ES2283402T3 - Secuencias reguladoras de la expresion del hongo filamentoso. - Google Patents

Abstract

Constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos reguladora de la expresión operativamente enlazada a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de interés, donde dicha secuencia de ácidos nucleicos reguladora de la expresión tiene al menos el 70% de identidad de la secuencia de nucleótidos en toda la longitud a los nucleótidos 1 a 1779 de SEC ID NO 1 o donde dicha secuencia reguladora de la expresión comprende al menos 40 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 1 a 1779 de SEC ID NO 1.

Description

Secuencias reguladoras de la expresión del hongo filamentoso Chrysosporium.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a enzimas derivadas de hongos filamentosos, especialmente de cepas del género Chrysosporium, y a secuencias reguladoras de la expresión para estas enzimas. La presente invención es una extensión sobre la invención descrita en WO 00/20555 (PCT/NL99/00618), depositada el 6 de Octubre de 1999; no publicada antes de la presente fecha de prioridad.

Antecedentes de la invención

Varios huéspedes para expresión genética y métodos de transformación han sido descritos en la técnica anterior. Las bacterias están frecuentemente mencionadas p. ej. la Escherichia coli. La E. coli es no obstante un microorganismo incapaz de segregar varias proteínas o polipéptidos y como tal es indeseable como célula huésped para la producción de proteínas o polipéptidos a nivel industrial. Una desventaja adicional de la E. coli, que es válida también para las bacterias en general, es que los procariotas no pueden proporcionar modificaciones adicionales requeridas para numerosas proteínas o polipéptidos eucarióticos que deben ser producidos en una forma activa. La glicosilación de proteínas y el doblamiento apropiado de proteínas son ejemplos del tratamiento requerido para asegurarse de que una proteína o polipéptido activos son producidos. Para asegurar tal tratamiento uno puede a veces usar células mamíferas; no obstante, la desventaja de estas células es que éstas son frecuentemente difíciles de mantener y requieren medios caros. Los sistemas de transformación de este tipo en consecuencia no son prácticos para la producción de proteínas o polipéptidos a nivel industrial. Estos pueden ser rentables para compuestos farmacéuticos muy valorados que requieren cantidades relativamente bajas, pero ciertamente no ocurre lo mismo con las enzimas industriales. Varios sistemas de expresión fúngica han sido desarrollados p. ej. Aspergillus Niger, Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei. Otros varios han sido sugeridos pero por varias razones no han tenido mucha aceptación ni uso. En términos generales el huésped ideal debe cumplir un gran número de
criterios:

- el huésped ideal debe ser fácilmente fermentado usando un medio poco costoso.

- el huésped ideal debería usar el medio eficazmente.

- el huésped ideal debe producir el polipéptido o proteína con un alto rendimiento, es decir debe presentar una proporción alta de proteína a biomasa.

- el huésped ideal debería ser capaz de segregar de forma eficaz la proteína o polipéptido.

- el huésped ideal debe facilitar el aislamiento y purificación de la proteína o polipéptido deseados.

- el huésped ideal debe procesar la proteína o polipéptido deseados de manera que sea producido en una forma activa que no requiera fases adicionales de activación o de modificación.

- el huésped ideal debería ser fácilmente transformado.

- el huésped ideal debería permitir una gama amplia de elementos reguladores de la expresión para ser usados asegurando así una fácil aplicación y versatilidad.

- el huésped ideal debería permitir el uso de marcadores fácilmente seleccionables que sean de uso económico.

- el huésped ideal debería producir transformantes estables.

- el huésped ideal debería permitir el cultivo bajo condiciones no perjudiciales para el producto proteico o polipéptido, p. ej. baja viscosidad, baja cizallla.

Las patentes WO 96/02563 y US 5,602,004, 5,604,129 y 5,695,985 de Novo Nordisk describen los inconvenientes de los sistemas del Aspergillus y Trichoderma y sugieren que las condiciones de cultivo para otros hongos puedan ser más adecuadas para producir proteínas a gran escala. Los únicos ejemplos proporcionados para cualquier cultivo transformado son aquellos de las cepas Myceliophthora thermophila, Acremonium alabamense, Thielavia terrestris y Sporotrichum cellulofilum. La cepa Sporotrichum se proporciona para lisar y producir un pigmento verde bajo condiciones de fermentación que no conducen a tales resultados para las demás cepas. Un mutante no esporulante de Thielavia terrestris está descrito como el organismo de elección en virtud de su morfología. No obstante está también establecido que la eficacia protoplástica de Thielavia y Acremonium (donde la cepa Acremonium usada fue el estado imperfecto de la cepa Thielavia usada) es baja y que la higromicina no era útil como marcador de la selección. Otro gran número está sugerido como siendo potencialmente útil en virtud de su morfología pero no se describe su transformación. Las cepas sugeridas son Corynascus, Thermoascus, Chaetomium, Ctenomyces, Scytalidium y Talaromyces. Se menciona que los huéspedes transformados sólo producen niveles bajos de xilanasa de Humicola introducida con la Thielavia que produce la mínima cantidad; no obstante, la información es ambigua y podría en realidad inferir que la Thielavia era la mejor forma de realización. La nomenclatura de esta referencia se basa en los nombres de la ATCC de Hongos Industriales de 1994. Es por tanto evidente que no se consiguió un alto grado de expresión heteróloga y que de hecho ninguna correlación positiva podría ser derivada entre la morfología postulada y el grado de expresión. Si se pudiera hacer alguna correlación, sería con más probabilidad negativa. Según la clasificación fúngica de 1996 de la ATCC Sporotrichum thermophilum ATCC 20493 es una cepa Myceliophthora thermophila. Actualmente la cepa se sigue identificando como Myceliophthora thermophila. La imprevisibilidad de la técnica es evidente a partir de estas últimas descripciones.

WO 97/26330 de Novo Nordisk sugiere un método para obtener mutantes de células fúngicas genitoras filamentosas con una propiedad mejorada para la producción del polipéptido heterólogo. El método comprende primero el hecho de encontrar una morfología específica alterada seguido de la evaluación de si un transformante produce más polipéptido heterólogo que el genitor. El método está ilustrado sólo para cepas de Fusarium A3/5 y de Aspergillus oryzae. Se sugiere que el método sea aplicable para Aspergillus, Trichoderma, Thielavia, Fusarium, Neurospora, Acremonium, Tolyplocadium, Humicola, Scytalidium, Myceliophthora o Mucor. Como se ha declarado arriba, la imprevisibilidad en la técnica y también la imprevisibilidad del método de aplicación citados no proporcionan un enseñamiento generalmente aplicable con una esperanza razonable de éxito.

En WO 00/120555, hemos descrito un sistema de expresión fúngica alternativo con la simplicidad de uso de las anteriormente mencionadas Aspergilli y Trichoderma que reúnen los requisitos anteriores. El sistema nuevo proporciona las ventajas adicionales cuyos índices de transformación son superiores a aquellos frecuentemente utilizados para el sistema de Trichoderma reesei. Además las condiciones del cultivo ofrecen la ventaja adicional de ser ventajosas para el producto del polipéptido.

El derecho anterior WO 00/20555 no describe secuencias de ácidos nucleicos reguladoras de la expresión para la producción de proteínas recombinantes.

WO98/15633 se refiere a la purificación de fracciones enzimáticas de Chrysosporium. Las secuencias reguladoras de la expresión no están descritas.

US 5,955,270 y Takashini et al. (1996; J. of Biotechnology 50, p137-147) describen celulasas de Neurospora crassa y Humicola grisea, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

Ahora describimos nuevos sistemas promotores derivados de cepas de Chrysosporium y útiles para expresar genes homólogos y heterólogos. La presente invención está particularmente interesada en las glicosil hidrolasas de las familias 7 (p. ej. celobiohidrolasas) como se identifican por su secuencia de aminoácidos, al igual que en los péptidos derivados de estas proteínas enzimáticas, y en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican estos péptidos y proteínas, al igual que, en particular, en las secuencias reguladoras relacionadas con estos genes.

La invención también pertenece a sistemas de expresión (casetes) que comprenden sea una región reguladora de la expresión (incluso un promotor) de cualquier familia 7 de glicosil hidrolasa fusionada a un gen que codifica otra proteína de interés. La región reguladora de la expresión comprende al menos el 60%, preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 75% o incluso el 80% de la región no codificante 5' de la SEC ID N°. 1 y/o al menos 20, especialmente al menos 40 nucleótidos contiguos de estas regiones 5' no codificantes. Las secuencias terminadoras derivadas de forma similar de las regiones 3' no codificantes de los genes de la invención son también útiles para expresar casetes de expresión, en el caso de ser combinadas con genes homólogos o heterólogos.

Los polinucleótidos y oligonucleótidos de la invención pueden tener la identidad de secuencia mínima con las secuencias correspondientes de SEC ID NO 1, o, de forma alternativa pueden hibridarse bajo condiciones severas con las secuencias dadas. Las condiciones severas de hibridación son aquellas que se entienden en la técnica, p. ej. hibridación en 6 x SSC (20 x SSC por 1000 ml: 175.3 g de NaCl; 107.1 g de citrato de sodio.5H_{2}O, pH 7.0); SDS al 0.1%; pirofosfato del sodio al 0.05%; 5 * solución de Denhardt's y 20 \mug/ml de ADN de esperma de arenque desnaturalizado a 56°C durante 18-24 hrs seguido de dos lavados de 30 min. en 5 x SSC; SDS al 0.1% a 56°C y dos lavados de 30 min. en 2 x SSC; SSC al 0.1% a 56°C.

Estos sistemas de expresión pueden estar contenidos en un huésped de Chrysosporium, tal como un huésped de Chrysosporium lucknowense, o en otro huésped no fúngico o, preferiblemente, fúngico. Ejemplos de otros huéspedes fúngicos son otras especies o cepas de Chrysosporium, las especies de Fusarium, especies de Aspergillus etc. Éste huésped puede ser ventajosamente un huésped que no produzca él mismo, intrínsecamente o como resultado de las condiciones del cultivo, una proteína correspondiente a la proteína de interés, para simplificar la recuperación de la proteína de interés.

Cuando se hace referencia en esta especificación y en las reivindicaciones anexas a "polipéptidos" o "péptidos" o "polipéptidos de interés" o "péptidos de interés" como los productos del sistema de expresión de la invención, este término también comprende proteínas, es decir polipéptidos que tienen una función particular y/o estructura secundaria y/o terciaria. Cuando se hace referencia a un porcentaje de identidad del aminoácido, tal identidad se refiere a una proteína completa o a una parte específica definida por el número de aminoácidos inicial y final, como está determinado por el algoritmo BLAST usado de forma convencional.

En el sistema de expresión fúngica descrito en WO 00/20555, el pH del medio de cultivo puede ser neutro o alcalino de modo que ya no se somete a la proteína o polipéptido producidos a un pH agresivo e inactivando de forma potencial el pH ácido. Es también posible el cultivo a pH ácido tal como pH 4 para casos en los que la proteína o polipéptido es más adecuado para un medio acídico. El cultivo de manera adecuada puede ocurrir a un pH entre 4.0- 10.0. Se prefiere no obstante un pH neutro a alcalino cuando la cepa huésped muestra mejor crecimiento a este pH, p. ej. entre 6 y 9. El crecimiento a pH alcalino que puede ser de pH 8 en adelante y puede incluso ser tan alto como 10 es también una buena alternativa para algunos casos. También la temperatura del cultivo de tales cepas huéspedes es ventajosa para la estabilidad de algunos tipos del polipéptido producido. La temperatura del cultivo es adecuada a una temperatura de 23-43°C. Claramente tales condiciones son de interés particular para la producción de polipéptidos mamíferos. La temperatura
seleccionada dependerá de la eficacia del coste del cultivo y de la sensibilidad del polipéptido o de la cepa del cultivo.

