ES2538396T3 - C1 ß-glucosidasa recombinante para la producción de azúcares a partir de biomasa celulósica - Google Patents

Abstract

Polinucleótido que codifica un polipéptido ß-glucosidasa recombinante, en el que dicho polipéptido: a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5), ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP), glutamina en la posición 381 (381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU), en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4.

Description

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C1 β-glucosidasa recombinante para la producción de azúcares a partir de biomasa celulósica

Descripción

La invención se refiere a la expresión de una β-glucosidasa recombinante y su uso en la producción de azúcares fermentables a partir de biomasa celulósica.

ANTECEDENTES

La biomasa celulósica es un recurso renovable significativo para la generación de azúcares. La fermentación de estos azúcares puede producir productos finales comercialmente valiosos, incluidos biocombustibles y productos químicos actualmente derivados del petróleo. Aunque la fermentación de azúcares simples a etanol es relativamente sencilla, la conversión eficaz de biomasa celulósica en azúcares fermentables tales como la glucosa, es un reto. Véase, por ejemplo, Ladisch et al., 1983, Enzyme Microb. Technol. 5:82. El material celulósico puede pretratarse químicamente, mecánicamente o de otras formas para aumentar la susceptibilidad de la celulosa a la hidrólisis. Tal pretratamiento puede ir seguido de la conversión enzimática de la celulosa en glucosa, celobiosa, celo-oligosacáridos y similares, utilizando enzimas que están especializadas en romper los enlaces β-1-4 glicosídicos de la celulosa. Estas enzimas son conocidas colectivamente como "celulasas".

Las celulasas se dividen en tres subcategorías de enzimas: 1,4-β-D-glucano glucanohidrolasa ("endoglucanasa" o "EG"); 1,4-β-D-glucano celobiohidrolasa ("exoglucanasa", "celobiohidrolasa" o "CBH") y β-D-glucósido glucohidrolasa ("β-glucosidasa", "celobiasa" o "BG"). Las endoglucanasas atacan al azar las partes interiores y fundamentalmente las regiones amorfas de la celulosa, produciendo principalmente glucosa, celobiosa y celotriosa. Las exoglucanasas acortan progresivamente las moléculas de glucano uniéndose a los extremos del glucano y liberando principalmente unidades de celobiosa de los extremos del polímero de celulosa. Las β-glucosidasas dividen la celobiosa, un dímero de glucosa unido en β-1,4 soluble en agua, en dos unidades de glucosa. La producción eficaz de celulasas para su uso en el procesamiento de biomasa celulósica reduciría los costos y aumentaría la eficacia de producción de biocombustibles y otros compuestos con valor comercial. En el documento WO2008/008070 y en Gusakov et al., 2007 (Carbohydrate research, 343:48-55) se describe una β-glucosidasa de Chrysosporium lucknowense.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido β-glucosidasa recombinante, en el que dicho polipéptido:

a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5), ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP), glutamina en la posición 381 (381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU), en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4.

La invención también proporciona vectores de expresión que comprenden el polinucleótido de la invención, unido operativamente a un promotor heterólogo.

La invención también proporciona un método de producción de un polipéptido β-glucosidasa secretado, que comprende cultivar una célula que comprende un polinucleótido de la invención, unido operativamente a un promotor heterólogo, o un vector de expresión de la invención, en condiciones en las que se produce β-glucosidasa.

La invención también proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende un polinucleótido de la invención que codifica un polipéptido β-glucosidasa recombinante, en el que la secuencia codificante no comprende intrones.

La invención también proporciona una composición que comprende una célula que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido β-glucosidasa recombinante unida operativamente a un promotor heterólogo, en el que dicho polipéptido:

a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5), ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP), glutamina en la posición 381

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(381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU), en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4, y una proteína β-glucosidasa secretada por la célula.

La invención también proporciona un método de producción de glucosa a partir de celobiosa, que comprende poner en contacto celobiosa con una célula recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido β-glucosidasa recombinante, unida operativamente a un promotor heterólogo, en el que dicho polipéptido:

a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5), ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP), glutamina en la posición 381 (381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU), en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4, en condiciones en las que la β-glucosidasa es expresada y secretada por la célula y dicha celobiosa es convertida enzimáticamente en glucosa por dicha β-glucosidasa.

En un aspecto, la invención proporciona un método de producción de un polipéptido β-glucosidasa secretado, mediante el cultivo de una célula que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica C1 β-glucosidasa (SEQ ID NO: 3) o una variante enzimáticamente activa de la misma según la invención, unida operativamente a un promotor heterólogo, en condiciones en las cuales se produce β-glucosidasa. La célula puede ser una célula de la cepa C1. Como alternativa, la célula puede ser distinta de una célula de la cepa C1. En algunos casos, el promotor heterólogo es el promotor de C1 celobiohidrolasa 1a (CBH1a). En algunos casos, la secuencia polinucleotídica no codifica una o más de entre la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31. Opcionalmente, la secuencia polinucleotídica codifica la SEQ ID NO: 4.

En un aspecto, la invención proporciona un método de producción de glucosa a partir de celobiosa, poniendo en contacto celobiosa con una célula recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica C1 β-glucosidasa (SEQ ID NO: 3) o una variante enzimáticamente activa de la misma según la invención, unida operativamente a un promotor heterólogo, en condiciones en las que la β-glucosidasa es expresada y secretada por la célula y dicha celobiosa es convertida enzimáticamente en glucosa por dicha β-glucosidasa. La célula puede ser una célula de la cepa C1. Como alternativa, la célula puede ser distinta de una célula de la cepa C1. En algunos casos, el promotor heterólogo es el promotor de C1 celobiohidrolasa 1a (CBH1a). En algunos casos, la secuencia polinucleotídica no codifica una o más de entre la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31. Opcionalmente, el polinucleótido codifica la SEQ ID NO: 4.

También se contempla un método de conversión de un sustrato de biomasa en un azúcar fermentable, combinando la β-glucosidasa recombinante generada según la invención, con el sustrato de biomasa (por ejemplo, celobiosa) en condiciones adecuadas para la producción del azúcar fermentable. En algunos casos, el método incluye la etapa de recuperar la β-glucosidasa a partir del medio en el que se cultiva la célula. En un aspecto, se proporciona una composición que comprende la β-glucosidasa recombinante.

En un aspecto, la invención proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica C1 β-glucosidasa (SEQ ID NO: 3), o una variante de la misma según la invención, unida operativamente a un promotor heterólogo. Opcionalmente, el polinucleótido codifica la SEQ ID NO: 4. En una forma de realización, la célula hospedadora recombinante expresa al menos otra enzima celulasa recombinante. También se contempla un método de conversión de un sustrato de biomasa en un azúcar fermentable, combinando la célula recombinante con el sustrato de biomasa en condiciones adecuadas para la producción del azúcar fermentable.

También se proporciona una célula que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica C1 β-glucosidasa (SEQ ID NO: 3), o una variante enzimáticamente activa de la misma como se describe en el presente documento, en el que la secuencia codificante no comprende un intrón, y, opcionalmente, está operativamente unida a un promotor heterólogo, que puede ser un promotor de C1 celobiohidrolasa 1a (CBH1a). En una forma de realización, la célula expresa al menos una enzima celulasa recombinante adicional.

También se proporciona una composición que contiene una célula que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica C1 β-glucosidasa (SEQ ID NO: 3) o una variante enzimáticamente activa de la misma, tal como se describe en el presente documento, y una proteína β-glucosidasa secretada por la célula. En un aspecto, una célula recombinante descrita en el presente documento se pone en contacto con un sustrato de biomasa (por ejemplo, celobiosa) y el sustrato se convierte en un azúcar fermentable (por ejemplo, glucosa).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

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La Figura 1 muestra las secuencias genómica (SEQ ID NO: 1) y de ADNc (SEQ ID NO: 2) que codifican la proteína C1 β-glucosidasa 1 (BGL1). La secuencia genómica está por encima de y alineada con la secuencia de ADNc inferior. Los huecos en la secuencia inferior muestran las posiciones de los intrones. La Figura 2 muestra la secuencia de ADNc de BGL1 (SEQ ID NO: 2) y la secuencia proteica correspondiente. El péptido señal predicho y la secuencia nucleotídica correspondiente están en negrita. La secuencia de aminoácidos que incluye la secuencia del péptido señal es la SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos que no incluye la secuencia del péptido señal es la SEQ ID NO: 3. La Figura 3 ilustra la estructura del exón del gen bgl1 (flecha inferior) en comparación con una estructura de exón descrita anteriormente (flecha superior). La Figura 4 muestra la secuencia (promotora) 5' del gen C1 cbh1a (SEQ ID NO: 8). La Figura 5 muestra una secuencia polinucleotídica artificial que codifica una proteína secretada C1 β-glucosidasa 1 (BGL1) (SEQ ID NO: 9). La secuencia tiene una preferencia de uso de codones para optimizar la expresión en Saccharomyces cerevisiae.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

I. DEFINICIONES

Las siguientes definiciones se proporcionan para ayudar al lector. A menos que se defina lo contrario, todos los términos de la técnica pretenden tener los significados que entienden comúnmente los expertos en materia de microbiología y biología molecular. En algunos casos, los términos con significados entendidos comúnmente se definen en el presente documento para mayor claridad y/o para una fácil referencia, y la inclusión de tales definiciones en el presente documento no debe interpretarse necesariamente que represente una diferencia sustancial con respecto a la definición del término en su acepción general en la técnica.

El término "celulasa" se refiere a una categoría de enzimas capaces de hidrolizar la celulosa (enlaces β-1,4glucano o β-D-glucosidico) a oligosacáridos más cortos, celobiosa y/o glucosa.

El término "β-glucosidasa" o "celobiasa" que se utiliza indistintamente en el presente documento se refiere a una β-D-glucósido glucohidrolasa que cataliza la hidrólisis de un dímero de azúcar, incluido pero no limitado a celobiosa, con la liberación de un monómero de azúcar correspondiente. En una forma de realización, una β-glucosidasa es una β-glucosidasa glucohidrolasa de la clasificación E.C. 3.2.1.21 que cataliza la hidrólisis de la celobiosa a glucosa. Algunas de las β-glucosidasas tienen la capacidad de hidrolizar también P-D-galactósidos, β-Larabinósidos y/o β-D-fucósidos y, adicionalmente, algunas β-glucosidasas pueden actuar sobre sustratos con enlaces α-1,4 tales como el almidón. Puede medirse la actividad β-glucosidasa mediante métodos bien conocidos en la técnica, incluidos los ensayos que se describen más adelante en el presente documento.

La expresión "polipéptido β-glucosidasa" se refiere en el presente documento a un polipéptido que tiene actividad β-glucosidasa.

La expresión "polinucleótido β-glucosidasa" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad β-glucosidasa.

"Actividad celulolítica" abarca la actividad exoglucanasa (CBH), la actividad endoglucanasa (EG) y/o la actividad β-glucosidasa.

El término "exoglucanasa", "exocelobiohidrolasa" o "CBH" se refiere a un grupo de enzimas celulasas clasificadas como E.C. 3.2.1.91. Estas enzimas hidrolizan la celobiosa desde el extremo reductor o no reductor de la celulosa.

El término "endoglucanasa" o "EG" se refiere a un grupo de enzimas celulasas clasificadas como

E.C. 3.2.1.4. Estas enzimas hidrolizan los enlaces β-1,4 glucosídicos internos de la celulosa.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aislado" se refiere a un ácido nucleico, polinucleótido, polipéptido, proteína, u otro componente que está parcial o completamente separado de los componentes con los que está normalmente asociado (otras proteínas, ácidos nucleicos, células, reactivos sintéticos, etc.).

La expresión "de tipo silvestre" tal como se aplica a un polipéptido (proteína) se refiere a un polipéptido (proteína) expresado por un microorganismo natural tal como bacterias u hongos filamentosos. Tal como se aplica a un microorganismo, la expresión "de tipo silvestre" se refiere al microorganismo no recombinante original.

Un ácido nucleico (tal como un polinucleótido), un polipéptido o una célula es "recombinante" cuando es artificial o manipulado, o se deriva de o contiene una proteína o ácido nucleico artificial o manipulado. Un ácido nucleico recombinante, o de forma equivalente, polinucleótido, es aquel que se inserta en una ubicación heteróloga

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de manera que no está asociado con secuencias nucleotídicas que normalmente flanquean el ácido nucleico tal como se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, un polinucleótido que se inserta en un vector o en cualquier otra ubicación heteróloga, por ejemplo, en un genoma de un organismo recombinante, de manera que no esté asociado con secuencias nucleotídicas que normalmente flanquean el polinucleótido tal como se encuentra en la naturaleza, es un polinucleótido recombinante. Los ejemplos de ácidos nucleicos recombinantes incluyen una secuencia de ADN que codifica una proteína que (i) está unida operativamente a un promotor heterólogo y/o (ii) codifica un polipéptido de fusión con una secuencia proteica y una secuencia de péptido señal heterólogo. Una proteína expresada in vitro o in vivo a partir de un polinucleótido recombinante es un ejemplo de polipéptido recombinante. Asimismo, una secuencia polinucleotídica que no aparece en la naturaleza, por ejemplo una variante de un gen natural, es recombinante.

