PL207374B1

PL207374B1 - Białko odpowiadające glikozylohydrolazie, konstrukty kwasu nukleinowego, sekwencja kwasu nukleinowego, rekombinantowy szczep mikroorganizmu i sposób wytwarzania białka

Info

Publication number: PL207374B1
Application number: PL358491A
Authority: PL
Inventors: Mark Aaron Emalfarb; Peter Jan Punt; Zeijl Cornelia Maria Johanna Van
Original assignee: Dyadic International
Priority date: 2000-04-13
Filing date: 2001-04-17
Publication date: 2010-12-31
Also published as: ZA200208311B; BR0110090A; WO2001079507A2; CN100420753C; JP2004504012A; JP2011234729A; DE60127661D1; CN1436242A; AU782105B2; NO20024945D0; WO2001079507A3; IL152272A; DK1276876T3; KR100903780B1; CZ303980B6; ES2283402T3; CA2405954C; US20030187243A1; RU2272835C2; EP1276876A2

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy białka odpowiadającego glikozylohydrolazie, konstruktów kwasu nukleinowego, sekwencji kwasu nukleinowego, rekombinantowego szczep mikroorganizmu i sposobu wytwarzania białka.

Niniejszy wynalazek dotyczy opracowania nowych enzymów pochodzących z grzybów nitkowatych, zwłaszcza ze szczepów należących do rodzaju Chrysosporium oraz sekwencji kodujących i sekwencji regulujących ekspresję dla tych enzymów. Niniejszy wynalazek jest rozwinięciem wynalazku ujawnionego w publikacji zgłoszenia patentowego międzynarodowego, WO 00/20555 (PCT/NL99/00618) zgłoszonego 6 października 1999 r., nie opublikowanego przed datą pierwszeństwa niniejszego wynalazku.

Tło wynalazku

W stanie techniki ujawnionych jest wiele gospodarzy dla ekspresji genów oraz sposobów transformacji. Często wymieniane są bakterie, np. E. coli. E. coli jest jednak mikroorganizmem niezdolnym do sekrecji wielu białek i polipeptydów i jako taka nie nadaje się jako komórka gospodarza do produkcji białek ani polipeptydów na skalę przemysłową. Dodatkową cechą niekorzystną E. coli, odnoszącą się również do bakterii ogółem jest fakt, że w organizmach prokariotycznych nie zachodzą dodatkowe modyfikacje, niezbędne dla wytwarzania wielu eukariotycznych białek lub polipeptydów w formie aktywnej. Przykładami procesów przetwarzania niezbędnych do wytworzenia aktywnych form białek lub polipeptydów jest glikozydacja białek i właściwe sfałdowanie białek. W celu uzyskania tego typu przetwarzania można w pewnych przypadkach użyć komórki ssaków. Jednakże, wadą takich komórek jest to, że często są trudne do utrzymania przy życiu i wymagają drogich pożywek. Takie układy transformacyjne nie mają zatem praktycznego znaczenia w produkcji białek i polipeptydów na skalę przemysłową. Ich użycie może być opłacalne do produkcji drogich substancji farmaceutycznych wytwarzanych w stosunkowo małych ilościach ale z pewnością nie do produkcji enzymów przemysłowych.

Dotychczas opracowano wiele grzybowych układów ekspresyjnych, np. Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei. Proponowano również wiele innych ale z różnych powodów nie znalazły one szerokiej akceptacji ani zastosowania. W kategoriach ogólnych, idealny gospodarz powinien odpowiadać wielu kryteriom:

- idealny gospodarz musi ł atwo fermentować na taniej poż ywce;

- idealny gospodarz powinien efektywnie zuż ywać pożywkę;

- idealny gospodarz musi wytwarzać dany polipeptyd lub biał ko z wysoką wydajnoś cią , czyli musi zapewniać wysoką proporcję wytworzonego białka do biomasy;

- idealny gospodarz powinien mieć zdolność wydajnego wydzielania tego białka lub polipeptydu;

- idealny gospodarz musi dawać możliwość łatwej izolacji i oczyszczania żądanego białka lub polipeptydu;

- idealny gospodarz musi przetwarzać żądane biał ko lub polipeptyd tak, aby był on produkowany w formie aktywnej, nie wymagającej dodatkowych etapów aktywacji lub modyfikacji;

- idealny gospodarz powinien ł atwo podlegać transformacji;

- idealny gospodarz powinien pozwalać na wprowadzenie i uż ycie szerokiego zakresu elementów regulujących ekspresję, co zapewni łatwość jego stosowania i uniwersalność;

- idealny gospodarz powinien pozwalać na uż ycie markerów umoż liwiają cych ł atwą selekcję i tanich w użyciu;

- idealny gospodarz powinien dawać stabilne transformanty;

- idealny gospodarz powinien dawać możliwość hodowli w warunkach nie szkodzących produktowi białkowemu lub polipeptydowemu, np. niskiej lepkości i niskich sił ścinania.

W publikacjach opisów patentowych WO 96/02563 oraz US 5.602.004, US 5.604.129 i US 5.695.985 należących do firmy Novo Nordisk opisane są niekorzystne cechy układów Aspergillus i Trichoderma z sugestią , ż e warunki hodowli innych grzybów mogą być bardziej przydatne do celów produkcji białek na skalę wielkoprzemysłową. Jako przykłady szczepów nadających się do transformowanych kultur podano jedynie szczepy Myceliophthora thermophila, Acremonium alabamense, Thielavia terrestris i Sporotrichum cellulophilum. Podano, że szczep Sporotrichum w warunkach fermentacji lizuje i wytwarza zielony barwnik, czego nie można uzyskać przy użyciu innych szczepów. Opisano nie zarodnikujący mutant Thielavia terrestris jako mikroorganizm z wyboru dzięki jego morfologii. Podano jednak również, że wydajność tworzenia protoplastów u Thielavia i Acremonium (przy

PL 207 374 B1 czym szczep Acremonium był stanem niedoskonałym użytego szczepu Thielavia) jest niska i że higromycyna jest nieużyteczna jako marker selekcyjny dla tego szczepu. Proponowano wiele innych szczepów jako potencjalnie użytecznych ze względu na ich morfologię, jednak nie opisano ich transformacji. Proponowano szczepy Corynascus, Thermoascus, Chaetomium, Ctenomyces, Scytalidium i Talaromyces. Podano, ż e te transformowane szczepy wytwarzają jedynie niskie poziomy ksylanazy z Humicola, przy czym Thielavia wytwarza najmniejsze iloś ci tego enzymu. Informacja ta jest jednak niejasna i mogłaby w rzeczywistości prowadzić do wniosku, że Thielavia jest najlepszym rozwiązaniem. Nomenklatura użyta w powyższym odnośniku jest oparta na wydawnictwie: ATCC names of Industrial Fungi, 1994 (Nazwy ATCC grzybów przemysłowych, 1994). Jest zatem oczywiste, że nie uzyskano wysokiego stopnia ekspresji heterologicznej i faktycznie nie można wyprowadzić dodatniej korelacji pomiędzy postulowaną morfologią a stopniem ekspresji. Jeśli już można byłoby wyprowadzić jakąś zależność, to byłaby ona prawdopodobnie negatywna. Według klasyfikacji grzybów ATCC z 1996 r., Sporotrichum thermophilum ATCC 20493 jest szczepem Myceliophthora thermophila. Obecnie, szczep ten identyfikuje się jako Myceliophthora thermophila. Nieprzewidywalność stanu wiedzy opisanego w powyższych ujawnieniach jest oczywista.

W publikacji zgł oszenia patentowego mię dzynarodowego WO 97/26330 firmy Novo Nordisk proponowany jest sposób otrzymywania mutantów komórek macierzystych grzybów nitkowatych o ulepszonych wł asnoś ciach produkcji heterologicznego polipeptydu. Sposób ten polega na znalezieniu specyficznej zmienionej morfologii i następnej ocenie, czy transformant produkuje bardziej heterologiczny polipeptyd niż rodzic. Sposób jest zilustrowany jedynie na szczepach Fusarium A3/5 i Aspergillus oryzae. Sugerowano, ż e sposób może mieć zastosowanie do Aspergillus, Trichoderma, Thielavia, Fusarium, Neurospora, Acremonium, Tolyplocadium, Humicola, Scytalidium, Myceliophthora i Mucor. Jak podano powyżej, wobec nieprzewidywalności stanu techniki oraz nieprzewidywalności sposobu opisanego w referowanym zgłoszeniu, należy uznać, że brak jest dotychczas nadających się do ogólnego stosowania wskazówek pozwalających na założenie sukcesu w racjonalnym zakresie.

W publikacji zgłoszenia patentowego międzynarodowego WO 00/20555 opisaliśmy alternatywny grzybowy układ ekspresyjny zapewniający łatwość użycia wyżej wspomnianych grzybów Aspergilli i Trichoderma, speł niają cy podane powyż ej wymagania. Dodatkową zaletą tego nowego ukł adu jest to, że wydajności transformacji są wyższe od tych, jakie występują w często stosowanym układzie Trichoderma reesei. Ponadto, warunki hodowli mają tę dodatkową zaletę, że są korzystne dla produktu polipeptydowego.

Szczegółowy opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest białko odpowiadające glikozylohydrolazie z Chrysosporium należące do rodziny 7, wykazujące co najmniej 75% identyczności aminokwasów jak oznaczono algorytmem BLAST z aminokwasami 1-526 w sekwencji aminokwasowej SEQ ID Nr: 2 lub jego część posiadająca co najmniej 20 kolejnym aminokwasów identycznych z odpowiadającą częścią sekwencji aminokwasowej 1-246 albo 394-526 z SEQ ID nr: 2.

Korzystnie białko to zawiera sekwencję aminokwasów SEQ ID nr: 2.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób hydrolizowania wiązań β-glukozydowych, polegający na tym, że hydrolizę wiązań przeprowadza się białkiem jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja kwasu nukleinowego kodująca białko jak zdefiniowano powyż ej.

Przedmiotem wynalazku jest również konstrukt kwasu nukleinowego zawierający sekwencję kwasu nukleinowego regulującego ekspresję operacyjnie związaną z sekwencją kwasu nukleinowego kodującego białko jak zdefiniowano powyżej.

Wspomniana, regulująca ekspresję sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku korzystnie pochodzi z Chrysosporium.

Przedmiotem wynalazku jest również sekwencja kwasu nukleinowego posiadająca co najmniej 70% identyczność z nukleotydami 1-1779 w SEQ ID nr: 1.

Przedmiotem wynalazku jest także konstrukt kwasu nukleinowego zawierający sekwencję kwasu nukleinowego regulującą ekspresję, która to sekwencja jest operacyjnie związaną z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania, przy czym wspomniana sekwencja kwasu nukleinowego regulująca ekspresję ma co najmniej 70% identyczności nukleotydów z całkowitą długością nukleotydów 1-1779 z SEQ ID nr: 1 lub ta wspomniana sekwencja regulująca ekspresję zawiera co najmniej 40 sąsiadujących nukleotydów spośród nukleotydów 1-1779 w SEQ ID nr: 1.

PL 207 374 B1

Konstrukt kwasu nukleinowego korzystnie charakteryzuje się tym, że sekwencja kwasu nukleinowego regulująca ekspresję jest sekwencją nukleotydów 1-1779 w SEQ ID nr: 1.

Korzystnie białko będące przedmiotem zainteresowania jest wybrane z grupy obejmującej: enzym rozkładający węglowodany, proteazę, hydrolazę, oksydoreduktazę i transferazę.

Bardziej korzystnie enzym rozkładający węglowodany jest wybrany z grupy obejmującej: celulazę, ksylanazę, mannanazę, mannozydazę, pektynazę lub amylazę.

Przedmiotem wynalazku jest również rekombinantowy szczep mikroorganizmu, zawierający konstrukt kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej zdolny do ekspresji wspomnianego białka kodowanego przez wspomnianą sekwencję kwasu nukleinowego, lub zdefiniowanego przez następny konstrukt jak opisano powyżej, i zdolny do ekspresji wspomnianego polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania.

Korzystnym rekombinantowym szczepem mikroorganizmu jest szczep grzyba.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka które zdefiniowano powyżej, polegający na tym, że rekombinantowy szczep mikroorganizmu zdefiniowany powyżej, hoduje się w warunkach pozwalających na ekspresję wspomnianego białka i następnie odzyskuje się wspomniane białko.

Przedmiotem wynalazku są szczególnie glikozylo-hydrolazy z rodziny 7 (np. cellobiohydrolazy) także sekwencje kwasu nukleinowego kodujące te peptydy i białka oraz szczególnie, sekwencje regulatorowe dla tych genów.

Szczególnie, przedmiotem wynalazku jest izolowane lub rekombinantowe białko enzymatyczne bądź jego aktywne części, z cytowanej powyżej klasy, łącznie z ich mutantami, posiadającymi przynajmniej pewien stopień identyczności sekwencji, a także sekwencje kwasu nukleinowego kodujące to białko lub ich części i/lub sekwencje kwasu nukleinowego regulujące ich ekspresję. Enzymami tymi są zwłaszcza: (1) glikozylo-hydrolaza z rodziny 7 (cellobiohydrolaza, CBH1) wykazująca co najmniej 75%, korzystnie co najmniej 80% a nawet co najmniej 85% identyczności aminokwasów z sekwencją SEQ ID Nr: 2. Polipeptydy i sekwencje kwasu nukleinowego kodujące te polipeptydy, zawierające co najmniej 20, korzystnie co najmniej 30 sąsiednich aminokwasów z sekwencji SEQ ID nr: 2, również korzystną część wynalazku. Odpowiadające im sekwencje nukleotydowe są przedstawione na sekwencji SEQ ID o numerze 1.

Te rekombinantowe enzymy mogą zawierać zasadniczo kompletne białko albo białko skrócone, posiadające przynajmniej część aktywności enzymatycznej. Taką skróconą częścią może być domena katalityczna albo co najmniej około 75% aminokwasów wchodzących w jej skład. Przykładowo, domena katalityczna CBH1 według wynalazku obejmuje aminokwasy 20-495 z sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr: 2, natomiast np. domena katalityczna XYL1 obejmuje aminokwasy 54-384 z sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr: 4. Domena katalityczna może ale nie musi być połączona z sekwencją sygnałową pochodzącą z innego białka i/lub z domeną wiążącą węglowodan z innego białka enzymatycznego. Alternatywnie, domena wiążąca celulozę z enzymów także opisanych w niniejszym opisie (CBH1 i XYL1) może być dołączona przez fuzję do domen katalitycznych innych białek enzymatycznych.

Sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku mogą być całkowitymi regionami kodującymi białko albo oligonukleotydami, bądź korzystnie, sekwencjami regulującymi ekspresję. Oligonukleotydy te mogą być również użyte jako sondy do identyfikacji genów korespondujących ale nie identycznych z genami przedstawionymi na sekwencji SEQ ID nr 1. Celem dalszej ilustracji innych możliwych rozwiązań przestawiono sekwencje 3 i 5. Geny te, spełniające kryteria procentowej identyczności określone powyżej, a także ich części kodujące i nie kodujące oraz produkty ich ekspresji stanowią również część wynalazku. Oligonukleotydy mają korzystnie długość 15-75 a najkorzystniej 20-50 nukleotydów.

Wynalazek dotyczy również układów ekspresyjnych (kaset) zawierających albo region regulujący ekspresję (łącznie z promotorem) dla jednej z trzech klas białek połączony przez fuzję z genem kodującym inne żądane białko albo region kodujący dla jednego z tych białek, połączony przez fuzję z innym regionem regulują cym ekspresję albo zarówno region regulują cy ekspresję jak i region kodujący białko dla tych nowych białek. Region regulujący ekspresję zawiera co najmniej 60%, korzystnie co najmniej 70%, jeszcze korzystniej co najmniej 75% a nawet 80% regionu nie kodującego 5' z sekwencji SEQ ID nr: 1, lub ewentualnie 3 i albo 5 i/lub co najmniej 20, a zwłaszcza 40 kolejnych nukleotydów z tych regionów nie kodujących 5'. Sekwencje terminatorowe podobnie pochodzące z regionów nie kodujących 3' z genów według wynalazku są również przydatne w kasetach ekspresyjnych, zarówno w połączeniu z genami homologicznymi jak i heterologicznymi.

PL 207 374 B1

Opisane w wynalazku polinukleotydy i oligonukleotydy mogą mieć minimalną identyczność sekwencji z odpowiednimi sekwencjami SEQ ID Nr: 1, 3 albo 5 albo alternatywnie, hybrydyzują one w warunkach ostrych z tymi sekwencjami. Ostrymi warunkami hybrydyzacji są warunki opisane w stanie techniki, np. hybrydyzacja w roztworze o sk ładzie: 6 x SSC (20 x SSC na 1000 ml: 175,3 g

NaCl, 107,1 g cytrynianu sodu. 5 H2O, (pH 7,0), 0,1% SDS, 0,05% pirofosforanu sodu, 5* roztwór

Denhardta i 20 μg/ml DNA z denaturowanej spermy śledzia, w temperaturze 56°C, w czasie 18-24 godzin, następne dwa 30-minutowe płukania w 5 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 56°C i dwa 30-minutowe płukania w 2 x SSC, 0,1% SSC, w temperaturze 56°C.

Te układy ekspresyjne mogą być zawarte w gospodarzu Chrysosporium, takim jak Chrysosporium lucknowense albo w innym gospodarzu nie grzybowym lub korzystnie grzybowym. Przykładami innych gospodarzy grzybowych są inne gatunki albo szczepy Chrysosporium, gatunek Fusarium, gatunek Aspergillus i inne. Takim gospodarzem może być korzystnie gospodarz, który sam z siebie ani w wyniku dobrania warunków hodowli, nie wytwarza białka odpowiadającemu żądanemu białku, dzięki czemu upraszcza się proces odzysku tego żądanego białka.

Stosowane w niniejszym opisie i w załączonych zastrzeżeniach określenia „polipeptydy” bądź „peptydy” albo „żądane polipeptydy” lub „żądane peptydy” jako produkty ekspresji układu według wynalazku, obejmują również białka, względnie polipeptydy posiadające określoną funkcję i/lub strukturę drugorzędową i/lub trzeciorzędową. Termin „procentowa identyczność aminokwasów” odnosi się do całkowitego białka albo do określonej części zdefiniowanej numerem aminokwasu początkowego i ostatniego, oznaczonego z użyciem powszechnie stosowanego algorytmu BLAST.

