, aproximadamente un 30-45 %, aproximadamente un 30-40 %, o aproximadamente un 30-35 %. La a-amilasa (EC 3.2.1.1) se puede añadir a la suspensión mediante, por ejemplo, una bomba dosificadora. La a-amilasa que se suele utilizar para esta aplicación es una a-amilasa bacteriana termoestable, como una a-amilasa de Geobacillus stearothermophilus. Normalmente, la a-amilasa se proporciona, por ejemplo, a aproximadamente 1500 unidades por kg de materia seca de almidón. Con el fin de optimizar la estabilidad y actividad de a-amilasa, normalmente se ajusta el pH de la suspensión hasta aproximadamente un pH 5,5-6,5, y también puede añadirse aproximadamente 1 mM de calcio (aproximadamente 40 ppm de iones libres de calcio). Las variantes de Geobacillus stearothermophilus u otras a-amilasas pueden necesitar condiciones diferentes. La a-amilasa bacteriana que queda en la suspensión tras la licuefacción puede desactivarse a través de una serie de métodos, incluyendo la reducción del pH en una etapa posterior de la reacción o la eliminación de calcio de la suspensión en los casos en los que la enzima sea dependiente del calcio.
[0179] La suspensión de almidón con la a-amilasa puede bombearse continuamente a través de un je t cooker, que se calienta con vapor a 105 °C. La gelatinización sucede rápidamente en estas condiciones, y la actividad enzimática, junto con las fuerzas de corte significativas, inicia la hidrólisis del sustrato de almidón. El período de permanencia en el je t cooker es breve. El almidón parcialmente gelatinizado puede atravesar una serie de tubos de retención manteniendo una temperatura de 105-110 °C y permaneciendo durante 5-8 min hasta completar el proceso de gelatinización («licuefacción primaria»). La hidrólisis a la DE necesaria se completa en tanques de retención a 85-95 °C o a temperaturas más altas durante aproximadamente de 1 a 2 horas («licuefacción secundaria»). Estos tanques pueden contener deflectores para impedir la retromezcla. Según se utiliza en el presente documento, el término «minutos de licuefacción secundaria» se refiere al tiempo transcurrido desde el comienzo de la licuefacción secundaria hasta el momento en que se mide la dextrosa equivalente (DE). A continuación, se deja que la suspensión se enfríe hasta llegar a la temperatura ambiente. Esta etapa de enfriamiento puede durar de 30 minutos a 180 minutos, p. ej., de 90 minutos a 120 minutos. Normalmente, el almidón licuado presenta la forma de una suspensión con un contenido de materia seca (p/p) de aproximadamente un 10-50 %; aproximadamente un 10-45 %; aproximadamente un 15-40 %; aproximadamente un 20-40 %; aproximadamente un 25-40 %; o aproximadamente un 25-35 %.
[0180] Ventajosamente, la licuefacción con variantes de amilasa puede llevarse a cabo con un pH bajo, eliminando la necesidad de ajustar el pH a aproximadamente un pH de 5,5-6,5. Las variantes de amilasas se pueden utilizar para la licuefacción en un rango de pH de 2 a 7; p. ej., pH 3,0 - 7,5, pH 4,0 - 6,0, o pH 4,5 - 5,8. Las variantes de amilasas pueden mantener actividad de licuefacción en un intervalo de temperatura de aproximadamente 85 °C - 95 °C, p. ej., 85 °C, 90 °C o 95 °C. Por ejemplo, la licuefacción se puede llevar a cabo con 800 pg de una amilasa en una solución de almidón de maíz de 25 % de materia seca durante 10 min con un pH de 5,8 a 85 °C, o con un pH de 4,5 a 95 °C, por ejemplo. La actividad de licuefacción se puede analizar utilizando cualquiera de entre una serie de pruebas de viscosidad conocidas en la técnica.
4.3. Sacarificación
[0181] El almidón licuado se puede sacarificar en un jarabe rico en sacáridos con DP más bajo (p. ej., DPI DP2), utilizando variantes de amilasa, opcionalmente en presencia de otra(s) enzima(s). La composición exacta de los productos de sacarificación depende de la combinación de enzimas utilizada, así como del tipo de almidón granular procesado. Ventajosamente, el jarabe que se puede obtener utilizando las variantes de amilasas proporcionadas puede contener un porcentaje en peso de DP2 del total de oligosacáridos en el almidón sacarificado que sobrepasa el 30 %, p. ej., de 45 % a 65 %, o de 55 % a 65 %. El porcentaje en peso de (DPI DP2) en el almidón sacarificado puede sobrepasar aproximadamente un 70 %, p. ej., de un 75 % a un 85 %, o de un 80 % a un 85 %. Las amilasas presentes también producen un rendimiento de glucosa relativamente elevado, p. ej., DPI > 20 % en el producto de jarabe.
[0182] Mientras que la licuefacción funciona por lo general como un proceso continuo, la sacarificación se lleva a cabo a menudo como un proceso por lotes. Normalmente, la sacarificación es más efectiva a temperaturas de aproximadamente 60-65 °C y a un pH de aproximadamente 4,0-4,5, por ejemplo, un pH de 4,3, requiriendo un enfriamiento y un ajuste del pH del almidón licuado. La sacarificación se puede llevar a cabo, por ejemplo, a una temperatura que oscila entre aproximadamente 40 °C, aproximadamente 50 °C o aproximadamente 55 °C, hasta aproximadamente 60 °C o aproximadamente 65 °C. En general, la sacarificación se realiza en depósitos de agitación, que pueden tardar varias horas en llenarse o vaciarse. Normalmente, las enzimas se añaden bien en una proporción fija de materia seca mientras se llenan los tanques, o se añaden en una única dosis al inicio de la etapa de llenado. Habitualmente, se procesa una reacción de sacarificación para realizar un jarabe durante aproximadamente 24-72 horas, por ejemplo, 24-48 horas. Cuando se alcanza una d E máxima o deseada, la reacción se detiene calentándola a 85 °C durante 5 min., por ejemplo. Una incubación más larga dará como resultado una DE más baja, hasta llegar a aproximadamente 90 d E, ya que la glucosa acumulada se repolimeriza a isomaltosa y/o a otros productos de reversión a través de una reacción de reversión enzimática y/o en línea con el equilibrio termodinámico. Al utilizar una amilasa, la sacarificación se realiza de forma óptima en un intervalo de temperatura que oscila entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 75 °C, p. ej., 45 °C - 75 °C o 47 °C - 74 °C. La sacarificación puede llevarse a cabo en un intervalo de pH de aproximadamente pH de 3 a aproximadamente pH de 7, p. ej., pH 3,0 - pH 7,5, pH 3,5 - pH 5,5, pH 3,5, pH 3,8 o pH 4,5.
[0183] Se puede añadir una a-amilasa en la suspensión en forma de una composición. Se puede añadir una amilasa a una suspensión de un sustrato de almidón granular en una cantidad de aproximadamente 0,6 - 10 ppm ds, p. ej., de 2 ppm ds. Se puede añadir una amilasa como una enzima de caldo de cultivo completo, clarificada, enriquecida, parcialmente purificada o purificada. La actividad específica de la amilasa puede ser de aproximadamente 300 U/mg de enzima, por ejemplo, medida con el ensayo PAHBAH. La amilasa también se puede añadir como un producto de caldo de cultivo completo.
[0184] Se puede añadir una amilasa en la suspensión como una solución de enzimas aislada. Por ejemplo, se puede añadir una amilasa en forma de un material celular de cultivo producido por células huésped que expresan una amilasa. Una célula huésped también puede secretar una amilasa en el medio de reacción durante el proceso de fermentación o de SFS, de forma que la enzima se incorpora continuamente en la reacción. La célula huésped que produce y secreta amilasa puede expresar también una enzima adicional, como una glucoamilasa. Por ejemplo, en el documento de patente estadounidense U.S. 5,422,267 se da a conocer el uso de una glucoamilasa en levadura para la producción de bebidas alcohólicas. Por ejemplo, una célula huésped, p. ej., Trichoderma reesei o Aspergillus niger, se puede modificar para coexpresar una amilasa y una glucoamilasa, p. ej., una variante de HgGA, TrGA o TrGA, durante la sacarificación. La célula huésped puede estar genéticamente modificada de forma que no exprese su glucoamilasa endógena ni otras enzimas, proteínas u otros materiales. La célula huésped puede modificarse para expresar un amplio espectro de diversas enzimas sacarolíticas. Por ejemplo, la célula huésped recombinante de levadura puede comprender ácidos nucleicos que codifican una glucoamilasa, una alfa-glucosidasa, una enzima que utiliza azúcar pentosa, una a-amilasa, una pululanasa, una isoamilasa y/o una isopululanasa. Véase, por ejemplo, WO 2011/153516 A2.
4.4. Isomerización
[0185] El hidrolizado de almidón soluble producido mediante el tratamiento con amilasa puede convertirse en jarabe de almidón con alto contenido en fructosa (HFSS), como jarabe de maíz de alta fructosa (HFCS). Esta conversión se puede alcanzar utilizando una glucosa isomerasa, especialmente una glucosa isomerasa inmovilizada en un soporte sólido. El pH se incrementa hasta aproximadamente de 6,0 a aproximadamente 8,0, p. ej., un pH de 7,5 (dependiendo de la isomerasa), y se elimina Ca2+ mediante intercambio iónico. Entre las isomerasas adecuadas se incluyen Sweetzyme®, IT (Novozymes A/S); G-zyme® IMGI y G-zyme® G993, Ketomax®, G-zyme® G993, G-zyme® G993 líquida y GenSweet® IGI. Tras la isomerización, la mezcla contiene normalmente alrededor de un 40-45 % de fructosa, p. ej., un 42 % de fructosa.
4.5. Fermentación
[0186] El hidrolizado de almidón soluble, especialmente un jarabe rico en glucosa, se puede fermentar poniendo en contacto el hidrolizado de almidón con un organismo de fermentación, normalmente a una temperatura en torno a 32 °C, como de 30 °C a 35 °C para la levadura que produce alcohol. La temperatura y el pH de la fermentación dependerán del organismo de fermentación. Entre los productos de EOF se incluyen metabolitos, como ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato de sodio, gluconato de calcio, gluconato de potasio, ácido itacónico y otros ácidos carboxílicos, glucono-delta-lactona, eritorbato sódico, lisina y otros aminoácidos, ácido graso omega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol y otros biomateriales.
[0187] Entre los microorgnaismos etanologénicos se incluye la levadura, como Saccharomyces cerevisiae, y las bacterias, p. ej., Zymomonas mobilis, que expresan alcohol deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa. El microorganismo etanologénico puede expresar xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, que convierte a la xilosa en xilulosa. En la técnica se conocen cepas mejoradas de microorganismos etanologénicos que, por ejemplo, pueden soportar temperaturas más altas, y se pueden utilizar. Véase Liu et al. (2011) Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 27(7): 1049-56. El origen comercial de esta levadura incluye ETHANOL RED® (LeSaffre); Thermosacc® (Lallemand); RED STAR® (Red Star); FERMIOL® (DSM Specialties); y SUPERSTART® (Alltech). En la técnica se conocen también microorganismos que producen otros metabolitos, como ácido cítrico y ácido láctico, mediante fermentación. Véase, por ejemplo, Papagianni (2007) "Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger: biochemical aspects, membrane transport and modeling," Biotechnol Adv. 25(3): 244-63; John et al. (2009) "Direct lactic acid fermentation: focus on simultaneous saccharification and lactic acid production," Biotechnol. Adv. 27(2): 145-52.
[0188] Los procesos de sacarificación y fermentación se pueden llevar a cabo como un proceso de SFS. La fermentación puede comprender, por ejemplo, un enriquecimiento, una purificación y una recuperación posteriores de etanol. Durante la fermentación, el contenido de etanol del caldo o «cerveza» puede alcanzar aproximadamente un 8­ 18 % v/v, p. ej., 14-15 % v/v. El caldo puede destilarse para producir soluciones de etanol enriquecidas, p. ej., 96 % puras. Además, el CO2 generado en la fermentación puede recogerse con un purificador de CO2, comprimirse y comercializarse para otros usos, p. ej., bebidas carbonatadas o producción de hielo seco. Los residuos sólidos derivados del proceso de fermentación pueden utilizarse como productos ricos en proteínas, p. ej., alimento para animales.
[0189] Como se ha mencionado anteriormente, puede llevarse a cabo un proceso de SFS con células fúngicas que expresan y secretan amilasa continuamente durante el proceso de SFS. Las células fúngicas que expresan amilasa también pueden ser el microorganismo de fermentación, p. ej., un microorganismo etanologénico. Por lo tanto, la producción de etanol también se puede llevar a cabo utilizando una célula fúngica que exprese suficiente amilasa, de forma que se tenga que añadir una cantidad inferior o nula de enzima de forma exógena. La célula huésped fúngica puede ser de una cepa fúngica modificada de forma apropiada. Asimismo, se pueden utilizar células huésped fúngicas que expresan y secretan otras enzimas, además de amilasa. Dichas células pueden expresar glucoamilasa y/o una pululanasa, fitasa, alfa-glucosidasa, isoamilasa, beta-amilasa, celulasa, xilanasa, otras hemicelulasas, proteasa, betaglucosidasa, pectinasa, esterasa, enzimas redox, transferasa u otra enzima.
[0190] Una variación de este proceso es un sistema de «fermentación por lote alimentado», donde el sustrato se añade en incrementos mientras progresa la fermentación. Los sistemas por lote alimentado resultan útiles si la represión catabólica puede inhibir el metabolismo de las células, y en los casos en los que se desea tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La concentración real del sustrato en sistemas por lote alimentado se calcula mediante los cambios en factores cuantificables como el pH, el oxígeno disuelto y la presión parcial de gases residuales, como el CO2. La fermentación discontinua (por lotes) y la fermentación por lote alimentado son técnicas habituales y conocidas en la técnica.
[0191] La fermentación continua es un sistema abierto donde un medio de fermentación determinado se añade progresivamente a un biorreactor, y una cantidad equivalente de medio condicionado se elimina de forma simultánea para el procesamiento. En general, la fermentación continua mantiene los cultivos con una densidad alta constante, donde las células se encuentran principalmente en crecimiento en fase logarítmica. La fermentación continua permite modular el crecimiento celular y/o la concentración de producto. Por ejemplo, un nutriente limitante como la fuente de carbono o la fuente de nitrógeno se mantiene en una tasa fija, y se permite que se moderen el resto de parámetros. Debido a que el crecimiento se mantiene constante, la pérdida celular causada por el drenaje del medio se debería equilibrar con respecto a la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos para optimizar los procesos de fermentación continua y para maximizar la tasa de formación de producto se conocen en la técnica de la microbiología industrial.
4.6. Composiciones que comprenden variantes de amilasas
[0192] Las variantes de amilasas se pueden combinar con una glucoamilasa (EC 3.2.1.3), p. ej., una glucoamilasa de Trichoderma o una variante de la misma. Un ejemplo de glucoamilasa es la glucoamilasa de Trichoderma reesei (T rGA) y variantes de la misma, que poseen actividad específica y termoestabilidad superiores. Véanse las solicitudes de patente estadounidenses con n.° de publicación 2006/0094080, 2007/0004018 y 2007/0015266 (Danisco US Inc.). Entre las variantes adecuadas de TrGA se incluyen aquellas que presentan actividad de glucoamilasa y al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad de secuencia con la T rGA natural. Las variantes de amilasas incrementan ventajosamente el rendimiento de glucosa producido en un proceso de sacarificación catalizado mediante TrGA.
[0193] De forma alternativa, la glucoamilasa puede ser otra glucoamilasa de origen vegetal (incluyendo algas), fúngica o bacteriana. Por ejemplo, las glucoamilasas pueden ser glucoamilasa G1 o G2 de Aspergillus niger, o sus variantes (p. ej., Boel et al. (1984) EMBO J. 3: 1097-1102; WO 92/00381; WO 00/04136 (Novo Nordisk A/S)); y la glucoamilasa de A. awamori (p. ej., WO 84/02921 (Cetus Corp.)). Otra glucoamilasa de Aspergillus que se contempla incluye variantes con una termoestabilidad mejorada, p. ej., G137A y G139A Chen et al. (1996) Prot. Eng. 9: 499-505); D257e y D293E/Q (Chen et al. (1995) Prot. Eng. 8 : 575-582); N182 (Chen et al. (1994) Biochem. J. 301: 275-281); A246C (Fierobe et al. (1996) Biochemistry, 35: 8698-8704); y variantes con residuos Pro en las posiciones A435 y S436 (Li et al. (1997) Protein Eng. 10: 1199-1204). Otras glucoamilasas que se contemplan incluyen las glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de T. emersonii (p. ej., WO 99/28448 (Novo Nordisk A/S), T. leycettanus (p. ej., patente estadounidense n.° RE 32,153 (CPC International, Inc.)), T. duponti o T. thermophilus (p. ej., patente estadounidense n.° 4,587,215). Entre las glucoamilasas bacterianas que se contemplan se incluyen glucoamilasas del género Clostridium, en concreto, de C. thermoamylolyticum (p. ej., EP 135,138 (CPC International, Inc.) y C. thermohydrosulfuricum (p. ej., WO 86/01831 (Michigan Biotechnology Institute)). Entre las glucoamilasas adecuadas, se incluyen las glucoamilasas derivadas de Aspergillus oryzae, como una glucoamilasa que se muestra en SEQ ID NO: 2 en WO 00/04136 (Novo Nordisk A/S). También son adecuadas las glucoamilasas comerciales, como AMG 200L; AMG 300 L; SUPER de SAN™ y E de AMG™ (Novozymes); 300 de OPTIDEX® y L-400 de OPTIDEX (Danisco US Inc.); AMIGASE™ y PLUS de AMIGASE™ (DSM); G900 de G-ZYME® (Enzyme Bio-Systems); y G990 ZR de G-ZYME® (glucoamilasa de A. niger con un bajo contenido de proteasa). Otras glucoamilasas adecuadas incluyen la glucoamilasa de Aspergillus fumigatus, la glucoamilasa de Talaromyces, la glucoamilasa de Thielavia, la glucoamilasa de Trametes, la glucoamilasa de Thermomyces, la glucoamilasa de Athelia o la glucoamilasa de Humicola (p. ej., HgGA). Normalmente, las glucoamilasas se añaden en una cantidad de aproximadamente 0,1 - 2 unidades de glucoamilasa (GAU)/g ds, p. ej., aproximadamente 0,16 GAU/g ds, 0,23 GAU/g ds, o 0,33 GAU/g ds.
[0194] Otras enzimas apropiadas que se pueden utilizar con amilasa incluyen una fitasa, proteasa, pululanasa, pamilasa, isoamilasa, una a-amilasa distinta, alfa-glucosidasa, celulasa, xilanasa, otras hemicelulasas, betaglucosidasa, transferasa, pectinasa, lipasa, cutinasa, esterasa, enzimas redox, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, se puede añadir una enzima desramificante, como una isoamilasa (EC 3.2.1.68 ), en cantidades efectivas que conocen los expertos en la materia. También resulta adecuada una pululanasa (EC 3.2.1.41), p. ej., Promozyme®. Normalmente, la pululanasa se añade en 100 U/kg ds. Otras enzimas adecuadas incluyen proteasas, como proteasas fúngicas y bacterianas. Las proteasas fúngicas incluyen aquellas que se obtienen de Aspergillus, como de A. niger, A. awamori, A. oryzae; Mucor (p. ej., M. miehei); Rhizopus; y Trichoderma.
[0195] Las p-amilasas (EC 3.2.1.2) son amilasas maltogénicas que actúan en exo, que catalizan la hidrólisis de enlaces 1,4-a-glucosídicos en amilopectina y polímeros de glucosa relacionados, de manera que se libera maltosa. Las p-amilasas se han aislado de diversas plantas y microorganismos. Véase Fogarty et al. (1979) en PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol. 15, pp. 112-115. Estas p-amilasas tienen temperaturas óptimas en el rango de 40 °C a 65 °C y pH óptimo en el rango de aproximadamente entre 4,5 y aproximadamente 7,0. Entre las p-amilasas que se contemplan se incluyen, aunque sin carácter limitativo, las p-amilasas de cebada BBA 1500 de SPEZYME®, DBA de SPEZYME®, ME de OPTIMALT™, BBA de OPTIMALT™ (Danisco US Inc.); y WBA de Novozym™ (Novozymes A/S).
[0196] Las composiciones que comprenden las presentes amilasas pueden ser formulaciones acuosas o no acuosas, gránulos, polvos, geles, suspensiones, pastas, etc., que pueden comprender además cualquiera de una o más de las enzimas adicionales que se exponen en el presente documento, junto con tampones, sales, conservantes, agua, codisolventes, tensioactivos, y similares. Dichas composiciones pueden funcionar en combinación con enzimas endógenas u otros ingredientes ya presentes en una suspensión, baño de agua, lavadora, producto de alimento o bebida, etc.; por ejemplo, enzimas endógenas de origen vegetal (incluyendo algas), enzimas residuales de una etapa anterior del proceso, y similares.
5. Composiciones y métodos para la elaboración de alimentos y productos de panadería
[0197] La presente exposición se refiere también a una «composición alimenticia», incluyendo, sin carácter limitativo, un producto alimenticio, de alimentación animal y/o aditivos alimentarios, que comprende una amilasa, y métodos para preparar dicha composición alimenticia que comprende mezclar una variante de amilasa con uno o más ingredientes alimentarios, o los usos de la misma.
