NO20024945L - Ekspresjonsregulerende sekvenser og ekspresjonsprodukter - Google Patents

Description

Område for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører nye enzymer avledet

fra filamentøs fungi, spesielt fra stammene til genus Chrysosporium, og til kodesekvenser og ekspresjonsregulerende sekvenser for disse enzymer. Den foreliggende oppfinnelse er en utvidelse av oppfinnelsen beskrevet i WO 00/20555 (PCT/NL99/00618), innsendt 6. oktober 1999, og

som ikke er publisert før prioritetsdatoen av foreliggende søknad. Beskrivelsen av denne inkorporeres heri ved referanse .

Bakgrunn og teknikkens stilling

Et antall verter for genekspresjon, og fremgangsmåte for transformasjon er blitt beskrevet innen teknikkens stilling. Bakterier nevnes ofte, f.eks. Escherichia coli. E. coli er imidlertid en mikroorganisme som ikke er i stand

til sekresjon av en rekke proteiner eller polypeptider og som således er uønsket som vertsceller for produksjon av proteiner eller polypeptider på det industrielle nivå. En ytterligere ulempe for E. coli, som også gjelder for bakterier generelt, er at prokaryoter ikke kan tilveiebringe ytterligere modifiseringer som er nødvendige for et antall eukaryote proteiner eller polypeptider for å kunne produseres i en aktiv form. Glykosylering av proteiner og egnet folding av proteiner er eksempler på prosessering som er nødvendig for å sikre at det produseres et aktivt protein eller polypeptid. For å sikre slik prosessering kan man noen ganger anvende mammalske celler, men ulempen med slike celler er at de ofte er vanskelige å opprettholde og krever kostnadsdyre media. Slike transformasjonssystemer er derfor ikke praktiske for produksjon av proteiner eller polypeptider på et industrielt nivå. De kan imidlertid være kostnadseffektive for høyt prisede farmasøytiske

forbindelser som er nødvendige i relativt lave mengder, men vanligvis ikke for industrielle enzymer.

Et antall fungale ekspresjonssystemer er blitt utviklet, f.eks. Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei. Ytterligere flere er blitt foreslått, men det er av forskjellige grunner ikke funnet en bred aksept for bruk av disse. I generelle termer må den ideelle vert oppfylle et stort antall kriterier: Den ideelle vert må enkelt kunne fermenteres ved

anvendelse av billige medium.

Den ideelle vert bør bruke mediet effektivt.

Den ideelle vert må produsere polypeptidet eller proteinet i stort utbytte, dvs. må oppvist høyt protein til biomasseforhold.

Den ideelle vert bør være i stand til effektiv

sekresjon av proteinet eller polypeptidet.

Den ideelle vert må muliggjøre enkel isolering og

rensing av det ønskede protein eller polypeptid.

Den ideelle vert må prosessere det ønskede protein eller polypeptid slik at det produseres i en aktiv form som ikke krever ytterligere aktivering eller modifiseringstrinn.

Den ideelle vert bør enkelt transformeres.

Den ideelle vert bør muliggjøre at et bredt spekter av ekspresjonsregulerende elementer og kan anvendes, noe som dermed sikrer enkel applikasjon og diversitet.

Den ideelle vert bør muliggjøre anvendelse av enkle selekterbare markører som er billige å bruke.

Den ideelle vert bør produsere stabile

transformanter.

Den ideelle vert bør muliggjøre dyrkning under betingelser som ikke er ødeleggende for proteinet

eller polypeptidproduktet, f.eks. lav viskositet, lave skjærkrefter.

WO 96/02563 og US Patenter 5.602.004, 5.604.129 og 5.695.985 til Novo Nordisk beskriver ulempene med Aspergillus- og Tric^oderma-systemer, og antyder at dyrkningsbetingelser for andre fungi kan være mer egnet for storskala proteinproduksjon. De eneste eksempler gitt for transformerte kulturer er av Myceliophthora thermophila, Acremonium alabamense, Thielavia terrestris og Sporotrichum cellulophilum- stammer. Sporotrichum-stammen rapporteres å lysere og produsere grønt pigment under fermenteringsbetingelser som ikke fører til slike resultater for andre stammer. En ikke-sporedannende mutant av Thielavia terrestris er beskrevet som å være den utvalgte organisme pga. dens morfologi. Det angis imidlertid også at protoplast-effektiviteten av Thielavia og Acremonium (hvor Acremonium-stammen var den ufullstendige form av Thielavia-stammen som ble benyttet) er lav, og at hygromycin ikke kunne nyttes som en seleksjonsmarkør. Et stort antall andre er foreslått å være potensielt nyttige pga. deres morfologi, men ingen transformasjon av disse er beskrevet. De foreslåtte stammer er Corynascus, Thermoascus, Chaetomium, Ctenomyces, Scytalidium og Talaromyces. De transformerte verter angis til kun å produsere lave nivåer av den introduserte Humicoia-xylanase, hvor Thielavia produserte de minste mengder, imidlertid er informasjonen tvetydig og antydet faktisk Thielavia som beste utførelse. Nomenklaturen av denne referanse er basert på ATCC-navnet til industrielle fungi fra 1994. Det er åpenbart at ingen høy grad av heterologisk ekspresjon ble oppnådd, og at faktisk ingen positiv korrelasjon kunne avledes mellom den postulerte morfologi og graden av ekspresjon. Dersom man kunne utlede en korrelasjon, var denne mest sannsynligvis negativ. I samsvar med 1996 ATCC fungiklassifisering, er Sporotrichum thermophilum ATCC 20493 en Myceliophthora thermophila- stamme. Imidlertid identifiseres stammen frem-deles som Myceliophthora thermophila. Manglende predikerbarhet innen fagfeltet er åpenbar ut fra disse nylige be-skrivelser.

WO 97/26330 til Novo Nordisk antyder en fremgangsmåte for å oppnå mutanter av filamentøse fungale morceller som har en forbedret egenskap for produksjon av heterologt polypeptid. Fremgangsmåten omfatter først å finne en spesifikt forandret morfologi etterfulgt av en undersøkelse av om transformanten produserer mer heterologt polypeptid enn morstammen. Fremgangsmåten er illustrert kun for stammene Fusarium A3/5 og Aspergillus oryzae. Fremgangsmåten antydes å kunne benyttes for Aspergillus, Trichoderma, Thielavia, Fusarium, Neurospora, Acremonium, Tolyplo-cadium, Humicola, Scytalidium, Myceliophthora eller Mucor. Som antydet ovenfor tilveiebringer manglende predikerbarhet innen fagfeltet og manglende predikerbarhet i fremgangsmåten i de angitte applikasjoner ingen generell appliserbar lære der man med god grunn kan forvente en god grad av suksess.

I WO 00/20555 har vi beskrevet et alternativt fungalt ekspresjonssystem som er enklere i bruk enn de ovenfor angitte Aspergilli og Trichoderma, og som oppfyller de ovenfor angitte krav. Det nye system tilveiebringer de ytterligere fordeler at transformasjonsratene er høyere enn for det hyppig anvendte Trichoderma reesei-system. I tillegg muliggjør dyrkningsbetingelsene ytterligere fordeler idet det er fordelaktig for polypeptidproduktet.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Vi vil nå beskrive et antall industrielle interessante enzymer avledet fra Chrysosporium-stammer, sammen med full sekvensinformasjon. Vi beskriver også nye promotorsystemer avledet fra Chrysosporium-stammer og som er nyttige for ekspresjon av homologe og heterologe gener.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt gly-kosylhydrolaser av familien 7 (f.eks. cellobiohydrolaser) og 10 (f.eks. xylanaser), og glyceraldehyd-fosfat-dehydro-genaser, som identifisert med deres aminosyresekvens, og likeledes peptider avledet fra disse enzymatiske proteiner, og nukleinsyresekvenser som koder for disse peptider og proteiner, og likeledes, spesielt, med regulerende sekvenser relatert til disse gener.

Nærmere bestemt vedrører foreliggende oppfinnelse isolerte eller rekombinante enzymatiske proteiner eller aktive deler derav av de tre klasser angitt ovenfor, inkluderende mutanter derav som har minst en viss grad av sekvensidentitet som spesifisert i den videre beskrivelse og i kravene, og likeledes nukleinsyresekvenser som koder for disse proteiner eller deler derav, og/eller nukleinsyresekvenser som regulerer deres ekspresjon. Disse enzymer er spesielt: (1) en glycosylhydrolase av familie 7 (cellobiohydrolase, CBH1) som har minst 75%, fortrinnsvis minst 80% eller mer fortrinnsvis 85% aminosyreidentitet med sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 2; (2) en glycosylhydrolase av familie 10 (endo-xylanase XYL1) som har minst 70%, fortrinnsvis minst 75% eller mer fortrinnsvis minst 80% aminosyreidentitet med sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 4; og (3) en glyceraldehydfosfatdehydrogenase (GPD1) som har minst 86%, fortrinnsvis minst 90% eller mer fortrinnsvis minst 93% aminosyreidentitet med sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 6.

Polypeptider og nukleinsyresekvenser som koder for disse polypeptider, som har minst 20, fortrinnsvis minst 30 kontiguøse aminosyrer ifølge SEKV. ID. NR. 2, 4 og 6, er også foretrukket innen forbindelsen. De korresponde rende nukleinsyresekvenser er avbildet i SEKV. ID. NR. 1 (cbhl), 3 (xyll) og 5 (gpdl), respektivt.

De rekombinante enzymer kan omfatte i hovedsak det fullstendige protein, eller et trunkert protein som har i det minste deler av den enzymatiske aktivitet. Slik trunkert del kan være det katalytiske domenet, eller minst ca. 75% av aminosyrene derav. For å eksemplifisere, omfatter det katalytiske domenet til CBH1 i samsvar med oppfinnelsen aminosyrene 20-495 av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 2, og det katalytiske domenet av XYL1 i samsvar med oppfinnelsen omfatter aminosyrene 54-384 av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 4. Det katalytiske domenet kan, eller trenger ikke, å kombineres med en signalsekvens som stammer fra et annet protein og/eller med et karbohydrat-bindende domene fra et annet enzymatisk protein. Alternativt kan det cellulose-bindende domenet av enzymene ifølge oppfinnelsen (CBH1 og XYL1) fusjoneres til katalytiske domener av andre enzymatiske proteiner.

Nukleinsyresekvensene i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan være fullstendige protein-kodende regioner eller oligonukleotider, eller fortrinnsvis ekspresjonsregulerende sekvenser. Oligonukleotider kan også anvendes som prober for å identifisere gener som korresponderer til, men som ikke er identiske til genene ifølge SEKV. ID. NR. 1, 3 og 5 idet disse gener, idet de oppfyller pro-sentandelen identitetskriterier definert heri, og likeledes kodende og ikke-kodende deler derav og deres eks-presjonsprodukter er også del av oppfinnelsen. Oligonukleotidene er fortrinnsvis 15-75, mer fortrinnsvis 20-50 nukleotider i lengde.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også ekspresjonssystemer (kassetter) som omfatter enten en ekspresjonsregulerende region (inkluderende en promotor) av en hver av de tre proteinklasser fusjonert til et genkodende annet protein av interesse, eller en koderegion av ethvert av disse proteiner fusjonert til en annen ekspresjonsregulerende region, eller både den ekspresjonsregulerende region og den protein-kodende region av disse nye proteiner. Den ekspresjonsregulerende region omfatter minst 60%, fortrinnsvis minst 70%, mer fortrinnsvis minst 75% eller også 80% av 5'-ikke-kodende region av SEKV. ID. NR. 1, 3 og 5, og/eller minst 20, fortrinnsvis minst 40 konti-guøse nukleotider fra disse 5'-ikke-kodende regioner. Termineringssekvenser som tilsvarende er avledet fra de 3'-ikke-kodende regioner av genene ifølge oppfinnelsen er også nyttige i ekspresjonskassetter, enten kombinert med homologe eller heterologe gener.

Polynukleotidene og oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen kan ha minimum sekvensidentitet med de korresponderende sekvenser ifølge SEKV. ID. NR. 1, 3 eller 5, eller alternativt hybridisere under stringentbetingelser med disse gitte sekvenser. Stringente hybridiseringsbetingelser er de som forstås innen fagfeltet, f.eks. hybridisering i 6xSSC (20xSSC pr. 1000 ml:175,3 g NaCl, 107,1 g natriumcitrat.5H20, pH 7,0), 0,1% SDS, 0,05% natriumpyrof osf at, 5<*>Denhardfs løsning og 20 ug/ml denaturert DNA fra sildesperm ved 56°C i 18-24 timer etterfulgt av 32 min. utvaskinger i 5xSSC, 0,1% SDS ved 56°C og 32 min. utvaskinger i 2xSSC, 0,1% SSC ved 56°C.

