KR20020093932A - 사상균 크리소스포리움 분야에서의 발현 조절 서열 및발현 생성물 - Google Patents
사상균 크리소스포리움 분야에서의 발현 조절 서열 및발현 생성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 서열 번호 2 및 4의 아미노산 서열과 각각 70% 및 75%의 최소 아미노산 동일성을 나타내는 크리소스포리움 글리코실 히드롤라제 7군 및 10군에 해당하는 신규 단백질과, 서열 번호 6의 부분 아미노산 서열과 86% 이상의 아미노산 동일성을 나타내는 크리소스포리움 글리세르알데히드 포스페이트 데히드로게나제에 해당하는 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 단백질을 암호화하는 핵산 서열과, 특히 해당 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 서열에 관한 것이다. 상기 유전자의 발현용으로 바람직한 숙주는 진균, 특히 크리소스포리움 균주이다.
Description
유전자 발현을 위한 다수의 숙주 및 형질전환 방법은 종래 기술에 이미 공지되어 있다. 박테리아, 예를 들어 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)가 종종 언급되나, 이. 콜리는 다수의 단백질 또는 폴리펩티드를 분비할 수 없는 미생물이고, 따라서 산업적인 수준에서 단백질 또는 폴리펩티드의 생성을 위한 숙주 세포로는 바람직하지 못하다. 이. 콜리의 다른 단점은 원핵세포인 이. 콜리는 활성형으로 생성되어야 하는 다수의 진핵 단백질 또는 폴리펩티드를 위해 필요한 추가적인 변경을 제공할 수 없다는 점이다. 이러한 단점은 대부분의 박테리아에도 동일하게 적용된다. 단백질의 글리코실화 및 단백질의 적절한 폴딩은 활성 단백질 또는 폴리펩티드의 생성을 담보하기 위해 필요한 프로세싱의 예이다. 이러한 프로세싱을 보장하기 위해, 때때로 포유동물 세포를 사용할 수 있지만; 이러한 세포들도 단점을 갖고 있는데, 이들은 종종 유지하기 어려우며, 고가의 배지를 필요로 한다. 따라서, 산업적인 수준으로 단백질 또는 폴리펩티드를 생성하기 위해 이러한 형질전환 시스템을 이용하는 것은 실익이 없다. 이들은 상대적으로 소량을 요구하는 고가의 약품에 대해서는 비용면에서 효율적일 수 있지만, 산업용 효소의 경우에는 그렇지 못한 것이 분명하다.
다수의 진균 발현 시스템, 예를 들어 아스퍼길러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼길러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼길러스 니덜란스(Aspergillus nidulans), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)가 개발되어 왔다. 다수의 다른 발현 시스템이 제안되었지만, 여러가지 이유로 광범위하게 허용되거나 이용되지 않았다. 일반적으로, 이상적인 숙주는 다음과 같은 많은 요건을 충족시켜야만 한다:
- 이상적인 숙주는 저렴한 배지를 이용하여 용이하게 발효되어야 한다.
- 이상적인 숙주는 배지를 효율적으로 이용하여야 한다.
- 이상적인 숙주는 높은 수율로 폴리펩티드 또는 단백질을 생성해야만 한다. 즉, 높은 단백질 대 바이오매스 비율을 나타내야만 한다.
- 이상적인 숙주는 단백질 또는 폴리펩티드를 효과적으로 분비할 수 있어야 한다.
- 이상적인 숙주는 목적 단백질 또는 폴리펩티드의 분리 및 정제를 용이하게 할 수 있어야 한다.
- 이상적인 숙주는 추가의 할성화 처리 또는 변경 처리를 수행할 필요없이 목적 단백질 또는 폴리펩티드를 활성형으로 생성하기 위해 목적 단백질 또는 폴리펩티드를 프로세싱하여야만 한다.
- 이상적인 숙주는 용이하게 형질전환되어야 한다.
- 이상적인 숙주는 광범위한 발현 조절 요소의 사용을 가능하게 하여 용이한 적용 및 다양성을 보장하여야 한다.
- 이상적인 숙주는 저렴하게 이용되는 선별 마커의 용이한 이용이 가능해야 한다.
- 이상적인 숙주는 안정한 형질전환체를 생성해야 한다.
- 이상적인 숙주는 단백질 또는 폴리펩티드 생성물에 유해하지 않은 조건, 예를 들어 저점도, 저전단 조건 하에서 배양할 수 있어야 한다.
WO 96/02563호 및 미국 특허 제5,602,004호, 제5,604,129호 및 제5,695,985호(출원인 및 특허권자는 노보 노르디스크임)에는 아스퍼길러스 및 트리코더마 시스템의 단점이 기술되어 있으며, 다른 진균에 대한 배양 조건이 대규모 단백질 생산에 적합할 수 있음을 제안하고 있다. 임의의 형질전환된 배양물을 위해 제공된 유일한 예는 마이셀리오프토라 써모필리아(Myceliophthora thermophila), 아크레모니움 알라바멘스(Acremonium alabamense), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris) 및 스포로트리쿰 셀룰로필럼(Sporotrichum cellulophilum) 균주의 배양 조건이다. 스포로트리쿰 균주는 발효 조건 하에서 용해되어 녹색 색소를 생성하는데, 다른 균주에서는 이러한 결과가 나타나지 않는다. 티엘라비아 테레스트리스의 비포자형성 돌연변이체는 그의 형태로 인해 선택된 유기체라고 기술되어 있다. 그러나, 티엘라비아 및 아크레모니움의 원형질체형성 효율(protoplasting efficiency)(사용된 아크레모니움 균주는 사용된 티엘라비아 균주의 불완전한 상태임)은 낮고, 하이그로마이신은 선별 마커로 사용하기에는 유용하지 않다는 것 또한 기술되어 있다. 다른 다수의 균주가 그들의 형태로 인해 잠재적으로 유용한 것으로 제안되었지만, 이의 형질전환에 대해서는 기술된 바 없다. 제안된 균주는 코리나스커스(Corynascus), 써모아스커스(Thermoascus), 카에토미움(Chaetomium), 크테모마이세스(Ctenomyces), 싸이탈리디움(Scytalidium) 및 탈라로마이세스(Talaromyces)이다. 형질전환된 숙주는 최소량을 생성하는 티엘라비아를 이용하여 도입한 후미콜라(Humicola) 자일라나제를 낮은 수준으로만 생성하는 것으로 언급되어 있다. 그러나, 이러한 정보는 불확실하여, 실제로 티엘라비아를 최적예임가 추측할 수 있다. 이러한 참조물의 명명은 산업용 진균의 ATCC 명칭(1994)에 기초한 것이다. 따라서, 높은 정도의 이종성 발현은 획득되지 않고, 실제로 가정한 형태와 발현 정도와의 긍정적인 상관관계는 없는 것이 명백하다. 임의의 상관관계가 있을 수 있지만, 이는 아마도 부정적인 관계일 것이다. ATCC 진균 분류(1996)에 따르면, 스포로트리컴 써모필리엄 ATCC 20493은 마이셀리오프토라 써모필리아 균주이다. 현재, 이 균주는 여전히 마이셀리오프토라 써모필리아로 동정된다. 이러한 최근의 개시는 당업계에서는 예상할 수 없었던 일이다.
노보 노르디스크의 WO 97/26330호는 이종 폴리펩티드의 개선된 생산성을 보유하는 사상균 모세포의 돌연변이체를 얻는 방법을 제안하고 있다. 이 방법은 먼저특정 변경된 형태를 확인한 후, 이어서 형질전환체가 모세포보다 이종 폴리펩티드를 더 생성하는지 여부를 평가하는 단계를 포함한다. 이 방법은 푸사륨(Fusarium) A3/5 및 아스퍼길러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주에 대해서만 예시되었다. 이 방법은 아스퍼길러스, 트리코더마, 티엘라비아, 푸사륨, 뉴로스포라(Neurospora), 아크레모니움, 톨리플로카디움(Tolyplocadium), 후미콜라, 사이탈리디움, 마이셀리오프토라, 또는 무코르(Mucor)에도 적용할 수 있는 것으로 제안하고 있다. 상기한 바와 같이, 당업계의 예측불가능성 및 인용된 출원에 기재된 방법의 예측불가능성은 성공을 이상적으로 예측할 수 있는 적용가능한 교시는 제공하고 있지 않다.
WO 00/20555호에서, 본 발명자들은 상기한 요건을 충족하는 상기 아스퍼길러스 및 트리코더마를 단순하게 이용하는 대체 진균 발현 시스템을 기술하였다. 상기 신규 시스템은, 형질전환 속도가 종종 사용된 트리코더마 리세이 시스템의 형질전환 속도보다 더 높다는 추가의 잇점을 제공한다. 또한, 배양 조건은 폴리펩티드 생성물에 이로운 추가의 잇점을 제공한다.
본 발명은 사상균, 구체적으로 크리소스포리움(Chysosporium) 속 균주로부터 유도된 신규한 효소와, 이들 효소의 암호화 서열 및 발현 조절 서열에 관한 것이다. 본 발명은 본원의 우선일 이전에 발행되지 않은, 1999년 10월 6일에 출원된 WO 00/20555(PCT/NL/00618)에 개시된 발명의 개량 발명이다.
이하, 본 발명자들은 크리소스포리움 균주로부터 유도된 산업적으로 유용한 다수의 효소를 그의 완전한 서열 정보와 함께 기술한다. 또한, 본 발명자들은 크리소스포리움 균주로부터 유도되고, 상동 유전자 및 이종 유전자 발현에 유용한 신규한 프로모터 시스템도 기술한다.
구체적으로, 본 발명은 아미노산 서열에 의해 확인되는 바와 같이, 7군(예를들어, 셀로바이오히드롤라제) 및 10군(예를 들어, 자일라나제)의 글리코실 히드롤라제, 글리세르알데히드 포스페이트 데히드로게나제, 이들 효소 단백질로부터 유도된 펩티드, 이들 펩티드 및 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 그리고 특히 이들 유전자에 관련된 조절 서열에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 후술하는 내용 및 특허청구의 범위에 기술된 바와 같은 서열 동일성이 일정 범위 이상인 돌연변이체를 포함하는 상기 3가지 부류의 분리된 또는 재조합 효소 단백질 또는 이의 활성 부분, 및 이들 단백질 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산 서열, 및/또는 이들의 발현을 조절하는 핵산 서열에 관한 것이다. 이들 효소는 특히 (1) 서열 번호 2의 서열과 아미노산 동일성이 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상 또는 심지어 85% 이상 동일인 7군의 글리코실 히드롤라제(셀로바이오히드롤라제, CBH1); (2) 서열 번호 4의 서열과 아미노산 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상 또는 심지어 80% 이상인 10군의 글리코실 히드롤라제(엔도자일라나제 XYL1); 및 (3) 서열 번호 6의 서열과 아미노산 동일성이 86% 이상, 바람직하게는 90% 이상 또는 심지어 93% 이상인 글리세르알데히드 포스페이트 데히드로게나제(GPD1)이다. 폴리펩티드, 및 서열 번호 2, 4 및 6의 20개 이상, 바람직하게는 30개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 이들 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열도 본 발명의 바람직한 일부분이다. 상응하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 1(cbh1), 3(xyll) 및 5(gpd1)이다.
재조합 효소는 주로 완전 단백질, 또는 효소 활성의 적어도 일부를 가진 절두 단백질을 포함할 수 있다. 그러한 절두 부분은 촉매 도메인, 또는 그것의 아미노산의 약 75% 이상일 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 CBH1의 촉매 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 서열의 아미노산 20-495를 포함하고, 본 발명에 따른 XYL1의 촉매 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열의 아미노산 54-384를 포함한다. 촉매 도메인은 다른 단백질로부터 기원하는 시그널 서열 및/또는 다른 효소 단백질로부터의 탄수화물 결합 도메인과 결합되거나 또는 결합되지 않을 수 있다. 대안으로, 본 발명의 효소(CBH1 및 XYL1)의 셀룰로스 결합 도메인은 다른 효소 단백질의 촉매 도메인에 융합될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 서열은 완전 단백질 암호화 영역, 또는 바람직하게는 발현 조절 서열일 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 1, 3 및 5의 유전자에 상응하지만, 동일하지는 않은 유전자를 동정하기 위한 프로브로서 사용될 수 있는데, 전술한 동일성(%) 기준을 충족시키는 경우의 이러한 유전자, 뿐만 아니라 그것의 암호화 및 비암호화 부분, 그리고 그것의 발현 생성물도 본 발명의 일부이다. 올리고뉴클레오티드의 길이는 15-75 뉴클레오티드가 바람직하고, 20-50 뉴클레오티드인 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명은 관심 대상의 다른 단백질을 암호화하는 유전자에 융합된 세 가지 단백질 부류 중 임의의 것의 발현 조절 영역(프로모터 포함)이나, 다른 발현 조절 영역에 융합된 이러한 단백질 중 임의의 것의 암호화 영역을 포함하거나, 또는 이러한 신규한 단백질의 발현 조절 영역과 단백질 암호화 영역을 모두 포함하는 발현 시스템(카세트)에 관한 것이다. 발현 조절 영역은 서열 번호 1, 3 및 5의 5'-비암호화 영역의 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상,보다 더 바람직하게는 80% 이상 및/또는 이들 5'-비암호화 영역으로부터의 20개 이상, 특히 40개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 본 발명의 유전자의 3'-비암호화 영역으로부터 유사하게 유도된 종결신호 서열도 상동성 유전자와 결합하거나 이종 유전자와 결합하건 간에 발현 카세트에 유용하다.
본 발명의 폴리펩티드 및 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 1, 3 또는 5의 해당 서열과 최소 서열 동일성을 갖거나, 또는 대안으로 이러한 소정의 서열로 엄중 상태 하에 하이브리드화될 수 있다. 엄중 하이브리드화 조건은 당업계에 알려진 바와 같은데, 예를 들면 6 X SSC(1000 ㎖당 20 X SSC: 175.3 g NaCl, 107.1 g 시트르산나트륨.5H2O, pH 7.0), 0.1% SDS, 0.05% 피로인산나트륨, 5 * 덴하르트 용액 및 20 ㎍/㎖ 변성 청어 정자 DNA 중에 56℃에서 18∼24시간 동안 하이브리드화한 다음, 5 X SSC, 0.1% SDS 중에 56℃에서 30분 세척을 2회 수행하고, 2 X SSC, 0.1% SSC 중에 56℃에서 30분 세척을 2회 수행한다.
