JP2019506186A - α−アミラーゼバリアントおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
α−アミラーゼバリアントであって、親α−アミラーゼのアミノ酸配列中の少なくとも1個のアミノ酸残基を変異または欠失させることによって得られ、親α−アミラーゼのα−1,4−グリコシド結合加水分解能を保持しており、親α−アミラーゼと95%以上のアミノ酸配列相同性を有していることを特徴とするα−アミラーゼバリアントが提供される。本発明によって提供される一連のα−アミラーゼバリアントは、pH5.0の酸性条件および100℃以上の高温条件で比較的高い触媒活性を示す。
Description
本発明は酵素工学分野に関し、特にα−アミラーゼバリアントおよびその使用に関する。
産業分野におけるデンプンの加水分解は、主にα−アミラーゼを使用して開始される。微生物由来のα−アミラーゼと別の種類の酵素(たとえばプルラナーゼ、グルコアミラーゼやグルコースイソメラーゼなど)を併用することによって、デンプンの巨大分子を効率よく分解することができ、このようにして製造された低分子多糖類や単糖類は、食品製造、穀物加工、ビール製造およびアルコール製造の様々な用途において非常に重要である。α−アミラーゼは糖化・加水分解酵素に属し、主な構造的特徴として(α/β)8バレルの折りたたみ構造を有しており、通常10個以下の単糖モノマーからなる特有のデンプン基質結合部位を含んでいる。しかしながら、デンプンの巨大分子を切断するためには、いくつかの種類のアミラーゼの結合部位が共同で機能してデンプンと複数箇所で結合を形成する必要がある。
α−アミラーゼは、デンプン基質のα−1,4−グリコシド結合を効率よく切断し、デンプン基質の分子量および粘度を速やかに低下させることができる。これによって得られる生成物は主として様々な長さのデキストリンである。様々な種類のα−アミラーゼが存在し、これらのα−アミラーゼを産業利用する際の条件は、所望の生成物の特徴に大きく左右される。
α−アミラーゼ(α−1,4−グルカン−4−グルカノヒドロラーゼ、E.C.3.2.1.1)は、デンプンや他の多糖類のα−1,4−グリコシド結合を効率よく加水分解する。デンプンの加水分解において酵素の効率を上げ、生産コストを下げることが要求されていることから、様々な応用分野においてデンプンを効率よく液化することができるα−アミラーゼを探索することが、学術分野や産業分野での研究領域の一つとして重要視されるようになった。現在、酵素工学技術を使用した酵素種の改良は、主に耐熱性、酸・塩基耐性および液化作用の改善に焦点を当てて行われている。
植物や微生物に見出される様々なα−アミラーゼ、主にB.リケニフォルミス(B. licheniformis)のα−アミラーゼ、B.アミロリクエファシエンス(B. amyloliquefaciens)のα−アミラーゼ、G.ステアロサーモフィルス(G. stearothermophilus)のα−アミラーゼなどに商品価値があることがわかっており、特にB.リケニフォルミスのα−アミラーゼをテンプレートとしたバリアントは最も数が多く、最も広く使用されている。
本発明では、工業生産におけるニーズを満たすことを目的として、G.ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼをテンプレートとして使用して一連のα−アミラーゼバリアントを構築し、α−アミラーゼの利用効率を向上させることに成功した。特に、本発明のα−アミラーゼバリアントによる液化効率は、pHが低く、添加量が少ない場合でも、代表的な市販品とほぼ同等である。
本発明は、液化効率の向上を可能とし、工業生産におけるニーズに応えることができる、G.ステアロサーモフィルス由来の一連のα−アミラーゼバリアントを提供することを目的とする。特に、本発明のα−アミラーゼバリアントの酵素活性およびその他の特性は、100℃以上の温度およびpH5.0の条件下において代表的な市販品とほぼ同等である。
また、本発明は、α−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、α−アミラーゼバリアントの製造方法およびその使用を提供することを目的とする。
本発明の目的は以下の技術的解決策によって達成することができる。
α−アミラーゼバリアントであって、親α−アミラーゼのアミノ酸配列中の少なくとも1個のアミノ酸残基を変異または欠失させることによって得られ、親α−アミラーゼのα−1,4−グリコシド結合加水分解能を保持しており、親α−アミラーゼと95%以上のアミノ酸配列相同性を有していることを特徴とするα−アミラーゼバリアント。
α−アミラーゼバリアントであって、親α−アミラーゼのアミノ酸配列中の少なくとも1個のアミノ酸残基を変異または欠失させることによって得られ、親α−アミラーゼのα−1,4−グリコシド結合加水分解能を保持しており、親α−アミラーゼと95%以上のアミノ酸配列相同性を有していることを特徴とするα−アミラーゼバリアント。
前記親α−アミラーゼは、天然のα−アミラーゼすなわち細菌性α−アミラーゼであることが好ましく、バチルス・サブチリス(枯草菌)、B.リケニフォルミス、B.アミロリクエファシエンス、G.ステアロサーモフィルスおよびバチルス・セレウスからなる群から選択される1種の細菌のα−アミラーゼであることがより好ましく、B.リケニフォルミスまたはG.ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼであることがさらに好ましく、G.ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼであることが最も好ましい。
G.ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼをコードする完全長遺伝子配列は配列番号1で示され、これに対応するアミノ酸配列は配列番号2で示される。
前記α−アミラーゼバリアントは、
(1)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から1番目〜5番目のアミノ酸残基を欠失させて、VNまたはANLNで置換すること;
(2)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのC末端から27〜32個のアミノ酸残基を欠失させること、たとえば、C末端から1番目〜27番目のアミノ酸残基を欠失させること、C末端から1番目〜29番目のアミノ酸残基を欠失させること、またはC末端から1番目〜32番目のアミノ酸残基を欠失させること;ならびに
(3)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から180番目および181番目のアミノ酸残基を欠失させること
のいずれか1つまたはこれらの任意の組み合わせによって得られることが好ましい。
(1)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から1番目〜5番目のアミノ酸残基を欠失させて、VNまたはANLNで置換すること;
(2)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのC末端から27〜32個のアミノ酸残基を欠失させること、たとえば、C末端から1番目〜27番目のアミノ酸残基を欠失させること、C末端から1番目〜29番目のアミノ酸残基を欠失させること、またはC末端から1番目〜32番目のアミノ酸残基を欠失させること;ならびに
(3)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から180番目および181番目のアミノ酸残基を欠失させること
のいずれか1つまたはこれらの任意の組み合わせによって得られることが好ましい。
前記α−アミラーゼバリアントは、前記3種の改変のいずれか1つまたは前記3種の改変の任意の組み合わせに加えて、C末端に3個のアミノ酸残基FANが付加されていることがさらに好ましい。
