BR112016008972B1 - Método para tratamento de têxtil com um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase, polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase e polinucleotídeo codificando os mesmos - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEOS TENDO ATIVIDADE DE ENDOGLUCANASE E POLINUCLEOTÍDEOS CODIFICANDO OS MESMOS. Polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase, domínios catalíticos, e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos ou domínios catalíticos. Constructos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos ou domínios catalíticos.

Description

Referência a uma Listagem de Sequências

[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada aqui por referência.

Referência a um Depósito de Material Biológico

[002] Este pedido contêm uma referência a um depósito de material biológico, cujo depósito é incorporado aqui por referência.

Antecedentes da Invenção Área da Invenção

[003] A presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase, domínios catalíticos, e domínios de ligação de celulose, e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos, domínios catalíticos, e domínios de ligação de celulose. A invenção se relaciona também com constructos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos, domínios catalíticos, e domínios de ligação de celulose.

Descrição da Técnica Relacionada

[004] As celulases ou enzimas celulíticas são enzimas envolvidas na hidrólise da celulose. É conhecido que existem três tipos principais de enzimas celulase envolvidos, nomeadamente endoglucanase, celobioidrolase, e betaglucosidase.

[005] Existe um amplo espectro de aplicações industriais de celulases. Na indústria têxtil são usadas celulases no acabamento de brim para criar uma aparência lavada à pedra elegante em tecidos de brim usando um processo de biolapidação. As celulases são também usadas, por exemplo, para limpar cotão e prevenir a formação de borbotos na superfície de peças de vestuário de algodão usando um processo de biopolimento.

[006] WO9629397 divulga preparações de enzimas com desempenho em aplicações industriais tais como composições de lavanderia, para biopolimento de têxteis recém-fabricados, para proporcionar um aspecto desgastado a tecidos ou peças de vestuário de celulose, e para tratamento da pasta de papel.

[007] WO2010/076388 divulga endoglucanases fúngicas com desempenho substancial a baixas temperaturas; as endoglucanases são usadas para tratar material celulósico, especialmente na indústria têxtil, p.ex. em bioacabamento ou biolapidação.

[008] Existem necessidades continuadas na técnica de novas endoglucanases e métodos para obtenção de um tecido têxtil celulósico com bom efeito de abrasão, e/ou tendência reduzida para formação de borbotos no processo de biopolimento, especialmente a baixa temperatura.

[009] A presente invenção pretende satisfazer estas necessidades.

Sumário da Invenção

[0010] A presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase selecionados do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA; (d) uma variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de endoglucanase.

[0011] A presente invenção se relaciona também com polipeptídeos compreendendo um domínio catalítico selecionado do grupo consistindo em: (f) um domínio catalítico tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com os aminoácidos 22 a 237 de SEQ ID NO: 2; (g) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de muito elevada estringência com (i) os nucleotídeos 64 a 764 de SEQ ID NO: 1, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); (h) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com os nucleotídeos 64 a 764 de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA; (i) uma variante dos aminoácidos 22 a 237 de SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições; e (j) um fragmento do domínio catalítico de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de endoglucanase.

[0012] A presente invenção se relaciona também com um método para tratamento de têxtil com um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase selecionado do grupo consistindo em: (k) um polipeptídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (l) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de elevada ou muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) a cadeia complementar de comprimento total de (i); (m) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (n) uma variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições; e (o) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de endoglucanase.

[0013] A presente invenção se relaciona também com um polinucleotídeo codificando um peptídeo sinal compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2, um polinucleotídeo codificando um pró-peptídeo compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos 1 a 63 de SEQ ID NO: 2, cada um dos quais está operacionalmente ligado a um gene codificando uma proteína; constructos de ácido nucleico, vetores de expressão, e células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de produção de uma proteína.

Definições

[0014] Endoglucanase: O termo "endoglucanase" significa uma endo- 1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glucana-4-glucanoidrolase (E.C. 3.2.1.4) que catalisa a endoidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como celulose de carboximetila e celulose de hidroxietila), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glucanas mistas tais como beta-D- glucanas ou xiloglucanas de cereais, e outro material de plantas contendo componentes celulósicos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada por medição da redução na viscosidade do substrato ou aumento nas extremidades redutoras determinado por um ensaio de açúcares redutores (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452481). A atividade de endoglucanase pode ser determinada usando celulose de carboximetila (CMC) como substrato de acordo com o procedimento da parte VI na página 264 de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268.

[0015] Para propósitos da presente invenção, a atividade de endoglucanase é determinada de acordo com o procedimento descrito nos Exemplos. Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 100 % da atividade de endoglucanase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

[0016] Variante alélica: O termo "variante alélica" significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0017] Domínio de ligação: O termo "domínio de ligação de celulose" significa a região de uma enzima que medeia a ligação da enzima a regiões amorfas de um substrato de celulose. O domínio de ligação de celulose (CBD) é tipicamente encontrado na extremidade N-terminal ou C-terminal de uma endoglucanase. In the context, cellulose binding domain and carbohydrate binding modules are used interchangeable.

[0018] Domínio catalítico: O termo "domínio catalítico" significa a região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima.

[0019] Família 45 ou Família GH45 ou CEL45: O termo "Família 45" ou "Família GH45" ou "CEL45" é definido aqui como um polipeptídeo dentro da Família 45 de glicosídeo hidrolases de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat e Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. Os módulos de ligação de carboidrato estão frequentemente associados a módulos catalíticos codificando enzimas tais como glicosil hidrolases. Guillén D, Sánchez S, Rodríguez-Sanoja R. Carbohydrate-binding domains: multiplicity of biological roles. Applied Microbiology & Biotechnology fevereiro 2010; 85(5):1241. Disponível da: EDS Foundation Index, Ipswich, MA.

[0020] cDNA: O termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, processada, obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntrons que possam estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo encadeamento, antes de aparecer como mRNA maduro encadeado.

[0021] Sequência codificante: O termo "sequência codificante" significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG, ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma sua combinação.

[0022] Sequências de controle: O termo "sequências de controle" significa sequências de ácidos nucleicos necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa do (i.e., do mesmo gene) ou estranha (i.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal, e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sequências de terminação transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo codificando um polipeptídeo.

[0023] Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer passo envolvido na produção do polipeptídeo incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional, e secreção.

[0024] Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo e está operacionalmente ligada a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[0025] Fragmento: O termo "fragmento" significa um polipeptídeo ou um domínio catalítico ou domínio de ligação de celulose tendo um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila do seu polipeptídeo maduro ou domínio; em que o fragmento tem atividade de endoglucanase. Em um aspecto, um fragmento contém 85 %, 90 %, e 95 % do número de aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

[0026] Condições de elevada estringência: O termo "condições de elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 65 °C.

[0027] Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução, ou similares com um constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0028] Isolado: O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais, ou de todos os, constituintes ocorrendo naturalmente, aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (p.ex., produção recombinante em uma célula hospedeira; múltiplas cópias de um gene codificando a substância; e uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância).

[0029] Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 22 a 293 de SEQ ID NO: 2 e os aminoácidos 22 a 293 de SEQ ID NO: 4 com base em SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prevê que os aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2 e os aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 4 são um peptídeo sinal. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. É também conhecido na técnica que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos diferentemente, e, assim, uma célula hospedeira expressando um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (p.ex., tendo um aminoácido com C-terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com outra célula hospedeira expressando o mesmo polinucleotídeo.

[0030] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo "sequência codificante do polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de endoglucanase. Em um aspecto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro é os nucleotídeos 64 a 764 de SEQ ID NO: 1 e os nucleotídeos 1 a 63 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo sinal. Em um aspecto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro é os nucleotídeos 64 a 764 de SEQ ID NO: 3 e os nucleotídeos 1 a 63 de SEQ ID NO: 3 codificam um peptídeo sinal.

[0031] Constructo de ácido nucleico: O termo "constructo de ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que de outra maneira não existiria na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0032] Operacionalmente ligado: O termo "operacionalmente ligado" significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.

[0033] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro "identidade de sequência".

[0034] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:

[0035] (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[0036] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:

[0037] (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[0038] Subsequência: O termo "subsequência" significa um polinucleotídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento tendo atividade de endoglucanase.

[0039] Variante: O termo "variante" significa um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção, e/ou deleção, em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Uma substituição significa substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente e imediatamente a seguir ao aminoácido ocupando uma posição.

[0040] Condições de muito elevada estringência: O termo "condições de muito elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 70 °C.

[0041] Têxtil: O termo "têxteis" usado aqui se destina a incluir fibras, fios, tecidos e peças de vestuário.

[0042] Um tecido pode ser construído a partir de fibras por tecelagem, confecção de malhas ou operações sem urdidura. A tecelagem e a confecção de malhas necessitam de fios como a matéria-prima ao passo que o tecido não urdido é o resultado da ligação aleatória de fibras (o feltro pode ser considerado como não urdido). No presente contexto, o termo "tecido" se destina também a incluir fibras e outros tipos de tecidos processados.

[0043] De acordo com a invenção, o método da invenção pode ser aplicado a qualquer têxtil conhecido na técnica (urdido, tricotado, ou não urdido). Em particular, o processo da presente invenção pode ser aplicado a têxtil contendo celulose ou celulósico, tal como algodão, viscose, raiom, rami, linho, liocel (p.ex., Tencel, produzido pela Courtaulds Fibers), ou suas misturas, ou misturas de qualquer uma destas fibras em conjunto com fibras sintéticas (p.ex., poliéster, poliamida, náilon) ou outras fibras naturais tais como lã e seda, tais como combinações de viscose/algodão, combinações de liocel/algodão, combinações de viscose/lã, combinações de liocel/lã, combinações de algodão/lã; linho, rami e outros tecidos à base de fibras de celulose, incluindo todas as combinações de fibras celulósicas com outras fibras tais como lã, fibras de poliamida, acrílico e poliéster, p.ex., combinações de viscose/algodão/poliéster, combinações de lã/algodão/poliéster, combinações de linho/algodão, etc.

Descrição Detalhada da Invenção Polipeptídeos Tendo Atividade de Endoglucanase

[0044] Em uma forma de realização, a presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de endoglucanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 4 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4 ou 5 em relação ao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[0045] Em uma forma de realização, a presente invenção se relaciona com um método para tratamento de têxtil com um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 de pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %, que têm atividade de endoglucanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 em relação ao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

[0046] Em uma forma de realização, o polipeptídeo foi isolado. Um polipeptídeo da presente invenção ou um método para tratamento de têxtil preferencialmente compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de endoglucanase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 22 a 293 de SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos 22 a 293 de SEQ ID NO: 4.

[0047] Em outra forma de realização, a presente invenção se relaciona um polipeptídeo ou um método para tratamento de têxtil com um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de elevada estringência ou condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). Em uma forma de realização, o polipeptídeo foi isolado.

[0048] O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 ou uma sua subsequência, bem como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento, pode ser usado para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase a partir de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí presente. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, p.ex., pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, p.ex., pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[0049] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase. O DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para, e imobilizado em, nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que hibrida com SEQ ID NO: 1 ou uma sua subsequência, o material transportador é usado em uma transferência de Southern.

[0050] Para propósitos da presente invenção, hibridação indica que o polinucleotídeo hibrida com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo a (i) SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, (ii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; (iii) a sua sequência de cDNA; (iv) o seu complemento de comprimento total; ou (v) uma sua subsequência; sob condições de muito baixa a muito elevada estringência. As moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[0051] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; o seu polipeptídeo maduro; ou um seu fragmento. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 ou a sua sequência de cDNA.

[0052] Em outra forma de realização, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 99 %, ou 100 %. Em uma forma de realização adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[0053] Em outra forma de realização, a presente invenção se relaciona com variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Em uma forma de realização, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 é até 10, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente a dobragem e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0054] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

[0055] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade quanto ao substrato, mudar o pH ótimo, e similares.

[0056] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura da alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Em esta última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de endoglucanase para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[0057] Substituições, deleções, e/ou inserções simples ou múltiplas de aminoácidos podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreio relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição de fagos (p.ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 1083210837; Patente dos E.U.A. No. 5,223,409; WO 92/06204), e mutagênese direcionada para região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0058] Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com métodos de rastreio automatizados, de elevado rendimento, para detetar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados, expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[0059] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.

[0060] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo de fusão clivável ao qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando um outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos tal que fiquem em grelha e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós- translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[0061] Um polipeptídeo de fusão pode adicionalmente compreender um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen- Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade de Endoglucanase

[0062] Um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presente invenção pode ser obtido de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo "obtido de" como usado aqui em conexão com uma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

[0063] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de Neurospora.

[0064] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Neurospora tetrasperma, Neurospora crassa, Neurospora africana, Neurospora brevispora, bonaerensis caffera, Neurospora calospora, Neurospora cerealis, Neurospora cratophora, Neurospora dictyophora, Neurospora discreta, Neurospora dodgei, Neurospora himalayensis, Neurospora hippopotama, Neurospora indica, Neurospora intermedia, Neurospora inversa, Neurospora kobi, Neurospora lineolata, Neurospora longispora, Neurospora novoguineensis, Neurospora pannonica, Neurospora pseudocalospora, Neurospora pseudoreticulata, Neurospora reticulate ou Neurospora sitophila.

[0065] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, p.ex., anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Aqueles peritos na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.