W opisanym w publikacji zgłoszeniowej WO 00/20555 grzybowym układzie ekspresyjnym, pH pożywki hodowlanej może być obojętne albo alkaliczne, dzięki czemu wytwarzane białko lub polipeptyd nie jest poddawany agresywnemu i potencjalnie dezaktywującemu środowisku kwaśnemu. Możliwe jest również prowadzenie hodowli przy pH kwaśnym, takim jak pH 4 w przypadkach, gdy dane białko lub polipeptyd lepiej znosi środowisko kwaśne. Dogodnie, hodowlę można prowadzić w zakresie pH od 4,0 do 10,0. Preferuje się jednakże pH obojętne do zasadowego, ponieważ szczep gospodarza wykazuje lepszy wzrost w takim zakresie pH, czyli pomiędzy 6 a 9. W niektórych przypadkach, również dobrą alternatywą jest prowadzenie wzrostu przy pH zasadowym, które może mieć wartość od 8 w górę, a nawet może osiągać wysoką wartość 10. Również temperatura hodowli takich szczepów gospodarza ma korzystny wpływ na stabilność niektórych typów wytwarzanych polipeptydów. Hodowlę prowadzi się dogodnie w zakresie temperatur od 23 do 43°C. Konkretnie, takie warunki mają szczególne znaczenie przy produkcji polipeptydów ssaczych. Wybór temperatury będzie zależał od opłacalności i wrażliwości danego polipeptydu lub szczepu hodowlanego.

Sprawdzono również, że relacja biomasy do lepkości i ilości wytworzonego białka jest wyjątkowo korzystna dla gospodarza Chrysosporium. Przeprowadzono porównania z Trichoderma longibrachiatum (dawniej znanym również jako Trichoderma reesei) i z Aspergillus niger. W odpowiednich, równoważnych warunkach, Trichoderma longibrachiatum dawał 2,5 do 5 g biomasy/litr, Aspergillus niger dawał 5 do 10 g biomasy/litr a gospodarz Chrysosporium dawał 0,5 do 1 g biomasy/litr. Stanowi to 5-10-krotne polepszenie w stosunku do szczepów stosowanych w przemyśle. Niniejszy wynalazek jest ukierunkowany na układy ekspresyjne obejmujące sekwencję kwasu nukleinowego kodującą heterologiczne białko lub polipeptyd, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z regionem regulującym ekspresję opisanym poniżej i ewentualnie z sekwencją sygnałową sekrecji i/lub z sekwencją kodującą białko nośnikowe. Korzystnie, rekombinacyjny szczep według wynalazku będzie wydzielał żądany polipeptyd. Pozwoli to pominąć proces rozrywania komórek w celu wyizolowania żądanego polipeptydu i zminimalizować ryzyko degradacji wytwarzanego produktu przez inne komponenty komórki gospodarza.

Chrysosporium można zdefiniować poprzez jego cechy morfologiczne zgodne z opisanymi przez Barnetta i Huntera w „Illustrated Genera of Imperfect Fungi”, 1972, III wydanie, wydawca: Burgess Publishing Company. Znane są również inne źródła podające szczegóły dotyczące klasyfikacji grzybów z rodzaju Chrysosporium, np. Sutton Classification (Van Oorschot, C.A.N. (1980) “A revision of Chrysosporium and allied genera” w wydawnictwie: Studies in Mycology, No. 20 z CBS in Baarn, Holandia, str. 1-36). CBS jest jednym z instytutów depozytowych w ramach Traktatu Budapesztańskiego. Zgodnie z powyższymi danymi literaturowymi, rodzaj Chrysosporium należy do rodziny Moniliaceae, która należy do rzędu Hyphomycetales. Jako Chrysosporium definiowane są następujące szczepy: C. botryoides, C. carmichaelii, C. crassitunicatum, C. europae, C. evolceannui, C. farinicola, C. fastidium, C. filiforme, C. georgiae, C. globiferum, C. globiferum var. articulatum, C. globiferum var.

PL 207 374 B1 niveum, C. hirundo, C. hispanicum, C. holmii, C. indicum, C. inops, C. keratinophilum, C. kreiselii, C. kuzurovianum, C. lignorum, C. lobatum, C. lucknowense, C. lucknowense Garg 27K, C. medium, C. medium var. spissescens, C. mephiticum, C. merdarium, C. merdarium var. roseum, C. minor, C. pannicola, C. parvum, C. parvum var. crescens, C. pilosum, C. pseudomerdarium, C. pyriformis, C. queenslandicum, C. sigleri, C. sulfureum, C. synchronum, C. tropicum, C. undulatum, C. vallenarense, C. vespertilium, C. zonatum, jednak definicja Chrysosporium nie ogranicza się do tych szczepów.

C. lucknowense jest jednym z gatunków Chrysosporium, który wzbudza szczególne zainteresowanie, gdyż jest naturalnym, dużym producentem białek celulazy (WO 98/15633 i pokrewny opis patentowy US 5.811.381). Chrysosporium lucknowense jest charakteryzowany następująco:

Kolonie osiągają średnicę 55 mm na agarze Sabourauda z glukozą w czasie 14 dni, mają barwę kremową, wygląd pilśni, są pokryte meszkiem, są zwarte, mają wysokość 3 - 5 mm, obrzeża są wyraźne, regularne z obramowaniem; strona spodnia ma barwę jasno-żółtą do kremowej. Strzępki są szkliste, gładkie, cienkościenne, lekko rozgałęzione. Strzępki powietrzne są w większości zarodnikujące, ze ścisłymi przegrodami poprzecznymi, o szerokości około 1 - 3,5 μm. Strzępki zanurzone są niezarodnikujące, mają szerokość około 1 - 4,5 μm, cieńsze strzępki są często z konturami. Konidia znajdują się na końcach i na bokach, w większości są siedzące albo na krótkich często stożkowych występach albo na krótkich odgałęzieniach bocznych. Konidia są osobne ale w bliskim wzajemnym sąsiedztwie, na jednej komórce strzępki rozwija się 1 - 4 konidiów, półprzezroczystych, o ściankach cienkich i gładkich, głównie o kształtach zbliżonych do kulistych, również maczugowatych, odwrotnie jajowatych, jednokomórkowych, o wymiarach 2,5-11 x 1,5 - 6 um, z szerokimi bliznami u podstawy (1 - 2 um). Nie występują konidia interkalarne. Nie występują też chlamidospora. Przykładami szczepów Chrysosporium lucknowense są szczepy: ATCC 44006, CBS 251.72, CBS 143.77 i CBS 272.77. Inne przykłady są podane w opisach patentowych WO 98/15633 i US 5.811.381.

Z tego gatunku wyizolowano dalszy szczep o nawet wyższej zdolności produkcji celulaz. Szczep ten oznaczono symbolem C1 według notacji wewnętrznej i zdeponowano w muzeum mikroorganizmów International Depository of the All Russian Collection of microorganisms Rosyjskiej Akademii Nauk, Moskwa, ul Bakrushina 8, Rosja 113184 w dniu 29 sierpnia 1996 r. jako depozyt zgodnie z Traktatem Budapesztańskim o numerze akcesyjnym VKM F-3500D. Szczep otrzymał nazwę Chrysosporium lucknowense Garg 27K. Szczep C1 jest charakteryzowany następująco:

Kolonie rosną do średnicy około 55-66 mm na agarze ziemniaczano-glukozowym w czasie około 7 dni, mają barwę jasno kremową i wygląd pilśni, w środku mają wysokość 2 - 3 um, obrzeża są wyraźne, regularne i obramowane; strona odwrotna ma barwę jasno-kremową. Strzępki są szkliste, gładkie, z cienkimi ściankami, lekko rozgałęzione. Strzępki powietrzne są płodne, z przegrodami, o szerokości około 2 - 3 mm. Strzępki zanurzone są niepłodne. Konidia są szczytowe i boczne, utwierdzone, siedzące albo na krótkich odgałęzieniach bocznych, nieobecne, osobne ale w bliskim wzajemnym sąsiedztwie, są szkliste, mają ścianki cienkie i gładkie, zbliżone do kulistych, są maczugowate lub odwrotnie jajowate, jednokomórkowe, o rozmiarach 4 - 10 um. Brak chlamidospor i konidiów interkalarnych.

Sposób izolacji szczepu C1 jest opisany w publikacji zgłoszenia patentowego WO 98/15633 i w opisach patentowych US 5.811.381 i US 6.015.707. Definicją Chrysosporium są również objęte szczepy pochodzące od przodków Chrysosporium, również i tych, które zostały nieco zmutowane, albo w sposób naturalny albo przez mutagenezę indukowaną. Mutanty Chrysosporium można otrzymać przez indukowaną mutagenezę, zwłaszcza przez połączenie napromieniania i mutagenezy chemicznej.

Przykładowo, szczep C1 mutowano przez poddanie go działaniu światła ultrafioletowego, generując szczep UV13-6. Ten szczep następnie dalej mutowano N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyną, generując szczep NG7C-19. Ten ostatni szczep poddano mutacji światłem ultrafioletowym, uzyskując szczep UV18-25. Podczas tego procesu mutacji charakterystyka morfologiczna nieco się zmieniła w hodowli w cieczy i na płytkach oraz w badaniach mikroskopowych. Wraz z każdą kolejną mutagenezą hodowle na płytkach stawały się mniej puszyste i spilśnione od tych, które opisano jako charakterystyczne dla Chrysosporium, aż do osiągnięcia płaskiego i zwartego wyglądu kolonii. Brunatny barwnik obserwowany w szczepach typu dzikiego na niektórych pożywkach był również mniej przeważający w szczepach zmutowanych. W ciekłej hodowli, mutant UV18-25 był wyraźnie mniej lepki niż szczep typu dzikiego C1 i mutanty UV13-6 i NG7C-19. Chociaż wszystkie szczepy zachowywały w zasadzie cechy mikroskopowe Chrysosporium to grzybnie stawały się węższe z każdą kolejną mutacją a w mutancie UV18-25 można było zauważyć wyraźną fragmentację grzybni. Ta fragmentacja grzybni jest prawdopodobnie przyczyną mniejszej lepkości obserwowanej w kulturach UV18-25. Zdolność

PL 207 374 B1 szczepów do sporulacji spadała z każdym etapem mutagenezy. Powyższe fakty świadczą o tym, że w przypadku szczepów należących do rodzaju Chrysosporium istnieje pewien zakres swobody w odniesieniu do powyższej charakterystyki morfologicznej. Wraz z każdym etapem mutacji wzrastała również produkcja celulazy i pozakomórkowych białek, chociaż w wyniku kilku mutacji otrzymano spadek ekspresji proteazy. Kryteria, według których można oznaczyć taksonomię grzybów są dostępne np. w muzeach szczepów CBS, VKMF i ATCC. Szczepy te, oznaczone roboczo jako Chrysosporium szczep C1, szczep UV13-6, szczep NG7C-19 i szczep UV18-25, zostały zdeponowane zgodnie z Traktatem Budapesztańskim w instytucie depozycyjnym „All Russian Collection” (VKM) w Moskwie. Szczep typu dzikiego C1 zdeponowano pod numerem VKM F-3500 D w dniu 29.08.1996 r., mutant C1, UV13-6 zdeponowano pod numerem VKM F-3632 D w dniu 2.09.1998, mutant C1, NG7C-19 zdeponowano pod numerem VKM F-3633 D w dniu 2.09.1998 r. i mutant C1, UV18-25 zdeponowano pod numerem VKM F-3631 D w dniu 2.09.1998 r.

Korzystne jest użycie nietoksycznych szczepów Chrysosporium, których wiele jest znanych w stanie techniki, gdyż zmniejszy to zagro żenie dla środowiska przy produkcji na wielką skalę i uprości procedury produkcyjne z jednoczesnym obniżeniem kosztów.

Regionem regulującym ekspresję jest sekwencja DNA przyjęta przez szczep gospodarza Chrysosporium przeznaczony do ekspresji. Zawiera on sekwencję promotora związaną operacyjnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd, który ma być wytwarzany. Promotor ten jest tak związany, aby usytuowanie naprzeciw kodonu inicjacji sekwencji, która ma podlegać ekspresji umożliwiało ekspresję. Sekwencja promotora może być konstytutywna lub indukowalna. Dopuszczalna jest każda sekwencja regulująca ekspresję lub kombinacja takich sekwencji zdolna do zapewnienia ekspresji polipeptydu ze szczepu Chrysosporium. Sekwencją regulującą ekspresję jest dogodnie grzybowy region regulujący ekspresję, np. region regulujący z klasy Ascomycetes. Dogodnie, grzybowym regionem regulującym ekspresję jest region regulacyjny z jednego z następujących gatunków grzybów: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Hansenula, Mucor, Pichia, Neurospora, Tolypocladium, Rhizomucor, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces albo z ich alternatywnych form płciowych, takich jak Emericella, Hypocrea, np. promotor dla cellobiohydrolazy z Trichoderma, promotor dla glukoamylazy z Aspergillus, promotor dla dehydrogenazy fosforanu aldehydu glicerynowego z Aspergillus, promotor dla dehydrogenazy alkoholowej A i dehydrogenazy alkoholowej R z Aspergillus, promotor dla amylazy TAKA z Aspergillus, promotory dla fosfoglicerynianu i kontroli szlaku sieciowania (cross-pathway) z Neurospora, promotor dla proteinazy asparaginianowej z Rhizomucor miehei, promotor dla lipazy z Rhizomucor miehei i promotor dla beta-galaktozydazy z Penicillium canescens. Szczególnie odpowiednia jest sekwencja regulująca ekspresję z tego samego gatunku co szczep gospodarza, gdyż występuje wówczas największe prawdopodobieństwo, że będzie swoiście zaadaptowana przez organizm tego konkretnego gospodarza. Tak więc, korzystnie, sekwencja regulująca ekspresję pochodzi ze szczepu Chrysosporium.

Korzystnie stosuje się taki region regulujący ekspresję, który daje wysoką ekspresję w wybranym gospodarzu. Jest to korzystnie region regulujący ekspresję pochodzący z Chrysosporium. Może nim być również region dający wysoki poziom ekspresji, pochodzący z gospodarza heterologicznego, takiego, jakie są znane w stanie techniki. Szczególnymi nieograniczającymi przykładami białek, o których wiadomo, że są wytwarzane w dużych ilościach, a zatem dostarczających odpowiednich sekwencji regulujących ekspresję dla celów wynalazku, są hydrofobina, proteaza, amylaza, ksylanaza, pektynaza, esteraza, beta-galaktozydaza, celulaza (np. endoglukanaza, cellobiohydrolaza) i poligalakturonaza. Wysoką wydajność uzyskuje się zarówno w warunkach hodowli na podłożu stałym jak i fermentacji wgłębnej. Metody oceny obecności lub wytwarzania tych białek są dobrze znane. Wiele przykładów dostarczają np. katalogi Sigma i Megazyme. Megazyme ma siedzibę w Bray Business Park, Bray, County Wicklow w Irlandii. Sigma Aldrich ma wiele filii na całym świecie, np. w USA P.O. Box 14508 St. Louis Missouri. Dla oznaczania cellulazy, powołujemy się na dostępne na rynku próby, takie jak próby CMCase, próby endowiskometryczne, próby Avicelase, próby na beta-glukanazę, próby RBBCMCase, próby Cellazyme C. Na rynku dostępne są również próby na ksylanazę, np. DNS i Megazyme). Dla specjalistów z tej dziedziny dobrze znane są próby alternatywne. Można je znaleźć w ogólnie dostępnym piśmiennictwie dotyczącym tego tematu i informację tę traktuje się jako włączoną do niniejszego opisu jako odnośnik. Przykładowo, powołujemy się na wydawnictwo „Methods in Enzymology”, od tomu 1 z 1955 r do tomów 297-299 z 1998 r. Dogodnie, stosuje się sekwencję promotorową z Chrysosporium w celu zapewnienia dobrego jej przyjęcia przez gospodarza.

PL 207 374 B1

Wykazaliśmy, że heterologiczne sekwencje regulujące ekspresje działają w Chrysosporium tak samo wydajnie jak natywne sekwencje Chrysosporium. Pozwala to na użycie do transformowania Chrysosporium dobrze znanych konstrukcji i wektorów a także na proponowanie wielu innych możliwości konstruowania wektorów dających dobre wydajności ekspresji w tym nowym gospodarzu ekspresyjnym i wydzielniczym. Można przykładowo wykorzystać standardowe techniki transformacji Aspergillus, opisane np. przez Christiansen'a i wsp., w Bio/Technol. 6: 1419-1422 (1988). Innymi dokumentami dostarczającymi szczegółowych informacji o wektorach transformacyjnych Aspergillus są np. opisy patentowe US 4.816.405, US 5.198.345, US 5.503.991, US 5.364.770, US 5.578.463, EP-B-215.594 (również dla Trichoderma). Zawartość tych pozycji jest włączona do niniejszego opisu jako odnośnik. Szczególnie wysokie wydajności ekspresji dla celulazy uzyskuje się przy użyciu szczepów Chrysosporium a regiony regulujące ekspresję dla tych białek są szczególnie zalecane. Mamy na myśli konkretne przykłady wymienionych powyżej zdeponowanych szczepów Chrysosporium.

Korzystne rozwiązanie według wynalazku stanowią: konstrukcja kwasu nukleinowego zawierająca region regulujący ekspresję kwasu nukleinowego z Chrysosporium, korzystnie z Chrysosporium lucknowense albo jego pochodna a także zmutowany szczep Chrysosporium zawierający taki region związany operacyjnie z genem kodującym polipeptyd, który ma być wytwarzany. Taką konstrukcją kwasu nukleinowego będzie region regulujący ekspresję z Chrysosporium związany z ekspresją genu celulazy albo ksylanazy, korzystnie ekspresją genu cellobiohydrolazy albo dehydrogenazy fosforanu aldehydu glicerynowego, co jest szczegółowo opisane poniżej. Sekwencję kwasu nukleinowego według wynalazku można dogodnie uzyskać ze szczepu Chrysosporium, który to szczep jest zdefiniowany w innej części opisu. Wiele jest metod oznaczania sekwencji promotorowych i są one znane w stanie techniki. Taką sekwencję można uzyskać w doświadczeniach delecji z użyciem nukleazy, z regionu w górę od kodonu ATG na począ tku odnoś nego genu. W celu znalezienia żądanego genu można przykładowo przeprowadzić analizę sekwencji o najwyższej zgodności (consensus). Wykorzystując techniki hybrydyzacji i amplifikacji, specjalista może łatwo uzyskać odpowiednie sekwencje promotorowe.