前記α−アミラーゼバリアントのアミノ酸配列は、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号12からなる群から選択されることがさらに好ましい。
前記α−アミラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列は、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11からなる群から選択される。
本発明のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子が提供される。前記遺伝子は、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11からなる群から選択されることが好ましい。
請求項8に記載のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子を含む、本発明のα−アミラーゼバリアントを発現させるための発現ベクターが提供される。前記発現ベクターは、天然または合成のプロモーター配列、天然または合成のリボソーム結合部位、天然または合成のターミネーター配列、および本発明のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子配列を主として含む発現カセットを含む。
本発明のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子を1つ以上含む、本発明のα−アミラーゼバリアントを発現させるための組換え細胞が提供される。前記組換え細胞を得るための宿主細胞は、バチルス株から選択されることが好ましく、遺伝子組換えによりいくつかの内因性タンパク質を失活させたB.リケニフォルミスまたはその他のバチルス株から選択されることがさらに好ましく、遺伝子組換えによりAprEおよび/またはNprEを失活させたB.リケニフォルミスから選択されることが最も好ましい。
本発明のα−アミラーゼバリアントを製造する方法であって、前記α−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子配列を含む組換え細胞を、前記α−アミラーゼバリアントの発現に適した条件下で培養すること、および該組換え細胞またはその培養上清から前記α−アミラーゼバリアントを得ることを含む方法が提供される。
さらに、多糖類のα−1,4−グリコシド結合の加水分解における、好ましくは高温および/または低pHの条件下における多糖類のα−1,4−グリコシド結合の加水分解における、本発明のα−アミラーゼバリアントの使用が提供される。前記高温は80℃〜110℃であることが好ましく、100℃〜110℃であることがより好ましく、前記低pHは5.0〜5.5であることが好ましい。
本発明によって提供される一連のα−アミラーゼバリアントは、pH5.0の酸性条件および100℃以上の高温条件で高い触媒活性を示す。これらのα−アミラーゼバリアントの耐酸性および熱安定性はデンプンの液化に適している。
特に記載がない限り、本明細書で使用されている技術用語および科学用語はいずれも、当業者によって一般的に理解される意味を有すると見なされる。本願において、特定の用語の意味は本明細書に記載されている通りである。本明細書および添付の請求項において、単数形の「a」、「an」および「the」は、明確な記載がない限り、複数のものを含むことに留意されたい。
本発明において「α−アミラーゼ」は、多糖類のα−1,4−グリコシド結合を加水分解することができる酵素を指す。たとえば、α−アミラーゼは、デンプンを加水分解してデキストリンを生成することができる。
本発明において「親α−アミラーゼ」は天然のα−アミラーゼを指す。この天然のα−アミラーゼは細菌性α−アミラーゼであり、細菌性α−アミラーゼの由来細菌として、バチルス・サブチリス(枯草菌)、B.リケニフォルミス、B.アミロリクエファシエンス、G.ステアロサーモフィルスおよびバチルス・セレウスが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の好ましい一実施形態によれば、天然のα−アミラーゼは、バチルス株、特にB.リケニフォルミスおよびG.ステアロサーモフィルスに由来するものである。G.ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼをコードする完全長配列は配列番号1で示され、これに対応するアミノ酸配列は配列番号2で示される。
本発明において「α−アミラーゼバリアント」は、親α−アミラーゼのアミノ酸配列中の1個または複数個のアミノ酸残基を変異または欠失させることによって得られる非天然のα−アミラーゼであり、親α−アミラーゼのα−1,4−グリコシド結合加水分解能を保持しているものを指す。
本発明において「液化」は、通常、糖質を低分子多糖類に分解するプロセスを指す。α−アミラーゼまたはα−アミラーゼバリアントを添加する場合、「液化」は特に糖質のα−1,4−グリコシド結合を加水分解することを指す。
本発明において「α−1,4−グリコシド結合」は、一方のグルコースのC1と他方のグルコースのC4とを連結する結合、すなわち、α−1,4−グリコシド結合を指す。
本発明は、親α−アミラーゼの配列を改変することによって得られる「α−アミラーゼバリアント」に関する。親α−アミラーゼは天然のα−アミラーゼであり、特に細菌由来の天然のα−アミラーゼである。本発明の一実施形態によれば、α−アミラーゼバリアントは、親α−アミラーゼのアミノ酸配列中の1個または複数個のアミノ酸残基を変異または欠失させることによって得られる。
本発明は一連のα−アミラーゼバリアントを含む。本発明の一実施形態によれば、一連のα−アミラーゼバリアントの各アミノ酸配列は少なくとも95%の相同性を有し、さらには95%、96%、97%、98%、99%または100%の相同性を有する。
本発明において、α−アミラーゼバリアントは、たとえば、以下のいずれか1つの改変によって得られるが、これらに限定されない。
(1)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から1番目〜5番目のアミノ酸残基を欠失させてVNで置換し、C末端から1番目〜27番目のアミノ酸残基を欠失させる。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号4に示す。
(2)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から1番目〜5番目のアミノ酸残基を欠失させてANLNで置換し、N末端から180番目および181番目のアミノ酸残基を欠失させ、C末端から1番目〜27番目のアミノ酸残基を欠失させる。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号6に示す。
(3)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から1番目〜5番目のアミノ酸残基を欠失させてANLNで置換し、N末端から180番目および181番目のアミノ酸残基を欠失させ、C末端から1番目〜29番目のアミノ酸残基を欠失させる。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号8に示す。
(4)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から1番目〜5番目のアミノ酸残基を欠失させてANLNで置換し、N末端から180番目および181番目のアミノ酸残基を欠失させ、C末端から1番目〜32番目のアミノ酸残基を欠失させる。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号10に示す。