[0066] Estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de culturas, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0067] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (p.ex., solo, adubos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p.ex., solo, adubos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo pode ser depois obtido por rastreio similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de um outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas daqueles com perícia ordinária na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

Domínios Catalíticos

[0068] Em uma forma de realização, a presente invenção se relaciona também com domínios catalíticos tendo uma identidade de sequência com os aminoácidos 22 a 237 de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 99 % ou 100 %. Em um aspecto, os domínios catalíticos compreendem sequências de aminoácidos que diferem em até 4 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, ou 4, dos aminoácidos 22 a 237 de SEQ ID NO: 2.

[0069] O domínio catalítico preferencialmente compreende os ou consiste nos aminoácidos 22 a 237 de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de endoglucanase.

[0070] Em outra forma de realização, a presente invenção se relaciona também com domínios catalíticos codificados por polinucleotídeos que hibridam sob condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência (como definido acima), com (i) os nucleotídeos 64 a 764 de SEQ ID NO: 1, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o seu complemento de comprimento total de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, supra).

[0071] Em outra forma de realização, a presente invenção se relaciona também com domínios catalíticos codificados por polinucleotídeos tendo uma identidade de sequência com os nucleotídeos 64 a 764 de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 99 %, ou 100 %.

[0072] Em outra forma de realização, a presente invenção se relaciona também com variantes do domínio catalítico dos aminoácidos 22 a 237 de SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Em um aspecto, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas na sequência de aminoácidos 22 a 237 de SEQ ID NO: 2 é até 4, p.ex., 1, 2, 3 ou 4.

Polinucleotídeos

[0073] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, um domínio catalítico, ou domínio de ligação de celulose da presente invenção, como descrito aqui. Em uma forma de realização, o polinucleotídeo codificando um polipeptídeo, um domínio catalítico, ou domínio de ligação de celulose da presente invenção foi isolado.

[0074] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento a partir de DNA genômico ou cDNA, ou uma sua combinação. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de DNA genômico pode ser efetuada, p.ex., usando a bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR) ou rastreio com anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturais partilhadas. Ver, p.ex. Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em polinucleotídeos (NASBA). Os polinucleotídeos podem ser clonados de uma estirpe de Neurospora, ou um organismo relacionado, e, assim, por exemplo, podem ser uma variante alélica ou de espécies da região codificante do polipeptídeo do polinucleotídeo.

[0075] A modificação de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo "substancialmente similar" ao polipeptídeo se refere a formas do polipeptídeo não ocorrendo naturalmente. Estes polipeptídeos podem diferir de algum modo manipulado do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, p.ex., variantes que diferem na atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo, ou similares. As variantes podem ser construídas com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 ou a sua sequência de cDNA, p.ex., uma sua subsequência, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeos que não resultam em uma mudança da sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondem ao uso de códons do organismo hospedeiro pretendido para produção da enzima, ou por introdução de substituições de nucleotídeos que podem dar origem a uma sequência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituições de nucleotídeos ver, p.ex., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Constructos de Ácido Nucleico

[0076] A presente invenção se relaciona também com constructos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[0077] O polinucleotídeo pode ser manipulado de uma variedade de modos para proporcionar expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[0078] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[0079] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos constructos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene crylllA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e gene da betalactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados em WO 99/43835.

[0080] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos constructos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos. Outros promotores são descritos na Patente dos E.U.A. No. 6,011,147.

[0081] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, e 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[0082] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. O terminador está operacionalmente ligado ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Na presente invenção pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.

[0083] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.

[0084] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum, betaglucosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei.

[0085] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[0086] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizadora de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[0087] Exemplos de regiões estabilizadoras de mRNA adequadas são obtidos de um gene crylllA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[0088] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. O líder está operacionalmente ligado ao terminal 5' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.

[0089] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[0090] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3- fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae, e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[0091] A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina a mRNA transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.

[0092] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa- glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0093] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[0094] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de um polipeptídeo e que dirige o polipeptídeo para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo sinal naturalmente ligada em grelha de leitura de tradução ao segmento da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante de um peptídeo sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante do peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção do polipeptídeo. No entanto pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo sinal que dirija o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira.

[0095] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[0096] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa, e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[0097] Peptídeos sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes do fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes do peptídeo sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[0098] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante de pró-peptídeos que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes da protease alcalina (aprE de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[0099] Onde estiverem presentes sequências do peptídeo sinal e pró- peptídeo, a região do pró-peptídeo está posicionada junto ao terminal N de um polipeptídeo e a sequência do peptídeo sinal está posicionada junto ao terminal N da sequência do pró-peptídeo.

[00100] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sequências reguladoras são aquelas que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sequências reguladoras em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac, e trp. Em levedura pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos podem ser usados o promotor de glucomilase de Aspergillus niger, o promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e o promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae, promotor de celobioidrolase I de Trichoderma reesei, e promotor de celobioidrolase II de Trichoderma reesei. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene da diidrofolato reductase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Em estes casos, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora.

Vetores de Expressão

[00101] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação transcricional e translacional. As várias sequências de nucleotídeos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um constructo de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor de modo que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.

[00102] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p.ex., um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa provocar expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[00103] O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, /.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, p.ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(ais) foi integrado. Além disso pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transpóson.

[00104] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitam seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas, ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.

[00105] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tal como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina, ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras levedura incluem, mas não estão limitados a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, mas não estão limitados a, adeA (fosforribosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintase), adeB (fosforribosil-aminoimidazol sintase), amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoíltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato reductase), pyrG (orotidina-5’- fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. Preferenciais para uso em uma célula de Aspergillus são genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus. Preferenciais para uso em uma célula de Trichoderma são os genes adeA, adeB, amdS, hph, e pyrG.

[00106] O marcador selecionável pode ser um sistema de marcador selecionável dual como descrito em WO 2010/039889. Em um aspecto, o marcador selecionável dual é um sistema de marcador selecionável dual hph-tk.

[00107] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[00108] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local(ais) preciso(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases, e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00109] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem da replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funcione em uma célula. O termo "origem da replicação" ou "replicador de plasmídeo" significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor replique in vivo.

[00110] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 permitindo replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMβl permitindo replicação em Bacillus.

[00111] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[00112] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.

[00113] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e deste modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

[00114] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na arte (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

[00115] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um constructo ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o constructo ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não é idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene codificando o polipeptídeo e da sua fonte.

[00116] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, p.ex., um procariota ou um eucariota.

[00117] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Erterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Ocearobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. Bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomoras, Salmorella, e Ureaplasma.

[00118] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[00119] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[00120] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não limitada a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[00121] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação com protoplastos (ver, p.ex., Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação com células competentes (ver, p.ex., Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, p.ex., Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742751), ou conjugação (ver, p.ex., Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação com protoplastos (ver, p. ex., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, p.ex., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação com protoplastos, eletroporação (ver, p.ex., Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, p.ex., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou transdução (ver, p.ex., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, p.ex., Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397), ou conjugação (ver, p.ex., Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, p.ex., Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação com protoplastos (ver, p.ex., Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, p.ex., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), ou conjugação (ver, p.ex., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.

[00122] A célula hospedeira pode ser também um eucariota, tal como uma célula de mamífero, de inseto, de planta, ou fúngica.

[00123] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. "Fungos" como usado aqui incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).

[00124] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. "Levedura" como usado aqui inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena, e levedura pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de leveduras pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, e Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[00125] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

[00126] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por floração de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

[00127] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[00128] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[00129] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformações dos protoplastos, e regeneração da parede celular de uma forma conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adequados para transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de Produção

[00130] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula que, na sua forma de tipo selvagem, produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptídeo. Em um aspecto, a célula é uma célula de Neurospora. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Neurospora tetrasperma ou célula de Neurospora crassa.

[00131] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula hospedeira recombinante da presente invenção sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptídeo.

[00132] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, descontínuas, descontínuas alimentadas, ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais, em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo tem lugar em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado para o meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado pode ser recuperado de lisatos de células.

[00133] O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção incluem, mas não estão limitados a, uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzimas para determinar a atividade do polipeptídeo.

[00134] O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação. Em um aspecto é recuperado um caldo de fermentação compreendendo o polipeptídeo.

[00135] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obterem polipeptídeos substancialmente puros.

[00136] Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo.

Plantas

[00137] A presente invenção se relaciona também com plantas isoladas, p.ex., uma planta, parte de planta, ou célula de planta transgênica, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção de modo a expressarem e produzirem um polipeptídeo ou domínio em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo ou domínio pode ser recuperado da planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo ou domínio pode ser usada como tal para melhoria da qualidade de um alimento ou ração, p.ex., melhoria do valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

[00138] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocot são gramíneas, tais como gramíneas dos prados (poácea, Poa), gramíneas forrageiras tais como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como Agrostis, e cereais, p.ex., trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, e maís (milho).

[00139] Exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba-sacarina, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, colza, e o organismo modelo relacionado de perto Arabidopsis thaliana.

[00140] Exemplos de partes de plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutos, sementes, e tubérculos, bem como os tecidos individuais compreendendo estas partes, p.ex., epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Compartimentos específicos de células de plantas, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomos e citoplasma, são também considerados uma parte de planta. Além do mais, qualquer célula de planta, independentemente da origem do tecido, é considerada como sendo uma parte de planta. De igual modo, partes de plantas tais como tecidos e células específicos isolados para facilitar a utilização da invenção também são consideradas partes de plantas, p.ex., embriões, endospérmios, aleurona e tegumentos de sementes.

[00141] Também incluída dentro do escopo da presente invenção é a descendência de tais plantas, partes de plantas, e células de plantas.

[00142] A planta ou célula de planta transgênica expressando o polipeptídeo ou domínio pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída por incorporação de um ou mais constructos de expressão codificando o polipeptídeo ou domínio no genoma da planta hospedeira ou genoma do cloroplasto e propagação da planta ou célula de planta modificada resultante em uma planta ou célula de planta transgênica.

[00143] O constructo de expressão é convenientemente um constructo de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo ou domínio operacionalmente ligado a sequências reguladoras apropriadas requeridas para expressão do polinucleotídeo na planta ou parte de planta de escolha. Além do mais, o constructo de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificação de células de plantas nas quais foi integrada o constructo de expressão e sequências de DNA necessárias para introdução do constructo na planta em questão (estas últimas dependem do método de introdução de DNA a ser usado).

[00144] A escolha de sequências reguladoras, tais como sequências promotoras e terminadoras e opcionalmente sequências sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, com base em quando, onde, e como é desejado que o polipeptídeo ou domínio seja expresso. Por exemplo, a expressão do gene codificando um polipeptídeo ou domínio pode ser constitutiva ou induzível, ou pode ser específica quanto ao desenvolvimento, etapa ou tecido, e o produto de gene pode ser dirigido para um tecido ou parte de planta específico tal como sementes ou folhas. Sequências reguladoras são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

[00145] Para expressão constitutiva pode ser usado o promotor de 35S- CaMV, ubiquitina 1 do milho, ou actina 1 do arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Promotores específicos quanto a órgãos podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de dreno de armazenamento tais como sementes, tubérculos de batata, e frutos (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de dreno metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico quanto a sementes tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina do arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de sementes desconhecida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de uma proteína do corpo oleaginoso de sementes (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor da proteína de reserva napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico quanto a sementes conhecido na técnica, p.ex., como descrito em WO 91/14772. Além do mais, o promotor pode ser um promotor específico quanto a folhas tal como o promotor rbcs do arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), o promotor do gene de adenina metiltransferase do gene promotor (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP do arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), ou um promotor induzível por ferida tal como o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). De igual modo, o promotor pode ser induzido por tratamentos abióticos tais como temperatura, seca, ou alterações na salinidade ou induzido por substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor, p.ex., etanol, estrogênios, hormônios de plantas tais como etileno, ácido abscísico, e ácido giberélico, e metais pesados.

[00146] Um elemento intensificador de promotores pode ser também usado para alcançar expressão mais elevada de um polipeptídeo ou domínio na planta. Por exemplo, o elemento intensificador de promotores pode ser um íntron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo codificando um polipeptídeo ou domínio. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, divulgam o uso do primeiro íntron do gene da actina 1 do arroz para intensificar a expressão.

[00147] O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do constructo de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.

[00148] O constructo de ácido nucleico é incorporado no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na área, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partículas, transformação biolística, e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[00149] A transferência de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens é um método para geração de dicots transgênicas (para uma revisão ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) e para transformação de monocots, embora outros métodos de transformação possam ser usados para estas plantas. Um método para geração de monocots transgênicas é bombardeamento com partículas (partículas microscópicas de outro ou tungstênio revestidas com o DNA transformante) de calos embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para transformação de monocots é baseado em transformação com protoplastos como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Métodos adicionais de transformação incluem aqueles descritos nas Patentes dos E.U.A. Nos. 6,395,966 e 7,151,204 (ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade).

[00150] Após transformação, os transformantes tendo incorporado o constructo de expressão são selecionados e regenerados em plantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Frequentemente, o procedimento de transformação é desenhado para a eliminação seletiva de genes de seleção durante a regeneração ou nas gerações seguintes por uso, por exemplo, de cotransformação com dois constructos separados de T-DNA ou excisão sítio-específica do gene de seleção por uma recombinase específica.

[00151] Adicionalmente à transformação direta de um genótipo particular de planta com um constructo da presente invenção podem ser feitas plantas transgênicas por cruzamento de uma planta tendo o constructo com uma segunda planta à qual falta o constructo. Por exemplo, um constructo codificando um polipeptídeo ou domínio pode ser introduzido em uma variedade de planta particular por cruzamento, sem a necessidade de transformar diretamente uma planta dessa dada variedade. Portanto, a presente invenção engloba não só uma planta diretamente regenerada a partir de células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a descendência de tais plantas. Como usado aqui, descendência pode se referir à descendência de qualquer geração de uma planta genitora preparada de acordo com a presente invenção. Tal descendência pode incluir um constructo de DNA preparado de acordo com a presente invenção. O cruzamento resulta em introdução de um transgene em uma linhagem de planta por polinização cruzada de uma linhagem de partida com uma linhagem de planta dadora. Exemplos não limitantes de tais passos são descritos na Patente dos E.U.A. No. 7,151,204.