W ten sposób zidentyfikowano sekwencje promotorowe dla genów C1 endoglukanaz, klonują c odpowiednie geny. Korzystnymi promotorami według wynalazku są: promotor dla genu cellobiohydrolazy (CBH1) o wielkości 55 kDa, promotory dla genu ksylanazy o wielkości 30 kDa (Xyl1) i promotor dla genu dehydrogenazy fosforanu aldehydu glicerynowego, gdyż ekspresja tych enzymów przebiega na wysokim poziomie z ich własnych promotorów. Korespondujące sekwencje promotorowe zidentyfikowano w prosty sposób przez klonowanie, co opisano w publikacji zgłoszenia patentowego WO 00/20555, wykorzystując informację o sekwencji podaną odpowiednio na sekwencji SEQ ID Nr: 1 (dla CBH1) i SEQ ID Nr: 3 (dla Xyl1). Do ekspresji żądanych polipeptydów w organizmie gospodarza, zwłaszcza w organizmie grzyba lub innego drobnoustroju jako gospodarza można korzystnie użyć promotory genów dla enzymów rozkładających węglowodany z Chrysosporium, zwłaszcza promotory C1. Częścią wynalazku są także sekwencje promotorowe posiadające przynajmniej 65% identyczności, korzystnie co najmniej 70% identyczności, najkorzystniej co najmniej 75% identyczności w sekwencji nukleotydowej z sekwencjami podanymi na SEQ ID Nr: 1, 3 albo 5 albo z sekwencjami znalezionymi dla innych genów Chrysosporium.

Odnośnie szczegółowych urzeczywistnień rekombinantowego szczepu i sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku odwołujemy się do przykładów. Powołujemy się również na szczepy rekombinantowe ze stanu techniki, do opisanych sekwencji promotorowych o wysokiej ekspresji, zwłaszcza do tych, które dają wysoką ekspresję w grzybach, np. takich jak ujawnione dla Aspergillus i Trichoderma. Stan techniki dostarcza wielu regionów regulują cych ekspresję do uż ycia w Aspergillus, między innymi, są one opisane w patentach US 5.252.726 firmy Novo i US 5.705.358 firmy Unilever. Te ujawnienia ze stanu techniki są również włączone do niniejszego opisu jako odnośniki.

Gen hydrofobiny jest genem grzybowym podlegającym wysokiej ekspresji. Proponuje się zatem, aby sekwencję promotora genu hydrofobiny, korzystnie z Chrysosporium, użyć dogodnie jako sekwencję regulującą ekspresję w odpowiednim urzeczywistnieniu wynalazku. Przykładowo, w stanie techniki zostały ujawnione sekwencje genu hydrofobiny z Trichoderma reesei i Trichoderma harzianum a także sekwencja genu dla Aspergillus fumigatus i Aspergillus nidulans a odpowiednia informacja o sekwencji jest włączona do niniejszego opisu jako odnośnik [Munoz i wsp., Curr. Genet. 32(3): 225-230 (1997); Nakari-Setala T. i wsp., Eur. J. Biochem. 15: 235 (1-2): 248-255 (1996); M. Parta i wsp., Infect. Immun. 62 (10): 4389-4395 (1994); Stringer M. A. i wsp., Mol. Microbiol. 16(1): 33-44 (1995)]. Wykorzystując tę informację o sekwencji, specjalista z tej dziedziny wiedzy może otrzymać

PL 207 374 B1 sekwencje regulujące ekspresję z genów hydrofobiny Chrysosporium bez zbędnego eksperymentowania, postępując według standardowych technik, jak już wspomniano powyżej. Rekombinantowy szczep Chrysosporium według wynalazku może zawierać region regulujący dla hydrofobiny, operacyjnie związany z sekwencją kodującą ten żądany polipeptyd.

Sekwencja regulująca ekspresję może dodatkowo zawierać sekwencję wzmacniającą albo osłabiającą transkrypcję (wzmacniacz albo „silencer”). Są one dobrze znane w stanie techniki. Są one na ogół zlokalizowane w pewnej odległości od promotora. Sekwencje regulujące ekspresję mogą również zawierać promotory z miejscami wiążącymi aktywator i z miejscami wiążącymi represor. W niektórych przypadkach takie miejsca można również modyfikować, eliminując ten typ regulacji. Zostały opisane promotory grzybów nitkowatych, w których występują miejsca creA. Takie miejsca creA można mutować dla zapewnienia, aby została wyeliminowana represja glukozy normalnie powodowana obecnością miejsc nie zmutowanych. Zasada ta jest zilustrowana w opisie patentowym WO 94/13820 firmy Gist-Brocades. Użycie takiego promotora umożliwia produkcję polipeptydu kodowanego przez sekwencję kwasu nukleinowego regulowaną przez promotor w obecności glukozy. Ta sama zasada wynika również w opisu patentowego WO 97/09438. Promotory te można stosować albo z albo bez ich miejsc creA. Mutanty, w których zostały zmutowane miejsca creA można stosować jako sekwencje regulujące ekspresję w szczepie rekombinantowym według wynalazku a sekwencja kwasu nukleinowego, którą one regulują może podlegać ekspresji w obecności glukozy. Takie promotory Chrysosporium zapewniają derepresję w sposób analogiczny do opisanego w publikacji WO 97/09438. Miejsca creA są zidentyfikowane w stanie techniki. Alternatywnie, możliwe jest użycie promotora z miejscami wiążącymi creA, które nie zostały zmutowane w szczepie gospodarza z mutacją w innym miejscu w układzie represyjnym, np. w samym genie creA, i w ten sposób szczep, nie wytrzymując obecności miejsc wiążących creA, może produkować białko lub polipeptyd w obecności glukozy.

Sekwencjami regulującymi ekspresję są również sekwencje terminatorowe. Są one związane operacyjnie z końcem 3' sekwencji, która ma podlegać ekspresji. Każdy terminator grzybowy będzie prawdopodobnie funkcjonował w szczepie Chrysosporium według wynalazku jako gospodarzu. Przykłady obejmują terminator trpC z A. nidulans (1), terminator alfa-glukozydazy z A. niger (2), terminator glukoamylazy z A. niger (3), terminator karboksylo-proteazy z Mucor miehei (US 5.578.463) i terminator cellobiohydrolazy z Trichoderma reesei. Oczywiście, sekwencje terminatorowe z Chrysosporium będą funkcjonowały w Chrysosporium i nadają się jako np. terminator CBH1.

Odpowiedni zrekombinowany szczep Chrysosporium, który ma być użyty zgodnie z wynalazkiem, posiada sekwencję kwasu nukleinowego, która ma podlegać ekspresji, związaną operacyjnie z sekwencją kodującą sekwencję aminokwasową określaną jako sekwencja sygnałowa. Sekwencja sygnałowa jest sekwencją aminokwasową, która jeśli jest związana operacyjnie z sekwencją aminokwasową wytwarzanego polipeptydu pozwala na jego sekrecję z gospodarza grzybowego. Taką sekwencją sygnałową może być sekwencja normalnie związana z heterologicznym polipeptydem albo może być to sekwencja natywna gospodarza. Może ona być również obca zarówno dla gospodarza jak i dla polipeptydu. Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca sekwencję sygnałową musi być usytuowana w zgodnej ramce odczytu dla umożliwienia translacji tej sekwencji sygnałowej i heterologicznego polipeptydu. Przewidywana jest dowolna sekwencja sygnałowa zapewniająca sekrecję polipeptydu ze szczepu Chrysosporium. Taką sekwencją sygnałową jest dogodnie grzybowa sekwencja sygnałowa, korzystnie sekwencja sygnałowa z Ascomycetes.

Odpowiednimi przykładami sekwencji sygnałowych są sekwencje pochodzące z drożdży generalnie albo z następujących konkretnych gatunków grzybów: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Pichia, Neurospora, Rhizomucor, Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Sascharomyces, Talaromyces albo ich alternatywnych form płciowych, jak Emericella lub Hypocrea. Sekwencjami sygnałowymi szczególnie użytecznymi są często sekwencje natywnie związane z następującymi białkami: cellobiohydrolazą, endoglukanazą, betagalaktozydazą, ksylanazą, pektynazą, esterazą, hydrofobiną, proteazą lub amylazą. Przykłady obejmują amylazę albo glukoamylazę z Aspergillus albo Humicola (4), amylazę TAKA z Aspergillus oryzae, alfa-amylazę z Aspergillus niger, karboksylo-peptydazę z Mucor (US 5.578.463), lipazę albo proteinazę z Rhizomucor miehei, cellobiohydrolazę z Trichoderma (5), beta-galaktozydazę z Penicillium canescens i drożdżowy czynnik kojarzenia alfa z Saccharomyces.

Alternatywnie, sekwencja sygnałowa może pochodzić z genu amylazy albo subtylizyny ze szczepu Bacillus. Szczególnie użyteczna jest sekwencja sygnałowa z tego samego gatunku, do którego należy szczep gospodarza, gdyż jest najbardziej prawdopodobne, że będzie swoiście przyjęta

PL 207 374 B1 przez organizm konkretnego gospodarza, a więc, korzystnie sekwencją sygnałową jest sekwencja sygnałowa z Chrysosporium, zwłaszcza ze szczepu Chrysosporium, szczep C1, szczep UV13-6, szczep NG7C-19 i szczep UV18-25, opisane powyżej. Użyteczne są sekwencje sygnałowe z grzybów nitkowatych, drożdży i bakterii. Sekwencje sygnałowe pochodzenia nie-grzybowego są również uważane za przydatne, zwłaszcza sekwencje bakteryjne, roślinne i ssacze.

Rekombinantowy gospodarz przeznaczony do użycia zgodnie z rozwiązaniami według wynalazku może ponadto zawierać marker selekcyjny. Taki marker selekcyjny będzie umożliwiał łatwą selekcję transformowanych lub transfekowanych komórek. Marker selekcyjny często koduje produkt genu, wprowadzający specyficzny typ oporności obcej dla szczepu nie transformowanego. Może to być na ogół oporność na metale ciężkie, antybiotyki i biocydy. Cecha prototrofii jest również użytecznym markerem selekcyjnym z grupy nie-antybiotycznej. Nie-antybiotykowe markery selekcyjne mogą być preferowane wówczas, gdy żądane białko lub polipeptyd mają być użyte do żywności lub do farmaceutyków ze względu na szybszą i mniej skomplikowaną administracyjną procedurę uzyskiwania zezwolenia na wprowadzenie do obrotu takiego produktu. Bardzo często takie markery nazywa się markerami GRAS. Dla specjalistów jest dostępnych wiele takich markerów. Przykładowo, ich wykaz podaje FDA. Najczęściej stosuje się markery selekcyjne wybrane z grupy nadającej oporność na lek albo znoszący defekt pokarmowy, np. z grupy zawierającej gen amdS (acetamidazy), hph (fosfotransferazy higromycyny), pyrG (dekarboksylazy orotydyno-5'-fosforanu), trpC (syntazy antranilanowej), argB (karbamoilotransferazy ornityny), sC (siarczanu adenylotransferazy), bar (acetylotransferazy fosfinotricyny), oporności na glufosinat, niaD (reduktazy azotanowej), gen oporności na bleomycynę, szczególnie Sh ble, oporności na sulfonylomocznik, np. mutację genu syntazy acetomleczanowej ilv1. Selekcję można również prowadzić drogą wspólnej transformacji, gdzie marker selekcyjny znajduje się na oddzielnym wektorze albo gdzie marker selekcyjny znajduje się na tym samym fragmencie kwasu nukleinowego co sekwencja kodująca polipeptyd dla żądanego polipeptydu.

Stosowany w opisie termin „polipeptyd heterologiczny” oznacza białko lub polipeptyd, który nie jest normalnie wytwarzany i wydzielany przez szczep gospodarza Chrysosporium użyty do ekspresji według wynalazku. Polipeptyd ten może być pochodzenia roślinnego lub zwierzęcego (od zwierząt kręgowych lub bezkręgowców), np. może to być polipeptyd powstający w organizmach ssaków, ryb, owadów lub mikroorganizmów, z zastrzeżeniem, że nie występuje w szczepie gospodarza. Termin ssak obejmuje również człowieka. Termin mikroorganizm obejmuje wirusy, bakterie, archaebakterie i grzyby, np. grzyby nitkowate i droż dż e. Podrę cznik „Bergey's Manual for Bacterial Terminology” podaje stosowne wykazy bakterii i archaebakterii. Do celów farmaceutycznych często preferuje się białka ludzkie, tak więc, rekombinantowy gospodarz według wynalazku stanowiący rozwiązanie korzystne, będzie gospodarzem, który ma wytwarzać polipeptyd pochodzenia ludzkiego. Do celów takich jak produkcja żywności, odpowiednim heterologicznym polipeptydem będzie polipeptyd pochodzenia zwierzęcego, roślinnego albo z alg. Takie urzeczywistnienia traktuje się zatem jako stosowne przykłady wynalazku. Użyteczne urzeczywistnienia alternatywne obejmują również heterologiczne polipeptydy dowolnego pochodzenia bakteryjnego, drożdżowego, wirusowego, archaebakteryjnego i grzybowego. Najbardziej preferowane jest pochodzenie z grzybów.

Dogodne rozwiązanie według wynalazku będzie stanowiła heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego z zaadoptowanym użyciem kodonów. Taka sekwencja koduje natywną sekwencję aminokwasową gospodarza, z którego pochodzi, ale posiada inną sekwencję kwasu nukleinowego, np. sekwencję kwasu nukleinowego, w której niektóre kodony zostały zastąpione innymi kodonami kodującymi ten sam aminokwas ale znacznie łatwiej stosowanymi przez szczep gospodarza użyty do ekspresji. Może to prowadzić do lepszej ekspresji heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego. Jest to praktyka powszechnie stosowana przez specjalistów z tej dziedziny. Taką adaptację użycia kodonu można prowadzić biorąc za podstawę znane użycie kodonu grzybowego w porównaniu do użycia kodonu nie-grzybowego. Może ono być nawet bardziej swoiście zaadaptowane niż użycie kodonu w samym Chrysosporium. Podobieństwa są tego typu, że uż ycie kodonu obserwowane w Trichoderma, Humicola i Aspergillus powinno umożliwić wymianę sekwencji tych organizmów bez adaptacji użycia kodonu. Szczegóły są dostępne dla specjalistów zajmujących się użyciem kodonu tych grzybów i są one włączone do niniejszego opisu jako odnośnik.

Wynalazek nie ogranicza się do wyżej wspomnianych rekombinantowych szczepów Chrysosporium, obejmuje także rekombinantowy szczep Chrysosporium zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą białko homologiczne dla szczepu Chrysosporium, która to sekwencja kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z regionem regulującym ekspresję a wspomniany rekombinantowy

PL 207 374 B1 szczep wytwarza więcej wspomnianego białka niż odpowiedni szczep nie rekombinantowy w tych samych warunkach. Jeśli chodzi o homologiczny żądany polipeptyd, jest nim korzystnie obojętny lub zasadowy enzym, taki jak hydrolaza, proteaza albo enzym degradujący węglowodan, co jest opisane w piśmiennictwie. Polipeptyd ten może mieć również charakter kwaśny. Korzystnie, taki szczep rekombinantowy będzie wytwarzał polipeptyd w większych ilościach niż szczep nie rekombinantowy. Wszystkie uwagi odnoszące się do polipeptydu heterologicznego mają zastosowanie na zasadach wzajemności również do homologicznego polipetydu celulazy.

Wynalazkiem objęte są zatem również zmodyfikowane technikami inżynierii genetycznej szczepy drobnoustrojów, w których wprowadzona sekwencja pochodzi z Chrysosporium. Takie szczepy będą jednak odróżnialne od szczepów natywnych dzięki temu, że przykładowo, w sekwencji kwasu nukleinowego użytego do transformowania lub transfekowania Chrysosporium będą występować sekwencje heterologiczne, dzięki temu, że będzie występować wiele kopii sekwencji kodujących żądany polipeptyd albo dzięki temu, że ekspresja tych kopii będzie przebiegała z wydajnością przewyższającą wydajność szczepu nie poddanego modyfikacjom genetycznym w identycznych warunkach albo dzięki temu, że ekspresja będzie przebiegać w warunkach normalnie nie dających ekspresji. Ta ostatnia opcja będzie miała miejsce wówczas, gdy żądana sekwencja będzie regulowana promotorem indukowalnym w odróżnieniu od sytuacji, w której byłby użyty szczep nie rekombinowany albo jeśli ekspresja jest indukowana innym czynnikiem niż w szczepie nie poddawanym procesom inżynierii. Wynalazek dotyczy szczepów pochodzących z modyfikacji albo z użyciem klasycznych technologii genetycznych albo metodologii inżynierii genetycznej.

Układy ekspresyjne i szczepy gospodarza je zawierające według wynalazku mogą zawierać sekwencję kwasu nukleinowego kodującą heterologiczne białko wybrane spośród enzymów degradujących węglowodany (celulaz, ksylanaz, mannanaz, mannozydaz, pektynaz, amylaz, np. glukoamylaz, α-amylaz, α- i β-glukozydaz, β-glukanaz, chitynaz, chitanaz), proteaz (endo-proteaz, amino-proteaz, amino- i karboksy-peptydaz, keratynaz), innych hydrolaz (lipaz, esteraz, fitaz), oksydoreduktaz (katalaz, glukozooksydaz) i transferaz (transglukozylaz, transglutaminaz, izomeraz i inwertaz).

Najbardziej interesującymi produktami, które będą produkowane zgodnie z wynalazkiem są celulazy, ksylanazy, pektynazy, lipazy i proteazy, przy czym celulazy i ksylanazy rozszczepiają wiązania beta-1,4-, celulazy obejmują endoglukanazy, cellobiohydrolazy i beta-glukozydazy. Te białka są szczególnie użyteczne w różnych procesach przemysłowych znanych w stanie techniki. Szczególnie w przypadku celulaz powołujemy się na publikację zgłoszeniową WO 98/15633 opisującą cellobiohydrolazy i endoglukanazy stosowane w przemyśle. Zawartość tego opisu patentowego jest włączona do niniejszego opisu jako odnośnik.

