BRPI0808461A2 - Ppce da endoglucanase e preparação de celulase contendo a mesma - Google Patents

Description

“PPCE DA ENDOGLUCANASE E PREPARAÇÃO DE CELULASE CONTENDO A MESMA”

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção se refere a um PPCE de endoglucanase, uma preparação de celulase que contém a PPCE de endoglucanase, e um método de tratar um tecido contendo celulase utilizando a PPCE de endoglucanase ou a preparação de celulase.

TÉCNICA ANTECEDENTE

Convencionalmente, um tecido contendo celulase foi tratado com celulase para dar as propriedades desejadas ao tecido. Por exemplo, na indústria têxtil, um tratamento com celulase é realizado para melhorar a sensação ao tocar e aparência de um tecido contendo celulase, ou dar uma aparência de "desgastada" a um tecido contendo celulase colorido, desse modo fornecendo o tecido com mudança de cor localizada [referência de patente 1].

As celulases usadas para tais usos incluem endoglucanases que pertencem a família 45, endoglucanases que pertencem a família 5, e endoglucaneses que pertencem a famíIia 12. É normal neste campo técnico que estas endoglucanases possam ser adequadamente selecionadas de acordo com suas propriedades (por exemplo, um pH ideal, uma temperatura ideal, um efeito para melhorar a textura de um tecido, ou uma influência em resistência da fibra). As endoglucanases que pertencem a família 45 são principalmente usadas sob condições neutras, endoglucanases que pertencem a família 12 são usadas sob condições ácidas a condições neutras, e endoglucanases que pertencem a família 5 são principalmente usados sob condições ácidas. Os exemplos de endoglucanases que pertencem a família 45 incluem um componente de endoglucanase de 43 kDa purificado derivado do gênero Humicola [referência de patente 2), endoglucanase NCE5 derivado do gênero Humicola [referência de patente 3], e endoglucanase RCE derivada do gênero Rhizopus [referência de patente 4].

Os exemplos de endoglucanases que pertencem a família 5 incluem endoglucanase SCE3 derivada do gênero Trichoderma [referência de patente 5]. Os exemplos de endoglucanases que pertencem à família 12 incluem endoglucanase EG Ill derivada do gênero Trichoderma [referência de não patente 1] e endoglucanase FI-CMCase derivada 30 do gênero Aspergillus [referência de não patente 2]. Sabe-se que o gênero Penicillium produz endoglucanase tendo um peso molecular de 25 kDa [referência de não patente 3].

Quando estas enzimas são usadas para processamento de tecido, as reações geralmente são realizadas sob condições ideais. As temperaturas ideais destas enzimas conhecidas estão dentro de uma área de temperatura média (por exemplo, 40°C a 60°C), e os 35 pHs ideais estão portanto em cerca de entre uma condição ácida e uma condição neutra (por exemplo, pH 4,0 a pH 8,0). Neste campo técnico, não há nenhum caso de uma enzima que tenha uma temperatura ideal baixa (tal como menor do que 40°C) ou um pH ideal fortemente ácido (tal como menor do que o pH 4,0) sendo geralmente usado industrialmente. No processo industrial de tecidos contendo celulase, uma preparação de celulase é geralmente fornecida como uma preparação que compreende uma grande quantidade de endoglucanase que tem uma atividade elevada. Como um processo para fabricar uma tal preparação, os 5 processos de super-expressão de um componente de endoglucanase desejado que tem uma atividade elevada em células hospedeiras usando técnicas recombinantes genéticas, são conhecidos [patentes de referências 6, 7].

Como células hospedeiras preferíveis usadas nestes processos, nesse aspecto podem ser mencionados, por exemplo, os fungos filamentosos que pertencem a Hyphomyce10 tes, tal como fungos filamentosos que pertencem ao gênero Aspergillus, Humicola, ou Trichoderma. Quando a celulase usada no processamento de tecido sob condição ácida ou fortemente ácida é produzida, o gênero Trichoderma que produz celulase ácida é preferível como células hospedeiras, em comparação com gênero Aspergillus ou Humicola que produzem celulase neutra, porque um efeito sinérgico causado pela celulase derivada do hospe15 deira é esperado. Particularmente, devido à produção industrial da enzima, os fungos filamentosos que pertencem ao gênero Trichoderma tendo uma produtividade elevada são muito preferíveis [referência de patente 8]. Porém, quando um fungo filamentoso que pertence ao gênero Trichoderma é usado para expressar um gênero derivado de uma espécie diferente (isto é, gênero de exógeno), a expressão é freqüentemente inibida porque as caracte20 rísticas na seqüência de nucleotídeo do gênero (tal como uso de código no gene) são diferentes. Neste caso, é necessário modificar o gênero exógeno. Por exemplo, quando endoglucanase RCE I derivado do gênero Rhizopus pertencendo a Zygomycetes é superexpressado em Humicola insolens, o gênero RCE I codificante deveria ser otimizado de acordo com o uso de código da célula hospedeira [referência de patente 4]. Porém, se tal otimiza25 ção é realizada, será difícil de expressar um gênero exógeno tanto como gêneros endógenos. Além disso, até mesmo quando a enzima de interesse é de fato expressa e produzida em um hospedeiro, é antecipado que a enzima é digerida com proteases ou similares contidos em um líquido de cultura durante o cultivo para obter a enzima como produtos digeridos ou fragmentos parciais.

[referência de patente 1] Patente Européia No. 307.564

[referência de patente 2] Publicação Internacional W098/03640 [referência de patente 3] Publicação Internacional W001/090375 [referência de patente 4] Publicação Internacional WOOO/24879 [referência de patente 5] Publicação Internacional W098/54332 [referência de patente 6] Publicação Internacional W091/17243

[referência de patente 7] Publicação Internacional W098/03667 [referência de patente 8] Publicação Internacional W005/054475 [referência de não patente 1] Okada, H e outros, “Appl- Environ. Microbiol”, 64, 1998, p.555-563

[referência de não patente 2] Ooi, e outros, “Nucleic Acids Research”, 18, 1990,

p,5884

[referência de não patente 3] K. Mahalingeshwara, e outros, "Carbohydrate Resear

ch” 190, 1989, p.279-297

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO

Para uso no processamento de tecido, várias celulases foram isoladas de fungos filamentosos que pertencem ao gênero Humicola, Trichoderma, Rhizopus, Mucor, Phycomyces, Staphylotrichum ou similares, e gêneros que codificam as celulases também foram isolados. Em particular, os grupos de enzima pertencendo a família de celulase 5, família 12, e família 45, derivados de fungos filamentosos, exibem atividades vantajosas no processamento de tecido, e desse modo, são amplamente usados neste campo técnico. Porém, estes grupos de enzima são enzimas que têm uma temperatura ideal moderada e um pH ideal ácido ou neutro, porém não há uma enzima de temperatura baixa nem uma enzima fortemente ácida. Neste campo técnico, uma enzima que tem uma atividade alta contra fibras e uma temperatura ideal baixa e/ou um pH ideal fortemente ácido é fortemente desejado. Além disso, para praticamente usar uma enzima tendo tal perfil específico, é necessário alcançar a superexpressão de um gênero de interesse em um hospedeiro excelente, tal como fungos filamentosos que pertencem ao gênero Trichoderma, e para fornecer uma preparação de celulase que tenha uma atividade elevada a um custo pequeno. Se tal preparação de celulase for praticamente fornecida, ela trará enormes benefícios industriais. Porém, tal preparação de celulase não foi praticamente fornecida, e tal processo que usa técnicas recombinantes genéticas não é reportado.

MEIOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS

Os presentes inventores descobriram uma nova proteína tendo atividade de endoglucanase e um gênero da mesma de Penicillium pinophilum PF1365 (FERM BP-1080). A presente invenção fornece PPCE de endoglucanase, uma preparação 30 de celulase que contém endoglucanese PPCE, e um método para tratar um tecido contendo celulase que utiliza PPCE de endoglucanase ou a preparação de celulase. Os presentes inventores descobriram que a nova proteína que tem atividade de endoglucanase, que foi isolada de Penicillium pinohilum PF1365 (FERM BP-10780), exibiu atividades extremamente elevadas para melhorar a aparência de um tecido 35 contendo celulase e dar uma aparência “desgastada” a um tecido contendo celulase colorido. Em particular, PPCE de endoglucanase (a seguir, simplesmente referido como “PPCE") exibiu uma atividade notavelmente elevada no processamento de tecido, em comparação com endoglucanase SCE3 [referência de patente 5] e endoglucanase EG Ill [referência de não patente 1], que são amplamente usados como uma celulase típica para processamento de tecido, principalmente sob condições ácidas. Além disso, PPCE de endoglucanase exibiu características surpreendentes que seu pH ideal e temperatura ideal foram notavelmente baixos, isto é, em cerca de pH 3 e 30°C, respectivamente, em comparação com celulases conhecidas para o processamento de tecido. Até mesmo se comparado com a temperatura ideal (50 a 55°C) e o pH ideal (pH 4,0 a 5,0) de andoglucanase I derivado de Penicillium pinophilum IMI87160U [referência de não patente 3], que não foram usados no processamento de tecido, o pH ideal e temperatura ideal de PPCE de endoglucanase foram notavelmente baixos.

Os presentes inventores isolaram um gene que codifica PPCE de endoglucanase derivado de Penicillium pinophilum PFI365 (FERM BP-10780), e atingiram uma produção em grande escala industrial de PPCE em Trichoderma viride utilizando uma seqüência reguladora de um gene de celulase cbhl (W098/11239). Então, a presente invenção fornece a nova proteína que tem atividade de endoglucanase derivada de Penicillium pinophilum FF1365 (FERM: BF-10780) e o gene da mesma, e uma preparação de celulase contendo a proteína e tendo propriedades excelentes. Além disso, a presente invenção fornece uma célula hospedeira transformada com o gene que codifica a proteína, e um método para obter a proteína de interesse cultivando-se a célula hospedeira. Além disso, a presente invenção fornece um método para tratar um tecido contendo celulase com a proteína da presente invenção ou a preparação de celulase da presente invenção.

Então, a presente invenção inclui as seguintes invenções.

(1) Uma proteína que tem as seguintes propriedades (a), (b), e (c):

(a) derivado de Penicillium pinophilum.

(b) tendo uma atividade de endoglucanase, e

(c) tendo no terminal de N do mesmo (1) a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, ou (2) uma seqüência de aminoácido na qual um aminoácido é deletado, substituído, ou adicionado na seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

(2) A proteína de (1), tendo a seguinte propriedade (d):

(d) tendo um peso molecular médio de 25 kDa a 27 kDd, determinado por uma eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE).

(3) A proteína selecionada do grupo que consiste nas seguintes proteínas (e) a (i):

(e) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido que consiste em aminoácidos 16-236 de SEQ ID NO: 4,

(f) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácido que consiste em aminoácidos 1-236 de SEQ ID NO; 4,

(g) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 30, (h) uma proteína modificada que compreende uma seqüência de aminoácido na qual um ou aminoácidos plurais são deletado, substituídos, adicionados e/ou modificados na seqüência de aminoácido consistindo em aminoácidos 16-236 ou 1-236 de SEQ ID NO: 4, e tendo uma atividade de endoglucanase, e

(i) uma proteína homóloga que compreende uma seqüência de aminoácido que tem uma homologia de 90% ou mais com a seqüência de aminoácido que consiste em aminoácidos 16-236 ou 1-236 de SEQ ID NO: 4 ou com a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 30, e tendo uma atividade de endoglucanase.

(4) Um polinucleotídeo que codifica a proteína de qualquer um dentre (1) a (3).

(5) Um polinucleotídeo selecionado do seguinte (j) ou (k):

0) um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 3 ou 28, ou a seqüência de nucleotídeo que consiste em nucleotídeos 46-834 de SEQ ID NO: 3 ou 28, ou

(k) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeo na qual um ou nucleotídeos plurais são deletados, substituídos, e/ou adicionados na seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 3 ou 28 ou na seqüência de nucleotídeo que consistem em nucleotídeos 46-834 de SEQ ID NO: 3 ou 28, e codificando uma proteína que tem uma atividade de endoglucanase.

(6) Um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo de (4) ou (5).

(7) Uma célula hospedeira transformada com o vetor de expressão de (6).

(8) A célula hospedeira de (7), em que o hospedeiro é uma levedura ou um fungo filamentoso.