이러한 발현 시스템은 크리소스포리움 숙주, 예컨대 크리소스포리움 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense) 숙주, 또는 다른 비진균, 바람직하게는 진균 숙주 내에 함유될 수 있다. 다른 진균 숙주의 예로는 다른 크리소스포리움 종 또는 균주, 푸사리움 종, 아스퍼길러스 종 등이 있다. 그러한 숙주는 그 자체로, 본래 또는 배양 조건의 결과로서 목적 단백질에 해당하는 단백질을 생성하지 않아서 목적 단백질 회수를 단순화시키는 숙주인 것이 유리할 수 있다.
본 발명의 명세서 및 첨부된 특허청구의 범위에서 본 발명의 발현 시스템의생성물로서 "폴리펩티드" 또는 "펩티드" 또는 "목적 폴리펩티드" 또는 "목적 펩티드"가 언급되어 있는데, 이 용어 또한 단백질, 즉 특정 기능 및/또는 2차 구조 및/또는 3차 구조를 가진 폴리펩티드를 포함한다. 아미노산 동일성(%)이 언급된 경우, 그러한 동일성은 통상적으로 사용되는 BLAST 알고리즘에 의해 결정된 바와 같이, 완전 단백질 또는 초기 및 최종 아미노산 수로 한정된 특정 부분에 관한 것이다.
WO 00/20555호에 기재된 진균 발현 시스템에서, 배양 배지의 pH는 중성이거나 알칼리성일 수 있으므로, 생성된 단백질 또는 폴리펩티드를 이를 불활성화시킬 수 있는 공격적인 산 pH에 노출시킬 필요가 없다. 또한, 단백질 또는 폴리펩티드가 산성 환경에 더 잘 적응하는 경우, pH 4와 같은 산 pH에서 배양하는 것도 가능하다. 배양은 4.0∼10.0의 pH에서 행하는 것이 적절하다. 그러나, 중성 내지 알칼리성 pH가 바람직한데, 그 이유는 숙주 균주가 그러한 pH, 예컨대 6∼9에서 더 나은 성장을 나타내기 때문이다. pH 8 이상, 심지어 10만큼 높을 수 있는 알칼리성 pH에서의 성장은 일부 경우에 있어서 좋은 대안이 되기도 한다. 또한, 그러한 숙주 균주의 배양 온도는 생성된 폴리펩티드의 일부 형태의 안정성에 유리하다. 배양 온도는 23∼43℃의 온도가 적절하다. 명백히, 그러한 조건은 포유동물 폴리펩티드의 생성에 특히 유용하다. 선택된 온도는 배양의 비용 효율과 폴리펩티드 또는 배양 균주의 감수성에 따라 달라진다.
또한, 바이오매스 대 점도 관계와 생성된 단백질의 양이 크리소스포리움 숙주에 매우 바람직하다는 것이 확인되었다. 비교는 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum)(전에는 트리코더마 리세이로도 알려짐)과, 아스퍼길러스 나이거로 행하였다. 이들 각각의 최적 조건 하에서, 트리코더마 롱기브라키아툼은 2.5∼5 g/ℓ바이오매스를 제공하였으며, 아스퍼길러스 나이거는 5∼10 g/ℓ바이오매스를 제공하였고, 크리소스포리움 숙주는 0.5∼1 g/ℓ바이오매스를 제공하였다. 따라서, 이것은 상업적으로 이용된 균주에 비하여 5∼10배 개선된 것이다. 본 발명은 비상동 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(후술하는 발현 조절 영역에 작동가능하게 연결됨), 선택적으로 분비 시그널 암호화 서열 및/또는 캐리어 단백질 암호화 서열을 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 균주는 목적 폴리펩티드를 분비하는 것이 바람직하다. 목적 폴리펩티드를 분리하고, 또한 숙주 세포의 다른 성분에 의한 발현된 생성물의 분해 위험을 최소화하기 위하여 세포를 붕괴시켜야 하는 필요성을 피할 수 있다.
크리소스포리움은 문헌[Barnett 및 Hunter, 1972, Illustrated Genera of Imperfect Fungi, 3rd Edition of Burgess Publishing Company]에 기재된 것과 일치하는 형태로 정의할 수 있다. 크리소스포리움 속의 진균의 분류에 관한 상세를 제공하는 다른 출처가 알려져 있는데, 예를 들면 문헌[Sutton Classification, Van Oorschot, C.A.N. (1980) "A revision ofChrysosporiumand allied genera" in Studies in Mycology No. 20 of the CBS in Baarn, The Netherlands p 1-36]이 있다. CBS는 부다페스트 조약의 기탁 기관 중 하나이다. 이러한 교시에 따르면, 크리소스포리움 속은 히포마세탈레스(Hyphomycetales) 목에 속하는 모닐리아세아에(Moniliaceae) 과에 속한다. 하기 균주는 크리소스포리움으로 정의되지만, 크리소스포리움의 정의는 이들 균주로 한정되는 것은 아니다: 씨. 보트리오이데스(C. botryoides), 씨. 카르미카엘리(C. carmichaelii), 씨. 크라시투니카툼(C. crassitunicatum), 씨. 에우로파에(C. europae), 씨. 에볼세아누이(C. evolceannui), 씨. 파리니콜라(C. farinicola), 씨. 파스티디움(C. fastidium), 씨. 필리포르메(C. filiforme), 씨. 게오르기아에(C. georgiae), 씨. 글로비페룸(C. globiferum), 씨. 글로비페룸 변종 아르티쿨라툼(C. globiferumvar.articulatum), 씨. 글로비페룸 변종 니베움(C. globiferumvar.niveum), 씨. 히룬도(C. hirundo), 씨. 히스파니쿰(C. hispanicum), 씨. 홀미(C. holmii), 씨. 인디쿰(C. indicum), 씨. 이놉스(C. inops), 씨. 케라티노필룸(C. keratinophilum), 씨. 크레이셀리(C. kreiselii), 씨. 쿠주로비아눔(C. kuzurovianum), 씨. 리그노룸(C. lignorum), 씨. 로바툼(C. lobatum), 씨. 루크노웬세(C. lucknowense), 씨. 루크노웬세(C. lucknowenseGarg 27K), 씨. 메디움(C. medium), 씨. 메디움 변종 스피세센스(C. mediumvar.spissescens), 씨. 메피티쿰(C. mephiticum), 씨. 메르다리움(C. merdarium), 씨. 메르다리움 변종 소세움(C. merdariumvar.soseum), 씨. 미노르(C. minor), 씨. 파니콜라(C. pannicola), 씨. 파르붐(C. parvum), 씨. 파르붐 변정 크레센스(C. parvumvar.crescens), 씨. 필로숨(C. pilosum), 씨. 수도메르다리움(C. pseudomerdarium), 씨. 피리포르미스(C. pyriformis), 씨. 퀸슬랜디쿰(C. queenslandicum), 씨. 시글레리(C. sigleri), 씨. 설푸레움(C. sulfureum), 씨. 신크로눔(C. synchronum), 씨. 트로피쿰(C. tropicum), 씨. 운둘라툼(C. undulatum), 씨. 발레나렌세(C. vallenarense), 씨. 베스페르틸리움(C. vespertilium), 씨. 조나툼(C. zonatum).
씨. 루크노웬세는 셀룰라제 단백질의 천연 고 생성자를 제공하기 때문에 특히 주목되고 있는 크리소스포리움의 종 중 하나를 형성한다(WO 98/15633호 및 관련 미국 특허 제5,811,381호).
콜로니는 사보라드(Sabouraud) 글루코스 아가 상에서 14일 이내에 55 mm 직경에 도달하며, 크림색을 띠고, 펠트형이고, 솜털형이며, 조밀하고, 3∼5 mm 높이이며, 가장자리가 한정되고, 직사각형이며, 둘레에 털이 나고, 담황색에서 크림색으로 반전된다. 균사는 유리질의 평활하고 얇은 벽을 이루고, 약간 분지된다. 공기 중의 균사는 대부분 번식력이 있고, 약 1∼3.5 ㎛ 폭으로 밀접하게 분리되어 있다. 수중 균사는 번식력이 없고, 약 1∼4.5 ㎛ 폭으로, 더 얇은 균사는 종종 왜곡된다. 분생자는 말단화 및 측면화되어 있고, 또는 짧고, 빈번하게 원추형 돌출부이거나 또는 짧은 면 분지형이다. 분생자는 단생이지만, 서로 밀접하게 인접하여, 균사 세포 상에 1∼4개의 분생자가 생장하고, 고르게 얇고 평활한 벽을 이루며, 대부분 구형이고, 또한 곤봉형의 울퉁불통한 모양이며, 1개의 세포로 되고, 2.5-11 x 1.5-6 ㎛이고, 넓은 기본 엽흔(1-2 ㎛)을 가진다. 마디 사이의 분생자는 존재하지 않는다. 후막포자 분생자는 존재하지 않는다. ATCC 44006, CBS 251.72, CBS 143.77 및 CBS 272.77이 크리소스포리움 루크노웬세 균주의 예이며, 다른 예는 WO 98/15633(미국 특허 제5,811,381호)에 제공된다.
더 높은 셀룰라제 생산 용량을 가진 상기 종으로부터 추가의 균주를 분리하였다. 이 숙주는 내부 표시법에 따라 C1으로 명명하고 부다페스트 조약에 따른 기탁물로서 올 러시안 콜렉션 오브 마이크로-오가니즘스 오브 더 러시안아카데미(All Russian Collection of micro-organisms of the Russian Academy; 러시아 113184, 모스크바, 사이언시스 바크루시나 스트리트 8)에 1996년 8월 29일 기탁하였으며, 수탁번호 VKM F-3500D를 부여받았다. 이것을 크리소스포리움 루크노웬세 Garg 27K로 명명하였다. C1 균주의 특징은 다음과 같다:
감자-덱스트로스 아가에서 약 7일 동안 직경 약 55-66 ㎜로 성장한 콜로니는 화이트 크림색의 펠트상으로 중앙의 높이가 2-3 ㎛이고; 가장자리 부분은 구획이 있고 규칙적인 사상 돌기가 있었으며; 옅은 크림색으로 바뀌었다. 균사는 유리질로, 평활하고 얇은 벽이 있었으며 약간 가지가 나 있었다. 공기 중의 균사는 번식력이 있고, 분리되어 있으며, 폭이 2-3 ㎜이다. 수중 균사는 번식력이 없다. 분생자는 말단화 및 측면화되어 있거나; 고착 또는 단쇄 가지 상태이거나; 없거나; 고립 상태, 단 서로 가까운 거리에 있으며, 유리질의 얇고 평활한 벽 형태, 구형, 곤봉 또는 오볼 모양으로 4-10 ㎛의 1개의 세포이다. 클라미도 포자와 삽입성 분생자는 없다.
C1 균주의 분리 방법은 WO 98/15633, US 5,811,381 및 US 6,015,707 호에 개시되어 있다. 또한 크리소스포리움의 정의에 포함된 것은 천연적으로 또는 유도된 돌연변이에 의해 다소 돌연변이된 것들을 포함하는 크리소스포리움 선조이다. 크리소스포리움의 돌연변이체는 유도된 돌연변이에 의해, 특히 방사선조사 및 화학적 돌연변이를 병행함으로써 얻을 수 있다.
예를 들면, 균주 C1에 자외선을 조사하여 돌연변이시킴으로써 균주 UV13-6을 생성하였다. 이어서, 그 균주를 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 더 돌연변이시켜서 NG7C-19를 생성하였다. 균주 NG7C-19를 다시 자외선에 의해 돌연변이시켜 균주 UV18-25를 생성하였다. 이 돌연변이 과정 중, 액상의 배양물 중에서 또는 플레이트 상에서는 물론 현미경 하에서 형태 형성 특성이 다소 변화하였다. 순차적 돌연변이 각 단계에 의해, 콜로니가 평탄하고 광택이 없는 외관을 갖게 될 때까지 배양물은 플레이트 상에서 다소 솜털 및 펠트상의 외관을 띠었는데, 이것은 크리소스포리움의 특징으로 표시된다. 일부 배지 중에서 야생형 균주에 의해 관찰된 갈색 색소 또한 돌연변이체 균주의 다소 일반적 특징이다. 액상 배양물 중에서, 돌연변이체 UV18-25는 야생형 균주 C1과 돌연변이체 UV13-6 및 NG7C-19보다 현저하게 점성을 띠었다. 모든 균주들은 크리소스포리움의 광택이 있는 현미경적 특성을 유지하였지만, 균사체는 연속 돌연변이 각 단계에 의해, 그리고 UV18-25에 의해 균사체의 특징적인 분열을 관찰할 수 있었다. 균사체의 분열은 UV18-25의 배양물과 관련된 낮은 점성의 원인인 것으로 생각된다. 균주가 포자를 형성하는 능력은 각 돌연변이 단계에 의해 감소되었다. 이것은, 크리소스포리움 속에 속하는 균주의 경우, 상기 형태의 정의로부터 다소 벗어남을 시사하는 것이다. 또한, 각 돌연변이 단계에서 셀룰라제 및 세포외 단백질의 생성이 증가되는 한편, 다수의 돌연변이는 프로테아제 발현의 감소를 유발하였다. 진균학적 분류에 이용할 수 있는 기준은 예를 들면 CBS, VKMF 및 ATCC에서 입수할 수 있다. 크리소스포리움 균주 C1, 균주 UV13-6, 균주 NG7C-19 및 UV18-25로 내부적으로 정의된 균주는 부타페스트 조약에 따라 모스크바의 올 러시안 콜렉션(VKM) 기탁 기관에 기탁하였다. 야생형 C1 균주는 기탁번호 VKM F-3500 D, 기탁일 1996년 8월 29일로 기탁되었으며, C1 UV13-6 돌연변이체는 VKM F-3632 D(1998. 9. 2)로, C1 NG7c-19 돌연변이체는 VKM F-3633 D(1998. 9. 2)로, 그리고 C1 UV 18-25 돌연변이체는 VKM F-3631 D(1998. 9. 2)로 기탁되었다.