(5)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から1番目〜5番目のアミノ酸残基を欠失させてANLNで置換し、N末端から180番目および181番目のアミノ酸残基を欠失させ、C末端から1番目〜27番目のアミノ酸残基を欠失させ、C末端に3個のアミノ酸残基FANを付加する。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号12に示す。
(1)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から1番目〜5番目のアミノ酸残基を欠失させてVNで置換し、C末端から1番目〜27番目のアミノ酸残基を欠失させる。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号4に示す。
(2)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から1番目〜5番目のアミノ酸残基を欠失させてANLNで置換し、N末端から180番目および181番目のアミノ酸残基を欠失させ、C末端から1番目〜27番目のアミノ酸残基を欠失させる。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号6に示す。
(3)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から1番目〜5番目のアミノ酸残基を欠失させてANLNで置換し、N末端から180番目および181番目のアミノ酸残基を欠失させ、C末端から1番目〜29番目のアミノ酸残基を欠失させる。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号8に示す。
(4)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から1番目〜5番目のアミノ酸残基を欠失させてANLNで置換し、N末端から180番目および181番目のアミノ酸残基を欠失させ、C末端から1番目〜32番目のアミノ酸残基を欠失させる。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号10に示す。
(5)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から1番目〜5番目のアミノ酸残基を欠失させてANLNで置換し、N末端から180番目および181番目のアミノ酸残基を欠失させ、C末端から1番目〜27番目のアミノ酸残基を欠失させ、C末端に3個のアミノ酸残基FANを付加する。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号12に示す。
本発明のα−アミラーゼバリアントのアミノ酸配列は、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号12からなる群から選択される。
本発明のα−アミラーゼバリアントは、α−1,4−グリコシド結合を加水分解する能力が保持されている。さらに、本発明のα−アミラーゼの性能は、工業生産で要求される条件、たとえば、液化効率の向上、酸性pHまたは高温下での安定した触媒活性などを満たすものである。
本発明の一実施形態によれば、本発明のα−アミラーゼバリアントは、pH5.0の酸性条件または100℃以上の温度(特に100℃〜110℃)で安定した触媒活性を示す。デンプン産業において実施される液化プロセスは低pHおよび高温の条件下で行われることが多いことから、本発明のα−アミラーゼバリアントが有するこのような改良された特性は、デンプン産業における液化反応により適したものである。
本発明のα−アミラーゼバリアントはいずれも液化反応に使用することができる。好ましい一実施形態において、本発明のα−アミラーゼバリアントは、親α−アミラーゼ、特にG.ステアロサーモフィルス由来の親α−アミラーゼから作製される。特に好ましい一実施形態において、本発明のα−アミラーゼバリアントのアミノ酸配列は、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12のいずれかで示される。
本発明によれば、α−1,4−グリコシド結合を含む糖質であればどのようなものであっても液化反応に使用することができる。1つ以上のα−1,4−グリコシド結合を含む糖質としては、デンプン、アミロペクチン、アミロースおよびデキストランが挙げられるが、これらに限定されない。
アミロペクチンなどの糖質の多くは、α−1,6−グリコシド結合およびα−1,4−グリコシド結合を含んでいる。「α−1,4−グリコシド結合」は、一方のグルコースのC1と他方のグルコースのC4とを連結する結合、すなわち、α−1,4−グリコシド結合を指す。したがって、糖化プロセスにおいて、α−1,6−グリコシド結合を加水分解することができるプルラナーゼを、本発明のα−アミラーゼバリアントと組み合わせて使用することができる。α−1,4−グリコシド結合を加水分解することができる酵素としては、α−アミラーゼが挙げられるが、これに限定されない。本発明の好ましい一実施形態において、α−1,4−グリコシド結合の加水分解を触媒する酵素はα−アミラーゼである。
したがって、本発明の一実施形態によれば、糖化反応に対する触媒性能を向上させて糖化反応の効率を上昇させる方法では、プルラナーゼと組み合わせて使用する。本発明において「プルラナーゼ」は、α−1,6−グリコシド結合を加水分解することができる加水分解酵素を指す。
デンプンの糖化において、本発明のα−アミラーゼとプルラナーゼとを併用することによって、グルコースおよびマルトースの純度を上げることができる。さらに、糖化反応においてこの複合酵素を使用することによって、基質濃度を効果的に低下させることができ、転化効率を効果的に上昇させることができ、酸性pHまたは高温下においてさらに高い触媒活性を発揮させることができ、デンプンを加水分解するための工業条件により合致させることができる。
本発明は、工業生産に適した任意の温度条件およびpH条件において、α−アミラーゼバリアントを使用してα−1,4−グリコシド結合を加水分解して糖化を行う方法を提供する。本発明によれば、液化反応は、80℃〜110℃の高温域、たとえば、80℃、90℃、100℃、105℃、110℃などで実施することができる。糖化反応は、pH5.0〜pH5.5の酸性pH条件、たとえば、pH5.0、pH5.1、pH5.2、pH5.3、pH5.4、pH5.5などで実施することができる。
本発明の一実施形態によれば、酸性pHおよび100℃以上の温度の条件下においてα−アミラーゼバリアントによって触媒される液化反応の触媒活性は安定である。
別の一態様において、本発明の発現ベクターは、α−アミラーゼバリアントをコードする合成ヌクレオチド配列を含み、組換え宿主細胞はこの発現ベクターを含む。本発明の発現ベクターは、様々なα−アミラーゼバリアントをコードする一連の合成ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。本発明の発現ベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。たとえば、本発明の発現ベクターは、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11で示される合成ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
本発明の発現ベクターは、天然または合成のプロモーター配列、天然または合成のリボソーム結合部位および天然または合成のターミネーター配列を含むことが好ましい。これらの遺伝因子と合成α−アミラーゼバリアントのコード配列から発現カセットが構成され、この発現カセットとベクターバックボーンから発現ベクターが構成される。たとえば、本発明の発現ベクターは、遺伝因子として、プロモーター配列、合成リボソーム結合部位、本発明のα−アミラーゼバリアントをコードする合成ヌクレオチド配列およびターミネーター配列を含む発現カセットを含む。シグナル配列は、α−アミラーゼバリアントの分泌を誘導することができる配列であり、本発明の発現ベクターまたは発現カセットへのシグナル配列の導入、特に開始コドンの上流へのシグナル配列の導入は、α−アミラーゼバリアントの分泌においてさらに有利である。
