ES2556728T3

ES2556728T3 - Endoglucanasa PPCE y preparación de celulasa que contiene la misma

Info

Publication number: ES2556728T3
Application number: ES08721927.5T
Authority: ES
Inventors: Tatsuki Moriya; Akitaka Nakane; Goh Tsujiuchi; Takayoshi Fukushima
Original assignee: Meiji Seika Pharma Co Ltd
Current assignee: Meiji Seika Pharma Co Ltd
Priority date: 2007-03-12
Filing date: 2008-03-12
Publication date: 2016-01-19
Anticipated expiration: 2028-03-12
Also published as: EP2135944A4; BRPI0808461A2; CN101679965A; US8257955B2; CN101679965B; WO2008111613A1; US20100098807A1; JP5193997B2; CN103451170A; CA2680656C; EP2135944B1; DK2135944T3; EP2135944A1; CA2680656A1; JPWO2008111613A1

Abstract

Una proteína que tiene actividad endoglucanasa seleccionada entre el grupo que consiste en las siguientes proteínas (e) a (h): (e) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 16-236 de la SEC ID Nº 4, (f) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1-236 de la SEC ID Nº 4, (g) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 30, (h) una proteína modificada que comprende una secuencia de aminoácidos en que 1 a 20 aminoácidos están delecionados, sustituidos, añadidos y/o modificados en la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 16-236 o 1-236 de la SEC ID Nº 4.

Description

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aminoácidos que consiste en los aminoácidos 16-236 o 1-236 de la SEC ID Nº 4 o con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 30, y que tiene actividad endoglucanasa. La homología como se usa en el presente documento se muestra como un valor calculado por un software disponible en el mercado de procesamiento de información genética GENETYX (GENETYX Corporation), de acuerdo con parámetros por defecto en un programa de búsqueda de homología.

Parámetros por defecto:

Tamaño unitario a comparar = 2

Lugar de recogida = 1

Polinucleótido que codifica proteína que tiene actividad endoglucanasa

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan polinucleótidos que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 4 o una secuencia parcial de la misma, o una proteína modificada de la misma. Cuando se da la secuencia de aminoácidos de una proteína, puede seleccionarse fácilmente una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos, y por tanto pueden seleccionarse diversas secuencias de nucleótidos que codifican la proteína de la presente invención. El término "polinucleótido" como se usa en el presente documento incluye ADN y ARN, y es preferible ADN.

Típicamente, el polinucleótido de la presente invención puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 o 28 (o una secuencia parcial de la misma), y (b) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos en que una o múltiples nucleótidos están delecionados, sustituidos, y/o añadidos en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 o 28 (o una secuencia parcial de la misma), y que codifica una proteína que tiene actividad endoglucanasa.

Ejemplos del polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 o una secuencia parcial de la misma incluyen un polinucleótido que la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1-834 de la SEC ID Nº 3, y un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 46-834 de la SEC ID Nº 3.

El polinucleótido de la presente invención incluye un polinucleótido de origen natural. Además, puede sintetizarse la totalidad. Además, la síntesis puede realizarse usando parte del polinucleótido de origen natural. Típicamente, el polinucleótido de la presente invención puede obtenerse realizando una reacción de PCR usando ADN genómico de Penicillium pinophilum como un molde. Además, el polinucleótido de la presente invención puede obtenerse de acuerdo con un procedimiento habitual comúnmente usado en ingeniería genética, por ejemplo, preparando una biblioteca de ADN genómico y explorando la biblioteca usando una sonda de ADN apropiada diseñada en base a la información de una secuencia parcial de aminoácidos.

En la presente invención, una secuencia típica de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la endoglucanasa PPCE tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3. La secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 tiene una fase de lectura abierta desde el codón ATG en la 1ª a 3ª posición hasta el codón TAG en la 832ª a 834ª posición y dos intrones en la 411ª a 469ª y 691ª a 754ª posición. La secuencia de nucleótidos en las 46ª a 48ª posición corresponde al aminoácido N-terminal de una proteína madura de la endoglucanasa PPCE que consiste en 221 restos de aminoácido.

Vector de expresión y transformante

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 4 o una secuencia parcial de la misma, o una proteína modificada (a partir de ahora mencionada como el polinucleótido de la presente invención) de modo que el polinucleótido pueda replicarse y la proteína codificada por el polinucleótido puede expresarse en un microorganismo huésped. El vector de expresión de la presente invención puede construirse en base a un vector de auto-replicación (tal como un plásmido), que existe como elemento extra-cromosómico y puede replicarse independientemente de la replicación de los cromosomas. Como alternativa, el vector de expresión de la presente invención puede ser un vector que se integra en el genoma del microorganismo huésped y se replica junto con los cromosomas, cuando el huésped se transforma con el vector. La construcción del vector de la presente invención puede realizarse por procesos o procedimientos habituales comúnmente usados en ingeniería genética. Para expresar una proteína que tiene una actividad deseada por transformación de un microorganismo huésped con el vector de expresión de la presente invención, es preferible que el vector de expresión contenga, por ejemplo, un polinucleótido capaz de controlar la expresión, además del polinucleótido de la presente invención. Como polinucleótido capaz de controlar la expresión, por ejemplo, puede usarse un promotor, un terminador, o un polinucleótido que codifica un péptido señal, en la presente invención. El promotor que puede usarse en la presente invención no está particularmente limitado, siempre que muestre una actividad transcripcional en un microorganismo huésped. El promotor puede obtenerse como un polinucleótido que controla la expresión de un gen que codifica una proteína igual o diferente de la derivada del microorganismo huésped.