Disse ekspresjonssystemer kan kombineres i en Chrysosporium- vert, så som en Chrysosporium lucknowense- vert eller i en annen ikke-fungal, eller fortrinnsvis fungal vert. Eksempler på andre fungale verter er andre Chrysosporium- former eller stammer, Fusarium- former, Aspergillus- f ormer etc. Slike verter kan fordelaktig være en vert som ikke selv, internt eller som et resultat av dyrk ningsbetingelser, produserer et protein som korresponderer til det aktuelle protein, for å forenkle gjenvinning av det aktuelle protein.

Der hvor det gjøres henvisning i denne beskrivelse og i de medfølgende krav til «polypeptider» eller «peptider» eller «aktuelle polypeptider» eller «aktuelle peptider» som produkter av ekspresjonssystemet ifølge oppfinnelsen, skal denne term også omfatte proteiner, dvs. polypeptider som har en bestemt funksjon og/eller sekundær og/eller tertiær struktur. Dersom det henvises til prosentandel aminosyreidentitet, relaterer slik identitet seg til et fullstendig protein eller til en spesifikk del definert med innledende og finalt aminosyretall, som bestemt ved konvensjonelt anvendt BLAST-algoritme.

I det fungale ekspresjonssystem beskrevet i WO 00/20555 kan pH i dyrkningsmedium være nøytralt eller alkalisk slik at de produserte proteiner eller polypeptider ikke lenger underlegges aggressiv og potensiell inaktivering ved sur pH. Det er også mulig å dyrke ved sur pH slik som en pH på 4 i tilfeller der proteinet eller polypeptidet er bedre egnet til et surt miljø. Egnet dyrkning kan forekomme ved en pH mellom 4,0 og 10,0. Det eksisterer imidlertid en preferanse for nøytral til alkalisk pH idet vertsstammene oppviser bedre vekst ved slik pH, f.eks. mellom 6 og 9. Vekst ved alkalisk pH som kan være fra pH=8 og oppover, og som også kan være så høy som 10, er også et godt alternativ i noen tilfeller. Videre er dyrkningstempe-raturen for noen vertsstammer fordelaktig for å sta-bilisere noen typer produsert polypeptid. Dyrkningstempe-raturen er hensiktsmessig ved en temperatur av'23-43°C. Spesielt er slike betingelser av viktighet for produksjon av mammalske polypeptider. Den valgte temperatur vil av-henge av kostnadseffektivitet av dyrkningen, og sensiti-viteten til polypeptidet eller den kultiverte stamme.

Det er også blitt antatt at forholdet biomasse til viskositet og mengde protein produsert er i stort favør av Chrysosporium- verten. Sammenligninger er blitt utført med Trichoderma longibrachiatum (tidligere kjent som Trichoderma reesei) og med Aspergillus niger. Trichoderma longibrachiatum ga 2,5-5 g/l biomasse, Aspergillus niger ga 5-10 g/l biomasse og Chrysosporium-verten ga 0,5-1 g/l biomasse under deres respektive optimerte betingelser. Dette gir således mulighet til en 5-10 gangers forbedring i forhold til kommersielt brukte stammer. Den foreliggende oppfinnelse er rettet mot ekspresjonssystemer som omfatter en nukleinsyresekvens som koder for et heterologt protein eller polypeptid, hvor nukleinsyresekvensen er operativt koblet til en ekspresjonsregulerende region beskrevet nedenfor, og valgfritt en sekresjonssignals-kodende sekvens og/eller en bærerprotein-kodende sekvens. Fortrinnsvis vil en rekombinant stamme i samsvar med foreliggende oppfinnelser utskille det aktuelle polypeptid. Dette vil unngå nødvendigheten av å ødelegge cellen for å isolere polypeptidet, og også minimere risikoen for nedbryting av det uttrykte produkt av andre komponenter i verts-cellen. ■

Chrysosporium kan defineres som morfologisk konsistent med det som er beskrevet i Barnett og Hunter, 1972, Illustrated Genera of Imperfect Fungi, 3rd Edition of Burgess Publishing Company. Andre kilder som gir detaljer vedrørende klassifisering av sopp av genus Chrysosporium er kjent f.eks. Sutton Classification (Van Oorschot, C.A.N. (1980) «A revision of Chrysosporium and allied genera» in Studies in Mycology No. 20 of the CBS in Baarn, The Netherlands pl-36). CBS er ett av deponeringsinsti-tuttene i Budapest-Traktaten.

I samsvar med denne lære faller genus Chrysosporium innen familien Moniliaceae som tilhører ordenen Hyphomycetaler. De følgende stammer defineres som Chrysosporium, men definisjonen av Chrysosporium er ikke begrenset til disse stammer: C. botryoides, C. carmichaelii, C. crassitunicatum, C. europae, C. evolceannui, C. farinicola, C. fastidium, Cf ili f orme, C. georgiae, C. globiferum, C. globiferum var. articulatum, C. globiferum var. niveum., C. hirundo, C. hispanicum, C. holmii, C. indicum, C. inops,

C. keratinophilum, C. kreiselii, C. kuzurovianum, C. lignorum, C. lobatum, C. lucknowense, C. lucknowense Garg 27K, C. medium, C. medium var, spissescens, C. mephiticum, C. merdarium, C. merdarium var.roseura, C. minor, C. pannicola, C. parvum, C. parvum var, crescens, C. pilosum, C. pseudomer-darium, C. pyriformis, C. queenslandicum, C. sigleri, C. sulfureum, C. synchronum, C. tropicum, C. undulatum,

C. vallenarense, C. vespertilium, C. zonatum.

C. lucknowense danner én av artene av Chrysosporium som har ført til spesiell interesse og som har tilveiebrakt en naturlig produsent av cellulaseproteiner (WO 98/15633) og beslektet US Patent Nr 5.811.381). Karakteristiska for denne Chrysosporium lucknowense er: Koloniene blir 55 mm i diameter på Sabouraud glukose agar i løpet av 14 dager, er kremfargede, feltformig og dunaktig; tette og 3-5 mm høye, marger er definert, regelmessige og fimbriate, revers svakt gul til kremfarget. Hyphae er hyalin, glatt- og tynnvegget, litt forgrenet. Luft hyphae er mest fertil og nær septat,

ca. 1-3,5 um brede. Neddykket hyphae er infertile, ca. 1,4,5 um brede, med den tynnere hyphae fordreid. Conidia er terminal og lateral, for det meste sessil på korte, frekvente konikale fremspring eller korte sidegrener. Conidia er alenestående, men i nærhet til hverandre, 1-4

conidia utvikles på en hyphalcelle, subhyaline, ganske tynn- og glattveggget, for det meste subgolobose, også klavat orobovoid, 1-cellede, 2,5-11 x 1,5-6 um, med brede basale arr (1-2 |xm) . Intercalarieconidia er fraværende. Ahlamydosprer er fraværende. ATCC 44006, CBS 251.72, CBS 143.77 og CBS 272.77 er eksempler på Chrysosporium lucknowense-stammer, og andre eksempler er gitt i W098/15633 (US 5.811.381).

En ytterligere stamme ble isolert fra denne species med en enda høyere produksjonskapasitet for cellulaser. Denne stamme benevnes Cl med dens interne notasjon og ble deponert ved The International Depository of the All Russian Collection of micro-organisms of the Russian Academy of Sciences Bakrushina Street 8, Moscow, Russia 113184 on August 29, 1996, som en deponering i samsvar med Budapest-Traktaten og ble tilordnet katalognummer VKM F-3500D. Denne benevnes Chrysosporium luckowense Garg 27K. Karakteristika for Cl-stammen er som følger: Kolonier som hadde fått vokse 55-66 diameter i størrelse på potetdekstroseagar i ca. 7 dager, er hvitkremet av farge, feltformige, 2-3 um høye ved senter, klarer avgrensninger, regelmessige, fimbrate, revers bleke, kremfarget. Hyphae er hyalin, glatt- og tynnvegget, litt forgrenet. Aerialle hyphae er fertil, septat, 2-3um brede. Neddykkete hyphae er infertile. Conidi er terminale og laterale, sessile eller på kortsidetorgreninger; fraværende; enkeltstårende, men i nærhet til hverandre, hyalin, tynn- og glattvegget, subglobose, klavat eller obovoid, 1-cellede, 4-10 (im. Chlamydosporer er fraværende. Intercalarier conidia er fraværende.

Fremgangsmåten for isolering av Cl-stammen er beskrevet i WO 98/15633, US Patent Nr 5.811.381 og US Patent Nr 6.015.707. Også inkludert innen definisjonen av Chrysosporium er stammer avledet fra Chrysosporium predecessorer inkluderende de som er mutert noe, enten naturlig eller ved indusert mutagenese. Mutanter av Chrysosporium kan oppnås ved indusert mutagenese, spesielt ved en kombinasjon av bestråling og kjemisk mutagenese.

F.eks. ble stamme Cl mutagenisert ved å underlegge den til ultrafiolett lys for å generere stamme UV13-6. Denne stamme var videre mutert med N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin for å generere stamme NG7C-19. Den siste stamme ble deretter underlagt mutering ved ultrafiolett lys som resulterte i stamme UV18-25. Under denne mute-ringsprosess varierte de morfologiske karakteristika noe i kultur i væske eller på plater, og likeledes under mikro-skopet. Med hver suksessive mutagenese viste kulturene noe mindre matte- og dunutseende på plater enn det som er beskrevet som karakteristisk for Chrysosporium, inntil koloniene oppnådde en flat og matt tilsynekomst. Et brunt pigment observert med villtype-stammen i noe media var også mindre fremtredende i mutante stammer. I væskekulturen var mutanten UV18-25 mindre viskøs enn villtype-stammen Cl, og mutantene UV13-6 og NG7C-19. Idet stammene opprettholdt de vesentligste mikroskopiske karakteristika for Chrysosporium, ble mycelia smalere med hver suksessive mutering, og med UV18-25 kunne distinkt fragmentering av mycelia observeres. Denne myceliafragmentering forårsakes sannsynligvis av lavere viskositet assosiert med kulturer av UV18-25. Evnen av stammene til å sporulere ble redusert md hvert mutageniske trinn. Det ovenfor illustrerer at for at en stamme skal tilhøre genus Chrysosporium er det noe ... fra den ovenfor morfologiske definisjon. Ved hvert muta-sjonstrinn økte produksjon av cellulase og ekstracellulære proteiner, mens flere mutasjoner resulterte i nedgang i proteaseuttrykking. Kriterier hvormed fungalt taksonom kan bestemmes, er tilgjengelig fra CBS, VKMF og ATCC, f.eks. Stammene ble internt merket som Chrysosporiu/n-stamme Cl, stamme UV13-6, stamme NG7C-19 og stamme UV18-25 og er blitt deponert i samsvar med Budapest-Traktaten ved The All Russian Collection (VKM) depository institute in Moscow. Villtype-Cl-stamme ble deponert med nummer VKM F-3500 D, deponeringsdato 29. august 1996, Cl UV13-6 mutant ble deponert ved VKM F-3632 D (2. september 1998), Cl NG7C-19 mutant ble deponert som VKM F-3633 D (2. september 1998) og Cl UV18-25 mutant ble deponert som VKM F-3631 D (2. september 1998).

Det er foretrukket å anvende ikke-toksiske Chrysosporium-stammer, og av disse er et antall kjente innen fagfeltet og dette vil redusere risikoen for miljøet ved storskalaproduksjon og forenkle produksjonsprosedyrer med påfølgende reduksjon i kostnader.

En ekspresjonsregulerende region er en DNA-sekvens gjenkjent av verten Chrysosporium-stamme for ekspresjon. Den omfatter en promotorsekvens operativt koblet til en nukleinsyresekvens som koder for polypeptidet som skal uttrykkes. Promotoren er koblet slik at posisjonen vis a vis startkolon til sekvensen som skal uttrykkes muliggjør ekspresjon. Promotorsekvensen kan være konstitutiv eller induserbar. Enhver ekspresjonsregulerende sekvens eller kombinasjon derav i stand til å muliggjøre ekspresjon av et polypeptid fra en Chrysosporium-stamme medtas. Den eks-pres jonsregulerende sekvens er hensiktsmessig en fungal-ekspresjonsregulerende region, f.eks. en ascomycete-regulerende region. Det er foretrukket at den fungale eks-pres j onsregulerende region er en regulerende region fra én av de følgende genera av fungi: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Hansenula, Mucor, Pichia, Neurospora, Tolypocladium, Rhizomucor, Fusarium, Penicillin, Saccharomyces, Talaromyces eller alternative seksuelle former derav så som Emericella, Hypocrea, f.eks. cellobiohydro- lasepromotoren fra Trichoderma, glukoamylasepromotoren fra Aspergillus, glyceraldehydfosfat-dehydrogenasepromotor fra Aspergillus, alkohol-dehydrogenase A og alkohol-dehydrogenase R promotor til Aspergillus, TAKA-amylasepromotor fra Aspergillus, fosfoglycerat- og kryss-reaksjonsvei-kontrollpromotere fra Neurospora, aspartisk proteinase-promotor av Rhizomucor miehei, lipasepromotor av Rhizomucor miehei og beta-galaktosidasepromotor av Penicillium canescens. En ekspresjonsregulerende sekvens fra den samme genus som vertsstammen er ekstremt egnet, idet denne mest sannsynlig er spesifikt tilpasset til den spesifikke vert. Således er det foretrukket at den ekspresjonsregulerende sekvens er fra en Chrysosporium-stamme.