Rekombinant według wynalazku może posiadać sekwencję kwasu nukleinowego kodującą żądany polipeptyd, który ulega inaktywacji lub jest nietrwały w kwaśnym pH, czyli przy wartościach poniżej pH 6, nawet poniżej 5,5, dogodniej poniżej pH 5 a nawet wynoszących 4 lub poniżej 4. Jest to rozwiązanie szczególnie interesujące, gdyż generalnie, ujawnione dotychczas grzybowe układy ekspresyjne nie nadają się do prowadzenia hodowli w środowisku obojętnym do alkalicznego, ich hodowlę prowadzi się w kwaśnym zakresie pH. Układ według wynalazku dostarcza zatem bezpiecznego grzybowego układu ekspresyjnego dla białek albo polipeptydów, które łatwo ulegają inaktywacji albo są nietrwałe w kwaśnym zakresie pH.

Szczególnie szczep rekombinantowy zdefiniowany w którymkolwiek z urzeczywistnień wynalazku, w którym to szczepie sekwencja kwasu nukleinowego kodująca żądany polipeptyd koduje białko lub polipeptyd wykazujący optymalną aktywność i/lub stabilność przy pH powyżej 5, korzystnie w środowisku obojętnym albo alkalicznym (czyli przy pH powyżej 7) i/lub przy pH powyżej 6, jest uznawany za korzystną realizację wynalazku. Zakłada się, że uzyskanie ponad 50%, ponad 70% a nawet ponad 90% optymalnej aktywności przy takich wartościach pH, należy do rozwiązań szczególnie użytecznych. Polipeptyd wytwarzany w danych warunkach hodowli niekoniecznie musi być aktywny w tych warunkach hodowli a w praktyce może być korzystne, aby hodowla była prowadzona w warunkach, w których jest on nieaktywny gdyż jego forma aktywna mogła by być szkodliwa dla gospodarza. Wymaga się jednakże, aby to białko lub polipeptyd były stabilne w warunkach hodowli. Stabilnością może być stabilność termiczna. Może to być również stabilność w obecności pewnych kompozycji lub związków chemicznych, które mogą przykładowo występować w kompozycjach lub w procesach produkcji albo będą stosowane łącznie z danym polipeptydem lub białkiem. LAS w kompozycjach detergentowych zawierających celulazy albo lipazy, lub inne enzymy jest przykładem związku chemicznego często niszczącego dla białek. Czas użycia w zastosowaniach może być różny i wahać się od krótkiej

PL 207 374 B1 do długotrwałej ekspozycji, a więc stabilność może dotyczyć zmiennych okresów czasu, różnych dla każdego zastosowania. Specjalista będzie w stanie określić prawidłowe warunki, osobno dla każdego przypadku. Można wykorzystać wiele dostępnych na rynku prób w celu oceny optymalnej aktywności różnych produktów enzymatycznych. Podają je np. katalogi Sigma i Megazyme. Szczególne przykłady testów są podane w innej części niniejszego opisu. Producenci podają instrukcje ich stosowania.

Szczep Chrysosporium może być dogodnie poddany transformowaniu lub transfekcji żądaną sekwencją, której ekspresja ma w nim przebiegać. Szczep ten charakteryzuje się stosunkowo małą biomasą. Odkryliśmy, że szczepy Chrysosporium, dające dwu- do pięciokrotnie mniej biomasy niż szczep Trichoderma reesei przy hodowli do lepkości 200-600 cP pod koniec procesu fermentacji i dające 10 do 20 razy mniej biomasy niż Aspergillus niger przy hodowli do lepkości 1500-2000 cP w równoważnych warunkach, a więc, hodowane w optymalnych dla nich odpowiednich warunkach hodowli, mogą dawać wysoki poziom ekspresji. Ten poziom ekspresji daleko przewyższa poziomy ekspresji dwóch cytowanych handlowych szczepów referencyjnych przy znacznie mniejszej ilości biomasy i przy znacznie niższej lepkości. Oznacza to, że wydajność ekspresji takich szczepów Chrysosporium będzie znacząco wyższa od wydajności uzyskiwanej przy użyciu Aspergillus niger i Trichoderma reesei. Takie transformowane lub transfekowane formy szczepu Chrysosporium stanowią dogodne rozwiązanie według wynalazku.

Zbadaliśmy, że biomasa wytwarzana przez szczep Chrysosporium C1(18-25) wynosi 0,5-1,0 g/litr, natomiast biomasa wytwarzana przez Trichoderma reesei wynosi 2,5-5,0 g/litr a przez Aspergillus niger wynosi 5-10 g/litr w wyżej opisanych warunkach. Szczegóły procesu są podane w przykładach.

W korzystnym rozwiązaniu, rekombinantowy szczep Chrysosporium produkuje białko albo polipeptyd w ilości co najmniej równoważnej produkcji celulazy (w molach/litr) przez szczep UV13-6 albo szczep C-19 a najkorzystniej, co najmniej równoważnej albo wyższej niż szczep UV18-25 w równoważnych lub identycznych warunkach, to znaczy w odnośnych, optymalnych warunkach ich hodowli.

Okazało się również, że wydajności ekspresji i sekrecji są wyjątkowo wysokie przy użyciu szczepu Chrysosporium wykazującego morfologię grzybni szczepu UV18-25, a więc grzybni fragmentowanej i krótkiej. Tak więc, rekombinantowy szczep według wynalazku będzie korzystnie charakteryzował się taką morfologią. Wynalazkiem objęte są jednak również szczepy nie rekombinantowe bądź zmodyfikowane w inny sposób szczepy Chrysosporium wykazujące tę nową cechę według wynalazku. Wynalazek obejmuje również rekombinantowy szczep Chrysosporium w każdym z opisanych urzeczywistnień wynalazku, poza tym odznaczający się zmniejszoną sporulacją w porównaniu do szczepu C1, korzystnie mniejszą niż szczep UV13-6 i korzystnie mniejszą niż szczep NG7C-19, korzystnie mniejszą niż szczep UV18-25 w równoważnych warunkach fermentora. Przedmiotem wynalazku jest również rekombinantowy szczep Chrysosporium w każdym z opisanych urzeczywistnień wynalazku, odznaczający się ponadto co najmniej taką samą proporcją produkcji białka do biomasy jakim charakteryzuje się szczep C1, korzystnie taką samą jak szczepy UV13-6, NG7C-19 i UV18-25 w równoważnych warunkach fermentora. Wynalazkiem objęte są też jednak szczepy nie rekombinatowe bądź szczepy Chrysosporium w inny sposób modyfikowane, wykazujące tę nową cechę według wynalazku jako taką albo w połączeniu z innymi urzeczywistnieniami.

Inne ciekawe rozwiązanie według wynalazku obejmuje rekombinantowy szczep Chrysosporium dający lepkość niższą od lepkości charakterystycznej dla szczepu NG7C-19 i korzystnie niższą od szczepu UV18-25 w odpowiednich lub identycznych warunkach fermentacji. Wynalazkiem objęte są też jednak nie rekombinantowe szczepy bądź szczepy Chrysosporium w inny sposób modyfikowane, wykazujące tę nową cechę według wynalazku jako taką albo w połączeniu z innymi urzeczywistnieniami. Oznaczona przez nas lepkość hodowli szczepu UV18-25 pod koniec procesu fermentacji była niższa od 10 cP w porównaniu do lepkości rzędu 200-600 cP dla hodowli Trichoderma reeisei i lepkości rzędu 1500-2000 cP dla hodowli Aspergillus niger w odpowiednich, optymalnych dla nich warunkach hodowli. Metoda zastosowana do tego oznaczenia jest opisana w przykładach.

W wielu przypadkach można oznaczać lepkość wizualnie. Płynność brzeczki może wahać się w tak ogromnym zakresie, że może ona być prawie zestalona, mieć konsystencję sosu lub cieczy. Lepkość można również łatwo oznaczyć przy użyciu wiskozymetru rotacyjnego Brookfielda albo kinematycznych wiskozymetrów kapilarnych, w wiskozymetrze kulkowym albo w wiskozymetrze stożkowym. Wydajności (na jednostkę czasu i na komórkę) uzyskiwane z hodowli o tak niskiej lepkości są wyższe od tych, jakie dają znane w przemyśle hodowle o wysokiej lepkości.

Prowadzenie procesu fermentacji kultury o tak niskiej lepkości według wynalazku jest korzystne zwłaszcza wówczas, gdy zwiększa się skalę produkcji. Szczepy Chrysosporium o niskiej lepkości

PL 207 374 B1 zachowują się bardzo dobrze w hodowlach o wielkości do 150.000 litrów. Tak więc, każda pojemność hodowli do 150.000 litrów stanowi użyteczne urzeczywistnienie wynalazku. Z użyciem szczepów według wynalazku powinno się z powodzeniem prowadzić fermentację przy każdej innej dogodnej wielkości szarży. Takie rozumowanie ma uzasadnienie w związku z trudnościami jakie mogą występować przy produkcji na wielką skalę, wywołanymi powstawaniem agregatów grzybni, które są zbyt gęste, zbite i/lub nierównomiernie rozprzestrzenione. W rezultacie, pożywki nie mogą być utylizowane efektywnie podczas hodowli, co powoduje, że proces produkcyjny jest mało wydajny, zwłaszcza gdy fermentację prowadzi się na dużą skalę, czyli w objętości ponad 150.000 litrów. Napowietrzanie i mieszanie staje się trudne, co prowadzi do głodu tlenowego i pokarmowego i w rezultacie do zmniejszenia stężenia biomasy produkcyjnej i obniżonej wydajności polipeptydu podczas hodowli i/lub może być powodem wydłużenia czasu fermentacji. Poza tym, wysoka lepkość i wysokie siły ścinania są niepożądane w przemysłowych procesach fermentacji i w obecnych procesach przemysłowych są one czynnikami ograniczającymi produkcję. Wszystkie te negatywne aspekty można przezwyciężyć przez użycie Chrysosporium według wynalazku jako gospodarza, będącego szczepem, który posiada znacznie lepsze cechy niż Trichoderma reeisei, Aspergillus niger i Aspergillus oryzae, stosowane do tych celów w przemyśle, to znaczy, charakteryzuje się wyższymi poziomami wytwarzanego białka, lepszymi własnościami lepkościowymi i parametrami dotyczącymi biomasy.

Szczep Chrysosporium według każdego z wyżej wymienionych urzeczywistnień wynalazku, posiadający ponadto zdolność wytwarzania jednego lub większej ilości enzymów grzybowych wybranych spośród enzymów degradujących węglowodany, proteaz, innych hydrolaz, oksydoreduktaz i transferaz wymienionych powyżej, uważany jest za szczególnie użyteczne rozwiązanie według wynalazku. Najbardziej interesującymi produktami są zwłaszcza celulazy, ksylanazy, pektynazy, lipazy i proteazy. Również użytecznym rozwiązaniem według wynalazku jest szczep Chrysosporium mający zdolność wytwarzania jednego lub większej ilości enzymów grzybowych charakteryzujących się optymalną stabilnością i/lub aktywnością w środowisku obojętnym i zasadowym, korzystnie stabilnością i/lub aktywnością w środowisku zasadowym, który to enzym jest wybrany spośród enzymów degradujących węglowodany, hydrolaz i proteaz, korzystnie hydrolaz i enzymów degradujących węglowodany. W przypadku nie rekombinantowego szczepu Chrysosporium, takimi enzymami są enzymy inne niż celulaza, ujawnione w publikacji zgłoszenia patentowego międzynarodowego WO 98/15633. Enzymami o szczególnym znaczeniu są ksylanazy, proteazy, esterazy, alfa-galaktozydazy, beta-galaktozydazy, beta-glukanazy i pektynazy. Enzymy nie ograniczają się do wyżej wymienionych. Dla tych enzymów mają również zastosowanie uwagi odnośnie stabilności i aktywności podane w innych częściach opisu.

Przedmiotem wynalazku objęty jest również sposób wytwarzania żądanego polipeptydu, który to sposób polega na hodowli szczepu gospodarza (np. grzybowego, takiego jak szczep z rodzaju Chrysosporium, Aspergillus, Trichoderma, Hansenula, Mucor, Pichia, Neurospora, Tolypocladium, Rhizomucor, Fusarium, Penicillium albo bakteryjnego bądź innego mikroorganizmu) w każdym z rozwiązań według wynalazku, w warunkach pozwalających na ekspresję i korzystnie wydzielanie żądanego polipeptydu i następny odzysk tego polipeptydu.

W odniesieniu do białka lub polipeptydu, wynalazkiem objęte są warianty, mutanty, np. mutanty substytucyjne, insercyjne lub delecyjne białek naturalnych, wykazujące aktywność produktów nie zmutowanych. To samo odnosi się do odpowiednich sekwencji kwasu nukleinowego. Procesy takie jak przesunięcia genu, modyfikacja białka, ukierunkowana ewolucja i kierowana miejscem mutagenezą oraz mutageneza losowa są sposobami, za pomocą których można uzyskać takie polipeptydy, warianty i mutanty. Pouczenia na temat ukierunkowanej ewolucji są zawarte w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych, US 5.223.409, US 5.780.279 i US 5.770.356. Według tego sposobu, biblioteka losowo zmutowanych sekwencji genu utworzona np. przez przesunięcie genu drogą dającej błędy reakcji PCR pojawia się w każdym typie komórki. Każdy gen ma region wydzielniczy i region immobilizacyjny do niego przyłączony, dzięki czemu wytworzone białko jest wydzielane i jest zatrzymywane na powierzchni komórki gospodarza. Następnie stwarza się warunki wymuszające aktywność biologiczną danego polipeptydu. Procesy te mają miejsce w wielu cyklach prowadzących ostatecznie do końcowego genu o żądanej charakterystyce. W innych słowach, przyspiesza się ukierunkowany proces ewolucji. W opisie patentowym US 5.763.192 również jest opisany proces otrzymywania DNA, RNA, peptydów, polipeptydów lub białka przez sprzęganie stochastycznie (losowo) generowanych sekwencji syntetycznego polinukleotydu, wprowadzenie ich do gospodarza i selekcję komórek gospodarza o odpowiednich zadanych cechach.

PL 207 374 B1

Innym zastosowaniem sposobu według wynalazku jest sposób „ukierunkowanej ewolucji”, w którym generuje się nowe sekwencje DNA kodujące białko, prowadzi się ekspresję tego zakodowanego białka w komórce gospodarza i prowadzi się mutację i powtórną ekspresję tych sekwencji kodujących białko, które mają żądane właściwości. Proces ten powtarza się w wielu cyklach, dopóki nie uzyska się białka o żądanych własnościach. Przesunięcie genu, modyfikacja białka, dająca błędy reakcja PCR, kierowana miejscem mutageneza, mutageneza kombinatoryjna i losowa, są to przykłady sposobów, jakimi można generować nowe sekwencje DNA kodujące egzogenne białka. Wiadomości na temat kierowanej ewolucji są zawarte w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych, US 5.223.409, US 5.780.279 i US 5.770.356, jak również w publikacjach Kuchner'a i Arnold'a, Trends in Biotechnology, 15: 523-530 (1997); Schmidt'a-Dannert'a i Arnold'a, Trends in Biotech., 17: 135-136 (1999); Arnold'a i Volkov'a, Curr. Opin. Chem. Biol., 3: 54-59 (1999); Zhao i wsp.. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, II wydanie (wydawca: Demain and Davies), str. 597-604, ASM Press, Washington DC, 1999; Arnold'a i Wintrode'a, Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation (wyd. Flickinger and Drew), str. 971-987, John Wiley & Sons, Nowy Jork (1999) i Minshull'a i Stemmer'a, Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 284-290.

Zastosowanie mutagenezy kombinatoryjnej jest ujawnione w publikacji Hu i wsp., Biochemistry, 37: 10006-10015 (1998). W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych, US 5.763.192 opisany jest sposób otrzymywania nowych sekwencji DNA kodujących białko przez stochastyczne generowanie sekwencji syntetycznych, wprowadzenie ich do gospodarza i wyselekcjonowanie komórek gospodarza o żądanych cechach. Sposoby przeprowadzania sztucznej rekombinacji genu (przesunięcie DNA) obejmują rekombinację losową (random priming) [Z. Shao i wsp., Nucleic Acid Res. 26: 681-683 (1998), proces wydłużenia naprzemianległego (staggered extension) (H. Zhao i wsp.. Nature Biotech. 16: 258-262 (1998)] i rekombinację heterodupleksową. [Volkov i wsp., Nucleic Acids Res. 27: e18 (1999)]. Dająca błędy reakcja PCR jest jeszcze innym podejściem [Song i Rhee, Appl. Environ. Microbiol. 66: 890-894 (2000)].

Istnieją dwa szeroko stosowane sposoby prowadzenia etapu selekcji w procesie ukierunkowanej ewolucji. W jednym sposobie, doprowadza się do tego, aby aktywność żądanego białka była w jakiś sposób niezbędna dla przetrwania komórek gospodarza. Przykładowo, jeśli pożądaną aktywnością jest celulaza aktywna przy pH 8, wówczas gen celulazy powinien być zmutowany i wprowadzony do komórek gospodarza. Następnie prowadzi się wzrost transformantów na celulozie jako jedynym źródle węgla i stopniowo podnosi się wartość pH, aż pozostanie tylko niewiele żywych komórek. Zmutowany gen celulazy pochodzący od komórek, które przetrwały, a więc prawdopodobnie zawierających gen kodujący celulazę aktywną przy stosunkowo wysokiej wartości pH, poddaje się następnej rundzie mutacji i powtarza się proces do czasu, aż uzyska się transformanty mające zdolność wzrostu na celulozie przy pH 8. Podobnie można rozwinąć warianty termostabilne enzymów, prowadząc cykle mutacji genu i hodowlę komórek gospodarza w wysokich temperaturach [Liao i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 576-580 (1986); Giver i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12809-12813 (1998)].