本発明の好ましい一実施形態によれば、本発明の発現ベクターは、細菌において適切に発現され、特にバチルス株、より好ましくはB.リケニフォルミスにおいて適切に発現される。特に好ましい一実施形態において、本発明の発現ベクターは、バチルス属のゲノム、特にB.リケニフォルミスのゲノムに組み込むことができる。宿主細胞の染色体にポリヌクレオチド配列を組み込むために使用することができる発現ベクターおよびこのような発現ベクターの構築方法は、現在の生物学分野においてよく知られている一般的な技術である。
本発明の一実施形態によれば、本発明の組換え宿主細胞は、遺伝子組換えにより、α−アミラーゼバリアントをコードする1つ以上の核酸配列が導入されていてもよい。遺伝子組換えを利用した、本発明のα−アミラーゼバリアントをコードする1つ以上の合成核酸配列の宿主細胞への導入は、どのような技術を使用して行ってもよく、たとえば染色体組み込みを利用してもよい。温度感受性因子および耐性選択マーカーを含むベクターを使用して、組み込み工程を行うことができる。ベクターは、Campbell機構を介してゲノムの特定領域に組み込まれ、組換え株は耐性スクリーニングによって得られる。組換え株の耐性スクリーニングマーカーは、この後の培養工程において相同組換えによって除去される。
本発明の一実施形態によれば、本発明の組換え宿主細胞は、遺伝子組換えによっていくつかの内因性タンパク質が失活している。失活させることができる内因性タンパク質としては、菌体外プロテアーゼが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの内因性タンパク質は、α−アミラーゼバリアント発現遺伝子を含む核酸配列で形質転換された組換え宿主細胞を得る前またはその後に失活させる。より好適な方法では、α−アミラーゼバリアント発現遺伝子を含むベクターを導入する前に、宿主細菌において菌体外分泌プロテアーゼを失活させる。
最初に、B.リケニフォルミスを遺伝子組換えして、いくつかの菌体外分泌プロテアーゼ遺伝子を失活させる。具体的には、いくつかの菌体外プロテアーゼ、たとえばサブチリシン(AprE)やグルタミン酸特異的プロテアーゼ(Blase)などを、B.リケニフォルミス株において失活させることができる。このような遺伝子組換えを行うことによって、B.リケニフォルミス株を、α−アミラーゼバリアントの発現および分泌により適したものとすることができる。
本発明は、α−アミラーゼバリアントの製造方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、前記方法は、α−アミラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞を、前記α−アミラーゼバリアントの発現に適した条件下で培養すること、および該組換え宿主細胞またはその上清から前記α−アミラーゼバリアントを得ることを含む。
本発明の組換え宿主細胞はいずれもα−アミラーゼバリアントを産生することができる。本発明の組換え宿主細胞は、α−アミラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を少なくとも1コピー含む。α−アミラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列は、好適な条件下でα−アミラーゼバリアントを発現することができる。組換え宿主細胞から分泌されたα−アミラーゼバリアントは、該組換え細胞またはその上清から回収することができる。回収方法としては、濾過、遠心分離などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態によれば、遺伝子組換えB.リケニフォルミスを使用した発酵によってα−アミラーゼバリアントを大量生産することができる。目的のα−アミラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を、遺伝子操作によりB.リケニフォルミスに導入する。より好ましくは、本発明のB.リケニフォルミスは、遺伝子組換えによって、耐性スクリーニング遺伝子が除去されており、よって、環境に優しく、製造されるα−アミラーゼバリアントは、食品産業での使用により適したものである。
以下の本発明の実施例は本発明の本質をさらに詳しく説明するものである。ただし、以下の実施例は本発明をなんら限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求項によって定義される。
実施例1:pYF-tsDEプラスミドの構築
pYF-tsDE(図1)は、大腸菌/B.リケニフォルミスの熱感受性シャトルプラスミドである。このプラスミドは温度感受性複製起点(30℃において活性を示す)およびエリスロマイシン耐性遺伝子(ErmC)を含んでおり、大腸菌では300μg/mlのエリスロマイシンに耐性を示し、B.リケニフォルミスでは5μg/mlのエリスロマイシンに耐性を示す。このプラスミドの複製起点を37℃で失活させ、プラスミドを宿主ゲノムの所定の部位に組み込み、ErmCでスクリーニングした。
pYF-tsDE(図1)は、大腸菌/B.リケニフォルミスの熱感受性シャトルプラスミドである。このプラスミドは温度感受性複製起点(30℃において活性を示す)およびエリスロマイシン耐性遺伝子(ErmC)を含んでおり、大腸菌では300μg/mlのエリスロマイシンに耐性を示し、B.リケニフォルミスでは5μg/mlのエリスロマイシンに耐性を示す。このプラスミドの複製起点を37℃で失活させ、プラスミドを宿主ゲノムの所定の部位に組み込み、ErmCでスクリーニングした。
pYF-tsDEプラスミドは以下のようにして構築した。まず、pUC57-KS-ermプラスミド(Genscript社に委託して合成したもの、配列は中国特許第104073458A号の図2に示す)をBglIIで消化し、消化した断片を回収し、3.8kbpの断片を精製し、T4リガーゼ(ニュー・イングランド・バイオラボ)でセルフライゲートさせ、クローニングしてpYF-tsDEプラスミドを得た。このプラスミドを大腸菌TOP10に導入して形質転換体を増殖させ、以下のすべての遺伝子操作においてバックボーンとして使用した。
実施例2:プロテアーゼ欠損B.リケニフォルミス株の構築
組換え酵素を産生する宿主細胞としての遺伝子組換え株は文献で報告されている(Widner et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 25, 204-212, 2000)。このような組換え宿主細胞は、通常、酵素を発現するための標的配列をコードする1つ以上の核酸構造を含む。本発明では、B.リケニフォルミスを、遺伝子組換えレシピエント細菌として使用する。現在、バチルス属の形質転換は、十分に確立された方法を使用して実施することができ、このような方法として、たとえば、コンピテントセル形質転換法、電気的形質転換法およびプロトプラスト形質転換法が挙げられる(Young et al., J Bacteriology, 81, 823-829, 1961; Shigekawa et al., Biotechniques, 6, 742-751, 1988; Chang et al., Molecular General Genetics, 168, 111-115, 1979)。
組換え酵素を産生する宿主細胞としての遺伝子組換え株は文献で報告されている(Widner et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 25, 204-212, 2000)。このような組換え宿主細胞は、通常、酵素を発現するための標的配列をコードする1つ以上の核酸構造を含む。本発明では、B.リケニフォルミスを、遺伝子組換えレシピエント細菌として使用する。現在、バチルス属の形質転換は、十分に確立された方法を使用して実施することができ、このような方法として、たとえば、コンピテントセル形質転換法、電気的形質転換法およびプロトプラスト形質転換法が挙げられる(Young et al., J Bacteriology, 81, 823-829, 1961; Shigekawa et al., Biotechniques, 6, 742-751, 1988; Chang et al., Molecular General Genetics, 168, 111-115, 1979)。