El péptido señal no está particularmente limitado, siempre que contribuya a la secreción de la proteína en un

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microorganismo huésped. El péptido señal puede obtenerse como un polinucleótido derivado de un gen que codifica una proteína igual o diferente de la derivada del microorganismo huésped.

El vector de expresión de la presente invención puede contener un marcador genético para seleccionar un transformante obtenido por introducción del vector de expresión en un microorganismo huésped. El marcador genético puede seleccionarse apropiadamente de acuerdo con el procedimiento para seleccionar un transformante. Como marcador genético, por ejemplo, puede usarse un gen de resistencia a fármacos o un gen que complementa una mutación auxotrófica en la presente invención.

El marcador genético puede insertarse en un vector diferente al vector de expresión, y este vector que contiene el marcador genético puede mezclarse con el vector de expresión para transformar un huésped con estos vectores simultáneamente (también llamado co-transformación). De acuerdo con la presente invención, se proporciona un microorganismo transformado con el vector de expresión. No está particularmente limitado el sistema huéspedvector que puede usarse en la presente invención. Por ejemplo, puede usarse un sistema que utiliza E. coli, Actinomices, levaduras, u hongos filamentosos, o un sistema para la expresión de una proteína de fusión usando dicho microorganismo. La transformación de un microorganismo con el vector de expresión puede realizarse de acuerdo con un procedimiento habitual.

En la presente invención, el transformante de la presente invención se cultiva, y el transformante resultante o cultivo se usa para obtener la proteína de la presente invención. De acuerdo con otra realización de la presente invención, puede proporcionarse el proceso para producir la nueva proteína de la presente invención. El cultivo del transformante (incluyendo condiciones de cultivo) puede realizarse de un modo sustancialmente similar al de un huésped original usado para preparar el transformante.

Como procedimiento para recuperar la proteína de interés después del cultivo del transformante, pueden realizarse procedimientos habitualmente usados. Como proceso preferible para producir la nueva proteína de la presente invención, se proporciona un procedimiento para expresar la proteína en un hongo filamentoso que pertenece a Hyphomycetes. Como hongo filamentoso preferible que puede usarse como huésped en la presente invención, pueden mencionarse, por ejemplo, hongos filamentosos que pertenecen al género Trichoderma, Humicola, Aspergillus, Acremonium, o Penicillium, más preferentemente Trichoderma o Humicola. Más particularmente, pueden mencionarse, por ejemplo, Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Humicola insolens, Humicola thermoidea, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Acremonium cellulolyticus, o Penicillium pinophilum, preferentemente Trichoderma viride o Humicola insolens.

Uso de celulasa/preparación de celulasa

La presente invención se refiere a una preparación de celulasa que comprende la proteína de la presente invención (por ejemplo, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 4 o una secuencia parcial de la misma, una proteína modificada de la misma, o una proteína que se puede obtener por cultivo de la célula huésped de la presente invención).

Convencionalmente, la preparación de celulasa puede contener, por ejemplo, cargas (por ejemplo, lactosa, cloruro sódico, o sorbitol), antisépticos, y/o tensioactivos no iónicos, además de la enzima celulasa. La forma de la preparación de celulasa puede ser sólida o líquida, tal como polvo, particulado, gránulo, gránulo que no produce polvo, o formulación líquida. Además de la proteína de la presente invención, la preparación de celulasa de la presente invención puede contener otras enzimas celulasa, tales como celobiohidrolasa, -glucosidasa, y/o endoglucanasa diferente a la endoglucanasa de la presente invención. El gránulo que no produce polvo (preferentemente un gránulo que no tiene propiedades de pulverización), es decir una forma de preparación de celulasa, puede producirse de acuerdo con el procedimiento habitual de granulación en seco. Es decir, se mezcla una proteína en polvo de la presente invención con una o múltiples sustancias seleccionadas entre el grupo que comprende sales inorgánicas (tales como sulfato sódico o cloruro sódico), minerales (tales como bentonita o montmorillonita), y sustancias orgánicas (tales como almidón o celulosa molida). Después de ello, los polvos o la suspensión finamente suspendida de uno o múltiples tensioactivos no iónicos se añaden a la mezcla, y después el producto obtenido se mezcla completamente o amasa. Dependiendo de la situación, se añade opcionalmente un polímero sintético (tal como polietilenglicol) o un polímero natural (tal como almidón), que une sólidos, a la mezcla y se amasa adicionalmente. Después de ello, se realiza granulación mediante molde o por extrusión, usando, por ejemplo, un disco pelleter, y el material moldeado obtenido después se convierte en una forma esférica usando un marumerizador seguido por secado, de modo que puedan producirse gránulos que no producen polvo. La cantidad de uno o múltiples tensioactivos no iónicos no está particularmente limitada, y es preferentemente del 0,1 al 50% en peso, más preferentemente del 0,1 al 30% en peso, mucho más preferentemente del 1 al 10% en peso del peso total de la preparación de celulasa de presente invención. También es posible recubrir la superficie de los gránulos con un polímero o similar para controlar la penetración de oxígeno o agua. Además, la preparación líquida, que es una de las preparaciones de celulasa (preferentemente un líquido estabilizado), puede prepararse mezclando un estabilizante de endoglucanasa (tal como un polímero sintético o natural) con una solución que contiene la proteína de la presente invención y, si fuera necesario, añadiendo sales inorgánicas y/o un conservante sintético.