[00152] Podem ser geradas plantas através de um processo de conversão por retrocruzamento. Por exemplo, plantas incluem plantas referidas como genótipo, linhagem, planta endogâmica, ou híbrido convertido de modo retrocruzado.

[00153] Podem ser usados marcadores genéticos para auxiliar a ingressão de um ou mais transgenes da invenção de um fundo genético para outro. A seleção auxiliada por marcadores oferece vantagens em relação ao melhoramento convencional na medida em que pode ser usada para evitar erros causados por variações fenotípicas. Adicionalmente, marcadores genéticos podem proporcionar dados dizendo respeito ao grau relativo de plasma germinativo de elite na descendência individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com um traço desejado que de outro modo tem um fundo genético agronomicamente não desejável é cruzada com uma genitora de elite, podem ser usados marcadores genéticos para selecionar descendência que não só possui o traço de interesse, como tem também uma proporção relativamente grande do plasma germinativo desejado. Deste modo, o número de gerações requerido para ingressar um ou mais traços em um fundo genético particular é minimizado.

[00154] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo ou domínio da presente invenção compreendendo (a) cultivo de uma planta ou célula de planta transgênica compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou domínio sob condições conducentes à produção do polipeptídeo ou domínio; e (b) recuperação do polipeptídeo ou domínio.

[00155] Remoção ou Redução da Atividade de Endoglucanase

[00156] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um mutante de uma célula genitora, que compreendem desagregação ou deleção de um polinucleotídeo, ou uma sua porção, codificando um polipeptídeo da presente invenção, o que resulta na célula mutante produzindo menos do polipeptídeo do que a célula genitora quando cultivada sob as mesmas condições.

[00157] A célula mutante pode ser construída por redução ou eliminação da expressão do polinucleotídeo usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, inserções, desagregações, substituições, ou deleções. Em um aspecto preferencial, o polinucleotídeo é inativado. O polinucleotídeo a ser modificado ou inativado pode ser, por exemplo, a região codificante ou uma sua parte essencial para a atividade, ou um elemento regulador requerido para expressão da região codificante. Um exemplo de tal sequência reguladora ou de controle pode ser uma sequência promotora ou uma sua parte funcional, /.e., uma parte que é suficiente para afetar a expressão do polinucleotídeo. Outras sequências de controle para possível modificação incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, sequência de peptídeo sinal, terminador da transcrição, e ativador da transcrição.

[00158] A modificação ou inativação do polinucleotídeo pode ser efetuada por sujeição da célula genitora a mutagênese e seleção quanto a células mutantes nas quais a expressão do polinucleotídeo foi reduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória, pode ser efetuada, por exemplo, por uso de um agente de mutagenização físico ou químico adequado, por uso de um oligonucleotídeo adequado, ou por sujeição da sequência de DNA a mutagênese gerada por PCR. Adicionalmente, a mutagênese pode ser realizada por uso de qualquer combinação destes agentes de mutagenização.

[00159] Exemplos de um agente de mutagenização físico ou químico adequado para o presente propósito incluem irradiação de ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, metanossulfonato de etila (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico, e análogos de nucleotídeos.

[00160] Quando são usados tais agentes, a mutagênese é tipicamente realizada por incubação da célula genitora a ser mutagenizada na presença do agente de mutagenização de escolha sob condições adequadas, e rastreio e/ou seleção quanto a células mutantes exibindo expressão reduzida ou nula do gene.

[00161] A modificação ou inativação do polinucleotídeo pode ser alcançada por inserção, substituição, ou deleção de um ou mais nucleotídeos no gene ou um elemento regulador requerido para a sua transcrição ou tradução. Por exemplo, nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos de modo a resultar na introdução de um códon de terminação, na remoção do códon de iniciação, ou uma mudança da grelha de leitura aberta. Tal modificação ou inativação pode ser alcançada por mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese gerada por PCR de acordo com métodos conhecidos na técnica. Embora, em princípio, a modificação possa ser realizada in vivo, i.e., diretamente na célula expressando o polinucleotídeo a ser modificado é preferencial que a modificação seja realizada in vitro como exemplificado em baixo.

[00162] Um exemplo de um modo conveniente de eliminar ou reduzir a expressão de um polinucleotídeo é baseado em técnicas de substituição de genes, deleção de genes, ou desagregação de genes. Por exemplo, no método de desagregação de genes, uma sequência de ácido nucleico correspondendo ao polinucleotídeo endógeno é mutagenizada in vitro para produzir uma sequência de ácido nucleico defeituosa que é depois transformada na célula genitora para produzir um gene defeituoso. Por recombinação homóloga, a sequência de ácido nucleico defeituosa substitui o polinucleotídeo endógeno. Pode ser desejável que o polinucleotídeo defeituoso codifique também um marcador que pode ser usado para seleção de transformantes nos quais o polinucleotídeo foi modificado ou destruído. Em um aspecto, o polinucleotídeo é desagregado com um marcador selecionável tal como aqueles descritos aqui.

[00163] A presente invenção se relaciona também com métodos de inibição da expressão de um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase em uma célula, compreendendo administração à célula ou expressão na célula de uma molécula de RNA de fita dupla (dsRNA), em que o dsRNA compreende uma subsequência de um polinucleotídeo da presente invenção. Em um aspecto preferencial, o dsRNA tem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos do dúplex em comprimento.

[00164] O dsRNA é preferencialmente um pequeno RNA de interferência (siRNA) ou um micro RNA (miRNA). Em um aspecto preferencial, o dsRNA é pequeno RNA de interferência para inibição da transcrição. Em outro aspecto preferencial, o dsRNA é micro RNA para inibição da tradução.

[00165] A presente invenção se relaciona também com tais moléculas de RNA de cadeia dupla (dsRNA), compreendendo uma porção da sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 para inibição da expressão do polipeptídeo em uma célula. Embora a presente invenção não esteja limitada por qualquer mecanismo de ação particular, o dsRNA pode entrar em uma célula e causar a degradação de um RNA de cadeia única (ssRNA) de sequências similares ou idênticas, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta a dsRNA, mRNA do gene homólogo é seletivamente degradado por um processo chamado interferência de RNA (RNAi).

[00166] Os dsRNAs da presente invenção podem ser usados em silenciamento de genes. Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para degradação seletiva de RNA usando um dsRNAi da presente invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de dsRNA podem ser usadas para gerar uma mutação de perda-de-função em uma célula, um órgão ou um animal. Métodos para preparação e uso de moléculas de dsRNA para degradação seletiva de RNA são bem conhecidos na técnica; ver, por exemplo, Patentes dos E.U.A. Nos. 6,489,127; 6,506,559; 6,511,824; e 6,515,109.

[00167] A presente invenção se relaciona adicionalmente com uma célula mutante de uma célula genitora que compreende uma desagregação ou deleção de um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou uma sua sequência de controle ou um gene silenciado codificando o polipeptídeo, o que resulta na célula mutante produzindo menos do polipeptídeo ou nenhum polipeptídeo em comparação com a célula genitora.

[00168] As células mutantes deficientes no polipeptídeo são particularmente úteis como células hospedeiras para expressão de polipeptídeos nativos e heterólogos. Portanto, a presente invenção se relaciona adicionalmente com métodos de produção de um polipeptídeo nativo ou heterólogo, compreendendo (a) cultivo da célula mutante sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo. O termo "polipeptídeos heterólogos" significa polipeptídeos que não são nativos da célula hospedeira, p.ex., uma variante de uma proteína nativa. A célula hospedeira pode compreender mais do que uma cópia de um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo nativo ou heterólogo.

[00169] Os métodos usados para cultivo e purificação do produto de interesse podem ser realizados por métodos conhecidos na técnica.

[00170] Os métodos da presente invenção para produção de um produto essencialmente isento de atividade de endoglucanase são de particular interesse na produção de polipeptídeos eucarióticos, em particular proteínas fúngicas tais como enzimas. As células deficientes em endoglucanase podem ser também usadas para expressar proteínas heterólogas de interesse farmacêutico tais como hormônios, fatores de crescimento, receptores, e similares. O termo "polipeptídeos eucarióticos" inclui não só polipeptídeos nativos, mas também aqueles polipeptídeos, p.ex., enzimas, que foram modificados por substituições, deleções ou adições de aminoácidos, ou outras modificações similares, para intensificar a atividade, termoestabilidade, tolerância ao pH e similares.

[00171] Em um aspecto adicional, a presente invenção se relaciona com um produto de proteína essencialmente isento de atividade de endoglucanase que é produzido por um método da presente invenção.

Formulações de Caldo de Fermentação ou Composições de Células

[00172] A presente invenção se relaciona também com uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. O produto de caldo de fermentação compreende adicionalmente ingredientes adicionais usados no processo de fermentação, tais como, por exemplo, células (incluindo as células hospedeiras contendo o gene codificando o polipeptídeo da presente invenção que são usadas para produzir o polipeptídeo de interesse), detritos celulares, biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. Em algumas formas de realização, a composição é um caldo inteiro de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou detritos celulares, e meio de cultura.

[00173] O termo "caldo de fermentação" como usado aqui se refere a uma preparação produzida por fermentação celular que sofre recuperação e/ou purificação nulas ou mínimas. Por exemplo são produzidos caldos de fermentação quando culturas microbianas são cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese (p.ex., expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção de proteínas para o meio de cultura de células. O caldo de fermentação pode compreender conteúdos não fracionados ou fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação não é fracionado e compreende o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (p.ex., células fúngicas filamentosas) serem removidas, p.ex., por centrifugação. Em algumas formas de realização, o caldo de fermentação contém meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares, e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

[00174] Em uma forma de realização, a formulação de caldo de fermentação e composições de células compreendem um primeiro componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 1-5 carbonos e/ou um seu sal e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos e/ou um seu sal. Em uma forma de realização específica, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um seu sal, ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um seu sal, ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores.

[00175] Em um aspecto, a composição contém um ácido(s) orgânico(s), e opcionalmente contém adicionalmente células mortas e/ou detritos celulares. Em uma forma de realização, as células mortas e/ou detritos celulares são removidos de um caldo inteiro de células mortas para proporcionar uma composição que está isenta destes componentes.

[00176] As formulações de caldo de fermentação ou composições de células podem compreender adicionalmente um conservante e/ou agente antimicrobiano (p.ex., bacteriostático), incluindo, mas não se limitando a, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio, e outros conhecidos na técnica.

[00177] O caldo inteiro ou composição de células mortas pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (p.ex., células fúngicas filamentosas) crescerem até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas. Em algumas formas de realização, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares, e células fúngicas filamentosas mortas. Em algumas formas de realização, as células microbianas presentes no caldo inteiro ou composição de células mortas podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.

[00178] Um caldo ou composição de células inteiro como descrito aqui é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, detritos celulares, componentes de meios de cultura, e/ou enzima(s) insolúvel(eis). Em algumas formas de realização, os componentes insolúveis podem ser removidos para proporcionar uma composição líquida clarificada.

[00179] As formulações de caldo inteiro e composições de células da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673.

Peptídeo Sinal

[00180] A presente invenção se relaciona também com um polinucleotídeo codificando um peptídeo sinal compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2. Os polinucleotídeos podem adicionalmente compreender um gene codificando uma proteína, que está operacionalmente ligado ao peptídeo sinal. A proteína é preferencialmente estranha ao peptídeo sinal. Em um aspecto, o polinucleotídeo codificando o peptídeo sinal é os nucleotídeos 1 a 63 de SEQ ID NO: 1.

[00181] A presente invenção se relaciona também com constructos de ácido nucleico, vetores de expressão e células hospedeiras recombinantes compreendendo tais polinucleotídeos.

[00182] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de uma proteína, compreendendo (a) cultivo de uma célula hospedeira recombinante compreendendo tal polinucleotídeo; e (b) recuperação da proteína.

[00183] A proteína pode ser nativa ou heteróloga de uma célula hospedeira. O termo "proteína" não se destina aqui a se referir a um comprimento específico do produto codificado, e, portanto, engloba peptídeos, oligopeptídeos, e polipeptídeos. O termo "proteína" engloba também dois ou mais polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas incluem também polipeptídeos híbridos e polipeptídeos fundidos.

[00184] Preferencialmente, a proteína é um hormônio, enzima, receptor ou sua porção, anticorpo ou sua porção, ou repórter. Por exemplo, a proteína pode ser uma hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorreductase, ou transferase, p.ex., uma alfa-galactosidase, alfa-glucosidase, aminopeptidase, amilase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, beta- xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamilase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase.

[00185] O gene pode ser obtido de qualquer fonte procariótica, eucariótica, ou outra.

Composições de Enzimas

[00186] A presente invenção se relaciona também com composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Preferencialmente, as composições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo "enriquecido" indica que a atividade de endoglucanase da composição foi aumentada, p.ex., com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.

[00187] As composições podem compreender um polipeptídeo da presente invenção como o principal componente enzimático, p.ex., uma composição monocomponente. Alternativamente, as composições podem compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorreductase, ou transferase, p.ex., uma alfa- galactosidase, alfa-glucosidase, aminopeptidase, amilase, betagalactosidase, beta-glucosidase, beta-xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamilase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase.

[00188] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[00189] São dados em baixo exemplos de usos preferenciais das composições da presente invenção. A dosagem da composição e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica.