本発明において、α−アミラーゼバリアントを発現させるための単一の発現カセットは、天然または合成のプロモーター配列、バチルス属からスクリーニングされたシグナルペプチド配列、合成リボソーム結合部位、G.ステアロサーモフィルス由来のα−アミラーゼバリアントのコード遺伝子および転写ターミネーターを含むものであった。このような設計にすることにより、宿主菌株における遺伝子発現量およびα−アミラーゼバリアントの分泌量の大幅な増加が期待される。B.リケニフォルミス細胞のゲノム上の特定部位におけるα−アミラーゼバリアントのコード遺伝子への置換は、プラスミドを介した1回交叉型相同組換えによって行った。
B.リケニフォルミスにおいて、菌体外プロテアーゼの活性は異種酵素の分泌に悪影響を与える。サブチリシン(AprE)とグルタミン酸特異的プロテアーゼ(Blase)の2種の主要な菌体外プロテアーゼが同定されている。B.リケニフォルミスにおいて見られる菌体外プロテアーゼ活性の大部分は、これらの2種のプロテアーゼに由来するものである。
本発明では、完全な構造のα−アミラーゼバリアント遺伝子を得るため、前記2種の遺伝子を失活させ、Campbell様機構による1回交叉型連続組換えを採用した。具体的な手順を以下に示す。
2.1 BglIIによるpYF-tsDEの消化およびCIP処理によるセルフライゲーションの抑制
2.2 遺伝子ノックアウト
(1)前記各遺伝子を欠失した断片を得るため、B.リケニフォルミス(CICC 22794、China Center of Industrial Culture Collectionから購入したもの)のゲノムDNAをテンプレートとして使用してPCRを行い、欠失させる遺伝子の両末端から約500bpの相同配列をそれぞれ増幅した。B.リケニフォルミスの単クローンは、あらかじめ98℃で5分間変性させることによって、PCR反応のゲノムDNAテンプレートとしてそのまま使用することができた。
2.2 遺伝子ノックアウト
(1)前記各遺伝子を欠失した断片を得るため、B.リケニフォルミス(CICC 22794、China Center of Industrial Culture Collectionから購入したもの)のゲノムDNAをテンプレートとして使用してPCRを行い、欠失させる遺伝子の両末端から約500bpの相同配列をそれぞれ増幅した。B.リケニフォルミスの単クローンは、あらかじめ98℃で5分間変性させることによって、PCR反応のゲノムDNAテンプレートとしてそのまま使用することができた。
PCR反応用のプライマーは、Genscript社で合成したものを使用した。プライマー配列を以下に示す。
Apr遺伝子の上流配列を増幅するためのプライマー:
lichApr_F1 TTATTGAGCGGCAGCTTCGACATTGATCAGACCTT
lichApr_R1 CCTTACGGCATTCCTCTCAACAGCGGATCTTCAG
Apr遺伝子の下流配列を増幅するためのプライマー:
lichApr_F2 CCTGAAGATCCGCTGTTGAGAGGAATGCCGTAAGG
lichApr_R2 ATGATGAGGAAAAAGAGTTTTTGGCTTGGGATGCTGAC
Blase遺伝子の上流配列を増幅するためのプライマー:
blalich_F1 TTATTGTGCGCTGTTTTTCCAGTTGGTCAAATTGTCG
blalich_cR1 CGGACAAGGGTCACCAACGGGACAACTGTTACCATC
Blase遺伝子の下流配列を増幅するためのプライマー:
blalich_cF2 GATGGTAACAGTTGTCCCGTTGGTGACCCTTGTCC
blalich_R2 CGGCGTTGGTTAGTAAAAAGAGTGTTAAACGAGGTTTGAT
Apr遺伝子の上流配列を増幅するためのプライマー:
lichApr_F1 TTATTGAGCGGCAGCTTCGACATTGATCAGACCTT
lichApr_R1 CCTTACGGCATTCCTCTCAACAGCGGATCTTCAG
Apr遺伝子の下流配列を増幅するためのプライマー:
lichApr_F2 CCTGAAGATCCGCTGTTGAGAGGAATGCCGTAAGG
lichApr_R2 ATGATGAGGAAAAAGAGTTTTTGGCTTGGGATGCTGAC
Blase遺伝子の上流配列を増幅するためのプライマー:
blalich_F1 TTATTGTGCGCTGTTTTTCCAGTTGGTCAAATTGTCG
blalich_cR1 CGGACAAGGGTCACCAACGGGACAACTGTTACCATC
Blase遺伝子の下流配列を増幅するためのプライマー:
blalich_cF2 GATGGTAACAGTTGTCCCGTTGGTGACCCTTGTCC
blalich_R2 CGGCGTTGGTTAGTAAAAAGAGTGTTAAACGAGGTTTGAT
PCR増幅系の反応容量は50μlであった。反応操作を以下に示す。
(1)単クローン性B.リケニフォルミス14580を98℃で8分間あらかじめ変性
(2)96℃、15秒
(3)58℃、15秒
(4)72℃、30秒
工程2〜4を25〜30回繰り返した。
(5)72℃、2分間で最終伸長
(1)単クローン性B.リケニフォルミス14580を98℃で8分間あらかじめ変性
(2)96℃、15秒
(3)58℃、15秒
(4)72℃、30秒
工程2〜4を25〜30回繰り返した。
(5)72℃、2分間で最終伸長
0.8%アガロースゲル電気泳動によってPCR産物を検出し、Axygenキットを使用して精製した。
2.3 約400〜500bpの内部配列が欠失した標的遺伝子のオーバーラップ伸長PCR法による増幅
内部欠失遺伝子断片はオーバーラップ伸長PCR(SOE)法を使用して得た。具体的な手順を以下に示す。
(1)2.2節で得た各遺伝子の上流PCR断片および下流PCR断片を回収し精製した。
(2)各目的遺伝子の上流相同断片および下流相同断片を1:1のモル比でテンプレートとして使用し、プライマーXX-CZ-F1およびXX-CZ-R2(「XX」にはAprまたはBlaseが入る)を使用してPCR増幅を行い、内部断片が欠失したAprE遺伝子またはBlase遺伝子を得た。
内部欠失遺伝子断片はオーバーラップ伸長PCR(SOE)法を使用して得た。具体的な手順を以下に示す。
(1)2.2節で得た各遺伝子の上流PCR断片および下流PCR断片を回収し精製した。
(2)各目的遺伝子の上流相同断片および下流相同断片を1:1のモル比でテンプレートとして使用し、プライマーXX-CZ-F1およびXX-CZ-R2(「XX」にはAprまたはBlaseが入る)を使用してPCR増幅を行い、内部断片が欠失したAprE遺伝子またはBlase遺伝子を得た。
Clone-EZ Cloning Kit(Genscript社から入手)を使用して、BglIIで線状化したpYF-tsDEベクターに各断片を再度組み込んだ。このようにして得られた各組換えプラスミドを、pYF-tsDE-AprおよびpYF-tsDE-Blaseと名付けた。これらの組換えプラスミドは温度感受性プラスミドであり、各組換えプラスミドに含まれているApr遺伝子またはBlase遺伝子は、それぞれ元の遺伝子から約400〜500bpの内部配列が欠失されている。
別のアレルを相同組換えによって置換することもできる。具体的な方法は中国特許第102124112A号に記載されており、当技術分野で公知のその他の相同組換え法を使用することもできる。
2.4 プラスミドによる形質転換
ノックアウトプラスミドによってB.リケニフォルミスのコンピテントセルを形質転換する方法および実験において使用したスクリーニング法を以下に示す。