Los ácidos nucleicos "hibridan" cuando se asocian, por lo general en solución. Los ácidos nucleicos hibridan debido a diversas fuerzas fisicoquímicas bien caracterizadas, tales como enlaces de hidrógeno, exclusión de disolvente, apilamiento de bases y similares. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "condiciones de lavado de hibridación rigurosas" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tal como hibridaciones Southern y Northern, son dependientes de la secuencia, y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Se encuentra una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) "Laboratory Techniques in biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes", parte I, capítulo 2 (Elsevier, Nueva York). Para polinucleótidos de al menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones de rigurosidad baja a muy alta se definen de la siguiente manera: prehibridación e hibridación a 42°C en 5xSSPE, SDS al 0,3%, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y, formamida al 25% para rigurosidades bajas, formamida al 35% para rigurosidades media y media-alta, o formamida al 50% para rigurosidades alta y muy alta, siguiendo los procedimientos de transferencia de Southern convencionales. Para polinucleótidos de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material transportador se lava finalmente tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando 2xSSC, SDS al 0,2% al menos a 50°C (baja rigurosidad), al menos a 55°C (rigurosidad media), al menos a 60°C (rigurosidad media-alta), al menos a 65°C (alta rigurosidad) y al menos a 70°C (rigurosidad muy alta).

El término "cultivar" o "cultivo" se refiere a hacer crecer una población de células microbianas en condiciones adecuadas en un medio líquido o sólido. En algunas formas de realización, el cultivo se refiere a la bioconversión fermentativa de un sustrato celulósico hasta un producto final.

La expresión "poner en contacto" se refiere a colocar una enzima respectiva lo suficientemente cerca de un sustrato respectivo para permitir que la enzima convierta el sustrato en un producto. Los expertos en la materia reconocerán que mezclar una solución de la enzima con el sustrato respectivo logrará el contacto.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "transformado" o "transformación" utilizado en referencia a una célula, se refiere a que una célula tiene una secuencia de ácido nucleico no original integrada en su genoma o tiene un plásmido episómico que se mantiene a través de múltiples generaciones.

El término "introducido" en el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula se refiere a una célula transfectada, transducida o transformada (conjuntamente "transformada") y procariota en la que el ácido nucleico se incorpora en el genoma de la célula.

Tal como se utiliza en el presente documento, "C1" se refiere a una cepa fúngica descrita por Garg, A., 1966, "An addition to the genus Chrysosporium corda", Mycopathologia 30:3-4. "Chrysosporium lucknowense" incluye las cepas descritas en las patentes de EE.UU. Nº 6.015.707; 5.811.381 y 6.573.086; las publicaciones de patente de EE.UU. Nº 2007/0238155, US 2008/0194005, US 2009/0099079; las publicaciones de patente internacional Nº WO 2008/073914 y WO 98/15633, y cualquiera de sus derivados, e incluye, sin limitación, Chrysosporium lucknowense Garg 27K, VKM-F 3500 D (número de registro VKM F-3500-D), la cepa C1 UV13-6 (número de registro VKM F-3632 D), la cepa C1 NG7C-19 (número de registro VKM F-3633 D) y la cepa C1 UV1825 (VKM F-3631 D), todas los cuales han sido depositadas en la All-Russian Collection of Microorganisms de la Academia Rusa de las Ciencias (VKM), Bakhurhina St. 8, Moscú, Rusia, 113184, y cualquiera de sus derivados. Aunque se ha descrito inicialmente como Chrysosporium lucknowense, C1 puede considerarse actualmente una cepa de Myceliophthora thermophila. Otras cepas C1 incluyen las células depositadas con los números de registro ATCC 44006, CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures) 122188, CBS 251.72, CBS 143.77, CBS 272.77 y VKM F-3500D. Las cepas C1 ejemplares incluyen organismos modificados en los que se han delecionado una o más secuencias o genes endógenos y/o se han introducido una o más secuencias o genes heterólogos. Los derivados incluyen UV18#100f∆alpl, UV18#100f, ∆pyr5 ∆alpl, UV18#100.f ∆alpl ∆pep4 ∆alp2, UV18#100.f ∆pyr5 ∆alpl ∆pep4 ∆alp2 y UV18#100.f ∆pyr4 ∆]yr5 ∆alp 1 ∆pep4 ∆alp2, como se describe en el documento WO2008073914.

Cuando se dice que dos elementos, por ejemplo, un promotor y una secuencia codificante, están "unidos operativamente", se refiere a que la yuxtaposición de los dos les permite ser funcionalmente activos. Por lo tanto, un promotor u otra secuencia de control está "unido/a operativamente" a una secuencia codificante cuando el promotor

o secuencia de control está colocado en una posición con respecto a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de manera que controle la transcripción de la secuencia codificante.

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Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de la descripción de dos o más secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos que son iguales cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación o región indicada (por ejemplo, toda la longitud de la secuencia de referencia), tal como se mide mediante alineamiento manual e inspección visual o utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias. Los métodos de alineamiento de secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. En una forma de realización, se alinean dos secuencias (por ejemplo, manualmente) para la identidad óptima sin introducir huecos en ninguna de las dos secuencias, o con no más de 1, 2 ó 3 huecos de por lo general menos de 10 residuos cada uno.

Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en el presente documento, incluye la referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionado del grupo que consiste en 20 a 500, normalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 300, también de aproximadamente 50 a 250, y también de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 en la que puede compararse una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de haber alineado de manera óptima las dos secuencias. Como se ha señalado, en algunas formas de realización la comparación es entre toda la longitud de las dos secuencias, o, si una secuencia es un fragmento de la otra, toda la longitud de la más corta de las dos secuencias.

Para la comparación de secuencias, por lo general una secuencia hace de secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen en un ordenador las secuencias de ensayo y de referencia, se asignan las coordenadas de subsecuencia, en caso necesario, y se asignan los parámetros de programa de algoritmo de secuencia. Pueden utilizarse parámetros de programa por defecto, o pueden asignarse parámetros alternativos. Los ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y de similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. El software para realizar los análisis BLAST está a disposición del público en la página web del National Center for Biotechnology Information, ncbi.nlm.nih.gov. El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produciría por casualidad una coincidencia entre dos secuencias nucleotídicas o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01, y lo más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.

Cuando se utiliza en el presente documento, la expresión "secuencia codificante" pretende incluir una secuencia nucleotídica que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteico. Los límites de la secuencia codificante vienen determinados generalmente por un marco de lectura abierto, que normalmente empieza con el codón de inicio ATG. La secuencia codificante incluye por lo general un ADN, ADNc, y/o secuencia nucleotídica recombinante.

Un promotor u otra secuencia de control es "heterólogo", cuando está unido operativamente a una secuencia que codifica una secuencia proteica con la que el promotor no está asociado en la naturaleza. Por ejemplo, en un constructo recombinante en el que el promotor de C1 Cbh1a está unido operativamente a una secuencia codificante de proteína distinta de la secuencia codificante de la proteína C1 Cbh1a, el promotor es heterólogo. Por ejemplo, en un constructo que comprende un promotor de C1 Cbh1a unido operativamente a una secuencia codificante de C1 β-glucosidasa 1, el promotor es heterólogo.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción del polipéptido, incluida pero no limitada a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

La expresión "vector de expresión" se refiere en el presente documento a una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de la invención, y que está unida operativamente a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción.

Un polipéptido es "enzimáticamente activo" cuando tiene actividad β-glucosidasa.

El término "preproteína" se refiere a una proteína secretada con una región de péptido señal amino terminal fijada. El péptido señal es escindido de la preproteína por una peptidasa señal antes de la secreción para dar como resultado la proteína "madura" o "secretada".

Tal como se utiliza en el presente documento, un "codón de inicio" es el codón ATG que codifica el primer residuo de aminoácido (metionina) de una proteína.

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II. INTRODUCCIÓN

La C1 fúngica produce diversas enzimas que actúan concertadamente para catalizar la descristalización y la hidrólisis de la celulosa para producir azúcares solubles. El genoma C1 se ha secuenciado al menos parcialmente, como se indica en las publicaciones de patente de Estados Unidos US 2007/0238155, US 2008/0194005 y US 2009/0099079. La figura 13 de la publicación de patente de EE.UU. 2007/0238155 proporciona información de la secuencia para el gen de C1 β-glucosidasa 1 (bgl1) y la proteína codificada (BGL1). Como se analiza en los Ejemplos 1 y 2, más adelante, se ha descubierto recientemente que esta secuencia del gen bgl1 publicada anteriormente incluía errores de secuenciación. Por otra parte, inesperadamente, la estructura del exón de la secuencia bgl1 publicada es incorrecta. A consecuencia de estos errores, la secuencia de la proteína C1 BGL1 disponible incluye errores, particularmente en el péptido señal y en el extremo amino terminal de la proteína BGL1 madura (es decir, secretada).

Tal como se analiza con mayor detalle más adelante, la secuencia correcta de la preproteína BGL1 se expone en el presente documento como SEQ ID NO: 3 y la secuencia correcta de la proteína secretada BGL1 se expone como SEQ ID NO: 4. La Tabla 1 presenta un resumen de las secuencias a las que frecuentemente se hace referencia en la presente descripción.

TABLA 1

SEQ ID NO:

Descripción

1

Secuencia del gen C1 bgl nucleótido

2

Secuencia de ADNc de C1 nucleótido

3

Proteína secretada BGL aminoácido

4

Preproteína BGL aminoácido

5

Extremo amino terminal de la proteína secretada BGL (IESRK) aminoácido

6

Péptido señal de BGL (MKAAALSCLFGSTLAVAGA) aminoácido

7

Extremo amino terminal de la preproteına BGL (MKAAALSCLFGSTLAVAGAIESRK) aminoácido

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Secuencia promotora de C1 Cbh1a nucleótido

9

Polinucleótido artificial que codifica la proteína C1 BGL1 (codón optimizado para la expresión en S. cerevisiae) nucleótido

13-17

Secuencia flanqueante en sentido 5' respecto al codón de inicio nucleótido

18

Secuencia intrónica de bgl1 nucleótido

19

Fragmento de la secuencia intrónica de bugl1 nucleótido

20

Secuencia del exón 1 de bgl1 nucleótido

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Exón 1 e intrón 1 de bgl1 nucleótido

La preproteína y la proteína secretada C1 β-glucosidasa, y los polinucleótidos que las codifican, pueden utilizarse en diversas aplicaciones en las que se desea la actividad β-glucosidasa, tales como las que se describen más adelante en el presente documento. En aras de la simplicidad, y como resultará evidente a partir del contexto, las referencias a la "proteína C1 BGL1" y similares pueden utilizarse para referirse tanto a la forma madura (secretada) de la proteína como a la preproteína.

En una forma de realización, una secuencia que codifica una proteína C1 BGL1 descrita en el presente documento está unida operativamente a un promotor no asociado con BGL1 en la naturaleza (es decir, un promotor heterólogo), para, por ejemplo, mejorar la eficacia de la expresión de la proteína BGL1 cuando se expresa en una célula hospedadora. En una forma de realización, la célula hospedadora es un hongo, tal como un hongo filamentoso. En una forma de realización, la célula hospedadora es una célula de la cepa C1. En una forma de realización, la célula hospedadora es C1 y el promotor es el promotor de C1 Cbh1a. Ventajosamente, las células C1 cultivadas transfectadas con un vector que comprende una secuencia que codifica C1 β-glucosidasa unida operativamente a un promotor de Cbh1a producía aproximadamente 35 veces mayor actividad β-glucosidasa que la de las células de control que expresaban bgl1 endógeno.

El sistema de expresión de C1 β-glucosidasa que se describe en el presente documento es particularmente útil para la producción de azúcares fermentables a partir de biomasa celulósica. En un aspecto, la invención se refiere a un método de producción de glucosa poniendo en contacto una composición que comprende celobiosa con una C1 β-glucosidasa expresada de manera recombinante en condiciones en las que la celobiosa se convierte enzimáticamente en glucosa. Puede ponerse en contacto proteína β-glucosidasa recombinante purificada o

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parcialmente purificada con la celobiosa. Como alternativa, pueden ponerse en contacto células hospedadoras recombinantes que expresan β-glucosidasa con celobiosa. En un aspecto de la presente invención, dicho "poner en contacto" comprende cultivar una célula hospedadora recombinante en un medio que contenga celobiosa producida a partir de materia prima celulósica, en el que la célula recombinante comprende una secuencia codificante de C1 β-glucosidasa unida operativamente a un promotor heterólogo.

En otro aspecto de la invención, el péptido señal de C1 β-glucosidasa (SEQ ID NO: 6) puede fusionarse con el extremo amino terminal de un polipéptido que no sea una C1 β-glucosidasa (es decir, un polipéptido "heterólogo") para mejorar la secreción, la estabilidad u otras propiedades del polipéptido cuando se expresa en una célula hospedadora, por ejemplo, una célula fúngica tal como una célula C1.

En las siguientes secciones se describen diversos aspectos de la invención.

III. PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS β-GLUCOSIDASA PARA SU USO EN LOS MÉTODOS DE LA

INVENCIÓN

En un aspecto, la descripción proporciona un método para expresar una proteína β-glucosidasa mediante el cultivo de una célula hospedadora que comprende un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica C1 BGL1 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 3) unida operativamente a un promotor heterólogo, en condiciones en las que se expresa la proteína β-glucosidasa, una variante de la misma, o un fragmento enzimáticamente activo de la misma. Generalmente, la proteína expresada comprende un péptido señal, que puede ser la SEQ ID NO: 6 (el péptido señal de C1 BGL1) o puede ser un péptido señal diferente. En una forma de realización, la proteína no comprende una o más de las secuencias MQLPAAAQWLLTPAKASL (SEQ ID NO: 11), ADNHR (SEQ ID NO: 30) o MQLPAAAQWLLTPAKASLADNHR (SEQ ID NO: 31).