대규모 생산시의 환경적 위험 부담이 적고 생산절차가 간단하면서도 비용을 절감할 수 있는 비독성 크리소스포리움 균주가 다수 공지되어 있으므로 그들을 사용하는 것이 바람직하다.
발현 조절 영역은 발현을 위해 숙주 크리소스포리움 균주에 의해 인식된 DNA 서열이다. 이것은 발현시키고자 하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 서열을 포함한다. 프로모터는 발현시키고자 하는 서열의 개시 코돈의 마주보는 위치가 발현할 수 있도록 결합된다. 프로모터 서열은 구성적이거나 유도성일 수 있다. 크리소스포리움 균주로부터 폴리펩티드를 발혈할 수 있는 임의의 발현 조절 서열 또는 그들의 조합체가 고려된다. 발현 조절 서열은 진균 발현 조절 영역, 예를 들면 자낭균 조절 영역이 적당하다. 진균 발현 조절 영역은 하기 속의 임의의 진균류에서 선택된 조절 영역이 적당하다: 아스퍼길러스,트리코더마,크리소스포리움,한세눌라(Hansenula),무코르(Mucor),피키아(Pichia),뉴로스포라(Neurospora),톨리포클라듐(Tolypocladium),리조무코르(Rhizomucor),푸사륨(Fusarium),페니실륨(Penicilluim),사카로마이세스(Saccharomyces),탈라로마이세스(Talaromyces)또는 에메리셀라(Emericella),하이포크레아(Hypocrea)와 같은 그들의 교대 유성 형태, 예를 들면 트리코더마로부터의 셀로바이오히드로라세 프로모터, 아스퍼길러스로부터의 글루코아밀라제 프로모터, 아스퍼길러스로부터의글리세르알데히드 포스페이트 데히드로게나제 프로모터, 아스퍼길러스로부터의 알콜 데히드로게나제 A 및 알콜 데히드로게나제 B 프로모터, 아스퍼길러스로부터의 TAKA 아밀라제 프로모터, 뉴로스포라의 포스포글리세레이트 및 크로스-패스웨이 제어 프로모터, 리조마코르 미에헤이의 아스파틱 프로테이나제 프로모터, 리조무코르 미에헤이의 리파제 프로모터 및 페니실륨 카네센스의 베타-갈락토시다제 프로모터. 숙주 균주로서 상기 속으로부터 선택된 발현 조절 서열은 매우 적합한데, 특정 숙주에 대해서 특별히 적응된 것처럼 보일 정도이다. 따라서 발현 조절 서열은 크리소스포리움 균주로부터 선택된 것이 바람직하다.
선택된 숙주에서 고도의 발현을 가능하게 하는 발현 조절 영역을 적용하는 것이 바람직하다. 이것은 본 발명에 의한 크리소스포리움으로부터 유도된 발현 조절 영역이 바람직하다. 또한, 당해 기술 분야에 알려진 것과 같은 이종 숙주로부터 유도된 고 발현 조절 영역일 수 있다. 다량으로 발현되어 본 발명에 적합한 발현 조절 서열을 제공하는 것으로 알려진 단백질의 구체적인 예는 히드로포빈, 프로테아제, 아밀라제, 자일라나제, 펙티나제, 에스테라제, 베타-갈락토시다제, 셀룰라제(예를 들면, 엔도-글루카나제, 셀로바이오히드롤라제) 및 폴리갈락투로나제가 있으며, 이들에 한정되는 것은 아니다. 고체 상태 및 수중 발효 조건에서 고생산률이 달성되었다. 그러한 단백질의 존재 또는 생성의 확인 분석법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면 시그마(Sigma) 및 메가자임(Megazyme)의 카탈로그가 다양한 예를 제공한다. 메가자임은 아일랜드, 카운티 윅로우, 브레이, 브레이 비지니스 팍에 소재한다. 시그마 알드리히는 예를 들면 미국, 미조리주, 세인트루이스,P. O. BOX 14508에 있는 것을 비롯하여 세계적으로 많은 자회사를 갖고 있다. 셀룰라제의 경우, CMC아제 분석법, 엔도비스코메트릭 분석법, 아비셀라제 분석법, 베타-글루카나제 분석법, RBBCMC아제 분석법, 셀라자임 C 분석법과 같은 시판 분석법을 예로 들 수 있다. 자일라나제 분석법 또한 시판된다(예를 들면, DNS 및 메가자임). 다른 것들도 당업자들에게 잘 알려져 있으며 본 주제와 관련한 일반 문헌으로부터 찾아 볼 수 있고, 그러한 정보는 본 명세서에 참고 인용한다. 예를 들면, 문헌["Methods in Enzymology" Volume 1(1955)에서 Volumes 297-299(1998)까지]을 참조할 수 있다. 숙주에 의한 그것의 우수한 인식능을 보장하기 위해서는 크리소스포리움 프로모터 서열을 적용하는 것이 적합하다.
본 발명자들은 이종 발현 조절 서열이 천연 크리소스포리움 서열과 같이 크리소스포리움 내에서와 같이 효과적으로 작동한다는 것을 발견하게 되었다. 이것은 잘 알려진 작제물 및 벡터를 크리소스포리움의 형질전환에 사용 가능하게 할 뿐만 아니라 이러한 신규 발현 및 분비 숙주 내에서 우수한 발현 속도를 가능하게 하는 벡터를 작제하기 위한 무수한 다른 가능성을 제공할 수 있다. 예를 들면, 표준 아스퍼길러스 형질전환 기법은, 예를 들면 문헌[Christiansen 등, Bio/Techol. 6:1419-1422(1988)]에 설명되어 있는 바와 같이 사용할 수 있다. 아스퍼길러스 형질전환 벡터에 대한 상세한 설명을 제공하는 다른 문헌, 예를 들면 미국 특허 제4,816,405호, 제5,198,345호, 제5,503,991호, 제5,364,770호 및 제5,578,463호, EP-B-215.594호(또한 트리코더마의 경우) 및 이들 특허의 내용은 본 명세서에 참고 인용되어 있다. 셀룰라제에 대한 매우 높은 발현 속도가 크리소스포리움 균주에 있어 확인되었기 때문에, 그러한 단백질의 발현 조절 부위는 특히 바람직하다. 본 발명자들은 구체적 예로서 앞에서 언급한 기탁된 크리소스포리움 균주로 언급한다.
크리소스포리움으로부터 유래하는, 바람직하게는 크리소스포리움 루크노웬세 로부터 유래하는 핵산 발현 조절 부위를 포함하는 핵산 작제물 또는 이것의 유도체는 본 발명의 바람직한 구체예를 형성하며, 그러한 돌연변이 크리소스포리움 균주는 발현하고자 하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자에 작동가능하게 결합되어 있는 핵산 발현 조절 부위를 포함한다. 그러한 핵산 작제물은 이하에서 상세히 설명하고 있는 바와 같이 셀룰라제 또는 자일라나제 발현, 바람직하게는 셀로바이오히드롤라제 발현 또는 글리세르알데히드 포스페이트 데히드로게나제 발현과 관련된 크리소스포리움으로부터 유래하는 발현 조절 부위이다. 본 발명에 따른 핵산 서열은 크리소스포리움 균주로부터 얻는 것이 적합할 수 있으며, 그러한 균주는 명세서의 다른 부분에 정의되어 있다. 프로모터 서열을 결정할 수 있는 방식은 해당 기술 분야에 무수히 많고 잘 알려져 있다. 관련 유전자의 개시 지점에 있는 ATG 코돈의 상류 부위의 뉴클레아제 결실 실험은 그러한 서열을 제공한다. 또한, 예를 들면 일치 서열의 분석은 중요한 유전자를 발견하는 것을 유도할 수 있다. 하이브리드화 기법 및 증폭 기법을 이용하면, 당업자들은 상응하는 프로모터 서열에 용이하게 도달할 수 있다.
C1 엔도클루카나제의 프로모터 서열은 상응하는 유전자를 클로닝함으로써 그러한 방식으로 확인되었다. 본 발명에 따른 프로모터는 55 kDa 셀로바이오히드롤라제(CBH1) 프로모터, 30 kDa 자일라나제(Xyl1) 프로모터, 및 글리세르알데히드 포스페이트 데히드로게나제 프로모터인 것이 바람직한데, 그 이유는 이들 효소가 그 자신들의 프로모터에 의해 고도로 발현되기 때문이다. 상응하는 프로모터 서열은 서열 번호 1(CBH1의 경우) 및 서열 번호 3(Xyl1의 경우) 각각에 주어진 서열 정보를 사용하여 WO 00/20555호에 설명되어 있는 바와 같이 클로닝함으로써 직접적인 방식으로 확인되었다. 크리소스포리움의 탄수화물 분해 효소의 프로모터, 특히 C1 프로모터는 숙주 유기체, 특히 진균 또는 다른 미생물 숙주 유기체 내에 원하는 폴리펩티드를 발현시키는 데 유리하게 사용할 수 있다. 서열 번호 1, 3 및 5에 주어진 서열 또는 다른 크리소스포리움 유전자와 서열 동일성이 65% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상인 프로모터 서열은 동일하며, 본 발명의 일부이다.
또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 재조합 균주 및 핵산 서열의 특수한 구체예를 실시예에 언급하고 있다. 또한, 본 발명자들은 고 발현 프로모터 서열, 특히 진균, 예를 들면 아스퍼길러스 및 트리코더마에 대하여 개시되어 있는 것과 같은 진균 내에서 고도의 발현을 제공하는 프로모터 서열을 설명하고 있는 재조합 균주를 선행 기술로 언급하고 있다. 이 선행 기술, 예를 들면 미국 특허 제5,252,726호(노보) 및 미국 제5,705,358호(우닐레버)는 아스퍼길러스에 사용하기 위한 다수의 발현 조절 부위를 제공한다. 이러한 선행 기술의 내용은 본 명세서에 참고 인용되어 있다.
히드로포빈 유전자는 고도로 발현되는 진균 유전자이다. 따라서, 제시된 바에 의하면, 바람직하게는 크리소스포리움으로부터 유래한 히드로포빈 유전자의 프로모터 서열은 본 발명의 적당한 구체예에서 발현 조절 서열로서 적절히 적용될 수 있다. 히드로포빈에 대한 트리코더마 리세이 및 트리코더마 하지아눔(Trichoderma harzianium) 유전자 서열은 예를 들면 선행 기술에 개시되어 있을 뿐만 아니라 아스퍼길러스 퍼미가투스(Aspergillus fumigtus) 및 아스퍼길러스 니덜란스에 대한 유전자 서열, 그리고 관련 서열 서열 정보는 본 명세서에 참고 인용되어 있다(Munoz 등,Curr. Genet.1997, 32(3); Nakari-Setala T. 등, Eur.J. Biochem.1996 15:235(1-2):248-255, M. Para 등,Infect. Immun.1994 62(10): 4389-4395 및 Stringer M.A. 등,Mol. Microbiol.1995 16(1): 33-44). 이러한 서열 정보를 사용하면, 당업자는 이미 앞에서 제시한 바와 같이 표준 기법을 수행하는 부적절한 시험을 하지 않고도 크리소스포리움 히드로포빈 유전자의 발현 조절 서열을 얻을 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 크리소스포리움 균주는 목적 폴리펩티드를 암호화하는 서열에 작동가능하게 결합된 히드로포빈-조절 부위를 포함할 수 있다.
발현 조절 서열은 또한 인핸서 또는 사일런서를 더 포함할 수 있다. 이들은 또한 선행 기술에 잘 알려져 있고, 보통 프로모터로부터 일정 거리를 두고 위치해 있다. 발현 조절 서열은 또한 작동자 결합 부위 및 억제자 결합 부위를 지닌 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 경우, 그러한 부위는 또한 이러한 유형의 조절을 제제거하도록 변형될 수 있다. creA 부위가 존재하는 사상균 프로모터가 설명되고 있다. 그러한 creA 부위는 비돌연변이된 부위의 존재로부터 보통 형성되는 글루코스 억제가 확실하게 제거되도록 돌연변이될 수 있다. WO 94/13820호(Gist-Brocades)에서는 이러한 원리를 예시하고 있다. 그러한 프로모터의 사용은 글루코스의 존재 하에 프로모터에 의해 조절되는 핵산 서열로 암호화된 폴리펩티드의 생산을 가능하게 한다. 동일한 원리를 WO 97/09438호부터 명백히 알 수 있다. 이러한 프로모터들은 creA 부위를 함유하거나 또는 함유하지 않은 채로 사용할 수 있다. creA 부위가 돌연변이되어 있는 돌연변이는 본 발명에 따른 재조합 균주 내에서 발현 조절 서열로서 사용할 수 있고, 따라서 이 재조합 균주가 조절하는 핵산 서열은 글루코스의 존재 하에서 발현될 수 있다. 그러한 크리소스포리움 프로모터는 WO 97/09438호에 예시되어 있는 것과 유사한 방식으로 활성화를 보장한다. creA 부위의 실체는 선행 기술로부터 알려져 있다. 대안으로, 억제 시스템 내, 예를 들면 creA 유전자 자체 내 어느 곳에서 돌연변이를 갖는 숙주 균주에서 돌연변이되지 않은 CreA 결합 부위를 함유한 프로모터를 이용하여, 균주는 creA 결합 부위의 존재에도 불구하고 글루코스의 존재 하에서 단백질 또는 폴리펩티드를 생성할 수 있게 하는 것이 가능하다.
종결신호 서열은 또한 발현 조절 서열이고, 발현하고자 하는 서열의 3' 말단에 작동가능하게 결합된다. 임의의 진균류 종결신호는 본 발명에 따른 숙주 크리소스포리움 균주에서 작용하는 것으로 생각된다. 예로는 에이.니덜란스 trpC 종결신호(1), 에이. 나이거 알파-글루코시다제 종결신호(2), 에이. 나이거 글루코아밀라제 종결신호(3), 무코르 미헤이카르복시 프로테아제 종결신호(미국 특허 제5,578,463호) 및 트리코더마 리세이 셀로바이오히드롤라제 종결신호가 있다. 본래, 크리소스포리움 종결신호 서열은 크리소스포리움 내에서 작용을 하는데, 예를들면 CBH1 종결신호가 적합하다.
