CZ20023435A3 - Nové sekvence regulující expresi a produkty exprese v oblasti plísní - Google Patents

Description

1 ···· • · · · · · · ·· ··· ··· * » ···· >Ι/^1-3Υ1Γ

Nové sekvence regulující expresi a produkty exprese v oblasti plísní

Oblast techniky Předkládaný vynález se týká enzymů odvozených od plísní, obzvláště od kmene druhu Chrysosporium a kódujících sekvencí a sekvencí regulujících expresi pro tyto enzymy. Předkládaný vynález je rozšířením vynálezu uvedeného ve známost v WO 00/20555 (PCT/NL99/00618), vyplněného 6.10.1999, který nebyl do současné doby vydán. Tento dokument je v předkládaném vynálezu zahrnut do literatury.

Dosavadní stav techniky

Mnoho hostitelů pro expresi genu a způsobů transformace bylo dříve uvedeno v oboru. Často jsou uváděny bakterie, například Escherichia Coli. E. Coli je však mikroorganismus neschopný sekrece mnoha proteinů nebo polypeptidů a proto je nežádoucí jako hostitelská buňka pro produkci proteinu nebo polypeptidů na průmyslové úrovni. Další nevýhodou E. Coli, která je platná jako bakterie obecně, je, že prokaryota nemohou poskytovat další modifikace, požadované pro mnoho eukaryotických proteinů nebo polypeptidů produkovaných v aktivní formě. Glykosylace proteinů a vlastnost skládání proteinů jsou příklady procesů požadovaných k zajištění produkce aktivního proteinu nebo polypeptidů. K zajištění této produkce je možno použít savčích buněk, avšak nevýhodou takových buněk je, že se rozdílně uchovávají a požadují drahá prostředí. Takové transformace jsou nepraktické pro produkci proteinů na průmyslové úrovni. Proteiny by být efektivně prodávány pro přípravu drahých farmaceutických sloučenin, které jsou požadovány v relativně malých množstvích, ale obvykle ne pro průmyslové enzymy.

Bylo vyvinuto mnoho expresních systémů plísní: například Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspregillus nidulants, Trichoderma reesei. Řada dalších byla navržena, ale z různých důvodů nebyl nalezen souhlas nebo použití. Obecně musí hostitel splňovat velké množství kritérií: - Ideální hostitel musí snadno fermentovat za použití levného prostředí. - Ideální hostitel by měl využívat prostředí účinně. - Ideální hostitel musí produkovat polypeptid nebo protein ve vysokém výtěžku, t j. musí vykazovat vysoký poměr proteinu k rostlinné hmotě. - Ideální hostitel by měl být schopen účinné sekrece proteinu nebo polypeptidu. - Ideální hostitel musí umožnit snadnou izolaci a přečištění požadovaného proteinu nebo polypeptidu. - Ideální hostitel musí produkovat požadovaný protein nebo polypeptid tak, aby byl produkován v aktivní formě nepožadující další aktivaci nebo modifikační kroky. - Ideální hostitel by měl být snadno transformovatelný. - Ideální hostitel by měl umožnit použití širokého rozsahu elementů pro regulaci exprese k zajištění snadné aplikovatelnosti a univerzálnosti. - Ideální hostitel by měl dovolit snadné použití levných selekčních markérů. - Ideální hostitel by měl produkovat stabilní produkty transformací.

Ideální hostitel by měl dovolit kultivaci za podmínek neškodících proteinu nebo polypeptidu (například nízká WO 96/02563 a US Patenty 5 602 004, 5 604 129 a 5 695 958, Novo Nordisk popisují nevýhody systémů Aspergillus a Trichoderma a navrhují kultivační podmínky pro ostatní plísně, které jsou vhodnější pro produkci proteinů v širokém měřítku. Jediné příklady poskytující jakoukoliv transformovanou kulturu zahrnují kmeny Myceliophthora thermophila, Acremonium alabamense, Thielavia terrestris a Sporotrichtum cellulophilum. Kmen Sporotrichum byl označen jako štěpící se a produkující zelený pigment za fermentačních podmínek, které nevedou u ostatních kmenů ke stejným výsledkům. Výtrusy netvořící mutant Thielavia terrestris byl popsán jako organismus schopný volby vlastní morfologie. Bylo také uvedeno, že Thielavia a Acremonium (přičemž použitý kmen Acremonium byl nedokonalým stádiem použitého kmene Thielavia) jsou kmeny s nízkou protoplastickou účinností a že hydromycin byl jako selekční markér neúspěšný. Mnoho dalších bylo navrženo jako potenciálně schopných volit vlastní morfologii, avšak ne vlastní transformací. Navržené kmeny zahrnovaly Corynascus, Thermoascus, Chaetomium, Ctenomyces, Scytalidium a Talaromyces. Transformovatelní hostitelé jsou označováni jako jediní produkovatelé nízké úrovně zavedené xalanázy Humicola s kmenem Thielavia produkujícím nejnižší množství; avšak tato informace je víceznačná a může ve skutečnosti vyvozovat, že Thielavia byla nej lepším provedením. Nomenklatura tohoto odkazu je založena na ATCC jménech Průmyslových hub 1994. Je zřejmé, že nebylo dosaženo vyššího stupně heterologní exprese a ve skutečnosti nemůže být odvozena pozitivní korelace mezi postulovanou morfologií a stupněm exprese. Pokud by měla být provedena jakákoliv korelace, mnohem více je pravděpodobné, že bude negativní. Podle 1966 ATCC 'klasifikace hub Sporotrichum thermophilum ATCC 20493 je kmen Myceliophthora thermophila. Přesně je kmen stále definován jako Myceliophthora thermophila. Nepředvídatelnost v oboru je zřejmá z těchto nedávných zveřejnění. 4 • · WO 97/26330 Novo Nordisk navrhuje způsob získání mutantů rodičovských buněk plísní, které mají vylepšenou vlastnost pro produkci heterologních polypeptidů. Způsob zahrnuje nejprve nalezení specifické pozměněné morfologie následované posouzením, zda transformant produkuje více heterologního polypetidu než původní. Způsob je ilustrován pouze pro kmeny Fusarium A3/5 a Aspergillus oryzae. Navržený způsob je aplikovatelný pro kmeny Aspergillus, Trichoderma, Thielavia, Neurospora, Acremonium, Tolyplocadium, Humicola, Scytalidium, Myceliophthora nebo Mucor. Jak je výše uvedeno, nepředvídatelnost v oboru a také nepředvídatelnost způsobu citovaných aplikací neposkytuje obecně aplikovatelnou nauku s rozumnými nadějemi na úspěch. V WO 00/20555, jsme popsali alternativní expresní systém plísní s jednoduchým použitím výše uvedených Aspergilli a Trichoderma splňujících výše uvedené požadavky. Nový systém poskytuje přídavné výhody, jako například: transformační rychlosti jsou vyšší než pro rychlosti u obvykle používaného systému Trichoderma reesei. K tomu kultivační podmínky nabízejí další bonus, neboť jsou výhodné pro polypeptidické produkty.

Detailní popis vynálezu V následující sekci bude popsáno množství průmyslově zajímavých enzymů odvozených od kmene Chrysosporium, spolu s kompletní sekvenční informací. Bude také popsán nový aktivační systém odvozený od kmene Chrysosporium, který je použitelný pro expresi heterologních a homologních genů. Předkládaný vynález se obzvláště týká glykosylhydrolás rodiny 7 (například cellobiohydrolás) a 10 (například xylanás) a glyceraldehydfosfátdehydrogenás, jak bylo identifikováno z jejich aminokyselinové sekvence, stejně tak jako peptidů odvozených od těchto enzymatických proteinů a s nukleovými kyselinami kódujícími tyto peptidy a proteiny, stejně tak jako a obzvláště s řídícími regulačními sekvencemi spojenými s těmito geny.

Obzvláště se předkládaný vynález týká izolovaných nebo rekombinovaných proteinů tří skupin výše uvedených nebo jejich aktivních částí, zahrnující jejich mutanty obsahující alespoň jistý stupeň sekvenční identity, jak bude dále upřesněno a uvedeno v nárocích, stejně tak jako sekvence nukleových kyselin kódující tyto proteiny nebo jejich části a/nebo sekvence nukleových kyselin regulujících jejich expresi. Tyto enzymy jsou obzvláště: (1) glykosylhydrolásy rodiny 7 (cellobiohydrolásy, CBH1) vykazující alespoň 75 %, výhodně 80 % nebo dokonce 85 % identity aminokyselin se sekvencí SEQ ID číslo 2; (2) glykosylhydrolásy rodiny 10 (endoxylanásy XYLl) vykazující alespoň 70 %, výhodně 75 % nebo dokonce 80 % identity aminokyselin se sekvencí SEQ ID číslo 4; a (3) glyceraldehydfosfátdehydrogenásy (GPD1) vykazující alespoň 86 %, výhodně 90 % nebo dokonce alespoň 93 % identity aminokyselin se sekvencí SEQ ID číslo 6. Polypeptidy a sekvence aminových kyselin kódující tyto polypeptidy mají alespoň 20, výhodně alespoň 30 sousedících aminokyselin sekvencí SEQ ID číslo 2 a 4 a 6 a jsou upřednostněným provedením tohoto vynálezu. Odpovídající nukleotidové sekvence jsou popsány v SEQ ID číslo 1 (cbhl), 3 (xyll), a 5 (gpdl).

Rekombinované enzymy mohou obsahovat v podstatě kompletní protein nebo zkrácený protein obsahující alespoň část enzymatické aktivity. Takové zkrácené části mohou být katalytickými oblastmi nebo oblastmi s alespoň 75 % jejich aminokyselin. Katalytická oblast CBH1 podle předkládaného vynálezu obsahuje aminokyseliny 20 až 495 aminokyselinové sekvence SEQ ID číslo 2 a katalytická oblast XYL1 podle předkládaného vynálezu obsahuje aminokyseliny 54 až 384 aminokyselinové sekvence SEQ ID číslo 4. Katalytická oblast může, ale nemusí být kombinována se signální sekvencí vyvolanou jiným proteinem a/nebo uhlovodíkovou vázanou oblastí jiného enzymatického proteinu. Případně může být celulózově vázaná oblast enzymu předkládaného vynálezu (CBH1 a XYL1) kondenzována ke katalytické oblasti jiného enzymatického proteinu.

Sekvence nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu mohou být kompletní protein kódující oblasti nebo oligonukleotidy a nebo, což je upřednostněno, expresi regulující sekvence. Oligonukleotidy mohou být také použity jako vzorky pro identifikaci genů odpovídajících, ale ne identických ke genům SEQ ID číslo 1, 3 a 5; tyto geny, pokud vykazují kriterium úplné procentuelní identity výše definované, stejně tak jako jejich kódující a nekódující části a jejich produkty exprese jsou také částí předkládaného vynálezu. Olignukleotidy obsahují výhodně 15 až 50 a nejvýhodněji 20 až 50 nukleotidů na délku. Předkládaný vynález se také týká expresních systémů (kazet) obsahujících jak expresi regulující oblast (zahrnující promotor) jakéhokoliv ze tří skupin proteinů kondenzovaných k kódovacímu genu jiného proteinu nebo kódující oblasti jakéhokoliv z těchto proteinů kondenzovaných k jiné výrazově regulační oblasti, nebo oba, výrazově regulující oblast a protein kódovací oblast těchto nových proteinů. Expresi regulující oblast obsahuje alespoň 60 %, výhodně 70 %, výhodněji 75 % nebo dokonce 80 % z 5 '-nekódujících oblastí SEQ ID číslo 1, 3, a 5 a/nebo alespoň 20, konkrétně alespoň 40 sousedících nukleotidů z těchto 5' nekódujících oblastí. Koncové sekvence stejně odvozené od 3" nekódujících oblastí genů předkládaného vynálezu jsou také použitelné ve expresních kazetách, kombinované s homologními nebo heterologními geny. • # · 7

Polynukleotidy nebo oligonukleotidy předkládaného vynálezu můžou obsahovat minimální sekvence identity s odpovídajícími sekvencemi SEQ ID 1, 3 nebo 5, případně křížené za striktních podmínek s těmito danými sekvencemi. Striktní hybridizačni podmínky jsou podmínky známé v oboru, například hybridizace v 6 x SSC (20 x SSC na 1000 ml: 175,3 g NaCl, 107,1 g citrátu sodného pentahydrátu, pH 7,0), 0,1% SDS, 0,05% pyrofosfát sodný, 5* Denhardtův roztok a 20 pg/ml DNA denaturovaného spermatu sledě při 56 °C během 18 až 2 4 hodin následovaná 2x promytím po dobu 30 minut v 5x SSC, 0,1 % SDS při 56 °C a promytím 2x SSC, 0,1% SSC při 56 °C.

Tyto expresní systémy mohou být obsaženy v Chrysosporium hostiteli, jako je Chrysosporium lucknowense hostitel nebo jiný nehoubový nebo výhodně houbový hostitel. Příklady ostatních houbových hostitelů jsou ostatní druhy nebo kmeny Chrysosporium, druhy Aspergillus atd. Tyto hostitelé by měly být výhodně hostiteli, kteří nemohou samostatně, vnitřně nebo jako výsledek kultivačních podmínek produkovat protein odpovídající proteinu, o který se zajímáme, stejně tak jako jednoduše regenerovat tento protein.

Pokud reference a připojené nároky obsahují termín „polypeptidy" nebo „peptidy" nebo „polypeptidy, o které se zajímáme” nebo „peptidy, o které se zajímáme" jako produkty expresního systému předkládaného vynálezu, může tento termín obsahovat proteiny, tj . polypeptidy vykazující zvláštní funkci a/nebo sekundární a/nebo terciální strukturu. Pokud je reference odkazem na procentuelní aminokyselinovou identitu, je tato identita spojena s kompletním proteinem nebo se specifickou částí definovanou počátečním a koncovým číslem aminokyseliny, jak je definováno obvykle používaným BLAST algoritmem. V expresním systému hub popsaném v WO 00/20555, může být pH kultivačního prostředí neutrální nebo alkalické, tudíž nedochází k inaktivaci produkovaného proteinu nebo polypeptidu díky pH. Je také možné kultivovat při kyselém pH jako je pH 4 pro případy, kde protein nebo polypeptid je lépe situován do kyselého prostředí. Vhodné prostředí může vykazovat pH mezi 4,0 až 10,0. Upřednostnění pro neutrální až alkalické pH existuje, například pokud hostitelský kmen roste lépe při pH 6 až 9. Růst při alkalickém pH, které může být od pH 8 výše a může být dokonce vysoké až pH 10, je také dobrá alternativa pro některé případy. Také kultivace při teplotě, která je výhodná pro stabilitu hostitele je vhodná pro některé typy polypeptidů. Kultivační teplota je vhodná při teplotě 23 až 43 °C. Takové podmínky jsou obzvláště vhodné pro produkci savčích polypeptidů. Vybrané teploty budou záviset na efektivnosti kultivace a citlivosti polypeptidu nebo kultivačního kmene.

Bylo také pozorováno, že vztah rostlinné hmoty k viskozitě a množství proteinu je nesmírně favorizující pro hostitele Chrysosporium. Porovnání bylo provedeno s Trichoderma longibrachiatum (dříve také známý jako Trichoderma. reesei) a s Aspergillus niger. Trichoderma longibrachiatum poskytuje 2,5 až 5 g/1 rostlinné hmoty, Aspergillus niger poskytuje 5 až 10 g/1 rostlinné hmoty a hostitel

Chrysosporium poskytuje 0,5 až 1 g/1 rostlinné hmoty za optimalizovaných podmínek. Což poskytuje 5 až 10 násobné vylepšení oproti komerčně používaným kmenům. Předmět předkládaného vynálezu je směřován na expresní systémy obsahující kódujících sekvence nukleových kyselin heterologních proteinů nebo polypeptidů, tyto sekvence nukleových kyselin jsou spojeny s expresně regulační oblastí popsanou níže a případně se sekrečním signálem kódující sekvence a/nebo nosičem proteinové kódující sekvence. Výhodně rekombinovaný kmen podle předkládaného vynálezu bude vyměšovat polypeptidy, o které se zajímáme. Nebude proto nutné roztrhat 9

• * buňky za účelem izolovat polypeptidy a také bude minimalizováno nebezpečí degradace produktu exprese ostatními složkami hostitelské buňky.