En algunas formas de realización, el polipéptido BGL1 incluye secuencias adicionales que no modifican la actividad codificada de una β-glucosidasa. Por ejemplo, la β-glucosidasa puede estar unida a un epítopo de identificación o a otra secuencia útil para la purificación de la β-glucosidasa.

En algunas formas de realización, la proteína BGL1 es una variante que se diferencia de la SEQ ID NO: 3 en una o más posiciones. Por ejemplo, en algunas formas de realización, la secuencia de ácido nucleico codifica una variante de BGL1 enzimáticamente activa que se diferencia de la SEQ ID NO: 3 ó 4 en una o más posiciones, y que:

a) es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 3 (proteína secretada) y/o es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 4 (preproteína); y

b) comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5), ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o codifica una preproteína con una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o comprende al menos uno, al menos dos, o tres de los siguientes residuos de aminoácidos: ácido aspártico en la posición 358 (358ASP), glutamina en la posición 381 (381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU) en los que los números de posición corresponden a la SEQ ID NO: 4.

En una forma de realización, la proteína variante de BGL1 tiene una identidad de secuencia sustancial con la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4. Por ejemplo, la variante de BGL1 puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 80% idéntica, al menos aproximadamente un 81% idéntica, al menos aproximadamente un 82% idéntica, al menos aproximadamente un 83% idéntica, al menos aproximadamente un 84% idéntica, al menos aproximadamente un 85% idéntica, al menos aproximadamente un 86% idéntica, secuencia que es al menos aproximadamente un 87% idéntica, al menos aproximadamente un 88% idéntica, al menos aproximadamente un 89% idéntica, al menos aproximadamente un 90% idéntica, al menos aproximadamente un 91% idéntica, al menos aproximadamente un 92% idéntica, al menos aproximadamente un 93% idéntica, secuencia que es al menos aproximadamente un 94% idéntica, al menos aproximadamente un 95% idéntica, al menos aproximadamente un 96% idéntica, al menos aproximadamente un 97% idéntica, al menos aproximadamente un 98% idéntica, o al menos aproximadamente un 99% idéntica a la SEQ ID NO: 3 o a la SEQ ID NO: 4.

Las variantes de BGL1 ejemplares pueden tener otras inserciones, deleciones y/o sustituciones (incluidas una o más sustituciones conservadoras), tal como se describe más adelante en el presente documento, sin dejar de ser sustancialmente idénticas a la proteína de tipo silvestre. Pueden aplicarse métodos de evolución dirigida y mutagénesis a los polinucleótidos que codifican una proteína C1 BGL1 para obtener variantes enzimáticamente activas con propiedades deseables.

Los métodos adecuados de evolución dirigida y mutagénesis son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se han utilizado técnicas de recombinación in vitro tales como el barajado de ADN, el proceso de extensión escalonada (StEP), la generación aleatoria de quimeras en moldes transitorios (RACHITT), el truncamiento iterativo para la creación de enzimas híbridas (ITCHY), la extensión recombinada en moldes truncados (RETT), y otros para producir proteínas con las propiedades deseadas. En general, los polipéptidos se expresan a partir de secuencias

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polinucleotídicas mutagenizadas y se ensayan para la actividad beta-galactosidasa (véase más adelante) y/u otras propiedades deseables.

Pueden generarse y cribarse genotecas de estas variantes de polipéptidos β-glucosidasa utilizando cribado de alto rendimiento para la presencia de actividad β-glucosidasa. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una β-glucosidasa de referencia (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4) se somete a procesos de mutagénesis (por ejemplo mutagénesis aleatoria y recombinación) para introducir mutaciones en el polinucleótido. El polinucleótido mutado se expresa y traduce, generando así enzimas β-glucosidasa manipuladas con modificaciones en el polipéptido. Tal como se utiliza en el presente documento, "modificaciones" incluye sustituciones, deleciones e inserciones de aminoácidos incluidas, por ejemplo, las que se describen más adelante. Puede introducirse en el polipéptido enzimáticamente activo natural cualquier modificación o una combinación de modificaciones para generar enzimas manipuladas, que a continuación se criban mediante diversos métodos para identificar los polipéptidos con una mejora deseada en una propiedad enzimática específica (por ejemplo, actividad enzimática potenciada). Pueden someterse uno o más polinucleótidos que codifican una β-glucosidasa manipulada con una propiedad mejorada a rondas adicionales de tratamientos de mutagénesis para generar polipéptidos con mejoras adicionales en la propiedad enzimática deseada y/o en otras propiedades. Puede determinarse la actividad β-glucosidasa utilizando cualquier ensayo de β-glucosidasa conocido en la técnica, tal como los ensayos de paranitrofenil-β-D-glucopiranósido (pNPG) y celobiosa que se describen más adelante.

En algunas formas de realización, el polipéptido β-glucosidasa puede tener una sustitución, deleción y/o inserción, con respecto a la SEQ ID NO: 3. Pueden realizarse diversas modificaciones conservando al mismo tiempo (o aumentando) la actividad enzimática. Por lo general, el polipéptido β-glucosidasa es sustancialmente idéntico a la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.

En algunas formas de realización, la variante de proteína BGL1 se diferencia de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4 por tener una inserción o uno o más aminoácidos. Tales inserciones pueden ser en el extremo amino terminal, en el extremo carboxilo terminal o en una porción no terminal de la proteína. En algunas formas de realización, puede insertarse una deleción de 1 a 2, o de 1 ó 2 a 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 residuos de aminoácidos (en el extremo N-terminal, C-terminal y/o una región no terminal de la proteína).

En una forma de realización, la proteína BGL1 comprende sustituciones conservadoras de aminoácidos (con respecto a la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4) en una o más posiciones. El concepto de sustitución conservadora es bien conocido y se describe en el presente documento. La presente invención incluye variantes modificadas de manera conservadora de las β-glucosidasas descritas en el presente documento. Estas variantes tienen sustituciones conservadoras realizadas en sus secuencias de aminoácidos. Los ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina, prolina, cisteína y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que normalmente no modifican la actividad específica son conocidas en la técnica y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en "The Proteins", Academic Press, Nueva York. Los intercambios que se producen con más frecuencia son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly así como éstos a la inversa.

En algunas formas de realización, las variantes de polipéptidos β-glucosidasa de la presente invención incluyen sustituciones de un pequeño porcentaje, por lo general menos de un 5%, más generalmente menos de un 2%, y con frecuencia menos de un 1% de los aminoácidos de la secuencia polipeptídica, por ejemplo, con un aminoácido seleccionado de manera conservadora del mismo grupo de sustitución conservadora.

En algunas formas de realización, la variante de BGL1 incluye secuencias adicionales. La adición de secuencias que no modifican la actividad codificada de una β-glucosidasa, tal como la adición de una secuencia no funcional o no codificante, se considera una variación conservadora del polipéptido/polinucleótido β-glucosidasa. Por ejemplo, la β-glucosidasa puede estar unida a un epítopo de identificación o a otra secuencia útil para la purificación de la β-glucosidasa.

Péptido señal

En general, los polipéptidos β-glucosidasa son secretados por la célula hospedadora en la que se expresan (por ejemplo, C1) y se expresan como una preproteína que incluye un péptido señal, es decir, una secuencia de aminoácidos unida al extremo amino terminal de un polipéptido y que dirige al polipéptido codificado a la vía secretora de la célula. En una forma de realización, el péptido señal es el péptido señal de C1 β-glucosidasa endógeno que tiene la secuencia que se expone como SEQ ID NO: 6. En otras formas de realización, se utilizan péptidos señal de otras proteínas secretadas por C1.

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Pueden utilizarse otros péptidos señal, dependiendo de la célula hospedadora y de otros factores. Las regiones codificantes del péptido señal eficaces para las células hospedadora de hongos filamentosos incluyen pero no se limitan a las regiones codificantes del péptido señal obtenidas de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y celobiohidrolasa II de T. reesei. Por ejemplo, puede utilizarse una secuencia de C1 BGL1 con diversos péptidos señal de hongos filamentosos conocidos en la técnica. Los péptidos señal útiles para las células hospedadoras de levadura también incluyen aquellos de los genes para el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Se describen todavía otras regiones codificantes del péptido señal útiles en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488. Las regiones codificantes del péptido señal eficaces para las células hospedadoras bacterianas son las regiones codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para la amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, β-lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y prsA de Bacillus subtilis. Se describen otros péptidos señal en Simonen y Palva, 1993, Microbiol Rev 57: 109-137. Las variantes de estos péptidos señal y otros péptidos señal resultan adecuadas.

Actividad β-glucosidasa

Las proteínas β-glucosidasa utilizadas en el método de la invención son enzimáticamente activas o son precursoras de la proteína enzimáticamente activa. Puede determinarse la actividad β-glucosidasa mediante métodos conocidos en la técnica. En una forma de realización, la actividad β-glucosidasa se determina utilizando un ensayo de para-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (pNPG). En una forma de realización, la actividad β-glucosidasa se determina utilizando un ensayo de celobiosa. Por lo general un polipéptido β-glucosidasa enzimáticamente activo tiene al menos un 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO: 3.

Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo colorimétrico basado en pNPG (p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido) para medir la actividad β-glucosidasa. Uno de tales ensayos se describe en el Ejemplo 5, más adelante. En otro ensayo de pNPG ejemplar, en un volumen total de 100 µl, se añaden 20 µl de sobrenadante del medio transparente que contiene la enzima β-glucosidasa a una solución de pNPG 4 mM (Sigma-Aldrich, Inc. St. Louis, MO) en tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5. Las reacciones se incuban a pH 6,5, 45°C durante 1 hora. La mezcla de reacción se inactiva con 100 µl de solución pH 11 de carbonato de sodio 1 M. Se mide la absorbancia de la solución a 405 nm para determinar la conversión del pNPG en p-nitrofenol. Se mide la liberación de p-nitrofenol (ε = 17.700 M-1 cm-1) a 405 nm para calcular la actividad β-glucosidasa. Se observa actividad β-glucosidasa detectable en condiciones de cribado de alto rendimiento (pH 7, 50°C). Véase Breves et al. (1997) Appl. Environmental Microbiol. 63: 3902.

Como alternativa, puede determinarse la actividad β-glucosidasa utilizando un ensayo de celobiosa, que utiliza celobiosa como sustrato. En un volumen total de 100 µl, se añaden 25 µl de sobrenadante del medio transparente que contiene la enzima β-glucosidasa a 10 g/l de celobiosa (Fluka Cat. Nº 22150, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) en tampón de fosfato de sodio 100 mM (pH 6-7) o tampón de acetato de sodio (pH 5-5,5). Se incuba la reacción a 45°C-70°C durante un tiempo apropiado (de 25 minutos a toda la noche en función de la concentración de enzima) mientras se agita. Se determina la producción de glucosa utilizando un ensayo de glucosa enzimático (K-GLUC, Megazyme, Irlanda). Se añaden 10 µl de cada reacción a 190 µl de reactivo GOPOD (suministrado como parte del kit de ensayo K-GLUC). Se incuba la reacción a 45°C durante 20 minutos y se mide la absorbancia de la solución a 510 nm. El reactivo GOPOD contiene tampón de fosfato de potasio 50 mM pH 7,4, ácido p-hidroxibenzoico 0,011 M, azida de sodio al 0,008% p/v, glucosa oxidasa (>12.000 U/l), peroxidasa (>650 U/l) y 80 mg/l de 4-aminoantipirina. La enzima glucosa oxidasa en el reactivo reacciona con cualquier glucosa presente en la muestra y produce peróxido de hidrógeno que, a continuación, reacciona con la 4-aminoantipirina para producir un colorante quinoneimina en cantidades proporcionales a la cantidad de glucosa presente y que puede medirse mediante espectrofotometría a 510 nm.

IV. POLINUCLEÓTIDOS β-GLUCOSIDASA Y SISTEMAS DE EXPRESIÓN

La presente invención proporciona secuencias polinucleotídicas que codifican C1 β-glucosidasa (es decir, las SEQ ID NO: 3 y 4), así como el péptido señal de C1 β-glucosidasa (SEQ ID NO: 6). Las secuencias genómica y de ADNc de C1 que codifican β-glucosidasa se exponen como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente. La secuencia de ADNc que codifica el péptido señal de C1 β-glucosidasa es la secuencia del nucleótido 1 al 57 de la SEQ ID NO: 2. Los expertos en la materia entenderán fácilmente que debido a la degeneración del código genético, existe una multitud de secuencias nucleotídicas que codifican polipéptidos β-glucosidasa de la presente invención. La Tabla 2 proporciona el código genético en tripletes convencional para cada aminoácido. Por ejemplo, los codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG y CGU codifican todos ellos el aminoácido arginina. Por lo tanto, en cada posición en los ácidos nucleicos de la invención en la que una arginina esté especificada por un codón, el codón puede cambiarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos anteriormente sin modificar el polipéptido codificado. Se entiende que U en una secuencia de ARN corresponde a T en una secuencia de ADN. La invención contempla y proporciona todas y cada una de las posibles variaciones de secuencia de ácido nucleico que codifica

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un polipéptido de la invención que podrían realizarse seleccionando combinaciones basadas en posibles elecciones de codones.