본 발명에 따라 사용하고자 하는 적당한 재조합 크리소스포리움 균주는 시그널 서열로서 정의된 아미노산 서열을 암호화하는 서열에 작동가능하게 결합된 핵산 서열을 발현시킨다. 시그널 서열은, 발현된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 작동가능하게 결합되었을 때, 숙주 진균으로부터 그 분비를 허용할 수 있는 아미노산 서열이다. 그러한 시그널 서열은 이종 폴리펩티드와 정상적으로 결합된 것일 수 있거나, 또는 숙주에 대하여 천연인 것일 수 있다. 또한, 상기 시그널 서열은 숙주 또는 폴리펩티드에 대하여 외부 물질일 수 있다. 시그널 서열을 암호화하는 핵산 서열은 시그널 서열 및 이종 폴리펩티드의 번역을 허용할 수 있는 프레임 내에 위치할 수 있다. 크리소스포리움 균주로부터 폴리펩티드의 분비를 허용할 수 있는 임의의 시그널 서열도 고려된다. 그러한 시그널 서열은 진균 시그널 서열, 바람직하게는 아스코마세트(ascomycete) 시그널 서열인 것이 적합하다.
시그널 서열의 적당한 예로서는 일반적으로 효모 또는 다음과 같은 진균의 특정 속중 임의의 것으로부터 얻을 수 있다. 즉, 아스퍼길러스, 트리코더마, 크리소스포리움, 피키아(Pichia), 뉴로스포라(Neurospora), 리조무코르(Rhizomucor), 한세눌라(Hansenula), 휴미콜라(Humicola), 무코르(Mucor), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 푸사리움(Fusarium), 페니실리움(Penicillium), 사카로마이세스(Saccharomyces), 탈라로마이세스(Talaromyces) 또는 이들의 또다른 생식형 예컨대, 에메리셀라(Emericella) 및 히포크레아(Hypocrea). 특히 유용한 시그널 서열은 종종 다음의 단백질들, 즉 셀로바이오히드롤라제, 엔도글루카나제, 베타-갈락토시다제, 자일라나제, 펙티나제, 에스테라제, 히드로포빈, 프로테아제 또는 아밀라제와 천연적으로 결합되어 있다. 그 예로서는 아스퍼길러스 또는 휴미콜라의 아밀라제 또는 글루코아밀라제(4), 아스퍼길러스 오리재의 TAKA 아밀라제, 아스퍼길러스 나이저의 알파-아밀라제, 무코르의 카르복실 펩티다제(US 5,578,463), 리조무코미에하이의 리파제 또는 프로티나제, 트리코더마의 셀로바이오히드롤라제(5), 페니실리움 카네센스의 베타-갈락토시다제 및 사카로마이세스의 알파 교배 인자를 포함한다.
이와는 달리 시그널 서열은 바실러스 균주의 아밀라제 또는 서브틸리신 유전자로부터 얻을 수 있다. 숙주 균주로서 동일한 속으로부터 유래한 시그널 서열은 대부분 특이적 숙주에 특이적으로 변형되기 때문에 매우 적당하므로 상기 시그널 서열은 크리소스포리움, 특히 상기된 바와 같은 크리소스포리움 균주 C1, 균주 UV13-6, 균주 NG7C-19 및 균주 UV18-25의 시그널 서열인 것이 바람직하다. 사상균, 효모 및 박테리아로부터 유래한 시그널 서열이 유용하다. 비진균성 유래의 시그널 서열도 또한 유용한 것으로 간주되는데, 특히 박테리아, 식물 및 포유동물에 유용하다.
본 발명의 구체예 중 임의의 것에 의하여 사용되는 재조합 숙주는 선별 마커를 추가로 포함한다. 이러한 선별 마커는 형질 전환된 세포 또는 형질 감염된 세포의 선별을 용이하게 한다. 선별 마커는 종종 비형질감염 균주에 대하여 외래의 특정 유형의 내성을 제공하는 유전자 생성물을 암호화한다. 이는 일반적으로 중금속, 항생제 및 살균제에 대한 내성일 수 있다. 원영양성은 또한 비항생제 다양성의 선별 마커로서 유용하다. 이러한 생성물의 보다 신속하고 덜 복잡한 규제 승인의 관점에서 목적 단백질 또는 폴리펩티드가 식품 또는 약제에 사용되는 경우 비항생제 선별 마커가 바람직할 수 있다. 이러한 마커로서 GRAS 지표가 매우 자주 사용된다. 이러한 마커들 다수는 당업자의 입수가 용이하다. 예를 들어 FDA에서 이것의 목록을 제공한다. 가장 일반적으로 사용되는 것들로서는 약품에 대한 내성을 부여하거나 또는 영양 결핍을 구제하는 군 예컨대, amdS(아세트아미다제), hph(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제), pyrG(오로티딘-5'-포스페이트 디카복실라제), trpC(안트라닐레이트 신타제), argB(오르니틴 카바모일트랜스퍼라제), sC(설페이트 아데닐트랜스퍼라제), bar(포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제), 글루포시네이트 내성, niaD(니트레이트 리덕타제), 블레오마이신 내성 유전자, 더욱 구체적으로 Sh 블레, 설포닐우레아 내성 유전자 예컨대, 아세토락테이트 합성효소 돌연변이 ilv1을 포함하는 군으로부터 선택된 선별 마커가 있다. 또한 선별은 선별 마커가 별개의 벡터상에 존재하거나 또는 목적 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드 암호화 서열인 선별 마커가 동일한 핵산 단편상에 존재하는 경우인 공동 형질전환에 의하여 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 이종 폴리펩티드란 용어는 본 발명에 의한 발현에 사용되는 크리소스포리움 숙주 균주에 의하여 분비되나 정상적으로 발현되지는 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 폴리펩티드는 예를 들어, 포유동물, 어류, 곤충 또는 미생물 기원과 같은 식물 또는 동물(척추 동물 또는 무척추 동물) 기원일 수 있으나, 단 이는 숙주 균주에서 생성되지는 않는다. 포유동물로서는 인간을 포함할 수 있다. 미생물은 바이러스, 박테리아, 고세균 및 진균 즉, 사상균 및 효모를 포함한다. Bergey's Manual for Bacterial Determinology는 박테리아 및 고세균의 충분한 목록을 제공한다. 약학적 목적으로, 인간 단백질로서 존재하는 것이 바람직하므로 바람직한 구체예를 이루는 본 발명에 의한 재조합 숙주는 폴리펩티드가 인간 기원의 것인 숙주일 것이다. 식품 생산과 같은 목적을 위하여, 이종 폴리펩티드는 동물, 식물 또는 조류 기원인 것이 적당할 것이다. 따라서 이러한 구체예들은 또한 본 발명의 적당한 예로서 간주된다. 유용한 또 다른 구체예들로서는 박테리아, 효모, 바이러스, 고세균 및 진균 기원중 임의의 것의 이종 폴리펩티드를 포함한다. 진균 기원이 가장 바람직하다.
본 발명의 적당한 구체예는 변형된 코돈 이용법이 사용된 이종 핵산 서열을 포함한다. 이러한 서열은 이것이 유래된 숙주의 천연 아미노산 서열을 암호화하나, 상이한 핵산 서열, 즉 임의의 코돈이 동일한 아미노산을 암호화하지만 발현용으로 사용되는 숙주 균주에 의하여 더욱 용이하게 사용되는 다른 서열로 치환된 핵산 서열을 보유한다. 이로써 이종 핵산 서열의 발현을 보다 양호하게 할 수 있다. 이는 당업자에게 일반적인 관례이다. 이와 같은 변형된 코돈 이용법은 비진균성인 코돈을 사용하는 것에 대해서 공지의 진균 코돈을 사용하는 것을 기초로하여 수행될 수 있다. 또한 크리소스포리움 자체의 코돈을 사용하도록 보다 특이적으로 변형시킬 수도 있다. 유사성은 트리코더마에서 관찰되는 코돈 이용법과 같다. 헤미콜라 및 아스퍼길러스는 이 코돈을 변형시키지 않고 이러한 유기체의 서열을 치환시킬 수 있어야 한다. 이러한 진균의 코돈 이용법에 관한 상세한 사항은 당업자에게 명백한것으로서 본원에 참고 문헌으로서 인용되어 있다.
본 발명은 상기 재조합 크리소스포리움 균주에 한정되는 것은 아니지만, 크리소스포리움 균주에 대한 동종 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 크리소스포리움 균주를 포함하기도 하며, 여기서 상기 핵산 서열은 발현 조절 영역에 작동가능하게 연결되어 있으며 상기 재조합 균주는 동일한 조건하에서 해당 비재조합 균주보다 단백질을 다량 발현한다. 목적 상동성 폴리펩티드의 경우, 본원에서 이미 기술된 히드롤라제, 프로테아제 또는 탄수화물 분해 효소와 같은 중성 또는 알칼리성 효소가 바람직하다. 폴리펩티드는 또한 산성일 수도 있다. 재조합 균주는 비재조합 균주보다 더욱 다량으로 폴리펩티드를 발현한다. 이종 폴리펩티드에 대한 모든 논의 사항들은 또한 상동성 폴리펩티드 셀룰라제에 대하여 유효하다(뮤타티스 뮤탄디스; mutatis mutandis).
그러므로, 본 발명은 또한 도입된 서열이 크리소스포리움 기원일 수 있는 유전적으로 조작된 미생물 균주를 포함한다. 하지만, 이러한 균주는, 예를 들어 크리소스포리움을 형질 전환시키거나 또는 형질 감염시키는 데 사용되는 핵산 서열에 존재하는 이종 서열, 목적 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 복수개의 카피의 존재, 이들이 동일한 조건에서 조작되지 않은 균주의 경우를 초과하는 양으로 발현되는 점 또는 보통 비발현성인 조건하에서 발현된다는 점에 의하여 천연 생성 균주와 구별될 수 있다. 만약 유도성 프로모터가 비재조합체와는 반대로 목적 서열을 조절하거나, 또는 다른 인자가 미조작된 균주의 경우보다 발현을 촉진하면 후자의 경우일 수 있다. 본 발명은 고전적인 유전자 기법 또는 유전자 조작 방법을 사용하는 조작을 통하여 유래되는 균주에 관한 것이다.
본 발명에 의한 발현 시스템 및 이를 함유하는 숙주 균주는 탄수화물 분해 효소(셀룰라제, 자일라나제, 만나제, 마노시다제, 펙티나제, 아밀라제 예컨대, 글루코아밀라제, α-아밀라제, α-갈락토시다제 및 β-갈락토시다제, α-글루코시다제 및 β-글루코시다제, β-글루카나제, 키티나제, 키타나제), 프로테아제(엔도프로테아제, 아미노-프로테아제, 아미노펩티다제 및 카복시펩티다제, 케라티나제), 기타 히드롤라제(리파제, 에스테라제, 피타제), 산화환원효소(카탈라제, 글루코스 산화효소) 및 트랜스퍼라제(트랜스글리코실라제, 트랜스글루타미나제, 이소머라제 및 인버타제)로부터 선택된 이종 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 의하여 생성되는 가장 흥미있는 생성물로서는 셀룰라제, 자일라제, 펙티나제, 리파제 및 프로테아제가 있는데, 여기서 셀룰라제 및 자일라제는 베타-1,4-결합을 절단하고, 셀룰라제는 엔도글루카나제, 셀로바이오히드롤라제 및 베타-글루코시다제를 포함한다. 이들 단백질은 당업계에 공지된 다수의 산업적 방법에서 매우 유용하다. 특히 셀룰라제에 있어서는, 셀로바이오히드롤라제 및 엔도글루카나제의 사용에 관하여 기술되어 있는 WO 98/15633을 예로 들 수 있다. 상기 출원의 내용은 본원에 참고 문헌으로서 인용되어 있다.
본 발명에 따른 재조합체는 산성의 pH, 즉 6 미만, 5.5 미만, 더욱 적합하게는 5 미만, 심지어 4보다 낮은 pH에서 불안정하거나 또는 불활성화된 폴리펩티드를 암호하는, 목적 폴리펩티드 암호의 핵산 서열을 가질 수 있다. 이것이 특히 흥미로운 구체예가 되는 이유는 일반적으로 개시된 진균에 의한 발현 시스템은 중성에서 알카리성의 조건에서는 배양되지 않고 산성 pH에서 배양되기 때문이다. 그러므로, 본발명의 시스템은 산성 pH에서 불안정하거나 또는 불활성화되는 것에 민감한 단백질 또는 폴리펩티드용의 안정한 진균 발현 시스템을 제공한다.
특히, 본 발명에 따른 임의의 구체예에서 정의된 재조합 균주가 본발명의 바람직한 구체예로 간주되는데, 이 구체예에서 목적 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 pH가 5보다 높은, 바람직하게는 중성 또는 알카리성 pH(즉, 7 이상), 및/또는 6보다 높은 pH에서 최적 활성 및/또는 안정성을 나타내는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호한다. 이러한 pH 값에서 최적 활성의 50% 이상, 70% 이상, 및 심지어는 90% 이상이 특히 유용한 구체예로 인식된다. 배양 조건에서 발현된 폴리펩티드는 배양 조건에서 꼭 활성화되어야 할 필요는 없고, 사실상, 불활성화 상태의 조건하에서 배양되는 것이 유리할 수도 있다. 그것은 이의 활성형이 숙주에 유해할 수도 있기 때문이다. 그러나, 배양 조건에서 단백질이나 폴리펩티드는 안정할 것을 요구한다. 이러한 안정성은 열적 안정성일 수 있다. 또한, 이 안정성은 예컨대, 폴리펩티드 또는 단백질 조성물에 존재하는 특정 조성물 또는 화학 약품이나, 폴리펩티드 또는 단백질의 생산 방법, 또는 이의 용도에 대한 것일 수 있다. 셀룰라제 또는 리파제 등을 함유하는 세정제 조성물 중의 LAS는 단백질에 종종 해로운 화학약품의 일례이다. 이러한 용도에 사용하는 시간은 짧은 노출 시간으로부터 긴 노출시간으로 변할 수 있는데, 이로써, 안정성은 용도에 따라 변화하는 시간의 가변성 길이에 대한 것일 수 있다. 당업자는 케이스별로 정확한 조건을 설정할 수 있을 것이다.당업자는 상업적으로 사용되는 다수의 분석을 사용하여 여러가지 효소 생성물의 최적 활성을 측정할 수있다. 예를 들면 시그마 및 메가자임의 카탈로그는 그러한 것들의 예를 제시한다. 특정 예의 테스트가 본 명세서 중에 언급되어 있다. 제조업자들은 용도에 대한 가이드라인을 제공한다.