[0198] Asimismo, la presente exposición se refiere al uso de una amilasa en la preparación de una composición alimenticia, donde la composición alimenticia se hornea con posterioridad a la incorporación del polipéptido de la invención. Según se utiliza en el presente documento, el término «composición de panadería» hace referencia a cualquier composición y/o aditivo preparados en el proceso de suministro de un producto alimenticio de panadería, que incluye, sin carácter limitativo, harina de panadería, una masa, un aditivo de panificación y/o un producto horneado. La composición alimenticia o el aditivo puede tener forma líquida o sólida.
[0199] Según se utiliza en el presente documento, el término «harina» hace referencia a los granos de cereal molidos o triturados. El término «harina» también hace referencia a productos de sagú o de tubérculos que han sido molidos o triturados. En algunas formas de realización, la harina puede contener también componentes, además de la materia vegetal o el cereal molidos o aplastados. Un ejemplo de un componente adicional, aunque no se pretende que posea carácter limitativo, es un agente leudante. Los granos de cereales incluyen trigo, avena, centeno y cebada. Los productos de tubérculos incluyen harina de tapioca, harina de mandioca y polvo de natillas. El término «harina» incluye también harina de maíz molida, sémola de maíz, harina de arroz, harina integral, harina con levadura, harina de tapioca, harina de mandioca, arroz molido, harina enriquecida y polvo de natillas.
[0200] En el caso de la harina para elaborar productos de panadería y alimenticios para su uso comercial y doméstico, es importante mantener un nivel apropiado de actividad de a-amilasa en la harina. Un nivel de actividad demasiado elevado puede resultar en un producto pegajoso y/o pastoso y que, por lo tanto, no se puede comercializar. La harina con una actividad de a-amilasa insuficiente puede no contener la cantidad de azúcar suficiente para el funcionamiento adecuado de la levadura, derivando en un pan o productos de panadería secos y quebradizos. Por consiguiente, una amilasa, por sí misma o en combinación con otra(s) a-amilasa(s), se puede(n) añadir a la harina para aumentar el nivel de actividad de a-amilasa endógena en la harina.
[0201] Puede añadirse además una amilasa sola o en una combinación con otras amilasas para impedir o retrasar el endurecimiento del pan, esto es, el hecho de que las migas de productos de panadería se vuelvan firmes. Normalmente, la cantidad de amilasa antiendurecimiento estará comprendida en el intervalo de 0,01-10 mg de proteína enzimática por kg de harina, p. ej., 0,5 mg/kg ds. Entre las amilasas antiendurecimiento adicionales que se pueden utilizar junto con una amilasa se incluye una endoamilasa, p. ej., una endoamilasa bacteriana de Bacillus. La amilasa adicional puede ser otra a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133), p. ej., de Bacillus. Novamyl® es un ejemplo de aamilasa maltogénica de la cepa NCIB 11837 de B. stearothermophilus, y se describe en Christophersen et al. (1997) Starch 50: 39-45. Entre otros ejemplos de endoamilasas antiendurecimiento se incluyen a-amilasas bacterianas derivadas de Bacillus, como B. licheniformis o B. amyloliquefaciens. La amilasa antiendurecimiento puede ser una exoamilasa, como una p-amilasa, p. ej., de origen vegetal, como de soja, o de origen microbiano, como de Bacillus.
[0202] La composición de panadería que comprende una amilasa puede comprender además una fosfolipasa o una enzima con actividad de fosfolipasa. Una enzima con actividad de fosfolipasa presenta una actividad que se puede medir en unidades de lipasa (LU). La fosfolipasa puede presentar actividad A 1 o A2 para eliminar ácidos grasos de los fosfolípidos, formando un lisofosfolípido. Puede presentar o no actividad de lipasa, es decir, actividad en sustratos triglicéridos. Normalmente, la fosfolipasa presenta una temperatura óptima que oscila entre 30 y 90 °C, p. ej., 30-70 °C. Las fosfolipasas añadidas pueden ser de origen animal; por ejemplo, del páncreas, como páncreas de vaca o de cerdo, o del veneno de serpiente o de abeja. De forma alternativa, la fosfolipasa puede ser, por ejemplo, de origen microbiano, p. ej., de hongos filamentosos, levaduras o bacterias.
[0203] La fosfolipasa se añade en una cantidad que mejora la ternura del pan durante el período inicial tras el horneado, especialmente las primeras 24 horas. Normalmente, la cantidad de fosfolipasa estará comprendida en el intervalo de 0,01-10 mg de proteína enzimática por kg de harina, p. ej., 0,1-5 mg/kg. Es decir, la actividad de fosfolipasa estará comprendida generalmente en el intervalo de 20-1000 LU/kg de harina, donde una unidad de lipasa se define como la cantidad de enzima que se necesita para liberar 1 pmol de ácido butírico por minuto a 30 °C, en pH 7,0, con goma arábiga como emulsionante y tributirina como sustrato.
[0204] Por lo general, las composiciones de masa comprenden sémola de trigo o harina de trigo y/u otros tipos de sémola, harina o almidón, como harina de maíz, sémola de centeno, harina de centeno, harina de avena, copos de avena, harina de soja, sémola de sorgo, harina de sorgo, sémola de patata, harina de patata o fécula de patata. La masa puede ser fresca, congelada o precocida. La masa puede ser una masa leudada o una masa que se haya sometido a fermentación. La masa puede leudar de diversas formas, como mediante la adición de agentes leudantes químicos, p. ej., bicarbonato de sodio, o mediante la adición de un agente leudante, esto es, una masa de fermentación. La masa también puede leudar mediante la incorporación de un cultivo de levadura adecuado, como un cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería), p. ej., una cepa comercializada de S. cerevisiae.
[0205] La masa puede comprender también otros ingredientes habituales para masas, como proteínas, p. ej. leche en polvo, gluten y soja; huevos (p. ej., huevos enteros, yemas de huevo o claras de huevo); un oxidante, como ácido ascórbico, bromato de potasio, yodato de potasio, azodicarbonamida (ADA) o persulfato de amonio; un aminoácido como L-cisteína; un azúcar; o una sal, como cloruro de sodio, acetato de calcio, sulfato de sodio o sulfato de calcio. La masa puede comprender además grasas, p. ej., triglicéridos, como grasa granulada o grasa alimentaria. Asimismo, la masa puede comprender un emulsionante, como mono- o diglicéridos, ésteres de ácido tartárico de mono- o diglicéridos, ésteres de azúcar de ácidos grasos, ésteres de poliglicerol de ácidos grasos, ésteres de ácido láctico de monoglicéridos, ésteres de ácido acético de monoglicéridos, estearatos de polioxietileno, o lisolecitina. En concreto, la masa puede realizarse sin la incorporación de emulsionantes.
[0206] El producto de masa puede ser cualquier producto de masa procesado, incluyendo masas fritas, fritas en abundante aceite, asadas, horneadas, cocidas y cocidas al vapor, como pan o pasteles de arroz cocidos al vapor. En una forma de realización, el producto alimenticio es un producto de panadería. Entre los productos típicos de panadería (horneados) se incluye pan (como hogazas, panecillos, bollos, bagels, bases de pizza, etc.), pastas, pretzels, tortas, pasteles, galletas, bizcochos, galletas saladas, etc.
[0207] De forma opcional, se puede utilizar una enzima adicional junto con la amilasa antiendurecimiento y la fosfolipasa. La enzima adicional puede ser una segunda amilasa, como una amiloglucosidasa, una p-amilasa, una ciclodextrina glucanotransferasa, o la enzima adicional puede ser una peptidasa, en concreto una exopeptidasa, una transglutaminasa, una lipasa, una celulasa, una xilanasa, una proteasa, una proteína disulfuro-isomerasa, p. ej., una proteína disulfuro-isomerasa según se da a conocer en el documento WO 95/00636, por ejemplo, una glucosiltransferasa, una enzima ramificante (enzima ramificante 1,4-a-glucano), una 4-a-glucanotransferasa (dextrina glucosiltransferasa) o una oxidorreductasa, p. ej., una peroxidasa, una lacasa, una glucosa oxidasa, una piranosa oxidasa, una lipooxigenasa, una L-aminoácido oxidasa o una carbohidrato oxidasa. La(s) enzima(s) adicional(es) puede(n) ser de cualquier origen, incluyendo vegetales y mamíferos, y especialmente de origen microbiano (bacterias, levaduras u hongos), y se puede(n) obtener mediante técnicas habitualmente utilizadas en la técnica.
[0208] Normalmente, la xilanasa es de origen microbiano, p. ej., derivada de una bacteria o de un hongo, como una cepa de Aspergillus. Entre las xilanasas, se incluye Pentopan® y Novozym 384®, por ejemplo, que son preparaciones de xilanasa comercializadas y producidas a partir de Trichoderma reesei. La amiloglucosidasa puede ser una amiloglucosidasa de A. niger (como AMG®). Entre otros productos de amilasa útiles se incluyen Grindamyl® A 1000 o A 5000 (Grindsted Products, Dinamarca) y Amylase® H o Amylase® P (DSM). La glucosa oxidasa puede ser una glucosa oxidasa fúngica, en concreto, una glucosa oxidasa de Aspergillus niger (como Gluzyme®). Un ejemplo de proteasa es Neutrase®.
[0209] El proceso puede emplearse para cualquier tipo de producto horneado preparado a base de masa, de naturaleza blanda o crujiente, ya sea de tipo blanco, ligero u oscuro. Entre los ejemplos se incluye pan, especialmente blanco, integral o de centeno, normalmente en forma de hogazas o panecillos, como, entre otros, pan de tipo baguette, pan pita, tortillas, pasteles, tortitas, bizcochos, galletas, bases de tarta, tostas, pan al vapor, pizza y similares.
[0210] Se puede utilizar una amilasa en una premezcla, que comprende harina junto con una amilasa antiendurecimiento, una fosfolipasa, y/o un fosfolípido. La premezcla puede contener otros aditivos mejoradores para masa y/o aditivos mejoradores para pan, p. ej., cualquiera de los aditivos, incluidas las enzimas, mencionadas anteriormente. Una amilasa puede ser un componente de una preparación de enzimas que comprende una amilasa antiendurecimiento y una fosfolipasa, para su uso como aditivo de panificación.
[0211] Opcionalmente, la preparación de enzimas se encuentra en forma de un granulado o un polvo aglomerado. La preparación puede presentar una estrecha distribución granulométrica, con más del 95 % (en peso) de las partículas en el intervalo de 25 a 500 pm. Los granulados y polvos aglomerados pueden prepararse mediante métodos convencionales, p. ej., pulverizando una amilasa en un portador en un granulador de lecho fluido. El portador puede constar de núcleos de partículas que presentan un tamaño adecuado de partículas. El portador puede ser soluble o insoluble, p. ej., una sal (como NaCl o sulfato de sodio), un azúcar (como sacarosa o lactosa), un polialcohol (como sorbitol), almidón, arroz, sémola de maíz o soja.
[0212] Las partículas envueltas, esto es, las partículas de a-amilasa, pueden comprender una amilasa. Para preparar partículas envueltas de a-amilasa, se establece un contacto de la enzima con un lípido de calidad alimentaria en una cantidad suficiente como para suspender todas las partículas de a-amilasa. Los lípidos de calidad alimentaria, según se utilizan en el presente documento, pueden ser cualquier compuesto orgánico de origen natural que es insoluble en agua, pero soluble en disolventes orgánicos no polares, como hidrocarburo o éter dietílico. Entre los lípidos de calidad alimentaria adecuados se incluyen, sin carácter limitativo, triglicéridos, ya sean en forma de grasas o aceites, saturados o insaturados. Entre los ejemplos de ácidos grasos y combinaciones de los mismos que conforman los triglicéridos saturados se incluyen, pero sin carácter limitativo, el butírico, (derivado de grasa láctea), el palmítico (derivado de grasa animal y vegetal), y/o el esteárico (derivado de grasa animal y vegetal). Entre los ejemplos de ácidos grasos y combinaciones de los mismos que conforman los triglicéridos insaturados se incluyen, aunque sin carácter limitativo, el palmitoleico, (derivado de grasa animal y vegetal), el oleico (derivado de grasa animal y vegetal), el linoleico (derivado de aceites vegetales), y/o el linolénico (derivado de aceite de linaza). Otros lípidos de calidad alimentaria apropiados incluyen, aunque sin carácter limitativo, monoglicéridos y diglicéridos derivados de los triglicéridos descritos anteriormente, fosfolípidos y glucolípidos.
[0213] El lípido de calidad alimentaria, especialmente en forma líquida, se pone en contacto con una forma pulverizada de las partículas de a-amilasa, de tal manera que el material lipídico cubre al menos una porción de la superficie de al menos una mayoría, p. ej., un 100 % de las partículas de a-amilasa. Así, cada partícula de a-amilasa está envuelta individualmente en un lípido. Por ejemplo, la totalidad o la práctica totalidad de las partículas de a-amilasa se proporcionan con una película lipídica fina, continua y envolvente. Esto se puede lograr vertiendo en primer lugar una cantidad de lípido en un contenedor y poniendo en suspensión a continuación las partículas de a-amilasa, de forma que el lípido humedece profundamente la superficie de cada partícula de a-amilasa. Tras un breve período de agitación, se recuperan las partículas de a-amilasa envueltas, portando una cantidad considerable de los lípidos en sus superficies. El grosor del recubrimiento aplicado de esta forma en las partículas de a-amilasa se puede controlar mediante la selección del tipo de lípido empleado y repitiendo la operación con el fin de formar una película más gruesa, cuando así se desee.
[0214] Se puede lograr el almacenamiento, la manipulación y la incorporación del vehículo de entrega cargado por medio de una mezcla envasada. La mezcla envasada puede comprender la a-amilasa envuelta. No obstante, la mezcla envasada puede contener, además, ingredientes adicionales según considere el fabricante o el panadero. Tras haberse incorporado la a-amilasa envuelta en la masa, el panadero prosigue con el proceso de producción normal de ese producto.
[0215] Las ventajas de envolver las partículas de a-amilasa son dobles. En primer lugar, el lípido de calidad alimentaria protege a la enzima frente a la desnaturalización térmica durante el proceso de cocción en el caso de aquellas enzimas que sean termolábiles. Por consiguiente, al mismo tiempo que se estabiliza y se protege la a-amilasa durante las etapas de leudado y cocción, se libera del recubrimiento protector en el producto final de panadería, donde hidroliza los enlaces glucosídicos en poliglucanos. El vehículo de entrega cargado proporciona también una liberación constante de la enzima activa en el producto de panificación. Es decir, tras el proceso de cocción, la a-amilasa activa se libera constantemente desde el recubrimiento protector a un ritmo que contrarresta y, por tanto, reduce los mecanismos de endurecimiento.
[0216] Por lo general, la cantidad de lípido aplicada en las partículas de a-amilasa puede variar desde un porcentaje bajo del peso total de la a-amilasa hasta varias veces ese peso, dependiendo de la naturaleza del lípido, la manera en que se aplica en las partículas de a-amilasa, la composición de la mezcla de la masa que va a tratarse, y de la gravedad de la operación de mezcla de masa implicada.
[0217] El vehículo de entrega cargado, esto es, la enzima envuelta en lípido, se añade a los ingredientes utilizados para preparar un producto de panadería en una cantidad efectiva para ampliar el tiempo de caducidad del producto de panadería. El panadero calcula la cantidad de a-amilasa envuelta, preparada según se ha expuesto anteriormente, que se necesitará para lograr el efecto antiendurecimiento que se desea. La cantidad que se necesita de a-amilasa envuelta se calcula basándose en la concentración de enzima envuelta y en la proporción de a-amilasa y la harina especificada. Se ha descubierto que existe una amplia gama de concentraciones efectivas, pero, como se ha expuesto, las perceptibles mejoras antiendurecimiento no se corresponden de forma lineal con la concentración de a-amilasa, aunque, por encima de ciertos niveles mínimos, unos grandes incrementos de la concentración de a-amilasa producen una pequeña mejora adicional. La concentración de a-amilasa que se utiliza realmente en una producción de panadería concreta podría ser mucho más elevada que la mínima necesaria para proporcionar al panadero alguna garantía frente a errores involuntarios de medición a la baja por parte del panadero. El límite inferior de concentración de enzimas se determina mediante el efecto antiendurecimiento mínimo que quiere lograr el panadero.
[0218] Un método de preparación de un producto de panadería puede comprender: a) preparar partículas de a-amilasa recubiertas de lípido, donde prácticamente todas las partículas de a-amilasa están recubiertas; b) mezclar una masa que contiene harina; c) añadir la a-amilasa recubierta de lípido a la masa antes de que se complete la mezcla, y terminar de mezclar antes de que se elimine el recubrimiento lipídico de la a-amilasa; d) leudar la masa; y e) hornear la masa para proporcionar el producto de panadería, donde la a-amilasa es inactiva durante las etapas de mezclado, leudado y horneado y es activa en el producto de panadería.
[0219] La a-amilasa envuelta se puede añadir a la masa durante el ciclo de mezcla, p. ej., cerca del final del ciclo de mezcla. La a-amilasa envuelta se añade en un momento de la etapa de mezclado que permite la suficiente distribución de la a-amilasa envuelta por toda la masa; no obstante, la etapa de mezclado se termina antes de que el recubrimiento protector quede desprovisto de la(s) partícula(s) de a-amilasa. Dependiendo del tipo y del volumen de la masa, y del funcionamiento y la velocidad del mezclador, se podrían necesitar entre uno y seis minutos o más para mezclar la a -amilasa envuelta con la masa, aunque la media es de dos a cuatro minutos. De este modo, el procedimiento concreto se puede determinar según diversas variables. En primer lugar, la cantidad de a-amilasa envuelta debería presentar un volumen total suficiente como para permitir que se reparta la a-amilasa envuelta por toda la mezcla de masa. Si la preparación de a-amilasa envuelta está muy concentrada, puede ser necesario añadir aceite adicional a la premezcla con anterioridad a la incorporación de la a-amilasa envuelta en la masa. Las recetas y los procesos de producción pueden requerir modificaciones concretas; no obstante, en general, se pueden lograr buenos resultados cuando el 25 % del aceite especificado en una fórmula de masa de pan se mantiene fuera de la masa y se utiliza como portador para una a-amilasa envuelta concentrada si se añade cerca del final del ciclo de mezcla. En el caso del pan u otros productos de panadería, especialmente aquellos que poseen un bajo contenido de grasa, p. ej., panes de estilo francés, una mezcla de a-amilasa envuelta de aproximadamente un 1 % del peso seco de la harina es suficiente para mezclar adecuadamente la a-amilasa envuelta con la masa. El intervalo de porcentajes adecuados es amplio y depende de la fórmula, del producto acabado y de los requisitos de la metodología de producción del panadero concreto. En segundo lugar, la suspensión de a-amilasa envuelta debería añadirse a la masa con el tiempo suficiente como para que se mezcle por completo en la masa, pero no durante tanto tiempo como para que el exceso de acción mecánica raspe el recubrimiento lipídico protector de las partículas de a-amilasa envueltas.
[0220] En otro aspecto, la composición alimenticia es una composición de aceite, carne o grasa que comprende una amilasa. En este contexto, el término «composición de [aceite/carne/grasa]» se refiere a cualquier composición, que esté basada, formada y/o que contenga aceite o carne o grasa, respectivamente. Otro aspecto está relacionado con un método para preparar una composición de aceite o carne o grasa y/o un aditivo que comprenda una amilasa, que comprende mezclar el polipéptido de la invención con una composición de aceite/carne/grasa y/o ingredientes aditivos.
[0221] En otro aspecto, la composición alimenticia es una composición de alimento para animales, un aditivo de alimento para animales y/o alimento para mascotas que comprende una amilasa y variantes de la misma. La presente exposición se refiere además a un método para preparar dicha composición de alimento para animales, composición de aditivo de alimento para animales, y/o alimento para mascotas que comprende mezclar una amilasa y variantes de la misma con uno o más ingredientes de alimento para animales y/o ingredientes de aditivos de alimento para animales y/o ingredientes de alimento para mascotas. Asimismo, la presente exposición se refiere al uso de una amilasa en la preparación de una composición de alimento para animales y/o una composición de aditivo de alimento para animales y/o alimento para mascotas.
[0222] El término «animal» incluye todo animal rumiante y no rumiante. En una forma de realización concreta, el animal es un animal no rumiante, como un caballo y un animal monogástrico. Entre los ejemplos de animales monogástricos se incluyen, aunque sin carácter limitativo, cerdos, tales como lechones, cerdos en crecimiento, cerdas; aves, tales como pavos, patos, pollos, pollos de engorde, gallinas ponedoras; peces, tales como salmón, trucha, tilapia, siluros y carpas; y crustáceos, tales como gambas y camarones. En otra forma de realización, el animal es un animal rumiante, incluyendo, aunque sin carácter limitativo, bovinos, terneros jóvenes, cabras, ovejas, jirafas, bisontes, alces, wapitíes, yaks, búfalos de agua, ciervos, camellos, alpacas, llamas, antílopes, berrendos y nilgós.
[0223] En el presente contexto, se pretende que el término «alimento para mascotas» haga referencia a un alimento para un animal doméstico como, aunque sin carácter limitativo, perros, gatos, jerbos, hámsteres, chinchillas, ratas de compañía, cobayas; mascotas aves, como canarios, periquitos y loros; mascotas reptiles, como tortugas, lagartos y serpientes; y mascotas acuáticas, como peces tropicales y ranas.