(9) A célula hospedeira de (8), em que o fungo filamentoso é um microorganismo que pertence ao gênero Trichoderma. Humicola. Aspergillus. Acremonium. ou Penicillium.

(10) A célula hospedeira de (9), em que o fungo filamentoso é um microorganismo que pertence a gênero Trichoderma.

(11) A célula hospedeira de (10), em que o fungo filamentoso é Trichoderma viride,

(12) Um processo para produzir a proteína de qualquer um dentre (1) a (3), compreendendo as etapas de:

Cultivar as células hospedeiras de qualquer uma dentre (7) a (11), e coletar a proteína das células hospedeiras ou uma cultura obtida pelo cultivo.

(13) Uma proteína produzida pelo processo de (12).

(14) Uma preparação de celulase que compreende a proteína de qualquer um dentre (1) a (3) e (13).

(15) Uma composição detergente que compreende a proteína de qualquer um dentre (1) a (3) e (13) ou a preparação de celulase de (14).

(16) Um método de tratar um tecido contendo celulose, compreendendo a etapa Ievar o tecido contendo celulase em contato com a proteína de qualquer um dentre (1) a (3) e (13), a preparação de celulase de (14), ou a composição detergente de (15).

(17) Um método para reduzir o peso para melhorar a sensação ao tocar e aparência de um tecido contendo celulase, compreendendo a etapa de trazer o tecido contendo

celulase em contato com a proteína de qualquer um dentre (1) a (3) e (13), a preparação de celulosa de (14), ou a composição detergente de (15).

(18) Um método para fornecer uma mudança de cor localizada a um tecido contendo celulase colorido, compreendendo a etapa de trazer o tecido contendo celulase colorido em contato com a proteína de qualquer um dentre (1) a (3) e (13), a preparação de celulosa

de (14), ou a composição detergente de (15).

(19) Um método de clarificação de cor de um tecido contendo celulase colorido, compreendendo a etapa de trazer o tecido contendo celulase colorido em contato com a proteína de qualquer um dentre (1) a (3) e (13), a preparação de celulosa de (14), ou a composição detergente de (15).

(20) Um método para reduzir a aparência felpuda de um tecido contendo celulase

ou reduzir uma taxa da formação de penugem, compreendendo a etapa de levar o tecido contendo celulose em contato com a proteína de qualquer um dentre (1) a (3) e (13), a preparação de celulase de (14), ou a composição detergente de (15).

(21) Um método para reduzir a dureza de um tecido contendo celulase ou reduzir

uma taxa da formação de dureza, compreendendo a etapa de levar o tecido contendo celulose em contato com a proteína de qualquer um dentre (1) a (3) e (13), a preparação de celulase de (14), ou a composição detergente de (15)

(22) O método de qualquer um dentre (16) a (21), em que a etapa de contatar o tecido com a composição detergente é realizada por embebimento, lavagem, ou enxágüe do

tecido.

(23) Um método de remover tinta de papel usado, caracterizado, por, usar a proteína de (1) a (3) e (13) ou a preparação de celulase de (14), no processo para tratar o papel usado junto com um agente de remoção de tinta.

(24) Um método para melhorar uma liberação de água de polpa de papel, compre

endendo a etapa de tratar a polpa de papel com a proteína de qualquer um dentre (1) a (3) e

(13), ou a preparação de celulase de (14)

(25) Um método para melhorar uma digestibilidade de alimento animal, compreendendo a etapa de tratar um alimento animal com a proteína de qualquer um dentre (1) a (3) e (13), ou a preparação de celulase de (14).

S5 (26) Um método para produzir etanol de biomassa, digerindo-se e sacarificando-se

uma substância com base em celulase, compreendendo a etapa de tratar a substância com base em celulase com a proteína de qualquer um dentre (1) a (3) e (13), ou a preparação de celulase de (14).

EFEITOS PA INVENÇÃO

A proteína da presente invenção, PPCE de endoglucanase, está disponível para lavagem ou processamento de tecido, tal como melhora da sensação ao tocar e aparência de um tecido contendo celulase, fornecendo uma mudança de cor localizada ao tecido, clarificação de cor, redução de penugem ou uma redução de dureza.

MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

Proteína tendo atividade de endoglucanase

O termo "endoglucanase" como usado aqui significa uma enzima que exibe uma atividade de endoglucanase, isto é, endo-1, 4-/?-glucanase (EC 3.2.1.4), que tem uma atividade de hidrolisação da ligação de /?-1,4-glicopiranosila de /?-1,4-glucan.

O termo "atividade de endcglucanase" como usado aqui significa uma atividade de CMCase. O termo "atividade de CMCase" como usado aqui significa uma atividade de hidrolisação de carboximetilcelulose (CMC; Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.). Quando uma solução 15 que contém uma proteína (enzima) a ser ensaiada e CMC é incubada durante um período predeterminado e a quantidade de açúcar redutor liberado é medida, a quantidade da enzima que produz o açúcar redutor que corresponde a 1 //mol de glicose por minuto é definida como 1 unidade de atividade de CMCase.

A atividade de endoglucanase pode ser medida, por exemplo, pelos seguintes procedimentos. Isto é, 0,5 mL de uma solução que contém uma proteína a ser ensaiada é adicionado a 0,5 mL de uma solução de CMC a 2% dissolvida em um tampão de acetato acetato-sódio de 50 mmol/L (pH6.0), e a mistura é incubada a 50°C durante 30 minutos. Uma concentração de açúcar redutor gerado na mistura de reação é medida pelo método de ácido 3,5-dinitrosalicílico (método de DNS). Mais particularmente, depois da incubação durante 30 minutos, 3,0 mL de um reagente de DNS é adicionado a 1,0 ml, da mistura de reação, o todo é incubado em um banho de água fervente durante 5 minutos e diluído com 8,0 ml de água destilada, e a absorbância a 540 nm é medida. Uma curva de calibração é produzida usando soluções de glicose preparadas por diluição em etapas, e uma quantidade de açúcar redutor gerado na mistura de reação de enzima é determinada como aquela de gli50 cose convertida. A atividade é calculada definindo-se como 1 unidade a quantidade da enzima que produz o açúcar redutor que corresponde a 1 //mol de glicose por minuto.

O reagente de DNS pode ser preparado de acordo com as descrições em referências tais como Sakuzo Hukui, “Seikagaku Jikken-hou 1, Kangen-Tou no Teiryo-hou (Laboratory Biological Chemistry, Vol. 1, Assay of Reducing Sugar", pp. 19-20, Japan Scientific So5 cieties Press, ou pelo seguinte procedimento. A 300 mL de uma solução aquosa de hidrato de sódio a 4,5% são adicionados 880 mL de uma solução de ácida 3,5-dinitrossalicílico e 255 g de sal de Rochelle (Solução A). A 22 ml de uma solução aquosa a 1,0% de hidrato de sódio, é adicionado 10 g de fenol cristalino, e então água é adicionada para dissolver e ajustar o volume para 100 ml (Solução B). Então, 6,9 g de hidrogencarbonato de sódio é dissolvido em 69 mL de Solução B, e a Solução A é derramada nisto. O todo é misturado com agitação para dissolver o sal de Rochelle, permitido repousar durante 2 dias, e então filtrado.

A proteína da presente invenção pode ser obtida de fungos filamentosos, tal como microorganismo que pertence ao gênero Penicillium. preferivelmente Penicillium pinophilum. mais preferivelmente Penicillium pinophilum PF1365 (FERM BP-10780), e uma cepa mutante derivada disto pode ser usada. A seqüência de aminoácido de terminal de N da proteína da presente invenção é tipicamente aquela de SEQ ID NO: 2. A seqüência de aminoácido de terminal de N pode ser determinada, por exemplo, de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 2. De acordo com a presente invenção, uma proteína derivada de Penicillium pinophilum. e tendo as seguintes propriedades (A), (B), e (C);

(A) tendo atividade de endoglucanase,

(B) tendo no terminal de N do mesmo (1) a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, ou (2) uma seqüência de aminoácido na qual um aminoácido é deletado, substituído, ou adicionado na seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, e

(C) tendo um peso molecular médio de 25 kDa a 27 kDa, determinado por SDS

PAGE,

é fornecido.

O peso molecular médio determinado por SDS-PAGE pode ser determinado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.

A proteína da presente invenção derivada de Penicillium pinophilum tipicamente consiste na seqüência de aminoácido que consiste em aminoácidos 36-236 de SEQ ID NO:

4, e o resíduo de glutamina de terminal de N (GIn) é convertido para um resíduo de ácido piroglutâmico (pyroGlu) por modificação (isto é, a proteína consiste na seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 30).

De acordo com outra modalidade da presente invenção, uma proteína que compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 (ou uma seqüência parcial da mesma), e uma proteína modificada ou uma proteína homóloga da mesma, é fornecida.

Os exemplos de "a proteína que compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 ou uma seqüência parcial da mesma” incluem:

um proteína madura que tem a seqüência de aminoácido que consiste em aminoácidos 16-236 de SEQ ID NO: 4;

uma proteína precursora que compreende a seqüência de aminoácido que consiste em aminoácidos 1-236 de SEQ ID NO: 4 na qual um peptídeo sinal (1o a 15a posições) é adicionado;

uma proteína que consiste em uma seqüência de aminoácido na qual uma ou mais seqüência s apropriadas são adicionadas ao terminal de N e/ou ao terminal de C da proteína madura que tem a seqüência de aminoácido que consiste em aminoácidos 16-236 de SEQ ID NO 4; e

uma proteína na qual o aminoácido de terminal de N e/ou aminoácido de terminal de C da proteína madura que tem a seqüência de aminoácido que consiste em aminoácidos 16-236 de SEQ ID NO: 4 são modificadas.

O termo "adição de seqüência de aminoácido" como usado aqui inclui uma adição de parte ou o todo do peptídeo sinal que consiste em aminoácidos 1-15 de SEQ ID NO: 4 ao terminal de N da proteína madura que tem a seqüência de aminoácido que consiste em aminoácidos 16-226 de SEQ ID NO: 4

O termo "modificação de seqüência de aminoácido" como usado aqui inclui uma modificação do terminal de N da proteína madura que tem a seqüência de aminoácido que consiste em aminoácidos 16-236 de SEQ ID NO: 4 por uma enzima derivada de um hospedeiro. Esta modificação inclui uma modificação do resíduo de glutamina de terminal de N (GIn) da proteína madura para um resíduo de ácido piroglutâmico (pyroGlu).

Os exemplos dos peptídeos de sinal incluem a seqüência de aminoácido que consiste em aminoácidos 1-15 de SEQ ID NO: 4, isto é, a seqüência de aminoácido que consiste em 15 resíduos de aminoácido codificados pela seqüência de nucleotídeo do códon ATG na 1a a 3a posições para o códon na 43a a 45a posições.

O termo "proteína modificada", como usado aqui significa uma proteína que com

preende uma seqüência de aminoácido na qual um ou aminoácidos plurais (preferivelmente um ou vários aminoácidos) são deletados, substituídos, adicionados e/ou modificados na seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 (ou uma seqüência parcial do mesmo), e tendo atividade de endoglucanase.

O número de aminoácidos a ser modificado tal como "deletado, substituído, ou adi

cionado" é um ou aminoácidos plurais (preferivelmente um ou vários aminoácidos), por exemplo, 1 a 20, preferivelmente 1 a 10, mais preferivelmente 1 a 5, preferivelmente 1 a 3. A proteína modificada inclui uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácido na qual um ou aminoácidos plurais são de modo conservador substituídos na seqüência de 50 aminoácido de SEQ ID NO: 4, e tendo atividade de endoglucanase.

O termo "substituição conservadora" como usado aqui significa que um ou resíduos de aminoácido plurais contidos em uma proteína são substituídos com aminoácidos diferentes que têm propriedades químicas semelhantes de forma que as atividades da proteína não sejam substancialmente mudadas. Como a substituição conservadora, nesse aspecto pode

ser mencionado, por exemplo, uma substituição de um resíduo hidrofóbico por outro resíduo hidrofóbico, ou uma substituição de um resíduo polar por outro resíduo polar com a mesma carga. Os aminoácidos que têm propriedades químicas semelhantes e podem ser de modo conservador substituídos para um outro, são conhecidos por aqueles versados na técnica. Mais particularmente, como aminoácidos não polares (hidrofóbicos), nesse aspecto podem ser mencionadas, por exemplo, alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptofano, fenilalanina, ou metionina. Como aminoácidos polares (neutro), nesse aspecto podem ser mencionados, por exemplo, glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina, ou cisteína. Como aminoácidos básicos que têm uma carga positiva, nesse aspecto podem ser mencionados, por exemplo, arginina, histidina, ou lisina.