(1)熱感受性プラスミドpYF-tsDE-AprまたはpYF-tsDE-Blaseを使用して、B.リケニフォルミス(CICC 22794、China Center of Industrial Culture Collectionから購入したもの)のコンピテントセルを形質転換した。
(2)LB培地(1L当たり、ペプトン10g、酵母エキス5gおよび塩化ナトリウム10gを含む)において30℃で培養を行い、エリスロマイシン(5μg/ml)耐性に基づいて陽性クローン株を選別した。
(2)陽性クローン株を37℃の条件に移してインキュベーションを行い、温度感受性プラスミドを宿主ゲノムに融合させた。所定の位置で遺伝子の置換が起こるように、いくつかのクローンを選択し、2×YT培地に接種して24時間培養し、次いで継代培養を1回行った。全工程を通して4〜5回(通常5〜7日間)の継代培養を行った。
(3)エリスロマイシン感受性バチルスを選別し、PCRにより同定を行った。これと同時に、1%スキムミルク含有LB平板培地を用いることにより、加水分解に伴う透明環の観察も行うことができる。ノックアウト株であれば、加水分解に伴い形成される透明環が有意に小さくなるはずである。
ノックアウトプラスミドによってB.リケニフォルミスのコンピテントセルを形質転換する方法および実験において使用したスクリーニング法を以下に示す。
(1)熱感受性プラスミドpYF-tsDE-AprまたはpYF-tsDE-Blaseを使用して、B.リケニフォルミス(CICC 22794、China Center of Industrial Culture Collectionから購入したもの)のコンピテントセルを形質転換した。
(2)LB培地(1L当たり、ペプトン10g、酵母エキス5gおよび塩化ナトリウム10gを含む)において30℃で培養を行い、エリスロマイシン(5μg/ml)耐性に基づいて陽性クローン株を選別した。
(2)陽性クローン株を37℃の条件に移してインキュベーションを行い、温度感受性プラスミドを宿主ゲノムに融合させた。所定の位置で遺伝子の置換が起こるように、いくつかのクローンを選択し、2×YT培地に接種して24時間培養し、次いで継代培養を1回行った。全工程を通して4〜5回(通常5〜7日間)の継代培養を行った。
(3)エリスロマイシン感受性バチルスを選別し、PCRにより同定を行った。これと同時に、1%スキムミルク含有LB平板培地を用いることにより、加水分解に伴う透明環の観察も行うことができる。ノックアウト株であれば、加水分解に伴い形成される透明環が有意に小さくなるはずである。
同定に使用したPCRプライマー:
AprE:Apr-seqF1/Apr-seqR3
Blase:Blase-seqF1/Blase-seqR3
Apr-seqF1:GCCAGGTTGAAGCGGTCTATTCAT
Apr-seqR3:TACGGCCATCCGACCATAATGGAAC
Blase-seqF1:GAAGAGCCGGTCACAATTGC
Blase-seqR3:GGCCGTTAGATGTGACAGCC
AprE:Apr-seqF1/Apr-seqR3
Blase:Blase-seqF1/Blase-seqR3
Apr-seqF1:GCCAGGTTGAAGCGGTCTATTCAT
Apr-seqR3:TACGGCCATCCGACCATAATGGAAC
Blase-seqF1:GAAGAGCCGGTCACAATTGC
Blase-seqR3:GGCCGTTAGATGTGACAGCC
実施例3:α−アミラーゼバリアント株の構築および組み込み
3.1 アミラーゼ発現カセットの構築
組み込みプラスミドは、前記のpYF-tsDEプラスミドと同様の方法で構築した。ゲノム上の所定のAmyE部位に発現カセットを組み込むため、ゲノム上のAmyE部位の上流と下流にある約800bpの相同領域をそれぞれ作製し、α−アミラーゼバリアント発現カセットの両末端にライゲートした。これと同時に、α−アミラーゼバリアント遺伝子の発現制御に必要な、完全に天然由来の細菌染色体DNA断片と機能的合成配列とを複数連結した。
3.1 アミラーゼ発現カセットの構築
組み込みプラスミドは、前記のpYF-tsDEプラスミドと同様の方法で構築した。ゲノム上の所定のAmyE部位に発現カセットを組み込むため、ゲノム上のAmyE部位の上流と下流にある約800bpの相同領域をそれぞれ作製し、α−アミラーゼバリアント発現カセットの両末端にライゲートした。これと同時に、α−アミラーゼバリアント遺伝子の発現制御に必要な、完全に天然由来の細菌染色体DNA断片と機能的合成配列とを複数連結した。
代表的なアミラーゼ発現カセットは以下の要素を含んでいた。すなわち、代表的なα−アミラーゼバリアント発現カセットは、天然または合成のプロモーター配列(配列番号13)、合成リボソーム結合部位(aaaggagg)、G.ステアロサーモフィルス由来のα−アミラーゼバリアントのコード遺伝子(配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9または配列番号11)および合成ターミネーター配列(配列番号14)を含むものであった。また、発現させる酵素の分泌効率を向上させるため、バチルス・サブチリス(枯草菌)からスクリーニングされた強力な天然のシグナル配列(配列番号15)を、α−アミラーゼバリアントのコード遺伝子のプロモーターの上流に挿入した。構築したα−アミラーゼバリアント発現カセットを、Clone-EZ Cloning Kit(Genscript)を使用して、線状化pYF-tsDEのBglII部位に挿入した。このようにして得られた温度感受性の組み込みプラスミドをpYF-tsINT-amyと名付けた(図3)。前記配列の合成はGenscript社で行い、各配列を直列に順次連結してα−アミラーゼ酵素発現カセットを得た。このカセット中のシグナルペプチド配列はバチルス・サブチリス(枯草菌)からスクリーニングされたものであり、α−アミラーゼの分泌を効果的に増加させることができる。
3.2 プラスミドによる形質転換
BglIIで線状化したpYF-tsDEプラスミドを環化するための遺伝子組換え技術(Genscript社によって提供された組換えキット)を使用して、α−アミラーゼ発現カセットの全体(amyE遺伝子の上流および下流の相同部分を含む)を環化した。このようにして構築した熱感受性プラスミドをpYF-tsINT-amyと名付けた。AprEプロテアーゼ遺伝子およびBlaseプロテアーゼ遺伝子を欠失させたバチルス・リケニフォルミス(CICC 22794、China Center of Industrial Culture Collectionから購入したもの)を、このプラスミドで形質転換することによって、耐性マーカーを持たないα−アミラーゼバリアント発現カセットでAmyE部位を置換した。B.リケニフォルミスの染色体にα−アミラーゼバリアントのコード遺伝子が組み込まれた細菌株を、前述の方法と同様にして青色デンプン平板培地に播種したところ、透明環が形成された。さらにPCRでは、このレシピエント細菌のAmyE部位に前記発現カセットが組み込まれていることが確認できた。
BglIIで線状化したpYF-tsDEプラスミドを環化するための遺伝子組換え技術(Genscript社によって提供された組換えキット)を使用して、α−アミラーゼ発現カセットの全体(amyE遺伝子の上流および下流の相同部分を含む)を環化した。このようにして構築した熱感受性プラスミドをpYF-tsINT-amyと名付けた。AprEプロテアーゼ遺伝子およびBlaseプロテアーゼ遺伝子を欠失させたバチルス・リケニフォルミス(CICC 22794、China Center of Industrial Culture Collectionから購入したもの)を、このプラスミドで形質転換することによって、耐性マーカーを持たないα−アミラーゼバリアント発現カセットでAmyE部位を置換した。B.リケニフォルミスの染色体にα−アミラーゼバリアントのコード遺伝子が組み込まれた細菌株を、前述の方法と同様にして青色デンプン平板培地に播種したところ、透明環が形成された。さらにPCRでは、このレシピエント細菌のAmyE部位に前記発現カセットが組み込まれていることが確認できた。