[0224] Los términos «composición de pienso para animales», «piensos» y «forraje» se utilizan indistintamente y pueden comprender uno o más materiales para piensos seleccionados del grupo que comprende a) cereales, como granos pequeños (p. ej., trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de los mismos) y/o granos grandes, como maíz o sorgo; b) productos derivados de cereales, como la harina de gluten de maíz, granos secos de destilería con solubles (DDGS) (especialmente granos secos de destilería con solubles a base de maíz (cDDGS), salvado de trigo, harinillas de trigo, harina baja de trigo, salvado de arroz, cascarilla de arroz, cascarilla de avena, almendra de palma y pulpa de cítrico; c) proteína obtenida a partir de fuentes como soja, girasol, cacahuete, altramuz, guisantes, habas, algodón, colza, harina de pescado, proteína plasmática seca, harina de huesos y carne, proteína de patata, suero de leche, copra, sésamo; d) aceites y grasas obtenidas a partir de fuentes vegetales y animales; e) minerales y vitaminas.
6. Composiciones y uso en desencolado textil
[0225] Asimismo, se contemplan composiciones y métodos para tratar tejidos (p. ej., para desencolar un tejido) utilizando una variante de a-amilasa como se define en las reivindicaciones adjuntas. En la técnica se conocen métodos de tratamiento de tejidos (véase, p. ej., la patente estadounidense n.° 6,077,316). Por ejemplo, se puede mejorar el tacto y la apariencia de un tejido mediante un método que comprende poner en contacto el tejido con una amilasa en una solución. El tejido se puede tratar con la solución bajo presión.
[0226] Se puede aplicar una amilasa durante o tras el tejido de una tela, o durante la etapa de desencolado, o una o más etapas adicionales de procesamiento textil. Durante el tejido de las telas, los hilos están expuestos a una tensión mecánica considerable. Antes del tejido en telares mecánicos, a menudo se recubren hilos de urdimbre con almidón para encolado o derivados de almidón para aumentar su fuerza tensil y para evitar su rotura. Se puede aplicar una amilasa durante o tras el tejido para eliminar este almidón encolado o derivados de almidón. Tras el tejido, se puede utilizar una amilasa para eliminar la capa de encolado antes del procesamiento posterior del tejido para garantizar un resultado homogéneo y resistente al lavado.
[0227] Se puede utilizar una amilasa solo o en combinación con otros reactivos químicos de desencolado y/o enzimas de desencolado para desencolar tejidos, incluidos tejidos que contengan algodón, como aditivos detergentes, p. ej., en composiciones acuosas. También se puede utilizar una amilasa en composiciones y métodos para producir un aspecto de lavado a la piedra en un tejido y prendas vaqueras con tinte azul. Para la fabricación de ropa, el tejido puede cortarse y coserse en ropa o prendas, que se acaban a continuación. En concreto, para la fabricación de pantalones vaqueros, se han desarrollado distintos métodos de acabado enzimático. El acabado de las prendas vaqueras comienza normalmente con una etapa de desencolado enzimático, durante la cual se someten las prendas a la acción de enzimas amilolíticas para proporcionar suavidad al tejido y para hacer que el algodón sea más accesible para las posteriores etapas de acabado enzimático. Se puede utilizar una amilasa en métodos de acabado para prendas vaqueras (p. ej., un «proceso de lavado biológico o biostoning»), de desencolado enzimático y aporte de suavidad al tejido, y/o proceso de acabado.
7. Composiciones de limpieza
[0228] Un aspecto de las presentes composiciones y métodos es una composición de limpieza que incluye una variante de a-amilasa como un componente, como se define en las reivindicaciones adjuntas. Se puede utilizar un polipéptido de amilasa como un componente en composiciones detergentes para el lavado manual, el lavado de ropa, el lavado de vajilla y la limpieza de superficies duras.
7.1. Resumen
[0229] Preferiblemente, se incorpora una amilasa en detergentes en una concentración de o cercana a una concentración utilizada habitualmente en el caso de amilasa en detergentes. Por ejemplo, se puede añadir un polipéptido de amilasa en una cantidad correspondiente a 0,00001 - 1 mg (calculada como proteína enzimática pura) de amilasa por litro de solución de lavado/lavavajillas. En el presente documento se proporcionan ejemplos de formulaciones, como se expone por ejemplo a continuación:
[0230] Un polipéptido de amilasa puede ser un componente de una composición detergente, como única enzima o junto con otras enzimas, incluidas otras enzimas amilolíticas. Como tal, puede incluirse en la composición detergente en forma de un granulado no pulverulento, un líquido estabilizado, o una enzima protegida. Se pueden producir granulados no pulverulentos, por ejemplo, según se da a conocer en los documentos de patente estadounidense n.° 4,106,991 y 4,661,452 y opcionalmente pueden estar recubiertos mediante métodos que se conocen en la técnica. Entre los ejemplos de materiales de recubrimiento ceroso se incluyen productos de poli(óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que presentan de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados, en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los que hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos de ácidos grasos. En el documento GB 1483591, por ejemplo, se proporcionan ejemplos de materiales de recubrimiento que forman una película adecuados para aplicarse mediante técnicas. Las preparaciones de enzimas líquidas pueden, por ejemplo, estabilizarse añadiendo un poliol como propilenglicol, un azúcar o un polialcohol, ácido láctico o ácido bórico de acuerdo con los métodos establecidos. En la técnica se conocen otros estabilizadores enzimáticos. Se pueden preparar enzimas protegidas de acuerdo con el método que se da a conocer por ejemplo en el documento EP 238216. Los polioles se reconocen desde hace mucho tiempo como estabilizadores de proteínas y como mejoradores de la solubilidad de proteína.
[0231] La composición detergente puede presentar cualquier forma útil, p. ej., polvos, gránulos, pastas, barras o líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso y contener normalmente hasta aproximadamente un 70 % de agua y desde un 0 % hasta aproximadamente un 30 % de disolvente orgánico. También puede presentarse en forma de un tipo de gel compacto que únicamente contiene aproximadamente un 30 % de agua.
[0232] La composición detergente comprende uno o más tensioactivos, cada uno de los cuales puede ser aniónico, no iónico, catiónico o zwitteriónico. El detergente contendrá normalmente de un 0 % a aproximadamente un 50 % de tensioactivo aniónico, como sulfonato de alquilbenceno lineal (LAS); a-olefinsulfonato (AOS); sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso) (AS); etoxisulfato de alcohol (AEOS o AES); alcanosulfonatos secundarios (SAS); ésteres metílicos de ácido graso a-sulfo; ácido alquilsuccínico o alquenilsuccínico; o jabón. La composición puede contener también de un 0 % a aproximadamente un 40 % de tensioactivo no iónico como etoxilato de alcohol (AEO o AE), etoxilatos de alcohol carboxilado, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglucósido, óxido de alquil dimetil amina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, o polihidroxi alquil amida de ácido graso (según se describe, por ejemplo, en el documento WO 92/06154).
[0233] La composición detergente puede comprender de forma adicional una o más de otras enzimas, como proteasas, otra enzima amilolítica, cutinasa, lipasa, celulasa, pectato liasa, perhidrolasa, xilanasa, peroxidasa, y/o lacasa en cualquier combinación.
[0234] El detergente puede contener desde aproximadamente un 1 % hasta aproximadamente un 65 % de un mejorador de detergente o de un agente complejante como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTMPA), ácido alquilsuccínico o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (p. ej., SKS-6 de Hoechst). El detergente también puede ser no mejorado, es decir, básicamente sin presentar mejorador de detergente. Las enzimas se pueden utilizar en cualquier composición compatible con la estabilidad de la enzima. Por lo general, las enzimas pueden protegerse frente a componentes perjudiciales por medio de formas de encapsulación conocidas, por ejemplo, mediante granulación o secuestro en hidrogeles. Se pueden utilizar enzimas, y específicamente amilasas, ya sean con o sin dominios de unión al almidón, en varias composiciones que incluyen aplicaciones de lavado de ropa y de vajilla, limpiadores de superficies, así como en composiciones para la producción de etanol a partir de almidón o biomasa.
[0235] El detergente puede comprender uno o más polímeros. Entre los ejemplos se incluye la carboximetilcelulosa (CMC), la poli(vinilpirrolidina) (PVP), el polietilenglicol (PEG), el poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilatos como los poliacrilatos, los copolímeros de ácido maleico/acrílico y los copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico.
[0236] El detergente puede contener un sistema de blanqueo, que puede comprender una fuente de H2O2 como perborato o percarbonato, que puede combinarse con un activador de blanqueo que forma perácido, como tetraacetiletilendiamina (TAED) o nonanoiloxibencenosulfonato (NOBS). De forma alternativa, el sistema de blanqueo puede comprender peroxiácidos (p. ej., peroxiácidos de tipo amida, imida o sulfona. El sistema de blanqueo puede ser también un sistema de blanqueo enzimático, por ejemplo, perhidrolasa, como el que se describe en la solicitud internacional PCT WO 2005/056783.
[0237] Las enzimas de la composición detergente pueden estabilizarse utilizando agentes estabilizadores convencionales, p. ej., un poliol como propilenglicol o glicerol; un azúcar o polialcohol; ácido láctico; ácido bórico o un derivado de ácido bórico como, por ejemplo, un éster de borato aromático; y la composición puede estar formulada según se describe, p. ej., en WO 92/19709 y WO 92/19708.
[0238] El detergente puede contener también otros ingredientes detergentes habituales como, p. ej., suavizantes de tejidos, incluidas arcillas, potenciadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensión de suciedad, agentes de redeposición antisuciedad, tintes, bactericidas, inhibidores de decoloración, blanqueadores ópticos o perfumes.
[0239] Normalmente, el pH (medido en solución acuosa en concentración de uso) es neutro o alcalino, p. ej., pH de aproximadamente 7,0 hasta aproximadamente 11,0.
[0240] Más adelante, se describen formas concretas de composiciones detergentes para la incorporación de la presente a-amilasa.
7.2. Composición detergente líquida de alta resistencia (HDL) para el lavado de ropa
[0241] Entre los ejemplos de composiciones detergentes HDL para el lavado de ropa se incluye un tensioactivo detersivo (10 % - 40 % peso/peso), incluidos un tensioactivo detersivo aniónico (seleccionado de entre un grupo de cadena lineal o ramificada o aleatoria, alquilsulfatos sustituidos o no sustituidos, alquilsulfonatos, sulfato alcoxilado de alquilo, fosfatos de alquilo, fosfonatos de alquilo, carboxilatos de alquilo, y/o mezclas de estos); y, opcionalmente, un tensioactivo no iónico (seleccionado de un grupo de cadena lineal o ramificada o aleatoria, alcohol alcoxilado de alquilo sustituido o no sustituido, por ejemplo, un alcohol etoxilado de alquilo C8-C18 y/o alcoxilatos de alquilfenol C6-C12), donde la relación de peso entre el tensioactivo detersivo aniónico (con un índice hidrofílico (HIc) de entre 6,0 y 9) y el tensioactivo detersivo no iónico es mayor que 1:1. Entre los tensioactivos detersivos adecuados se incluyen también tensioactivos detersivos catiónicos (seleccionados de un grupo de compuestos de alquilpiridinio, compuestos cuaternarios de alquilamonio, compuestos cuaternarios de alquil-fosfonio, compuestos ternarios de alquilsulfonio, y/o mezclas de estos); tensioactivos detersivos zwitteriónicos y/o anfóteros (seleccionados de un grupo de sulfobetaínas de alcanolamina); tensioactivos anfolíticos; tensioactivos semipolares no iónicos y mezclas de estos.
[0242] Opcionalmente, la composición puede incluir un polímero potenciador de la tensioactividad que consiste en polímeros desengrasantes alcoxilados anfifílicos (seleccionados de un grupo de polímeros alcoxilados que posean propiedades hidrofílicas e hidrofóbicas ramificadas, como polialquileniminas alcoxiladas en el intervalo de 0,05 % en peso - 10 % en peso) y/o polímeros de injerto aleatorio (que normalmente comprenden una cadena principal hidrofílica que comprende monómeros seleccionados del grupo que consiste en: ácidos carboxílicos insaturados C1-C6, éteres, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, unidades de azúcar, unidades alcoxi, anhídrido maleico, polialcoholes saturados como glicerol, y mezclas de los mismos; y cadena(s) lateral(es) hidrofóbica(s) seleccionada(s) del grupo que consiste en: grupo alquilo C4-C25, polipropileno, polibutileno, éster de vinilo de un ácido monocarboxílico C1-C6 saturado, éster alquilo C1-C6 de ácido acrílico o metacrílico, y mezclas de los mismos.
[0243] La composición puede incluir polímeros adicionales, como polímeros de liberación de suciedad (incluidos poliésteres con extremos protegidos aniónicamente, por ejemplo SRP1, polímeros que comprenden al menos una unidad de monómero seleccionado de entre sacárido, ácido dicarboxílico, poliol y combinaciones de estos, en configuración aleatoria o en bloque, polímeros a base de tereftalato de etileno y copolímeros de los mismos en una configuración aleatoria o en bloque, por ejemplo Repel-o-tex SF, SF-2 y SRP6, Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 y SRN325, Marloquest SL), polímeros de antirredeposición (0,1 % en peso a 10 % en peso, incluidos polímeros de carboxilato, tales como polímeros que comprenden al menos un monómero seleccionado de entre ácido acrílico, ácido maleico (o anhídrido maleico), ácido fumárico, ácido itacónico, ácido aconítico, ácido mesacónico, ácido citracónico, ácido metilenmalónico, y cualquier mezcla de los mismos, homopolímero de vinilpirrolidona, y/o polietilenglicol, peso molecular en el intervalo de 500 a 100000 Da); polímero celulósico (incluidos aquellos seleccionados de entre alquilcelulosa, alquil alcoxialquilcelulosa, carboxialquil celulosa, alquil carboxialquilcelulosa, ejemplos de los cuales incluyen carboximetilcelulosa, metilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, metilcarboximetilcelulosa, y mezclas de los mismos) y carboxilato polimérico (como copolímero aleatorio de maleato/acrilato u homopolímero de poliacrilato).
[0244] La composición puede incluir, además, ácido graso saturado o insaturado, preferiblemente ácido graso C12-C24 saturado o insaturado (de un 0 % en peso a un 10 % en peso); coadyuvantes de deposición (ejemplos de los cuales incluyen polisacáridos, preferentemente polímeros celulósicos, haluros de poli dialil dimetil amonio (DADMAC), y copolímeros de DAD MAC con vinilpirrolidona, acrilamidas, imidazoles, haluros de imidazolinio, y mezclas de los mismos, en configuración aleatoria o en bloque, goma guar catiónica, celulosa catiónica tal como hidroxietilcelulosa catiónica, almidón catiónico, poliacilamidas catiónicas, y mezclas de estos.
[0245] La composición puede incluir además agentes inhibidores de transferencia de tintes, entre los ejemplos de los cuales se incluye ftalocianina de manganeso, peroxidasas, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros N-óxidos de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles y/o mezclas de estos; agentes quelantes, entre los ejemplos de los cuales se incluye ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentametilenfosfónico (DTPMP), ácido hidroxietano difosfónico (HEDP), ácido etilendiamino N,N'-disuccínico (EDDS), ácido metilglicindiacético (MGDA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido propilendiaminotetraacético (PDT A), 2-hidroxipiridina-N-óxido (HPNO), o ácido metilglicindiacético (MGDA), ácido glutámico N,N-ácido diacético (sal tetrasódica de ácido glutámico N,N-dicarboximetil (GLDA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido 4,5-dihidroxi-m-bencenosulfónico, ácido cítrico y cualesquiera sales de los mismos, ácido N-hidroxietiletilendiaminotriacético (HEDTA), ácido trietilentetraminohexaacético (TTHA), ácido N-hidroxietiliminodiacético (HEIDA), dihidroxietilglicina (DHEG), ácido etilendiaminotetrapropiónico (EDTP), y derivados de los mismos.
[0246] Preferiblemente, la composición incluía enzimas (en general, de aproximadamente 0,01 % en peso de enzima activa a 0,03 % en peso de enzima activa), seleccionadas de entre proteasas, amilasas, lipasas, celulasas, colina oxidasas, peroxidasas/oxidasas, pectato liasas, mananasas, cutinasas, lacasas, fosfolipasas, lisofosfolipasas, aciltransferasas, perhidrolasas, arilesterasas, y cualquier mezcla de estas. La composición puede incluir un estabilizador de enzimas (entre los ejemplos de los cuales se incluyen polioles como propilenglicol o glicerol, azúcar o polialcohol, ácido láctico, inhibidor de la proteasa reversible, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, p. ej., un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenilborónico como ácido 4-formilfenil borónico).
[0247] Opcionalmente, la composición incluye supresores de espuma con base de silicona o de ácido graso; tintes matizadores, cationes de calcio y de magnesio, ingredientes de señalización visual, antiespumante (de 0,001 % en peso a aproximadamente 4,0 % en peso) y/o estructurante/espesante (de 0,01 % en peso a 5 % en peso, seleccionado del grupo que consiste en diglicéridos y triglicéridos, diestearato de etilenglicol, celulosa microcristalina, materiales a base de celulosa, celulosa microfibrilada, biopolímeros, goma xantana, goma gellan, y mezclas de los mismos).
[0248] La composición puede estar en cualquier forma líquida, por ejemplo, una forma de líquido o gel, o cualquier combinación de las mismas. La composición puede estar en cualquier formato monodosis, por ejemplo, una cápsula.
7.3. Composición detergente seca/sólida de alta resistencia (HDD) para el lavado de ropa
[0249] Entre las composiciones detergentes HDD para el lavado de ropa se incluye un tensioactivo detersivo, incluidos tensioactivos detersivos aniónicos (p. ej., de cadena lineal o ramificada o aleatoria, sulfatos de alquilo sustituidos o no sustituidos, alquilsulfonatos, sulfato de alquilo alcoxilado, alquilfosfatos, alquilfosfonatos, alquilcarboxilatos y/o mezclas de los mismos), tensioactivo detersivo no iónico (p. ej., de cadena lineal o ramificada o aleatoria, alquil etoxilatos C8-C18 sustituidos o no sustituidos, y/o alcoxilatos de alquilfenol C6-C12), tensioactivos detersivos catiónicos (p. ej., compuestos de alquil piridinio, compuestos de alquilamonio cuaternario, compuestos de alquilfosfonio cuaternario, compuestos de alquilsulfonio ternario, y mezclas de estos), tensioactivos detersivos zwitteriónicos y/o anfóteros (p. ej., sulfobetaínas de alcanolamina), tensioactivos anfolíticos, tensioactivos semipolares no iónicos, y mezclas de estos; mejoradores incluyendo mejoradores sin fosfato (por ejemplo, mejoradores de zeolita, ejemplos de los cuales incluyen zeolita A, zeolita X, zeolita P y zeolita MAP en el intervalo de un 0 % en peso a menos de un 10 % en peso), mejoradores de fosfato (p. ej., tripolifosfato de sodio en el intervalo de un 0 % en peso a menos de un 10 % en peso), ácido cítrico, sales de citrato y ácido nitrilotriacético, sal de silicato (p. ej., silicato de sodio o de potasio o metasilicato de sodio en el intervalo de un 0 % en peso a menos de un 10 % en peso, o silicato estratificado (SKS-6)); sal de carbonato (p. ej., carbonato de sodio y/o bicarbonato de sodio en el intervalo de un 0 % en peso a menos de un 80 % en peso); y agentes de blanqueo, incluidos fotoblanqueadores (p. ej., ftalocianinas de zinc sulfonadas, ftalocianinas de aluminio sulfonadas, tintes de xanteno, y mezclas de estos), activadores de blanqueo hidrofóbicos o hidrofílicos (p. ej., dodecanoil oxibenceno sulfonato, decanoil oxibenceno sulfonato, ácido decanoil oxibenzoico o sus sales, 3,5,5-trimetilhexano oxibenceno sulfonato, tetraacetiletilenodiamina-TAED, nonanoiloxibenceno sulfonato-NOBS, quats de nitrilo, y mezclas de estos), fuentes de peróxido de hidrógeno (p. ej., sales inorgánicas de perhidrato, ejemplos de las cuales incluyen sal de sodio monohidratada o tetrahidratada de perborato, percarbonato, persulfato, perfosfato, o persilicato), perácidos preformados hidrofílicos y/o hidrofóbicos (p. ej., ácidos y sales percarboxílicos, ácidos y sales percarbónicos, ácidos y sales perimídicos, ácidos y sales peroximonosulfúricos, y mezclas de estos), y/o catalizadores de blanqueo (p. ej., potenciadores del blanqueo de imina (entre los ejemplos de los cuales se incluyen cationes y poliiones de iminio), zwitteriones de iminio, aminas modificadas, óxidos de aminas modificadas, N-sulfonil iminas, N-fosfonil iminas, N-acil iminas, dióxidos de tiadiazol, perfluoroiminas, cetonas de azúcar cíclico, y mezclas de estos, y catalizadores de blanqueo que contienen metal (p. ej., cationes de cobre, hierro, titanio, rutenio, wolframio, molibdeno o manganeso, así como cationes de un metal auxiliar como zinc o aluminio y un secuestrante como ácido etilendiaminotetraacético, etilendiaminotetra (ácido metilenfosfónico), y sales hidrosolubles de estos.
[0250] Preferiblemente, la composición incluye enzimas, p. ej., proteasas, amilasas, lipasas, celulasas, colina oxidasas, peroxidasas/oxidasas, pectato liasas, mananasas, cutinasas, lacasas, fosfolipasas, lisofosfolipasas, aciltransferasas, perhidrolasas, arilesterasas, y cualquier mezcla de estas.