Fortrinnsvis benyttes en ekspresjonsregulerende region som muliggjør høy ekspresjon i den selekterte vert. Dette er fortrinnsvis en ekspresjonsregulerende region avledet fra Chrysosporium i samsvar med oppfinnelsen. Det kan også være en høyekspresjonsregulerende region avledet fra en heterolog vert, slik det er kjent innen fagfeltet. Spesifikke eksempler på proteiner kjent som kan uttrykkes i store mengder og som således tilveiebringer egnede eks-pres j onsregulerende sekvenser for oppfinnelsen er, uten å være begrenset dertil, hydrofobin, protease, amylase, xylanase, pektinase, esterase, beta-galaktosidase, cellulase (f.eks. endo-glukanase, cellobiohydrolase) og polygalakturonase. Den høye produksjon er blitt undersøkt både i fast fase og neddykkede fermenteringsbetingelser. Analyser for å undersøke nærvær eller produksjon av slike proteiner er kjente innen fagfeltet. Katalogene til Sigma og Megazym f.eks., gir et antall eksempler. Megazym er lokalisert ved Bray Business Park, Bray, County Wicklow i Irland. Sigma Aldrich har mange virksomheter verden over, f.eks. USA P.O. Box 14508 St. Louis Missouri. For cellulase refererer vi til kommersielt tilgjengelige analyser så som CMCase-analysen, endoviskometrisk analyse, Avice- lase-analyser, beta-glukanase-analyser, RBBCMCase-analyser, Cellazym-C-analyser. Xylanase-analyser er kommersielt tilgjengelig (f.eks. DNS og Megazym). Alternativer er godt kjente for en person innen fagfeltet og kan finnes fra generell litteratur som omhandler subjek-tet, og slik informasjon vurderes inkorporert heri med henvisning. F.eks. refererer vi til «Methods in Enzymology», vol 1, 1955 right through to volumes 297-299 of 1998. Foretrukket benyttes en Chrysospori ujn-promotorsekvens for å sikre god gjenkjenning derav av verten.

Vi har funnet at heterologe ekspresjonsregulerende sekvenser arbeider like effektivt i Chrysosporium som native Chrysosposium-sekvenser. Dette muliggjør at godt kjente konstrukter og vektorer kan anvendes ved transformasjon av Chrysosporium, og tilbyr likeledes andre mulig-heter for å konstruere vektorer som muliggjør gode eks-pres jonsrater i denne nye ekspresjons- og sekresjonsvert. F.eks. kan standard Aspergillus-transformasjonsteknikker anvendes som beskrevet for eksemplet til Christiansen et. al. in Bio./Technol., (1998), vol 6, pp 1419-1422. Andre dokumenter som detaljer på Aspergillus-transformasjonsvektorer, f.eks. US Patenter 4.816.405. 5,198.345, 5.503.991, 5.364.770 og 5.578.463, EP-B-215.594 (også for Trichoderma) og deres innhold inkorporeres heri med referanse. En ekstremt høy ekspresjonsrate for cellulase er blitt funnet for Chrysosporium-stammer, og ekspresjonsregulerende regioner for slike proteiner er spesielt foretrukket. Vi refererer til spesifikke eksempler for de tidligere nevnte deponerte Chrysosporium-stammer.

Et nukleinsyrekonstrukt som omfatter en nukleinsyreeks-presjonsregulerende region for Chrysosporium, fortrinnsvis fra Chrysosporium lucknowense, eller et derivat derav danner en foretrukket utførelse av oppfinnelsen, og likeledes den mutante Chrysosporium-stamme som omfatter slikt operativt koblet til et gen som koder for et polypeptid som skal uttrykkes. Et slikt nukleinsyrekonstrukt vil være en ekspresjonsregulerende region fra Chrysosporium assosiert med cellulase eller xylanase-ekspresjon, fortrinnsvis cellobiohydrolase-ekspresjon, eller ekspresjon av glyceraldehyd-fosfatdehydrogenase som beskrevet detaljert nedenfor. Nukleinsyresekvensen i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan hensiktsmessig oppnås fra en Chrysospo-riu/r?-stamme, og en slik stamme defineres et annet sted i beskrivelsen. På hvilken måte promotorsekvensene kan bestemmes er flere, og velkjent innen fagfeltet. Nuklease-deleteringseksperimenter av regionen oppstrøms for ATG-kodon ved starten av det relevante gen vil tilveiebringe slik sekvens. F.eks. kan også analyse av konsensussekven-ser føre til funn av et aktuelt gen. Ved anvendelse av hybridiserings- og amplifiseringsteknikker kan en fagkyndig enkelt fremkomme til de korresponderende promotorsekvenser.

Promotorsekvensene til Cl-endoglukanaser ble identifisert på denne måte, ved kloning av de korresponderende gener. Foretrukne promotorer i samsvar med oppfinnelsen er 55 kDa cellobiohydrolase (CBH1)-promotor, 30 kDa xylanase (Xyll)-promotorer, og glyceraldehyd-fosfatdehydrogenasepromotor, idet enzymene uttrykkes ved høye nivåer av deres egne promotorer. De korresponderende promotorsekvenser er identifisert på enkel måte med kloning som beskrevet ved WO 00/20555, ved anvendelse av sekvensinformasjon i SEKV. ID. NR. 1 (for CBH1) og SEKV. ID. NR. 3 (for Xyll), respektivt. Promotorene for de karbohydrat-nedbrytende enzymer av Chrysosporium, spesielt Cl-promotorer, kan med fordel anvendes for å uttrykke ønskede polypeptider i en vertsorganisme, spesielt en fungal eller annen mikrobiell vertsorganisme. Promotorsekvenser som har minst 65%, fortrinnsvis minst 70%, mest fortrinnsvis minst 75% nukleo-tidsekvensidentitet med sekvensen gitt i SEKV. ID. NR. 1, 3 og 5, eller med sekvensene funnet for andre Chryso-sporiumqener, er en del av foreliggende oppfinnelse.

For bestemte utførelser av den rekombinante stamme og nukleinsyresekvensene i samsvar med oppfinnelsen refereres det også til eksemplene. Vi refererer for de rekombinante stammer til teknikkens stilling som beskriver høyekspre-sjons-promotorsekvenser og spesielt de som tilveiebringer høy ekspresjon i fungi f.eks. så som beskrevet for Aspergillus og Trichoderma. Innen teknikkens stilling beskrives et antall ekspresjonsregulerende regioner for anvendelse i Aspergillus, f.eks. US Patent Nr 5.252.726 til Novo og US Patent Nr 5.705.358 til Unilever. Innholdet til disse pub-likasjoner inkorporeres heri ved henvisning.

Hydrofobingenet er et fungalt gen som er sterkt uttrykt. Det antydes således at promotorsekvensen til et hydrofobingen, fortrinnsvis fra Chrysosporium, kan være egnet for å applisere som en ekspresjonsregulerende sekvens i en egnet utførelse av oppfinnelsen. Trichoderma reesei og Trichoderma harzianum- qensekvensene for hydrofobin er blitt beskrevet f.eks. innen teknikkens stilling, og likeledes en gensekvens for Aspergillus fumigatus og Aspergillus nidulans og den relevante sekvensinformasjon inkorporeres heri med referanse (Munoz et al., Curr. Genet., 1997, vol 32(2), pp 225-230, T. Netala-Setala et al., Eur. J. Biochem, 1996, vol 15, p 235 (1-2), pp 248-255, M. Parta et al., Infect. Immun., 1994, vol 62(10), pp 4389-4395 and M.A. Stringer, et al., Mol. Microbiol., 1995, vol 16(1, pp 33-44). Ved anvendelse av denne sek-vensinf ormas j on kan en person innen fagfeltet oppnå de ekspresjonsregulerende sekvenser til Chrysosporium-hydrofobin-genene uten utilbørlig eksperimentering ved å følge standardteknikker som allerede foreslått ovenfor. En rekombinant Chrysosporium- stamme i samsvar med oppfinnelsen kan omfatte en hydrofobin-regulerende region operativt koblet til sekvensen som koder for det aktuelle polypeptid.

En ekspresjonsregulerende sekvens skal også i tillegg omfatte en enhancer eller silencer. Disse er også kjent innen teknikkens stilling og lokaliseres vanligvis i en viss avstand fra promotoren. De ekspresjonsregulerende sekvenser kan også omfatte promotorer med aktivator-bindingsseter og repressorbindingsseter. I noen tilfeller kan slike seter også modifiseres for å eliminere denne type regulering. Filamentøse fungale promotorer hvor creA-setene foreligger er blitt beskrevet. Slike creA-seter kan muteres for å sikre at glukoserepresjon normalt resulterende fra nærvær av ikke-muterte seter elimineres. Gist-Brocades' WO 94/13820 illustrerer dette prinsipp. Anvendelse av en slik promotor muliggjør produksjon av polypeptidet som kodes for av nukleinsyresekvensen regulert av promotoren i nærvær av glukose. Det samme prinsipp frem-kommer også av WO 97/09438. Disse promotorer kan enten anvendes med eller uten deres creA-seter. Mutanter hvor creA-setene er blitt mutert kan anvendes som ekspresjonsregulerende sekvenser i en rekombinant stamme i samsvar med oppfinnelsen og nukleinsyresekvensen den regulerer, kan deretter uttrykkes i nærvær av glukose. Slike Chrysosporium-promotorer sikrer derepresjon på tilsvarende måte som illustrert i WO 97/09438. Identiteten av creA-seter er kjent fra teknikkens stilling. Alternativt er det mulig å anvende en promotor med creA-bindingsseter som ikke er blitt mutert i en vertsstamme med en mutasjon et annet sted i represjonssystemet, f.eks. i creA-genet selv, slik at stammen kan, uavhengig av nærvær av creA-bindingsseter, produserer proteinet eller polypeptidet i nærvær av glukose .

Terminatorsekvenser er også ekspresjonsregulerende sekvenser og disse er operativt koblet til 3'-terminus av sekvensen som skal uttrykkes. Enhver fungal terminator er sannsynlig å være funksjonell i verten Chrysospori u/n-stamme i samsvar med oppfinnelsen. Eksempler er A. nidulans trpC terminator (1), A. niger alfa-glukosidase-terminator (2), A. niger glukoamylase-terminator (3), Mucor miehei karboksylprotease-terminator (US Patent Nr 5.578.463) og Trichoderma reesei cellobiohydrolase-terminator. Naturlige Chrysosporium-terminatorsekvenser vil fungere i Chrysosporium og er hensiktsmessig, f.eks. CBHl-terminator.

En egnet rekombinat Chrysosporium-stamme som kan anvendes i samsvar med foreliggende oppfinnelse har nukleinsyresekvensen som skal uttrykkes operativt koblet til en sekvens som koder for aminosyresekvensen definert som signalsekvens. En signalsekvens er en aminosyresekvens som idet den er operativt koblet til aminosyresekvensen til det uttrykte polypeptid muliggjør sekresjon av dette fra fungusverten. En slik signalsekvens kan være én som normalt er assosiert med det heterologe polypeptid eller kan være én som er nativ for verten. Det kan også være fremmed både for vert og polypeptidet. Nukleinsyresekvensen som koder for signalsekvensen må posisjoneres i ramme for å muliggjøre translasjon av signalsekvensen og det heterologe polypeptid. Enhver signalsekvens som er i stand til å muliggjøre en sekresjon av et polypeptid fra en Chrysospori um-stamme er forutsatt. En slik signalsekvens er hensiktsmessig en fungal-signalsekvens, fortrinnsvis en ascomycete-signalsekvens.

Egnede eksempler på signalsekvenser kan være avledet fra gjær generelt, eller enhver av de følgende spesifikke genera av fungi: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Pichia, Neurospora, Rhizmucor, Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces eller alternative kjønnsformer derav så som Emericella, Hypocrea. Signalsekvensene som er spesielt nyttige er ofte nativt assosiert med de følgende proteiner en cellobiohydrolase, en endoglukanase, en beta-galaktosidase, en xylanase, en pektinase, en esterase, et hydrofobin, en protease eller en amylase. Eksempler inkluderer amylase eller glukoamylase av Aspergillus eller Humicola (4), TAKA-amylase av Aspergillus oryzae, alfa-amylase avAspergillus niger, karboksylpeptidase av Mucor (US Patent Nr 5.5.78.463), en lipase eller proteinase fra Rhizomucur miehei, cellobiohydrolase av Trichoderma (5), betagalakto-sidase av Penicillium canescens og alfa-paringsfaktor til Saccharomyces.