En este caso, puede mezclarse uno o múltiples tensioactivos no iónicos con la preparación líquida. La cantidad del

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uno o múltiples tensioactivos no iónicos no está particularmente limitada, y preferentemente del 0,1 al 50% en peso, más preferentemente del 0,1 al 30% en peso, mucho más preferentemente del 1 al 10% en peso del peso total de la preparación de celulasa de presente invención. Además, la presente invención proporciona una composición detergente que comprende la proteína de la presente invención o la preparación de celulasa de la presente invención. La composición detergente de la presente invención también puede comprender tensioactivos, que pueden ser aniónicos, no iónicos, catiónicos, anfotéricos, o zwitteriónicos, o una mezcla de los mismos. La composición detergente puede comprender otras composiciones detergentes conocidas en la técnica, por ejemplo, un aditivo, lejía, agente blanqueante, inhibidor de manchas, secuestrante, polímero liberador de suciedad, aroma, otras enzimas (tales como proteasa, lipasa, o amilasa), estabilizante para enzimas, granulante, abrillantador óptico, y/o agente espumante. Como tensioactivos aniónicos típicos, pueden mencionarse, por ejemplo, alquil benzeno sulfonato lineal (LAS), alquil sulfato (AS), sulfonato de -olefina (AOS), sulfonato de polioxietilen alquiléter (AES), sulfo éster de ácido graso (-SFMe), o sales de metales alcalinos de ácido graso de origen natural. Como tensioactivos no iónicos, pueden mencionarse, por ejemplo, polioxietilen alquil éter (AE), alquilpolietilenglicol éter, nonilfenol polietilenglicol éter, etoxilato de éster metílico de ácido graso, sacarosa, o éster de ácido graso de glucosa, o ésteres de alquilglucósido o alquilglucósido polietoxilado.

El procedimiento de la presente invención para tratar un tejido que contiene celulosa se realiza poniendo el tejido que contiene celulosa en contacto con la proteína de la presente invención, la preparación de celulasa de la presente invención, o la composición detergente de la invención. Pueden mejorarse las siguientes propiedades del tejido que contiene celulosa mediante el procedimiento de la presente invención:

(1): Mejora de la sensación al tacto y aspecto de un tejido reduciendo el peso;

(2): Proporcionar un cambio de color localizado a un tejido que contiene celulosa coloreada, es decir, proporcionar un aspecto tipo lavado a la piedra y textura a un tejido que contiene celulosa coloreada, típicamente tejido vaquero;

(3): Aclaramiento del color de un tejido que contiene celulosa coloreada;

(4): Flexibilización de un tejido (reducción de la tasa de rigidez, y una reducción de la rigidez); y

(5): Eliminación de pelusas (reducción de la tasa de la formación de pelusas, y reducción de pelusas).

Más particularmente, el procedimiento de la presente invención puede realizarse añadiendo a la proteína de la presente invención, la preparación de celulasa de la presente invención, o la composición detergente de la presente invención en agua en que un tejido se empapa o empapará, por ejemplo, durante el remojo, lavado, o aclarado de un tejido. Las condiciones tales como temperatura de contacto o la cantidad de la proteína, la preparación de celulasa, o la composición de celulasa a añadir pueden determinarse apropiadamente de acuerdo con otras diversas condiciones. Por ejemplo, para la mejora de la sensación al tacto y el aspecto de un tejido que contiene celulosa reduciendo el peso, la proteína, la preparación de celulasa, o la composición detergente en una concentración de proteína de 0,1 a 50 mg/l se usa preferentemente a una temperatura de aproximadamente 10 a 60ºC. Para proporcionar un cambio de color localizado a un tejido que contiene celulosa coloreada, la proteína, la preparación de celulasa, o la composición detergente en una concentración de proteína de 0,1 a 100 mg/l se usa preferentemente a una temperatura de aproximadamente 20 a 60ºC. Para aclaramiento del color de un tejido que contiene celulosa coloreada, la proteína, la preparación de celulasa, o la composición detergente en una concentración de proteína de 0,01 a 20 mg/l se usa preferentemente a una temperatura de aproximadamente 10 a 60ºC. Para reducir la rigidez de un tejido que contiene celulosa o reducir la tasa de la formación de rigidez, la proteína, la preparación de celulasa, o la composición detergente en una concentración de proteína de 0,01 a 20 mg/l se usa preferentemente a una temperatura de aproximadamente 10 a 60ºC. Para la reducción de pelusas de un tejido que contiene celulosa o la reducción de la tasa de la formación de pelusas, la proteína, la preparación de celulasa, o la composición detergente en una concentración de proteína de 0,01 a 20 mg/l se usa preferentemente a una temperatura de aproximadamente 10 a 60ºC.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para destintar papel de desecho, caracterizado por el uso de la proteína de la presente invención o la preparación de celulasa de la presente invención, en el proceso para tratar el papel de desecho junto con un agente de destintado. La proteína o la preparación de celulasa de la presente invención es útil en el proceso para producir papel reciclado a partir de papel de desecho, ya que puede mejorarse la eficacia del destintado haciendo reaccionar el papel de desecho con la misma. De acuerdo con el procedimiento de destintado, la blancura del papel de desecho puede mejorarse de forma notable reduciendo las fibras con tinta residual. El agente de destintado no está particularmente limitado, siempre que sea un agente que pueda usarse en destintar papel de desecho en general. Como agente de destintado, pueden mencionarse, por ejemplo, álcalis (tales como hidróxido sódico o carbonato sódico), silicato sódico, peróxido de hidrógeno, fosfatos, tensioactivos aniónicos