También puede diseñarse una secuencia de ADN para los codones con alta preferencia de uso de codones (codones que se utilizan con mayor frecuencia en las regiones codificantes de la proteína que otros codones que codifican el mismo aminoácido). Pueden determinarse los codones preferentes con relación al uso de codones en un único gen, un conjunto de genes de origen o función común, genes altamente expresados, la frecuencia de codones en el conjunto de las regiones codificantes de la proteína de todo el organismo, la frecuencia de codones en el conjunto de las regiones codificantes de la proteína de organismos relacionados, o combinaciones de las mismas. Los codones cuya frecuencia aumenta en función del nivel de expresión génica son por lo general los codones óptimos para la expresión. En particular, puede optimizarse una secuencia de ADN para la expresión en un organismo hospedador particular. Las referencias que proporcionan información de preferencia para una gran variedad de organismos están fácilmente disponibles. Véase, por ejemplo, Henaut y Danchin en "Escherichia Salmonella", Neidhardt, et al. Eds., ASM Pres, Washington D.C. (1996), págs. 2047-2066. Con fines de ilustración, y no de limitación, la Figura 5 muestra una secuencia polinucleotídica que codifica C1 BGL1 diseñada con preferencia codónica para la expresión en Saccharomyces cerevisiae.

TABLA 2: CÓDIGO GENÉTICO

Aminoácido Alanina Cisteína Ácido aspártico Ácido glutámico Fenilalanina Glicina Histidina Isoleucina Lisina Leucina Metionina Asparagina Prolina Glutamina Arginina Serina Treonina Valina Triptófano Tirosina

Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y Codón GCA GCC GCG GCU UGC UGU GAC GAU GAA GAG UUC UUU GGA GGC GGG GGU CAC CAU AUA AUC AUU AAA AAG UUA UUG CUA CUC CUG CUU AUG AAC AAU CCA CCC CCG CCU CAA CAG AGA AGG CGA CGC CGG CGU AGC AGU UCA UCC UCG UCU ACA ACC ACG ACU GUA GUC GUG GUU UGG UAC UAU

Se conocen diversos métodos para determinar la frecuencia de codones (por ejemplo, uso de codones, uso relativo de codones sinónimos) y la preferencia codónica en organismos específicos, incluido el análisis multivariante, por ejemplo, que utiliza el análisis por conglomerados o el análisis de correspondencias, y el número efectivo de codones utilizados en un gen (véase GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; Codon W, John Peden, Universidad de Nottingham; McInerney, J. O, 1998, Bioinformatics. 14: 372-73; Stenico et al., 1994, Nucleic Acids Res. 222437-46; Wright, F., 1990, Gene 87: 23-29; Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118; Nakamura et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28: 292; Henaut y Danchin, "Escherichia coli and Salmonella", 1996, Neidhardt, et al. Eds, ASM Press, Washington D.C., p. 2047-2066). La fuente de datos para obtener el uso de codones puede basarse en cualquier secuencia nucleotídica disponible capaz de codificar una proteína. Estos conjuntos de datos incluyen secuencias de ácidos nucleicos que se sabe codifican realmente proteínas expresadas (por ejemplo, secuencias codificantes de proteínas completas -CDS), marcadores de secuencia expresada (EST), o regiones codificantes predichas de secuencias genómicas (véase, por ejemplo, Mount, D., Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, capítulo 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; Uberbacher, E. C., 1996, Methods Enzymol. 266:259-281; Tiwari et al., 1997, Comput. Appl. Biosci. 13:263-270).

Vectores de expresión

La presente invención utiliza constructos recombinantes que comprenden una secuencia que codifica una β-glucosidasa como se ha descrito anteriormente. En un aspecto particular, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido β-glucosidasa unido operativamente a un promotor heterólogo. Los vectores de expresión de la presente invención pueden utilizarse para transformar una célula hospedadora apropiada para permitir que el hospedador exprese la proteína β-glucosidasa. Los métodos para la expresión recombinante de proteínas en hongos y otros organismos son bien conocidos en la técnica, y se dispone de o pueden construirse una serie de vectores de expresión utilizando métodos de rutina. Véase, por ejemplo, Tkacz y

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Lange, 2004, ADVANCES IN FUNGAL BIOTECHNOLOGY FOR INDUSTRY, AGRICULTURE, AND MEDICINE, KLUWER ACADEMIC/PLENUM PUBLISHERS. Nueva York; Zhu et al., 2009, Construction of two Gateway vectors for gene expression in fungi Plasmid 6:128-33; Kavanagh, K. 2005, FUNGI: BIOLOGY AND APPLICATIONS Wiley.

Los constructos de ácido nucleico de la presente invención comprenden un vector, tal como un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), y similares, en los que se ha insertado una secuencia de ácido nucleico de la invención. Los polinucleótidos de la presente invención pueden incorporarse en cualquiera de diversos vectores de expresión adecuados para la expresión de un polipéptido. Los vectores adecuados incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, de la pseudorrabia, adenovirus, virus adenoasociado, retrovirus y muchos otros. Puede utilizarse cualquier vector que transduzca material genético a una célula, y, si se desea la replicación, que sea replicable y viable en el hospedador pertinente.

En un aspecto, preferente de esta forma de realización, el constructo comprende adicionalmente secuencias reguladoras, incluido, por ejemplo, un promotor, unido operativamente a la secuencia codificante de proteína. Los expertos en la materia conocen un gran número de vectores y promotores adecuados.

Constructos de promotor/gen

Tal como se ha analizado anteriormente, para obtener altos niveles de expresión en un hospedador particular, con frecuencia resulta útil expresar C1 β-glucosidasa bajo el control de un promotor heterólogo (tal como el promotor del gen C1 cbh1a). Por lo general, puede unirse operativamente una secuencia promotora a la región 5’ de la secuencia codificante de C1 β-glucosidasa. Se reconocerá que en la generación de un constructo de este tipo no es necesario definir los límites de un promotor mínimo. En su lugar, la secuencia de ADN en sentido 5’ respecto al codón de inicio de la C1 β-glucosidasa puede sustituirse con la secuencia de ADN que está en sentido 5' respecto al codón de inicio de un determinado gen heterólogo (por ejemplo, cbh1a). Esta secuencia 5’ "heteróloga" incluye por lo tanto, además de los elementos promotores per se, una señal de inicio de la transcripción y la secuencia de la porción 5' no traducida del ARNm quimérico transcrito. Por lo tanto, el constructo de promotor-gen y el ARNm resultante comprenderán una secuencia que codifica β-glucosidasa y una secuencia 5’ heteróloga cadena arriba del codón de inicio de la secuencia que codifica β-glucosidasa. En algunos, pero no todos, los casos la secuencia 5’ heteróloga empalmará inmediatamente el codón de inicio de la secuencia que codifica β-glucosidasa.

Las SEQ ID NO: 13 y 15 representan la secuencia del gen inmediatamente en sentido 5’ respecto al codón de inicio de la preproteína C1 BGL1 natural, y las SEQ ID NO: 14, 16 y 17 son fragmentos de la SEQ ID NO: 13 que terminan un poco cadena arriba del codón de inicio. En una forma de realización, la C1 β-glucosidasa recombinante se expresa a partir de un gen recombinante como una preproteína que incluye el péptido señal de BGL1 natural, y la secuencia del gen recombinante en sentido 5’ respecto al codón de inicio de β-glucosidasa no es la SEQ ID NO: 13. En términos más generales, la SEQ ID NO: 14 no se encuentra dentro de las 100 bases en sentido 5’ respecto al codón de inicio de β-glucosidasa en la secuencia recombinante. Es decir, el gen de la β-glucosidasa recombinante codifica un ARN que comprende una secuencia que codifica la SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma, pero no comprende una secuencia no traducida 5’ que contiene la SEQ ID NO: 13, o, como alternativa, no comprende la SEQ ID NO: 14 o no comprende la SEQ ID NO: 15. En otras formas de realización la secuencia no traducida 5’ no contiene la SEQ ID NO: 15, o, como alternativa, la SEQ ID NO: 16, o, como alternativa, la SEQ ID NO: 17.

En una forma de realización del constructo génico de la presente invención, la C1 β-glucosidasa se expresa a partir del constructo como una preproteína con un péptido señal heterólogo, en el que, en el constructo, la SEQ ID NO: 13 no está en sentido 5’ con respecto al codón de inicio del péptido señal heterólogo. En términos más generales, en el constructo, la SEQ ID NO: 14 no se encuentra dentro de las 100 bases en sentido 5’ respecto al codón de inicio del péptido señal heterólogo. Es decir, el constructo génico de β-glucosidasa recombinante codifica un ARN que comprende una secuencia que codifica la SEQ ID NO: 3, o una variante de la misma y un péptido señal heterólogo, pero no comprende una secuencia no traducida 5’ que contiene la SEQ ID NO: 13. En otras formas de realización la secuencia no traducida 5’ no contiene la SEQ ID NO: 14, o, como alternativa, no contiene la SEQ ID NO: 15, o, como alternativa, no contiene la SEQ ID NO: 16, o, como alternativa, no contiene la SEQ ID NO: 17.

En algunas formas de realización, el promotor heterólogo está unido operativamente a una secuencia genómica de C1 β-glucosidasa que comprende la SEQ ID NO: 18, que es la secuencia del intrón 1 de bgl1.

En algunas formas de realización, el promotor heterólogo está unido operativamente a una secuencia de ADNc de C1 β-glucosidasa y no comprende la SEQ ID NO: 19 (secuencia intrónica) y/o no comprende una secuencia de aminoácidos codificada en la SEQ ID NO: 19.

En algunas formas de realización, el constructo incluye la SEQ ID NO: 20 (el primer exón de C1 β-glucosidasa) y/o la secuencia de aminoácidos codificada en la SEQ ID NO: 20.

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En algunas formas de realización, el constructo incluye la SEQ ID NO: 21.

Los ejemplos de promotores útiles para la expresión de polinucleótidos β-glucosidasa incluyen promotores fúngicos. Por ejemplo, pueden utilizarse secuencias promotoras que dirigen la expresión de genes distintos del gen de β-glucosidasa 1 en C1. Por ejemplo, puede utilizarse un promotor fúngico de un gen que codifica celobiohidrolasa. En una forma de realización, se utiliza el promotor asociado con el gen de C1 celobiohidrolasa 1 (cbh1a). En la figura 4 se proporciona una secuencia promotora asociada con cbh1a. Véase también la publicación PCT WO 01/79507 y la publicación de patente de EE.UU. US 2003/0187243, que proporcionan la secuencia de ADN del gen de C1 CBH1a completo, incluidas las secuencias promotora y terminadora.

Se comprenderá que puede utilizarse una subsecuencia de la SEQ ID NO: 8 o una variante del promotor de CBH1a para dirigir la expresión de β-glucosidasa. En determinadas formas de realización, el promotor heterólogo unido operativamente a la secuencia que codifica β-glucosidasa comprende la SEQ ID NO: 8, una subsecuencia de la SEQ ID NO: 8 con actividad promotora o una secuencia de ADN capaz de hibridar con el complemento de la SEQ ID NO: 8 y que tiene actividad promotora. Puede identificarse una subsecuencia de la SEQ ID NO: 8 con actividad promotora utilizando métodos bien conocidos. En un enfoque, se une una supuesta secuencia promotora en sentido 5’ respecto a una secuencia que codifica una proteína indicadora, se transfecta el constructo a la célula hospedadora (por ejemplo, C1) y se mide el nivel de expresión del indicador. La expresión del indicador puede determinarse midiendo, por ejemplo, los niveles de ARNm de la secuencia indicadora, una actividad enzimática de la proteína indicadora, o la cantidad de proteína indicadora producida. Por ejemplo, la actividad promotora puede determinarse utilizando la proteína fluorescente verde como secuencia codificante (Henriksen et al., 1999, Microbiology 145: 729-34) o un gen indicador lacZ (Punt et al., 1997, Gene, 197: 189-93). Pueden derivarse promotores funcionales a partir de secuencias promotoras naturales mediante métodos de evolución dirigida. Véase, por ejemplo, Wright et al., 2005, Human Gene Therapy, 16: 881-892. En algunas formas de realización, el ADN del promotor comprende los nucleótidos 1 a 1817 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 100 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 200 a 1800 de la SEQ ID NO: 6, los nucleótidos 300 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 400 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 500 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 600 a 1800 de la SEQ ID NO.: 8, los nucleótidos 700 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 800 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 900 a 1800 de la SEQ ID NO: 8; los nucleótidos 1000 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 1100 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 1200 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 1300 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 1400 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 1500 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 1600 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, los nucleótidos 1700 a 1800 de la SEQ ID NO: 8, o es un polinucleótido que hibrida en condiciones de baja rigurosidad con el complemento de la secuencia o subsecuencia identificada anteriormente, hibrida preferentemente en condiciones de rigurosidad media y lo más preferentemente hibrida en condiciones de alta rigurosidad.

Los ejemplos de otros promotores adecuados útiles para dirigir la transcripción de los constructos de nucleótidos de la presente invención en una célula hospedadora de hongo filamentos son promotores obtenidos a partir de genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en medio ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae), promotores tales como cbh1, cbh2, egl1, egl2, pepA, hfb1, hfb2, xyn1, amy y glaA (Nunberg et al., Mol Cell Biol., 4: 2306 -2315 (1984), Boel et al., EMBO J. 3: 1581-1585 ((1984) y EPA 137280), y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos. En un hospedador de levadura, los promotores útiles pueden ser de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Se describen otros promotores útiles para células hospedadoras de levadura en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488. Pueden utilizarse promotores asociados con la producción de quitinasa en hongos. Véase, por ejemplo, Blaiseau y Lafay, 1992, Gene 120243-248 (hongo filamentoso Aphanocladium album); Limon et al., 1995, Curr. Genet, 28: 478-83 [Trichoderma harzianum].