Kmen Chyrososporium může být definován morfologickou konzistencí, uvedenou ve známost v Barnett a Hunter 1972, Illustrated Genera of Imperfect Funghi, 3rd Edition of Burgess Publishing Company. Ostatní zdroje poskytující detaily

týkající se klasifikace hub kmene Chrysosporium jsou známé, například Sutton Classification (Van Oorschot, C. A. N. (1980) „A Revision of Chrysosporium a allied genera" ve studii Mycology číslo 20 CBS v Baarn, Nizozemí, strana 1 až 36. CBS je jedna z úložných institucí Budapest Treaty. Podle těchto nauk kmen Chrysosporium spadá do rodiny Moniliaceae, která náleží k řádu Hyphomycetales. Následující kmeny jsou definovány jako Chrysosporium, ale definice Chrysosporia není limitována těmito kmeny: C. botryoides, C. carmichaelii, C. crassitunicatum, C. europae, C. evolceannui, C. farinicola, C. fastidium, C. filiformě, C. georgiae, C. globíferum, C. globiferum var. articulatum, C. globíferum var. niveum, C. hirundo, C. hispanicum, C. holmii, C. indicum, C. inops, C. keratinophilum, C. kreiselii, C. kuzurovianum, C. lignorum, C. lobatum, C. lucknowense, C. lucknowense Garg 27K, C. medium, C. medium var. spissescens, C. mephiticum, C. merdarium, C. merdarium var. roseum, C. minor, C. pannicola, C. parvum, C. parvum var. crescens, C. pilosum, C. pseudomerdarium, C. pyriformis, C. gueenslandicum, C. sigleri, C. sulfureum, C. synchronům, C. tropičům, C. ondulatum, C. vallenarense, C. vespertilium, C. zonatum. C. lucknowense tvoří jednu skupinu kmene Chrysosporium, která pozvednula zájem tím, že poskytuje vyšší produkci cellulásových proteinů (WO 98/15633 a spojený US Patent 5 811 381) . Charakteristika Chrysosporium lucknowense zahrnuj e: «4 10 • * * •λ ··#·

Kolonie dosahují 55 mm v průměru v Sabouraud glukózovém agaru po 14 dnech, jsou krémově zabarvené a nadýchané; husté a 3 až 5 mm dlouhé; okraje jsou definované, pravidelné a třásnité; reverzní barva je světle žlutá až krémová. Hyfa je sklovitá, hladká a tenkostěnná, málo větvená. Vzdušná hyfa je nejvíce plodná a těsně přepažená, 1 až 3,5 μιη široká. Hloubková hyfa je neplodná, 1 až 4,5 ym široká, s tenkou hyfou často zakřivenou. Konidia jsou koncová a postranní, většinou přilehlé a v krátkých, často kónických výčnělcích nebo na krátkých stranách jsou větvené. Konidia jsou samovolně rostoucí, ale v blízkosti jedna ke druhé, 1 až 4 konidia se vyvíjejí v buňce hyfy, často tenko a hladkostěnné, většinou subglobulární, také kyjovité, jednobuněčné, 2,5 až 11 x 1,5 až 6 ym, se širokými základními zákružemi. Interkalární konidia nejsou přítomna. Chlamydospory jsou nepřítomny. ATCC 44006, CBS 251,72, CBS 143,77 a CBS 272,77 jsou příklady

Chrysosporium lucknowense kmenů a ostatní příklady jsou uvedeny v WO 98/15633 (US Patent 5 811 381).

Další kmen byl izolován z tohoto druhu s ještě vyšší produkční kapacitou pro cellulásy. Kmen je nazván Cl podle interní notace a je uložen v Mezinárodním depozitáři všech ruských kolekcí mikroorganismů v Ruské akademii věd, Bakrushina Street 8, Moskva, Rusko 113184, 29.8.1996, podle

Budapest Treaty a byl označen přístupovým číslem VKM Number F-3500D. Je nazván Chrysosporium lucknowense Garg 27K. Charakteristika Cl kmene je následující:

Kolonie rostou 55 až 66 mm v průměru v potato-dextrose agaru během 7 dní; jsou zabarveny do světle krémové barvy a jsou 2 až 3 ym vysoké v prostředku; okraje jsou definované, pravidelné, řasovité, reversní barva je světle krémová. Hyfa je sklovitá, hladká a tenkostěnná, málo větvená. Vzdušná hyfa je plodná, přepažená, 2 až 3 mm široká. Hloubková hyfa je interfertilní. Konidia jsou koncová a postranní, přisedlá nebo na krátké straně větvená; samostatně rostoucí, ale v blízkosti k dalším, sklovitá, tenko a hladkostěnná, subglobulární, kyjovitá, jednobuněčná, 4 až 10 pm. Chlamydospory nejsou přítomny. Interkalární konidia nejsou přítomna.

Způsob izolace Cl kmene je popsán v WO 98/15633, US Patentu 5 811 381 a US Patentu 6 015 707. Tyto publikace také zahrnují definici, která říká, že Chrysosporium jsou kmeny odvozené od předchůdce Chrysosporia, zahrnující předchůdce, který mutoval přírodně nebo indukovanou mutagenázou. Mutanty Chrysosporia mohou být získány indukovanou mutagenázou, obzvláště kombinací iradiace a chemické mutageneze.

Například kmen Cl byl mutován ultrafialovým světlem za produkce kmene UV13-6. Tento kmen byl později dále mutován N~methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidinem za produkce kmene NG7C-19. Posledně jmenovaný kmen byl předložen mutaci ultrafialovým světlem za vzniku kmene UV18-25. Během mutačního procesu se měnila morfologická charakteristika v prostředí jak kapalném tak na deskách a stejně tak jako pod mikroskopem. S každou za sebou jdoucí mutagenezí ukazuje prostředí méně načechraný vzhled na deskách, jak je popsáno pro charakteristiku Chrysosporia, dokud kolonie nedosáhnou hladký a matový vzhled. Hnědý pigment pozorovaný u přírodních typů kmene v některých prostředích byl také méně rozšířen u mutovaných kmenů. V kapalném prostředí byl mutant UV 18-25 pozorován jako méně viskózní než přírodní typ kmene Cl a mutanty UV 13-6 a NG7C-19. Pokud všechny kmeny zachovávají celkovou mikroskopickou charakteristiku Chrysosporia, mycelia budou užší s každou další mutací a u UV 18-25 může být pozorována odlišná fragmentace mycelia. Tato micelární fragmentace je obvykle způsobena nízkou viskozitou spojenou s kulturou UV 18-25. Schopnost kmene tvořit výtrusy klesá s 0t 00 · · «1 « «« > 4 4 4· » 4« > »t ♦ * « t · 12 4ř· ····( ««·· *· 4«· *»» ·· C^t· každým mutačním krokem. Výše uvedené ilustruje, že pro kmen náležící k druhu Chrysosporium existuje určitá svoboda u výše definované morfologické charakteristiky. V každém mutačním kroku produkujícím cellulásy a extracellulární proteiny má v podstatě také zvyšující se tendenci, zatímco několik mutací vyúsťuje ve snížení tvorby proteás. Kriteria podle kterých je stanovena systematika hub je dostupná například od CBS, VKMF a ATCC. Kmeny interně označené jako Chrysosporium kmen Cl, kmen UV 13-6, kmen NG7C-19 a kmen UV 18-25 jsou uloženy v souladu s Budapest Treaty v All Russian Collection (VKM) depozitorním institutu v Moskvě. Přírodní typ Cl kmene byl uložen pod číslem VKM F-3500 D, dne 29. 8. 1996, Cl UV 13-6 mutant byl uložen jako VKM F-3632 D (2. 9. 1998), Cl NG7C-19 mutant byl uložen jako VKM F-3633 D (2. 9. 1998) a Cl UV18-25 mutant byl uložen jako VKM F-3631 D (2. 9. 1998).

Je výhodné použít netoxické kmeny Chrysosporium, kterých je známo v oboru mnoho, čímž bude sníženo nebezpečí ohrožení prostředí při výrobě ve velkém měřítku a budou zjednodušeny procedury výroby s průvodním snížením cen.

Exprese je regulována hostitelským kmenem Chrysosporium v regulační oblasti DNA. Zahrnuje aktivační sekvenci spojenou se sekvencí nukleových kyselin kódující polypeptidy, které jsou exprimovány. Aktivační část promotoru je spojena v pozici vis a vis k iniciaci sekvence kodonu, který umožní expresi. Promotor sekvence může být konstitutivní nebo vyvolaná. Jakákoliv expresní regulační sekvence nebo jejich kombinace schopná povolit expresi polypeptidu z Chrysosporia kmene je předvídatelná. Expresní regulační sekvence je vhodně expresní regulační oblast houby, například regulační oblast ascomycete. Vhodné expresní regulační oblasti hub jsou regulační oblasti kterékoliv z následujících druhů hub: Aspergillus,

Trichoderma, Chrysosporium, Hansenula, Mucor, Pichia, Neurospora, Tolypocladium, Rhizomucor, Fusarium, Penicillium, 13 • · ·

Saccharomyces, Talaromyces nebo případně jejich pohlavní formy jako je například Emericella, Hypocrea. Cellobiohydrolásový promotor od Trichoderma, glukoamylásový promotor od Aspergillus, glyceraldehydfosfátdehydrogenásový promotor od Aspergillus, alkoholdehydrogenása A a alkoholdehydrogenása R promotor od Aspergillus, TAKA amylása promotor od Aspergillus, fosfoglycerát a křížící kontrolní promotor Neurospora, aspartic proteinása od Rhizomucor miehei, lipázový promotor od Rhizomucor miehei a beta-galaktosidásový promotor Penicillium canescens. Expresně regulační sekvence od stejného kmenu jako je hostitelský kmen je velice vhodná, neboť je nejvíce adaptabilní ke specifickému hostiteli. Takže výhodně je expresně regulační sekvence jednou z Chrysosporium kmene. Výhodně je použita expresně regulační oblast umožňující vysokou expresi ve vybraném hostiteli. Je to výhodně expresně regulační oblast odvozená od Chrysosporium kmene podle předkládaného vynálezu. Expresně regulační oblast může být také odvozená od heterologního hostitele, který je velice dobře známý v oboru. Konkrétní příklady známých proteinů vylučovaných ve velkých množstvích a poskytujících vhodné expresní regulační sekvence pro předkládaný vynález jsou, ale nejsou limitovány, hydrophobin, proteásy, amylásy, xylanásy, pektinásy, esterásy, beta-glaktosidásy, cellulásy (například endo-glukanásy, cellobiohydrolásy) a polygalakturonásy. Vysoká produkce byla zjištěna jak v pevném stavu, tak za kapalných fermentačních podmínek. Kvalitativní rozbory pro stanovení přítomnosti nebo výše produkce těchto proteinů jsou velmi dobře známé v oboru. Katalogy Sigma a Megazyme obsahují mnoho příkladů. Megazyme se nachází v Bray Bussines Park, Bray, County Wicklow v Irsku. Sigma Aldrich má mnoho poboček po celém světě, například USA P. 0. Box 14508 St. Louis Missouri. Pro cellulásy odkazujeme na komerčně dostupné zdroje jako jsou CMCase kvalitativní analýzy, endoviskomerické analýzy,

Avicelase analýzy, beta-glukanásové analýzy, RBBCMCase analýzy, Cellazyme C analýzy. Xylanásové analýzy jsou také komerčně dostupné (například DNS a Megazyme). Alternativy jsou dobře známé odborníkům a je možné je snadno nalézt v literatuře týkající se této problematiky a tyto informace je požadováno inkorporovat do referencí. Příkladem může být „Methods in Enzymatodology" Volume 1, 1955 a volumy 297 až 299 z roku 1999. Vhodná promotér sekvence Chrysosporium je použita k zajištění dobrého rozpoznání hostitelem.

Bylo zjištěno, že heterologní expresně regulační sekvence pracují stejně účinně v Chrysosporium tak i v přírodních Chrysosporium sekvencích. To umožňuje použít dobře známé stavby a vektory k transformaci Chrysosporiua stejně tak jako se nabízí mnoho dalších možností pro konstrukci vektorů umožňujících dobré rychlosti vyměšování v tomto novém vyměšovacím a sekrečním hostiteli. Například standardní Aspergillus transformační techniky mohou být použity jak je popsáno například v Christiansen a kol., Bio/Technol. 6:1490 až 1422 (1988) . Ostatní dokumenty poskytující detaily transformačních vektorů Aspergillus jsou například US Patenty 4 816 405, 5 198 345, 5 503 991, 5 364 770 a 5 578 463, EP-B-215 594 (také pro kmen Trichoderma) a jejich obsah je zahrnut do literatury. Protože byly zjištěny extrémně vysoké vyměšovací rychlosti pro cellulásu u Chrysosporium kmenů, byly upřednostněny vyměšovací regulující oblasti toho proteinu. Pro konkrétní příklady odkazujeme na dříve popsané a uložené Chrysosporium kmeny.

Stavba nukleových kyselin obsahuje expresně regulační oblast nukleových kyselin z Chrysosporium kmene, výhodně z Chrysosporium lucknowense nebo jeho derivátů a stavby s těmito sekvencemi představují upřednostněné provedení předkládaného vynálezu, stejně tak jako exprese mutantu kmene Chrysosporium, který obsahuje operativně spojené geny kódující polypeptidy.

Tato stavba nukleových kyselin bude expresní regulační oblastí od Chrysosporium spojená s cellulásami nebo xylanásami, výhodně s expresí cellobiohydrolás, nebo glyceraldehydehydrogenás jak bude detailně uvedeno níže. Sekvence nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu může vhodně být získána z kmene Chrysosporium, který byl dostatečně definován v popisu. Množství metod ke stanovení promotor sekvencí je mnoho a jsou dobře známy v oboru. Experimenty o vypuštění nukleových kyselin v oblasti proti proudu ATG kodonu na začátku náležitého genu poskytnou požadovanou sekvenci. Také například analýza shody sekvencí může být nalezení genu zajímavá. Použitím hybridizace a rozšiřujících technik může odborník snadno nalézt odpovídající promotor sekvence.

Promotor sekvence Cl endoglukanás byly definovány v tomto množství, klonováním odpovídajících genů. Upřednostněné promotory podle předkládaného vynálezu jsou: 55 kDa cellobiohydrolása (CBH1) promotor, 30 kDa xylanása (Xyll) promotor a glyceraldehydfosfátdehydrogenása promotor, podle exprese enzymů na vyšší úrovni jejich vlastních promotorů. Odpovídající promotor sekvence jsou identifikovány v jasném množství klonováním, jak je popsáno v WO 00/20555, za použití sekvenční informace dané v SEQ ID číslo 1 (pro CBH 1) a SEQ ID číslo 3 (pro Xyll) · Promotory karbohydrát degradujících enzymů Chrysosporia, konkrétně Cl promotory, mohou být výhodně použity pro expresi požadovaných polypeptidů v hostitelském organismu, obzvláště houbových nebo ostatních mikrobiálních hostitelských organismech. Sekvence promotoru, které vykazují alespoň 65 %, výhodně alespoň 70 %, nejvýhodněji alespoň 75 % identity nukleotidové sekvence se sekvencí danou v SEQ ID číslo 1, 3 a 5 nebo se sekvencí nalezenou pro ostatní Chrysosporium kmeny, jsou částí předkládaného vynálezu. 16 ···· • · • « • · • · * ·

Pro jednotlivé provedení rekombinovaných kmenů a sekvencí nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu také odkazujeme na příklady. Také odkazujeme pro rekombinované kmeny na dříve uvedené vysoce expresní sekvence promotorů, obzvláště ty, které poskytují vysokou expresi u hub, například jak je uvedeno pro kmen Aspergillus nebo Trichoderma. Dříve bylo uvedeno mnoho expresních regulujících oblastí pro použití v Aspergillus například US Patenty 5 252 726 Novo a US 5 705 358 Unilever. Obsah těchto dříve uvedených publikací je zahrnut do literatury.

