ES2455269T3 - Variantes de beta-glucosidasa recombinante para la producción de azúcares solubles de biomasa celulósica - Google Patents

Abstract

Una variante de polipéptido de ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína C1 natural (Bgl1) y que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a ß-glucosidasa C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y tiene al menos una sustitución en la posición D369 en la que la posición se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a la expresión de variantes de �-glucosidasa recombinantes y a su uso en la producción de azúcares solubles de biomasa celulósica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La biomasa celulósica es un recurso renovable significativo para la generación de azúcares solubles. Estos azúcares pueden usarse como reactantes en diversos procedimientos metabólicos, que incluyen fermentación, para producir biocombustibles, compuestos químicos y otros productos comercialmente valiosos. Aunque la fermentación de azúcares simples tales como glucosa en etanol es relativamente directa, la conversión eficaz de biomasa celulósica en azúcares solubles es exigente (véase, por ejemplo, Ladisch y col., 1983, Enzyme Microb. Technol. 5:82). La celulosa puede pretratarse químicamente, mecánicamente, enzimáticamente o de otras formas para aumentar la susceptibilidad de celulosa a la hidrólisis. Tal pretratamiento puede ir seguido de la conversión enzimática de celulosa a celobiosa, celo-oligosacáridos, glucosa y otros azúcares y polímeros de azúcar, usando enzimas que rompen los enlaces glucosídicos �-1-4 de celulosa. Estas enzimas se denominan conjuntamente “celulasas”.

Las celulasas se dividen en tres subcategorías de enzimas: 1,4-�-D-glucano glucanohidrolasa (“endoglucanasa” o “EG”); 1,4-�-D-glucano celobiohidrolasa (“exoglucanasa”, “celobiohidrolasa”, o “CBH”); y �-D-glucósidoglucohidrolasa (“�-glucosidasa”, “celobiasa” o “BGL”). Las endoglucanasas rompen enlaces internos y alteran la estructura cristalina de la celulosa, exponiendo cadenas de polisacárido de celulosa individuales (“glucanos”). Las celobiohidrolasas acortan gradualmente las moléculas de glucano, liberando principalmente unidades de celobiosa (un dímero de glucosa ligado en �-1,4 soluble en agua), además de glucosa, celotriosa y celotetraosa. Las �glucosidasas fraccionan celobiosa en monómeros de glucosa.

Las celulasas con propiedades mejoradas para su uso en el procesamiento de biomasa celulósica reducirían los costes y aumentarían la eficiencia de producción de biocombustibles y otros compuestos comercialmente valiosos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la invención proporciona una variante de �-glucosidasa aislada o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 60 % idéntica, algunas veces al menos aproximadamente el 65 % idéntica y frecuentemente al menos aproximadamente el 70 % idéntica a los residuos 20870 de SEC ID Nº: 2 (�-glucosidasa C1 natural), o que está codificada por un ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEC ID Nº: 1 o el complemento exacto de SEC ID Nº: 1, y que tiene al menos una sustitución, con respecto a SEC ID Nº: 2, de un residuo de aminoácido descrito en el presente documento, en la que la variante tiene mayor actividad de �-glucosidasa que la proteína natural y/o es más termoestable que la proteína natural. También se proporcionan polinucleótidos que codifican las variantes de �-glucosidasa, vectores de expresión que comprenden dichos polinucleótidos y células huésped transformadas con los vectores de expresión.

La invención también proporciona un procedimiento de producción de una variante de �-glucosidasa cultivando una célula huésped transformada con un polinucleótido que codifica una variante de �-glucosidasa en condiciones adecuadas para la expresión de la �-glucosidasa. En algunas realizaciones, el polipéptido de �-glucosidasa se recupera del medio de cultivo o de las células transformadas y cultivadas.

La invención también proporciona una composición de enzima que comprende una variante de �-glucosidasa C1 aislada o recombinante. Opcionalmente, la composición de enzima también incluye al menos una enzima celulasa adicional.

En un aspecto relacionado y/u otros aspectos, la invención proporciona un procedimiento de conversión de un sustrato de biomasa, tal como celobiosa, en un azúcar fermentable poniendo en contacto una variante de �glucosidasa con el sustrato de biomasa en condiciones adecuadas para la producción del azúcar fermentable. En una realización, el sustrato de biomasa se mantiene en un medio que contiene células que expresan una variante de �-glucosidasa. En una realización, la célula huésped recombinante que expresa una variante de �-glucosidasa también expresa al menos otra celulasa recombinante y/u otra enzima. Opcionalmente, el sustrato de biomasa se pretrata antes de poner en contacto el sustrato con una variante de polipéptido de �-glucosidasa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. (A) Termoestabilidades de variantes de Bgl1 C1 mejoradas producidas en la cepa C1; la actividad enzimática residual después de 6 h de incubación a pH 5, 65 ºC se determinó por ensayo de pNPG a pH 5, 50 ºC

durante 20 min. N = 6-8; las barras de error representan ± 1 desviación estándar. (B) Termoestabilidades de variantes de Bgl1 C1 mejoradas producidas en la cepa C1; la actividad enzimática residual después de 24 h de incubación a pH 5, 65 ºC se determinó por ensayo de pNPG a pH 5, 50 ºC durante 20 min. N = 6-30; las barras de error representan ± 1 desviación estándar. (C) Correlación de termoestabilidad de Bgl1 C1 entre levadura y huéspedes C1. Figura 2. (A) Las termoestabilidades de las variantes de Bgl1 C1 mejoradas 481, 269 y 3 se compararon con las de la enzima Bgl1 C1 nativa. La actividad enzimática residual después de 24 h de incubación a pH 4,5, 65 ºC se midió usando pNPG como sustrato a pH 5, 50 ºC durante 20 min. N=6-16; las barras de error representan ± 1 desviación estándar. (B) La termoestabilidad de la variante de Bgl1 C1 mejorada 664 se comparó con la de la variante 481. La actividad enzimática residual después de 4 h de incubación a pH 4, 65 ºC se midió usando pNPG como sustrato a pH 5, 50 ºC durante 20 min. N=6-24; las barras de error representan ± 1 desviación estándar. Figura 3. Las termoestabilidades de las variantes de Bgl1 C1 mejoradas 3, 481, 664, 916, 885 y 871 se compararon con las de la enzima Bgl1 C1 nativa. La actividad enzimática residual después de 72 h de incubación a pH 4,5, 65 ºC se midió usando pNPG como sustrato a pH 5, 50 ºC durante 20 min. N=6-10; las barras de error representan ± 1 desviación estándar. Figura 4. La actividad específica de Bgl1 C1 nativa se comparó con la de la variante 871 en un ensayo de celobiosa. Condiciones de ensayo: pH 4,5-5, temperaturas 55 ºC-75 ºC; 8 g/l de celobiosa, 18 h de reacción. La concentración de proteína se normalizó en reacciones. N+2; las barras de error representan ± 1 desviación estándar. Figura 5. La Figura 5 muestra un alineamiento de secuencia de aminoácidos de Bgl1 C1 nativa (SEC ID Nº: 2) con las secuencias de aminoácidos de las variantes 3 (SEC ID Nº: 5), 269 (SEC ID Nº: 7), 481 (SEC ID Nº: 9), 647 (SEC ID Nº: 15), 664 (SEC ID Nº: 13), 871 (SEC ID Nº: 17), 885 (SEC ID Nº: 19) y 916 (SEC ID Nº: 21).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. DEFINICIONES

Las siguientes definiciones se proporcionan para ayudar al lector. A menos que se defina de otro modo, todos los términos de la materia pretenden tener los significados comúnmente entendidos por aquellos expertos en las materias de biología molecular y microbiología. En algunos casos, términos con significados comúnmente entendidos se definen en el presente documento para claridad y/o para facilitar la referencia, y la inclusión de tales definiciones en el presente documento no debe interpretarse necesariamente que represente una diferencia sustancial con respecto a la definición del término como generalmente se entiende en la materia.

El término “celulasa” se refiere a una categoría de enzimas que puede hidrolizar celulosa ( -1,4-glucano o enlaces D-glucosídicos) a oligosacáridos más cortos, celobiosa y/o glucosa.

Los términos “ -glucosidasa” y “celobiasa” se usan indistintamente y se refieren a una -D-glucósido glucohidrolasa que cataliza la hidrólisis de un dímero de azúcar, que incluye, pero no se limita a, celobiosa, con la liberación de un monómero de azúcar correspondiente. En una realización, una -glucosidasa es una -glucosidasa glucohidrolasa de la clasificación E.C. 3.2.1.21 que cataliza la hidrólisis de celobiosa en glucosa. Algunas de las -glucosidasas tienen la capacidad para también hidrolizar -D-galactósidos, -L-arabinósidos y/o -D-fucósidos y adicionalmente algunas -glucosidasas pueden actuar sobre a-1,4-sustratos tales como almidón. La actividad de -glucosidasa puede medirse mediante procedimientos muy conocidos en la técnica, que incluyen los ensayos descritos en el presente documento más adelante.

El término “polipéptido de -glucosidasa” se refiere a un polipéptido que tiene actividad de -glucosidasa.

El término “polinucleótido de -glucosidasa” se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de -glucosidasa.

“Actividad celulolítica” engloba actividad de exoglucanasa (CBH), actividad de endoglucanasa (EG) y/o actividad de -glucosidasa.

Los términos “exoglucanasa”, “exo-celobiohidrolasa” o “CBH” se refieren a un grupo de enzimas celulasas clasificadas como E.C. 3.2.1.91. Estas enzimas hidrolizan celobiosa del extremo reductor o no reductor de celulosa.

Los términos “endoglucanasa” o “EG” se refieren a un grupo de enzimas celulasas clasificadas como E.C. 3.2.1.4. Estas enzimas hidrolizan enlaces glucosídicos -1,4 internos de celulosa.

Como se usa en el presente documento, el término “aislado” se refiere a un ácido nucleico, polinucleótido, polipéptido, proteína u otro componente que se separa parcialmente o completamente de componentes con los que normalmente está asociado (otras proteínas, ácidos nucleicos, células, etc.).

El término “natural” como se aplica a un polipéptido (proteína) significa un polipéptido (proteína) expresado por un microorganismo que se produce naturalmente tal como bacteria u hongo filamentoso. Como se aplica a un microorganismo, el término “natural” se refiere al microorganismo no recombinante nativo. Con referencia a

glucosidasa C1, Bgl1 natural se refiere a la forma madura (secretada) de la proteína que tiene la secuencia de residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2.

Una “variante” como se usa en el presente documento significa un polipéptido de -glucosidasa o polinucleótido que codifica una -glucosidasa que comprende una o más modificaciones con respecto a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) o el polinucleótido natural tal como sustituciones, inserciones, deleciones y/o truncaciones de uno o más residuos de aminoácidos específicos o de uno o más nucleótidos o codones específicos en el polipéptido o polinucleótido.

Una “secuencia de -glucosidasa de referencia” se refiere a una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias, tales como SEC ID Nº: 2. Una secuencia de -glucosidasa de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos 25 residuos de aminoácidos de longitud, al menos 50 residuos de longitud, al menos 100 residuos de longitud, al menos 150 residuos de longitud, al menos 200 residuos de longitud, al menos 300 residuos de longitud, al menos 350 residuos de longitud, al menos 500 residuos de longitud, al menos 600 residuos de longitud, al menos 700 residuos de longitud, o la longitud completa del polipéptido.

Un ácido nucleico (tal como un polinucleótido), un polipéptido o una célula es “recombinante” cuando es artificial o manipulado, o derivado de o contiene una proteína o ácido nucleico artificial o manipulada. Por ejemplo, un polinucleótido que se inserta en un vector o cualquier otra localización heteróloga, por ejemplo, en un genoma de un organismo recombinante, de forma que no se asocie a secuencias de nucleótidos que normalmente flanquean el polinucleótido como se encuentra en la naturaleza, es un polinucleótido recombinante. Una proteína expresada in vitro o in vivo de un polinucleótido recombinante es un ejemplo de un polipéptido recombinante. Asimismo, una secuencia de polinucleótidos que no aparece en la naturaleza, por ejemplo, una variante de un gen que se produce naturalmente, es recombinante.

Una “propiedad mejorada” se refiere a un polipéptido de -glucosidasa que presenta una mejora en cualquier propiedad con respecto a la -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2). Propiedades mejoradas pueden incluir elevada expresión de proteínas, termoactividad, termoestabilidad, actividad por pH, estabilidad por pH, especificidad de producto, elevada actividad específica, especificidad de sustrato, elevada resistencia a sustrato o inhibición de producto final, perfil de pH/temperatura alterado y estabilidad química.

Una variante con “actividad de -glucosidasa mejorada”, como el término se usa en el presente documento, significa una variante que muestra un aumento, con respecto a una secuencia de referencia, en la cantidad de hidrólisis de sustrato que se produce en un momento especificado bajo condiciones de reacción especificadas. La actividad de glucosidasa puede medirse usando una variedad de procedimientos conocidos en la técnica tales como los ensayos de celobiosa descritos en el presente documento más adelante. Para comparar la actividad de -glucosidasa de dos proteínas recombinantemente expresadas puede compararse la actividad específica (actividad por mol de enzima o actividad por gramo de enzima). Alternativamente, las células que expresan y que secretan las proteínas recombinantes pueden cultivarse bajo las mismas condiciones y puede compararse la actividad de -glucosidasa por volumen medio de cultivo.

El término “termoestabilidad mejorada” como se usa en el presente documento significa una enzima de variante que muestra un aumento en la “actividad residual” con respecto a la enzima natural. La actividad residual se determina exponiendo la enzima (variante o referencia, por ejemplo, natural) a condiciones de estrés de temperatura elevada durante un periodo de tiempo y luego determinando la actividad de -glucosidasa en condiciones en las que la enzima de referencia (por ejemplo, natural) tiene normalmente actividad. La actividad de -glucosidasa de la enzima expuesta a condiciones de estrés (“a”) se compara con la de un control en el que la enzima no se expone a las condiciones de estrés (“b”), y la actividad residual es igual a la relación a/b. Una variante con elevada termoestabilidad tendrá mayor actividad residual que la enzima de referencia (por ejemplo, natural). Condiciones a modo de ejemplo para determinar la termoestabilidad se proporcionan en los ejemplos, más adelante. En una realización, las enzimas se exponen a condiciones de estrés de 65 ºC a pH 5 durante 6 h, y se ensayan a 50 ºC, pH 5, durante 1,5 h.

Los términos “identidad en porcentaje”, “% de identidad”, “porcentaje idéntico” y “ % idéntico” se usan indistintamente en el presente documento para referirse al porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos que se obtiene por análisis de ClustalW (versión W 1.8 disponible de European Bioinformatics Institute, Cambridge, RU), contando el número de coincidencias idénticas en el alineamiento y dividiendo tal número de coincidencias idénticas entre la longitud de la secuencia de referencia, y usando los siguientes parámetros de ClustalW por defecto para lograr alineamientos óptimos por parejas lentos/precisos - Penalización por hueco abierto: 10; Penalización por extensión de hueco: 0,10; matriz de peso de proteínas: serie Gonnet; matriz de peso de ADN: IUB; alineamientos por parejas lentos/rápidos de Toggle = Alineamiento SLOW o FULL.

Dos secuencias están “óptimamente alineadas” cuando están alineadas para puntuación de similitud usando una matriz de sustitución de aminoácidos definida (por ejemplo, BLOSUM62), penalización por existencia de huecos y penalización por extensión de hueco de manera que lleguen a la mayor puntuación posible para ese par de

secuencias. Las matrices de sustitución de aminoácidos y su uso en cuantificar la similitud entre dos secuencias son muy conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Dayhoff y col. (1978), “A model of evolutionary change in proteins”; “Atlas of Protein Sequence and Structure”, vol. 5, Supl. 3 (Ed. M.O. Dayhoff), pág. 345-352, Natl. Biomed. Res. Round., Washington, D.C.; y Henikoff y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, ambos de los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. La matriz BLOSUM62 se usa frecuentemente como matriz de sustitución de puntuación por defecto en protocolos de alineamiento de secuencias tales como Gapped BLAST

2.0. La penalización por existencia de huecos se impone para la introducción de un único hueco de aminoácido en una de las secuencias alineadas, y la penalización por extensión de hueco se impone para cada posición de aminoácido vacía adicional insertada en un hueco ya abierto. El alineamiento se define por la posición de aminoácidos de cada secuencia en la que empieza y termina el alineamiento, y opcionalmente por la inserción de un hueco o múltiples huecos en una o ambas secuencias de manera que lleguen a la mayor puntuación posible. Mientras que el alineamiento y la puntuación óptimos pueden llevarse a cabo manualmente, el procedimiento se facilita por el uso de un algoritmo de alineamiento implementado por ordenador, por ejemplo, BLAST 2.0 con huecos, descrito en Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (incorporado en el presente documento por referencia), y puesto a disposición para el público en la página web del Centro Nacional para Información Biotecnológica. Pueden hacerse alineamientos óptimos y múltiples alineamientos usando programas fácilmente disponibles tales como PSI-BLAST, que se describe por Altschul y col. (1997), arriba. Una herramienta de alineamiento útil es “T-Coffee” (Notredame y col., 2000, J. Mol. Bio. 302:205-17). Los alineamientos de T-Coffee pueden llevarse a cabo usando parámetros por defecto (Documentación técnica de T-Coffee, versión 8.01, julio de 2009, www.tcoffee.org).

“Correspondiente a”, “referencia a” o “con respecto a”, cuando se usan en el contexto de la numeración de una secuencia de aminoácidos o de polinucleótidos dada, se refiere a la numeración de los residuos de una secuencia de referencia especificada cuando la secuencia de aminoácidos o de polinucleótidos dada se compara con la secuencia de referencia.

Una “posición” de base de aminoácido o nucleótido se denota por un número que identifica secuencialmente cada aminoácido (o base de nucleótido) en la secuencia de referencia basándose en su posición con respecto al extremo N (o extremo 5'). Debido a deleciones, inserciones, truncaciones, fusiones y similares que deben tenerse en cuenta cuando se determina un alineamiento óptimo, en general el número de residuos de aminoácidos en una secuencia de prueba determinada contando simplemente desde el extremo N no será necesariamente la misma que el número de su posición correspondiente en la secuencia de referencia. Por ejemplo, en un caso en el que una variante tenga una deleción con respecto a una secuencia de referencia alineada, no habrá aminoácido en la variante que se corresponde con una posición en la secuencia de referencia en el sitio de deleción. Si hay una inserción en una secuencia de referencia alineada, esa inserción no se corresponderá con una posición de aminoácido numerada en la secuencia de referencia. En el caso de truncaciones o fusiones puede haber estiramientos de aminoácidos en tanto la secuencia de referencia como alineada que no se corresponden con ningún aminoácido en la secuencia correspondiente.

Los ácidos nucleicos “se hibridan” cuando se asocian para formar estructuras bicatenarias, normalmente en disolución. Los ácidos nucleicos se hibridan debido a una variedad de fuerzas fisicoquímicas bien caracterizadas, tales como enlace de hidrógeno, exclusión de disolvente, apilamiento de bases y similares. Como se usa en el presente documento, el término “condiciones de lavado de hibridación rigurosas” en el contexto de experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como hibridaciones de Southern y Northern, depende de la secuencia y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Una amplia guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, 1993, “Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes”, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York), que se incorpora en el presente documento por referencia. Para polinucleótidos de al menos 100 nucleótidos de longitud, condiciones de baja a muy alta rigurosidad se definen como sigue: prehibridación e hibridación a 42 ºC en 5xSSPE, 0,3 % de SDS, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y tanto 25 % de formamida para rigurosidades bajas, 35 % de formamida para rigurosidades medias y medias-altas como 50 % de formamida para rigurosidades altas y muy altas, siguiendo procedimientos de transferencia Southern convencionales. Para polinucleótidos de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material de vehículo se lava finalmente tres veces cada vez durante 15 minutos usando 2xSSC, 0,2 % de SDS al menos a 50 ºC (baja rigurosidad), al menos a 55 ºC (rigurosidad media), al menos a 60 ºC (rigurosidad media-alta), al menos a 65 ºC (rigurosidad alta) y al menos a 70 ºC (rigurosidad muy alta).

Los términos “cultivar” o “cultivo” se refieren a hacer crecer una población de células microbianas bajo condiciones adecuadas en un medio líquido o sólido.

El término “poner en contacto” se refiere a la colocación de una enzima respectiva en proximidad suficientemente próxima a un sustrato respectivo para permitir que la enzima convierta el sustrato en un producto. Por ejemplo, combinar una disolución que contiene la enzima con el sustrato respectivo efectuará la puesta en contacto. Tal puesta en contacto también incluye incubar una célula que secreta una enzima en un medio que contiene un sustrato de enzima.

Como se usa en el presente documento, referencia a una célula “que metaboliza” un azúcar soluble u otro sustrato

para producir un producto final significa que el azúcar sirve de fuente de carbono y/o fuente de energía para una reacción metabólica en la célula. Normalmente, la célula es una célula microbiana tal como una célula fúngica o célula bacteriana.

Como se usa en el presente documento, el término “transformada” o “transformación” usado en referencia a una célula significa que una célula tiene una secuencia de ácidos nucleicos no nativa integrada en su genoma o como un plásmido episómico que se mantiene a través de múltiples generaciones.

El término “introducido” en el contexto de insertar una secuencia de ácidos nucleicos en una célula significa transfectado, transducido o transformado (conjuntamente “transformado”) o de otro modo incorporado en el genoma de, o mantenido como un episoma en, la célula.

El término “operativamente ligada” se refiere en el presente documento a una configuración en la que una secuencia de control se dispone apropiadamente en una posición con respecto a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de forma que la secuencia de control influya en la expresión de un polipéptido.

Cuando se usa en el presente documento, el término “secuencia codificante” pretende cubrir una secuencia de nucleótidos, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto de proteína. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente por un marco de lectura abierto, que normalmente empieza con el codón de iniciación ATG. La secuencia codificante normalmente incluye una secuencia de ADN, ADNc y/o de nucleótidos recombinante.

Una secuencia promotora, péptido señal u otra secuencia es “heteróloga” cuando está operativamente ligada a una secuencia de ácidos nucleicos o de proteínas con la que un promotor, péptido señal u otra secuencia no está asociado en la naturaleza.

Como se usa en el presente documento, el término “expresión” incluye cualquier etapa que participe en la producción del polipéptido que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

El término “vector de expresión” se refiere en el presente documento a una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de la invención, y que está operativamente ligado a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción.

Un polipéptido de variante de -glucosidasa es “enzimáticamente activo” cuando tiene actividad de -glucosidasa.

El término “pre-proteína” se refiere a una proteína que incluye una región del péptido señal del extremo amino (o secuencia conductora) unida. El péptido señal se escinde de la pre-proteína por una peptidasa señal antes de que la secreción produzca la proteína “madura” o “secretada”.

Como se usa en el presente documento, un “codón de iniciación” es el codón ATG que codifica el primer residuo de aminoácido (metionina) de una proteína.

En el contexto de identidad de secuencias, una referencia a “al menos x % de identidad de secuencias” en esta memoria descriptiva está prevista, a menos que se especifique de otro modo, para referirse a “x % de identidad de secuencias” además de para realizaciones alternativas en las que el % de identidad de secuencias se define por cada número entero de (x + 1) % al 99 % de identidad, precisamente como si cada realización alternativa se enumerara explícitamente. Por ejemplo, referencia a “al menos el 70 % de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 2”, o “residuos de aminoácidos 20-870 de SEC ID Nº: 2”, se refiere a realizaciones alternativas con al menos el 71 % de identidad de secuencias, al menos el 72 % de identidad, al menos el 73 % de identidad, al menos el 74 % de identidad, al menos el 75 % de identidad, al menos el 76 % de identidad, al menos el 77 % de identidad, al menos el 78 % de identidad, al menos el 79 % de identidad, al menos el 80 % de identidad, al menos el 81 % de identidad, al menos el 82 % de identidad, al menos el 83 % de identidad, al menos el 84 % de identidad, al menos el 85 % de identidad, al menos el 86 % de identidad, al menos el 87 % de identidad, al menos el 88 % de identidad, al menos el 89 % de identidad, al menos el 90 % de identidad, al menos el 91 % de identidad, al menos el 92 % de identidad, al menos el 93 % de identidad, al menos el 94 % de identidad, al menos el 95 % de identidad, al menos el 96 % de identidad, al menos el 97 % de identidad, al menos el 98 % de identidad, o al menos el 99 % de identidad con el aminoácido SEC ID Nº: 2, o residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2. Para un alineamiento que extiende la longitud entera de 851 aminoácidos de los residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2, puede haber al menos 596 identidades entre una secuencia de variante y SEC ID Nº: 2, algunas veces al menos 604, al menos 613, al menos 622, al menos 630, al menos 638, al menos 647, al menos 655, al menos 664, al menos 672, al menos 681, al menos 723, al menos 766, o al menos 808 identidades.

Como se usa en el presente documento, “C1” se refiere a una cepa fúngica descrita por Garg, A., 1966, “An addition to the genus Chrysosporium Corda” Mycopathologia 30: 3-4. “Chrysosporium lucknowense” incluye las cepas descritas en las patentes de EE.UU. nº 6.015.707, 5.811.381 y 6.573.086; publicaciones de patente de EE.UU. nº

2007/0238155, US 2008/0194005, US 2009/0099079; publicaciones de patente internacional nº WO 2008/073914 y WO 98/15633, e incluyen, sin limitación, Chrysosporium lucknowense Garg 27K, VKM-F 3500 D (nº de acceso VKM F-3500-D), cepa de C1 UV13-6 (nº de acceso VKM F-3632 D), cepa de C1 NG7C-19 (nº de acceso VKM F-3633 D) y cepa de C1 UV18-25 (VKM F-3631 D), todas las cuales se han depositado en la Colección para toda Rusia de microorganismos de la Academia de ciencias rusa (VKM), Bakhurhina St. 8, Mosvaca, Rusia, 113184, y cualquier derivado de las mismas. Aunque inicialmente se describió como Chrysosporium lucknowense, C1 puede considerarse actualmente una cepa de Myceliophthora thermophila. Derivados de C1 a modo de ejemplo incluyen organismos modificados en los que uno o más genes endógenos o secuencias se han delecionado y/u modificado y/o se han introducido uno o más genes heterólogos o secuencias. Derivados incluyen UV18#100fLalpl, UV18#100f Lpyr5 Lalpl, UV18#100.f Lalpl Lpep4 Lalp2, UV18#100.f Lpyr5 Lalpl Lpep4 Lalp2 y UV18#100.f Lpyr4 Lpyr5 Lalp 1 Lpep4 Lalp2, como se describen en el documento WO2008073914, incorporado en el presente documento por referencia.

La siguiente nomenclatura puede usarse para describir sustituciones en una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos con respecto a una secuencia de referencia: “R-#-V” en la que # se refiere a la posición en la secuencia de referencia, R se refiere al aminoácido (o base) en esa posición en la secuencia de referencia y V se refiere al aminoácido (o base) en la posición correspondiente en la secuencia de variante. Por ejemplo, para un polipéptido de variante descrito con referencia a SEC ID Nº: 2, “D369L” indica que en el polipéptido de variante el ácido aspártico en la posición 369 de la secuencia de referencia está sustituido por leucina, estando la posición de aminoácido determinada por el alineamiento óptimo de la secuencia de variante con SEC ID Nº: 2. Similarmente, “S182L/W” describe dos variantes: una variante en la que la serina en la posición 182 está sustituida por leucina y una variante en que la serina en la posición 182 está sustituida por triptófano.

Los siguientes usos se usan para describir posiciones de aminoácidos en variantes de Bgl1. Las posiciones de aminoácidos están numeradas en relación con la secuencia de referencia SEC ID Nº: 2, que es la secuencia de la pre-proteína de Bgl1 C1 natural (incluyendo el péptido señal). Los alineamientos para determinar un grado de identidad de secuencias (por ejemplo, “al menos el 70 % de identidad”) o para describir deleciones (por ejemplo, deleciones de residuos en el extremo C de la proteína) son en relación con la forma secretada de la proteína Bgl1 natural, residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2. Las sustituciones de bases de nucleótidos se numeran con respecto a SEC ID Nº: 1. Las sustituciones en el péptido señal (residuos 1-19 de SEC ID Nº: 2) se refieren a la secuencia de la pre-proteína Bgl1.

II. INTRODUCCIÓN

The hongo C1 produce una variedad de celulasas y otras enzimas que actúan de acuerdo para catalizar la descristalización e hidrólisis de celulosa para dar azúcares solubles. C1 se describió por Garg, 1966, “An addition to the genus Chrysosporium corda” Mycopathologia 30: 3-4. Véanse también las patentes de EE.UU. nº 6.015.707 y 6.573.086, que se incorporan en el presente documento por referencia para todos los fines.

El genoma de C1 se ha secuenciado al menos parcialmente, como se indica en las publicaciones de patente de EE.UU. US 2007/0238155, US 2008/0194005 y US 2009/0099079, incorporadas en el presente documento por referencia para todos los fines. La secuencia del gen 1 de -glucosidasa C1 (bgl1) y la proteína codificada (Bgl1) se exponen en el presente documento como SEC ID Nº: 1 y 2 (véanse también las solicitudes pendientes de tramitación nº 61/247.379 y PCT/US10/50982, incorporadas en el presente documento por referencia). Obsérvese que estas secuencias se diferencian de las secuencias de Bgl1 de la publicación de patente US 2007/0238155.

Las variantes de -glucosidasa C1 descritas en el presente documento son particularmente útiles para la producción de azúcares solubles de biomasa celulósica. En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de producción de glucosa poniendo en contacto una composición que comprende celobiosa con una variante de glucosidasa C1 recombinantemente expresada en condiciones en las que la celobiosa se convierte enzimáticamente en glucosa. En un aspecto, células huésped recombinantes que expresan una variante de -glucosidasa pueden combinarse con celobiosa en condiciones en las que la -glucosidasa se expresa (y en algunas realizaciones, secreta) por las células. Alternativamente, la proteína -glucosidasa recombinante purificada o parcialmente purificada puede ponerse en contacto con celobiosa. En un aspecto de la presente invención, la puesta en contacto comprende cultivar una célula huésped recombinante en un medio que contiene celobiosa producido de una materia prima celulósica. Por ejemplo, las variantes de -glucosidasa C1 descritas en el presente documento demuestran beneficio en reacciones de sacarificación conjuntamente con otras celulasas tales como celulasas de T. reesei (por ejemplo, CBH1, CBH2 y/o EG1 de T. reesei o variantes de las mismas, y/o caldo de T. reesei) y celulasas de C1 (véanse las patentes de EE.UU. nº 6.015.707, 5.811.381 y 6.573.086; publicaciones de patente de EE.UU. nº 2007/0238155, US 2008/0194005, US 2009/0099079; publicaciones de patente internacional WO 2008/073914 y WO 98/15633, todas incorporadas en el presente documento por referencia).

Diversos aspectos de la invención se describen en las siguientes secciones.

III. PROPIEDADES DE PROTEÍNAS -GLUCOSIDASA PARA SU USO EN PROCEDIMIENTOS DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para expresar una proteína -glucosidasa cultivando una célula huésped que comprende un vector o plásmido episómico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una variante de Bgl1 C1, o que tiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una variante de Bgl1 C1 integrada en su genoma, en condiciones en las que se expresa la proteína -glucosidasa o un fragmento enzimáticamente activo de la misma. Generalmente, la proteína expresada comprende un péptido señal que se elimina por la célula a medida que se secreta la enzima. En una realización, la transcripción de la secuencia que codifica la variante de Bgl1 C1 está controlada por un promotor heterólogo operativamente ligado.

Variantes de polipéptido de -glucosidasa

La presente invención proporciona novedosas enzimas que son variantes de -glucosidasa (Bgl1) C1. Las variantes de polipéptido de -glucosidasa de la presente invención son variantes de Bgl1 que presentan actividad de glucosidasa, normalmente mayor actividad de -glucosidasa que la -glucosidasa C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2), especialmente en condiciones relevantes para los procedimientos de sacarificación comerciales. También se incluyen variantes de polipéptido de -glucosidasa que presentan mayor estabilidad en condiciones relevantes para procedimientos de sacarificación comerciales (por ejemplo, elevada termoestabilidad con respecto a

-

glucosidasa natural).

La presente invención proporciona variantes de Bgl1 que tienen mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural (WT) y que tienen al menos una de las sustituciones encontradas en una variante de actividad elevada y/o termoestabilidad elevada descrita en el presente documento. Como se trata más abajo en más detalle, se preparó un polinucleótido que codifica la proteína Bgl1 C1 natural (WT) (SEC ID Nº: 2). El polinucleótido se insertó en un vector de expresión como se describe en el Ejemplo 1, más adelante, se prepararon bibliotecas de polinucleótidos que codifican proteínas Bgl1 de variante por mutagénesis y evolución dirigida, y se evaluaron las propiedades (por ejemplo, actividad de -glucosidasa y termoestabilidad) de variantes de Bgl1 individuales (véanse las Tablas 2-7 y Ejemplos 2-9, más adelante). Se identificaron varias sustituciones de aminoácidos y combinaciones de sustituciones en variantes con actividad superior a las naturales y/o termoestabilidad a las naturales. Véase la Tabla 2. Se seleccionó una variante con elevada actividad y termoestabilidad y se sometió a posterior mutagénesis y selección. Véase la Tabla 3. Una variante de esta ronda de mutagénesis y selección se seleccionó y se sometió a mutagénesis y selección adicionales. Véase la Tabla 4. Una variante de esta ronda adicional de selección se seleccionó y se sometió a mutagénesis y selección adicionales. Véase la Tabla 5. Dos variantes de esta ronda de selección se seleccionaron y se sometieron a mutagénesis y selección adicionales. Véanse las Tablas 6 y 7.

Más específicamente, la presente invención proporciona una variante de polipéptido de -glucosidasa aislado y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína C1 natural, y que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en K57; A88; I106; N112; Q119; T120; A123; R132; Y135; A136; A141; K142; L149; G158; P161; P172; T177; I179; G180; M181; S182; E183; K186; A197; G202; Y219; N220; S222; T224; I229; M234; F242; A243; V246; Q258; D274; V286; Q291; Q313; V318; A343; T354; T357; D358; E360; D369; P374; I375; A378; Q381; E385; S388; V390; A394; N398; E402; K406; I428; S434; N437; E449; Q474; A475; T482; S489; Y491; K530; N536; T540; T565; V674; R682; I867; E868; P870 (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). “Sustitución”, en este contexto, significa que el residuo en la proteína de variante es otro distinto al residuo mostrado. Por ejemplo, “A88” indica una variante que comprende un aminoácido distinto de alanina en la posición 88 (es decir, uno de los otros 19 aminoácidos que se producen naturalmente). En algunas realizaciones, el aminoácido en la proteína de variante no es ni el residuo natural ni un residuo que sea un sustituto conservativo para el residuo natural. Como se trata más adelante, en este contexto, un sustituto conservativo para un residuo es otro residuo en el mismo grupo identificado en la Tabla 1.

La presente invención proporciona adicionalmente una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 (WT), en la que la variante comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2); tiene una sustitución en cada una de las posiciones Q291, D369 y E402; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en I106, A109, Q119, T120, R132, Y135, M181, Q215, A243, V246, Q258, A265, D274, N278, Q313, F314, G332, T357, D358, P374, E385, S434, N437, A475, S489, Y491, E493, K495, K497, S501. A503E N504, A505, N521, K530, N536. T540, D566, T591, A601, K610, T611, R612, S614, L620, G628, T635, V638, V648, D650, S652, N670, R672, V674, S676, T685, T687, A689, Q690, T699, D703, K708, Y715, A732, E742, L757, V775, T777 y D781 (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). En algunas realizaciones, el aminoácido en la proteína de variante no es ni el residuo natural ni un residuo que sea un sustituto conservativo para el residuo natural. Como se trata más adelante, en este contexto, un sustituto conservativo para un residuo es otro residuo en el mismo grupo identificado en la Tabla 1.