Alternatywą do zmasowania paralelnego podejścia „przetrwania najbardziej dopasowanego” jest przesiewanie seryjne. W tym podejściu, dokonuje się przesiewania poszczególnych transformantów metodami tradycyjnymi, takimi jak obserwacja przezroczystych albo barwnych stref wokół kolonii rosnących na pożywkach wskaźnikowych, kolorymetryczne lub fluorometryczne próby enzymatyczne, próby immunologiczne, próby wiązania i podobne. Patrz np. Joo i wsp.. Nature 399: 670-673 (1999). W pracy tej, uzyskano wytwarzanie monooksygenazy cytochromu P450 nie wymagającej NADH jako kofaktora w cyklach mutacji i przesiewania. W pracy May'a i wsp. [Nature Biotech. 18: 317-320 (2000)] uzyskano hydantoinazę o odwróconej stereoselektywności w podobny sposób. Miyazaki i wsp. ([J. Mol. Biol. 297: 1015-1026 (2000)] uzyskał termostabilną subtylizynę.

Do dotarcia do żądanej informacji o sekwencji można wykorzystać standardowe techniki klonowania i izolacji białka lub polipeptydu. Części znanych sekwencji można użyć jako sondy do izolacji innych homologów w innych rodzajach i szczepach. Przykładowo, sekwencję kwasu nukleinowego kodującą daną aktywność enzymatyczną można użyć do skriningu biblioteki Chrysosporium. Osoba będąca specjalistą określi stosowne warunki hybrydyzacji. Konwencjonalne metody hybrydyzacji kwasów nukleinowych, konstruowania bibliotek i technik klonowania są opisane w podręczniku Sambrook'a i wsp. (wyd. 1989), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor, Press Plainview, Nowy Jork i Ausubel'a i wsp. (red.) “Current Protocols in Molecular Biology” (1987), John Wiley and Sons, Nowy Jork. Potrzebne informacje można również uzyskać z późniejszych podręczników i patentów oraz z różnych dostępnych na rynku gotowych zestawów.

PL 207 374 B1

W rozwią zaniu alternatywnym, sposób polega na hodowli szczepu wedł ug wynalazku w warunkach pozwalających na ekspresję i korzystnie sekrecję białka lub polipeptydu bądź jego prekursora, na wyodrębnieniu tak wytworzonego polipeptydu i na ewentualnym poddaniu prekursora dodatkowym etapom izolacji i oczyszczania, uzyskując żądany polipeptyd. Sposób ten może dogodnie obejmować etap rozszczepiania prekursora na żądany polipeptyd lub prekursor. Etap rozszczepiania może polegać na rozszczepieniu proteazą podobną do Kex-2, dowolną proteazą rozszczepiającą zasadowe pary aminokwasów albo proteazą Kex-2, np. jeśli miejsce rozszczepiane przez proteazę łączy łatwo wydzielane białko nośnikowe i żądany polipeptyd. Specjalista z tej dziedziny może łatwo znaleźć sekwencje proteazy podobnej do Kex-2, ponieważ dane o sekwencji consensus dla tego enzymu są dostępne a dotychczas ujawniono już wiele jego alternatyw, np. furinę.

Dogodnie, w sposobie produkcji polipeptydu według rozwiązań według wynalazku, hodowlę prowadzi się przy wartości pH powyżej 5, korzystnie 5-10, bardziej korzystnie przy pH 6-9. Dogodnie, w tym sposobie hodowlę prowadzi się w zakresie temperatur od 25 do 43°C, korzystnie 30-40°C. Szczepem użytym w sposobie według wynalazku jest dogodnie rekombinantowy szczep Chrysosporium albo inny szczep grzybowy lub niegrzybowy. W takim przypadku, sposób według wynalazku będzie poprzedzony etapem wytwarzania rekombinantowego szczepu według wynalazku. Odpowiednie warunki będą dobrane zależnie od rodzaju polipeptydu, którego ekspresja ma przebiegać a dobranie tych warunków należy do normalnej pracy specjalisty z tej dziedziny.

Sposób wytwarzania rekombinantowego szczepu według wynalazku również stanowi część wynalazku. Sposób ten obejmuje trwałe wprowadzenie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej heterologiczny lub homologiczny polipeptyd do odpowiedniego szczepu gospodarza, która to sekwencja kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z regionem regulującym ekspresję, a powyższego wprowadzenia dokonuje się w sposób znany przy transformowaniu grzybów nitkowatych. Jak podano powyżej, dostępnych jest wiele pozycji literaturowych a mała, wybrana ich część jest w opisie cytowana. Dostarczone w nich informacje są wystarczające do praktycznego zastosowania tego sposobu bez zbędnego obciążenia. Sposób ten polega na wprowadzeniu sekwencji kwasu nukleinowego zawierającej elementy kwasu nukleinowego opisane w różnych urzeczywistnieniach rekombinantowego szczepu według wynalazku, jako takie lub w kombinacji.

Przykładowo, wprowadzenia można dokonać metodą transformacji protoplastu. Metoda ta jest opisana w przykładach. Alternatywne metody transformacji protoplastów albo sferoplastów są znane i mogą być uż yte tak, jak został y opisane w stanie techniki dla innych grzybów nitkowatych. Szczegółowe dane na temat tych metod można znaleźć w cytowanych odnośnikach, a zatem są one włączone do niniejszego opisu. Sposób według wynalazku dogodnie obejmuje użycie szczepu nie rekombinantowego jako materiału startowego do wprowadzenia danej sekwencji kodującej żądany polipeptyd.

Wynalazek obejmuje również sposób produkcji enzymu Chrysosporium, który to sposób polega na hodowli Chrysosporium lub innego szczepu w albo na pożywce o wartości pH powyżej 5, korzystnie 5-10, bardziej korzystnie 6-9 a dogodnie 6-7,5. Wartości pH 7,5-9 są przykładami zakresu obojętnego do zasadowego.

W bardziej ogólnym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania enzymów wykazujących optymalną aktywność i/lub stabilność w środowisku obojętnym lub zasadowym, korzystnie, optymalną aktywność i/lub stabilność w środowisku zasadowym. Korzystne zakresy wartości pH względem optymalnej aktywności oraz odpowiednie próby służące do określania tych wartości są podane w innej części opisu. Enzym powinien być wybrany spośród enzymów degradujących węglowodany, proteaz, innych hydrolaz, oksydoreduktaz i transferaz, jak podano powyżej. Sposób polega na hodowli komórki gospodarza, transformowanej lub transfekowanej odpowiednią, kodującą enzym, sekwencją kwasu nukleinowego. Dogodnie, enzymem tym będzie enzym z Chrysosporium. Dogodny sposób, taki jak ten, obejmuje wytwarzanie zwłaszcza celulazy, ksylanazy, pektynazy, lipazy i proteazy, przy czym celulaza i ksylanaza rozszczepiają wiązania β-1,4 a celulaza obejmuje endoglukanazę, cellobiohydrolazę i β-glukozydazę. Sposób według wynalazku może polegać na hodowli dowolnego gospodarza Chrysosporium według wynalazku, zawierającego kwas nukleinowy kodujący wyżej wymienione enzymy. Produkcja z udziałem nie-rekombinantowych gospodarzy Chrysosporium według wynalazku jest ukierunkowana na wytwarzanie enzymów degradujących węglowodany, hydrolaz i proteaz. W takim przypadku, enzymem jest dogodnie enzym inny niż celulaza. Sposoby izolowania są analogiczne do opisanych w publikacji zgłoszenia międzynarodowego WO 98/15633 i są włączone do niniejszego opisu jako odnośnik.

PL 207 374 B1

Enzymy wytwarzane sposobem według wynalazku są również objęte wynalazkiem. Wynalazek obejmuje też enzymy pochodzące z Chrysosporium, jakie można wyizolować z nierekombinantowych szczepów Chrysosporium według wynalazku. Charakteryzują się one wyżej opisaną stabilnością i aktywnością. Dogodnie, są one stabilne w obecności LAS. Zastrzega się zwłaszcza proteazy o pH od 4 do 9,5, proteazy o masie czą steczkowej 25-95 kD, ksylanazy o optymalnym pH od 4,0 do 9,5, ksylanazy o masie cząsteczkowej od 25 do 65 kD, endoglukanazy o zakresie pH od 3,5 do 6,5, endoglukanazy o masie cząsteczkowej 25-55 kDa, β-glukozydazy, α,β-galaktozydazy o pH od 4 do 4,5, β-glukozydazy, α,β-galaktozydazy o masie cząsteczkowej 45-50 kDa, cellobiohydrolazy o pH 4-5, cellobiohydrolazy o masie cząsteczkowej 45-75 kD, np. o masie cząsteczkowej 55 kDa i pH 4,4, poligalakturonasy o zakresie pH 4,0-5,0, poligalakturonazy o masie cząsteczkowej 60-70 kDa, np. 65 kDa, esterazy o zakresie pH 4-5 i esterazy o masie cząsteczkowej 95-105 kDa o wyżej opisanych cechach stabilności i aktywności. Podane powyżej masy cząsteczkowe są masami oznaczonymi metodą SDS-PAGE. Nie-rekombinantowy, czyli występujący w stanie naturalnym enzym jest enzymem innym niż celulaza ujawniona w publikacji zgłoszenia międzynarodowego WO 98/15633. Wynalazkiem są również objęte enzymy wykazujące połączone cechy odpowiednich wartości pH i mas cząsteczkowych.

Wynalazek dotyczy również zwiększonego wytwarzania, (nadprodukcji), nie-białkowych produktów wytwarzanych przez zmutowane (rekombinantowe) szczepy według wynalazku. Do takich produktów nie-białkowych należą metabolity pierwszego rzędu, takie jak kwasy organiczne, aminokwasy i metabolity drugiego rzędu, takie jak antybiotyki, np. penicyliny i cefalosporyny oraz inne związki lecznicze. Produkty te są wytwarzane w wyniku połączeń szlaków biochemicznych, w których są zaangażowane różne, będące przedmiotem zainteresowania geny grzybowe. W stanie techniki są znane grzybowe metabolity pierwszego i drugiego rządu i procesy wytwarzania tych metabolitów w organizmach grzybów. Przykłady produkcji metabolitów pierwszego rzędu są podane przez Mattey'a M. w pracy: „The Production of Organic Acids (produkcja kwasów organicznych), Current Reviews in Biotechnology 12: 87-132 (1992). Przykłady produkcji metabolitów drugiego rzędu zostały opisane przez Panelva'ę i wsp. w pracy: „The Optimization of Penicillin Biosynthesis in Fungi” (Optymalizacja biosyntezy penicyliny w grzybach), Trends in Biotechnology 16: 483-489 (1998).

P r z y k ł a d y

Przykłady transformacji z porównaniem genów Chrysosporium, Trichoderma i Tolypocladium.

Dwa nie transformowane szczepy Chrysosporium C1 i jeden szczep referencyjny, Trichoderma reesei, testowano na dwu pożywkach (Gs, pH 6,8 i agar Pridham'a, PA, pH 6,8). W celu zbadania poziomu oporności na antybiotyki, zebrano zarodniki z płytek PDA z hodowlą 7-dniową. Płytki selekcyjne inkubowano w temperaturze 32°C i zliczano kolonie po 2, 4 i 5 dniach. Oznaczono, że szczepy C-1, NG7C-19 i UV18-25 wyraźnie wykazywały niski wyjściowy poziom oporności zarówno na fleomycynę jak i higromycynę. Poziom ten jest porównywalny z tym, jaki daje często stosowany laboratoryjny szczep referencyjny z T. reesei. Istnieje zatem wyraźna przesłanka, że te dwa standardowe grzybowe markery selekcyjne mogą być korzystnie użyte w szczepach Chrysosporium. Nie powinno być trudności z innymi standardowymi grzybowymi markerami selekcyjnymi.

Selekcję w oparciu o cechę oporności na fleomycynę (Shble) transformowanych szczepów Chrysosporium z powodzeniem prowadzono przy stężeniu 50 μg/ml. Ten poziom selekcji przyjęto również dla T. reesei, przez co wykazano, że w szczepach Chrysosporium można łatwo uzyskać zróżnicowaną selekcję. Te same uwagi mają zastosowanie do transformowanych szczepów z cechą oporności na higromycynę na poziomie 150 μg/ml.

Wobec Chrysosporium zastosowano technikę transformowania protoplastów, opartą na najczęściej stosowanej technologii transformacji grzybów. Wszystkie zarodniki z płytki PDA o średnicy 90 mm zebrano do 8 ml pożywki IC1, przeniesiono do wstrząsanej kolby zawierającej 50 ml pożywki IC1 i prowadzono inkubację w czasie 15 godzin w temperaturze 35°C z wstrząsaniem z szybkością 200 obrotów/minutę. Następnie hodowlę odwirowano, peletkę przemyto w roztworze MnP, z powrotem rozprowadzono w 10 ml roztworu MnP i 10 mg/ml enzymu Caylase C3 i prowadzono inkubację przez 30 minut w temperaturze 35°C, z mieszaniem (150 obrotów/minutę).

Roztwór przefiltrowano i filtrat poddano wirowaniu przez 10 minut z szybkością 3500 obrotów/minutę. Peletkę przemyto ilością 10 ml roztworu MnPCa²⁺. Całość wirowano przez 10 minut w temperaturze 25°C i następnie dodano 50 μl zimnego MPC. Mieszaninę trzymano na lodzie przez 30 minut, po czym dodano 2,5 ml PMC. Po 15 minutach utrzymywania w temperaturze pokojowej, 500 μl tak traktowanych protoplastów domieszano do 3 ml odczynnika MnR Soft i natychmiast posiano na płytkę MnR zawierającą fleomycynę albo higromycynę jako środek selekcyjny. Po inkubacji przez

PL 207 374 B1 dni w temperaturze 30°C analizowano transformanty (klony stawały się widoczne po 48 godzinach). Wydajność transformacji oznaczano z użyciem 10 ug plazmidu referencyjnego pAN8-1¹⁹. Wyniki doświadczenia są podane w poniższej tabeli 1.

T a b e l a 1. Wydajność transformacji (z użyciem 10 ug plazmidu referencyjnego, pAN8-1)

	T. reesei	NG7C-19	UV18-25
Żywotność	10⁶/200 μ\|	5 x 10⁶/200 μ\|	5 x 10⁶/200 μ!
T ransformantów w 200 μ!	2500	10⁴	10⁴
Transformantów na 10⁶ żywych komórek	2500	2000	2000

Żywotność transformantów Chrysosporium jest lepsza niż szczepów Trichoderma. Podatność na transformację tych szczepów jest porównywalna, a nawet ilość transformantów otrzymanych w jednym doświadczeniu była 4-krotnie wyższa dla Chrysosporium niż dla T. reesei. Tak więc, układ transformacyjny Chrysosporium nie tylko dorównuje powszechnie stosowanemu układowi T. reesei ale nawet go przewyższa. Ulepszenie to może się okazać szczególnie użyteczne dla wektorów, które dają niższą wydajność transformacji niż pAN8-1. Przykładami takich mniej wydajnych wektorów transformacyjnych są protein wektory dla białek nośnikowych używane do produkcji białek nie-grzybowych, które z zasady dają 10-krotnie mniej transformantów.

Skonstruowano wiele innych wektorów transformacyjnych i ekspresyjnych z homologicznymi sekwencjami kodującymi białko z Chrysosporium oraz z heterologicznymi sekwencjami kodującymi białko do użycia w doświadczeniach nad transformacją Chrysosporium.

Przykłady układów ekspresyjnych obejmują fragment promotora ksylanazy Xyl1 z Chrysosporium przyłączony do sekwencji sygnałowej ksylanazy w zgodnej ramce odczytu z otwartą ramką odczytu genu ksylanazy i następującą po niej sekwencją terminatorową ksylanazy. Selekcji transformantów dokonuje się przez prowadzenie wspólnej transformacji z wektorem selekcyjnym.

Innym przykładem jest promotor cellobiohydrolazy z Chrysosporium lucknowense związany z sekwencją sygnałową endoglukanazy 3 z Penicyllium w zgodnej fazie z otwartą ramką odczytu genu endoglukanazy z Penicillium i następującą po niej sekwencją terminatorową cellobiohydrolazy z Chrysosporium. Poza tym w wektorze znajduje się druga kaseta ekspresyjna z markerem selekcyjnym, np. genem acetamidazy S (genem AmdS).

Dalszy przykład stanowi promotor dehydrogenazy-1 3-fosforanu aldehydu glicerynowego z Chrysosporium związany z sekwencją sygnałową glukoamylazy z Aspergillus niger i otwartą ramką odczytu genu glukoamylazy połączoną z otwartą ramką odczytu genu dla ludzkiej interleukiny IL-6. Poza tym w wektorze znajduje się druga kaseta ekspresyjna z markerem selekcyjnym, np. z genem AmdS.

Jeszcze innym przykładem jest konstrukcja promotora dehydrogenazy A 3-fosforanu aldehydu glicerynowego z Aspergillus nidulans przyłączonego do otwartej ramki odczytu genu dla endoglukanazy 5, z następującą po nich sekwencją terminatorową Aspergillus nidulans.

Przykłady heterologicznej i homologicznej ekspresji transformantów Chrysosporium

Szczepy C1 (NG7C-19 i/lub UV18-25) testowano na zdolność wydzielania różnych białek heterologicznych: białka bakteryjnego (białka oporności na fleomycynę ze Streptoalloteichus hindustanus, Sh ble), białka grzybowego (ksylanazy II z Trichoderma reesei, XYN2) i białka ludzkiego (ludzkiego lizozymu, HLZ). Sekrecja ksylanazy II z Trichoderma reesei (XYN2) w szczepie C1

C1, szczep UV18-25 transformowano plazmidami pUT1064 i pUT1065.

Plazmid pUT1064 posiadał dwie następujące grzybowe kasety ekspresyjne:

Pierwsza kaseta umożliwiająca selekcję transformantów opornych na fleomycynę zawierała:

- promotor genu 1 (cpc-1) kontrolującego szlak sieciowania cross-pathway) z Neurospora crassa¹⁴;

- gen oporności na fleomycynę (Sh ble⁴) ze Streptoalloteichus hindustanus;

- terminator syntazy tryptofanowej (trpC) z Aspergillus nidulans⁵);

Drugą kasetą była kaseta wytwarzania ksylanazy zawierająca:

- promotor cbh1 ze szczepu T. reesei TR2¹⁵),

- gen xyn2 ze szczepu T. reesei TR2 (w tym sekwencję sygnałową)¹⁶,

- terminator cbh1 ze szczepu T. reesei TR2¹⁵).