Como aminoácidos ácidos que têm uma carga negativa, nesse aspecto pode ser mencionado, por exemplo, ácido aspártico ou ácido glutâmico.

A proteína da presente invenção pode ser isolada e purificada de um microorganismo, por exemplo, como descrito no Exemplo 1. A proteína da presente invenção pode ser obtida expressando-se um polinucleotídeo que codifica a proteína da presente invenção em um hospedeiro apropriado através de técnicas recombinantes genéticas, e isolando e purificando a proteína produzida, como descrito abaixo.

Os exemplos da proteína homóloga da presente invenção incluem uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácido que tem uma homologia de 90% ou mais (preferivelmente 95% ou mais, mais preferivelmente 98% ou mais, mais preferivelmente 99% ou mais) com a seqüência de aminoácido que consiste em aminoácidos 16-236 ou 1- 236 de SEQ ID NO: 4 ou com a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 30, e tendo atividade de endaglucanase. A homologia como usado aqui é mostrada como um valor calculado por um Software de Processamento de Informação Genética comercialmente disponível GENETYX (GENETYX Corporation), de acordo com parâmetros padrões em um programa de pesquisa de homologia.

Parâmetros Padrões:

Tamanho de unidade a Comparar = 2 Sítio da Unidade a Comparar = 1 Local Pick up = 1

Polinucleotídeo de codificação de proteína tendo atividade de endoqlucanase De acordo com a presente invenção, os polinucleotídeos que codificam uma proteína que compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 ou uma seqüência parcial da mesma, ou uma proteína modificada da mesma são fornecidas. Quando a seqüência de aminoácido de uma proteína for determinada, uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido pode ser selecionada facilmente, e desse modo várias seqüência s de nucleotídeo que codificam a proteína da presente invenção podem ser selecionadas. O termo "polinucleotídeo" como usado aqui inclui ADN e RNA, e ADN é preferível.

Tipicamente, o polinucleotídeo da presente invenção pode ser selecionado do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 3 ou 28 ou uma seqüência parcial da mesma), e

(b) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeo na qual um ou nucleotídeos plurais são deletados, substituídos, e/ou adicionados na seqüência de nu

cleotídeo de SEQ ID NO. 3 ou 28 ou uma seqüência parcial da mesma), e codificando uma proteína que tenha atividade de endoglucanase.

Os exemplos do polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 3 ou uma seqüência parcial da mesma incluem um polinucleotídeo que tenha a seqüência de nucleotídeo que consiste em nucleotídeos 1-834 de SEQ ID NO: 3; e um polinucleotídeo que tenha a seqüência de nucleotídeo que consiste em nucleotídeos 46-834 de SEQ ID NO: 3.

O polinucleotídeo da presente invenção inclui um polinucleotídeo de ocorrência natural. Além disso, o todo pode ser sintetizado. Além disso, a síntese pode ser realizada usando parte do polinucleotídeo de ocorrência natural. Tipicamente, o polinucleotídeo da pre15 sente invenção pode ser obtido realizando-se uma reação de PCR usando ADN genômico de Penicillium pinophilum como um modelo. Além disso, o polinucleotídeo da presente invenção pode ser obtido de acordo com um método ordinário geralmente usado em engenharia genética, por exemplo, preparando-se uma biblioteca de ADN genômico e avaliando-se a biblioteca usando uma sonda de ADN apropriada projetada na base de informação de uma 20 seqüência de aminoácido parcial.

Na presente invenção, uma seqüência de nucleotídeo típica que codifica a seqüência de aminoácido de PPCE de endoglucanase tem a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 3. A seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 3 tem uma estrutura de leitura aberta do códon ATG na 1a a 3a posições para o códon TAG na 832a a 834a posições e dois íntrons 25 nas 411a a 469a e 691a a 754a posições. A seqüência de nucleotídeo nas 46a a 48a posições corresponde ao aminoácido de terminal de N de uma proteína madura de endoglucanase PFCE que consiste em 221 resíduos de aminoácido.

Transformante e vetor de expressão

De acordo com a presente invenção, um vetor de expressão que compreende um poli30 nucleotídeo que codifica uma proteína que compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 ou uma seqüência parcial da mesma, ou uma proteína modificada (a seguir referida como o polinucleotídeo da presente invenção) de forma que o polinucleotídeo possa ser replicado e a proteína codificou pelo polinucleotídeo possa ser expressa em um microorganismo de hospedeiro, é fornecido. O vetor de expressão da presente invenção pode ser construído na 35 base de um vetor auto-replicante (como um plasmídeo), que existe como um elemento extracromossômico e pode replicar independentemente da replicação de cromossomos. Alternativamente, o vetor de expressão da presente invenção pode ser um vetor que é integrado no genoma do microorganismo hospedeiro e replicado junto com cromossomos, quando o hospedeiro é transformado com o vetor. A construção do vetor da presente invenção pode ser realizada por procedimentos ordinários ou métodos geralmente usados em engenharia genética. Para expressar uma proteína que tem uma atividade desejada transformando-se um microorganismo hospedeiro com o vetor de expressão da presente invenção, é preferível que o vetor de expressão contenha, por exemplo, um polinucleotídeo capaz de controlar a expressão, além do polinucleotídeo da presente invenção. Como o polinucleotídeo capaz de controlar a expressão, por exemplo, um promotor, um terminador, ou um polinucleotídeo que codificam um peptídeo sinal, pode ser usado na presente invenção. O promotor que, pode ser usado na presente invenção não está particularmente limitado, contanto que mostre uma atividade transcricional em um microorganismo hospedeiro. O promotor pode ser obtido como um polinucleotídeo que controla a expressão de um gene que codifica uma proteína igual ou diferente daquela derivada do microorganismo hospedeiro.

O peptídeo sinal não está particularmente limitado, contanto que contribua com a secreção de proteína em um microorganismo hospedeiro. O peptídeo sinal pode ser obtido como um polinucleotídeo derivado de um gene que codifica uma proteína igual ou diferente daquela derivada do microorganismo hospedeiro.

O vetor de expressão da presente invenção pode conter um marcador genético para selecionar um transformante obtido introduzindo-se o vetor de expressão em um microorganismo hospedeiro. O marcador genético pode ser adequadamente selecionado de acordo com o método para selecionar um transformante. Como o marcador genético, por exemplo, um gene de resistência a fármaco ou um gene que complementa uma mutação de auxotrófica pode ser usado na presente invenção.

O marcador genético pode ser inserido em um vetor diferente do vetor de expressão, e este vetor que contém o marcador genético pode ser misturado com o vetor de expressão para transformar um hospedeiro com estes vetores simultaneamente (também chamado co-transforma). De acordo com a presente invenção, um microorganismo transformado com o vetor de expressão é fornecido. Um sistema de hospedeiro-vetor que pode ser usado na presente invenção não é particularmente limitado. Por exemplo, um sistema utilizando E. coli, Actinomycetes1 levedura, ou fungos filamentosos, ou um sistema para a expressão de uma proteína de fusão que usa tal microorganismo, pode ser usado. A transformação de um microorganismo com o vetor de expressão pode ser realizada de acordo com um método ordinário. Na presente invenção, o transformante da presente invenção é cultivado, e o transformante resultante ou cultura é usado para obter a proteína da presente invenção. De acordo com outra modalidade da presente invenção, o processo para produzir a nova proteína da presente invenção pode ser fornecido. O cultivo do transformante (incluindo condições de cultura) pode ser realizado de um modo substancialmente semelhante àquele do hospedeiro original usado para preparar o transformante. Como o método para recuperar a proteína de interesse depois do cultivo do transformante, procedimentos geralmente usados podem ser realizados. Como um processo preferível para produzir a nova proteína da presente invenção, um método de expressar a proteína em um fungo filamentoso que pertence a Hyphomycetes é fornecido. Como fungos filamentosos preferíveis que podem ser usados como um hospedeiro na presente invenção, nesse aspecto podem ser mencionados, por exemplo, fungos filamentosos que pertencem ao gênero Trichoderma. Humicola. Asperaillus. Acremonium. ou Penicillium. mais preferivelmente Trichoderma ou Humicola. Mais particularmente, nesse aspecto pode ser mencionado, por exemplo, Trichoderma viride. Trichoderma reesel. Trichoderma Iongibrachiatum. Humicola insolens. Humicola thermoidea. Asperaillus niaer. Asperqillus orvzae. Acremonium cellulolvticus. ou Penicillium pinophilum. preferivelmente Trichoderma viride ou Humicola insolens.

Uso de celulase/preparacão de celulase

A presente invenção se refere a uma preparação de celulase que compreende a proteína da presente invenção (por exemplo, uma proteína que compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 ou uma seqüência parcial da mesma, uma proteína modificada da mesma, ou uma proteína obtenível cultivando-se a célula hospedeira da presente invenção).

Convencionalmente, a preparação de celulase pode conter, por exemplo, cargas (por exemplo, lactose, cloreto de sódio, ou sorbitol), antissépticos, e/ou tensoativos não iônicos, além da enzima de celulase. A forma da preparação de celulase pode ser sólida ou líquida, tal como pó, particulado, grânulo, grânulo não pulverizante, ou formulação líquida. Além da proteína da presente invenção, a preparação de celulase da presente invenção pode conter outras enzimas de celulase, tal como celobioidrolase, β-gulucosidase, e/ou endoglucanase diferente da endoglucanase da presente invenção. O grânulo não pulverizante (preferivelmente um grânulo que não tem uma capacidade de ser pulverizado), que é uma forma de preparação de celulase, pode ser produzido de acordo com o método de granulação seco comum. Isto é, uma proteína em pó da presente invenção é misturada com uma ou substâncias plurais selecionadas do grupo que compreende sais inorgânicos (tal como sulfato de sódio ou cloreto de sódio), minerais (tal como bentonita ou montmorilonita), e substâncias orgânicas (tal como amido ou celulase moída). Depois disso, os pós ou a suspensão finamente suspensa de um ou tensoativos não iônicos plurais são adicionadas à mistura, e então o produto obtido é completamente misturado ou amassado. Dependendo da situação, um polímero sintético (tal como, polietileno glicol) ou um polímero natural (tal como amido), que liga sólidos, é opcionalmente adicionado à mistura e também amassado. Depois disso, a granulação é realizada por moldagem por extrusão, usando, por exemplo, um peletizador de disco, e o material moldado obtido é então convertido em uma forma esférica que usa um marumerizador seguido por secagem, de forma que os grânulos não pulverizantes possam ser produzidos. A quantidade de um ou tensoativos não iônicos plurais não é particularmente limitada, e é preferivelmente 0,1 a 50% em peso, mais preferivelmente 0,1 a 30% em pe5 so, preferivelmente 1 a 10% em peso do peso total da preparação de celulase da presente invenção. Também é possível cobrir a superfície de grânulos com um polímero ou similar para controlar a permeação de oxigênio ou água. Além disso, a preparação líquida, que é uma das preparações de celulase (preferivelmente um líquido estabilizado), pode ser preparada misturando-se um estabilizador de endoglucanese (tal como um polímero sintético ou 10 natural) com uma solução que contém a proteína da presente invenção e, se necessário, adicionando sais inorgânicos e/ou um preservativo sintético.