Los promotores que se sabe controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus y que pueden utilizarse en algunas formas de realización de la invención incluyen el promotor SV40, el promotor lac

o trp de E. coli, el promotor PL del fago lambda, el promotor tac, promotor de T7, y similares. En las células hospedadoras bacterianas, los promotores adecuados incluyen los promotores obtenidos del operón lac de E. coli, gen de agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, gen de levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, gen de alfaamilasa (amyl) de Bacillus licheniformis, gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gen de alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, genes xylA y xylB de Bacillus subtilis y gen de β-lactamasa procariota.

Un vector de expresión contiene opcionalmente un sitio de unión al ribosoma para la iniciación de la traducción y un terminador de la transcripción, tal como Pinll. El vector también incluye opcionalmente secuencias apropiadas para amplificar la expresión, por ejemplo, un potenciador.

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Además, los vectores de expresión de la presente invención contienen opcionalmente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de las células hospedadoras transformadas. Los genes marcadores adecuados incluyen aquellos que codifican resistencia a antibióticos, tal como resistencia a ampicilina (ampR), kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Otros ejemplos incluyen el antibiótico espectinomicina o estreptomicina (por ejemplo, el gen aada), el gen de estreptomicina fosfotransferasa (SPT) que codifica resistencia a estreptomicina, el gen de neomicina fosfotransferasa (NPTII) que codifica resistencia a kanamicina o a geneticina, el gen de higromicina fosfotransferasa (HPT) que codifica resistencia a higromicina. Los genes marcadores seleccionables adicionales incluyen resistencia a dihidrofolato reductasa o a neomicina para el cultivo de células eucariotas, y resistencia a tetraciclina o a ampicilina en E. coli.

En el Ejemplo 3 se describe un vector de expresión ejemplar para la expresión de polipéptidos β-glucosidasa de la invención, que se presenta más adelante en el presente documento.

Síntesis y manipulación de polinucleótidos β-glucosidasa

Pueden prepararse polinucleótidos que codifican β-glucosidasa utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica. Por lo general, los oligonucleótidos de hasta aproximadamente 40 bases se sintetizan individualmente, a continuación se unen (por ejemplo, mediante métodos de ligación enzimática o química, o métodos mediados por polimerasa) para formar esencialmente cualquier secuencia continua deseada. Por ejemplo, pueden prepararse polinucleótidos de la presente invención mediante síntesis química utilizando, por ejemplo, el clásico método de la fosforamidita descrito por Beaucage, et al., 1981, Tetrahedron Letters, 22:1859-1869, o el método descrito por Matthes, et al., 1984, EMBO J. 3:801-05. Estos métodos se ponen en práctica por lo general en métodos de síntesis automatizados. Según el método de la fosforamidita, los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, se purifican, hibridan, ligan y clonan en vectores apropiados.

Además, puede encargarse esencialmente cualquier ácido nucleico a cualquiera de diversas fuentes comerciales, tales como The Midland Certified Reagent Company (Midland, TX), The Great American Gene Company (Ramona, CA), ExpressGen Inc. (Chicago, IL), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA), y muchos otros.

Los polinucleótidos también pueden sintetizarse mediante técnicas bien conocidas como se describe en la literatura técnica. Véase, por ejemplo, Carruthers, et al., 1982, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 47:411-18 y Adams et al., 1983, J. Am. Chem. Soc. 105:661. A continuación, pueden obtenerse fragmentos de ADN bicatenario ya sea sintetizando la hebra complementaria e hibridando las hebras juntas en condiciones apropiadas, o añadiendo la hebra complementaria utilizando ADN polimerasa con una secuencia de cebador apropiada.

Los textos generales que describen técnicas de biología molecular que son útiles en el presente documento, que incluyen el uso de vectores, promotores, protocolos suficientes para dirigir a los expertos a través de métodos de amplificación in vitro, incluida la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR), y muchos otros métodos pertinentes, incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning -A Laboratory Manual (2ª ed.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (con suplementos hasta 1999) ("Ausubel"). Se hace referencia a Berger, Sambrook y Ausubel, así como a Mullis et al., (1987) patente de Estados Unidos Nº 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim y Levinson (1 de octubre de 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3, 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86, 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem. 35, 1826; Landegren et al., (1988) Science 241, 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8, 291-294; Wu y Wallace, (1989) Gen 4, 560; Barringer et al. (1990) Gen 89, 117, y Sooknanan y Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. Se describen métodos para la clonación in vitro de ácidos nucleicos amplificados en Wallace et al., patente de Estados Unidos Nº 5.426.039.

Hospedadores de expresión

La presente invención también proporciona células hospedadoras manipuladas (recombinantes) que se transforman con un vector de expresión o constructo de ADN que codifica β-glucosidasa. Opcionalmente, la expresión de β-glucosidasa en la célula está bajo el control de un promotor heterólogo. Las células hospedadoras de la invención pueden utilizarse para producir polipéptidos β-glucosidasa. Por lo tanto, la presente invención se refiere a una célula hospedadora que comprende cualquier polinucleótido β-glucosidasa de la presente invención que se haya descrito anteriormente en el presente documento. Tal como se utiliza en el presente documento, una célula hospedadora genéticamente modificada o recombinante incluye la progenie de dicha célula hospedadora que comprende un polinucleótido β-glucosidasa que codifica un polipéptido recombinante de la invención. En algunas formas de realización, la célula hospedadora genéticamente modificada o recombinante es una célula eucariota. Las células hospedadoras eucariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células fúngicas, células de algas, células de insectos y células vegetales. En algunos casos, las células hospedadoras pueden modificarse para

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aumentar la expresión, secreción o estabilidad de las proteínas, o para conferir otras características deseadas. Las células (por ejemplo, de hongos) que se han mutado o seleccionado para que tengan baja actividad proteasa son particularmente útiles para la expresión. Por ejemplo, pueden utilizarse cepas C1 en las que se ha delecionado o alterado el locus alp1 (proteasa alcalina).

Las células hospedadoras fúngicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Ascomycota, Basidiomycota, Deuteromycota, Zygomycota, Fungi imperfecti. Las células hospedadoras fúngicas particularmente preferentes son células de levadura y células de hongos filamentosos. Las células hospedadoras de hongos filamentosos de la presente invención incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina y Oomycota (véase, por ejemplo, Hawksworth et al., En Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8ª edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido). Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo con una pared celular compuesta por quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos. Las células hospedadoras de hongos filamentosos de la presente invención son morfológicamente distintas de la levadura.

En una forma de realización, la célula hospedadora es una célula C1. En una forma de realización, la célula hospedadora es una célula de una especie de Myceliophthora, tal como Myceliophthora thermophila. En algunas formas de realización, la célula hospedadora de hongo filamentoso puede ser una célula de una especie de, pero no limitada a, Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Trametes, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella o teleomorfos

o anamorfos y sinónimos o equivalentes taxonómicos de las mismas. En algunas formas de realización, la célula hospedadora es una célula distinta de C1 o distinta de una especie de Myceliophthora.

En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de especies de Aspergillus, especies de Ceriporiopsis, especies de Chrysosporium, especies de Corynascus, especies de Fusarium, especies de Humicola, especies de Neurospora, especies de Penicillium, especies de Tolypocladium, especies de Tramates, o especies de Trichoderma.

En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de especies de Trichoderma, por ejemplo, T. longibrachiatum, T. viride (por ejemplo, ATCC 32098 y 32086), Hypocrea jecorina o T. reesei (NRRL 15709, ATTC 13631, 56764, 56765, 56466, 56767 y RL-P37 y derivados de las mismas -Véase Sheir-Neiss et al., 1984, Appl. Microbiol. Biotechnology, 20:46-53), T. koningii,y T. harzianum. Además, el término "Trichoderma" se refiere a cualquier cepa fúngica que se haya clasificado anteriormente como Trichoderma

o que se clasifica actualmente como Trichoderma.

En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de especies de Aspergillus, por ejemplo, A. awamori, A. funigatus, A. japonicus, A. nidulans, A. niger, A. aculeatus, A. foetidus, A. oryzae, A. sojae, y A. kawachi. (Se hace referencia a Kelly y Hynes, 1985, EMBO J. 4,475479; NRRL 3112, ATCC 11490, 22342, 44733 y 14331; Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 81, 1470-1474; Tilburn et al., 1982, Gene 26,205-221; y Johnston et al., 1985, EMBO J. 4, 1307 -1311).

En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de especies de Fusarium, por ejemplo, F. bactridioides, F. cerealis, F. crookwellense, F. culmorum, F. graminearum, F. graminum. F. oxysporum, F. roseum,y F.venenatum. En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de especies de Neurospora, por ejemplo, N. crassa. Se hace referencia a Case, M.E. et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 76, 5259-5263; USP 4.486.553; y Kinsey, J.A. y J.A. Rambosek (1984) Molecular and Cellular Biology 4, 117-122. En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de especies de Humicola, por ejemplo, H. insolens, H. grisea,y H. lanuginosa. En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de especies de Mucor, por ejemplo, M. miehei y M. circinelloides. En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de especies de Rhizopus, por ejemplo, R. oryzae y R. niveus. En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de especies de Penicillum, por ejemplo, P. purpurogenum, P. chrysogenum y P. verruculosum. En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de especies de Thielavia, por ejemplo, T. terrestris. En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de especies de Tolypocladium, por ejemplo, T. inflatum y T. geodes. En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de especies de Trametes, por ejemplo, T. villosa y T. versicolor.

En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es de especies de Chrysosporium, por ejemplo, C. lucknowense, C. keratinophilum, C. tropicum, C. merdarium, C. inops,

C. pannicola, y C. zonatum. En una forma de realización particular, el hospedador es C. lucknowense.

En la presente invención, una célula hospedadora de levadura puede ser una célula de una especie de, pero no limitada a, Candida, Hansenula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, y Yarrowia.

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En algunas formas de realización de la invención, la célula de levadura es Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia kodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia quercuum, Pichia pijperi, Pichia stipitis, Pichia methanolica, Pichia angusta, Kluyveromyces lactis, Candida albicans, y Yarrowia lipolytica.

En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora es de alga tal como, Chlamydomonas (por ejemplo, C. reinhardtii)y Phormidium (P. sp. ATCC29409).

En otras formas de realización, la célula hospedadora es una célula procariota. Las células procariotas adecuadas incluyen células de bacterias gram positivas, gram negativas y gram variables. La célula hospedadora puede ser una especie de, pero no limitada a, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Acinetobacter, Acidothermus, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Brevibacterium, Butyrivibrio, Buchnera, Campestris, Campylobacter, Clostridium, Corynebacterium, Chromatium, Coprococcus, Escherichia, Enterococcus, Enterobacter, Erwinia, Fusobacterium, Faecalibacterium, Francisella, Flavobacterium, Geobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Ilyobacter, Micrococcus, Microbacterium, Mesorhizobium, Methylobacterium, Mycobacterium, Neisseria, Pantoea, Pseudomonas, Prochlorococcus, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Roseburia, Rhodospirillum, Rhodococcus, Scenedesmus, Streptomyces, Streptococcus, Synecoccus, Saccharomonospora, Staphylococcus, Serratia, Salmonella, Shigella, Thermoanaerobacterium, Tropheryma, Tularensis, Temecula, Thermosynechococcus, Thermococcus, Ureaplasma, Xanthomonas, Xylella, Yersinia y Zymomonas.

En algunas formas de realización, la célula hospedadora es una especie de Agrobacterium, Acinetobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Buchnera, Geobacillus, Campylobacter, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Enterococcus, Erwinia, Flavobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Pantoea, Pseudomonas, Staphylococcus, Salmonella, Streptococcus, Streptomyces,y Zymomonas.

En otras formas de realización más, la cepa hospedadora bacteriana no es patógena para los seres humanos. En algunas formas de realización, la cepa hospedadora bacteriana es una cepa industrial. Se conocen y son adecuadas en la presente invención numerosas cepas industriales bacterianas.

En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora bacteriana es de especies de Agrobacterium, por ejemplo, A. radiobacter, A. rhizogenes y A. rubi. En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora bacteriana es de especies de Arthrobacter, por ejemplo, A. aurescens, A. citreus,

A. globformis, A. hydrocarboglutamicus, A. mysorens, A. nicotianae, A. paraffineus, A. protophonniae, A. roseoparqffinus, A. sulfureus,y A. ureafaciens. En algunas formas de realización de la invención, la célula hospedadora bacteriana es de especies de Bacillus, por ejemplo, B. thuringiensis, B. anthracis, B. megaterium, B. subtilis, B. lentus, B. circulans, B. pumilus, B. lautus, B.coagulans, B. brevis, B. firmus, B. alkaophius, B. licheniformis, B. clausii, B. stearothermophilus, B. halodurans y B. amyloliquefaciens. En formas de realización particulares, la célula hospedadora será una cepa de Bacillus industrial incluida, pero no limitada a, B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis, B. megaterium, B. clausii, B. stearothermophilus y B. amyloliquefaciens. Algunas formas de realización preferentes de una célula hospedadora de Bacillus incluyen B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. stearothermophilus y B. amyloliquefaciens. En algunas formas de realización, la célula hospedadora bacteriana es de especies de Clostridium, por ejemplo, C. acetobutylicum, C. tetani E88, C. lituseburense, C. saccharobutylicum,

C. perfringens, C. y beijerinckii. En algunas formas de realización, la célula hospedadora bacteriana es de especies de Corynebacterium, por ejemplo, C. glutamicum y C. acetoacidophilum. En algunas formas de realización, la célula hospedadora bacteriana es de especies de Escherichia, por ejemplo, E. coli. En algunas formas de realización, la célula hospedadora bacteriana es de especies de Erwinia, por ejemplo, E. uredovora, E. carotovora, E. ananas, E. herbicola, E. punctata,y E. terreus. En algunas formas de realización, la célula hospedadora bacteriana es de especies de Pantoea, por ejemplo, P. citrea y P. agglomerans. En algunas formas de realización, la célula hospedadora bacteriana es de especies de Pseudomonas, por ejemplo, P. putida, P. aeruginosa, P. mevalonii y P. sp. D-0l 10. En algunas formas de realización, la célula hospedadora bacteriana es de especies de Streptococcus, por ejemplo, S. equisimiles, S. pyogenes y S. uberis. En algunas formas de realización, la célula hospedadora bacteriana es de especies de Streptomyces, por ejemplo, S. ambofaciens, S. achromogenes, S. avermitilis, S. coelicolor, S. aureofaciens, S. aureus, S. fungicidicus, S. griseus y S. lividans. En algunas formas de realización, la célula hospedadora bacteriana es de especies de Zymomonas, por ejemplo, Z. mobilis y Z. lipolytica.