o no iónicos, aceptores tales como ácido oleico, y agentes auxiliares tal como un estabilizante del pH, un agente quelante, o un agente de dispersión. El papel de desecho que puede tratarse mediante el procedimiento de destintado no está particularmente limitado, siempre que sea papel de desecho común. Como papel de desecho, pueden mencionarse, periódicos usados, revistas usadas, y papel usado impreso de grado bajo a medio que comprende pulpa mecánica y pulpa química; papel sin madera usado que compren de pulpa química; o papel de desecho impreso del mismo tal como papel de revestimiento. Un papel diferente al papel de desecho común puede tratarse mediante el procedimiento de destintado, siempre que deposite tinta.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para mejorar la liberación de agua de pulpa de papel,

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que comprende el proceso de tratar una pulpa de papel con la proteína de la presente invención o la preparación de celulasa de la presente invención. De acuerdo con el procedimiento, se considera que este procedimiento puede mejorar significativamente la liberación de agua de pulpa de papel, sin disminución seria de la resistencia. Una pulpa de papel que puede tratarse por el procedimiento no está particularmente limitada, pero pueden mencionarse, por ejemplo, pulpa de papel de desecho, pulpa cartón reciclado, pulpa kraft, pulpa de sulfito, pulpa de tratamiento termomecánico, y otra pulpa de alto rendimiento.

La presente invención se refiere a un procedimiento para mejorar la digestibilidad de pienso animal, que comprende la etapa de tratar el pienso animal con la proteína de la presente invención o la preparación de celulasa de la presente invención. De acuerdo con este procedimiento, puede mejorarse la digestibilidad de pienso animal por digestión del glucano en el pienso animal en moléculas apropiadas que tengan un peso molecular bajo. Además, puede mejorarse la digestibilidad del glucano en pienso animal usando la proteína de la presente invención en pienso animal. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para mejorar la digestibilidad de pienso animal que comprende la etapa de tratar el pienso animal con la proteína de la presente invención o la preparación de celulasa de la presente invención.

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir etanol de biomasa, que comprende la etapa de tratar una sustancia basada en celulosa (tal como fibras de celulosa) con la proteína o la preparación de celulasa de la presente invención. De acuerdo con el procedimiento, la sustancia basada en celulosa puede digerirse y sacarificarse tratando la sustancia con la proteína de la presente invención, para producir glucosa. La glucosa resultante puede convertirse en etanol de biomasa mediante técnicas de fermentación usando otros microorganismos tales como levaduras.

Deposición de microorganismos

Penicillium pinophilum PF1365, de la que se obtuvo la endoglucanasa PPCE de la presente invención, se depositó internacionalmente en el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) el 7 de febrero de 2007, y el número de depósito internacional es FERM BP-10780.

Escherichia coli JM109/p28FULL18 de la presente invención, es decir, Escherichia coli JM109 transformada con el plásmido p28FULL18 obtenida por inserción del gen de PPCE en el plásmido PCR 2.1-TOPO, se depositó internacionalmente en el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) el 7 de febrero de 2007, y el número de depósito internacional es FERM BP-10781.

Trichoderma viride MC300-1, que puede usarse como huésped para el vector de expresión de la presente invención, de depositó de forma local (originalmente) en el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) el 9 de septiembre de 1996, y se transfirió a un depósito internacional el 11 de agosto de 1997. El número de depósito internacional (un número en paréntesis [] después del número de depósito internacional es un número de depósito local) es FERM BP-6047 [FERM P-15842].

Ejemplos

La presente invención se ilustrará ahora adicionalmente mediante el siguiente Ejemplo, aunque sin limitarse en absoluto al mismo.

Ejemplo 1: Aislamiento y purificación del componente que tiene actividad para eliminar las pelusas de algodón coloreado a partir de Penicillium pinophilum PF1365