También se ha constatado que la biomasa para la relación de la viscosidad y la cantidad de proteína producida es exageradamente favorable para el huésped de Chrysosporium. Se han realizado comparaciones con Trichoderma longibrachiatum (anteriormente también conocida como Trichoderma reesei) y con Aspergillus Niger, Trichoderma longibrachiatum dio 2.5-5 g/l de biomasa, Aspergillus Niger dio 5-10 g/l de biomasa y el huésped de Chrysosporium dio 0.5-1 g/l de biomasa bajo sus condiciones respectivas optimizadas. Esto ofrece así una mejora de 5-10 veces sobre las cepas usadas comercialmente. La presente invención está dirigida a los sistemas de expresión que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifican una proteína o polipéptido heterólogo, dicha secuencia de ácidos nucleicos estando operativamente enlazada a una región reguladora de la expresión descrita a continuación y opcionalmente una secuencia codificadora de la señal de secreción y/o una secuencia codificadora de la proteína transportadora. Preferiblemente una cepa recombinante según la invención segregará el polipéptido de interés. Esto evitará la necesidad de interrumpir la célula para aislar el polipéptido de interés y también minimizar el riesgo de degradación del producto expresado por otros componentes de la célula huésped.

El Chrysosporium puede ser definido por la morfología consecuente con aquella descrita en Barnett y Hunter 1972, Illustrated Genera of Imperfect Fungi, 3rd Edition of Burgess Publishing Company. Otras fuentes que proporcionan detalles que conciernen a la clasificación de hongos del género Chrysosporium son conocidos p. ej. Sutton Classification (Van Oorschot, C.A.N. (1980) "A revision of Chrysosporium and allied genera" en Studies in Mycology No. 20 of the CBS in Baarn, The Netherlands pl-36). El CBS es uno de los institutos depositarios del Tratado de Budapest. Según estas instrucciones el género Chrysosporium cae dentro de la familia Moniliaceae que pertenece a la gama de los Hifomicetos. Las cepas siguientes están definidas como Chrysosporium pero la definición de Chrysosporium no está limitada a estas cepas: C. botryoides, C. carmichaelii, C. crassitunicatum, C. europae, C. evolceannui, C. farinicola, C. fastidium, C. filiforme, C. georgiae, C. globiferum, C. globiferum var. articulatum, C. globiferum var. niveum, C. hirundo, C. hispanicum, C. holmii, C. indicum, C. inops, C. keratinophilum, C. kreiselii, C. kuzurovianum, C. lignorum, C. lobatum, C. lucknowense, C. lucknowense Garg 27K, C. medium, C. medium var. spissescens, C. mephiticum, C. merdarium, C. merdarium var. roseum, C. minor, C. pannicola, C. parvum, C. parvum var. crescens, C. pilosum, C. pseudomerdarium, C. pyriformis, C. queenslandicum, C. sigleri, C. sulfureum, C. synchronum, C. tropicum, C. undulatum, C. vallenarense, C. vespertilium, C. zonatum.

C. lucknowense forma una de las especies de Chrysosporium que ha incrementado un interés particular ya que ha proporcionado un gran productor natural de proteínas celulasas (WO 98/15633 y US 5,811,381 relacionada).

Las características de esta Chrysosporium lucknowense son:

Las colonias logran 55 mm de diámetro en Sabouraud glucosa agar en 14 días, son de color crema, fieltrosas y esponjosas; densas y de 3-5 mm de alto; los márgenes están definidos, son regulares, y fimbriados; se vuelven de color amarillo palo a color crema. Las hifas son hialinas, de pared homogénea y fina, poco ramificadas. Las hifas aéreas son principalmente fértiles y casi septadas, aproximadamente 1-3.5 \mum de ancho. Las hifas sumergidas son infértiles, aproximadamente 1-4.5 \mum de ancho, las hifas más delgadas frecuentemente estando contorsionadas. Los conidios son terminales y laterales, principalmente sésiles o simplemente, frecuentemente protuberancias cónicas cortas o ramificaciones laterales cortas. Los conidios son solitarios pero muy próximos entre sí; 1-4 conidios se desarrollan en una célula hifal, subhialina, de pared suficientemente fina y, homogénea, principalmente subglobosa, también claviforme obovoide; de 1 célula; 2.5-11 x 1.5-6 \mum, con cicatrices basales anchas (1-2 \mum). Los conidios intercalados están ausentes. Las clamidosporas están ausentes. ATCC 44006; CBS 251.72; CBS 143.77 y CBS 272.77 son ejemplos de cepas de Chrysosporium lucknowense y otros ejemplos están proporcionados en WO 98/15633 (US 5,811,381).

Otra cepa fue aislada de estas especies con una capacidad de producción incluso mayor para las celulasas. Esta cepa se llama CI por su notación interna y fue depositada con el Depósito Internacional de la Colección Rusa de Microorganismos de la Academia Rusa de las Ciencias, Bakrushina Street 8, Moscú, Rusia 113184 el 29 de Agosto, 1996; como un depósito según el tratado de Budapest y fue asignado el número de accesión VKM F-3500D. Se llama Chrysosporium lucknowense Garg 27K. Las características de la cepa C1 son las siguientes:

Las colonias crecen hasta aproximadamente 55-66 mm de diámetro de tamaño en dextrosa agar de la patata en aproximadamente 7 días; son de color blanco-crema, fieltrosas; 2-3 \mum de alto en el centro; los márgenes están definidos, son regulares y fimbriados; se vuelven de color crema palo. Las hifas son hialinas, de pared homogénea y fina, poco ramificadas. Las hifas aéreas son fértiles, septadas; 2-3 mm de ancho. Las hifas sumergidas son infértiles. Los conidios son terminales y laterales; sésiles o en ramificaciones laterales cortas; ausentes, solitarios, pero muy próximos entre sí, hialinas, de pared fina y, homogénea, subglobosas, claviformes u obovoides; de 1 célula; 4-10 \mum. Las clamidosporas están ausentes. Los conidios intercalados están ausentes.

El método de aislamiento de la cepa C1 está descrito en WO 98/15633; US 5,811,381; y US 6,015,707. También se incluyen dentro de la definición de Chrysosporium las cepas derivadas de los predecesores de Chrysosporium incluso de aquellos que han mutado un poco bien de forma natural o por mutagénesis inducida. Los mutantes de Chrysosporium pueden ser obtenidos por mutagénesis inducida, especialmente por una combinación de irradiación y mutagénesis química.

Por ejemplo la cepa C1 fue mutagenizada sometiéndola a luz ultravioleta para generar la cepa UV 13-6. Esta cepa fue posteriormente mutada adicionalmente con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina para generar la cepa NG7C-19. Esta cepa sucesivamente fue sometida a mutación por luz ultravioleta dando como resultado la cepa UV 18-25. Durante este proceso de mutación las características morfológicas han variado un poco en el cultivo en líquido o en placas al igual que bajo el microscopio. Con cada mutagénesis sucesiva los cultivos mostraron menos apariencia esponjosa y fieltrosa en las placas que están descritas como siendo características de Chrysosporium, hasta que las colonias lograron una apariencia plana y enredada. Un pigmento marrón observado con la cepa de tipo salvaje en algunos medios fue también menos predominante en las cepas mutantes. En el cultivo líquido de los mutantes UV 18-25 fue notablemente menos viscoso que la cepa C1 de tipo salvaje y los mutantes UV13-6 y NG7C-19. Mientras que todas las cepas mantuvieron la mayoría de las características microscópicas de Chrysosporium, los micelios se volvieron más estrechos con cada mutación sucesiva y con UV18-25 se pudo observar una fragmentación diferente de los micelios. Esta fragmentación micelial es posiblemente la causa de la viscosidad más baja que se asocia a los cultivos de UV 18-25. La capacidad de esporulación de las cepas disminuyó con cada fase mutagénica. Lo anterior ilustra que para que una cepa pertenezca al genero Chrysosporium hay cierta libertad en cuanto a la anterior definición morfológica. En cada fase de la mutación, la producción de proteínas celulasas y extracelulares también ha aumentado, mientras que varias mutaciones resultaron en la reducción de la expresión de las proteasas. Los criterios con los que la taxonomía fúngica puede ser determinada están disponibles por CBS, VKMF y ATCC por ejemplo. Las cepas internamente designadas como cepa C1, cepa UV13-6, cepa NG7C-19 y cepa UV 18-25 de Chrysosporium, han sido depositadas de acuerdo con el Tratado de Budapest con el instituto de depósito de la Colección Rusa (VKM) en Moscú. La cepa C1 de tipo salvaje fue depositada con el número VKM F-3500 D, fecha de depósito 29-08-1996, el mutante UV13-6 de C1 fue depositado como VKM F- 3632 D (02-09-1998), el mutante NG7c-19 de C1 fue depositado como VKM F-3633 D (02-09-1998) y el mutante UV 18-25 de C1 fue depositado como VKM F-3631 D (02-09-1998).

Es preferible usar cepas de Chrysosporium no tóxicas de las cuales algunas son conocidas en la técnica puesto que esto reducirá los riesgos para el medio ambiente con la producción a gran escala y simplificará los procedimientos de producción con una reducción concomitante de los costes.

Una región reguladora de la expresión es una secuencia de ADN reconocida por la cepa huésped de Chrysosporium para la expresión. Esta comprende una secuencia promotora enlazada operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido que debe ser expresado. El promotor es enlazado de manera que la colocación de cara al codón iniciador de la secuencia que debe ser expresada permita la expresión. La secuencia promotora puede ser constitutiva o inducible. Cualquier secuencia reguladora de la expresión o combinación de la misma capaz de permitir la expresión de un polipéptido a partir de una cepa de Chrysosporium está prevista. La secuencia reguladora de la expresión es de manera adecuada una región reguladora de la expresión fúngica p. ej. una región reguladora de ascomicetes. De manera adecuada la región reguladora de la expresión fúngica es una región reguladora de cualquiera de los géneros de hongos siguientes: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Hansenula, Mucor, Pichia, Neurospora, Tolypocladium, Rhizomucor, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces o formas sexuales alternativas de los mismos como Emericella, Hypocrea p. ej. el promotor de la celobiohidrolasa de Trichoderma. Una secuencia reguladora de la expresión del mismo género que la cepa huésped es extremadamente adecuada, puesto que es más susceptible de adaptarse específicamente al huésped específico. Así preferiblemente la secuencia reguladora de la expresión es una de una cepa de Chrysosporium.