[0251] Opcionalmente, la composición puede incluir ingredientes detergentes adicionales, incluidas microcápsulas de perfume, acorde de perfume de almidón encapsulado, agentes matificantes, polímeros adicionales, incluidos polímeros de integridad de los tejidos y catiónicos, ingredientes bloqueadores de tinte, agentes suavizantes, abrillantadores (por ejemplo, abrillantadores fluorescentes C.I.), agentes floculantes, agentes quelantes, poliaminas alcoxiladas, auxiliares de deposición de tejido, y/o ciclodextrina.
7.4. Composición detergente lavavajillas automática (ADW)
[0252] Entre los ejemplos de composición detergente ADW se incluyen tensioactivos no iónicos, incluidos tensioactivos etoxilados no iónicos, tensioactivos de alcohol alcoxilado, alcoholes poli(oxialquilados) cubiertos de epoxi, o tensioactivos de óxido de amina presentes en cantidades de 0 a 10 % en peso; mejoradores en el intervalo de 5-60 %, incluidos mejoradores de fosfato (p. ej., monofosfatos, difosfatos, tripolifosfatos, otros polifosfatos oligoméricos, tripolifosfato de sodio-STPP) y mejoradores sin fosfato (p. ej., compuestos a base de aminoácido, incluido ácido metilglicindiacético (MGDA) y sus sales y derivados, ácido glutámico-N,N-diacético (GLDA) y sales y derivados de este, ácido iminodisuccínico (IDS) y sus sales y derivados, carboximetilinulina y sus sales y derivados, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido p-alaninodiacético (B-ADA) y sus sales, homopolímeros y copolímeros de ácidos policarboxílicos y sus sales parcial o completamente neutralizadas, ácidos policarboxílicos monoméricos y ácidos hidroxicarboxílicos y sus sales en el intervalo de 0,5 % a 50 % en peso; polímeros sulfonados/carboxilados en el intervalo de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 50 % en peso para proporcionar estabilidad dimensional; agentes de secado en el intervalo de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 10 % en peso (p. ej., poliésteres, especialmente poliésteres aniónicos, opcionalmente junto con otros monómeros con de 3 a 6 funcionalidades; normalmente, funcionalidades de ácido, alcohol o éster, que son propicios a la policondensación, compuestos o compuestos precursores de policarbonato-poliorganosiloxano, poliuretano-poliorganosiloxano y/o poliurea-poliorganosiloxano, de los mismos, especialmente del tipo urea y carbonato cíclico reactivo); silicatos en el intervalo de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 20 % en peso (incluidos silicatos de sodio o potasio, por ejemplo, disilicato de sodio, metasilicato de sodio y filosilicatos cristalinos); blanqueador inorgánico (p. ej., sales de perhidrato, como sales de perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato y persilicato) y blanqueador orgánico (p. ej., peroxiácidos orgánicos, incluidos diacil y tetraacilperóxidos, especialmente ácido diperoxidodecanodioico, ácido diperoxitetradecanodioico, ácido diperoxihexadecanodioico); activadores de blanqueo (esto es, precursores orgánicos de perácido en el intervalo de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 10 % en peso); catalizadores de blanqueo (p. ej., triazaciclononano de manganeso y complejos relacionados, Co, Cu, Mn y Fe bispiridilamina y complejos relacionados, y acetato de pentamina de cobalto(III) y complejos relacionados); agentes de tratamiento de metal en el intervalo de aproximadamente un 0,1 % a un 5 % en peso (p. ej., benzatriazoles, sales y complejos metálicos, y/o silicatos); enzimas en el intervalo de aproximadamente 0,01 a 5,0 mg de enzima activa por gramo de composición detergente lavavajillas automático (p. ej., proteasas, amilasas, lipasas, celulasas, colina oxidasas, peroxidasas/oxidasas, pectato liasas, mananasas, cutinasas, lacasas, fosfolipasas, lisofosfolipasas, aciltransferasa, perhidrolasa, arilesterasa, y mezclas de estas); y componentes estabilizadores de enzimas (p. ej., oligosacáridos, polisacáridos, y sales metálicas inorgánicas divalentes).
7.5. Composiciones detergentes adicionales
[0253] A continuación, en los párrafos numerados, se describen ejemplos adicionales de formulaciones de detergente a las que se puede añadir la presente amilasa.
1) Una composición detergente formulada como granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/L que comprende entre aproximadamente un 7 % y aproximadamente un 12 % de sulfonato de alquilbenceno lineal (calculado como ácido); entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 4 % de etoxisulfato de alcohol (p. ej., alcohol C12-18, 1-2 óxido de etileno (EO)) o sulfato de alquilo (p. ej., C16-18); entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 9 % de etoxilato de alcohol (p. ej., alcohol C14-15, 7 EO); entre aproximadamente un 14 % y aproximadamente un 20 % de carbonato de sodio (p. ej., Na2CO3); entre aproximadamente un 2 y aproximadamente un 6 % de silicato soluble (p. ej., Na2O, 2SiO2); entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 22 % de zeolita (p. ej., NaAlSiO4); entre un 0 % y aproximadamente un 6 % de sulfato de sodio (p. ej., Na2SO4); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 15 % de citrato de sodio/ácido cítrico (p. ej., C6H5Na3O7/C6H8O7); entre aproximadamente un 11 % y aproximadamente un 18 % de perborato de sodio (p. ej., NaBO3H2O); entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de TAED; y entre un 0 % y aproximadamente un 2 % de carboximetilcelulosa (CMC); 0-3 % de polímeros (p. ej., ácido maleico/acrílico, copolímero, PVP, PEG); 0,0001-0,1 % de enzimas (calculadas como enzima pura) proteína; y 0-5 % de ingredientes minoritarios (p. ej., supresores de espuma, perfumes, abrillantador óptico, fotoblanqueador).
2) Una composición detergente formulada como granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende entre aproximadamente un 6 % y aproximadamente un 11 % de sulfonato de alquilbenceno lineal (calculado como ácido); entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 3 % de etoxisulfato de alcohol (p. ej., alcohol C12-181-2, EO) o sulfato de alquilo (p. ej., C16-18); entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 9 % de etoxilato de alcohol (p. ej., alcohol C14-15, 7 EO); entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 21 % de carbonato de sodio (p. ej., Na2CO3); entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 4 % de silicato soluble (p. ej., Na2O, 2SiO2); entre aproximadamente un 24 % y aproximadamente un 34 % de zeolita (p. ej., NaAlSiO4); entre aproximadamente un 4 % y aproximadamente un 10 % de sulfato de sodio (p. ej., Na2SO4); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 15 % de citrato de sodio/ácido cítrico (p. ej., C6H5Na3O7/C6H8O7); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 2 % de carboximetilcelulosa (CMC); 1-6 % de polímeros (p. ej., copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG); 0,0001-0,1 % de enzimas (calculadas como proteína enzimática pura); 0-5 % de ingredientes minoritarios (p. ej., supresores de espuma, perfume). 3) Una composición detergente formulada como granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 9 % de sulfonato de alquilbenceno lineal (calculado como ácido); entre aproximadamente un 7 % y aproximadamente un 14 % de etoxilato de alcohol (p. ej., alcohol C12-15, 7 EO); entre aproximadamente un 1 y aproximadamente un 3 % de jabón como ácido graso (p. ej., ácido graso C16-22); entre aproximadamente un 10 % y aproximadamente un 17 % de carbonato de sodio (como Na2CO3); entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 9 % de silicato soluble (p. ej., Na2O, 2SiO2); entre aproximadamente un 23 % y aproximadamente un 33 % de zeolita (NaAlSiO4); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 4 % de sulfato de sodio (p. ej., Na2SO4); entre aproximadamente un 8 % y aproximadamente un 16 % de perborato de sodio (p. ej., NaBO3H2O); entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 8 % de TAED; entre un 0 % y aproximadamente un 1 % de fosfonato (p. ej., EDTMPA); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 2 % de carboximetilcelulosa (CMC); 0-3 % de polímeros (p. ej., copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG); 0,0001-0,1 % de enzimas (calculadas como proteína enzimática pura); y 0-5 % de ingredientes minoritarios (p. ej., supresores de espuma, perfumes, abrillantador óptico).
4) Una composición detergente formulada como granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende entre aproximadamente un 8 % y aproximadamente un 12 % de sulfonato de alquilbenceno lineal (calculado como ácido); entre aproximadamente un 10 % y aproximadamente un 25 % de etoxilato de alcohol (p. ej., alcohol C12-15, 7 EO); entre aproximadamente un 14 % y aproximadamente un 22 % de carbonato de sodio (como Na2CO3); entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 5 % de silicato soluble (p. ej., Na2Ü, 2 SÍO2; entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 35 % de zeolita (p. ej., NaAlSiO4); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 10 % de sulfato de sodio (p. ej., Na2SO4); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 2 % de carboximetilcelulosa (CMC); 1-3 % de polímeros (p. ej., copolímero de ácido maleico/acrílico PVP, PEG); 0,0001-0,1 % de enzimas (calculadas como proteína enzimática pura); y 0-5 % de ingredientes minoritarios (p. ej., supresores de espuma, perfume).
5) Una composición detergente líquida acuosa que comprende entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 21 % de sulfonato de alquilbenceno lineal (calculado como ácido); entre aproximadamente un 12 % y aproximadamente un 18 % de etoxilato de alcohol (p. ej., alcohol C12-15, 7 EO o alcohol C12-15, 5 EO); entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 13 % de jabón como ácido graso (p. ej., ácido oleico); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 13 % de ácido alquenilsuccínico (C12-14); entre aproximadamente un 8 % y aproximadamente un 18 % de etanolamina; entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 8 % de ácido cítrico; entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 3 % de fosfonato; entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 3 % de polímeros (p. ej., PVP, PEG); entre un 0 % y aproximadamente un 2 % de borato (p. ej., B4O7); entre aproximadamente un 8 % y aproximadamente un 14 % de propilenglicol; 0,0001-0,1 % de enzimas (calculadas como proteína enzimática pura); y 0-5 % de ingredientes minoritarios (p. ej., dispersantes, supresores de espuma, perfume, abrillantador óptico).
6) Una composición detergente líquida acuosa estructurada que comprende entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 21 % de sulfonato de alquilbenceno lineal (calculado como ácido); 3-9 % de etoxilato de alcohol (p. ej., alcohol C12-15, 7 EO, o alcohol C12-15, 5 EO); entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 10 % de jabón como ácido graso (p. ej., ácido oleico); entre aproximadamente un 14 % y aproximadamente un 22 % de zeolita (como NaAlSiO4); entre aproximadamente un 9 % y aproximadamente un 18 % de citrato de potasio; entre un 0 % y aproximadamente un 2 % de borato (p. ej., B4O7); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 2 % de carboximetilcelulosa (CMC); entre un 0 % y aproximadamente un 3 % de polímeros (p. ej., PEG, PVP); entre un 0 % y aproximadamente un 3 % de polímeros de anclaje como, p. ej., copolímero de lauril metacrilato/ácido acrílico; fracción molar 25:1, PM 3800; entre un 0 % y aproximadamente un 5 % de glicerol; 0,0001-0,1 % de enzimas (calculadas como proteína enzimática pura); y 0-5 % de ingredientes minoritarios (p. ej., dispersantes, supresores de espuma, perfume, abrillantadores ópticos).
7) Una composición detergente formulada como granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 10 % de sulfato de alcohol graso; entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 9 % de monoetanolamida de ácido graso etoxilado; 0-3 % de jabón como ácido graso; entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 10 % de carbonato de sodio (como Na2CO3); entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 4 % de silicato soluble (p. ej., Na2O, 2SiO2); entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 40 % de zeolita (p. ej., NaAlSiO4); entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 8 % de sulfato de sodio (p. ej., Na2SO4); entre aproximadamente un 12 % y aproximadamente un 18 % de perborato de sodio (p. ej., NaBO3H2O); entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 7 % de TAED; entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 5 % de polímeros (p. ej., copolímero de ácido maleico/acrílico, p Eg ); 0,0001-0,1 % de enzimas (calculadas como proteína enzimática pura); y 0-5 % de ingredientes minoritarios (p. ej., abrillantador óptico, supresores de espuma, perfume).
8) Una composición detergente formulada como granulado que comprende entre aproximadamente un 8 % y aproximadamente un 14 % de sulfonato de alquilbenceno lineal (calculado como ácido); entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 11 % de monoetanolamida de ácido graso etoxilado; entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 3 % de jabón como ácido graso; entre aproximadamente un 4 % y aproximadamente un 10 % de carbonato de sodio (p. ej., Na2CO3); entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 4 % de silicato soluble (Na2O, 2SiO2); entre aproximadamente un 30 % y aproximadamente un 50 % de zeolita (p. ej., NaAlSiO4); entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 11 % de sulfato de sodio (p. ej., Na2SO4); entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 12 % de citrato de sodio (p. ej., C6HsNa3O7); entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 5 % de polímeros (p. ej., PVP, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG); 0,0001-0,1 % de enzimas (calculadas como proteína enzimática pura); y 0-5 % de ingredientes minoritarios (p. ej., supresores de espuma, perfume).
9) Una composición detergente formulada como granulado que comprende aproximadamente entre un 6 % y aproximadamente un 12 % de sulfonato de alquilbenceno lineal (calculado como ácido); entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 4 % de tensioactivo no iónico; entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de jabón como ácido graso; entre aproximadamente un 14 % y aproximadamente un 22 % de carbonato de sodio (como Na2CO3); entre aproximadamente un 18 % y aproximadamente un 32 % de zeolita (p. ej., NaAlSiO4); entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 20 % de sulfato de sodio (p. ej., Na2SO4); entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 8 % de citrato de sodio (p. ej., C6HsNa3O7); entre aproximadamente un 4 % y aproximadamente un 9 % de perborato de sodio (p. ej., NaBO3H2O); entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 5 % de activador de blanqueo (p. ej., NOBS o TAED); entre un 0 % y aproximadamente un 2 % de carboximetilcelulosa (CMC); entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 5 % de polímeros (p. ej., policarboxilato o PEG); 0,0001-0,1 % de enzimas (calculadas como proteína enzimática pura); y 0-5 % de ingredientes minoritarios (p. ej., abrillantador óptico, perfume).
10) Una composición detergente líquida acuosa que comprende entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 23 % de sulfonato de alquilbenceno lineal (calculado como ácido); entre aproximadamente un 8 % y aproximadamente un 15 % de etoxisulfato de alcohol (p. ej., alcohol C12-15, 2-3 EO); entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 9 % de etoxilato de alcohol (p. ej., alcohol C12-15, 7 EO, o alcohol C12-15, 5 EO); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 3 % de jabón como ácido graso (p. ej., ácido láurico); entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 5 % de etanolamina; entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de hidrotropo (p. ej., toluensulfonato de sodio); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 2 % de borato (p. ej., B4O7); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 1 % de carboximetilcelulosa; entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 3 % de etanol; entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 5 % de propilenglicol; 0,0001-0,1 % de enzimas (calculadas como proteína enzimática pura); y 0-5 % de ingredientes minoritarios (p. ej., polímeros, dispersantes, perfume, abrillantadores ópticos).
11) Una composición detergente líquida acuosa que comprende entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 32 % de sulfonato de alquilbenceno lineal (calculado como ácido); 6-12 % de etoxilato de alcohol (p. ej., alcohol C12-15, 7 EO, o alcohol C12-15, 5 EO); entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de etanolamina; entre aproximadamente un 8 % y aproximadamente un 14 % de ácido cítrico; entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 3 % de borato (p. ej., B4O7); entre un 0 % y aproximadamente un 3 % de polímero (p. ej., copolímero de ácido maleico/acrílico, polímero de anclaje como, por ejemplo, copolímero de lauril metacrilato/ácido acrílico); entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 8 % de glicerol; 0,0001­ 0,1 % de enzimas (calculadas como proteína enzimática pura); y 0-5 % de ingredientes minoritarios (p. ej., hidrotropos, dispersantes, perfume, abrillantadores ópticos).
12) Una composición detergente formulada como granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 40 % de tensioactivo aniónico (sulfonato de alquilbenceno lineal, sulfato de alquilo, a-olefinsulfonato, ésteres metílicos de ácido graso a-sulfo, alcanosulfonatos, jabón); entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 10 % de tensioactivo no iónico (p. ej., etoxilato de alcohol); entre aproximadamente un 8 % y aproximadamente un 25 % de carbonato de sodio (p. ej., Na2CO3); entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 15 % de silicatos solubles (p. ej., Na2O, 2SiO2); entre un 0 % y aproximadamente un 5 % de sulfato de sodio (p. ej., Na2SO4); entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 28 % de zeolita (NaAlSiO4); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 20 % de perborato de sodio (p. ej., NaBO3-4H2O); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 5 % de activador de blanqueo (TAED o NOBS); 0,0001-0,1 % de enzimas (calculadas como proteína enzimática pura); y 0-3 % de ingredientes minoritarios (p. ej., perfume, abrillantadores ópticos).
13) Composiciones detergentes según se han descrito anteriormente en las composiciones 1) - 12), donde la totalidad o parte del sulfonato de alquilbenceno lineal se sustituye por sulfato de alquilo (C12-C18).
14) Una composición detergente formulada como granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende entre aproximadamente un 9 % y aproximadamente un 15 % de sulfato de alquilo (C12-C18); entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 6 % de etoxilato de alcohol; entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 5 % de amida de ácido graso de polihidroxialquilo; entre aproximadamente un 10 % y aproximadamente un 20 % de zeolita (NaAlSiO4); entre aproximadamente un 10 % y aproximadamente un 20 % de disilicato estratificado (p. ej., SK56 de Hoechst); entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 12 % de carbonato de sodio (p. ej., Na2CO3); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 6 % de silicato soluble (p. ej., Na2O, 2SiO2); entre aproximadamente un 4 % y aproximadamente un 8 % de citrato de sodio; entre aproximadamente un 13 % y aproximadamente un 22 % de percarbonato de sodio; entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 8 % de TAED; entre un 0 % y aproximadamente un 5 % de polímeros (p. ej., policarboxilatos y PVP); 0,0001-0,1 % de enzimas (calculadas como proteína enzimática pura); y 0-5 % de ingredientes minoritarios (p. ej., abrillantador óptico, fotoblanqueo, perfume, supresores de espuma).
15) Una composición detergente formulada como granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende entre aproximadamente un 4 % y aproximadamente un 8 % de sulfato de alquilo (C12-C18); entre aproximadamente un 11 % y aproximadamente un 15 % de etoxilato de alcohol; entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 4 % de jabón; entre aproximadamente un 35 % y aproximadamente un 45 % de zeolita MAP o zeolita A; entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 8 % de carbonato de sodio (como Na2CO3); entre aproximadamente un 0 % y aproximadamente un 4 % de silicato soluble (p. ej., Na2O, 2SiO2); entre aproximadamente un 13 % y aproximadamente un 22 % de percarbonato de sodio; 1-8 % de TAED; entre un 0 % y aproximadamente un 3% de carboximetilcelulosa (CMC); entre un 0 % y aproximadamente un 3 % de polímeros (p. ej., policarboxilatos y PVP); 0,0001-0,1 % de enzimas (calculadas como proteína enzimática pura); y 0-3 % de ingredientes minoritarios (p. ej., abrillantador óptico, fosfonato, perfume).
16) Formulaciones detergentes según se ha descrito anteriormente en 1) - 15), que contienen un perácido estabilizado o encapsulado, bien como un componente adicional o como un sustituto para sistemas de blanqueo ya especificados.
17) Composiciones detergentes según se ha escrito anteriormente en 1), 3), 7), 9) y 12), donde el perborato se sustituye por percarbonato.
18) Composiciones detergentes según se ha escrito anteriormente en 1), 3), 7), 9), 12), 14) y 15), que contienen adicionalmente un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso es, por ejemplo, uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching," Nature 369: 637-639 (1994).
19) Composición detergente formulada como líquido detergente no acuoso que comprende un tensioactivo líquido no iónico como, por ejemplo, alcohol primario alcoxilado lineal, un sistema mejorador (p. ej., fosfato), una(s) enzima(s), y álcali. El detergente puede comprender también tensioactivo aniónico y/o un sistema de blanqueamiento.
[0254] Como se ha indicado anteriormente, el presente polipéptido de amilasa se puede incorporar en una concentración empleada habitualmente en detergentes. Actualmente, se contempla que, en la composición detergente, la enzima se puede añadir en una cantidad correspondiente a 0,00001 - 1,0 mg (calculada como proteína enzimática pura) de polipéptido de amilasa por litro de solución de lavado.
[0255] La composición detergente también puede contener otros ingredientes detergentes habituales, p. ej., material defloculante, material de relleno, depresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes suspensores de la suciedad, agentes secuestrantes, agentes de redeposición antisuciedad, agentes deshidratantes, tintes, bactericidas, fluorescentes, espesantes y perfumes.
[0256] La composición detergente puede estar formulada como una composición detergente para lavar la ropa a mano (manual) o a máquina (automática), incluida una composición de aditivo para lavado de ropa adecuada para pretratar tejidos manchados y una composición suavizante de tejido añadida al aclarado, o estar formulada como una composición detergente para su uso en operaciones de limpieza domésticas de superficies duras generales, o estar formulada para operaciones de lavado de vajilla manual o automático.
[0257] Cualquiera de las composiciones de limpieza descritas en el presente documento pueden incluir cualquier número de enzimas adicionales. Por lo general, la(s) enzima(s) debería(n) ser compatible(s) con el detergente seleccionado (p. ej., en lo que respecta al pH óptimo, la compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, y similares), y la(s) enzima(s) debería(n) estar presente(s) en cantidades efectivas. Las siguientes enzimas se proporcionan a modo de ejemplos.