Penicillium pinophilum PF1365 se cultivó en un medio TS (almidón soluble al 2,0%, glucosa al 1,0%, polipeptona al 0,5%, germen de trigo al 0,6%, extracto de levadura al 0,3%, torta de soja al 0,2%, carbonato de calcio al 0,2%, pH 7,0) a 25ºC en agitación. Después de cultivo durante 24 horas, el hongo se inoculó en un medio (N) (avicel al 5,0%, extracto de levadura al 2,0%, polipeptona al 0,1%, sulfato de magnesio al 0,03%, pH 6,8), y se cultivó adicionalmente a 25ºC durante 5 días. Se retiraron los micelios del cultivo para obtener un sobrenadante de cultivo como una solución en bruto de preparación de celulasa. Se añadió sulfato de amonio a la solución en bruto de preparación de celulasa de modo que la concentración final de sulfato de amonio en la solución llegara a ser de 1,2 mol/l. La solución se aplicó a una columna de Fenil HP HiTrap™ (GE Healthcare Bio-Sciences) equilibrada con un tampón acetato sódico 50 mM (pH 5) que contenía 1,2 mol/l de sulfato de amonio, y se eluyó mediante un procedimiento de elución por etapas usando 1,2 mol/l, 0,96 mol/l, 0,72 mol/l, 0,48 mol/l, 0,24 mol/l, y 0 mol/l de sulfato de amonio en un tampón acetato sódico de 50 mmol/l (pH 5), para recoger las fracciones. La fracción eluida a una concentración de sulfato de amonio de 0,24 mol/l mostró una actividad de eliminación de pelusas de un tejido de algodón coloreado. La actividad de eliminación de pelusas de un tejido de algodón coloreado se evaluó por el siguiente procedimiento. Se trataron tejidos tricotados de algodón teñidos de azul en una lavadora grande para generar pelusas. Los tejidos tricotados de algodón azul con pelusas se trataron en las siguientes condiciones para la eliminación de pelusas y se evaluó la actividad de eliminación de pelusas, juzgando el grado de pelusas eliminadas de los tejidos después del tratamiento en base a una inspección visual.

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Ejemplo 3: Amplificación por PCR del gen de la endoglucanasa PPCE

Como la secuencia de aminoácidos N-terminal de PPCE tenía homología con la de endoglucanasa III derivada de Penicillium verruculosum que pertenece a la familia 12, se intentó amplificar un gen de endoglucanasa PPCE derivado de Penicillium pinophilum PF1365 por PCR en base a la secuencia de nucleótidos de EG III descrita en el documento RU 2238974.

(1): Aislamiento de ADN cromosómico derivado de Penicillium pinophilum PF1365

Penicillium pinophilum PF1365 se cultivó en el medio TS a 28ºC durante 24 horas, y se centrifugó para recoger los micelios. Se usó un kit (ISOPLANT; Nippon Gene Co., Ltd.) para extraer el ADN cromosómico de los micelios obtenidos. La extracción se realizó de acuerdo con las condiciones descritas en el manual adjunto al mismo.

(2): Amplificación de fragmento génico de endoglucanasa de la familia 12 derivada de Penicillium pinophilum PF1365 por PCR

Se prepararon cebadores sintéticos que tenían las siguiente secuencias en base a las secuencias de aminoácidos N-terminal y C-terminal de la endoglucanasa III derivada de Penicillium verruculosum.

MSW-N: CAACAGAGTCTATGCGCTCAATACTCGAGCTACACCAGT (SEC ID Nº 5)

MSW-C: CTAATTGACAGCTGCAGACCAA (SEC ID Nº 6)

Se realizó una reacción de PCR usando los cebadores anteriores (MSW-N, MSW-C), el ADN cromosómico preparado en el Ejemplo 3(1) como molde, y un kit LA PCR™ Kit Ver2.1 (Takara Bio). Esta reacción de PCR se realizó realizando una reacción a 94ºC durante 1 minuto, repitiendo un ciclo que consiste en una reacción a 94ºC durante 30 segundos, una reacción a 60ºC durante 30 segundos, y una reacción a 72ºC durante 1 minuto 20 veces, y realizando una reacción a 72ºC durante 10 minutos. El líquido de reacción resultante se sometió a electroforesis en gel de agarosa. Como resultado, se confirmó que se amplificaba un fragmento génico de aproximadamente 0,8 kpb, y por tanto, se intentó clonar este fragmento para determinar la secuencia de nucleótidos del mismo. El fragmento génico de aproximadamente 0,8 kpb, que se aisló por electroforesis en gel de agarosa, se escindió del gel, y se usó un sistema Wizard SVGel y PCR Clean-Up (Promega) para purificar el ADN. La purificación se realizó de acuerdo con las condiciones descritas en el manual adjunto al mismo. El ADN purificado resultante de aproximadamente 0,8 kpb se clonó en un vector TOPO (PCR 2.1-TOPO) usando un kit de clonación TOPO TA (Invitrogen). El plásmido resultante se amplificó y extrajo para determinar la secuencia de ADN del mismo de acuerdo con procedimientos convencionales. Esta extracción del plásmido se realizó usando un kit QIAfilter Plasmid (Xiagen) de acuerdo con las condiciones descritas en el manual adjunto al mismo. La secuencia de nucleótidos del ADN se determinó mediante una reacción usando un kit dRhodamine Terminator (Applied Biosystems) y el cebador universal M13 o un cebador Inv (Inverso) que tiene la siguiente secuencia como cebador. Rev: CAGGAAACAGCTATGAC (SEC ID Nº 7)

Esta reacción se realizó de acuerdo con las condiciones descritas en el manual adjunto al mismo. El líquido de reacción resultante se purificó de acuerdo con las condiciones descritas en el manual adjunto al mismo, y se analizó usando un analizador genético ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). Como resultado, el fragmento génico amplificado por PCR era un gen que tenía homología con la endoglucanasa III derivada de Penicillium verruculosum.