La presente invención proporciona adicionalmente una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural, en la que la variante comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2); tiene una sustitución en cada una de las posiciones Q258, Q291, Q313, D369, E402, S434, A475, K495, y G628; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en A4, A15, E21, S22, K24, V25, H26, Q27, P29, L30, N45, D47, Q55, S58, A79, Q85, I06, A109, Q119, Y135, A136, P161, V175, G180, G202, G216, I221, L237, D244, V253, V260, L275, D311, F314, A343, D358, E360, Q381, E385, A394, A404, A405, K421, I428, P436, N437, M454, D470, R476, A477, Q479, T482, Y491, E493, E494, T496, S501, A505, N536, V559, V562, N588, S604, R612, G616, A617, G626, N627, F634, D646, D650, S652, R672, V673, T685, T687, A689, Q690, K708, Y715, Q716, A732, A748, D751, L757K, S764, R769, V775, T777, T783, T785, S787, S799, P806, K807, R817, E819, E822, T823, V840, V846, 1847, S848, Y850, K866 y P870 (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). En algunas realizaciones, el aminoácido en la proteína de variante no es ni el residuo natural ni un residuo que sea un sustituto conservativo para el residuo natural. Como se trata más adelante, en este contexto, un sustituto conservativo para un residuo es otro residuo en el mismo grupo identificado en la Tabla 1.

La presente invención proporciona adicionalmente una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural, en la que la variante comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2); tiene una sustitución en cada una de las posiciones Q258, Q291, Q313, D369, E402, S434, A475, K495, G628, A689, y Y715; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en C8, L9, K24, V25, D47, S58, A79, Q85, I106, A109, A136, V175, L237, A243, V253, V260, D274, L275, F314, A343, Q381, E385, P436, N437, Q474, R476, A505, S550, N588, S604, G616, G626, D650, D651, S652, V674, T687, Q690, D709, E710, A732, D733, Y736N, L757, S764, T777, T783, T785, K807, M816, D844, V846, L869 y P870 (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). En algunas realizaciones, el aminoácido en la proteína de variante no es ni el residuo natural ni un residuo que sea un sustituto conservativo para el residuo natural. Como se trata más adelante, en este contexto, un sustituto conservativo para un residuo es otro residuo en el mismo grupo identificado en la Tabla 1.

La presente invención proporciona adicionalmente una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural, en la que la variante comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2); tiene una sustitución en cada una de las posiciones D47, Q258, Q291, Q313, A343, D369, E402, S434, A475, K495, G628, T687, A689 y Y715; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en A79, Q85, V260, L275, F314, D395, P439, A505, D646, T693, N723, A730, A732, S764, R769, T827 y Y855 (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). En algunas realizaciones, el aminoácido en la proteína de variante no es ni el residuo natural ni un residuo que sea un sustituto conservativo para el residuo natural. Como se trata más adelante, en este contexto, un sustituto conservativo para un residuo es otro residuo en el mismo grupo identificado en la Tabla 1.

La presente invención proporciona adicionalmente una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural, en la que la variante comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2); tiene una sustitución en cada una de las posiciones I106, Q258, V260, Q291W, Q313, F314, D369, E402, S434, K495, G628, A689, Y715 y A732; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en A109, A343, A475, A505, A689, A79, C8, D47, L275, N315, Q85, T591 y T687 (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). En algunas realizaciones, el aminoácido en la proteína de variante no es ni el residuo natural ni un residuo que sea un sustituto conservativo para el residuo natural. Como se trata más adelante, en este contexto, un sustituto conservativo para un residuo es otro residuo en el mismo grupo identificado en la Tabla 1.

TABLA 1

Aminoácidos básicos

Arginina, lisina, histidina

Aminoácidos ácidos

Ácido glutámico, ácido aspártico

Aminoácidos polares

Glutamina, asparagina

Aminoácidos hidrofóbicos

Leucina, isoleucina, valina

Aminoácidos aromáticos

Fenilalanina, triptófano, tirosina

Aminoácidos pequeños

glicina, alanina, serina, treonina, prolina, cisteina, metionina

En algunas realizaciones, el aminoácido en la proteína de variante no es ni el residuo natural ni un residuo que sea un residuo comúnmente intercambiado con el residuo natural como se define por los siguientes pares: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile,

Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

Como se resume en la Tabla 2, en ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural, es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2), y que tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K57R; A88S; I106V; N112V; Q119E/L; T120M/Y/V/H; A123N; R132K/G/W; Y135I/Q/M; A136E; A141F; K142R; L149Q/M; G158D; P161S; P172A; T177I; I179M; G180E; M181Y; S182L/W; E183G/M/Q/K; K186R; A197V; G202M/V; Y219V; N220Y/S/L; S222Q/E; T224N; I229M; M234E/I; F242L; A243V; V246L; Q258N; D274Y/N; V286I; Q291W/A/F; Q313M; V318E; A343V/T; T354Q; T357L/P; D358K/N; E360R/A/D; P374Y; I375V; A378K/T; Q381V/D/I/L; D369Q/L/Y/C/A/I/P/E/K/R/F/M/H/V; E385L; S388W/C; V390I; A394G/V/L/P/Q; N398G; E402N; K406D; I428V; S434P; N437F/Y/D/L/W; E449Q; Q474I; A475F/Y/H/W/C; T482A; S489L; Y491 H/F; K530M/G; N536K; T540K; T565A/G/P; V674I; R682W; I867M; E868R; P870S (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enumeradas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualesquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, o más de las posiciones anteriormente identificadas.

Como se resume en la Tabla 3, en ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural, en la que la variante es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2); tiene las sustituciones Q291W, D369H/L/R/Y y E402N; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en A109S, A243V, A265S, A475C/F/L/W, A503E, A505C, A601T, A689I, A732G/M, D274Y, D358E/K/N, D566G, D650F/V, D703K, D781N, E385L, E493A/V/Y, E742G, F314L/V, G332D, G628L/V/W, I106V, K495F/H/I/N/Q/V, K497R, K530C/D/E/I/M/N/V, K610S, K708F, L620M, L757K, M181Y, N278Y, N437D/F/I/K/L/V/W/Y, N504Y, N521C, N536K, N670D, P374Y, Q119E, Q215E/M, Q258H/N, Q313M, Q690A/K/R, R132H, R612H/P, R672A/D/F/G/I/S/T/V, S434P, S489I/UN/T, S501H/N/R, S614A/C/D/H/L/R/V/Y, S652D, S676C, S764F, T120H/Y, T357A, T540K, T591A/C/R, T611A/H/Q, T635A/I/V, T685V, T687C/F/K/L/M/W/Y, T699L, T777N, T779S, V246I, V638E/R/S, V648W, V674M, V775C, Y135Q, Y491F/H/L y Y715P (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enumeradas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualesquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ó 70, o más de las posiciones anteriormente identificadas.

Como se resume en la Tabla 4, en ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural, es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2), tiene las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N y G628W; y tiene al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en A4V, A15V, A109S/T, A136L, A343C, A394G, A404S, A405T, A477G, A505C, A617V, A689I, A732G/M/S, A748T, A79E/G/M, D244H, D311N, D358K, D470N, D47I, D646N, D650F/N/Y, D751 N, E21Q/R, E360D, E385L, E493A/V/Y, E494K, E819A/L/V. E822A/G/K/M, F314L/V, F634A, G180E, G202M, G216L, G616D, G626D, H26R, I106V, I221V, I428V, I847T, K24G/UT, K421R, K708F, K807R, K866I/Q, L237Y, L275Y, L30K, L757K, M454E, N437W, N45H, N536K, N588F, N627H, P161S, P29M/Q/R, P436E/Q, P806L, P870S, Q119E, Q27H/R, Q381V, Q479R, Q55R, Q690A/H/K, Q716R, Q85N, R476Q, R612H, R672G, R769H, R817P, S22UR, S501C/R, S58G, S604I, S652D, S764F, S787G, S799N, S848N, T482A, T496A, T685V, T687C/K/M, T777N, T783H/Q, T785L, T823K, V175A, V253F, V25A/G/R, V260G/L, V559T, V562C/L, V673A, V775C, V840I, V846F, Y135M/Q, Y491F, Y715P y Y850H/Q (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). En algunas realizaciones, el polipéptido de Bgl1 no tiene una sustitución en la posición A475. Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enumeradas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualesquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, o más de las posiciones anteriormente identificadas.

Como se resume en la Tabla 5, en ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural, es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2), tiene las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, A689I y Y715P; y tiene al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: C8A, L9F, K24G/T, V25A, D47I/N, S58G, A79E/G/M, Q85H/N, I106V, A109S/T, A136L, V175A, L237Y, A243G, V253F, V260G, D274Y, L275F/Y, F314L/V, A343C/G, Q381V, E385L, P436Q, N437D/K, Q474I/L, R476G, A505C, S550C, N588F, S604A/C/I/V, G616D, G626D, D650N/Y, D651 E, S652D, V674I, T687C/K/W, Q690H/K, D709E, E710G, A732G/M/V, D733G, Y736N, L757I/K, S764F, T777N, T783A, T785L, K807R, M816L, D844G, V846F/L/Q, L869R y P870S (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). En algunas realizaciones, la variante de péptidos de Bgl1 no tiene una sustitución en la posición A475. Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enumeradas anteriormente

incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualesquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más de las posiciones anteriormente identificadas.

Como se resume en la Tabla 6, en ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural, es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2), tiene las sustituciones D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, T687K, A689I, Y715P; y tiene al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: A79E/G/M, Q85N, V260G, L275Y, F314L/V, D395N, P439S, A505C, D646N, T693A/E, N723G, A730S, A732G/M/V, S764Y, R769H, T827I y Y855 (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). En algunas realizaciones, el polipéptido de Bgl1 de variante tiene la sustitución T687K o T687W en lugar de T687K. En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de Bgl no tiene una sustitución en la posición A475. Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enumeradas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualesquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15, o más de las posiciones anteriormente identificadas.

Como se resume en la Tabla 7, en ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural, es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2), tiene las sustituciones I106V, Q258N, V260G, Q291W, Q313M, F314L/V, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I, Y715P y A732G; y tiene al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: A109S/T, A343C/G, A475L, A505C, A79E/G/M, C8G, D47I, L275F/Y, N315D, Q85H/N y T591I, T687C/K/W (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). En algunas realizaciones, la proteína Bgl1 tiene adicionalmente la sustitución F314V. Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enumeradas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualesquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 o más de las posiciones anteriormente identificadas.

La presente invención proporciona además una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural y que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones rigurosas con el complemento de SEC ID Nº: 1 (por ejemplo, sobre sustancialmente la longitud entera de un ácido nucleico exactamente complementario a SEC ID Nº: 1) en la que el polipéptido codificado tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K57; A88; I106; N112; Q119; T120; A123; R132; Y135; A136; A141; K142; L149; G158; P161; P172; T177; I179; G180; M181; S182; E183; K186; A197; G202; Y219; N220; S222; T224; 1229; M234; F242; A243; V246; Q258; D274; V286I; Q291; Q313; V318; A343; T354; T357; D358; E360; P374; I375; A378; Q381; D369; E385L; S388; V390I; A394; N398; E402; K406; 1428; S434; N437; E449Q; Q474I; A475; T482; S489; Y491; K530; N536; T540; T565; V674; R682; I867; E868; P870 (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enumeradas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualesquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de las posiciones anteriormente identificadas.

La presente invención proporciona además una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural y que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones rigurosas con el complemento de SEC ID Nº: 1 (por ejemplo, sobre sustancialmente la longitud entera de un ácido nucleico exactamente complementario a SEC ID Nº: 1); en la que el polipéptido codificado tiene una sustitución en cada una de las posiciones Q291, D369 y E402; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en I106, A109, Q119, T120, R132, Y135, M181, Q215, A243, V246, Q258, A265, D274, N278, Q313, F314, G332, T357, D358, P374, E385, S434, N437, A475, S489, Y491, E493, K495, K497, S501. A503E N504, A505, N521, K530, N536. T540, D566, T591, A601, K610, T611, R612, S614, L620, G628, T635, V638, V648, D650, S652, N670, R672, V674, S676, T685, T687, A689, Q690, T699, D703, K708, Y715, A732, E742, L757, V775, T777 y D781 (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enumeradas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualesquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o más de las posiciones anteriormente identificadas.

La presente invención proporciona además una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 WT y que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones rigurosas con el complemento de SEC ID Nº: 1 (por ejemplo, sobre sustancialmente la longitud entera de un ácido nucleico exactamente complementario a SEC ID Nº: 1); en la que el polipéptido codificado tiene sustituciones en cada una de las posiciones Q258, Q291, Q313, D369, E402, S434, A475, K495 y G628; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en A4, A15, E21, S22, K24, V25, H26, Q27, P29, L30, N45, D47, Q55, S58, A79, Q85, I106, A109, Q119, Y135, A136, P161, V175, G180, G202, G216, 1221, L237, D244, V253, V260, L275, D311, F314, A343, D358, E360, Q381, E385, A394, A404, A405, K421, 1428, P436, N437, M454, D470, R476, A477, Q479, T482, Y491, E493, E494, T496, S501, A505, N536, V559, V562, N588, S604, R612, G616,

A617, G626, N627, F634, D646, D650, S652, R672, V673, T685, T687, A689, Q690, K708, Y715, Q716, A732, A748, D751, L757K, S764, R769, V775, T777, T783, T785, S787, S799, P806, K807, R817, E819, E822, T823, V840, V846, 1847, S848, Y850, K866 y P870 (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enumeradas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualesquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más de las posiciones anteriormente identificadas.

La presente invención proporciona además una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural y que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones rigurosas con el complemento de SEC ID Nº: 1 (por ejemplo, sobre sustancialmente la longitud entera de un ácido nucleico exactamente complementario a SEC ID Nº: 1) en la que el polipéptido codificado tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K57R; A88S; I106V; N112V; Q119E/L; T120M/Y/V/H; A123N; R132K/G/W; Y135I/Q/M; A136E; A141F; K142R; L149Q/M; G158D; P161S; P172A; T177I; I179M; G180E; M181Y; S182L/W; E183G/M/Q/K; K186R; A197V; G202M/V; Y219V; N220Y/S/L; S222Q/E; T224N; I229M; M234E/I; F242L; A243V; V246L; Q258N; D274Y/N; V286I; Q291W/A/F; Q313M; V318E; A343V/T; T354Q; T357L/P; D358K/N; E360R/A/D; P374Y; I375V; A378K/T; Q381V/D/I/L; D369Q/L/Y/C/A/I/P/E/K/R/F/M/H/V; E385L; S388W/C; V390I; A394G/V/LP/Q; N398G; E402N; K406D; I428V; S434P; N437F/Y/D/L/W; E449Q; Q474I; A475F/Y/H/W/C; T482A; S489L; Y491H/F; K530M/G; N536K; T540K; T565A/G/P; V674I; R682W; I867M; E868R; P870S (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enumeradas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualesquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de las posiciones anteriormente identificadas.

La presente invención proporciona además una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural y que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones rigurosas con el complemento de SEC ID Nº: 1 (por ejemplo, sobre sustancialmente la longitud entera de un ácido nucleico exactamente complementario a SEC ID Nº: 1) en la que el polipéptido codificado tiene una sustitución Q291W, D369H/UR/Y, y E402N; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A109S, A243V, A265S, A475C/F/L/W, A503E, A505C, A601T, A689I, A732G/M, D274Y, D358E/K/N, D369H/L/R/Y, D566G D650F/V, D703K, D781 N, E385L, E402N, E493A/V/Y, E742G, F314V, G332D, G628L/V/W, I106V, K495F/H/I/N/Q/V, K497R, K530C/D/E/I/M/N/V, K610S, K708F, L620M, L757K, M181Y, N278Y, N437D/F/I/K/L/V/W/Y, N504Y, N521C, N536K, N670D, P374Y, Q119E, Q215E/M, Q258H/N, Q291W, Q313M, Q690A/K/R, R132H, R612H/P, R672A/D/F/G/I/S/T/V, S434P, S489I/UN/T, S501H/N/R, S614A/C/D/H/UR/V/Y, S652D, S676C S764F, T120H/Y, T357A, T540K, T591A/C/R, T611A/H/Q, T635A/I/V, T685V. T687C/F/K/L/M/W/Y, T699L, T777N, T779S, V246I, V638E/R/S, V648W, V674M, V775C, Y135Q, Y491F/H/L y Y715P (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enumeradas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualesquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de las posiciones anteriormente identificadas.

La presente invención proporciona además una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 natural y que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones rigurosas con el complemento de SEC ID Nº: 1 (por ejemplo, sobre sustancialmente la longitud entera de un ácido nucleico exactamente complementario a SEC ID Nº: 1) en la que el polipéptido codificado tiene una sustitución en la posición Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N y G628W; y tiene al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en A4V, A15V, A109S/T, A136L, A343C, A394G, A404S, A405T, A477G, A505C, A617V, A689I, A732G/M/S, A748T, A79E/G/M, D244H, D311N, D358K, D470N, D47I, D646N, D650F/N/Y, D751N, E21Q/R, E360D, E385L, E493A/V/Y, E494K, E819A/L/V, E822A/G/K/M, F314L/V, F634A, G180E, G202M, G216L, G616D, G626D, H26R, I106V, I221V, I428V, I847T, K24G/L/T, K421R, K708F, K807R, K866I/Q, L237Y, L275Y, L30K, L757K, M454E, N437W, N45H, N536K, N588F, N627H, P161S, P29M/Q/R, P436E/Q, P806L, P870S, Q119E, Q27H/R, Q381V, Q479R, Q55R, Q690A/H/K, Q716R, Q85N, R476Q, R612H, R672G, R769H, R817P, S22L/R, S501C/R, S58G, S604I, S652D, S764F, S787G, S799N, S848N, T482A, T496A, T685V, T687C/K/M, T777N, T783H/Q, T785L, T823K, V175A, V253F, V25A/G/R, V260G/L, V559T, V562C/L, V673A, V775C, V840I, V846F, Y135M/Q, Y491F, Y715P, Y850H/Q (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enumeradas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualesquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de las posiciones anteriormente identificadas. En ciertas realizaciones, la proteína Bgl1 C1 tiene las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369L, E402N, S434P, A475L, K495N y G628W.

Se apreciará que variantes de Bgl1 de la invención pueden englobar sustituciones de aminoácidos adicionales más allá de aquellas enumeradas anteriormente (tales como sustituciones conservativas adicionales) y pueden ser de longitud inferior a completa en comparación con la proteína Bgl1 C1 natural. Así, las variantes de Bgl1 de la invención pueden comprender inserciones o deleciones (por ejemplo, truncación en los extremos amino y/o carboxi) con respecto a los residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2. La forma secretada natural de la proteína Bgl1 C1 tiene aproximadamente 851 aminoácidos de longitud; variantes de la presente invención pueden ser más largas o más

cortas que la natural. Para ilustración y no limitación, en algunas realizaciones la variante puede ser más larga o más corta hasta el 10 % de la longitud natural, algunas veces hasta el 5 %, algunas veces hasta el 4 %, algunas veces hasta el 3 %, algunas veces hasta el 2 %, algunas veces hasta el 1 %.

El análisis de actividad de las secuencias de variantes se realizó según los procedimientos descritos en el documento WO 03/075129, USSN 10/379.378 presentado el 3 de marzo de 2003; R. Fox y col., 2003, “Optimizing the search algorithm for protein engineering by directed evolution”, Protein Eng. 16(8):589-597, y R. Fox y col., 2005, “Directed molecular evolution by machine learning and the influence of nonlinear interactions”, J. Theor. Biol. 234(2):187-199, todas las cuales se incorporan en el presente documento por referencia, para identificar sustituciones con probablemente los mayores efectos significativos sobre la actividad.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q119E; R132H; Y135Q; G180E; G202M/V; Q258N; D274Y; Q291W/A/F; D358K/N; D369L/Y/V/A/H/R/F/E/M/I/K/C/P/Q; P374Y; E385L; A394L; E402N; S434P; N437F/D/UW/Y; Q474I; A475F/Y/H/C/W; T482A; S489L; K530M; N536K; T540K, que se predice que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la actividad de -glucosidasa.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye las sustituciones Q291W + D369L + E402N (como se encuentran en la variante 3), o las sustituciones Q291W + D369H/UR/Y + E402N. En algunas realizaciones, la secuencia incluye al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q258N/H, D358K/N, I106V, E385L, D274Y, K495H/I/N/Q, Q119E, Y135Q, G628W, R132H, N437I, S501R, P374Y, N437V, S614A, Q313M, L369H, S434P, N437W/D y Y491F. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es Q258N. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es D358K o Q258H. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es I106V, E385L, D274Y o K495H. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es K495I/N, Q119E, Y135Q o D358N. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es G628W, R132H, K495Q, N437I, S501R o P374Y. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es N437V, S614A, Q313M, L369H, S434P, N437W/D

o Y491F. Se predice que estas sustituciones son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la actividad de -glucosidasa.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N y G628W (como se encuentran en la variante 269), y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y715P, S764F, E385D/L, A732G/M, A689I, A109T, T687M/C/K, L757K, Q381V/D, A109S, T777N, I106V, T823K, Q716R, V846F, T685V, T687K, D650Y, F314V/L, S652D y I428V. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es Y715P. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es S764F, E385L, A732G, A689I, o A109T, o E285D. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es T687M, A732M o L757K. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es Q381V, A109S, T777N, I106V, T823K, T687C o Q716R. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es V846F, T685V, T687K, D650Y, F314V/L, S652D, Q381D o I428V. Se predice que estas sustituciones son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la actividad de -glucosidasa.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, A689I y Y715P (como se encuentran en la variante 481); o las sustituciones 258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I y Y715P; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A79E/M/G, Q85N, I106V, A109S/T, V260G, F314L/V, A343C/G, A505C, T687K/W/C y A732G/M/V. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es T687W. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es T687C o T687W, V260G, A343C, A732G o A109T. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es F314V/L, A732M/V, A109S o A343G. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es A79E, A505C, I106V o A79M/G. En algunas realizaciones, la variante Se predice que estas sustituciones son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la actividad de

-

glucosidasa.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye las sustituciones D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, A475L, S434P, K495N, G628W, T687K, A689I y Y715P (como se encuentran en la variante 647) o las sustituciones D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, T687W, A689I y Y715P; o las sustituciones D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, T687K/W/C, A689I y Y715P; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A79G/E/M, Q85N, V260G, L275Y y F314L/V, y A732G/M. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es A79E, A79M, A79G, A732G, V260G o F314L. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es Q85N, F314V o A732M. Se predice que estas sustituciones son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la actividad de -glucosidasa.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye las sustituciones I106V, Q258N, V260G, Q291W, Q313M, F314L/V, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I, Y715P y A732G (como se encuentran en la variante 664) y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D47I, A79G/E/M, A109T, A505C, A343C/G, T687W/C/K, N315D y L275F. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es A79E o A79G. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido sustituido es A109T, A79M, A505C o A343C. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido sustituido es T687W, T687C, D47I, T687K N315D o A343G. Se predice que estas sustituciones son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la actividad de -glucosidasa.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I106V; A123N; G180E; M181Y; M234E; Q258N; Q291W/F/A; T357L/P; D358K; E360D; D369L/V/C/Y/R/K/M/A/H/E/F/Q/P/I; P374Y; E385L; A394G; N437D/L; T482A; S489L; K530M; N536K; T540K, que se predice que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye las sustituciones Q291W, D369H/L/R/Y y E402N; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q313M, Q258N/H, N536K, Q119E, S489I/N/L/T, T120Y, K495N/V/I/H/Q, I106V, T120H, N437I/D/W/F/K/L/V/Y, E385L, M181Y, D274Y, S434P, S501R, T591C, Y135Q, Y491H/F, T540K, N521C, T591R, G628W y A475L. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es Q313M o Q258N. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es N437I, K495N, Q258H o N536K. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es Q119E, S489I, T120Y, K495V, S489L, I106V, T120H o N437D. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es N437W, K495I, N437F, E385L, K495H, N437K, N437L, S489T, M181Y, D274YS434P o N437V. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es S501R, T591C, Y135q, Y491H, R491F, T540K, N521C, T591R, K495K, G628W, N437Y, S489N o A475L. Se predice que estas sustituciones son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, Q381V, E385L, E402N, S434P, A475L, K495N y G628W; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S764F, Y715P, E385UD, A732G/M, A109T/S, T687M/C/K, T777N, I106V, L475A, F314V, D650Y, L757K. Q716R, T685V o F314L. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es S764F o Y715P. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es E385L o A732G. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es A109T o T687M. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es T777N, I106V, !732M, T687C, T687K, E385D, L475A o A109S. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es P720P, F314V, D650Y, L757K, Q716R, T685V, o F314L. Se predice que estas sustituciones son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, A689I y 715P (como se encuentran en la variante 481); y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D47I, A79E, Q85N, I106V, A109S/T, V260G, L275Y, F314L/V, A505C, T687W/C/K y A732G/M/V. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es T687K/W/C. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido sustituido es I106V, V260G, F314V, A732G, A109T, F314L, A732M, Q85N o A109S. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido sustituido es F314, A732V, A505C, D47I, L275Y o A79E. Se predice que estas sustituciones son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye las sustituciones D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, T687K/W, A689I y Y715P (como se encuentran en la variante 647); o las sustituciones D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, T687K/W, A689I y Y715P; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A79E/G/M, Q85N, V260G, L275Y, F314V/L, D395N y A732G, que se predice que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es A79M, F314V o A79G. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es A79E, F314L, V260G, A85N, D395N o A732G.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye las sustituciones I106V, Q258N, V260G, Q291W, Q313M, F314L/V, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I, Y715P y A732G (como se encuentran en la variante 664) y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A109S/T, A79G/E/M, D47I, Q85N/H, L314V y T591I. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es A109S, A79G, A109T o A79E. En algunas realizaciones, el al menos un residuo de aminoácido sustituido es D47I, A79M, A85N o A85H. Se predice que estas sustituciones son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye al

menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en G180E; Q258N; Q291W/A/F; D358K; D369L/Y/V/A/H/R/F/E/M/I/K/C/P/Q; P374Y; E385L; N437D/L; T482A; S489L; K530M; N536K; y T540K, que se predice que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar tanto la termoestabilidad como la actividad de -glucosidasa.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye Q291W, D369H/L/R/Y y E402N; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q258N/H, I106V, E385L, D274Y, K495H/I/N/Q, Q119E, Y135Q, G628W, N437I/V/W/D, S501R, Q313M, S434P y Y491F, que se predice que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar tanto la termoestabilidad como la actividad de -glucosidasa.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N y G628W; o Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, K495N y G628W; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S764F, Y715P, E385UD, A732G/M, A109T/S, T687M/C/K, T777N, I106V, F314V, D650Y, L757K, Q716R, T685V y F314L. Se predice que las sustituciones son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar tanto la termoestabilidad como la actividad de -glucosidasa.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, A689I y 715P (como se encuentran en la variante 481); y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A79E, Q85N, T687K/W/C, I106V, A109T/S, V260G, F314V/L, A505C y A732G/M/V. Se predice que las sustituciones son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar tanto la termoestabilidad como la actividad de glucosidasa.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, T687K/W, A689I y Y715P (como se encuentran en la variante 647); o D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, T687K/W, A689I y Y715P; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A79E/G/M, Q85N, V260G, F314V/L, A732G y L275Y. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituido es A79E, A79M, A79G, Q85N, V260G, F314V, F314L o A732G. Se predice que las sustituciones son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar tanto la termoestabilidad como la actividad de

-

glucosidasa.

Ciertas variantes de -glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye las sustituciones I106V, Q258N, V260G, Q291W, Q313M, F314L/V, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I, Y715P y A732G (como se encuentran en la variante 664) y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D47I, A79E/M/G y A109T, que se predice que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar tanto la termoestabilidad como la actividad de -glucosidasa.

En particular, varias variantes con actividad y/o termoestabilidad superior comprenden sustituciones en la posición 369, con 14 residuos alternativos diferentes (es decir, no ácido aspártico) que aparecen en variantes beneficiosas. Se predice que las sustituciones en la posición 369 aumentan la actividad y/o termoestabilidad. Así, en un aspecto la invención proporciona una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) en la que el aminoácido en la posición 369 no es ácido aspártico. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 369 está seleccionado del grupo que consiste en Q, L, Y, C, A, I, P, E, K, R, F, M, H y V. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 369 es L (leucina), que parece particularmente beneficioso para -glucosidasa y termoestabilidad.

Varias variantes con actividad y/o termoestabilidad superior comprenden sustituciones en la posición 291. Se predice que las sustituciones en la posición 291 aumentan la actividad y/o termoestabilidad. Así, en un aspecto la invención proporciona una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20870 de SEC ID Nº: 2) en la que el aminoácido en la posición 291 no es glutamina. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 291 es W, A o F. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 369 es W (triptófano), que parece particularmente beneficioso para -glucosidasa y termoestabilidad.

Varias variantes con actividad y/o termoestabilidad superior comprenden sustituciones en la posición 402. Se predice que las sustituciones en la posición 402 aumentan la actividad y/o termoestabilidad. Así, en un aspecto la invención proporciona una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (Bgl1) (residuos 20870 de SEC ID Nº: 2) en la que el aminoácido en la posición 402 no es ácido glutámico. En algunas realizaciones, el aminoácido no es ni ácido glutámico ni ácido aspártico. En algunas realizaciones, el aminoácido no es ácido glutámico, ácido aspártico o prolina. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 402 es asparagina, glutamina, histidina, lisina o arginina. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 402 es asparagina o

glutamina. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 402 es N (asparagina), que parece particularmente beneficioso para -glucosidasa y termoestabilidad.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en:

M181Y + Q291W + E402N + S434P; R132K + L149M + Q313M + D369L + E385L + N437D; Q291W + D369L + E402N; Y135I + Q258N + Q474I; M181Y + Q291W + E360D + D369V + P374Y + T482A; Q258N + N437F + S489L + Y491 H; Q119E + Q258N + T357L + Q474I + S489L; Q258N + D369R + S489L + Y491 H; N220Y + Q258N + T357L + D369R + Q474I + Y491F; M234E + V246L + D358K + D369L + N398G + K530M; Y135Q + I229M + F242L + D369L + K530M; D369Q + P374Y + E402N + T540K; Y135Q + P172A + I179M + I229M + Q291A + D358K + D369L + N398G; R132K + D369L + E385L; Y135M + I179M + Q291A + D358K + D369L; Q291W + P374Y + E402N

+

S434P; Q119E + N220Y + Q258N + T357L + S489L; I179M + Q291A + D358K + D369L + I375V + S388W; Q291W + D369C; R132K + T354Q + D369L + N437L; Q291A + D369L + N398G + K530M; Q119E + Q258N + D274Y + S489L; Q119E + N220Y + Q258N + Q474I + S489L; M181Y + D369L; T120M + S222E + Q313M + T354Q

+

D369L + E385L; A4G + Q258N + D274Y + T357L + N437W + Q474I + Y491 H; R132G + D369L + N437D; S182L + Q313M + D369L + E385L; R132G + D369L + E385L; N112V + D358K + D369L + S388W + K530M; I106V + G180E + D369L + Q381V; I179M + Q291A + D369L; I179M + D358K + D369L + S388W; M234E + Q291A + D369L

+

N398G; I179M + Q291A + D358K + D369L + Q381I; Y135Q + N220L + Q291A + D369L + N398G; Y135I + D369L; S182L + D369L + E385L + N437L; T120Y + R132K + D369L + N437D; M234E + D369L + S388W + N398G + K530M; Y135M + I179M + D369L + V3901 + K530M; L149Q + A197V + Q313M + D369L; T120M + R132K + D369L

+

N437L; T120M + R132W + L149M + Q313M + T354Q + D369L + E385L + N437D; A4G + Y135I + N220Y + Q258N

+

T357P + N437Y; D358K + D369L + S388W; Q258N + D274Y + N437F; D369L + S434P + T540K; G158D + I179M

+

Q291A + D358K + D369L + I375V + N398G + K530M; Y135I + D274Y + D369R; Q258N + D369L + Q474I + S489L

+

Y491F; R132W + S182W + D369L + E385L; S182L + T354Q + D369L + E385L; S222Q + T354Q + D369L + E385L

+

N437D + T565G; Y135M + P161S + Q291A + A343T + D369L + I375V + K406D; Q291W + D369C + T540K; D369L + P374Y + E402N; Y135I + A343V + D369F + S489L; M234E + D358K + D369L + S388W; T120M + L149Q + D369L + E385L; Q313M + D369L + E385L; T120Y + D369L + E385L; D369L + N437D + T565A; N112V + Q291A + D369L + I375V; R132W + L149Q + Q313M + T354Q + D369L; Y135M + D369L + I375V + N398G; D369L + E385L; T120M + S182L + Q313M + T354Q + D369L + E385L; T177I + Q291W + P374Y + T482A; Q258N + N437F; T120V + R132W + D369L + T565G; N112V + Q291A + D358N + D369E + S388C + K406D; Q291A + D358K + D369L + S388W + K406D; I106V + E360R + D369L + Q381V; M234E + Q291A + D369L + S388W + N398G; L149M + Q313M + D369L; M234I + Q291W + E360D + D369V + T482A; T120V + T354Q + D369L + E385L + T565P; M234I + Q291W + E360D + S434P; D369Y + I867M + E868R; R132W + S182L + Q313M + D369L; M234I + Q291W + P374Y + T482A; Y219V + M2341 + D369C + P374Y + S434P; S182L + Q313M + D369L + E385L + N437L; M234E + D358K + D369L + S388W + K530M; R132G + S222E + D369L + E385L; R132K + L149M + S182L + D369L + N437L; T120H + Q313M + D369L; R132W + D369L; D369L + P374Y; N112V + N220L + Q291A + D369L + S388W + N398G; Q291A + D369L + I375V + K530G; R132K + L149M + S182L + T354Q + D369L + N437D + T565G; T120H + S222E + Q313M + D369L + N437D + T565G; A123N + Q291W + T482A + T540K; S222E + Q313M + T354Q + D369L + E385L; R132W + D369L + T565G; G202M + E360A + D369I + A394L; R132G + S222Q + Q313M + D369L; R132W + L149M + D369L; L149M + Q313M + T354Q + D369L; Q119L + G202M + D369L; M181Y + M234I + D369C; I179M + N220L + Q291A + D369L + I375V; S222E + Q313M + D369L + E385L + N437L; I179M + M234E + D358K + D369L + S388W + N398G; A123N + Y219V + Q291W + E360D + P374Y + S434P; D369L + E402N; D369L; Y219V + M234I + Q291W + T482A; Q291W + E360D + S434P; D369L + S434P; G180E + E360R + D369L; A123N + M181Y + Q291W + D369K + S434P + T540K; Q119E + T357L + D369M + S489L; Q119E + D369F + Y491H; Q119L + D369L; Q119E + N220Y + V286I + S489L; Q291A + D369L + Q381I; A475F; D369L + N536K; Q119E + Y135I + D369H; Q258N + S489L; Q119E + Y135I + N437Y; Q119E + Y135I + N437F + Y491F; Q119L + D369L + A394V; E183G + E360A + D369L + I428V; D369L + E449Q + N536K; Q119L + G202M + E360A + A475F; I106V + D369L; Y135I + D369M; M234I + D369C + S434P; D369L + A475Y; Q119E + Y135I + S489L; D369Y + N536K; E360R + D369L; G202V + A475H; D369L + Q381V + N536K; N220Y + Q258N + S489L + Y491F; Q258N + T357L + D369M; I179M + Q291A + D369L + Q381L + S388W + N398G; D369Y + A394G + N536K; Q291W + E360D

+

D369V + P374Y; T120M + L149Q + T354Q + D369L + E385L; S489L + Y491H; N220S + Q291F + D369L; D369C + S434P + T540K; V318E + D369L + I428V; E183M + G202M + E360A + D369L + A378K + A394V; A394G + N536K; Q291W + T540K; N220L + Q291A + D369L + Q381L + S388W + K530M; T120V + R132W + E385L + N437D; Q119L + E360A + D369L + A378K; D369A + N536K; G202V + D369L + A475H; Q381V + A475Y + N536K; S434P; I106V + G180E + D369Y + A394G; G180E + Q381V + A475H; Q119E + N220Y + Q474I; I106V + D369Q; A475Y + N536K; K142R + Y219V + Q291W + S434P + V674I; L149Q + S182L + Q313M + D369L + N437L; N112V + I179M + M234E + D369L + N398G; E360A + D369L + A378K; E360R + D369Y + N536K; E360R + D369A + Q381V + N536K; D369L + Q381D; N437F + S489L; E183M + G202M + V318E + D369I + A394L + I428V; E360D + D369L + E402N + S434P; Q119L + A141 F + G202M + A394L + I428V + A475F; T357L + D369R + S489L + Y491H; Y135I + Q258N + T357L; K142R + Q291W + E360D + D369C + E402N; E183M + A243V + D369L + A378K + A475F; R132K + L149M + E385L; D369Y; M234I + E402N + S434P; N437Y; Q119E + N437F; N536K; Q119L + E183Q + G202M + D369P; N112V + I179M + Q291A + D358K + K406D; A123N + Q291W + T540K; D369I + A394L

+

I428V; A88S + N536K; Q119E + Y135I + N437F; A141 F + G202M + E360A + D369P + A378K; A123N + T482A; Q313M + N437D; E360R + D369Y; E183M + G202M + A475F; Q119L + E360A + A394V + A475F; D369L + A378K;

E360R + D369L + A394G; M181Y + D369E + S434P; D369I; N112V + Y135Q + I375V + K406D + K530M + P870S; Q119E + Y135I + N220Y + Q258N; D369P + A394V + 1428V; V318E + D369L; K186R + N536K; Q119L + D369L + A378K; M234I + D369K + S434P; N112V + I179M + N220L + Q291A + Q381I + S388W + N398G; E402N + S434P; Q119L + A141 F + G202M + A394Q; Q313M + T354Q + N437D; N112V + M234E + D369L + I375V + K406D; Q119E

+

A136E + N220Y; Q381D + A394G + N536K; Q119L + E183G + D369Q + A378T + V390I; Y135I + T357L + Q474I

+

S489L + Y491F; D369E + A394P + I428V; N112V + Q291A + Q381I + N398G; E360R + N536K; E360D + D369C; R132W + S182L + E385L; I179M + Q291A + D358K + N398G + K530G; N220Y + Q258N + T357L; T224N + D274Y

+

T357L + N437F; N437D; M234I + E360D + T482A; A141 F + G202M + D274N + V318E + E360A + I428V; D369Q; N112V + N220L + D358K + D369L + I375V + Q381I + N398G; Y135I + D369F; A243V + V318E + E360A + A475W; N220L + D369L + Q381L + S388W + N398G + K530G; S489L; K142R + Y219V; Y135I + N220Y + Y491F; S182W + T354Q + E385L; I179M + D358K + S388W; L149M + Q313M + T565P; R132G + E385L; V318E; Q119L + E183K; R132W + E385L; E183G + V318E + E360A + A394Q + A475C; E183M + G202M + E360A; A394G; D369P; Y135M + Q291A + S388W + N398G; Y219V + D369C; A394V + I428V; Q119L; Y135I; E360R + D369Q + Q381D + N536K; N220L + M234E + Q291A + I375V + K530M; Q119L + G202M + E360A; N220Y + Q258N + D369R; M181Y + M234I + Q291W + E402N; A394V; T120M + L149Q + Q313M; Q119L + V318E + I428V; E360R + Q381V; K57R + G202M + E360A + A394V; I179M + D358K + I375V + Q381L; E360A; I179M + R682W; E360A + I428V; y D369K + P374Y (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2).