[0258] P ro te a sa s : Entre las proteasas adecuadas se incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se incluyen mutantes modificados químicamente o con proteínas modificadas, así como proteínas procesadas de forma natural. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, una proteasa microbiana alcalina, una proteasa de tipo tripsina, o una proteasa de tipo quimotripsina. Entre los ejemplos de proteasas alcalinas se incluyen las subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de B a c illu s , p. ej., subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (véase, p. ej., WO 89/06279). Entre los ejemplos de proteasas de tipo tripsina se incluyen la tripsina (p. ej., de origen porcino o bovino), y proteasas de F u sa riu m (véase, p. ej., WO 89/06270 y WO 94/25583). Entre los ejemplos de proteasas útiles se incluyen también, aunque sin carácter limitativo, las variantes descritas en los documentos WO 92/19729, WO 98/20115, W o 98/20116 y WO 98/34946. Entre las enzimas proteasas disponibles comercialmente se incluyen, aunque sin carácter limitativo: ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE™, DURALASE™, ESPERASE®, KANNASE™ y BLAZE™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S); MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT OXP™, FN2™ y FN3™ (Danisco US Inc.). Entre otros ejemplos de proteasas se incluye NprE de B a c illu s a m y lo liq u ifa c ie n s y ASP de la cepa 69B4 de C e llu lo m o n a s sp.
[0259] L ip a s a s : Entre las lipasas adecuadas se incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente, modificadas proteolíticamente, o con proteínas modificadas. Entre los ejemplos de lipasas útiles se incluyen, aunque sin carácter limitativo, las lipasas de H u m ico la (sinónimo T h e rm o m yce s ), p. ej., de H. la n u g in o s a (T. la n u g in o s u s ) (véase, p. ej., EP 258068 y Ep 305216), de H. in s o le n s (véase, p. ej., WO 96/13580); una lipasa de P se u d o m o n a s (p. ej., de P. a lca lig e n e s o P. p s e u d o a lc a lig e n e s ; véase, p. ej., EP 218272), P. ce p a c ia (véase, p. ej., EP 331 376), P. s tu tze r i (véase, p. ej., GB 1,372,034), la cepa SD 705 de P. fluo resce ns , P se u d o m o n a s sp. (véase, p. ej., WO 95/06720 y WO 96/27002), P. w isco n s in e n s is (véase, p. ej., WO 96/12012); una lipasa de B ac illu s (p. ej., de B. s u b tilis ; véase, p. ej., Dartois e t a l. Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993)), B. s te a ro th e rm o p h ilu s (véase, p. ej., JP 64/744992), o B. p u m ilu s (véase, p. ej., WO 91/16422). Otras variantes de lipasa contempladas para su uso en las formulaciones incluyen aquellas que se describen por ejemplo en los documentos: WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225 y EP 260105. Algunas enzimas lipasa disponibles comercialmente incluyen LIPOLASE® y LIPOLASE ULTRA™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S).
[0260] P o lie s te ra sa s : En la composición se pueden incluir poliesterasas adecuadas, como las que se describen, por ejemplo, en WO 01/34899, WO 01/14629 y US6933140.
[0261] Amilasas: Las composiciones pueden combinarse con otras amilasas, como la amilasa mejorada sin producción. Estas pueden incluir amilasas disponibles comercialmente como, aunque sin carácter limitativo, STAINZYME®, NATALASE®, DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL® y BAN™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S); RAPIDASE®, POWERASE® y PURASTAR® (de Danisco US Inc.).
[0262] C e lu lasa s : Se pueden añadir celulasas a las composiciones. Entre las celulasas adecuadas se incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o con proteínas modificadas. Entre las celulasas adecuadas se incluyen celulasas de los géneros B acillu s , P seu do m on as , H u m ico la , Fusa rium , Th ie lav ia , A c re m o n iu m , p. ej., las celulasas fúngicas producidas por H u m ico la in so le ns , M yce lio p h th o ra th e rm o p h ila y F u sa riu m o x y s p o ru m , que se exponen por ejemplo en las patentes estadounidenses n.° 4,435,307; 5,648,263; 5,691,178; 5,776,757; y WO 89/09259. Ejemplos de celulasas que se contemplan para su uso son aquellas que presentan beneficios para el cuidado del color en el tejido. Ejemplos de dichas celulasas son las celulasas que se describen por ejemplo en los documentos EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397 y WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa, como las que se describen en los documentos WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531315; las patentes estadounidenses n.° 5,457,046; 5,686,593; y 5,763,254. Entre las celulasas disponibles comercialmente se incluyen CELLUZYME® y CAREZYME® (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S); CLAZINASE® y PURADAX HA® (Danisco US Inc.); y KAC-500(B)™ (Kao Corporation).
[0263] P e ro x id a s a s /O x id a s a s : Entre las peroxidasas/oxidasas adecuadas que se contemplan para su uso en las composiciones se incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o con proteínas modificadas. Entre los ejemplos de peroxidasas útiles se incluyen las peroxidasas de C o p rin u s , p. ej., de C. c in e re u s , y sus variantes, como se describe en los documentos WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257. Algunas peroxidasas disponibles comercialmente incluyen por ejemplo GUARDZYME™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S).
[0264] La composición detergente puede comprender también 2,6-p-D-fructano hidrolasa, que resulta efectiva en la eliminación/limpieza de biopelículas presentes en prendas/tejidos de carácter doméstico y/o industrial.
[0265] La(s) enzima(s) detergente(s) se puede(n) incluir en una composición detergente añadiendo aditivos separados que contienen una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprende la totalidad de estas enzimas. Un aditivo detergente, esto es, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede estar formulado, por ejemplo, como un granulado, un líquido, una suspensión, y similares. Entre los ejemplos de formulaciones de aditivo detergente se incluyen, aunque sin carácter limitativo, granulados, en concreto granulados no pulverulentos, líquidos, en concreto líquidos estabilizados, o suspensiones.
[0266] Se pueden producir granulados no pulverulentos, por ejemplo, según se da a conocer en los documentos de patente estadounidense n.° 4,106,991 y 4,661,452 y opcionalmente pueden estar recubiertos mediante métodos que se conocen en la técnica. Entre los ejemplos de materiales de recubrimiento ceroso se incluyen productos de poli(óxido de etileno) (p. ej., polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que presentan de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los que hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos de ácidos grasos. En el documento GB 1483591, por ejemplo, se proporcionan ejemplos de materiales de recubrimiento que forman una película adecuados para aplicarse mediante técnicas de lecho fluido. Las preparaciones de enzimas líquidas pueden, por ejemplo, estabilizarse añadiendo un poliol como propilenglicol, un azúcar o un polialcohol, ácido láctico o ácido bórico de acuerdo con los métodos establecidos. Se pueden preparar enzimas protegidas conforme al método que se da a conocer en el documento EP 238,216.
[0267] La composición detergente puede estar presentada en cualquier forma conveniente, p. ej., una barra, una pastilla, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso y contener normalmente hasta aproximadamente un 70 % de agua, y desde un 0 % hasta aproximadamente un 30 % de disolvente orgánico. Asimismo, se contemplan geles detergentes compactos que contienen aproximadamente un 30 % o menos de agua. Opcionalmente, la composición detergente puede comprender uno o varios tensioactivos, que pueden ser no iónicos, incluyendo semipolares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos. Los tensioactivos pueden estar presentes en una amplia gama, desde aproximadamente un 0,1 % hasta aproximadamente un 60 % en peso.
[0268] Cuando se incluya en este, el detergente contendrá normalmente desde aproximadamente un 1 % hasta aproximadamente un 40 % de un tensioactivo aniónico, como sulfonato de alquilbenceno lineal, a-olefinsulfonato, alquilsulfato (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico de ácido graso a-sulfo, ácido alquilsuccínico o alquenilsuccínico, o jabón.
[0269] Cuando se incluya en este, el detergente contendrá normalmente desde aproximadamente un 0,2 % hasta aproximadamente un 40 % de un tensioactivo no iónico, como etoxilato de alcohol, etoxilato de nonilfenol, alquil poliglucósido, óxido de alquil dimetil amina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de ácido graso de polihidroxialquilo, o derivados de N-acilo-N-alquilo de glucosamina («glucamidas»).
[0270] El detergente puede contener desde un 0 % hasta aproximadamente un 65 % de un mejorador de detergente o de un agente complejante como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético, ácido alquilsuccínico o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (p. ej., SKS-6 de Hoechst).
[0271] El detergente puede comprender uno o más polímeros. Entre los ejemplos de polímeros se incluyen carboximetilcelulosa (CMC), poli(vinilpirrolidina) (PVP), poli(etilenglicol) (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos, p. ej., poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico), y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico.
[0272] La(s) enzima(s) de la composición detergente se puede(n) estabilizar empleando agentes estabilizadores convencionales, como, por ejemplo, poliol (p. ej., propilenglicol o glicerol), un azúcar o polialcohol, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico (p. ej., éster de borato aromático), o un derivado de ácido fenilborónico (p. ej., ácido 4-formilfenilborónico). La composición puede estar formulada según se describe en los documentos WO 92/19709 y WO 92/19708.
[0273] Se contempla que, en las composiciones detergentes, en concreto las variantes de enzima, se pueden añadir en una cantidad correspondiente a aproximadamente de 0,01 mg a aproximadamente 100 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado (p. ej., de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5,0 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado o de 0,1 a aproximadamente 1,0 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado).
[0274] En las tablas siguientes, se indican otras formulaciones detergentes de ejemplo adicionales a las que puede añadirse la presente amilasa (o que, en algunos casos, se identifica como componente).
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7.6. Métodos para analizar la actividad de amilasa en composiciones detergentes
[0275] En la técnica se conocen numerosos ensayos de limpieza de a-amilasa, incluidos análisis de muestras y de micromuestras. En los ejemplos adjuntos se describen únicamente algunos de estos ensayos.
[0276] Con el fin de representar además las composiciones y métodos, y las ventajas de los mismos, los siguientes ejemplos específicos se proporcionan con el entendimiento de que presentan un carácter ilustrativo en lugar de limitativo.
8. Composiciones de destilado
[0277] La presente variante de amilasa puede ser un componente de una composición de destilado utilizada en un proceso de elaboración de cerveza, esto es, elaboración de una bebida de malta fermentada. Los carbohidratos no fermentables forman la mayoría de los sólidos disueltos en la cerveza final. Este residuo permanece debido a la incapacidad de las amilasas de malta para hidrolizar los enlaces alfa-1,6 del almidón. Los carbohidratos no fermentables aportan alrededor de 50 calorías por cada 0,35 l de cerveza. Una amilasa, en combinación con una glucoamilasa y opcionalmente una pululanasa y/o isoamilasa, contribuyen a convertir el almidón en dextrinas y azúcares fermentables, disminuyendo los carbohidratos restantes no fermentables en la cerveza final.
[0278] Las principales materias primas utilizadas para elaborar estas bebidas son agua, lúpulo y malta. Además, adjuntos como la sémola de maíz común, la sémola de maíz refinada, la levadura de cerveza molida, el arroz, el sorgo, el almidón de maíz refinado, la cebada, el almidón de cebada, la cebada descascarillada, el trigo, el almidón de trigo, el cereal torrefacto, los copos de cereal, el centeno, la avena, la patata, la tapioca y jarabes, tales como el jarabe de maíz, el jarabe de caña de azúcar, el jarabe de azúcar invertido, jarabes de cebada y/o de trigo y similares pueden utilizarse como fuente de almidón.
[0279] Por una serie de razones, la malta, que se produce principalmente a partir de determinadas variedades de cebada, tiene el mayor efecto en el carácter y calidad globales de la cerveza. En primer lugar, la malta es el agente aromatizante principal de la cerveza. En segundo lugar, la malta proporciona la mayor parte del azúcar fermentable. En tercer lugar, la malta aporta las proteínas, que contribuirán al carácter del cuerpo y la espuma de la cerveza. En cuarto lugar, la malta proporciona la actividad enzimática necesaria durante la maceración. El lúpulo también contribuye de forma significativa a la calidad de la cerveza, incluido su aroma. En concreto, el lúpulo (o los constituyentes de lúpulo) añade sustancias amargas deseables a la cerveza. El lúpulo actúa además como precipitante de proteínas, establece agentes conservantes y ayuda en la formación y estabilización de la espuma.
[0280] Asimismo, para la elaboración de cerveza se emplean granos, como cebada, avena, trigo, así como componentes vegetales, como maíz, lúpulo y arroz, tanto en la industria como en la elaboración de cerveza casera. Los componentes utilizados en la elaboración de cerveza pueden ser no malteados o pueden ser malteados, esto es, parcialmente germinados, lo cual resulta en un aumento de los niveles de enzimas, incluida la a-amilasa. Para una elaboración correcta de cerveza, se necesitan unos niveles adecuados de actividad de enzima a-amilasa con el fin de asegurar los niveles apropiados de azúcares para la fermentación. Por consiguiente, puede añadirse una amilasa, por sí sola o en combinación con otra(s) a-amilasa(s), a los componentes utilizados para la elaboración de cerveza.
[0281] Según se utiliza en el presente documento, el término «material de partida» hace referencia a los granos y componentes vegetales que se trituran o se rompen. Por ejemplo, la cebada utilizada en la producción de cerveza es un grano que se ha molido o machacado bruscamente para obtener una consistencia adecuada para producir una masa de malta para la fermentación. Según se utiliza en el presente documento, el término «material de partida» incluye cualquiera de los tipos de vegetales y granos mencionados anteriormente en forma triturada o molida gruesa. Los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para determinar las concentraciones de actividad de a-amilasa tanto en las harinas como en el material de partida.
[0282] En la técnica se conocen procesos para elaborar cerveza. Véase, p. ej., Wolfgang Kunze (2004) "Technology Brewing and Malting," Research and Teaching Institute of Brewing, Berlín (VLB), 3a edición. En resumen, el proceso implica: (a) la preparación de una masa de malta, (b) el filtrado de la masa de malta para preparar un mosto y (c) la fermentación del mosto para obtener una bebida fermentada, como la cerveza. Normalmente, la malta molida o machacada se mezcla con agua y se mantiene durante un periodo de tiempo en temperaturas controladas para permitir que las enzimas presentes en la malta transformen el almidón presente en la malta en azúcares fermentables. A continuación, la masa de malta se transfiere a un filtro de masa de malta en el que el líquido se separa del residuo de grano. Este líquido dulce se denomina "mosto" y el residuo de grano restante se denomina "bagazo". La masa de malta se somete normalmente a una extracción, lo que conlleva la adición de agua a la masa de malta con el fin de recuperar el extracto soluble residual del bagazo. El mosto se hierve entonces enérgicamente para esterilizar el mosto y ayudar a la formación del color, el sabor y el olor. En algún momento de la ebullición se añade el lúpulo. El mosto se enfría y se transfiere a un fermentador.
[0283] A continuación, se pone el mosto en contacto con levadura en un fermentador. El fermentador puede refrigerarse para detener la fermentación. La levadura flocula y se elimina. Por último, la cerveza se enfría y se almacena durante un período de tiempo, durante el cual la cerveza se aclara y se desarrolla su sabor, y se asienta cualquier material que pudiera afectar a la apariencia, el sabor o la vida útil de la cerveza. La cerveza contiene normalmente entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 10 % v/v de alcohol, aunque puede obtenerse cerveza con un contenido de alcohol mayor, por ejemplo, un 18 % v/v. Antes del envasado, la cerveza se carbonata y, opcionalmente, se filtra y se pasteuriza.
[0284] La composición de destilado que comprende una amilasa, en combinación con una glucoamilasa y opcionalmente una pululanasa y/o isoamilasa, se puede añadir a la masa de malta de la etapa (a) expuesta anteriormente, esto es, durante la preparación de la masa de malta. De forma alternativa, o adicionalmente, la composición de destilado se puede añadir a la masa de malta de la etapa (b) descrita anteriormente, esto es, durante la filtración de la masa de malta. De forma alternativa, o adicionalmente, la composición de destilado se puede añadir al mosto de la etapa (c) descrita anteriormente, esto es, durante la fermentación del mosto.
[0285] Una bebida fermentada, como una cerveza, puede producirse mediante uno de los métodos anteriores. La bebida fermentada puede ser una cerveza, tal como cerveza de pura malta, cerveza elaborada de acuerdo con la Ley de la pureza, IPA, rubia, cerveza amarga, Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, bebida afín a la cerveza, cerveza ligera, cerveza de bajo contenido alcohólico, cerveza baja en calorías, porter, bock, cerveza negra, licor de malta, cerveza sin alcohol, licor de malta sin alcohol y similares, pero también bebidas a base de malta y cereales alternativas, tales como bebidas a base de malta con sabor a fruta, por ejemplo, con sabor a cítrico, tales como limón, naranja, lima o bebidas a base de malta con sabor a baya, bebidas a base de malta con sabor a licor, por ejemplo, licor de malta con sabor a vodka, ron o tequila o bebidas a base de malta con sabor a café, tal como licor a base de malta con sabor a cafeína y similares.
9. Reducción de almidón positivo al yodo
[0286] Las variantes de amilasa pueden reducir la cantidad de almidón positivo al yodo (IPS), al utilizarse en un método de licuefacción y/o sacarificación. El IPS se puede obtener a partir de la amilosa que escapa de la hidrólisis y/o a partir de polímero de almidón retrogradado. La retrogradación del almidón se lleva a cabo de forma espontánea en una pasta de almidón, o en un gel al envejecer, a causa de la tendencia de las moléculas de almidón a unirse entre sí, seguida por un aumento de la cristalinidad. Las soluciones de concentración baja se tornan cada vez más turbias como consecuencia de la asociación progresiva de moléculas de almidón en artículos más grandes. Tiene lugar la precipitación espontánea y el almidón precipitado parece retomar su condición original de insolubilidad en agua fría. Las pastas de concentración más alta se convierten en un gel al enfriarse, y al envejecer, se vuelve progresivamente más firme a causa de la creciente asociación de moléculas de almidón. Este hecho se debe a la fuerte tendencia a la formación de enlace de hidrógeno entre grupos hidroxi en moléculas de almidón adyacentes. Véase J.A. Radley, ed., STARCH AND ITS DERIVATIVES 194-201 (Chapman and Hall, Londres (1968)).
[0287] La presencia de IPS en la solución de sacárido afecta negativamente a la calidad del producto final y representa un problema importante para el procesamiento posterior. El IPS tapona o ralentiza el sistema de filtración, y obstruye las columnas de carbono utilizadas para la purificación. Cuando el IPS alcanza niveles suficientemente elevados, podría filtrarse a través de las columnas de carbono y reducir la eficiencia productiva. Asimismo, podría resultar en un producto final borroso tras el almacenamiento, lo cual resulta inaceptable para la calidad del producto final. La cantidad de IPS se puede reducir aislando el tanque de sacarificación y volviendo a mezclar los contenidos. No obstante, el IPS se acumulará en las columnas de carbono y en los sistemas de filtros, entre otros. Se espera que el empleo de variantes de amilasas mejore al rendimiento general del proceso al reducir la cantidad de IPS.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Ensayos
[0288] A continuación se exponen, para facilitar la comprensión, diversos ensayos utilizados en el presente documento. Cualquier desviación de los protocolos en ejemplos posteriores se indica en las secciones correspondientes. En estos experimentos, se utilizó un espectrofotómetro para medir la absorbancia de los productos formados una vez concluidas las reacciones. Todos los ensayos se realizaron con sobrenadantes de cultivo tratados con perlas chelex.
A. Tratamiento con perlas Chelex de sobrenadantes de cultivo
[0289] Las microplacas (MTP) de 96 pocillos que contienen cultivos en crecimiento se extrajeron de las incubadoras y se sustituyeron las tapas de Enzyscreen por selladores de plástico desechables (Nunc cat. # 236366; Rochester, Nueva York, Ee . UU.). Las células se separaron del sobrenadante de cultivo mediante centrifugación (RCF 1118, 5 minutos). Se extrajeron 150 pl de sobrenadante de cada pocillo y se transfirieron a placas filtrantes (Millipore Multiscreen HTS, Billerica, Massachusetts, EE. UU.) que contenían perlas Chelex preparadas como se describe a continuación. Las placas se agitaron enérgicamente durante 5 minutos y se recogió el sobrenadante de 3 placas de crecimiento de replicación en una única microplaca de pocillos profundos (Axygen, PDW-11-C) empleando un dispositivo colector de vacío. Las placas que contenían sobrenadantes se sellaron y se almacenaron a 4 °C.
[0290] Las perlas Chelex-100 y la malla 200-400 (BioRad, Hercules, California, EE. UU.) se lavaron dos veces con 2 volúmenes de lecho de 1 M de HCl, y después con 5 volúmenes de lecho de agua ultrapura en un aparato de filtro de vidrio sinterizado. Se utilizaron 2 volúmenes de lecho de 1 M de KOH para lavar las perlas, y a continuación se realizó otro lavado con 5 volúmenes de lecho con agua ultrapura. Las cuentas filtradas se transfirieron a un vaso de precipitado y se suspendieron con la suficiente agua ultrapura para producir una suspensión capaz de mezclarse. El pH de la suspensión se ajustó a 8-8,5 empleando HCl. El líquido se extrajo y las cuentas se secaron empleando un filtro de vidrio sinterizado. Se preparó una suspensión de perlas (40 % p/p) en agua ultrapura y su pH se ajustó a 8,0 utilizando KOH/HCl. Se mantuvo una suspensión que presentaba una consistencia constante mediante un mezclado enérgico. Se utilizó un dispositivo de depósito bubblepaddle (V&P Scientific, San Diego, California, EE. UU.) para transferir 100 pl de suspensión a todos los pocillos de las placas filtrantes. El líquido se extrajo empleando un dispositivo colector de vacío.