Preferiblemente se aplica una región reguladora de la expresión que permite una gran expresión en el huésped seleccionado. Esta es preferiblemente una región reguladora de la expresión derivada de Chrysosporium según la invención. Ésta puede también ser una región reguladora de una gran expresión derivada de un huésped heterólogo, como es bien conocido en la técnica. Ejemplos específicos de proteínas conocidas para ser expresadas en cantidades grandes y que por tanto proporcionan secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para la invención son, sin estar limitadas a las mismas hidrofobina, proteasa, amilasa, xilanasa, pectinasa, esterasa, betagalactosidasa, celulasa (p. ej. endoglucanasa, celobiohidrolasa) y poligalacturonasa. La gran producción ha sido constatada tanto en condiciones de fermentación en estado sólido como en estado sumergido. Los ensayos para evaluar la presencia o producción de tales proteínas son bien conocidos en la técnica. Los catálogos de Sigma y Megazyme por ejemplo proporcionan numerosos ejemplos. Megazyme está localizado en Bray Business Park, Bray, County Wicklow, en Irlanda. Sigma Aldrich tiene muchos afiliados en el mundo entero p. ej. USA P.O. Box 14508 St. Louis Missouri. Para la celulasa nos referimos a los ensayos comercialmente disponibles tales como los ensayos de CMCasa, ensayos endoviscométricos, ensayos de Avicelasa, ensayos de beta-glucanasa, ensayos de RBBCMCasa, ensayos de Cellazyme C. Los ensayos de xilanasa están también comercialmente disponibles (p. ej. DNS y Megazyme). Las alternativas son conocidas por un experto en la técnica y pueden ser encontradas a partir de la bibliografía general referente al tema. Por ejemplo nos referimos a "Methods in Enzymology" volumen 1, 1955 exactamente a los volúmenes 297-299 de 1998. De manera adecuada una secuencia promotora de Chrysosporium se aplica para asegurar un buen reconocimiento de la misma por el huésped.

Hemos encontrado que las secuencias reguladoras de la expresión heterólogas trabajan tan eficazmente en Chrysosporium como en secuencias de Chrysosporium nativas. Esto permite que constructos y vectores bien conocidos sean usados en la transformación de Chrysosporium así como también ofrecen otras numerosas posibilidades para construir vectores que permiten buenos índices de expresión en este nuevo huésped de expresión y de secreción. Por ejemplo se pueden utilizar técnicas estándar de transformación de Aspergillus como se describe por ejemplo por Christiansen et al en Bio/Technol. 6:1419-1422 (1988). Otros documentos que proporcionan detalles de vectores de transformación de Aspergillus, p. ej. patentes US 4,816,405, 5,198,345, 5,503,991, 5,364,770 y 5,578,463; EP-B- 215.594 (también para Trichoderma).

Como se ha constatado unos índices de expresión extremadamente altos para celulasa para cepas de Chrysosporium, las regiones reguladoras de la expresión de tales proteínas son particularmente preferidas. Nos referimos a ejemplos específicos para las cepas de Chrysosporium depositadas previamente mencionadas. Un constructo de ácidos nucleicos que comprende una región reguladora de la expresión de ácido nucleicos de Chrysosporium, preferiblemente de Chrysosporium lucknowense o un derivado del mismo constituye una forma de realización preferida de la invención, como lo hace la cepa mutante de Chrysosporium que comprende aquella operativamente enlazada a un gen que codifica un polipéptido para ser expresado. Tal constructo de ácidos nucleicos será una región reguladora de la expresión de Chrysosporium asociada con la expresión de la celulosa, preferiblemente de la celobiohidrolasa, según se detalla más abajo. La secuencia de ácidos nucleicos según la invención puede ser obtenida idóneamente de una cepa de Chrysosporium, esta cepa estando definida en otro lugar en la descripción. La manera en la que las secuencias del promotor pueden ser determinadas son numerosas y bien conocidas en la técnica. Los experimentos para la deleción de la nucleasa de la región en la dirección ascendente del codón ATG al principio del gen pertinente proporcionarán esta secuencia. También por ejemplo el análisis de las secuencias de consenso pueden llevar a encontrar un gen de interés. Usando técnicas de hibridación y de amplificación un experto en la técnica puede rápidamente llegar a las secuencias del promotor correspondientes.

Los promotores preferidos según la invención son el promotor de celobiohidrolasa (CBHI) de 55 kDa, puesto que las enzimas son expresadas a gran nivel por sus propios promotores. Las secuencias del promotor están identificadas de una manera directa mediante donación como se describe en WO 00/20555, usando la información de la secuencia dada en la SEC ID N°. 1 (para CBH1). Los promotores de las enzimas degradadoras de carbohidratos de Chrysosporium, especialmente los promotores C1, pueden ventajosamente ser usados para expresar los polipéptidos deseados en un organismo huésped, especialmente un organismo huésped fúngico u otro microbiano. Las secuencias del promotor que tienen al menos el 65%, preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 75% de identidad de la secuencia de nucleótidos con la secuencia dada en la SEC ID NO 1, o con las secuencias encontradas para otros genes de Chrysosporium, son parte de la presente invención.

Para formas de realización particulares de la cepa recombinante y la secuencia de ácidos nucleicos según la invención también nos referimos a los ejemplos. También nos referimos a las cepas recombinantes para la técnica anterior que describe secuencias del promotor de gran expresión en particular aquellas que proporcionan gran expresión en hongos p. ej. tales como los que están descritos para Aspergillus y Trichoderma. La técnica anterior proporciona varias regiones reguladoras de la expresión para el uso en Aspergillus p. ej.. US 5,252,726 de Novo y US 5,705,358 de Unilever.

Una secuencia reguladora de la expresión puede también adicionalmente comprender un intensificador o silenciador. Estas son también bien conocidas en la técnica anterior y están normalmente localizadas a cierta distancia del promotor. Las secuencias reguladoras de la expresión pueden también comprender promotores con sitios de unión del activador y sitios de unión del represor. En algunos casos, estos sitios pueden también ser modificados para eliminar este tipo de regulación. Los promotores filamentosos fúngicos en los que los sitios de creA están presentes han sido descritos. Estos sitios para creA pueden ser mutados para asegurar la represión por glucosa que normalmente resulta de la presencia de los sitios no mutados se elimina. Gist-Brocades' WO 94/13820 ilustra este principio. El uso de tal promotor permite la producción del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos regulada por el promotor en presencia de glucosa. El mismo principio es también evidente a partir de WO 97/09438. Estos promotores pueden ser usados bien con o sin sus sitios para creA. Los mutantes en los que los sitios para creA han sido mutados pueden ser usados como secuencias reguladoras de la expresión en una cepa recombinante según la invención y la secuencia de ácidos nucleicos que regula puede después ser expresada en presencia de glucosa. Tales promotores de Chrysosporium aseguran la desrepresión de una manera análoga a aquella que está ilustrada en WO 97/09438. La identidad de sitios para creA es conocida a partir de la técnica anterior. De forma alternativa, es posible aplicar un promotor con los sitios de unión de creA que no han sido mutados en una cepa huésped con una mutación en otro lugar en el sistema de represión p. ej. en el propio gen creA, de modo que la cepa puede, sin importar la presencia de sitios de unión de creA, producir la proteína o polipéptido en presencia de glucosa.

Las secuencias del terminador son también secuencias reguladoras de la expresión y éstas están operativamente enlazadas al término 3' de la secuencia que debe ser expresada. Cualquier terminador fúngico es susceptible de ser funcional en la cepa huésped de Chrysosporium según la invención. Ejemplos son el terminador de trpC de A. nidulans (1), el terminador de alfa-glucosidasa de A. niger (2), el terminador de glucoamilasa de A. niger (3), el terminador de carboxil proteasa de Mucor miehei (US 5,578,463) y el terminador de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei. De forma natural, las secuencias del terminador de Chrysosporium funcionarán en Chrysosporium y son adecuadas p. ej. el terminador CBH1.

Una cepa recombinante de Chrysosporium adecuada para ser usada según la invención tiene la secuencia de ácidos nucleicos para ser expresada operativamente enlazada a una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos definida como la secuencia señal. Una secuencia señal es una secuencia de aminoácidos que cuando está operativamente enlazada a la secuencia de aminoácidos del polipéptido expresado permite la secreción de la misma a partir del hongo huésped. Tal secuencia señal puede ser una normalmente asociada con el polipéptido heterólogo o puede ser una nativa del huésped. Ésta puede también ser externa tanto al huésped como al polipéptido. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia señal debe estar situada en el marco para permitir la traducción de la secuencia señal y del polipéptido heterólogo. Cualquier secuencia señal capaz de permitir la secreción de un polipéptido a partir de una cepa de Chrysosporium está prevista. Esta secuencia señal es de manera adecuada una secuencia señal fúngica, preferiblemente una secuencia señal de ascomicetes.

Ejemplos adecuados de secuencias señal pueden ser derivados de levaduras en general o cualquiera de los géneros siguientes específicos de hongos: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Pichia, Neurospora, Rhizomucor, Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces o formas sexuales alternativas de los mismos como Emericella, Hypocrea. Las secuencias señal que son particularmente útiles frecuentemente están asociadas originalmente con las proteínas siguientes una celobiohidrolasa, una endoglucanasa, una beta-galactosidasa, una xilanasa, una pectinasa, una esterasa, una hidrofobina, una proteasa o una amilasa. Los ejemplos incluyen amilasa o glucoamilasa de Aspergillus o Humicola (4), TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, alfa-amilasa de Aspergillus Níger, carboxil peptidasa de Mucor (US 5,578,463), una lipasa o proteinasa de Rhizomucor miehei, celobiohidrolasa de Trichoderma (5), beta-galactosidasa de Penicillium canescens y factor alfa de acoplamiento de Saccharomyces.

De forma alternativa la secuencia señal puede proceder de un gen de amilasa o de subtilisina de una cepa de Bacillus. Una secuencia señal del mismo género que la cepa huésped es extremadamente adecuada puesto que es más susceptible de ser específicamente adaptada al huésped específico así preferiblemente la secuencia señal es una secuencia señal de Chrysosporium, especialmente de la cepa C1 de Chrysosporium, de la cepa UV13-6, de la cepa NG7C-19 y de la cepa UV 18-25, a las que se ha hecho referencia anteriormente. Las secuencias señal de hongos filamentosos, levaduras y bacterias son útiles. Las secuencias señal de origen no fúngico también están consideradas útiles, particularmente las bacterianas, vegetales y mamíferas.

Un huésped recombinante para ser usado según cualquiera de las formas de realización de la invención pueden adicionalmente comprender un marcador seleccionable. Este marcador seleccionable permitirá una fácil selección de células transformadas o modificadas. Un marcador seleccionable frecuentemente codifica un producto genético que proporciona un tipo específico de resistencia externo a la cepa no transformada. Ésta puede ser resistencia a metales pesados, antibióticos y biocidas en general. La prototrofia es también un marcador seleccionable útil de la variedad no antibiótica. Los marcadores seleccionables no antibióticos pueden ser preferidos cuando se va a utilizar la proteína o polipéptido de interés en alimentos o fármacos con el propósito de una aprobación regulatoria menos complicada y más rápida de tal producto. Muy a menudo la indicación GRAS se usa para este tipo de marcadores. Varios de estos marcadores están disponibles para el experto en la técnica. La FDA p. ej. proporciona una lista de este tipo. Más frecuentemente usados son los marcadores seleccionables seleccionados del grupo que confiere resistencia a un fármaco o que libera un defecto nutricional p. ej. el grupo que comprende amdS (acetamidasa), hph (higromicina fosfotransferasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), trpC (antranilato sintasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), sC (sulfato adenil-transferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), resistencia al glufosinato, niaD (nitrato-reductasa), un gen de resistencia a la bleomicina, más específicamente Sh ble, resistencia a la sulfonilurea p. ej. mutación ilv1 de la acetolactato sintasa. La selección puede también efectuarse en virtud de la cotransformación cuando el marcador de la selección está en un vector separado o cuando el marcador de la selección está en el mismo fragmento de ácidos nucleicos que la secuencia de codificación del polipéptido para el polipéptido de interés.