Neste caso, um ou tensoativos não iônicos plurais podem ser misturados com a preparação líquida. A quantidade de um ou plural dos tensoativos não iônicos não é particularmente limitada, e é preferivelmente 0,1 a 50% em peso, mais preferivelmente 0,1 a 30% 15 em peso, mais preferivelmente 1 a 10% em peso da quantidade total da preparação de celulase da presente invenção. Além disso, a presente invenção fornece uma composição detergente que compreende a proteína da presente invenção ou a preparação de celulase da presente invenção. A composição detergente da presente invenção também pode compreender tensoativos, que podem ser aniônicos, não iônicos, catiônicos, anfotéricos, ou zwiteri20 ônicos, ou uma mistura dos mesmos. A composição detergente pode compreender outras composições detergentes conhecidas na técnica, por exemplo, reforçador, alvejante, agente de branqueamento, inibidor de mancha, sequestrante, polímero de liberação de sujeira, flavorizante, outras enzimas (tal como protease, lipase, ou amilase), estabilizador para enzima, granulador, abrilhantador óptico, e/ou agente espumante. Como tensoativos aniônicos típi25 cos, nesse aspecto pode ser mencionado, por exemplo, sulfonato de benzeno de alquila linear (LAS), sulfato de alquila (AS), sulfonato de σ-olefina (AOS), sulfonato de alquiléter de polioxietileno (AES), éster de ácido a-sulfo-graxo (σ-SEMe), ou sal de metal de álcali de ácido graxo de ocorrência natural. Como os tensoativos não iônicos, nesse aspecto podem ser mencionados, por exemplo, éter de alquila de polioxietileno (AE)1 éter de alquilpolietilenogli30 col, éter de polietileno glicol de nonilfenol, etoxilato de éster de metila de ácido graxo, sacarose, ou éster de ácido graxo de glicose, ou ésteres de alquilglicosídeo ou alquilglicosídeo polietoxilado.

O método da presente invenção para tratar um tecido contendo celulase é realizado levando-se o tecido contendo celulase em contato com a proteína da presente invenção, a preparação de celulase da presente invenção, ou a composição detergente da invenção. As seguintes propriedades de tecido contendo celulase podem ser melhoradas pelo método da presente invenção: (1) Melhora da sensação ao tocar e aparência de um tecido reduzindo-se o peso; (2) Fornecer uma mudança de cor localizada a um tecido contendo celulase colorido, isto é, fornecer uma aparência do tipo desgastada e textura a um tecido contendo celulase colorido, tipicamente brim;

(3) Clarificação de cor de um tecido contendo celulase colorido;

(4) Amaciar um tecido (redução da taxa de dureza, é uma redução de dureza); e

(5) Remoção de penugem (redução da taxa da formação de penugem, e redução de penugem).

Mais particularmente, o método da presente invenção pode ser realizado adicionando-se a proteína da presente invenção, a preparação de celulosa da presente invenção, ou a composição detergente da presente invenção, em água na qual um tecido é ou será embebido, por exemplo, durante um embebimento, lavagem, ou enxágüe de um tecido. Condições tais como temperatura de contato ou a quantidade da proteína, a preparação de celulase, ou a composição detergente a ser adicionada podem ser adequadamente determinadas de acordo com várias outras condições. Por exemplo, para melhora da sensação ao tocar e aparência de um tecido contendo celulase reduzindo-se o peso, a proteína, a preparação de celulase, ou a composição detergente em uma concentração de proteína de 0,1 a 50 ng/L é preferivelmente usada a uma temperatura de cerca de 10 a 60°C. Para fornecer uma mudança de cor localizada a um tecido contendo celulase colorido, a proteína, a preparação de celulase, ou a composição detergente em uma concentração de proteína de

0,1 a 100 mg/L é preferivelmente usada a uma temperatura de cerca de 20 a 60°C. Para clarificação de cor de um tecido contendo celulase colorido, a proteína, a preparação de celulase, ou a composição detergente em uma concentração de proteína de 0,01 a 20 mg/L é preferivelmente usada a uma temperatura de cerca de 10 a 60°C. Para reduzir a dureza de um tecido contendo celulase ou reduzir a taxa da formação de dureza, a proteína, a preparação de celulase, ou a composição detergente em uma concentração de proteína de 0,01 a mg/L é preferivelmente usada a uma temperatura de 10 a 60°C. Para redução de penugem de um tecido contendo celulase ou redução da taxa da formação de penugem, a proteína, a preparação de celulase, ou a composição detergente em uma concentração de proteína de 0,01 a 20 mg/L é preferivelmente usada a uma temperatura de 10 a 6°C.

Além disso, a presente invenção se refere a um método para extrair tinta de papel usado, caracterizado usando-se a proteína da presente invenção ou a preparação de celulase da presente invenção, no processo de tratar o papel usado junto com um agente de extração de tinta. A proteína ou a preparação celulosa da presente invenção são úteis no processo de produzir papel reciclado de papel usado, uma vez que uma eficiência da extração de tinta pode ser melhorada reagindo-se o papel usado nela. De acordo com o método de extração de tinta, a brancura do papel usado pode ser melhorada notavelmente reduzindose a fibra de tinta residual. O agente de extração de tinta não é particularmente limitado, contanto que seja o agente que possa ser usado na extração de tinta de papel usado em geral. Como o agente de extração de tinta, nesse aspecto pode ser mencionado, por exemplo, álcalis (tal como hidróxido de sódio ou carbonato de sódio), silicato de sódio, peróxido 5 de hidrogênio, fosfato, tensoativos aniônicos ou não iônicos, limpadores tal como ácido oléico, e agentes assistentes tal como um stabilizador de pH, um agente de quelação, ou um agente dispersante. O papel usado que pode ser tratado pelo método de extração de tinta não está limitado particularmente, contanto que seja papel usado comum. Como o papel usado, nesse aspecto pode ser mencionado, jornal usado, papel de revista usado, e papel 10 usado impresso de grau baixo a médio que compreende polpa mecânica e polpa química; papel sem madeira usado que compreende polpa química; ou papel usado impresso do mesmo tal como papel para embrulho. Um papel diferente do papel usado comum pode ser tratado pelo método extração de tinta, contanto que deposite tinta.

Além disso, a presente invenção se refere a um método para melhorar uma Iibera15 ção de água de polpa de papel, que compreende o processo de tratar uma polpa de papel com a proteína da presente invenção ou a preparação de celulase da presente invenção. De acordo com o método, é considerado que este método possa significativamente melhorar uma liberação de água de polpa de papel, sem um declínio sério de força. Uma polpa de papel que pode ser tratada pelo método não está particularmente limitada, porém pode ser 20 mencionada, por exemplo, polpa de papel usado, polpa de papelão reciclado, polpa de kraft, polpa de sulfito, polpa de tratamento termo-mecânico, e outra polpa de alta produção.

A presente invenção se refere a um método para melhorar uma digestibilidade de alimento animal, compreendendo a etapa de tratar o alimento animal com a proteína da presente invenção ou a preparação de celulase da presente invenção. De acordo com este mé25 todo, uma digestibilidade de alimento animal pode ser melhorada digerindo-se glucan em alimento animal em moléculas apropriadas tendo um baixo peso molecular. Além disso, uma digestibilidade de glucan em alimento animal pode ser melhorada usando a proteína da presente invenção em alimento animal. De acordo com a presente invenção, um método para melhorar uma digestibilidade de alimento animal, compreende a etapa de tratar o alimento SO animal com a proteína da presente invenção ou a preparação celulosa da presente invenção, é fornecido.

A presente invenção se refere a um método para produzir etanol de biomassa, compreendendo a etapa de tratar uma substância com base em celulase (tal como fibras de celulose) com a proteína ou a preparação de celulosa da presente invenção. De acordo com 5 método, a substância com base em celulase pode ser digerida e sacarificada tratando-se a substância com a proteína da presente invenção, para produzir glicose. A glicose resultante pode ser convertida em etanol de biomassa por técnicas de fermentação que usam outros microorganismos como levedura.

Deposição de microorganismos

Penicillium pinophilum PF1365, do qual a PPCE de endoglucanase da presente invenção foi derivada, foi depositado internacionalmente no Instituto Nacional Depositário de 5 Organismo de Patente Internacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (Endereço: AISTTsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japão) no dia 7 de fevereiro de 2007, e o número de depósito internacional é FERM BP-10780.

Escherichia coli JM109/p28FULL18 da presente invenção, isto é, Escherichia coli JM109 transformado com plasmídeo p28FULL78 obtido inserindo-se o gene de PPCE em 10 plasmídeo PCR 2.1-TOPO, foi depositado internacionalmente no Instituto Nacional Depositário de Organismo de Patente Internacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (Endereço: AISTTsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japão) no dia 7 de fevereiro de 2007, e o número de depósito internacional é FERM BP10781.

Trichoderma viride MC300-1, que pode ser usado como um hospedeiro para o vetor

de expressão da presente invenção, foi domesticamente (originalmente) depositado no Instituto Nacional Depositário de Organismo de Patente Internacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (Endereço: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japão) no dia 9 de setembro de 1996, e foi transferido para um depó20 sito internacional no dia 21 de agosto de 1997. O número de depósito internacional (um número em parêntese [ ] seguinte o número de depósito internacional é um número de depósito doméstico) é FERM BP-6047 [FERM P-15842],

EXEMPLOS

A presente invenção agora será também ilustrada por, porém não está de modo algum limitada aos seguintes Exemplos.

Exemplo 1: Isolamento a purificação de componente tendo atividade para remover penugem de algodão colorido de Penicillium pinophilum PF1355

Penicillium pinophilum PF1365 foi cultivado em um meio de TS (2,0% de amido solúvel, 1,0% de glicose, 0,5% de polipeptona, 0,6% de germe de trigo, 0,3% extrato de Ieve30 dura, 0,2% de bolo de feijão, 0,2% de carbonato de cálcio, pH 7,0) a 25°C sob agitação. Após cultivo durante 24 horas, o fungo foi inoculado em um meio (N) (5,0% de avicel, 2,0% de extrato de fermento, 0,1% de polipeptona, 0,03% de sulfato de magnésio, pH 6,8), e também cultivado a 25°C durante 5 dias. Os micélios foram removidos da cultura para obter um sobrenadante de cultura como uma solução de preparação de celulase bruta. O sulfato de a55 mônio foi adicionado à solução de preparação de celulase bruta de forma que uma concentração final sulfato de amônio na solução se tornasse 1,2 mol/L. A solução foi aplicada a uma coluna HiTrap™ Phenyl HP (GE Healthcare Bio-Science) equilibrada com um tampão de acetato de sódio de 50 nM (pH 5) contendo 1,2 mol/L de sulfato de amônio, e eluída por um método de eluição em etapas usando 1,2 mol/L, 0,96 mol/L, 0,72 mol/L, 0,46 mol/L, 0,24 mol/L, e 0 mol/L de sulfato de amônio em um tampão de acetato de sódio de 50 mmol/L (pH

5), para coletar frações. A fração eluída em uma concentração de sulfato de amônio de 0,24 5 mol/L exibiu uma atividade de remover penugem de um tecido de algodão colorido. A atividade de remover penugem de um tecido de algodão colorido foi avaliada pelo seguinte procedimento. Os tecidos tricotados de algodão manchados de azul foram tratados em uma lavadora grande para gerar penugem. Os tecidos tricotados de algodão azul com penugem foram tratados sob as seguintes condições para remover penugem e a atividade de remoção 10 de penugem avaliada, julgando-se a extensão de penugem removida de tecidos depois do tratamento com base em uma avaliação visual.

Máquina de teste: Launder Meter L-12 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japão) Temperatura: 40°C Tempo: 120 minutos pH de reação: pH 2 (5 mmol/L de tampão de citrato)

A uma solução de tratamento, uma quantidade apropriada de contas de aço foi adicionada junto com cada solução de fração.