Hydrofobní gen je gen týkající se hub, který má vysokou expresi. Bylo navrženo, že promotor sekvence hydrofobního genu, výhodně z kmene Chrysosporium, může být vhodně aplikována jako expresní regulační sekvence v upřednostněných provedeních předkládaného vynálezu. Trichoderma reesei a Trichoderma harzianum genové sekvence pro hydrofobní geny byly uvedeny již dříve, stejně jako genová sekvence pro Aspergillus fumigatus a Aspergillus nidulants a důležitá sekvenční informace je zde zahrnuta do reference (Munoz a kol., Curr. Genet. 1997, 32 (3):225 až 230; Nakari-Setala T. a kol., Eur. J. Biochem. 1996 15:235 (1 až 2):248 až 255, M. Parta a kol., Infect. Immun. 1994, 62 (10):4389 až 4395 a Stringer M. A. a kol., Mol. Microbiol. 1995 16(1):33 až 44. Použitím této sekvenční informace může odborník získat expresně regulační sekvenci Chrysosporia hydrofóbních genů bez nutnosti mnoha experimentů následujících standardní techniky, jak je doporučeno výše. Rekombinovaný kmen Chrysosporium podle předkládaného vynálezu může obsahovat hydrofobní regulační oblast operativně spojenou se sekvencí kódující polypeptidy našeho zájmu.

Expresně regulační sekvence může také případně obsahovat zlepšovač nebo tlumič. Oba jsou již dříve dobře známé v oboru a jsou obvykle umístěny v určité vzdálenosti od 17 17

• ·

« · · · • « · » · • ·« • · ♦ · • · · · · · · promotoru. Expresní regulační sekvence také obsahuje promotory s aktivátorem vázaným stranou a represor vázané strany. V některých případech může být také sekvence modifikovaná k eliminaci tohoto typu regulace. Vláknité houby, ve kterých jsou creA strany přítomny již byly popsány. Takové creA strany mohou mutovat pro zajištění glukózové represe, která je eliminována a plyne z přítomnosti nemutující stran. Gist-brocades WO 94/13820 popisuje tento princip. Použití takového promotoru umožňuje produkci polypeptidu kódujícího sekvence nukleových kyselin regulující promotor v přítomnosti glukózy. Ten samý princip je také viditelný v WO 97/09738. Tyto promotory mohou být použity jak s tak bez creA stran. Mutanty ve kterých creA strany byly mutovány, byly použity jako expresně regulační sekvence v rekombinovaných kmenech podle předkládaného vynálezu a sekvence nukleových kyselin je regulující mohou vykazovat expresi v přítomnosti glukózy. Takové Chrysosporium promotory zajišťují expresi v analogickém množství k ilustrovanému v WO 97/09438. Identita creA stran je známá v oboru. Případně je možné použít promotor s creA vázanými stranami, které nebyly mutovány v hostitelském kmeni s mutací jinde v expresním systému například ve vlastním genu creA, tak že kmen může, navzdory přítomnosti creA vazných stran, produkovat protein nebo polypeptid v přítomnosti glukózy.

Terminační sekvence jsou také sekvencemi regulujícími expresi, které jsou vázány ke 3' koncovému bodu sekvence, která produkuje expresi. Jakýkoliv konečný bod týkající se hub je ochotně funkcionalizovatelný hostitelem kmene Chrysosporium podle předkládaného vynálezu. Příkladem jsou A. nidulans trpC terminátor (1) , A. niger alfa-glukosidásový terminátor (2), A. niger glukoamylásový terminátor (3), Mucor miehei karboxyl proteásový terminátor (US Patent 5 578 463) a Trichoderma reesei cellobiohydrolásový terminátor. Přírodní 18 ···· • · · ·

··· ··· · ·

Chrysosporíum terminační sekvence budou fungovat v Chrysosporium a jsou vhodné, například CBH1 terminátor.

Vhodný rekombinant kmene Chrysosporium použitý podle předkládaného vynálezu má k expresi sekvenci nukleových kyselin spojenou se sekvencí kódující aminokyselinové sekvence definované jako signální sekvence. Signální sekvence je sekvence aminokyselin, která pokud je operativně vázána k sekvenci aminokyselin expresního polypeptidu, dovoluje jeho sekreci z hostitelské houby. Taková signální sekvence může být normálně spojena s heterologním polypeptidem nebo může být integrována v hostiteli. Může být také cizí pro oba, jak pro hostitele, tak pro polypeptid. Sekvence nukleových kyselin kódující signální sekvence musí být umístěna ve skeletu dovolující přemístění signální sekvence a heterologního polypeptidu. Každá signální sekvence schopná umožnit sekreci polypeptidu z Chrysosporia kmene je předvídatelná. Taková signální sekvence je vhodná signální sekvence týkající se hub, výhodně ascomycete signální sekvence.

Vhodné příklady signálních sekvencí mohou být odvozeny obecně od kvasnic nebo kterýchkoli následujících konkrétních kmenů hub: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Pichia, Neurospora, Rhizomucor, Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces nebo případně jejich pohlavní formy jako Emericella, Hypocrea. Signální sekvence, které jsou obzvláště použitelné jsou často vrozeně spojeny s následujícími proteiny zahrnujícími cellobiohydrolásy, andoglukanásy, beta-galaktosidásy, xylanásy, pektinásy, esterásy, hydrofobinásy, proteinásy nebo amylásy. Příklady zahrnují amylásy nebo glukoamylásy Aspergillus nebo Humicola (4), TAKA amylásu Aspergillus oryzae, alfa-amylásu Aspergillus niger, karboxylpeptidásu Mucor (US Patent 5 578 463), lipásu nebo proteinásu Rhizomucor miehei, cellobiohydrolásu Trichoderma (5) , beta-galaktosidásu Penicillium canescens a alfa spárující faktor Saccharomyces. Případné mohou být signální sekvence tvořeny od amylásy nebo genu subtilisinu kmene Bacillus. Signální sekvence od stejného genu jako je hostitelský kmen je extrémně vhodná, protože je nejlépe specificky adaptabilní ke specifickému hostiteli, takže výhodná signální sekvence je signální sekvence Chrysosporia, obzvláště Chrysosporia kmene Cl, kmene UV13-6, kmene NG7C-19 a kmene UV18-25, výše uvedených. Signální sekvence od vláknitých hub, kvasnic a bakterií jsou použitelné. Signální sekvence nehoubného původu jsou také považovány za použitelné, obzvláště bakterielní, rostlinné a savčí.

Rekombinant hostitele použitý podle jakéhokoliv provedení předkládaného vynálezu může dále obsahovat selekční markér. Takový selekční markér bude umožňovat snadný výběr transformovaných nebo transformovatelných buněk. Selekční markér obvykle kóduje genový produkt poskytnutý konkrétním typem odolnosti cizího netransformovaného genu. Resistence může být obecně proti těžkým kovům, antibiotikům a biocidům. Prototrofie je také použitelným selekčním markérem neantibiotického druhu. Neantibiotický selekční markér může být upřednostněn pokud protein nebo polypeptid zájmu je použit v jídle nebo farmaceutikách s vyhlídkou na spedici nebo méně komplikované schválení takového produktu. Často je pro tyto markéry použita GRAS indikace. Mnoho těchto značkovačů je odborníkům dostupných. Například FDA poskytuje jejich seznam. Nejčastěji použité jsou selekční markéry vybrané ze skupiny týkající se odolnosti vůči drogám nebo uvolnění vyživovacího defektu, například skupina zahrnující amdS (acetamidásy), hph (hydromycin fosfotransferásy), pyrG (orotidin-5'-fosfát dekarboxylásy), trpC (anthranilát synthásy) , argB (ornithin karbamoyltransferásy), sC (sulfát adenyltransferásy) , bar (fosfinotricin acetytransferásy) , glufosinate resistence, niaD (nitrát reduktásy) bleomycin resistenční gen, konkrétněji Sh ble, sulfonylmočovinová resistence například acetolaktát synthása mutace ilvi. Výběr může být také proveden virtuální kotransformací, kde je selekční markér v odděleném vektoru nebo kde je selekční markér na stejném fragmentu nukleové kyseliny jako je polypeptidová kódující sekvence pro polypeptid našeho zájmu.

Jak je zde použito, termín „heterologní polypeptid" je protein nebo polypeptid, který není exprimován a vyměšován Chrysosporium hostitelem použitým pro expresi podle předkládaného vynálezu. Polypeptid může být rostlinného nebo živočišného původu (obratlovci nebo bezobratlí), například savčí, rybí, hmyzového původu nebo mikroorganického původu s podmínkou, že se nevyskytuje v hostitelském kmeni. Savčí může zahrnovat také lidský. Mikroorganický může zahrnovat viry, bakterie, archaebakterie a houby, například plísně a kvasinky. Bergey's Manual pro stanovení bakterií poskytuje odpovídající seznam bakterií a archaebakterií. Pro farmaceutické účely existuje často preference pro lidské proteiny, proto rekombinantní hostitel podle předkládaného vynálezu tvořící upřednostněné provedení bude hostitel, jehož polypeptid je lidského původu. Pro účely produkce potravin budou vhodné heterologní polypeptidy živočišné, rostlinné nebo řasy. Tyto provedení jsou také uváženými vhodnými příklady předkládaného vynálezu. Další provedení, které jsou použitelné, zahrnující heterologní polypeptidy jsou jakékoliv bakterie, kvasinky, viry, achaebakterie nebo houby. Heterologní polypeptidy houbovitého původu jsou obzvláště upřednostněné.

Vhodná provedení předkládaného vynálezu budou zahrnovat sekvenci nukleových kyselin s adaptabilním kodonovým použitím. Taková sekvence kóduje vrozené sekvence aminokyselin ale mají rozdílnou hostitele, od kterého jsou odvozeny, sekvenci nukleových kyselin, tj . sekvenci nukleových kyselin ve kterých je jistý kodon nahrazen jiným kodonem kódujícím stejné aminokyseliny, ale který je snadněji použitelný hostitelským kmenem pro expresi. To může vést ke snadnější expresi heterologní sekvence nukleových kyselin. Toto je hlavní dovedností odborníka. Použití tohoto adaptabilního kodonu může být provedeno na základě použití známého houbového vis-a-vis nehoubového kodonu. Může být dokonce konkrétněji adaptabilní k použití kodonu samotného Chrysosporia. Podobnosti jsou takové, že použití kodonu, jak bylo pozorováno u Trichoderma, Humicola a Aspergillus by mělo umožnit výměnu sekvencí takových organismů bez adaptace použití kodonu. Detaily jsou dostupné odborníkovi, který pracuje v oblasti použití kodonů těchto hub a jsou zde zabudovány do literatury. Předkládaný vynález není omezen na výše uvedené rekombinace kmenů Chrysosporium, ale také zahrnuje rekombinace kmenů Chrysosporium, které zahrnují sekvence nukleových kyselin kódující heterogenní protein pro kmen Chrysosporium. Tyto sekvence nukleových kyselin jsou operativně spojeny s oblastí regulující expresi a tento kmen rekombinant je více exprimován než odpovídající nerekombinovaný kmen za stejných podmínek. V případě homologního polypetidu našeho zájmu, který je výhodně neutrální nebo alkalický enzym jako je hydrolása, proteása nebo karbohydrát degradující enzym, jak je zde uvedeno. Polypeptid může být také kyselý. Výhodně bude rekombinovaný kmen vyměšovat polypeptid ve větším množství než nerekombinovaný kmen. Všechny připomínky uvedené k heterolognímu polypeptidu jsou také platné pro homologní polypeptidové cellzulásy.

Tento vynález také zahrnuje geneticky konstruované mikrobiální kmeny, kde zabudovaná sekvence může být původu Chrysosporium. Takový kmen může být avšak odlišen od přírodně se vyskytujících kmenů, například účinnou přítomností ·· ·« 22 • · heterologní sekvence v sekvenci nukleových kyselin použitých pro transformaci Chrysosporia a faktem, že jsou vyměšovány v množství převyšující nekonstruovaný kmen za stejných podmínek nebo z důvodu, že se exprese nachází za normálních nevyměšovacích podmínek. Později uvedené může být případem, kdy vyvolací promotor reguluje sekvenci našeho zájmu v protikladu k nerekombinovanému případu nebo pokud jiný faktor indukuje expresi, pak je to případ nekonstruovaného kmene. Předkládaný vynález také směřuje ke kmenům odvozených vybudováním za použití klasických genetických technologií nebo genetických inženýrských metodologií.

Expresní systémy a hostitelský kmen je zahrnující podle předkládaného vynálezu může obsahovat sekvenci nukleových kyselin kódující heterogenní proteiny vybrané ze skupiny zahrnující karbohydrát degradující enzymy (cellulásy, xylanásy, mananásy, manosidásy, pektinásy, amylásy, například glukoamylásy, alfa-amylásy, alfa- a beta-glukosidásy, beta-glukanásy, chitinásy, chitanásy), proteásy (amino-proteásy, animo a karboxypeptidásy, keratinásy), ostatní hydrolásy (lipásy, esterásy, fytásy), axidoreduktásy (katalásy, glukoseoxidásy a transferásy (transglykosydásy, transglutaminásy, izomerásy a intravertásy).

Nejzajímavější produkty vytvořené podle předkládaného vynálezu jsou cellulásy, xylanásy, pektinásy a proteásy, přičemž celulásy a xylanásy štěpí beta-1,4-vazby a cellulásy obsahují endoglukanásy, cellobiohydrolásy a beta-glukosidásy. Tyto proteiny jsou nesmírně použitelné v různých průmyslových procesech známých v oboru. Obzvláště pro cellulásy odkazujeme na WO 98/15633 popisující použití cellobiohydrolás a endoglukanás. Obsah těchto aplikací je zahrnut do literatury.

Rekombinant podle předkládaného vynálezu může obsahovat sekvenci nukleových kyselin kódující polypeptidy našeho zájmu 23

a polypeptid, který je neaktivovaný nebo nestálý při kyselém pH, tj . pH pod 6, dokonce pod 5,5, výhodněji pod pH 5 a dokonce tak nízký jako pH 4. Toto je obzvláště upřednostněné provedení, protože obecně uvedené výrazové systémy hub nejsou kultivované za neutrálních až alkalických podmínek, ale jsou kultivovány při kyselém pH. Takové systémy podle předkládaného vynálezu poskytují bezpečné výrazové systémy pro proteiny nebo polypeptidy, které snadno podléhají inaktivaci nebo jsou nestálé za kyselého pH.

Zcela rekombinovaný kmen je definován v každém provedení předkládaného vynálezu, přičemž sekvence nukleových kyselin kódující polypeptidy našeho zájmu kódují proteiny nebo polypeptidy vykazující optimální aktivitu a/nebo stabilitu při pH 5, výhodně při pH neutrálním nebo alkalickém pH (tj. nad 7) a/nebo při pH vyšším než 6, je považována za upřednostněné provedení předkládaného vynálezu. Více než 50 %, více než 70 % a dokonce více než 90 % optimální aktivity při těchto pH hodnotách jsou očekávány v obzvláště použitelném provedení předkládaného vynálezu. Polypeptidy vyměšované během kultivačních podmínek nemusí být nutně aktivní za kultivačních podmínek, ve skutečnosti může být pro kultivaci výhodné, aby byla provedena za podmínek, během kterých je polypeptid inaktivní, protože jeho aktivní forma může být škodlivá pro hostitele. Co je ale pro protein nebo polypeptid požadováno, je stabilita za kultivačních podmínek. Stabilita může být termální stabilita. Může to být také stabilita proti specifickým směsím nebo chemikáliím, které jsou přítomny například ve směsích nebo procesech produkce nebo aplikace polypeptidu nebo proteinu našeho zájmu. LAS v detergentové směsi obsahuje cellulásy nebo lipásy, které jsou příkladem chemikálie, která je škodlivá proteinům. Doba použití v aplikacích se může lišit od krátké do dlouhé expozice, takže stabilita může být různá při různých aplikacích. Odborník je schopen zjistit vhodné podmínky případ od případu. Mohou být také použity komerční dostupné analýzy k stanovení optimální aktivity různých enzymatických produktů. Například katalogy Sigma a Megazyme to ukazují. Specifické příklady testů jsou zmíněny v popisu. Výrobci poskytují poučení pro použití.

Chrysosporium kmen může být vhodně použit k transformaci exprese sekvence našeho zájmu a který vykazuje relativně nízkou rostlinnou hmotu. Bylo nalezeno, že Chrysosporium kmen má dvakrát až pětkrát nižší rostlinnou hmotu než Trichoderma reesei, pokud byl kultivován k viskozitě 200 až 600 cP na konci fermentace a vykazuje rostlinnou hmotu lOx až 20x nižší než Aspergillus niger, pokud byl kultivován k viskozitě 1500 až 2000 cP za odpovídajících podmínek, tj. jejich optimálních kultivačních podmínek, kdy může poskytovat vyšší úroveň exprese. Tato úroveň exprese daleko převyšuje dva komerčně odkazované kmeny při nižší rostlinné hmotě a nižší viskozitě. To znamená, že výtěžek exprese kmene Chrysosporium bude zjevně vyšší než od Aspergillus niger nebo Trichoderma reesei. Transformovaný Chrysosporium kmen tvoří vhodné provedení předkládaného vynálezu.

