BR112013019324B1 - processos para refinamento enzimático de um material celulósico pré-tratado - Google Patents

Abstract

PROCESSOS PARA REFINAMENTO ENZIMÁTICO DE UM MATERIAL CELULÓSICO PRÉ-TRATADO, PARA HIDROLISAR E PARA FERMENTAR UM MATERIAL CELULÓSICO PRÉ-TRATADO, E PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO. A presente invenção se refere aos processos para refinamento enzimático de um material celulósico pré- tratado para sacarificação..

Description

Referência a uma Listagem de Sequências

[0001] Este pedido contém uma listagem de sequências na forma legível em computador. A forma legível em computador é aqui incorporada pela referência.

Fundamentos da Invenção Campo da Invenção

[0002] A presente invenção se refere aos processos para refinamento enzimático de um material celulósico pré-tratado usando uma ou mais enzimas esterase. O material celulósico pré-tratado refinado é adequado para sacarificação.

Descrição da Técnica Relacionada

[0003] A celulose é um polímero do açúcar simples glicose covalentemente ligado por ligações beta-1,4. Muitos microrganismos produzem enzimas que hidrolisam beta-glicanas ligadas. Estas enzimas incluem endoglucanases, celobioidrolases e beta-glucosidases. As endoglucanases digerem o polímero de celulose em locais aleatórios, abrindo- o para ataque por celobioidrolases. As celobioidrolases liberam sequencialmente moléculas de celobiose a partir das extremidades do polímero de celulose. A celobiose é um dímero ligado a 1,4-beta de glicose solúvel em água. As beta-glucosidases hidrolisam celobiose em glicose.

[0004] A conversão de matérias primas lignocelulíticas em etanol apresenta as vantagens da disponibilidade imediata de grandes quantidades de matéria prima, a vantagem de evitar queimar ou aterrar os materiais, e a limpeza do etanol combustível. Madeira, resíduos agrícolas, culturas herbáceas e resíduos sólidos municipais são considerados matérias primas para a produção de etanol. Estes materiais consistem principalmente em celulose, hemicelulose e lignina. Uma vez que a lignocelulose é convertida em açúcares fermentáveis, por exemplo, glicose, os açúcares fermentáveis são facilmente fermentados por levedura em etanol. Os açúcares também podem ser convertidos cataliticamente ou fermentados em outros produtos químicos, além do etanol.

[0005] A conversão de matérias primas lignocelulósicas em açúcares, envolve tipicamente o pré-tratamento dos materiais celulósicos, seguido por sua hidrólise enzimática, antes da conversão dos açúcares em produtos de fermentação ou produtos convertidos cataliticamente. Os pré-tratamentos quebram o material lignocelulósico, de maneira que a hidrólise enzimática possa ocorrer de maneira eficiente.

[0006] Entretanto, o pré-tratamento de materiais celulósicos pode produzir impurezas nos materiais celulósicos pré-tratados que apresentam um efeito prejudicial nas enzimas celulase, e/ou diminui ou inibe a hidrólise enzimática e/ou sacarificação.

[0007] Pode ser vantajoso na técnica ser capaz de melhorar o material celulósico pré-tratado para sacarificação. Por exemplo, pode ser vantajoso na técnica melhorar o desempenho da hidrólise enzimática do material celulósico pré-tratado, tal como biomassa, incluindo resíduo de milho, lascas de madeira, gramíneas, etc, reduzindo, eliminando ou removendo impurezas tais como ésteres que apresentam um efeito prejudicial nas enzimas celulase.

[0008] A técnica prévia de interesse inclui WO 2009/042622 A2, que descreve um processo para produzir o produto de fermentação a partir do material contendo madeira, em que o processo inclui as etapas de i) pré-tratar o material contendo madeira; ii) hidrolisar submetendo o material contendo madeira pré-tratado a uma ou mais enzimas celulolíticas; iii) fermentar usando um organismo fermentador, em que o material contendo madeira é submetido a uma ou mais esterases antes e/ou durante o pré-tratamento na etapa i), e/ou a hidrólise na etapa ii), e/ou fermentação na etapa iii).