Alternativt kan signalsekvensen være fra en amylase eller subtilisingen av en stamme av Bacillus. En signalsekvens fra det samme genus som vertsstammen er ekstremt hensiktsmessig idet det er mest sannsynlig å være spesifikt tilpasset til den spesifikke vert, og således er en foretrukket signalsekvens en signalsekvens av Chrysosporium, spesielt av Chrysosporium-stamme Cl, stamme UV13-6, stamme NG7C-19 og stamme UV18-25, angitt ovenfor. Signalsekvenser fra filamentøse fungi, gjær og bakterier er nyttige. Signalsekvenser av ikke-fungal opprinnelse kan også vurderes som nyttige, spesielt fra bakterier, planter og pattedyr.

En rekombinant vert som kan anvendes i samsvar med enhver av utførelsene ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte en selekterbar markør. En slik selekterbar markør vil muliggjøre enkelt-seleksjon av transformerte eller transfekterte celler. En selekterbar markør koder ofte for et genprodukt som gir en spesifikk type resistens som er fremmed for den ikke-transformerte stamme. Dette kan være resistens mot tungmetaller, antibioltika og biocider generelt. Prototrofi er også en nyttig selekterbar markør av ikke-antibiotisk variasjon. Ikke anti-biotiske selekterbare markører kan være foretrukket der hvor proteinet eller polypeptidet skal anvendes i nærings-middelindustri eller som farmasøytika der man får hurtigere og mindre komplisert godkjennelse av et slikt produkt. Svært ofte anvendes GRAS-indikering for slike markører. Et antall av slike markører er tilgjengelig for fagkyndige. FDA tilveiebringer f.eks. en liste over slike. Mest vanlig anvendt er selekterbare markører valgt fra gruppen som gir resistens til et medikament eller som gir en ernæringsdefekt, f.eks. gruppen som omfatter amdS (acetamidase), hph (hygromycinfosfotransferanse), pyrG (orotidin-5'-fosfat dekarboksylase), trpC (antranilat-syntase), argB (ornitin-karbamoyltransferase), glufosinat-resistens, niaD (nitrat-reduktase), et bleomycin-resistent gen, mer spesifikt Sh Ble, sulfonylurea-resistent, f.eks. acetolaktat-syntase-mutasjon ilvl. Seleksjoner kan også utføres ved hjelp av kotransformering hvor seleksjons-markøren er på en separat vektor eller hvor seleksjons-markøren er på det samme nukleinsyrefragment som den polypeptid-kodende sekvens for det aktuelle polypeptid.

Som anvendt heri angir termen heterologt polypeptid et protein eller polypeptid som ikke normalt uttrykkes og sekreres av Chrysosporium-vertsstammen som anvendes for ekspresjon i samsvar med foreliggende oppfinnelse. Polypeptidet kan være av plante eller animalsk (vertebral-eller invertibral) oppfinnelse f.eks. mammalsk, fisk, insekt, eller mikroorganisme, med den forutsetning at det ikke forekommer i vertsstammen. Et pattedyr kan inkludere et menneske. En mikroorganisme omfatter virus, bakterie, archae-bakterie og fungi, dvs. filamentøse fungi og gjær. Bergey's Manual for Bacterial Determinology opplister ade-kvate bakterier og archae-bakterier. For farmasøytiske formål vil det ofte være en preferanse for humane proteiner slik at en rekombinant vert i samsvar med foreliggende oppfinnelse danner i en foretrukket utførelse en vert hvor polypeptidet er av human opprinnelse. For formål så som produksjon av næringsmidler vil egnet heterologt polypeptid være animalsk, plante- eller algeopprinnelse. Slike utførelser er derfor også vurdert som egnede eksempler på oppfinnelsen. Alternative utførelser som er nyttige inkluderer et heterologt polypeptid av enhver bakteriell, gjær, viral, archae-bakteriell eller fungal opprinnelse. Fungal opprinnelse er mest foretrukket.

En egnet utførelse av oppfinnelsen vil omfatte en heterolog nukleinsyresekvens ved adaptert kodonbruk. En slik sekvens koder for den native aminosyresekvens av verten hvorfra den er avledet, men har en forskjellig nukleinsyresekvens, dvs. en nukleinsyresekvens hvor visse kodon er blitt erstattet av andre kodon som koder for den samme aminosyre, men som enklere kan benyttes av vertsstammen som anvendes for ekspresjon. Dette kan føre til bedre ekspresjon av den heterologe nukleinsyresekvens. Dette er en vanlig praksis for en fagkyndig. Den adapterte kodonbruk kan utføres på basis av kjent kodonbruk til fungale vis a vis ikke-fungale kodonbruk. Det kan også være mer spesifikt tilpasset kodonbruk for selve Chrysosporium. Likhetene med en slik kodonbruk som observert i Trichoderma, Humicola og Aspergillus bør muliggjøre ut-bytting av sekvenser for slike organismer uten adapsjon av kodonbruk. Detaljer er tilgjengelig for fagkyndige ved-rørende kodonbruk av disse fungi, og inkorporeres heri med referanse.

Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til de ovenfor angitte rekombinante Chrysosporium-stammer, men dekker også en rekombinant Chrysosposium-stamme som om-fatter en nukleinsyresekvens som koder for et homologt protein for en Chrysosporium-stamme, hvor nukleinsyresekvensen er operativt koblet til en ekspresjonsregulerende region og hvor nevnte rekombinante stamme uttrykker mer av nevnte protein enn den korresponderende ikke-rekombinante stamme under de samme betingelser. I tilfellet homologt polypeptid av interesse, er dette fortrinnsvis et nøytralt eller alkalisk enzym så som hydrolase, en protease eller et karbohydratnedbrytende enzym som allerede beskrevet annet sted. Polypeptidet kan også være surt. Fortrinnsvis vil den rekombinante stamme uttrykke polypeptidet i større mengder enn den ikke-rekombinante stamme. Alle kommentarer angitt vis a vis det heterologe polypeptid er også gyldige (mutatis mutandis) for den homologe polypeptid-cellulase.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også genetisk konstruerte mikrobiologiske stammer hvor sekvensen som introduseres kan være av Chrysosporium-opprinnelse. En slik stamme kan, imidlertid, skilles fra nativt forekommende stammer ved hjelp av f.eks. heterologe sekvenser som foreligger i nukleinsyresekvensen anvendt for å transformere eller transfektere Chrysosporium, ved hjelp av det faktum av multiple kopier av sekvensen som koder for det aktuelle polypeptid foreligger, eller ved hjelp av det faktum at disse uttrykkes i en mengde som overstiger det til den ikke-konstruerte stamme under identiske betingelser, eller ved hjelp av det faktum at ekspresjonen forekommer under normalt ikke-uttrykkende betingelser. Det siste kan være tilfellet dersom en induserbar promotor regulerer sekvensen av interesse i motsetning til den ikke-rekombinante situasjon, eller dersom en annen faktor induserer ekspresjonen enn det som er tilfellet i den ikke-konstruerte stamme. Foreliggende oppfinnelse vedrører stammer avledet gjennom engineering enten ved anvendelse av klassiske genetiske teknologier, eller genetiske engineering smetodo logier .

Ekspresjonssystemene og vertsstammene som inneholder disse i samsvar med oppfinnelsen kan omfatte en nukleinsyresekvens som koder for et heterologt protein valgt fra karbohydrat-nedbrytende enzymer (cellulaser, xylanaser, mannanaser, mannosidaser, pektinaser, amylaser, f.eks. glukoamylaser, a-amylaser, a- og p-galaktosidaser, a- og P-glukosidaser, p-glukanaser, chitinaser, chitanaser), proteaser (endoproteaser, amino-proteaser, amino- og karboksypeptidaser, keratinaser), andre hydrolaser (lipaser, esteraser, fytaser), oksidoreduktaser (katalaser, glukoseoksidaser) og transferanser (transglykozylaser, transglutaminaser, isomeraser og invertaser).

De mest interessante produkter som kan produseres i samsvar med foreliggende oppfinnelse er cellulaser, xylanaser, pektinaser, lipaser og proteaser, hvor cellulaser og xylanaser spalter beta-1,4-bindinger, og cellulaser om-fatter endoglukanaser, cellobiohydrolaser og beta-glukosidaser. Disse proteiner er ekstremt nyttige i forskjellige industrielle prosesser kjent innen fagfeltet. Spesielt for cellulaser refereres det til f.eks. WO 98/15633 som beskriver cellobiohydrolaser og endoglukanaser. Inn-holdene i disse søknader inkorporeres heri med referanse.

En rekombinant i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan ha en nukleinsyresekvens som koder for det aktuelle polypeptid som koder for et polypeptid som inaktiveres eller er ustabilt ved sur pH, dvs. pH under 6, eller under pH 5,5, eller under pH 5, og også så lav som eller lavere enn pH=4. Dette er en spesielt interessant utførelse, idet de generelt beskrevne fungale ekspresjonssystemer ikke dyrkes under betingelser som er nøytrale til alkaliske, men dyrkes ved sur pH. Således tilveiebringer systemet i samsvar med foreliggende oppfinnelse et sikkert fungalt ekspresjonssystem for proteiner eller polypeptider som er utsatt for å bli inaktivert eller er ustabilt ved sur pH.

Spesielt vurderes en rekombinant stamme som definert i én av utførelsene i samsvar med oppfinnelsen, hvor nukleinsyresekvensen koder for det aktuelle polypeptid som koder for et protein eller polypeptid som oppviser optimal aktivitet og/eller stabilitet ved en pH over 5, fortrinnsvis ved nøytral eller alkalisk pH (dvs. over 7) og/eller ved en pH høyere enn 6, som en foretrukket utførelse av oppfinnelsen. Mer enn 50%, mer enn 70% eller også mer enn 90% av optimale aktiviteter av slike pH-verdier antas å være spesielt nyttige utførelser. Et polypeptid uttrykt under dyrkningsbetingelsene trenger ikke nødvendigvis å være aktivt ved dyrkningsbetingelser, faktisk kan det være fordelaktig at de dyrkes under betingelser hvor det er in-aktivt idet dets aktive form kan være skadelig for verten. Det som imidlertid er nødvendig er at proteinet eller polypeptidet er stabilt under dyrkningsbetingelsene. Sta-biliteten kan være termisk stabilitet. Det kan også være stabilitet mot spesifikke materialer eller kjemikalier, slike som f.eks. foreligger i sammensetninger eller prosesser for produksjon eller applisering av polypeptidet eller proteinet av interesse. LAS er detergentmaterialer som omfatter cellulaser eller lipaser, etc, er et eksempel på et kjemikalium som ofte er skadelig for proteiner. Tidsperiodene for bruk i applikasjoner kan variere fra kort til lang eksponering slik at stabilitet kan være over en varierende lengde. Det kan anvendes et antall kommersielt tilgjengelig analyser for å bestemme de optimale aktiviteter for de forskjellige enzymatiske produkter. F.eks. viser katalogene til Sigma og Megazym slike. Spesifikke eksempler på tester er angitt annet sted i beskrivelsen. Leverandørene tilveiebringer retningslinje for bruken.

En Chrysosporium-stamme kan hensiktsmessig anvendes for å transformere eller transfektere med den aktuelle sekvens som skal uttrykkes og en slik stamme oppviser en relativt lav biomasse. Vi har funnet at Chrysosporiumstammer har en biomasse 2 til 5 ganger lavere enn for Trichoderma reesei idet de dyrkes til en viskositet av 200 til 600 cP ved slutten av fermenteringen og oppviser en biomasse på 10 til 20 ganger lavere enn for Aspergillus niger idet de dyrkes til en viskositet på 1500-2000 cP under tilsvarende betingelser, dvs. deres respektive optimale dyrkningsbetingelser kan tilveiebringe et høyere nivå av ekspresjon. Ekspresjonsnivået overstiger klart det for de to kommersielle referansestammene ved en langt lavere biomasse og ved langt lavere viskositet. Dette betyr at ekspresjonsnivået for slike Crysosporium-stammer vil være betydelig høyere enn for Aspergillus niger og Trichoderma reesei. En slik transformert eller transfektert Chrysosporiuin-stamme danner en egnet utførelse ifølge oppfinnelsen.

Vi finner en biomasse på 0,5-1,0 g/l for Chrysosporium-stamme Cl(18-25) i motsetning til 2,5-5,0 g/l for Trichoderma reesei og 5-10 g/l, for Aspergillus niger under de ovenfor beskrevne betingelser. I eksemplene tilveiebringes detaljer for denne prosess.

I en egnet utførelse produserer en rekombinant Chrysospori um-stamme protein eller polypeptid i minst en mengde tilsvarende til produksjonen i mol pr. liter av cellulase ved stammen UV13-6 eller C-19, og mer fortrinnsvis minst ekvivalent til, eller høyere enn for stammen UV18-25 under de korresponderende eller identiske betingelser, dvs. deres respektive optimale dyrkningsbetingelser.