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en:

I106V + Q258N + Q291W + D369L + E402N + S434P; I106V + Y135Q + Q258N + Q291W + Q313M + D369H + E402N + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; I106V + Q258N + Q291W + Q313M + D369H + E402N + S434P + A475C + K495I + T540K + G628W; 1106V + Q258N + Q291W + D369R + E402N + S434P + K495H + G628L; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437I + S489N; Q258N + Q291W + Q313M + D369H + E402N + S434P + T540K; 1106V + Q258N + Q291W + D369L + E402N + S434P + A475F + K495H + G628V; Q258N + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P + A475C + K495I + G628W; I106V + Y135Q + M181Y + Q258N + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P + K495N; Y135Q + Q258N + Q291W + D369L + E402N + K495N; Q119E + D274Y + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437V + S489N + S614A; Y135Q + Q258N + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P + A475F + K495N + G628V; R132H + Q258N + Q291W + D369Y + E402N + K495Q; Y135Q + Q258N + Q291W + D369L + E402N + S434P + A475F + K495H; Y135Q + Q258N + Q291W + D369R + E402N + S434P + K495I + G628V; I106V + M181Y + Q258N + Q291W + D369L + E402N; I106V + Q258N + Q291W + D369H + E402N + S434P + A475F + K495F + G628V; Q258N + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P + G628V; Q258N + Q291W + D369L + E402N + A475F + K495I; Q119E + D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437I; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L; Q258N + Q291W + D369Y + E402N + S434P + K495H + G628W; D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437I + S489N + K530C; I106V + Y135Q + Q258N + Q291W + Q313M + D369Y + E402N + S434P + A475F + K495H + T540K; Q119E + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N; I106V + M181Y + Q258N + Q291W + Q313M + D369H + E402N + S434P + A475L + K495Q + G628V; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437D; Q258N + Q291W + D369R + E402N + S434P + G628V; Q258N + Q291W + Q313M + D369H + E402N + S434P + G628L; Q258N + Q291W + D369L + E402N; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437F + S614D; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437L + K530V; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437V + S489L + K530N; Q258N + Q291W + D369L + E402N + S434P + A475F + K495F + T540K; M181Y + Q291W + Q313M + D369Y + E402N; A243V + D274Y + Q291W + D358K + D369L + E402N + N437I + K530C; Q119E + D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437V + K530V + S614A; Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437W + K530C + S614A; Q119E + D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437W; D274Y + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437I + K530N + S614V; M181Y + Q258N + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P; A109T + Q291W + D369L + E402N; Q119E + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437Y + S489I + K530N; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437D; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437W + K530V + S614D; Q258N + Q291W + D369R + E402N + A475W + K495H + G628V; A109S + Q291W + D369L + E402N; Q119E + D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437L + S614A; Q291W + D369L + E402N + E493Y + N504Y + T611A; Q119E + D274Y + Q291W + D358K + D369L + E402N + S614V; D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437L + K530N + S614A; Q258H + Q291W + Q313M + D369R + E402N + A475F + K495N + G628L; Q258N + Q291W + Q313M + D369Y + E402N + A475W + K495V + T540K + G628W; D274Y + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437W + S614V; I106V + Y135Q + Q291W + Q313M + D369L + E402N + A475L + K495Q; Q258N + Q291W + D369R + E402N + S434P + A475F + G628V; Q119E + D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437V; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437Y + S489L + K530V; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E402N; Q291W + D369L + E402N + K495V + S501 R + A503E + K530N + T611H; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437V + S489I + K530C; Q119E + Q291W + D358K + D369L + E402N + N437L + S489N; D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437W + K530C + S614D; Q258N + Q291W + D369R + E402N + A475F + K495N + T540K + G628V; Q291W + D369L + E402N + E493V + N504Y; Q291W + D358E + D369L + E385* + E402N + S489T; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + A475L + K495V + A601T + G628W; D274Y + Q291W + D358N + D369L +

E385L + E402N + S489N + S614C; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E402N + N437V + S489L + K530C + S614A; Q119E + D274Y + Q291W + D358E + D369L + E402N + N437D; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437L + S614R; D274Y + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437Y + K530V; D274Y + Q291W + D358E + D369L + E402N + N437Y + S489N + K530N + S614V + D781 N; Q258H + Q291W + D369* + E402N + S434P + T540K + G628L; Q119E + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437L + S489N + K530V; Q258N + Q291W + D369L + E402N + G628V; Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + S489I + K530N; Q119E + Q291W + D369L + E385L + E402N + S489N + K530V + S614A; I106V + Y135Q + Q291W + D369L + E402N + S434P + A475F + K495H + G628L; Q119E + Q291W + D358K + D369L + E402N + N437V + K497R + S614A; Q119E + D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437L; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E402N + N437L + S489I + K530V + S614A; I106V + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P + A475W + K495N + G628W; Q291W + D369L + E402N + A505C + L620M + T635I; Q291W + D369L + E402N + E493A + N504Y + A505C + L620M + T635A; D274Y + Q291W + D358N + D369L + E402N + S489N + K530C + S614A; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437W + K530D; Q291W + D369L + E402N + S489N + K495H + S501 R + K530N; D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437D + K530C + S614H; Q119E + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437W + S489N + K530E + S614A; Q291W + D369L + E402N + E493Y + N504Y + N521C + T591A + R612P + L620M + T635I; Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437I + K530M + S614L; Q291W + D369L + E402N + R672I; D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437L + S489L; A265S + Q291W + D369L + E402N; Q215M + Q291W + D369L + E402N; Q291W + D369L + E402N + E493V + N504Y + N521 C + T591A + L620M + T635I; Q119E + D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437L + S489N + K530M + S614D; Q119E + Q291W + D369L + E385L + E402N; Q291W + D369L + E402N + E493A + N504Y + D566G + R612P + L620M + T635A; Q119E + D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + S614Y; I106V + Y135Q + M181Y + Q258N + Q291W + D369L + E402N; Q119E + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437W + K530V; Q215E + Q291W + D369L + E402N; Q291W + D369L + E402N + N504Y + N521C + T591A + R612H + L620M + T635I; Q119E + D274Y + Q291W + D358K + D369L + E402N + N437Y + K530I; Q258H + Q291W + D369L + E402N + K495N; Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437D + S489N + K530I; Q291W + D369L + P374Y + E402N + Y491L + S501 R; Q258N + Q291W + Q313M + G332D + D369H + E402N + S434P; Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437F + S489L + K530V; Q291W + D369L + E402N + R672S; Q291W + D369L + E402N + T687M; Q291W + F314V + D369L + E402N; Q258N + Q291W + T357A + D369H + E402N + S434P + K495F; Q291W + D369L + P374Y + E402N + Y491F + S501R + N521C; Q291W + D369L + E402N + Q690K; Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437F + K530V + S614A; Q291W + D369L + E402N + R672A; Q291W + D369L + E402N + R672T; Q291W + D369L + E402N + D703K; D274Y + Q291W + D369L + E402N; Q291W + D369L + E402N + R672F; Q291W + D369L + E402N + R672D; Q291W + D369L + E402N + Y491F + S501 R + N536K + D566G; Q291W + D369L + E402N + A732G; Q291W + D369L + E402N + E493Y + N504Y + N521C + T591 C + R612P + L620M; I106V + Y135Q + Q291W + D369L + E402N + A475F + G628W; Q291W + D369L + E402N + R672G; Q291W + D369L + E402N + T777N; Q291W + Q313M + D369L + E402N + T540K; Q291W + D369L + E402N + K708F; Q291W + D369L + P374Y + E402N + S501H; Q291W + D369L + E402N + Y715P; Q291W + D369L + E402N + A732M; Q291W + D369L + E402N + E493A + N504Y + N521C + D566G + R612P + L620M; Q291W + D369L + E402N + Q690R; D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437V + K530I + S614D; Q291W + D369L + E402N + L757K; Q291W + D369L + E402N + T687Y; Q291W + D369L + E402N + Y491H + S501R + N521C + T591A; Q291W + D369L + E402N + V775C; Q291W + D369L + E402N + R672V; Q291W + D369L + E402N + N670D; Q291W + D369L + E402N + T779S; Q291W + D369L + E402N + V638R; Q291W + D369L + E402N + T687F; Q291W + D369L + E402N + T687L; Q291W + D369L + E402N + K610S; Q291W + D369L + E402N + Y491 L + S501R + N521C; D274Y + Q291W + D358E + D369L + E402N + K530V + S614V; I106V + M181Y + Q258N + Q291W + D369R + E402N + S434P + A475W + K495V + T540K + G628V; Q291W + D369L + E402N + N536K; Q291W + D369L + E402N + E493V + N504Y + R612P + L620M; Q291W + D369L + E402N + S676C; Q291W + D369L + E402N + T540K + G628W; Q291W + D369L + E385L + E402N + N437D + S489L + K530C + S614D; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437F + S489N + S614L; Q291W + D369L + E402N + S434P + A475W + K495V; Q291W + D369L + E402N + A689I; Q291W + D369L + E402N + E493A + N504Y + N521C + D566G + R612H + L620M; Q291W + D369L + E402N + V638S; Q291W + D369L + E402N + V648W; Q291W + D369L + E402N + D650V; Q291W + D369L + E402N + V674M; Q291W + D369L + E402N + V638E; I106V + Q291W + D369L + E402N; Y135Q + Q291W + D369L + E402N; Q291W + D369L + E402N + S764F; Q291W + D369L + E402N + E493A + N504Y + A505C + N521C + T591A + R612P; Q291W + D369L + E402N + S489N + K495Q + S501 R + K530N + T611Q; Q291W + D369L + E402N + T685V; I106V + Q291W + D369L + E402N + S434P + A475C + K495N + T540K; Q119E + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437D + K530N + S614V; Q291W + D369L + E402N + T687K; Q291W + D369L + E402N + S652D; Q291W + D369R + E402N + A475F + K495Q + T540K + G628L; Y135Q + Q291W + D369L + E402N + G628V; Q291W + D369L + E402N + E493Y + A505C + N521 C + T591A + L620M; Q291W + D369L + E402N + T687W; Q291W + D369L + E402N + D650F; Q291W + D369L + E402N + T687C; Q291W + D369L + E402N + S434P + K495N + G628V; Q291W + D369L + E402N + S501 N; D274Y + Q291W + D369L + E402N + N437K + S489I + K530V + S614L; Q291W + D369L + E402N + T699L; Q119E + V246I + Q291W + D358E + D369L + E402N + S614L; Q291W + D369L + E402N + N504Y + N521C + D566G + L620M + T635A; Q291W + D369L + E402N + E493Y + N504Y + D566G + T591A + R612P + L620M; Q291W + D369L + E402N + N536K + T591 A; Q291W + D369L + E402N + Q690A; Q291W + D358K + D369L + E402N + N437L + S489I + K530D; Q119E + D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437V + S489N + K530M + S614H; Q291W + D369L + P374Y + E402N + Y491 L; Q291W + D369L + E402N + S501 R; Q291W + D369L + E402N + Y491 L + N521C + N536K; Q291W + D369L + E402N + E493Y + N504Y +

N521C + T591C + R612P + L620M + T635V; Q119E + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437I + S489I + S614L; T120Y + Q291W + D369L + E402N + S501R + N521C + D566G; Q291W + D369L + E402N + Y491 L + N521C; Q291W + D369L + E402N + Y491 L + S501 N + D566G + T591A; D274Y + N278Y + Q291W + D358E + D369L + E402N + N437Y + S489L + K530E; I106V + Q291W + D369L + E402N + S434P + A475W + K495F + T540K + G628V; Q119E + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437Y + E742G; Y135Q + Q291W + D369Y + E402N + A475F + K495F; T120H + Q291W + D369L + E402N + Y491H + S501 H + T591C; Q119E + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437F + S489N + K530E + S614L; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437I + S489N + K530V + S614Y; T120Y + Q291W + D369L + E402N + N521C + N536K; Q291W + D369L + E402N + Y491F + S501 N + N521C + N536K + T591R; Q291W + D369L + E402N + S501 N + N521C + D566G + T591R; Q291W + D369L + E402N + Y491 L + S501 R + N536K + D566G + T591 R; y D274Y + Q291W + D358E + D369L + E402N + N437Y + S489N + K530I + S614L (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2).

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 WT (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en:

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + Y715P + T823K; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T685V + Y715P; I106V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S764F; A109T + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + I428V + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + Y491F + K495N + G628W + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + Q381V + E402N + S434P + A475L + K495N + S501R + G628W + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S764F; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E385L + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + N627H + G628W + A732G; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T685V + Y715P + T777N; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + D650Y + Q716R + L757K; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + V562L + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + S764F; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + Y715P + E819V; A109T + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S652D + V846F; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + Q690K; D47I + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; E21Q + V175A + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + E360D + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + L757K; Q258N + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S604I + N627H + G628W + A732G; A109T + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + V775C; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S764F; P29Q + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; A136L + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S764F + P870S; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E385L + E402N + S434P + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687M; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + N588F + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D358K + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Y135M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T785L; A79G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; A109T + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S848N; I106V + Q258N + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A732G; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + L757K; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + N627H + G628W + T687M + E822K; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G616D + G628W; A79M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; I106V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A617V + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + P436Q + A475L + K495N + G626D + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C; Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; A109S + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + N536K + G628W; S58G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; E21Q + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + Q381V + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + L275Y + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L +

K495N + A505C + G628W; E21R + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; V25A + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; H26R + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; L30K + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; N45H + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + E493V + K495N + G628W; P29R + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; P29M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A732S + A748T + V840I; Q55R + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; K24G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; G180E + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + Q479R + K495N + S501R + G628W + Y715P + E819L; 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Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + E494K + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + E360D + D369R + E402N + S434P + D470N + A475L + K495N + G628W + L757K; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S764F; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + D650F; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S848N; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + T496A + N536K + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + K421 R + S434P + A475L + K495N + G628W + T777N; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + N627H + G628W + E822M; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + F634A; A4V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + N437W + A475L + K495N + G628W; Y135Q + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P +

A475L + K495N + G628W; Y135Q + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + V673A + T685V; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + L757K + P806L; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + V559T + G628W; Y135M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + V775C; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + N627H + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + A405T + S434P + A475L + K495N + G628W; I221V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S501 R + G628W + T685V; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + A394G + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + L757K; P161S + Q258N + Q291W + Q313M + D358K + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G616D + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + K807R; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A732M; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + E822G; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + E493V + K495N + G628W + S652D; A15V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + K866Q; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + E493A + K495N + G628W + S652D + Q690A; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + E819L; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + E819V; G180E + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E385L + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + D751N; G202M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + N627H + G628W + T687K + E822A; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + K866I; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T783Q; Q258N + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + E493Y + K495N + A505C + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + T482A + K495N + G628W + D646N; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + A477G + K495N + G628W + S764F + S848N; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + I847T; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T685V + Y850Q; Y135M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S501R + G628W + T685V + T777N; y Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + Y850Q (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2).

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 WT (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en:

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; D471 + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A6891 + Y715P; A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P + S764F; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P + S764F; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P; D47I + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A6891 + Y715P + S764F; D47I + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F; D47I + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A6891 + Y715P; A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P; D47I + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P; I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; D47I + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S652D + A689I + Y715P + A732G; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S652D + A689I + Y715P + A732G; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R +

E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A6891 + Y715P + S764F; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S652D + A689I + Y715P + A732M; A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A6891 + Y715P + S764F; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343G + D369R + E402N + S434P + Q474L + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A6891 + Y715P + S764F; D47I + A109T + Q258N

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Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + P436Q + A475L + K495N + G616D + G628W + D650N + A689I + Y715P; A79E + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + V674I + A689I + Y715P;V25A + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + L757K;V25A + Q85H + Q258N + L275F + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + D650N + A689I + Y715P + L757I;K24T + A79E + A136L + Q258N + D274Y + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P;V25A + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A6891 + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;K24G + A79E + Q258N + D274Y + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P; Q85N + V175A + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;V25A + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + D650N + A689I + Y715P;V25A + Q85N + Q258N + L275Y + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + L757K; A79M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P; Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + P436Q + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + ; Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I+ Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I+ Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A6891 + Y715P; Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N +

G628W + A689I + Y715P;1106V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S604A + G628W + A689I + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;V25A + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + Q474I + A475L + K495N + G628W + A6891 + Y715P + S764F; Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; D47I + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + N588F + G628W + A689I + Y715P;S58G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + Q381V + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;V253F + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + T785L + M816L; A243G + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F; I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + N588F + G628W + S652D + A689I + Y715P + D733G; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + V846L; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S604A + G628W + A689I + Y715P; A79G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + T777N; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;V25A + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;K24T + A79E + Q258N + D274Y + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + T777N; D47I + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S604V + G628W + T687C + A689I + Y715P + S764F + L869R; Q258N + D274Y + Q291W + Q313M + D369R + E385L + E402N + S434P + A475L + K495N + G626D + G628W + A689I + Y715P + T777N;S58G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + Q381V + E402N + S434P + N437D + A475L + K495N + G628W + A689I + Q690H + D709E + E710G + Y715P; D47I+ Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + Q474I+ A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + N437K + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + T785L; A109S + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S604I + G628W + A689I + Y715P; Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S604V + G628W + A689I + Y715P + K807R; Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S604V + G628W + A689I + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + L757K; D47I + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + K495N + N588F + G628W + S652D + A689I + Y715P; A79M + A136L + Q258N + D274Y + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + T783A; D47I + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S604V + G628W + A689I + Y715P + S764F;S58G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + T785L;K24G + A136L + Q258N + D274Y + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + T777N; S58G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + Q381V + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + T785L; y S58G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + T785L + M816L (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2).

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 WT (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en:

D47I + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732M; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79E + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687W + A689I + Y715P; D47I+ A79E + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687C + A689I + Y715P + S764Y + R769H; D47I+ A79G + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M

+ F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + A79M + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + A79M + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79M + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q258N + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79E + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732V; D47I + A79M + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732M; D471 + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W +

T687C + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A6891 + Y715P + A732M; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M

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A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79G + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732M; D471 + Q85N + Q258N

+

V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79M + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M

+

A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L

+

K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W

+

Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687C + A689I + Y715P; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q258N + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79G + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A6891 + Y715P; D47I + A79M + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I+ Q85N + Q258N + L275Y + Q291W + Q313M

+

F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I+ Y715P + A732G; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I+ Y715P; D47I + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q258N + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A6891 + Y715P; D47I + Q258N + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + D646N + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732V; D47I + A79G + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + P439S + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + D395N + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732V; D47I + A79G + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N

+

S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687C + A689I + T693A + Y715P + T827I; D47I + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732V; y D47I + A79G + Q258N + L275Y + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + T693E + N723G + A730S + Y855 (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2).

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 WT (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en:

I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79E + Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79E + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79M + Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79E + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79G + Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79E + Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79G + Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + L275F + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G; D47I + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79E + Q85N + I106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R +

E402N + S434P + K495N + G628W + A689I+ Y715P + A732G; D47I + A79E + Q85N + I106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + N315D + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q85N + I106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79E + Q85N + I106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79G + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79G + Q85N + I106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q85N + I106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79E + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79M + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A6891 + Y715P + A732G; D47I+ A79G + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W +A689I + Y715P + A732G; A79M + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79M + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79M + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79G + Q85N + I106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79E + Q85H + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79G + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79G + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79E + Q85N + I106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;C8G + D47I + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79E + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79G + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79G + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + T591I + G628W + A689I + Y715P + A732G; Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79M + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; Q85N + I106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + A732G; I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D471 + Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343G + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q85N + I106V + A109S + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q85N + I106V + A109S + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79M + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79G + Q85N + I106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79E + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; Q85N + I106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732G; I106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; Q85N + I106V + A109S + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79M + I106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; A79M + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; y A79M + Q85N + I106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + A732G (en la que la posición de aminoácido se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2).

En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado de aquellos ejemplificados anteriormente (Tabla 2, 3, 4, 5, 6, 7) y comprende además sustituciones que (a) no disminuyen la actividad o termoestabilidad de la variante y (b) no incluyen sustituciones en ningún residuo adicional en el grupo que consiste en: K57; A88; 1106; N112; Q119; T120; A123; R132; Y135; A136; A141; K142; L149; G158; P161; P172; T177; 1179; G180; M181; S182; E183; K186; A197; G202; Y219; N220; S222; T224; 1229; M234; F242; A243; V246; Q258; D274; V286; Q291; Q313; V318; A343; T354; T357; D358; E360; D369; P374; I375; A378; Q381; E385; S388; V390; A394; N398; E402; K406; 1428; S434; N437; E449; Q474; A475; T482; S489; Y491; K530; N536; T540; T565; V674; R682; 1867; E868; y P870.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 6,0 a 6,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la Bgl1 C1 nativa, como se identifica en la Tabla 2. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 5,0 a 5,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la Bgl1 C1 nativa, como se identifica en la Tabla 2. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 4,0 a 4,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la Bgl1 C1 nativa, como se identifica en la Tabla 2. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 3,0 a 3,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la Bgl1 C1 nativa, como se identifica en la Tabla 2. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 2,0 a 2,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la Bgl1 C1 nativa, como se identifica en la Tabla 2. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 1,1 a 1,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la Bgl1 C1 nativa, como se identifica en la Tabla 2.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 6,0 a 6,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 3, como se identifica en la Tabla 3. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 5,0 a 5,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 3, como se identifica en la Tabla 3. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 4,0 a 4,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 3, como se identifica en la Tabla 3. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 3,0 a 3,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 3, como se identifica en la Tabla 3. En algunas realizaciones, la variante un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 2,0 a 2,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 3, como se identifica en la Tabla 3. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 1,1 a 1,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 3, como se identifica en la Tabla 3.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 4,0 a 4,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 269, como se identifica en la Tabla 4. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 3,0 a 3,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 269, como se identifica en la Tabla 4. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 2,0 a 2,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 269, como se identifica en la Tabla 4. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 1,1 a 1,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 269 como se identifica en la Tabla 4.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 4,0 a 4,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 481, como se identifica en la Tabla 5. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 3,0 a 3,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 481, como se identifica en la Tabla 5. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 2,0 a 2,9 veces

de mejora en la actividad con respecto a la variante 481, como se identifica en la Tabla 5. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 1,1 a 1,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 481, como se identifica en la Tabla 5.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 4,0 a 4,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 647, como se identifica en la Tabla 6. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 3,0 a 3,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 647, como se identifica en la Tabla 6. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 2,0 a 2,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 647, como se identifica en la Tabla 6. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 1,1 a 1,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 647, como se identifica en la Tabla 6. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 0,6 a 1,0 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 647, como se identifica en la Tabla 6.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 3,0 a 3,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 664, como se identifica en la Tabla 7. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 2,0 a 2,9 veces de mejora en la actividad con respecto a la variante 664, como se identifica en la Tabla 7.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 4,0 a 4,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la Bgl1 C1 nativa, como se identifica en la Tabla 2. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 3,0 a 3,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la Bgl1 C1 nativa, como se identifica en la Tabla 2. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 2,0 a 2,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la Bgl1 C1 nativa, como se identifica en la Tabla 2. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 1,1 a 1,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la Bgl1 C1 nativa, como se identifica en la Tabla 2.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 3,0 a 3,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 3, como se identifica en la Tabla 3. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 2,0 a 2,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 3, como se identifica en la Tabla 3. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 1,1 a 1,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 3, como se identifica en la Tabla 3.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 2,0 a 2,0 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 269, como se identifica en la Tabla 4. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 1,1 a 1,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 269, como se identifica en la Tabla 4.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 4,0 a 4,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 481, como se identifica en la Tabla 5. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 2,0 a 2,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 481, como se identifica en la Tabla 5. En algunas realizaciones, la

variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 1,1 a 1,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 481, como se identifica en la Tabla 5. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 0,6 a 1,0 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 481, como se identifica en la Tabla 5.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 2,0 a 2,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 647, como se identifica en la Tabla 6. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 1,1 a 1,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 647, como se identifica en la Tabla 6. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 0,6 a 1,0 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 647, como se identifica en la Tabla 6. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 0,2 a 0,5 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 647, como se identifica en la Tabla 6.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 1,1 a 1,9 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 664, como se identifica en la Tabla 7. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran al menos 0,6 a 1,0 veces de mejora en la termoestabilidad con respecto a la variante 664, como se identifica en la Tabla 7.

En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a Bgl1 C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran cualquier mejora en la actividad y/o termoestabilidad con respecto a la Bgl1 C1 nativa, como se identifica en la Tabla 2. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran cualquier mejora en la actividad y/o termoestabilidad con respecto a la variante 3 como se identifica en la Tabla 3. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran cualquier mejora en la actividad y/o termoestabilidad con respecto a la variante 269 como se identifica en la Tabla 4. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran cualquier mejora en la actividad y/o termoestabilidad con respecto a la variante 481 como se identifica en la Tabla 5. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran cualquier mejora en la actividad y/o termoestabilidad con respecto a la variante 647 como se identifica en la Tabla 6. En algunas realizaciones, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste en conjuntos de sustitución que muestran cualquier mejora en la actividad y/o termoestabilidad con respecto a la variante 664 como se identifica en la Tabla 7.

Como se observa anteriormente, los polipéptidos de -glucosidasa englobados por la invención tienen al menos aproximadamente el 70 % de identidad de secuencias con los residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2. En algunas realizaciones, los polipéptidos de -glucosidasa englobados por la invención incluyen aquellos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 71 % idéntica, al menos aproximadamente el 72 % idéntica, al menos aproximadamente el 73 % idéntica, al menos aproximadamente el 73 % idéntica, al menos aproximadamente el 74 % idéntica, al menos aproximadamente el 75 % idéntica, al menos aproximadamente el 76 % idéntica, al menos aproximadamente el 77 % idéntica, al menos aproximadamente el 78 % idéntica, al menos aproximadamente el 79 % idéntica, al menos aproximadamente el 80 % idéntica, al menos aproximadamente el 81 % idéntica, al menos aproximadamente el 82 % idéntica, al menos aproximadamente el 83 % idéntica, al menos aproximadamente el 84 % idéntica, al menos aproximadamente el 85 % idéntica, al menos aproximadamente el 86 % idéntica, al menos aproximadamente el 87 % idéntica, al menos aproximadamente el 88 % idéntica, al menos aproximadamente el 89 % idéntica, al menos aproximadamente el 90 % idéntica, al menos aproximadamente el 91 % idéntica, al menos aproximadamente el 92 % idéntica, al menos aproximadamente el 93 % idéntica, al menos aproximadamente el 94 % idéntica, al menos aproximadamente el 95 % idéntica, al menos aproximadamente el 96 % idéntica, al menos aproximadamente el 97 % idéntica, al menos aproximadamente el 98 % idéntica o al menos aproximadamente el 99 % idéntica a los residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2. Cada recitación en el presente documento de “70 %” debe entenderse que también incluye, provisionalmente, cualquiera de los mayores valores anteriores.

Como se observa anteriormente, las variantes de Bgl1 de la invención pueden englobar sustituciones de aminoácidos adicionales más allá de aquellas enumeradas anteriormente que incluyen, por ejemplo, variantes con

una o más sustituciones conservativas adicionales hechas en sus secuencias de aminoácidos. Ejemplos de sustituciones conservativas están dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina y histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparaginas), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina, prolina, cisteína y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que no alteran generalmente la actividad específica se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en “The proteins”, Academic Press, Nueva York, que se incorpora en el presente documento por referencia. Los intercambios que se producen más comúnmente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly, además de éstos a la inversa.

Variaciones conservativamente sustituidas de las variantes de polipéptido de -glucosidasa de la presente invención incluyen sustituciones de un pequeño porcentaje, normalmente inferior al 5 %, más normalmente inferior al 2 % y frecuentemente inferior al 1 % de los aminoácidos de la secuencia de polipéptidos, con un aminoácido conservativamente seleccionado del mismo grupo de sustitución conservativa. La adición de secuencias que no alteran la actividad codificada de una -glucosidasa, tal como la adición de una secuencia no funcional o no codificante, se considera una variación conservativa del polinucleótido de -glucosidasa.

La presente invención también proporciona fragmentos enzimáticamente activos de las variantes de polipéptido de

-

glucosidasa descritas en el presente documento que tienen actividad de -glucosidasa y al menos una sustitución descrita en el presente documento. Se cree basándose en estudios anteriores que C1 Bgl1 tolera la truncación (es decir, retiene actividad). Se ha observado que una variante de C1 Bgl1 que tiene una secuencia que se diferencia de la natural en cada una de las 25 posiciones de aminoácidos del extremo N retuvo actividad de -glucosidasa (no mostrada). Similarmente, la truncación en los extremos carboxi de 16 residuos de aminoácidos es tolerada en glucosidasa de Azospirillum irakense (CeIA). Véase USSN 61/218.020, que se incorpora en el presente documento por referencia. Por consiguiente, la presente invención proporciona además una variante de polipéptido de glucosidasa aislada o recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos que tienen una deleción de 1 a 50 residuos de aminoácidos del extremo carboxi (C-), el extremo amino (N-), o ambos (es decir, una deleción de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 residuos de aminoácidos de cualquiera o ambos del extremo N o C) con respecto a SEC ID Nº: 2. En ciertas realizaciones, la deleción será de 1 a 15 residuos de aminoácidos del extremo N y/o de 1 a 40 residuos de aminoácidos del extremo C. Estos fragmentos de -glucosidasa también se denominan en el presente documento variantes de polipéptido de -glucosidasa truncadas en el extremo N y truncadas en el extremo C, respectivamente. En algunas realizaciones, la deleción puede ser de 1 a 30, o 1 a 20, o 1 a 10 residuos, o 1 a 5 residuos desde el extremo C, el extremo N, o ambos.

TABLA 2 Tabla 2: Condiciones de termoactividad: pH 5, 65 ºC durante 21 h. Condiciones de termoestabilidad: la actividad residual enzimática se determinó después de incubar a pH 5, 65 ºC durante 6 h.