Según se utiliza en este caso, el término polipéptido heterólogo es una proteína o polipéptido normalmente no expresado y segregado por la cepa huésped que se utiliza para la expresión según la invención. El polipéptido puede ser de origen vegetal o animal (vertebrado o invertebrado) p. ej. proveniente de un mamífero, pez, insecto, o microorganismo, con la condición de que se genere en la cepa huésped. Un mamífero puede incluir un humano. Un microorganismo comprende virus, bacterias, arqueobacterias y hongos es decir hongos filamentosos y levaduras. El Manual de Bergey de Determinología Bacteriana proporciona listas adecuadas de bacterias y arqueobacterias. Para fines farmacéuticos existirá con bastante frecuencia una preferencia por proteínas humanas de modo que un huésped recombinante según la invención que constituya una forma de realización preferida será un huésped en el que el polipéptido sea de origen humano. Para fines tales como la producción de alimentos de manera adecuada el polipéptido heterólogo será de origen animal, vegetal o algal. Las formas de realización de este tipo también están consideradas en consecuencia ejemplos adecuados de la invención. Las formas de realización alternativas que son útiles también incluyen un polipéptido heterólogo de cualquiera de los orígenes bacteriano, de levadura, vírico, arqueobacteriano y fúngico. El origen fúngico es el más preferido.

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Una forma de realización adecuada de la invención comprenderá una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga con el uso adaptado del codón. Tal secuencia codifica la secuencia de aminoácidos nativa del huésped del cual deriva, pero tiene una secuencia de ácidos nucleicos diferente, es decir una secuencia de ácidos nucleicos en la que determinados codones han sido sustituidos por otros codones que codifican el mismo aminoácido pero que se utilizan más fácilmente por la cepa huésped utilizada para la expresión. Esto puede llevar a una mejor expresión de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga. Ésta es una práctica común para un experto en la técnica. Este uso adaptado del codón puede llevarse a cabo en base al uso del codón conocido del uso del codón fúngico con respecto al no fúngico. También se puede adaptar más específicamente al uso del codón del propio Chrysosporium. Las similitudes son tales que el uso del codón como se ha observado en Trichoderma, Humicola y Aspergillus debería permitir el intercambio de secuencias de organismos de este tipo sin adaptación del uso del codón. Están disponibles para el experto en la materia detalles referentes al uso del codón de estos hongos.

La invención no está limitada a las cepas recombinantes de Chrysosporium mencionadas arriba, sino que también cubre una cepa recombinante de Chrysosporium que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína homóloga para una cepa de Chrysosporium, dicha secuencia de ácidos nucleicos estando operativamente enlazada a una región reguladora de la expresión y dicha cepa recombinante expresa más de dicha proteína que la cepa correspondiente no recombinante bajo las mismas condiciones. En el caso de un polipéptido homólogo de interés es preferiblemente una enzima neutra o alcalina como una hidrolasa, una proteasa o una enzima degradadora de carbohidratos como ya se ha descrito en otro lugar. El polipéptido puede también ser acídico. Preferiblemente la cepa recombinante expresará el polipéptido en cantidades mayores que la cepa no recombinante. Todas las observaciones mencionadas con respecto al polipéptido heterólogo son también válidas (mutatis mutandis) para la celulasa del polipéptido homólogo.

Así la invención también cubre las cepas microbianas creadas genéticamente en las que la secuencia que se introduce puede provenir de Chrysosporium. Esta cepa puede, no obstante, ser distinguida de las cepas de origen nativo en virtud de por ejemplo secuencias heterólogas que están presentes en la secuencia de ácidos nucleicos usada para transformar o transfectar el Chrysosporium, en virtud del hecho de que múltiples copias de la secuencia que codifica el polipéptido de interés están presentes o en virtud del hecho de que éstas son expresadas en una cantidad que supera aquella de la cepa no creada genéticamente bajo condiciones idénticas o en virtud del hecho de que la expresión ocurre normalmente bajo condiciones de no expresión. Éste puede ser el caso si un promotor inducible regula la secuencia de interés contraria a la situación no recombinante o si otro factor induce la expresión como es el caso de la cepa no creada genéticamente. La invención está dirigida a cepas derivadas por ingeniería bien usando las tecnologías genéticas tradicionales o las metodologías de ingeniería genética.

Los sistemas de expresión y las cepas huéspedes que los contienen según la invención pueden comprender una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína heteróloga seleccionada de enzimas degradadoras de carbohidratos (celulasas, xilanasas, mananasas, mannosidasas, pectinasas, amilasas, p. ej. glucoamilasas, \alpha-amilasas, \alpha- y \beta-galactosidasas, \alpha- y \beta-glucosidasas, \beta-glucanasas, quitinasas, quitanasas), proteasas (endoproteasas, amino-proteasas, amino-y carboxi-peptidasas, queratinasas), otras hidrolasas (lipasas, esterasas, fitasas), oxidorreductasas (catalasas, glucosa-oxidasas) y transferasas (transglicosilasas, transglutaminasas, isomerasas e invertasas). Los productos más interesantes para ser producidos según la invención son las celulasas, xilanasas, pectinasas, lipasas y proteasas, donde las celulasas y las xilanasas se dividen en enlaces beta-1,4, y las celulasas comprenden endoglucanasas, celobiohidrolasas y beta-glucosidasas. Estas proteínas son extremadamente útiles en varios procesos industriales conocidos en la técnica. Específicamente para las celulasas nos referimos p. ej. a WO 98/15633 que describe las celobiohidrolasas y las endoglucanasas útiles.

Una cepa recombinante según la invención puede tener una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de interés codificando un polipéptido que es inactivado o inestable a pH ácido es decir pH inferior a 6; incluso inferior a pH 5,5; de manera más adecuada incluso inferior a pH 5 e incluso tan bajo como o inferior a pH 4. Ésta es una forma de realización particularmente interesante, puesto que los sistemas de expresión fúngica generalmente descritos no son cultivados bajo condiciones neutras a alcalinas, sino que son cultivados a pH ácido. Así el sistema según la invención proporciona un sistema de expresión fúngico seguro para proteínas o polipéptidos que son susceptibles de ser inactivados o que son inestables a pH ácido.

De manera bastante específica, una cepa recombinante tal y como se define en cualquiera de las formas de realización según la invención, donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de interés codifica una proteína o polipéptido que presenta actividad y/o estabilidad óptima a un pH 5, preferiblemente a pH neutro o alcalino (es decir por encima de 7) y/o a un pH superior a 6, está considerada una forma de realización preferida de la invención. Más del 50%, más del 70% e incluso más del 90% de las 20 actividades óptimas a tales valores de pH están anticipadas como siendo formas de realización particularmente útiles. Un polipéptido expresado según las condiciones del cultivo no necesariamente debe estar activo en las condiciones del cultivo, de hecho puede ser ventajoso que sea cultivado bajo condiciones bajo las cuales está inactivo puesto que su forma activa podría ser perjudicial para el huésped. No obstante lo que se requiere es que la proteína o polipéptido sea estable bajo las condiciones del cultivo. La estabilidad puede ser termoestabilidad. También puede haber estabilidad contra composiciones o productos químicos específicos, tal y como están presentes por ejemplo en composiciones o procesos de producción o aplicación del polipéptido o proteína de interés. LAS en composiciones detergentes que comprenden celulasas o lipasas, etc. es un ejemplo de un químico frecuentemente perjudicial para proteínas. Los períodos temporales de uso en aplicaciones pueden variar entre una exposición corta a larga de modo que la estabilidad pueda ser sobre una duración de tiempo variable que varía por aplicación. El experto en la materia será capaz de averiguar las condiciones correctas en un caso en base al caso. Se pueden usar varios ensayos comercialmente disponibles para determinar las actividades óptimas de los distintos productos enzimáticos. Las catálogos de Sigma y Megazyme por ejemplo lo demuestran. Ejemplos específicos de pruebas están mencionados en otro lugar en la descripción. Los fabricantes proporcionan instrucciones sobre la aplicación.

Una cepa de Chrysosporium puede ser de manera adecuada usada para transformarse o transfectarse con la secuencia de interés para ser expresada y tal cepa muestra una biomasa relativamente baja. Hemos encontrado que las cepas de Chrysosporium que tienen una biomasa dos a cinco veces inferior a la de Trichoderma Reesei cuando son cultivadas a una viscosidad de 200-600 cP al final de la fermentación y que presentan una biomasa de 10 a 20 veces inferior a la del Aspergillus niger cuando se cultiva a una viscosidad de 1500-2000 cP bajo las condiciones correspondientes, es decir sus condiciones de cultivo óptimas respectivas, pueden proporcionar un nivel alto de expresión. Este nivel de expresión supera de lejos al de las dos cepas de referencia comercial a una biomasa mucho más baja y a una viscosidad mucho inferior. Esto significa que el rendimiento de expresión de estas cepas de Chrysosporium serán considerablemente superiores a las de Aspergillus niger y Trichoderma reesei. Esta cepa transformada o transfectada de Chrysosporium constituye una forma de realización adecuada de la invención.

Encontramos una biomasa de 0,5-1,0 g/l para la cepa de Chrysosporium C1(18-25) en oposición a 2,5-5,0 g/l para Trichoderma reesei y 5-10 g/l de Aspergillus niger según las condiciones descritas anteriormente. En los ejemplos proporcionamos detalles de este proceso.

En una forma de realización adecuada una cepa de Chrysosporium recombinante produce proteína o polipéptido en al menos la cantidad equivalente a la producción en moles por litro de celulasa por la cepa UV13-6 o C-19, y más preferiblemente al menos equivalente o superior a la de la cepa UV18-25 según las condiciones correspondientes o idénticas, es decir sus condiciones de cultivo óptimas respectivas.

Hemos encontrado también que los índices de expresión y de secreción son exageradamente altos cuando se usa una cepa de Chrysosporium que presenta la morfología micelial de la cepa UV 18-25 es decir fragmentada en micelios cortos. Así una cepa recombinante según la invención preferiblemente presenta esta morfología. La invención no obstante también cubre cepas no recombinantes o por el contrario cepas de Chrysosporium creadas genéticamente que presentan esta característica nueva e inventiva. También está cubierta por la invención una cepa recombinante de Chrysosporium en cualquiera de las formas de realización descritas según la invención que presenta demás una esporulación reducida en comparación con C1, preferiblemente inferior a la de cepa UV13- 6, preferiblemente inferior a la de NG7C-19, preferiblemente inferior a la de UV 18-25 bajo condiciones de fermentación equivalentes. La invención cubre también una cepa recombinante de Chrysosporium en cualquiera de las formas de realización descritas según la invención que presenta además al menos la cantidad de proporción de producción de proteína a biomasa en comparación con C1, preferiblemente en comparación con aquella de cualquiera de las cepas UV13-6; NG7C-19 y UV18-25 bajo condiciones de fermentación equivalentes. La invención no obstante también cubre cepas no recombinantes o por el contrario cepas de Chrysosporium creadas genéticamente que presentan esta característica nueva e inventiva como tal o en combinación con cualquiera de las otras formas de realización.