[0009] A presente invenção se refere aos processos para o refino auxiliado enzimaticamente de um material celulósico pré-tratado para sacarificação.

Sumário da Invenção

[0010] A presente invenção se refere a um processo para o refinamento enzimático de um material celulósico pré-tratado, incluindo: (a) colocar o material celulósico pré-tratado em contato com uma enzima esterase e/ou composição de enzima esterase para formar um material celulósico pré- tratado refinado.

[0011] A presente invenção também se refere a um processo para refinamento enzimático de um material celulósico pré-tratado, incluindo: (a) processar o material celulósico pré-tratado para formar uma mistura sólida/líquida de material celulósico pré-tratado; (b) separar um licor da mistura sólida/líquida de material celulósico pré-tratado; e (c) tratar o licor com feruloil esterase. Nas modalidades, a esterase ou feruloil esterase reduz e/ou elimina os ésteres tóxicos que inibem a hidrólise de materiais celulósicos pré-tratados.

[0012] Em um aspecto, os processos da presente descrição incluem uma enzima e/ou composição de enzima, incluindo uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma esterase e feruloil esterase. Os exemplos não limitantes de feruloil esterase adequada para uso de acordo com a presente descrição incluem enzimas que apresentam um aminoácido que apresenta pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NOS: 133, 134, 135, 136 e 137, ou fragmentos deste, com atividade de feruloil esterase, sozinho ou em combinação.

[0013] Em um aspecto, os processos anteriores incluem adicionalmente recuperar o material celulósico pré-tratado refinado.

[0014] Em um aspecto, os processos anteriores incluem adicionalmente separar o licor do material celulósico pré-tratado.

[0015] Em um aspecto, os processos anteriores incluem adicionalmente colocar o licor em contato com feruloil esterase e reciclar o licor, de maneira tal que seja colocado em contato com o material celulósico, material celulósico pré-tratado e/ou material celulósico pré-tratado refinado.

[0016] Em um aspecto, os processos anteriores incluem adicionalmente reciclar o licor em um novo pré-tratamento de um material celulósico pré- tratado com a composição de enzima.

[0017] Em um aspecto, os processos anteriores incluem adicionalmente pós-tratar o material celulósico pré-tratado refinado com um pré-tratamento enzimático, pré-tratamento químico, pré-tratamento mecânico e/ou um pré- tratamento físico.

[0018] Um aspecto da presente descrição se refere a um processo para hidrolisar um material celulósico pré-tratado, incluindo sacarificar um material celulósico pré-tratado, tratado e refinado de acordo com a presente descrição. Nas modalidades, o processo inclui recuperar o material celulósico pré-tratado sacarificado a partir da sacarificação. Nas modalidades, o material celulósico sacarificado é um açúcar tal como glicose, xilose, manose, galactose e arabinose.

[0019] Um aspecto da presente descrição se refere a um processo para produzir um produto de fermentação, incluindo: (a) sacarificar um material celulósico pré-tratado com uma composição de enzima adequada para sacarificação, em que o material celulósico pré-tratado é colocado em contato ou tratado de acordo com a presente descrição com uma enzima, incluindo a esterase e/ou a feruloil esterase; (b) fermentar o material celulósico pré-tratado sacarificado com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação. Nas modalidades, a esterase inclui uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma esterase e feruloil esterase de acordo com a presente descrição. Nas modalidades, a esterase compreende ou consiste em um aminoácido que apresenta pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NOS: 133, 134, 135, 136 e 137, sozinho ou em combinação, ou fragmentos deste com atividade de esterase. Nas modalidades, a esterase compreende ou consiste no polipeptídeo maduro do aminoácido de SEQ ID. NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136 ou SEQ ID NO: 137, ou fragmentos deste com atividade de enzima, tal como atividade de esterase. Nas modalidades, a enzima é selecionada do grupo que consiste em FAE(1), FAE-A, FAE-C, e FAE-D ou fragmentos desta com atividade de enzima. Nas modalidades, as etapas (a) (sacarificar um material celulósico pré-tratado com uma composição de enzima, em que o material celulósico pré-tratado é colocado em contato ou tratado de acordo com a presente descrição com esterase e/ou feruloil esterase) e (b) (fermentar o material celulósico pré-tratado sacarificado com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultânea. Nas modalidades, o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido, um alcano, um cicloalcano, um alceno ou um gás. As enzimas/composições de enzima adequadas para sacarificação incluem uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma laccase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina. Nas modalidades, a celulase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase. Nas modalidades, a hemicelulase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetixilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase, uma beta-xilosidase e uma glucuronidase.