Las cepas que pueden utilizarse en la práctica de la invención, incluidas cepas procariotas y eucariotas, son fácilmente accesibles al público a partir de varias colecciones de cultivos tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y el Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Las células hospedadoras pueden modificarse genéticamente para que tengan características que mejoren la secreción de proteínas, la estabilidad de las proteínas u otras propiedades deseables para la expresión y/o secreción de una proteína. La modificación genética puede conseguirse mediante técnicas de ingeniería genética o

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utilizando técnicas microbiológicas clásicas, tales como mutagénesis química o por UV y selección posterior. Puede utilizarse una combinación de técnicas de selección clásica y de modificación recombinante para producir el organismo de interés. Utilizando la tecnología recombinante, pueden introducirse, delecionarse, inhibirse o modificarse moléculas de ácido nucleico, de modo que dé como resultado un aumento de los rendimientos de β-glucosidasa dentro del organismo o en el cultivo. Por ejemplo, la desactivación génica de la función de Alp1 da como resultado una célula que no expresa la mayoría de o todas las celulasas. La desactivación génica de la función de pyr5 da como resultado una célula con un fenotipo deficiente en pirimidina.

Transformación

La introducción de un vector o constructo de ADN en una célula hospedadora puede efectuarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, electroporación, u otras técnicas comunes (véase Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology). Se describe un método para la transformación de células hospedadoras C1 en el Ejemplo 4, que se presenta más adelante. La transformación de células hospedadoras C1 es conocida en la técnica (véase, por ejemplo, el documento US 2008/0194005).

Condiciones de cultivo

Las células hospedadoras manipuladas pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según resulte apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar el polinucleótido β-glucosidasa. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las utilizadas anteriormente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para los expertos en la materia. Como se ha señalado, se dispone de muchas referencias para el cultivo y la producción de muchas células, incluidas células de origen bacteriano, vegetal, animal (especialmente de mamíferos) y arquebacteriano. Sambrook, Ausubel y Berger (todos supra), así como Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, Nueva York y las referencias citadas en los mismos; Doyle y Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, cuarta edición, W.H. Freeman and Company; y Ricciardelli, et al., (1989) In vitro Cell Dev. Biol. 25:10161024. Para el cultivo y regeneración de células vegetales, Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY; Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nueva York); Jones, ed. (1984) Plant Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey y Plant Molecular Biology (1993) R.R.D. Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, Reino Unido. ISBN 0 12 198370 6. Los medios de cultivo celular en general se establecen en Atlas y Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL. Se encuentra información adicional para el cultivo celular en la literatura disponible en el mercado, tal como el Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) de Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, MO) ("Sigma-LSRCCC") y, por ejemplo, The Plant Culture Catalogue y suplemento (1997) también de Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, MO) ("Sigma-PCCS").

Las condiciones de cultivo para las células hospedadoras C1 son conocidas en la técnica y pueden ser determinadas fácilmente por un experto. Véanse, por ejemplo, los documentos US 2008/0194005, US 20030187243, WO 2008/073914 y WO 01/79507.

En algunas formas de realización, las células que expresan los polipéptidos β-glucosidasa de la invención se cultivan en condiciones de fermentación discontinua o continua. La fermentación discontinua clásica es un sistema cerrado, en el que las composiciones del medio se establecen al comienzo de la fermentación y no está sujeta a alternancias artificiales durante la fermentación. Una variación del sistema discontinuo es una fermentación alimentada que también se utiliza en la presente invención. En esta variación, el sustrato se añade en incrementos a medida que avanza la fermentación. Los sistemas semicontinuos son útiles cuando es probable que la represión catabólica inhiba el metabolismo de las células y cuando resulta deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. Las fermentaciones discontinua y alimentada son comunes y bien conocidas en la técnica. La fermentación continua es un sistema abierto en el que se añade continuamente un medio de fermentación definido a un biorreactor y se elimina simultáneamente una cantidad igual de medio acondicionado para el procesamiento. La fermentación continua mantiene generalmente los cultivos a una alta densidad constante en la que las células se encuentran principalmente en la fase de crecimiento logarítmico. Los sistemas de fermentación continua procuran mantener condiciones de crecimiento en estado estacionario. Los métodos para la modulación de nutrientes y factores de crecimiento para los procesos de fermentación continua así como las técnicas para maximizar la velocidad de formación de producto son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial.

También pueden emplearse sistemas de transcripción/traducción sin células para producir polipéptidos β-glucosidasa utilizando los polinucleótidos de la presente invención. Varios de tales sistemas están disponibles en el mercado. Se encuentra una guía general de protocolos de transcripción y traducción in vitro en Tymms (1995) In vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology, volumen 37, Garland Publishing, NY.

V. PRODUCCIÓN Y RECUPERACIÓN DE POLIPÉPTIDOS β-GLUCOSIDASA

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La presente invención se refiere a un método para producir un polipéptido con actividad β-glucosidasa, comprendiendo el método proporcionar una célula hospedadora transformada con cualquiera de los polinucleótidos β-glucosidasa descritos de la presente invención; cultivar la célula hospedadora transformada en un medio de cultivo en condiciones en las que la célula hospedadora expresa el polipéptido β-glucosidasa codificado; y, opcionalmente, recuperar o aislar el polipéptido β-glucosidasa expresado, o recuperar o aislar el medio de cultivo que contiene el polipéptido β-glucosidasa expresado. El método proporciona adicionalmente de manera opcional lisar las células hospedadoras transformadas después de que hayan expresado el polipéptido β-glucosidasa codificado y, opcionalmente, recuperar o aislar el polipéptido β-glucosidasa expresado a partir del lisado celular. La presente invención proporciona adicionalmente un método para producir un polipéptido β-glucosidasa, comprendiendo dicho método cultivar una célula hospedadora transformada con un polinucleótido β-glucosidasa en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido β-glucosidasa y recuperar el polipéptido β-glucosidasa. En una forma de realización adicional, la presente invención proporciona un método para sobreexpresar (es decir, producir) un polipéptido C1 β-glucosidasa que comprende: (a) proporcionar una célula hospedadora C1 recombinante que comprende un constructo de ácido nucleico, en el que el constructo de ácido nucleico comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una C1 β-glucosidasa madura de la presente invención y el constructo de ácido nucleico también comprende opcionalmente una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal en el extremo amino terminal de dicha β-glucosidasa madura, en el que la secuencia polinucleotídica que codifica la C1 β-glucosidasa madura y el péptido señal opcional está unida operativamente a un promotor heterólogo; y (b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en condiciones en las que la célula hospedadora expresa el polipéptido β-glucosidasa codificado, en el que el nivel de expresión de β-glucosidasa de la célula hospedadora es al menos aproximadamente 2 veces superior al de C1 de tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones. Puede medirse la expresión del polipéptido β-glucosidasa utilizando un ensayo de actividad β-glucosidasa con para-nitrofenil-β-Dglucopiranósido (pNPG), tal como el descrito en el Ejemplo 5. Puede medirse la expresión (es decir, la actividad) de la β-glucosidasa secretada. Como alternativa, puede determinarse la expresión de la actividad β-glucosidasa total en el cultivo. El péptido señal empleado en este método puede ser cualquier péptido señal heterólogo conocido en la técnica o puede ser el péptido señal de C1 β-glucosidasa de tipo silvestre (SEQ ID NO: 6). En algunas formas de realización, el nivel de sobreexpresión es al menos aproximadamente 5 veces, 10 veces, 12 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces ó 35 veces superior al de la expresión de β-glucosidasa del C1 de tipo silvestre.

Por lo general, la recuperación o aislamiento del polipéptido β-glucosidasa se da a partir del medio de cultivo de la célula hospedadora, la célula hospedadora o ambos, utilizando técnicas de recuperación de proteínas que son bien conocidas en la técnica, incluidas las descritas en el presente documento. Las células se recolectan por lo general por centrifugación, se rompen mediante medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante puede conservarse para una purificación adicional. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse mediante cualquier método conveniente, incluidos ciclos de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica o uso de agentes de lisis celular, u otros métodos, que son bien conocidos para los expertos en la materia.

El polipéptido resultante puede recuperarse/aislarse y opcionalmente purificarse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede aislarse del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales incluidos, pero no limitados a, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, de interacción hidrófoba, cromatofocalización, y de exclusión por tamaño), o precipitación. Pueden utilizarse etapas de renaturalización de proteínas, como se desee, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) en las etapas finales de purificación. La purificación de BGL1 se describe en la publicación de patente de EE.UU. US 2007/0238155. Además de las referencias citadas anteriormente, se conocen en la técnica diversos métodos de purificación, incluidos, por ejemplo, los expuestos en Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, segunda edición, Wiley-Liss, Nueva York; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook, Humana Press, NJ; Harris y Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach, IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris y Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach, IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice, 3ª edición, Springer Verlag, Nueva York; Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, segunda edición, Wiley-VCH, Nueva York; y Walker (1998) Protein Protocols en CD-ROM, Humana Press, NJ. En algunos casos, la proteína purificada puede purificarse casi a homogeneidad o puede constituir al menos un 20%, al menos un 30% o al menos un 50% de la proteína en la composición.

Pueden utilizarse métodos inmunológicos para purificar los polipéptidos β-glucosidasa. En un enfoque, un anticuerpo generado contra los polipéptidos β-glucosidasa (por ejemplo, contra un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 5) que utiliza métodos convencionales, se inmoviliza sobre perlas, se mezcla con medios de cultivo celular en condiciones en las que la β-glucosidasa se una, y se hace precipitar. En un enfoque relacionado, se utiliza inmunocromatografía.

Tal como se ha señalado, en algunas formas de realización la β-glucosidasa se expresa como una proteína de fusión que incluye una porción que no es enzima. En algunas formas de realización, la secuencia de β-glucosidasa se fusiona a un dominio que facilita la purificación. Tal como se utiliza en el presente documento, la

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expresión "dominio que facilita la purificación" se refiere a un dominio que interviene en la purificación del polipéptido al que se fusiona. Los dominios de purificación adecuados incluyen péptidos quelantes de metales, módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, una secuencia que se une a glutatión (por ejemplo, GST), un marcador hemaglutinina (HA) (que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe; Wilson et al. (1984) Cell, 37: 767), secuencias proteicas de unión a maltosa, el epítopo FLAG utilizado en el sistema de purificación por extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle, Wash.), y similares. La inclusión de una secuencia conectora polipeptídica escindible por proteasas entre el dominio de purificación y el polipéptido HHDH es útil para facilitar la purificación. Un vector de expresión contemplado para su uso en las composiciones y los métodos descritos en el presente documento proporciona la expresión de una proteína de fusión que comprende un polipéptido de la invención fusionado a una región de polihistidina, separados por un sitio de escisión de enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación en IMAC (cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados, como se describe en Porath et al. (1992) Protein Expression and Purification 3:263-281) mientras que el sitio de escisión de enteroquinasa proporciona un medio para separar el polipéptido HHDH de la proteína de fusión. También pueden utilizarse vectores pGEX (Promega. Madison, Wis.) para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con la glutatión S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas por adsorción a perlas de ligando-agarosa (por ejemplo, glutatión-agarosa en el caso de fusiones con GST), seguido de elución en presencia de ligando libre.

VI. MÉTODOS DE USO DE POLIPÉPTIDOS β-GLUCOSIDASA Y CÉLULAS QUE EXPRESAN POLIPÉPTIDOS β-GLUCOSIDASA

Tal como se ha descrito anteriormente, los polipéptidos β-glucosidasa de la presente invención pueden utilizarse para catalizar la hidrólisis de un dímero de azúcar con la liberación del monómero de azúcar correspondiente, por ejemplo, la conversión de celobiosa con la liberación de glucosa. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método de producción de glucosa, (a) proporcionando una celobiosa; y (b) poniendo en contacto la celobiosa con un polipéptido β-glucosidasa de la invención en condiciones suficientes para formar una mezcla de reacción para convertir la celobiosa en glucosa. El polipéptido β-glucosidasa puede utilizarse en tales métodos, ya sea en forma aislada o como parte de una composición, tal como cualquiera de los descritos en el presente documento. El polipéptido β-glucosidasa también puede proporcionarse en medios de cultivo celular o en un lisado celular. Por ejemplo, después de producir el polipéptido β-glucosidasa mediante cultivo de una célula hospedadora transformada con un vector o polinucleótido β-glucosidasa de la presente invención, no es necesario aislar la β-glucosidasa del medio de cultivo (es decir, si la β-glucosidasa es secretada en el medio de cultivo) o lisado celular (es decir, si la β-glucosidasa no es secretada en el medio de cultivo) o utilizarla en forma purificada para que sea útil en otros métodos de utilización del polipéptido β-glucosidasa. Cualquier composición, medio de cultivo celular o lisado celular que contenga un polipéptido β-glucosidasa de la presente invención puede ser adecuado para su uso en métodos que utilizan una β-glucosidasa. Por lo tanto, la presente invención proporciona adicionalmente un método de producción de glucosa: (a) proporcionando una celobiosa; y (b) poniendo en contacto la celobiosa con un medio de cultivo o lisado celular o composición que comprende un polipéptido β-glucosidasa de la presente invención en condiciones suficientes para formar una mezcla de reacción para convertir la celobiosa en glucosa.