크리소스포리움 균주를 적절히 사용하여 발현시킬 목적 서열로 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있다. 이러한 균주는 비교적 바이오메스가 낮다. 본 발명자는 발효 종료 무렵 200-600 cP의 점도에서 배양시 트리코더마 리세이보다 바이오매스 양이 2-5배 적고, 또한 상응하는 조건에서, 즉 이들 각각의 최적 배양 조건에서 1500-2000 cP의 점도로 배양시 아스퍼길러스 나이거보다 바이오매스 양이 10-20배 정도 낮은 크리소스프륨 균주가 높은 발현율을 제공할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 발현율은 훨씬 적은 양의 바이오매스와 훨씬 작은 수준의 점도에서, 시판되는 두가지 균주의 발현율을 크게 능가하는 것이다. 이는 상기 크리소스포리움 균주의 발현 생산 수준이 아스퍼길러스 나이거나 트리코더마 리세이에서 얻은 발현 생산 수준보다 높다는 것을 감지할 수 있다는 것을 의미한다. 이렇게 형질전환된 또는 형질감염된 균주는 본발명의 적합한 구체예에 해당된다.
본 발명자는 상술한 조건하에서 트리코더마 리세이의 경우 2.5-5.0 g/ℓ이고, 아스퍼길러스 나이거의 경우 5-10 g/ℓ인 바이오매스 양을 나타내는 경우와는 대조적으로, 크리소스포리움 균주 C1(18-25)의 경우 0.5 - 1.0 g/ℓ의 바이오매스 양을 가진다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 실시예에서 이 과정의 자세한 사항을 언급한다.
적합한 구체예에서, 재조합 크리소스포리움 균주는 상응하는 조건 또는 동일한 조건하에서, 즉 균주 각각의 최적 배양 조건하에서 균주 UV13-6 또는 C-19 에 의해 셀룰라제 1 리터당 생성 몰량이 적어도 동일한 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하고, 가장 바람직하게는 균주 UV 18-25의 것과 적어도 동일하거나 또는 이보다 높은 단백질 또는 폴리펩티드를 생산한다.
또한, 본 발명자는 균주 UV18-25의 균사 형태, 즉 단편화된 짧은 균사 형태를 나타내는 크리소스포리움 균주 사용시 발현율과 분비율이 놀라울 정도로 높았다는 것을 발견하였다. 그러므로, 본발명에 따른 재조합 균주는 이러한 형태를 나타내는 것이 바람직하다. 그러나, 본발명은 이러한 신규하면서 진보적인 특성을 갖는 크리소스포리움의 비재조합 균주 또는 가공된 균주도 포함한다. 또한, 본발명은 동일한 발효 조건에서 C1에 비하여 감소된 발아율을 나타내는, 바람직하게는 균주 UV13-6의 발아율 미만으로, NG7C-19의 발아율 미만으로, 바람직하게는 UV18-25의 발아율 미만으로 발아 수준을 나타내는 본 발명의 구체예에 기술된 재조합 크리소스포리움 균주도 포함한다. 그러나, 본 발명은 다른 임의의 구체예와 조합하여 또는 그 자체로서 신규하고 진보한 특징을 나타내는 크리소스포리움의 비재조합 균주 또는 가공된 균주를 물론 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예는 상응하는 조건 또는 동일한 발효 조건에서 균주 NG7C-19 균주의 점도보다 낮은 점도를 지닌, 바림직하게는 UV 18-25의 점도 보다 낮은 점도를 지닌 재조합 크리소스포리움 균주를 포함한다. 그러나, 본발명은 임의의 다른 구체예와 조합하여 또는 그 자체로서 신규하면서 진보한 특징을가지는 크리소스포리움의 비재조합 균주 또는 가공된 균주를 포함한다. 본 발명자는 발효 종료시 균주 각각의 최적 배양 조건하에서 트리코더마 리세이의 경우 약 200-600 cP, 아스퍼길러스 나이거의 경우 1500-2000 cP의 점도를 나타내는 경우와는 대조적으로, UV18-25의 배양물은 10 cP 보다 낮은 점도를 보인다는 것을 발견하였다. 이러한 측정에 사용되는 과정은 실시예에 제공되어 있다.
점도 평가는 많은 경우 육안 모니터로 행할 수 있다. 성분의 유동도는 거의 고형, 소스형, 또는 액체로 존재가능한 크기로 변할 수 있다. 또한, 점도는 브룩크필드 회전 점도계, 운동학 점도 튜브, 낙하하는 볼 점도계, 또는 컵유형의 점도계를 사용하면 쉽게 확인할 수있다. 이러한 점도 배양물에서 나타나는 수득량은 1 세포당 1 유닛의 시간에 대해 상업적으로 알려진 높은 점도에서 얻은 것보다 높다.
본 발명에 따른 이러한 낮은 점도의 가공은 배양물이 대규모 생산인 경우에 특히 바람직하다. 점도가 낮은 크리소스포리움 균주는 150,000 리터의 배양물까지의 큰 규모의 배양물에서 수행력이 매우 높다. 그러므로, 150,000 리터까지의 임의의 배양물 크기는 본발명의 유용한 구체예에 해당된다. 임의의 다른 통상의 발효 규모도 본 발명에 따른 균주에 의해 잘 수행될 수 있어야 한다. 이는 너무 조밀하고/또는 불균등하게 분포된 균사를 지닌 응집물이 대규모 생산에서 형성되는 문제가 일어날 수 있기 때문이다. 그 결과 배지가 150,000 리터보다 큰 규모의 발효 공정에서는 비효율적인 생산 공정을 유발하므로 효과적으로 사용될 수 없다. 호기과정 및 혼합과정이 문제를 일으킬 수 있는 데, 이는 산소 및 영양분을 고사시켜 배양시 바이오매스의 생산 농도를 감소시킴은 물론, 폴리펩티드의 수율의 감소/또는발효 시간을 더 길어지게 할 수 있기 때문이다. 또한, 높은 점도 및 전단이 상업적인 발효 공정 및 현재의 상업 공정에서는 바람직하지 않은 것은 이들이 생산 제한 요인이 되기 때문이다. 이러한 모든 부정적인 요인이 본 발명의 크리소스포리움 숙주에 의해 극복될 수 있는 것은 이 균주가 상기 관점에서 상업적으로 사용되는 트리코더마 리세이, 아스퍼길러스 나이거, 및 아스퍼길러스 오리재보다 훨씬 더 나은 특성을 보여 더 높은 단백질 생산량, 더 개선된 점도 특성, 그리고 더 나은 바이오매스 수치를 나타내기 때문이다.
전술한 탄수화물 분해 효소, 프로테아제, 기타 히드롤라제, 산환 환원 효소 및 전이 효소에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 진균 효소의 생산을 추가로 나타내는 본 발명의 전술한 임의의 구체예에 따른 크리소스포리움 균주는 본 발명의 특히 유용한 구체예로 생각된다. 가장 흥미로운 생성물은 특히 셀룰라제, 자일라나제, 펙티나제, 리파아제 및 프로타아제이다. 그러나, 중성 또는 알칼리성 최적 안정성 및/또는 활성, 바람직하게는 알칼리성 최적 안정성 및/또는 활성을 나타내고 탄수화물 분해 효소, 히드롤라제 및 프로테아제, 바람직하게는 히드롤라제 및 탄수화물 분해 효소에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 진균 효소의 생산을 나타내는 크리소스포리움 균주도 역시 본 발명의 구체예로서 유용하다. 비재조합 크리소스포리움의 경우에 있어서, 이들 효소는 WO 98/15633에 기재되어 있는 바와 같이 적절하게 셀룰라제가 제외된다. 특히 흥미로운 효소는 자일라나제, 프로테아제, 에스테라제, 알파 갈락토시다제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루카나제 및 펙티나제이다. 상기 효소는 전술한 것에 한정되지는 않는다. 본 명세서의 다른 곳에서 안정성 및활성에 관한 언급도 역시 여기와 같다.
본 발명은 또한 흥미로운 폴리펩티드의 생산 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명에 따른 임의의 구체예에서 발현 및 바람직하게는 폴리펩티드의 분비를 허용하는 조건하에서 숙주 균주(예컨대, 일반명 크리소스포리움, 아스퍼길러스, 트리코더마, 한세눌라, 무코르, 피치아, 뉴로스포라, 톨리포클라디움, 리조무코르, 푸사리움, 페니실리움과 같은 진균 또는 박테리아나 기타 미생물)를 배양하는 단계와 연속하여 생산되는 흥미로운 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
단백질이나 폴리펩티드가 언급되는 경우, 변종 및 돌연변이, 예컨대 중성 발생 단백질의 치환, 삽입 또는 결실 돌연변이는 비돌연변이의 활성을 나타내는 것이 포함되는 것으로 의도된다. 동일한 것은 해당 핵산 서열에 관하여도 타당하다. 유전자 셔플링, 단백질 공학 및 진화 유도 부위 지정 돌연변이 및 무작위 돌연변이와 같은 과정이 진행되어 상기 폴리펩티드, 변종 또는 돌연변이가 얻어질 수 있다. US 5,223,409, US 5,780,279 및 US 5,770,356은 진화 유도의 교시를 제공한다. 이 과정을 사용하여, 예컨대 오류성 PCR을 통한 유전자 셔플링에 의하여 만들어진 무작위 돌연변이 유전자 서열의 라이브러리가 임의의 세포 종류에서 발생한다. 각 유전자는 분비 영역 및 이에 부착된 부동 영역을 보유하므로 생성되는 단백질은 분비되어 숙주 표면에 고착된 채로 유지된다. 이어서 특별한 폴리펩티드의 생물학적 활성을 요하는 조건을 형성한다. 이것을 다수 사이클 동안 일으켜 궁극적으로 원하는 특성을 갖는 최종 유전자를 유도한다. 다시 말하면, 진화 유도 과정은 가속된다. 또한, US 5,763,192에는 통계학적으로 일반화된 서열을 커플링하는 합성 폴리뉴클레오티드를 숙주내로 도입한 후 해당하는 소정의 특성을 갖는 숙주 세포를 선별하는 방식에 의하여 DNA, RNA, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 얻는 공정이 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 방법은 "진화 유도" 공정에 적용되는데, 여기서 신규한 단백질 암호 DNA 서열이 제조되고, 암호화된 단백질은 숙주 세포 내에서 발현되며, 원하는 특성을 갖는 단백질을 암호하는 이들 서열은 돌연변이되고 다시 발현된다. 이 과정은 원하는 특성을 갖는 단백질을 얻어질 때까지 다수의 주기 동안 반복된다. 외인성 단백질을 암호하는 신규한 DNA 서열이 제조될 수 있는 공정의 예로는 유전자 셔플링, 단백질 엔지니어링, 오류성 PCR, 지정부위 돌연변이 및 조합과 무작위 돌연변이가 있다. 미국 특허 제5,223,409호, 제5,780,279호 및 제5,770,356호는 진화 유도의 교시를 제공한다. 또한, 문헌[Kuchner and Arnold,Trends in Biotechnology, 15:523-530(1997); Schmidt-Dannert and Arnold,Trends in Biotech., 17:135-136(1999); Arnold and Volkov,Curr. Opin. Chem. Biol., 3:54-59(1999) ; Zhao et al.,Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2nd Ed., (Demain and Davies, eds.) pp.597-604, ASM Press, Washington DC, 1999; Arnold and Wintrode,Encyclopedia of Bioprocess Technology:Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, (Flickinger and Drew, eds.) pp.971-987, John Wiley & Sons, New York, 1999; and Minshull and Stemmer,Curr. Opin. Chem. Biol.3: 284-290]을 참고하라.
조합 돌연변이의 적용은 문헌[Hu et al., Biochemistry. 1998 37:10006-10015]에 기재되어 있다. US 5,763,192에는 확률적으로 합성 서열을 제조하고 이들을 숙주에 도입한 후 원하는 특성을 갖는 숙주 세포를 선별하는 것에 의한 신규한 단백질 암호 DNA 서열을 얻는 공정이 기재되어 있다. 인위적인 유전자 재조합(DNA 셔플링) 방법으로서는 무작위 프라이밍 재조합[Z. Shao, et al.,Nucleic Acids Res., 26:681-683 (1998)], 스테거드(staggered) 확장 공정[H. Zhao et al.,Nature Biotech., 16:258-262 (1998)], 및 헤테로이중 재조합[A. Volkov et al.,Nucleic Acids Res., 27:el8 (1999))]이 있다. 오류성 PCR은 또 하나의 접근 방법이다[Song and Rhee, Appl.Environ. Microbiol. 66:890-894 (2000)].
진화 유도 공정 중의 선별 단계를 수행하기 위한 2가지의 광범위하게 실행되는 방법이 있다. 하나의 방법에 있어서, 흥미로운 단백질 활성은 어떻게 해서든지 숙주 세포의 생존에 본질적이도록 만들어진다. 예를 들면, 원하는 활성이 pH 8에서 셀룰라제 활성인 경우, 셀룰라제 유전자는 돌연변이되어 숙주 세포로 도입될 수 있다. 형질변환체를 단일의 탄소원으로 셀룰로스를 가지고 증식시키고 pH를 몇몇의 생존체가 남아 있을 때까지 점점 높인다. 비교적 높은 pH에서 셀룰라제 활성을 암호하는 것으로 생각되는 상기 생존체로부터 얻은 돌연변이된 셀룰라제 유전자를 돌연변이의 또 하나의 과정에 적용시키고, 이 공정을 pH 8의 셀룰로스에서 증식할 수 있는 형질변환체를 얻을 때까지 반복한다. 효소의 내열성 변종은 유전자 돌연변이의 수회의 주기 및 숙주 세포의 고온 배양에 의하여 유사하게 진화될 수 있다[Liao et al.,Proc. Natl. Acad Sci.USA 83:576-580 (1986); Giver et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 95:12809-12813 (1998)].