Vi har også funnet at ekspresjon og sekresjonsrater er ekstremt høye ved anvendelse av en Chrysosporium-stamme som oppviser mycelia-morfologi til stamme 18-25, dvs. fragmentert kort mycelia. Således vil en rekombinant stamme i samsvar med oppfinnelsen fortrinnsvis oppvise slik morfologi. Oppfinnelsen dekker imidlertid også ikke-rekombinante stammer eller på annen måte konstruerte stammer av Chrysosporium som oppviser disse nye og oppfinne riske karakteristika. Også dekket av oppfinnelsen er en rekombinant Chrysosporium-stamme i enhver av utførelsene beskrevet i samsvar med oppfinnelsen som videre oppviser redusert sporulering sammenlignet med Cl, fortrinnsvis under det for stamme UV13-6, fortrinnsvis under det for stamme NG7C-19, fortrinnsvis under det for stamme UV18-25 under ekvivalente fermenteringsbetingelser. Også dekket av oppfinnelsen er en rekombinant stamme i enhver av ut-førelsene beskrevet i samsvar med oppfinnelsen som videre oppviser den mengde av forholdet proteinproduksjon til biomasse sammenlignet med Cl, fortrinnsvis sammenlignet til enhver av stammene UV13-6, NG7C-19 og UV18-25 under ekvivalente fermenteringsbetingelser. Oppfinnelsen dekker imidlertid også ikke-rekombinante stammer eller stammer som på annen måte er konstruert fra Chrysosporium som oppviser disse nye og oppfinneriske karakteristika eller i kombinasjon med enhver av de andre utførelser.

En annen attraktiv utførelse av oppfinnelsen dekker også en rekombinant Chrysosporium-stamme som oppviser en viskositet under det for stamme NG7C-19, fortrinnsvis under det for stamme UV18-25 under korresponderende eller identiske fermenteringsbetingelser. Oppfinnelsen dekker imidlertid også ikke-rekombinante stammer eller stammer som på annen måte er konstruert fra Chrysosporium som oppviser disse nye og oppfinneriske karakteristika, eller i kombinasjon med enhver av de andre utførelser. Vi har bestemt at viskositeten av en kultur av UV18-25 er under 10 cP i motsetning til for Trichoderma reesei som er i stør-relsesorden 200-600 cP, hvor den for Aspergillus niger er i størrelsesorden 1500-2000 cP under deres respektive optimale dyrkningsbetingelser ved slutten av fermenteringen. Prosessen anvendt for slik bestemmelse er gitt i eksemplene.

Viskositet kan undersøkes i mange tilfeller ved visuell inspeksjon. Fluiditeten av substansen kan variere i en slik grad at den nærmest kan være faststoff-aktig, sauslignende eller i væskeform. Viskositet kan også enkelt måles ved Brookfield-rotasjonsviskometri, ved anvendelse av kinematiske viskositetsrør, fallende ball-viskometer eller ...-type viskometer. Utbyttene fra en slik lav visko-sitetskultur er høyere enn fra de kommersielt kjente kulturer med høyere viskositet pr. tidsenhet og pr. celle.

Prosesseringen av slike lav-viskositetskulturer i samsvar med oppfinnelsen er fordelaktig spesielt idet kulturene skal skaleres opp. Chrysosporium-stammen med den lave viskositet oppfører seg godt i kulturer så store som opptil 150.000 liter kulturer. Således er enhver kultur-størrelse opptil 150.000 liter en nyttig utførelse av oppfinnelsen. Enhver annen konvensjonell størrelse av fermenteringen kan utføres med stammene i samsvar med oppfinnelsen. Begrunnelsen for dette er at problemene kan oppstå i storskalaproduksjon med formateringen av aggregater som har mycelia som er for tett og/eller er ikke-jevnt for-delt. Således kan media som et resultat ikke effektivt ut-nyttes under dyrkningen, noe som fører til ueffektiv pro-duksjonsprosess, spesielt i storskala-fermenteringer, dvs. over 150.000 liter. Lufting og blanding blir problematisk pga. at oksygen og næringsstoff-utsulting, og dermed redusert konsentrasjon av produktiv biomasse og redusert utbytte av polypeptid under kulturen og/eller kan resultere i lengre fermenteringstider. I tillegg er høy viskositet og høye skjærkrefter ikke ønskelig i kommersielle fermen-teringsprosesser og i dagens kommersielle prosesser er disse de produksjonsbegrensende faktorer. Alle disse nega-tive aspekter kan unngås ved bruk av Chrysosporium-vert i samsvar med oppfinnelsen som oppviser langt bedre karakteristika enn Trichoderma reesei, Aspergillus niger og Aspergillus oryzae som kommersielt anvendes i denne sammenheng, dvs. de oppviser bedre proteinproduksjons-nivåer og viskositetsegenskaper og biomassetall.

En Chrysosporium- stamme i samsvar med én av de ovenfor angitte utførelser ifølge oppfinnelsen, hvor nevnte stamme ytterligere oppviser produksjon av én eller flere av de fungale enzymer valgt fra karbohydrat-nedbrytende enzymer, proteaser, andre hydrolaser, og oksidoreduktase, og transferase angitt ovenfor, vurderes som en spesielt nyttig utførelse av oppfinnelsen. De mest interessante produkter er spesifikt cellulaser, xylanaser, pektinaser, lipaser og proteaser. Også nyttige som utførelse av oppfinnelsen er imidlertid en Chrysosporium-stamme som oppviser produksjon av ett eller flere fungale enzymer som oppviser nøytral eller alkalisk optimal stabilitet og/ eller aktivitet, fortrinnsvis alkalisk optimal stabilitet og/eller aktivitet, hvor enzymene er valgt fra karbohydrat-nedbrytende enzymer, hydrolaser og proteaser, fortrinnsvis hydrolaser og karbohydrat-nedbrytende enzymer. I tilfellet ikke-rekombinant Chrysosporium, er slike enzymer hensiktsmessig andre enn cellulase som beskrevet i WO 98/15633. Enzymer av bestemt interesse er xylanaser, proteaser, esteraser, alfa-galaktosidaser, beta-galaktosidaser, beta-glukanaser og pektinaser. Enzymene er ikke begrenset til det ovenfor angitte. Kommentarene vis a vis stabilitet og aktivitet et annet sted i beskrivelsen er også gyldig her.

Foreliggende oppfinnelse dekker også en fremgangsmåte for å produsere et aktuelt polypeptid, hvor fremgangsmåten omfatter dyrkning av en vertsstamme (f.eks. fungal så som av genera Chrysosporium, Aspergillus, Trichoderma, Hansenula, Mucor, Pichia, Neurospora, Tolypocladium, Rhizomucor, Fusarium, Penicillium, eller bakterielle eller andre mikrobielle organismer) i enhver av utførelsene i samsvar med oppfinnelsen under betingelser som muliggjør ekspresjon og fortrinnsvis sekresjon av polypeptidet, og gjenvinning av det derav produserte aktuelle polypeptid.

Der hvor termene protein eller polypeptid angis, er det ment at varianter og mutanter, f.eks. substitusjon, innskudd eller deleteringsmutaner av naturlig forekommende proteiner er tiltenkt å være inkludert idet disse oppviser aktiviteten til ikke-mutanten. Det samme er gyldig vis a vis de korresponderende nukleinsyresekvenser. Prosesser så som gene-shuffling, protein-engineering og rettet evolu-sjonssete-rettet mutagenese og vilkårlig mutagenese er prosesser hvorved slike polypeptider, varianter eller mutanter kan oppnås. US Patent Nr 5.223.409, US Patent Nr 5.780.279 og US 5.770.356 gir en beskrivelse på rettet evolusjon. Ved anvendelse av denne prosess forekommer et bibliotek av vilkårlig muterte gensekvenser etablert f.eks. ved gen-shuffling via error-prone PCR i enhver celletype. Hvert gen har en sekresjonsregion og en immobi-lisert region festet til denne slik at det resulterende protein utskilles og forblir festet til vertsoverflaten. Det etableres deretter betingelser som nødvendiggjør den biologiske aktivitet av det bestemte polypeptid. Dette forekommer i et antall sykluser som til slutt fører til et finalt gen med ønskede karakteristika. Med andre ord en rettet evolusjonsprosess som gjøres hurtigere. US Patent Nr 5.763.192 beskriver også en prosess for å oppnå DNA, RNA, peptider, polypeptider eller proteiner ved hjelp av syntetisk polynukleotidkoblende stokastisk genererte sekvenser, som introduseres inn i en vert etterfulgt av seleksjon av vertscellen med de korresponderende forut-bestemte karakteristika.

En annen anvendelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er i prosessen «rettet evolusjon», hvor nye proteinkodende DNA-sekvenser genereres, de kodede proteiner uttrykkes i en vertscelle, og hvor de sekvenser som koder for proteiner har en ønsket karakteristikk som muteres og uttrykkes igjen. Prosessen repeteres for et antall sykluser inntil et protein med de ønskede karakteristika oppnås. Gene-shuffling, protein-engineering, error-prone PCR, sete-rettet mutagenese, og kombinatorisk eller vilkårlig mutagenese er eksempler på prosesser hvorigjennom nye DNA-sekvenser som koder for eksogene proteiner kan genereres. US Patenter Nr 5.223.409, 5.780.279 og 5.770.356 gir en beskrivelse av rettet evolusjon. Se også Kuchner and Arnold, Trends in Biotechnology, (1997), vol 15, pp 523-530; Schmidt-Dannert and Arnold, Trends in Biotech., (1999), vol 17, pp 135-136; Arnold and Volkov, Curr. Opin. Chem. Biol., (1999), vol 3, pp 54-59; Zhao et al., Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2nd Ed., (Demain and Davies, eds.) pp 597-604, ASM Press, Washington DC, 1999, Arnold and Wintrode, Encyclopedia of Bioprocess Techology; Fermen-tation, Biocatalysis, and Bioseparation, (Flickinger and Drew, eds.) pp 971-987, John Wiley&Sons, New York, 1999; and Minshull and Stemmer, Curr. Opin. Chem. Biol., vol 3, pp 284-290.

En applikasjon for kombinatorisk mutagenese er beskrevet i Hu et al., Biochemistry, 1998, vol 37, pp 10006-10015. US

Patent Nr 5.763.192 beskriver en prosess for å oppnå nye protein-kodende DNA-sekvenser ved sto-kastisk å generere syntetiske sekvenser, introdusere dem inn i en vert, og selektere verts-celler med de ønskede karakteristika. Metoder for å effektuere artifisiell gen rekombinasjon (DNA-shuffling) inkluderer vilkårlig priming-rekombinasjon (Z. Shao, et al., Nucleic Acids Res., (1998), vol 26, pp 681-683)), staggered-ekstensjonsprosess (H. Zhao et al., Nature Biotech., (1998), vol 16, pp 258-262)) og heterodupleks-rekombinasjon (A. Volkov et al., Nucleic Acids Res., (1999), vol 27, p el8)). Errorprone PCR er en annen løsning (Song and Rhee, Appl. Environ. Microbiol. ,

(2000), vol 66, pp 890-894)).

Det er to bredt praktiserte metoder for å utføre seleksjonstrinnet i en rettet evolusjonsprosess. I den ene metode gjøres proteinaktiviteten som er interessant essen-siell for overlevelse av verts-cellen. Dersom f.eks. den ønskede aktivitet er en cellulase som er aktiv ved pH 8, kan et cellulasegen muteres og introduseres inn i verts-cellene. Transformantene får vokse med cellulose som den eneste karbonkilde, og pH reises gradvis inntil noen få overlevende forblir. Det muterte cellulasegen fra dem som overlever, som antakeligvis koder for en cellulaseaktivi-tet med relativt høy pH, underlegges en andre mutasjons-runde, og prosessen repeteres inntil det oppnås transformanter som vokser på cellulose ved pH=8. Termostabile varianter av enzymene kan likeledes utvikles, ved sykluser av genmutering og høytemperatur-dyrkning av verts-cellene (Liao et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA (1986), vol 83, pp 576-580; Giver et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA

(1998), vol 95, pp 12809-12813.

Et alternativ til den massive parallelle løsning «survival of the fittest» er seriell screening. I denne løsning screenes det for individuelle transformanter ved tradisjonelle metoder, så som observasjon av klare eller fargede soner rundt kolonier som vokser på et indikator-medium, kolorimetriske eller fluorometriske enzymanalyser, immunoanalyser, bindingsanalyser, etc, se f.eks. Joo et al., Nature (1999), vol 399, pp 670-673, hvor et cytokrom P450 monooksygenase som ikke krever NADH er en ko-faktor som ble utviklet ved sykluser av mutasjon og screening; May et al., Nature Biotech., (2000), vol 18, pp 317-320, hvor en hydantoinase av reversert stereoselektivitet ble utviklet på tilsvarende måte; og Miyazaki et al., J. Mol. Biol., (2000), vol 297, pp 1017-1026, hvor en termostabil subtilisin ble utviklet.