La presente invención proporciona adicionalmente composiciones que son útiles para la conversión enzimática de la celobiosa en glucosa. Por ejemplo, pueden combinarse uno o más polipéptidos β-glucosidasa de la presente invención con otra enzima y/o un agente que modifique las propiedades de manejo de material a granel o procesabilidad adicional de la(s) β-glucosidasa(s) (por ejemplo, un agente fluidificante, agua, tampón, un tensioactivo, y similares), o que mejore la eficacia de la conversión de la celobiosa en glucosa, tal como se describe con más detalle más adelante. La otra enzima puede ser una β-glucosidasa diferente u otra enzima celulasa.

Mezclas de celulasas

Por ejemplo, en algunas formas de realización, la β-glucosidasa se combina con otras celulasas para formar una mezcla de celulasas. La mezcla de celulasas puede incluir celulasas seleccionados de entre celulasas CBH, EG y BG (por ejemplo, celulasas de Trichoderma reesei (por ejemplo, celulasa C2730 de Trichoderma reesei ATCC Nº 25921, Sigma-Aldrich, Inc.), Acidothermus cellulolyticus, Thermobifida fusca, Humicola grisea y Chrysosporium sp.). Las enzimas de la mezcla de celulasas trabajan conjuntamente, lo que da como resultado la descristalización y la hidrólisis de la celulosa a partir de un sustrato de biomasa para producir azúcares solubles, tales como, pero no limitados a, la glucosa (Véase Brigham et al., 1995, en Handbook on Bioethanol (C. Wyman ed.) págs. 119-141, Taylor y Francis, Washington DC).

Las mezclas de celulasas para una hidrólisis enzimática eficaz de la celulosa son conocidas (véase, por ejemplo, Viikari et al., 2007, "Thermostable enzymes in lignocellulose hydrolysis" Adv Biochem Eng Biotechnol 108:121-45, y las publicaciones de patentes de EE.UU. US 2009/0061484, US 2008/0057541 y US 2009/0209009 de logen Energy Corp.). En algunas formas de realización, las mezclas de enzimas naturales o recombinantes purificadas se combinan con materia prima celulósica o un producto de hidrólisis de la celulosa. Como alternativa, o además, puede utilizarse una o más células que producen celulasas naturales o recombinantes.

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Otros componentes de las composiciones de β-glucosidasa

Los polipéptidos β-glucosidasa de la presente invención pueden utilizarse en combinación con otros ingredientes opcionales, tales como un tampón, un tensioactivo y/o un agente limpiador. Puede utilizarse un tampón con un polipéptido β-glucosidasa de la presente invención (opcionalmente en combinación con otras celulasas, incluida otra β-glucosidasa) para mantener un pH deseado dentro de la solución en la que se emplea la β-glucosidasa. La concentración exacta de tampón empleado dependerá de varios factores que el experto en la técnica puede determinar. Los tampones adecuados son bien conocidos en la técnica. Puede utilizarse adicionalmente un tensioactivo en combinación con las celulasas de la presente invención. Los tensioactivos adecuados incluyen cualquier tensioactivo compatible con la β-glucosidasa y otras celulasas opcionales que se estén utilizando. Los tensioactivos ejemplares incluyen un tensioactivo aniónico, un tensioactivo no iónico y tensioactivos anfolíticos.

Los tensioactivos aniónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, alquilbencenosulfonatos ramificados

o lineales; sulfatos de alquil éter o alquenil éter con grupos alquilo o grupos alquenilo lineales o ramificados; sulfatos de alquilo o alquenilo; olefinsulfonatos; alcanosulfonatos, y similares. Los contraiones adecuados para los tensioactivos aniónicos incluyen, por ejemplo, iones de metales alcalinos, tales como sodio y potasio; iones de metales alcalinotérreos, tales como calcio y magnesio; ion amonio; y alcanolaminas que tienen de 1 a 3 grupos alcanol con un número de átomos de carbono de 2 ó 3. Los tensioactivos anfolíticos adecuados para su uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, sulfonatos de sales de amonio cuaternario, tensioactivos anfolíticos de tipo betaína, y similares. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen generalmente éteres de polioxialquileno, así como alcanolamidas de ácidos grasos superiores o aductos de óxido de alquileno de las mismas, monoésteres de ácidos grasos de glicerina, y similares. También pueden emplearse mezclas de tensioactivos como se conoce en la técnica.

Producción de azúcares fermentables a partir de biomasa celulósica

Los polipéptidos β-glucosidasa de la presente invención, así como cualquier composición, medio de cultivo

o lisado celular que comprende tales polipéptidos β-glucosidasa, pueden utilizarse en la producción de monosacáridos, disacáridos u oligómeros de un mono o disacárido como materia prima química o de fermentación a partir de biomasa. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "biomasa" se refiere a material biológico vivo o muerto que contiene un sustrato polisacárido, tal como, por ejemplo, celulosa, almidón, y similares. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para convertir un sustrato de biomasa en un azúcar fermentable, comprendiendo el método poner en contacto un medio de cultivo o lisado celular que contiene un polipéptido β-glucosidasa según la invención, con el sustrato de biomasa en condiciones adecuadas para la producción del azúcar fermentable. La presente invención proporciona adicionalmente un método para convertir un sustrato de biomasa en un azúcar fermentable (a) pretratando un sustrato de celulosa para aumentar su susceptibilidad a la hidrólisis; (b) poniendo en contacto el sustrato de celulosa pretratado de la etapa (a) con una composición, medio de cultivo o lisado celular que contiene un polipéptido β-glucosidasa de la presente invención (y opcionalmente otras celulasas) en condiciones adecuadas para la producción del azúcar fermentable.

En algunas formas de realización, la biomasa incluye sustratos celulósicos, incluidos pero no limitados a, madera, pasta de madera, pasta de papel, rastrojo de maíz, fibra de maíz, arroz, desechos de la elaboración de pulpa y papel, plantas herbáceas o leñosas, pulpa vegetal o de fruta, grano de destilería, hierbas, cascarilla de arroz, paja de trigo, algodón, cáñamo, lino, sisal, mazorcas de maíz, bagazo de caña de azúcar, pasto varilla, y mezclas de los mismos. La biomasa puede pretratarse opcionalmente para aumentar la susceptibilidad de la celulosa a la hidrólisis utilizando métodos conocidos en la técnica tales como pretratamientos químicos, físicos y biológicos (por ejemplo, explosión de vapor, reducción a pulpa, desfibrado, hidrólisis ácida, exposición a disolventes, y similares, así como combinaciones de los mismos). En algunas formas de realización, la biomasa comprende plantas transgénicas que expresan enzimas ligninasa y/o celulasa que degradan la lignina y la celulosa. Véase, por ejemplo, el documento US 20080104724. La biomasa puede incluir celobiosa y/o puede tratarse enzimáticamente para generar celobiosa para la conversión en un azúcar soluble (por ejemplo, glucosa).

En algunas formas de realización, pueden hacerse reaccionar el polipéptido β-glucosidasa y lisados celulares, medios de cultivo celular y composiciones que contienen polipéptido β-glucosidasa con la biomasa o biomasa pretratada a una temperatura en el intervalo comprendido entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 100°C, entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 90°C, entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 80°C, entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 80°C, y entre aproximadamente 35°C y aproximadamente 75°C. También pueden hacerse reaccionar la biomasa con los lisados celulares, medios de cultivo celular y composiciones que contienen polipéptido β-glucosidasa y polipéptidos 11-glucosidasa a una temperatura de aproximadamente 25°C, a aproximadamente 30°C, a aproximadamente 35°C, a aproximadamente 40°C, a aproximadamente 45°C, a aproximadamente 50°C, a aproximadamente 55°C, a aproximadamente 60°C, a aproximadamente 65°C, a aproximadamente 70°C, a aproximadamente 75°C, a aproximadamente 80°C, a aproximadamente 85°C, a aproximadamente 90°C, a aproximadamente 95°C y a aproximadamente 100°C. Además de las temperaturas descritas anteriormente, las condiciones adecuadas para la conversión de un sustrato de

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biomasa en un azúcar fermentable que emplea un polipéptido β-glucosidasa de la presente invención (opcionalmente en una composición, medio de cultivo celular o lisado celular) incluyen llevar a cabo el proceso a un pH en un intervalo de aproximadamente pH 3,0 a aproximadamente 8,5, aproximadamente pH 3,5 a aproximadamente 8,5, aproximadamente pH 4,0 a aproximadamente 7,5, aproximadamente pH 4,0 a aproximadamente 7,0 y aproximadamente pH 4,0 a aproximadamente 6,5. Los expertos habituales en la materia comprenderán que los tiempos de reacción para convertir un sustrato de biomasa particular en un azúcar fermentable pueden variar, pero que puede determinarse fácilmente el tiempo de reacción óptimo. Los tiempos de reacción ejemplares pueden estar en el intervalo comprendido entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 240 horas, entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 180 horas, y entre aproximadamente 10,0 y aproximadamente 150 horas. Por ejemplo, el tiempo de incubación puede ser de al menos 1 hora, al menos 5 horas, al menos 10 horas, al menos 15 horas, al menos 25 horas, al menos 50 horas, al menos 100 horas, al menos 180, y similares.

La reacción de la β-glucosidasa con el sustrato de biomasa o sustrato de biomasa pretratado en estas condiciones puede dar como resultado la liberación de cantidades considerables de los azúcares solubles a partir del sustrato. Por ejemplo, puede disponerse de al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o más de azúcar soluble, en comparación con la liberación de azúcar mediante la C1 de tipo silvestre. En alguna forma de realización, la cantidad de azúcar soluble disponible puede ser al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces o al menos 5 veces superior a la disponible mediante la C1 de tipo silvestre en las mismas condiciones. En algunas formas de realización, los azúcares solubles comprenderán glucosa.

Los azúcares solubles producidos mediante los métodos de la presente invención pueden utilizarse para producir un alcohol (tal como, por ejemplo, etanol, butanol, y similares). Por consiguiente, la presente invención proporciona un método de producción de un alcohol, en el que el método comprende (a) proporcionar un azúcar fermentable producido utilizando un polipéptido β-glucosidasa de la presente invención en los métodos descritos anteriormente; (b) poner en contacto el azúcar fermentable con un microorganismo fermentador para producir el alcohol u otro producto metabólico; y (c) recuperar el alcohol u otro producto metabólico.

En algunas formas de realización, el polipéptido β-glucosidasa de la presente invención, o la composición, medio de cultivo celular o lisado celular que contiene el polipéptido β-glucosidasa puede utilizarse para catalizar la hidrólisis de un sustrato de biomasa hasta un azúcar fermentable en presencia de un microorganismo fermentador tal como una levadura (por ejemplo, Saccharomyces sp., tal como, por ejemplo, S. cerevisiae, Zymomonas sp., E. coli, Pichia sp., y similares) u otros microorganismos fermentadores de C5 ó C6 que son bien conocidos en la técnica, para producir un producto final tal como etanol. En este proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) los azúcares fermentables (por ejemplo, glucosa y/o xilosa) se eliminan del sistema mediante el proceso de fermentación.

Los azúcares solubles producidos utilizando un polipéptido β-glucosidasa de la presente invención también pueden utilizarse en la producción de otros productos finales tal como, por ejemplo, acetona, un aminoácido (por ejemplo, glicina, lisina, y similares), un ácido orgánico (por ejemplo, ácido láctico, y similares), glicerol, un diol (por ejemplo, 1,3 propanodiol, butanodiol, y similares) y piensos.

Un experto en la materia comprenderá fácilmente que las composiciones de polipéptido β-glucosidasa de la presente invención pueden utilizarse en forma de solución acuosa o concentrado sólido. Cuando se emplean soluciones acuosas, la solución de β-glucosidasa puede diluirse fácilmente para permitir las concentraciones precisas. Un concentrado puede estar en cualquier forma reconocida en la técnica incluido, por ejemplo, líquidos, emulsiones, suspensiones, gel, pastas, gránulos, polvos, un aglomerado, un disco sólido, así como otras formas que son bien conocidas en la técnica. También pueden utilizarse otros materiales con o incluidos en la composición de β-glucosidasa de la presente invención como se desee, incluidas piedras, piedra pómez, cargas, disolventes, activadores enzimáticos y agentes anti-redeposición dependiendo del uso pretendido de la composición.