Processo de Fabricação de Têxteis

[00190] O processamento de um tecido, tal como de um material celulósico, em material pronto para a fabricação de peças de vestuário envolve vários passos: fiação da fibra em um fio; construção de tecido urdido ou tricotado a partir do fio; e processos de preparação subsequentes, operações de tingimento/impressão e acabamento. Os processos de preparação são necessários para remoção de impurezas naturais e induzidas pelo homem das fibras e para melhoria da sua aparência estética e processabilidade antes por exemplo do tingimento/impressão e acabamento. Processos comuns de preparação compreendem desengomagem (para artigos urdidos), desengorduramento, e branqueamento, que produzem um tecido adequado para tingimento ou acabamento.

[00191] O tecido urdido é construído por tecelagem de fios "de preenchimento" ou "de trama" entre fios de urdidura esticados na direção longitudinal no tear. Os fios de urdidura têm de ser engomados antes da tecelagem para os lubrificar e proteger da abrasão na inserção a elevada velocidade dos fios de preenchimento durante a tecelagem. Agentes engomantes comuns são amidos (ou derivados de amidos e amidos modificados), poli(álcool de vinila), celulose de carboximetila (i.e., CMC) onde os amidos são dominantes. A parafina, aglutinantes acrílicos e variedade de lubrificantes são frequentemente incluídos na mistura engomante. O fio de preenchimento pode ser urdido através dos fios de urdidura de maneira "um por cima - um por baixo" (tecelagem simples) ou "um por cima - dois por baixo" (tecido entrançado) ou qualquer outra miríade de permutações. Geralmente, os vestidos, camisas, calças, panos para lençóis, toalhas, cortinados, etc. são produzidos a partir de tecidos urdidos. Depois do tecido ser fabricado, tem que se remover novamente a goma do tecido (i.e., desengomagem).

[00192] A confecção de malhas é a formação de um tecido juntando laçadas de fios interligadas. Em oposição à tecelagem, que é construída a partir de dois tipos de fios e tem muitas "pontas", o tecido tricotado é produzido a partir de um único fio contínuo. Como com a tecelagem existem muitos modos diferentes de enlaçar os fios, e as propriedades finais dos tecidos dependem tanto do fio como do tipo de malha. Roupa interior, blusas, meias, camisas de esporte, camisolas, etc. são derivadas de tecidos tricotados.

Desengomagem

[00193] A desengomagem é a degradação e/ou remoção de compostos engomantes dos fios de urdidura em um tecido urdido. O amido é usualmente removido por um procedimento de desengomagem enzimática. Adicionalmente, a desengomagem oxidativa e a desengomagem química com ácidos ou bases são por vezes usadas.

[00194] Em algumas formas de realização, a enzima de desengomagem é uma enzima amilolítica, tal como uma alfa-amilase, uma beta-amilase, uma manase, uma glicoamilase, ou uma sua combinação.

[00195] Alfa e beta-amilases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica, bem como mutantes e variantes quimicamente ou geneticamente modificados de tais amilases. Alfa-amilases adequadas incluem alfa-amilases obteníveis de espécies de Bacillus. Amilases comerciais adequadas incluem mas não estão limitadas a OPTISIZE® NEXT, OPTISIZE® FLEX e OPTISIZE® COOL (todas da Genencor International Inc.), e DURAMYL™, ERMAMYL™, FUNGAMYL™ TERMAMYL™, AQUAZYME™ e BAN™ (todas disponíveis da Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca).

[00196] Outras enzimas amilolíticas adequadas incluem as CGTases (ciclodextrina glucanotransferases, EC 2.4.1.19), p.ex., aquelas obtidas das espécies Bacillus, Thermoanaerobactor ou Thermoanaero-bacterium.

Desengorduramento

[00197] O desengorduramento é usado para remover impurezas das fibras, para inchar as fibras e para remover tegumento de sementes. É um dos passos mais críticos. Os objetivos principais do desengorduramento são a) limpar uniformemente o tecido, b) suavizar as partículas e outros resíduos, c) melhorar a absorção dos tecidos, d) saponificar e solubilizar gorduras, óleos, e ceras, e e) minimizar o algodão imaturo. O desengorduramento com hidróxido de sódio a cerca da temperatura de ebulição é o tratamento aceite para algodão a 100 %, enquanto o hidróxido de cálcio e o carbonato de sódio são usados menos frequentemente. As fibras sintéticas são desengorduradas em condições muito mais suaves. Tensioativos e agentes quelantes são essenciais para o desengorduramento alcalino. Foi introduzido o desengorduramento enzimático, em que se relatou que a celulase, hemicelulase, pectinase, lipase, e protease têm todas efeitos de desengorduramento.

Branqueamento

[00198] O branqueamento é a destruição da cor pigmentada e/ou impurezas coloridas bem como remoção de fragmentos de tegumento das sementes. É o tratamento químico mais crítico uma vez que tem de ser mantido um equilíbrio entre os graus de brancura sem dano às fibras. O branqueamento é realizado por uso de química oxidativa ou redutora. Os agentes oxidantes podem ser adicionalmente subdivididos em aqueles que empregam ou geram: a) hipoclorito (OCT), b) dióxido de cloro (ClO2), e espécies de hidroperóxido. Os agentes redutores são tipicamente dióxido de enxofre, sais de hidrossulfito, etc. Foi relatado o branqueamento enzimático usando glucose oxidase. Tradicionalmente é usado peróxido de hidrogênio em este processo.

Impressão ou tingimento

[00199] A impressão ou tingimento de têxteis é levado a cabo por aplicação de corantes (os nomes "corante" e "matéria corante" podem ser usados indistintamente no contexto) ao têxtil por qualquer método apropriado para ligação da matéria corante às fibras nos têxteis. O tingimento de têxteis é por exemplo levado a cabo por passagem do tecido através de uma solução concentrada de corante, seguida por armazenamento do tecido úmido em um compartimento apertado com vapor para dar tempo para a difusão e reação do corante com o substrato de tecido antes de enxaguamento do corante que não reagiu. Alternativamente, o corante pode ser fixado por vaporização subsequente do têxtil antes do enxaguamento. A matéria corante solúvel em excesso não ligada às fibras tem de ser removida após o tingimento para assegurar a firmeza dos têxteis tingidos e para prevenir transferência indesejada de corante durante a lavagem do têxtil pelo consumidor. Um processo enzimático para remoção de corante em excesso do tecido tingido com um licor de enxaguamento compreendendo pelo menos uma peroxidase, um agente de oxidase e pelo menos um mediador, tal como um licor compreendendo uma peroxidase, peroxidase de hidrogênio e um mediador tipo 1-hidroxi-benzotriazol é divulgado em WO99/34054.

Biopolimento

[00200] Como usado aqui, o termo "biopolimento", "bioblasting", "remoção de borbotos" e "antiformação de borbotos" são permutáveis.

[00201] A maioria dos tecidos de algodão e dos tecidos de combinações de algodão tem uma aparência ao toque que é bastante dura e rígida sem a aplicação de componentes de acabamento. A superfície do tecido não é também macia porque pequenas microfibrilas difusas sobressaem dela. Adicionalmente, após um período de uso relativamente curto, aparecem borbotos à superfície do tecido dando-lhe deste modo um aspecto desagradável, desgastado.

[00202] O biopolimento é um método para tratar tecidos celulósicos durante a sua fabricação por enzimas tais como celulases, que melhora a qualidade do tecido no que diz respeito à "formação de borbotos reduzida". Os efeitos mais importantes do biopolimento podem ser caracterizados por menos pelos e borbotos, lustre/brilho aumentados, toque do tecido melhorado, suavidade duradoura aumentada e/ou absorção de água aumentada. O biopolimento tem usualmente lugar no processamento a úmido da fabricação de tecidos ou peças de vestuário tricotados e urdidos. O processamento a úmido compreende tais passos como, p.ex., desengomagem, desengorduramento, branqueamento, lavagem, tingimento/impressão e acabamento. O biopolimento pode ser realizado como um passo separado após qualquer um dos passos de umedecimento ou em combinação com qualquer um destes passos de umedecimento, tal como em combinação com um passo de branqueamento com catalase e/ou em combinação com um passo de tingimento.

Fabricação de Tecidos de Brim

[00203] Alguns tecidos tingidos tais como tecidos de brim, requerem que os fios sejam tingidos antes da tecelagem. Para tecidos de brim, os fios de urdidura são tingidos por exemplo com indigo, e engomados antes da tecelagem. Preferencialmente, o tingimento dos fios de brim é um tingimento em anel. Uma forma de realização preferencial da invenção é tingimento em anel do fio com um corante de cuba tal como indigo, ou um corante relacionado com indigo tal como tioindigo, ou um corante de enxofre, ou um corante direto, ou um corante reativo, ou um naftol. O fio pode ser também tingido com mais do que um corante, p.ex., primeiro com um corante de enxofre e depois com um corante de cuba, ou vice versa.

[00204] Preferencialmente, os fios sofrem desengorduramento e/ou branqueamento antes de serem tingidos, de modo a se alcançar uma qualidade do tecido de brim mais elevada. Em geral, depois de urdido em tecido tingido, tal como brim, o tecido ou peça de vestuário tingido prossegue para um passo de desengomagem, preferencialmente seguido por um passo de biolapidação e/ou um passo de modificação da cor.

[00205] O processo de desengomagem como usado aqui é o mesmo processo como mencionado acima no contexto.

[00206] Após a desengomagem, o tecido tingido é submetido a um passo de biolapidação se for desejado um aspecto desgastado. O passo de biolapidação pode ser realizado com enzimas ou pedras-pomes ou ambas. Como usado aqui, os termos "biolapidação", "lavagem à pedra" e "abrasão" são intermutáveis, o que significa agitação do brim em um meio aquoso contendo um agente de abrasão mecânico tal como pedra-pomes, uma celulase abrasiva ou uma combinação das destas, para proporcionar um aspecto "lavado à pedra". Em todos os casos é necessária ação mecânica para remover o corante, e o tratamento é usualmente levado a cabo em máquinas de lavagem, como lavadores de tambor, lavadores de barriga. Como resultado de uma remoção não uniforme do corante existem contrastes entre zonas tingidas e zonas das quais foi removido o corante, isto aparece como uma variação localizada da densidade da cor. O tratamento com celulase pode substituir completamente o tratamento com pedras-pomes. No entanto, o tratamento com celulase pode ser também combinado com o tratamento com pedra-pomes, quando é desejado produzir um acabamento fortemente desgastado.

[00207] A biolapidação é geralmente seguida pelo terceiro passo, pós- tratamento que inclui geralmente passos de lavagem e enxaguamento durante as quais podem ser usados detergentes, branqueadores óticos, agentes de branqueamento ou amaciadores.

[00208] O método para fabricação de têxtil da presente invenção, por tratamento do têxtil com um polipeptídeo isolado tendo atividade de endoglucanase como definido na presente invenção, pode ser aplicado a um processo de biolapidação.

[00209] Em outra forma de realização, a invenção proporciona um processo de fabricação de brim, que compreende: a) desengomagem do tecido de brim; b) biolapidação do brim com um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presente invenção; c) enxaguamento.

[00210] O processo da invenção pode ser levado a cabo em condições convencionais em uma máquina de lavagem convencionalmente usada para lavagem à pedra, p.ex., um lavador-extrator, lavador de barriga, etc. A enzima da invenção deve ser adicionada em uma quantidade eficaz.

Condições de Processo

[00211] Preferencialmente, na presente invenção, o método de tratamento de têxtil com um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase é aplicado em um processo de biolapidação ou de biopolimento. Todas as condições de processo em baixo são aplicáveis tanto no processo de biolapidação como no processo de biopolimento.

[00212] É presentemente recomendado que uma razão licor/têxtil adequada a ser usada no presente método possa estar na gama de cerca de 20:1 a cerca de 1:1, preferencialmente na gama de cerca de 15:1 a cerca de 3:1, mais preferencialmente na gama de cerca de 15:1 a 5:1 (Volume/peso, mL/g).

[00213] Em processos de "biolapidação" ou "biopolimento" convencionais, o tempo de reação está usualmente na gama de cerca de 10 minutos a cerca de 16 horas. Preferencialmente, o tempo de reação está dentro da gama de cerca de 20 minutos a cerca de 180 minutos, mais preferencialmente o tempo de reação está dentro da gama de cerca de 30 minutos a cerca de 120 minutos.

[00214] O pH do meio de reação depende grandemente da(s) enzima(s) em questão. Preferencialmente, o processo da invenção é levado a cabo a um pH na gama de cerca de pH 4 a cerca de pH 8, preferencialmente na gama de cerca de pH 5 a cerca de pH 7,5, ou dentro da gama de cerca de pH 6 a cerca de pH 7,0.

[00215] O processo da presente invenção é capaz de funcionar a uma temperatura abaixo de 60 °C, preferencialmente abaixo de 50 °C, mais preferencialmente abaixo de 45 °C, mais preferencialmente abaixo de 40 °C, ainda mais preferencialmente abaixo de 35 °C, ainda mais preferencialmente abaixo de 30 °C, ainda mais preferencialmente abaixo de 25 °C.

[00216] Em algumas formas de realização, o processo da presente invenção é conduzido à gama de temperaturas de 15-65 °C, preferencialmente 15-45 °C, preferencialmente 20-60 °C, preferencialmente 20-55 °C, preferencialmente 20-45 °C, preferencialmente 20-40 oC, mais preferencialmente 25-55 °C, mais preferencialmente 25-50 °C, mais preferencialmente 25-45 °C, mais preferencialmente 25-35 °C, e ainda mais preferencialmente 30-45 °C.