Otra forma de realización atractiva de la invención también cubre una cepa recombinante de Chrysosporium que presenta una viscosidad inferior a la de la cepa NG7C-19, preferiblemente inferior a la de UV 18-25 bajo condiciones de fermentación correspondientes o idénticas. La invención no obstante también cubre cepas no recombinantes o por el contrario cepas de Chrysosporium creadas genéticamente que presentan esta característica nueva e inventiva como tal o en combinación con cualquiera de las demás formas de realización. Hemos determinado que la viscosidad de un cultivo de UV18-25 está por debajo de 10 cP opuesta a la de Trichoderma reesei que está en el orden de 200-600 cP, con aquella de Aspergillus niger que está en el orden de 1500-2000 cP bajo sus condiciones de cultivo óptimas respectivas al final de la fermentación. El proceso usado para esta determinación está provisto en los ejemplos.

La viscosidad puede ser evaluada en muchos casos por monitorización visual. La fluidez de la sustancia puede variar hasta una extensión tan grande que ésta puede ser casi sólida, tipo salsa o líquida. La viscosidad puede también fácilmente ser constatada por la viscometría rotacional de Brookfield, el uso de tubos de viscosidad cinemática, el viscosímetro de caída de la bola o viscosímetro tipo copa. Los rendimientos de tal cultivo de baja viscosidad son superiores a los de los cultivos de mayor viscosidad comerciales conocidos por unidad de tiempo y por célula.

El tratamiento de tales cultivos de baja viscosidad según la invención es ventajoso en particular cuando los cultivos son extrapolados. Las cepas de Chrysosporium en cuestión con la baja viscosidad funcionan muy bien en cultivos tan grandes como de hasta 150,000 litros de cultivo. Así cualquier tamaño de cultivo superior a 150,000 litros proporciona una forma de realización útil de la invención. Cualquier otro tamaño convencional de fermentación debería funcionar bien con las cepas según la invención. El razonamiento detrás de esto es que los problemas pueden aumentar con la producción a gran escala con la formación de agregados con micelios que son demasiado densos y/o están distribuidos de forma no uniforme. Los medios como resultado no pueden ser eficazmente utilizados durante el cultivo conduciendo así a un proceso de producción ineficiente en particular en fermentaciones a gran escala es decir por encima de 150, 000 litros. La aireación y la mezcla se hacen problemáticas conduciendo a una inanición de oxígeno y de nutrientes y por lo tanto una concentración reducida de la biomasa productiva y un rendimiento reducido del polipéptido durante el cultivo y/o puede resultar en unos tiempos de fermentación más largos. Además una viscosidad alta y una cizalla alta no es deseable en los procesos de fermentación comerciales y en los procesos comerciales actuales son factores limitadores de la producción. Todos estos aspectos negativos pueden ser superados por el huésped de Chrysosporium según la invención que presenta características mucho mejores que Trichoderma reesei, Aspergillus Níger y Aspergillus oryzae que son comercialmente usados con este propósito, es decir presenta mejores niveles de producción proteica y mejores propiedades de viscosidad y figuras de la biomasa.

Una cepa de Chrysosporium según cualquiera de las formas de realización de la invención mencionadas arriba, dicha cepa que además presenta la producción de una o más de las enzimas fúngicas seleccionadas de las enzimas degradantes de carbohidratos, proteasas, otras hidrolasas, oxidorreductasa, y transferasas mencionadas arriba, se considera una forma de realización particularmente útil de la invención. Los productos más interesantes son específicamente celulasas, xilanasas, pectinasas, lipasas y proteasas. También útil como forma de realización de la invención no obstante es una cepa de Chrysosporium que presenta la producción de una o más enzimas fúngicas que presenta estabilidad y/o actividad neutra o alcalina óptima, preferiblemente estabilidad alcalina óptima y/o actividad, dicha enzima siendo seleccionada de enzimas degradantes de carbohidratos, hidrolasas y proteasas, preferiblemente hidrolasas y enzimas degradantes de carbohidratos. En el caso de Chrysosporium no recombinante, estas enzimas son de manera adecuada distintas de la celulasa como se describe en WO 98/15633. Las enzimas de particular interés son xilanasas, proteasas, esterasas, alfa galactosidasas, beta-galactosidasas, beta-glucanasas y pectinasas. Las enzimas no están limitadas a lo anteriormente mencionado. Las observaciones con respecto a la estabilidad y actividad en otro lugar en la descripción son válidas aquí también.

La invención también cubre un método para producir un polipéptido de interés, dicho método comprendiendo el cultivo de una cepa huésped (p. ej. fúngica tal como la de los géneros Chrysosporium, Aspergillus, Trichoderma, Hansenula, Mucor, Pichia, Neurospora, Tolipocladium, Rhizomucor, Fusarium, Penicillium o bacteriano u otro microbiano) en cualquiera de las formas de realización según la invención bajo condiciones que permiten la expresión y preferiblemente la secreción del polipéptido y posteriormente la recuperación del polipéptido de interés producido.

Cuando se menciona proteína o polipéptido, se prevé que las variantes y mutantes p. ej. mutantes de sustitución, inserción o deleción de proteínas de origen natural estén incluidos, los cuales presentan la actividad del no mutante. Lo mismo es válido con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes. Procesos tales como transposición de genes, ingeniería de proteínas y mutagénesis sitio dirigida de evolución dirigida y mutagénesis aleatoria son procesos a través de los cuales tales polipéptidos, variantes o mutantes pueden ser obtenidos. US 5,223,409; US 5,780,279 y US 5,770,356 proporcionan un enseñamiento de evolución dirigida. Usando este proceso una biblioteca de secuencias de genes mutados de forma aleatoria creadas por ejemplo por transposición de genes por medio de PCR con tendencia al error ocurre en cualquier tipo de célula. Cada gen tiene una región de secreción y una región de inmovilización fijada a él de manera que la proteína resultante es segregada y queda fijada a la superficie del huésped. Posteriormente se crean condiciones que necesitan la actividad biológica del polipéptido particular. Esto ocurre en varios ciclos en última instancia conduciendo a un gen final con las características deseadas. En otras palabras un proceso de evolución acelerado dirigido. US 5,763,192 también describe un proceso para obtener ADN, ARN, péptidos, polipéptidos o proteínas por medio del polinucleótido sintético acoplando secuencias generadas estocásticamente, introduciéndolo en un huésped seguido de la selección de la célula huésped con la característica correspondiente predeterminada.

Otra aplicación del método de la presente invención es en el proceso de "evolución dirigida", en el que se generan secuencias de ADN que codifican la proteína nueva, las proteínas codificadas son expresadas en una célula huésped, y éstas secuencias que codifican proteínas que tienen una característica deseada son mutadas y expresadas nuevamente. El proceso es repetido varios ciclos hasta que se obtiene una proteína con las características deseadas. La transposición de genes, ingeniería de proteínas, PCR con tendencia al error, mutagénesis dirigida, y mutagénesis combinatoria y aleatoria son ejemplos de procesos a través de los cuales se pueden generar secuencias de ADN que codifican proteínas exógenas nuevas. Las patentes U.S. 5,223,409, 5,780,279 y 5,770,356 proporcionan el enseñamiento de la evolución dirigida. Ver también Kuchner y Arnold, Trends in Biotechnology, 15:523-530 (1997); Schmidt-Dannert y Arnold, Trends in Biotech., 17:135-136 (1999); Arnold y Volkov, Curr. Opin. Chem. Biol; 3:54-59 (1999); Zhao et Al., Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2nd Ed., (Demain and Davies, eds.) pp. 597-604, ASM Press, Washington DC, 1999; Arnold y Wintrode, Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, (Flickinger and Drew, eds.) pp. 971-987, John Wiley & Sons, New York, 1999; y Minshull y Stemmer, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284-290.

Una aplicación de la mutagénesis combinatoria se describe en Hu et Al., Biochemistry. 1998 37:10006-10015. US 5,763,192 describe un proceso para obtener nuevas secuencias de ADN que codifican proteínas mediante la generación estocásticamente de secuencias sintéticas, introduciéndolas en un huésped, y seleccionando las células huéspedes con la característica deseada. Los métodos para efectuar la recombinación de genes artificial (redistribución de ADN) incluyen la recombinación aleatoria (Z. Shao, et al., Nucleic Acids Res., 26:681-683 (1998)), el proceso de extensión empalmada (H. Zhao et al., Nature Biotech., 16:258-262 (1998)), y la recombinación heteroduplex (A. Volkov et Al., Nucleic Acids Res., 27:e18 (1999)). La PCR con tendencia al error es también otro enfoque (Song and Rhee, Appl. Environ. Microbiol. 66:890-894 (2000)).

Hay dos métodos de realización muy practicados para realizar la fase de selección en un proceso de evolución dirigida. En un método, la actividad de la proteína de interés es de alguna manera esencial para la supervivencia de las células huéspedes. Por ejemplo, si la actividad deseada es una celulasa activa a pH 8, un gen de celulasa podría ser mutado e introducido en las células huéspedes. Los transformantes son sometidos a crecimiento con celulosa como la fuente de carbono única, y el pH es aumentado gradualmente hasta que sólo quedan unos pocos supervivientes. El gen de la celulasa mutada de los supervivientes, que supuestamente codifica una celulasa activa a pH relativamente alto, está sujeto a otra ronda de mutación, y el proceso es repetido hasta obtener transformantes que pueden crecer en celulosa a pH 8. Las variantes termoestables de enzimas pueden asimismo ser desarrolladas, por ciclos de mutación del gen y el cultivo a alta temperatura de células huéspedes (Liao et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 83:576-580 (1986); Giver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12809-12813 (1998).

Una alternativa al enfoque de la "ley del más fuerte" masivamente paralela es la selección en serie. En este enfoque, los transformantes individuales son seleccionados por métodos tradicionales, tales como observación de zonas aclaradas o coloreadas alrededor de las colonias que crecen en medios indicadores, ensayos colorimétricos o enzimáticos, inmunoensayos, ensayos de enlaces, etc. ver por ejemplo Joo et al., Nature 399:670-673 (1999), donde una monooxigenasa del citocromo P450 que no requiere NADH como un cofactor fue desarrollada por ciclos de mutación y selección; May et al., Nature Biotech. 18:317-320 (2000), donde una hidantoinasa con estereoselectividad inversa fue desarrollada de una forma similar; y Miyazaki et al., J. Mol. Biol. 297:1015-1026 (2000), donde una subtilisina termoestable fue desarrollada.

La clonación estándar y las técnicas de aislamiento de la proteína o del polipéptido pueden utilizarse para llegar a la información de la secuencia requerida. Partes de secuencias conocidas pueden ser usadas como sondas para aislar otros homólogos en otros géneros y cepas. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica una actividad enzimática particular puede utilizarse para seleccionar una biblioteca de Chrysosporium por ejemplo. Un experto en la técnica sabrá qué condiciones de hibridación son apropiadas. Unos métodos convencionales para la construcción de la hibridación de los ácidos nucleicos de bibliotecas y técnicas de clonación están descritos en Sambrook et Al (Eeds) (1989) en "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor, Press Plainview, New York, y Ausubel et al (Eds) "Current Protocols in Molecular Biology" (1987) John Wiley and Sons, New York. La información pertinente puede también derivar de manuales y patentes recientes, así como de varios equipos comercialmente disponibles en el campo.