A fração eluída em uma concentração de sulfato de amônio de 0,24 mol/L foi dessalgada usando uma coluna de dessalgamento PD-10 (GE Healthcare Bio-Science) de acordo com as condições descritas em um manual em anexo, e ajustada para se tornar um tampão de acetato de 50 mmol/L (pH 4,0). A fração ajustada foi aplicada a uma coluna Resource Mono S (GE Healthcare Bio-Science) equilibrada com um tampão de acetato de 50 mmol/L (pH 4,0), e eluída por um método de eluição em etapas de um tampão de acetato de sódio de 50 mmol/L (pH 4,0) para um tampão de acetato de sódio de 50 mmol/L (pH 5,0) contendo 1 mol/Z, cloreto de sódio, em incrementos de 0,1 mol de NaCI1 para coletar frações. Como um resultado, a atividade de remover penugem de um tecido de algodão colorido foi detectada na fração que atravessou a coluna sem ser adsorvida pela coluna. Esta fração de fluxo total foi aplicada a uma coluna Resource Mono Q (GE Healthcare BioScience) equilibrada com um tampão de acetato de 50 mmol/L (pH 4,0), e eluída por um método de eluição em etapas de um tampão de acetato de 50 mmol/L (pH 4,0) para um tampão de acetato de 50 mmol/L (pH 5,0) contendo 1 mol/L de cloreto de sódio, em incrementos de 0,1 mol de NaCI, para coletar frações. Como um resultado, a atividade de remover penugem de um tecido de algodão colorido foi detectada na fração que atravessou a coluna sem ser adsorvida pela coluna. A fração de fluxo total resultante foi concentrada u55 sando uma membrana de ultrafiltração de redução de 10 kDa (MiIIipore) para designar uma fração de PPCE. Esta fração de PPCE exibiu uma atividade de CMCase. Em seguida, a solução de preparação de celulase bruta e frações ativas obtidas nas etapas de purificação de coluna acima foram submetidas à SDS-PAGE. Esta SDS-PAGE foi realizada usando um aparato de eletroforese Safety Cell Mini STC-808 (Tefco) e um Precast Mini Gel 12%-SDSRAGEmini1 1,0 mm em espessura de gel (Tefco) de acordo com protocolos ligados a isto. A calibração de LMW por Eletroforese SDS (GE Healthcare Bio-Science) foi usada como mar5 cadores moleculares. Após a eletroforese, o gel foi manchado com azul brilhante Coomassie R-250 (Nacalai Tesque), e descolorido. Como um resultado, descobriu-se que uma proteína que tem um peso molecular médio (NW) de aproximadamente 26 kDa foi gradualmente concentrada por cada etapa de purificação. Em particular, o teor da proteína de aproximadamente 26 kDa foi notavelmente aumentado na fração de PPCE1 em comparação com a so10 lução de preparação celulase bruta. Destes resultados, foi presumido que o componente que tem a atividade para remover penugem de um tecido de algodão colorido foi a proteína que tem um peso molecular médio (MW) de aproximadamente 26 kDa, e realizou as seguintes experiências.

Exemplo 2: Identificação de seqüência de aminoácido de terminal de N de PPCE derivado de Penicillium pinophilum PF1365

A fração de PPCE obtida no Exemplo 1 foi submetida à SDS-PAGE, e eletricamente manchada em uma membrana de PVDF (MiIIipore) usando Multiphor Il (GE Healthcare Bio-Science). A membrana foi manchada com Azul Brilhante G (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), e descolorida. Da membrana, a porção na qual uma proteína (PPCE) tendo um 0 peso molecular de aproximadamente 26 kDa foi manchada, foi cortada. Este pedaço foi submetido a um seqüenciador de proteína Modele 42 (Applied Biosystems) para determinar a seqüência de aminoácido de terminal de N, porém não descobriu-se nenhum sinal de degradação de Edman. Foi revelado deste resultado que o aminoácido de terminal de N foi protegido por modificação.

) A membrana cortada foi imergida em uma solução de polivinilpirrolidona-40 a 0,5%

(Sigma) /100 mmol/L de ácido acético a 37°C durante 30 minutos para bloquear as porções não ligadas à proteína na membrana, e tratada com Pfu piroglutamato aminopeptidase (Takara Bio) a 54°C durante 5 horas para remover o resíduo de N-terminal modificado da proteína. A membrana resultante foi re-submetida ao sequênciador de proteína para obter a seguinte seqüência de aminoácido. Xaa é um resíduo de aminoácido desconhecido.

Resultado de sequênciamento: Gln--Ser-Leu-Xaa-Ser-Gln-Tyr-Ser-Ser-Tyr-Thr-Ser (12 resíduos) (SEQ ID NO: 1)

Considerando que os sinais foram obtidos tratando-se o aminoácido N-terminal protegido com Pfu piroglutamato aminopeptidase, é considerado que o aminoácido N-terminal de PPCE é ácido piroglutâmico (pyroGlu). Além disso, Xaa é presumido ser cisteína (Cys), porque um sinal derivado de cisteína não é detectável com este sequênciador de proteína. Portanto, a seqüência de aminoácido N-terminal de PPCE é considerada a seqüência seguinte.

Seqüência de aminoácido N-terminal de PPCE: Gln-Gln-Ser-Leu-Cys-Ser-Gln-TyrSer-Ser-Tyr-Thr-Ser (13 resíduos; O Gln N-terminal é modificado em pyroGlu.) (SEQ ID NQ: 2)

Quando esta seqüência de aminoácido N-terminal foi usada para realizar uma pes

quisa de homologia (GENETYX; GENETYX Corporation), esta seqüência mostrou uma homologia com a seqüência de aminoácido da endoglucanase NI (RO 2238974) derivada de Penicillium verruculosum. Este resultado sugeriu que PPCE fosse uma endoglucanase que pertence à família 12.

Exemplo 3: Amplificação de PCT de gene dePPCE da endoglucanase

Visto que a seqüência de aminoácido N-terminal de PPCE teve uma homologia com aquela da endoglucanase Ill derivada de Penicillium verruculosum que pertence a família

12, nós tentamos amplificar um gene de PPCE da endoglucanase derivado de Penicillium pinophilum PF1365 por PCR com base na seqüência de nucleotídeo de EG Ill descrita em RU 2238974.

(1) Isolamento de ADN cromossômico derivado de Penicillium pinophilum PF1365

Penicillium pinophilum PF1365 foi cultivado no médio de TS a 28°C durante 24 horas, e centrifugado para coletar micélios. Um kit (ISOPLANT; Nippon Gene Co., Ltd.) foi usado para extrair ADN cromossômico dos micélios obtidos. A extração foi realizada de

acordo com as condições descritas no manual associado a estas.

(2) Amplificação do fragmento de gene da endoglucanase da família 12 derivado de de Penicillium pinophilum PF1365 por PCR

Iniciadores sintéticos que têm as seguintes seqüências foram preparados com base nas seqüências de aminoácido N-terminais e C-terminais da endoglucanase Ill derivada de Penicillium verruculosum.

MSW-N: CAACAGftGTCTATGCGC7CÃATACTCG*.GCTACACCAST (SEQ XD 5ÍO;

3)

HSff-C! CTARTTGACAôCTGCÃGÃCCÃA {SEQ ID NO: $)

Uma reação de PCR foi realizada usando os iniciadores anteriores (MSW-N, MSWC), o ADN cromossômico preparado no Exemplo 3(1) como o padrão, e o Kit LA PCR™ Ver2.1 (Takara Bio). Esta reação de PCR foi realizada realizando-se uma reação a 94°C durante 1 minuto, repetindo-se um ciclo que consiste em uma reação a 94°C 30 durante 30 segundos, uma reação a 60°C durante 30 segundos, e uma reação a 72°C durante 1 minuto 20 vezes, e realizando-se uma reação a 72 0C durante 10 minutos. O líquido de reação resultante foi submetido a eletroforese de gel de agarose. Como um resultado, foi confirmado que um fragmento de gene de aproximadamente 0,8 kbp foi amplificado, e desse modo, tentamos clonar este fragmento para determinar a seqüência de nucleotídeo do mesmo. O fragmento de gene de

aproximadamente 0,8 kbp, que foi isolado através de eletroforese de gel de agarose foi cortado do gel, e um Sistema 5VGe1 e PCR Clean-Up (Promega) foi usado para purificar o ADN. A purificação foi realizada de acordo com as condições descritas no manual associado a estas. O CN4 purificado resultante de aproximadamente 0,8 kbp foi clonado em um vetor TOPO (PCR 2.1-TOPO) usando um Kit de Clonagem TOPO TA (Invitrogen). O plasmídeo resultante foi amplificado e extraído para determinar a seqüência de ADN do mesmo de acordo com procedimentos convencionais. Esta extração do plasmídeo foi realizada usando um Kit QIAfiIter Plasmid (Xiagen) de acordo com as condições descritas no manual associado a estas. A seqüência de nucleotídeo de ADN foi determinada por uma reação usando um Kit dRhodamine Terminator (Applied Biosystems) e o inicidor universal M13 ou um iniciador Rev tendo a seqüência seguinte como um iniciador. Rsv: GAGGSAACftGCTATGftC (SEQ ID NO: 7)

Esta reação foi realizada de acordo com as condições descritas no manual associado a estas. O líquido de reação resultante foi purificado de acordo com as condições descritas no manual associado a estas, e analisado usando um Analisador Genético ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). Como resultado, o fragmento de gene amplificado por PCR foi um gene que tem uma homologia com endoglucanase Ill derivada de Penicillium verruculosum.

Exemplo 4: Clonagem de fragmento de gene da endoglucanase de família 12 derivada de Penicillium pinophilum PF1365 por caminhada de aenoma Nós tentamos amplificar as regiões a montante e a jusante do fragmento de gene

aplificado por PCR da endoglucanase de família 12 derivada de Penicillium pinophilum PF1365 usando um WfGenomeWaIker (Becton, Dickinson and Company). Esta amplificação foi realizada de acordo com as condições descritas no manual associado a estas. ADN cromossômico extraído de Penicillium pinophilum PF1365 foi completamente digerido com enzima 25 de restrição Pvull ou Stul, e os fragmentos digeridos resultantes do ADN cromossômico foram ligados a um adaptador ligado ao kit para construir bibliotecas de Pvull e Stul. Além disso, iniciadores sintéticos tendo as seqüências seguintes foram preparados com base na seqüência determinada no Exemplo 3 para usar reações de PCR descritas abaixo.

24-GSP-Rl: CGCCAGAQCTGG«AAie6AffirTSftCaTAAG (SJBQ ID NO: 3) 24-GSP-R2; GTC-CACrGGGAGCCAGAGCCACTjCTCTCA (SEQ ID NO: 9) 24-Ç5?-ri: tTTCCWATGATCTCTTCMGSCASCGGATA (SCO ID NO: 10) 24-3SP-F2: ATCAACCATGTTACCTACAGTGGΓGACTAX (SEQ ÍD »0í 11)

Uma reação de PCR foi realizada usando a biblioteca de Pvull ou Stul como o padrão, o iniciador 24-GSP-R1 ou 24-GSP-F1 e um iniciador AP-1 ligado ao kit, e Pré-Mistura Ex Taq (Takara Bio). Esta reação de PCR foi realizada executando-se uma reação a 94°C durante 2 minutos, repetindo-se um ciclo que consiste em uma reação a 94°C durante 2 segundos e uma reação a 72°C durante 3 minutos 7 vezes, repetindo-se um ciclo que consiste em uma reação a 94°C durante 2 segundos e uma reação a 67°C durante 3 minutos 32 vezes, e realizando-se uma reação a 67°C durante 4 minutos. A reação de PCR líquida obtida pela primeira reação de PCR foi diluída com água desionizada, e a segunda reação de PCP 5 foi realizada usando o líquido diluído como o padrão, o iniciador 24-GSP-R2 ou 24-GSP-F2 e um iniciador AP-2 ligado ao kit, e Pré-mistura Ex Taq (Takara Bio). Esta reação de PCR foi realizada executando-se uma reação a 94°C durante 2 minutos, repetindo-se um ciclo que consiste em uma reação a 94°C durante 2 segundos e uma reação a 72°C durante 3 minutos 5 vezes, repetindo-se um ciclo que consiste em uma reação a 94°C durante 2 segundos 10 e uma reação a 67°C durante 3 minutos 20 vezes, e executando-se uma reação a 67°C durante 4 minutos. O líquido de reação resultante foi submetido à eletroforese de a gel de agarose. Como um resultado, foi confirmado que um fragmento de gene de aproximadamente 2 kbp foi amplificado na amostra obtida usando a biblioteca de Pvull como o padrão, realizando-se a primeira reação de PCR usando o iniciador 24-GSP-R1 e o iniciador AP-1, e reali15 zando-se a segunda reação de PCR usando o iniciador 24-GSP-R2 e o iniciador AP-2. Além disso, foi confirmado que um fragmento de gene de aproximadamente 2 kbp foi amplificado na amostra obtida usando a biblioteca de Stul como o padrão, realizando-se a primeira reação de PCR usando o iniciador 24-GSP-F1 e o iniciador AP-1, e realizando-se a segunda reação de PCR usando o iniciador 24-GSP-F2 e o iniciador AP-2. Estes 20 fragmentos de gene de aproximadamente 2 kbp foram cortados dos géis, e um QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT (Xiagen) foi usado para purificar os ADNs. A purificação foi realizada de acordo com as condições descritas no manual associado a estas. Os ADNs purificados resultantes de aproximadamente 2 kbp foram individualmente clonados em um vetor TOPO (PCR 2.1-TOPO) usando um TOPO PCR CLONING KIT (Invitrogen).