대규모의 유사한 "적자생존" 접근법의 대안은 일련의 선별 방법이다. 이 접근법에 있어서, 개개의 형질전환체는 표준 배지 상에서 증식하는 콜로니 주변의 투명하거나 색깔이 있는 영역의 관찰, 색채계나 형광계 효소 분석법, 면역 분석법, 결합 분석법 등과 같은 전통적인 방법에 의하여 선별된다. 예를 들어, 문헌[Joo et al.,Nature399:670-673 (1999)]에는 공효소로서 NADH를 필요로 하지 않는 사이토크롬 P450 모노옥시게나제가 수회의 돌연 변이 및 선별 주기에 의하여 진화되었다고 기재되어 있고, 문헌[May et al.,Nature Biotech. 18:317-320 (2000)]에는 반대의 스테레오 선택성인 히단토이나제(hydantoinase)가 유사한 방식으로 진화되었다고 기재되어 있으며, 문헌[Miyazaki et al.,J. Mol. Biol.297:1015-1026 (2000)]에는 내열성 서브틸리신이 진화되었다고 기재되어 있다.
표준 클로닝 기술 및 단백질 또는 폴리펩티드 분리 기술을 이용하여 필요한 서열 정보를 얻을 수 있다. 공지된 서열 부분을 프로브로 사용하여 기타 속 및 균주의 기타 상동체를 분리할 수 있다. 특정 효소 활성을 암호하는 핵산 서열을 이용하여, 예컨대 크리소스포리움 라이브러리를 선별할 수 있다. 당업자는 어떠한 하이브리드화 조건이 적당한 것인지 이해할 것이다. 라이브러리의 핵산 하이브리드화 구성 및 클로닝 기술에 대한 종래 방법은 문헌들[Sambrook 등 (Eeds)(1989), "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor, Press Plainview, New York, 및 Ausubel 등 (Eds), "Current Protocols in Molecular Biology" (1987) John Wiley and Sons, New York]에 기재되어 있다. 관련 정보는 또한 최근의 핸드북 및 특허, 그리고 당업계의 다양한 시판 키트로부터 유도해 낼 수도 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 단백질 또는 폴리펩티드 또는 그 전구체를 발현, 바람직하게는 분비할 수 있는 조건하에서 본 발명에 따라 균주를 배양하는 단계, 및 그 결과로 생성된 폴리펩티드를 회수하는 단계, 및 선택적으로 상기 전구체를 추가 분리 및 정제하여 당해 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함한다. 그러한 방법은 상기 전구체를 당해 폴리펩티드 또는 전구체로 절단시키는 단계를 적절하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 절단 부위가 분비 단백질 담체 및 당해 폴리펩티드에 결합되는 경우, 상기 절단 단계는 Kex-2류 프로테아제, 임의의 염기성 아미노산 쌍 프로테아제(basic amino acid paired protease) 또는 Kex-2를 이용하여 수행할 수 있다. 당업자는 Kex-2류 프로테아제 서열을 용이하게 찾아낼 수 있다. 왜냐하면, 그 일치 서열에 대한 세부사항을 입수할 수 있고, 다수의 대체물, 예를 들어 퓨린이 이미 공개되어 있기 때문이다.
본 발명의 어느 구체예에 따른 폴리펩티드의 제조 방법에 있어서, 배양은 pH 5 이상, 바람직하게 pH 5∼10, 더욱 바람직하게 pH 6∼9에서 수행하는 것이 적당하다. 그러한 방법에 있어서, 배양은 25∼43℃, 바람직하게 30∼40℃에서 수행하는 것이 적당하다. 본 발명에 따른 방법에서 사용하는 균주는 재조합 크리소스포리움 균주 또는 기타 진균 또는 비진균 균주가 매우 적당하다. 그러한 경우에 있어서 본 발명에 따른 방법은 추가로 본 발명에 따른 재조합 균주의 생산 단계를 먼저 행할 수 있다. 적절한 조건의 선택은 발현되는 폴리펩티드의 성질에 따라 달라질 것이며, 그러한 선택은 당업자의 통상적인 실시 영역내에 있다.
본 발명에 따른 재조합 균주의 생산 방법도 본 발명의 일부분을 이룬다. 상기 방법은 이종성 또는 상동성 폴리펩티드를 암호하는 핵산 서열을 적당한 숙주 균주 내로 안정되게 도입하는 단계를 포함하는데, 상기 핵산 서열은 발현 조절 영역에 작동가능하게 결합되며, 상기 도입은 사상균류를 형질전환시키기 위한 공지된 방법으로 행해진다. 전술한 바와 같은 다수의 참고 문헌을 이용할 수 있는데, 이들에는 소선별(small selection)이 언급되어 있다. 상기 제공된 정보는 당업자가 과도한 부담없이 상기 방법을 수행할 수 있게 하는 데 충분하다. 상기 방법은 본 발명에 따른 재조합 균주의 다양한 구체예에 기술된 어느 핵산 성분 그 자체 또는 그들의 조합을 포함하는 핵산 서열의 도입 단계를 포함한다.
상기 도입 방법의 예로서 원형질체 형질전한 방법을 이용하여 상기 도입을 행할 수 있다. 이 방법은 실시예에 기재되어 있다. 대안적인 원형질체 또는 스페로플라스트(spheroplast) 형질전환 방법이 공지되어 있으며, 그러한 방법은 기타 사상균류에 대한 선행 기술에 기술되어 있는 바와 같이 이용할 수 있다. 그러한 방법의 상세한 내용은 다수의 참고 문헌에 기재되어 있으며, 따라서 그러한 참고 문헌은 본 명세서에 포함된다. 본 발명에 따른 방법은 당해 폴리펩티드를 암호하는 소정 서열의 도입을 위한 출발 물질로서 비재조합 균주를 이용하는 단계를 적당하게 포함한다.
본 발명은 또한 크리소스포리움 효소를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 pH 5 이상, 바람직하게 pH 5∼10, 더욱 바람직하게 pH 6∼9, 적당하게 pH 6∼7.5, 중성 및 알칼리 pH 영역의 예로서 pH 7.5∼9에서, 배양 배지상에서 또는배양 배지내에서 크리소스포리움 또는 기타 균주를 배양하는 단계를 포함한다.
더욱 일반적으로, 본 발명은 중성 또는 알칼리성 최적 활성 및 또는 안정성, 바람직하게는 알칼리성 최적 활성 및/또는 안정성을 나타내는 효소를 생산하는 방법을 추가로 포함한다. pH에 관한 바람직한 범위 및 최적 활성, 그리고 그것을 측정하는 분석법은 다른 곳에서 상세히 제공된다. 상기 효소는 전술한 바와 같은 탄수화물-분해 효소, 프로테아제, 기타 히드롤라제, 옥시도리덕타제 및 트랜스퍼라제로부터 선택되며, 상기 방법은 상기 상응하는 효소-암호화 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 그러한 효소로는 크리소스포리움 효소가 적당할 것이다. 이와 같은 적당한 방법은 특히 셀룰라제, 자일라나제, 펙티나제, 리파제 및 프로테아제의 생산 단계를 포함하는데, 여기에서, 셀룰라제 및 자일라나제는 β-1,4-결합을 절단시키며, 셀룰라제는 엔도글루카나제, 셀로바이오히드롤라제 및 β-글루코시다제를 포함한다. 본 발명에 따른 방법은 전술한 바와 같은 효소를 암호하는 핵산을 포함하는 본 발명에 따른 임의의 크리소스포리움 숙주를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 비-재조합 크리소스포리움 숙주의 생산은 탄수화물 분해 효소, 히드롤라제 및 프로테아제의 생산에 관한 것임이 적당하다. 그러한 경우에 있어서, 상기 효소는 셀룰라제 이외의 것이 적당하다. 분리 방법은 WO 98/15633에 기술된 것과 유사하며, 이 문헌도 본 명세서에 참고 인용된다.
본 발명에 따라 생산한 효소도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명에 따라 비-재조합 크리소스포리움 균주로부터 크리소스포리움원의 효소를 분리할 수 있으며, 이 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 효소는 전술한 안정성, 활성 특성을 나타낸다. 적당하게, 그들은 LAS의 존재 하에서 안정하다. 특히, 전술한 안정성, 활성 특성을 갖는 pI 4∼9.5의 프로테아제, MW 25∼95 kD의 프로테아제, pI 4.0∼9.5의 자일라나제, MW 25∼65 kD의 자일라나제, pI 3.5∼6.5의 엔도글루카나제, MW 25∼55 kDa의 엔도글루카나제, pI 4∼4.5의 α,β-갈락토시다제, β-글루코시다제, MW 45∼50 kDa의 α,β-갈락토시다제, β-글루코시다제, pI 4∼5의 셀로바이오히드롤라제, MW 45∼75 kDa, 예를 들어, MW 55 kD 및 pI 4.4의 셀로바이오히드롤라제, pI 4.0∼5.0의 폴리갈락투로나제, MW 60∼70 kDa, 예를 들어, 65 kDa의 폴리갈락투로나제, pI 4∼5의 에스테라제, 및 MW 95∼105 kDa의 에스테라제를 청구한다. 상기 분자량(MW)은 SDS-PAGE에 의해 측정한 것이다. 비-재조합 효소, 즉, 천연 발생 효소는 WO 98/15633에 공개된 바와 같은 셀룰라제와는 다른 것이다. 전술한 pI 값 및 분자량의 조합을 갖는 효소가 또한 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이체 (재조합) 균주에 의해 생산한 비-단백질 산물의 (과)생산에 관한 것이다. 그러한 비-단백질 산물로는 1차 대사산물, 예를 들어, 유기산, 아미노산, 및 2차 대사산물, 예를 들어, 항생제, 예컨대, 페니실린 및 세팔로스포린 및 기타 치료제가 있다. 이들 산물은 당해 몇몇 진균 유전자가 관여하는 생화학적 경로의 조합의 결과로서 산출되는 것이다. 진균의 1차 및 2차 대사산물 및 진균 유기체에서 이들 대사산물을 생산하는 과정은 당업계에 주지되어 있다. 문헌[Martey M., The Production of Organic Acids,Current Reviews in Biotechnology, 12, 87-132 (1992)]에 1차 대사산물의 생산 방법의 예가 기술되어있다. 문헌[Penalva 등, The Optimization of Penicillin Biosynthesis in Fungi,Trends in Biotechnology16, 483-489 (1998)]에 2차 대사산물의 생산 방법의 예가 기술되어 있다.
크리소스포리움. 트리코더마(CHRYSOSSPORIUM. TRICHODERMA)의 형질전환과와 톨리포크라디움 제오데스(TOLYPOCLADIUM GEODES)의 형질전환을 비교한 실시예
2개의 배지(Gs pH 6,8 and Pridham agar, PA, pH 6,8) 상에서 2개의 비형질전환된 크리소스포리움 C1 균주와 1개의 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 참조 균주를 테스트하였다. 항생제 내성 레벨을 테스트하기 위하여, 7일된 PDA 플레이트으로부터 포자를 수집하였다. 32℃에서 선별 플레이트를 항온처리하고, 2일, 4일 및 5일 후에 기록하였다. C-1 균주 NG7C-19 및 UV18-25는 플레오마이신 및 하이그로마이신 모두에 대해 낮은 기본(basal) 내성 레벨을 보유한다는 것이 명백해 졌다. 이 레벨은 통상 실험실 균주로 사용되는 참조 티. 리세이가 보유하는 레벨에 필적할 만하다. 따라서, 상기 2개의 표준 진균 선별 마커는 크라리소스포리움 균주에 잘 사용될 수 있음이 명백하다. 다른 표준 균주 선별 마커가 갖는 문제점은 예상되지 않는다.
50 ㎍/㎖에서 Sh-ble(플레오마이신-내성) 형질전환 크리소스포리움 균주의 선별을 성공적으로 수행하였다. 이는 또한 티. 리세이에 사용된 선별 레벨이고, 따라서 크리소스포리움에서 시차 선별(differential selection)을 용이하게 수행할 수 있었다. 동일한 평가는 150 ㎍/㎖의 레벨에서 하이그로마이신 내성을 보유하는형질전환 균주에 대하여 가치있는 것이다.
가장 일반적으로 적용되는 진균 형질전환 기법에 기초하여, 크리소스포리움 상에서 원형질체 형질전환 기법을 사용하였다. 1개의 90 mm PDA 플레이트으로부터 유래한 모든 포자를 8 ㎖ IC1 내에 회수하고, 35℃ 및 200 rpm에서 15시간 동안 항온처리하기 위하여 50 ㎖ IC1 배지의 진탕 플라스크 내로 옮겼다. 이 후, 배양을 원심분리하고, MnP 중에서 펠렛을 세척하고, 10 ㎖의 MnP 및 10 mg/㎖의 카일라제 C3중의 용액 내에 되돌리고, 교반하면서(150 rpm) 35℃에서 30분 동안 항온처리하였다.
상기 용액을 여과하고, 여과물을 3500 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 10 ㎖ MnPCa2+로 펠렛을 세척하였다. 25℃에서 10분 동안 이것을 원심분리하였다. 이어서, 50 ㎕의 냉(冷)MPC를 첨가하였다. 상기 혼합물을 얼음 상에서 30분 동안 유지시키고, 그 위에 2.5 ㎖의 PMC를 첨가하였다. 15분 후, 실온에서, 선별제로서 플레오마이신 또는 하이그로마이신을 함유하는 MnR 플레이트 상에 도말된 3 ㎖의 MnR Soft에 500 ㎕의 처리된 원형질체를 혼합하였다. 30℃에서 5일 동안 항온처리 후, 형질전환체를 분석하였다(클론은 48시간 후에 가시화되었다). 10 ㎍의 참조 플라스미드 pAN8-I19를 사용하여 형질전환 효율을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| 형질전환 효율(10 ㎍의 참조 플라스미드 pAN8-I 19 를 사용함) | |||
| 티. 리세이 | NG7C-19 | UV18-25 | |
| 생존율 | 106/200 ㎕ | 5 ×106/200 ㎕ | 5 ×106/200 ㎕ |
| 200 ㎕ 당 형질전환체 | 2500 | 104 | 104 |
| 106개의 생존 세포당 형질전환체 | 2500 | 2000 | 2000 |
크리소스포리움 형질전환체의 생존율은 트리코더마의 생존율보다 우수하다. 균주의 형질전환도는 상당하고, 따라서 1개의 실험에서 수득한 형질전환체의 수는 크리소스포리움의 경우가 티. 리세이의 경우보다 4배 더 많다. 따라서, 크리소스포리움 형질전환 시스템은 통상 사용되는 티. 리세이 시스템과 동등할 뿐만 아니라, 오히려 티. 리세이 시스템의 성능보다 우수하다. 이러한 개선점은 pAN8-1보다 저효율의 형질전환 벡터에 특히 유용하다는 것을 입증할 수 있다. 상기 저효율의 형질전환 벡터의 예로는 일반적으로 10배 더 소수인 형질전환체를 수득하는 비진균 단백질 제조용 단백질 캐리어 벡터를 들 수 있다.