B. Ensayo de determinación de proteínas
[0291] Los ensayos de determinación de proteínas se llevaron a cabo utilizando sobrenadante de cultivo tratado con perlas Chelex de cultivos cultivados en microplacas (MTP) de 96 pocillos durante 3 días a 37 °C con agitación a 300 rpm y con un 80 % de humedad. Se utilizó una nueva MTP de 96 pocillos de fondo redondo que contenía 25 pl de sobrenadante por pocillo para el método de determinación de proteínas mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los sobrenadantes se diluyeron cuatro veces en 25 mM de acetato de sodio con pH 5,5 y se analizaron 10 pl de cada muestra diluida. Se empleó una HPLC de Agilent 1200 (Hewlett Packard) equipada con una columna Poroshell 300SB-C8 (Agilent Technologies Santa Clara, California, EE. UU.). La muestra se unió a la columna utilizando 25 mM de acetato de sodio con pH 5,5, y se eluyó con un gradiente de hasta un 70 % de acetonitrilo. La absorbancia se midió a 220 nm, se integró empleando el software ChemStation (Agilent Technologies) y la concentración de proteínas se determinó basándose en una curva estándar de proteína CspAmy2-v1 purificada.
C. Ensayo Ceralpha de actividad de a-amilasa
[0292] El ensayo Ceralpha de a-amilasa se llevó a cabo utilizando el kit Ceralpha (Megazyme, Wicklow, Irlanda). El ensayo implica incubar el sobrenadante de cultivo con una mezcla de sustrato en condiciones definidas, y la reacción se concluye (y se desarrolla el color) mediante la incorporación de un tampón de borato (200 mM de ácido bórico/tampón de NaOH, pH 10). El sustrato es una mezcla del oligosacárido definido «p-nitrofenil maltoheptaósido con extremo no reductor bloqueado» (BPNPG7) y niveles excesivos de a-glucosidasa (que no actúa en el sustrato nativo a causa de la presencia del «grupo bloqueador»). En la hidrólisis del oligosacárido mediante una a-amilasa endoactiva, las cantidades excesivas de a-glucosidasa presentes en la mezcla proporcionan una hidrólisis instantánea y cuantitativa del fragmento de pnitrofenil maltosacárido a glucosa y a p-nitrofenol libre. Se midió la absorbancia a 405 nm, que se relaciona directamente con el nivel de amilasa en la muestra analizada.
[0293] El equipo empleado para este ensayo incluía un robot Biomek FX (Beckman Coulter Brea, California, EE. UU.); un lector de microplacas SpectraMAX (tipo 340-Dispositivos moleculares, Sunnyvale, California, EE. UU.) y una incubadora/agitador iEMS (Thermo Scientific, Rockford, Illinois, EE. UU.). El reactivo y las soluciones utilizadas fueron: 1) sustrato de p-nitrofenil maltoheptaósido (BPNPG7) (kit Ceralpha HR de Megazyme);
2) 50 mM de tampón de malato, 0,005 % de TWEEN® 80 con pH 5,6 o 50 mM de MOPS, 0,005 % de TWEEN® 80 con pH 7 (soluciones tampón de dilución); y
3) 200 mM de ácido bórico/tampón de NaOH, pH 10 (tampón STOP).
[0294] Se disolvió un vial que contenía 54,5 mg de sustrato de BPNPG7 en 10 ml de agua MilliQ y a continuación se diluyó en 30 ml de tampón de dilución para conformar 40 ml del sustrato de trabajo (1,36 mg/ml). Las muestras de amilasa (sobrenadante de fermentación) se diluyeron 40X con tampón de dilución. El ensayo se llevó a cabo añadiendo 5 pl de solución de amilasa diluida en los pocillos de una MTP, y después se añadieron 55 pl de la solución de sustrato de trabajo de BPNPG7 diluido. Las soluciones se mezclaron y la MTP se selló con un sello para placa y se colocó en una incubadora/agitador (iEMS - Thermo Scientific) durante 4 minutos a 25 °C. La reacción se concluyó añadiendo 70 pl de tampón STOP y la absorbancia se leyó a una longitud de onda de 400 nm en un lector de microplacas. Se empleó un control no enzimático para los valores de fondo de la absorbancia.
D. Ensayo de termoestabilidad
[0295] Se midió la termoestabilidad de CspAmy2-v1 y de las variantes determinando la actividad de amilasa utilizando el ensayo Ceralpha de a-amilasa. El equipo utilizado para este ensayo incluía un robot Biomek FX (Beckman Coulter); un lector de microplacas SpectraMAX (tipo 340-Molecular Devices), una máquina de PCR Tetrad2DNA Engine (Biorad), y una incubadora/agitador iEMS (Thermo Scientific). Las soluciones de reactivo utilizadas fueron (* no en todos los ensayos):
1) Tampones de estrés térmico
a) 50 mM de KOAc con pH 4,5 (5 ppm de CaCl2, 50 ppm de NaCl)*,
b) 50 mM de KOAc con pH 5,0 (10 ppm de CaCl2, 10 mM de NaCl),
c) 50 mM de KOAc con pH 5,7 (5 ppm de CaCl2, 50 ppm de NaCl),
d) 50 mM de KOAc con pH 5,7 (condición sin sal)*
2) Sustrato de p-nitrofenil maltoheptaósido (BPNPG7) (kit Ceralpha HR de Megazyme);
3) 50 mM de tampón de malato, 0,005 % de TWEEN® 80, pH 5,6 (tampón de dilución); y
4) 200 mM de ácido bórico/NaOH, pH 10 (tampón STOP).
5) Sobrenadante de cultivo de amilasa: 1:10 placas enzimáticas de dilución maestra se diluyeron 1:10 en cada uno de los cuatro tampones de estrés térmico en una placa de PCR
[0296] Se añadieron 5 pl de las muestras enzimáticas diluidas en una placa de PCR de 96 pocillos que contenía 55 pl de solución de sustrato de trabajo BPNPG7 diluida y se determinó la actividad de amilasa inicial de las muestras empleando el ensayo de a-amilasa Ceralpha según se ha descrito en la Sección C. Las muestras se sometieron a estrés térmico durante 3-6 minutos en un termociclador PCR del siguiente modo: tampones (a) 50 °C, (b) 59 °C - 60 °C, (c) 65 °C -70 °C, y (d) 65 °C. Las muestras sometidas a estrés térmico se enfriaron inmediatamente a temperatura ambiente y se analizaron 5 pl de alícuotas para determinar la actividad de amilasa empleando el ensayo de a-amilasa Ceralpha según se ha descrito en la Sección C. Para cada variante, se utilizó la proporción de las actividades de amilasa iniciales y residuales para calcular la termoestabilidad de la siguiente forma: termoestabilidad = [valor de tresidual] / [valor de tinicial], por lo que se calculó la proporción de actividad de termoestabilidad basándose en la actividad enzimática tras la incubación térmica dividida por la actividad enzimática antes de la incubación térmica. Para cada muestra (variantes), se ha calculado el índice de rendimiento (IR). El índice de rendimiento para la termoestabilidad se determinó comparando la termoestabilidad de la variante de enzima con la de la enzima CspAmy2-v1 tratada de forma similar (SEQ ID NO: 3).
E. Ensayos de hidrólisis de almidón (ensayos de aplicación de harina de maíz y almidón de maíz)
[0297] La hidrólisis de almidón de harina de maíz y de almidón de maíz se utilizó para medir la actividad específica de CspAmy2-v1 y sus variantes. La actividad se midió como extremos reductores generados mediante la descomposición enzimática de harina de maíz o de almidón de maíz. Los extremos reductores generados durante la incubación con cualquier sustrato se cuantificaron utilizando un ensayo PAHBAH (hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico). El equipo utilizado para el ensayo incluía un robot Biomek FX (Beckman Coulter); un lector de microplacas SpectraMAX (tipo 340-Molecular Devices), una máquina de PCR Tetrad2DNA Engine (Biorad), y una incubadora/agitador iEMS (Thermo Scientific), y un depósito b u b b le pa dd le .
[0298] La harina de maíz orgánico de Azure Farms (Norco, California) se molió hasta formar un polvo fino empleando un molinillo de café para consumidores y a continuación se tamizó para obtener una fracción de < 250 micras. La harina de maíz tamizada se lavó minuciosamente con agua MilliQ mediante la suspensión y centrifugación repetida. El material de harina de maíz orgánico de Cargill Farms también se lavó minuciosamente con agua MilliQ mediante la suspensión y centrifugación repetida.
[0299] Tanto las fracciones lavadas de harina de maíz como las de almidón de maíz se suspendieron en agua MilliQ que contenía un 0,005 % de azida de sodio como 20 % (p/p) de soluciones madre. Las soluciones madre se diluyeron además con una solución tampón madre 20X a 10,9 % p/v de soluciones de harina de maíz y de almidón de maíz (concentración de tampón final: 55 mM de KOAc, pH 5).
[0300] Se añadieron 55 pl de los sustratos de harina de maíz y almidón de maíz diluidos en microplacas de PCR junto con 5 pl de muestras de enzima diluidas 1:10 empleando un depósito bubble paddle. Las placas se sellaron y se colocaron a 83 °C durante 5 minutos, y después se redujo a 45 °C. La reacción de hidrólisis de almidón se concluyó añadiendo 70 pl de NaOH 0,1 N. Las placas se sellaron y se centrifugaron durante 3 minutos a 1610 RCF. Los productos de reacción de hidrólisis de almidón de ambas reacciones se analizaron mediante el ensayo PAHBAH según se describe a continuación.
[0301] Ensayo PAHBAH: Se añadieron alícuotas de 80 pl de 0,5 N NaOH a todos los pocillos de una placa de PCR vacía (una «placa de reacción PAHBAH»), y a continuación se añadieron 20 pl de reactivo PAHBAH (5 % p/v de hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico (Sigma # H9882, San Luis, Misuri) disuelto en 0,5 N HCl). Las soluciones se mezclaron pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Se añadieron 20 pl de los sobrenadantes de reacción de hidrólisis de almidón en cada pocillo de la placa de reacción PAHBAH. Las placas se sellaron y se colocaron en un termociclador, programado durante 2 minutos a 95 °C para desarrollar el color, y se enfrió a continuación hasta 20 °C. Las muestras de 80 pl de las mezclas de reacción PAHBAH desarrolladas se transfirieron a una placa nueva, y se midió la absorbancia a 450 nm en un espectrofotómetro.
F. Ensayo de m icromuestras de almidón de arroz CS-28
[0302] El fundamento de este ensayo de amilasa es la liberación de un tinte naranja a causa de la hidrólisis de almidón de arroz incorporado a una micromuestra de algodón. Se mide la absorbancia a 488 nm del líquido de lavado y esta se relaciona con el nivel de actividad de amilasa en la muestra analizada en las condiciones deseadas (pH, temperatura y tampón).
[0303] El equipo utilizado para este ensayo incluía un robot Biomek FX (Beckman Coulter); un lector de microplacas SpectraMAX (tipo 340-Molecular Devices) y una incubadora/agitador iEMS (Thermo Scientific). El reactivo y las soluciones utilizados fueron:
1) Micromuestras CS-28 (almidón de arroz, de color);
2) 10 mM de HEPES, 2 mM de CaCl2, 0,005 % de tampón TWEEN 80, pH 8,0, conductividad 1 mS/cm;
3) 25 mM de CAPS, 2 mM de CaCl2, 0,005 % de tampón TWEEN 80, pH 10,0, conductividad 5 mS/cm (ajustada con 5 M de NaCl); y
4) 10 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl2, 0,005 % de TWEEN 80.
5) 50 mM de MOPS pH 7,15, 0,1 mM de CaCl2.
[0304] Las micromuestras CS-28 con 5,5 mm de diámetro circular las proporcionó el Center for Testmaterials (CFT, Vlaardingen, Países Bajos). Se colocaron dos micromuestras en cada pocillo de una microplaca de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos Corning 9017. Los sobrenadantes de cultivo se diluyeron ocho veces en 50 mM de MOPS con pH 7,15, 0,1 mM de CaCl2, y posteriormente en 10 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl2, 0,005 % de solución TWEEN®80 hasta aproximadamente 1 ppm, concentración enzimática final.
[0305] La incubadora/agitador se configuró a la temperatura deseada, 25 °C (temperatura ambiente) o 50 °C. Se añadieron 174 pl o 177 pl de tampón HEPES o CAPS, respectivamente, en cada pocillo de la microplaca que contenía las micromuestras, y posteriormente se añadieron 6 pl o 3 pl de solución diluida de enzimas en cada pocillo dando como resultado un volumen total de 180 pl/pocillo. La microplaca se selló con un sellado de placa y se colocó en la incubadora/agitador iEMS y se incubó durante 15 minutos a 1150 rpm a 25 °C para la limpieza con un pH 8, baja conductividad (1 mS/cm), o durante 15 minutos a 1150 rpm a 50 °C para la limpieza con un pH 10, conductividad alta (5 mS/cm). T ras la incubación en las condiciones apropiadas, se transfirieron 100 pl de solución de cada pocillo a una nueva microplaca, y se midió la absorbancia a 488 nm empleando un espectrofotómetro para microplacas. Se incluyeron controles que contenían dos micromuestras y tampón, pero no enzima, para la sustracción del rendimiento de limpieza de fondo.
[0306] Cada valor de absorbancia se corrigió mediante la sustracción del blanco (obtenido tras la incubación de micromuestras en ausencia de enzima), y la absorbancia resultante proporcionó una medida de la actividad hidrolítica. Se calculó un índice de rendimiento (IR) para cada muestra.
[0307] Para calcular los índices de rendimiento (IR) de limpieza, se utilizó la ecuación de Langmuir para ajustar los datos basándose en el control de la enzima CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 3). Utilizando la concentración de proteínas de las variantes, se calculó el rendimiento esperado basado en el ajuste de curvas. El rendimiento observado se dividió por el rendimiento calculado. A continuación, este valor se dividió por el rendimiento de la enzima CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 3).
G. Ensayo de estabilidad detergente
[0308] La estabilidad de la amilasa de referencia (enzima CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 3)) y de sus variantes se determinó midiendo su actividad tras la incubación en condiciones definidas, en presencia de una mezcla de 10 % de detergente (detergente Persil Color Gel adquirido comercialmente, Henkel (Düsseldorf, Alemania), adquirido en 2011). El detergente se inactivó por calor antes de su uso, y las actividades de amilasa inicial y residual se determinaron empleando el ensayo de a-amilasa Ceralpha según se ha descrito anteriormente en la sección C.
[0309] El equipo utilizado para este ensayo incluía un robot Biomek FX (Beckman Coulter); un lector de microplacas SpectraMAX (tipo 340-Molecular Devices), una máquina de PCR Tetrad2DNA Engine (Biorad), y una incubadora/agitador iEMS (Thermo Scientific). Las soluciones de reactivo utilizadas fueron:
1) Sustrato de p-nitrofenil maltoheptaósido (BPNPG7) (kit Ceralpha HR de Megazyme);
2) Detergente líquido (Persil Color Gel, inactivado por enzimas mediante calor durante 2 h a 80°C);
3) 50 mM de MOPS, 0,1 mM de CaCl2, 0,005 % de tampón TWEEN®80, pH 7 (tampón de dilución);
4) Solución de 10 % de detergente diluida en tampón de dilución;
5) 200 mM de ácido bórico/tampón de NaOH, pH 10 (tampón de STOP).
6) Sobrenadantes de cultivo de amilasa diluidos ocho veces en 50 mM de MOPS con pH 7,15, 0,1 mM de CaCh que contenía 0-100 pg/ml de proteína.
[0310] Se añadieron 85 pl de una solución de 10 % de detergente a una placa de PCR de 96 pocillos y se mezclaron con 15 pl del sobrenadante de cultivo diluido. Se diluyó una muestra de la placa de PCR 3X en tampón de dilución y se utilizó una alícuota de 5 pl de esta dilución para determinar la actividad de amilasa inicial. La placa de PCR se incubó en un bloque de PCR Tetrad a 80,5 °C durante 5 minutos. Tras la incubación, la mezcla detergente-enzima se diluyó 3X en tampón de dilución y se midió la actividad residual. La actividad de amilasa inicial (tinicial) y residual (tresidual) se determinó mediante el ensayo de a-amilasa Ceralpha, según se ha descrito anteriormente en la Sección C, empleando una muestra de 5 pl.
[0311] Para cada variante, se utilizó la proporción de las actividades de amilasa residual e inicial para calcular la estabilidad detergente del siguiente modo: estabilidad detergente = [valor de tresidual] / [valor de tinicial].
[0312] Se calculó el índice de rendimiento (IR) para cada muestra (variantes). El índice de rendimiento para la estabilidad detergente se determinó comparando la estabilidad detergente de la variante de enzima con la de la enzima CspAmy2-v1 tratada de forma similar (SEQ ID NO: 3).
H. Índice de rendimiento
[0313] El índice de rendimiento (IR) compara el rendimiento o la estabilidad de la variante y de la enzima original (CspAmy2-v1) en la misma concentración de proteínas. Además, se pueden calcular los valores teóricos por medio de los parámetros de la ecuación de Langmuir de la enzima estándar. Un índice de rendimiento (IR) superior a 1 (IR>1) indica un mejor rendimiento de una variante en comparación con la original (por ejemplo, CspAmy2-v1, SEQ ID NO: 3), mientras que un IR de 1 (IR=1) identifica una variante que tiene el mismo rendimiento que la original, y un IR que es menor que 1 (IR<1) identifica una variante que tiene un rendimiento peor que la original.
Ejemplo 2
Generación de cepas de B. subtilis que expresan CspAmy2-v1 y sus variantes
[0314] En este ejemplo, se describe la construcción de cepas de B a c illu s su b tilis que expresan amilasa CspAmy2-v1 y sus variantes. CspAmy2-v1 es una variante de amilasa CspAmy2 de origen natural (CspAmy2 wt) que tiene una deleción tanto de Arginina 178 como de Glicina 179. CspAmy2 wt es una amilasa de una C y to p h a g a s p ., cuya secuencia de nucleótido fue descrita por Chii-Ling e t a l. (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68(7): 3651-3654. Se describió que la amilasa CspAmy2-v1 presentaba una termoestabilidad mejorada con respecto a la amilasa CspAmy2 wt en Rong-Jen e t al. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69(4): 2383-2385.
[0315] Se produjo un fragmento de ADN sintético (SEQ ID NO: 4) denominado en la presente memoria «ADN de C s p A m y 2 -v 1 ») que codifica CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 2) mediante GeneArt AG (Regensburg, Alemania) y sirvió como patrón de ADN para la construcción de cepas de B a c illu s su b tilis que expresan amilasa CspAmy2-v1 y sus variantes.