Byla nalezena rostlinná hmota 0,5 až 1,0 g/1 pro kmen Chrysosporium Cl(18-25) oproti 2,5 až 5,0 g/1 pro Trichoderma, reesei a 5 až 10 g/1 pro Aspergillus niger za výše uvedených podmínek. V Příkladech budou uvedeny detaily k tomuto postupu.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu rekombinant kmene Chrysosporium produkuje protein nebo polypeptid v množství alespoň ekvivalentním produkci v molech na litr cellulásy kmene UV13-6 nebo C-19 a nejvýhodněji alespoň ekvivalent nebo více než kmen UV18-25 za odpovídajících nebo identických podmínek, tj. jejich optimálních kultivačních podmínek. 4· «V * · <» Μ • 1« ν 9 * 9» * 9 9 • · » · · 9 ·

Bylo také nalezeno, že rychlost exprese a sekrece jsou neobyčejně vysoké za použití kmene Chrysosporium vykazující morfologii kmene UV18-25 tj. malou fragmentovanou mycelu. Rekombinovaný kmen podle předkládaného vynálezu bude výhodně vykazovat tuto morfologii. Předkládaný vynález se také týká nerekombinovaných kmenů nebo ostatních konstruovaných kmenů Chrysosporium vykazujících tyto nové vynálezecké charakteristiky. Předkládaného vynálezu se také týkají rekombinované kmeny Chrysosporia v každém provedení popsané podle předkládaného vynálezu a dále vykazující redukované tvoření výtrusů ve srovnání s Cl, výhodně pod kmenem UV13-6, výhodněji pod kmenem NG7C-19, výhodně pod kmenem UV18-25 za stejných fermentačních podmínek. Také zahrnut do předkládaného vynálezu je rekombinant kmene Chrysosporiumv každém provedení vynálezu popsaný podle vynálezu a dále vykazující alespoň rychlost produkce proteinu k rostlinné hmotě ve srovnání s Cl, výhodně ve srovnání s kterýmkoliv kmenem UV13-6, NG7C-19 a UV18-25 za stejných fermentačních podmínek. Předkládaný vynález se také týká nerekombinovaných kmenů nebo jinak budovaných kmenů Chrysosporium vykazující novou nebo vynálezeckou charakteristiku jako takovou nebo v kombinaci s kterýmkoliv dalším provedením.

Další velmi atraktivní provedení předkládaného vynálezu také zahrnuje rekombinant kmene Chrysosporium vykazující viskozitu nižší než kmen NG7C-19, výhodněji nižší než UV 18-25 za odpovídajících nebo identických fermentačních podmínek. Předkládaný vynález také zahrnuje nerekombinované kmeny nebo jinak budované kmeny Chrysosporium vykazující nové nebo vynálezecké charakteristiky stejně tak jako kombinace kterýchkoli ostatních provedení. Byla stanovena viskozita kultury UV18-25, která je pod 10 cP oproti kmenu Trichoderma reesei, která je řádově 200 až 600 cP a pro kmen Aspergillus niger v řádu 1500 až 2000 cP za optimálních kultivačních 26 • · « « • t * • * 4 m · * »· * * *» podmínek na konci fermentace. Provedení použité pro toto stanovení bude poskytnuto v Příkladech.

Viskozita může být posouzena v mnoha případech vizuálně. Tekutost substance se může lišit, může být blízká pevné látce nebo kapalině. Viskozita může být také stanovena Brookfield rotačním viskozimetrem, za použití kinematických viskozitních trubiček, spouštěním kulovitého viskozimetru nebo košíčkovým viskozimetrem. Výtěžky u těchto nízko viskozitních kultur jsou vyšší než u komerčně známých vysoce viskozitních kultur za jednotku času a na buňku.

Zpracování těchto nízko viskozitních kultur podle předkládaného vynálezu je výhodné obzvláště pokud jsou kultury zvětšeny v měřítku. Chrysosporium kmen s nízkou viskositou poskytuje velice dobře kultury o velikosti 150 000 litrů.

Jakákoliv velikost kultury větší než 150 000 litrů poskytuje použitelné provedení předkládaného vynálezu. Jakákoliv jiná konvenční velikost fermentace by měla být provedena s kmeny podle předkládaného vynálezu. Problém může vzniknout ve velké produkci, protože vznikají agregáty, které mají mycelia, která jsou příliš hustá nebo nerovnoměrně distribuovaná. Prostředí jako výsledek nemůže být efektivně použit během kultivace, protože vede k neúčinnému procesu fermentace ve velkém měřítku tj. nad 150 000 litrů. Provzdušnění a mixování se stává problematickým a živná hodnota a tím redukovaná koncentrace produktivní rostlinné hmoty a redukovaný výtěžek polypeptidu během kultivace může vést k delší fermentační době. Ve spojení s vysokou viskozitou nejsou vhodné v komerčních fermentačních procesech a v běžných komerčních procesech tyto limitující faktory. Všechny tyto negativní aspekty mohou být zdolány hostitelem Chrysosporiem podle předkládaného vynálezu, který vykazuje mnohem lepší vlastnosti než kmen Trichoderma reesei, Aspergillus niger a Aspergillus oryzae, které jsou komerčně ···· *» »· ··«« dostupné vzhledem k tomu, že vykazují lepší produkční úroveň a viskozitní vlastnosti a hodnoty rostlinné hmoty.

Chrysosporium kmen je obsažen v kteréhokoliv z výše uvedených provedení předkládaného vynálezu a dále vykazuje produkci jednoho nebo více houbových enzymů vybraných ze skupiny zahrnující karbohydrát degradujících enzymy, proteásy, ostatní hydrolásy, oxidoreduktásy, a výše zmíněné transferásy. Tento kmen je požadován v zejména upřednostněných provedeních předkládaného vynálezu. Nejvíce zajímavé produkty jsou konkrétně cellulásy, xylanásy, pektinásy, lipásy a proteásy. Také použitelné jako provedení předkládaného vynálezu je Chrysosporium kmen vykazující produkci jednoho nebo více houbových enzymů, které vykazují neutrální nebo alkalickou optimální stabilitu a/nebo aktivitu, výhodně alkalickou optimální stabilitu a/nebo aktivitu. Tento enzym je vybrán ze skupiny zahrnující karbohydrát degradující enzymy, hydrolásy a proteásy, výhodně hydrolásy a karbohydrát degradující enzymy. V případě nerekombinovaného kmene Chrysosporium, jsou vhodné enzymy jiné než hydrolásy jak je uvedeno v WO 98/15633. Enzymy zvláštního zájmu jsou xylanásy, proteásy, esterásy, alfa-galaktosidásy, beta-galaktosidásy, beta-glukanásy a pektinásy. Enzymy nejsou omezeny těmito uvedenými enzymy. Připomínky ke stabilitě a aktivitě v popisu jsou pro tyto enzymy také platné.

Vynález se také týká způsobů produkce polypeptidu našeho zájmu, tyto způsoby obsahují kultivaci hostitelského kmenu (tj. kmenu druhu Chrysosporium, Aspergillus, Trichoderma, Hansenula, Mucor, Pichia, Neurospora, Tolypocladium, Rhizomucor, Fusarium, Penicillium nebo bakteriálního nebo jiného mikrobiálního kmenu) ve kterémkoliv provedení podle předkládaného vynálezu za podmínek umožňujících expresi a výhodně sekreci polypeptidu a regeneraci produkovaného polypeptidu našeho zájmu. ·« · · I · ·| ||

• I I · · · · · · I I • Μ · · · · « ···· · · · I · |

Pokud je zmíněn polypeptid nebo protein jsou do vynálezu zahrnuty také varianty a mutanty například substituční, inserční nebo vypouštěcí z přírodně se vyskytujících enzymů, které vykazují aktivitu nemutovaného kmene. Toto je platné pro odpovídající sekvence nukleových kyselin. Procesy, které zahrnují genové přemísťování článků, proteinovou konstrukci a řízenou evoluci, stranou řízenou mutagenezi a náhodnou mutagenezi jsou procesy, kterými tyto polypeptidy, varianty a nebo mutanty mohou být získány. US Patent 5 223 409, 5 780 279 a US Patent 5 770 356 poskytují ukázky řízené evoluce. Za použití tohoto procesu byly vytvořeny knihovny náhodně mutovaných genových sekvencí, například přemísťováním genů náchylných k chybám PCR vyskytující se v každé buňce. Každý gen má sekreční oblast a imobilizační oblast, které sousedí tak, aby výsledný protein vyměšoval a setrvával fixovaný k povrchu hostitele. Podmínky byly přizpůsobeny tak, aby byla vyžadována biologická aktivita polypeptidu. Tento požadavek se vyskytuje pro mnoho cyklů vedoucích ke konečnému genu s požadovanou charakteristikou. Jinými slovy to urychluje přímý proces evoluce. US Patent 5 763 192 také popisuje způsob získání DNA, RNA, peptidů, polypeptidů nebo proteinů cestou syntetického polynukleotidového kaplingu náhodně generovaných sekvencí, jejich zavedením do hostitele následovaným výběrem hostitelských buněk s odpovídající předem definovanou charakteristikou.

Další aplikací způsobů podle předkládaného vynálezu je proces „přímé evoluce" přičemž jsou generovány nové protein kódující DNA sekvence, kódující proteiny jsou vyjádřeny v hostitelské buňce a tyto sekvence kódující proteiny mají požadovanou charakteristiku a jsou mutovány a znovu dochází k expresi. Proces je opakován několik cyklů dokud není získán protein s požadovanou charakteristikou. Přemísťování genů, proteinové inženýrství, PCR náchylná k chybám, stranou řízená mutace a kombinovaná nebo náhodná mutageneze jsou příklady procesů, kterými jsou generovány nové sekvence DNA kódující exogenní proteiny. US patenty 5 223 409 a 5 780 279 a 5 770 356 poskytují dostatek informací o řízené evoluci. Také v Kuchner a Arnold, Trends in Biotechnology, 15:523 až 530 (1997); Schmidt-Dannert a Arnold, Trends in Biotech, 17:135 až 136 (1999); Arnold a Volkov, Curr. Opin. Chem. Biol., 3:54 až 59 (1999); Zhao a kol., Manual of Industrial Microbiology a Biotechnology, 2nd Ed. , (Demain a Davies, eds.) strany 597 až 604, ASM Press, Washington DC, 1999; Arnold a Winrode, Encyklopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation, (Flickinger a Drew, eds.) strany 971 až 987, John Willey & Sons, New York, 1999; a Minshull a Stemmer, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284 až 290.

Použití kombinatorielní mutageneze je uvedeno v Hu a kol., Biochemistry. 1998 37:10006 až 10015. US Patent 5 763 192 popisuje způsob získání nových protein kódujících DNA sekvencí stochasticky generovaných syntetických sekvencí, jejich zavedení do hostitele a vybrání hostitelských buněk s požadovanými vlastnostmi. Způsoby pro fungování umělých rekombinovaných genů (přemisťovacích DNA) zahrnuje náhodnou prvotní rekombinaci (Z. Shao a kol., Nucleic Acid Res., 26:681 až 683 (1998), stupňovitý extenzní proces (H. Zhao a kol., Nátuře Biotech, 16:258 až 262 (1998)) a heteroduplexní rekombinaci (A. Volkov a kol., Nucleic Acids Res., 27:18 (1999)). K chybám náchylná PCR je nyní jiným přiblížením (Song a Rhee, Appl. Environ. Microbiol. 66:890 až 894 (2000)).

Existují dvě široce používané metody provedení výběrového kroku v přímém evolučním procesu. V jedné metodě je aktivita proteinu našeho zájmu orientována konkrétně na přežití v hostitelských buňkách. Například pokud je požadována cellulásová aktivita při pH 8, cellulásový gen může být mutován a zaveden do hostitelských buněk. Transformanty jsou ponechány růst s cellulósou jako slaným uhlíkovým zdrojem a pH se graduálně zvyšuje dokud několik žijících buněk zůstává. Mutovaný cellulásový gen ze Zachovalých buněk aktivní při relativně vysokém pH, který pravděpodobně kóduje cellulásy, je předložen do druhého cyklu mutace a proces je opakován dokud jsou získávány transformanty, které mohou růst na cellulóse při pH 8. Termostabilní varianty enzymů mohou být také vyvinuty, mutačními genovými cykly a vysokoteplotní kultivací hostitelských buněk (Liao a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:576 až 580 (1986); Giver a kol.. Proč. Nati. Acad Sci. USA 95:12809 ažl2813 (1998).

Alternativa k paralelnímu přístupu „přirozeného výběru" je sériový screening. V tomto přístupu jsou individuelní transformanty tříděny tradičními způsoby, jako je pozorování čistých nebo zabarvených zón kolem kolonií rostoucích v indikačním prostředí, kalorimetrické nebo fluorometrické enzymové analýzy, imunoanalýzy atd. Například v Joo a kol., Nátuře 399:670 až 673 (1999), kde byl vyvinut cytochrom P450 monooxygenása nepožadující NADH jako kofaktor cyklu mutací a screeningu; May a kol., Nátuře Biotech. 18:317 až 320 (2000), kde byla stejně vyvinuta hydantoinása s reverzní selektivitou; a Miyazaki a kol., J. Mol. Biol. 297:1015 až 1026 (2000), kde je zveřejněn termostabilní subtilisin.

Standardní klonovací a izolační techniky pro syntézu peptidů a polypeptidů byly použity k získání požadované sekvenční informace. Části známých sekvencí byly použity jako sondy k izolaci ostatních druhů a kmenů. Sekvence nukleových kyselin kódující konkrétní enzymatickou aktivitu mohou být použity ke screeningu Chrysosporium knihoven. Odborník může sám uznat vhodné podmínky pro hybridizaci. Obvyklé metody pro hybridizaci nukleových kyselin a tvorbu knihoven a klonovacích technik jsou popsány v Sambrook a kol., (Eeds) (1989) v 31 31 • · • · • · » · · ι • · ·

• · I

• · I » · · · · · „Molecular cloning. A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor, Press Plainview, New York a Ausubel a kol. (Eds) „Current Protocols in Molecular Biology" (1987) John Willey a Sons, New York. Důležité informace můžou být také získány z pozdějších příruček nebo patentů, stejně tak jako z ostatních komerčně dostupných publikací v oboru. V případném provedení předkládaného vynálezu obsahuje uvedená metoda kultivaci kmene podle předkládaného vynálezu za podmínek umožňujících expresi a výhodně sekreci proteinu nebo polypeptidu nebo jeho prekursoru a regeneraci následně produkovaného polypeptidu nebo případně předložení prekursoru k další izolaci a přečištění za získání polypeptidu našeho zájmu. Takové metody mohou případně obsahovat krok štěpení prekursoru na polypeptid nebo prekursor, o který se zajímáme. Štěpící krok může být štěpení s Kex-2 podobnou proteásou, jakoukoliv aminokyselinu párující proteásou nebo Kex-2 například, pokud proteása štěpí místo spojení nosiče vysoce proteinu a polypeptidu našeho zájmu. Odborník může nalézt Kex-2 podobnou proteásovou sekvenci která je vhodná a počet možností byl uveden ve známost, například furin.

Vhodná metoda k produkci polypeptidu našeho zájmu podle kteréhokoliv provedení předkládaného vynálezu je kultivace při pH vyšším než 5, výhodně 5 až 10, výhodněji 6 až 9. Výhodně se kultivace při této metodě provádí při teplotě mezi 2 5 až 43 °C, výhodně 30 až 40 °C. Kmen použitý ve způsobu podle předkládaného vynálezu je zcela vhodný pro rekombinant kmene Chrysosporium nebo ostatní houbovité nebo nehoubovité kmeny. Způsob podle předkládaného vynálezu může v takových případech dále předcházet kroku produkce rekombinovaného kmene podle předkládaného vynálezu. Výběr odpovídajících podmínek bude záviset na povaze vylučovaného polypeptidu a tento výběr spočívá v oblasti normální aktivity odborníka. 32 • · • · · · · ·

Způsob produkce rekombinantu kmene podle předkládaného vynálezu je také částí předmětu vynálezu. Způsob zahrnuje stabilní zavedení sekvence nukleových kyselin kódujících heterologní nebo homologní polypeptidy do hostitelského kmene, daná sekvence nukleových kyselin je operativně spojena s oblastí regulující expresi, dané zavedení se vyskytuje v množství známém pro transformované plísně. Množství výše uvedených referencí je uvedeno a pouze malá část je citována. Informace poskytnutá je dostatečná k umožnění odborníkovi provést metodu bez přehnaného experimentálního zatížení. Způsob obsahuje zavedení sekvence nukleových kyselin obsahující jakýkoliv element nukleových kyselin popsaný v různých provedeních rekombinovaného kmene podle předkládaného vynálezu stejně tak jako jeho vlastní rekombinaci.