[00217] A dosagem de enzima depende grandemente do tempo de reação da enzima e da atividade da enzima, i.e., um tempo de reação enzimático relativamente curto ou uma atividade enzimática baixa necessita de uma dosagem de enzima relativamente aumentada, e vice versa. Em geral, a dosagem de enzima pode ser estipulada de acordo com o tempo de reação disponível.

[00218] A quantidade de polipeptídeo com atividade de endoglucanase a ser usada de acordo com o método da presente invenção depende de muitos fatores. De acordo com a invenção, a concentração de polipeptídeo da presente invenção no meio aquoso pode ser de cerca de 0,001 a cerca de 10 miligramas (mg) de proteína enzima por grama (g) de tecido, preferencialmente de 0,02-5 miligramas de proteína enzima por grama de tecido, mais preferencialmente de 0,03-3 miligramas de proteína enzima por grama de tecido.

[00219] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção.

[00220] Os presentes métodos e composições são adicionalmente descritos nos seguintes parágrafos numerados.

[00221] 1. Um método para tratamento de têxtil com um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de elevada, ou muito elevada, estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) a cadeia complementar de comprimento total de (i); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (d) uma variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de endoglucanase.

[00222] 2. Em algumas formas de realização do método do parágrafo 1, em que o polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase tem pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00223] 3. Em algumas formas de realização do método do parágrafo 1, em que o polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de 10 ou 9 ou 8 ou 7 ou 6 ou 5 ou 4 ou 3 ou 2 ou 1 aminoácido(s) do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00224] 4. Em algumas formas de realização do método de qualquer um dos parágrafos 1-3, em que o polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase é obtido de Neurospora, especialmente Neurospora tetrasperma ou Neurospora crassa.

[00225] 5. Em algumas formas de realização do método de qualquer um dos parágrafos 1-4, compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

[00226] 6. Em algumas formas de realização do método de qualquer um dos parágrafos precedentes, em que o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 22 a 237 de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos 22 a 237 de SEQ ID NO: 4.

[00227] 7. Em algumas formas de realização do método de qualquer um dos parágrafos precedentes, em que o método é conduzido sob uma gama de temperaturas de 15-65 °C, preferencialmente 20-60 °C, preferencialmente 25-55 °C, mais preferencialmente 25-50 °C, e ainda mais preferencialmente 30-45 °C.

[00228] 8. Em algumas formas de realização do método de qualquer um dos parágrafos precedentes, em que o método é conduzido sob pH 4 a cerca de pH 8, preferencialmente na gama de cerca de pH 5 a cerca de pH 7,5, ou dentro da gama de cerca de pH 6 a cerca de pH 7.

[00229] 9. Em algumas formas de realização do método de qualquer um dos parágrafos precedentes, em que o método é aplicado em um processo de biopolimento.

[00230] 10. Em algumas formas de realização do método de qualquer um dos parágrafos precedentes, em que o método é aplicado em um processo de biolapidação.

[00231] 11. Em algumas formas de realização do método de qualquer um dos parágrafos precedentes, em que o têxtil de tratamento é fabricação do têxtil.

[00232] 12. Um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de elevada, ou muito elevada, estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) a cadeia complementar de comprimento total de (i); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (d) uma variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de endoglucanase.

[00233] 13. Em algumas formas de realização do método do parágrafo 12, tendo pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00234] 14. Em algumas formas de realização do método do parágrafo 12 ou 13, compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção de 5 ou 4 ou 3 ou 2 ou 1 aminoácido(s) do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00235] 15. Em algumas formas de realização do método de qualquer um dos parágrafos 12-14, compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 2, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00236] 16. Em algumas formas de realização do método de qualquer um dos parágrafos 12-15, em que o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 22 a 237 de SEQ ID NO: 2.

[00237] 17. Um polipeptídeo compreendendo um domínio catalítico selecionado do grupo consistindo em: (a) um domínio catalítico tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com os aminoácidos 22 a 237 de SEQ ID NO: 2; (b) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de muito elevada estringência com (i) os nucleotídeos 64 a 764 de SEQ ID NO: 1, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com os nucleotídeos 64 a 764 de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA; (d) uma variante dos aminoácidos 22 a 237 de SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições; e (e) um fragmento do domínio catalítico de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de endoglucanase.

[00238] 18. Em algumas formas de realização do método de qualquer um dos parágrafos 12-17, que é obtido de Neurospora, especialmente Neurospora tetrasperma ou Neurospora crassa.

[00239] 19. Uma composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 12-18.

[00240] 20. Um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 12-18.

[00241] 21. Um constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 20 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[00242] 22. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 20 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo.

[00243] 23. Um método de produção do polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 12-18, compreendendo cultivo de uma célula que, na sua forma de tipo selvagem, produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo.

[00244] 24. O método do parágrafo 23, compreendendo adicionalmente recuperação do polipeptídeo.

[00245] 25. Um método de produção de um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase, compreendendo cultivo da célula hospedeira do parágrafo 22 sob condições conducentes à produção do polipeptídeo.

[00246] 26. O método do parágrafo 25, compreendendo adicionalmente recuperação do polipeptídeo.

[00247] 27. Uma planta, parte de planta ou célula de planta transgênica transformada com um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 12-18.

[00248] 28. Um método de produção de um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase, compreendendo cultivo da planta ou célula de planta transgênica do parágrafo 27 sob condições conducentes à produção do polipeptídeo.

[00249] 29. O método do parágrafo 28, compreendendo adicionalmente recuperação do polipeptídeo.

[00250] 30. Um método de produção de um mutante de uma célula genitora, compreendendo inativação de um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 12-18, que resulta no mutante produzindo menos do polipeptídeo do que a célula genitora.

[00251] 31. Uma célula mutante produzida pelo método do parágrafo 30.

[00252] 32. A célula mutante do parágrafo 31, compreendendo adicionalmente um gene codificando uma proteína nativa ou heteróloga.

[00253] 33. Um método de produção de uma proteína, compreendendo cultivo da célula mutante do parágrafo 31 ou 32 sob condições conducentes à produção da proteína.

[00254] 34. O método do parágrafo 33, compreendendo adicionalmente recuperação da proteína.

[00255] 35. Uma molécula de RNA inibidor de fita dupla (dsRNA) compreendendo uma subsequência do polinucleotídeo do parágrafo 20, em que opcionalmente o dsRNA é uma molécula de siRNA ou miRNA.

[00256] 36. A molécula de RNA inibidor de fita dupla (dsRNA) do parágrafo 35, que tem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos do dúplex em comprimento.

[00257] 37. Um método de inibição da expressão de um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase em uma célula, compreendendo administração à célula ou expressão na célula da molécula de RNA inibidor de fita dupla (dsRNA) do parágrafo 35 ou 36.

[00258] 38. Uma célula produzida pelo método do parágrafo 37.

[00259] 39. A célula do parágrafo 38, compreendendo adicionalmente um gene codificando uma proteína nativa ou heteróloga.

[00260] 40. Um método de produção de uma proteína, compreendendo cultivo da célula do parágrafo 38 ou 39 sob condições conducentes à produção da proteína.

[00261] 41. O método do parágrafo 40, compreendendo adicionalmente recuperação da proteína.

[00262] 42. Um polinucleotídeo codificando um peptídeo sinal compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2.

[00263] 43. Um constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um gene codificando uma proteína operacionalmente ligado ao polinucleotídeo do parágrafo 42, em que o gene é estranho ao polinucleotídeo codificando o peptídeo sinal.

[00264] 44. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo um gene codificando uma proteína operacionalmente ligado ao polinucleotídeo do parágrafo 42, em que o gene é estranho ao polinucleotídeo codificando o peptídeo sinal.

[00265] 45. Um método de produção de uma proteína, compreendendo cultivo de uma célula hospedeira recombinante compreendendo um gene codificando uma proteína operacionalmente ligado ao polinucleotídeo do parágrafo 42, em que o gene é estranho ao polinucleotídeo codificando o peptídeo sinal, sob condições conducentes à produção da proteína.

[00266] 46. O método do parágrafo 45, compreendendo adicionalmente recuperação da proteína.

[00267] 47. Uma formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 12-18.

Exemplos Materiais

[00268] Os químicos usados como tampões e substratos foram produtos comerciais de pelo menos grau de reagente.

Estirpes

[00269] A estirpe de Neurospora tetrasperma NRRL11265 foi usada como a fonte do gene da endoglucanase da família GH45.

[00270] A estirpe de Aspergillus oryzae MT3568 foi usada para expressão heteróloga do gene da família GH45 codificando um polipeptídeo tendo homologia com polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase. A. oryzae MT3568 é um derivado do gene destruído amdS (acetamidase) de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694) no qual a auxotrofia de pyrG foi restabelecida por desagregação do gene da acetamidase (amdS) de A. oryzae com o gene pyrG.

Meios

[00271] O meio DAP-4C-1 era composto por 0,5 g de extrato de levedura, 10 g de maltose, 20 g de dextrose, 11 g de sulfato de magnésio heptaidratado, 1 g de fosfato de dipotássio, 2 g de ácido cítrico monoidratado, 5,2 g de fosfato de potássio tribásico monoidratado, 1 mL de Dowfax 63N10 (agente antiespumante), 2,5 g de carbonato de cálcio, suplementado com 1 mL de solução de metais KU6, e água desionizada até 1000 mL.

[00272] A solução de metais KU6 era composta por 6,8 g de ZnCl2, 2,5 g de CuSO4-5H2O, 0,13 g de NiCl2, 13,9 g de FeSO4-7H2O, 8,45 g de MnSO4-H2O, 3 g de C6H8O7-H2O, e água desionizada até 1000 mL.

[00273] As placas PDA eram compostas por 39 g de Ágar de Dextrose de Batata e água desionizada até 1000 mL.

[00274] As placas LB eram compostas por 10 g de Triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, 15 g de ágar Bacto, e água desionizada até 1000 mL.

[00275] O meio LB era composto por 10 g de Triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, e 10 g de cloreto de sódio, e água desionizada até 1000 mL.

[00276] As placas de Sacarose-T COVE eram compostas por 342 g de sacarose, 20 g de pó de ágar, 20 mL de solução de sais COVE, e água desionizada até 1000 mL. O meio foi esterilizado por autoclavagem a 15 psi durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edição, Revisão A, 1998). O meio foi resfriado até 60 °C e foram adicionados acetamida a 10 mM, Triton X-100 (50 μL/500 mL).

[00277] Os tubos N-Ágar COVE eram compostos por 218 g de Sorbitol, 10 g de Dextrose, 2,02 g de KNO3, 25 g de Ágar, 50 mL de solução de sais Cove, e água desionizada até 1000 mL.

[00278] A solução de sais COVE era composta por 26 g de MgSO4-7H2O, 26 g de KCl, 26 g de KH2PO4, 50 mL de solução de metais vestigiais COVE, e água desionizada até 1000 mL.

[00279] A solução de metais vestigiais COVE era composta por 0,04 g de Na2B4O7‘10H2O, 0,4 g de CuSO4‘5H2O, 1,2 g de FeSO4‘7H2O, 0,7 g de MnSO4-H2O, 0,8 g de Na2MoO<2H2O, 10 g de ZnSO<7H2O, e água desionizada até 1000 mL.

[00280] O meio MDU2BP contém por litro 45 g de maltose, 1 g de MgSO4-7H2O, 1 g de NaCl, 2 g de K2SO4, 12 g de KH2PO4, 7 g de extrato de levedura, 2 g de ureia e 0,5 mL de solução de metais vestigiais AMG. O meio é titulado até pH 5,0 com NaOH e esterilizado por filtração.

[00281] Os metais vestigiais AMG eram compostos por por litro 14,3 g de ZnSO4-7H2O, 2,5 g de CuSO4-5H2O, 0,5 g de NiCI2, 13,8 g de FeSO4, 8,5 g de MnSO4, 3,0 g de ácido cítrico.

[00282] O meio YEG contém por litro 5 g de extrato de levedura e 20 g de dextrose e é esterilizado por autoclavagem.

[00283] O tampão TE contém Tris-HCl a 10 mM e EDTA a 0,1 mM pH 8,0.

[00284] Tampão a pH 5,0 com acetato a 50 mM: 2,873 g de acetato de sódio e 0,901 g de ácido acético foram dissolvidos em 1 L de água desionizada;

[00285] Tampão a pH 6,5 com fosfato a 50 mM: 5,642 g de hidrogenofosfato dissódico dodecaidratado (Na2HPO4-12H2O) e 5,344 g de diidrogenofosfato de sódio diidratado (NaH2PO4-2H2O) foram dissolvidos em 1 L de água desionizada;

[00286] Tampão a pH 7,5 com fosfato a 50 mM: 15,045 g de hidrogenofosfato dissódico dodecaidratado (Na2HPO4-12H2O) e 1,248 g de diidrogenofosfato de sódio diidratado (NaH2PO4-2H2O) foram dissolvidos em 1 L de água desionizada;

[00287] Tampão a pH 8,5 com fosfato a 50 mM: 17,607 g de hidrogenofosfato dissódico dodecaidratado (Na2HPO4-12H2O) e 0,116 g de diidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) foram dissolvidos em 1 L de água desionizada.

Enzimas

[00288] Biotouch XC 300® (um produto de celulase neutro, comercialmente disponível da AB Enzymes, descrito como SEQ ID NO:13 Geomyces pannorum RF6293 Cel45 em WO2010/076388).

Tecidos

[00289] Entrelaçamento de algodão: 40S, branqueado, HM-A0008, disponível da HM Cotton Co., Ltd, Guangzhou, China.