[0020] Um outro aspecto da presente descrição se refere a um processo para fermentar um material celulósico pré-tratado, incluindo: fermentar um material celulósico pré-tratado com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico pré-tratado é tratado, refinado e/ou sacarificado de acordo com a presente descrição com esterase e/ou feruloil esterase, ou uma composição destas. Nas modalidades, a fermentação do material celulósico pré-tratado produz um produto de fermentação. Nas modalidades, a etapa de recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação é incluída. Nas modalidades, o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido, um alcano, um cicloalcano, um alceno ou um gás.

[0021] Em uma modalidade, o material celulósico pré-tratado é um substrato não lenhoso.

[0022] A presente descrição se refere a um processo para refinamento enzimático de um material celulósico pré-tratado que compreende ou que consiste em: (a) colocar o material celulósico pré-tratado em contato com uma ou mais enzimas esterase para formar um material celulósico pré-tratado refinado. Nas modalidades, a um ou mais esterase compreende ou consiste em uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma esterase e feruloil esterase. Nas modalidades, a esterase compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136 ou SEQ ID NO: 137, ou fragmentos deste com atividade de feruloil esterase. Nas modalidades, a esterase compreende ou consiste em SEQ ID. NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136 ou SEQ ID NO: 137 ou o polipeptídeo maduro desta. Nas modalidades, a feruloil esterase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em FAE(1), FAE-A, FAE-C e FAE-D. Nas modalidades, o processo compreende ou consiste em recuperar o material celulósico pré-tratado refinado. Nas modalidades, o processo compreende separar um licor do material celulósico pré-tratado. Nas modalidades, o processo compreende colocar o licor em contato com feruloil esterase e reciclar o licor, de maneira tal que seja colocado em contato com o material celulósico pré-tratado ou material celulósico pré-tratado refinado. Nas modalidades, o processo compreende reciclar o licor em um novo pré- tratamento de um material celulósico pré-tratado com a composição de esterase. Nas modalidades, o processo compreende pós-tratar o material celulósico pré-tratado refinado com um pré-tratamento enzimático, pré- tratamento químico, pré-tratamento mecânico e/ou um pré-tratamento físico. Nas modalidades, o processo compreende recuperar o material celulósico pré- tratado refinado. Nas modalidades, o colocar em contato com a esterase é realizado com cerca de 0,0005 a cerca de 5 mg, por exemplo, cerca de 0,001 a cerca de 5 mg, cerca de 0,0025 a cerca de 5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 4,5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 4 mg, cerca de 0,005 a cerca de 3,5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 3 mg, cerca de 0,005 a cerca de 2 mg, cerca de 0,005 a cerca de 1 mg, cerca de 0,075 a cerca de 1 mg, ou cerca de 0,1 a cerca de 1 mg de esterase por g de material celulósico pré-tratado. Nas modalidades, o colocar em contato com esterase é realizado com um total de sólidos (TS) de cerca de 1 % a cerca de 50 %, por exemplo, cerca de 2 % a cerca de 40 %, cerca de 2 % a cerca de 35 %, cerca de 3 % a cerca de 30 %, cerca de 3 % a cerca de 25 %, cerca de 4 % a cerca de 20 %, ou cerca de 5 % a cerca de 10 %. Nas modalidades, o colocar em contato com esterase é realizado em um pH de cerca de 2 a cerca de 9, por exemplo, cerca de 3 a cerca de 7,5, cerca de 3,5 a cerca de 7, cerca de 4 a cerca de 6,5, cerca de 4,5 a cerca de 6,5, cerca de 4,5 a cerca de 6,0, cerca de 5 e cerca de 6,0, ou cerca de 5 a cerca de 5,5. Nas modalidades, o colocar em contato é realizado em uma temperatura na faixa de cerca de 20°C a cerca de 70°C, por exemplo, cerca de 25°C a cerca de 65°C, cerca de 30°C a cerca de 65°C, cerca de 35°C a cerca de 65°C, cerca de 40°C a cerca de 60°C, cerca de 45°C a cerca de 55°C, ou cerca de 45°C a cerca de 50°C. Nas modalidades, o colocar em contato com esterase é realizado por um período de tempo de 5 minutos a 35 horas, por exemplo, 10 minutos a 15 horas, 10 horas a 15 horas, 10 horas a 20 horas, 10 horas a 20 horas, 20 horas a 24 horas, 24 horas a 30 horas, 1 hora a 72 horas.