Os plasmídeos resultantes foram amplificados e purificados para determinar as se

qüências de ADN dos mesmos de acordo com procedimentos convencionais. Esta purificação dos plasmídeos foi realizada usando um QIAPREP MINIPREP KIT (Xiagen) de acordo com as condições descritas no manual associado a estas. As seqüências de nucleotídeo dos ADNs foram determinadas por uma reação usando um Kit dRhodamine Terminator 30 (Applied Biosystems) e o iniciador universal M13 ou o iniciador Rev como um iniciador. Esta reação foi realizada de acordo com as condições descritas no manual associado a estas. Os líquidos de reação resultantes foram purificados de acordo com as condições descritas no manual associado a estas, e analisados usando um Analisador Genético ABI PRISMA 310 (Applied Biosystems).

Como um resultado, o produto de PCR de aproximadamente 2 kbp derivado da bi

blioteca de Pvull continha a região a montante do gene obtido no Exemplo 3(2’, e o produto de PCR de aproximadamente 2 kbp derivado da biblioteca de Stul continha a região a jusante do gene obtido no Exemplo 3 (2). Estas seqüências de nucleotídeo dos produtos de PCR foram ligadas para determinar o comprimento completo da seqüência de nucleotídeo do gene de PPCE derivado de Penicillium pinophilum PF1365. A seqüência de nucleotídeo determinada do gene de PPCE (SEQ ID NO. 3) continha uma região homóloga com a região 5 de codificação do gene da endoglucanase Ill derivada de Penicillium verruculosum. A homologia entre estes genes calculada usando Software de Processamento de Informação Genética GENETYX (GENETIX Corporation) foi 82%. A homologia da seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 4) deduzida da seqüência de nucleotídeo do fragmento de ADN PPCE com aquela da endoglucanase Ill derivada de Penicillium verruculosum foi cal10 culada usando o GENETYX (GENETYX Corporation) como 86%. Uma pesquisa blastp, com base na seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 4) deduzida da seqüência de nucleotídeo do fragmento de ADN, foi realizada contra a base de dados conhecida NCEI para constatar que teve uma homologia de 72% com aquela de FI-CMCase derivada de Asperaollus aculeatus e uma homologia de 53% com aquela de EG Ill derivada de Trichoderma reesei. 15 Porque todas as proteínas foram enddglucanases que pertencem à família 12, foi considerado que o fragmento de ADN obtido foi um fragmento de gene que contém a região de codificação de um gene da endoglucanase da família 12 derivado de Penicillium pinophilum PF1365 e as regiões a montante e a jusante do mesmo.

Exemplo 5: Expressão de gene de PPCE em Trichoderma viride (1) Clonagem de fragmento de gene para expressão de PPCE

Os seguintes iniciadores para mutagênese tendo o sítio de reconhecimento Stul a jusante do codon de iniciação e o sítio de reconhecimento de Pstl a jusante do códon de interrupção foram designados, e o gene de PPCE foi amplificado por PCR.

32228-MSTUí CCAGGCCTGCGCATCATGftÃGCTAACTTTTCTCCTG Í3EQ ID NOi

12)

32228-CPSTs CCCTGCAGC5MTTGACAGAS-GCAjSACC (SEQ ID ΓΪ0: 133

Esta reação de PCR foi realizada usando o ADN cromossômico de Penicillium pl· 25 nophilum PF1365 obtido no Exemplo 3(1) como o padrão, iniciadores de ADN sintéticos 32228-NSTU e 32228-UST, e Pré-Mistura Ex Taq (Takara Bio), realizando-se uma reação a 94°C durante 2 minutos, repetindo-se um ciclo que consiste em uma reação a 94°C durante 1 minuto, uma reação a 50°C durante 2 minutos, e uma reação a 72°C durante 1,5 minuto 25 vezes, e realizando-se uma reação a 72°C durante 3 30 minutos. A amostra depois que a reação foi submetido a eletroforese de gel de agarose, e um fragmento de gene de aproximadamente 800 bp foi cortada e purificada usando um QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT (Xiagen) de acordo com as condições descritas no manual ligadas a estas. O ADN purificado resultante foi clonado em um vetor TOPO (PCR 2.1- TOPO) usando um TOPO PCR CLONING KIT (Invitrogen). O plasmídeo resultante foi designado p28FULL18. P28FULL18 de plasmídeo foi amplificado e purificado de acordo com os procedimentos convencionais, para determinar a seqüência de ADN do mesmo como descrito acima. Como um resultado, foi confirmado que p28FULL18 de plasmídeo continha o gene de PPCE tendo o sítio de reconhecimento Stul a montante do códon de iniciação e o 5 sítio de reconhecimento de Pstl a jusante do codon de interrupção. A seqüência de nucleotídeo do gene de PPCE contido no p28FULL18 de plasmídeo esteve de acordo com a seqüência de nucleotídeo da região de codificação de PPCE determinada no Exemplo 4, e desse modo, este fragmento de gene foi usado nos seguintes procedimentos para expressar

o gene de PPCE.

(2) Construção de plasmídeo para expressar PPCE

P28FULL18 de plasmídeo foi digerido com as enzimas de restrição Stul e Pstl, e a amostra depois da reação foi submetida à eletroforese de gel de agarose. O fragmento de gene de aproximadamente 800 bp foi cortado do gel, e um QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT (Xiagen) foi usado para purificar o ADN. pCB1-M2 de Plasmídeo (Exemplo B1 de WO 15 2005/056787) foi digerido com enzimas de restrição Stul e Pstl, e a amostra depois que a reação foi submetida à eletroforese de gel de agarose. Um fragmento de gene de aproximadamente 5,6 kbp foi cortado do gel, e um QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT (Xiagen) foi usado para purificar o ADN. Este fragmento de gene de aproximadamente 5,6 kbp foi ligado ao fragmento de gene previamente obtido de aproximadamente 800 bp usando 20 um Kit de Ligação de ADN TaKaRa Ver.1 (Takara Bio) para construir o pPPCE de plasmídeo F2.

(3) Preparação de transformante de Trichoderma viride com plasmídeo pPPCE-F2 Trichoderma viride foi transformado com plasmídeo pPPCE-F2 obtido no Exemplo 5(2) de acordo com os procedimentos descritos em WO 2005/056787. Isto é, esta transformação foi realizada por um método de co-transformação usando cepa de Trichoderma viride

2 deficiente de um gene para biossíntese de uracila (pyr4) como um hospedeiro e um gene de pyr4 de Neurospora crassa como um marcador de seleção. Mais particularmente, de acordo com o método descrito em WO 2005/056787, protoplastos de cepa de Trichoderma viride 2 foram preparados, e 100 μί da suspensão de protoplasto foram misturados com 7 30 μg de de plasmídeo pPPCE-F2 e 3 μg de plasmídeo pPYR4 (um plasmídeo preparado através da subclonagem do gene pyr4 de Neurosoora crassa em LITMUS28). Depois que esta mistura foi permitida permancer em gelo durante 5 minutos, 400 μί de uma solução de PEG (60% de polietileno glicol 4000, 10 mmol/L de cloreto de cálcio, e 10 mmol/L de tampão de Tris-HCL, pH7,5) foram adicionados à mistura, e permitidos permanecer sobre gelo durante 35 20 minutos. A suspensão de protoplasto resultante foi lavada com um tampão de SUTC (0,5 mol/L de sacarose, 10 mmol/L de cloreto de cálcio, e 1,0 mmol/L de tampão de Tris-HCI, pH 7,5), revestida com agar macio em um meio mínimo contendo 0,5 mol/L de sacarose, e cultivada a 28°C durante 5 dias. Depois do cultivo, as colônias crescidas foram transferidas no meio mínimo, e colônias crescidas neste meio foram usadas como transformantes nos seguintes procedimentos.

(4) Cultivo de transformante de Trichoderma viride com plasmídeo pPPCE-F2 Dos transformantes obtidos no Exemplo 5 (3), 60 cepas foram inoculadas em um

meio de PSW (1,0% de glicose, 4,0% de lactose, 2,0% de massa de soja, 1,0% de germe de trigo, 0,2% de diidrogenofosfato de potássio, 0,2% de sulfato de amônio, 0,2% de fosfato de amônio, 0,2% de carbonato de cálcio) e cultivadas a 23°C durante 5 dias. Depois do cultivo, os micélios foram removidos através de centrifugação para obter os sobrenadantes de cultu10 ra como soluções de enzima cruas. Estas soluções de enzima cruas foram submetidas a SDS-PAGE, e foi confirmado que uma proteína de aproximadamente 26 kDa foi especificamente expressa nos transformantes. O sobrenadante de cultura da cepa 322F-205, que expressou mais altamente a proteína, foi usado para realizar o seguinte teste de lavagem.

Exemplo 6: Avaliação de atividade de remoção depenuaem em aene de PPCE de expressão de cepa

(1) Medida de concentração de proteína expressa

Para avaliar uma atividade de remoção de penugem da cepa que expressa o gene de PPCE, cada gene de EG Ill derivado de Trichoderma reesei (referência de não patente 1), SCE3 derivado de Trichoderma viride (referência de patente 5), e FI-CMCase derivado 20 de Asperqollus aculeatus (referência de não patente 2) foi expresso em Trichoderma viride. e os sobrenadantes de cultura dos mesmos foram preparados como controles, de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 5. Estes sobrenadantes de cultura para controles, e o sobrenadante de cultura da cepa que expressa o gene de PPCE foram submetidos a SDS-PAGE usando um gel a 12% de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 1. 25 Depois da eletroforese, o gel foi manchado usando uma mancha de gel de proteína SYPRO Ruby (Invitrogen) e lavado com água. As faixas foram analisadas usando um Molecular Imager FX (Bio-Rad Laboratories) e uma Quantity One (Bio-Rad Laboratories) para determinar uma relação da proteína expressa para as proteínas totais. Além disso, uma concentração de proteínas totais contidas em cada sobrenadante de cultura foi 30 analisada usando globulina y bovina como um padrão e um Kit de Ensaio de Proteína (BioRad Laboratories). A concentração da proteína expressa foi calculada multiplicando-se a concentração de proteínas totais pela relação da proteína expressa.

Tabela 1

Quantidade de proteína expressa em transformantes de Trichoderma

Concentração Relação de Concentração de proteínas Proteína de proteína Proteína ativa totais expressa expressa PPCE 13,2 μg/mL 6,1% 0,81 μg/mL (presente invenção) EG Ill 11,8 μς/ηηί 18,1% 2,1 μg/mL SCE3 14,7 μg/mL 17,9% 2,6 μg/mL FI-CMCase 13,3 μς/mL 9,6% 1,3 μg/mL (2) Medida de atividade de remoção de penugem de algodão colorido

Os sobrenadantes de cultura da cepa expressa por PPCE e as cepas de controle preparadas no Exemplo 6(1) foram usados para medir a atividade de remoção de penugem dos mesmos. Mais particularmente, tecidos tricotados de algodão manchados de marrom foram tratados em uma lavadora grande para gerar penugem. Os tecidos tricotados de algodão marrom com penugem foram tratados sob as seguintes condições para remover a penugem e a atividade de remoção de penugem avaliada, decidindo-se a extensão da penugem removida dos tecidos depois do tratamento com base em uma avaliação visual. Máquina de teste: Launder Meter L-12 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japan) Temperatura: 40°C Tempo: 60 minutos

Solução de reação:5 mmol/L de tampão de acetato (pH 4) 40 mL Em uma solução de tratamento, uma quantidade apropriada de contas de aço inoxidável foi adicionada juntamente com cada sobrenadante de cultura.

Os volumes dos sobrenadantes de cultura requeridos para remover aproximadamente 50% da penugem formada com base em uma avaliação visual são mostrados na Tabela 2. Quantidades da proteína expressa usadas para remover 50% da penugem foram da mesma forma calculadas a partir das concentrações de proteína expressas determinadas no Exemplo 6 (1). Como um resultado, foi clarificado que PPCE requereu a proteína menor para remover a penugem dos tecidos.