수많은 다른 형질전환 및 발현 벡터는 동종 크리소스포리움 단백질 암호화 서열 및 이종 단백질 암호화 서열로 구축되는데, 이는 크리소스포리움으로 형질전환 실험을 하는 데 유용하다.
발현 시스템의 예로는 자일라나제 오픈 리딩 프레임을 보유하는 프레임 내의자일라나제 시그널 서열 및 연이은 자일라나제 종결신호 서열과 연결된 크리소스포리움 자일라나제 Xyl1 프로모터 단편을 들 수 있다. 선별가능 벡터로서 공(共)형질전환을 사용함으로써, 형질전환체 선별을 수행하였다.
다른 예로는 페니실리움 엔도글루카나제 3 오픈 리딩 프레임을 보유하는 프레임 내의 페니실리움 엔도글루카나제 3 시그널 서열 및 연이은 크리소스포리움 셀로바이오히드롤라제 종결신호 서열과 연결된 크리소스포리움 루크노웬세 셀로바이오히드롤라제 프로모터를 들 수 있다. 또한, 이 벡터는 선별 마커, 즉 아세트아미다제 S 유전자(AmdS 유전자)를 보유하는 제2 발현 카세트를 보유한다.
또 다른 예는 인간 인터류킨 6 오픈 리딩 프레임에 융합된 글루코아밀라제 오픈 리딩 프레임 및 아스퍼길루스 나이거 글루코아밀라제 시그널 서열에 연결된 크리소스포리움 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 1 프로모터를 포함한다. 또한, 이 벡터는 선별 마커, 즉 AmdS 유전자를 보유하는 제2 발현 카세트를 운반한다.
또 다른 예로는 엔도글루카나제 5 개방 프레임 및 연이은 아스퍼길루스 니덜란스 종결신호 서열에 연결된 아스퍼길루스 니덜란스 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 A 프로모터를 들 수 있다.
크리소스포리움 형질전환체의 이종 및 동종 발현의 실시예
C1 균주(NG7C-19 및/또는 UV18-25)의 하기 각종 이종 단백질을 분비할 수 있는 성능에 대해 테스트하였다: 박테리아 단백질(스트렙토알로테이쿠스 힌드스타누스 플레오마이신-내성 단백질, Sh-ble), 진균 단백질(트리코더마 리세이 자일라나제 II, XYN2) 및 인간 단백질(인간 리소자임, HLZ).
트리코더마 리세이 자일라나제 II(XYN2)의 C1 분비
플라스미드 pUT1064 및 pUT1065에 의해 C1 균주 UV18-25를 형질전환시켰다.
pUT1064는 하기 2개의 진균 발현 카세트를 제공한다:
제1 카세트는 플레오마이신-내성 형질전환체의 분비를 가능하게 한다:
- 뉴로스포라 크라사 크로스 패쓰웨이(cross-pathway) 조절 유전자 1(cpc-1) 프로모터14
- 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타누스 플레오마이신-내성 유전자 Sh ble4
- 아스퍼길루스 니덜란스 트립토판-신타제(trpC) 종결신호5
제2 카세트는 자일라나제 생산 카세트이다:
- 티.리세이 균주 TR2 cbh1 프로모터15
- 티. 리세이 균주 TR2 xyn2 유전자(이의 시그널 서열을 포함함)16
- 티. 리세이 균주 TR2 cbh1 종결신호15
또한, 상기 벡터는 플라스미드 pUC196으로부터 유래한 대장균(E. coli) 복제 개시점을 보유한다. 상기 플라스미드의 상세한 지도는 도 1에 제시되어 있다.
pUT1065는 하기 진균 발현 카세트를 제공한다:
- 에이. 니덜란스 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(gpdA) 프로모터2
- 합성 티. 리세이 셀로바이오히드롤라제 I(cbh1) 시그널 서열1, 3
- 캐리어 단백질10로서 사용되는 에스. 힌더스타너스 플레오마이신-내성 유전자 Sh ble4
- KEX-2 유사 프로테아제 절단 부위1를 특징으로 하는 링커 펩티드(SGERK)
- 티. 리세이 균주 TR2xyn2 유전자(시그널 서열이 없음)16
- 에아. 니덜란스 트립토판-신타제(trpC) 종결신호5
또한, 상기 벡터는 베타-락타마제 유전자(bla) 및 플라스미드 pUC186로부터 유래한 대장균 복제 개시점을 보유한다. 상기 플라스미드의 상세한 지도는 도 2에 제시되어 있다.
상기 실시예에 기술되어 있는 것과 동일한 방법에 따라, 플라스미드 pUT1064 또는 pUT1065로 C1 원형질체를 형질전환시켰다. 플라스미드 pUT1065 내의 융합 단백질(Sh ble::XYN2)은 플레오마이신 내성에 대하여 기능성이고, 따라서 C1 형질전환체의 용이한 선별을 가능하게 한다. 더욱이, 플레오마이신 내성의 수준은 대개 xyn2 발현 수준과 상관관계가 있다. pUT1064에 있어서, xyn2는 이의 시그널 서열과 함께 클로닝하였다.
다음과 같은 자일라나제 활성 분석에 의해 C1 형질전환체(플레오마이신-내성 클론)의 자일라나제 생산을 분석하였다: 제1 형질전환체는 GS+플레오마이신(5 ㎍/㎖) 플레이트(내성의 입증)에 투스피킹(toothpicking)하고, 또한 XYLAN 플레이트(청정 구역 가시화17에 의한 자일라나제 활성 검측) 상에서 투스피킹하였다. 32℃에서 5일 동안 플레이트를 배양시켰다. 확인된 각 클론을 XYLAN 플레이트 상에 서브클로닝하였다. 형질전환체당 2개의 서브클론을 사용하여 PDA 플레이트에 접종함으로써, 액체 배양 개시용 스포를 수득하였다. IC1 + 5g/l 칼륨 프탈레이트 내의 액체 배양물을 27℃에서 5일 동안 성장시켰다(180 rpm으로 진탕하면서). 이어서, 배양물을 원심분리하였다(5000 g, 10분). 상기 샘플로부터, Miller 등18에 따른 DNA 기법에 의해 자일라나제 활성을 측정하였다.
| C1(최대의 생산자)에 있어서의 활성 XYN2 생산 레벨 | ||
| 배양 배지 내의 활성자일라나제 II 농도 | 배양 배지 내의 자일라나제 II특이 활성 | |
| 비형질전환된 UV18-25 | 3.9 U/㎖ | 3.8 U/mg 총 단백질 |
| UV18-25::1064 클론 7-1 | 4.7 U/㎖ | 4.7 U/mg 총 단백질 |
| UV18-25::1064 클론 7-2 | 4.4 U/㎖ | 4.3 U/mg 총 단백질 |
| UV18-25::1065 클론 7-1 | 29.7 U/㎖ | 25.6 U/mg 총 단백질 |
| UV18-25::1065 클론 7-2 | 30.8 U/㎖ | 39.4 U/mg 총 단백질 |
상기 데이터는 다음과 같은 것을 나타낸다:
1) 실시예 2로부터 유래한 점(point) 1∼4가 확인되었다.
2) C1은 이종 진균 단백질의 분비용 숙주로서 사용될 수 있다.
실시예에 대한 부록: 배지
형질전환 배지:
만델스(Mandels) 염기:
MnP 배지:
KH2PO42.0 g/ℓ만델스 염기 +
(NH4)2SO41.4 g/ℓ펩톤 1 g/ℓ
CaCl20.3 g/ℓ수크로스 100 g/ℓ
올리고성분(oligoelement) 1.0 ㎖/ℓpH 5로 조절함
MnR
MnP Ca
2+
MnP + 수크로스130 g/ℓMnP 배지 +
효모 추출물2.5 g/ℓCaCl2·2H2O50 mM
글루코스2.5 g/ℓpH를 6.5로 조절함
아가15 g/ℓ
MnR Soft: 7.5 g/ℓ의 아가만을 보유하는 MnR
MPC:
CaCl250 mMpH 5.8
MOPS10 mM
PEG40%
선별 및 배양용
GS:
글루코스10 g/ℓ
비오소이아제(biosoyase)5 g/ℓ[메리욱스]
아가15 g/ℓpH가 6.8이어야 함
PDA:
감자 덱스트로스 아가 39 g/ℓ[딥코]
pH가 5.5이어야 함
MPG:
만델스 염기 +
칼륨 프탈레이트5 g/ℓ
글루코스30 g/ℓ
효모 추출물5 g/ℓ
50 ㎍/㎖ 플레오마이신 또는 100-150 ㎍/㎖ 히그로마이신으로 보충된 재생 배지(MnR)을 사용하여 형질전환체를 선별한다. 5 ㎍/㎖ 플레오마이신으로 보충된 GS 배지를 사용하여 항생제 내성을 확인한다.
PDA는 빠른 생장 및 양호한 포자형성을 위한 완전 배지이다. 액체 배지를 1/20의 포자 현탁액(5 ㎖ 0.1% Tween 중의 하나의 90 mm PDA 플레이트의 모든 포자)으로 접종한다. 이러한 배지를 셰이크 플라스크(200 rpm)에서 27℃에서 생장시킨다.
CBH1, XYL1 및 GPD의 유전자 발현 서열 및 C1 유전자의 분리와 특정화
UV18-25의 BlueSTAR 유전자 라이브러리의 제조
UV18-25의 염색체 DNA를 Sau3A로 부분분해시키고, 12-15 kb의 단편을 분리하고 클로닝 벡터 BlueSTAR의 BamH1 위치에 결합시켰다. 결합 혼합물의 20%를 패키징하여 4.6 x 104독립 클론의 유전자 라이브러리를 생성하였다. 이 라이브러리를 증식시켜서 4℃ 및 -80℃에서 보관하였다. 또한 결합 혼합물의 나머지를 4℃에서 보관하였다.
cbh, xyl1 및 gpd1의 유전자 분리를 위한 UV18-25의 유전자 라이브러리 스크리닝
다른 유전자의 분리를 위하여 프로브당 전체 ±7.5 x 104의 각 BlueSTAR 파지를 이중으로 하이브리드화시켰다. 하이브리드화는 동종 조건(65℃; 0.2xSSC)에서 cbh1, xyl1의 PCR 단편(WO 00/20555에 기재되어 있음), 그리고 이종 조건(53℃; 0.5xSSC)에서 에이. 나이거의 gpd1 유전자로 수행되었다. 포지티브 시그널의 수가 표 3에 나타나 있다. 포지티브 클론을 재스크리닝하고 각 클론에 있어서 두 각각의 파지를 이용하여 추가 실험을 하였다. 다른 클론의 DNA를 제한 효소 분석에 의해 분석하여 각 유전자로부터 분리된 다른 클론의 수를 결정하였다(결과를 표 3에 나타낸다). 3 유전자 각각에 대하여, 4-6개의 다른 클론을 분리하였고, 일차 유전자 라이브러리(±4-5 x 104클론)가 UV 18-25의 대략 5x 게놈을 나타낸다고 결론지었다. 이 결과로부터, UV 18-25의 완전 게놈은 9x103클론에서 나타난다고 결론을 내렸다. 13 kb의 평균 게놈 삽입체에 기초하면, 이것은 ±120 Mb의 게놈 크기를 나타낼 것이며, 이것은 아스퍼길러스 게놈 크기의 3배이다.
pBlueSTAR의 폴리링커상에 존재하는 T7 및 T3 프라이머 그리고 플라스미드(분리된 PCR 단편의 사전의 서열결정에 기초함)상에 존재하는 유전자의 특이적 프라이머로의 PCR 반응에 의하여, 다수의 클론에서 유전자의 위치를 결정할 수 있었다. 각 유전자에 있어서 유전자의 서열결정에 플라스미드를 이용하였다.
| 유전자 | 1차 스크리닝에서 포지티브 | 재스크리닝에서 포지티브 | 다른 클론 | 서열결정에 사용된 클론 |
| cbh1 | 8 | 7 | 4 | pCBH7 |
| xyl1 | 9 | 6 | 5 | pXyl5 |
| gpd1 | 12 | 12 | 6 | pGPD4 |
| 에이. 나이거의 cbh1 유전자 및 xyl1 유전자의 UV 18-25의 PCR 단편으로(동종 조건) 그리고 gpdA 유전자로의, UV 18-25 유전자 라이브러리의 7.5 x 104파지의 스크리닝. DNA 분리 및 제한 효소 분석을 이용하여 다른 클론의 수를 결정하였다. |
클로닝된 유전자의 서열 분석
cbh1, xyl1 및 gpd1 유전자에 있어서, 서열결정 결과가 각각 서열 번호 1, 3 및 5에 나타나 있다. 또한, 추정되는 단백질의 아미노산 서열이 서열 번호 2, 4 및 6에 나타나 있다. 단백질의 일부 성질은 표 4에 나타나 있다. 번역 개시 위치 및 인트론은 동일한 부류의 유전자와의 상동성에 기초한다는 것이 언급되어야 한다(즉, 페이퍼 유전학).
CBH1
CBH1의 아미노산 서열로부터 단백질의 크기가 약 63 kD이고 단백질의 C-말단 부분에 셀룰로스-결합 도메인(CBD)이 존재한다고 결론을 내렸다. 흥미롭게도 분리된 55 kD 주요 단백질에서 CBD의 존재에 대한 어떤 증거도 발견되지 않았다. 하지만, 암호화된 CBH1 단백질(서열 번호 1, 2)에서 이러한 55 kD 주요 단백질로부터의분리된 펩티드의 존재는 55 kD 단백질이 클로닝된 유전자에 의하여 암호화된다는 것을 확인시켜 준다. 이러한 결과의 가능한 설명은 55 kD 단백질이 CBD가 결핍된 CBH1 단백질의 절두형이라는 것이다.