Ten wektor również zawierał źródło replikacji z E. coli z plazmidu pUC19⁶). Szczegółowa mapa tego plazmidu jest przedstawiona na fig. 1.

Plazmid pUT1065 prezentował grzybową kasetę ekspresyjną zawierającą:

PL 207 374 B1

- promotor genu dehydrogenazy 3-fosforanu aldehydu glicerynowego (gpdA) z A. nidulans²⁾,

- syntetyczną sekwencję sygnałową genu cellobiohydrolazy I (cbhl) z T. reesei,

- gen oporności na fleomycynę Sh ble⁴) z S. hindustanus użyty jako gen białka nośnikowego¹⁰⁾,

- peptyd łączący (SGERK) tworzący KEX2-podobne miejsce rozszczepiane przez proteazę¹⁾,

- gen TR2xyn2 z T. reesei (bez sekwencji sygnałowej)¹⁶⁾,

- terminator genu syntazy tryptofanowej (trpC) z A. nidulans⁵⁾.

Wektor ten posiadał również gen beta-laktamazy (bla) i źródło replikacji E. coli z plazmidu pUC18⁶). Szczegółowa mapa tego plazmidu jest przedstawiona na fig. 2.

Protoplasty C1 transformowano plazmidem pUT1064 albo plazmidem pUT1065, postępując w sposób taki sam, jaki opisano w powyższym przykładzie. Białko fuzyjne w plazmidzie pUT1065 (Sh ble :: XYN2) ma funkcję w odniesieniu do oporności na fleomycynę, co pozwala na łatwą selekcję transformantów C1. Poza tym, poziom oporności na fleomycynę z grubsza koreluje z poziomem ekspresji genu syn2. W plazmidzie pUT1064, gen syn2 sklonowane z jego własną sekwencją sygnałową.

Wytwarzanie ksylanazy przez transformanty C1 (klony oporne na fleomycynę) analizowano wykonując próbę na aktywność ksylanazy w sposób następujący: pierwszorzędowe transformanty posiano przez nakłuwanie na płytki z GS+ fleomycyna (5 μg/ml) (weryfikacja oporności) i na płytki XYLAN (detekcja aktywności ksylanazy przez wizualizację strefy przejaśnienia¹⁷). Wzrost na płytkach prowadzono przez 5 dni w temperaturze 32°C. Każdy zwalidowany klon subklonowano na płytki XYLAN. Stosowano dwa subklony na jednego transformanta do posiewu na płytki PDA w celu uzyskania zarodników potrzebnych do zapoczątkowania hodowli ciekłej. Ciekłe kultury w pożywce IC1 + 5 g/litr ftalanu potasu rosły przez 5 dni w temperaturze 27°C (180 wstrząsów/minutę). Następnie, hodowle odwirowano (5000 g, 10 minut). W tych próbkach oznaczano aktywność ksylanazy techniką DNS opisaną przez Miller'a i wsp.¹⁸⁾.

T a b e l a 2. Poziomy wytwarzania aktywnego XYN2 w C1 (najlepsi producenci)

	Stężenie aktywnej ksylanazy II w pożywce hodowli	Aktywność swoista ksylanazy II w pożywce hodowli
Nie transformowany UV18-25	3,9 jednostek/ml	3,8 jednostek/mg całkowitego białka
UV18-25::1064 klon 7-1	4,7 jednostek/ml	4,7 jednostek/mg całkowitego białka
UV18-25::1064 klon 7-2	4,4 jednostek/ml	4,3 jednostek/mg całkowitego białka
UV18-25::1065 klon 1-1	29,7 jednostek/ml	25,6 jednostek/mg całkowitego białka
UV18-25::1065 klon 1-2	30,8 jednostek/ml	39,4 jednostek/mg całkowitego białka

Powyższe dane świadczą o tym, że:

1) potwierdzone zostały punkty 1 do 4 z przykładu 2,

2) C1 może być użyty jako gospodarz do sekrecji heterologicznego białka grzybowego. Załącznik do przykładów: Pożywki

Pożywki do transformacji:

Podstawa Mandelsa: KH2PO4 (NH4)2SO4 MgSO,:7H-O CaCl₂ Pierwiastki śladowe	Pożywka MnP: 2,0 g/litr 1,4 g/litr 0,3 g/litr 0,3 g/litr 1,0 ml/litr	Podstawa Mandelsa oraz: Pepton 1 g/litr MES 2 g/litr Sacharoza 100 g/litr Doprowadź do pH 5
Pożywka MnR	MnP Ca²⁺:
Mn⁺ sacharoza	130 g/litr	Pożywka Mn+CaCl₂ZH₂O 50 mM
Wyciąg drożdżowy	2,5 g/litr	Doprowad ź do pH 6,5
Glukoza	2,5 g/litr
Agar	15 g/litr
Pożywka MnR Soft:	MnR i tylko 7,5 g/litr agaru
Pożywka MPC:
CaCl₂	50 mM	pH 5,8

PL 207 374 B1

MOPS PEG Do selekcjonowania i hodowli Pożywka GS: Glukoza Wyciąg z soi Biosoyase Agar	10 mM 40%
10 g/litr 5 g/litr 15 g/litr	[Merieux] pH powinno wynosić 6,8
Pożywka PDA: Agar ziemniaczanoGlukozowy	39 g/litr	[Difco] pH powinno wynosić 5,5
Pożywka MPG: Podstawa Mandelsa + Ftalan potasu Glukoza Wyciąg drożdżowy	5 g/litr 30 g/litr 5 g/litr

Do selekcjonowania transformantów użyto pożywki regeneracyjne (MnR) wzbogacone ilością μg/ml fleomycyny albo 100-150 μg/ml higromycyny. Pożywkę GS z dodatkiem 5 μg/ml fleomycyny użyto do potwierdzenia oporności na antybiotyk. PDA jest kompletną pożywką stosowaną do szybkiego wzrostu i dobrej sporulacji. Ciekłe pożywki zaszczepiano zawiesiną zarodników w rozcieńczeniu 1/20 (wszystkie zarodniki z jednej płytki PDA o średnicy 90 mm w 5 ml 0,1% Tween'u). Wzrost tych hodowli prowadzono w temperaturze 27°C we wstrząsanych kolbach (200 obrotów/minutę).

Izolowanie i charakteryzacja genów C1 i sekwencji ekspresji genów z CBH1, XYL1 i GPD Konstruowanie biblioteki genu, BlueSTAR z UV18-25

Chromosomalny DNA z UV18-25 częściowo trawiono enzymem Sau3A i fragmenty o długości 12-15 kilozasad izolowano i ligowano w miejscu BamH1 w wektorze do klonowania BlueSTAR. Upakowanie ilością 20% mieszaniny ligacyjnej dało bibliotekę genów zawierającą 4,6 x 10⁴ niezależnych klonów. Tę bibliotekę powielono i przechowywano w temperaturze 4°C i -80°C. Pozostałą część mieszaniny ligacyjnej również przechowywano w temperaturze 4°C.

Przesiewanie biblioteki genów UV18-25 w celu izolowania genów cbh1, xyl1 i gpd1

W celu wyizolowania różnych genów, przeprowadzono w dwóch kopiach hybrydyzację ogółem ± 7,5 x 10⁴ indywidualnych fagów BlueSTAR na jedną sondę. Hybrydyzację prowadzono z fragmentami PCR genów cbh1 i xyl1 (jak opisano w publikacji WO 00/20555) w homologicznych warunkach (65°C; 0,2 x SSC) i genu gpd1 z A. niger w warunkach heterologicznych (53°C; 0,5 x SSC). Ilość sygnałów pozytywnych jest podana w tabeli 3. Klony pozytywne powtórnie przesiewano i do dalszych doświadczeń, dla każdego klonu użyto dwa indywidualne fagi. DNA różnych klonów analizowano metodą analizy restrykcyjnej, oznaczając ilość różnych klonów wyizolowanych z każdego genu (wyniki są podane w tabeli 3).

Ponieważ dla każdego z trzech genów wyizolowano 4-6 różnych klonów, uznajemy, że pierwszorzędowa biblioteka genu (± 4-5 x 10⁴ klonów) reprezentuje około 5 x genom UV18-25. Na podstawie tego wyniku wnioskujemy, że całkowity genom UV18-25 jest reprezentowany przez 9 x 10³ klonów. W oparciu o średnią wielkość genomowego insertu wynoszącą 13 kilozasad, mogłoby to wskazywać na wielkość genomu ± 120 Megazasad (Mb), co stanowi 3-krotną wielkość genomu Aspergillus.

Reakcje PCR z określonymi primerami dla genu obecnego na plazmidzie (w oparciu o uprzednie oznaczenie sekwencji wyizolowanych fragmentów PCR) i z primerami T7 i T3 obecnymi w polilinkerze plazmidu pBlueSTAR pozwoliły na ustalenie lokalizacji genów w wielu klonach. Dla każdego genu, użyto plazmidu do oznaczenia sekwencji tego genu.

Gen	Pozytywny w pierwszym skriningu	Pozytywny w powtórnym skriningu	Różne klony	Klony użyte do sekwencjonowania
cbh1	8	7	4	pCBH7
xyl1	9	6	5	pXyl5
gpd1	12	12	6	pGPD4

PL 207 374 B1

Tabela 3. Skrining 7 x 10⁴ fagów z biblioteki genów UV18-25 wobec fragmentów PCR UV18-25 dla genu cbh1 i genu xyl1 (warunki homologiczne) i wobec genu gpdA z A. niger (warunki heterologiczne). Do oznaczenia ilości różnych klonów użyto metody izolacji DNA i analizę restrykcyjną.

Analiza sekwencji sklonowanych genów

Dla genów cbh1, xyl1 i gpd1, wyniki oznaczenia sekwencji są przedstawione odpowiednio na sekwencjach SEQ ID Nr. 1, 3 i 5. Również, na sekwencjach SEQ ID 2, 4 i 6 podane są wyprowadzone sekwencje aminokwasowe białek. Niektóre własności tych białek są podane w tabeli 4. Należy zaznaczyć, że pozycja początku translacji i pozycje intronów są wyznaczone w oparciu o homologię z genami z tej samej rodziny (czyli jest to genetyka teoretyczna).

CBH1

Na podstawie sekwencji aminokwasowych CBH1 wyliczyliśmy, że białko to ma wielkość około 63 kD i że domena wiążąca celulozę (CBD) znajduje się w C-końcowej części tego białka. Jest interesujące, że nie znaleziono dowodów na obecność CBD w wyizolowanym głównym białku o wielkości 55 kD. Jednakże, obecność wyizolowanych peptydów z tego głównego białka o wielkości 55 kD w kodowanym białku CBH1 (SEQ ID nr. 1 i 2) jest potwierdzeniem, że białko o wielkości 55 kD jest kodowane przez sklonowany gen. Możliwym wytłumaczeniem tych wyników może być założenie, że białko o wielkości 55 kD jest skróconą wersją białka CBH1, w której nie występuje CBD.

Cellobiohydrolaza CBH1 wykazuje aktywność wobec MUF-cellobiozydu, MUF-laktozydu, FP i avicelu oraz wobec β-glukozydu p-nitrofenylowego, cellobiozy i laktozydu p-nitrofenylowego. Jej aktywność wobec MUF-cellobiozydu jest hamowana przez cellobiozę ze stałą hamowania wynoszącą 0,4 mM. Stała Michaelisa wobec MUF cellobiozydu wynosi 0,14 mM, wobec MUF-laktozydu 4 mM i wobec CMC 3,6 g/litr. Optymalna wartość pH zawiera się w zakresie od 4,5 do 7. 50% Maksymalnej aktywności wobec CMC i 80% aktywności wobec RBB-CMC uzyskuje się przy pH 8. 70-80% Aktywności w zakresie pH 5-8 utrzymuje się w czasie 25 godzin inkubacji. Optymalna temperatura wynosi 60-70°C. CBH1 należy do rodziny 7 cellobiohydrolaz. Odpowiedni promotor CBH, będący korzystną realizacją wynalazku jest przedstawiony na SEQ ID Nr: 1.

Xyl1

Na podstawie sekwencji aminokwasowych Xyl1 wnioskujemy, że również w tym przypadku występuje CBD i w tym białku jest ona usytuowana w N-końcu (jest przyłączona bezpośrednio albo w odległości poniżej 5 aminokwasów od sekwencji sygnałowej). W literaturze jest opisanych tylko kilka ksylanaz z aktywnością CBD (Fusarium oxysporum, Humicola grisea i Neocallimastix patriciarum). Wielkość białka Xyl1 szacuje się na 43 kD. Z tego białka pochodzi kilka peptydów wyizolowanych z ksylanazy o wielkości 30 kD (SEQ ID Nr: 3 i 4). Kilku wyizolowanych peptydów nie można było znaleźć w kodowanej sekwencji. Mogłoby to wskazywać na fakt, że w UV18-25 występują alternatywne białka ksylanazy. W poprzednich analizach nie znaleziono dowodu na obecność CBD w tym białku o wielkości 30 kD. Na podstawie powyższych wyników wysunęliśmy również hipotezę, że CBD tego białka ulega rozszczepieniu przez proteolizę. Ta hipoteza będzie analizowana dalej (przez oznaczenie aktywności, sekwencji N-końcowych i wielkości różnych białek w różnych szczepach C1: w szczepie C1 typu dzikiego, w NG7C, w UV13-6, w UV18-25 i w mutantach proteazy szczepu UV18-25). Również bardziej szczegółowo jest analizowany wpływ obecności lub nieobecności CBD na aktywności enzymatyczne. Można rozważać nadekspresję genów o pełnej długości w różnych gospodarzach C1.

Obecność domeny wiążącej celulozę (CBD) jest szczególną cechą tego enzymu. Jedynym innym znanym enzymem glikolitycznym (ksylanaza) z rodziny 10 posiadającym N-terminalną CBD jest XylF z Fusarium oxysporum. CBD białka Xyl1 z Chrysosporium lucknowense ma sekwencję: WGQCG GQGWT GPTTC VSGAV COFVN DWYSQ CV (aminokwasy 22-53 z SEQ ID Nr: 4). Ta sekwencja nie jest zgodna z sekwencją najwyższej zgodności (consensus) CBD opisaną w opisie patentowym US 5.763.254 (firmy Novo).

Tą sekwencją consensus według opisu patentowego US 5.763.254 jest sekwencja: W/Y-G/A-QC-G G-Q/I/N-G/N-W/F/Y-S/T/N/Q G-P/A/C-T/R/K-T/C/N-C X-X-G/P-S/T/F/L/A/- -T/K C/V/T/R/E/KK/Q/A-Q/I-N Q/D/A-W/F/Y-Y-Y/S/H/A-Q C-L/I/Q/V/T, w której W/Y oznacza albo W albo Y i tak dalej, X oznacza dowolny aminokwas a - oznacza nieobecność. W Xyl1 występują cztery różnice w stosunku do najbardziej zdegenerowanej sekwencji consensus. Są one podkreślone w powyższej sekwencji

7. Wynalazek dotyczy zatem ksylanaz posiadających N-terminalną CBD różniącą się od tej consensus CBD i innych niż ksylanaza z Fusarium oxysporum. Konkretniej, ksylanaza według wynalazku zawiera CBD posiadającą co najmniej 55%, zwłaszcza co najmniej 65%, korzystnie co najmniej 75% identyczności sekwencji z powyższą sekwencją 7. Korzystnie, ta CBD zawiera jeden z aminokwasów Phe, Tyr

Ksy|anaza ta nie posiada aktywności ce||obiazy MUF, a zatem jest prawdziwą ksy|anazą. Wykazuje ona wysoką aktywność w szerokim zakresie pH, od 5 do 8, zachowując 65% aktywności maksyma|nej przy pH 9-10. Na|eży do rodziny ksy|anaz F. Odpowiedni promotor d|a ksy|anazy, będący korzystną rea|izacją wyna|azku, jest przedstawiony na SEQ ID Nr: 3. Stała Michae|isa wzg|ędem ksy|anu z brzozy wynosi 4,2 g/| d|a ksy|anazy o masie 30 kD. D|a tej ksy|anazy optyma|na temperatura jest wysoka, wynosi ona 70°C.

Gpd1

Sekwencja DNA C-termina|nej części genu gpd1 nie jest oznaczona. Sekwencje promotorowe d|a tego genu stanowią korzystne rozwiązanie według wyna|azku, są one przedstawione na SEQ ID Nr. 5.

Poziom ekspresji czterech genów Chrysosporium badano metodą ana|izy typu Northern. Prowadzono wzrost różnych szczepów C. |ucknowense na pożywce wzbogaconej, zawierającej produkt „pharmedia” z ce|u|ozą i |aktozą (pożywka 1) a|bo na pożywce wzbogaconej zawierającej produkt „pharmedia” i g|ukozę (pożywka 2), w temperaturze 33°C. Po 48 godzinach grzybnię zbierano i izo|owano RNA. Ten RNA hybrydyzowano z 4 różnymi sondami: EG5, EG6, Xy|1 i CBH. Po ekspozycji, zbierano Northern b|oty i hybrydyzowano je ponownie z sondą na rybosoma|ny L3 jako kontro|ą w ce|u oznaczenia i|ości mRNA na b|ocie. Większość szczepów wykazała bardzo si|ną odpowiedź na CBH i si|ną odpowiedź na Xy|1 w pożywce 1. W pożywce 2, połowa szczepów wykazała si|ną odpowiedź na wszystkie geny a druga połowa wykazała słabą odpowiedź. Na podstawie tych danych wyprowadzono rząd siły ekspresji jako CBH > Xy|1 > EG5 > EG6.

Białko Xy|1 z C. |ucknowense jest w 67% identyczne (w 72% homo|ogiczne) z jego najb|iższym homo|ogiem w banku genów DATABASE (tabe|a 4). Godna uwagi jest si|na homo|ogia białka CBH1 z pokrewnym jej homo|ogiem z Humico|a grisea (74% identyczności i 82% homo|ogii). Zwraca się uwagę również na to, że we wszystkich przypadkach najb|iższe homo|ogi pochodzą z Fusarium, Humico|a a|bo z innych grzybów Pyrenomycetous (Sordariamycetous) (tabe|a 4), podczas gdy Chrysosporium na|eży do grzybów P|ectomycetous (Eurotiomycetous) zgodnie z bazą danych NCBI (tabe|a 4). Wyna|azek obejmuje więc enzymy g|ukano|ityczne, zwłaszcza ce||obiohydro|azy i ksy|anazy zawierające CBD, pochodzące z grzybów P|ectomycetous.