Standard klonings- og protein eller polypeptid-isoleringsteknikker kan anvendes for å oppnå den nødven-dige sekvensinformasjon. Deler av kjente sekvenser kan anvendes som prober for å isolere andre homologe i andre generer og stammer. Nukleinsyresekvensen som koder for en bestemt enzymaktivitet kan anvendes for å screene et Chrysosporium-bibliotek f.eks. En fagkyndig vil realisere hvilke hybridiseringsbetingelser som kan benyttes. Konven-sjonelle metoder for nukleinsyrehybridiserings-konstruksjon av bibliotek og kloningsteknikker er beskrevet i Sambrook et al., (Eds) (1989) i «Molecular Cloning, A Laboratory Manual» Cold Spring Harbor, Press Plainview, New York, and Ausubel et al., (Eds) «Current Protocols in Molecular Biology» (1987), John Wiley and Sons, New York. Den relevante informasjon kan også avledes fra senere håndbøker og patenter, og likeledes fra forskjellige kommersielt tilgjengelig kits innen fagfeltet.

I en alternativ utførelse omfatter fremgangsmåten dyrkning av en stamme i samsvar med oppfinnelsen under betingelser som muliggjør ekspresjon og fortrinnsvis sekresjon av proteinet eller polypeptidet eller precursoren derav, og gjenvinning av det deretter produserte polypeptid, og valgfritt underlegge precursoren til ytterligere isolering og rensing for å oppnå det aktuelle polypeptid. En slik metode kan hensiktsmessig omfatte et spaltningstrinn av precursoren til polypeptidet eller den aktuelle precursor. Spaltningstrinnet kan være spalting med en Kex-2-lignende protease, enhver basisk aminosyre paret protease eller Kex-2 f.eks., idet et proteasespaltnings-sete kobler en godt utskilt proteinbærer og det aktuelle polypeptid. En fagkyndig kan enkelt finne Kex-2-lignende protease-sekvenser idet konsensus-sekvens-detaljer for slike er tilgjengelige, og et antall alternativer er allerede blitt beskrevet, f.eks. for furin.

Det er hensiktsmessig i en metode for produksjon av polypeptidet i samsvar med én av utførelsene ifølge oppfinnelsen at dyrkningen foregår ved pH høyere enn 5, fortrinnsvis 5-10, mer fortrinnsvis 6-9. Egnet i en slik metode foregår dyrkningen ved en temperatur på mellom 25-43°C, fortrinnsvis 30-40°. Stammen anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er ganske hensiktsmessig en rekombinant Chrysosporium-stamme eller annen fungal eller ikke-fungal stamme. Fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen kan i et slikt tilfelle ytterligere omfatte trinnet å produsere en rekombinant stamme i samsvar med oppfinnelsen. Seleksjon av hensiktsmessige betingelser vil av-henge av naturen til polypeptidet som skal uttrykkes, og en slik seleksjon ligger innen området av normal aktivitet for en fagkyndig.

Fremgangsmåten for produksjon av en rekombinant stamme i samsvar med oppfinnelsen er også en del av foreliggende oppfinnelse. Fremgangsmåten omfatter stabil introdusering av en nukleinsyresekvens som koder for et heterologt eller homologt polypeptid i en egnet vertsstamme, hvor nukleinsyresekvensen er operativt koblet til en ekspresjonsregulerende region, hvor nevnte introduksjon foregår på en måte kjent per se for transformering av filamentøs fungi. Som angitt ovenfor er et antall referanser for dette tilgjengelig og et lite utvalg er blitt angitt. Informasjonen som er tilveiebragt er tilstrekkelig for å muliggjøre for en fagkyndig å utføre fremgangsmåten uten unødvendige problemer. Fremgangsmåten omfatter introduksjon av en nukleinsyresekvens som omfatter ett av nukleinsyreelementene beskrevet i de forskjellige ut-førelser av den rekombinante stamme i samsvar med oppfinnelsen eller i kombinasjon. F.eks. kan introduseringen foregå ved anvendelse av protoplast-transformasjons-metoden. Fremgangsmåten er beskrevet i eksemplene. Alternativ protoplast eller sferoplast-transformasjons-metoder er kjent og kan anvendes idet disse er blitt beskrevet innen teknikkens stilling for andre filamentøse fungi. Detaljer for slike metoder kan finnes i mange av de angitte referanser, og inkorporeres således heri. En fremgangsmåte i samsvar med oppfinnelsen omfatter hensiktsmessig anvendelse av en ikke-rekombinant stamme som ut-gangsmateriale for å introdusere den ønskede sekvens som koder for det aktuelle polypeptid.

Den foreliggende oppfinnelse dekker også en fremgangsmåte for å produsere Chrysosporium-enzym, hvor fremgangsmåten omfatter dyrkning av en Chrysosporium eller annen stamme i- eller på et dyrkningsmedium ved pH høyere enn 5, fortrinnsvis 5-10, mer fortrinnsvis 6-9, hensiktsmessig 6-7,5, 7,5-9 som eksempler på nøytrale og alkaliske pH-områder.

Mer generelt omfatter foreliggende oppfinnelse også en fremgangsmåte for å produsere enzymer som oppviser nøy-trale eller alkalisk optimal aktivitet og/eller stabilitet, fortrinnsvis alkalisk optimal aktivitet og/eller stabilitet. De foretrukne områder viser pH og optimal aktivitet, og likeledes analyser for å bestemme slike, er blitt tilveiebragt annet sted i beskrivelsen. Enzymet kan selekteres fra karbohydrat-nedbrytende enzymer, proteaser, andre hydrolaser, oksidoreduktaser og transferaser, som beskrevet ovenfor, og nevnte fremgangsmåte omfatte dyrkning av en verts-celle transformert eller transfektert med den korresponderende enzym-kodende nukleinsyresekvens. Et slikt enzym til hensiktsmessig være et Chrysosporiurnenzym. En hensiktsmessig metode omfatter produksjon spesifikt av cellulase, xylanase, pektinase, lipase og protease, hvor cellulase og xylanase spalter (3-1, 4-bindinger og cellulase omfatter endoglukanase, cellobiohydralase og P-glukosidase. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan omfatte dyrkning av enhver Chrysosporium-vert i samsvar med oppfinnelsen som omfatter nukleinsyre som koder for et av de ovenfor angitte enzymer. Hensiktsmessig er produksjon av ikke-rekombinante Chrysosporium- verter i samsvar med oppfinnelsen rettet for produksjon av karbohydrat-nedbrytende enzymer, hydrolaser og proteaser. I et slikt tilfelle er enzymet fortrinnsvis et annet enn en cellulase. Fremgangsmåter for å isolere er analog til de som er beskrevet i WO 98/15633, og inkorporeres herved med referanse .

Enzymene produsert i samsvar med oppfinnelsen er også dekket av oppfinnelsen. Enzymer av Chrysosporium- opprinnelse som kan isoleres fra ikke-kombinante Chrysosporium- stammer i samsvar med oppfinnelsen inndekkes også. Disse oppviser den ovenfor nevnte stabilitet, og aktivitetskarakteristika. Hensiktsmessig er de stabile i nærvær av ALS. Spesielt proteaser med pl 4-9,5, proteaser med en MW av 25-95 kD, xylanaser med pl mellom 4,0 og 9,5, xylanaser med MW mellom 25 og 65 kD, endoglukanaser med en pl mellom 3,5 og 6,5, endoglukanase med MW på 25-55 kDa, P~glukosidaser, a,p-glukosidaser med en pl av 4-4,5, P~glukosidaser, a,p-galaktosidaser med en MW av 45-50 kDa, cellobiohydrolaser av pl 4-5, cellobiohydrolaser av MW 45-75 kDa, f.eks. en MW av 55 kD og pl 4,4, polygalakturo-naser med en pl av 4,0-5,0, polygalakturonase av 60-70 kDa, f.eks. 65 kDa, esteraser med en pl på 4-5, og esteraser med en MW av 95-105 kDa med den ovenfor nevnte stabilitet, hvor aktivitetskarakteristika gjøres krav på. De molekylære vekter (MW) er de som bestemmes ved SDS-PAGE. Det ikke-rekombinante, dvs. nativt forekommende enzym er en annen enn cellulase som beskrevet i WO 98/ 15633. Enzymer med kombinasjoner av pl-verdier og molekylære vekter som angitt ovenfor, inndekkes også.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også (over-produksjon av ikke-protein-produkter ved hjelp av mutante (rekombinante) stammer ifølge oppfinnelsen. Slike ikke-proteinprodukter inkluderer primære metabolitter så som organiske syrer, aminosyrer, og sekundære så som anti-biotika, f.eks. penicilliner og cefalosporiner og andre terapeutika. Disse produkter er resultater av kombinasjoner av biokjemiske reaksjonsveier, og involverer flere fungale gener av interesse. Fungale primære og sekundære metabolitter og fremgangsmåter for å produsere disse metabolitter i fungale organismer er kjent innen fagfeltet. Eksempler på produksjon av primære metabolitter er blitt beskrevet av M. Mattey, The Production of Organic Acids, Current Reviews in Biotechnology, (1992), vol 12, pp 87-132. Eksempler på produksjon av sekundære metabolitter er blitt beskrevet av Penalva et al., The Optimization of Penicillin Biosynthesis in Fungi, Trends in Biotechnology,

(1998), vol 16, pp 483-489.

EKSEMPLER

EKSEMPLER PÅ TRANSFORMASJON. SAMMENLIGNING AV CHRYSOSPORIUM, TRICHODERMA OG TOLYPOCLADIUM GEODER

To ikke-transformerte Chrososporium Cl-stammer og én Trichoderma reesei- referansestamme ble testet på to media (Gs pH 6,8 og Pridham agar, PA, pH 6,8). For å teste de antibiotiske resistanse-nivåer ble sporer opptatt fra 7-dager gamle PDA-plater. Selektive plater ble inkubert ved 32°C og monitorert etter 2, 4 og 5 dager. Det fulgte at Cl-stammen NG7C-19 og UV18-25 klart hadde en lavt, basalt resistansenivå både til fleomycin og hygromycin. Dette nivå er sammenlignbart til det for referansen T. reesei som vanligvis anvendes som laboratorie-stamme. Det er således en klar indikasjon på at disse to standard-fungale selekterbare markører kan anvendes i Chrysosporium-stammer. Problemer med andre standard-fungale selekterbare markører kan ikke forventes.

Seleksjon av SH-ble (fleomycin-resistens) transformerte Chrysosporium-stammer ble med suksess utført ved 50 ug/ ml. Dette var også seleksjonsnivået anvendt for T. reesei som således viste at differensialseleksjon enkelt kan oppnås i Chrysosporium. De samme kommentarer er gyldige for transformerte stammer med hygromycin-restens ved et nivå på 150 ug/ml.

Protoplast-transformasjonsteknikken ble anvendt på Chrysosporium basert på den mest anvendte fungale trans-formasjonsteknologi. Alle sporer fra én 90 mm PDA-plate ble gjenvunnet i 8 ml ICI og overført til en ryste-flaske av 50 mkl ICl-medium for inkubering i 15 timer ved 35°C og 200 rpm. Etter dette ble kulturen sentrifugert, pelletten ble vasket i MnP, bragt tilbake i løsning i 10 ml MnP og 10 mg/ml Caylase C3, og inkubert i 30 min. ved 35°C med rysting (150 rpm).

Løsningen ble filtrert og filtratet ble underlagt sentrifugering i 10 min. ved 3500 rpm. Pelletten ble vasket med 10 ml MnPCa<2+>. Dette ble sentrifugert' i 10 min. ved 25°C. Deretter ble 50 mikroliter kald MPC tilsatt.' Blandingen ble holdt på is i 30 min., hvorpå 2,5 ml PMC ble tilsatt. Etter 15 min. ved romtemperatur ble 500 mikroliter av de behandlede protoplaster blandet til 3 ml MnR Soft og umiddelbart utsådd på en MnR-plate som inneholder fleomycin eller hygromycin som seleksjonsmiddel. Etter inkubering i 5 dager ved 30°C ble transformantene analysert (klonene ble synlige etter 48 timer). Transfor- masjonseffektivitet ble bestemt ved anvendelse av 10 mikrogram referanseplasmid pAN8-l<19>. Resultatene presen-teres i den følgende Tabell 1.

Chrysosporium-transformantenes levedyktighet er overlegen den for Trichoderma. Transformabiliteten av stammen er sammenlignbar og således er antallet transformanter oppnådd i ett eksperiment 4 ganger høyere for Chrysosporium enn for T. reesei. Således er Chrysosporium-transformasjonssystemet ikke kun likt det vanlig anvendt T.reesei-systemet, men utklasser dette. Denne forbedring kan vise seg å være spesielt nyttig for vektorer som er mindre transformasjonseffektive enn pAN8-l. Eksempler på slike mindre effektive transformasjonsvektorer er protein-bærervektorer for produksjon av ikke-fungale proteiner som generelt gir 10 ganger færre transformanter.

Et antall andre transformasjons- og ekspresjonsvektorer ble konstruert med homologe Chrysosporium-proteinkodende sekvenser, og også med heterologe proteinkodende sekvenser for anvendelse i transformasjonseksperimenter med Chrysosporium.