셀로바이오히드롤라제 CBH1은 MUF-셀로바이오시드, MUF 락토시드, FP 및 아비셀에 대한 활성, 그리고 또한 p-니트로페닐 β-글루코시드, 셀로바이오스 및 p-니트로페닐 락토시드에 대한 활성을 갖는다. MUF 셀로바이오시드에 대한 그것의 활성은 0.4 mM의 억제 상수로 셀로비오스에 의하여 억제된다. MUF 셀로바이오시드에 대한 미카엘리스 상수(Michaelis constant)는 0.14 mM, MUF 락토시드에 대한 것은 4 mM, CMC에 대한 것은 3.6 g/ℓ였다. 최적 pH는 4.5∼7이고, pH 8에서 CMC에 대한 최대 활성의 50% 그리고 RBB-CMC에 대해서는 80% 활성이 유지된다. 25시간의 배양 동안에는 pH 5-8에서 70-80% 활성이 유지된다. 최적 온도는 60-70℃이다. CBH1은 셀로바이오히드롤라제 7군에 속한다. 본 발명의 바람직한 구체예인 대응하는 CBH 프로모터는 서열 번호 1에 나타나 있다.
Xyl1
Xyl1의 아미노산 서열로부터, 또한 여기서도 CBD가 N-말단 쪽에서(즉, 직접적으로 시그널 서열에 부착되거나 또는 그것으로부터 5 이하의 아미노산 거리에서) 이 단백질에 존재한다고 결론을 내렸다. 문헌상에는 CBD를 갖는 몇몇의 자일라나제가 공지되어 있다(Fusarium oxysporum, Humicola grisea, Neocallmastix patriciarum). Xyl1 단백질의 측정된 크기는 43 kD이고 30 kD 자일라나제로부터 분리된 여러 펩티드가 이 단백질(서열 번호 3, 4)로부터 유래한다. 여러 분리된 펩티드는 암호화된 서열에서 발견될 수 없었다. 이것은 또 다른 자일라나제 단백질이 UV18-25에 존재한다는 것을 나타낼 수 있다. 이전의 분석에서는, 이 30 kD 단백질에서 CBD의 존재에 대한 어떤 증거도 발견되지 않았다. 또한 이들 결과로부터 이 단백질의 CBD가 단백질분해에 의해 절단된다고 가정하였다. 이 가정은 추가로 분석될 것이다(다른 C1 균주; C1 야생형, NG7C, UV13-6, UV18-25 및 UV18-25의 프로테아제 돌연변이체에서 다른 단백질의 크기, N-말단 서열, 활성의 결정에 의하여). 또한 효소 활성에 대한 CBD 존재 또는 부재의 효과를 보다 세부적으로 분석한다. 각종 C1 숙주에서 전체 길이의 유전자의 과발현을 고려할 수 있다.
셀룰로스-결합 도메인(CBD)의 존재는 이 효소의 특별한 특징이다. N-말단 CBD를 갖는 유일한 다른 공지된 10 당분해 효소(자일라나제)는 푸사리움 옥시스포룸 Xyl1F이다. 크리소스포리움 루크노웬세 Xyl1 단백질의 CBD는 다음 서열을 갖는다: WGQCG GQGWT GPTTC VSGAVCQFVN DWYSQ CV (서열 번호 4의 아미노산 22-53). 이 서열은 미국 특허 5,763,254(Novo)에 기재된 CBD 일치 서열에 일치하지 않는다. 미국 특허 5,763,254의 일치 서열은 다음과 같다: W/Y-G/A-Q-C-G G-Q/I/N-G/N-W/F/Y-S/T/N/Q G-P/A/C-T/R/K-T/C/N-C X-X-G/P-S/T/F/L/A/- -T/K C-V/T/R/E/K-K/Q/A-Q/I-N Q/D/A-W/F/Y-Y-Y/S/H/A-Q C-L/I/Q/V/T (여기서 W/Y는 W 또는 Y 등을 의미하고, X는 임의의 아미노산을 의미하고, -는 부재를 의미한다). 최상의 축퇴 일치 서열을 갖는 4개의 차이가 xyl1에 존재하는데, 이것은 상기 서열 7에서 밑줄로 표시된다. 따라서, 본 발명은 푸사리움 옥시스포룸이 아닌 다른 그리고 이 일치 CBD와 다른 N-말단 CBD를 갖는 자일라나제에 속한다. 더 특이적으로 본 발명의 자일라나제는상기 서열 7과 적어도 55%, 특히 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 CBD를 갖는다. 바람직하게는 CBD는 위치 23에서 아미노산 Phe, Tyr, Trp을 포함하고, 또는 4개의 아미노산, 위치 20의 Val, 위치 22의 Gln, 위치 23의 phe, 위치 24의 Val 중 적어도 하나를 포함한다. 바람직한 서열은 Cys-Xaa-Phe, Xaa-Phe-Val, Cys-Xaa-Phe-Val, Cys-Gln-phe, Val-Cys-Xaa-Phe, Gln-Phe-Val, Gln-Trp-Val, Gln-Tyr-Val, Val-Cys-Gln, Val-Cys-Gln-Phe, Val-Cys-Xaa-Phe-Val 을 포함하며, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산이고 또는 바람직하게는 Val, Thr, Arg, Glu, Gln 또는 Lys이고, 또는 가장 바람직하게는 Gln 또는 Glu이다.
자일라나제는 MUF 셀로비아제 활성을 갖지 않으며 따라서 진정한 자일라나제가다. 그것은 5-8의 넓은 pH 범위에서 높은 활성을 나타내어 pH 9-10에서 최대 활성의 65%를 유지한다. 그것은 자일라나제 F군에 속한다. 본 발명의 바람직한 구체예인 대응하는 자일라나제 프로모터는 서열 번호 3에서 보여진다. 자작나무 크실란에 대한 미카엘리스 상수는 30 kD 자일라나제에 있어서 4.2 g/ℓ이다. 자일라나제에 있어서 최적 온도는 70℃와 동일하거나 높았다.
Gpd1
gpd1유전자의 C-말단부 DNA 서열은 결정하지 않는다. 이 유전자의 프로모터 서열은 본 발명의 바람직한 구체예이며, 서열 번호 5에 도시되어 있다.
4개의 크리소스포리움 유전자의 발현 수준을 노던 분석에 의해 연구하였다. 다양한 C. 루크노웬세 균주를, 셀룰로스 및 락토스가 있는 파미디아(pharmedia)를 함유하는 풍부한 배지(배지 1) 또는 파미디아 및 글루코스를 함유하는 풍부한배지(배지 2) 중에서 33℃에서 성장시켰다. 48시간 후, 균사체를 수집하고, RNA를 분리하였다. RNA를 4개의 상이한 프로브, EG5, EG6, Xy11 및 CBH와 하이브리드화시켰다. 노출 후, 노던 블롯을 긴 조각으로 만들고, 블롯 상에서 mRNA의 양에 대한 대조군으로서 리보좀 L3에 대한 프로브와 재차 하이브리드화시켰다. 대부분의 균주는 배지 1에서 CBH에 대하여 매우 높은 반응과 Xyl1에 대하여 높은 반응을 나타내었고, 배지 2에서는, 균주의 절반이 모든 유전자에 대하여 높은 반응을 나타내었고, 나머지 절반은 낮은 반응을 나타내었다. 이들 데이타로부터 발현 강도의 순서를 CBH > Xyl1 > EG5 > EG6로 추론하였다.
C. 루크노웬세의 단백질 Xyl1은 진뱅크 데이타베이스에서 그것과 가장 밀접한 상동체에 대하여 67% 동일성(72% 상동성)을 가진다(표 4). CBH1 단백질의 그것의 관련된 후미콜라 그리시아 상동체(74% 동일성/82% 상동성)에 대한 강한 상동성은 주목할 만하다. 모든 경우에서 가장 밀접한 상동체가 푸사리움, 후미콜라 또는 기타 파이레노마이세트(소르다리아마이세트) 진균(표 4)에서 기원하는 것인 한편, 크리소스포리움은 NCBI 데이타베이스에 따라서 플렉토마이세트(유로티오마이세트) 진균에 속하는 것(표 4)임을 유념한다. 그러므로, 본 발명은 또한 글리카놀리틱 효소, 특히 플렉토마이세트 진균에서 유래된, CBD를 포함하는 자일라나제 및 셀로바이오히드롤라제에 관계된다.
| 본 발명의 CBH1, Xyl1, 및 GPD1의 구조 및 비교 데이타 | ||||||
| 글리코시다제류 | C1으로부터의 분리물 d | 아미노산 개수 | 인트론 | 비고 | 관련 서열(% 동일성/% 상동성) | |
| CBH1 | 7 | 70 kD55 kD | 526(63 kD) | 1 | CBD | 후미콜라 그리시아(74/82)(CBH1:P15828)푸사리움 옥시스포룸(58/68)(CBH:P46238)뉴로스포라 크라사(60/69)(CBH1:P38676) |
| XYL1 | 10 | 30 kD | 333(43 kD) | 3 | CBD | 푸사리움 옥시스포룸(67/72)(XylF:P46239)페니실리움 심플리시쿰(63/72)(XylF:P56588)아스퍼길러스 아쿨레아투스(61/70)(XylF:O59859) |
| GPD1 | - | - | 미완성 | 2+? | - | 포도스포라 안세리나(85/89)(GPD:P32637)뉴로스포라 크라사(80/86)(GPD:U67457)크리포넥트리아 파라시티카(80/85)(GPD:P19089) |
특성에 대한 설명
도 1은 pUT1064 지도이다.
도 2는 pUT1065 지도이다.
참고 문헌(이의 내용은 참고로 포함된다)
서열 번호 1: 프로모터 및 종결신호 서열을 포함하는 완전한 크리소스포리움CBH1 유전자의 DNA 서열 및 아미노산. 프로모터 서열(1-1779), 종결신호 서열(3427-4451) 및 인트론 서열(2179-2256)은 소문자로 표시한다.
서열 번호 2: 완전한 크리소스포리움 CHB1 단백질의 아미노산. 추정 시그널펩티드(1-19)는 이탤릭 문자로 나타내고, 셀룰로스 결합 도메인(496-526)은 밑줄친 굵은 문자로 나타낸다.
서열 번호 3: 프로모터 및 종결신호 서열을 포함하는 완전한 크리소스포리움 Xyl1 유전자의 DNA 서열. 프로모터 서열(1-969), 종결신호 서열(2428-3030(3028)) 및 인트론 서열(1043-1116), 1181-1332(1331), 1596(1595)-1674(1672)는 소문자로 표시한다.
서열 번호 4: 완전한 크리소스포리움 Xyl1 단백질의 아미노산 서열. 시그널 펩티드(1-20)는 이탤릭 문자로 나타내고, 셀룰로스 결합 도메인(22-53)은 밑줄친 굵은 문자로 나타낸다.
서열 번호 5: 프로모터 서열을 포함하는 부분적인 크리소스포리움 GPD1 유전자의 DNA 서열. 프로모터 서열(1-1555) 및 인트론 서열(1682-1781)은 소문자로 표시한다. 이 유전자는 3' 말단이 결여되어 있다.
서열 번호 6: 부분적인 크리소스포리움 GPD1 단백질의 아미노산(C-말단은 이용가능한 서열에서 결여되어 있음)
Claims (15)
- 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열 1-246 또는 394-526의 해당 부분과 동일한 20개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 서열 번호 2의 아미노산 서열의 일부와 75% 이상의 아미노산 동일성[BLAST 알고리즘으로 측정]을 나타내는 크리소스포리움(Chrysosporium) 글리코실 히드롤라제 7군에 해당하는 단백질.
- 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열 1-133 또는 252-383의 해당 부분과 동일한 20개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 서열 번호 4의 아미노산 서열의 일부와 70% 이상의 아미노산 동일성[BLAST 알고리즘으로 측정]을 나타내는 크리소스포리움 글리코실 히드롤라제 10군에 해당하는 단백질.
- 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열 1-383의 해당 부분과 동일한 20개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 서열 번호 4의 아미노산 서열의 일부와 65% 이상의 아미노산 동일성[BLAST 알고리즘으로 측정]을 나타내는 크리소스포리움 글리코실 히드롤라제 10군에 해당하는 단백질.
- 서열 번호 4의 아미노산 서열 22-53과 55% 이상의 아미노산 동일성을 나타내고/나타내거나, 서열 번호 4의 아미노산 서열 22-53 유래의 20개 이상의 연속 아미노산을 포함하고/포함하거나, 상대 위치 44에서 아미노산 F, W 및 Y 중 하나를 포함하는, 셀룰로스 결합 도메인을 포함하는 글리코실 히드롤라제 10군에 해당하는 단백질.
- 서열 번호 6의 부분 아미노산 서열 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열 1-277의 해당 부분과 동일한 20개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 서열 번호 6의 아미노산 서열의 일부와 86% 이상의 아미노산 동일성[BLAST 알고리즘으로 측정]을 나타내는 크리소스포리움 글리세르알데히드 포스페이트 데히드로게나제에 해당하는 단백질.
- 제1항에 기재된 효소를 사용하는 것을 포함하는 β-글루코시드 결합의 가수분해 방법.
- 제2항, 제3항 또는 제4항에 기재된 효소를 사용하는 것을 포함하는 β-자일로시드 결합의 가수분해 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 기재된 단백질을 암호화하는 핵산 서열.
- 서열 번호 1, 3 및 5 중 어느 하나의 핵산 서열의 5'-비암호화 영역에 포함되는 뉴클레오티드의 70% 이상을 포함하는 핵산 서열.
- 서열 번호 1, 3 및 5 중 어느 하나의 핵산 서열의 5'-비암호화 영역에 포함되는 크리소스포리움 유래의 핵산 발현 조절 영역이 목적 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 포함되어 있는 핵산 작제물.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 서열을 포함하고, 이 암호화 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 미생물 균주, 바람직하게는 진균 균주.
- 제10항에 기재된 작제물 또는 제11항에 기재된 미생물 균주를 사용하여 폴리펩티드를 생산하는 방법.
- 서열 번호 1, 3 및 5 중 어느 하나의 핵산 서열의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드, 또는 이의 상보 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
- 제13항에 있어서, 프로브의 길이가 20∼50 뉴클레오티드인 것인 프로브.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 프로브가 검출가능한 표지로 표지되어 있는 것인 프로브.
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