Ejemplo 4: Clonación de fragmento génico de endoglucanasa de la familia 12 derivada de Penicillium pinophilum PF1365 por paseo genómico

Se intentó amplificar las regiones cadena arriba y cadena abajo del fragmento génico amplificado por PCR de la endoglucanasa de la familia 12 derivada de Penicillium pinophilum PF1365 usando un kit GenomeWalker (Becton, Dickinson and Company). Esta amplificación se realizó de acuerdo con las condiciones descritas en el manual adjunto al mismo. El ADN cromosómico extraído de Penicillium pinophilum PF1365 se digirió completamente con la enzima de restricción PvuII o StuI, y los fragmentos digeridos resultantes del ADN cromosómico se ligaron a un adaptador adjunto al kit para construir bibliotecas PvuII y StuI. Además, se prepararon cebadores sintéticos que tienen las siguientes secuencias en base a la secuencia determinada en el Ejemplo 3 para usar reacciones de PCR descritas a continuación. 24-GSP-R1: CGCCAGAGCTGGAAATGGAGTTGACATAAG (SEC ID Nº 8) 24-GSP-R2: GTGCACTGGGAGCCAGAGCCACTGCTCTCA (SEC ID Nº 9) 24-GSP-F1: TTTCGTATGATCTCTTCACGGCAGCGGATA (SEC ID Nº 10) 24-GSP-F2: ATCAACCATGTTACCTACAGTGGTGACTAT (SEC ID Nº 11)

Se realizó una reacción de PCR usando la biblioteca PvuII o StuI como molde, el cebador 24-GSP-R1 o 24-GSP-F1 y un cebador AP-1 adjunto al kit, y la premezcla Ex Taq (Takara Bio). Esta reacción de PCR se realizó realizando una reacción a 94ºC durante 2 minutos, repitiendo el ciclo que consiste en una reacción a 94ºC durante 2 segundos y una reacción a 72ºC durante 3 minutos 7 veces, repitiendo un ciclo que consiste en una reacción a 94ºC durante 2 segundos y una reacción a 67ºC durante 3 minutos 32 veces, y realizando una reacción a 67ºC durante 4 minutos. El líquido de reacción de PCR obtenido por la primera reacción de PCR se diluyó con agua desionizada, y la segunda reacción de PCR se realizó usando el líquido diluido como molde, el cebador 24-GSP-R2 o 24-GSP-F2 y

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fragmento génico se usó en los siguientes procedimientos para expresar el gen de PPCE.

(2): Construcción de plásmido para expresar PPCE

El plásmido p28FULL18 se digirió con las enzimas de restricción StuI y PstI, y la muestra después de la reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa. El fragmento génico de aproximadamente 800 pb se escindió del gel, y se usó un kit de extracción de gel QIAQUICK (Xiagen) para purificar el ADN. El plásmido pCBI-M2 (Ejemplo B1 del documento WO 2005/056787) se digirió con las enzimas de restricción StuI y PstI, y la muestra después de la reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa. Se escindió un fragmento génico de aproximadamente 5,6 kpb del gel, y se usó un kit de extracción de gel QIAQUICK (Xiagen) para purificar el ADN. Este fragmento génico de aproximadamente 5,6 kpb se ligó al fragmento génico previamente obtenido de aproximadamente 800 pb usando un kit de ligamiento de ADN TaKaRa Ver.1 (Takara Bio) para construir el plásmido pPPCE-F2.

(3): Preparación de Trichoderma viride transformante con plásmido pPPCE-F2

Trichoderma viride se transformó con el plásmido PPCE-F2 obtenido en el Ejemplo 5(2) de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento WO 2005/056787. Es decir, esta transformación se realizó mediante un procedimiento de co-transformación usando Trichoderma viride cepa 2 deficiente en un gen para la biosíntesis de uracilo (pyr4) como huésped y un gen pyr4 de Neurospora crassa como marcador de selección. Más particularmente, de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2005/056787, se prepararon protoplastos de Trichoderma viride cepa 2, y se mezclaron 100 l de la suspensión de protoplastos con 7 g del plásmido pPPCE-F2 y 3 g del plásmido pPYR4 (un plásmido preparado por subclonación del gen pyr4 de Neurospora crassa en LITMUS28). Después de dejar esta mezcla en reposo en hielo durante 5 minutos, se añadieron 400 l de una solución de PEG (polietilenglicol 4000 al 60%, 10 mmol/l de cloruro de calcio, y 10 mmol/l de tampón Tris-HCl, pH 7,5) a la mezcla, y se dejó reposar en hielo durante 20 minutos. La suspensión resultante de protoplastos se lavó con un tampón SUTC (0,5 mol/l de sacarosa, 10 mmol/l de cloruro de calcio, y 10 mmol/l de tampón Tris-HCl, pH 7,5), se recubrió con agar blando en un medio mínimo que contenía 0,5 mol/l de sacarosa, y se cultivó a 28ºC durante 5 días. Después del cultivo, las colonias cultivadas se transfirieron en el medio mínimo, y las colonias cultivadas en este medio se usaron como transformantes en los siguientes procedimientos.