Eksempler på ekspresjonssystemer inkluderer et Chrysospori um-xylanase Xyll-promotorfragment koblet til en xylanase-sekvens i ramme med en xylanase åpen leseramme etterfulgt av en xylanase terminatorsekvens. Transformant-seleksjon utføres ved anvendelse av ko-transformasjon med en selekterbar vektor.

Et annet eksempel er en Chrysosporium lucknowense-cellobiohydrolase-promotor koblet til Penicillium-endoglukanase-3-signalsekvens i ramme med Penicillium-endoglukanase-3 åpen leseramme etterfulgt av Chrysosporium cellobiohydrolase terminatorsekvens. I tillegg bærer denne vektor en andre ekspresjonskassett med en seleksjons-markør, dvs. acetamidase-S-genet (AmdS-gen).

Et ytterligere eksempel omfatter Chrysosporium-glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase 1-promotor koblet til Aspergillus niger glukoamylase-signalsekvens og mikroamy-lase åpen leserammen fusjonert til humant interleukin 6 åpen leseramme. I tillegg bærer denne vektor en andre eks-pres jonskassett med en seleksjonsmarkør, dvs. AmdS-genet.

Et ytterligere eksempel er en Aspergillus nidulans-glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase. En promotor koblet til endoglukanase-5 åpen leseramme etterfulgt av en Aspergillus nidulans-terminatorsekvens.

EKSEMPLER PÅ HETEROLOG OG HOMOLOG EKSPRESJON AV CHRYSOSPORIUM-TRANSFORMANTER

Cl-stammer (NG7C-19 og/eller UV18-25) er blitt testet for deres evne til å utskille forskjellige heterolog proteiner: et bakterielt protein { Streptoalloteichus hindustanus fleomycin-resistent protein, Sh ble) , et fungalt protein ( Trichoderma reesei xylanase II, XYN2) og et humant protein (humant lysozym, HLZ).

Cl-sekresjon av Trichoderma reesi-zylanse II (XYN2).

Cl-stammen UV18-25 er blitt transformert med plasmidene pUT1064 og pUT1065. pUT1064 presenterer de to følgende fungale ekspresjonskassetter: Den første kassett muliggjør seleksjon av fleomycin resistente transformanter: Neurospora crassa kryss-reaksjonsvei kontrollgen

1 (cpc-1) promotor14

Streptoalloteichus hindustanus fleomycinresistent

gen Sh ble' 1

Aspergillus nidulans tryptofan-syntase ( trpC)

terminator<5>

Den andre kassett er xylanase-produksjonskassetten: T. reesei- stamme TR2 cbhl-promotor<15>T.reesei-stamme TR2 xyn2-gen (inkluderende dens

signalsekvens)<16>

T. reesei-stamme TR2Cjbhi-terminator<15>.

Vektorene bærer også et E.coli-replikasjonsorigo fra plasmid pUC19<6>. Det detaljerte kart over plasmidet er gitt i Fig. 1.

pUT1065 presenterer de følgende fungale ekspresjonskassetter: A. nidulans glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase

( gpdA) promotor2

En syntetisk T.reesei-cellobiohydrolase 1

( cbhl) signalsekvens1'3

S. hindustanus fleomycinresistent gen Sh ble<4>

anvendt som bærerprotein<10>

Et linkerpeptid (SGERK) med et KEX2-lignende proteasespaltningssete<1>

T.reesei-stamme TR2xyn2-gen (uten

signalsekvens)<16.>

A.nidulans-tryptofansyntase (trpC)-terminator<5>.

Vektoren bærer også beta-laktamasegenet ( bla) og et E. coli-replikasjonsorigo fra plasmid pUC18<6>. Plasmidets detaljerte kart er vist i Fig. 2.

Cl-protoplaster ble transformert med plasmid pUT1064 eller pUT1065 ved å følge den samme prosedyre som allerede beskrevet i eksemplet ovenfor. Fusjonsproteinet i plasmid pUT1065 ( Sh ble::XYN2) er funksjonelt med hensyn til fleo-mycinresistens, noe som muliggjør enkel seleksjon av Cl-transformantene. Videre korrelerer grovt nivået av fleo-mycinresistens med nivået av xyn-2-ekspresjon. I pUTl064 ble xyn2 klonet med dets egne signalsekvens.

Xylanase-produksjon av Cl-transformanter (fleomycin-resistente kloner) ble analysert ved xylanase-aktivitets-analyse som følger: Primære transformanter ble overført med tannpirker til GS+fleomycin (5 ug/ml) plater (resistens verifisering) og også på XYLAN-plater (xylanase-aktivitet-deteksjon med visualisering av klarede soner17) . Plater fikk vokse i 5 dager ved 32°C. Hver varierte klon ble subklonet på XYLANplater. To subkloner pr. transformant ble anvendt for å inokulere PDA-plater for å gi sporer for væskedyrkningsinitiering. Væskekulturene i ICI+5 g/l K.ftalat fikk vokse i 5 dager ved 27°C (risting 180 rpm). Deretter ble kulturene sentrifugert (5000 g, 10 min.). Fra disse plater ble xylanase-aktivitet målt med DNS-teknikk i samsvar med Miller et al.<18>.

Dataene viste at:

1) Punktene 1-4 fra Eks. 2 bekreftes.

2) Cl kan anvendes som vert for sekresjon av heterologt fungalt protein.

Appendiks til eksemplene: Media

Transformasj onsmedium:

For seleksjon og dyrkning

Regenereringsmedium (MnR) tilsatt 50 ug/ml fleomycin

Og 100-150 ug/ml hygromycin anvendes for å selektere transformanter. GS-medium, tilsatt 5 ug/ml fleomycin anvendes for å bekrefte antibiotisk resistens.

PDA er et komplett medium for hurtig vekst og god sporulering. Væskemedia inokuleres med 1/20 av spore-suspensjon (alle sporer fra én 90 mm PDA-plate i 5 ml 0,1% Tween). Slike kulturer dyrkes ved 27°C i ryste-flasker (200 rpm) .

ISOLERING OG KARAKTERISERING AV Cl- GENER OG GEN- EKSPRESJONSSEKVENSER TIL CBH1. XYL1, OG GPD

Konstruksjon av et BlueSTAR- genbibliotek av UV18- 25

Kromosomalt DNA av UV18-25 ble delvis oppkuttet med Sau3A, fragmenter av 12-15 kb ble isolert og ligert i et Bamtil-sete av kloningsvektor BlueSTAR. Pakking av 20% av ligeringsblandingen resulterte i et genbibliotek av 4,6xl0<4>uavhengige kloner. Dette bibliotek ble multiplisert, og lagret ved 4°C og -80°C. Resten av ligeringsblandingen ble også lagret ved 4°C.

Screening av genbiblioteket av UV18- 25 for isolering av genene for cbhl, xyll og gpdl.

For isolering av de forskjellige gener, ble totalt ±7,5xl0<4>individuelle BlueSTAR-fag pr. probe hybridisert in duplo. Hybridiseringen ble utført med PCR-fragmentene av cbhl og xyll (som beskrevet i WO 00/20555) ved homologe betingelser (65°, 0,2xSSC) og med gpdl-genet av A. niger med heterologe betingelser (53°C, 0,5xSSC). Antallet positive signaler er gitt i Tabell 3. De positive kloner ble re-screenet og for hver klon ble to individuelle fag anvendt for videre eksperimenter. DNA av de forskjellige kloner ble analysert ved restriksjonsanalyse for å bestemme antall av forskjellige kloner isolert fra hvert gen (resultatet er gitt i Tabell 3). Idet det for hvert av de 3 gener ble isolert 4-6 forskjellige kloner, konkluderte vi med at det primære genbibliotek (±4-5xl0<4->kloner) re-presenterte ca. 5x genom, av UV18-25. Fra dette resultat ble det konkludert at det komplette genom av UV18-25 er representert i 9xl0<3->kloner. Basert på et midlet genomisk innskudd på 13 kb, vil dette indikere en genomstørrelse på ±120Mb, som er 3 ganger størrelsen av genomet i Aspergillus.

PCR-reaksjoner med spesifikke primere for genet som foreligger på plasmidet,(basert på tidligere sekvens- bestemmelser fra de isolerte PCR-fragmenter) og T7- og T3-primerne som foreligger i polylinkeren på pBlueSTAR gjorde oss i stand til å bestemme lokaliseringen av genene i et antall kloner. For hvert gen ble et plasmid anvendt for sekvensbestemmelse av genet.

Sekvensanalyse av de klonede gener

For cbhl, xyll og gpbl-genet er resultatene av sekvensbestemmelsen representert i SEKV. ID. NR. 1, 3 og 5, respektivt. Også den deduserte aminosyresekvens av proteinene er representert i disse sekvensnumre 2, 4 og 6. Noen egenskaper av proteinene er gitt i Tabell 4. Det skal angis at posisjonen til translasjonsstart og intronene er basert på homologi med gener fra den samme familie (dvs. papir-genetikk).

CBH1

Fra aminosyresekvensene til CBH1 konkluderte vi med at proteinet er ca. 63 kD i størrelse, og at et cellulose-bindende domene (CBD) foreligger ved den C-terminale del av proteinet. Interessant, intet bevis ble funnet for nær vær av et CBD i isoleringen av 55 kD hovedprotein. Imidlertid, nærvær av de isolerte peptider fra dette 55 kD hovedprotein i det kodede CBHl-protein (SEKV. ID. NR. 1, 2), bekrefter at det 55 kD-protein kodes av det klonede gen. En mulig forklaring på disse resultater er at 55 kD-proteinet er en trunkert versjon av CBHl-proteinet som mangler CBD.

Cellobiohydrolase CBH1 har aktivitet mot MUF-cellobiosid, MUF-laktosid, FP og avicel, og også mot pnitrofenyl-p-glukosid, cellobiose og p-nitrofenyl-laktosid. Dens aktivitet mot MUF cellobiosid inhiberes ved cellobiose med inhiberingskonstant av 0,4 mM. Michaelis konstant mot MUF-cellobiosid var 0,14 mM, mot MUF-laktosid var den 4 mM og mot CMC 3,6 g/l. pH-optimum er fra 4,5-7. 50% av maksimal aktivitet mot CMC og 80% mot RBB-CMC bevares ved pH 8. 70-80% aktivitet innen 5-8 bevares under 25 timers inkubering. Temperaturoptimum er 60-70°C. CBH1 er et medlem av cellobiohydrolase-familien 7. Den korresponderende CBH-promotor, som er en foretrukket utførelse av oppfinnelsen, er indikert i SEKV. ID. NR. 1.

Xyll

Fra aminosyresekvensene til Xyll konkluderer vi at også er en CBD tilstede, i dette protein ved den N-terminale side (dvs. direkte festet til, eller i en mindre enn 5 aminosyreavstand fra signalsekvensen). I litteraturen er kun noen få flere xylanaser med en CBD kjent ( Fusarium oxysporum, Humicola grisea og Neocallimastix patriciarum). Den estimerte størrelse av Xyllproteinet er 43 kD og flere peptider isolert fra 30 kD xylanase stammer fra dette protein (SEKV. ID. NR. 3, 4). Flere isolerte peptider kunne ikke finnes i den kodede sekvens. Dette kan indikere at alternative xylanaseproteiner foreligger i UV18-25. I tidligere analyser ble idet ikke funnet bevis for nærvær av CBD i dette 30 kDprotein. Det ble antatt fra disse resultater at CBD i proteinet spaltes av ved proteolyse. Denne hypotese vil bli analysert ytterligere (ved bestemmelse av aktiviteter, N-terminale sekvenser og størrelser for de forskjellige proteiner i forskjellige Cl-stammer; Cl-villtype, NG7C, UV13-6, UV18-25 og proteasemutanter av UV18-25). Videre analyseres effekten av nærvær eller fravær av CBD på enzymatiske aktiviteter mer detaljert. Overekspresjon av fulllengde-genene i forskjelllige Cl-verter kan vurderes.

Nærvær av et cellolose-bindende domene (CBD) er en bestemt egenskap til dette enzym. Det eneste andre kjente familie 10-glykotiske enzym (xylanase) som har en Nterminal CBD er Fusarium ozysporum XylF. CBD av Chrysosporium luckownese Xyll-protenet har sekvensen: WGQCG GQGWT GPTTC CSGAV COFVN DWYSQ CV (aminosyrer 22-52 av SEKV. ID. NR. 4). Denne sekvens samsvarer ikke med CBDkonsensus-sekvensen beskrevet i US Patent Nr 5.763.254 (NOVO).