En una forma de realización alternativa, dicho método comprende el cultivo de una cepa según la invención bajo condiciones que permiten la expresión y preferiblemente la secreción de la proteína o polipéptido o precursor de los mismos y la recuperación del polipéptido posteriormente producido y opcionalmente someter al precursor a fases adicionales de aislamiento y de purificación para obtener el polipéptido de interés. Tal método puede de manera adecuada comprender una fase de seccionamiento del precursor en el polipéptido o precursor de interés. La fase del seccionamiento puede ser un seccionamiento con una Kex-2 como proteasa, cualquier proteasa pareada de aminoácido básico o Kex-2 por ejemplo cuando un sitio de seccionamiento de la proteasa enlaza un portador de la proteína bien segregado y el polipéptido de interés. Un experto en la técnica puede rápidamente encontrar secuencias de la proteasa tipo Kex-2 como detalles de la secuencia de consenso para aquellas que están disponibles y varias alternativas han sido ya descritas p. ej. la furina.

De manera adecuada en un método para la producción del polipéptido según cualquiera de las formas de realización de la invención el cultivo ocurre a pH superior a 5, preferiblemente 5-10, más preferiblemente 6-9. De manera adecuada en tal método el cultivo ocurre a una temperatura entre 25-43°C, preferiblemente 30-40°C. La cepa usada en el método según la invención es de manera bastante adecuada una cepa de Chrysosporium recombinante u otra cepa fúngica o no fúngica. El método según la invención en tal caso puede adicionalmente ser precedida por la fase de producción de una cepa recombinante según la invención. La selección de las condiciones apropiadas dependerán de la naturaleza del polipéptido que debe ser expresado y esta selección está incluida dentro del reino de la actividad normal de un experto en la técnica.

El método de producción de una cepa recombinante según la invención es también parte de la presente invención. El método comprende la introducción estable de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido heterólogo u homólogo en una cepa huésped, dicha secuencia de ácidos nucleicos estando operativamente enlazada a una región reguladora de la expresión, dicha introducción ocurre en cierto modo conocido per se para transformar hongos filamentosos. Como se ha declarado antes, numerosas referencias de ello están disponibles y una pequeña selección ha sido citada. La información proporcionada es suficiente para permitir al experto en la técnica llevar a cabo el método sin que suponga una carga excesiva. El método comprende la introducción de una secuencia de ácidos nucleicos que comprende cualquiera de los elementos del ácido nucleico descritos en las distintas formas de realización de la cepa recombinante según la invención como tal o en combinación.

Por ejemplo la introducción puede ocurrir usando el método de transformación de protoplastos. El método está descrito en los ejemplos. Los métodos alternativos de transformación de protoplastos o esferoplastos son conocidos y pueden ser usados como se ha descrito en la técnica anterior para otros hongos filamentosos. Detalles de tales métodos pueden ser encontrados en muchas de las referencias citadas. Un método según la invención comprende de manera adecuada el uso de una cepa no recombinante como materia prima para la introducción de la secuencia deseada que codifica el polipéptido de interés.

La presente invención también cubre un método para producir la enzima de Chrysosporium, dicho método comprendiendo el cultivo de una cepa de Chrysosporium u otra cepa en o sobre un medio de cultivo a pH superior a 5; preferiblemente 5-10; más preferiblemente 6-9; de manera adecuada 6-7.5, 7.5-9 como ejemplos de gamas de pH neutras y alcalinas.

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De forma más general la invención cubre además un método para producir enzimas que presentan actividad y/o estabilidad óptima neutra o alcalina, actividad y/o estabilidad óptima preferiblemente alcalina. Las gamas preferidas de cara al pH y la actividad óptima al igual que los ensayos con los cuales determinarlos han sido proporcionados en otro lugar en la descripción. La enzima debería ser seleccionada de enzimas degradadoras de carbohidratos, proteasas, otras hidrolasas, oxidorreductasas, y transferasas, según se ha descrito anteriormente, dicho método comprendiendo el cultivo de una célula huésped transformada o modificada con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la enzima correspondiente. De manera adecuada tal enzima será una enzima de Chrysosporium. Un método adecuado tal como este comprende la producción específicamente de celulasa, xilanasa, pectinasa, lipasa y proteasa, donde la celulasa y xilanasa seccionan los enlaces 8-1,4 y la celulasa comprende endoglucanasa, celobiohidrolasa y \beta-glucosidasa. El método según la invención puede comprender el cultivo de cualquier huésped de Chrysosporium según la invención que comprende los ácidos nucleicos que codifican las mencionadas enzimas. De manera adecuada la producción de huéspedes no recombinantes de Chrysosporium según la invención se dirige a la producción de enzimas degradantes de carbohidratos, las hidrolasas y las proteasas. En tal caso la enzima es de manera adecuada distinta de una celulasa. Los métodos de aislamiento son análogos a aquellos descritos en WO 98/15633.

Las enzimas producidas según la invención están también cubiertas por la invención. Las enzimas de origen Chrysosporium como pueden ser aisladas de cepas no recombinantes de Chrysosporium según la invención están también cubiertas. Éstas presentan las características mencionadas de estabilidad y de actividad. De manera adecuada son estables en presencia de LAS. En particular las proteasas con pl 4-9.5, las proteasas con un PM de 25-95 kD, las xilanasas con pl entre 4.0 y 9.5, las xilanasas con PM entre 25 y 65 kD, las endoglucanasas con un pl entre 3.5 y 6.5, las endoglucanasas con PM de 25-55 kDa, B-glucosidasas, \alpha,\beta-galactosidasas con un pl de 4-4.5, \beta-glucosidasas, \alpha,\beta-galactosidasas con un PM de 45-50 kDa, celobiohidrolasas de pl 4-5, celobiohidrolasas de PM 45-75 kDa, p. ej. poligalacturonasas con PM de 55 kD y pl 4.4, con una poligalacturonasa de pl de 4.0-5.0 de 60-70 kDa, p. ej. esterasas de 65^{-}kDa con un pl 4-5, y esterasas con un PM de 95-105 kDa con las características de estabilidad y de actividad mencionadas anteriormente están reivindicadas. Los pesos moleculares (PM) son aquellos determinados por SDS-PAGE. La enzima no recombinante es decir de origen natural es distinta de la celulasa como está descrito en WO 98/15633. Las enzimas con combinaciones de los valores de pl y los pesos moleculares mencionados arriba están también cubiertos.

La invención también se ocupa de la (sobre)producción de productos no proteínicos por las cepas mutantes (recombinantes) de la invención. Los productos no proteínicos de este tipo incluyen metabolitos primarios tales como ácidos orgánicos, aminoácidos, y secundarios tales como antibióticos, p. ej. penicilinas y cefalosporinas y otros terapéuticos. Estos productos son el resultado de combinaciones de vías bioquímicas, implicando diferentes genes fúngicos de interés. Los metabolitos fúngicos primarios y secundarios y los procedimientos para producir estos metabolitos en organismos fúngicos son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de la producción de metabolitos primarios han sido descritos por Mattey M., The Production of Organic Acids, Current Reviews in Biotechnology, 12, 87-132 (1992). Ejemplos de la producción de metabolitos secundarios han sido descritos por Penalva et Al. The Optimization of Penicillin Biosynthesis in Fungi, Trends in Biotechnology 16, 483-489 (1998).

Ejemplos Ejemplos de transformación comparando Chrysosporium, Trichoderma y Tolypocladium geodes

Dos cepas C1 no transformadas de Chrysosporium y una cepa de referencia de Trichoderma reesei fueron evaluadas en dos medios (Gs pH 6,8 y Pridham agar, PA, pH 6,8). Para evaluar el nivel de resistencia a los antibióticos, las esporas fueron recogidas de placas de PDA de 7 días de antigüedad. Las placas selectivas fueron incubadas a 32°C y evaluadas después de 2, 4 y 5 días. Resultó que las cepas C-1 NG7C-19 y UV 18-25 claramente tenían un nivel basa) de resistencia bajo tanto a la fleomicina como a la higromicina. Este nivel es comparable al de una cepa de referencia de T. reesei de laboratorio usada de forma común. Por tanto hay una indicación clara de que estos dos marcadores fúngicos estándar seleccionables pueden ser usados bien en cepas de Chrysosporium. No se prevén problemas con otros marcadores fúngicos estándar seleccionables.

Selección de cepas de Chrysosporium transformadas con Sh-ble (resistencia a la fleomicina) fue realizada satisfactoriamente a 50 \mug/ml. Este fue también el nivel de selección usado para T. reesei mostrando así que la selección diferencial puede ser fácilmente conseguida en Chrysosporium. Las mismas observaciones son válidas para cepas transformadas con resistencia a la higromicina a un nivel de 150 \mug/ml.

La técnica de la transformación del protoplasto fue usada en Chrysosporium en base a la tecnología de transformación fúngica generalmente más aplicada. Todas las esporas de una placa de PDA de 90 mm fueron recuperadas en 8 ml de IC1 y transferidas a un frasco de agitación de medio de IC1 de 50 ml para su incubación durante 15 horas a 35°C y 200 rpm. Después de que este el cultivo fuera centrifugado, el granulado fue lavado en MnP, puesto de nuevo en solución en 10 ml de MnP y 10 mg/ml de Caylase C_{3} e incubado durante 30 minutos a 35°C con agitación (150 rpm).

La solución fue filtrada y el filtrado fue sometido a centrifugado durante 10 minutos a 3500 rpm. El granulado fue lavado con 10 ml de MnPCa^{2+}. Este fue centrifugado durante 10 minutos a 25°C. Luego 50 microlitros de MPC frío fueron añadidos. La mezcla fue mantenida en hielo durante 30 minutos a lo cual se añadieron 2,5 ml de PMC. Después de 15 minutos a la temperatura ambiente 500 microlitros de los protoplastos tratados fueron mezclados con 2 ml de MnR blando e inmediatamente puestos en una placa de MnR que contenía fleomicina o higromicina como agente de selección. Tras la incubación durante cinco días a 30°C los transformantes fueron analizados (loe clones se vuelven visibles después de 48 horas). La eficacia de la transformación fue determinada usando 10 microgramos del plásmido de referencia pAN8-119. Los resultados están presentados en la siguiente Tabla 1.

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TABLA 1

Eficacia de la transformación
(usando 10 \mug de plásmido de referencia pAN8-1)

1

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La viabilidad del transformante de Chrysosporium es superior al de Trichoderma. La transformabilidad de las cepas es comparable y así el número de transformantes obtenidos en un experimento es 4 veces más alto para Chrysosporium que para T. reesei. Así el sistema de transformación de Chrysosporium no sólo iguala el sistema de T. reesei usado de forma común, sino que incluso lo supera. Esta mejora puede ser especialmente útil para vectores que son menos eficaces para la transformación que pAN8-1. Ejemplos de tales vectores tan poco eficaces para la transformación son vectores portadores de proteínas para la producción de proteínas no fúngicas que generalmente producen 10 veces menos transformantes.

Varios otros vectores de transformación y de expresión fueron construidos con secuencias de codificación de proteínas homólogas de Chrysosporium y también con secuencias de codificación de proteínas heterólogas para el uso en experimentos de transformación con Chrysosporium.