Ve smyslu uvedení příkladu zavedení může být použit protoplast transformační způsob. Způsob je popsán v Příkladech. Případný protoplast nebo sferoplast transformační způsoby jsou známé a mohou být použity jak bylo již dříve popsáno pro ostatní plísně. Detaily těchto způsobů mohou být nalezeny v mnoha citovaných odkazech a jsou zde zahrnuty do referencí. Způsob podle předkládaného vynálezu vhodně obsahuje použití nerekombinovaného kmene jako výchozí látky pro zavedení požadované sekvence kódující polypeptid našeho zájmu. Předmět vynálezu se také týká způsobu produkce Chrysosporium enzymu, způsobu zahrnujícího kultivaci kmene Chrysosporium nebo jiného kmene v kultivačním prostředí při pH vyšším než 5, výhodně 5 až 10, výhodněji 6 až 9. Vhodné příklady neutrálního a alkalického rozmezí pH jsou 6 až 7,5 a 7,5 až 9. 33 • · • · • · • ·» · Φ 9 · · · · · • · · · · · · ···· · I · » · · ♦ · · I · · · · ···· « · ··· ··· 9 9 ·*·

Mnohem obecněji dále zahrnuje předkládaný vynález způsob produkce enzymů vykazujících neutrální nebo alkalickou optimální aktivitu a/nebo stabilitu, výhodně alkalickou optimální aktivitu a/nebo stabilitu. Upřednostněné rozmezí pH a optimální aktivity stejně tak jako analýz, kterými můžeme stanovit, byly poskytnuty v popisu. Enzym může být vybrán ze skupiny zahrnující karbohydrát degradující enzymy, proteásy, ostatní hydrolásy, oxidoreduktásy a transferásy. Jak je popsáno výše, způsob zahrnuje kultivaci hostitelských buněk transformovaných odpovídajícím enzymem kódující sekvencí nukleových kyselin. Vhodný enzym je Chrysosporium enzym. Vhodná metoda je metoda obsahující produkci konkrétně cellulásy, xylanásy, lipásy a proteásy, přičemž cellulása a xylanása štěpí ů~l,4-vazby a cellulásy obsahují endoglukanásy, cellobiohydrolásy a β-glukosidásy. Způsob podle předkládaného vynálezu může obsahovat kultivaci jakéhokoliv Chrysosporium hostitele, který obsahuje nukleové kyseliny kódující výše zmíněné enzymy. Vhodná produkce nerekombinovaného Chrysosporium hostitele podle předkládaného vynálezu je směřována k produkci karbohydrát degradujících enzymů, hydrolás a proteás. V takovém případě je enzym vhodnější než cellulása. Způsoby izolace jsou analogické způsobům popsaným v WO 98/15633 a jsou zahrnuty do referencí.

Enzymy produkované podle předkládaného vynálezu jsou také zahrnuty do vynálezu. Enzymy Chrysosporium původu mohou být izolovány z nerekombinovaného Chrysosporium kmene podle předkládaného vynálezu a jsou do vynálezu také zahrnuty. Vykazují již dříve zmíněnou stabilitu a aktivitu. Vhodně jsou stabilní při přítomnosti LAS. Obzvláště proteásy s pH 4 až 9,5, proteásy s molekulovou váhou 25 až 95 kD, xylanásy s pH 4,0 až 9,5, xylanásy s molekulovou váhou mezi 25 až 65 kD, endoglukanásy s pH mezi 3,5 až 6,5, endoglukanásy s molekulovou váhou 25 až 55 kD, β-glukosidásy, a,β-galaktosidásy s pH 4 až 4,5, β-glukosidásy, α,β-galaktosidázy s molekulovou váhou 45 až 50 kD, cellobiohydrolásy s pH 4 až 5, cellobiohydrolásy s molekulovou váhou 45 až 75 kD například molekulová váha 55 kD a pH 4,4, polygalakturonásy s pH 4,0 až 5,0, polygalakturonásy s 60 až 70 kDa, například 65 kDa, esterásy s pH 4 až 5, esterásy s molekulovou váhou 95 až 105 kDa s výše uvedenou stabilitou a aktivitou. Molekulové váhy jsou stanoveny pomocí SDS-PAGE. Nerekombinovaný tj . přírodně se vyskytující enzym je jiný než cellulása je uvedeno v WO 98/15633. Enzymy s kombinací pH hodnot a molekulových vah výše zmíněných jsou také zahrnuty do předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález se také týká nadprodukce neproteinových produktů mutovanými (rekombinovanými) kmeny podle předkládaného vynálezu. Takové neproteinové produkty zahrnují primární metabolity jako jsou organické kyseliny, aminokyseliny a sekundární jako antibiotika, například peniciliny a cefalosporiny a ostatní terapeutika. Tyto produkty jsou výsledkem kombinací biochemických cest, zahrnující několik genů našeho zájmu týkající se hub. Houbovité primární a sekundární metabolity a procedury pro produkci těchto metabolitů v houbovitých organismech jsou velice dobře známy v oboru. Příklady produkce primárních metabolitů byly popsány v Mattey M. , The production of Organic acid, Current Reviews in Biotechnology, 12, 87 až 132 (1992). Příklady produkce sekundárních metabolitů byly popsány v Penalva a kol. The Optimalization of Penicillin Biosynthesis in Funghi, Trends in Biotechnology 16, 483 až 489 (1998). • · · · 35 • · · • · · · · · ι·« · ·· Příklady provedení vynálezu Příklady transformace srovnávající kmeny Chrysosporiwn, Trichoderma a Tolypocladium geodes

Dva netransformované Chrysosporium Cl kmeny a jeden Trichoderma reesei referenční kmen byly testovány ve dvou prostředích (Gs pH 6,8 a Pridham agar, PA, pH 6,8). K testování antibiotické úrovně odolnosti sporů byly shromážděny během 7 dní na PDA destičkách. Vybrané destičky byly inkubovány při 32 °C a byly rýhovány po 2,4 a 5 dnech. Bylo zjištěno, že Cl kmeny NG7C-19 a UV18-25 poskytovaly čistě základní nízkou úroveň odolnosti k phleomycinu a hygromycinu, Tato úroveň je srovnatelná s úrovní pro referenční T. reesei, nejběžněji používaným laboratorním kmenem. Byla nalezena jasná indikace, že tyto dva standardní houbní selekční markéry byly dobře použity u Chrysosporium kmene. Problémy s ostatními houbními selekčními markéry nejsou očekávány. Výběr Sh-ble (phleomycin odolných) transformovaných Chrysosporium kmenů bylo úspěšně provedeno při 50 yg/ml. Tato selekční úroveň byla také použitá pro T. reesei, což ukazuje, jak rozdílná selekce může být dosažena u kmene Chrysosporium. Stejné poznámky jsou platné i pro transformované kmeny hydromycin resistentní na úrovni 150 pg/ml.

Transformační techniky protoplastů založené na nevíce používané plísňové transformační technologii byly použity u kmene Chrysosporium. Všechny spory z jedné PDA destičky byly pokryty 8 ml IC1 a převedeny do třepací baňky s 50 ml IC1 prostředí pro inkubaci po dobu 15 h při 35 °C 200 ot./min. Poté centrifugaci kultur byla destička promyta MnP a vrácena do roztoku s 10 ml MnP a 10 mg/ml Caylase C3 a inkubovány po dobu 30 minut při 35 °C s rotací (150 ot./min.). 36 ·· Μ · · Μ ·| • ·· · · · ·· · ·· ··· · · · · · ···· · ···· · • · · · · ··· • · · · ·· ··· ·Μ ·· ·#··

Roztok byl filtrován a filtrát byl předložen centrifugaci po dobu 10 min při 3500 rot. /min. Destička byla promyta 10 ml MnPCa2+. Roztok byl centrifugován 10 min při 25 °C. Poté bylo přidáno 50 μΐ chladného MPC. Směs byla držena na ledu a poté bylo přidáno 2,5 ml PMC. Po 15 minutách při pokojové teplotě bylo mixováno 500 μΐ upravených protoplastů s 3 ml MnR Soft, které byly bezprostředně odděleny a umístěny na MnP destičku obsahující phleomycin nebo hydromycin jako selekční markér. Po inkubaci po dobu 5 dní při teplotě 30 °C byly transformanty analyzovány (klony byly viditelné po 48 hodinách). Transformační účinnost byla stanovena za použití 10 μg referenčního plasmidu pAN8-l19. Výsledky jsou uvedeny v následující Tabulce 1.

Tabulka 1: Transformační účinnost (za použití 10 μg referenčního plasmidu pNA8-l) T. reesei NG7C-19 UV18-25 Životaschopnost 106/200 μΐ 5 106/200 μΐ 5 106/200 μΐ Transformanty (per 200 μΐ) 2500 104 104 Transfrománty (na 106 životaschopných buněk) 2500 2500 2000 Životaschopnost Chrysosporium transformantů je nadřazena životaschopnosti kmene Trichoderma. Transformovatelnost kmenů je srovnatelná a tím počet transfromantů získaných v jednom experimentu je 4 krát vyšší pro Chrysosporium než pro T. reesei. Tudíž Chrysosporium transformační systém není stejný jako obvykle používaný T. reesei systém, ale dokonce ho překonává. Toto vylepšení může být specielně použitelné pro vektory, které jsou méně transformačně účinné než pAN8-l. Příklady těchto méně účinných transformačních vektorů jsou protein přenášecí vektory pro 37 37 ···· produkce neplísnových proteinů, které obvykle poskytují 10 krát méně transformantů.

Počet ostatních transformací a expresních vektorů bylo konstruováno s homolognámi proteiny kódujícími sekvencemi kmene Chrysosporium a také s heterologními proteiny kódujícími sekvencemi pro použití v transformačních experimentech s kmenem Chrysosporium. Příklady expresních systémů zahrnují Chrysosporium xylanásu Xyll promotor spojený s xylanásovou signální sekvencí v rámci s xylanásovým otevřeným čtecím rámcem následovaným xylanásovou terminační sekvencí. Výběr transformantů byl proveden za použití kotransformace s vybraným vektorem.

Dalším příkladem je Chrysosporium lucknowese cellobiohydrolase promotor spojený s Penicillium endoglukanásou 3 signální sekvencí v rámci s Penicillium endoglukanásou 3 otevřeným čtecím rámcem následovaným Chrysosporium cellobiohydrolásovou terminační sekvencí. K tomu tento vektor přináší druhou expresní kazetu se selekčním markérem tj. genem acetamidázy S (AmdS gen).

Další příklad obsahuje Chrysosporium glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenásu 1 promotor spojený s Aspergillus niger glukoamylásovou signální sekvencí a glykoamylásovým otevřeným čtecím rámcem kondenzovným· k lidskému Interleukinu 6 otevřenému čtecímu rámci. Tento vektor poskytuje druhou expresní kazetu se selekčním markérem tj. AdmS genem.

Dalším příkladem je Aspergillus nidulans glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenása A promotor spojený s endoglukanásou 5 otevřeným čtecím rámcem následovaným Aspergillus nidulans terminační sekvencí. Příklady exprese (heterologních a homologních) Chrysosporium transformantů.

Cl kmeny (NG7C-19 a/nebo UV18-25) byly testovány na jejich schopnost vyměšovat různé heterologní proteiny: bakteriální protein (Streptoalloteichus hindustanus phleomycin odolný protein, Sk ble), plísňový protein (Trichoderma reesei xylanása II, XYN2) a lidský protein (lidský lysozym, HLZ).

Cl sekrece Trichoderma reesei xylanase II (XYN2).

Cl kmen UV18-25 byl transformován plasmidem pUT1064 a PUT1065. pUT1064 představuje dvě následující plísňové expresní kazety: První kazeta dovoluje výběr phleomycin odolných transformantů: -Neurospora crassa kontrolní gen křížové cesty 1 (cpc-1) promotor14 -Streptoalloteichus hindustanus phleomycin odolný gen Sh ble4 -Aspergillus nidulans tryptofan synthása (trpC) terminátor5 Druhá kazeta je xylanásová produkční kazeta: -T. reesei kmen TR2 cbhl promotor15 -T. reesei kmen RT2 xyn 2 gen (zahrnující jeho signální sekvenci)16 -T. reesei kmen TR2 cbhl terminátor15

Vektor také přináší E. coli replikačního původu z plasmidu pUC196. Na Obr.l je detailní mapa plasmitu. PUT1065 představuje následující plísňové expresní kazety: -A. nidulans glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenása (gpdA) promotor2 -A. syntetická T. reesei cellobiohydrolása I (cbhl) signální sekvence1,3 -S. hindustanus phleomycin odolný gen Sh ble4 použitý jako protein-nosič1 39 • · · · · · • · · · · ··· · * · · « Μ·· -Spojovací peptid (SGERK) vyznačující se KEX2 typem štěpící strany1 -T. reesei kmen TR2.xy.n2 gen (bez signální sekvence)16 -A. nidulants tryptofan synthása (trpC) terminátor5

Vektor také přenáší beta-laktamásu gen (bia) a E. coli replikaci původu z plasmidu pUC186. Plasmid je detailněji popsán na Obr.2.

Cl protoplasty byly transformovány plasmidem pUT1064 nebo pUTl065 podle stejné procedury popsané ve výše uvedeném příkladu. Rozpouštění proteinu v plasmitu pUT1065 (Sh ble :: XYN2) je funkční vzhledem k odolnosti vůči phleomycinu, která dovoluje snadné odlišení od Cl transformantů. Kromě toho, úroveň odolnosti vůči phleomycinu zhruba odpovídá úrovni xyn2 exprese. pUTl064, xyn2 byl klonován s jeho vlastní signální sekvencí.

Produkce Cl transformantů xylanásou (phleomycin odolné geny) byla analyzována kvalitativními testy na xylanásovou aktivitu následovně: Primární transformanty byly zavedeny do GS+phleomycin (5pg/ml) destiček (ověření odolnosti) a také na XYLAN destičky (detekce xylanásové aktivity byla jasnou vizualizační zónou17) . Destičky byly ponechány růst 5 dní při 32 °C. Každý platný klon byl subklonován do XYLAN destičky.

Dva subklony na transformant byly použity k naočkování PDA destiček ve smyslu získat spory pro kapalnou iniciaci kultury.

Kapalné kultury v ICI+ 5 g/1 Kphtalátu bylo ponecháno růst 5 dní při 27 °C (třepáno při 180 ot./min.) . Poté byly kultury centrifugovány (5000 g, 10 min.). Pro tyto vzorky byla změřena xylanásová aktivita DNS technikou podle Miller a kol.18. 40 40 • » 1« ·· · • · · · · · • ·· · • · · · « • · · · • · · · ·· ··

Tabulka 2: Úroveň aktivní produkce XYN2 v Cl (nejlepší provedení)

Aktivní koncentrace xylanásy II v kultivačním prostředí Specifická aktivita xylanásy II v kultivačním prostředí Netransformovaný UV18-25 3,9 U./ml 3,8 U./mg celkové prot. UV18-25::1064 klon 7-1 4,7 U./ml 4,7 U./mg celkové prot. UV18-25::1064 klon 7-2 4,4 U./ml 4,3 U./mg celkové prot. UV18-25::1065 klon 1-1 29,7 U./ml 25,6 U./mg celkové prot. UV18-25::1065 klon 1-2 30,8 U./ml 39,4 U./mg celkové prot.

Tyto data ukazují, že: 1) Body 1 až 4 z Příkladu 2 byly potvrzeny 2) Cl může být použit jako hostitel pro sekreci heterologního plísnového proteinu.