(4): Cultivo de Trichoderma viride transformante con plásmido pPPCE-F2

De los transformantes obtenidos en el Ejemplo 5(3), se inocularon 50 cepas en un medio PSW (glucosa al 1,0%, lactosa al 4,0%, torta de soja al 2,0%, germen de trigo al 1,0%, dihidrogenofosfato potásico al 0,2%, sulfato de amonio al 0,2%, fosfato de amonio al 0,2%, carbonato de calcio al 0,2%) y se cultivaron a 28ºC durante 5 días. Después del cultivo, se retiraron los micelios por centrifugación para obtener sobrenadantes de cultivo como soluciones enzimáticas en bruto. Estas soluciones enzimáticas en bruto se sometieron a SDS-PAGE, y se confirmó que se expresaba específicamente una proteína de aproximadamente 26 kDa en los transformantes. El sobrenadante de cultivo de la cepa 322F-205, que expresaba de forma muy elevada la proteína, se usó para realizar el siguiente ensayo de lavado.

Ejemplo 6: Evaluación de actividad de eliminación de pelusas en cepa que expresa el gen de PPCE

(1) Medición de la concentración de proteína expresada

Para evaluar una actividad de eliminación de pelusas de la cepa que expresa el gen de PPCE, se expresó cada gen de EG III derivada de Trichoderma reesei (referencia no de patente 1), SCE3 derivada de Trichoderma viride (patente de referencia 5), y FI-CMCasa derivada de Aspergillus aculeatus (referencia no de patente 2) en Trichoderma viride, y se prepararon sobrenadantes de cultivo del mismo, como controles, de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 5. Estos sobrenadantes de cultivo para controles, y el sobrenadante de cultivo de la cepa que expresa el gen de PPCE se sometieron a SDS-PAGE usando un gel al 12% de acuerdo con los procedimientos descrito en el Ejemplo 1. Después de la electroforesis, el gel se tiñó usando un tinte de gel de proteínas SYPRO Ruby (Invitrogen) y se lavó con agua. Las bandas se analizaron usando un Molecular Imager FX (Bio-Rad Laboratories) y un Quantity One (Bio-Rad Laboratories) para determinar la relación de la proteína expresada a las proteínas totales. Además, se ensayó la concentración de proteínas totales contenidas en cada sobrenadante de cultivo usando  globulina bovina como patrón y un kit de ensayo de proteínas (Bio-Rad Laboratories). La concentración de la proteína expresada se calculó multiplicando la concentración de proteínas totales por la relación de la proteína expresada.

Tabla 1

Cantidad de proteína expresada en transformantes de Trichoderma

Proteína activa: Concentración de proteínas totales Relación de proteína expresada Concentración de proteína expresada

PPCE (presente invención): 13,2 g/ml 6,1% 0,81 g/ml

EG III: 11,8 g/ml 18,1% 2,1 g/ml

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(continuación)

Perfil de temperatura de cepa que expresaba PPCE

30ºC: 100 85

40ºC: 95 100

50ºC: 80 80

60ºC: 40 50

(2) Perfil de pH en la actividad de eliminación de pelusas de PPCE

Los sobrenadantes de cultivo de las cepas que expresaban PPCE y EG III usadas en el Ejemplo 6 se usaron para examinar perfiles de pH en las siguientes condiciones para lavado. Después del tratamiento de lavado, se juzgaron los grados de eliminación de pelusas de los tejidos en base a una inspección visual, y se calcularon los volúmenes de sobrenadantes de cultivo necesarios para retirar aproximadamente el 50% de las pelusas en base a una inspección visual. Las actividades relativas se determinaron a partir de los volúmenes, cuando la actividad al pH que muestra la mayor actividad de eliminación de pelusas en cada muestra se consideró del 100%. Como se muestra en la Tabla 4, el pH óptimo de PPCE fue pH 3, y el de EG III fue pH 4.

Máquina de ensayo: Launder Meter L-12 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japón)

Temperatura: 40ºC

Tiempo: 60 minutos

Solución de reacción: 5 mmol/l de tampón citrato o tampón acetato (pH 2 a 6) 40 ml

A una solución de tratamiento, se añadió una cantidad apropiada de perlas inoxidables junto con cada sobrenadante de cultivo.

Tabla 4

Perfil de pH de cepa que expresaba PPCE

Tampón, pH: PPCE EG III

Actividad de lavado (%)
Actividad de lavado (%)

Citrato, pH 2: 85 25

Citrato, pH 3: 100 45

Citrato, pH 4: 90 100

Acetato, pH 4: 90 90

Acetato, pH 5: 30 55

Acetato, pH 6: 10 o menos 10

Ejemplo 8: Expresión del gen de PPCE de codones optimizados en Trichoderma viride

(1) Clonación del gen de PPCE de codones optimizados

Se sintetizó un gen de PPCE que consistía solamente en los codones altamente usados en el género Trichoderma por reacciones de PCR.

a) Preparación del fragmento PCEM1-2

Se prepararon dos oligonucleótidos sintéticos que tenían las siguientes secuencias.