Además de utilizarse para la conversión de biomasa celulósica, los polipéptidos β-glucosidasa y las composiciones de los mismos también pueden utilizarse en la industria de alimentos y bebidas, por ejemplo, en el proceso de elaboración del vino para la liberación eficaz de los monoterpenoles (véase, por ejemplo, Yanai y Sato (1999) Am. J. Enol Eitic., 50: 231 -235) y para la preparación de tofu enriquecido en glicona isoflavonas (véase, por ejemplo, Mase et al., (2004). J. Appl. Glycosci., 51:211-216). Los polipéptidos β-glucosidasa de la presente invención también pueden emplearse en las composiciones de detergente para mejorar el rendimiento de limpieza (véase, por ejemplo, los documentos USP 7.244.605; US 5.648.263 y WO 2004/048592).

Los aspectos anteriores y otros aspectos de la invención pueden comprenderse mejor en relación a los siguientes ejemplos no limitativos.

VIII. EJEMPLOS

Ejemplo 1. Clonación de ADN genómico

15

25

35

45

55

65

E10821289

11-06-2015

Se aisló ADN genómico de células C1 mediante procedimientos convencionales. En resumen, se sembró un inóculo de hifas en un medio de crecimiento y se dejó crecer durante 72 horas a 35°C. La estera micelial se recogió por centrifugación, se lavó y se añadieron 50 ul de tampón de extracción de ADN (TRIS 200 mM pH 8,0; NaCl 250 mM; EDTA 125 mM; SDS al 0,5%). Se molió el micelio con una trituradora cónica, se volvió a extraer con 250 ul de tampón de extracción y se centrifugó la suspensión. Se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo que contenía 300 µl de isopropanol. Se recogió el ADN por centrifugación, se lavó dos veces con etanol al 70%, y se diluyó en 100 µl de agua.

Se clonó la región que incluía el gen bgl1 de β-glucosidasa de cada una de tres cepas C1, incluidas las células de tipo silvestre y dos líneas celulares Alp1□ diferentes, y se secuenciaron. La clonación se llevó a cabo utilizando PCR con los cebadores internos y externos que se muestran en la Tabla 3. El producto de amplificación de los cebadores internos es la porción que codifica la proteína del gen bgl1, mientras que el cebador externo incluye las secuencias flanqueantes 5’ y 3'.

TABLA 3

Cebadores internos:

C1bgl_fwd1

ATGAAGGCTGCTGCGCTTTC SEQ ID NO:22

C1bgl_rev1

TCATTAAGGAAGCTCAATCTTGAGATC SEQ ID NO:23

Cebadores externos:

C1_bgl_fwd2

TCTCTGCCGGTGCCATCAATCATCT SEQ ID NO:24

C1_bgl_rev2

GCTCACCGGAACTTGCCAAGTGCT SEQ ID NO:25

La secuencia de bgl1 se proporciona en la Figura 1 (secuencia superior). En particular, la secuencia genómica de C1 que se obtuvo difería de las secuencias publicadas en cuatro posiciones (correspondientes a los nucleótidos 1440, 1451, 1511 y 1521 de la SEQ ID NO: 1).

Ejemplo 2. Clonación de ADNc

Se clonó ADNc de bgl1 de C1 y se secuenció como se describe a continuación.

Extracción de ARN a partir de medios de fermentación de C1

Se purificó ARN a partir de un cultivo de C1 de 3 días (cepa Alp1□) cultivado a 35°C con agitación a 250 rpm. Se transfirieron 500 µl-1.200 µl del caldo de cultivo a un mortero enfriado y se trituraron minuciosamente con la mano de mortero en presencia de N2 líquido. Se transfirió el polvo de células a un tubo Eppendorf y se añadieron a la muestra 1,500 µl de reactivo Trizol. Después de mezclar, se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó a 12.000 g, 4°C, durante 15 minutos. Se transfirió el homogeneizado transparente a un tubo de centrífuga de 2 ml y se añadieron 300 µl de cloroformo, se mezcló y se centrifugó a 12.000 g 4°C durante 30 minutos. Se transfirió la fase acuosa superior a un nuevo tubo de 2 ml y se hizo precipitar por adición de 1.200 µl de EtOH al 96%. Se purificó adicionalmente la muestra utilizando el kit RNeasy de Qiagen utilizando las instrucciones del fabricante. Brevemente: se transfirieron 700 µl de muestra precipitada a la minicolumna de centrifugación del RNeasy y se centrifugó durante 20 segundos a 10.000 g a 20°C. Se añadieron 350 µl de tampón RW1 y se centrifugó durante 20 segundos a 10.000 g a 20°C. La solución de ADNasa se añadió directamente a la membrana de la columna de centrifugación del RNeasy, y se incubó a temperatura ambiente durante 25 minutos. Se añadieron 350 µl de tampón RW1 y se centrifugó durante 20 segundos a 10.000 g a 20°C. Se añadieron a la columna de centrifugación dos veces 500 µl de tampón RPE y se centrifugó durante 20 segundos a 10.000 g a 20°C. Se colocó la columna de centrifugación del RNeasy en un nuevo tubo de recogida de 2 ml y se centrifugó durante 1 minuto a

10.000 g a 20°C. A continuación, se colocó la columna de centrifugación del RNeasy en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml y se añadieron 30 µl de agua sin ARNasa directamente a la membrana de la columna de centrifugación y se centrifugó durante 1 minuto a 10.000 g a 20°C. La concentración de la solución de ARN total fue aproximadamente 1,9 µg/ul.

Síntesis de la primera hebra mediante transcriptasa inversa Superscript III

A un tubo de microcentrífuga sin nucleasa se añadieron los siguientes componentes:

1.

5 µl de oligo(dT) (400 ng/ul) (Qiagen Cat. Nº 70DT01-1)

2.

1 ug de ARN total

3.

1 µl de dNTP 10 mM

4.

Agua destilada estéril hasta 13 µl

15

25

35

45

55

65

E10821289

11-06-2015

Se calentó la mezcla a 65°C durante 5 minutos y se incubó en hielo durante 1 minuto y 4 µl de 5X tampón de primera hebra, 1 µl de DTT 0,1 M, 1,3 µl de inhibidor de ARNasa recombinante RNaseOUT™ (Cat. Nº 10777019) y 2 µl de transcriptasa inversa SuperScript™ III RT. Se incubó la mezcla a 50°C durante 60 minutos y se interrumpió la reacción mediante calentamiento a 70°C durante 15 minutos.

Clonación por PCR de ADNc de bgl1

Para clonar ADNc de longitud completa de bgl1 a partir de la mezcla RT-PCR, se añadieron 2 µl de la mezcla RT-PCR, 10 µl de 5X tampón Phusion HF, 1 µl de dNTP (Σ10mM), 1 µl de cebador cdx09050 (10 µM), 1 ul de cebador cdx09052 (10 µM), 34,5 ul de agua MQ y 0,5 µl de polimerasa Phusion HF* (Finnzymes) y se mezclaron. Las condiciones de PCR fueron: desnaturalización inicial: 98°C-30 segundos, seguido de 35 ciclos de 98°C-10 segundos de desnaturalización y 72°C, 2 minutos 40 segundos de elongación, y un ciclo de extensión final de 72°C durante 5 minutos. El producto de PCR se purificó con columna de centrifugación EZ-10 según las instrucciones del fabricante y se clonó en pCRBlunt utilizando el kit de clonación StrataClone Ultra Blunt PCR (Stratagene) según las instrucciones del fabricante.

TABLA 4

Nombre del cebador

Secuencia (5’-3’) SEQ ID NO:

cdx09050

GGCTCATGAAGGCTGCTGCGCTTTCCTGC 26

cdx09052

GCCGAATTCTCAAGGAAGCTCAATCTTGAGATCC 27

TcbhC1bgl_R1

28

PcbhC1bgl_F

10

La Figura 2 muestra la secuencia de ADNc obtenida (véase también la Figura 1), junto con la secuencia proteica predicha. Tal como se ilustra en la Figura 3, la estructura del exón del gen bgl1 se diferencia de la descrita anteriormente (véase la publicación de patente US 2007/0238155). La estructura del exón que se refleja en la secuencia de ADNc fue coherente con el análisis de la secuencia genómica correspondiente utilizando los algoritmos de predicción de genes Augustus v.2.03 y Genemark-ES v.2 (véase Stanke et al., 2006 "AUGUSTUS: ab initio prediction of alternative transcripts" Nucleic Acids Res. 34 (publicación en el servidor Web): W435-9; Ter-Hovhannisyan et al., 2008, Genome Res. 18:1979-1990). Como consecuencia de las diferencias en la secuencia de ADNc, se ha identificado que la secuencia de la proteína BGL1 se diferencia de la secuencia descrita anteriormente en el extremo amino terminal e internamente.

Puesto que BGL1 se secreta, se espera que tenga un péptido señal. SignalP (Bendtsen et al., 2004, "Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0". J Mol Biol. 340(4):783-95) predice un sitio de escisión ("//") entre los aminoácidos 19 y 20 de la SEQ ID NO: 4.

Extremo N-terminal-MKAAALSCLFGSTLAVAGA // IESRKVHQKPLARSEPFYPS … -extremo C-terminal [SEQ ID NO: 12]

Además, los resultados de los investigadores demuestran que BGL1 comprende ácido aspártico en la posición 358, glutamina en la posición 381 y ácido glutámico en la posición 385, mientras que la secuencia publicada proporciona, histidina, histidina y lisina, respectivamente, en las posiciones correspondientes.

Ejemplo 3. Construcción de vectores de expresión de bgl1 con promotores de C1

Para producir la secuencia de bgl1 bajo el control del promotor de C1 CBH1a, se clonó la secuencia genómica de bgl1 en un vector que incluye una secuencia promotora de CBH1a (SEQ ID NO: 8, véase la Figura 4; véase también la publicación PCT WO 01/79507), secuencias reguladoras 3' que incluyen un terminador de la transcripción CBH1a, y un marcador de resistencia a ampicilina. Además, se clonó un casete génico de resistencia a fleomicina en el vector en 3' hasta el terminador. Mediante la técnica de clonación SLIC (Mamie et al., 2007, Nature Methods 4:251-56) se amplificó el ADN correspondiente a la porción de preproteína de la secuencia de bgl1 utilizando los cebadores PcbhClbgl_F y TcbhC1bgl_R1 (véase la tabla 4 en el Ejemplo 2, supra). El producto resultante se clonó en el vector digerido con Pmll/Pacl en sentido 3' respecto al promotor de CBH1a para crear un vector de expresión que expresase el transcrito proteína BGL1 bajo el control del promotor de CBH1a.

Ejemplo 4. Método de transformación de C1

Preparación de protoplastos

Claims (11)

1. 15

   25

   35

   45

   55

   Reivindicaciones

   1.

   Polinucleótido que codifica un polipéptido β-glucosidasa recombinante, en el que dicho polipéptido:

   a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5), ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP), glutamina en la posición 381 (381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU), en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4.

2. 2.

   Polinucleótido según la reivindicación 1 en el que el polipéptido β-glucosidasa recombinante comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.

3. 3.

   Polinucleótido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el polinucleótido comprende la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 9.

4. 4.

   Vector de expresión que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, unido operativamente a un promotor heterólogo.

5. 5.

   Método de producción de un polipéptido β-glucosidasa secretado, que comprende cultivar una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, unido operativamente a un promotor heterólogo, o un vector de expresión según la reivindicación 4, en condiciones en las que se produce β-glucosidasa.

6. 6.

   Célula hospedadora recombinante que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que codifica un polipéptido β-glucosidasa recombinante, en el que la secuencia codificante no comprende intrones, y en el que opcionalmente el polinucleótido está unido operativamente a un promotor heterólogo, y en el que opcionalmente la célula expresa al menos otra enzima celulasa recombinante.

7. 7.

   Composición que comprende una célula que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido β-glucosidasa recombinante unido operativamente a un promotor heterólogo, en el que dicho polipéptido:

   a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5), ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP), glutamina en la posición 381 (381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU), en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4, y una proteína β-glucosidasa secretada por la célula.

8. 8.

   Método de producción de glucosa a partir de celobiosa, que comprende poner en contacto celobiosa con una célula recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido β-glucosidasa recombinante, unida operativamente a un promotor heterólogo, en el que dicho polipéptido:

   a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5), ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP), glutamina en la posición 381 (381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU), en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4, en condiciones en las que la β-glucosidasa es expresada y secretada por la célula y dicha celobiosa es convertida enzimáticamente en glucosa por dicha β-glucosidasa.

9. 9.

   Método según la reivindicación 5 u 8 en el que la célula es una célula de la cepa C1.

10. 10.

    Método según la reivindicación 5 u 8 en el que la célula no es una célula de la cepa C1.

11. 11.

    Vector de expresión según la reivindicación 4, método según la reivindicación 5 u 8, célula hospedadora recombinante según la reivindicación 6, o composición según la reivindicación 7, en los que el promotor heterólogo es el promotor de C1 celobiohidrolasa 1a (CBH1a).

    50

    5 15

    12. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, vector de expresión según la reivindicación 4 u 11, o método según cualquiera de las reivindicaciones 5, 8, 9, 10 y 11 en los que la secuencia polinucleotídica no codifica una o más de entre la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31. 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5, 8, 9, 10 y 11, que comprende adicionalmente recuperar la β-glucosidasa a partir del medio en el que se cultiva la célula. 14. Método de conversión de un sustrato de biomasa en un azúcar fermentable, que comprende combinar la célula según la reivindicación 6 con el sustrato de biomasa en condiciones adecuadas para la producción del azúcar fermentable. 15. Método según la reivindicación 14 en el que el sustrato de biomasa es la celobiosa y el azúcar fermentable es la glucosa.

    25

    35

    45

    55

    51