Ejemplos de sistemas de expresión incluyen un fragmento del promotor de xilanasa Xyl1 de Chrysosporium enlazado a una secuencia señal de xilanasa enmarcada con un marco de lectura abierto de la xilanasa seguido de una secuencia de terminación de la xilanasa. La selección del transformante se realiza usando la cotransformación con un vector seleccionable.

Otro ejemplo es un promotor de la celobiohidrolasa de Chrysosporium lucknowense enlazado a la secuencia señal de la endoglucanasa 3 de Penicillium enmarcada con un marco de lectura abierto de la endoglucanasa 3 de Penicillium seguido de la secuencia de terminación de la celobiohidrolasa de Chrysosporium. Además este vector lleva un segundo casete de expresión con un marcador de la selección es decir el gen de la aceetamidasa S (amdS gen).

Otro ejemplo comprende el promotor de la gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa 1 de Chrysosporium enlazado a la secuencia señal de la glucoamilasa de Aspergillus niger y el marco de lectura abierto de la glucoamilasa fusionado al marco de lectura abierto de la Interleukina 6 humana. Además este vector lleva un segundo casete de expresión con un marcador de la selección es decir el gen amdS.

Otro ejemplo adicional es un promotor de la gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa de Aspergillus nidulansenlazado al marco de lectura abierto de la endoglucanasa 5 seguido de una secuencia del terminador de Aspergillus nidulans.

Ejemplos de expresión heteróloga y homóloga de transformantes de Chrysosporium

Se han evaluado cepas C1 (NG7C-19 y/o UV18-25) para su capacidad para segregar varias proteínas heterólogas: una proteína bacteriana (proteína de resistencia a la feomicina de Streptoalloteichus hindustanus, Sh ble), una proteína fúngica (xilanasa II de Trichoderma reesei, XYN2) y una proteína humana (la lisozima humana, HLZ).

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La secreción de C1 de xilanasa II (XYN2) de Trichoderma reesei

La cepa C1 de UV18-25 ha sido transformada por los plásmidos pUT1064 y pUT1065. pUT1064 presenta los dos casetes de expresión fúngica siguientes:

El primer casete permite la selección de transformantes resistentes a la fleomicina:

- promotor^{14} del gen 1 de control de vía cruzada (cpc-1) de Neurospora crassa

- gen de resistencia a la fleomicina Sh ble^{4} de Streptoalloteichus hindustanus

- terminador^{5} de la triptófano-sintasa (trpC) de Aspergillus nidulans

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El segundo casete es el casete de producción de la xilanasa:

- promotor^{15} cbh1 de la cepa TR2 de T. reesei

- gen^{16} xyn2 de la cepa TR2 (incluso de su secuencia señal) de T. reesei

- terminador^{15} cbh1 de la cepa TR2 de T. reesei

El vector también lleva un origen de la replicación de E. coli del plásmido pUC19^{6}. El mapa plásmido detallado está provisto en la figura 1.

pUT1065 presenta el casete de expresión fúngica siguiente:

- promotor^{2} de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (gpdA) de A. nidulans

- una secuencia señal^{1,3} de celobiohidrolasa I (cbh1) sintética de T. reesei

- gen de resistencia a la fleomicina Sh ble^{4} de S. hindustanus usado como portador-proteína^{10}

- un péptido de enlace (SGERK) representando un sitio de seccionamiento de la proteasa 1 tipo KEX2

- gen^{16} xyn2 de la cepa TR2 (sin secuencia señal) de T. reesei

- terminador^{5} de triptófano-sintasa (trpC) de A. nidulans

El vector también lleva el gen de la beta-lactamasa (bla) y un origen de la replicación de E. coli del plásmido pUC18^{6}. El mapa del plásmido detallado está provisto en la Figura 2.

Los protoplastos de C1 fueron transformados con el plásmido pUT1064 o pUT1065 siguiendo el mismo procedimiento ya descrito en el ejemplo anterior. La proteína de fusión en el plásmido pUT1065 (Sh ble:: XYN2) es funcional con respecto a la resistencia a la fleomicina permitiendo así una selección fácil de los transformantes de C1. Además, el nivel de resistencia a la fleomicina se correlaciona aproximadamente con el nivel de expresión de xyn2. En pUT1064, xyn2 fue clonado con su propia secuencia señal.

La producción de la xilanasa de los transformantes de C1 (clones resistentes a la fleomicina) fue analizada por ensayo de la actividad de la xilanasa como sigue: transformantes primarios fueron puestos con palillos en placas de GS+fleomicina (5 \mug/ml) (verificación de la resistencia) y también en placas de xilano (detección de la actividad xilanasa mediante aclarado de la zona de visualización^{17}). Las placas fueron hechas crecer durante 5 días a 32°C. Cada clon aceptado fue subclonado en placas de xilano. Dos subclones por transformante fueron usados para inocular placas de PDA para obtener esporas para la iniciación del cultivo líquido. Los cultivos líquidos en IC1+ 5 g/l Kftalato fueron hechos crecer 5 días a 27°C (agitación a 180 rpm). Luego, los cultivos fueron centrifugados (5000 g; 10 min.). De estas muestras, la actividad de la xilanasa fue medida mediante la técnica DNS según Miller et al.^{18}

TABLA 2 Niveles de producción de XYN2 activa en C1 (mejores productores)

2

Estos datos muestran que:

1) Puntos 1 a 4 del Ejemplo 2 están confirmados.

2) C1 puede ser usada como huésped para la secreción de una proteína heteróloga fúngica.

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Apéndice de los ejemplos: Medios Medios de transformación

3

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4

5

Para la selección y el cultivo

6

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7

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8

Los medios de regeneración (MnR) suplementados con 50 \mug/ml de fleomicina o 100-150 \mug/ml de higromicina se utilizan para seleccionar transformantes. Medio GS, suplementado con 5 \mug/ml de fleomicina se utiliza para confirmar la resistencia a los antibióticos.

PDA es un medio completo para un crecimiento rápido y una buena esporulación. Los medios líquidos son inoculados con 1/20 de suspensión de esporas (todas las esporas de una placa de PDA de 90 mm en 5 ml 0.1% Tween). Tales cultivos son hechos crecer a 27°C en frascos de agitación (200 rpm).

Aislamiento y caracterización de genes de C1 y secuencias de expresión genética de CBH1, XYL1, y GPD Construcción de una genoteca BlueSTAR de UV18-25

ADN cromosómico de UV 18-25 fue parcialmente digerido con Sau3A, fragmentos de 12-15 kb fueron aislados y ligados en un sitio BamHI del vector de clonación BlueSTAR. La envoltura del 20% de la mezcla de ligadura resultó en una biblioteca genética de 4.6 x 10^{4} clones independientes. Esta biblioteca fue multiplicada y almacenada a 4°C y -80°C. El resto de la mezcla de ligadura fue también almacenada a 4°C.

Selección de la biblioteca genética de UV18-25 para el aislamiento de los genes para cbh1, xyl1 y gpd1

Para el aislamiento de los genes diferentes, en total \pm7.5 X 10^{4} fagos BlueSTAR individuales por sonda fueron hibridados por duplicado. La hibridación se efectuó con los fragmentos de la PCR de cbh1, y xyl1 (como se describe en WO 00/20555) en condiciones homólogas (65°C; 0.2xSSC) y con el gen gpd1 de A Níger en condiciones heterólogas (53°C; 0.5xSSC). El número de señales positivas está proporcionado en la tabla 3. Los clones positivos fueron refiltrados y para cada clon dos fagos individuales fueron usados para experimentos sucesivos. El ADN de los clones diferentes fue analizado por análisis de restricción para determinar el número de diferentes clones aislados de cada gen (los resultados están proporcionados en la tabla 3). Igual que para cada uno de los 3 genes; 4-6 clones diferentes fueron aislados, concluimos que la biblioteca genética primaria (\pm4-5 x 10^{4} clones) representa aproximadamente 5x el genoma de UV 18-25. De este resultado concluimos que el genoma completo de UV18-25 está representado en 9 x 10^{3} clones. En base a un inserto genómico promedio de 13 kb, esto indicaría un tamaño del genoma de \pm120 Mb, que es 3 veces el tamaño del genoma del Aspergillus.

Las reacciones PCR con cebadores específicos para el gen presente en el plásmido (en base a la determinación de la secuencia precedente de los fragmentos aislados de la PCR) y el cebador T7 y T3 presente en el poliligador de pBlueSTAR pudimos determinar la ubicación de los genes en un número de clones. Se utilizó un plásmido de cada gen para la determinación de la secuencia del gen.

TABLA 3 Selección de 7.5 x 10^{4} fagos de la biblioteca genética de UV 18-25 con fragmentos de la PCR de UV 18-25 para el gen cbh1 y el gen xyl9 (condiciones homólogas) y con el gen gpdA de A. Niger (condiciones heterólogas). El aislamiento del ADN y el análisis de la restricción fueron usados para determinar el número de clones diferentes

9

Análisis de secuencias de los genes donados

Para el gen cbh1, xyl1, y gpd1, los resultados de la determinación de la secuencia están representados en las SEC ID No 1, 3 y 5 respectivamente. También las secuencias de aminoácidos deducidas de las proteínas están representadas en estas SEC ID No 2, 4 y 6. Algunas propiedades de las proteínas están proporcionadas en la Tabla 4. Debe ser mencionado que la posición del inicio de la traducción y los intrones se basa en la homología con los genes de la misma familia (es decir papel de la genética).

CBH1

De las secuencias de aminoácidos de CBH1, concluimos que la proteína tiene aproximadamente 63 kD de tamaño y que un dominio de unión a la celulosa (CBD) está presente en la parte C-terminal de la proteína. De manera interesante, no se encontró ninguna evidencia para la presencia de un CBD en la proteína más grande aislada de 55 kD. No obstante, la presencia de los péptidos aislados de esta proteína más grande de 55 kD en la proteína CBH1 codificada (SEC ID No.1, 2), confirma que la proteína de 55 kD está codificada por el gen clonado. Una explicación posible de estos resultados es que la proteína de 55 kD es una versión truncada de la proteína CBH1 carente del CBD.

La celobiohidrolasa CBH1 tiene actividad contra MUF-celobiósido, MUF lactósido, FP y Avicel, también contra p-nitrofenil \beta-glucósido, celobiosa y p-nitrofenil lactósido. Su actividad hacia MUF celobiósido es inhibida por la celobiosa con inhibición constante de 0.4 mM. La constante de Michaelis hacia MUF celobiósido fue 0.14 mM, hacia MUF lactósido fue 4 mM y hacia CMC fue 3.6 g/l. El pH óptimo es de 4.5 a 7. El 50% de actividad máxima hacia CMC y 80% actividad hacia RBB-CMC es mantenida a pH 8. El 70-80% de la actividad entre pH 5-8 es mantenida durante 25 horas de incubación. La temperatura óptima es 60-70°C. CBH1 es un elemento de la familia de la celobiohidrolasa 7. El correspondiente promotor de CBH, que es una forma de realización preferida de la invención, está indicado en la SEC ID n°. 1.