	Rodzina g\|ukozydaz	Izo\|owana z C1	I\|ość aminokwasów	Introny	uwagi	Odnośne sekwencje (% identyczności/% homo\|ogii)
CBH1	7	70 kD 55 kD	526 (63 kD)	1	CBD	Humico\|a grisea (74/82) (CBH1: P15828) Fusarium oxysporum (50/68) (CBH: P46238) Neurospora crassa (60/69) (CBH1: P38676)
XYL1	10	30 kD	333 (43 kD)	3	CBD	Fusarium oxysporum (67/72) (Xy\|F: P46239) Penici\|\|ium simp\|issicum (63/72) (Xy\|F: P56588) Aspergi\|\|us acu\|eatus (61/70) (Xy\|F: O59859)
GPD1			Nie całkowita	2 + ?		Podospora anserina (85/89) GPD: P32637) Neurospora crassa 80/86) GPD: U67457) Cryphonectria parasitica 80/85) (GPD: P19089)

T a b e | a 4. Dane struktura|ne i porównawcze CBH1, Xy|1 i GPD1 według wyna|azku.

PL 207 374 B1

Opis figur

Fig. 1 przedstawia mapę plazmidu pUT1064

Fig. 2 przedstawia mapę plazmidu pUT1065.

Piśmiennictwo (zawartość poniższych pozycji jest włączona do niniejszego opisu)

1. Calmels T. P., Martin H. i Tiraby G., Proteolytic events in the processing of secreted proteins in fungi. J. Biotechnol. 17(1): 51-66 (1991);

2. Punt P. J., Dingemanse M. A., Jacobs-Meijsing B. J., Pouwels P. H. i van den Hondel C. A.: Isolation and characterization of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene of Aspergillus nidulans. Gene 69(1): 49-57 (1988);

3. Shoemaker S., Schweickart V., Ladner M., Gelfand D., Kwok S., Myambo K. i Innis M.: Molecular cloning of exocellobiohydrolase I derived from Trichoderma reesei strain L27. Bio/Technology, Oct. 691-696 (1983);

4. Drocourt D., Calmels T., Reynes J. P., Baron M. i Tiraby G.: Cassettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin resistance. Nucleic Acids Res. 18(13): 4009 (1990);

5. Mullaney E. J., Hamer J. E., Roberti K. A., Yelton M. M. i Timberlake W. E.: Primary structure of the trpC gene from Aspergillus nidulans. Mol. Gen. Genet. 199(1): 37-45 (1985);

6. Yanisch-Perron C, Vieira J. i Messing J.: Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33: 103-119 (1987);

7. Durand H., Baron M., Calmels T. i Tiraby G.: Classical and molecular genetics applied to Trichoderma reesei for the selection of improved cellulolytic industrial strains. W publikacji Biochemistry and genetics of cellulose degradation, wyd. J. P. Aubert, Academic Press, str. 135-151 (1988).

8. Lowry O. H., Rosebrought N. J., Farr A. L. i Randall R. J.: Protein measurements with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951);

9. Parriche M., Bousson J. C., Baron M. i Tiraby G.: Development of heterologous protein secretion systems in filamentous fungi. III Europejska konferencja na temat genetyki grzybów. 1996, Mϋnster, Niemcy;

10. Baron M., Tiraby G., Calmels T., Parriche M. i Durand H.: Efficient secretion of human lysozyme fused to the Sh ble phleomycin resistance protein by the fungus Tolypocladium geodes. J. Biotechnol. 24(3): 253-266 (1992);

11. Jeenes D. J., Marczinke B., MacKenzie D. A. i Archer D. B.: A truncated glucoamylase gene fusion for heterologous protein secretion from Aspergillus niger. FEMS Microbiol. Lett. 107(2-3), str. 267-271 (1993);

12. Stone P. J., Makoff A. J., Parish J. H. i Radford A.: Cloning and sequence-analysis of the glucoamylase gene of neurospora crassa. Current Genetics 24(3): 205-211 (1993);

13. Morsky P,: Turbidimetric determination of lysozyme with Micrococcus lysodeikticus cells: Reexamination of reaction conditions. Analytical Blochem. 128: 77-85 (1983);

14. Paluh J. L., Orbach M. J., Legerton T. L. i Yanofsky C: The cross-pathway control gene of Neurospora crassa, cpc-1, encodes a protein similar to GCN4 of yeast and the DNA-binding domain of the oncogene v-jun encoded protein. Proc. Natl. Acad. Sci USA 85(11): 3728-32 (1988);

15. Nakari T., Onnela M. L., Ilmen M., Nevalainen K. i Penttila M.: Fungal promoters active in the presence of glucose. Publikacja zgłoszenia patentowego międzynarodowego WO 94/04673 firmy Alko.

16. Torronen A., Mach R. L., Messner R., Gonzalez R., Kalkkinen N., Harkki A. i Kubicek C. P.: The two major xylanases from Trichoderma reesei: characterization of both enzymes and genes. Biotechnology (NY) 10(11): 1461-5 (1992);

17. Farkas V,: Novel media for detection of microbial producers of cellulase and xylanase. FEMS Microbiol. Letters 28: 137-140 (1985);

18. Miller G. L.: Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31: 426-428 (1959);

19. Punt P. J., Mattern I. E., van den Hondel C. A. M. J. J.: A vector for Aspergillus transformation conferring phleomycin resistance. Fungal Genetics Newsletter 35: 25-30 (1988).

PL 207 374 B1

SEQ ID Nr. 1

Sekwencja DNA i sekwencja aminokwasowa kompletnego genu z Chrysosporium CBH1 włącznie z sekwencją promotorową i terminatorową. Sekwencja promotorową (1-1779), sekwencja terminatorowa (3427-4451) i sekwencja intronu (2179-2256) są podane małymi literami.

aaggtatccgatttggggaacgtcgatgaaagtattgcaaaagtgacgagagttgcgcaa 60 ctaactcgctgccgaagaagctgcggaagaaagagaacaccgaaagtggaataacgttac 120 ggargtcctgacctcaaagrtgaaaccagcccttcctgctctatttgggaaagcggcttg 180 cocttgaatgcgctgcactgtggcacgactaccagtgatcgggaggagcaaactaccctg 240 gtccgttcctcggtggggcggcactaggcceaacttagggtgatcggaggtcgatgccgc 300 ggtcctcgttggtctgggcccttctcatttcccggtttgcaccccccgtLgcacctgctg 360 atcgcccgccaacgccgatgaggttgcgcccagaccgacaatcaccgcggctgcattccc 420 aagtatattgaagatggcaccaggtacccggttttgcgtcccagtcgtttggtgccaaat 480 tcgggagtttttgagcctcaagatctggggaaatcgacctcaacttccatacaagttaaa 540 gtcgcacacacggcgagttccacgaagagacacatttttttctgaaggcctotctccccg 600 cacatcagaaaccaccaaataccaagactgcagaagccggggtaagtgggccaccgggac 660 tacactaaaatgcggggagaagcgagatccgttgogaagggaagggatggggtgtgctgc 720 ggctttctccgctctcgtgcgccttttgcttgaatctagtgtacaccagggtaggctccg 700 aaggagtatctacggcagcgctgttcgtgctgcgttgagagtcagggcggagacgagcag 840 gcgacaggagcctcgcaccggcacttcggatcgcatttgcgcggagcgtcaaatacgctc 900 ttctgcggtcatcagagagcatcgtgaaccaaggttcttccgcagggcggcctgggcttc 960 gcagagtcgcactcggcggacgccttccgtgtcacccctgataacctggctgccgcgccc 1020 agacccccccaatgaggtgtgtggttgccctcgccgacccttcagcaaccttaatcgctt 1080 ocatcgcacggctccacgtcctcgaacgatgccctcagtccgtgcccggccgtggcaacc 1140 ataacgtgacatcgccgcccagcctactagccgctatcgaccggttaggcttgtcaccgc 1200 agcgcccactctccatcgggcctctactctgatccacctcacccaccgcaagcactagcg 1260 agcctcaccagagtgcaagcgacacgacccgcttggcccttcgtccttgactatctccca 1320 gaccrcttgccatcttgccgacgccgcccccttttttttctcctccccctgccggcaggt 1380 cggtggccccagtcccgagatggcattgctccgttgtccatgacgacccatcattcgatg 1440 gctgactggcacactcgrcttgtttgagcatcgacggcccgcggcccgtcccccacggta 1500 cggaacctcgttgtacagtacctctcgtaatgatacccaacaccggggccgagcgcrggg 1560 agggcggcgttcccgagaagccgggaaggcggctggccggctgacctttgtgacttggcg 1620 atggatgcggccatggagaatgtccgtecgaagcgacgcgacaattagcctggctaccat 1660

PL 207 374 B1 cgarataaattgggtgatccccagctcttgatgggcgtgtcttctgcctggcagccctcg 1740 tcttcagatcaagcaactgtgtgctgatcętcttccgccATGTACGCCAAGTTCGCGACC 1800 Μ Y A K F A T

CTCGCCGCCCTTGTGGCTGGCGCCGCTGCTCAGAACGCCTGCACTCTGACCGCTGAGAAC 1860 LAALVAGAAAQNACTLTAEN

CACCCCTCGCTGACGTGGTCCAAGTGCACGTCTGGCGGCAGCTGCACCAGCGTCCAGGGT 1920 HPSLTWSKCTSGGSCTSVQG

TCCATCACCATCGACGCCAACTGGCGGTGGACTCACCGGACCGATAGCGCCACCAACTGC 1980 S I T I DANW RWTHRTD SATNC

TACGAGGGCAACAAGTGGGATACTTCGTACTGCAGCGATGGTCCTTCTTGCGCCTCCAAG 2040 YEGNKWDTSYCSDGPSCASK

TGCTGCATCGACGGCGCTGACT ACTCGAGCACCTATGGCATCACCACGAGCGGTAACTCC 2100 CCIDGADYSSTYGITTSGNS

CTGAACCTCAAGTTCGTCACCAAGGGCCAGTACTCGACCAACATCGGCTCGCGTACCTAC 2160 LNLKFVTKGQYSTNIGSRTY

CTGATGGAGAGCGACACCAAGTACCAGAgtaagttcctctcgcacccggccgccgggaga 2220 LME5DTKYQM tgatggcgcccagcccgctgacgcgaatgacacaGTGTTCCAGCTCCTCGGCAACGAGTT 2280 FQLLGNEF

CACCTTCGATGTCGACGTCTCCAACCTCGGCTGCGGCCTCAATGGCGCCCTCTACTTCGT 2340 TFDVDVSNLGCGLNGALYFV

GTCCATGGATGCCGATGGTGGCATGTCCAAGTACTCGGGCAACAAGGCAGGTGCCAAGTA 24 00 SMDADGGMSKYSGNKAGAKY

CGGTACCGGCTACTGTGATTCTCAGTGCCCCCGCGACCTCAAGTTCATCAACGGCGAGGC 24 60 GTGYCDSQCPRDLKFINGEA

CAACGTAGAGAACTGGCAGAGCTCGACCAACGATGCCAACGCCGGCACGGGCAAGTACGG 2520 NVENWQSSTNDANAGTGKYG

CAGCTGCTGCTCCGAGATGGACGTCTGGGAGGCCAACAACATGGCCGCCGCCTTCACTCC 2580 SCCSEMDVWEANNMAAAFTP

CCACCCTTGCACCGTGATCGGCCAGTCGCGCTGCGAGGGCGACTCGTGCGGCGGTACCTA 2 64 0 HPCWVIGQSRCEGDSCGGTY

CAGCACCGACCGCTATGCCGGCATCTGCGACCCCGACGGATGCGACTTCAACTCGTACCG 27 00 STDRYAGICDPDGCDFNSYR

CCAGGGCAACAAGACCTTCTACGGCAAGGGCATGACGGTCGACACGACCAAGAAGATCAC 27 60 QGNKTFYGKGMTVDTTKKIT

GGTCGTCACCCAGTTCCTCAAGAACTCGGCCGGCGAGCTCTCCGAGATCAAGCGGTTCTA 2820 VVTQFLKNSAGELSEIKRFY

CGTCCAGAACGGCAAGGTCATCCCCAACTCCGAGTCCACCATCCCGGGCGTCGAGGGCAA 2 8 80 V Q N G Κ V I PNSESTIPGVEGN

CTCCATCACCCAGGACTGGTGCGACCGCCAGAAGGCCGCCTTCGGCGACGTGACCGACTT 2940 SITQDWCDRQKAAFGDVTD?

PL 207 374 B1

NCAGGACAAGGGCGGCATGGTCCAGATGGGCAAGGCCCTCGCGGGGCCCATGGTCCTCGT 3000 QDKGGMVQMGKALAGPMVLV

CATGTCCATCTGGGACGACCACGCCGTCAACATGCTCTGGCTCGACTCCACCTGGCCCAT 3060 msiwddhavnmlwldstwpi

CGACGGCGCCGGCAAGCCGGGCGCCGAGCGCGGTGCCTGCCCCACCACCTCGGGCGTCCC 3120 DGAGKPGAERGACPTTSGVP

CGCTGAGGTCGAGGCCGAGGCCCCCAACTCCAACGTCATCTTCTCCAACATCCGCTTCGG 31Θ 0 AEVEAEAPNSNVIFSNIRFG

CCCCATCGGCTCCACCGTCTCCGGCCTGCCCGACGGCGGCAGCGGCAACCCCAACCCGCC 3240 PIGSTVSG, LPDGGSGNPNPP

CGTCAGCTCGTCCACCCCGGTCCCCTCCTCGTCCACCACATCCTCCGGTTCCTCCGGCCC 3300 VSSSTPVPSSSTTSSGSSGP

GACTGGCGGCACGGGTGTCGCTAAGCACTATGAGCAATGCGGAGGAATCGGGTTCACTGG 3360 TGGTGVAKHYEQCGGI GFTG

CCCTACCCAGTGCGAGAGCCCCTACACTTGCACCAAGCTGAATGACTGGTACTCGCAGTG 342 0 PTQCESPYTCTKLNDWYSQC

CCTGTAAacgaacctctctgaaggaggttctgagacacgcgcgattcctctgtatatagt 3480 L * tttatttttcactctggagtgottcgctccaccagtacataaaccttttutttcacgtaa 3540 caaaatggcttcttttcagaccatgtgaaccatcttgatgccttgacoccttcagttctc 3600 actrtaacgtagttcgcgttagtctgtatgtcccagttgcatgtagttgagataaatacc 3660 cctggaagtgggtctgggcctttgtgggacggagccctctttctgtggtctggagagccc 3720 gctctctaocgcctaccttcttaccacagtacactactcacacattgctgaactgaccca 3780 tcataccgtacrttatcctgttaattcgtggtgctgtcgactattctatttgctcaaatg 3840 gagagcacattcatcggcgcagggatacacggtttatggaccccaagagtgtaaggacta 3900 ttattagtaatattatargcctctaggcgccttaacttcaacaggcgagcactactaatc 3960 aacttttggtagacccaattacaaacgaccatacgtgccggaaattttgggattccgtcc 4020 gctctccccaaccaagctagaagaggcaacgaacagccaatęccggtgctaattaaatta 4080 tatggttcattttttttaaaaaaartttttcttcccattttcctctcgcttttctttttc 4140 gcatcgtagttgatcaaagtccaagtcaagcgagctatttgtgctatagctcggtggcta 4200 taatcagtacagcrcagagaggctgtaaaggtatgataccacagcagtattcgcgctata 4260 agcggcactcctagactaattgttacggtctacagaagtaggtaataaaagcgttaattg 4320 ttctaaatactagaggcacttagagaagctatctaaatatatattgaccctagcttatta 4380 tccctattagtaagtcagttagctctaacctatagatagccaaatgctaraataggtacc 4440 agggttcaaaa 4451

PL 207 374 B1

SEQ ID Nr. 2

Sekwencja aminokwasowa kompletnego białka z Chrysosporium CBH1. Przypuszczalna sekwencja sygnałowa (1-19) jest opisana pismem pochyłym a domena wiążąca celulozę (496-526) jest podana tłustym drukiem z podkreśleniem.