[0023] A presente descrição se refere a um processo para refinamento enzimático de um material celulósico pré-tratado que compreende: (a) processar o material celulósico pré-tratado para formar uma mistura sólida/líquida de material celulósico pré-tratado; (b) separar um licor da mistura sólida/líquida de material celulósico pré-tratado; e (c) tratar o licor com um tratamento com feruloil esterase. Nas modalidades, o processo compreende retornar o licor tratado para o material celulósico pré-tratado. Nas modalidades, o processo compreende tratar com feruloil esterase, realizado com cerca de 0,0005 a cerca de 5 mg, por exemplo, cerca de 0,001 a cerca de 5 mg, cerca de 0,0025 a cerca de 5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 4,5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 4 mg, cerca de 0,005 a cerca de 3,5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 3 mg, cerca de 0,005 a cerca de 2 mg, cerca de 0,005 a cerca de 1 mg, cerca de 0,075 a cerca de 1 mg, ou cerca de 0,1 a cerca de 1 mg de esterase por mL de licor. Nas modalidades, o tratamento com feruloil esterase é realizado com um total de sólidos (TS) de cerca de 1 % a cerca de 50 %, por exemplo, cerca de 2 % a cerca de 40 %, cerca de 2 % a cerca de 35 %, cerca de 3 % a cerca de 30 %, cerca de 3 % a cerca de 25 %, cerca de 4 % a cerca de 20 %, ou cerca de 5 % a cerca de 10 %. Nas modalidades, o tratamento com feruloil esterase é realizado em um pH de cerca de 2 a cerca de 9, por exemplo, cerca de 3 a cerca de 7,5, cerca de 3,5 a cerca de 7, cerca de 4 a cerca de 6,5, cerca de 4,5 a cerca de 6,5, cerca de 4,5 a cerca de 6,0, cerca de 5 e cerca de 6,0, ou cerca de 5 a cerca de 5,5. Nas modalidades, o tratamento com feruloil esterase é realizado em uma temperatura na faixa de cerca de 20°C a cerca de 70°C, por exemplo, cerca de 25°C a cerca de 65°C, cerca de 30°C a cerca de 65°C, cerca de 35°C a cerca de 65°C, cerca de 40°C a cerca de 60°C, cerca de 45°C a cerca de 55°C, ou cerca de 45°C a cerca de 50°C. Nas modalidades, o tratamento com feruloil esterase é realizado por um período de tempo de 5 minutos a 35 horas, por exemplo, 10 minutos a 15 horas, 10 horas a 15 horas, 10 horas a 20 horas, 10 horas a 20 horas, 20 horas a 24 horas, 24 horas a 30 horas, 1 hora a 72 horas.