Denne konsensus-sekvens i US Patent Nr. 5.763.254 er: W/Y-G/A-Q-C-G G-Q/I/N-G/N-W/F/Y-S/T/N/Q G-P/A/C-T/R/K-T/C/N-C X-X-G/P-S/T/F/L/A/-T/K C-V/T/R/E/K-K/Q/A-Q/I-N Q/D/A-W/F/Y-Y-Y/S/H/A-Q C-L/I/Q/V/T, hvor W/Y enten betyr W eller Y etc, X betyr enhver aminosyre, og - betyr fraværende. Fire forskjeller i forhold til den mest de-genererte konsensus-sekvens foreligger i Xyll, som er understreket i sekvens 7 ovenfor. Oppfinnelsen vedrører således xylanaser som har en N-terminal CBD forskjellig fra denne konsensus CBD og som ikke er Fusarium oxysporum xylanase. Mer spesielt har xylanase ifølge oppfinnelsen en CBD som har minst 55%, spesielt minst 65%, fortrinnsvis minst 75% sekvensidentitet med sekvensen 7 ovenfor. Fortrinnsvis inneholder CBD'en én av aminosyrene Phe, Tyr og Trp ved posisjon 23, eller minst én av de fire aminosyrer Val ved posisjon 20, Gin ved posisjon 22, Phe ved posisjon 23 og Val ved posisjon 24. Foretrukne sekvenser omfatter: Cys-Xaa-Phe, Xaa-Phe-Val, Cys-Xaa-Phe-Val, Cys-Gln-Phe, Val-Cys-Xaa-Phe, Gln-Phe-Val, Gln-Trp-Val, Gln-Tyr-Val, Val-Cys-Gln, Val-Cys-Gln-Phe og Val-Cys-Xaa-Phe-Val, hvor Xaa er enhver aminosyre eller fortrinnsvis Val, Thr, Arg, Glu, Gin eller Lys, eller mest foretrukket Gin eller Glu.

Xylanasen oppviser ikke MUF-cellobiaseaktivitet og er således ingen sann xylanase. Den oppviser høy aktivitet innen et bredt pH-område fra 5-8 og opprettholder 65% av maksimal aktivitet ved pH 9-10, den er et medlem av xylanase F-familien. Den korresponderende xylanasepro-motor, som er en foretrukket utførelse ifølge oppfinnelsen, er vist i SEKV. ID. NR. 3. Michaelis-konstanten mot ...-xylan er 4,2 g/l for 30 kD xylanase. Temperaturoptimum var høyt og tilsvarte 70°C for xylanase.

Gpdl

DNA-sekvensen til den C-terminale del av gpdl-genet er ikke bestemt. Promotorsekvensene til dette gen er en foretrukket utførelse ifølge oppfinnelsen og er avbildet i

SEKV. ID. NR. 5.

Ekspresjonsnivået av fire Chrysosporum- qener ble studert med Northern-analyse. Forskjellige stammer av C. lucknowense fikk vokse i rikt medium inneholdende farmedia med cellulose og laktose (medium 1) eller rikt medium inneholdende farmedia og glukose (medium 2) ved 33°C. Etter 48 timer ble mycelium høstet og RNA ble isolert. RNA ble hybridisert med 4 forskjellige prober: EG5, EG6, Xyll og CBH. Etter eksponering ble Northern-blottene strippet og hybridisert igjen med en probe for ribosomalt L3 som en kontroll for mengden av mRNA på blottet. De fleste stammer viste høy respons for CBH og høy respons for Xyll i medium 1; i medium 2, halvparten av stammen viste høy respons for alle gener, og den andre halvpart viste lavest respons. Rekkefølgene på ekspresjonsstyrken ble dedusert fra disse data som CBH>Xyll>EG5>EG6. Proteinet Xyll fra C. lucknowense er 67% identisk (72% homolog) til dets nærmeste homolog i Genbank DATABASE (Tabell 4). Den sterke homologi til CBHl-proteinet til dets beslektede Humicola grisea-homolog (74% identisk/82%

homolog) er bemerkelsesverdig. Det skal også bemerkes at i alle tilfeller var den nærmeste homolog fra Fusarium,

Humicola eller andre Pyrenomycetous (Sordariamycetus) fungi (Tabell 4), mens Chrysosporium tilhører Plectomycetus (Eurotiomycetus) i samsvar med NCBI-databasen (Tabell 4). Således vedrører også oppfinnelsen glykano-lytiske enzymer, spesielt cellobiohydrolaser og xylanaser som omfatter en CBD, avledet fra plectomycetus fungi.

Beskrivelse av figurene Fig. 1 er et pUT1064-kart. Fig. 2 er et pUT1065-kart.

Referanser ( hvis innhold heri inkorporeres)

1. T.P. Calmels, F. Martin, H. Durand and G. Tiraby (1991), Proteolytic events in the processing of secreted proteins in fungi.

J. Biotechnol., vol 17(1), p 51-66.

2. P.J. Punt, M.A. Dingemanse, B.J. Jacobs-Meijsing, P.H. Pouwels and CA. van den Honden (1988). Isolation and characerization of the glyceraldehyde- 3- phosphate dehydro-genasegen of Aspergillus nidulans, Gene, vol 69 (1), pp 49-57. 3. S. Shoemaker, V. Schweickart, M. Ladner, D. Gelfand, S. Kwok, K. Myambo and M. Innis

(1983). Molecular doning of exo- cellobiohydrolase I derived from Trichoderma reesei strain L27. Bio/Technology, Oet., pp 691-696.

4. D. Drocourt, T. Calmels, J.P. Reynes, M. Baron and G. Tiraby (1990) . Cassettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for trans formation of lower and higher euka-ryotes to phleomycin resistance. Nucleic

Acids Res, vol 18(13), p 4009.

5. E.J. Mullaney, J.E. Hamer, K.A. Roberti, M.M. Yelton and W.E. Timberlake (1985). Primary structure of the trpC gene from Aspergillus nidulans. Mol. Gen. Genet, vol

199 (1), pp 37-45.

6. C. Yanisch-Perron, J. Vieira and J. Messing

(1987) . Improved M13 phage doning vectors

and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, vol 33,

pp 103-119.

7. H. Durand, M. Baron, T. Calmels and G. Tiraby (1988). Classical and molecular gene tics applied to Trichoderma reesei for the selection of improved cellulolytic industrial strans, in Biochemistry and genetics of cellulose degradiation, J.P. Aubert,

Editor. Academic Press, p 135-151.

8. O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr and R.J. Randall (1951). Protein measurements with the folin phenol reagent. J. Biol.

Chem., vol 193, pp 265-275.

9. M. Parriche, J.C. Bousson, M. Baron and G. Tiraby. Development of heterologous protein secretion systems in filamentous fungi. In 3rd European Conference on Fungal Genetics,

1996, Munster, Germany.

10. M. Baron, G. Tiraby, T. Calmels, M. Parriche and H. Durand (1992). Efficient secretion of human lysozyme fused til the Sh ble phleomycin resistance protein by the fungus Tolypocladium geodes. J. Biotechnol., vol

24(3), pp 253-266.

11. D.J. Jeenes, B. Marczinke, D.A. MacKenzie and D.B. Arvher (1993). A truncated glucoamylase gene fusion for heterologoun protein secretion from Aspergillus niger. FEMS

Microbiol. Lett., vol 107(2-3), pp 267-271. 12. P.J. Stone, A.J. Makoff, J.H. Parish and A. Radford (1993). Cloning and sequence- ana-lysis of the glucoamylase gene of neurospora- crassa. Current Genetics, vol 24(3), pp 205-211. 13. P. Morsky (1983). Turbidimetric determination of lysozyme with Micrococcus lysodeikticus cells: Reexamination of reaction conditions. Analytical Biochem., vol 128, pp 77-83. 14. J.L. Paluh, M.J. Orbach, T.L. Legerton and C. Yanofsky (1988). The cross- pathway-control gene of Neurospora crassa, cpc- 1, encodes a protein similar to GCN4 of yeast and the DNA- binding domain of the oncogene v- jun- encoded protein. Proe. Nati. Acad.

Sei., USA, vol 85(11), pp 3728-32.

15. T. Nakari, M.L. Onnela, M. limen, K. Neva-lainen and M. Penttilå (1994). Fungal pro-moters active in the presences of glucose,

WO 94/04673, Alko. 16. A. Torronen, R.L. Mach, R. Messner, R. Gonzales, N. Kalkkinen, A. Harkki and CP Kubicek (1992). The two major xylanases from Trichoderma reesei: characterization of both enzymes and genes. Biotechnology (NY), vol 10 (11), pp 1461-5. 17. V. Farkas (1959). Novel media for detection of microbial producers of cellulase and xylanase. FEMS Microbiol. Letters, vol 28,

pp 137-140.

18. G.L. Miller (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing

sugar. Anal. Chem., vol 31, pp 426-428.

19. P.J. Punt, I.E. Mattern, CA.M.J.J. Hondel

(1988). A vector for Aspergillus trans-formation conferring phleomycin resistance. Fungal Genetics Newsletter, vol 35, pp 25-

Claims (15)

1. Protein, karakterisert ved at det korresponderer til en Chrysosporium-glykosyl hydrolase-familie 7, som oppviser minst 75% aminosyreidentitet [som bestemt med BLASTalgoritme] med aminosyresekvensen i SEKV. ID. NR. 2 eller en del derav som har minst 20 kontiguøse aminosyrer som er identiske til den korresponderende del av aminosyresekvensen 1-246 eller 394-526 i SEKV. ID. NR.

2.

2. Protein, karakterisert ved at det korresponderer til en Chrysosporium-glykosyl hydrolase-familie 10, som oppviser minst 70% aminosyreidentitet [som bestemt med BLAST-algoritme] med aminosyresekvensen i SEKV. ID. NR. 4 eller en del derav som har minst 20 kontiguøse aminosyrer som er identiske til den korresponderende del av aminosyresekvensene 1-133 eller 252-383 i SEKV. ID. NR.

4 .

3. Protein, karakterisert ved at det korresponderer til en Chrysosporium-glykosyl hydrolase-familie 10, som oppviser minst 65% aminosyreidentitet [som bestemt med BLAST-algoritme] med aminosyresekvensen i SEKV. ID. NR. 4 eller en del derav som har minst 20 kontiguøse aminosyrer som er identiske til den korresponderende del av aminosyresekvensene 1-383 i SEKV. ID. NR. 4.

4. Protein, karakterisert ved at det korresponderer til en Chrysosporium-glykosyl hydrolase-familie 10, og omfatter et cellulosebindende domene som har minst 35% aminosyreidentitet med aminosyresekvensen 22-53 og/eller har minst 20 kontiguøse aminosyrer fra aminosyresekvensen 22-53 i SEKV. ID. NR. 4, og/eller har én av aminosyrene F, W og Y ved relativ posisjon 44.

5. Protein, karakterisert ved at det korresponderer til en Chrysosporium glyceraldehyd fosfatdehydrogenase, som oppviser minst 85% aminosyreidentitet [som bestemt med BLAST-algoritme] med den partielle aminosyresekvens i SEKV. ID. NR. 6 eller en del derav som har minst 20 kontiguøse aminosyrer som er identiske til den korresponderende del av aminosyresekvensen 1-277 i SEKV. ID. NR. 6.

6. Fremgangsmåte for å hydrolysere p-glukosidiske bindinger, karakterisert ved at det anvendes et enzym i samsvar med krav 1.

7. Fremgangsmåte for å hydrolysere p-xylosidiske bindinger, karakterisert ved at det anvendes et enzym i samsvar med krav 2, 3 eller 4.

8. Nukleinsyresekvens, karakterisert ved at den koder for et protein i samsvar med et av kravene 1-5.

9. Nukleinsyresekvens, karakterisert ved at minst 70% av nukleotidene inneholdt i den 5'-ikke-kodende region av nukleinsyresekvensen i én av SEKV. ID. NR. 1, 3 og 5.

10. Nukleinsyrekonstrukt, karakterisert ved at det omfatter en nukleinsyre ekspresjonsregulerende region avledet fra Chrysosporium, inneholdt i den 5'-ikke-kodende region av nukleinsyresekvensen i én av sekvensene SEKV. ID. NR. 1, 3 og 5, operativt koblet til en nukleinsyresekvens som koder for et aktuelt polypeptid.

11. Rekombinant mikrobiell stamme, fortrinnsvis en fungal stamme, karakterisert ved at den inneholder en nukleinsyresekvens i samsvar med et av kravene 8-10, og i stand til å uttrykke polypeptidet som kodes for av den kodende nukleinsyresekvens.

12. Fremgangsmåte for å produsere et polypeptid, karakterisert ved at det anvendes et konstrukt i samsvar med krav 10, eller en mikrobiell stamme i samsvar med krav 11.

13. En oligonukleotidprobe, karakterisert ved at den omfatter minst 15 kontiguøse nukleotider av nukleinsyresekvensen av én av sekvensene i SEKV. ID. NR.

1, 3 og 5, eller dets komplement.

14. En oligonukleotidprobe i samsvar med krav 13, karakterisert ved at proben er 20-50 nukleotider lang.

15. En oligonukleotidprobe i samsvar med krav 13 eller 14, karakterisert ved at proben er merket med en detekterbar markør.