WYAKFATIAA	LVAGAAAQNA	CTLTAENHPS	LTWSKCTSGG	SCTSVQGSIT	50
IDANWRWTHR	TDSATNCYEG	NKWDTSYCSD	GPSCASKCCI	DGADYSSTYG	100
ITTSGNSLNL	KFVTKGQYST	NIGSRTYLME	SDTKYQMFQL	LGNEFTFDVD	150
VSNLGCGŁNG	ALYFVSMDAD	GGMSKYSGNK	AGAKYGTGYC	DSOCPRDLKF	200
INGEANVENW	QSSTNDANAG	TGKYGSCCSE	MDVWEANNMA	AAFTPHPC?V	250
IGOSRCEGDS	CGGTYSTDRY	AGICDPDGCD	FNSYRQGNKT	FYGKGMTVDT	300
TKKITWTQF	LKNSAGELSE	IKRFYVQNGK	VIPNSESTIP	GVEGNSITQD	350
WCDRQKAAFG	DVTD?QDKGG	MVQMGKALAG	PMVLVMSIWD	DHAVNMLWLD	400
STWPIDGAGK	PGAERGACPT	TSGVPAEVEA	EAPNSNVIFS	NIRFGPIGST	450
VSGLPDGGSG	NPNPPVSSST	PVPSSSTTSS	GSSGPTGGTG	VAKHYEQCGG	500
IGPTGPTOCE	SPYTCTKLND	WYSOCL *	526

SEQ ID Nr. 3

Sekwencja DNA kompletnego genu Chrysosporium Xyll włącznie z sekwencjami promotorową i terminatorową. Sekwencja promotorowa (1-969), sekwencja terminatorowa (2428-3030 (3028)) i sekwencje intronowe (1043-1116, 1181-1332 (1331), 1596 (1595)-1674 (1672)) są podane małymi literami.

tcatcaacttggcgtttggatgtactaatattacacgtcgtrtgcnnagcggagLctgtg 60 tcacctccgtggggtcgggtgctccagacgacgcttcgggccgatcctgaatzcgggaag 120 gaaacggttcggctaatcaggtcctctaaaatataacgaagcactacagagggagrtcct 180 cagaggacatcgtatcaaccgaagaacgaagcgccgaaaggactgatcaaaacaggagza 240 ggtagggatgtgtgagtacctaaactttccatacczgacataaaatcatcatggtgcttc 300 agacctgtttgatgaggcgagggcggaggccgcattgtattttcgtcccttcczzctttt 360 tgttagtatatcznagggttccatcgtaaaatggaatcttccagctctactagtaaztag 420 aacaatagttctgatgtcgtgcgccaagctctttcagatgactgccaaaaacccatcatg 480 ggtatggacaaaagcagtaatcggagtcacaacgccgcatzttccttcatgatttccgtc 540 aaccggagaggtcggaggaggaccccggccacazgtgatgcgaagaagtacacggcgoca 600 tggttctaacctcttatagtctgaaaatgcgcggaggccagcgaagccaagcccgggaac 660 cgtLGttgtcatggztrcagtattgtttcgctaaacaztctatccgattcgcgataggtg 720 cggctgccaccgaaggrrgratccttaaag.cttzggtaagtacggagtacggaaatggaa 780

PL 207 374 B1 acgcgccgcagtcccggttccatcggtatcctccgcatgctccgccaaaaaaagaaaacc 840 cgggtatgtttacaaaggatataagagacaagatgcaccacccgcccccttcccatctgc 900 cggttgcccacgtcgccgtcgactgcttgtccgcttcctacctgcagcctctttcagaga 960 ccatcaaacATGCGTACTCTTACGTTCGTGCTGGCAGCCGCCCCGGTGGCTGTGCTTGCC 1020 MRTLTFVLAAAPVAVLA

CAATCTCCTCTGTGGGGCCAGTgtatgtaattgccttactcggaaaatagtcaccactag 1080 QSPLWGQC agggacttaagctcactacttcctgtttcacaatagGCGGCGGTCAAGGCTGGACAGGTC 1140 G G Q G W T G

CCACGACCTGCGTTTCtGGCGCAGTATGCCAATTCGTCAAgtcagtaaccgcttttatt 1200 PTTCVSGAVCQFVN tctttzctctccgggattacgatrtcgttttgcacttagcttggttctgcatttcattgt 1260 tgtattgttctctttttgtgtgtgagaggttttatraccacctaaaggccatttgctaac 1320 aaatctccccagTGACTGGTACTCCCAATGCGTGCCCGGATCGAGCAACCCTCCTACGGG 1380 DWYSQCVPGSSNPPTG

CACCACCAGCAGCACCACTGGAAGCACCCCGGCTCCTACTGGCGGCGGCGGCAGCGGAAC 1440 TTSSTTGSTPAPTGGGGSGT

CGGCCTCCACGACAAATTCAAGGCCAAGGGCAAGCTCTACTTCGGAACCGAGATCGATCA 1500 GLHDKFKAKGKLYFGTEIDH

CTACCATCTCAACAAC AATGCCTTGACCAACATTGTCAAGAAAGACTTTGGTCAAGTCAC 1560 YHLNNNALTNIVKKDFGQVT

TCACGAGAACAGCTTGAAGTGGGATGCTACTGAGCgtgagrgacctctcctccttctccc 1620 HENSLKWDATEP gacaataatagataattacgagccggttcgaggctgacattgcgcgattctagCGAGCC 1680 S R

GCAATCAATTCAACTTTGCCAACGCCGACGCGGTTGTCAACTTTGCCCAGGCCAACGGCA 1740 NQFNFANADAVVNFAQANGK

AGCTCATCCGCGGCCACACCCTCCTCTGGCACTCTCAGCTGCCGCAGTGGGTGCAGAACA 1800 LIRGHTLLWHSQLPQWVQNI

TCAACGACCGCAACACCTTGACCCAGGTCATCGAGAACCACGTCACCACCCTTGTCACTC 1860 NDRNTLTQVIENHVTTLVTR

GCTACAAGGGCAAGATCCTCCACTGGGACGTCGTTAACGAGATCTTTGCCGAGGACGGCT 1920 YKGKILHWDVVNEIFAEDGS

CGCTCCGCGACAGCGTCTTCAGCCGCGTCCTCGGCGAGGACTTTGTCGGCATCGCCTTCC 1980 LRDSVFSRVLGEDFVGIAFR

GCGCCGCCCGCGCCGCCGATCCCAACGCCAAGCTCTACATCAACGACTACAACCTCGACA 20 4 0 AARAADPNAKLYI NDYNLDI

TTGCCAACTACGCCAAGGTGACCCGGGGCATGGTCGAGAAGGTCAACAAGTGGATCGCCC 2100 ANYAKVTRGMVEKVNKWIAQ

PL 207 374 B1

AGGGCATCCCGATCGACGGCATCGGCACCCAGTGCCACCTGGCCGGGCCCGGCGGGTGGA 2160 GIPI DGIGTQCHLAGPGGWN

ACACGGCCGCCGGCGTCCCCGACGCCCTCAAGGCCCTCGCCGCGGCCAACGTCAAGGAGA 2220 TAAGVPDALKALAAANVKEI

TCGCCATCACCGAGCTCGACATCGCCGGCGCCTCCGCCAACGACTACCTCACCGTCATGA 2280 AITELDIAGASANDYLTVMN

ACGCCTGCCTCCAGGTCTCCAAGTGCGTCGGCATCACCGTCTGGGGCGTCTCTGACAAGG 2340 ACLQVSKCVGITVWGVSDKD

ACAGCTGGAGGTCGAGCAGCAACCCGCTCCTCTTCGACAGCAACTACCAGCCAAAGGCGG 2400 SWRS S S N P LLFDSNYQPKAA

CATACAATGCTCTGATTAATGCCTTGTAAgaggaggtatattatttttagaggcaatgaa 2460 YNALINAL* ' gctaggaggaaagaggggaagtgaggtaattagctaggacaggcaaatctagcagcaatt 2520 ataagtcaacactatataaaatattcctataatggcttgtgcttcggtgtgcaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcaaaaacaaaaatgatccaacatgatt 2640 cgaaatggcgaccttgcaaatgcacacetcagaraataccactatacaatacacoctaaa 2700 tggcacctaaatccatttgtccgcggtcatagacggggcttaagaagcctgggatgcagg 2760 tgccgatgcaagggttacgtcagtgtatgatatgagtatgaaccatgctgtotgggtaat 2820 tctccactttcccteeccttacgactcttcgggtgtgcctctctagaaagtcgactcctg 2880 gcgcctcagatcgccctttggctctgttcggtacaatgacgtccgctggtttcttccaaa 2940 gaccaggtatttctcecgtggcaacaaagaataccaaatacctatatcgaaccgtagtct 3000 tctgataattagatgtctctcaaggcgcgg 3030

SEQ ID Nr. 4

Sekwencja aminokwasowa kompletnego białk Chrysosporium Xyll. Sekwencja sygnałowa (1-20) jest opisana pismem pochyłym a domena wiążąca celulozę (22-53) jest podana tłustym drukiem z podkreśleniem.

MRTLTFVLAA APVAVLAQSP ŁWGQCGGQGW TGPTTCVSGA VCQPVNDWYS 51 pęyPGSSNPP TGTTSSTTGS TPAPTGGGGS GTGLHDKFKA KGKLYFGTEI

101 DHYHLNNNAL TNIVKKDFGQ VTENSLKWDA TEPSRNQFNF ANADAWNFA 151 QANGKLIRGH TLLWHSQLPQ WVQNINDRNT LTQVISNHVT TLVTRYKGKI 201 LHWDWNEIF AEDGSLRDSV FSRVLGEDFV GIAFRAARAA DPNAKLYIND 251 YNLDIANYAK VTRGMVEKVN KWIAOGIPID GIGTQCHLAG PGGWNTAAGV 301 PDALKALAAA NVKEIAITEL DIAGASANDY LTVMNACLQV SKCVGITVWG 351 VSDKDSWRSS SNPLLFDSNY QPKAAYNALI NAL*

PL 207 374 B1

SEQ ID Nr. 5

Sekwencja DNA części genu Chrysosporium GPD1 łącznie z sekwencją promotorową. Sekwencja promotorowa (1-1555) , sekwencja intronu (1682-1781) są podane małymi literami. Brak końca 3' tego genu.

tgagcagcaacgagcagcaatgagcattcctgggccaccgagtctgagtgccagtacgga 60 gtatcgtacttcgtaccggggtttgatttggtgacggtgcttttcacctctcgatgcccg 120 aaatcgggtctaagctgagtttgatcaaatatgtgactccaacatcgcccccttcggcaa 180 accccgtcgacacgtgtgtcatccttccattgcaagcgatcactcgcagggcgrgacgat 240 gaacgagatttttgcccggaccgattcgcggatatagcggcagccgaccagcccraccac 300 actgatggccgtgtcactagtgtatgctcccagaaccgcaagcatacactgggcaatgct 360 tggtatgcagttgaggcagctttatgtttccatacccttccacttcggctcggggactcg 420 gcggggtcgcggaagtttgacggcagccgtcgggccttaggccgagattaccgtggttgt 430 ggcccagttttagccgttcccgtccgtttcctaccggaccatgatttrcgtgaaccattg 540 caatcccgaagcgcatttccgacgttaaggagttacctccgctgcccagaattcatgarc 600 grggccggctcaaggcagcgtggcggggcatccgtgtcaagctcccaggaggaggtgcgc 660 gatttcaaacccgggccaaaacaggccaagactggctggccaaaaaaaggagcgragacg 720 gcccgggacatcggacgtcagctcgcagccacccaaaaccggrccgatccactcgcttac 780 tgtggtagttcaggtaettttgagragtaaaaacgctacggcagggccggggggttcccc 840 ggtgacggaggtgccrcrgcggtggcgaacatcccacgcactctcgagctacggtgacac 900 ctcgtgrcctgttggrcttgcaatgctggggcggcaggaaatgcgtcgcgcccctcccgg 960 ccaagacctaaaacagacagcgccgcaaagtcgctcactagoaccgcgaaacgaagatgc 1020 cccacctcaacgcaatctgtgatgcaagcaattgggaaggctcaccccacctcagcgagg 1080 ggcrcaaccatttttattatcagctcatgccaccacaacatgactgttttctttccttgc 1140 tcatcccacatttgacaaaaarcgtcgattaatctctrrccatacaggccgtccgcgctc 1200 tgataaccacataaaagtctcttcagtcaacagctcaaagctccctcatccctccaggta 1260 agcagccaaagagctcccccacggaccccgcacrgcctcatcccgcctgtatcggacctg 1320 cgcgacccagcagagaatcccaaacctrtgctgctcgctgcccggttccggactgagctg 1380 caacccaagcctttaaaaagcttrtcccttctcccacggtgtcaactctgtcctatccct 1440 ccgacatccgttgagctcaacaactccccgaacctttraccccgcgccgagctacccctc 1500 catcaaaccaccctgacagcccgctcactcaccEccccacatcacagaaarcaaaATGAC 1560 Μ T TATCAAGGTCGGCATCAACGGTTTCGGCCGTATCGGCCGTATCGTCTTCCGCAACTCCAT 1620 IKVGINGFGRIGRIVFRNSICGAGCACTCGGATGTCGAGATCGTTGCCGTCAACGACCCCTTCATTGAGCCCAAGTACGC 1680

PL 207 374 B1 £ Η 5 - D V Ε I V A V Ν D PFIE P K Y A Tgtaagtagttttttttttccfccctcgcgttctttcctgttccatcgacagtacgagat 1740 GatcttgcaggcggazcggagctaaccgcgattgtcgtacagGAGTACATGCTCAAGTAT 1800

GACTCGACCCACGGTATCTTCAACGGCACCATCGCCGTCGAGGGCAĄCGACCTCATTGTC 1860 DSTHGIFNGTIAVEGNDLIV AACGGCAAGAGGGTCAAGTTCTACACTGAGCGGGMCCCCGCCAACATTCCCTGGARGGAA 1920 NGKRVKFYTER?PANIPW?E ACTGGTGCCGAGTACATMRTCGAGTCGACCGGTGTGTTCACCAMCACCSAGAAGGCTAGC 1980 TGAEYI?E STGVFT?T?KAS GCCCACCTCAAGGGCGGCGCCAAGCGCGTCATCATCTCTGCTCCCTCGGCCGATGCCCCC 2040 AHLKGGAKRVIISAPSADAP ATGTACGTCATGGGCGTCAACGAGAAGACCTACGACGGCAAGGCCCAGGTCATCTCTAAC 2100 MYVMGVNEKTYDGKAQVISN GCCTCGTGCACCACCAACTGCCTGGCTCCCCTCGCCAAGGTCATCCACGACAAGTT CGGC 2160 ASCTTNCLAPLAKVIHDKFG CTCGTTGAGGGTCTCATGACCACCGTCCACTCCTACACTGCCACCCAGAAGACCGTCGAT 2220 LVEGLMTTVHSYTATQKTVD GGTCCCTCTGCCAAGGACTGGCGTGGTGGCCGTGGTGCTGCTCAGAACATCATCCCCAGC 2280 GPSAKDWRGGRGAAQNIIPS AGCACTGGCGCCGCCAAGGCCGTCGGCAAGGTCATCCCTGAGCTCAACGGCAAGCTCACC 2340 STGAAKAVGKVIPELNGKLT GGCATGTCCCTCCGTGTCCCCACCCCCAACGTTTCCGTTGTCGACCTCACCTGCCGCCTC 2400 GMSLRVPTPNVSVVDLTCRL GAGAAGGAGGCTACCTACGACGACATCAAGGCC3CCATCAAGGAGGCCGCCGCCGGCCCC 2460 EKEATYDDIKAAIKEAAAGP CTCAAGGgtgagttatctggttcctttttttttttttggagaacgacacatgctgataaa 2520 L K G acccagGCATCCTCGACTACACTGAGG 2547 I L D Y T E

SEQ ID Nr. 6

Sekwencja aminokwasowa części białka GPD1 Chrysosporium. W oznaczonej (dostępnej) sekwencji brakuje C-końca.

MTIKVGINGF GRIGRIVFRN SIEHSDVEIV AVNDPFIEPK YAEYMLKYDS THGIFNGTIA VEGNDLIVNG KRVKFYTER? PANIPW7ETG AEYI?£STGV FT?T?KA5AH 1KGGAKRVII SAPSADAPMY VMGVNEKTYD GKAQVISNAS CTTNCLAPLA KVIHDKFGLV EGLMTTVHSY TATQKTVDGP SAKDWRGGRG AAQNIIPSST GAAKAVGKVI PELNGKLTGM SLRVPTPNVS WDLTCRLEK EATYDDIKAA ZKEAAAGPLK GILDYTE

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Białko odpowiadające glikozylohydrolazie z Chrysosporium należące do rodziny 7, wykazujące co najmniej 75% identyczności aminokwasów jak oznaczono algorytmem BLAST z aminokwasami 1-526 w sekwencji aminokwasowej SEQ ID Nr. 2 lub jego część posiadająca co najmniej 20 kolejnym aminokwasów identycznych z odpowiadającą częścią sekwencji aminokwasowej 1-246 albo 394526 z SEQ ID nr: 2.
2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że białko to zawiera sekwencję aminokwasów SEQ ID nr: 2.
3. Sposób hydrolizowania wiązań β-glukozydowych, znamienny tym, że hydrolizę wiązań przeprowadza się białkiem jak zdefiniowano w zastrz. 1 lub 2.
4. Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca białko jak zdefiniowano w zastrz. 1 lub 2.
5. Konstrukt kwasu nukleinowego zawierający sekwencję kwasu nukleinowego regulującego ekspresję operacyjnie związaną z sekwencją kwasu nukleinowego kodującego białko jak zdefiniowano w zastrz. 1 lub 2.
6. Konstrukt kwasu nukleinowego według zastrz. 5, znamienny tym, że wspomniana regulująca ekspresję sekwencja kwasu nukleinowego pochodzi z Chrysosporium.
7. Sekwencja kwasu nukleinowego posiadająca co najmniej 70% identyczność z nukleotydami

1-1779 w SEQ ID nr: 1.
8. Konstrukt kwasu nukleinowego zawierający sekwencję kwasu nukleinowego regulującą ekspresję operacyjnie związaną z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania, przy czym wspomniana sekwencja kwasu nukleinowego regulująca ekspresję ma co najmniej 70% identyczności nukleotydów z całkowitą długością nukleotydów 1-1779 z SEQ ID nr: 1 lub ta wspomniana sekwencja regulująca ekspresję zawiera co najmniej 40 sąsiadujących nukleotydów spośród nukleotydów 1-1779 w SEQ ID nr: 1.
9. Konstrukt kwasu nukleinowego według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego regulująca ekspresję jest sekwencją nukleotydów 1-1779 w SEQ ID nr: 1.
10. Konstrukt kwasu nukleinowego według zastrz. 8 lub 9, znamienny tym, że białko będące przedmiotem zainteresowania jest wybrane z grupy obejmującej: enzym rozkładający węglowodany, proteazę, hydrolazę, oksydoreduktazę i transferazę.
11. Konstrukt kwasu nukleinowego według zastrz. 10, znamienny tym, że enzym rozkładający węglowodany jest wybrany z grupy obejmującej: celulazę, ksylanazę, mannanazę, mannozydazę, pektynazę lub amylazę.
12. Rekombinantowy szczep mikroorganizmu, zawierający konstrukt kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 5-6 zdolny do ekspresji wspomnianego białka kodowanego przez wspomnianą sekwencję kwasu nukleinowego, lub zdefiniowanego w zastrz. 8-11, i zdolnego do ekspresji wspomnianego polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania.
13. Rekombinantowy szczep mikroorganizmu według zastrz. 12, znamienny tym, że wspomniany szczep stanowi szczep grzyba.
14. Sposób wytwarzania białka zdefiniowanego z zastrz. 1-2, znamienny tym, że stosuje się rekombinantowy szczep mikroorganizmu zdefiniowany w zastrz. 12-13, hoduje się wspomniany szczep mikroorganizmu w warunkach pozwalających na ekspresję wspomnianego białka i następnie odzyskuje się wspomniane białko.