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre WT (SEQ ID NO: 2) 3 Mejora encontrada en estabilidad sobre WT (SEQ ID NO: 2) 3

1

M181Y+Q291W+E402N+S434P ++++++ ++

2

R132K+L149M+Q313M+D369L+E385L+N437D ++++++ ++

3

Q291W+D369L+E402N +++++ +++

4

Y135I+Q258N+Q474I +++++ +

5

M181Y+Q291W+E360D+D369V+P374Y+T482A +++++ +++

6

Q258N+N437F+S489L+Y491H +++++ ++

7

Q119E+Q258N+T357L+Q474I+S489L +++++ ++

8

Q258N+D369R+S489L+Y491H +++++ ++

9

N220Y+Q258N+T357L+D369R+Q474I+Y491F g1428a +++++ ++

10

M234E+V246L+D358K+D369L+N398G+K530M +++++ ++

11

Y135Q+I229M+F242L+D369L+K530M ++++ ++

12

D369Q+P374Y+E402N+T540K ++++ ++

13

Y135Q+P172A+I179M+I229M+Q291 A+D358K+D369L+N398G ++++ ++

14

R132K+D369L+E385L ++++ ++

15

Y135M+I179M+Q291A+D358K+D369L t573g ++++ ++

16

Q291W+P374Y+E402N+S434P ++++ ++

17

Q119E+N220Y+Q258N+T357L+S489L ++++ ++

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre WT (SEQ ID NO: 2) 3 Mejora encontrada en estabilidad sobre WT (SEQ ID NO: 2) 3

18

I179M+Q291A+D358K+D369L+I375V+S388W c1068a+c1 461t ++++ ++

19

Q291W+D369C c2580t ++++ ++

20

R132K+T354Q+D369L+N437L ++++ +

21

Q291A+D369L+N398G+K530M ++++ ++

22

Q119E+Q258N+D274Y+S489L ++++ ++

23

Q119E+N220Y+Q258N+Q474I+S489L ++++ ++

24

M181Y+D369L ++++ +

25

T120M+S222E+Q313M+T354Q+D369L+E385L ++++ ++

26

A4G+Q258N+D274Y+T357L+N437W+Q474I+Y49 1H c27t ++++ ++

27

R132G+D369L+N437D ++++ ++

28

S182L+Q313M+D369L+E385L ++++ ++

29

R132G+D369L+E385L ++++ ++

30

N112V+D358K+D369L+S388W+K530M ++++ ++

31

I106V+G180E+D369L+Q381V ++++ ++

32

I179M+Q291A+D369L c489t+c12 84t ++++ ++

33

I179M+D358K+D369L+S388W ++++ ++

34

M234E+Q291A+D369L+N398G ++++ ++

35

I179M+Q291A+D358K+D369L+Q381I ++++ ++

36

Y135Q+N220L+Q291A+D369L+N398G ++++ ++

37

Y135I+D369L ++++ +

38

S182L+D369L+E385L+N437L ++++ ++

39

T120Y+R132K+D369L+N437D ++++ ++

40

M234E+D369L+S388W+N398G+K530M c1098t ++++ ++

41

Y135M+I179M+D369L+V390I+K530M t573g ++++ ++

42

L149Q+A197V+Q313M+D369L c852t+c13 08t ++++ +

43

T120M+R132K+D369L+N437L ++++ ++

44

T120M+R132W+L149M+Q313M+T354Q+D369L+ E385L+N437D c540t ++++ ++

45

A4G+Y135I+N220Y+Q258N+T357P+N437Y ++++ +

46

D358K+D369L+S388W t573g+c65 7t ++++ ++

47

Q258N+D274Y+N437F ++++ +

48

D369L+S434P+T540K ++++ ++

49

G158D+I179M+Q291A+D358K+D369L+I375V+N3 98G+K530M ++++ ++

50

Y135I+D274Y+D369R ++++ +

51

Q258N+D369L+Q474I+S489L+Y491F ++++ ++

52

R132W+S182W+D369L+E385L ++++ ++

53

S182L+T354Q+D369L+E385L ++++ ++

54

S222Q+T354Q+D369L+E385L+N437D+T565G ++++ ++

55

Y135M+P161S+Q291A+A343T+D369L+I375V+K4 06D c1200a ++++ ++

56

Q291W+D369C+T540K c855t ++++ ++

57

D369L+P374Y+E402N ++++ +

58

Y135I+A343V+D369F+S489L ++++ +

59

M234E+D358K+D369L+S388W ++++ ++

60

T120M+L149Q+D369L+E385L ++++ ++

61

Q313M+D369L+E385L +++ ++

62

T120Y+D369L+E385L g750g +++ ++

63

D369L+N437D+T565A +++ +

64

N112V+Q291A+D369L+I375V c1128t +++ ++

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre WT (SEQ ID NO: 2) 3 Mejora encontrada en estabilidad sobre WT (SEQ ID NO: 2) 3

65

R132W+L149Q+Q313M+T354Q+D369L c1305t +++ +

66

Y135M+D369L+I375V+N398G +++ ++

67

D369L+E385L +++ ++

68

T120M+S182L+Q313M+T354Q+D369L+E385L +++ ++

69

T177I+Q291W+P374Y+T482A +++ +

70

Q258N+N437F +++ +

71

T120V+R132W+D369L+T565G +++ +

72

N112V+Q291A+D358N+D369E+S388C+K406D +++ +

73

Q291A+D358K+D369L+S388W+K406D t573g +++ ++

74

I106V+E360R+D369L+Q381V +++ +

75

M234E+Q291 A+D369L+S388W+N398G +++ ++

76

L149M+Q313M+D369L +++ ++

77

M234I+Q291W+E360D+D369V+T482A +++ +++

78

T120V+T354Q+D369L+E385L+T565P +++ ++

79

M234I+Q291W+E360D+S434P t42n +++ ++

80

D369Y+I867M+E868R +++ +

81

R132W+S182L+Q313M+D369L c285t+c10 92t+c109 5t +++ +

82

M234I+Q291W+P374Y+T482A +++ ++

83

Y219V+M234I+D369C+P374Y+S434P +++ ++

84

S182L+Q313M+D369L+E385L+N437L c1044t +++ ++

85

M234E+D358K+D369L+S388W+K530M +++ ++

86

R132G+S222E+D369L+E385L a51g +++ ++

87

R132K+L149M+S182L+D369L+N437L +++ +

88

T120H+Q313M+D369L +++ ++

89

R132W+D369L c1047t +++ +

90

D369L+P374Y +++ ++

91

N112V+N220L+Q291A+D369L+S388W+N398G +++ ++

92

Q291A+D369L+1375V+K530G +++ ++

93

R132K+L149M+S182L+T354Q+D369L+N437D+T 565G +++ +

94

T120H+S222E+Q313M+D369L+N437D+T565G +++ ++

95

A123N+Q291W+T482A+T540K +++ ++

96

S222E+Q313M+T354Q+D369L+E385L +++ ++

97

R132W+D369L+T565G +++ +

98

G202M+E360A+D369I+A394L +++ *

99

R132G+S222Q+Q313M+D369L +++ ++

100

R132W+L149M+D369L +++ +

101

L149M+Q313M+T354Q+D369L +++ +

102

Q119L+G202M+D369L +++ +

103

M181Y+M234I+D369C +++ +

104

I179M+N220L+Q291A+D369L+I375V +++ ++

105

S222E+Q313M+D369L+E385L+N437L +++ ++

106

I179M+M234E+D358K+D369L+S388W+N398G +++ ++

107

A123N+Y219V+Q291W+E360D+P374Y+S434P +++ ++

108

D369L+E402N c1092t +++ +

109

D369L +++ ++

110

Y219V+M234I+Q291W+T482A +++ +

111

Q291W+E360D+S434P +++ ++

112

D369L+S434P +++ ++

113

G180E+E360R+D369L +++ ++

114

A123N+M181Y+Q291W+D369K+S434P+T540K +++ ++++

115

Q119E+T357L+D369M+S489L +++ +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre WT (SEQ ID NO: 2) 3 Mejora encontrada en estabilidad sobre WT (SEQ ID NO: 2) 3

116

Q119E+D369F+Y491H +++ +

117

Q119L+D369L +++ +

118

Q119E+N220Y+V286I+S489L c1749t+g2 280t +++ +

119

Q291A+D369L+Q381I +++ ++

120

A475F +++ **

121

D369L+N536K +++ ++

122

Q119E+Y135I+D369H +++ +

123

Q258N+S489L +++ +

124

Q119E+Y135I+N437Y +++ **

125

Q119E+Y135I+N437F+Y491F +++ +

126

Q119L+D369L+A394V +++ +

127

E183G+E360A+D369L+I428V +++ +

128

D369L+E449Q+N536K +++ +

129

Q119L+G202M+E360A+A475F +++ **

130

I106V+D369L +++ ++

131

Y135I+D369M +++ +

132

M234I+D369C+S434P +++ +

133

D369L+A475Y +++ ++

134

Q119E+Y135I+S489L +++ +

135

D369Y+N536K +++ +

136

E360R+D369L +++ +

137

G202V+A475H +++ +

138

D369L+Q381V+N536K +++ ++

139

N220Y+Q258N+S489L+Y491F +++ +

140

Q258N+T357L+D369M +++ ++

141

I179M+Q291A+D369L+Q381L+S388W+N398G a69g +++ +

142

D369Y+A394G+N536K +++ ++

143

Q291W+E360D+D369V+P374Y ++ +++

144

T120M+L149Q+T354Q+D369L+E385L ++ ++

145

S489L+Y491H ++ +

146

N220S+Q291F+D369L ++ ++

147

D369C+S434P+T540K ++ +

148

V318E+D369L+I428V ++ +

149

E183M+G202M+E360A+D369L+A378K+A394V ++ **

150

A394G+N536K ++ +

151

Q291 W+T540K ++ +

152

N220L+Q291A+D369L+Q381L+S388W+K530M ++ +

153

T120V+R132W+E385L+N437D ++ +

154

Q119L+E360A+D369L+A378K ++ +

155

D369A+N536K t726c ++ +

156

G202V+D369L+A475H ++ +

157

Q381V+A475Y+N536K ++ +

158

S434P ++ +

159

I106V+G180E+D369Y+A394G ++ ++

160

G180E+Q381V+A475H ++ +

161

Q119E+N220Y+Q474I ++ +

162

I106V+D369Q ++ +

163

A475Y+N536K ++ +

164

K142R+Y219V+Q291W+S434P+V674I c1398t ++ ++

165

L149Q+S182L+Q313M+D369L+N437L ++ +

166

N112V+I179M+M234E+D369L+N398G c1188t ++ ++

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre WT (SEQ ID NO: 2) 3 Mejora encontrada en estabilidad sobre WT (SEQ ID NO: 2) 3

167

E360A+D369L+A378K ++ +

168

E360R+D369Y+N536K ++ +

169

E360R+D369A+Q381V+N536K ++ +

170

D369L+Q381D c858t ++ +

171

N437F+S489L ++ +

172

E183M+G202M+V318E+D369I+A394L+I428V ++ **

173

E360D+D369L+E402N+S434P ++ +

174

Q119L+A141F+G202M+A394L+I428V+A475F c2488t ++ *

175

T357L+D369R+S489L+Y491H ++ +

176

Y135I+Q258N+T357L ++ +

177

K142R+Q291W+E360D+D369C+E402N ++ ++

178

E183M+A243V+D369L+A378K+A475F ++ +

179

R132K+L149M+E385L ++ +

180

D369Y a1266t ++ +

181

M234I+E402N+S434P ++ **

182

N437Y c1641t ++ **

183

Q119E+N437F ++ +

184

N536K ++ +

185

Q119L+E183Q+G202M+D369P ++ +

186

N112V+I179M+Q291A+D358K+K406D g1122a ++ +

187

A123N+Q291W+T540K ++ +

188

D369I+A394L+I428V t2364n ++ *

189

A88S+N536K ++ +

190

Q119E+Y135I+N437F c1473t ++ *

191

A141F+G202M+E360A+D369P+A378K ++ *

192

A123N+T482A ++ **

193

Q313M+N437D ++ +

194

E360R+D369Y ++ +

195

E183M+G202M+A475F ++ **

196

Q119L+E360A+A394V+A475F t2364g ++ **

197

D369L+A378K ++ +

198

E360R+D369L+A394G c90a ++ +

199

M181Y+D369E+S434P ++ +

200

D369I t2364n ++ +

201

N112V+Y135Q+1375V+K406D+K530M+P870S ++ +

202

Q119E+Y135I+N220Y+Q258N ++ +

203

D369P+A394V+1428V ++ +

204

V318E+D369L ++ +

205

K186R+N536K ++ +

206

Q119L+D369L+A378K ++ +

207

M234I+D369K+S434P + +

208

N112V+I179M+N220L+Q291A+Q381I+S388W+N 398G + +

209

E402N+S434P + +

210

Q119L+A141F+G202M+A394Q c993t + *

211

Q313M+T354Q+N437D + +

212

N112V+M234E+D369L+I375V+K406D g1437a + ++

213

Q119E+A136E+N220Y + **

214

Q381D+A394G+N536K + **

215

Q119L+E183G+D369Q+A378T+V390I + **

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre WT (SEQ ID NO: 2) 3 Mejora encontrada en estabilidad sobre WT (SEQ ID NO: 2) 3

216

Y135I+T357L+Q474I+S489L+Y491F + +

217

D369E+A394P+I428V + +

218

N112V+Q291A+Q381I+N398G + +

219

E360R+N536K + +

220

E360D+D369C + +

221

R132W+S182L+E385L + **

222

I179M+Q291A+D358K+N398G+K530G + +

223

N220Y+Q258N+T357L + +

224

T224N+D274Y+T357L+N437F + +

225

N437D + +

226

M234I+E360D+T482A + +

227

A141F+G202M+D274N+V318E+E360A+I428V + *

228

D369Q + +

229

N112V+N220L+D358K+D369L+I375V+Q381I+N3 98G + +

230

Y135I+D369F + +

231

A243V+V318E+E360A+A475W + **

232

N220L+D369L+Q381L+S388W+N398G+K530G + +

233

S489L + +

234

K142R+Y219V + *

235

Y135I+N220Y+Y491F + *

236

S182W+T354Q+E385L + +

237

I179M+D358K+S388W + **

238

L149M+Q313M+T565P + **

239

R132G+E385L + **

240

V318E + +

241

Q119L+E183K + **

242

R132W+E385L + **

243

E183G+V318E+E360A+A394Q+A475C + **

244

E183M+G202M+E360A + **

245

A394G + +

246

D369P + +

247

Y135M+Q291A+S388W+N398G + *

248

Y219V+D369C + ++

249

A394V+I428V g1428a + **

250

Q119L + +

251

Y135I + **

252

E360R+D369Q+Q381D+N536K + **

253

N220L+M234E+Q291A+I375V+K530M + +

254

Q119L+G202M+E360A + **

255

N220Y+Q258N+D369R + +++

256

M181Y+M234I+Q291W+E402N + +

257

A394V g2382a + **

258

T120M+L149Q+Q313M c1686t + +

259

Q119L+V318E+I428V + +

260

E360R+Q381V + +

261

K57R+G202M+E360A+A394V + **

262

I179M+D358K+1375V+Q381 L + +

263

E360A + +

264

I179M+R682W + +

265

E360A+I428V + +

266

D369K+P374Y + +

(continúa)

1 Los cambios en aminoácidos son indicados con respecto a SEQ ID NO:2.

5 2 Los cambios en nucleótidos son indicados con respecto a SEQ ID NO:1.

3 La mejora está representada de la siguiente manera:

* = 0.3 a 0.5 veces mejora con respecto a los nativos C1 Bgl1 (SEQ ID NO:2) ** = 0.6 a 1 veces mejora con respecto a los nativos C1 Bgl1 (SEQ ID NO:2)

+ = 1.1 a 1.9 veces mejora con respecto a los nativos C1 Bgl1 (SEQ ID NO:2) ++ = 2.0 a 2.9 veces mejora con respecto a los nativos C1 Bgl1 (SEQ ID NO:2) +++ = 3.0 a 3.9 veces mejora con respecto a los nativos C1 Bgl1 (SEQ ID NO:2) ++++ = 4.0 a 4.9 veces mejora con respecto a los nativos C1 Bgl1 (SEQ ID NO:2) +++++ = 5.0 a 5.9 veces mejora con respecto a los nativos C1 Bgl1 (SEQ ID NO:2)

15 ++++++ = 6.0 a 6.9 veces mejora con respecto a los nativos C1 Bgl1 (SEQ ID NO:2)

TABLA 3 Tabla 3: Condiciones de termoactividad: pH 5, 70 ºC durante 21 h. Condiciones de termoestabilidad: la actividad residual enzimática se determinó después de incubar a pH 5, 65 ºC durante 16-48 h.

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre Var3 Mejora encontrada en estabilidad sobre Var3

3

Q291W + D369L + E402N

267

I106V+Q258N+Q291W+D369L+E402N+S434P

268

I106V+Y135Q+Q258N+Q291W+Q313M+D369H+ E402N+K495N+G628 W t1620a

269

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628 W

270

I106V+Q258N+Q291W+Q313M+D369H+E402N+ S434P+A475C+K495I+T540K+G628W

271

I106V+Q258N+Q291W+D369R+E402N+S434P+K 495H+G628L

272

D274Y+Q291W+D358K+D369L+E385L+E402N+ N4371+S489N g357a

273

Q258N+Q291W+Q313M+D369H+E402N+S434P+ T540K c405t+t188 4g

274

I106V+Q258N+Q291W+D369L+E402N+S434P+A 475F+K495H+G628V t1620a

275

Q258N+Q291W+Q313M+D369L+E402N+S434P+ A475C+K495I+G628 W t60c+c246t +c318t +c405t+t16 20a

276

I106V+Y135Q+M181Y+Q258N+Q291W+Q313M+ D369L+E402N+S434P+K495N t1620a+t18 84g

277

Y135Q+Q258N+Q291W+D369L+E402N+K495N t1620a+t18 84g

278

Q119E+D274Y+Q291W+D358K+D369L+E385L+ E402N+N437V+S489N+S614A t846c

279

Y135Q+Q258N+Q291W+Q313M+D369L+E402N+ S434P+A475F+K495N+G628V c318t+c98 4a+ t1620a

280

R132H+Q258N+Q291W+D369Y+E402N+K495Q c318t+c40 5t+ t1620a

281

Y135Q+Q258N+Q291W+D369L+E402N+S434P+ A475F+K495H

282

Y135Q+Q258N+Q291W+D369R+E402N+S434P+ K495I+G628V t1620a

283

I106V+M181Y+Q258N+Q291W+D369L+E402N

284

I106V+Q258N+Q291W+D369H+E402N+S434P+A 475F+K495F+G628V c405t+t162 0a

285

Q258N+Q291W+Q313M+D369L+E402N+S434P+ G628V

286

Q258N+Q291W+D369L+E402N+A475F+K495I t1620a+t18 84g+c2463 t

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre Var3 Mejora encontrada en estabilidad sobre Var3

287

Q119E+D274Y+Q291W+D369L+E385L+E402N+ N437I +++ +

288

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L c318t+c40 5t +++ ++

289

Q258N+Q291W+D369Y+E402N+S434P+K495H+ G628W t1620a +++ +

290

D274Y+Q291W+D369L+E385L+E402N+N437I+S 489N+K530C g357a+a18 40t +++ +

291

I106V+Y135Q+Q258N+Q291W+Q313M+D369Y+ E402N+S434P+A475F+K495H+T540K t1884g +++ +++

292

Q119E+Q291W+D358K+D369L+E385L+E402N c822t +++ +

293

I106V+M181Y+Q258N+Q291W+Q313M+D369H+ E402N+S434P+A475L+K495Q+G628V c405t+c15 81t+ t1620a +++ ++

294

Q119E+D274Y+Q291W+D358N+D369L+E385L+ E402N+N437D +++ +

295

Q258N+Q291W+D369R+E402N+S434P+G628V +++ +

296

Q258N+Q291W+Q313M+D369H+E402N+S434P+ G628L t1620a +++ ++

297

Q258N+Q291W+D369L+E402N c318t +++ +

298

D274Y+Q291W+D358K+D369L+E385L+E402N+ N437F+S614D g357a+t14 65a +++ +

299

Q119E+D274Y+Q291W+D358N+D369L+E385L+ E402N+N437L+K530V a1840t +++ +

300

Q119E+D274Y+Q291W+D358N+D369L+E385L+ E402N+N437V+S489L+K530N a1840t +++ ++

301

Q258N+Q291W+D369L+E402N+S434P+A475F+ K495F+T540K c318t+c40 5t+ t1884g +++ +

302

M181Y+Q291W+Q313M+D369Y+E402N c318t+c40 5t +++ +

303

A243V+D274Y+Q291W+D358K+D369L+E402N+ N437I+K530C g357a+t14 65a+ a1840t +++ +

304

Q119E+D274Y+Q291W+D358E+D369L+E385L+ E402N+N437V+K530V+S614A t1465a ++ **

305

Q291W+D358K+D369L+E385L+E402N+N437W+ K530C+S614A g357a+c82 2t ++ +

306

Q119E+D274Y+Q291W+D369L+E385L+E402N+ N437W ++ ++

307

D274Y+Q291W+D358N+D369L+E385L+E402N+ N437I+K530N+S614V g357a+t14 65a ++ +

308

M181Y+Q258N+Q291W+Q313M+D369L+E402N+ S434P c318t+c40 5t ++ +++

309

A109T+Q291 W+D369L+E402N ++ +

310

Q119E+Q291W+D369L+E385L+E402N+N437Y+ S489I+K530N c822t+a18 40t ++ ++

311

Q119E+D274Y+Q291W+D358N+D369L+E402N+ N437D a1840t ++ +

312

D274Y+Q291W+D358K+D369L+E385L+E402N+ N437W+K530V+S614 D g357a+t14 65a ++ +

313

Q258N+Q291W+D369R+E402N+A475W+K495H+ G628V t1620a ++ +

314

A109S+Q291W+D369L+E402N c1119t ++ +

315

Q119E+D274Y+Q291W+D358E+D369L+E385L+ E402N+N437L+S614A c1329t+t14 65a ++ +

316

Q291W+D369L+E402N+E493Y+N504Y+T611A c1563t+g1 590a ++ +

317

Q119E+D274Y+Q291W+D358K+D369L+E402N+ S614V ++ +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre Var3 Mejora encontrada en estabilidad sobre Var3

318

D274Y+Q291W+D358E+D369L+E385L+E402N+ N437L+K530N+S614A g357a+t14 65a ++ +

319

Q258H+Q291W+Q313M+D369R+E402N+A475F+ K495N+G628L 1620a ++ +

320

Q258N+Q291W+Q313M+D369Y+E402N+A475W +K495V+T540K+G62 8W ++ ++

321

D274Y+Q291W+D358N+D369L+E385L+E402N+ N437W+S614V g357a+c93 6a ++ +

322

I106V+Y135Q+Q291W+Q313M+D369L+E402N+A 475L+K495Q t1620a+t18 84g ++ ++

323

Q258N+Q291W+D369R+E402N+S434P+A475F+ G628V ++ +

324

Q119E+D274Y+Q291W+D369L+E385L+E402N+ N437V t1465a ++ +

325

D274Y+Q291W+D358K+D369L+E385L+E402N+ N437Y+S489L+K530V g357a ++ +

326

Q119E+D274Y+Q291W+D358N+D369L+E402N a1840t ++ +

327

Q291W+D369L+E402N+K495V+S501R+A503E+ K530N+T611H t1465a ++ +

328

Q119E+D274Y+Q291W+D358N+D369L+E385L+ E402N+N437V+S489I+K530C ++ +

329

Q119E+Q291W+D358K+D369L+E402N+N437L+ S489N c822t ++ +

330

D274Y+Q291W+D369L+E385L+E402N+N437W+ K530C+S614D g357a ++ +

331

Q258N+Q291W+D369R+E402N+A475F+K495N+ T540K+G628V c318t+c40 5t ++ +

332

Q291W+D369L+E402N+E493V+N504Y c1563t+t16 98c+ c1773t+t18 72c+ c1905t ++ +

333

Q291W+D358E+D369L+E385*+E402N+S489T g357a+c82 2t ++ +

334

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+A475L+ K495V+A601T+G628 W ++ ++

335

D274Y+Q291W+D358N+D369L+E385L+E402N+ S489N+S614C g357a ++ +

336

D274Y+Q291W+D358K+D369L+E402N+N437V+ S489L+K530C+S614A g357a+g11 40a ++ +

337

Q119E+D274Y+Q291W+D358E+D369L+E402N+ N437D a1840t ++ +

338

Q119E+D274Y+Q291W+D358N+D369L+E402N+ N437L+S614R t1465a ++ +

339

D274Y+Q291W+D358N+D369L+E402N+N437Y+ K530V g357a+t14 65a+ a1840t ++ **

340

D274Y+Q291W+D358E+D369L+E402N+N437Y+ S489N+K530N+5614V+D781N g357a ++ +

341

Q258H+Q291W+D369*+E402N+S434P+T540K+ G628L c318t+c40 5t ++ +

342

Q119E+Q291W+D358E+D369L+E385L+E402N+ N437L+S489N+K530V c822t ++ +

343

Q258N+Q291W+D369L+E402N+G628V c405t+c11 79t ++ +

344

Q291W+D358K+D369L+E385L+E402N+S4891+K 530N g357a+c82 2t+ a1840t ++ +

345

Q119E+Q291W+D369L+E385L+E402N+S489N+ K530V+S614A g6a+c822t ++ +

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre Var3 Mejora encontrada en estabilidad sobre Var3

346

I106V+Y135Q+Q291W+D369L+E402N+S434P+A 475F+K495H+G628L t1620a ++ +

347

Q119E+Q291W+D358K+D369L+E402N+N437V+ K497R+S614A c822t+t146 5a ++ +

348

Q119E+D274Y+Q291W+D358E+D369L+E385L+ E402N+N437L t1465a ++ +

349

D274Y+Q291W+D358K+D369L+E402N+N437L+ S489I+K530V+S614A q357a ++ +

350

I106V+Q291W+Q313M+D369L+E402N+S434P+A 475W+K495N+G628 W c405t+t162 0a ++ ++

351

Q291W+D369L+E402N+A505C+L620M+T635I g1479a+t1 512c+ c1563t+t16 98c+ c1773t+t18 72c ++ +

352

Q291W+D369L+E402N+E493A+N504Y+A505C+L 620M+T635A c1563t+t16 98c+ c1773t+t18 72c ++ +

353

D274Y+Q291W+D358N+D369L+E402N+S489N+ K530C+S614A g357a+c98 1t ++ +

354

D274Y+Q291W+D358K+D369L+E385L+E402N+ N437W+K530D g357a+t14 65a+ a 1840t ++ +

355

Q291W+D369L+E402N+S489N+K495H+S501R+ K530N c1509g+c1 833g ++ +

356

D274Y+Q291W+D358E+D369L+E385L+E402N+ N437D+K530C+S614 H g357a ++ +

357

Q119E+Q291W+D358E+D369L+E385L+E402N+ N437W+S489N+K530E+S614A c822t ++ +

358

Q119E+Q291W+D358E+D369L+E385L+E402N+ N437W+S489N+K530E+S614A t1698c+t18 72c ++ +

359

Q291W+D358K+D369L+E385L+E402N+N437I+K 530M+S614L g357a+c82 2t+ t1465a + **

360

Q291W+D369L+E402N+R672I + **

361

D274Y+Q291W+D358E+D369L+E385L+E402N+ N437L+S489L g357a+a18 40t + +

362

A265S+Q291W+D369L+E402N + **

363

Q215M+Q291W+D369L+E402N + +

364

Q291W+D369L+E402N+E493V+N504Y+N521C+ T591A+L620M+T635I t1872c + +

365

Q119E+D274Y+Q291W+D369L+E385L+E402N+ N437L+S489N+K530M+S614D + +

366

Q119E+Q291W+D369L+E385L+E402N c822t + +

367

Q291W+D369L+E402N+E493A+N504Y+D566G+ R612P+L620M+T635 A c1563t+c1 773t+ c1863t+t18 72c+ c2403a + +

368

Q119E+D274Y+Q291W+D369L+E385L+E402N+ S614Y + +

369

106V+Y135Q+M181Y+Q258N+Q291W+D369L+E 402N + ++

370

Q119E+Q291W+D358E+D369L+E385L+E402N+ N437W+K530V c822t + +

371

Q215E+Q291W+D369L+E402N + **

372

Q291W+D369L+E402N+N504Y+N521C+T591A+ R612H+L620M+T635I g1479a+t1 698c+ + +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre Var3 Mejora encontrada en estabilidad sobre Var3

373

Q119E+D274Y+Q291W+D358K+D369L+E402N+ N437Y+K530I t1465a+a1 840t + **

374

Q258H+Q291W+D369L+E402N+K495N c318t+t162 0a+ t1884g + +

375

Q291W+D358N+D369L+E385L+E402N+N437D+ S489N+K5301 g357a+c82 2t+ a1840t + +

376

Q291W+D369L+P374Y+E402N+Y491L+S501R c360t+c17 73g + +

377

Q258N+Q291W+Q313M+G332D+D369H+E402N +S434P + ++

378

Q291W+D358N+D369L+E385L+E402N+N437F+S 489L+K530V c822t+a18 40t + +

379

Q291W+D369L+E402N+R672S + **

380

Q291W+D369L+E402N+T687M + +

381

Q291W+F314V+D369L+E402N + +

382

Q258N+Q291W+T357A+D369H+E402N+S434P+ K495F t1620a+t18 84g + +

383

Q291W+D369L+P374Y+E402N+Y491 F+S501 R+N521C c360t+c54 0a + +

384

Q291W+D369L+E402N+Q690K + +

385

Q291W+D358E+D369L+E385L+E402N+N437F+K 530V+S614A g357a+c82 2t+ t1465a + +

386

Q291W+D369L+E402N+R672A + **

387

Q291W+D369L+E402N+R672T + **

388

Q291W+D369L+E402N+D703K c1947t + **

389

D274Y+Q291W+D369L+E402N c1305t+t14 65a+ a1840t + +

390

Q291W+D369L+E402N+R672F + +

391

Q291W+D369L+E402N+R672D + **

392

Q291W+D369L+E402N+Y491F+S501R+N536K+ D566G c1773g + +

393

Q291W+D369L+E402N+A732G + +

394

Q291W+D369L+E402N+E493Y+N504Y+N521C+ T591C+R612P+L620 M t1698c+t18 72c+ c1905t + +

395

I106V+Y135Q+Q291W+D369L+E402N+A475F+G 628W + +

396

Q291W+D369L+E402N+R672G + **

397

Q291W+D369L+E402N+T777N c2328t + +

398

Q291W+Q313M+D369L+E402N+T540K c318t+c40 5t + +

399

Q291W+D369L+E402N+K708F + +

400

Q291W+D369L+P374Y+E402N+S501H + **

401

Q291W+D369L+E402N+Y715P c2241t + +

402

Q291W+D369L+E402N+A732M + +

403

Q291W+D369L+E402N+E493A+N504Y+N521C+ D566G+R612P+L620 M c1773t+t18 72c+ c1905t + +

404

Q291W+D369L+E402N+Q690R + +

405

D274Y+Q291W+D369L+E385L+E402N+N437V+K 530I+S614D t1465a + **

406

Q291W+D369L+E402N+L757K c2454t + +

407

Q291W+D369L+E402N+T687Y + +

408

Q291W+D369L+E402N+Y491H+S501R+N521C+ T591A + +

409

Q291W+D369L+E402N+V775C + +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre Var3 Mejora encontrada en estabilidad sobre Var3

409

Q291W+D369L+E402N+V775C + +

410

Q291W+D369L+E402N+R672V + **

411

Q291W+D369L+E402N+N670D + **

412

Q291W+D369L+E402N+T779S + **

413

Q291W+D369L+E402N+V638R + **

414

Q291W+D369L+E402N+T687F + +

415

Q291W+D369L+E402N+T687L + **

416

Q291W+D369L+E402N+K610S + **

417

Q291W+D369L+E402N+Y491L+S501R+N521C c1773g + +

418

D274Y+Q291W+D358E+D369L+E402N+K530V+ S614V g357a + **

419

1106V+M181Y+Q258N+Q291W+D369R+E402N+ S434P+A475W+K495V+T540K+G628V c405t + ++

420

Q291W+D369L+E402N+N536K t1501a+c1 773g + +

421

Q291W+D369L+E402N+E493V+N504Y+R612P+L 620M c1563t+t16 98c+ c1773t+t18 72c+ c1905t + +

422

Q291W+D369L+E402N+S676C + **

423

Q291 W+D369L+E402N+T540K+G628W c318t + **

424

Q291W+D369L+E385L+E402N+N437D+S489L+K 530C+S614D g357a+c82 2t + +

425

Q119E+D274Y+Q291W+D358N+D369L+E402N+ N437F+S489N+S614 L + +

426

Q291W+D369L+E402N+S434P+A475W+K495V t1620a + +

427

Q291W+D369L+E402N+A689I + +

428

Q291W+D369L+E402N+E493A+N504Y+N521C+ D566G+R612H+L620 M c1773t+t18 72c+ c1905t + +

429

Q291W+D369L+E402N+V638S + **

430

Q291W+D369L+E402N+V648W + **

431

Q291W+D369L+E402N+D650V + **

432

Q291W+D369L+E402N+V674M + **

433

Q291W+D369L+E402N+V638E + **

434

106V+Q291W+D369L+E402N t1884g + +

435

Y135Q+Q291W+D369L+E402N t1884g + **

436

Q291W+D369L+E402N+S764F + +

437

Q291W+D369L+E402N+E493A+N504Y+A505C+ N521C+T591A+R612P t1698c+t18 72c+c1905 t + +

438

Q291W+D369L+E402N+S489N+K495Q+S501R+ K530N+T611Q c1509g + +

439

Q291W+D369L+E402N+T685V + +

440

I106V+Q291W+D369L+E402N+S434P+A475C+K 495N+T540K + +

441

Q119E+Q291W+D358N+D369L+E402N+N437D+ K530N+S614V c822t + +

442

Q291W+D369L+E402N+T687K + +

443

Q291W+D369L+E402N+S652D + +

444

Q291W+D369R+E402N+A475F+K495Q+T540K+ G628L + +

445

Y135Q+Q291W+D369L+E402N+G628V c318t + **

446

Q291W+D369L+E402N+E493Y+A505C+N521C+ T591A+L620M t1512c+t16 98c+ t1872c+c1 905t + +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre Var3 Mejora encontrada en estabilidad sobre Var3

447

Q291W+D369L+E402N+T687W + +

448

Q291W+D369L+E402N+D650F + **

449

Q291W+D369L+E402N+T687C + +

450

Q291W+D369L+E402N+S434P+K495N+G628V + **

451

Q291W+D369L+E402N+S501N c540a+c17 73g + *

452

D274Y+Q291W+D369L+E402N+N437K+S489I+K 530V+S614L g357a + +

453

Q291W+D369L+E402N+T699L + +

454

Q119E+V2461+Q291W+D358E+D369L+E402N+ S614L c267t + **

455

Q291W+D369L+E402N+N504Y+N521C+D566G+ L620M+T635A g1479a+c1 773t+ t1872c ** +

456

Q291W+D369L+E402N+E493Y+N504Y+D566G+ T591A+R612P+L620 M c1563t+t18 72c+ c1905t ** +

457

Q291W+D369L+E402N+N536K+T591A ** +

458

Q291W+D369L+E402N+Q690A ** +

459

Q291W+D358K+D369L+E402N+N437L+S4891+K 530D g357a+c82 2t+c1458t+ a1840t ** **

460

Q119E+D274Y+Q291W+D358E+D369L+E385L+ E402N+N437V+S489N+K530M+S614H ** +

461

Q291W+D369L+P374Y+E402N+Y491L ** **

462

Q291 W+D369L+E402N+S501R c1773g+ ** +

463

Q291W+D369L+E402N+Y491L+N521C+N536K c360t+c54 0a+t1501a +c1773g ** +

464

Q291W+D369L+E402N+E493Y+N504Y+N521C+ T591C+R612P+L620M+T635V t1698c+t18 72c ** +

465

Q119E+Q291W+D358N+D369L+E385L+E402N+ N4371+S4891+S614L c822t ** ++

466

T120Y+Q291W+D369L+E402N+S501R+N521C+ D566G c1773g ** +

467

Q291W+D369L+E402N+Y491L+N521C t1501a ** **

468

Q291W+D369L+E402N+Y491L+S501N+D566G+ T591A ** **

469

D274Y+N278Y+Q291W+D358E+D369L+E402N+ N437Y+S489L+K530E g357a ** +

470

I106V+Q291W+D369L+E402N+S434P+A475W+K 495F+T540K+G628V c405t+a63 6g ** +

471

Q119E+Q291W+D358N+D369L+E402N+N437Y+ E742G c822t ** **

472

Y135Q+Q291W+D369Y+E402N+A475F+K495F t1620a+t18 84g ** **

473

T120H+Q291W+D369L+E402N+Y491H+S501H+ T591C * +

474

Q119E+Q291W+D358N+D369L+E402N+N437F+ S489N+K530E+S614L c822t * +

475

Q119E+D274Y+Q291W+D358N+D369L+E402N+ N4371+S489N+K530V+S614Y * +

476

T120Y+Q291W+D369L+E402N+N521C+N536K c540a+c17 73g * ++

477

Q291W+D369L+E402N+Y491F+S501N+N521C+ N536K+T591R c360t * +

478

Q291W+D369L+E402N+S501N+N521C+D566G+ T591R c1473t * **

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre Var3 Mejora encontrada en estabilidad sobre Var3

479

Q291W+D369L+E402N+Y491L+S501R+N536K+ D566G+T591R * +

480

D274Y+Q291W+D358E+D369L+E402N+N437Y+ S489N+K5301+S614L g357a * **

1 Los cambios en aminoácidos son indicados con respecto a SEQ ID NO:2; La secuencia del esqueleto contiene sustituciones Q291W + D369L + E402N 2 Los cambios en nucleótidos son indicados con respecto a SEQ ID NO:1. 3 La mejora está representada de la siguiente manera: * = 0.3 a 0.5 veces la mejora sobre la Variante 3 (SEQ ID NO:5) ** = 0.6 a 1 veces la mejora sobre la Variante 3 (SEQ ID NO:5) + = 1.1 a 1.9 veces la mejora sobre la Variante 3 (SEQ ID NO:5) ++ = 2.0 a 2.9 veces la mejora sobre la Variante 3 (SEQ ID NO:5) +++ = 3.0 a 3.9 veces la mejora sobre la Variante 3 (SEQ ID NO:5) ++++ = 4.0 a 4.9 veces la mejora sobre la Variante 3 (SEQ ID NO:5) +++++ = 5.0 a 5.9 veces la mejora sobre la Variante 3 (SEQ ID NO:5) ++++++ = 6.0 a 6.9 veces la mejora sobre la Variante 3 (SEQ ID NO:5)

25 TABLA 4 Tabla 4: Condiciones de termoactividad: pH 4,5, 70 ºC durante 21 h. Condiciones de termoestabilidad: la actividad residual enzimática se determinó después de incubar a pH 4,5, 70 ºC durante 2 h.