[00290] Brim: lote No. L001, 7*7/76*42, 12 oz., disponível da Hangzhou Yimei, Co., Ltd, China.

Método Determinação da perda de peso

[00291] As amostras foram colocadas na câmara condicionada (65 % +/- 5 % de umidade, 20 +/- 1 °C) durante 24 horas antes de serem numeradas, pesadas pela balança analítica (para amostras abaixo de 100 g) ou uma balança de precisão (para amostras acima de 100 g) e registradas. Após tratamento, todas as amostras foram secas em tambores (AEG, LAVATHERM 37700, Alemanha) durante 1 hora e condicionadas durante 24 horas na câmara condicionada mencionada como acima. Para cada amostra, a perda de peso foi definida como em baixo:

Teste de notas de formação de borbotos

[00292] Os tecidos incluindo tratados e não tratados que tinham sido pré-condicionados em clima normal (65 %, de umidade, 21 °C) durante pelo menos 24 horas foram testados quanto às notas de formação de borbotos com um Testador Nu-Martindale (James H. Heal Co. Ltd, Inglaterra) com tecidos não tratados do mesmo tipo dos tecidos desgastados. Um teste de formação de borbotos padrão (Norma Suíça (SN) 198525) foi levado a cabo após 2000 Rotações por marcação de 1-5, com o significado definido como em baixo, onde 1 mostra antiformação de borbotos fraca e 5 mostra excelente propriedade antiformação de borbotos. Assim, quanto mais elevado o índice de notas de formação de borbotos de Martindale, mais eficaz o tratamento de biopolimento com endoglucanase. Nota 5: Nenhuma formação de borbotos Nota 4: Formação de Borbotos Ligeira Nota 3: Formação de Borbotos Moderada Nota 2: Formação de Borbotos Distinta Nota 1: Formação de Borbotos Densa são permitidas notas 1/2, 1/4.

[00293] Para tornar o resultado do teste mais confiável foram levadas a cabo 3 leituras separadas por diferentes pessoas para cada amostra, e a média das 3 leituras foi adotada como o resultado final de notas de formação de borbotos.

Medição da Cor para brim

[00294] O nível de abrasão e nível de contracoloração das amostras de brim foram determinados por medição da refletância com DataColor SF450X pré-calibrado, alternativamente pode ser usado um dispositivo equivalente. Foram tiradas quatro leituras para cada amostra, e a média das leituras foi usada. O nível de abrasão foi avaliado com o índice CIE L* no lado azul (parte da frente) da amostra, e o nível de contracoloração foi avaliado com o índice CIE b* na parte de trás da amostra.

[00295] L* indica a mudança em branco/preto em uma escala de 0 a 100, e uma diminuição em L* significa um aumento na cor preta (diminuição na cor branca) e um aumento em L* significa um aumento na cor branca (diminuição na cor preta). Unidade Delta L* = L* da amostra tratada com uma certa celulase - L* da amostra antes do tratamento com celulase. Quanto maior for a unidade de Delta L*, mais elevado é o nível de abrasão do brim, p.ex., uma unidade Delta L* de 4 tem nível de abrasão mais elevado do que unidade Delta L* de 3.

[00296] b* indica a mudança em azul/amarelo, e uma diminuição em b* significa um aumento na cor azul (diminuição na cor amarela), e um aumento em b* significa um aumento na cor amarela (diminuição na cor azul). Unidades Delta b* = b* da amostra tratada com uma certa celulase - b* da amostra antes do tratamento com celulase. Uma unidade de Delta b* maior corresponde a um nível de contracoloração mais baixo, p.ex., uma unidade Delta b* de -1,5 tem nível de contracoloração mais baixo do que a unidade Delta b* de -2,5.

Conteúdo de Proteínas

[00297] A proteína enzima em um produto de enzima pode ser medida com BCATM Protein Assay Kit (número de produto 23225, comercialmente disponível da Thermo Fisher Scientific Inc.) de acordo com o manual do produto.

Exemplo 1: Clonagem de um gene da família GH45 de Neurospora tetrasperma

[00298] Um conjunto de iniciadores de clonagem (SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 6) foi desenhado para amplificar por PCR o gene codificando SWISSPROT: G4V0S1. Um marcador 5’ para clonagem InFusion no nosso vetor de expressão foi adicionado aos iniciadores de clonagem de acordo com o protocolo descrito no InFusion HD EcoDry Cloning Kit (Cat. 639691) (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EUA) para ajustar a clonagem no vetor de expressão pDAu109 (WO 2005042735). Iniciador direto: ACACAACTGGGGATCCACCATGCGCTCCTCCACTGTTCTGC (SEQ ID NO: 5) Iniciador reverso: AGATCTCGAGAAGCTTAGGCACACTGGTGGTAATAATCGTTGA (SEQ ID NO: 6)

[00299] O gene da endoglucanase de N. tetrasperma foi amplificado por PCR usando os iniciadores de clonagem diretos e reversos descritos acima (SEQ ID NO: 5 e 6) com DNA do genoma da estirpe de Neurospora tetrasperma NRRL11265, previamente preparado a partir de micélio cultivado em placas PDA com o kit MPBIO (FastDNA Spin kit for soil, Cat. 116560-200). A PCR era composta por 1 μL de DNA genômico, 2,5 μL de iniciador de clonagem direto (10 μM), 2,5 μL de iniciador de clonagem reverso (10 μM), 10 μL de tampão 5X HF (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), 1,6 μL de MgCl2 a 50 mM, 2 μL de dNTP a 10 mM, 0,5 μL de DNA polimerase PHUSION® (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), e água de grau PCR até 50 μL. Iniciadores SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 foram usados em DNA genômico de N. tetrasperma. A reação de amplificação foi realizada usando um Termociclador DYAD® (M.J. Research Inc. South San Francisco, CA, EUA) programado para 2 minutos a 98 °C seguido por 19 ciclos de impacto cada um a 98 °C durante 15 segundos, 70 °C (-1 °C/ciclo) durante 30 segundos, e 72 °C durante 2 minutos e 30 segundos; e 25 ciclos cada um a 98 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 2 minutos e 30 segundos, e finalmente uma extensão de 5 minutos a 72 °C.

[00300] Os produtos de reação foram isolados em eletroforese em gel de agarose a 1,0 % usando tampão TAE onde uma banda de PCR de aproximadamente 0,9 a 0,95 kb foi excisada do gel e purificada usando um GFX® PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, Hiller0d, Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante. DNA correspondendo ao gene da endoglucanase de N. tetrasperma foi clonado no vetor de expressão pDAu109 (WO 2005042735) previamente linearizado com Bam HI e Hind III, usando um IN-FUSION™ Dry-Down PCR Cloning Kit (Cat. 639691) (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

[00301] Um volume de 2,5 μL da mistura de ligação diluída foi usado para transformar células quimicamente competentes TOP10 de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Três colônias foram selecionadas em placas ágar LB contendo 100 μg de ampicilina por mL e cultivadas durante a noite em 3 mL de meio LB suplementado com 100 μg de ampicilina por mL. O DNA de plasmídeo foi purificado usando um Qiagen Spin Miniprep kit (Cat. 27106) (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência do gene de N. tetrasperma foi verificada por sequenciação de Sanger antes de expressão heteróloga. O plasmídeo designado como 001-8#1 (contendo gene SEQ ID NO: 1) foi selecionado para transformação com protoplastos e expressão heteróloga da sua endoglucanase codificada em uma célula hospedeira de Aspergillus oryzae MT3568.

Exemplo 2: Caracterização do DNA genômico de Neurospora tetrasperma codificando um polipeptídeo da Família GH45

[00302] A sequência de DNA genômico (SEQ ID NO: 1) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 2) do gene da endoglucanase de Neurospora tetrasperma são mostradas em baixo. A sequência codificante de SEQ ID NO: 1 tem 935 pb incluindo o códon de terminação com um íntron previsto (339..391). A proteína prevista codificada tem 293 aminoácidos. Usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) foi previsto um peptídeo sinal de 21 resíduos. Usando PEPSTATS do pacote EMBOSS (Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277) foi prevista uma proteína madura de 272 aminoácidos com uma massa molecular de 28 kDa e um ponto isoelétrico de 6,9.

[00303] Um alinhamento global par a par comparativo da sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) foi determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443- 453) com penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a sequência de aminoácidos deduzida do gDNA de N. tetrasperma codificando um polipeptídeo da família GH45 tendo homologia com proteínas com atividade de endoglucanase partilha 98,9 % de identidade (excluindo intervalos) com a sequência de aminoácidos deduzida de uma endoglucanase de N. tetrasperma (Uniprot: G4V0S1).

Exemplo 3: Transformação de Aspergillus oryzae com o gene codificando uma endoglucanase de Neurospora tetrasperma e seleção dos melhores transformantes

[00304] Protoplastos de Aspergillus oryzae MT3568 foram preparados de acordo com WO 95/002043. Cem μL de protoplastos foram misturados com 2,5-15 μg do plasmídeo 001-8#1 (preparado no Exemplo 1) e 250 μL de PEG 4000 a 60 % (Applichem, Darmstadt, Alemanha) (polietileno glicol, peso molecular 4.000), CaCl2 a 10 mM, e Tris-HCl a 10 mM pH 7,5 e gentilmente misturados. A mistura foi incubada a 37 °C durante 30 minutos e os protoplastos foram espalhados sobre placas COVE para seleção. Após incubação durante 4-7 dias a 37 °C, esporos de oito transformantes foram inoculados em 0,5 mL de meio DAP-4C-1 suplementado ácido láctico e com fosfato de diamônio em placas de 96 poços profundos. Após cultivo de 4 dias a 30 °C, os caldos de cultura foram analisados por SDS-PAGE usando Novex® 4-20% Tris-Glycine Gel (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA) para identificar os transformantes produzindo a maior quantidade de endoglucanase recombinante de N. tetrasperma.

[00305] Esporos do melhor transformante foram espalhados em placas Sacarose-T COVE contendo TRITON® X-100 a 0,01 % de modo a isolar colônias únicas. O espalhamento foi repetido duas vezes em total em placas Sacarose-T COVE, e depois uma única colônia foi espalhada em um tubo N-Ágar COVE até à esporulação.

Exemplo 4: Fermentação de Aspergillus oryzae transformada com o gene codificando uma endoglucanase de Neurospora tetrasperma

[00306] 150 mL de meio DAP-4C-1 suplementado com 5 mL de ácido láctico a 20 % e 3,5 mL de fosfato de diamônio a 50 % e esporos dos melhores transformantes foram cultivados em frascos de agitação durante 4 dias a uma temperatura de 30 °C sob agitação de 100 rpm. O caldo de cultura foi coletado por filtração usando um dispositivo de filtro de 0,2 μm.

Exemplo 5: Purificação de endoglucanase de Neurospora tetrasperma recombinante

[00307] (NH4)2SO4 foi adicionado ao caldo de cultura da Aspergillus oryzae recombinante (transformante preparado no Exemplo 3), a concentração final de (NH4)2SO4 foi 1,2 M. A solução foi filtrada através de um filtro de 0,45 mm e aplicada a coluna Phenyl Sepharose 6 Fast Flow de 40 mL (GE) equilibrada usando o tampão de equilíbrio consistindo em Tris- HCl a 20 mM, pH 7,0 suplementado com (NH4)2SO4 a 1,2 M, a proteína foi eluída com um gradiente linear de (NH4)2SO4 (1,2-0 M). As frações foram avaliadas por SDS-PAGE (NP0336BOX, NUPAGE 4-12 % BT GEL 1,5MM15W). As frações contendo uma banda de aproximadamente 28 kDa foram agrupadas. Depois, a solução agrupada foi concentrada por ultrafiltração.

Exemplo 6: Identificação de um gene de glicosil hidrolase da Família GH45 na sequência genômica de Neurospora crassa

[00308] Uma pesquisa tblastn (Altschul et al., 1997# Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) da sequência do genoma de Neurospora crassa (The Broad Institute, Cambridge, MA, EUA) foi levada a cabo usando como questão a sequência da proteína endoglucanase V de GH45 de Humicola insolens (número de acesso do GeneSeqP AEB00296). Um gene foi identificado como um homólogo putativo da Família GH45 com base em um elevado grau de similaridade com as sequências de questão ao nível dos aminoácidos. Esta região genômica de 935 pb foi escolhida para clonagem.

Exemplo 7: Extração de DNA genômico de Neurospora crassa

[00309] Uma estirpe de Neurospora crassa FGSC 2489 (obtida do Fungal Genetics Stock Center, Kansas Cit, Missouri) foi cultivada em 100 mL de meio YEG durante 2 dias a 34 °C em um frasco de agitação. Os micélios foram coletados em um filtro de fibra de vidro e congelados em nitrogênio líquido. Os micélios congelados foram triturados, por almofariz e pilão, até um pó fino. Aproximadamente 1/4 do pó foi suspenso em 15 mL d tampão TE ao qual foram adicionados 4 mL de tampão CAPS-NaOH a 0,1 M, pH 11,0, e 1,0 mL de dodecil sulfato de lítio a 10 %. A suspensão foi incubada a 60 °C durante 60 min com mistura periódica por inversão. A isto foram adicionados 20 mL de fenol: alcool de isoamila neutralizados (25:24:1 v/v/v), e o tubo foi misturado por inversão em uma roda giratória durante 60 min. Após centrifugação a 2500 rpm durante 5 min, a fase aquosa foi removida e re-extraída com fenol:clorofórmio:álcool de isoamila do mesmo modo. A fase aquosa foi levada a acetato de amônio a 2,5 M por adição de um terço de volume de acetato de amônio a 10 M, e congelada em gelo seco. Após descongelação, a suspensão foi centrifugada a 15.000 x g durante 20 min, a solução decantada, e os ácidos nucleicos precipitados por adição de 0,7 volumes de isopropanol. Após centrifugação a 15.000 x g durante 20 min, a solução foi decantada e o pélete lavado duas vezes com etanol a 70 % e seco ao ar. O pélete foi dissolvido em 1,0 mL de 0,1X TE. RNase A (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EUA) foi adicionada a 100 μg/mL e a solução incubada durante 30 min à temperatura ambiente. Os ácidos nucleicos foram precipitados por adição de 1/4 volume acetato de amônio a 10 M e 2 volumes de etanol a 95 %. Após centrifugação a 15.000 x g durante 20 min, o sobrenadante foi removido e o pélete lavado duas vezes com etanol a 70 % e seco ao ar. O DNA foi dissolvido em 0,75 mL de 0,1X TE.