Tabela 2

Atividade de remoção de penugem em cepa expressa por PPCE

Proteína Volume de sobrenadante de Quantidade de proteína ativa cultura removendo 50% de pe¬ expressando 50% de pe¬ nugem nugem PPCE 100 μ L 0,081 μg (presente invenção) EG Ill 140 μ\- 0,29 μς SCE3 150 μΐ 0,39 μg FI-CMCase 200 μΐ 0,26 μg Exemplo 7: Temperatura e perfis de pH na atividade de remoção de penuaemde

PPCE

(1) Perfil de temperatura na atividade de remoção de penugem de PPCE Os sobrenadantes de cultura das cepas expressas por PPCE- e EG Ill usados no Exemplo 6 foram usados para examinar os perfis de temperatura sob as seguintes condições para lavagem. Depois do tratamento de lavagem, extensões de penugem removidas dos tecidos foram avaliadas ou a base de uma avaliação visual, e volumes de sobrenadantes de cultura requeridos para remover aproximadamente 50% de penugem ou a base de uma avaliação visual foram calculados. Atividades relativas foram determinadas a partir dos volumes, quando a atividade na temperatura que mostra a atividade de remoção de penugem mais alta em cada amostra foi considerada como 100%. Como mostrado na Tabela 3, a temperatura ideal de PPCE foi de 30°C, e aquela de EG Ill foi de 40°C.

Máquina de teste: Launder Meter L-12 (Daiei Xagaku Seiki. MFG., Japan) Temperatura: 20°C a 60°C Tempo: 60 minutos

Solução de reação: 5 mmol/L de tampão de acetato (pH 4) 40 mL Em uma solução de tratamento, uma quantidade apropriada de contas de aço inoxidável foi adicionada juntamente com cada sobrenadante de cultura.

Tabela 3

Perfil de temperatura de cepa expressa por PPCE

Temperatura PPCE EG Ill de reação (presente invenção) Atividade relativa (%) Atividade relativa (%) 20°C 80 75 30°C 100 85 40°C 95 100 50°C 80 80 60°C 40 50 (2) Perfil de pH na atividade de remoção de penugem de PPCE Os sobrenadantes de cultura das cepas expressas por PPCE- e EG Ill usadas no Exemplo 6 foram usados para examinar os perfis de pH sob as seguintes condições para lavagem. Depois do tratamento de lavagem, extensões de penugem removidas dos tecidos foram avaliadas com base em uma avaliação visual, e volumes de sobrenadantes de cultura requeridos para remover aproximadamente 50% de penugem com base em uma avaliação visual foram calculados. Atividades relativas foram determinadas dos volumes, quando a atividade no pH que mostra a atividade de remoção de penugem mais alta em cada amostra 5 foi considerada como 100%. Como mostrado na Tabela 4, o pH ideal de PPCE foi pH 3, e aquele de EG Ill foi pH 4.

Máquina de teste: Launder Meter L-12 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japan) Temperatura: 40°C Tempo: 60 minutos

Solução de reação: 5 mmol/L de tampão de citrato ou tampão de acetato (pH 2 a

6) 40 ml

Em uma solução de tratamento, uma quantidade apropriada de contas de aço inoxidável foi adicionada juntamente com cada sobrenadante de cultura.

Tabela 4

Perfil de pH de cepa expressa por PPCE

Tampão, pH PPCE EG Ill Atividade de lavagem (%) Atividade de lavagem (%) Citrato, pH 2 85 25 Citrato, pH 3 100 45 Citrato, pH 4 90 100 Citrato, pH 4 90 90 Acetato, pH 5 30 55 Acetato, pH 6 10 ou menos 10 Exemplo 8: Expressão, de gene de PPCE otimizado por códon em Trichoderma viride

(1) Clonagem de gene de PPCE otimizado por códon

Um gene de PPCE que consiste apenas em códons altamente usados no gênero Trichoderma foi sintetizado através de reações de PCR.

a) Preparação de fragmento de PCEM1-2

Dois oligonucleotídeos sintéticos tendo as seqüências seguintes foram preparados. PCEM-1:

CCàGGCCTGCGCAT CAf GMGCTGACC7T CC í SCT GAACCTGGC CGfCGCCG CCAÇCGCC ^GCASAGCCIfÔTGCaÇCCAGTACAGCAGCTACAC (SEQ ID KO: 24}

?CEM-2;

rGSCXGC CGCTGC CGCTGC T CffCGC CCCACAQGrTT 3TTGTTSACGCTGTACTGGC CGCTG QTGTilGCTGCTGfMGGCf CSSO ID KOi 15) Uma reação de PCR foi realizada usando 20 pmol dos iniciadores anteriores (PCEM-1 e PCEM-2) e Primestar MAX DNA POLYMERASE (Takara)1 na ausência de um padrão, repetindo-se um ciclo que consiste em uma reação a 98°C durante 10 segundos, uma reação a 55°C durante 5 segundos, e uma reação a 72°C durante 30 segundos 30 ve5 zes. O ADN resultante foi purificado a partir do líquido de reação usando um QIAQUICK PCR PURIFICATION KIT (Xiagen), e eluído em 50 μΐ de um tampão de TE, de acordo com as condições descritas no manual associado a estas. O fragmento de ADN resultante de aproximadamente 150 bp foi designado PCEM1-2.

b) Preparação de fragmento de PCEM3-4

0 Dois oligonucleotídeos sintéticos tendo as seguintes seqüências foram preparados.

PCEM-3:

AGCAGC GGCAGCdfèCAGCCAGTGCACCTACGTCA^CAGCATC&GCAGCAGCGGCGTCAGC

TGG&GCACCACCTGGaACÍG (SEQ ID NO: 1<>)

PCSM-4 í

TTSGTCAGGCCGeTa^GCTGGCTGTTGSCGTAGC^CTTGACGCTGGTGCTGCeGCCGCTC

CAGXTCCÃGGTGGTGCTCCA (SEQ ID UO: Γ’)

Uma reação de PCR usando 20 pmol dos iniciadores anteriores (PCEM-3 e PCEM4) foi realizada na ausência de um padrão, e o fragmento resultante foi purificado, de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 8 (1) a). O fragmento de ADN resultante de aproximadamente 140 bp foi designado PCEM3-4.

c) Preparação de fragmento de PCEM5-6

Dois oligonucleotídeos sintéticos tendo as seguintes seqüências foram preparados.

PCEM-5:

í^GCIGAGCGGCCTGACCAAQAAGCTGGTCAGCAACCTSCAGAGCATCCCCACCAGCGTC

CAGfGGAGCfACAGCAACAC {SEQ, ID MO: 18)

2CEM-S:

GTSRCSTeeTTGAriTCGGCGGCGGTGSACASCTCSTafiCTaACSTCeeCGAafiATGTTG

G XSITGCTGTAGCTCCACTG {SEQ ID MO: Idt

Uma reação de PCR usando 20 pmol dos iniciadores anteriores (PCEM-5 e PCEM

1 6) foi realizada na ausência de um padrão, e o fragmento resultante foi purificado, de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 8(1 )a). O fragmento de ADN resultante de aproximadamente 140 bp foi designado PCEM5.6.

d) Preparação de fragmento de PCEM7-8

Dois oligonucleotídeos sintéticos tendo as seguintes seqüências foram preparados.

PCEM-7: FCSM-7í

GCCGACATCMCCACOTCACCTACASCGSCGACTiiCSAGCTGATGATCTGGTAAATATSC CCCCGTCGTAfTTCàAGTAT ÍSEQ ID NO: 20)

PCSM-8:

CAGGGGCTGGGCGCCGCCGTACTTGCCCAGCCTGATATCTTGATTAGCGGGAGATGTCTC ATACTTGAfeATACGfACGGGG <SSQ ID MO: 21J

Uma reação de PCR usando 20 pmol dos iniciadores anteriores (PCEM-7 e PCEM8) foi realizada na ausência de um padrão, e o fragmento resultante foi purificado, de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 8(1 )a). O fragmento de ADN resultante de aproximadamente 140 bp foi designado PCEM7-8.

e) Preparação do fragmento de PCEM9-10

Dois oligonucieotides sintéticos tendo as seguintes seqüências foram preparados. PCEM-9

ACGGCQGCGC CCAGC C CCTGGGCAGCCAGAICGGC ACCGC CAACG T CGGCGGCGCCACCT GGCAGCTGTGGTACGGCGTC (SSQ ID Wi 22)

)?CEM-10:

GCC STT CCAGCT GGTGGTCT GGCT GCT GGCGACGA, ^GCTGTAGGI CTTC TGGCT GCCGT T GÀCGCCSTACCACAGCTGCC (SEQ ID NO: 231

Uma reação de PCR usando 20 pmol dos iniciadores anteriores (PCEM-9 e PCEM10) foi realizada na ausência de um padrão, e o fragmento resultante foi purificado, de

IO acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 8 (1)a). O fragmento de ADN resultante de aproximadamente 140 bp foi designado PCEM9-10. f) Preparação de fragmento de PCEM11-12

Dois oligonucleotídeos sintéticos que tem as seguintes seqüências foram preparados.

PCEM-11

AGACCACCAGCTGGAACGGCGACATCCTGCAGTT-TTCAAGTACCTGCAGAGCAACCaGG GCTTCCCCGCCAGCAGCCAG |SEQ ID NO; 2Í)

PCEM-13:

AT CATOTCAôATACAAGQAGTC3?ATAGSAACAG3t ^ASGGTCATGGCTTACCGATCAGGTA CTGGCTSCTGGCGGGGAAGC íSêÔ ID mi 2.5Ϊ

Uma reação de PCR usando 20 pmol dos iniciadores anteriores (PCEM-11 e PCEMA-12) foi realizada na ausência de um padrão, e o fragmento resultante foi purificado, de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 8(1 )a). O fragmento de ADN resultante de aproximadamente 140 bp foi designado PCEM11-12.

!0 g) Preparação de fragmento de PCEM13-14

Dois oligonucleotídeos sintéticos que têm as seguintes seqüências foram preparados. PCEM-13:

^rCCTTGrATCTSACA Σ'CaTTG CJTTCGGTATCAGfi CCTSCAGTTCGGGACCGAGCCCTTC ACCG3CA3CCAGACCACCCT (SEQ ID HO; 26}

PC3M

14:CCCTCGAQCTAGTíGACQCTGGCGCTCCAGTGGTTSACGGTCAGGGTGGTCTGGCTG

CCGGT ÍSEQ ID NO: 271

Uma reação de PCR usando 20 pmol dos iniciadores anteriores (PCEM-13 e PCEM-14) foi realizada na ausência de um padrão, e o fragmento resultante foi purificado, de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 8(1 )a). O fragmento de ADN resultante de aproximadamente 120 bp foi designado PCEM13-14. h) Preparação de fragmento de PCEM1-4

Uma segunda reação de PCR foi realizada usando 1 μΙ_ de PCEM1-2 obtido no Exemplo 8(1 )a) e 1 μί de PCEM3-4 obtido no Exemplo 8(1 )b) como padrões, 20 pmol dos iniciadores anteriores (PCEM-1 e PCEM-4), e Prianestar MAX DNA POLIMERASE (Takara), 10 repetindo-se um ciclo que consiste em uma reação a 98°C durante 10 segundos, uma reação a 55°C durante 5 segundos, e uma reação a 72°C durante 30 segundos 30 vezes. O ADN resultante foi purificado a partir do líquido de reação usando um QIAQUICK PCR PURIFICATION KIT (Xiagen), e eluído em 50 μ!_ de um tampão de TE. O fragmento de ADN resultante e aproximadamente 270 bp foi designado PCEM1-4.

i) Preparação de fragmento de PCEM5-8

Uma segunda reação de PCR foi realizada usando 1 μΙ_ de PCEM5-6 obtido no Exemplo 8(1 )c) e 1 μΙ_ de PCEM7-8 obtido no Exemplo 8(1 )d) como padrões, e 20 pmol dos iniciadores anteriores (PCEM-5 e PCEM-8). Esta reação de PCR e uma purificação do fragmento resultante foram realizadas de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 20 8(1 )h) para designar o fragmento de ADN resultante de aproximadamente 260 bp como PCEM5-8.

j) Preparação de fragmento de PCEM9-12

Uma segunda reação de PCR foi realizada usando 1 μΙ_ de PCEM9-10 obtido no Exemplo 8(1 )e) e 1 μΙ_ de PCEM11-12 obtido no Exemplo 8(1 )f) como padrões, e 20 pmol 25 dos iniciadores anteriores (PCEM-9 e PCEM-12). Esta reação de PCR e uma purificação do fragmento resultante foram realizadas de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 8(1 )h) para designar o fragmento de ADN resultante de aproximadamente 260 bp como PCEM9-12.

k) Preparação de fragmento de PCEM1-8 Uma terceira reação de PCR foi realizada usando 1 μΐ_ de PCEM1-4 obtido no E

xemplo 8(1 )h) e 1 μί de PCEM5-8 obtido no Exemplo 8(1 )i) como padrões, 20 pmol dos iniciadores resultantes (PCEM-1 e PCEM-8), e Primestar MAX DNA POLYMERASE (Takara), repetindo-se um ciclo que consiste em uma reação a 98 0C durante 10 segundos, uma reação a 55 0C durante 5 segundos, e uma reação a 72°C durante 30 segundos 30 vezes. O ADN resultante foi purificado a partir do líquido de reação usando um QIAQUICK PCR PURIFICATION KIT (Xiagen), e eluído em 50 μΙ_ de um tampão de TE. O fragmento de ADN resultante de aproximadamente 510 bp foi designado PCEM1-8.