α−アミラーゼバリアントを産生する遺伝子組換えB.リケニフォルミス株を−80℃で保存した。
実施例4:振盪フラスコ発酵によるα−アミラーゼバリアントの製造
活性化した単クローン細菌(α−アミラーゼバリアント発現カセットを含む)を、20mlの培地(マルトースシロップ4.0%、ペプトン2.0%、酵母粉末0.1%、KH2PO4 0.6%および対応する抗生物質を含む)に接種し、対数増殖期まで培養した。培養液1.2mlを、30mlの培地(マルトースシロップ12.0%、ペプトン1.0%、酵母粉末1%、KH2PO4 0.2%およびMnCl2 0.003%を含む)に接種し、120rpmのレシプロシェーカー上で3日間培養した。24時間後、48時間後および72時間後に試料を採取し、1000rpmで1分間遠心分離した。上清を保存し、SDS-PAGEで分析した。α−アミラーゼバリアントの分子量は約53kDであった。
活性化した単クローン細菌(α−アミラーゼバリアント発現カセットを含む)を、20mlの培地(マルトースシロップ4.0%、ペプトン2.0%、酵母粉末0.1%、KH2PO4 0.6%および対応する抗生物質を含む)に接種し、対数増殖期まで培養した。培養液1.2mlを、30mlの培地(マルトースシロップ12.0%、ペプトン1.0%、酵母粉末1%、KH2PO4 0.2%およびMnCl2 0.003%を含む)に接種し、120rpmのレシプロシェーカー上で3日間培養した。24時間後、48時間後および72時間後に試料を採取し、1000rpmで1分間遠心分離した。上清を保存し、SDS-PAGEで分析した。α−アミラーゼバリアントの分子量は約53kDであった。
実施例6に記載の方法でα−アミラーゼバリアントの活性を測定した。
実施例5:α−アミラーゼバリアントのステップ供給発酵プロセス
実施例3で得た後−80℃で凍結保存した遺伝子組換えB.リケニフォルミス株を寒天斜面培地に塗抹し、37℃で一晩培養した。寒天斜面培地の組成は、ペプトン1%、酵母エキス0.5%、NaCl 1%および寒天粉末2%であった。
実施例3で得た後−80℃で凍結保存した遺伝子組換えB.リケニフォルミス株を寒天斜面培地に塗抹し、37℃で一晩培養した。寒天斜面培地の組成は、ペプトン1%、酵母エキス0.5%、NaCl 1%および寒天粉末2%であった。
新鮮なクローンをいくつか選択し、50mlの培地を入れた播種用振盪フラスコ中において37℃で16時間培養した。播種用振盪フラスコ中の組成は、マルトースシロップ4.0%、ペプトン2.0%、酵母エキス0.1%およびKH2PO4 0.6%であった。16時間後、播種された培養液すべてを、4Lの培地を入れた7Lのステンレス鋼製の発酵槽に移し、攪拌速度350rpmおよび通気速度650L/hで発酵を12時間行った。発酵槽中の組成は、麦芽シロップ6.0%、ペプトン1.0%、酵母エキス1%、KH2PO4 0.2%およびMnCl2 0.003%であった。その後、5%リン酸で発酵pHを約5.7±0.2に調整した。マルトースシロップ48%、ペプトン6%および酵母エキス8%からなる仕込み液を、最初の18時間は1L/18時間の速度で発酵槽に連続供給し、次の110時間は0.5L/18時間の速度で連続供給した。発酵プロセスの継続時間は合計で140〜150時間であった。発酵槽中の培地をすべて回収し、4℃、1010krpmで30分間遠心分離した。遠心分離後に得られた上清を使用してα−アミラーゼバリアントの酵素活性を分析した。
実施例6:アミラーゼ活性アッセイ
アミラーゼ活性は、Bestzymeアミラーゼ単位(BAU)を用いて評価した。「1BAU」とは、pH6.0および70℃の条件で1mgの可溶性デンプンを1分間で液化するのに必要な酵素の量と定義される。
アミラーゼ活性は、Bestzymeアミラーゼ単位(BAU)を用いて評価した。「1BAU」とは、pH6.0および70℃の条件で1mgの可溶性デンプンを1分間で液化するのに必要な酵素の量と定義される。
簡潔に述べると、酵素活性を以下のようにして測定した。20g/Lの可溶性デンプン溶液20mlをリン酸緩衝液(pH6.0)5mlと混合し、70℃で8分間あらかじめ加熱した後、希釈した酵素溶液1.0mlを加え、正確に5分間反応を行った。0.1mol/Lの塩酸溶液0.5mlおよび希ヨウ素溶液5mlをあらかじめ加えた試験管に反応溶液1mlを加え、よく振盪した。0.1mol/Lの塩酸溶液0.5mlおよび希ヨウ素溶液5mlをブランクとして使用し、波長660nmにおける吸光度を速やかに測定し、吸光度をプロットしたグラフから測定試料の酵素活性を求めた。
実施例7:アミラーゼの使用
以下の結果はいずれも、配列番号8のα−アミラーゼバリアント配列を使用して得られたものである。
以下の結果はいずれも、配列番号8のα−アミラーゼバリアント配列を使用して得られたものである。
特に記載がない限り、以下の通りである。
1BAU:アミラーゼ活性は、Bestzymeアミラーゼ単位(BAU)を用いて評価した。「1BAU」とは、pH6.0および70℃の条件で1mgの可溶性デンプンを1分間で液化するのに必要な酵素の量と定義される。
tDS:乾燥物1トン当たりを示す。
1BAU:アミラーゼ活性は、Bestzymeアミラーゼ単位(BAU)を用いて評価した。「1BAU」とは、pH6.0および70℃の条件で1mgの可溶性デンプンを1分間で液化するのに必要な酵素の量と定義される。
tDS:乾燥物1トン当たりを示す。
B.リケニフォルミス細胞で発現させて単離したアミラーゼを、最初の試験として、トウモロコシデンプンを使用した液化試験に供した。試験条件は、18ボーメ度(°Be)、十分な混合、塩酸でpH5.2に調整するものとした。100℃、105℃、108℃、110℃または115℃の注入温度で0.22kg/tDSのアミラーゼを加え、5〜8分間維持後フラッシュし、その後95℃で120分間維持した。液化後、DE(デキストロース当量)の測定およびヨウ素試験を行った。タンパク質の綿状沈殿が生じ、粘性があることが観察された。表1および図4に結果を示す。
様々な注入温度で実験を行った結果、以下のことが示された。100℃では液化が過剰に進みすぎた。105℃での液化は適切なレベルであり、タンパク質の綿状沈殿も良好であった。108℃および110℃での液化でも良好な結果が得られ、タンパク質の綿状沈殿も正常レベルであり、α−アミラーゼバリアントが良好な耐熱性を有することが示された。これに対して、115℃での液化では良好な結果は得られず、α−アミラーゼバリアントが115℃という高温に耐えられないことが示された。
次に、様々な濃度のデンプンスラリーを使用した液化実験を行い、高濃度の基質に対するアミラーゼの耐性を試験した。液化条件は前記と同様とし、注入温度は108℃とした。表2および図5に結果を示す。
表2に示したように、様々な濃度のデンプンスラリーを使用したところ、デンプンスラリーの濃度が22°Beという高い濃度であっても、α−アミラーゼバリアントを使用して正常レベルの液化を行うことができた。このことから、本発明のα−アミラーゼバリアントは濃厚なスラリーの液化に使用することができ、したがって、工場コストの効果的な削減が可能であることが示された。
次に、アミラーゼバリアントの耐酸性を測定するため、酵素の添加量を様々に変えて液化を行った。液化反応条件は前記と同様とし、pHは5.0とし、酵素の添加量を0.05kg/tDS、0.1kg/tDS、0.15kg/tDS、0.2kg/tDS、0.22kg/tDS、0.25kg/tDSまたは0.3kg/tDSとした。表3および図6に結果を示す。
表3に示したように、低いpH条件下において0.15〜0.3kg/tDSのα−アミラーゼバリアントを添加した場合であっても、α−アミラーゼバリアントを使用して正常レベルの液化を行うことができた。このことから、本発明のα−アミラーゼバリアントは低いpHに高い耐性を示すことが明らかとなった。また、0.15kg/tDSという少量のα−アミラーゼバリアントを加えた条件でも、本発明のα−アミラーゼバリアントを使用して正常レベルの液化を行うことができたことから、工場において使用される酵素のコストを効果的に削減できることが示された。