Dodatek k Příkladům: Prostředí Transformační prostředí:

Mendelova báze: MnP prostředí KH2PO4 2,0 g/1 Mendelova báze s (nh4)2so4 1,4 g/1 Pepton 1 g/1 MgS04. 7H20 0,3 g/1 MES 2 g/1 CaCl2 0,3 g/1 Sacharóza 100 g/1 Oligoelementy 1,0 g/1 Úprava pH na 5 MnR MnP CA2+ MnP+ sacharóza 130 g/1 MnP Prostředí+ Kvasnicový extrakt 2,5 g/1 CaCl2. H20 50 mM Glukóza 2,5 g/1 Úprava pH na 6,5 Agar 15 g/1

MnR Soft:

MnR pouze s 7,5 g/1 agaru MPC: CaCl2 50 mM pH 5,8 MOPS 10 mM PEG 40 %

Pro výběr a kultury: GS: Glukóza 10 g/1 Biosoyáza 5 g/1 Merieux Agar 15 g/1 pH by mělo být 6,8 PDA:

Difco, pH by mělo být 5,5

Potato dextrose agar 39 g/1 MPG:

Mandelova báze s K.Phtalátem 5 g/1

Glukóza 30 g/1

Kvasnicový extrakt 5 g/1

Regenerační médium (MnR) bylo obohaceno 50 pg/ml phleomycinu nebo 100 až 150 pg/ml hydromycinu k oddělení transformantů. GS prostředí, obohacené o 5 pg/ml phleomycinu bylo použito k potvrzení odolnosti vůči antibiotikům. PDA je kompletní prostředí pro rychlý růst a dobrou tvorbu sporů. Kapalné prostředí bylo naočkováno 1/20 objemovým dílem suspenze sporů (všechny spory z jedné PDA destičky v 5 ml 0,1% Tween). Takové kultury byly ponechány růst při 27 °C v třepací baňce (200 ot./min). 42 42 • · ·· « · *► »♦ • · · · Μ ·« · · · • *· · * » · · • · · · 0 0 0 0* · • · I · « · I · ···· 00 · Μ * «Μ ·· ····

Izolace a charakterizace Cl genů a sekvence regulující expresi CBH1, XYL1, a GPD

Konstrukce BlueSTAR genové knihovny UV18-25

Chromozomální DNA UV18-25 byla částečně zpracována Sau3A, části s 12 až 15 kb byly izolovány a podvázány na baumHI straně klonovacího vektoru BlueSTAR. Sbalení 2 0 % podvázané směsi poskytlo knihovnu genů 4,6 x 104 nezávislých klonů. Tato knihovna byla násobena a uchována při 4 °C a -80 °C. Zbytek podvázané směsi byl také skladován při 4 °C. Třídění knihovny genů UV18-25 pro izolaci genů cbhl, xyll a gpdl

Pro izolaci různých genů, celkem ±7,5 x 104 jednotlivých BlueSTAR bakteriofágů na vzorek bylo dvakrát hybridizováno. Hybridizace byla provedena s PCR fragmenty cbhl a xyll (jak je popsáno v WO 00/20555) při homologních podmínkách (65 °C; 0,2xSSC) a s gpdl A. niger za heterologních podmínek (53 °C; 0,5 x SSC) . Počet pozitivních signálů je uveden v Tabulce 3. Pozitivní klony byly roztříděny a pro každý klon byly použity individuálně dva bakteriofágy pro další experimenty. DNA různých klonů byly analyzovány restrikční analýzou k určení počtu různých klonů izolovaných z každého genu (výsledky jsou uvedeny v Tabulce 3).

Pro každý ze tří genů bylo izolováno 4 až 6 klonů. Z toho usuzujeme, že primární knihovna genů (±4 až 5 xlO4 klonů) představovala 5x genom UV18-25. Z tohoto výsledku usuzujeme, že kompletní genom UV18-25 by představovalo 9 x 103 klonů. Založeno na průměrné genomické vsuvce 13kb by to indikovalo genom velikosti ±120 Mb, který je třikrát tak velký jako velikost genomu Aspergillus. 43 ··*· ta »« um PCR reakcemi s konkrétními primery pro geny přítomnými na plasmidu (založeno na předchozích sekvenčních stanoveních z izolovaných PCR fragmentů) a T7 a T3 primery přítomnými ve spojení pBlueSTAR jsme byly schopni stanovit umístění genů v množství klonů. Z každého genu byl použit plasmid pro určení sekvence genu.

Gen pozitivních v prvním screeningu pozitivních v rescreeningu různých klonů klony použité pro řazení cbhl 8 7 4 pCBH7 xyll 9 6 5 pXyl5 gpdl 12 12 6 pGPD4

Tabulka 3: Screening 7,5 x 104 bakteriofágů knihovny genů UV18-25 s CPR fragmenty UV18-25 pro cbhl a xyll gen (homologní podmínky) a s gpdA geny A. niger (heterologní podmínky). Izolace DNA a restrikční analýzy byly použity ke stanovení počtu různých klonů.

Sekvenční analýza klonovaných genů

Pro cbhl, xyll a gpdl geny byly výsledky stanovení sekvence uvedeny v SEQ ID číslo 1, 3 a 5. Také vyvozené sekvence aminokyselin proteinů jsou uvedeny v SEQ ID číslo 2, 4 a 6. Některé vlastnosti proteinů jsou udány v Tabulce 4. Mělo by být poznamenáno, že pozice startu translace a intronu je založena na homologii s geny stejné rodiny (tj. papírová genetika). CBH1

Ze sekvence aminokyselin CBHl bylo vyvozeno, že protein je 63 kD velký a že vazba celulózové domény (CBD) je přítomna v C-terminální části proteinu. Zajímavé je, že nebyl nalezen 44 * 44 * 99 t m 9 9 ·* »· ·· · · » · · • « · · ·

9 · · C * A * * # · * fl»> ··« *· ···· důkaz přítomnosti CBD v izolovaném 55 kD majoritním proteinu.

Avšak přítomnost izolovaných peptidů byla z této 55 kD majoritního proteinu kódována CBHl proteinem (SEQ ID číslo 1, 2), což potvrzuje, že 55 kD proteinu bylo kódováno klonovaným genem. Možné vysvětlení těchto výsledků je, že 55 kD proteinu je zkrácenou verzí CBHl proteinu, který neobsahuje CBD.

Cellobiohydrolása CBHl vykazuje aktivitu proti MUF-cellobiosidu, MUF lactoside, FP a avocel a také proti p-nitrofenyl β-glukosidu, celobióse a p-nitrofenyllaktosidu.

Tato aktivita proti MUF cellobiosidu je inhibována cellobiázou s inhibiční konstantou 0,4 mM. Michaelisova konstanta proti MUF cellobiosidu byla 0,14 mM, proti MUF laktosidu 4 mM a proti CMC 3,6 g/1. Optimální pH bylo 4,5 až 7. 50% maximální aktivita proti CMC a 80% aktivita proti RBB-CMC byla udržena při pH 8. 70 až 80% aktivita během pH 5 až 8 byla udržena během 25 hodin inkubace. Teplotní optimum bylo 60 až 70 °C. CBHl je člen cellobiohydrolásové rodiny 7. Odpovídající CBH promotor, který je upřednostněným provedením předkládaného vynálezu, je udán v SEQ ID číslo 1.

Xyll

Ze sekvence aminokyselin Xyll usuzujeme, že také zde je CBD přítomna a to v tomto proteinu na N-koncové straně (tj. přímo atakuje alespoň 5 aminokyselin vzdálených od signální sekvence). V literatuře je známo pouze několik xylanás s CBD (Fusarium oxysporum, Humicola grisea a

Neocallimastix patriciarum). Odhadnutá velikost Xyll proteinu je 43 kD a několik peptidů izolovaných z 30 kD xylanásy pochází z tohoto proteinu (SEQ ID 3 a 4) . Několik izolovaných peptidů nemohlo být nalezeno v kódované sekvenci. To může znamenat, že jsou případně přítomny xylanásové proteiny v UV18-25. V předešlých analýzách nebyl nalezen důkaz přítomnosti CBD v 30 kD proteinu. Také z těchto výsledků 45 45

• · předpokládáme, že CBD proteinu je odštěpeno proteolýzou. Tato hypotéza byla dále analyzována (stanovením činnosti, N-koncových sekvencí a velikostí různých proteinů v různých Cl kmenech: Cl přírodní typ, NG7C, UV13-6, UV18-25 a proteázové mutanty UV18-25). Také efekt přítomnosti nebo absence CBD na enzymatickou aktivitu byl mnohem důkladněji zkoumán. Exprese plné délky genů v různých Cl hostitelích byla předpokládána. Přítomnost cellulósové vazné domény (CBD) je specifickou vlastností. Pouze jeden glykotický enzym známé rodiny 7 (xylanásy) obsahuje N-koncovou CBD: Fusarium oxysporium XylF. CBD v Chrysosporium lucknowense Xyll proteinu má proteinovou sekvenci: WGQCG CQGWT GPTTC VSGAV CQFVN DWYSQ CV (aminokyseliny 22 až 53 SEQ ID číslo 4) . Tato sekvence nevyhovuje CBD shodné sekvenci popsané v US Patentu 5 763 254 (Novo).

Shodná sekvence US 5 763 254 je: W/Y-G/A-Q-C-D G-Q/I/N-G/N-W/F/Y-S/T/N/Q G-P/A/C-T/R/K-T/C/N-C X-X-G/P-S/T/F/L/A-T/K C-V/T/R/E/K-K/Q/A-Q/I-N Q/D/A-W/F/Y-Y-Y/S/H/A-Q C-L/I/Q/V/T, kde W/Y znamená buď W nebo Y, X znamená jakoukoliv aminkyselinu a - znamená nepřítomen, v Xyll byly nalezeny čtyři odlišnosti s nej shodnější sekvencí, které jsou podtrženy v sekvenci 7 nahoře. Předkládaný vynález se týká xylanás, které mají N-koncovou CBD odlišnou od této shodné CBD a jsou jiné než Fusarium oxysporum xylanásy. Konkrétněji obsahuje xylanása podle předkládaného vynálezu CBD s alespoň 55 %, konkrétně alespoň 65 %, výhodně alespoň 75 % sekvenční shody se sekvencí 7 výše. Výhodně CBD obsahuje jednu z aminokyselin zahrnujících Phe, Tyr a Trp v pozici 23 nebo alespoň jednu ze čtyř aminokyselin Val v pozici 20, Gin v pozici 22, Phe v pozici 23 a Val v pozici 24. Upřednostněné sekvence zahrnují: Cys-Xaa-Phe, Xaa-Phe-Val, Cys-Xaa-Phe-Val, Cys-Gln-Phe, Val-Cys-Xaa-Phe, Gln-Phe-Val, Gln-Trp-Val, Gln-Tyr-Val, Val-Cys-Gln, Val-Cys-Gln-Phe a Val-cys-Xaa-Phe-Val, kde Xaa je 46 • · • · · # · · · · jakákoliv aminokyselina výhodně vybrána ze skupiny zahrnující Val, Thr, Arg, Glu, Gin nebo Lys, nejvýhodněji Gin nebo Glu.

Xylanása neobsahuje MUF cellobiásovou aktivitu a je tedy opravdovou xylanásou. Vykazuje vysokou aktivitu v široké oblasti pH 5 až 8 udržuje 65 % maximální aktivity při pH 9 až 10; je členem xylanásové rodiny F. Odpovídající xylanásový promotor, který je upřednostněným provedením předkládaného vynálezu je uveden jako SEQ ID číslo 3. Michaelisova konstanta proti xylan je 4,2 g/1 pro 30 kD xylanásy. Teplotní optimum je vyšší nebo rovno 70 °C pro xylanásu.

Gpdl DNA sekvence C-koncové části gpdl genu nebyla stanovena. Promotor sekvence genu je upřednostněným provedením předkládaného vynálezu a je uveden v SEQ ID číslo 5. Úroveň exprese čtyř genů Chrysosporium byla studována Northern analýzou. Různé kmeny C. lucknowense byly ponechány růst v bohatém prostředí obsahujícím pharmedium s celulósou a laktósou (protředí 1) nebo bohaté prostředí obsahující pharmedium a glukosu (prostředí 2) při 33 °C. Po 48 h bylo mycelium sklizeno a RNA byla izolována. RNA byla hybridizována 4 rozdílnými vzorky: EG5, EG6, Xyll a CBH. Po expozici byly Nothernovy skvrny zavedeny a znovu hybridizovány se vzorky ribosomální L3 pro kontrolu množství mRNA ve vzorku. Mnoho kmenů vykázalo vysokou odpověď na CBH a vysokou odpověď na Xyll v prostředí 1; v prostředí 2 polovina kmenů vykázala vysokou odpověď pro všechny geny a druhá polovina vykázala nízkou odpověď. Úroveň síly exprese byla dedukována z těchto dat jako CBH>Xyl>EG5>EG6.

Protein Xyll C. lucknowense je 67 % identický (72 % homologní) k nejbližšímu homologu v Genebank DATABASE (Tabulka • * · · • · • ♦ · · • * ···· 4) . Silná homologie CBH1 proteinu k němu spojenému homologu Humicola grisea (74 % identický/ 82 % homologní) je pozoruhodná. Je také poznamenáno, že ve všech případech je nejbližší homolog původu Fusarium, Humicola nebo jiného Pyrenomycetous (Sordariamycetous) kmene houby (Tabulka 4), přičemž Chrysosporium náleží k Plectomycetous (Eurotiomycetous) houbám podle NCBI databáze (Tabulka 4). Předkládaný vynález také zahrnuje glykanolycké enzymy, obzvláště cellibiohydrolásy a xyanásy obsahující CBD, odvozené od plectomycetous hub. • * · · • · • ♦ · · • * ···· Tabulka 4: Strukturní a srovnávací předkládaného vynálezu data CBHl,

Xyll a GPD1

Rodina glykosidás Izolát d z Cl Počet amino kyselin Introny Pozn. Příbuzné sekvence (% identity/% homologie) CBHl 7 70 kD 55 kD 526 (63 kD) 1 CBD Humicola grisea (74/82) (CBHl:P15828) Fusarium oxysporum (58/68) (CBH: P46238) Neurospora Crassa (60/69) CBHl: P38676) XYL1 10 3 0 kD 333 (43 kD) 3 CBD Fusarium oxysporum (67/72) (XylF: P46239) Penicillium simplissicum (63/72) (XylF: P56588) Aspergillus aculeatus (61/70) (XylF: 059859) GPD1 Nekom pletní 2? Podospora anserina (85/89) (CPD: P32637) Naurospora crassa (80/86) (GPD: U67457) Cryphonextria parasitica (80/85) (GPD: P19089)

Popis obrázků

Obr. 1 je pUTl064 zobrazení. Obr. 2 je pUTl065 zobrazení. 48

Odkazy (jejichž obsah je do předkládaného vynálezu zahrnut) 1. Calmels T. P., Martin F., Durand H. a Tiraby G. (1991) Proteolytic events in the Processing of secreted proteins in fungi. J. Biotechnol 17(1): strana 51 až 66. 2. Punt P. D., Dingemanse M. A., Jacobs-Meising B. J. , Pouwels P. H. a van den Hondel C. A. (1988) Isolation and Characterization of the glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase gene of Aspergillus nídulants. Gene 69(1): strana 49 až 57. 3. Shoemarker S., Schweickart V., Ladner M. , Gelfand D., Kwok S., Myambo K. a Innis M. (1983) Molecular cloning of exo-cellobiohydrolase I derived from Trichoderma reesei strain L27. Bio/Technology Oct.:691 až 696. 4. Drocourt D., Calmels T. , Raynes J. P., Baron M. a Tiraby G. (1990) Casettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin reistance. Nucleic Acids. Res 18(13) strana 4009. 5. Mullaney E. J.( Hamer J. E., Roberti K. A. a Timberlake W. E. (1985) Primary s truc ture of the trpC gene from

Aspergillus nídulants. Mol Gen Genet 199(1) strana 37 až 45. 6. Yannisch-Perron C., Vieira J. a Messing J. (1987) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequence of the M13mpl8 a pTJC19 vectors. Gene 33:103 až 119. 7. Durand H., Baron M., Calmels T. a Tiraby G. (1988) Classical and molecular genetics applied to Trichoderma reesei for the selection of improved cellulolytic industrial strains, in Biochemistry and genetics of cellulose degradation. J. P. Aubert, Editor. Academie Press strana 135 až 151. 8. Lowry 0. H., Rosebouth N. J., Farr A. L. a Randall R. J. (1951) Protein Measurements in the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265 až 275. 9. Parriche M., Bousson J. C., Baron M. a iraby G. Developement of heterologous protein secretion Systems in filamentous fungi. In 3rd European Conference on Fungi Genetics. 1996.