Exemplo 8: Construção de um vetor de expressão de Aspergillus oryzae para o gene da endoglucanase de Neurospora crassa

[00310] Dois iniciadores de oligonucleotídeos sintéticos mostrados em baixo foram desenhados para amplificar por PCR o gene da endoglucanase de Neurospora crassa a partir do DNA genômico. Foi usado IN-FUSION™ Cloning Kit (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EUA) para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pAILo2 (descrito em WO 2005/074647), sem a necessidade para digestão por restrição e ligação.

[00311] Iniciador direto: 5’-ACTGGATTTACCATGCGCTCCTCCACTATTCTGCAAA-3' (SEQ ID NO: 7) Iniciador reverso: 5’-TCACCTCTAGTTAATCAGGCACACTGATGGTAAT-3’ (SEQ ID NO: 8)

[00312] As letras sublinhadas representam sequência codificante. A sequência restante é homóloga com os locais de inserção de pAILo2.

[00313] Cinquenta picomoles de cada um dos iniciadores acima foram usados em uma reação de PCR contendo 5,0 μL de DNA genômico de Neurospora crassa (preparado como descrito no Exemplo 7), 1X Pfx Amplification Buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), 8 microlitros (μL) de uma combinação a 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 3,75 unidades de Platinum Pfx DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), e 3 μL de MgSO4 a 50 mM em um volume final de 150 μL. Isto foi dividido em 3 x alíquotas de 50 μL e a amplificação foi realizada usando um Robocycler Gradient 40 (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) programado para 1 ciclo a 94°C durante 3 minutos; e 30 ciclos cada um a 94 °C durante 30 segundos, 50, 53 ou 57 °C durante 30 segundos, e 68 °C durante 75 segundos. O calor em bloco foi depois mantido a 72 °C durante 10 minutos seguido por uma ciclo de embebição a 4 °C.

[00314] Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose a 0,8 % usando tampão TAE (Tris base a 40 mM, acetato de sódio a 20 mM, EDTA dissódico a 1 mM) onde uma bana de produto de aproximadamente 950 pb foi excisada de 3 linhas do gel (representando as 3 diferentes temperaturas de emparelhamento de PCR) e purificada usando um Eppendorf Perfectprep® Gel Cleanup kit (Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, NY, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

[00315] O fragmento foi depois clonado em pAlLo2 usando um INFUSION® Cloning Kit. O vetor foi digerido com Neo I e Pac I. O fragmento foi purificado por eletroforese em gel como acima e um QIAQUICK® Gel Purification Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EUA). O fragmento de gene e o vetor digerido foram combinados em conjunto em uma reação resultando no plasmídeo de expressão pPH45, no qual a transcrição do gene da endoglucanase de Neurospora crassa estava sob o controle do promotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae). A reação de recombinação (20 μL) era composta por Tampão 1X INFUSION® (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EUA), 1X BSA (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EUA), 1 μL de enzima IN-FUSION® (diluído em 1:10) (BD Biosciences, Palo Alto CA, EUA), 166 ng de pAILo2 digerido com Neo I e Pae I, e 170 ng do produto de PCR purificado de endoglucanase de Neurospora crassa. A reação foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos e 3 μL do produto de reação foram transformados em Células competentes XL1-Blue de E. coli (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Um transformante de E. coli contendo plasmídeo pPH45 foi identificado por digestão com enzimas de restrição e DNA de plasmídeo foi preparado usando um BIOROBOT® 9600 (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EUA).

Exemplo 9: Caracterização da sequência genômica de Neurospora crassa codificando Cel45A

[00316] A sequenciação de DNA da inserção de 935 pb em pPH45 foi realizada com um Sequenciador de DNA Automatizado Modelo 377 XL da Perkin-Elmer Applied Biosystems usando química com terminação de corante (Giesecke et al., 1992, supra) e estratégia de caminhada de iniciadores. Foram usados os seguintes iniciadores específicos de vetor para sequenciação: pAllo2 5’ Seq: 5' TGTCCCTTGTCGATGCG 3' (SEQ ID NO: 9) pAllo2 3’ Seq: 5' CACATGACTTGGCTTCC 3' (SEQ ID NO: 10)

[00317] Os dados das sequências de nucleotídeos foram escrutinados quanto à qualidade e todas as sequências foram comparadas umas com as outras com auxílio do software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, EUA). A sequência foi uma correspondência de 100 % com a sequência do genoma da estirpe de Neurospora crassa FGSC 2489 determinada pelo projeto de sequenciação de Neurospora crassa e disponível no Broad Institute (Cambridge, MA, EUA)

[00318] Um modelo de gene para a sequência de Neurospora crassa foi construído com base na similaridade da proteína codificada com uma proteína V endoglucanase de Humicola insolens (Número de Acesso de GeneSeqP AEB00296). A sequência de nucleotídeos e sequência de aminoácidos deduzida são SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente. O fragmento genômico codifica um polipeptídeo de 293 aminoácidos, interrompida por um íntron de 53 pb (nucleotídeos 339 a 391). Usando o programa de software SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) foi previsto um peptídeo sinal de 21 resíduos.

[00319] Foi determinado um alinhamento global par a par comparativo de sequências de aminoácidos usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle de EMBOSS com penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a sequência de aminoácidos deduzida do gene de Neurospora crassa codificando o polipeptídeo maduro de endoglucanase partilhava 100 % de identidade com a sequência de aminoácidos deduzida da proteína B19A17.010 de Neurospora crassa (Número de Acesso UniProt Q872Q1).

Exemplo 10: Expressão do DNA genômico de Neurospora crassa codificando endoglucanase em Aspergillus oryzae JaL250

[00320] Protoplastos de Aspergillus oryzae JaL250 foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Seis μg de pPH45 foram usados para transformar Aspergillus oryzae JaL250. Oito transformantes foram isolados em placas PDA individuais.

[00321] As placas PDA confluentes dos transformantes foram cada uma lavadas com 8 mL de TWEEN® 20 a 0,01 %, KCl a 0,7 M e os esporos foram cada um coletados. Dois mL de cada estoque de esporos foram adicionados a 25 mL de meio MDU2BP em frascos de 125 mL e incubados a 34 °C e 200 rpm. Após 4 dias de incubação, 10 μL de sobrenadante de cada frasco foram analisados usando um Novex NuPAGE®, gel de SDS- PAGE com gradiente de 4-12 % (Life Technologies, Grand Island, NI) de acordo com as instruções do fabricante. Os perfis de SDS-PAGE das culturas mostraram que todos os transformantes tinham uma nova banda de aproximadamente 32 kDa. O transformante com o nível de expressão mais elevado foi nomeado Jal250PaHa45.

Exemplo 11: Purificação de endoglucanase Neurospora crassa recombinante

[00322] (NH4)2SO4 foi adicionado ao caldo de cultura do transformante de Aspergillus oryzae recombinante (preparado no Exemplo 10), a concentração final de (NH4)2SO4 foi 1,2 M. A solução foi filtrada através de um filtro de 0,45 mm e aplicada a coluna Phenyl Sepharose 6 Fast Flow de 40 mL (GE) equilibrada usando o tampão de equilíbrio consistindo em Tris- HCl a 20 mM, pH 7,0 suplementado com (NH4)2SO4 a 1,2 M, a proteína foi eluída com um gradiente linear de (NH4)2SO4 (1,2-0 M). As frações foram avaliadas por SDS-PAGE (NP0336BOX, NUPAGE 4-12 % BT GEL 1,5MM15W). As frações contendo uma banda de aproximadamente 29 kDa foram agrupadas. Depois, a solução agrupada foi concentrada por ultrafiltração.

Exemplo 12: Purificação de Celulase a partir de Biotouch XC300

[00323] Um volume de 100 mL de Biotouch XC300 filtrado foi precipitado com sulfato de amônio (80 % de saturação), redissolvido em 40 mL de Tris-HCl a 20 mM pH 7,0, dialisado contra o mesmo tampão, e filtrado através de um filtro de 0,45 μm. O volume final foi 80 mL. A solução foi aplicada a uma coluna Q SEPHAROSE® Fast Flow de 40 mL equilibrada com Tris-HCl a 20 mM pH 7,0. As proteínas foram eluídas com um gradiente linear de NaCl a 0-0,5 M. As frações não ligadas à coluna foram coletadas e adicionalmente purificadas usando uma coluna Phenyl SEPHAROSE® 6 Fast Flow de 40 mL (GE Healthcare, Buckinghamshire, EU) com um gradiente linear de (NH4)2SO4 a 1,2-0 M. As frações foram analisadas por SDS-PAGE usando um Bis-Tris Gel a 4-12 % NUPAGE® NOVEX® com MES a 50 mM. O gel resultante foi corado com INSTANTBLUE™. As frações contendo uma banda a aproximadamente 40 kDa foram agrupadas. Depois, a solução agrupada foi concentrada por ultrafiltração.

Exemplo 13: Ensaio de atividade de endoglucanase

[00324] AZCL-HE-celulose a 0,2 % (Megazyme, I-AZCEL) foi suspensa em tampão Bis-Tris a 20 mM de pH 6,0 com adição de Triton X-100 a 0,01 % por agitação suave, que foi usada como um substrato. Depois, 120 microlitros de substrato e 30 microlitros de amostra de enzima de 1 mg/mL preparados de acordo com o Exemplo 5, 11 e 12 respectivamente foram misturados em uma placa de Microtitulação e colocados em gelo antes da reação. O ensaio foi iniciado por transferência da placa de Microtitulação para um termomisturador Eppendorf, que foi colocado à temperatura de ensaio de 50 oC. A placa foi incubada durante 20 minutos no termomisturador Eppendorf à sua taxa de agitação de 700 rpm para placas de Microtitulação. A incubação foi terminada por transferência da placa de volta para o banho de gelo. Depois, a placa foi centrifugada em uma centrífuga gelada durante 5 minutos e 100 microlitros de sobrenadante foram transferidos para uma placa de microtitulação. A OD595 foi lida como uma medida da atividade de endoglucanase. Todas as reações foram feitas em triplicado e um tampão cego sem adição de qualquer enzima foi incluído no ensaio.

[00325] Se o valor de OD595 da amostra de enzima menos o valor de OD595 do cego for acima de 0, a enzima é definida como a enzima tendo atividade de endoglucanase.

[00326] O valor de OD595 da amostra de endoglucanase de GH45 de Neurospora tetrasperma testada em este exemplo menos a OD595 do cego estava acima de 0, o que mostra que a endoglucanase de GH45 de Neurospora tetrasperma na presente invenção tem atividade de endoglucanase.

[00327] O valor de OD595 da amostra de endoglucanase de GH45 de Neurospora crassa testada em este exemplo menos a OD595 do cego estava acima de 0, o que mostra que a endoglucanase de GH45 de Neurospora crassa na presente invenção tem atividade de endoglucanase.

[00328] O valor de OD595 da amostra de endoglucanase de Biotouch XC300 testada em este exemplo menos a OD595 do cego estava acima de 0, o que mostra que a endoglucanase de Biotouch XC300 na presente invenção tem atividade de endoglucanase.

Exemplo 14: Biopolimento com GH45 de Neurospora crassa, GH45 de Neurospora tetrasperma e Biotouch XC 300 em Launder-O-meter

[00329] Endoglucanase de GH45 de Neurospora tetrasperma (abreviada como Nt Cel45, peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2), endoglucanase de GH45 de Neurospora crassa (abreviada como Nc Cel45, peptídeo maduro de SEQ ID NO: 4) e a proteína do produto comercialmente disponível Biotouch XC300 foram avaliadas quanto ao biopolimento após purificação como descrito nos Exemplos 5, 11 e 12 respectivamente.

[00330] Amostras de tecido de algodão foram cortadas em cerca de 16 cm * 16 cm (cerca de 5 gramas cada uma). As amostras foram colocadas na câmara condicionada (65 % de umidade, 21 °C) durante 24 horas antes de serem numeradas, pesadas pela balança analítica e registradas. O biopolimento foi conduzido com um Launder-O-meter. Duas amostras condicionadas e 20 esferas de aço grandes (peso total de 220 gramas) foram colocadas em cada proveta para fornecer os auxiliares mecânicos. A proveta foi cheia com enzimas de acordo com a Tabela 1 e tampões preparados como descrito na parte dos meios até um volume total em torno de 100 mL, o que poderia resultar em uma razão líquido em relação a tecido de cerca de 10:1 (v/p, mL/g).