PCEM-1: CCAGGCCTGCGCATCATGAAGCTGACCTTCCTGCTGAACCTGGCCGTCGCCGCCAGCGCC CAGCAGAGCCTGTGCAGCCAGTACAGCAGCTACAC (SEC ID Nº 14)

PCEM-2: TGGCTGCCGCTGCCGCTGCTCTCGCCCCACAGGTTGTTGTTGACGCTGTACTGGCCGCTG GTGTAGCTGCTGTACTGGCT (SEC ID Nº 15)

Se realizó una reacción de PCR usando 20 pmol de los cebadores anteriores (PCEM-1 y PCEM-2) y la ADN polimerasa Primestar MAX (Takara), en ausencia de molde, repitiendo un ciclo que consiste en una reacción a 98ºC durante 10 segundos, una reacción a 55ºC durante 5 segundos, y una reacción a 72ºC durante 30 segundos 30 veces. El ADN resultante se purificó del líquido de reacción usando un kit de purificación de PCR QIAQUICK (Xiagen), y se eluyó en 50 l de un tampón TE, de acuerdo con las condiciones descritas en el manual adjunto al mismo. El fragmento de ADN resultante de aproximadamente 150 pb se denominó PCEM1-2.

b) Preparación del fragmento PCEM3-4

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ATCATGTCAGATACAAGGAGTCTATAGGAACAGAAAGGGTCATGGCTTACCGATCAGGTA

CTGGCTGCTGGCGGGGAAGC (SEC ID Nº 25)

Se realizó una reacción de PCR usando 20 pmol de los cebadores anteriores (PCEM-11 y PCEM-12) en ausencia de molde, y se purificó el fragmento resultante, de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 8(1)a). El fragmento de ADN resultante de aproximadamente 140 pb se denominó PCEM11-12.

g) Preparación del fragmento PCEM13-14

PCEM-13:

CTCCTTGTATCTGACATGATTGCTTCGGTATCAGACCTGCAGTTCGGCACCGAGCCCTTC

ACCGGCAGCCAGACCACCCT (SEC ID Nº 2 6)

PCEM-14: CCCTCGAGCTAGTTGACGCTGGCGCTCCAGTGGTTGACGGTCAGGGTGGTCTGGCTG CCGGT (SEC ID Nº 27)

Se realizó una reacción de PCR usando 20 pmol de los cebadores anteriores (PCEM-13 y PCEM-14) en ausencia de molde, y se purificó el fragmento resultante, de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 8(1)a). El fragmento de ADN resultante de aproximadamente 120 pb se denominó PCEM13-14.

h) Preparación del fragmento PCEM1-4

Se realizó una segunda reacción de PCR usando 1 l de PCEM1-2 obtenido en el Ejemplo 8(1)a) y 1 l de PCEM3-4 obtenido en el Ejemplo 8(1)b) como moldes, 20 pmol de los cebadores anteriores (PCEM-1 y PCEM-4), y ADN polimerasa Primestar MAX (Takara), repitiendo un ciclo que consiste en una reacción a 98ºC durante 10 segundos, una reacción a 55ºC durante 5 segundos, y una reacción a 72ºC durante 30 segundos 30 veces. El ADN resultante se purificó del líquido de reacción usando un kit de purificación de PCR QIAQUICK (Xiagen), y se eluyó en 50 l de un tampón TE. El fragmento de ADN resultante de aproximadamente 270 pb se denominó PCEM1-4.

i) Preparación del fragmento PCEM5-8

Se realizó una segunda reacción de PCR usando 1 l de PCEM5-6 obtenido en el Ejemplo 8(1)c) y 1 l de PCEM7-8 obtenido en el Ejemplo 8(1)d) como moldes, y 20 pmol de los cebadores anteriores (PCEM-5 y PCEM-8). Esta reacción de PCR y una purificación del fragmento resultante se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 8(1)h) para denominar el fragmento de ADN resultante de aproximadamente 260 pb como PCEM5-8.

j) Preparación del fragmento PCEM9-12

Se realizó una segunda reacción de PCR usando 1 l de PCEM9-10 obtenido en el Ejemplo 8(1)e) y 1 l de PCEM11-12 obtenido en el Ejemplo 8(1)f) como moldes, y 20 pmol de los cebadores anteriores (PCEM-9 y PCEM12). Esta reacción de PCR y una purificación del fragmento resultante se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 8(1)h) para denominar el fragmento de ADN resultante de aproximadamente 260 pb como PCEM9-12.

k) Preparación del fragmento PCEM1-8

Se realizó una tercera reacción de PCR usando 1 l de PCEM1-4 obtenido en el Ejemplo 8(1)h) y 1 l de PCEM5-8 obtenido en el Ejemplo 8(1)i) como moldes, 20 pmol de los cebadores anteriores (PCEM-1 y PCEM-8), y ADN polimerasa Primestar MAX (Takara), repitiendo un ciclo que consiste en una reacción a 98ºC durante 10 segundos, una reacción a 55ºC durante 5 segundos, y una reacción a 72ºC durante 30 segundos 30 veces.

El ADN resultante se purificó del líquido de reacción usando un kit de purificación de PCR QIAQUICK (Xiagen), y se eluyó en 50 l de un tampón TE. El fragmento de ADN resultante de aproximadamente 510 pb se denominó PCEM1

8.

l) Preparación del fragmento CEM9-14

Se realizó una tercera reacción de PCR usando 1 l de PCEM9-12 obtenido en el Ejemplo 8(1)j) y 1 l de PCEM1314 obtenido en el Ejemplo 8(1)g) como moldes, y 20 pmol de los cebadores anteriores (PCEM-9 y PCEM-14). Esta reacción de PCR y una purificación del fragmento resultante se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 8(1)k) para denominar el fragmento de ADN resultante de aproximadamente 360 pb como PCEM9-14.

m) Preparación del plásmido pCR-PCEm

Claims

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