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 2693 Mejora encontrada en estabilidad sobre 2693

269

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W

481

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + A689I + Y715P ++++ ++

482

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + Y715P + T823K g1290a+g2 160a +++ +

483

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + T685V + Y715P + ++ +

484

I106V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + S764F ++ +

485

A109T + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + I428V + S434P+ A475L + K495N + G628W ++ +

486

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + Y491F+ K495N + G628W + Y715P ++ +

487

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + Q381V + E402N + S434P + A475L+ K495N + S501 R + G628W + Y715P ++ +

488

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + S764F ++ +

489

Q258N + Q291 W + Q313M + D369R + E385L + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W ++ +

490

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ N627H + G628W + A732G ++ +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 2693 Mejora encontrada en estabilidad sobre 2693

491

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + A6891 ++ +

492

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + T685V + Y715P + T777N ++ **

493

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + D650Y + Q716R + L757K ++ +

494

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + Y715P ++ ++

495

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ V562L + G628W c729t ++ +

496

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ A505C + G628W + S764F ++ +

497

Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W ++ +

498

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + Y715P + E819V ++ +

499

A109T + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W ++ +

500

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + S652D + V846F c27t ++ +

501

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + Q690K + +

502

D471 + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + ++

503

Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

504

E21Q + V175A + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P+ A475L + K495N + G628W c249t + **

505

Q258N + Q291W + Q313M + E360D + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + L757K + **

506

Q258N + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + S6041 + N627H + G628W + A732G + +

507

A109T + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + V775C + +

508

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + S764F + +

509

P29Q + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

510

A136L + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + S764F + P870S + +

511

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E385L + E402N + S434P + K495N+ G628W c1425g + +

512

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + T687M g2160a + +

513

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ N588F + G628W + **

514

Q258N + Q291W + Q313M + D358K + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W c951a + +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 2693 Mejora encontrada en estabilidad sobre 2693

515

Y135M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + Y715P t1341c + +

516

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + T785L + **

517

A79G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

518

A109T + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + S848N + +

519

I106V + Q258N + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P+ A475L + K495N + G628W + +

520

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + A732G + +

521

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + L757K + +

522

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ N627H + G628W + T687M + E822K + +

523

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G616D + G628W + +

524

A79M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

525

I106V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

526

Q258N + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + A617V + G628W + **

527

Q258N + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

528

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + P436Q + A475L+ K495N + G626D + G628W + +

529

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + T687C + +

530

Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

531

A109S + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + N536K + G628W + +

532

S58G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

533

E21Q + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + Q381V + E402N + S434P+ A475L + K495N + G628W + **

534

Q258N + L275Y + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

535

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ A505C + G628W + **

536

E21 R + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

537

V25A + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

538

H26R + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

539

L30K + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + *

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 2693 Mejora encontrada en estabilidad sobre 2693

540

N45H + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

541

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + E493V+ K495N + G628W + **

542

P29R + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + *

543

P29M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + A732S + A748T + V840I c21t+c191 1t + **

544

Q55R + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

545

K24G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

546

G180E + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

547

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W c1425g + **

548

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + Q479R+ K495N + S501 R + G628W + Y715P + E819L + +

549

A79E + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

550

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + R672G + **

551

Q258N + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + A505C + G628W g2493a + +

552

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + T687K + +

553

Q27R + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W c1689g + **

554

V253F + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

555

S22L + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

556

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + Q690H a321t + +

557

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + S799N + **

558

Q258N + Q291W + Q313M + F314V + E360D + D369R + E402N + S434P+ A475L + K495N + G628W + +

559

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + E822M + +

560

K24T + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

563

S22L + Q258N + Q291 W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ Q479R + K495N + G628W + +

561

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + S787G + +

562

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ R612H + G628W + L757K + S787G + *

564

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + E822M + **

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 2693 Mejora encontrada en estabilidad sobre 2693

565

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + M454E + A475L+ K495N + G628W + **

566

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ V562C + G628W + **

567

S22R + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

568

V25G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W c2478t + **

569

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + T685V c1842t + **

570

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + A404S + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

571

G216L + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

572

V25R + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

573

V25G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

574

Q27H + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

575

K24L + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

576

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + D650F + L757K + **

577

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + T482A+ K495N + G628W + **

578

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ A617V + G628W + **

579

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ S501 C + G628W + **

580

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + K495N + N536K+ G628W + R817P + +

582

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + T777N + **

581

G180E + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ R476Q + K495N + G628W + **

583

Q119E + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

584

A109S + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + K495N+ G628W + S848N + +

585

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + Y850H + **

586

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + P436E + A475L+ K495N + G628W + **

587

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + R769H + E819A + **

588

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ T496A + G628W + **

589

Q258N + V260L + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

590

D244H + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + **

591

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + E819V + **

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 2693 Mejora encontrada en estabilidad sobre 2693

592

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + S652D + **

593

Q258N + Q291W + D311 N + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + R612H + G628W + A689I + K866I g1479a + *

594

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + T783H c1917t + +

595

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + T823K + **

596

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + D650N + S787G + **

597

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + K708F g1869a + +

598

Q258N + Q291W + Q313M + E360D + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + S652D + **

599

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + E822G a321g + **

600

L237Y + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + +

601

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + E494K+ K495N + G628W + **

602

Q258N + Q291W + Q313M + E360D + D369R + E402N + S434P + D470N+ A475L + K495N + G628W + L757K c312t + *

603

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + S764F ** +

604

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + D650F ** **

605

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + S848N ** **

606

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ T496A + N536K + G628W ** **

607

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + K421 R + S434P + A475L+ K495N + G628W + T777N ** **

608

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ N627H + G628W + E822M ** **

609

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + F634A t1944g+c1 962t ** **

610

A4V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W c1635t ** **

611

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + N437W + A475L+ K495N + G628W ** **

612

Y135Q + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W ** +

613

Y135Q + Q258N + Q291 W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + V673A + T685V t99c ** **

614

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + L757K + P806L ** **

615

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ V559T + G628W c1476t ** **

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 2693 Mejora encontrada en estabilidad sobre 2693

616

Y135M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W ** **

617

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + V775C ** +

618

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ N627H + G628W ** **

619

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + A405T + S434P + A475L+ K495N + G628W ** **

620

I221V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W ** **

621

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ S501 R + G628W + T685V ** **

622

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + A394G + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W + L757K ** +

624

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G616D + G628W ** +

623

P161S + Q258N + Q291W + Q313M + D358K + D369R + E402N + S434P+ A475L + K495N + G628W ** *

625

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + K807R ** +

626

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + A732M ** +

627

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ A505C + G628W + E822G ** **

628

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + E493V+ K495N + G628W + S652D ** +

629

A15V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + G628W ** +

630

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + K866Q ** **

631

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + E493A+ K495N + G628W + S652D + Q690A ** +

632

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + E819L ** **

633

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + E819V ** +

634

G180E + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E385L + E402N + S434P+ A475L + K495N + G628W ** **

635

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + D751 N ** **

636

G202M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + N627H + G628W + T687K + E822A ** **

637

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + K866I ** **

638

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + T783Q ** **

639

Q258N + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W ** **

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 2693 Mejora encontrada en estabilidad sobre 2693

640

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + E493Y+ K495N + A505C + G628W ** **

641

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + T482A+ K495N + G628W + D646N ** +

642

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + A477G+ K495N + G628W + S764F + S848N ** +

643

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + I847T ** +

644

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N+ G628W + T685V + Y850Q c1434t ** +

645

Y135M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L+ K495N + S501 R + G628W + T685V + T777N g2472a ** +

646

Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + Y850Q ** +

1 los cambios en aminoácidos están indicados respecto a SEQ ID NO:2; La secuencia del esqueleto contiene sustituciones Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W2los cambio en nucleotides están indicados respecto a SEQ ID NO:1. 3Mejora encontrada con respect a laVariante 269 (SEQ ID NO:7) * = 0.2 a 0.5 mejora encontrada ** = 0.6 a 1.0 mejora encontrada + = 1.1 a 1.9 mejora encontrada ++ = 2.0 a 2.9 mejora encontrada +++ = 3.0 a 3.9 mejora encontrada ++++ = 4.0 a 4.9 mejora encontrada

TABLA 5 Tabla 5: Condiciones de termoactividad: pH 4,2, 70 ºC durante 21 h. Condiciones de termoestabilidad: la actividad residual enzimática se determinó después de incubar a pH 4,5, 70 ºC durante 3 h.

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 4813 Mejora encontrada en estabilidad sobre 4813

481

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A6891+Y715P

647

D47I+Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687K+A689 1+Y715P ++++ ++++

648

A109S+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+ D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A 6891+Y715P ++++ ++

649

A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+ D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T 687W+A6891+Y715P+S764F ++++ ++

650

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T68 7C+A6891+Y715P+S764F +++ +

651

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P c2292t +++ +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 4813 Mejora encontrada en estabilidad sobre 4813

652

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687C+A68 91+Y715P +++ +

653

D471+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A 343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G62 8W+A689I+Y715P +++ ++

654

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+T687W+A689I+Y7 15P +++ ++

655

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P+S764F +++ +

656

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+A7 32G +++ +

657

D47I+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A3 43C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+A689I+Y715P+S764F +++ +

658

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P+S764F +++ +

659

D47I+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A3 43C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+A689I+Y715P+S764F +++ +

660

D47I+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A3 43C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+A689I+Y715P ++ +

661

A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+ D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T 687C+A6891+Y715P ++ ++

662

D471+1106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F3 14L+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+A689I+Y715P+A732G ++ ++

663

Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+T687W+A689I+Y7 15P ++ +

664

I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D 369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y71 5P+A732G c1425g ++ +

665

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P ++ +

666

D47I+A109S+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A3 43C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+T687W+A689I+Y715P ++ +

667

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+S652D+A 689I+Y715P+A732G c747t ++ +

668

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P ++ +

669

I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+D 369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+S6 52D+A689I+Y715P+A732G ++ ++

670

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A6891+Y 715P+S764F ++ +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 4813 Mejora encontrada en estabilidad sobre 4813

671

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A68 9I+Y715P ++ +

672

I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D 369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+S6 52D+A689I+Y715P+A732M ++ +

673

A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P+S764F ++ +

674

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P ++ +

675

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343G+D369R+ E402N+S434P+Q474L+A475L+K495N+G628W+A 689I+Y715P ++ +

676

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A68 9I+Y715P+S764F ++ +

677

D47I+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A68 9I+Y715P+S764F t300c ++ +

678

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P+S764F ++ +

679

D47I+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A3 43C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+A6891+Y715P ++ +

680

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P+S764F ++ +

681

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ++ +

682

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A68 91+Y715P ++ +

683

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ++ +

684

A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+ D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A 689I+Y715P ++ +

685

I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E 402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y71 5P+A732G+P870S ++ ++

686

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ++ +

687

I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+D 369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A6 89I+Y715P+A732M ++ ++

688

Q258N+Q291W+Q313M+F314V+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A6891+Y715P+A7 32G ++ +

689

I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E 402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y71 5P+A732V ++ +

690

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P ++ +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 4813 Mejora encontrada en estabilidad sobre 4813

691

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A6891+Y 715P ++ +

692

D47I+I106V+Q258N+Q291W+Q313M+F314L+D36 9R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I +Y715P+A732G ++ +

693

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P c306t ++ +

694

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ++ +

695

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+K495N+G628W+S652D+A689I+Y715P+A7 32G c1425g ++ +

696

D47I+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D3 69R+E402N+S434P+K495N+G628W+S652D+A68 91+Y715P+A732G c1425g ++ ++

697

D47I+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D3 69R+E402N+S434P+K495N+G628W+S652D+A68 9I+Y715P c1425g ++ +

698

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P ++ +

699

C8A+L9F+D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+ D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y7 15P+A732G c1425g ++ +

700

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A68 9I+Y715P+A732G+D844G ++ +

701

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ++ +

702

I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E 402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y71 5P+A732G ++ ++

703

D47N+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+D 369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A6 89I+Y715P+A732G ++ ++

704

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A6891+Y715P ++ +

705

D47I+I106V+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E40 2N+S434P+A475L+K495N+G628W+S652D+A689I +Y715P+A732M ++ +

706

A109T+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+T687W+A689I+Y7 15P ++ +

707

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P ++ +

708

V25A+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ++ +

709

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715 P+A732M ++ +

710

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+T687W+A689I+Y715P ++ +

711

D47I+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F31 4V+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+S652D+A689I+Y715P ++ ++

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 4813 Mejora encontrada en estabilidad sobre 4813

712

D47I+A109T+Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A68 9I+Y715P ++ +

713

D47I+Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715 P+S764F ++ +

714

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+T687K+A689I+Y7 15P c1173t + +

715

A109T+Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P+S764F + +

716

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A6891+Y715P + +

717

D47I+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A68 9I+Y715P + +

718

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+S7 64F + +

719

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D369R+ E402N+S434P+K495N+G628W+S652D+A689I+Y7 15P c1425g + +

720

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P + +

721

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P + +

722

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+S764F + +

723

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+D369R+ E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P c1425g + +

724

L237Y+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+ D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A 689I+Y715P + **

725

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P + +

726

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P + +

727

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P + +

728

Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+L75 7K + +

729

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P + +

730

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P + +

731

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+S604C+G628W+A689I+Y7 15P + +

732

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+A475L+R476G+K495N+N588F+G628 W+D651 E+A689I+Y715P + +

733

Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+P436Q+A475L+K495N+G628W+A6891+Y71 5P+L757K + +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 4813 Mejora encontrada en estabilidad sobre 4813

734

I106V+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+A73 2M + +

735

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A6891+Y715P + +

736

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P + +

737

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ K495N+G628W+S652D+A6891+Y715P+A732G c1425g + +

738

A109T+Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+A475L+.K495N+G628W+A6891+Y 715P + +

739

D47I+Q258N+Q291W+Q313M+F314L+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715 P+Y736N c2277a + +

740

Q258N+Q291W+Q313M+F314L+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+S652D+A689I+Y7 15P+A732G + +

741

V25A+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+P436Q+A475L+K495N+G616D+G62 8W+D650Y+A689I+Y715P+L757K + +

742

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+S764F + +

743

V253F+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Q690K+D7 09E+E71G+Y715P + +

744

Q85N+V175A+Q258N+L275Y+Q291W+Q313M+D 369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A6 89I+Y715P + +

745

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A689I+Q690K+Y715P + **

746

V25A+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+G616D+G628W+A68 91+Y715P+L757K + +

747

Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P + +

748

V25A+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715 P c57a + +

749

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+T687C+A689I+Y715P + **

750

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A689I+Q690H+Y715P+M 816L + +

751

V25A+Q85N+Q258N+L275Y+Q291 W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N +G616D+G628W+A689I+Y715P+V846F + +

752

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+V846Q + +

753

A79E+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G626D+G628W+A689I+Y71 5P + **

754

Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P + **

755

A79E+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+A505C+G628W+A689I+Y71 5P + +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 4813 Mejora encontrada en estabilidad sobre 4813

756

Q258N+Q291W+Q313M+F314L+D369R+Q381V+ E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y7 15P + +

757

D47I+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A68 9I+Y715P c1704t + +

758

Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P + +

759

V25A+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+P436Q+A475L+K495N+G628W+A68 9I+Y715P+L757K+V846Q + +

760

V25A+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+P436Q+A475L+K495N+G628W+D65 0N+A689I+Y715P + +

761

D47I+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+S550C+G628 W+S652D+A689I+Y715P+A732G + +

762

A109S+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+ E402N+S434P+A475L+K495N+S604A+G628W+A 689I+Y715P + +

763

V25A+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715 P+V846Q + +

764

D471+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E 402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y71 5P + +

765

A109T+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P + +

766

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D369R+ E402N+S434P+K495N+N588F+G628W+A689I+Y7 15P+A732M + +

767

Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G616D+G628W+A689I+Y71 5P + +

768

V25A+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+P436Q+A475L+K495N+G616D+G62 8W+D650N+A689I+Y715P + +

769

A79E+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+A505C+G628W+V674I+A68 9I+Y715P + +

770

V25A+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+L75 7K + +

771

V25A+Q85H+Q258N+L275F+Q291W+Q313M+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+D65 0N+A689I+Y715P+L757I + +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 4813 Mejora encontrada en estabilidad sobre 4813

772

K24T+A79E+A136L+Q258N+D274Y+ Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+A505C+G628 W+A689I+Y715P + +

773

V25A+Q85N+Q258N+Q291W+Q313 M+D369R+E402N+S434P+A475L+ K495N+G628W+A689I+Y715P + +

774

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+G628W +A6891+Y715P + **

775

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+G628W +A6891+Y715P g633a + **

776

K24G+A79E+Q258N+D274Y+Q291 W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+A505C+G628W+A68 9I+Y715P + **

777

Q85N+V175A+Q258N+Q291W+Q31 3M+D369R+E402N+S434P+A475L+ K495N+G628W+A689I+Y715P + +

778

V25A+Q85N+Q258N+Q291W+Q313 M+D369R+E402N+S434P+A475L+ K495N+G628W+D650N+A689I+Y715 P + +

779

V25A+Q85N+Q258N+L275Y+Q291W +Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A689I+Y715 P+L757K + +

780

A79M+Q258N+Q291W+Q313M+D36 9R+E402N+S434P+A475L+K495N+ A505C+G628W+A6891+Y715P + +

781

Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D36 9R+E402N+S434P+P436Q+A475L+ K495N+G628W+A689I+Y715P+ + +

782

Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D36 9R+E402N+S434P+A475L+K495N+ G628W+A689I+Y715P + +

783

Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D36 9R+E402N+S434P+A475L+K495N+ G628W+A689I+Y715P + +

784

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+G628W +A6891+Y715P + +

785

Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+ G628W+A689I+Y715P + **

(continúa)

Cambios1 en Aminoácidos

Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 4813 Mejora encontrada en estabilidad sobre 4813

786

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P + **

787

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P + **

788

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P + +

789

Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P g927a + +

790

I106V+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ** +

791

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+S604A+G628W+A68 9I+Y715P ** +

792

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A6891+Y715P ** +

793

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S4334P +A475L+K495N+G628W+A6891+Y715P ** **

794

V25A+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ** **

795

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+ E402N+S434P+Q474I+A475L+K495N+G628W+A6 89I+Y715P+S764F ** +

796

Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ** +

797

D47I+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S4 34P+A475L+K495N+N588F+G628W+A689I+Y715 P ** +

798

S58G+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+Q381V+E 402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y71 5P ** +

799

V253F+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+T7 85L+M816L ** +

800

A243G+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+ E402N+S434P+A475L+ K495N+G628W+A689I+Y715P+S764F ** +

801

I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E 402N+S434P+A475L+ K495N+N588F+G628W+S652D+A689I+Y715P+D7 33G c597t ** ++

802

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+V846L ** **

803

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+S604A+G628W+A689I+Y715P ** +

804

A79G+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+T77 7N ** +

805

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ** **

806

V25A+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ** **

807

K24T+A79E+Q258N+D274Y+Q291W+Q313M+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+G628 W+A689I+Y715P+T777N ** +

808

D47I+Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+S604V+G628W+T687 C+A689I+Y715P+S764F+L869R ** +

(continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 4813 Mejora encontrada en estabilidad sobre 4813

809

Q258N+D274Y+Q291W+Q313M+D369R+E385L+ E402N+S434P+A475L+ K495N+G626D+G628W+A689I+Y715P+T777N ** **

810

S58G+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+Q381V+E 402N+S434P+N437D+A475L+K495N+G628W+A6 89I+Q690H+D709E+E710G+Y715P c489t ** **

811

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D3 69R+E402N+S434P+ Q474I+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ** +

812

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ N437K+A475L+K495N+ G628W+A689I+Y715P+T785L ** +

813

A109S+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+ S604I+G628W+A689I+Y715P ** +

814

Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+ S604V+G628W+A689I+Y715P+K807R c624t ** +

815

Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+ S434P+A475L+K495N+ S604V+G628W+A689I+Y715P ** +

816

Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+ A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+L757K ** **

817

D47I+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S4 34P+K495N+N588F+G628W+S652D+A689I+Y715 P c1425g ** +

818

A79M+A136L+Q258N+D274Y+Q291W+Q313M+D 369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+G62 8W+A689I+Y715P+T783A ** +

819

D47I+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+S604V+G628 W+A689I+Y715P+S764F ** +

820

S58G+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G628W+A6891+Y715P+T78 5L ** **

821

K24G+A136L+Q258N+D274Y+Q291W+Q313M+D 369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+G62 8W+A689I+Y715P+T777N g240a * **

822

S58G+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+Q381 V+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+ Y715P+T785L c2007t * +

823

S58G+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S 434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+T78 5L+M816L * **

1 Los cambios en aminoácidos están indicados respecto a SEQ ID NO:2; La secuencia del esqueleto contiene sustituciones Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P. 2 Los cambios en Nucleótidos están indicados respecto a SEQ ID NO:1. 3Mejoras encontradas con respect aVariante 481 (SEQ ID NO:9): * = 0.2 a 0.5 mejora encontrada ** = 0.6a 1.0 mejora encontrada + = 1.1 a 1.9 mejora encontrada ++ = 2.0 a 2.9 mejora encontrada +++ = 3.0 a 3.9 mejora encontrada ++++ = 4.0 a 4.9 mejora encontrada

Tabla 6 Tabla 6: Condiciones de termoactividad: pH 4, 70 ºC durante 21 h. Condiciones de termoestabilidad: la actividad residual enzimática se determinó después de incubar a pH 4,5, 70 ºC durante 24 h. Se indican cambios de aminoácidos y de nucleótidos silenciosos con respecto a la secuencia natural.

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 6473 Mejora encontrada en estabilidad sobre 6473

647

D47I+Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E4 02N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687K+A689 I+Y715P

824

D47I+A79G+Q85N+Q258N+V260G+Q291W+Q313 M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N +G628W+ T687K+A6891+Y715P+A732M ++++ +

825

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+A3 43C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+T687C +A689I+Y715P+A732G ++++ +

826

D47I+A79E+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+A343 C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+ G628W+ T687W+A689I+Y715P c1947t +++ ++

827

D47I+A79E+Q85N+Q258N+V260G+Q291W+Q313 M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+ K495N+ G628W+T687K+A689I+Y715P +++ **

828

D47I+A79G+Q85N+Q258N+V260G+L275Y+Q291 W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P +A475L+K495N+A505C+G628W+T687C+A689I+Y 715P+S764Y +R769H c1677t +++ ++

829

D47I+A79G+Q85N+Q258N+V260G+Q291W+Q313 M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+ K495N+ G628W+T687K+A689I+Y715P +++ ++

830

D47I+A79M+Q85N+Q258N+V260G+L275Y+Q291 W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P +A475L+K495N+A505C+G628W+T687K+A689I+Y 715P +++ ++

831

D47I+A79M+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+A34 3C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C +G628W+ T687C+A689I+Y715P+A732G t756c +++ ++

832

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+A3 43C+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G62 8W+T687 C+A689I+Y715P+A732G +++ +

833

D47I+A79M+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F31 4V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628 W+T687 K+A689I+Y715P+A732G +++ **

834

D47I+Q258N+L275Y+Q291W+Q313M+F314V+A3 43C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+T68 7K+A689I +Y715P+A732G +++ +

835

D47I+A79E+Q85N+Q258N+V260G+Q291W+Q313 M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N +A505C+ G628W+T687W+A689I+Y715P+A732V +++ ++

836

D47I+A79M+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A34 3C+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628 W+T687 K+A689I+Y715P+A732M +++ *

837

D47I+Q85N+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F31 4V+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N +G628W +T687C+A689I+Y715P +++ **

838

D47I+A79G+Q258N+V260G+L275Y+Q291W+Q31 3M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495 N+G628W +T687K+A689I+Y715P+A732G +++ +

839

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+A3 43C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+T687 W+A6891+Y715P+A732G +++ ++

(continúa)

65 (continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 6473 Mejora encontrada en estabilidad sobre 6473

840

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+A3 43C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+T687 K+A689I+Y715P+A732M +++ **

841

D47I+A79G+Q85N+Q258N+V260G+Q291W+Q313 M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N +G628W+ T687K+A689I+Y715P +++ **

842

D47I+A79G+Q85N+Q258N+V260G+L275Y+Q291 W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P +A475L+K495N+G628W+T687C+A689I+Y715P+A 732G +++ **

843

D47I+A79G+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A34 3C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+T687K+A689I+Y715P+A732M +++ **

844

D47I+Q85N+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A34 3C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+T687 K+A689I +Y715P +++ +

845

D47I+Q85N+Q258N+V260G+L275Y+Q291W+Q31 3M+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628 W+T687 K+A689I+Y715P+A732G +++ +

846

D47I+A79M+Q85N+Q258N+V260G+L275Y+Q291 W+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+K495 N+G628W +T687W+A689I+Y715P +++ *

847

D47I+A79G+Q85N+Q258N+V260G+Q291W+Q313 M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N +A505C+ G628W+T687K+A689I+Y715P +++ **

848

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+A3 43C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+T687 C+A689I+Y715P+A732G c498t +++ +

849

D47I+A79G+Q85N+Q258N+V260G+L275Y+Q291 W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P +A475L+ K495N+G628W+T687K+A689I+Y715P +++ ++

850

D47I+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D36 9R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687 W+A689I +Y715P+A732G +++ ++

851

D47I+A79G+Q85N+Q258N+V260G+L275Y+Q291 W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P +A475L+K495N+A505C+G628W+T687C+A689I+Y 715P c1335t +++ **

852

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+G628 W+T687 K+A689I+Y715P+A732G +++ +

853

D47I+Q258N+Q291W+Q313M+F314V+A343C+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T68 7W+A689 I+Y715P+A732G +++ ++

854

D47I+A79G+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+F314 V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628 W+T687K+ A689I+Y715P +++ **

855

D47I+A79M+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+A34 3C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+T687K+ A689I+Y715P+A732G +++ *

856

D47I+Q85N+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F31 4V+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N +G628W +T687K+A689I+Y715P +++ *

857

D47I+Q85N+Q258N+L275Y+Q291W+Q313M+F31 4V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628 W+T687 C+A6891+Y715P +++ ++

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 6473 Mejora encontrada en estabilidad sobre 6473

858

D47I+A79G+Q85N+Q258N+V260G+L275Y+Q291 W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P +A475L+K495N+G628W+T687K+A689I+Y715P+A 732G +++ **

859

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T68 7K+A689I +Y715P c1377t ++ +

860

D47I+Q85N+Q258N+V260G+L275Y+Q291W+Q31 3M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495 N+G628W +T687K+A689I+Y715P ++ +

861

D47I+A79G+Q258N+Q291W+Q313M+F314L+A34 3C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628 W+T687K +A689I+Y715P + ++

862

D47I+Q258N+Q291W+Q313M+F314V+A343C+D3 69R+E402N+S434P+K495N+G628W+T687K+A68 9I+Y715 P + +

863

D47I+Q258N+V260G+L275Y+Q291W+Q313M+A3 43C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505 C+G628W +D646N+T687K+A689I+Y715P+A732G + +

864

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D3 69R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T68 7K+A689I +Y715P + +

865

D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+A3 43C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+T68 7K+A689 I+Y715P+A732V + +

866

D47I+A79G+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+A343 C+D369R+E402N+S434P+P439S+A475L+K495N+ G628W+ T687K+A689I+Y715P + *

867

D47I+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+F314V+A34 3C+D369R+D395N+E402N+S434P+A475L+K495 N+G628 W+T687K+A689I+Y715P+A732V + +

868

D47I+A79G+Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D36 9R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+G628 W+T687C +A689I+T693A+Y715P+T827I ** +

869

D47I+Q85N+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A34 3C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C +G628W +T687K+A689I+Y715P+A732V t237g ** +

870

D47I+A79G+Q258N+L275Y+Q291W+Q313M+A34 3C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C +G628W+T687K+A689I+T693E+N723G+A730S+Y 855* a2185c ** +

1 Los cambios en aminoácidos están indicados respecto a SEQ ID NO:2; La secuencia del esqueleto contiene sustituciones D47I+Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687K+A6891+Y 715P. 2 Los cambios en Nucleótidos están indicados respecto a SEQ ID NO:1. 3 Mejoras encontradas con respect o a Variante 647 (SEQ ID NO:15): * = 0.2a 0.5 mejoras encontradas ** = 0.6 a 1.0 mejoras encontradas + = 1.1 a 1.9 mejoras encontradas ++ = 2.0 a 2.9 mejoras encontradas +++ = 3.0 a 3.9 mejoras encontradas ++++ = 4.0 a 4.9 mejoras encontradas

TABLA 7 Tabla 7: Condiciones de termoactividad: pH 4, 70 ºC durante 21 h. Condiciones de termoestabilidad: la actividad residual enzimática se determinó después de incubar a pH 4,5, 70 ºC durante 24 h.

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 6643 Mejora encontrada en estabilidad sobre 6643

664

I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D 369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y71 5P+A732 G c1425g

871

D47I+A79E+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G +Q291W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+ S434P+K 495N+G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

872

D47I+A79E+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W +Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+ K495N+A 505C+G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g +++ +

873

A79M+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q29 1W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434 P+K495N +G628W+A689I+Y715P+A732G c246t+c14 25 g+ c2346t +++ +

874

D47I+A79E+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291 W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P +K495N+ G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g +++ +

875

D47I+A79G+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G +L275Y+Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+ E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A7 32G c1425g +++ +

876

A79E+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291 W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P +K495N +G628W+A6891+Y715P+A732G c1425g +++ +

877

A79G+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+L275 F+Q291W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N +S434P+K495N+A505C+G628W+T687C+A689I+Y 715P+A732 G c1425g ++ +

878

D47I+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F31 4L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628 W+A689I +Y715P+A732G c1425g ++ +

879

D47I+A79E+Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G +Q291W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+ S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

880

D47I+A79E+Q85N+I106V+Q258N+V260G+L275Y +Q291W+Q313M+F314L+N315D+D369R+E402N+ S434P+K495N+A505C+G628W+T687W+A689I+Y 715P+A732G c1425g ++ **

881

D47I+Q85N+I106V+Q258N+V260G+L275Y+Q291 W+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N +G628W+ A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

882

A79E+Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+Q291 W+Q313M+F314V+D369R+E402N+S434P+K495N +G628 W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

883

A79G+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F3 14V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G62 8W+T687 W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

884

D47I+A79G+Q85N+I106V+Q258N+V260G+L275Y +Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+ S434P+K495N+A505C+G628W+A689I+Y715P+A7 32G c1425g+g2 23 5a ++ +

885

D47I+Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+Q291 W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P +K495N+ G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g+ ++ +

886

D47I+A79E+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W +Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+ K495N+G 628W+A689I+Y715P+A732G c811t+c14 25 g ++ +

(continúa) (continúa) (continúa)

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 6643 Mejora encontrada en estabilidad sobre 6643

887

D47I+A79M+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291 W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P +K495N+G 628W+A6891+Y715P+A732G c1425g ++ +

888

D47I+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q31 3M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495 N+G628 W+A689I+Y715P+A732G c1425g+c1 80 6t ++ +

889

D47I+A79G+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291 W+Q313M+F314V+D369R+E402N+S434P+K495N +A505C+G 628W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

890

A79M+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F3 14L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A68 9I+Y715P +A732G c1425g ++ +

891

A79M+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q31 3M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495 N+A505C +G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

892

A79M+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q31 3M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495 N+G628 W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

893

D47I+A79G+Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G +Q291W+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+ K495N+ G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g+c2 54 1t ++ +

894

A79E+Q85H+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q31 3M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628 W+A689I +Y715P+A732G c540t+c14 25 g ++ +

895

D47I+A79G+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291 W+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N +G628W+ A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

896

A79G+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q31 3M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495 N+G628W +A6891+Y715P+A732G c1425 ++ +

897

D47I+A79E+Q85N+I106V+Q258N+V260G+L275Y +Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+ S434P+K 495N+G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

898

D47I+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q31 3M+F314V+D369R+E402N+S434P+K495N+G628 W+A689I +Y715P+A732G c468t+c14 25 g ++ +

899

C8G+D47I+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W +Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+ G628W+A 689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

900

A79E+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q31 3M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628 W+A689I +Y715P+A732G c1425g ++ +

901

A79G+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q31 3M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495 N+G628W +A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

902

D47I+A79G+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291 W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P +K495N+T 591I+G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

903

Q85N+1I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q 313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K49 5N+G628 W+A6891+Y715P+A732G g150a+c14 25 g ++ +

904

A79M+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F3 14V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G62 8W+A689 I+Y715P+A732G c1425g ++ +

905

Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F3 14V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G62 8W+A689 I+Y715P+A732G c1425g ++ +

Variante Número

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 en nucleótidos silenciosos Mejora encontrada en actividad sobre 6643 Mejora encontrada en estabilidad sobre 6643

906

Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+Q291W+Q3 13M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+A505 C+G628 W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

907

I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D 369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628W+T6 87K+A689 I+Y715P+A732G c1425g ++ **

908

Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q3 13M+F314V+D369R+E402N+S434P+K495N+G62 8W+A689 I+Y715P+A732G c1425g ++ +

909

D47I+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291 W+Q313M+F314V+A343G+D369R+E402N+S434P +K495N+ G628W+A689I+Y715P+A732G t237q+c14 25 g ++ +

910

D47I+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291 W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P +K495N+ G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

911

D47I+Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+L275 Y+Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N +S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

912

D47I+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F31 4V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628 W+A689I +Y715P+A732G c933t+c14 25 g ++ +

913

I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+D 369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y71 5P+A73 2G c1425g ++ **

914

D47I+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F31 4L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628 W+689I +Y715P+A732G c1425g ++ **

915

D47I+Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+L275 Y+Q291W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402 N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687C+A689I+ Y715P+A32G ++ +

916

D47I+A79M+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313 M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W +A689I+ Y715P+A732G c1425g ++ +

917

A79G+Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+Q29 1W+Q313M+F314V+D369R+E402N+S434P+K495 N+A505C +G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

918

D47I+A79E+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W +Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+ G628W+ A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

919

Q85N+I106V+Q258N+V260G+L275Y+Q291W+Q3 13M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495 N+G628 W+T687W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ **

920

I106V+Q258N+V260G+L275Y+Q291W+Q313M+F 314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G62 8W+A689 I+Y715P+A732G c1425g ++ **

921

D47I+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291 W+Q313M+F314V+D369R+E402N+S434P+K495N +G628W +A6891+Y715P+A732G c1425g ++ +

922

Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+L275Y+Q29 1W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434 P+K495N +G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

923

D47I+A79M+I106V+A109S+Q258N+V260G+Q291 W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P +K495N+ G628W+A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

924

A79M+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q31 3M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495 N+G628W +A689I+Y715P+A732G c1425g ++ +

Variante

Cambios1 en Aminoácidos Cambios2 Mejora Mejora

Número

en nucleótidos silenciosos encontrada en actividad sobre 6643 encontrada en estabilidad sobre 6643

925

A79M+Q85N+I106V+Q258N+V260G+L275Y+Q291 W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P +K495N +A505C+G628W+A689I+Y715P+A732G c699t+c14 25g ++ **

1 Los cambios en aminoácidos están indicados respecto a SEQ ID NO:2; La secuencia del esqueleto contiene sustituciones I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+ A732G. 2 Los cambios en Nucleótidos están indicados respecto a SEQ 10 NO:1. 3 Mejoras encontradas con respect o a Variante 664 (SEQ ID NO:13) * = 0.2 a 0.5 mejoras encontradas ** = 0.6 a1.0 mejoras encontradas + = 1.1 a 1.9 mejoras encontradas ++ = 2.0 a 2.9 mejoras encontradas +++ = 3.0 a 3.9 mejoras encontradas

La Tabla 8 ilustra propiedades a modo de ejemplo de variantes de Bgl C1 con elevada termoactividad y/o termoestabilidad en comparación con la enzima natural. TABLA 8

Un ejemplo de realización tiene

Al menos x veces mayor= Actividad La variante No. Bajo condiciones Variante(s) Ejemplar(es) Ver tabla

5

Termoactividad De tipo salvaje pH 5, 65°C, 21h 3 2

2

Termoestabilidad* De tipo salvaje pH 5, 65°C, 6h 3

2

2,3,4,5 o 6

Termoactividad 3 pH 5, 70°C, 21h 269 3

1.1,2 o 3

Termoestabilidad 3 pH 5, 65°C, 16h 269 3

2,3 o 4

Termoactividad 269 pH 4.5, 70°C, 21h 481 4

1.1 o 2

Termoestabilidad 269 pH 4.5, 70°C, 2h 481 4

2,3 o 4

Termoactividad 481 pH 4.2, 70°C, 21h 647 5

1.1, 2 o 4

Termoestabilidad 481 pH 4.5, 70°C, 3h 647 5

3 o 4

Termoactividad 647 pH 4, 70°C, 21 h 824, 825 6

1,1 o 2

Termoestabilidad 647 pH 4.5, 70°C, 24h 824, 825 6

2 o 3

Termoactividad 664 pH 4, 70°C, 21 h 871, 885, 916 7

1,1

Termoestabilidad 664 pH 4.5, 70°C, 24h 871, 885, 916 7

Por ejemplo, en algunas realizaciones, una variante tiene al menos 5 veces mayor termoactividad y/o al menos 2 veces mayor termoestabilidad que Bgl1 natural. Para ejemplo y no limitación, la variante 3 tiene estas propiedades. Por ejemplo, en otra realización, una variante tiene al menos 4 veces mayor termoactividad y/o al menos 4 veces mayor termoestabilidad que la variante 481 de Bgl1. Por ejemplo y no limitación, la variante 647 tiene estas propiedades.