[00331] A máquina Launder-O-Meter (LOM) foi iniciada após o programa requerido ter sido escolhido, e se manteria quando a temperatura alcançasse a temperatura pré-definida, p.ex., 35 oC ou 55 oC. Cada proveta foi equipada com uma tampa revestida com 2 juntas de neopreno e fechada firmemente com o dispositivo de grampo de metal. As provetas foram carregadas no LOM pré-aquecido. Foram usadas prateleiras de metal para acomodar e fixar 5 provetas, na posição vertical, em cada uma das 4 posições do tambor. A tampa do LOM foi fechada e o programa de lavagem foi continuado e o tempo foi iniciado. Após o tratamento com celulose durante 1 hora à condição especificada na tabela em baixo, as amostras foram removidas das provetas e transferidas para a solução de inativação com 2 g/L de carbonato de sódio e mantidas a 85 °C durante 10 min. Depois, as amostras foram enxaguadas em água quente por 2 vezes e em água fria por 2 vezes. E foram secas por tambor (AEG, LAVATHERM 37700, Alemanha) durante 1 hora, condicionadas durante 24 horas a 65 % de umidade relativa, 21 °C antes da avaliação na perda de peso e notas de formação de borbotos.

[00332] Biotouch XC300 é um produto de celulase neutro no mercado, que se desempenha bem sob temperatura 20-50 oC. Como resumido na tabela 1, GH45 de Neurospora tetrasperma foi muito mais forte do que Biotouch XC300 na base de proteína: a 35 °C e pH 6,5, 0,032 mg de proteína enzima de Nt Cel45/g de tecido apresentaram um desempenho similar tanto na nota de formação de borbotos e perda de peso como 0,096 mg de proteína enzima de Biotouch XC300/g de tecido.

[00333] Similarmente se descobriu que a endoglucanase de GH45 de Neurospora crassa foi mais forte do que a endoglucanase de Biotouch XC300 na base de proteína: a 35 °C e pH 6,5, 0,032 mg de proteína enzima de Nc Cel45/g de tecido apresentaram melhoria significativa na nota de formação de borbotos em relação a 0,064 mg de proteína enzima de Biotouch XC300/g de tecido. Nc Cel45 mostrou superioridade em relação a proteína purificada de Biotouch XC300 quanto às suas notas de formação de borbotos mais elevadas a nível de perda de peso similar: com 0,5 % de perda de peso, Nc Cel45 apresentou uma nota de formação de borbotos 2,4, enquanto, em contraste, a proteína purificada de Biotouch XC300 resultou apenas em 1,5 na formação de borbotos.

[00334] Tabela 1. Biopolimento em LOM com GH45 de Neurospora crassa, GH45 de Neurospora tetrasperma e Biotouch XC 300 a 35 °C , pH 6,5

[00335] Nota: a perda de peso foi normalizada por subtração da perda pedo de amostras de branco, respectivamente.

Exemplo 15: Biopolimento com GH45 de Neurospora crassa, GH45 de Neurospora tetrasperma e Biotouch XC 300 a diferentes temperaturas em Launder-O-meter

[00336] A endoglucanase de GH45 de Neurospora crassa (Nc Cel45), endoglucanase de GH45 de Neurospora tetrasperma (Nt Cel45) e a proteína do produto comercialmente disponível Biotouch XC300 foram extensivamente testadas a diferentes temperaturas quanto ao biopolimento no presente exemplo após purificação como descrito nos Exemplo 5, 11 e 12 respectivamente.

[00337] A preparação do tecido e operação de ensaio foram similares ao Exemplo 14 exceto que foram conduzidos vários ensaios independentes com diferentes temperaturas/dosagens em este exemplo.

[00338] Como resumido na Tabela 2 foi confirmado que todas as três amostras de enzimas purificadas mostravam características de temperatura similar: melhores a 35 °C e tiverem desempenho gradualmente inferior com a temperatura aumentada até 45 e 55 °C. Novamente foi provado que GH45 de Neurospora tetrasperma e GH45 de Neurospora crassa foram mais fortes do que a proteína purificada de Biotouch XC300 em todas as condições testadas aqui. Por exemplo, a 35 °C, 0,048 mg de proteína enzima de Nt Cel45 por grama de tecido apresentaram notas de formação de borbotos mais elevada do que 0,096 mg de proteína enzima purificada de Biotouch XC300; e 0,064 mg de Nc Cel45 por grama de tecido apresentaram também notas de formação de borbotos similares ou mais elevadas do que 0,096 mg de proteína celulase purificada de Biotouch XC300 tanto a 35 como a 45 °C. Nt Cel45 e Nc Cel45 foram também superiores em relação à proteína purificada de Biotouch XC300 no alcance de uma nota de formação de borbotos similar mas a perda de peso menor, por exemplo, Nt Cel45 apresentou uma nota de formação de borbotos 3,9 com 0,9 % de perda de peso, Nc Cel45 apresentou uma nota de formação de borbotos 3,3 com 0,5 % de perda de peso, enquanto, em contraste, Biotouch XC 300 fez com que 1,1 % de perda peso causassem uma nota de formação de borbotos 3,5.

[00339] Tabela 2 Biopolimento em LOM com GH45 de Neurospora tetrasperma, GH45 de Neurospora crassa e Biotouch XC 300 a pH 6,5 e diferentes temperaturas

[00340] Nota: a perda de peso foi normalizada por subtração da perda pedo de amostras de branco no mesmo ensaio, respectivamente.

Exemplo 16: Biopolimento com GH45 de Neurospora crassa, GH45 de Neurospora tetrasperma e Biotouch XC 300 a diferentes pHs em Launder-O-meter

[00341] A GH45 de Neurospora crassa (Nc Cel45), endoglucanase de GH45 de Neurospora tetrasperma (Nt cel45) foram extensivamente testadas a 45 °C e diferentes pHs quanto ao biopolimento no presente exemplo após purificação como descrito nos Exemplos prévios.

[00342] A preparação do tecido e operação de ensaio foram similares ao Exemplo 14 exceto que foram usados diferentes pHs como especificado na tabela em baixo em este exemplo.

[00343] Como mostrado na Tabela 3, tanto GH45 de Neurospora tetrasperma como GH45 de Neurospora crassa trabalharam bem em uma ampla gama de pH de 5 a 7,5. 0,032 mg de GH45 de Neurospora tetrasperma por grama de tecido apresentam notas de formação de borbotos de 3,4 a 4,0, enquanto 0,064 mg de GH45 de Neurospora crassa por grama de tecido apresentaram notas de formação de borbotos de 3,8 a 3,9. A ampla gama de pH de aplicação destas duas enzimas permitirá que os consumidores produzem tecidos de elevada qualidade com grande flexibilidade.

[00344] Tabela 3 Biopolimento em LOM com GH45 de Neurospora tetrasperma, GH45 de Neurospora crassa a 45 °C e diferentes pHs

Exemplo 17: Abrasão de brim com GH45 de Neurospora crassa, GH45 de Neurospora tetrasperma e Biotouch XC 300 a diferentes temperaturas em Launder-O-meter

[00345] A GH45 de Neurospora crassa (Nc cel45), GH45 de Neurospora tetrasperma (Nt cel 45) purificadas de Exemplos prévios foram avaliadas quanto à abrasão de brim no presente exemplo. A proteína celulase purificada do produto comercialmente disponível Biotouch XC300 foi também testada como a referência.

[00346] Brim em bruto foi desengomado e cortado até largura de 16 cm e comprimento de 24 cm. O brim foi cortado e cozido, formando um tubo com altura de 12,5 cm e peso de cerca de 18 g. Os tubos foram colocados em uma câmara condicionada (umidade relativa a 65 %, 21 oC) durante 24 horas antes de serem numerados, pesados pela balança analítica e registrados. Um tubo condicionado foi colocado em cada proveta, com o lado azul virado para dentro. Para cada proveta, 30 porcas grandes (M6M- SR-A4-80, à prova de ácido, M10 DIN 934), 10 porcas pequenas (M6M-SR- A4-80, à prova de ácido, M6 DIN 934), 7 ímãs em estrela grandes (diâmetro de 17 mm, item no. 3-CO-411117, Cowie, Schweiz via Bie & Berntsen), e 3 ímãs em estrela pequenos (diâmetro de 14 mm, item no. 3-CO-11117, Cowie, Schweiz via Bie & Berntsen) foram usados para fornecer os auxiliares mecânicos. Depois, os tampões preparados como descrito na parte dos meios e as soluções de enzimas foram adicionados de acordo com a Tabela 4, com base no cálculo dos pesos reais do tecido, para perfazer um volume total em torno de 80 mL, que criaria uma razão líquido em relação a tecido de 3,8:1 (v/p).

[00347] A máquina Launder-O-Meter (LOM) foi iniciada após o programa requerido ter sido escolhido, e se manteria quando a temperatura alranríiQQP o tPiYinprati ira nrá-Hafinirla n PY oO Á^ °^ HII o& of* Parla alcançasse a temperatura pré-definida, p.ex., 35 C, 45 C ou 55 C. Cada proveta foi equipada com uma tampa revestida com 2 juntas de neopreno e fechada firmemente com o dispositivo de grampo de metal. As provetas foram carregadas no LOM pré-aquecido. Prateleiras de metal foram usadas para acomodar e fixar 6 provetas, na posição horizontal, em cada uma das 4 posições do tambor. A tampa do LOM foi fechada e o programa de lavagem foi continuado e o tempo foi iniciado. 2 horas mais tarde, todas as provetas foram removidas do LOM e as amostras de brim foram transferidas para a solução de inativação (carbonato de sódio a 2 g/L) a 85 oC durante 10 minutos. Depois, as amostras foram enxaguadas em água quente por 2 vezes e em água fria por 2 vezes. As amostras de brim foram secas em tambor (AEG, LAVATHERM 37700, Alemanha) durante 1 hora, e depois condicionadas a umidade relativa a 65 %, 21 °C durante 24 horas antes da avaliação.

[00348] O nível de abrasão e contracoloração das amostras de brim foi determinado por medição da refletância antes do e após o tratamento com endoglucanase com DataColor SF450X pré-calibrado. Para L* e b* foram tiradas quatro leituras para cada amostra e a média das quatro leituras foi usada. O nível de abrasão foi avaliado com o índice CIE L* do lado azul da amostra, e o nível de contracoloração foi avaliado com o índice CIE b* da parte de trás da amostra.

[00349] Como resumido na Tabela 4 foi provado que, na abrasão de brim, 't Cel45 foi mais forte do que celulase purificada de Biotouch XC 300, i.e, 0,032 mg de Nt Cel45 por grama de tecido apresentaram 4,9 e 5,0 no aumento do valor L* na face de brim a 35 e 55 oC respectivamente, enquanto, em contraste, 0,064 mg de celulase purificada de Biotouch XC 300 por grama de tecido conseguem apenas apresentar 4,7 e 3,1 no aumento do valor L* respectivamente.

[00350] Nt Cel45 foi também superior em relação à celulase em Biotouch XC300 quanto ao seu desempenho de abrasão de brim consistente ao longo de uma ampla gama de temperaturas. Na aplicação industrial real, esta característica dará aos usuários mais flexibilidade em operação e melhor qualidade em produtos têxteis. Nc Cel45 foi também melhor do que celulase purificada de Biotouch XC300 uma vez que metade da dosagem de Neurospora crassa Cel45a apresentou desempenho de abrasão de brim ligeiramente mais baixo do que a celulase de Biotouch XC300.

[00351] Tabela 4. Abrasão de brim por GH45 de Neurospora tetrasperma, GH45 de Neurospora crassa e Biotouch XC 300 em LOM a pH 6,5, 35 ou 55 oC, 2 horas

[00352] Nota: média de amostras trip as para cada condição.

[00353] A invenção descrita e reivindicada aqui não é para ser limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, uma vez que estes aspectos são pretendidos como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão evidentes àqueles peritos na técnica a partir da descrição acima mencionada. Tais modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação, incluindo definições, imperará.

Claims (20)

1. Método para tratamento de têxtil com um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase caracterizado por o polipeptídeo compreender a sequência de aminácidos de aminoácidos 22 a 293 da SEQ ID NO: 2, e em que o método é conduzido a uma temperatura na faixa de 25-55 °C e a um pH na faixa de 5 a 7,5.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase compreender uma sequência coma uma substituição, deleção, e/ou inserção de 1 a 10 aminoácidos dos aminoácidos 22 a 293 da SEQ ID NO: 2.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase ser obtido de uma espécie do gênero Neurospora.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase ser obtido de Neurospora tetrasperma ou Neurospora crassa.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase compreender ou consistir da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase compreender ou consistir nos aminoácidos 22 a 293 da SEQ ID NO: 2 ou nos aminoácidos 22 a 293 da SEQ ID NO: 4.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o têxtil ser têxtil contendo celulose.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o têxtil ser algodão, viscose, raiom, rami, linho ou liocel.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o têxtil compreender fibras sintéticas.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o método ser conduzido a uma temperatura na faixa de 30-45 °C.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o método ser conduzido a pH na faixa de 6 a 7.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o método ser conduzido a uma temperatura na faixa de 30-45 °C e a um pH na faixa de 6 a 7.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo compreender uma sequência que possui pelo menos 97% de identidade de sequência com os aminoácidos 22 a 293 da SEQ ID NO: 2.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo compreender uma sequência que possui pelo menos 98% de identidade de sequência com os aminoácidos 22 a 293 da SEQ ID NO: 2.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo compreender uma sequência que possui pelo menos 99% de identidade de sequência com os aminoácidos 22 a 293 da SEQ ID NO: 2.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase compreender uma sequência com uma substituição, deleção, e/ou inserção de 1 ou 2 aminoácidos dos aminoácidos 22 a 293 SEQ ID NO: 2.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o método ser aplicado em um processo de biopolimento.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o método ser aplicado em um processo biostoning.

19. Polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 22 a 293 da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos dos aminoácidos 22 a 293 da SEQ ID NO: 2 apenas por um ou dois aminoácidos.

20. Polinucleotídeo caracterizado por codificar o polipeptídeo conforme definido na reivindicação 19.