Xyl1

De las secuencias de aminoácidos de Xyl1 concluimos que también aquí un CBD está presente, en esta proteína en el lado del N-terminal (es decir directamente fijado a o a menos de 5 aminoácidos de distancia desde la secuencia señal). En la bibliografía sólo algunas xilanasas más con un CBD son conocidas (Fusarium oxysporum, Humicola grisea y Neocallimastix patriciarum). El tamaño estimado de la proteína Xyl1 es 43 kD y diferentes péptidos aislados de una xilanasa de 30 kD se originan a partir de esta proteína (SEC ID n°. 3, 4). Diferentes péptidos aislados no podrían encontrarse en la secuencia codificada. Esto podría indicar que proteínas de la xilanasa alternativas están presentes en UV18-25. En análisis precedentes, no se encontró ninguna evidencia de la presencia de CBD en esta proteína de 30 kD. También a partir de estos resultados hemos hipotetizado que el CBD de la proteína es seccionado por proteolisis. Esta hipótesis será analizada adicionalmente (por determinación de actividades, secuencias N-terminales y tamaños de las proteínas diferentes en las diferentes cepas C1:C1 tipo salvaje, NG7C, UV13-6; UV18-25 y mutantes de la proteasa de UV18-25). También el efecto de la presencia o ausencia del CBD en las actividades enzimáticas se analiza con más detalle. La sobreexpresión de los genes de longitud total en varios huéspedes de C1 pueden ser considerada.

La presencia de un dominio de unión a la celulosa (CBD) es una característica particular de esta enzima. La única otra familia conocida de 10 enzimas glicolíticas (xilanasa) con un CBD del N-terminal es el XylF de Fusarium oxysporum. El CBD de la proteína Xyl1 de Chrysosporium lucknowense tiene la secuencia: WGQCG GQGWT GPTTC VSGAV CQFVN DWYSQ CV (aminoácidos 22-53 de SEC ID n°. 4). Esta secuencia no cumple con la secuencia de consenso de CBD descrita en US 5,763,254 (Novo). Esta secuencia de consenso de US 5,763,254 es: W/Y-G/A-Q-C-G G-Q/I/N-G/N-W/F/Y-S/T/N/Q G-P/A/C-T/R/K-T/C/N-C X-X-G/P-S/T/F/L/A/- -T/K C-V/T/R/E/K-K/Q/A-Q/I-N Q/D/A-W/F/Y-Y-Y/S/H/A-Q C-L/I/Q/V/T, donde W/Y es W o Y etc., X significa cualquier aminoácido, y - significa ausente. Cuatro diferencias con la secuencia de consenso más degenerada están presentes en Xyl1, que están subrayadas en la secuencia 7 más arriba. La invención pertenece así a las xilanasas con un CBD del N-terminal diferente de este CBD de consenso y distinta de la xilanasa de Fusarium oxysporum. Más particularmente la xilanasa de la invención tiene un CBD que tiene al menos el 55%, especialmente al menos el 65%, preferiblemente al menos el 75% de identidad de la secuencia con la secuencia 7 arriba. Preferiblemente el CBD contiene uno de los aminoácidos Phe, Tyr y Trp en la posición 23, o al menos uno de los cuatro aminoácidos Val en la posición 20, Gin en la posición 22, Phe en la posición 23, y Val en la posición 24. Las secuencias preferidas comprenden Cys-Xaa-Phe, Xaa-Phe-Val, Cys-Xaa-Phe-Val, Cys-Gln-Phe, Val-Cys-Xaa-Phe, Gln-Phe-Val, Gln-Trp-Val, Gln-Tyr-Val, Val-Cys-Gln, Val-Cys-Gln-Phe, y Val-Cys-Xaa-Phe-Val, donde Xaa es cualquier aminoácido o preferiblemente Val, Thr, Arg, Glu, Gln o Lys, o más preferiblemente Gln o Glu.

La xilanasa no posee actividad MUF celobiasa y es por tanto una xilanasa real. Posee actividad alta dentro de un margen de pH amplio de 5-8 manteniendo el 65% de actividad máxima a pH 9-10; es un elemento de la familia de la xilanasa F. El promotor de la xilanasa correspondiente, que es una forma de realización preferida de la invención, está mostrado en SEC ID n°. 3. La constante de Michaelis hacia xilano de abedul es 4,2 g/l para la xilanasa de 30 kD. La temperatura óptima fue alta e igual a 70°C para la xilanasa.

Gpd1

La secuencia de ADN de la parte C-terminal del gen gpd1 no está determinada. Las secuencias del promotor de este gen es una forma de realización preferida de la presente invención y está representada en la SEC ID n°. 5.

El nivel de expresión de cuatro genes de Chrysosporium fue estudiado por análisis de Northern. Varias cepas de C. lucknowense fueron hechas crecer en un medio rico que contenía pharmedia con celulosa y lactosa (medio 1) o un medio rico que contenía pharmedia y glucosa (medio 2) a 33°C. Después de 48 h, el micelio fue cosechado y el ARN fue aislado. El ARN fue hibridado con 4 sondas diferentes: EG5, EG6, Xyl1 y CBH. Después de la exposición, las manchas Northern fueron dispuestas en líneas e hibridadas otra vez con una sonda para L3 ribosómico como un control para la cantidad de ARNm en la mancha. Muchas cepas mostraron una respuesta muy alta a CBH y una respuesta alta a Xyl1 en el medio 1; en el medio 2, la mitad de la cepa mostró una respuesta alta a todos los genes, y la otra mitad mostró una respuesta baja. En el orden de expresión la resistencia se dedujo de estos datos como CBH > Xyl1 > EG5 > EG6.

La proteína Xyl1 de C. lucknowense es un 67% idéntica (72% homóloga) a su homólogo más cercano en la base de datos GenBank (Tabla 4). La homología fuerte de la proteína CBH1 a su homólogo de Humicola grisea relacionado (74% idéntico/82% homólogo) es excelente. También se ha observado que en cualquier caso los homólogos más cercanos se originan de Fusarium, Humicola u otros hongos Pirenomicetos (Sordariamicetos) (Tabla 4), mientras que Chrysosporium pertenece a los hongos Plectomicetos (Eurotiomicetos) según la base de datos NCBI (tabla 4). Así la invención también pertenece a las enzimas glicanolíticas, especialmente celobiohidrolasas y xilanasas que comprenden un CBD, derivado de los hongos Plectomicetos.

TABLA 4 Datos estructurales y comparativos de CBH1, Xyl1, y GPD1 de la invención

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Descripción de las figuras

Figura 1 es un mapa de pUT1064

Figura 2 es un mapa de pUT1065

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18. Miller G.L. (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31:426-428.

19. Punt P.J., Mattern I.E., van den Hondel C.A.M.J.J. (1988) A vector for Aspergillus transformation conferring phleomycin resistance. Fungal Genetics Newsletter 35, 25-30.

SEC ID n°. 1:

La secuencia de ADN y aminoácido del gen de CBH1 de Chrysosporium completo que incluye las secuencias del promotor y del terminador. Secuencia del promotor (1-1779), secuencia del terminador (3427-4451) y secuencia del intrón (2179-2256) están provistas en minúsculas.

12

13

14

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SEC ID NO: 2:

Aminoácido de la proteína CBH1 de Chrysosporium completa. El péptido señal putativo (1-19) está indicado en letras en cursiva y el dominio de unión a la celulosa (496-526) está indicado en letras en negrita subrayadas.

15

SEC ID n°. 3

Secuencia de ADN del gen XylI de Chrysosporium completo incluye las secuencias del promotor y del terminador. La secuencia del promotor (1-969), secuencia del terminador (2428-3030(3028)) y secuencias del intrón (1043-1116, 1181-1332(1331); 1596(1595)-1674(1672) están provistas en minúsculas.

16

17

18

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SEC ID n°. 4

Secuencia de aminoácidos de la proteína de Xyl1 de Chrysosporium completa. El péptido señal (1-20) está mostrado en letras en cursiva y el dominio de unión a la celulosa (22-53) está mostrado en letras en negrita subrayadas.

19

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SEC ID NO: 5

La secuencia de ADN del gen GPD1 de Chrysosporium parcial incluye secuencias del promotor. La secuencia del promotor (1-1555) y la secuencia del intrón (1682-1781) están provistas en minúsculas. El extremo 3' del gen no está.

20

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SEC ID n°. 6

Aminoácido de la proteína de GPD1 de Chrysosporium parcial (el C-término no está disponible en la secuencia).

22

<110> Emalfarb, Mark A

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<120> Secuencias reguladoras de la expresión nuevas y productos de expresión en los hongos filamentosos depositados

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<130> BO43402.EMALFAR

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<140> EP00201343.1

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<141> 2000-04-13

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<160> 8

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 4451

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<212> ADN

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<213> Chrysosporium lucknowense

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<400> 1

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24

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<210> 2

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<211> 3028

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<212> ADN

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<213> Chrysosporium lucknowense

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<400> 2

25

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<210> 3

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<211> 3036

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<212> ADN

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<213> Chrysosporium lucknowense

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<400> 3

26

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<210> 4

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<211> 2547

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<212> ADN

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<213> Chrysosporium lucknowense

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<400> 4

27

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<210> 5

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<211> 526

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<212> PRT

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<213> Chrysosporium lucknowense

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<400> 5

28

29

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<210> 6

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<211> 383

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<212> PRT

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<213> Chrysosporium lucknowense

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<400> 6

30

31

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<210> 7

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<211> 247

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<212> PRT

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<213> Chrysosporium lucknowense

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<400> 7

32

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<210> 8

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<211> 277

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<212> PRT

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<213> Chrysosporium lucknowense

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<400> 8

33

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<210> 3

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<211> 3036

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<212> ADN

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<213> Chrysosporium lucknowense

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<400> 3

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34

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<210> 4

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<211> 2547

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<212> ADN

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<213> Chrysosporium lucknowense

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<400> 4

36

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<210> 5

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<211> 526

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<212> PRT

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<213> Chrysosporium lucknowense

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<400> 5

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38

Claims (9)

1. Constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos reguladora de la expresión operativamente enlazada a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de interés, donde dicha secuencia de ácidos nucleicos reguladora de la expresión tiene al menos el 70% de identidad de la secuencia de nucleótidos en toda la longitud a los nucleótidos 1 a 1779 de SEC ID NO 1 o donde dicha secuencia reguladora de la expresión comprende al menos 40 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 1 a 1779 de SEC ID NO 1.

2. Constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 1, donde dicha secuencia reguladora de la expresión es la secuencia de nucleótidos 1 a 1779 de la SEC ID NO 1.

3. Cepa recombinante microbiana, preferiblemente una cepa fúngica, conteniendo un constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 1 o 2, y capaz de expresar el polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos codificadora.

4. Proceso de producción de un polipéptido usando un constructo según la reivindicación 1 o 2 o una cepa microbiana según la reivindicación 3.

5. Secuencia de ácidos nucleicos reguladora de la expresión que tiene al menos el 70% de identidad de la secuencia de nucleótidos en toda la longitud a los nucleótidos 1 a 1779 de la SEC ID NO 1 o que comprende al menos 40 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 1 a 1779 de SEC ID NO 1.

6. Uso de una secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 5 o constructo según la reivindicación 1 o 2 para la expresión de un polipéptido de interés en un organismo huésped, preferiblemente un organismo huésped fúngico u otro microbiano.

7. Constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 1 o 2, donde el polipéptido de interés está seleccionado del grupo que consiste en: una enzima degradadora de carbohidratos, una proteasa, una hidrolasa, una oxidorreductasa y una transferasa.

8. Constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 7, donde la enzima degradadora de carbohidratos es una celulasa, xilanasa, mananasa, manosidasa, pectinasa, o amilasa.

9. Cepa recombinante microbiana según la reivindicación 3, donde la cepa es del género Chrysosporium.