Las secuencias de aminoácidos de variantes de -glucosidasa no específicamente descritas en el presente documento pueden generarse e identificarse fácilmente usando procedimientos que son muy conocidos para aquellos que son expertos habituales en la materia. Algunas variantes de -glucosidasa de la invención que tienen al menos el 70 % de identidad de secuencias con los residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2 y una o más sustituciones desveladas en el presente documento también tienen una o más sustituciones, deleciones o inserciones, además de aquellas específicamente desveladas en el presente documento. El efecto, si lo hay, de tales sustituciones, deleciones o inserciones sobre la actividad de -glucosidasa y termoestabilidad puede determinarse usando ensayos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 3 y 5, más adelante). Para ilustración, la variante número 1 en la Tabla 2 tiene las siguientes sustituciones con respecto a los residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2: M181Y+Q291W+E402N+S434P. Para determinar el efecto de otra sustitución (por ejemplo, sustitución de isoleucina en la posición 20 con leucina) la variante (en este caso, I20L+M181Y+Q291W+E402N+S434P) se expresa y sus propiedades se comparan con la parental (en este caso, M181Y+Q291W+E402N+S434P).

Además, pueden generarse bibliotecas de variantes de polipéptido de -glucosidasa (y polinucleótidos que codifican las variantes) de una secuencia parental (por ejemplo, tal como una o más variantes ejemplificadas en el presente documento) y cribarse usando selección de alto rendimiento para la presencia de actividad de -glucosidasa descrita en, por ejemplo, el Ejemplo 5. Los procedimientos de mutagénesis y evolución dirigida conocidos en la técnica pueden aplicarse fácilmente a polinucleótidos que codifican variantes de -glucosidasa ejemplificadas en el presente documento para generar bibliotecas de variante que pueden expresarse, cribarse y ensayarse usando los procedimientos descritos en el presente documento. Los procedimientos de mutagénesis y evolución dirigida son muy conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Ling y col., 1999, “Approaches to DNA mutagenesis: an overview”, Anal. Biochem., 254(2):157-78; Dale y col., 1996, “Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method”, Methods Mol. Biol., 57:369-74; Smith, 1985, “In vitro mutagenesis”, Ann. Rev. Genet., 19:423-462; Botstein y col., 1985, “Strategies and applications of in vitro mutagenesis”, Science, 229:1193-1201; Carter, 1986, “Site-directed mutagenesis”, Biochem. J., 237:1-7; Kramer y col., 1984, “Point Mismatch Repair”, Cell, 38:879-887; Wells y col., 1985, “Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites”, Gene, 34:315-323; Minshull y col., 1999, “Protein evolution by molecular breeding”, Current Opinion in Chemical Biology, 3:284-290; Christians y col., 1999, “Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling”, Nature Biotechnology, 17:259-264; Crameri y col., 1998, “DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution”, Nature, 391:288-291; Crameri y col., 1997, “Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling”, Nature Biotechnology, 15:436-438; Zhang y col., 1997 “Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening”, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 94:45-4-4509; Crameri y col., 1996, “Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling”, Nature Biotechnology, 14:315-319; Stemmer, 1994, “Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling”, Nature, 370:389-391; Stemmer, 1994, “DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution”, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 91:10747-10751; documentos WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; y WO 01/75767, todos incorporados en el presente documento por referencia.

En la generación de variantes que comprenden sustituciones, inserciones o deleciones en las posiciones, además de aquellas descritas arriba, el profesional habitual en la técnica sabrá que ciertas regiones de la proteína glucosidasa son menos tolerantes que otras a sustituciones (especialmente sustituciones no conservativas). Así, en algunas realizaciones, las proteínas Bgl1 de variante retienen residuos conservados y dominios funcionales de las parentales.

Actividad de f-glucosidasa y ensayos de termoestabilidad

La actividad de -glucosidasa puede determinarse mediante procedimientos descritos en los Ejemplos 3 y 5, además de cualquier otro procedimiento conocido en la técnica. La actividad de -glucosidasa puede determinarse, por ejemplo, usando un ensayo de para-nitrofenil--D-glucopiranósido (pNPG) o usando un ensayo de celobiosa.

Por ejemplo, puede usarse un ensayo basado en pNPG (p-nitrofenil--D-glucopiranósido) colorimétrico para medir la actividad de a-glucosidasa. Un ensayo tal se describe en el Ejemplo 3, más adelante. En otro ensayo de pNPG a modo de ejemplo, en un volumen total de 100 µl, 20 µl de sobrenadante de medio claro que contiene la enzima glucosidasa se añaden a disolución de pNPG 4 mM (Sigma-Aldrich, Inc. St. Louis, MO) en tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 5. Las reacciones se incuban a pH 5, 50 ºC durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se inactiva con 100 µl de disolución de carbonato sódico 1 M a pH 11. La absorbancia de la disolución se mide a 405 nm para determinar la conversión de pNPG en p-nitrofenol. La liberación de p-nitrofenol (£ = 17,700 M-1 cm-1) se mide a 405 nm para calcular la actividad de -glucosidasa. La actividad de -glucosidasa detectable se observa bajo condiciones de selección de alto rendimiento (pH 7, 50 ºC). Véase Breves y col., 1997, Appl. Environmental Microbiol. 63:3902, incorporado en el presente documento por referencia.

Alternativamente, la actividad de -glucosidasa puede determinarse usando un ensayo en el que la celobiosa es el sustrato. Un ensayo adecuado se describe en el Ejemplo 3, más adelante. Otro ensayo adecuado se lleva a cabo del siguiente modo: en un volumen total de 100 µl, 25 µl de sobrenadante de medio claro que contiene la enzima glucosidasa se añade a 10 g/l de celobiosa (cat. de Fluka nº 22150, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) en tampón fosfato de sodio 100 mM (pH 6-7) o tampón acetato sódico (pH 5-5,5). La reacción se incuba a 45-70 ºC durante un tiempo apropiado (25 minutos a durante la noche dependiendo de la concentración de enzima) mientras que se agita. La producción de glucosa puede determinarse usando cualquier número de procedimientos conocidos en la materia para medir glucosa. En un enfoque, la producción de glucosa se determina usando un ensayo de glucosa enzimático (K-GLUC, Megazyme, Irlanda). Se añaden 10 µl de cada reacción a 190 µl de reactivo GOPOD (suministrado como parte del kit de ensayo de K-GLUC). La reacción se incuba a 45 ºC durante 20 minutos y la absorbancia de la disolución se midió a 510 nm. El reactivo GOPOD contiene tampón fosfato potásico 50 mM a pH 7,4, ácido p-hidroxibenzoico 0,011 M, 0,008 % en peso/volumen de azida de sodio, glucosa oxidasa (>12.000 U/l), peroxidasa (>650 U/l) y 80 mg/l de 4-aminoantipirina. La enzima glucosa oxidasa en el reactivo reacciona con cualquier glucosa presente en la muestra y produce peróxido de hidrógeno que luego reacciona con la 4aminoantipirina para producir un colorante de quinoneimina en cantidades proporcionales a la cantidad de glucosa presente y puede medirse espectrofotométricamente a 510 nm.

Péptido señal

En general, los polipéptidos de -glucosidasa son secretados de la célula huésped en la que se expresan (por ejemplo, una levadura o célula fúngica) y se expresan como una pre-proteína que incluye un péptido señal, es decir, una secuencia de aminoácidos ligada al extremo amino de un polipéptido y que dirige el polipéptido codificado en la ruta secretora de células. En una realización, el péptido señal es el péptido señal de -glucosidasa C1 endógeno que tiene la secuencia expuesta como los residuos 1-19 de SEC ID Nº: 2. En otras realizaciones se usan los péptidos señal de otras proteínas secretadas C1.

Pueden usarse todavía otros péptidos señal, dependiendo de la célula huésped y otros factores. Regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huésped fúngicas filamentosas incluyen, pero no se limitan a, las regiones codificantes del péptido señal obtenidas de TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y celobiohidrolasa II de T. reesei (TrCBH2).

Regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huésped bacterianas son las regiones codificante del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica NCIB 11837 de Bacillus, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, -lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y prsA de Bacillus subtilis. Péptidos señal adicionales se describen por Simonen y Palva, 1993, Microbiol Rev 57: 109-137 (incorporado en el presente documento por referencia).

Péptidos señal útiles para células huésped de levadura también incluyen aquellos de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, invertasa SUC2 de Saccharomyces cerevisiae (véase Taussig y Carlson, 1983, Nucleic Acids Res 11:1943-54; nº de acceso de SwissProt P00724), y otros. Véase, por ejemplo, Romanos y col., 1992, Yeast 8:423-488. Son adecuadas variantes de estos péptidos señal y otros péptidos señal.

Polipéptidos de fusión y elementos de secuencia adicionales

En algunas realizaciones, una variante de polipéptido de -glucosidasa de la invención incluye secuencias adicionales que no alteran la actividad codificada de una -glucosidasa. Por ejemplo, la -glucosidasa puede ligarse a una marca de epítope o a otra secuencia útil en la purificación de -glucosidasa.

La presente invención también proporciona polipéptidos de fusión de variante de -glucosidasa, en los que el polipéptido de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido de variante de glucosidasa de la presente invención o fragmento del mismo, ligado tanto directamente como indirectamente mediante el extremo N o C del polipéptido de variante de -glucosidasa a una secuencia de aminoácidos que codifica al menos un segundo polipéptido (adicional). El polipéptido de fusión de variante de -glucosidasa puede incluir adicionalmente secuencia de aminoácidos que codifica un tercer, cuarto, quinto o polipéptidos adicionales. Normalmente, cada polipéptido adicional tiene una actividad biológica, o alternativamente, es una porción de un polipéptido que tiene una actividad biológica, en el que la porción tiene el efecto de mejorar la expresión y/o secreción del polipéptido de fusión del huésped de expresión deseado. Estas secuencias pueden fusionarse, tanto directamente como indirectamente, al extremo N o C del polipéptido de variante de -glucosidasa o fragmento del mismo, o alternativamente, al extremo N o C de los polipéptidos adicionales que tienen actividad biológica.

Normalmente, el (los) polipéptido(s) adicional(es) codifican una enzima o fragmento activo de la misma, y/o un polipéptido que mejora la expresión y/o secreción del polipéptido de fusión de la célula huésped de expresión deseada. Más normalmente, el (los) polipéptido(s) adicional(es) codifica(n) una celulasa (por ejemplo, una glucosidasa que tiene una secuencia de aminoácidos diferente del polipéptido de variante de -glucosidasa en el polipéptido de fusión (por ejemplo, una -glucosidasa natural o una variante de la misma, que incluye un polipéptido de variante de -glucosidasa de T. aurentiacus diferente), o un polipéptido que presenta actividad de CBH o EG) y/o un polipéptido que mejora la expresión y secreción de la célula huésped deseada tal como, por ejemplo, un polipéptido que normalmente se expresa y secreta del huésped de expresión deseado, tal como un polipéptido secretado normalmente expresado a partir de hongos filamentosos. Éstos incluyen glucoamilasa, a-amilasa y aspartil proteasas de Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori y Aspergillus oryzae, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II, endoglucanasa I y endoglucasa III de Trichoderma y glucoamilasa de especies de Neurospora y Humicola. Véase el documento WO 98/31821, que se incorpora en el presente documento por referencia.

Los componentes de polipéptido del polipéptido de fusión pueden ligarse entre sí indirectamente mediante un ligador. Ligadores adecuados para su uso en la práctica de la presente invención se describen en el documento WO 2007/075899, que se incorpora en el presente documento por referencia. Ligadores a modo de ejemplo incluyen ligadores de péptido de 1 a aproximadamente 40 residuos de aminoácidos de longitud, que incluyen aquellos de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 residuos de aminoácidos de longitud, y aquellos de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 residuos de aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los ligadores pueden estar constituidos por un único residuo de aminoácido tal como, por ejemplo, un residuo de Gly, Ser, Ala o Thr o combinaciones beneficiosas de los mismos, particularmente Gly y Ser. Los ligadores empleados en la práctica de la presente invención pueden ser escindibles. Ligadores escindibles adecuados pueden contener un sitio de escisión, tal como un sitio de reconocimiento de proteasa. Sitios de reconocimiento de proteasa a modo de ejemplo son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, Lys-Arg (el sitio de reconocimiento de la proteasa KEX2, que puede escindirse por una proteasa similar a KEX2 de Aspergillus nativo), Lys y Arg (los sitios de reconocimiento de la proteasa tripsina). Véase, por ejemplo, el documento WO 2007/075899, que se incorpora en el presente documento por referencia.

IV. POLINUCLEÓTIDOS DE -GLUCOSIDASA Y SISTEMAS DE EXPRESIÓN

La presente invención proporciona secuencias de polinucleótidos que codifican variantes de -glucosidasa C1 de la invención. Las secuencias genómicas y de ADNc de C1 se describen en la Sección II, arriba.

En una realización, para la expresión de una variante de -glucosidasa descrita en el presente documento puede usarse la secuencia de ADNc de -glucosidasa C1 natural (SEC ID Nº: 1), o la porción de la misma que comprende el marco de lectura abierto (con cambios según se requiera en los codones correspondientes a sustituciones (residuos mutados con respecto a la secuencia natural). Además, puede incorporarse uno o más de los cambios de nucleótidos “silenciosos” mostrados en la Tabla 2, Tabla 3, Tabla 4, Tabla 5, Tabla 6 o Tabla 7.

Aquellos expertos habituales en la materia entenderán que debido a la degeneración del código genético existe una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de -glucosidasa de la presente invención. La Tabla 9 proporciona el código genético de triplete convencional para cada aminoácido. Por ejemplo, los codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG y CGU codifican todos el aminoácido arginina. Así, en cada posición en los ácidos nucleicos de la invención en los que una arginina está especificada por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos anteriormente sin alterar el polipéptido codificado. Se entiende que U en una secuencia de ARN se corresponde con T en una secuencia de ADN. La invención contempla y proporciona todas y cada una de las posibles variaciones de secuencia de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la invención que podría prepararse seleccionando combinaciones beneficiosas basadas en posibles elecciones de codones.

También puede diseñarse una secuencia de ADN para codones de sesgo de alto uso de codones (codones que se usan a mayor frecuencia en las regiones codificantes de proteína que otros codones que codifican el mismo aminoácido). Los codones preferidos pueden determinarse en relación con el uso de codones en un único gen, un conjunto de genes de función u origen común, genes altamente expresados, la frecuencia de codones en las regiones codificantes de proteína agregadas del organismo completo, frecuencia de codones en las regiones codificantes de proteína agregadas de organismos relacionados, o combinaciones beneficiosas de los mismos. Los codones cuya frecuencia aumenta con el nivel de expresión génica son normalmente codones óptimos para la expresión. En particular, una secuencia de ADN puede optimizarse para la expresión en un organismo huésped particular. Referencias que proporcionan información de preferencia para una amplia gama de organismos están fácilmente disponibles. Véase, por ejemplo, Henaut y Danchin en “Escherichia Salmonella”, Neidhardt y col. Eds., ASM Pres, Washington D.C. (1996), pág. 2047-2066, que se incorpora en el presente documento por referencia. Para ilustración, y no para limitación, la SEC ID Nº: 3 muestra una secuencia de polinucleótidos que codifica Bgl1 C1 diseñada con sesgo de codones para la expresión en Saccharomyces cerevisiae.

TABLA 9: CÓDIGO GENÉTICO

Amino acid

Codon

Alanine

Ala A GCA GCC GCG GCU

Cysteine

Cys C UGC UGU

Aspartic acid

Asp D GAC GAU

Glutamic acid

Glu E GAA GAG

Phenylalanine

Phe F UUC UUU

Glycine

Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidine

His H CAC CAU

Isoleucine

Ile I AUA AUC AUU

Lysine

Lys K AAA AAG

Leucine

Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Methionine

Met M AUG

Asparagine

Asn N AAC AAU

Proline

Pro P CCA CCC CCG CCU

Glutamine

Gln Q CAA CAG

Arginine

Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Serine

Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU

Threonine

Thr T ACA ACC ACG ACU

Valine

Val V GUA GUC GUG GUU

Tryptophan

Trp W UGG

Tyrosine

Tyr Y UAC UAU

Se conocen una variedad de procedimientos para determinar la frecuencia de codones (por ejemplo, uso de codones, uso de codones sinónimos relativos) y preferencia de codones en organismos específicos, que incluyen análisis multifactorial, por ejemplo, usando análisis de agrupaciones o análisis de correspondencia, y el número eficaz de codones usados en un gen (véase GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; Codon W, John Peden, Universidad de Nottingham; McInerney, J. O, 1998, Bioinformatics 14:372-73; Stenico y col., 1994, Nucleic Acids Res. 222437-46; Wright, F., 1990, Gene 87:23-29; Wada y col., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118; Nakamura y col., 2000, Nucl. Acids Res. 28:292; Henaut y Danchin, “Escherichia coli and Salmonella”, 1996, Neidhardt y col. Eds., ASM Press, Washington D.C., pág. 2047-2066, todas las cuales se incorporan en el presente documento por referencia). La fuente de datos para obtener el uso de codones puede basarse en cualquier secuencia de nucleótidos disponible que pueda codificar una proteína. Estos conjuntos de datos incluyen secuencias de ácidos nucleicos en realidad conocidas por codificar proteínas expresadas (por ejemplo, secuencias codificantes de proteínas completas-CDS), marcas de secuencia expresadas (EST) o regiones codificantes predichas de secuencias genómicas (véase, por ejemplo, Mount, D., Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Capítulo 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; Uberbacher, E. C., 1996, Methods Enzymol. 266:259-281; Tiwari y col., 1997, Comput. Appl. Biosci. 13:263-270, todas las cuales se incorporan en el presente documento por referencia).

Para la expresión de una variante de -glucosidasa en C1 o huésped de M. Thermophila puede usarse la secuencia de ADNc de -glucosidasa C1 natural (SEC ID Nº: 1), o la porción de la misma que comprende el marco de lectura abierto (con cambios según se requiera en los codones correspondientes a sustituciones (residuos mutados con respecto a la secuencia natural). Además, puede incorporarse uno o más de los cambios de nucleótidos “silenciosos” mostrados en la Tabla 2. Estos cambios pueden afectar la actividad de -glucosidasa en una variedad de formas. Por ejemplo, sin pretender ligarse a un mecanismo particular, las mutaciones silenciosas pueden aumentar la estabilidad de ARNm que codifica la proteína de variante.

Vectores de expresión

La presente invención hace uso de construcciones recombinantes que comprenden una secuencia que codifica una -glucosidasa como se ha descrito anteriormente. En un aspecto particular la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido de -glucosidasa operativamente ligado a un promotor heterólogo. Los vectores de expresión de la presente invención pueden usarse para transformar una célula huésped apropiada para permitir que el huésped exprese la proteína -glucosidasa. Procedimientos para la expresión recombinante de proteínas en hongos y otros organismos son muy conocidos en la técnica, y están disponibles varios vectores de expresión o pueden construirse usando procedimientos rutinarios. Véase, por ejemplo, Tkacz y Lange, 2004, ADVANCES IN FUNGAL BIOTECHNOLOGY FOR INDUSTRY, AGRICULTURE, AND MEDICINE, KLUWER ACADEMIC/PLENUM PUBLISHERS. New York; Zhu y col., 2009, Construction of two Gateway vectors for

gene expression in fungi Plasmid 6:128-33; Kavanagh, K. 2005, FUNGI: BIOLOGY AND APPLICATIONS Wiley, todas las cuales se incorporan en el presente documento por referencia.

Las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención comprenden un vector, tal como un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), y similares, en los que se ha insertado una secuencia de ácidos nucleicos de la invención. Los polinucleótidos de la presente invención pueden incorporarse en uno cualquiera de una variedad de vectores de expresión adecuados para expresar un polipéptido. Vectores adecuados incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones beneficiosas de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tal como variolovacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, seudorrabia, adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus y muchos otros. Puede usarse cualquier vector que transduzca material genético en una célula y, si se desea la replicación, que sea replicable y viable en el huésped relevante.

En un aspecto de esta realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras que incluyen, por ejemplo, un promotor operativamente ligado a la secuencia codificante de proteína. Números grandes de vectores adecuados y promotores son conocidos para aquellos expertos en la materia.

Construcciones de promotor/gen

Como se trata anteriormente, para obtener altos niveles de expresión en un huésped particular es frecuentemente útil expresar -glucosidasa C1 bajo control de un promotor heterólogo. Normalmente, una secuencia promotora puede estar operativamente ligada a la región 5' de la secuencia codificante de -glucosidasa C1 usando procedimientos rutinarios.

Ejemplos de promotores útiles para la expresión de polinucleótidos de -glucosidasa incluyen promotores de hongos. Por ejemplo, pueden usarse secuencias promotoras que accionan la expresión de genes distintos del gen 1 de -glucosidasa en C1. Por ejemplo, puede usarse un promotor fúngico de un gen que codifica celobiohidrolasa.

Ejemplos de otros promotores adecuados útiles para dirigir la transcripción de las construcciones de nucleótidos de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable ácida de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans y proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum (documento WO 96/00787, que se incorpora en el presente documento por referencia), además del promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae), promotores tales como cbh1, cbh2, egl1, egl2, pepA,hfb1, hfb2, xyn1, amy y glaA (Nunberg y col., 1984, Mol. Cell Biol., 4:2306 -2315, Boel y col., 1984, EMBO J. 3:1581-85 y documento EPA 137280, todos los cuales incorporan en el presente documento por referencia), y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos. En un huésped de levadura, promotores útiles pueden ser de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (eno-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (gal1), alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) y 3-fosfoglicerato cinasa de S. cerevisiae. Otros promotores útiles para células huésped de levadura se describen por Romanos y col., 1992, Yeast 8:423-488, incorporado en el presente documento por referencia. Pueden usarse promotores asociados a la producción de quitinasa en hongos. Véanse, por ejemplo, Blaiseau y Lafay, 1992, Gene 120243-248 (hongo filamentoso Aphanocladium album); Limon y col., 1995, Curr. Genet, 28:478-83 (Trichoderma harzianum), ambos de los cuales se incorporan en el presente documento por referencia.

Promotores conocidos por controlar la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus y que pueden usarse en algunas realizaciones de la invención incluyen promotor SV40, promotor lac o trp de E. coli, promotor PL del fago lambda, promotor tac, promotor T7, y similares. En células huésped bacterianas, promotores adecuados incluyen los promotores obtenidos del operón lac de E. coli, gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyl), gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gen de alfa-amilasa de Bacillus amiloliquefaciens (amyQ), genes xy/A y xylB de Bacillus subtilis y gen de -lactamasa procariota.

Puede usarse cualquier otra secuencia promotora que accione la expresión en una célula huésped adecuada. Secuencias promotoras adecuadas pueden identificarse usando procedimientos muy conocidos. En un enfoque, una secuencia promotora putativa se liga en 5' a una secuencia que codifica una proteína indicadora, la construcción se transfecta en la célula huésped (por ejemplo, una célula C1) y se mide el nivel de expresión del indicador. La expresión del indicador puede determinarse midiendo, por ejemplo, niveles de ARNm de la secuencia indicadora, una actividad enzimática de la proteína indicadora, o la cantidad de proteína indicadora producida. Por ejemplo, la actividad promotora puede determinarse usando la proteína verde fluorescente como secuencia codificante (Henriksen y col., 1999, Microbiology 145:729-34, incorporada en el presente documento por referencia) o un gen indicador lacZ (Punt y col., 1997, Gene, 197:189-93, incorporado en el presente documento por referencia). Los promotores funcionales pueden derivarse de secuencias promotoras que se producen naturalmente por procedimientos de evolución dirigida. Véase, por ejemplo Wright y col., 2005, Human Gene Therapy, 16:881-892, incorporado en el presente documento por referencia.

Un vector de expresión contiene opcionalmente un sitio de unión al ribosoma para la iniciación de la traducción, y un terminador de la transcripción, tal como Pinll. El vector también incluye opcionalmente secuencias apropiadas para amplificar la expresión, por ejemplo, un potenciador.

Además, los vectores de expresión de la presente invención contienen opcionalmente uno o más genes marcadores de selección para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas. Genes marcadores adecuados incluyen aquellos que codifican resistencia antimicrobiana tales como resistencia a ampicilina (ampR), kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Otros ejemplos incluyen el antimicrobiano estreptomicina

o espectinomicina (por ejemplo, el gen aada), el gen estreptomicina fosfotransferasa (spt) que codifica la resistencia a estreptomicina, el gen neomicina fosfotransferasa (nptII) que codifica resistencia a kanamicina o geneticina, el gen higromicina fosfotransferasa (hpt) que codifica resistencia de higromicina. Genes marcadores de selección adicionales incluyen resistencia a dihidrofolato reductasa o neomicina para cultivo celular eucariota, y resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

Síntesis y manipulación de polinucleótidos de f-glucosidasa

Los polinucleótidos que codifican -glucosidasa pueden prepararse usando procedimientos que son muy conocidos en la técnica. Normalmente, los oligonucleótidos de hasta aproximadamente 40 bases se sintetizan individualmente, luego se unen (por ejemplo, por procedimientos de ligación enzimática o química, o procedimientos mediados por polimerasa) para formar esencialmente cualquier secuencia continua deseada. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención pueden prepararse por síntesis química usando, por ejemplo, el procedimiento de fosforamidito clásico descrito por Beaucage y col., 1981, Tetrahedron Letters, 22:1859-69, o el procedimiento descrito por Matthes y col., 1984, EMBO J. 3:801-05, ambos de los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Estos procedimientos se ponen normalmente en práctica en procedimientos sintéticos automatizados. Según el procedimiento de fosforamidito, los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, se purifican, se hibridan, se ligan y se clonan en vectores apropiados.

Además, el cliente puede pedir esencialmente cualquier ácido nucleico de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales tales como The Midland Certified Reagent Company (Midland, TX), The Great American Gene Company (Ramona, CA), ExpressGen Inc. (Chicago, IL), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA), y muchos otras.

Los polinucleótidos también pueden sintetizarse por técnicas muy conocidas como se describen en la bibliografía técnica. Véase, por ejemplo, Carruthers y col., 1982, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 47:411-18 y Adams y col., 1983, J. Am. Chem. Soc. 105:661, ambos de los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Los fragmentos de ADN bicatenarios pueden entonces obtenerse tanto sintetizando la hebra complementaria como hibridando las hebras juntas bajo condiciones apropiadas, o añadiendo la hebra complementaria usando ADN polimerasa con una secuencia de cebadores apropiada.

Textos generales que describen técnicas biológicas moleculares que son útiles en el presente documento, que incluyen el uso de vectores, promotores, protocolos suficientes para dirigir a los expertos mediante los procedimientos de amplificación in vitro, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR), y muchos otros procedimientos relevantes, incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2ª ed.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 (“Sambrook”) y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel y col., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementados hasta 2009) (“Ausubel”), todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Se hace referencia a Berger, Sambrook y Ausubel, además de a Mullis y col., (1987) patente de EE.UU. nº 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis y col., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1 de octubre de 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3, 81-94; (Kwoh y col., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173; Guatelli y col., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell y col., (1989) J. Clin. Chem 35, 1826; Landegren y col., (1988) Science 241, 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8, 291-294; Wu y Wallace, (1989) Gene 4, 560; Barringer y col., (1990) Gene 89, 117, y Sooknanan y Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564, todos los cuales se incorporan en el presente document por referencia. Los procedimientos para la clonación in vitro de ácidos nucleicos amplificados se describen en Wallace y col., patente de EE.UU. nº 5.426.039, que se incorpora en el presente documento por referencia.

Huéspedes de expresión

La presente invención también proporciona células huésped manipuladas (recombinantes) que se transforman con un vector de expresión o construcción de ADN que codifica -glucosidasa. Opcionalmente, la expresión de glucosidasa en la célula está bajo el control de un promotor heterólogo. Las células huésped de la invención pueden usarse para producir polipéptidos de -glucosidasa. Así, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende cualquier polinucleótido de -glucosidasa de la presente invención que se describe anteriormente en este documento. Como se usa en el presente documento, una célula huésped genéticamente modificada o recombinante incluye la progenie de dicha célula huésped que comprende un polinucleótido de -glucosidasa que codifica un polipéptido recombinante de la invención. Frecuentemente, la célula huésped genéticamente modificada o recombinante es un microorganismo. En algunas realizaciones, la célula huésped genéticamente modificada o recombinante es una procariota. En algunas realizaciones, la célula huésped genéticamente modificada o recombinante es una célula eucariota. Generalmente, la célula huésped eucariota es una célula no humana. Células huésped eucariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células fúngicas, células de alga, células de insecto y células vegetales. En algunos casos, las células huésped pueden modificarse para aumentar la expresión de proteínas, secreción o estabilidad, o para conferir otras características deseadas. Las células (por ejemplo, hongos) que se han mutado o seleccionado para tener actividad de baja proteasa son particularmente útiles para la expresión. Por ejemplo, pueden usarse cepas deficientes en proteasa de C. lucknowense (por ejemplo, en las que el sitio de proteasa alcalina se ha delecionado o alterado). En algunas realizaciones, las células huésped, por ejemplo, hongos, pueden modificarse para expresar una celulasa recombinante.

Células huésped fúngicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, ascomicotas, basidiomicotas, deuteromicotas, zigomicotas y hongos imperfectos. En algunas realizaciones, las células huésped fúngicas son células de levadura y células fúngicas filamentosas. Las células huésped fúngicas filamentosas de la presente invención incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión eumicotas y oomicotas (véase, por ejemplo, Hawksworth y col., en Ainsworth y Bisby's Dictionary of The Fungi, 8ª edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU, que se incorpora en el presente documento por referencia). Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo con una pared celular compuesta por quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos. Las células huésped fúngicas filamentosas de la presente invención son morfológicamente distintas de levadura.

En algunas realizaciones, la célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de una especie de, pero no se limita a, Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothia, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Trametes, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella, o teleomorfos, o anamorfos, y sinónimos o equivalentes taxonómicos de los mismos.

En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Aspergillus, Ceriporiopsis, especie Chrysosporium, especie Corynascus, especie Fusarium, especie Humicola, especie Neurospora, especie Penicillium, especie Tolypocladium, especie Tramates o especie Trichoderma.

En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Chrysosporium, por ejemplo, C. lucknowense, C. keratinophilum, C. tropicum, C. merdarium, C. inops, C. pannicola y C. zonatum.

En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Trichoderma, por ejemplo, T. longibrachiatum, T. viride (por ejemplo, ATCC 32098 y 32086), o T. reesei, un anamorfo de Hypocrea jecorina (NRRL 15709, ATTC 13631, 56764, 56765, 56466, 56767 y RL-P37 y derivados de los mismos - véase Sheir-Neiss y col., 1984, Appl. Microbiol. Biotechnology, 20:46-53, que se incorpora en el presente document por referencia), T. koningii y T. harzianum. Además, el término “Trichoderma” se refiere a cualquier cepa fúngica que se clasificó previamente como Trichoderma o se clasifica actualmente como Trichoderma.

En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Aspergillus, por ejemplo, A. awamori, A. fumigatus, A. japonicus, A. nidulans, A. niger, A. aculeatus, A. foetidus, A. oryzae, A. sojae y

A. kawachi (se hace referencia a Kelly y Hynes, 1985, EMBO J. 4,475479; NRRL 3112, ATCC 11490, 22342, 44733, y 14331;Yelton y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1470-1474; Tilburn y col., 1982, Gene 26,205-221; y Johnston y col., 1985, EMBO J. 4, 1307-1311, todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia).

En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Fusarium, por ejemplo, F. bactridioides, F. cerealis, F. crookwellense, F. culmorum, F. graminearum, F. graminum. F. oxysporum,

F. roseum y F. venenatum.

En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Myceliophthora , por ejemplo, M. thermophila.

En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Neurospora, por ejemplo, N. crassa. Se hace referencia a Case, M.E. y col., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 5259-5263; documento USP 4.486.553; y Kinsey, J.A. y J.A. Rambosek, 1984, Molecular and Cellular Biology 4, 117-122, todas las cuales se incorporan en el presente documento por referencia. En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Humicola, por ejemplo, H. insolens, H. grisea y H. lanuginosa. En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Mucor, por ejemplo, M. miehei y M. circinelloides. En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Rhizopus, por ejemplo, R. oryzae y R. niveus. En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Penicillium, por ejemplo, P. purpurogenum , P. chrysogenum y P. verruculosum. En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Thielavia, por ejemplo, T. terrestris. En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Tolypocladium, por ejemplo, T. inflatum y T. geodes. En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped fúngica filamentosa es de la especie Trametes, por ejemplo, T. villosa y T. versicolor.

En la presente invención, una célula huésped de levadura puede ser una célula de una especie de, pero no se limita a, Candida, Hansenula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces y Yarrowia. En algunas realizaciones de la invención, la célula de levadura es Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia kodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia quercuum, Pichia pijperi, Pichia stipitis, Pichia methanolica, Pichia angusta, Kluyveromyces lactis, Candida albicans y Yarrowia lipolytica.

En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped es un alga tal como, Chlamydomonas (por ejemplo, C. reinhardtii) y Phormidium (P. sp. ATCC29409).

En otras realizaciones, la célula huésped es una célula procariota. Células procariotas adecuadas incluyen células bacterianas Gram-positivas, Gram-negativas y Gram-variables. La célula huésped puede ser una especie de, pero no se limita a, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Acinetobacter, Acidothermus, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Brevibacterium, Butyrivibrio, Buchnera, Campestris, Camplyobacter, Clostridium, Corynebacterium, Chromatium, Coprococcus, Escherichia, Enterococcus, Enterobacter, Erwinia, Fusobacterium, Faecalibacterium, Francisella, Flavobacterium, Geobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Ilyobacter, Micrococcus, Microbacterium, Mesorhizobium, Methylobacterium, Mycobacterium, Neisseria, Pantoea, Pseudomonas, Prochlorococcus, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Roseburia, Rhodospirillum, Rhodococcus, Scenedesmus, Streptomyces, Streptococcus, Synecoccus, Saccharomonospora, Staphylococcus, Serratia, Salmonella, Shigella, Thermoanaerobacterium, Tropheryma, Francisella, Temecula, Thermosynechococcus, Thermococcus, Ureaplasma, Xanthomonas, Xylella, Yersinia y Zymomonas.

En algunas realizaciones, la célula huésped es una especie de Agrobacterium, Acinetobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Buchnera, Geobacillus, Campylobacter, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Enterococcus, Erwinia, Flavobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Pantoea, Pseudomonas, Staphylococcus, Salmonella, Streptococcus, Streptomyces y Zymomonas.

En todavía otras realizaciones, la cepa huésped bacteriana es no patogénica para seres humanos. En algunas realizaciones, la cepa huésped bacteriana es una cepa industrial. Se conocen numerosas cepas industriales bacterianas y son adecuadas en la presente invención.