[0316] SEQ ID NO:4 incluye una secuencia de nucleótidos de codón modificado que codifica la forma madura de la amilasa CspAmy2-v1 adyacente a una secuencia que codifica el péptido señal LAT (subrayado):
A T G A A A C A A C A A A A A C G G C T T T A C G C C C G A T T G C T G A C G C T G T T A T T T G C G C T C A T C
T T C T T G C T G C C T C A T T C T G C A G C T A G C G C A G C A G C G A C A A A C G G A A C A A T G A T G C A
GT A T T T C G A G T G G T A T GT A C C T A A C G A C G G C C A G C A A T G G A A C A G A C T G A G A A C A G
A T G C C C C T T A C T T G T C A T C T G T T G G T A T T A C A G C A G T A T G G A C A C C G C C G G C T T A T A
A G G G C A C G T C T C A A G C A G A T G T G G G G T A C G G C C C G T A C G A T C T G T A T G A T T T A G G C
G A G T T T A A T C A A A A A G G T A C A G T C A G A A C G A A G T A T G G C A C A A A A G G A G A A C T T A
A A T C TG C T G TT A A C A C G CT G C A T T C A A A T G G A A T C C A A G T GT A T G G T G A T GT C GT G A
T G A A T C A T A A A G C A G G T G CT G A T T A T A C A G A A A A C G T A A C G G C G G T G G A G G T G A A T
CC G TCT A A T A G A A A T C A G G A A A C G A G C G G C G A A T A T A A T A T T C A G G C A T GG A C A G G
C T T C A A C T T T C C G G G C A G A G G A A C A A C G T A T T C T A A C T T C A A A T G G C A G T G G T T C C A
TT TT G A T G G A A C GG A T T G G G A C C A G A G C A G A A G C CT C T C T A G A A T C T T C A A A T T C A
C G G G A A A G G C G T G G G A C T G G G A G G T T T C T T C A G A A A A C G G A A A T T A T G A C T A T C T G
A T G T A C G C G G A C A T T G A T T A T G A C C A T C C G G A T G T C G T G A A T G A A A T G A A A A A G T G
G G G C G T C T G G T A T G C C A A C G A A G T T G G G T T A G A T G G A T A C A G A C T T G A C G C G G T C A
A A C A T A T T A A A T T T A G C T T T CT C A A A G A C T G G G T G G A T A A C GC A A G A G C A G C G A C G
G G A A A A G A A A T G TTT A C G G T T G G C G A A T A T T G G C A A A A T G A T T T A G G G G C C CT G A A
T A A C T A C C T G G C A A A G G T A A A T T A C A A C C A A T C T C T T T T T G A T G C G C C G TT G C A T T A
C A A C T T T T A C G C T G C C T C A A C A G G G G G T GG A T A T T A C G A T A T G A G A A A T A T T C TT A A
T A A C A C G T T A G T C G C A A G C A A T C C G A C A A A G G C T G T T A C G T T A G T T G A G A A T C A T G
A C A C A C A G C CT G G A C A A T C A C T G G A A T C A A C A G T C C A A C C GT G G TTT A A A C C G TT A
G C C T A C G C G T T T A T T C T C A C G A G A A G C G G A G G C T A T C C T T C T G T A T T T T A T G G A G A T
A T GT A C G G T A C A A A A G G A A C G A C A A C A A G A G A G A T C C C T G C T C T T A A A T CT A A A A T
C G A A C C T T T G C T T A A G G C T A G A A A A G A C T A T G C T T A T G G A A C A C A G A G A G A C T A T A
T T G A T A A C C C G G A T G T C A T T G G C T G G A C G A G A G A A G G G G A C T C A A C G A A A G C C A A
G A G C G G T C T G G C C A C A G T G A T T A C A G A T G G G C C G G G C G G T T C A A A A A G A A T G T A T G
TT G G C A C G A G C A A T G C G G G T G A A A T C TG G T A T G A T T T G A C A G G G A A T A G A A C A G A T
A A A A T C A C G A T T GG A A G C G A T G G C T A T GC A A C A T T T C C T GT C A A T G G G G G C T C A G T
TT C A G T A T G G G T G C A G C A A
[0317] La forma precursora del polipéptido CspAmy2-v1 producida a partir del vector pHPLT02-CspAmy2-v1 se muestra a continuación como SEQ ID NO: 3. El péptido señal LAT está subrayado:
M K O O K R L Y A R L L T L LF A L IF LL P H SA A SA A A TN G TM M O YFE W YV PN D G O O W N R LR T D
A P Y L S S V GIT A V W TPP A Y K G T S Q A D V G Y GP Y D L Y D LG E FN Q K G T V R T K Y G TK G E LK S
A V N T L H SN G IQ V Y G D V V M N H K A G A D YT E N V T A V E V N P SN R N Q E T SG E Y N IQ A W T G FN
FPG R G TT Y SNFKW Q W FH FD G TD W D Q SR SLSR IFKFTG KAW D W EV S S E N G N Y D Y L M Y
AD ID YD H PD V V N E M K K W G V W Y AN E V G FD G Y R F D A V K H IK F SFFKD W V D N A R A A T G
KEM FT V GE Y W Q N D FG A F N N Y E A K V N Y N Q SFFD APFH Y N F Y A A S T G G G Y YD M R N IFN
N T L V A SN P T K A V T L V E N H D T Q P G Q SL E ST V Q P W F K P LA Y A F ILT R SG G Y P SV FY G D M Y
G T K G T T T R E IP A L K SK IE P L LK A R K D Y A YG T Q R D Y ID N P D V IG W T R E G D ST K A K SG L A T
V ITD G P G G SK R M Y V G T SN A G E IW Y D LT G N R T D K IT IG SD G Y A T F P V N G G SV SV W V Q Q
[0318] La forma madura del polipéptido CspAmy2-v1 producida a partir del vector pHPLT02-CspAmy2-v1 se muestra a continuación como SEQ ID NO: 2.
A A T N GTM M Q Y F E W Y V PN D G Q Q W N RLRTD A P Y L S S V G IT A V W TPP A Y K G T S Q A D V G Y
GP Y D L Y D LG E FN Q K G T V R T K Y G TK G E LK S A Y N T L H S N G IQ Y Y G D Y Y M N H K A G A D Y T
EN V TA V EV N PSN R N Q ETSG E YN IQ A W TG FN FPG R G TTYSN FK W Q W FH FD G TD W D Q SR
S L S R IF K F T G K A W D W E V SSE N G N Y D YL M Y A D ID Y D H PD V V N E M K K W G V W Y A N E V G L
D G Y R L D A V K H IK F S F L K D W V D N A R A A T G K E M F T V G E Y W Q N D L G A L N N Y L A K V N Y N
Q SL FD A P LH Y N FYA A ST G G G Y YD M R N ILN N T LV A SN P T K A V T L V E N H D T Q PG Q SLE ST
V Q P W F K P L A Y A F IL T R S G G Y P S V F Y G D M Y G T K G T T T R E IP A L K S K IE P L L K A R K D Y A Y G
TQ R D Y ID N P D V IG W T R E G D ST K A K SG LA T V IT D G P G G SK R M YV G T SN A G E IW Y D LT G N
R T D K ITIG SD G YA T FPV N G GS V S V W V Q Q
[0319] Para expresar CspAmy2-v1, el fragmento de ADN C sp A m y2-v1 se clonó en el vector pHPLT02, una versión modificada del vector pHPLT (Solingen e t a l. (2001) Extremophiles 5:333-341) por parte de GeneArt y se fusionó en el marco del péptido señal de A m yL (LAT) utilizando los sitios de restricción únicos N h e l y X h o l, lo que dio como resultado el plásmido pHPLT02-CspAmy2-v1. El vector de expresión pHPLT contiene el promotor LAT (Plat) de B. lic h e n ifo rm is y elementos adicionales de pUB110 (McKenzie e t al. (1986) Plasmid, 15: 93-103) incluido un gen de replicasa (reppUB), un gen de resistencia a la neomicina/kanamicina (neo) y un marcador de resistencia a la bleomicina (bleo). Se empleó la mutagénesis de sitio dirigido (Stratagene) para cambiar los nucleótidos 5’-TCA-3’ de serina 28 del péptido señal A m yL por los nucleótidos 5'-AGC-3’ para introducir el sitio de restricción único N h e I.
[0320] Una cepa adecuada de B. su b tilis se transformó con ADN de plásmido pHPLT02-CspAmy2-v1 utilizando un método conocido en la técnica (WO 02/14490). Los transformantes de B. s u b tilis se seleccionaron en placas de agar que contenían agar infusión de corazón (Difco, n.° de catálogo 244400, Lawrence, Kansas, EE. UU. y 10 mg/l de sulfato de neomicina (Sigma, N.° de catálogo. N-1876; contiene 732 pg de neomicina por mg, San Luis, Misuri, EE. UU.). El cultivo selectivo de los transformantes de B. su b tilis que albergan el plásmido pHPLT02-CspAmy2-v1 se llevó a cabo en matraces de agitación a 37 °C durante ~65 h en medio MBD (medio semidefinido enriquecido basado en tampón MOP, con urea como fuente principal de nitrógeno, glucosa como fuente principal de carbono, y complementado con un 1 % de soitona para un crecimiento celular sólido) conteniendo 5 mM de CaCl2 y 10 ppm de neomicina). El cultivo resultó en la producción de amilasa CspAmy2-v1 secretada con actividad hidrolizadora de almidón.
Ejemplo 3
Generación de bibliotecas de evaluación de sitio de CspAmy2-v1
[0321] Se realizó la construcción de una biblioteca de evaluación de sitio (SEL) de CspAmy2-v1 mediante GeneArt con su plataforma de tecnología para la optimización de genes, la síntesis de genes y la generación de bibliotecas (véase, p. ej., Patentes europeas n.° 0 200 362 y 0 201 184, Patentes estadounidenses n.° 4,683,195, 4,683,202 y 6,472,184 y número de solicitud de patente internacional WO 2004/059556A3). El ADN plasmídico pHPLT02-CspAmy2-v1 sirvió de plantilla para producir SEL en cada uno de los sitios de la región madura de la proteína CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 3). Se le encargó a GeneArt que creara las SEL en las posiciones empleando sus protocolos estándar. Los codones correspondientes a cada sitio fueron sustituidos por codones de al menos 10 (de 19 posibles) aminoácidos diferentes. Las mezclas de pHPLT02-CspAmy2-v1 con codones mutagenizados se utilizaron para transformar células competentes de B. subtilis como se conoce en la técnica (WO 2002/014490) para generar las SEL de CspAmy2-v1 . Se incubaron mezclas de transformación en placas de agar HI (agar infusión de corazón) con 10 mg/L de sulfato de neomicina. Para cada biblioteca, se escogieron y cultivaron colonias bacterianas únicas en medio líquido de TSB (caldo a base de triptona y soja) con una selección de 10 mg/ml de neomicina para el posterior aislamiento de ADN y el análisis de secuencia genética. Los datos del análisis de secuencias revelaron un máximo de 19 variantes maduras de CspAmy2-v1 por biblioteca. Para generar muestras de CspAmy2-v1 y de variantes de enzima para su caracterización bioquímica, se realizó un crecimiento selectivo de las variantes en MTP de 96 pocillos a 37 °C durante ~65 horas con un 70 % de humedad en medio MBD. Se obtuvo un total de 7870 de las 9139 variantes posibles para 478 de las 481 posiciones mutagenizadas.
Ejemplo 4
identificación de mutaciones combinables y productivas
[0322] Se determinaron los valores del índice de rendimiento (IR) para todas las variantes de amilasa CspAmy2-v1 analizadas utilizando los ensayos descritos en el ejemplo 1: ensayos de aplicación de harina de maíz y almidón de maíz, ensayo de termoestabilidad (a pH 5,0 y pH 5,7), ensayo de micromuestras CS-28 (a pH 8 y pH 10), ensayo de estabilidad detergente, ensayo de actividad Ceralpha y determinación de proteínas. Se describen posiciones productivas como aquellas posiciones dentro de una molécula que son más útiles para elaborar variantes combinatorias que muestran una característica mejorada, donde cada posición de producción permite al menos una mutación combinable. Las mutaciones combinables son mutaciones en cualquier posición de aminoácido que pueden utilizarse para realizar variantes combinatorias. Las mutaciones combinables mejoran al menos una propiedad deseada de la molécula, mientras que no reducen significativamente la expresión, la actividad ni la estabilidad. Las mutaciones combinables pueden agruparse de la siguiente manera:
Grupo A: Una mutación que produce una variante donde los índices de rendimiento (IR) mínimos relativos a una proteína original definida para: (i) la expresión de proteína, (ii) la actividad de micromuestra CS-28 a pH 8 (25 °C) o pH10 (50 °C), o la actividad en el ensayo Ceralpha, o la actividad en los ensayos de aplicación de harina de maíz o almidón de maíz, y (iii) la estabilidad detergente o la termoestabilidad a pH 5,0 o pH 5,7 es mayor o igual a 0,9, y además tiene un IR para cualquiera de estas pruebas que es mayor o igual a 1,0.
Grupo B: Una mutación que produce una variante donde los índices de rendimiento (IR) mínimos relativos a una proteína original definida para: (i) la expresión de proteína, (ii) la actividad de micromuestra CS-28 a pH 8 (25 °C) o pH10 (50 °C), o la actividad en el ensayo Ceralpha, o la actividad en los ensayos de aplicación de harina de maíz o almidón de maíz, y (iii) la estabilidad detergente o la termoestabilidad a pH 5,0 o pH 5,7 es mayor o igual a 0,8, y además tiene un IR para cualquiera de estas pruebas que es mayor o igual a 1,2.
Grupo C: Una mutación que produce una variante donde los índices de rendimiento (IR) mínimos relativos a una proteína original definida para: (i) la expresión de proteína, (ii) la actividad de micromuestra CS-28 a pH 8 (25 °C) o pH10 (50 °C), o la actividad en el ensayo Ceralpha, o la actividad en los ensayos de aplicación de harina de maíz o almidón de maíz, y (iii) la estabilidad detergente o la termoestabilidad a pH 5,0 o pH 5,7 es mayor o igual a 0,5, y además tiene un IR para cualquiera de estas pruebas que es mayor o igual a 1,5.
[0323] Las propiedades de las mutaciones combinables se resumen en la tabla 4.1.
Tabla 4.1. Propiedades para cada grupo de mutaciones combinables
Figure imgf000113_0001
[0324] Las mutaciones combinables preferidas se encuentran en «posiciones productivas», tal como se describe a continuación. En el caso de las presentes amilasas, la «actividad» se refiere a actividad a-amilasa, que puede medirse según se ha descrito en el presente documento.
[0325] Las posiciones productivas son posiciones de aminoácido que son tolerantes a la sustitución con distintos residuos de aminoácidos, donde las variantes resultantes cumplen un conjunto de criterios de rendimiento para la combinabilidad, tal como se ha expuesto anteriormente. Puede asignarse una puntuación de productividad a las posiciones productivas de la siguiente manera: a las posiciones donde menos del 15 % de las sustituciones en una posición determinada pertenecen a los grupos A, B o C se les da una puntuación de productividad de «1». A las posiciones donde menos del 30 %, pero más de o el 15 % de las sustituciones en una posición determinada pertenecen a los grupos A, B o C, se les da una puntuación de productividad de "2". A las posiciones donde menos del 50 %, pero más de o el 30 % de las sustituciones en una posición determinada pertenecen a los grupos A, B o C, se les da una puntuación de productividad de "3". A las posiciones donde el 50 % o más de las sustituciones en una posición determinada pertenecen a los grupos A, B o C se les da una puntuación de productividad de "4".
[0326] La puntuación de idoneidad se refiere a la habilidad para que una o más mutaciones altamente combinables se utilice para hacer variantes combinatorias, en función de los criterios de rendimiento para la combinabilidad (es decir, A, B y C, tal como se ha expuesto anteriormente) en los que se incluye cada una de las mutaciones. Una puntuación de idoneidad más alta indica una mutación o mutaciones que son más adecuadas para su utilización en la fabricación de variantes combinatorias. Las puntuaciones de idoneidad se describen en la tabla 4.2.
Tabla 4.2. Definiciones de las puntuaciones de idoneidad
Figure imgf000114_0001
[0327] En la tabla 4.3., se muestran puntuaciones de idoneidad de sustituciones individuales en CspAmy2-v1. Para cada posición de proteína CspAmy2-v1, las variantes se enumeran según la puntuación de idoneidad que han recibido (+, +, ++, +++ o ++++). La numeración de posición se basa en el polipéptido maduro de CspAmy2 (SEQ ID NO: 1).
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[0328] Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que entran en las puntuaciones de productividad descritas anteriormente de «1», «2», «3» y «4» y las sustituciones en esas posiciones que son combinables se indican a continuación. Cada posición identificada en la lista y cada sustitución identificada en paréntesis a continuación del identificador de posición numérico representa una mutación que ha sido determinada, a partir de datos experimentales, para contribuir al rendimiento de una variante de amilasa, en concreto, una variante que comprende más de una de las mutaciones descritas. La numeración de posición se basa en el polipéptido maduro de CspAmy2 (SEQ ID NO: 1).
[0329] Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que entran en las puntuaciones de productividad descritas anteriormente de «1», «2», «3» y «4» y las sustituciones en esas posiciones que son combinables se indican a continuación. La numeración de posición se basa en el polipéptido maduro de CspAmy2 (SEQ ID NO: 1).
Lista A:
[0330]
1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P,Q,R,S); 4(N,Q,T);
5(G,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 7(M,I); 8(M,F); 11(F,Y); 15(V,C,I,L,N,S,T);
20(Q,E); 21 (Q,L,T,W); 23(N,A,D,E,F,H,K,M,Q,S,T,V,W,Y); 26(R,K);
27(T,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,W,Y); 28(D,A,E,N);
30(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y); 31(Y,E,F,H,K,M,R,W); 33(S,D,E,G,H,K,N,Q,R);
35(V,H,I,M,N); 38(T,D,N,S); 39(A,S); 40(V,I); 42(T,A,C,I,L,M,V); 45(A,P,S); 46(Y,F,M,T);
48(G,A); 49(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 50(S,D,E,K); 51(Q,S);
52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W); 54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 57(G,K); 58(P,C);
68(N,A,C,E,F,M,S,Y); 70(K,N,R,W); 71(G,A,N); 72(T,G,H,S); 73(V,T); 75(T,C);
81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 82(E,Q); 83(L,F); 84(K,I,Q,V);
85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R); 87(V,I); 88(N,A,D,E,H,Q,R,T); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V);
92(S,A,L,M,R,V); 93(N,D,M,T); 94(G,N); 96(Q,I); 97(V,I); 98(Y,F,W); 101(V,I); 103(M,I,V);
104(N,D); 106(K,A,I,V); 107(A,G); 108(G,A,K,R,S); 109(A,P);
111(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W); 112(T,A,C,D,E,F,G,I,L,M,P,Q,R,V,W,Y);
113(E,D,Y); 114(N,G); 115(V,A,I,M); 116(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W); 117(A,C,S);
118(V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 119(E,S); 120(V,C); 121(N,K,R,S); 122(P,A,K,Q,R,T);
123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 124(N,D); 126(N,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y);
128(E,G,I,K,S,V,Y); 129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y); 130(S,A,G,H,I,R,T,V);
131(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W); 132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y);
133(Y,A,D,E,F,H,K,L,N,T,V); 134(N,C,D,F,G,H,M,P,Q,S,T,Y); 135(I,H,M,R,V);
136(Q,A,F,G,H,I,K,N,T,W,Y); 137(A,V); 138(W,A,D,F,G,H,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y);
140(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,S,T,V,Y); 141(F,H,W);
142(N,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y); 144(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y);
145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y); 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V);
148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y);
150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W); 151(S,D); 152(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W);
153(F,H,W,Y); 154(K,A,E,F,H,N,R,S,T); 156(Q,D,F,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 157(W,N);
158(F,A,C,D,E,G,H,I,L,N,P,R,S,T,V,W,Y); 160(F,C); 163(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 164(D,F,N);
165(W,F,H,P); 166(D,A,C,G,K,M); 167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y);
168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R,T,V,W); 169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y);
170(S,C,G,H,N,R,T); 171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T);
173(R,K,W); 174(I,L); 175(F,A,D,H,L,M,S,V,W,Y); 176(K,L); 177(F,G,H); 182(K,H);
183(A,E,K,R); 187(E,P,V); 189(S,A,C,D); 190(S,P); 191(E,A,C,I,L,M,N,T);
192(N,F,H,M,R,S,Y); 193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 195(Y,D); 198(L,A,C,G); 200(Y,E,L);
201(A,L); 203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 206(D,A,C,I,M,Q,Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y);
208(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 209(D,C,G,I,K); 210(V,S); 211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T);
212(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y); 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 216(K,R); 219(V,E,I,L);
222(A,T); 225(V,L); 226(G,C,E,K,Q); 227(L,Y); 232(L,R,V); 235(V,A,C,L,T);
238(I,L,M,P,Q,R); 239(K,C,M,Q); 240(F,D); 241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y);
242(F,E,I,V,Y); 243(L,A,I,M,S,T); 244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y); 245(D,E); 246(W,F);
248(D,A,N,Q); 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W); 250(A,S); 251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T);
252(A,C,D,F,H,M,R); 253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V); 254(T,F,I,L,M); 256(K,R);
257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y); 258(M,C,F,I,L,Y); 259(F,P); 260(T,A,L,S,Y); 262(G,A);
266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W); 267(N,D); 269(L,A,I,V);
270(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y); 271(A,C,S); 273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 275(Y,F);
276(L,M); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y); 280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y);
281(Y,A,D,G); 283(Q,H,T,V); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 285(L,A); 286(F,L,M); 288(A,V);
295(Y,H,L,Q); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T); 299(T,E,I,R); 300(G,A,K,L,Q,R);
301(G,A,F,H,K,M,Q,R,S,T,Y); 302(G,S); 303(Y,A,F,I,R,T,V,W); 307(R,Q,S);
308(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,Y); 310(L,D,E,T); 311(N,D,E,H,K,Q,S,V); 312(N,D,G);
313(T,A,S); 316(A,K,Q,S); 317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y);
318(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y); 320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y);
321(K,H,R); 325(L,F,I,M,V); 327(E,D); 335(Q,G); 336(S,A,D); 339(S,Q); 342(Q,E,L);
343(P,A,M,W); 348(L,C,G,Q,S); 349(A,G,S,W); 357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y);
358(G,D,E,Q,S); 360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 362(S,A,C,E,I,Q,T,V); 363(V,I,L); 368(M,L,W,Y);
372(K,A,D,H,M,N,R); 374(T,A,K,N,P,Q,S); 375(T,S); 376(T,A,G,H,K,N,Q,S,Y);
377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 378(E,Q); 384(S,D,E,G,H,N,P); 385(K,A,E);
388(P,C,D,I,K,L,R,S); 390(L,C,I); 391(K,E,F,L,T,V,Y); 392(A,G); 394(K,E,H,M);
395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 396(Y,C,F,K); 397(A,S);
400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 401(Q,M); 402(R,F,K,L,Q,S,T,V,W,Y); 403(D,S);
404(Y,W); 405(I,L); 407(N,A,C,D,E,G,H,Q,S); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y); 409(D,N);
410(V,E,I,K,L,M,R,S,Y); 414(T,A,S); 416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V);
418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y); 419(S,A,E,G,K,P,Q,R,T,V,Y);
420(T,A,C,D,E,F,G,H,I,L,P,Q,R,S,V,W,Y); 421(K,A,C,F,G,H,I,L,N,R,S,W,Y);
422(A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y);
424(S,A); 426(L,C); 427(A,C,G,S); 429(V,C,L,M); 430(I,C,E,L,M); 431(T,A,D);
433(G,A,H,N,S); 434(P,D,M,N,Q,R,S); 435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y);
437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 441(Y,C,K,L,N,Q,R,S,W); 442(V,A,I,L,T);
444(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W); 447(A,G,K,Q,R,S,T,V);
448(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 449(E,Q); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V);
452(Y,A,I,L,M,S,V,W); 454(L,A,C,E,F,H,I,K,M,Q,S,T,V,Y); 455(T,A,C,I,L,M,S,V);
456(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y); 458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y);
459(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W); 460(DE,H,N); 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y); 462(I,V);
463(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y); 464(I,V); 465(G,A,M,N,P,Q);
466(S,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,R,T,V,W,Y); 467(D,N); 469(Y,C,F,I,L,S,V); 470(A,G);
471(T,A,D,E,F,G,H,I,K,N,P,Q,W); 474(V,C); 475(N,A,D,F,G,H,I,K,L,M,P,S,T,V);
476(G,A,C,D,E,H,K,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 477(G,A,D,E,H,I,K,P,Q,R,S,T,V,Y); 479(V,C,H,W);
480(S,G); 481(VA,C,I,L); 482(W,Y); 483(V,I); 484(Q,A,H,K); y
485(Q,A,D,E,F ,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
[0331] Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que entran en las puntuaciones de productividad descritas anteriormente «2», «3» y «4», y las sustituciones en esas posiciones que son combinables se indican a continuación. La numeración de posición se basa en la proteína CspAmy2 madura indicada en SEQ ID NO: 1.