さらに、α−アミラーゼバリアントの糖化作用を試験し、Liquozyme Supra(Novozymes社から購入)で液化した液化溶液と比較した。試験条件は、乾燥物(DS)32%、十分な混合、塩酸でpH4.3に調整するものとした。本発明のα−アミラーゼバリアントとグルコアミラーゼとを組み合わせた複合酵素0.45kg/tDSを加え、反応量を200mlとして60℃で24時間および48時間反応を行った。孔径0.22μmの膜で試料を濾過し、100℃で失活させて、HPLC分析を行った。表4に結果を示す。
表4に示したように、α−アミラーゼバリアントによって得られた液化溶液と、Liquozyme Supraによって得られた液化溶液とを比較したところ、これらの酵素が同等の糖化作用を有することが示された。このことから、本発明のα−アミラーゼバリアントをデンプン糖産業に使用できることがわかった。
α−アミラーゼはアルコール産業においても重要な用途があることから、アルコールの製造における前記α−アミラーゼバリアントの液化作用を試験した。コーンフラワー(40メッシュ)と水を1:2.5の比率で仕込み、塩酸でpHを5.8に調整し、0.145kg/tDSのα−アミラーゼバリアントを加えた。得られた溶液を95℃で120分間かけて液化させた。反応終了後、試料のDEおよび粘度を測定した。これと同時に、Liquzoyme SC(Novozymesから入手可能)との比較試験も行った。結果を表5に示す。
表5に示したように、α−アミラーゼバリアントはLiquzoyme SCと同等の使用効果を発揮することができたことから、本発明のα−アミラーゼバリアントをコーンアルコール産業に使用できることが示された。
したがって、本発明における実験結果によれば、本発明の一連のα−アミラーゼバリアントは優れた耐熱性およびpH耐性を示し、高濃度のデンプンスラリーを液化することができたことから、デンプン糖産業およびアルコール産業に適用することができると考えられる。
本発明の実施例は、本発明の教示や当技術分野の技術手段と不可分なものである。したがって、本発明は開示された特定の実施例に限定されず、添付の請求項に詳細に記載されているように、本発明の要旨および範囲内のさらなる変更も可能である。
Claims (18)
- α−アミラーゼバリアントであって、親α−アミラーゼのアミノ酸配列中の少なくとも1個のアミノ酸残基を変異または欠失させることによって得られ、親α−アミラーゼのα−1,4−グリコシド結合加水分解能を保持しており、親α−アミラーゼと95%以上のアミノ酸配列相同性を有していることを特徴とするα−アミラーゼバリアント。
- 前記親α−アミラーゼが、バチルス・サブチリス(枯草菌)、B.リケニフォルミス、B.アミロリクエファシエンス、G.ステアロサーモフィルスおよびバチルス・セレウスからなる群から選択される1種の細菌のα−アミラーゼである、請求項1に記載のα−アミラーゼバリアント。
- 前記親α−アミラーゼが、B.リケニフォルミスまたはG.ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼであり、好ましくはG.ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼである、請求項2に記載のα−アミラーゼバリアント。
- G.ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼをコードする完全長遺伝子配列が配列番号1で示され、これに対応するアミノ酸配列が配列番号2で示される、請求項3に記載のα−アミラーゼバリアント。
- (1)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から1番目〜5番目のアミノ酸残基を欠失させて、VNまたはANLNで置換すること;
(2)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのC末端から27〜32個のアミノ酸残基を欠失させること;ならびに
(3)G.ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのN末端から180番目および181番目のアミノ酸残基を欠失させること
のいずれか1つまたはこれらの任意の組み合わせによって得られる、請求項4に記載のα−アミラーゼバリアント。 - C末端に3個のアミノ酸残基FANが付加されている、請求項5に記載のα−アミラーゼバリアント。
- 前記α−アミラーゼバリアントのアミノ酸配列が、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号12からなる群から選択される、請求項5または6に記載のα−アミラーゼバリアント。
- 前記α−アミラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列が、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11からなる群から選択される、請求項7に記載のα−アミラーゼバリアント。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子。
- ヌクレオチド配列が、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11からなる群から選択される、請求項9に記載の遺伝子。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のα−アミラーゼバリアントを発現させるための発現ベクターであって、請求項8に記載のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子を含む発現ベクター。
- 天然または合成のプロモーター配列、天然または合成のリボソーム結合部位、天然または合成のターミネーター配列、および請求項8に記載のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子を主として含む発現カセットを含む、請求項11に記載の発現ベクター。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のα−アミラーゼバリアントを発現させるための組換え細胞であって、請求項9に記載のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子を1つ以上含む組換え細胞。
- 前記組換え細胞を得るための宿主細胞が、バチルス株、好ましくは遺伝子組換えによりいくつかの内因性タンパク質を失活させたB.リケニフォルミスまたはその他のバチルス株から選択される、請求項13に記載の組換え細胞。
- 前記組換え細胞を得るための宿主細胞が、遺伝子組換えによりAprEおよび/またはNprEを失活させたB.リケニフォルミスから選択される、請求項14に記載の組換え細胞。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のα−アミラーゼバリアントを製造する方法であって、前記α−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子配列を含む組換え細胞を、前記α−アミラーゼバリアントの発現に適した条件下で培養し、該組換え細胞またはその培養上清から前記α−アミラーゼバリアントを得ることを含む方法。
- 多糖類のα−1,4−グリコシド結合の加水分解における、請求項1〜6のいずれか一項に記載のα−アミラーゼバリアントの使用。
- 前記α−アミラーゼバリアントが、高温および/または低pHの条件下における多糖類のα−1,4−グリコシド結合の加水分解において使用され、該高温が好ましくは80℃〜110℃であり、より好ましくは100℃〜110℃であり、低pHが好ましくは5.0〜5.5である、請求項17に記載の使用。
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