En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped bacteriana es de la especie Agrobacterium, por ejemplo,

A. radiobacter, A. rhizogenes y A. rubi. En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped bacteriana es de la especie Arthrobacter, por ejemplo, A. aurescens, A. citreus, A. globformis, A. hydrocarboglutamicus, A. mysorens,

A. nicotianae, A. paraffineus, A. protophonniae, A. roseoparqffinus, A. sulfureus y A. ureafaciens. En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped bacteriana es de la especie Bacillus, por ejemplo, B. thuringiensis, B. anthracis, B. megaterium, B. subtilis, B. lentus, B. circulans, B. pumilus, B. lautus, B. coagulans, B. brevis, B. firmus,

B. alkaophius, B. licheniformis, B. clausii, B. stearothermophilus, B. halodurans y B. amyloliquefaciens. En realizaciones particulares, la célula huésped será una cepa de Bacillus industrial que incluye, pero no se limita a, B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis, B. megaterium, B. clausii, B. stearothermophilus y B. amyloliquefaciens. Algunas realizaciones de una célula huésped de Bacillus incluyen B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. stearothermophilus y B. amyloliquefaciens. En algunas realizaciones, la célula huésped bacteriana es de la especie Clostridium, por ejemplo, C. acetobutylicum, C. tetani E88, C. lituseburense, C. saccharobutylicum, C. perfringens, C. thermocellum y C. beijerinckii. En algunas realizacones, la célula huésped bacteriana es de la especie Corynebacterium, por ejemplo, C. glutamicum y C. acetoacidophilum. En algunas realizacones, la célula huésped bacteriana es de la especie Escherichia, por ejemplo, E. coli. En algunas realizaciones, la célula huésped bacteriana es de la especie Erwinia, por ejemplo, E. uredovora, E. carotovora, E. ananas, E. herbicola, E. punctata y E. terreus. En algunas realizaciones, la célula huésped bacteriana es de la especie Pantoea, por ejemplo, P. citrea y P. agglomerans. En algunas realizaciones, la célula huésped bacteriana es de la especie Pseudomonas, por ejemplo,

P. putida, P. fluorescens, P. aeruginosa, P. mevalonii y P. sp. D-0I 10. En algunas realizaciones, la célula huésped bacteriana es de la especie Streptococcus, por ejemplo, S. equisimiles, S. pyogenes y S. uberis. En algunas realizaciones, la célula huésped bacteriana es de la especie Streptomyces, por ejemplo, S. ambofaciens, S. achromogenes, S. avermitilis, S. coelicolor, S. aureofaciens, S. aureus, S. fungicidicus, S. griseus y S. lividans. En algunas realizaciones, la célula huésped bacteriana es de la especie Zymomonas, por ejemplo, Z. mobilis y Z. lipolytica.

Cepas que pueden usarse en la práctica de la invención que incluyen tanto cepas procariotas como eucariotas están fácilmente accesibles al público de varias colecciones de cultivos tales como Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Colección de Cultivos de Patente del Servicio de Investigación Agrícola, Centro de Investigación Regional Norte (NRRL).

Las células huésped pueden modificarse genéticamente para tener características que mejoran la secreción de proteínas, estabilidad de proteínas u otras propiedades deseables para la expresión y/o secreción de una proteína. Por ejemplo, la inactivación de la función de Alp1 produce una célula que es deficiente en proteasa. La inactivación de la función de pyr5 produce una célula con un fenotipo deficiente en pirimidina. En realizaciones particulares, las células huésped se modifican para delecionar secuencias codificantes de proteína celulasa endógena o de otro modo eliminar la expresión de una o más celulasas endógenas. En una realización, la expresión de una o más celulasas endógenas se inhibe para aumentar la producción de celulasas de interés. La modificación genética puede lograrse por técnicas de ingeniería genética o usando técnicas microbiológicas clásicas tales como mutagénesis química o UV y posterior selección. Puede usarse una combinación de modificación recombinante y técnicas de selección clásicas para producir el organismo de interés. Usando tecnología recombinante, las moléculas de ácidos nucleicos pueden introducirse, delecionarse, inhibirse o modificarse, de un modo que se produce elevado rendimiento de -glucosidasa dentro del organismo o en el cultivo. Por ejemplo, la inactivación de la función de Alp1 produce una célula que es deficiente en proteasa. La inactivación de la función de pyr5 produce una célula con un fenotipo deficiente en pirimidina. En un enfoque de ingeniería genética, la recombinación homóloga puede usarse para inducir modificaciones de genes elegidas como diana eligiendo específicamente como diana un gen in vivo para suprimir la expresión de la proteína codificada. En un enfoque alternativo puede usarse ARNip, antisentido o tecnología de ribozimas para inhibir la expresión génica

Transformación y cultivo

La introducción de un vector o construcción de ADN en una célula huésped puede efectuarse por transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, electroporación u otras técnicas comunes (véase Davis y col., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, que se incorpora en el presente documento por referencia).

Las células huésped manipuladas pueden cultivarse en medios nutritivos convencionales modificados según convenga para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar el polinucleótido de -glucosidasa. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquellas previamente usadas con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para aquellos expertos en la materia. Como se observa, muchas referencias están disponibles para el cultivo y la producción de muchas células, que incluyen células de origen bacteriano, de planta, animal (especialmente de mamífero) y arqueobacteriano. Véanse por ejemplo, Sambrook, Ausubel y Berger (todos arriba), además de Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, Nueva York, y las referencias citadas en su interior; Doyle y Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques, John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, cuarta edición W.H. Freeman y Company; y Ricciardelli y col., (1989) In vitro Cell Dev. Biol. 25:10161024, todas las cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Para cultivo y regeneración de células de planta, Payne y col. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.; Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York); Jones, ed. (1984) Plant Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey y Plant Molecular Biology (1993) R.R.D.Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6, todas las cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Medios de cultivo celular en general se exponen en Atlas y Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL, que se incorpora en el presente documento por referencia. Información adicional para el cultivo celular se encuentra en bibliografía comercial disponible tal como the Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) de Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, Mo.) (“Sigma-LSRCCC”) y, por ejemplo, the Plant Culture Catalogue y suplemento (1997), también de Sigma-Aldrich, Inc (St. Louis, Mo.) (“Sigma-PCCS”), todas las cuales se incorporan en el presente documento por referencia.

En algunas realizaciones, las células que expresan los polipéptidos de -glucosidasa de la invención se cultivan bajo condiciones de fermentación discontinuas o continuas. La fermentación discontinua clásica es un sistema cerrado en el que las composiciones del medio se ponen al principio de la fermentación y no se someten a alternancias artificiales durante la fermentación. Una variación del sistema discontinuo es una fermentación por lotes alimentados que también encuentra uso en la presente invención. En esta variación, el sustrato se añade en incrementos a medida que progresa la fermentación. Los sistemas por lotes alimentados son útiles cuando es probable la represión de catabolitos para inhibir el metabolismo de las células y si se desea tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. Las fermentaciones discontinuas y por lotes alimentados son comunes y muy conocidas en la técnica. La fermentación continua es un sistema abierto en el que un medio de fermentación definido se añade continuamente a un biorreactor y una cantidad igual de medio acondicionado se elimina simultáneamente para el procesamiento. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una alta densidad constante en la que las células están principalmente en crecimiento de fase logarítmica. Los sistemas de fermentación continuos luchan por mantener condiciones de crecimiento en estado estacionario. Los procedimientos de modulación de nutrientes y factores de crecimiento para los procedimientos de fermentación continua, además de técnicas para maximizar la velocidad de formación de productos, son muy conocidos en la técnica de la microbiología industrial.

También pueden emplearse sistemas de transcripción/traducción sin células para producir polipéptidos de glucosidasa usando los polinucleótidos de la presente invención. Varios de tales sistemas están comercialmente disponibles. Una guía general para los protocolos de transcripción y traducción in vitro se encuentra en Tymms (1995) In vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology, volumen 37, Garland Publishing, NY, que se incorpora en el presente documento por referencia.

V. PRODUCCIÓN Y RECUPERACIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE -GLUCOSIDASA

La presente invención también se refiere a un procedimiento de preparación de un polipéptido que tiene actividad de

-

glucosidasa, comprendiendo el procedimiento proporcionar una célula huésped transformada con uno cualquiera de los polinucleótidos de -glucosidasa descritos de la presente invención; cultivar la célula huésped transformada en un medio de cultivo en condiciones en las que la célula huésped exprese el polipéptido de -glucosidasa codificado; y opcionalmente recuperar o aislar el polipéptido de -glucosidasa expresado, o recuperar o aislar el medio de cultivo que contiene el polipéptido de -glucosidasa expresado. El procedimiento proporciona además opcionalmente lisar las células huésped transformadas después de expresar el polipéptido de -glucosidasa codificado y opcionalmente recuperar o aislar el polipéptido de -glucosidasa expresado del lisado celular. La presente invención proporciona además un procedimiento de preparación de un polipéptido de -glucosidasa, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula huésped transformada con un polinucleótido de glucosidasa en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido de -glucosidasa y recuperar el polipéptido de -glucosidasa.

Normalmente, la recuperación o aislamiento del polipéptido de -glucosidasa es del medio de cultivo de células huésped, la célula huésped o ambos, usando técnicas de recuperación de proteínas que son muy conocidas en la técnica, que incluyen aquellas descritas en el presente documento. Las células se recogen normalmente por centrifugación, se alteran por medios físicos o químicos, y el extracto en bruto resultante puede retenerse para la posterior purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden alterarse por cualquier procedimiento conveniente, que incluye ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica o uso de agentes de lisado celular, u otros procedimientos, que son muy conocidos para aquellos expertos en la materia.

El polipéptido resultante puede recuperarse/aislarse y purificarse opcionalmente por distintos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede aislarse del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, interacción hidrófoba, cromatoenfoque y exclusión por tamaño), o precipitación. La etapas de replegamiento de proteínas pueden usarse, según se desee, en completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) puede emplearse en las etapas de purificación finales. La purificación de BGL1 se describe en Parry y col., 2001, Biochem. J. 353:117, y Hong y col., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol. 73:1331, ambos incorporados en el presente documento por referencia. Además de las referencias anotadas anteriormente, una variedad de procedimientos de purificación son muy conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, aquellos expuestos en Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag y col. (1996) Protein Methods, 2ª edición, Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ; Harris y Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris y Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3ª edición, Springer Verlag, NY; Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, segunda edición, Wiley-VCH, NY; y Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM, Humana Press, NJ, todas las cuales se incorporan en el presente documento por referencia.

Pueden usarse procedimientos inmunológicos para purificar polipéptidos de -glucosidasa. En un enfoque, el anticuerpo producido contra los polipéptidos de -glucosidasa (por ejemplo, contra un polipéptido que comprende SEC ID Nº: 2 o un fragmento inmunogénico del mismo) usando procedimientos convencionales se inmoviliza sobre perlas, se mezcla con medios de cultivo celular en condiciones en las que se una la -glucosidasa y se precipita. En un enfoque relacionado se usa inmunocromatografía.

Como se observa, en algunas realizaciones la -glucosidasa se expresa como una proteína de fusión que incluye una porción de no enzima. En algunas realizaciones, la secuencia de -glucosidasa está fusionada con un dominio que facilita la purificación. Como se usa en el presente documento, el término “dominio que facilita la purificación” se refiere a un dominio que media en la purificación del polipéptido con el que está fusionado. Dominios de purificación adecuados incluyen péptidos quelantes metálicos, módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, una secuencia que se une a glutatión (por ejemplo, GST), una marca de hemaglutinina (HA) (correspondiente a un epítope derivado de la proteína de hemaglutinina de la gripe; Wilson y col., 1984, Cell 37:767), secuencias de proteínas de unión a maltosa, el epítope FLAG utilizado en el sistema de purificación por extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle, WA), y similares. La inclusión de una secuencia de ligador de polipéptido escindible por proteasa entre el dominio de purificación y el polipéptido HHDH es útil para facilitar la purificación. Un vector de expresión contemplado para su uso en las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento proporciona la expresión de una proteína de fusión que comprende un polipéptido de la invención fusionado con una región de polihistidina separada por un sitio de escisión de enterocinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación sobre IMIAC (cromatografía de afinidad por ión metálico inmovilizado, como se describe en Porath y col., 1992, Protein Expression and Purification 3:263-281) mientras que el sitio de escisión de enterocinasa proporciona un medio para separar el polipéptido HHDH de la proteína de fusión. También pueden usarse vectores pGEX (Promega; Madison, Wis.) para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente de células lisadas por adsorción a perlas de ligando-agarosa (por ejemplo, glutatión-agarosa en el caso de fusiones GST), seguido de elución en presencia de ligando libre.

VI. PROCEDIMIENTOS DE USO DE POLIPÉPTIDOS DE -GLUCOSIDASA Y CÉLULAS QUE EXPRESAN POLIPÉPTIDOS DE -GLUCOSIDASA

Como se ha descrito arriba, los polipéptidos de -glucosidasa de la presente invención pueden usarse para catalizar la hidrólisis de un dímero de azúcar con la liberación del monómero de azúcar correspondiente, por ejemplo, la conversión de celobiosa con la liberación de glucosa. Así, la presente invención proporciona un procedimiento para producir glucosa, (a) proporcionando una celobiosa; y (b) poniendo en contacto la celobiosa con un polipéptido de glucosidasa de la invención en condiciones suficientes para formar una mezcla de reacción para convertir la celobiosa en glucosa. El polipéptido de -glucosidasa puede utilizarse en tales procedimientos en o bien forma aislada o bien como parte de una composición, tal como cualquiera de aquellas descritas en el presente documento. El polipéptido de -glucosidasa también puede proporcionarse en medios de cultivo de células o en un lisado celular. Por ejemplo, después de producir el polipéptido de -glucosidasa cultivando una célula huésped transformada con un polinucleótido de -glucosidasa o vector de la presente invención, la -glucosidasa no necesita aislarse del medio de cultivo (es decir, si la -glucosidasa es secretada en el medio de cultivo) o lisado celular (es decir, si la glucosidasa no es secretada en el medio de cultivo) o se usa en forma purificada para ser útil en otros procedimientos de uso del polipéptido de -glucosidasa. Cualquier composición, medio de cultivo celular o lisado celular que contenga un polipéptido de -glucosidasa de la presente invención puede ser adecuado para uso en procedimientos que utilicen una -glucosidasa. Por tanto, la presente invención proporciona además un procedimiento para producir glucosa: (a) proporcionando una celobiosa; y (b) poniendo en contacto la celobiosa con un medio de cultivo o lisado celular o composición que comprende un polipéptido de -glucosidasa de la presente invención en condiciones suficientes para formar una mezcla de reacción para convertir la celobiosa en glucosa.

La presente invención proporciona además composiciones que son útiles para la conversión enzimática de celobiosa en glucosa. Por ejemplo, uno o más polipéptidos de -glucosidasa de la presente invención pueden combinarse con otra enzima y/o un agente que altera las propiedades de manipulación del material a granel o procesabilidad adicional de la(s) -glucosidasa(s) (por ejemplo, un agente de ayuda del flujo, agua, tampón, un tensioactivo y similares) o que mejora la eficiencia de la conversión de celobiosa en glucosa, como se describe en más detalle en el presente documento más adelante. La otra enzima puede ser una -glucosidasa diferente u otra enzima celulasa.

Mezclas de enzimas

En otro aspecto, la invención proporciona una mezcla de enzimas que comprende un polipéptido de variante de Bgl1 C1 como se describe en el presente documento. La mezcla de enzimas puede estar libre de células, o en realizaciones alternativas, puede no separarse de células huésped que secretan un componente de mezcla de enzimas. Una mezcla de enzimas libre de células normalmente comprende enzimas que se han separado de cualquier célula. Las mezclas de enzimas libres de células pueden prepararse por cualquiera de una variedad de metodologías que se conocen en la técnica, tales como metodologías de filtración o centrifugación. En ciertas realizaciones, la mezcla de enzimas puede estar, por ejemplo, parcialmente libre de células, sustancialmente libre de células o completamente libre de células.

La variante de Bgl1 C1 y cualquier enzima adicional presente en la mezcla de enzimas puede secretarse de una única célula fúngica genéticamente modificada o por diferentes microbios en fermentaciones combinadas o separadas. Similarmente, la variante de Bgl1 C1 y cualquier enzima adicional presente en la mezcla de enzimas puede expresarse individualmente o en sub-grupos de las diferentes cepas de diferentes organismos y combinarse las enzimas in vitro para preparar la mezcla de enzimas. También se contempla que la variante de Bgl1 C1 y cualquier enzima adicional en la mezcla de enzimas pueda expresarse individualmente o en sub-grupos de diferentes cepas de un único organismo, y combinarse las enzimas para preparar la mezcla de enzimas. En algunas realizaciones, todas las enzimas se expresan a partir de un único organismo huésped, tal como la célula fúngica genéticamente modificada.

En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende otros tipos de celulasas, seleccionadas de celulasa CBH, EG y BG. En algunas realizaciones, la celobiohidrolasa es celobiohidrolasa II de T. reesei. En algunas realizaciones, la endoglucanasa comprende un dominio catalítico derivado del dominio catalítico de una endoglucanasa de Streptomyces avermitilis. Véase la solicitud pendiente de tramitación nº 12/751.985 incorporada en el presente documento por referencia. En algunas realizaciones, la al menos un celulasa es Acidothermus cellulolyticus, Termobifida fusca, Humicola grisea o Chrysosporium sp. Las enzimas celulasas de la mezcla de celulasa funcionan juntas produciendo la descristalización e hidrólisis de la celulosa de un sustrato de biomasa para dar azúcares solubles tales como, pero no se limitan a, glucosa (véanse Brigham y col., 1995, en Handbook on Bioethanol (C. Wyman ed.) pág. 119-141, Taylor y Francis, Washington DC, que se incorpora en el presente documento por referencia).

Se conocen mezclas de celulasas para la eficiente hidrólisis enzimática de celulosa (véase, por ejemplo, Viikari y col., 2007, “Thermostable enzymes in lignocellulose hydrolysis” Adv Biochem Eng Biotechnol 108:121-45, y publicaciones de patente de EE.UU. US 2009/0061484; US 2008/0057541; y US 2009/0209009 a logen Energy Corp.), cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia para todos los fines. En algunas realizaciones, las mezclas de enzimas que se producen naturalmente o recombinantes purificadas se combinan con materia prima celulósica o un producto de la hidrólisis de celulosa. Alternativamente o además, una o más poblaciones de células, cada una de las cuales produce una o más celulasas que se producen naturalmente o recombinantes, pueden combinarse con materia prima celulósica o un producto de la hidrólisis de celulosa.

Un polipéptido de -glucosidasa de variante de la invención también puede estar presente en mezclas con enzimas distintas de celulasas que degradan celulosa, hemicelulosa, pectina y/o lignocelulosa.

Una “hemicelulasa”, como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que puede catalizar la hidrólisis de hemicelulosa en pequeños polisacáridos tales como oligosacáridos, o sacáridos monoméricos. Las hemicelulosas incluyen xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Las hemicelulasas incluyen, por ejemplo, las siguientes: endoxilanasas, -xilosidasas, a-L-arabinofuranosidasas, a-D-glucuronidasas, feruloil esterasas, cumarolil esterasas, a-galactosidasas, -galactosidasas, -mananasas y -manosidasas. Por tanto, una mezcla de enzimas puede comprender una variante de -glucosidasa de la invención y una o más hemicelulasas.

Una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4--D-xilosídicos en xilanos. Esta enzima también puede denominarse endo-1,4--xilanasa o 1,4--D-xilano xilanohidrolasa. Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilano endoxilanasa, una enzima que puede hidrolizar enlaces 1,4-xilosídicos en glucuronoarabinoxilanos.

Una -xilosidasa (EC 3.2.1.37) cataliza la hidrólisis de 1,4--D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los extremos no reductores. Esta enzima también puede denominarse xilano 1,4--xilosidasa, 1,4--D-xilano xilohidrolasa, exo-1,4--xilosidasa o xilobiasa.

Una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) cataliza la hidrólisis de residuos de alfa-L-arabinofuranósido no reductores terminales en alfa-L-arabinósidos. La enzima actúa sobre alfa-L-arabinofuranósidos, alfa-L-arabinanos que contienen enlaces (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos. La alfa-L-arabinofuranosidasa también se conoce como arabinosidasa, alfa-arabinosidasa, alfa-L-arabinosidasa, alfa-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa, polisacárido alfa-L-arabinofuranosidasa, alfa-L-arabinofuranósido hidrolasa, L-arabinosidasa y alfa-L-arabinanasa.

Una alfa-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) cataliza la hidrólisis de un alfa-D-glucuronósido en D-glucuronato y un alcohol.

Una acetilxilanesterasa (EC 3.1.1.72) cataliza la hidrólisis de grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato de alfa-naftilo y acetato de p-nitrofenilo.

Una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) tiene actividad de 4-hidroxi-3-metoxicinamoil-azúcar hidrolasa (EC 3.1.1.73) que cataliza la hidrólisis del grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamoílo (feruloílo) de un azúcar esterificado, que es normalmente arabinosa en sustratos “naturales”, para producir ferulato (4-hidroxi-3-metoxicinamato). La feruloil esterasa también se conoce como ácido ferúlico esterasa, hidroxicinamoil esterasa, FAE-III, cinamoil éster hidrolasa, FAEA, cinAE, FAE-I o FAE-II.

Una cumaroil esterasa (EC 3.1.1.73) cataliza una reacción de la forma: cumaroil-sacárido + H(2)O = cumarato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Esta enzima también puede denominarse trans-4-cumaroil esterasa, trans-p-cumaroil esterasa, p-cumaroil esterasa o ácido p-cumárico esterasa. La enzima también se encuentra dentro de EC 3.1.1.73, así que también puede denominarse una feruloil esterasa.

Una a-galactosidasa (EC 3.2.1.22) cataliza la hidrólisis de residuos de a-D-galactosa no reductores terminales en aD-galactósidos, que incluyen oligosacáridos de galactosa, galactomananos, galactanos y arabinogalactanos. Esta enzima también puede denominarse melibiasa.

Una -galactosidasa (EC 3.2.1.23) cataliza la hidrólisis de residuos de -D-galactosa no reductores terminales en D-galactósidos. Un polipéptido tal también puede ser capaz de hidrolizar a-L-arabinósidos. Esta enzima también puede denominarse exo-(1->4)--D-galactanasa o lactasa.

Una -mananasa (EC 3.2.1.78) cataliza la hidrólisis al azar de enlaces 1,4--D-manosídicos en mananos, galactomananos y glucomananos. Esta enzima también puede denominarse manano endo-1,4--manosidasa o endo-1,4-mananasa.

Una -manosidasa (EC 3.2.1.25) cataliza la hidrólisis de residuos de -D-manosa no reductores terminales en -Dmanósidos. Esta enzima también puede denominarse mananasa o manasa.

También pueden incluirse una o más enzimas que degradan pectina en una mezcla de enzimas que comprende una variante de -glucosidasa de la invención. Una pectinasa cataliza la hidrólisis de pectina en unidades más pequeñas tales como oligosacárido o sacáridos monoméricos. Una mezcla de enzimas puede comprender cualquier pectinasa, por ejemplo, una endo- poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una exo-poligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa o una xilogalacturonasa.

Una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) cataliza la hidrólisis al azar de enlaces 1,4-a-D-galactosidurónicos en pectato y otros galacturonanos. Esta enzima también puede denominarse poligalacturonasa pectina depolimerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectina hidrolasa, pectina poligalacturonasa, poli-a-1,4-galacturónido glicanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli(1,4-a-D-galacturónido) glicanohidrolasa.

Una pectina metil esterasa (EC 3.1.1.11 ) cataliza la reacción: pectina + n H2O = n metanol + pectato. La enzima también puede conocerse como pectina esterasa, pectina demetoxilasa, pectina metoxilasa, pectina metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectina pectilhidrolasa.

Una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4--D-galactosídicos en arabinogalactanos. La enzima también puede conocerse como arabinogalactano endo-1,4--galactosidasa, endo1,4--galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactano 4--D-galactanohidrolasa.

Una pectina acetil esterasa cataliza la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de los residuos GalUA de pectina.

Una endo-pectina liasa (EC 4.2.2.10) cataliza la escisión eliminativa de (1 -4)-a-D-galacturonano metil éster para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-6-O-metil-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también puede conocerse como pectina liasa, pectina trans-eliminasa; endo-pectina liasa, transeliminasa polimetilgalacturónica, pectina metiltranseliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o (1 -4)-6-O-metil-a-Dgalacturonano liasa.

Una pectato liasa (EC 4.2.2.2) cataliza la escisión eliminativa de (1 -4)-a-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también puede conocerse como transeliminasa poligalacturónica, ácido péctico transeliminasa, poligalacturonato liasa, endopectina metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, ácido péctico liasa, liasa péctica, ácido a-1,4-D-endopoligalacturónico liasa, PGA liasa, PPasa-N, ácido endo-a-1,4-poligalacturónico liasa, ácido poligalacturónico liasa, pectina trans-eliminasa, ácido poligalacturónico trans-eliminasa o (1 -4)-a-D- galacturonano liasa.

Una alfa ramnosidasa (EC 3.2.1.40) cataliza la hidrólisis de residuos de a-L-ramnosa no reductores terminales en aL-ramnósidos o alternativamente en ramnogalacturonano. Esta enzima también puede conocerse como a-Lramnosidasa T, a-L-ramnosidasa N o a-L-ramnósido ramnohidrolasa.

Una exo-galacturonasa (EC 3.2.1.82) hidroliza ácido péptico del extremo no reductor, que libera digalacturonato. La enzima también puede conocerse como exo-poli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa.

Una exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67) cataliza una reacción del siguiente tipo: (1,4-a-D-galacturónido)n + H2O = (1,4a-D-galacturónido)n-i + D-galacturonato. La enzima también puede conocerse como galacturano 1,4-agalacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli(galacturonato) hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exopoli-D-galacturonasa o poli(1,4-a-D-galacturónido) galacturonohidrolasa.

Una exopoligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) cataliza la escisión eliminativa de 4-(4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosil)D-galacturonato del extremo reductor de pectato, es decir, pectina desesterificada. Esta enzima puede conocerse como pectato disacárido-liasa, pectato exoliasa, ácido exopéctico transeliminasa, exopectato liasa, ácido exopoligalacturónico-trans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o disacárido-liasa del extremo reductor de (1 -4)a-D-galacturonano.

Un ramnogalacturonano hidroliza el enlace entre ácido galactosilurónico y ramnopiranosilo en un modo endo en estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternantes que consisten en el disacárido [ácido (1,2-alfa-Lramnoil-(1,4)-alfa-galactosilurónico].

Una ramnogalacturonano liasa escinde enlaces a-L-Rhap-(1 -4)-a-D-GalpA en un modo endo en ramnogalacturonano por beta-eliminación.

Una ramnogalacturonano acetil esterasa cataliza la desacetilación del esqueleto de ramnosa alternante y residuos de ácido galacturónico en ramnogalacturonano.

Una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa hidroliza ácido galacturónico del extremo no reductor de estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternantes en un modo exo. Esta enzima también puede conocerse como xilogalacturonano hidrolasa.

Una endo-arabinanasa (EC 3.2.1.99) cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,5-a-arabinofuranosídicos en 1,5arabinanos. La enzima también puede conocerse como endo-arabinasa, arabinano endo-1 ,5-a-L-arabinosidasa, endo-1,5-a-L-arabinanasa, endo-a-1,5-arabanasa; endo-arabanasa o 1,5-a-L-arabinano 1,5-a-L-arabinanohidrolasa.

Uno o más enzimas que participan en la degradación de lignina también pueden incluirse en una mezcla de enzimas que comprende una variante de -glucosidasa de la invención. La despolimerización de lignina enzimática puede llevarse a cabo por lignina peroxidasas, manganeso peroxidasas, lacasas y celobiosa deshidrogenasas (CDH), trabajando frecuentemente en sinergia. Estas enzimas extracelulares se denominan frecuentemente enzimas modificadoras de lignina o LME. Tres de estas enzimas comprenden dos peroxidasas que contienen hemo glucosiladas: lignina peroxidasa (LIP); peroxidasa dependiente de Mn (MNP); y, una fenoloxidasa lacasa que contiene cobre (LCC).

Lacasa. Las lacasas son enzimas oxidasas que contienen cobre que se encuentran en muchas plantas, hongos y microorganismos. Las lacasas son enzimáticamente activas en fenoles y moléculas similares y realizan una oxidación de un electrón. Las lacasas pueden ser poliméricas y la forma enzimáticamente activa puede ser un dímero o trímero.

Peroxidasa dependiente de Mn. La actividad enzimática de peroxidasa dependiente de Mn (MnP) depende de Mn2+. Sin quedar ligado a teoría, se ha sugerido que la función principal de esta enzima es oxidar Mn2+ a Mn3+ (Glenn y col. (1986) Arch. Biochem. Biophys. 251:688-696). Posteriormente, los sustratos fenólicos se oxidan por el Mn3+ generado.

Lignina peroxidasa. La lignina peroxidasa es un hemo extracelular que cataliza la despolimerización oxidativa de disoluciones diluidas de lignina polimérica in vitro. Algunos de los sustratos de LiP, más en particular alcohol 3,4dimetoxibencílico (alcohol veratrílico, VA), son compuestos rédox activos que se ha mostrado que actúan de mediadores rédox. El VA es un metabolito secundario producido al mismo tiempo que LiP por cultivos ligninolíticos de P. chrysosporium y, sin quedar ligado a teoría, se ha propuesto que funciona como un mediador rédox fisiológico en la oxidación catalizada por LiP de lignina in vivo (Harvey y col. (1986) FEBS Lett. 195, 242-246).

Una mezcla enzimática que comprende una variante de -glucosidasa de la invención puede comprender además al menos una de las siguientes; una proteasa o una lipasa que participa en la degradación de celulosa.

“Proteasa” incluye enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos (peptidasas), además de enzimas que hidrolizan enlaces entre péptidos y otros restos, tales como azúcares (glicopeptidasas). Muchas proteasas se caracterizan bajo EC 3.4, y son adecuadas para su uso en la invención. Algunos tipos específicos de proteasas incluyen cisteína proteasas que incluyen pepsina, papaína y serina proteasas que incluyen quimotripsinas, carboxipeptidasas y metaloendopeptidasas.

“Lipasa” incluye enzimas que hidrolizan lípidos, ácidos grasos y acilglicéridos, que incluyen fosfoglicéridos, lipoproteínas, diacilgliceroles y similares. En plantas, los lípidos se usan como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua e infección por patógenos. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, además de cutina y suberina.

Una mezcla de enzimas que comprende una variante de -glucosidasa de la invención también puede comprender al menos una expansina o proteína similar a expansina tal como una swolenina (véase Salheimo y col., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211, 2002) o una proteína similar a swolenina.

Las expansinas participan en la relajación de la estructura de la pared celular durante el crecimiento celular de plantas. Se ha propuesto que las expansinas alteran el enlace de hidrógeno entre celulosa y otros polisacáridos de la pared celular sin tener actividad hidrolítica. De esta forma, se cree que permiten el deslizamiento de las fibras de celulosa y el alargamiento de la pared celular. La swolenina, una proteína similar a expansina, contiene un dominio de la familia 1 del módulo de unión a hidrato de carbono (CBD) del extremo N y un dominio similar a expansina del extremo C. Para los fines de la presente invención, una proteína similar a expansina o proteína similar a swolenina puede comprender uno o ambos de tales dominios y/o puede alterar la estructura de paredes celulares (tal como alterar la estructura de celulosa), opcionalmente sin producir cantidades detectables de azúcares reductores.

Una mezcla de enzimas que comprende una variante de -glucosidasa de la invención también puede comprender al menos uno de los siguientes: un producto de polipéptido de una proteína integrante de celulosa, escafoldina o una proteína similar a escafoldina, por ejemplo, CipA o CipC de Clostridium thermocellum o Clostridium cellulolyticum, respectivamente. Las escafoldinas y proteínas integrantes de celulosa son subunidades integrantes multifuncionales que pueden organizar subunidades celulolíticas en un complejo multienzimático. Esto se lleva a cabo por la interacción de dos clases complementarias de dominio, es decir, un dominio de cohesión sobre escafoldina y un dominio de dockerina sobre cada unidad enzimática. La subunidad de escafoldina también lleva un módulo de unión a celulosa que media en la unión del celulosoma a su sustrato. Una escafoldina o proteína integrante de celulosa para los fines de la presente invención puede comprender uno o ambos de tales dominios.

Una mezcla de enzimas que comprende una variante de -glucosidasa de la invención también puede comprender al menos una proteína inducida por celulosa o proteína modulante, por ejemplo, como se codifica por el gen cip1 o cip2 o genes similares de Trichoderma reesei (véase Foreman y col., J. Biol. Chem. 278(34), 31988-31997, 2003).

Una mezcla de enzimas que comprende una variante de -glucosidasa de la invención puede comprender un miembro de cada una de las clases de los polipéptidos descritos anteriormente, varios miembros de una clase de polipéptidos, o cualquier combinación de estas clases de polipéptidos.

Otros componentes de composiciones de f-glucosidasa

Los polipéptidos de -glucosidasa de la presente invención pueden usarse en combinación con otros componentes opcionales tales como un tampón, un tensioactivo y/o un agente de rastreo. Un tampón puede usarse con un polipéptido de -glucosidasa de la presente invención (opcionalmente combinado con otras celulasas, que incluyen otra -glucosidasa) para mantener un pH deseado dentro de la disolución en la que se emplea la -glucosidasa. La concentración exacta de tampón empleada dependerá de varios factores que el experto puede determinar. Tampones adecuados son muy conocidos en la técnica. Un tensioactivo puede usarse adicionalmente en combinación con las celulasas de la presente invención. Tensioactivos adecuados incluyen cualquier tensioactivo compatible con la -glucosidasa y, opcionalmente, con cualquier otra celulasa que se use. Tensioactivos a modo de ejemplo incluyen tensioactivos aniónicos, no iónicos y anfolíticos.

Tensioactivos aniónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, alquilbencenosulfonatos lineales o ramificados; étersulfatos de alquilo o alquenilo que tienen grupos alquilo o grupos alquenilo lineales o ramificados; sulfatos de alquilo o alquenilo; olefinsulfonatos; alcanosulfonatos, y similares. Contraiones adecuados para tensioactivos aniónicos incluyen, por ejemplo, iones de metales alcalinos tales como sodio y potasio; iones de metales alcalinotérreos tales como calcio y magnesio; ión amonio; y alcanolaminas que tienen de 1 a 3 grupos alcanol de número de carbono 2 ó 3. Tensioactivos anfolíticos adecuados para su uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, sulfonatos de sal de amonio cuaternario, tensioactivos anfolíticos tipo betaína y similares. Tensioactivos no iónicos adecuados incluyen generalmente éteres de polioxalquileno, además de alcanolamidas de ácidos grasos superiores o aducto de óxido de alquileno de las mismas, monoésteres de glicerina de ácidos grasos y similares. También pueden emplearse mezclas de tensioactivos como se conoce en la técnica.

Producción de azúcares solubles de biomasa celulósica

Los polipéptidos de -glucosidasa de la presente invención, además de cualquier composición, medio de cultivo o lisado celular que comprenda tales polipéptidos de -glucosidasa, pueden usarse en la producción de monosacáridos, disacáridos u oligómeros de un mono- o di-sacárido como materia prima química o de fermentación de biomasa. Como se usa en el presente documento, el término “biomasa” se refiere a material biológico vivo o muerto que contiene un sustrato de polisacárido tal como, por ejemplo, celulosa, almidón, y similares. Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento de conversión de un sustrato de biomasa en un azúcar fermentable, comprendiendo el procedimiento poner en contacto un medio de cultivo o lisado celular que contiene un polipéptido de -glucosidasa según la invención con el sustrato de biomasa en condiciones adecuadas para la producción del azúcar fermentable. La presente invención proporciona además un procedimiento de conversión de un sustrato de biomasa en un azúcar soluble (o “fermentable”) (a) pretratando un sustrato de celulosa para aumentar su susceptibilidad a la hidrólisis; (b) poniendo en contacto el sustrato de celulosa pretratado de la etapa (a) con una composición, medio de cultivo o lisado celular que contiene un polipéptido de -glucosidasa de la presente invención (y opcionalmente otros celulasas) en condiciones adecuadas para la producción del azúcar fermentable.