Lista B:
[0332]
(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P,Q,R,S);
(G,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 15(V,C,I,L,N,S,T); 21(Q,L,T,W);
3(N,A,D,E,F,H,K,M,Q,S,T,V,W,Y); 27(T,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,W,Y); 28(D,A,E,N); 0(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y); 31(Y,E,F,H,K,M,R,W); 33(S,D,E,G,H,K,N,Q,R); 5(V,H,I,M,N); 38(T,D,N,S); 42(T,A,C,I,L,M,V); 46(Y,F,M,T);
9(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 50(S,D,E,K); 52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W);
4(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y); 70(K,N,R,W); 72(T,G,H,S);
1(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 84(K,I,Q,V); 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R); 8(N,A,D,E,H,Q,R,T); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 92(S,A,L,M,R,V); 93(N,D,M,T);
06(K,A,I,V); 108(G,A,K,R,S); 111(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W);
12(T,A,C,D,E,F,G,I,L,M,P,Q,R,V,W,Y); 115(V,A,I,M);
16(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W); 118(V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 121(N,K,R,S);
22(P,A,K,Q,R,T); 123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y);
28(E,G,I,K,S,V,Y); 129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y); 130(S,A,G,H,I,R,T,V);
31(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W); 132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y);
33(Y,A,D,E,F,H,K,L,N,T,V); 134(N,C,D,F,G,H,M,P,Q,S,T,Y); 135(I,H,M,R,V);
36(Q,A,F,G,H,I,K,N,T,W,Y); 138(W,A,D,F,G,H,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y);
40(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,S,T,V,Y); 142(N,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y); 44(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y); 145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y);
47(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V); 148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y);
49(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y); 150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W);
52(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W); 153(F,H,W,Y); 154(K,A,E,F,H,N,R,S,T);
56(Q,D,F,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 158(F,A,C,D,E,G,H,I,L,N,P,R,S,T,V,W,Y);
63(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 165(W,F,H,P); 166(D,A,C,G,K,M);
67(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y); 168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R,T,V,W);
69(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 170(S,C,G,H,N,R,T);
71(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T);
75(F,A,D,H,L,M,S,V,W,Y); 183(A,E,K,R); 189(S,A,C,D); 191(E,A,C,I,L,M,N,T);
92(N,F,H,M,R,S,Y); 193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 198(L,A,C,G);
03(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 206(D,A,C,I,M,Q,Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y);
08(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 209(D,C,G,I,K); 211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T);
12(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y); 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 219(V,E,I,L);
26(G,C,E,K,Q); 235(V,A,C,L,T); 238(I,L,M,P,Q,R); 239(K,C,M,Q);
41(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y); 242(F,E,I,V,Y); 243(L,A,I,M,S,T);
44(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y); 248(D,A,N,Q); 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W);
51(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T); 252(A,C,D,F,H,M,R); 253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V);
54(T,F,I,L,M); 257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y); 258(M,C,F,I,L,Y); 260(T,A,L,S,Y);
66(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W); 269(L,A,I,V);
70(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y); 273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S);
77(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y); 280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y); 281(Y,A,D,G); 83(Q,H,T,V); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 295(Y,H,L,Q); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T); 99(T,E,I,R); 300(G,A,K,L,Q,R); 301(G,A,F,H,K,M,Q,R,S,T,Y); 303(Y,A,F,I,R,T,V,W); 08(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,Y); 310(L,D,E,T); 311(N,D,E,H,K,Q,S,V);
16(A,K,Q,S); 317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y);
18(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y); 320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y); 21(K,H,R); 325(L,F,I,M,V); 343(P,A,M,W); 348(L,C,G,Q,S); 349(A,G,S,W);
57(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y); 358(G,D,E,Q,S); 360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 362(S,A,C,E,I,Q,T,V); 68(M,L,W,Y); 372(K,A,D,H,M,N,R); 374(T,A,K,N,P,Q,S); 376(T,A,G,H,K,N,Q,S,Y);
77(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 384(S,D,E,G,H,N,P); 385(K,A,E); 388(P,C,D,I,K,L,R,S); 91(K,E,F,L,T,V,Y); 394(K,E,H,M); 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 396(Y,C,F,K);
00(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 402(R,F,K,L,Q,S,T,V,W,Y);
07(N,A,C,D,E,G,H,Q,S); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y); 410(V,E,I,K,L,M,R,S,Y);
16(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V); 418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y);
19(S,A,E,G,K,P,Q,R,T,V,Y); 420(T,A,C,D,E,F,G,H,I,L,P,Q,R,S,V,W,Y);
21(K,A,C,F,G,H,I,L,N,R,S,W,Y); 422(A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y);
23(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y); 427(A,C,G,S); 429(V,C,L,M); 430(I,C,E,L,M); 33(G,A,H,N,S); 434(P,D,M,N,Q,R,S); 435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y);
37(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 441(Y,C,K,L,N,Q,R,S,W); 442(V,A,I,L,T);
44(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W); 447(A,G,K,Q,R,S,T,V); 48(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V);
52(Y,A,I,L,M,S,V,W); 454(L,A,C,E,F,H,I,K,M,Q,S,T,V,Y); 455(T,A,C,I,L,M,S,V);
56(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y); 458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y);
59(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W); 460(DE,H,N); 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y);
463(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y); 465(G,A,M,N,P,Q); 466(S,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,R,T,V,W,Y);
469(Y,C,F,I,L,S,V); 471(T,A,D,E,F,G,H,I,K,N,P,Q,W); 475(N,A,D,F,G,H,I,K,L,M,P,S,T,V);
476(G,A,C,D,E,H,K,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 477(G,A,D,E,H,I,K,P,Q,R,S,T,V,Y); 479(V,C,H,W);
481(VA,C,I,L); 484(Q,A,H,K); y 485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
[0333] Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que entran en las puntuaciones de productividad descritas anteriormente «3» y «4», y las sustituciones en esas posiciones que son combinables se indican a continuación. La numeración de posición se basa en la proteína CspAmy2 madura indicada en SEQ ID NO: 1.
Lista C:
[0334]
1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P,Q,R,S);
5(G,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 15(V,C,I,L,N,S,T);
23(N,A,D,E,F,H,K,M,Q,S,T,V,W,Y); 27(T,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,W,Y);
30(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y); 31(Y,E,F,H,K,M,R,W); 33(S,D,E,G,H,K,N,Q,R);
42(T,A,C,I,L,M,V); 49(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W);
54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y);
81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R);
88(N,A,D,E,H,Q,R,T); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 92(S,A,L,M,R,V);
111(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W); 112(T,A,C,D,E,F,G,I,L,M,P,Q,R,V,W,Y);
116(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W); 118(V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 122(P,A,K,Q,R,T);
123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y); 128(E,G,I,K,S,V,Y);
129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y); 130(S,A,G,H,I,R,T,V); 131(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W);
132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 133(Y,A,D,E,F,H,K,L,N,T,V);
134(N,C,D,F,G,H,M,P,Q,S,T,Y); 136(Q,A,F,G,H,I,K,N,T,W,Y);
138(W,A,D,F,G,H,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 140(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,S,T,V,Y);
142(N,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y); 144(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y);
145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y); 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V);
148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y);
150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W); 152(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W);
154(K,A,E,F,H,N,R,S,T); 156(Q,D,F,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y);
158(F,A,C,D,E,G,H,I,L,N,P,R,S,T,V,W,Y); 163(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 166(D,A,C,G,K,M);
167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y); 168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R,T,V,W);
169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 170(S,C,G,H,N,R,T);
171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T);
175(F,A,D,H,L,M,S,V,W,Y); 191(E,A,C,I,L,M,N,T); 192(N,F,H,M,R,S,Y);
193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 206(D,A,C,I,M,Q,Y);
207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y); 208(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 209(D,C,G,I,K);
211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T); 212(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y);
215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y);
244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y); 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W);
251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T); 252(A,C,D,F,H,M,R); 253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V);
257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y); 258(M,C,F,I,L,Y);
266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W); 270(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y);
273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y);
280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T);
301(G,A,F,H,K,M,Q,R,S,T,Y); 303(Y,A,F,I,R,T,V,W);
308(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,Y); 311(N,D,E,H,K,Q,S,V);
317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 318(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y);
320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y); 357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y);
360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 362(S,A,C,E,I,Q,T,V); 372(K,A,D,H,M,N,R); 374(T,A,K,N,P,Q,S);
376(T,A,G,H,K,N,Q,S,Y); 377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 384(S,D,E,G,H,N,P);
388(P,C,D,I,K,L,R,S); 391(K,E,F,L,T,V,Y); 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 396(Y,C,F,K);
400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 402(R,F,K,L,Q,S,T,V,W,Y);
407(N,A,C,D,E,G,H,Q,S); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y); 410(V,E,I,K,L,M,R,S,Y);
416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V); 418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y);
419(S,A,E,G,K,P,Q,R,T,V,Y); 420(T,A,C,D,E,F,G,H,I,L,P,Q,R,S,V,W,Y);
421(K,A,C,F,G,H,I,L,N,R,S,W,Y); 422(A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y);
423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y); 434(P,D,M,N,Q,R,S);
435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 441(Y,C,K,L,N,Q,R,S,W);
444(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W); 447(A,G,K,Q,R,S,T,V);
448(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V);
452(Y,A,I,L,M,S,V,W); 454(L,A,C,E,F,H,I,K,M,Q,S,T,V,Y); 455(T,A,C,I,L,M,S,V);
456(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y); 458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y);
459(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W); 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y); 463(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y);
465(G,A,M,N,P,Q); 466(S,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,R,T,V,W,Y); 469(Y,C,F,I,L,S,V);
471(T,A,D,E,F,G,H,I,K,N,P,Q,W); 475(N,A,D,F,G,H,I,K,L,M,P,S,T,V);
476(G,A,C,D,E,H,K,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 477(G,A,D,E,H,I,K,P,Q,R,S,T,V,Y); y 485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
[0335] Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que entran en las puntuaciones de productividad descritas anteriormente de «4» y las sustituciones en esas posiciones que son combinables se indican a continuación. La numeración de posición se basa en la proteína CspAmy2 madura indicada en SEQ ID NO: 1.
Lista D:
[0336]
1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P,Q,R,S);
5(G,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 23(N,A,D,E,F,H,K,M,Q,S,T,V,W,Y);
27(T,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,W,Y); 30(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y);
49(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W);
54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y);
81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R);
89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 111(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W);
112(T,A,C,D,E,F,G,I,L,M,P,Q,R,V,W,Y); 116(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W);
118(V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y);
127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y); 128(E,G,I,K,S,V,Y); 129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y);
131(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W); 132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y);
133(Y,A,D,E,F,H,K,L,N,T,V); 134(N,C,D,F,G,H,M,P,Q,S,T,Y); 136(Q,A,F,G,H,I,K,N,T,W,Y);
138(W,A,D,F,G,H,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 140(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,S,T,V,Y);
142(N,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y); 144(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y);
145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y); 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V);
148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y);
150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W); 152(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W);
156(Q,D,F,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 158(F,A,C,D,E,G,H,I,L,N,P,R,S,T,V,W,Y);
163(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y);
168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R,T,V,W); 169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y);
171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T);
193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y);
208(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T);
212(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y); 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y);
241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y); 244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y);
249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W); 251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T);
253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V); 257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y);
266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W); 270(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y);
273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y);
280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T);
301(G,A,F,H,K,M,Q,R,S,T,Y); 308(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,Y);
317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 318(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y);
320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y); 357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y);
360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 384(S,D,E,G,H,N,P);
388(P,C,D,I,K,L,R,S); 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y);
400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y);
416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V); 418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y);
419(S,A,E,G,K,P,Q,R,T,V,Y); 420(T,A,C,D,E,F,G,H,I,L,P,Q,R,S,V,W,Y);
421(K,A,C,F,G,H,I,L,N,R,S,W,Y); 422(A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y);
423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y); 434(P,D,M,N,Q,R,S);
435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y);
444(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W);
448(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V);
454(L,A,C,E,F,H,I,K,M,Q,S,T,V,Y); 456(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y);
458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y); 459(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W); 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y);
463(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y); 466(S,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,R,T,V,W,Y);
471(T,A,D,E,F,G,H,I,K,N,P,Q,W); 475(N,A,D,F,G,H,I,K,L,M,P,S,T,V);
476(G,A,C,D,E,H,K,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 477(G,A,D,E,H,I,K,P,Q,R,S,T,V,Y); y
485(Q,A,D,E,F ,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
[0337] A continuación, se indican las posiciones productivas en CspAmy2-v1 adecuadas para modificaciones de carga o hidrofobicidad. La numeración de posición se basa en la proteína CspAmy2 madura indicada en SEQ ID NO: 1.
Lista E:
[0338] 1,5,15,23,30,31,49,68,111,112,116,123,127,128,129,131,132,134,140,142,144,147, 150, 152, 153, 168, 170, 171, 83, 187, 192, 203, 207, 209, 211, 212, 232, 241, 243, 244, 253, 266, 277, 280, 300, 301, 308, 320, 357, 362, 377, 388, 400, 402, 408, 416, 420, 423, 448, 450, 454, 455, 456, 458, 466, 475 y 485
[0339] A continuación, se indican las posiciones productivas y las sustituciones en esas posiciones en CspAmy2-v1 adecuadas para modificaciones de carga o hidrofobicidad. La numeración de posición se basa en la proteína CspAmy2 madura indicada en SEQ ID NO: 1
Lista F:
[0340] 1(A,K,V,Y); 5(G,F,V); 15(V,S); 23(N,K); 30(P,E,K,L,W); 31(Y,F,K,W); 49(T,I); 68(N,Y); 111(Y,D,Q,S,T,W); 112(T,I,W); 116(T,L); 123(S,K); 127(Q,I); 128(E,I,V); 129(T,I); 131(G,H,K); 132(E,G,H,I,M,P,R,T,V,Y); 134(N,D,F,M,Y); 140(G,E,F,H,K); 142(N,D,I,R); 144(P,G,K,L); 147(G,C,E,H,L,R,V); 150(Y,W); 152(N,D,E,L,R); 153(F,H,Y); 168(S,L); 170(S,R); 171(L,H,N,Q,R); 183(A,K); 187(E,P); 192(N,F,Y); 203(I,C); 207(H,E,F); 209(D,G); 211(V,D,E,N,Q); 212(N,D,E); 232(L,R); 241(S,D,E,I,L,W,Y); 243(L,S); 244(K,C); 253(A,R); 266(Q,I,R,W); 277(A,F,L,Y); 280(N,L); 300(G,R); 301(G,H); 308(N,D,E,F,L,R,V,Y); 320(T,E,W); 357(S,E); 362(S,I,V); 377(R,G,H); 388(P,K); 400(T,E,K,L,W,Y); 402(R,F); 408(P,E,R,W); 416(E,C,F,G,H,K,L,N,R,S,V); 420(T,D,E,I,L,R,W); 423(K,E,F,G,M,N,Q,S,V,Y); 448(G,F,H,K,W); 450(I,K,R,T); 454(L,C); 455(T,L,M); 456(G,F,W); 458(R,A,C,D,E,F,I,S); 466(S,I,L); 475(N,D); y 485(Q,E,K,L,Y,Y)

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Polipéptido de variante de a-amilasa derivado de un polipéptido de a-amilasa original, que comprende al menos una mutación combinable en una posición de aminoácido productiva; donde:
(i) la o cada mutación combinable es una mutación que mejora al menos una propiedad enzimática y bioquímica deseable de la variante de a-amilasa en comparación con la a-amilasa original, mientras que no disminuye significativamente la expresión, la actividad o la estabilidad de la variante de a-amilasa, en comparación con la a-amilasa original,
(ii) la o cada posición productiva es una posición de aminoácido que puede sustituirse por una pluralidad de residuos de aminoácido diferentes, cada una de cuyas sustituciones da lugar a una variante de a-amilasa que cumple los requisitos de (i), y
(iii) la o cada mutación combinable se indica en las listas A, B, C, D, E o F, o en la tabla D, que utiliza SEQ ID NO: 1 para la numeración; y
donde la variante de a-amilasa tiene al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2,
donde la variante de amilasa incluye una mutación combinable en la posición productiva correspondiente a la posición 203 de SEQ ID NO: 1 que es sustitución a Tyr.
2. Variante de amilasa de acuerdo con la reivindicación 1, donde la mutación combinable que es sustitución a Tyr en la posición 203 SEQ ID NO: 1 para la numeración produce una variante de amilasa donde los índices de rendimiento (IR) mínimos en relación con la amilasa original para (i) la expresión de proteína, (ii) la actividad, y (iii) la estabilidad detergente o la termoestabilidad son mayores o iguales a 0,9, y el IR para cualquiera de (i), (ii), o (iii) que es mayor o igual a 1,0,
por lo que el IR para la variante se calcula comparando el rendimiento o la estabilidad de la variante (valor medido) y la amilasa original (valor teórico) con la misma concentración de proteína.
3. Variante de amilasa de acuerdo con la reivindicación 1, donde la mutación combinable que es sustitución a Tyr en la posición 203 SEQ ID NO: 1 para la numeración produce una variante de amilasa donde los índices de rendimiento (IR) mínimos en relación con la amilasa original para (i) la expresión de proteína, (ii) la actividad, y (iii) la estabilidad detergente o la termoestabilidad son mayores o iguales a 0,8, y el IR para cualquiera de (i), (ii), o (iii) que es mayor o igual a 1,2,
por lo que el IR para la variante se calcula comparando el rendimiento o la estabilidad de la variante (valor medido) y la amilasa original (valor teórico) con la misma concentración de proteína.
4. Variante de amilasa de acuerdo con la reivindicación 1, donde la mutación combinable que es sustitución a Tyr en la posición 203 SEQ ID NO: 1 para la numeración produce una variante de amilasa donde los índices de rendimiento (IR) mínimos en relación con la amilasa original para (i) la expresión de proteína, (ii) la actividad, y (iii) la estabilidad detergente o la termoestabilidad son mayores o iguales a 0,5, y el IR para cualquiera de (i), (ii), o (iii) que es mayor o igual a 1,5,
por lo que el IR para la variante se calcula comparando el rendimiento o la estabilidad de la variante (valor medido) y la amilasa original (valor teórico) con la misma concentración de proteína.
5. Variante de amilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la o cada mutación combinable tiene una puntuación de idoneidad de ++, +++ o ++++, haciendo referencia a la tabla C.
6. Variante de amilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la o cada mutación combinable tiene una puntuación de idoneidad de +++ o ++++, haciendo referencia a la tabla C.
7. Variante de amilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la o cada mutación combinable tiene una puntuación de idoneidad de ++++, haciendo referencia a la tabla C.
8. Variante de amilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la o cada mutación combinable tiene una puntuación de idoneidad de 1 o 2, haciendo referencia a la tabla B.
9. Variante de amilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene una pluralidad de mutaciones combinables.
10. Variante de amilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende también una deleción correspondiente a un residuo seleccionado del grupo que consiste en Arg-178, Gly-179, Thr-180 y Gly-181 utilizando SEQ ID NO: 1 para la numeración.
11. Variante de amilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende también deleciones correspondientes a los residuos Arg-178 y Gly-179, utilizando SEQ ID NO: 1 para la numeración.
12. Composición que comprende la variante de amilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende también un tensioactivo, donde la composición es opcionalmente una composición detergente, por ejemplo, un detergente para lavado de ropa o un aditivo detergente para lavado de ropa.
13. Método para sacarificar una composición que comprende almidón para producir una composición que comprende glucosa, donde el método comprende:
(i) poner en contacto la solución que comprende almidón con una cantidad efectiva de la variante de amilasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-11; y
(ii) sacarificar la solución que comprende almidón para producir la composición que comprende glucosa; donde la variante de amilasa cataliza la sacarificación de la solución de almidón a glucosa,
opcionalmente donde la composición que comprende almidón comprende almidón licuado, almidón gelatinizado o almidón granular.
14. Método de acuerdo con la reivindicación 13, donde la sacarificación se lleva a cabo en un rango de temperatura de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 75 °C, opcionalmente donde el rango de temperatura es 47 °C-74 °C; y/o
donde la sacarificación se lleva a cabo en un rango de pH 2,0-7,5, opcionalmente donde el rango de pH es pH 3,5­ 5,5, opcionalmente además donde el rango de pH es pH 3,5-4,5.
15. Método de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, que comprende también fermentar la composición de glucosa para producir un producto final de fermentación (EOF).
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