Munster( Germany. 10. Baron M. , Tiraby G., Calmels T., Parriche M a Durand H. (1992) Efficient secretion of human lysozyme fused to the Sh ble phleomycin resistance protein by the fungus

Tolypocladium geodes. J Biotechnol 24(3): strana 253 až 266. 11. Jeenes D. J., Marczinke B., MacKenzie D. A. a Archer D. B. (1993) A truncated glucoamylase gene fusion for heterologous protein secretion from Aspergillus niger. FEMS Mocrobiol. Lett. 107(2 až 3): strana 267 až 271. 12. Stone P. J.( Makoff A. J., Parish J. H. a Radford A. (1993) Cloning and sequence-analysis of the glukoamylase gene of neurospora-crassa. Current Genetics 24 (3): strana 205 až 211. 13. Mořsky P. (1983) Turbidimetric determination of lysozyme with Micrococcus lysodeicticus cells: Reexamination of reactin conditions. Análytical Biochem. 128: 77 až 85. 14. Paluh J. L. , Orbách M. J. , Legerton T. L. a Yanofsky C. (1988) The cross-pathway control gene of Neurospora crassa, cpc-1, encodes a protein similar to GCN4 of yeast and the DNA-binding domain of the oncogene v-jun-encoded protein. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85(11): strana 3728 až 32. 50 15. Nakari T-, Onnela M. L., Ilmen L., Nevalainen K. a Penttila M. (1994,) Fungal promoters active in the presence of glukose. WO 94/04673, Alko. 16. Torronen A., Mach R. L., Messner M. , Gonzales R. , Kalkkinen N., Harkki A. a Kubíček C. P. (1992) The two major xylanases from Trichoderma reesei: characterization of bouth enzymes nad genes. Biotechnology (N Y) 10(11): strana 1461 až 5. 17. Farkas V. (1985) Novel media for detection of microbial procedures of cellulase and xylanase. FEMS Microbiol. Letters 28:137 až 140. 18. Miller G. L. (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31:426 až 428 . 19. Punt P. J., Mattern I. E. van den Hondel C. A. M. J. J. (1988) A vector for Aspergillus transfromation conferring phleomycin resistance. Fungal genetics Newsletter 35, 25 až 30. 51 • · · · SEQ ID čislolí DNA sekvence a aminokyseliny kompletního genu Chrysosporium CBH1, který zahrnuje promotor a terminátor sekvence. Promotor sekvence (1-1779), terminátor sekvence (3427 až 4451) a intron sekvence (2179 až 2256) jsou uvedeny v malými písmeny. 1680 aaggtatccgatttggggaacgtcgatgaaagtattgcaaaagtgacgagagttgcgcaa 60 ctaactcgctgccgaagaagctgcggaagaaagagaacaccgaaagtggaataacgttac 120 ggatgtcctgacctcaaagttgaaaccagcccttcctgctctatttgggaaagcggcttg 180 cccttgaatgcgctgcactgtggcacgactaccagtgatcgggaggagcaaactaccctg 240 gtccgttccttggtggggcggcactaggcccaacttagggtgatcggaggtcgatgccgc 300 ggtcctcgttggtctgggctcttctcatttcccggtttgcaccccccgttgcacctgctg 360 atcgcccgccaacgccgatgaggttgcgcccagaccgacaatcaccgcggctgcattccc 420 aagtatattgaagatggcaccaggtacccggttttgcgtcccagtcgtttggtgccaaat 480 ttgggagtttttgagcctcaagatctggggaaatcgacctcaacttccatacaagttaaa 540 gtcgcacacacggcgagttccacgaagagacacatttttttctgaaggcctctctccccg 600 cacatcagaaaccaccaaataccaagactgcagaagccggggtaagtgggccaccgggac 660 tacactaaaatgcggggagaagcgagatccgttgcgaagggaagggatggggtgtgctgc 720 ggctttctccgctctcgtgcgccttttgcttgaatctagtgtacaccagggtaggctccg 780 aaggagtatctacggcagcgctgttcgtgctgcgttgagagtcagggcggagacgagcag 840 gcgacaggagcctcgcaccggcacttcggatcgcatttgcgcggagcgtcaaatacgctc 900 ttctgcggtcatcagagagcatcgtgaaccaaggttcttccgcagggcggcctgggcttc 960 gcagagtcgcactcggcggacgccttccgtgtcacccctgataacctggctgccgcgccc 1020 agactcctccaatgaggtgtgtggttgccctcgccgacccttcagcaaccttaatcgctt 1080 ccatcgcacggctccacgtcctcgaacgatgccctcagtccgtgcccggccgtggcaacc 1140 ataacgtgacatcgccgcccagcctactagccgctatcgaccggttaggcttgtcaccgc 1200 agcgcccattctccatcgggcctctactctgatccacctcacccaccgcaagcactagcg 1260 agcctcaccagagtgcaagcgacacgacccgcttggcccttcgtccttgactatctccca 1320 gacctcttgccatcttgccgacgccgcccccttttttttctcctccccctgccggcaggt 1380 cggtggccccagtcccgagatggcattgctccgttgtccatgacgacccatcattcgatg 1440 gctgactggcacactcgtcttgtttgagcatcgacggcccgcggcccgtctcccacggta 1500 cggaacctcgttgtacagtacctctcgtaatgatacccaacaccggggccgagcgctggg 1560 agggcggcgttcccgagaagccgggaaggcggctggccggctgacctttgtgacttggcg 1620 atggatgcggccatggagaatgtccgtccgaagcgacgcgacaattagcctggctaccat •« · ♦ · • » · · · · 52 .·* :**· · i • · · · » • ♦ · 1 ···· ·· M • ♦♦* #· ···· cgatataaattgggtgattcccagctcttgatgggcgtgtcttctgcctggcagccctcg 1740 tcttcagatcaagcaactgtgtgctgatcctcttccgccATGTACGCCAAGTTCGCGACC 1800

Μ Y A K F A T

CTCGCCGCCCTTGTGGCTGGCGCCGCTGCTCAGAACGCCTGCACTCTGACCGCTGAGAAC 1860 LAALVAGAAAQNACTLTAEN

CACCCCTCGCTGACGTGGTCCAAGTGCACGTCTGGCGGCAGCTGCACCAGCGTCCAGGGT 1920 HPSLTWSKCTSGGSCTS VQG TCCATCACCATCGACGCCAACTGGCGGTGGACTCACCGGACCGATAGCGCCACCAACTGC 1980 SÍTI danw rwthrtdsatnc TACGAGGGCAACAAGTGGGATACTTCGTACTGCAGCGATGGTCCTTCTTGCGCCTCCAAG YEGNKWDTSYCSDGPSCASK 2040 TGCTGCATCGACGGCGCTGACTACTCGAGCACCTATGGCATCACCACGAGCGGTAACTCC CCIDGADYSSTYGITTSGNS 2100 CTGAACCTCAAGTTCGTCACCAAGGGCCAGTACTCGACCAACATCGGCTCGCGTACCTAC LNLKFVTKGQYSTNIGSRTY 2160 CTGATGGAGAGCGACACCAAGTACCAGAgtaagttcctctcgcacccggccgccgggaga LMESDTKYQM 2220 tgatggcgcccagcccgctgacgcgaatgacacaGTGTTCCAGCTCCTCGGCAACGAGTT FQLLGNEF 2280 CACCTTCGATGTCGACGTCTCCAACCTCGGCTGCGGCCTCAATGGCGCCCTCTACTTCGT TFDVDVSNLGCGLNGALYFV 2340 GTCCATGGATGCCGATGGTGGCATGTCCAAGTACTCGGGCAACAAGGCAGGTGCCAAGTA SMDADGGMSKYSGNKAGAKY 2400 CGGTACCGGCTACTGTGATTCTCAGTGCCCCCGCGACCTCAAGTTCATCAACGGCGAGGC GTGYCDSQCPRDLKFINGEA 2460 CAACGTAGAGAACTGGCAGAGCTCGACCAACGATGCCAACGCCGGCACGGGCAAGTACGG NVENWQS STNDANAGTGKYG 2520 CAGCTGCTGCTCCGAGATGGACGTCTGGGAGGCCAACAACATGGCCGCCGCCTTCACTCC SCCSEMDVWEANNMAAAFTP 2580 CCACCCTTGCACCGTGATCGGCCAGTCGCGCTGCGAGGGCGACTCGTGCGGCGGTACCTA HPCWVI GQSRCEGDSCGGTY 2640 CAGCACCGACCGCTATGCCGGCATCTGCGACCCCGACGGATGCGACTTCAACTCGTACCG STDRYAGI CDPDGCDFNSYR 2700 CCAGGGCAACAAGACCTTCTACGGCAAGGGCATGACGGTCGACACGACCAAGAAGATCAC QGNKT FYGKGMTV DTTKKIT 2760 GGTCGTCACCCAGTTCCTCAAGAACTCGGCCGGCGAGCTCTCCGAGATCAAGCGGTTCTA VVTQFLKNSAGELSEIKRFY 2820 CGTCCAGAACGGCAAGGTCATCCCCAACTCCGAGTCCACCATCCCGGGCGTCGAGGGCAA VQNGKVI PNSESTIPGVEGN 2880 CTCCATCACCCAGGACTGGTGCGACCGCCAGAAGGCCGCCTTCGGCGACGTGACCGACTT 2940 SITQDWCDRQKAAFGDVTD? • t ·· 53 • · * • · · • · · •· ··*«

NCAGGACAAGGGCGGCATGGTCCAGATGGGCAAGGCCCTCGCGGGGCCCATGGTCCTCGT 3000 QDKGGMVQMGKALAGPMVLV

CATGTCCATCTGGGACGACCACGCCGTCAACATGCTCTGGCTCGACTCCACCTGGCCCAT 3060 MSIWDDHAVNMLWLDSTWPI

CGACGGCGCCGGCAAGCCGGGCGCCGAGCGCGGTGCCTGCCCCACCACCTCGGGCGTCCC 3120 DGAGKPGAERGACPTTSGVP

CGCTGAGGTCGAGGCCGAGGCCCCCAACTCCAACGTCATCTTCTCCAACATCCGCTTCGG 3180 AEVEAEAPNSNVI FSNIRFG

CCCCATCGGCTCCACCGTCTCCGGCCTGCCCGACGGCGGCAGCGGCAACCCCAACCCGCC 3240 PIGSTVSG. LPDGGSGNPNPP

CGTCAGCTCGTCCACCCCGGTCCCCTCCTCGTCCACCACATCCTCCGGTTCCTCCGGCCC 3300 VSSSTPVPSSSTTSSGSSGP

GACTGGCGGCACGGGTGTCGCTAAGCACTATGAGCAATGCGGAGGAATCGGGTTCACTGG 3360 TGGTGVAKHYEQCGGIGFTG

CCCTACCCAGTGCGAGAGCCCCTACACTTGCACCAAGCTGAATGACTGGTACTCGCAGTG 3420 PTQCESPYTCTKLNDWYSQC CCTGTAAacgaacctctctgaaggaggttctgagacacgcgcgattcttctgtatatagt 3480 L * tttatttttcactctggagtgcttcgctccaccagtacataaaccttttttttcacgtaa 3540 caaaatggcttcttttcagaccatgtgaaccatcttgatgccttgacctcttcagttctc 3600 actttaacgtagttcgcgttagtctgtatgtcccagttgcatgtagttgagataaatacc 3660 cctggaagtgggtctgggcctttgtgggacggagccctctttctgtggtctggagagccc 3720 gctctctaccgcctaccttcttaccacagtacactactcacacattgctgaactgaccca 3780 tcataccgtactttatcctgttaattcgtggtgctgtcgactattctatttgctcaaatg 3840' gagagcacattcatcggcgcagggatacacggtttatggaccccaagagtgtaaggacta 3900 ttattagtaatattatatgcctctaggcgccttaacttcaacaggcgagcactactaatc 3960 aacttttggtagacccaattacaaacgaccatacgtgccggaaattttgggattccgtcc 4020 gctctccccaaccaagctagaagaggcaacgaacagccaatcccggtgctaattaaatta 4080 tatggttcattttttttaaaaaaattttttcttcccattttcctctcgcttttctttttc 4140 gcatcgtagttgatcaaagtccaagtcaagcgagctatttgtgctatagctcggtggcta 4200 taatcagtacagcttagagaggctgtaaaggtatgataccacagcagtattcgcgctata 4260 agcggcactcctagactaattgttacggtctacagaagtaggtaataaaagcgttaattg 4320 ttctaaatactagaggcacttagagaagctatctaaatatatattgaccctagcttatta 4380 tccctattagtaagttagttagctctaacctatagatagccaaatgctataataggtacc 4440 agggttcaaaa 4451 SEQ ID číslo 2: e uvedena tuč ; SCTSVQGSIT 50 DGADYSSTYG 100 , LGNEFTFDVD 150 DSQCPRDLKF 200 . AAFTPHPC7V 250 FYGKGMTVDT 300 GVEGNSITQD 350 DHAVNMLWLD 400 NIRFGPIGST 450 vakhyeqcgg 500

Aminokyseliny kompletního Chrysosporium CBHl proteinu. Domnělý signální peptid (1 až 19) je uveden italikou a cellulózová vazná doména (496 až 526) podtrženými písmeny. 526

IGFTGPTQCE SPYTCTKLND WYSQCL SEQ ID číslo 3: DNA sekvence a aminokyseliny kompletního genu Chrysosporium Xyll, který zahrnuje promotor a terminátor sekvence. Promotor sekvence (1-969), terminátor sekvence (2428 až 3030 (3028)) a intron sekvence (1043 až 1116, 1181 až 1332 (1331), 1596 (1595) az 1674 (1672)) jsou uvedeny v malými písmeny. tcatcaacttggcgtttggatgtactaatattacacgtcgtttgcnnagcggagtctgtg 60 tcatctccgtggggtcgggtgctccagacgacgcttcgggccgatcctgaattcgggaag 120 gaaacggttcggctaatcaggtcctctaaaatataacgaagcactacagagggagttcct 180 cagaggacatcgtatcaaccgaagaacgaagcgccgaaaggactgatcaaaacaggagta 240 ggtagggatgtgtgagtacctaaactttccatacctgacataaaatcatcatggtgcttc 300 agacctgtttgatgaggcgagggcggaggccgcattgtattttcgttccttccttctttt 360 tgttagtatatctnagggttccatcgtaaaatggaatcttccagctctactagtaattag 420 aacaatagttctgatgtcgtgcgccaagctttttcagatgactgccaaaaacccatcatg 480 ggtatggacaaaagcagtaatcggagtcacaacgccgcattttccttcatgatttccgtc 540 aaccggagaggtcggaggaggactccggccacatgtgatgcgaagaagtacatggcgcca 600 tggttctaacctcttatagtctgaaaatgcgcggaggccagcgaagccaagcccgggaac 660 cgttcttgtcatggtttcagtattgtttcgctaaacattctatccgattcgcgataggtg 720 cggctgccaccgaaggttgtatccttaaag.ctttggtaagtacggagtacggaaatggaa 780 55 ·· ·· · · * * ·»· ·· ·* ··· • ·· · * · * ···· · ···· • · · · · · * acgcgccgcagtcctggttccatcggtatcctccgcatgctccgccaaaaaaagaaaacc 840 cgggtatgtttacaaaggatataagagacaagatgcaccacccgcccccttcccatctgc 900 cggttgcccacgtcgccgtcgactgcttgtccgcttcctacctgcagcctctttcagaga 960

ccatcaaacATGCGTACTCTTACGTTCGTGCTGGCAGCCGCCCCGGTGGCTGTGCTTGCC 1020 MRTLTFVLAAAPVAVLA CAATCTCCTCTGTGGGGCCAGTgtatgtaattgccttactcggaaaatagtcaccactag QSPLWGQC 1080 agggacttaagctcactacttcctgtttcacaatagGCGGCGGTCAAGGCTGGACAGGTC G G Q G W T G 1140 CCACGACCTGCGTTTCtGGCGCAGTATGCCAATTCGTCAAgtcagtaactgcttttatt PTTCVSGAVCQFVN 1200 tcttttctctctgggattacgatttcgttttgcacttagcttggttctgcatttcattgt 1260 tgtattgttctctttttgtgtgtgagaggttttattaccacctaaaggccatttgctaac 1320 aaatctccccagTGACTGGTACTCCCAATGCGTGCCCGGATCGAGCAACCCTCCTACGGG DWYSQCVPGSSNPPTG 1380 CACCACCAGCAGCACCACTGGAAGCACCCCGGCTCCTACTGGCGGCGGCGGCAGCGGAAC TTSSTTGSTPAPTGGGGSGT 1440 CGGCCTCCACGACAAATTCAAGGCCAAGGGCAAGCTCTACTTCGGAACCGAGATCGATCA GLHDKFKAKGKLYFGTEIDH 1500 CTACCATCTCAACAACAATGCCTTGACCAACATTGTCAAGAAAGACTTTGGTCAAGTCAC YHLNNNALTNIVKKDFGQVT 1560 TCACGAGAACAGCTTGAAGTGGGATGCTACTGAGCgtgagtgacctctcctccttctccc HENSLKWDATEP 1620 gacaataatagataattacgagccggttcgaggctgacattgcgcgattctagCGAGCC 1680