En algunas realizaciones, la biomasa incluye sustratos celulósicos que contienen celulosa, hemicelulosa, lignocelulosa. Sustratos celulósicos incluyen, pero no se limitan a, que incluyen pero no se limitan a, madera, pulpa de madera, pulpa de papel, hojas y tallos de maíz, fibra de maíz, arroz, residuo de procesamiento de papel y pulpa, plantas leñosas o herbáceas, pulpa de fruta o verdura, grano de destilería, céspedes, cáscara de arroz, paja de trigo, algodón, cáñamo, lino, sisal, mazorcas de maíz, bagazo de caña de azúcar, césped de pradera y mezclas de los mismos. La biomasa puede pretratarse opcionalmente para aumentar la susceptibilidad de celulosa a la hidrólisis usando procedimientos conocidos en la técnica tales como pretratamientos químicos, físicos y biológicos (por ejemplo, explosión por vapor, reducción a pulpa, molienda, hidrólisis ácida, exposición a disolventes, y similares, además de combinaciones beneficiosas de las mismas). En algunas realizaciones, la biomasa comprende plantas transgénicas que expresan las enzimas ligninasa y/o celulasa que degradan lignina y celulosa. Véase, por ejemplo, el documento US 20080104724, que se incorpora en el presente documento por referencia.

En algunas realizaciones, el polipéptido de -glucosidasa y las composiciones que contienen polipéptido de glucosidasa, medios de cultivo celular y lisados celulares pueden hacerse reaccionar con la biomasa o biomasa pretratada a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 25 ºC a aproximadamente 100 ºC, aproximadamente 30 ºC a aproximadamente 90 ºC, aproximadamente 30 ºC a aproximadamente 80 ºC, aproximadamente 40 ºC a aproximadamente 80 ºC y aproximadamente 35 ºC a aproximadamente 75 ºC. Por tanto, la biomasa puede hacerse reaccionar con los polipéptidos de -glucosidasa y composiciones que contienen polipéptido de -glucosidasa, medios de cultivo celular y lisados celulares a una temperatura de aproximadamente 25 ºC, a aproximadamente 30 ºC, a aproximadamente 35 ºC, a aproximadamente 40 ºC, a aproximadamente 45 ºC, a aproximadamente 50 ºC, a aproximadamente 55 ºC, a aproximadamente 60 ºC, a aproximadamente 65 ºC, a aproximadamente 70 ºC, a aproximadamente 75 ºC, a aproximadamente 80 ºC, a aproximadamente 85 ºC, a aproximadamente 90 ºC, a aproximadamente 95 ºC y a aproximadamente 100 ºC. Además de las temperaturas descritas anteriormente, condiciones adecuadas para convertir un sustrato de biomasa en un azúcar fermentable que emplean un polipéptido de -glucosidasa de la presente invención (opcionalmente en una composición, medio de cultivo celular o lisado celular) incluyen llevar a cabo el procedimiento a un pH en un intervalo de aproximadamente pH 3,0 a aproximadamente 8,5, aproximadamente pH 3,5 a aproximadamente 8,5, aproximadamente pH 4,0 a aproximadamente 7,5, aproximadamente pH 4,0 a aproximadamente 7,0 y aproximadamente pH 4,0 a aproximadamente 6,5. Aquellos expertos habituales en la materia apreciarán que los tiempos de reacción para convertir un sustrato particular de biomasa en un azúcar fermentable pueden variar, pero el tiempo de reacción óptimo puede determinarse fácilmente. Tiempos de reacción a modo de ejemplo pueden estar en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 240 horas, de aproximadamente 5 a aproximadamente 180 h y de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 h. Por ejemplo, el tiempo de incubación puede ser al menos 1 h, al menos 5 h, al menos 10 h, al menos 15 h, al menos 25 h, al menos 50 h, al menos 100 h, al menos 180 y similares.

La reacción de la -glucosidasa con sustrato de biomasa o sustrato de biomasa pretratado bajo estas condiciones puede producir la liberación de cantidades sustanciales de los azúcares solubles del sustrato. Por ejemplo al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o más azúcar soluble puede estar disponible con respecto a la liberación de azúcar por C1 natural. En algunas realizaciones, la cantidad de azúcar soluble puesta a disposición puede ser al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces o al menos 5 veces superior a la puesta a disposición por C1 natural bajo las mismas condiciones. En algunas realizaciones, los azúcares solubles comprenderán glucosa.

Los azúcares solubles producidos mediante los procedimientos de la presente invención pueden usarse para producir un alcohol (tal como, por ejemplo, etanol, butanol, y similares). Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento de producción de un alcohol, en el que el procedimiento comprende (a) proporcionar un azúcar fermentable producido usando un polipéptido de -glucosidasa de la presente invención en los procedimientos descritos arriba; (b) poner en contacto el azúcar fermentable con un microorganismo fermentante para producir el alcohol u otro producto metabólico; y (c) recuperar el alcohol u otro producto metabólico.

En algunas realizaciones, el polipéptido de -glucosidasa de la presente invención, o composición, medio de cultivo celular o lisado celular que contiene el polipéptido de -glucosidasa, puede usarse para catalizar la hidrólisis de un sustrato de biomasa a un azúcar fermentable en presencia de un microorganismo fermentante tal como una levadura (por ejemplo, Saccharomyces sp. tal como, por ejemplo, S. cerevisiae, Pichia sp., y similares) u otros microorganismos fermentantes C5 o C6 que son muy conocidos en la técnica (por ejemplo, Zymomonas sp., E. coli) para producir un producto final tal como etanol. En un ejemplo se usa un procedimiento de sacarificación y fermentación (SSF) simultánea en el que los azúcares fermentables (por ejemplo, glucosa y/o xilosa) se eliminan del sistema por el procedimiento de fermentación.

Los azúcares solubles producidos por el uso de un polipéptido de -glucosidasa de la presente invención también pueden usarse en la producción de otros productos finales tales como, por ejemplo, acetona, un aminoácido (por ejemplo, glicina, lisina y similares), un ácido orgánico (por ejemplo, ácido láctico y similares), glicerol, un diol (por ejemplo, 1,3-propanodiol, butanodiol, y similares) y piensos animales.

Un experto en la materia apreciará fácilmente que las composiciones de polipéptido de -glucosidasa de la presente invención pueden usarse en forma de una disolución acuosa o un concentrado sólido. Cuando se emplean disoluciones acuosas, la disolución de -glucosidasa puede diluirse fácilmente para permitir concentraciones precisas. Un concentrado puede estar en cualquier forma reconocida en la materia que incluye, por ejemplo, líquidos, emulsiones, suspensiones, gel, pastas, gránulos, polvos, un aglomerado, un disco sólido, además de otras formas que son muy conocidas en la técnica. También pueden usarse otros materiales con o incluidos en la composición de -glucosidasa de la presente invención según se desee, que incluyen piedras, piedra pómez, cargas, disolventes, activadores de enzimas y agentes antirredeposición dependiendo del uso previsto de la composición.

Además del uso para la conversión de biomasa celulósica, los polipéptidos de -glucosidasa y composiciones de los mismos también pueden usarse en la industria alimentaria y de las bebidas, por ejemplo, en el procedimiento de elaboración de vinos para la eficaz liberación de monoterpenoles (véase, por ejemplo, Yanai y Sato (1999) Am. J. Enol. Eitic., 50:231 - 235, que se incorpora en el presente documento por referencia) y para la preparación de tofú enriquecido en glicona isoflavona (véase, por ejemplo, Mase y col., (2004) J. Appl. Glycosci., 51:211 - 216, que se incorpora en el presente documento por referencia). Los polipéptidos de -glucosidasa de la presente invención también pueden emplearse en composiciones de detergente para mejorar el rendimiento de limpieza (véanse, por ejemplo, los documentos USP 7.244.605; US 5.648.263 y WO 2004/048592, que se incorporan en el presente documento por referencia).

Lo anterior y otros aspectos de la invención pueden entenderse mejor a propósito de los siguientes ejemplos no limitantes.

VII: EJEMPLOS

Ejemplo 1: Adquisición del gen de -glucosidasa 1 de C1 natural (Bgl1 C1) y construcción de vectores de expresión

Se sintetizó ADNc de Bgl1 C1 natural y se verificó la secuencia de ADN. El gen se clonó en un vector lanzadera de Saccharomyces cerevisiae/C1 pYTDX20 usando sitios de clonación Pml1. El péptido señal y el gen estuvieron bajo el control de un promotor de quitinasa (Pchi). El vector contuvo REP2, rep1 y el origen de replicación de proteína D (parcial) para S. cerevisiae y un marcador de resistencia a URA3. El plásmido resultante (pYTDX20-C1 bgl1) se transformó en la cepa INVSC1 de S. cerevisiae, y las células huésped transformadas se cultivaron en HTP para la producción de proteína Bgl1 C1. Se verificó la secuencia de Bgl1 C1 de los transformantes. La porción que codifica proteína de la secuencia de ADNc de Bgl1 C1 natural se proporciona como SEC ID Nº: 1 y el polipéptido codificado se proporciona como SEC ID Nº: 2. Los 19 primeros residuos de SEC ID Nº: 2 se muestran en negrita y comprenden el péptido señal.

Ejemplo 2: Procedimiento en matraz con agitación

Una única colonia de S. cerevisiae que contenía un plásmido con el gen de ADNc de Bgl1 C1 se inoculó en 1 ml de caldo de uracilo definido sintético (SD-ura) (2 g/l de Drop-out sintético menos uracilo sin base nitrogenada de levadura (de United States Biological, Swampscott, MA), 5 g/l de sulfato de amonio, 0,1 g/l de cloruro de calcio, 2 mg/l de inositol, 0,5 g/l de sulfato de magnesio, 1 g/l de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) 0,1 g/l de cloruro sódico) que contenía 6 % de glucosa. Las células se cultivaron durante 24 h en una estufa de incubación a 30 ºC con agitación a 250 rpm. Entonces, 500 µl del cultivo durante la noche se diluyeron en 50 ml de medio SD-ura que contenía 2 % de glucosa en un matraz con agitación estéril con deflectores de 250 ml y se incubó a 37 ºC durante 48

h. Las células se sedimentaron por centrifugación (4000 rpm, 15 min, 4 ºC). El sobrenadante de medio claro que contenía la enzima Bgl1 C1 secretada se recogió y se guardó a -20 ºC hasta que se usó.

Ejemplo 3: Ensayos para determinar la actividad de -glucosidasa

La actividad de -glucosidasa puede determinarse tanto por un ensayo de para-nitrofenil--D-glucósido (pNPG) como un ensayo de celobiosa.

Se usó un ensayo basado en pNPG (p-nitrofenil--D-glucopiranósido) colorimétrico para medir la actividad de glucosidasa. En un volumen total de 150 µl, 75 µl de sobrenadante de medio claro que contenían enzima Bgl1 C1 se añadieron a 75 µl de disolución de pNPG 3 mM (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) en tampón acetato sódico 300 mM, pH 5. Las reacciones se incubaron a pH 5, 50 ºC durante 1,5 h. Después de la reacción, 75 µl de la mezcla de reacción se inactivaron con 75 µl de disolución de carbonato sódico 1 M a pH 11. La absorbancia de la disolución se midió a 405 nm para determinar la conversión de pNPG en p-nitrofenilo. La cantidad de producto de p-nitrofenol se midió espectrofotométricamente a 405 nm para calcular la actividad de -glucosidasa como se describe por Breves y col. (1997), Appl. Environmental Microbiol. 63:3902-3910. La actividad de -glucosidasa detectable se observó bajo condiciones de selección de alto rendimiento (pH 5, 65 ºC).

La actividad de -glucosidasa también se determinó usando un ensayo de celobiosa, que usó celobiosa (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) como sustrato. En un volumen total de 150 µl, 75 µl de sobrenadante de medio claro que contenían enzima Bgl1 C1 se añadieron a 75 µl de 6,6 g/l de celobiosa en tampón acetato sódico 300 mM (pH 5). La reacción se incubó a 65 ºC durante 21 horas con agitación. La producción de glucosa se determinó usando un kit de ensayo de glucosa enzimático (K-GLUC, Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irlanda). En un volumen total de 200 µl, 15 µl de la mezcla de reacción de Bgl1 C1 se añadieron a 185 µl de reactivo de determinación de glucosa (reactivo GOPOD, suministrado como parte del kit de ensayo de K-GLUC). La reacción se incubó a 50 ºC durante 30 minutos y la absorbancia de la disolución se midió a 510 nm. La enzima glucosa oxidasa en el reactivo GOPOD reacciona con glucosa y produce peróxido de hidrógeno que luego reacciona con 4-aminoantipirina en el reactivo para producir un colorante de quinoneimina. La cantidad de colorante de quinoneimina se midió espectrofotométricamente a 510 nm para calcular la actividad de -glucosidasa. La conversión de celobiosa a glucosa también se midió usando un Agilent HPLC 1200 equipado con columna de exclusión iónica HPX-87H (300 mm x 7,8 mm) con agua como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min a 80 ºC. Los tiempos de retención de la celobiosa y la glucosa fueron 4,7 y 5,8 minutos, respectivamente. La actividad de -glucosidasa detectable se observó bajo condiciones de selección de alto rendimiento (pH 5, 65 ºC).

Ejemplo 4: Evaluación de la actividad óptima de Bgl1 C1

El perfil de actividad de Bgl1 C1 nativa se investigó a diferentes temperaturas (50 ºC, 60 ºC y 65 ºC) y pH (3,5-7,5) usando celobiosa (3,3 g/l) como sustrato. Los procedimientos experimentales y analíticos se describen en el Ejemplo

3. Bgl1 C1 presentó actividad óptima a pH 5 y 50 ºC, y la actividad de -glucosidasa detectable (20 % de actividad óptima) se observó bajo condiciones de selección de alto rendimiento (pH 5 y 65 ºC).

Ejemplo 5: Ensayos de alto rendimiento para identificar variantes de Bgl1 C1 mejoradas

Se transformaron bibliotecas de plásmidos que contenían genes Bgl1 C1 de variante en la cepa INVSC1 de S. cerevisiae y se sembraron sobre placa de agar con SD-ura que contenía 2 % de glucosa. Después de la incubación durante al menos el 48 horas a 30 ºC, las colonias se recogieron usando un recolector de colonias robotizado Qbot® (Genetix USA, Inc., Beaverton, OR) en placas de microtitulación de pocillos de 96 pocillos poco profundas que contenían 200 µl de medio SD-ura y 6 % de glucosa. Las células se cultivaron durante 24 horas a 30 ºC con agitación a 250 rpm y 85 % de humedad. Entonces, 20 µl de este cultivo durante la noche se transfirieron a placas de microtitulación de 96 pocillos (pocillo profundo) que contenían 380 µl de medio SD-ura y 2 % de glucosa como se ha descrito en el Ejemplo 2. Las placas se incubaron a 37 ºC con agitación a 250 rpm y 85 % de humedad durante 48 horas. Las placas profundas se centrifugaron a 4000 rpm durante 15 minutos y el sobrenadante de medio claro que contenía la enzima Bgl1 C1 secretada se usó para el ensayo de pNPG de alto rendimiento o de celobiosa.

Las bibliotecas de Bgl1 C1 se cribaron con alto rendimiento usando tanto ensayos de termoactividad como de termoestabilidad. En el ensayo de termoactividad, las variantes de Bgl1 C1 se cribaron con un ensayo de alta selección basado en celobiosa (sustrato: celobiosa; pH: 5,0; temperatura: 65 ºC; tiempo: 21 h). Las variantes de Bgl1 C1 activas identificadas a partir del ensayo de termoactividad se sometieron posteriormente al ensayo de termoestabilidad. En el ensayo de termoestabilidad, las muestras de sobrenadante del medio HTP que contenían las enzimas de variante de Bgl1 C1 se preincubaron a pH 5, 65 ºC durante 0 ó 6 horas. La actividad enzimática residual después de la exposición térmica se midió usando pNPG como sustrato a pH 5, 50 ºC durante 1,5 h como se describe en el Ejemplo 3.

Ensayo de termoactividad

La selección por termoactividad fue un ensayo de alto rendimiento basado en celobiosa (HTA). En placas de microtitulación de 96 pocillos poco profundas, 75 µl de sobrenadante de medio que contenía la enzima de variante de Bgl1 C1 se añadieron a 75 µl de 6,6 g/l de celobiosa en tampón acetato sódico 300 mM a pH 5,0. Después de sellar con cinta de termosellado de laminado de aluminio/polipropileno (velocidad 11 (Menlo Park, CA), cat. nº 06643-001), las placas se agitaron a 65 ºC durante 21 h. Las placas se centrifugaron durante 5 minutos a 4000 rpm. En placas de microtitulación claras de pocillos poco profundos, 15 µl de la mezcla de reacción se inactivaron con 185 µl de disolución de reactivo GOPOD por pocillo. Las disoluciones se mezclaron suavemente durante 3 veces y la absorbancia se midió a 510 nm para la identificación de variantes de Bgl1 C1 de termoactividad mejorada.

Ensayo de termoestabilidad

La selección por termoestabilidad fue un ensayo de alto rendimiento basado en pNPG. En placas de microtitulación de 96 pocillos poco profundas, 180 µl de sobrenadante de medio que contenía la enzima de variante de Bgl1 C1 activa se mezclaron con 30 µl de tampón acetato sódico 1 M a pH 5,0. De un total de 210 µl de la disolución de enzima, 120 µl de la disolución de enzima se transfirieron a placas de PCR de 96 pocillos para el tratamiento de exposición térmica y los 90 µl de disolución de enzima que quedaron en las placas de 96 pocillos poco profundas se usaron como muestra de enzima Bgl1 C1 sin exponer. Después de sellar con cinta de termosellado de laminado de aluminio/polipropileno (velocidad 11 (Menlo Park, CA), cat. nº 06643-001), las placas de PCR se calentaron en el ciclador térmico (MJ Research, Waltham, MA) a 65 ºC durante 6 h. Después de la exposición térmica, 90 µl de la disolución de enzima expuesta se transfirieron a placas de 96 pocillos poco profundos. Para iniciar la reacción de pNPG, en placas de 96 pocillos poco profundos, 90 µl de disoluciones de enzima sin exponer o expuesta se mezclaron con 10 µl de disolución de pNPG 15 mM (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) en tampón acetato sódico 150 mM, pH 5. Las reacciones se incubaron a pH 5, 50 ºC durante 1,5 h. Después de la reacción, 100 µl de disolución de carbonato sódico 1 M a pH 11 se añadieron a la mezcla de reacción para extinguir la reacción. La absorbancia de la disolución se midió a 405 nm para determinar la conversión de pNPG a p-nitrofenilo. La actividad residual se calculó usando la fórmula:

% de actividad residual = 100 x (absorbancia de las muestras cuestionadas / absorbancia de las muestras no cuestionadas

Las actividades residuales de variantes de Bgl1 C1 se compararon con las de la enzima nativa para identificar las variantes de termoestabilidad mejorada.

Ejemplo 6: Actividades y estabilidades de -glucosidasa mejoradas de variantes de Bgl1 C1 manipuladas

Las variantes de Bgl1 C1 mejoradas se identificaron de la selección de alto rendimiento de diversas bibliotecas de variantes de Bgl1 C1 como se describe en el Ejemplo 5. Una secuencia de variante de referencia que presenta actividad y estabilidad mejoradas en comparación con Bgl1 C1 natural se seleccionó como proteína de referencia (variante 3, como se muestra en las Tablas 2 y 3) y se generaron variantes de Bgl1 C1 adicionales y se evaluaron como se indica en la leyenda de la Tabla 3 para identificar variantes que tenían estabilidad y actividad mejoradas con respecto a la secuencia de referencia de la variante 3. Entonces, una de las variantes mejoradas de esta ronda se seleccionó como proteína de referencia (variante 269, como se muestra en la Tablas 3 y 4) y se generaron variantes de Bgl1 C1 adicionales y se evaluaron como se describe en la leyenda de la Tabla 4 para identificar variantes que tenían estabilidad y actividad mejoradas con respecto a la variante 269. Una variante (variante 481, como se muestra en las Tablas 4 y 5) se seleccionó de esta ronda como proteína de referencia y se generaron variantes de Bgl1 C1 adicionales y se evaluaron como se describe en la leyenda de la Tabla 5 para identificar variantes que tenían estabilidad y actividad mejoradas con respecto a la variante 481. Entonces se seleccionaron dos variantes (variante 647, como se muestra en la Tablas 5 y 6; y variante 664 como se muestra en la Tablas 5 y 7). Cada variante sirvió de proteína de referencia para separar rondas de selección. Se generaron variantes de Bgl1 C1 adicionales y se evaluaron como se describe en la leyenda de la Tabla 6 para identificar variantes que tenían estabilidad y actividad mejoradas con respecto a la variante 647. También se generaron variantes de Bgl1 C1 y se evaluaron como se describe en la leyenda de la Tabla 7 para identificar variantes que tenían estabilidad y actividad mejoradas con respecto a la variante 664.

Las Tablas 2, 3, 4, 5, 6 y 7 resumen la mejora en termoactividades y termoestabilidades de ciertas variantes de Bgl1 C1 englobadas por la invención.

Ejemplo 7: Producción de variantes de -glucosidasa mejoradas en el huésped C1

Se usó un procedimiento de fermentación de dos etapas (inoculación y fermentaciones principales a partir de esporas) para expresar genes de variantes Bgl1 C1 en C1. Seis plásmidos que contenían genes de variantes Bgl1 C1 se transformaron en la cepa C1 y se sembraron sobre placas de agar que contenían medio M3-01 con 22,93 % de sacarosa (componentes del medio M3-01: 6,0 g/l de nitrato sódico, 0,52 g/l de cloruro de potasio, 1,52 g/l de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4), 0,24 g/l de sulfato de magnesio, 1,6 mg/l de sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO4·5H2O), 5 mg/l de sulfato ferroso heptahidratado (FeSO4·7H2O), 22 mg/l de sulfato de cinc heptahidratado (ZnSO4·7H2O), 5 mg/l de cloruro de manganeso (II) tetrahidratado (MnCl2·4H2O), 1,8 mg/l de sulfato de cobalto (II) heptahidratado (CoSO4·7H2O), 1,5 mg/l de molibdato de sodio dihidratado (Na2MoO4·2H2O), 11 mg/l de ácido bórico, 50 mg/l de EDTA, 10,0 g/l de glucosa, 1,0 g/l de aminoácidos CAS (Tritium Microbiologie B. V., Los Países Bajos), 16 g/l de agar, 1 ml/l de 1000x Pen/Estrep después de la esterilización (1000x Pen/Estrep: 2 g de penicilina G y 5 g de estreptomicina disuelta en 100 ml de H2O, esterilizada por filtración). El pH del medio se ajustó a 6,5 con KOH 10 M y se esterilizó en autoclave durante 25 minutos a 121 ºC. Las placas se incubaron a 35 ºC durante 5 días. Las esporas recogidas de las placas de agar se usaron para inocular un medio de inóculo F1-01 de 100 ml esterilizado en un matraz Erlenmeyer de 500 ml para alcanzar 5*104-105 esporas/ml de número de esporas inicial (componentes del medio de inóculo F1-01: 0,50 g/l de fosfato de potasio dibásico (K2HPO4), 0,05 g/l de cloruro de potasio, 0,007 g/l de sulfato ferroso heptahidratado (FeSO4·7H2O), 1,00 g/l de extracto de levadura (solo KAT), 10 g/l de Pharmamedia (Traders Protein, Lubbock, TX, EE.UU.), 10 g/l de D(+)lactosa monohidratada, 10 g/l de glucosa después de la esterilización, 1 ml/l de 1000x Pen/Estrep después de la esterilización (1000x Pen/Estrep: 2 g de penicilina G y 5 g de estreptomicina disuelta en 100 ml de H2O, esterilizada por filtración). El pH del medio se ajustó a 7,0 con NaOH 10 M y se esterilizó en autoclave durante 25 minutos a 121 ºC (el pH del medio después de la esterilización fue 6,5). Para preparar cultivo de inóculo, el matraz se incubó a 35 ºC, 85 % de humedad durante 3 días con agitación a 250 rpm y 25 mm de desplazamiento. 15 ml del medio de fermentación principal esterilizado en un matraz Erlenmeyer de 100 ml se inocularon con 750 µl del cultivo de inóculo obtenido (componentes del medio de fermentación principal F1-01: 0,66 g/l de fosfato de potasio dibásico (K2HPO4), 0,24 g/l de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4), 8,00 g/l de sulfato de amonio, 12,00 g/l de citrato de sodio tribásico deshidratado, 0,15 g/l de extracto de levadura (solo KAT), 0,09 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado, 0,80 g/l de cloruro de calcio dihidratado, 24,80 g/l de Pharmamedia (Traders Protein, Lubbock, TX, USA), 26,40 g/l de D(+)lactosa monohidratada, 64,80 g/l de celulosa (AlphaCel BH200A)). El medio se esterilizó en autoclave durante 25 minutos a 121 ºC. La fermentación principal se llevó a cabo por incubación a 35 ºC, 85 % de humedad durante 6 días con agitación a 300 rpm y 25 mm de desplazamiento. Después de acabar la fermentación principal, las células se sedimentaron por centrifugación (4500 rpm, 15 min, 4 ºC). El sobrenadante de medio claro que contenía la enzima Bgl1 C1 secretada se recogió y se guardó a -20 ºC hasta que se usó.

Ejemplo 8: Termoestabilidades mejoradas de variantes de -glucosidasa producidas en el huésped C1

Ocho variantes de Bgl1 C1 (3, 8, 70, 109, 143, 194, 269 y 270) y enzima nativa, producidas en el huésped C1, se caracterizaron para determinar sus estabilidades a alta temperatura (65 ºC). Las muestras que contenían diversas enzimas de variante de Bgl1 C1 se pre-incubaron a pH 5, 65 ºC durante 0, 6 ó 24 h. La actividad enzimática residual después de la exposición térmica se midió usando pNPG como sustrato a pH 5, 50 ºC durante 20 min. La mejor variante de las ocho presentó hasta 34 veces de mejora en la estabilidad con respecto a la enzima nativa (FIGURA 1A y FIGURA 1B). La comparación de los perfiles de estabilidad de la enzima nativa y las ocho variantes de Bgl1 C1, producidas a partir de levadura y a partir de C1, mostró buena correlación entre los dos huéspedes. (FIGURA 1 C).

Ejemplo 9: Termoestabilidades de variantes de Bal1 de C1

Las termoestabilidades de las variantes de Bgl1 C1 mejoradas 3, 26 y 481 se compararon con las de la enzima Bgl1 C1 nativa. La actividad enzimática residual después de 24 h de incubación a pH 4,5, 65 ºC se midió usando pNPG como sustrato a pH 5, 50 ºC durante 20 min. La FIGURA 2A muestra que la variante 481 tuvo el mayor aumento en la actividad tras la exposición térmica.

La termoestabilidad de la variante de Bgl1 C1 mejorada 664 se comparó con la de la variante 481. La actividad enzimática residual después de 4 h de incubación a pH 4, 65 ºC se midió usando pNPG como sustrato a pH 5, 50 ºC durante 20 min. La FIGURA 2B muestra que la variante 664 tuvo actividad enzimática mejorada después de la exposición térmica con respecto a la variante 481.

La termoestabilidad de las variantes de Bgl1 C1 mejoradas 3, 481, 664, 916, 885 y 871 se comparó con la enzima nativa (FIGURA 3). La actividad enzimática residual se midió después de 72 h de incubación a pH 4,5, 65 ºC usando un ensayo de pNPG a pH 5, 50 ºC durante 20 min. Los resultados mostraron que las variantes 664, 916, 885 y 871 retuvieron actividad sustancial.

La actividad específica de la variante 871 se comparó con la enzima nativa, es decir, natural usando un ensayo de celobiosa (pH 4,5 o pH 5, 55 ºC-75 ºC; 8 g/l de celobiosa, 18 h de reacción). La FIGURA 4 muestra que la variante 871 produjo más glucosa en el ensayo que la enzima nativa.

La FIGURA 5 muestra un alineamiento de las variantes 871, 916, 885, 664, 647, 481, 269 y 3 con la secuencia de aminoácidos de Bgl1 C1 nativa.

SEQ ID N º: 2: De tipo salvaje C1 Bgl1 polipéptido de secuencia; péptido señal se indica en negrita

SEQ ID NO: 3: secuencia polinucleotídica de codificación de tipo salvaje de Chrysosporium lucknowense proteína glucosidasa1 utilizando codones sesgada para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. La proteína codificada por SEQ ID NO: 3 es la SEQ ID NO. 2

SEQ ID NO:4 C1 Variante 3 cDNA secuencia SEQ ID NO:5 C1 Variante 3 Polipéptido Secuencia

SEQ ID NO:6 C1 Variante 269 cDNA Secuencia SEQ ID NO:7 C1 Variante 269 Polypéptido Secuencia SEQ ID NO:8 C1 Variante 481 cDNA Secuencia SEQ ID NO:9 C1 Variante 481 Polipéptido Secuencia

SEQ ID NO:10 C1 Variante 482 cDNA Secuencia SEQ ID NO:11 C1 Variante 482 polipéptido secuencia SEQ ID NO:12 C1 Variante 664 cDNA Secuencia SEQ ID NO:13 C1 Variante 664 polipéptido seqcencia

SEQ ID NO:14 C1 Variante 647 cDNA Secuencia SEQ ID NO:15 C1 Variant e647 polipéptido secuencia SEQ ID NO:16 C1 Variante 871 cDNA Secuencia SEQ ID NO:17 C1 Variante 871 polipéptido secuencia

SEQ ID NO:18 C1 Variante 885 cDNA secuencia SEQ ID NO:19 C1 Variante 885 polipéptido secuencia

SEQ ID NO:20 C1 Variant e916 cDNA secuencia SEQ ID NO:21 C1 Variante 916 polyipéptido secuencia

Claims (15)

1. Reivindicaciones

   1.

   Una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína C1 natural (Bgl1) y que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº: 2) y tiene al menos una sustitución en la posición D369 en la que la posición se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2.

2. 2.

   La variante de polipéptido de -glucosidasa según la reivindicación 1, en la que el aminoácido en la posición 369 está seleccionado del grupo que consiste en R, Q, L, Y, C, A, I, P, E, K, F, M, H y V, opcionalmente en la que, con respecto a una Bgl1 C1 nativa que comprende los aminoácidos 20-870 de SEC ID Nº: 2, la variante tiene:

   a) al menos 5 veces mayor termoactividad a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65 ºC, b) al menos 3 veces mayor termoestabilidad a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65 ºC, o c) tanto (a) como (b).

3. 3.

   La variante de polipéptido de -glucosidasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la secuencia de aminoácidos incluye Q291W, D369R/H/L/Y y E402N y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q258N/H, I106V, E385L, D274Y, K495H/I/N/Q, Q119E, Y135Q, G628W, N437I/V/W/D, S501R, Q313M, S434P y Y491F.

4. 4.

   La variante de polipéptido de -glucosidasa según la reivindicación 1 que tiene al menos el 70 % de identidad, al menos el 75 % de identidad, al menos el 80 % de identidad, al menos el 85 % de identidad, al menos el 90 % de identidad o al menos el 95 % de identidad con los residuos de aminoácidos 20-870 de SEC ID Nº: 2 y comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Q291, una sustitución de aminoácidos en la posición D369 y una sustitución de aminoácidos en la posición E402, como se determina con referencia a SEC ID Nº: 2.

5. 5.

   La variante de polipéptido de -glucosidasa de la reivindicación 4, que comprende además al menos una sustitución de aminoácidos adicional en D47, A79, Q85, I106, A109, Q258, V260, Q313, F314, A343, S434, A475, K495, G628, A689, Y715 o A732, en la que la sustitución es opcionalmente D471, A79E/G/M, Q85N/H, I106V, A109/S/T,V260G, Q313M, F314L/V, A343C, S434P, A475L, K495N, G628W, A689I, Y715P o A732G, tal como en la que la variante comprende al menos una sustitución Q291W, D369R/L/H/Y o E402N.

6. 6.

   La variante de polipéptido de -glucosidasa de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en la que, con respecto a una Bgl1 C1 nativa que comprende los aminoácidos 20-870 de SEC ID Nº: 2, la variante tiene:

   a) al menos 5 veces mayor termoactividad a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65 ºC, b) al menos 3 veces mayor termoestabilidad a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65 ºC, o c) tanto (a) como (b).

7. 7.

   La variante de polipéptido de -glucosidasa de cualquier reivindicación precedente que tiene al menos el 75 % de identidad, al menos el 80 % de identidad, al menos el 85 % de identidad, al menos el 90 % de identidad, al menos el 91 % de identidad, al menos el 92 % de identidad, al menos el 93 % de identidad, al menos el 94 % de identidad, al menos el 95 % de identidad, al menos el 96 % de identidad, al menos el 97 % de identidad, al menos el 98 % de identidad o al menos el 99 % de identidad con los residuos de aminoácidos 20-870 de SEC ID Nº: 2.

8. 8.

   La variante de polipéptido de -glucosidasa según la reivindicación 1 que comprende los residuos de aminoácidos 20-870 de una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7; SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 13; SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 21.

9. 9.

   Un ácido nucleico recombinante que codifica una variante de polipéptido de -glucosidasa de cualquier reivindicación precedente, opcionalmente en el que el ácido nucleico codifica una preproteína que comprende la variante de Bgl1 fusionada con un péptido señal, opcionalmente el péptido señal Bgl1 C1 que se produce naturalmente.

10. 10.

    Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 9.

11. 11.

    Una célula huésped que comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 10, en la que dicho ácido nucleico está opcionalmente operativamente ligado a un promotor distinto del promotor de Bgl1 C1, por ejemplo, en la que:

    a) la célula huésped es una especie de hongo filamentoso tal como una especie de Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Chrysosporium, Myceliophthora o Thielavia; o b) la célula huésped también expresa al menos un polipéptido de celulasa recombinante que no se produce naturalmente adicional, seleccionado de:

    i) un polipéptido de endoglucanasa (EG) recombinante, y ii) un polipéptido de celobiohidrolasa (CBH) recombinante.

12. 12.

    Un procedimiento de producción de un polipéptido de Bgl1 que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 11 en condiciones en las que se expresa la variante de Bgl1, tales como en las que la variante es secretada por la célula huésped, opcionalmente que comprende además una etapa de recuperar la variante de Bgl1 del medio en el que se cultiva la célula.

13. 13.

    Una composición que comprende una variante de Bgl1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y al menos una polipéptido de celulasa recombinante que no se produce naturalmente adicional, seleccionado de

    a) un polipéptido de endoglucanasa (EG) recombinante; b) un polipéptido de celobiohidrolasa (CBH) recombinante; y c) al menos un polipéptido de EG recombinante y al menos un polipéptido de CBH recombinante, opcionalmente:

    i) que comprende además al menos un polipéptido seleccionado de un grupo de polipéptidos que consiste en una hemicelulasa, una pectinasa, una lignina peroxidasa, una manganeso peroxidasa, una lacasa y una celobiosa deshidrogenasa; ii) en la que la celobiohidrolasa (CBH) y/o endoglucanasa (EG) es de Trichoderma reesei, Myceliophthora thermophila o Streptomyces avermitilis, o es una variante de una CBH o EG de T. reesei, CBH o EG de M. thermophila o una CBH o EG de S. avermitilis; o iii) que comprende una célula huésped que expresa la variante de Bgl1.

14. 14.

    El uso de una variante de Bgl1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en la producción de azúcares solubles de biomasa celulósica.

15. 15.

    El uso de la reivindicación 14 que es un procedimiento de producción de glucosa que comprende combinar celobiosa con una variante de -glucosidasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y opcionalmente al menos una celulasa adicional, en condiciones en las que se produce glucosa, por ejemplo, que comprende además:

    a) cultivar un microorganismo en condiciones en las que la glucosa producida se usa como una fuerte de energía y carbono para producir un producto metabólico; y b) recuperar el producto metabólico,

    opcionalmente en el que: i) el microorganismo es una levadura o bacteria; o ii) el producto metabólico es un alcohol, ácido orgánico o hidrocarburo con 1-20 átomos de carbono, por ejemplo, en el que el producto metabólico es etanol.