I) Preparação de fragmento de PCEM9-14

Uma terceira reação de PCR foi realizada usando 1 μΙ_ de PCEM9-12 obtido no Exemplo 8(1 )j; e 1 μί de PCEM13-14 obtido no Exemplo 8(1) g) como padrões, e 20 pmol dos iniciadores anteriores (PCEM-9 e PCEM-14). Esta reação de PCR e uma purificação do frag10 mento resultante foram realizadas de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 8(1 )k) para designar o fragmento de ADN resultante de aproximadamente 360 bp como PCEM9-24.

m) Preparação de plasmídeo pCR-PCEm

Uma quarta reação de PCR foi realizada usando 1 μΐ_ de PCEM1-8 obtido no E15 xemplo 8 (1) k) e 1 μί de PCEM9-14 obtido no Exemplo 8(1 )1) como padrões, e 20 pmol dos iniciadores anteriores (PCEM-1, e PCEM-14), repetindo-se um ciclo que consiste em uma reação a 98°C durante 10 segundos, uma reação a 55°C durante 5 segundos, e uma reação a 72°C durante 30 segundos 30 vezes. A amostra depois que a reação foi submetida à eletroforese de gel de agarose. Um fragmento de gene de 20 aproximadamente 800 bp foi cortado a do gel, purificado usando um QIAQUICK

GEL EXTRACTION KIT (Xiagen), e eluído em 50 μΙ_ de um tampão de TE. Um tampão, dNTPs, e EXTaq (Takara) foram adicionados ao ADN purificado resultante, e incubado a 72°C durante 10 minutos para adicionar as bases A ao ADN. O ADN tratado foi clonado em um vetor TOPO (PCR 2.1-TOPO) usando um TOPO PCR CLONING KIT (Invitrogen) para 25 designar o plasmídeo obtido como pCR-PCEm. pCR-PCEm foi amplificado e purificado de acordo com métodos convencionais, e a seqüência de ADN do mesmo foi analisada de acordo com os procedimentos descritos acima. Como um resultado, foi confirmado que plasmídeo pCR-PCEm não continha apenas a região de codificação (SEQ ID NO: 28) de um gene de PPCE otimizado por códon, mas também o sítio de reconhecimento de Stul a mon30 tante do códon de iniciação e o sítio de reconhecimento de Xhol a jusante do cóon de interrupção.

(2) construção de plasmídeo para expressar PPCE otimizado por códon

Plasmídeo pCR-PCEm foi digerido com enzimas de restrição Stul e Xhol. e a amostra depois que a reação foi submetida à eletroforese de gel de agarose. O fragmento de gene separado de aproximadamente 800 bp foi cortado do gel, e um QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT (Xiagen) foi usado para purificar o ADN.

Plasmídeo pCBI-M2 foi digerido com enzimas de restrição Stul e Xhol. e um fragmento de gene de aproximadamente 5,6 kbp foi coletado e purificado, de uma maneira similar como descrito no Exemplo 5 (2). O fragmento de gene previamente obtido de aproximadamente 800 bp foi ligado a este fragmento de gene de aproximadamente 5,6 kbp usando Ligation High (TOYOBO) para preparar o plasmídeo pPPCE-M.

(3) Preparação de Trichoderma viride foi transformado com com plasmídeo pPPCE

M

Trichoderma viride foi transformado com plasmídeo pPPCE-M obtido no Exemplo 8(2). Isto é, esta transformação foi realizada por um método de co-transformação usando cepa de Trichoderma viride 2 deficiente de um gene para biossíntese de uracila (pyr4) como um hospedeiro e um gene pyr4 de Neurospora crassa como um marcador de seleção, de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 5 (3). Cepa de Trichoderma viride 2 foi transformado com 7 μg de plasmídeo pPPCE-M e 3 μg de plasmídeo pPYR4 para obter 40 cepas de transtormantes.

(4) Cultivo de transformante de Trichoderma viride com plasmídeo pPPCE-M

Dos transformantes obtidos no Exemplo 8 (3), 40 cepas foram inoculadas no meio de PSW descrito no Exemplo 5(4), e cultivadas a 28°C durante 5 dias. Depois do cultivo, os micélios foram removidos através de centrifugação para obter os sobrenadantes de cultura como soluções de enzima cruas. Estas soluções de enzima cruas foram submetidas a SDSPAGE, e foi confirmado que uma proteína de aproximadamente 26 kDa foi especificamente expressada nos transformantes. Além disso, estas soluções de enzima cruas foram usadas para medir a atividade de remoção de penugem das mesmas de acordo com o Exemplo 7 (condições para medida: temperatura = 30°C, tempo = 60 minutos, solução de reação = 5 mmol/L de tampão de citrato, pH 3,0), e foi confirmado que a atividade foi especificamente melhorada nos transformantes por comparação com o hospedeiro transformado.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

A presente invenção é útil para vários tratamentos para celulose, por exemplo, no tratamento de um tecido contendo celulose, desentintação de papel usado, melhoria de uma drenabilidade de água da polpa de papel, melhoria de uma capacidade de digestão de alimento animal, e produção de bioetanol.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência às modalidades específicas, várias mudanças e modificações óbvias por aqueles versados na arte são possíveis sem afastar-se do escopo das reivindicações anexas.

TEXTO LIVRE NA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

Cada seqüência de SEQ ID NOS: 5 a 27 na Listagem de Seqüência é um iniciador para PCR. A seqüência de SEQ ID NO: 2 é um gene otimizado (modificado) por códon. A seqüência de SEQ ID NO: 29 é uma seqüência de aminoácido deduzida do gene otimizado (modificado) por códon.

Claims (26)

1. Proteína, CARACTERIZADA pelo fato de ter as seguintes propriedades (a), (b), e (c): (a) derivada de Penicillium pinophilum. (b) ter uma atividade da endoglucanase, e (c) ter no N-terminal da mesma (1) a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, ou (2) uma seqüência de aminoácido na qual um aminoácido é deletado, substituído ou adicionado na seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

2. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de ter a seguinte propriedade (d): (d) ter um peso molecular médio de 25 kDa a 27 kDa, determinado por um dodecil sulfato de sódio-eletroforese de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

3. Proteína, CARACTERIZADA pelo fato ser selecionada a partir do grupo consistindo das seguintes proteínas (e) a (i): (e) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido consistindo de aminoácidos 16-236 de SEQ ID NO: 4, (f) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido consistindo de aminoácidos 1-236 de SEQ ID NO: 4, (g) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 30, (h) uma proteína modificada compreendendo uma seqüência de aminoácido em que um ou aminoácidos plurais são deletados, substituídos, adicionados e/ou modificados na seqüência de aminoácido consistindo em 16-236 aminoácidos ou 1-236 de SEQ ID NO: 4, e tendo uma atividade da endoglucanase, e (i) uma proteína homóloga compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo uma homologia de 90% ou mais com a seqüência de aminoácido consistindo em 16-236 aminoácidos ou 1-236 de SEQ ID NO: 4 ou com a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:30, e tendo uma atividade da endoglucanase.

4. Polinucleotídeo, CARACTERIZADO pelo fato de codificar a proteína, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Polinucleotídeo, CARACTERIZADA pelo fato de ser selecionado a partir dos seguintes (j) ou (k): (j) um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 3 ou 28, ou a seqüência de nucleotídeo consistindo em nucleotídeos 46-834 de SEQ ID NO: 3 ou 28, ou (k) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo em que um ou nucleotídeos plurais são deletados, substituídos e/ou adicionados na seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 3 ou 28 ou a seqüência de nucleotídeo consistindo em 46-834 nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou 28, e codificando uma proteína tendo uma atividade da endoglucanase.

6.Vetor de expressão, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 4 ou 5.

7. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de ser transformada com o vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 6.

8. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato do hospedeiro ser uma levedura ou um fungo filamentoso.

9. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fa10 to do fungo filamentoso ser um microorganismo que pertence ao gênero Trichoderma. Humicola. Asperaillus. Acremonium. ou Penicillium.

10. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato do fungo filamentoso ser um microorganismo que pertence ao gênero Trichoderma.

11. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato do fungo filamentoso ser Trichoderma viride.

12. Processo para produzir a proteína, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: cultivar as células hospedeiras, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 11, e coletar a proteína das células hospedeiras ou uma cultura obtida pelo cultivo.

13. Proteína, CARACTERIZADA pelo fato de ser produzida pelo processo conforme definido na reivindicação 12.

14. Preparação de celulase, CARACTERIZADA pelo fato de compreender a proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 13.

15. Composição detergente, CARACTERIZADA pelo fato de compreender a proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 13 ou a preparação de celulase conforme definida na reivindicação 14.

16. Método de tratar um tecido contendo celulose, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a etapa de trazer o tecido contendo celulose em contato com a proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 13, a preparação de celulase conforme definida na reivindicação 14, ou a composição detergente conforme definida na reivindicação 15.

17. Método de reduzir o peso para melhorar a sensação de toque e o aparecimento de um tecido contendo celulose, CARACTERIZADA pelo fato de compreender a etapa de trazer o tecido contendo celulose em contato com a proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 13, a preparação de celulase conforme definida na reivindicação 14, ou a composição detergente conforme definida na reivindicação 15.

18. Método de fornecer uma mudança de cor localizada a um tecido contendo celulose colorido, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a etapa de trazer o tecido contendo celulose colorido em contato com a proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 13, a preparação de celulase conforme definida na reivindicação 14, ou a composição detergente conforme definida na reivindicação 15.

19. Método de clarificação de cor de um tecido contendo celulose colorido, CARACTERIZADO pelo fato de que compreender a etapa de trazer o tecido contendo celulose colorido em contato com a proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 13, a preparação de celulase conforme definida na reivindicação14, ou a composição detergente conforme definida na reivindicação 15.

20. Método de reduzir a aparência felpuda de um tecido contendo celulose ou reduzir uma taxa da formação de penugem, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a etapa de trazer o tecido contendo celulose em contato com a proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 13, a preparação de celulase conforme definida na reivindicação 14, ou a composição detergente conforme definida na reivindicação 15.

21. Método de reduzir a dureza de um tecido contendo celulose ou reduzir uma taxa da formação de dureza, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a etapa de trazer o tecido contendo celulose em contato com a proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 13, a preparação de celulase conforme definida na reivindicação14, ou a composição detergente conforme definida na reivindicação 15.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, CARACTERIZADO pelo fato da etapa de contatação do tecido com a composição detergente ser realizada por embebimento, lavagem ou enxágüe do tecido.

23. Método de extrair tinta papel usado, CARACTERIZADO pelo fato de ser através do uso da proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a3 e 13 ou a preparação de celulase conforme definida na reivindicação 14, no processo de tratar o papel usado junto com um agente de extração de tinta.

24. Método de melhorar uma drenabilidade de água da polpa de papel, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a etapa de tratar a polpa de papel com a proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 13, ou a preparação de celulase conforme definida na reivindicação 14.

25. Método de melhorar uma capacidade de digestão de alimento animal, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a etapa de tratar o alimento animal com a proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 13 ou a preparação de celulase conforme definida na reivindicação 14.

26. Método de produzir etanol de biomassa através de digestão e sacarificação de uma substância com base em celulose, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a etapa de tratar a substância com base em celulose com a proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 13 ou a preparação de celulase conforme definida na reivindicação 14.