S R GCAATCAATTCAACTTTGCCAACGCCGACGCGGTTGTCAACTTTGCCCAGGCCAACGGCA NQFNFANADAVVNFAQANGK 1740 AGCTCATCCGCGGCCACACCCTCCTCTGGCACTCTCAGCTGCCGCAGTGGGTGCAGAACA LIRGHTLLWHSQLPQWVQNI 1800 TCAACGACCGCAACACCTTGACCCAGGTCATCGAGAACCACGTCACCACCCTTGTCACTC NDRNTLTQVI ENHVTTLVTR 1860 GCTACAAGGGCAAGATCCTCCACTGGGACGTCGTTAACGAGATCTTTGCCGAGGACGGCT YKGKILHWDVVNEIFAEDGS 1920 CGCTCCGCGACAGCGTCTTCAGCCGCGTCCTCGGCGAGGACTTTGTCGGCATCGCCTTCC LRDSVFSRVLGEDFVGIAFR 1980 GCGCCGCCCGCGCCGCCGATCCCAACGCCAAGCTCTACATCAACGACTACAACCTCGACA AARAAD PNAKLY I NDYNLDI 2040 2100

TTGCCAACTACGCCAAGGTGACCCGGGGCATGGTCGAGAAGGTCAACAAGTGGATCGCCC

ANYAKVTRGMVEKVNKWIAQ

. · · • é · · · ·

AGGGCATCCCGATCGACGGCATCGGCACCCAGTGCCACCTGGCCGGGCCCGGCGGGTGGA 2160 GIPIDGIGTQCHLAGPGGWN

ACACGGCCGCCGGCGTCCCCGACGCCCTCAAGGCCCTCGCCGCGGCCAACGTCAAGGAGA 2220 TAAGVPDALKALAAANVKE I

TCGCCATCACCGAGCTCGACATCGCCGGCGCCTCCGCCAACGACTACCTCACCGTCATGA 2280 AITELDIAGASANDYLTVMN

ACGCCTGCCTCCAGGTCTCCAAGTGCGTCGGCATCACCGTCTGGGGCGTCTCTGACAAGG 2340 ACLQVSKCVGITVWGVSDKD

ACAGCTGGAGGTCGAGCAGCAACCCGCTCCTCTTCGACAGCAACTACCAGCCAAAGGCGG 2400 SWRSSSNPLLFDSNYQPKAA CATACAATGCTCTGATTAATGCCTTGTAAgaggaggtatattatttttagaggcaatgaa 2460 YNALINAL* gctaggaggaaagaggggaagtgaggtaattagctaggacaggcaaatctagcagcaatt 2520 ataagtcaacactatataaaatattcctataatggcttgtgcttcggtgtgcaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcaaaaacaaaaatgatccaacatgatt 2640 cgaaatggcgaccttgcaaatgcacacctcagataataccactatacaatacaccttaaa 2700 tggcacctaaatccatttgtctgcggtcatagacggggcttaagaagcctgggatgcagg 2760 tgtcgatgcaagggttacgtcagtgtatgatatgagtatgaaccatgctgtctgggtaat 2820 tctccactttccctccccttacgactcttcgggtgtgcctctctagaaagtcgactcctg 2880 gcgcctcagatcgccctttggctctgttcggtacaatgacgtccgctggtttcttccaaa 2940 gaccaggtatttctcccgtggcaacaaagaataccaaatacctatatcgaaccgtagtct 3000 tctgataattagatgtctctcaaggcgcgg 3030 SEQ ID číslo 4:

Aminokyselinová sekvence kompletního Chrysosporium Xyll proteinu. Signální peptid (1 až 20) je uveden italikou a cellulósová vazná doména (22 až 53) je uvedena tučnými podtrženými písmeny.

1 MRTLTFVLAA APVAVLAQSP LWGQCGGQGW TGPTTCVSGA VCQFVNDWYS 51 QCVPGSSNPP tgttssttgs tpaptggggs gtglhdkfka kgklyfgtei 101 DHYHLNNNAL TNIVKKDFGQ VTENSLKWDA TEPSRNQFNF ANADAVVNFA 151 QANGKLIRGH TLLWHSQLPQ WVQNINDRNT LTQVIENHVT TLVTRYKGKI 201 LHWDVVNEIF AEDGSLRDSV FSRVLGEDFV GIAFRAARAA DPNAKLYIND 251 YNLDIANYAK VTRGMVEKVN KWIAQGIPID GIGTQCHLAG PGGWNTAAGV 301 PDALKALAAA NVKEIAITEL DIAGASANDY LTVMNACLQV SKCVGITVWG 351 VSDKDSWRSS SNPLLFDSNY QPKAAYNALI NAL* 57 57

• · • · • · • · SEQ ID číslo 5: DNA sekvence částečného genu Chrysosporium GPD1, který zahrnuje promotor sekvenci. Promotor sekvence (1-1555) a intron sekvence (1682 až 1781) jsou udány v malými písmeny. 3' konec genu chybí. tgagcagcaatgagcagcaatgagcattcctgggccaccgagtctgagtgccagtacgga 60 gtatcgtacttcgtaccggggtttgatttggtgacggtgcttttcacctctcgatgcccg 120 aaatcgggtctaagctgagtttgatcaaatatgtgactccaacatcgcccccttcggcaa 180 accccgtcgacacgtgtgtcatccttccattgcaagcgatcactcgcagggcgtgacgat 240 gaacgagatttttgcccggaccgattcgcggatatagcggcagccgaccagccctaccac 300 actgatggccgtgtcactagtgtatgctcccagaaccgcaagcatacactgggcaatgct 360 tggtatgcagttgaggcagctttatgtttccatacccttccacttcggctcggggactcg 420 gcggggtcgcggaagtttgacggcagccgtcgggccttaggccgagattaccgtggttgt 480 ggcccagttttagccgttcccgtccgtttcctaccggaccatgattttcgtgaaccattg 540 caatcccgaagcgcatttccgacgttaaggagttacctccgctgcccagaattcatgatc 600 gtggccggctcaaggcagcgtggcggggcatccgtgtcaagctcccaggaggaggtgcgc 660 gatttcaaatccgggccaaaacaggccaagactggctggccaaaaaaaggagcgtagacg 720 gcccgggacatcggacgtcagctcgcagccacccaaaaccggtccgatctactcgcttac 780 tgtggtagttcaggtacttttgagtagtaaaaacgctacggcagggccggggggttcccc 840 ggtgacggaggtgcctctgcggtggcgaacatcccacgcactctcgagctacggtgacac 900 ctcgtgtcctgttggtcttgcaatgctggggcggcaggaaatgcgtcgcgctcctcccgg 960 ccaagacctaaaacagacagcgccgcaaagtcgctcactagcaccgcgaaacgaagatgc 1020 cccacctcaacgcaatctgtgatgcaagcaattgggaaggctcaccccacctcagcgagg 1080 ggctcaaccatttttattatcagctcatgccaccacaacatgactgttttctttccttgc 1140 tcatcccacatttgacaaaaatcgtcgattaatctctttccatacaggccgtccgcgctc 1200 tgataaccacataaaagtctcttcagtcaacagctcaaagctccctcatccctccaggta 1260 agcagccaaagagctcccccacggaccccgcactgcctcatcccgcctgtatcggacctg 1320 cgcgacccagcagagaatcccaaacctttgctgcttgctgcccggttccggactgagctg 1380 caacccaagcctttaaaaagcttttcccttctcccacggtgtcaactctgtcctatccct 1440 ccgacatccgttgagctcaacaactccccgaaccttttaccccgcgccgagctaccccte 1500 catcaaaccaccctgacagctcgctcactcacctccccacatcacagaaatcaaaATGAC 1560 Μ T - TATCAAGGTCGGCATCAACGGTTTCGGCCGTATCGGCCGTATCGTCTTCCGCAACTCCAT 1620 IKVGINGFGRIGRIVFRNSI- CGAGCACTCGGATGTCGAGATCGTTGCCGTCAACGACCCCTTCATTGAGCCCAAGTACGC 1680

E HS-DVE I VAVNDPFI E P K Y A -

Tgtaagtagttttttttttccttcctcgcgttctttcctgttccatcgacagtacgagat 1740

GatcttgcaggcggatcggagctaaccgcgattgtcgtacagGAGTACATGCTCAAGTAT 1800

E Y M L K Y

GACTCGACCCACGGTATCTTCAACGGCACCATCGCCGTCGAGGGCAACGACCTCATTGTC 1860 DSTHGIFNGTIAVEGNDLIV

AACGGCAAGAGGGTCAAGTTCTACACTGAGCGGGMCCCCGCCAACATTCCCTGGARGGAA 1920 NGKRVKFYTER7PANI P W 7 E

ACTGGTGCCGAGTACATMRTCGAGTCGACCGGTGTGTTCACCAMCACCSAGAAGGCTAGC 1980 TGAE Y I ? E S TGVFT ? T ? KAS

GCCCACCTCAAGGGCGGCGCCAAGCGCGTCATCATCTCTGCTCCCTCGGCCGATGCCCCC 2040 AHLKGGAKRVI I SAPSADAP

ATGTACGTCATGGGCGTCAACGAGAAGACCTACGACGGCAAGGCCCAGGTCATCTCTAAC 2100 MYVMGVNEKTYDGKAQVISN

GCCTCGTGCACCACCAACTGCCTGGCTCCCCTCGCCAAGGTCATCCACGACAAGTTCGGC 2160 ASCTTNCLAPLAKVIHDKFG

CTCGTTGAGGGTCTCATGACCACCGTCCACTCCTACACTGCCACCCAGAAGACCGTCGAT 2220 LVEGLMTTVHSYTATQKTVD

GGTCCCTCTGCCAAGGACTGGCGTGGTGGCCGTGGTGCTGCTCAGAACATCATCCCCAGC 2280 GPSAKDWRGGRGAAQNIIPS

AGCACTGGCGCCGCCAAGGCCGTCGGCAAGGTCATCCCTGAGCTCAACGGCAAGCTCACC 2340 STGAAKAVGKVI PELNGKLT

GGCATGTCCCTCCGTGTCCCCACCCCCAACGTTTCCGTTGTCGACCTCACCTGCCGCCTC 2400 GMSLRVPTPNVSVVDLTCRL

GAGAAGGAGGCTACCTACGACGACATCAAGGCCGCCATCAAGGAGGCCGCCGCCGGCCCC 2460 EKEATYD DIKAAIKEAAAGP CTCAAGGgtgagttatctggttcctttttttttttttggagaacgacacatgctgataaa 2520 L K G

acccagGCATCCTCGACTACACTGAGG 2547 I L D Y T E SEQ ID číslo 6:

Aminokyseliny částečného Chrysosporium GPD1 proteinu (C-konec chybí v dostupné sekvenci).

MTIKVGINGF GRIGRIVFRN SIEHSDVEIV AVNDPFIEPK YAEYMLKYDS THGIFNGTIA VEGNDLIVNG KRVKFYTER? PANIPW7ETG AEYI7ESTGV FT7T7KASAH LKGGAKRVII SAPSADAPMY VMGVNEKTYD GKAQVISNAS CTTNCLAPLA KVIHDKFGLV EGLMTTVHSY TATQKTVDGP SAKDWRGGRG AAQNIIPSST GAAKAVGKVI PELNGKLTGM SLRVPTPNVS VVDLTCRLEK

EATYDDIKAA IKEAAAGPLK GILDYTE

Claims (15)

1. 59

   ψ · • · · ♦ ♦ ·

   PATENTOVÉ NÁROKY 1. Protein odpovídající Chrysosporium glykosyl hydroláse rodiny 7, vykazující alespoň 75 % identity aminokyselin (jak je definováno BLAST algoritmem) se sekvencí aminokyselin SEQ ID číslo 2 nebo její částí, obsahující alespoň 20 sousedících aminokyselin, které jsou identické k odpovídající části 1 až 246 nebo 394 až 526 sekvence aminokyselin SEQ ID číslo 2.
2. 2. Protein odpovídající Chrysosporium glykosyl hydroláse rodiny 10, vykazující alespoň 70 % identity aminokyselin (jak je definováno BLAST algoritmem) se sekvencí aminokyselin SEQ ID číslo 4 nebo její částí, obsahující alespoň 20 sousedících aminokyselin, které jsou identické k odpovídající části 1 až 133 nebo 252 až 383 sekvence aminokyselin SEQ ID číslo 4.
3. 3. Protein odpovídající Chrysosporium glykosyl hydroláse rodiny 10, vykazující alespoň 65 % identity aminokyselin (jak je definováno BLAST algoritmem) se sekvencí aminokyselin SEQ ID číslo 4 nebo její částí, obsahující alespoň 20 sousedících aminokyselin, které jsou identické s odpovídající části 1 až 383 sekvence aminokyselin SEQ ID číslo 4.
4. 4. Protein odpovídající glykosyl hydroláse rodiny 10, který obsahuje cellulósovou vaznou doménu vykazující alespoň 55 % identity aminokyselin se sekvencí aminokyselin 22 až 53 a/nebo obsahuje alespoň 20 sousedících aminokyselin ze sekvence aminokyselin 22 až 53 SEQ ID číslo 4 a/nebo jednu z aminokyselin F, W a Y v relativní pozici 44.
5. 5. Protein odpovídající Chrysosporium glyceraldehyd fosfát dehydrogenáse, vykazující alespoň 86 % identity aminokyselin (jak je definováno BLAST algoritmem) s částečnou sekvencí aminokyselin SEQ ID číslo 6 nebo s její částí obsahující alespoň 20 sousedních aminokyselin, které jsou identické 60 • · • 9 ·· * * » · · « i · « Μ •· ···* s odpovídající částí 1 až 277 aminokyselinové sekvence SEQ ID číslo 6.
6. 6. Způsob hydrolýzy β-glukosidických vazeb, vyznačující se tím, že obsahuje použití enzymu podle nároku 1.
7. 7. Způsob hydrolýzy β-xylosidických vazeb, vyznačujících se tím, že obsahuje použití enzymu podle nároku 2, 3 nebo 4.
8. 8. Sekvence nukleových kyselin kódující protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
9. 9. Sekvence nukleových kyselin obsahující alespoň 70 % nukleotidů obsažených v 5'-nekódující oblasti sekvence nukleových kyselin kterékoliv z SEQ ID číslo 1, 3 a 5.
10. 10. Stavba nukleové kyseliny obsahující oblast regulující expresi nukleové kyseliny odvozené od Chrysosporium, obsahující 5'-nekódující oblast sekvence nukleové kyseliny kterékoliv z SEQ ID číslo 1, 3 a 5, provozně spojené se sekvencí nukleové kyseliny kódující polypeptid našeho zájmu.
11. 11. Rekombinant mikrobiálního kmene, výhodně kmen týkající se hub, obsahující sekvenci nukleových kyselin podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10 a je schopný exprese polypeptidu kódovaného sekvencí kódující nukleové kyseliny.
12. 12. Způsob vyznačující se tím, že se produkuje polypeptid se stavbou podle nároku 10 nebo mikrobiální kmen podle nároku 11.
13. 13. Oligonukleotidová sonda, obsahující alespoň 15 sousedících nukleotidů sekvence nukleových kyselin kterékoliv SEQ ID 1, 3 a 5 nebo jejich doplněk.
14. 14. Oligonukleotidová sonda podle nároku 13, přičemž sonda obsahuje 20 až 50 nukleotidů na délku.
15. 15. Oligonukleotidová sonda podle nároku 13 nebo 14, přičemž sonda je označena detekovatelným označením.