[0024] A presente descrição se refere adicionalmente a um processo para hidrolisar um material celulósico pré-tratado, compreendendo sacarificar um material celulósico pré-tratado, tratado e refinado com uma esterase, da maneira aqui descrita, com uma composição de enzima. Nas modalidades, o processo inclui esterase que compreende ou que consiste em uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma esterase e feruloil esterase. Nas modalidades, a esterase compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137 ou fragmentos deste com atividade de feruloil esterase. Nas modalidades, a esterase compreende ou consiste em SEQ ID. NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137 ou o polipeptídeo maduro desta. Nas modalidades, a feruloil esterase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em FAE(1), FAE-A, FAE-C e FAE-D. Nas modalidades, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma laccase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina. Nas modalidades, a celulase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase. Nas modalidades, a hemicelulase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetixilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase. Nas modalidades, o processo compreende recuperar o material celulósico pré- tratado sacarificado a partir da sacarificação. Nas modalidades, o material celulósico sacarificado é um açúcar. Nas modalidades, o açúcar é selecionado do grupo que consiste em glicose, xilose, manose, galactose e arabinose.

[0025] A presente descrição se refere a um processo para produzir um produto de fermentação que compreende ou que consiste em: (a) sacarificar um material celulósico pré-tratado com uma composição de enzima, em que o material celulósico pré-tratado é colocado em contato ou tratado com uma esterase de acordo com a presente descrição; (b) fermentar o material celulósico pré-tratado sacarificado com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação. Nas modalidades, a esterase compreende ou consiste em uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma esterase e feruloil esterase. Nas modalidades, a composição de esterase compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137 ou fragmentos deste com atividade de feruloil esterase. Nas modalidades, a composição de esterase consiste em SEQ ID NO: 133, SEQ ID. NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136 ou SEQ ID NO: 137 ou o polipeptídeo maduro desta. Nas modalidades, a feruloil esterase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em FAE(1), FAE- A, FAE-C e FAE-D. Nas modalidades, a feruloil esterase é FAE(1). Nas modalidades, a feruloil esterase é FAE-A. Nas modalidades, a feruloil esterase é FAE-C. Nas modalidades, a feruloil esterase FAE-D. Nas modalidades, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma laccase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina. Nas modalidades, a celulase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase. Nas modalidades, a hemicelulase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetixilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase. Nas modalidades, as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultânea. Em uma modalidade, o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido, um alcano, um cicloalcano, um alceno ou um gás.

[0026] A presente descrição se refere a um processo para fermentar um material celulósico pré-tratado que compreende: fermentar um material celulósico pré-tratado com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico pré-tratado é tratado, refinado e/ou sacarificado de acordo com a presente descrição. Nas modalidades, a fermentação do material celulósico pré-tratado produz um produto de fermentação. Nas modalidades, o processo compreende recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação. Nas modalidades, o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido, um alcano, um cicloalcano, um alceno ou um gás.

Definições

[0027] Enzima celulolítica ou celulase: O termo “enzima celulolítica” ou “celulase” significa uma ou mais (várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglucanase(s), celobioidrolase(s), beta-glucosidase(s), ou combinações destas. As duas abordagens básicas para avaliar a atividade celulolítica incluem: (1) avaliar a atividade celulolítica total, e (2) avaliar as atividades celulolíticas individuais (endoglucanases, celobioidrolases e beta-glucosidases) da maenira revisada em Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade celulolítica total é em geral avaliada usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman N°1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de alga, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio de atividade celulolítica total mais comum é o ensaio com papel de filtro, que usa o papel de filtro Whatman N°1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pelo International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

[0028] Com propósitos da presente descrição, a atividade da enzima celulolítica é determinada medindo o aumento na hidrólise de um material celulolítico pela(s) enzima(s) celulolítica(s) nas condições a seguir: 1-20 mg de proteína enzimática celulolítica/g de celulose em PCS por 3-7 dias a 50°C comparada a uma hidrólise controle sem a adição de proteína enzimática celulolítica. As condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavado ou não lavado, 5 % de sólidos insolúveis, acetato de sódio 50 mM em pH 5, MnSO4 1 mM, 50°C, 72 horas, análise de açúcar por coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

[0029] Endoglucanase: O termo “endoglucanase” significa uma endo- 1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glicano 4-glicanoidrolase (E.C. 3.2.1.4), que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como carboximetil celulose e hidroxietil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicanos mistos, tais como beta-D-glicanos ou xiloglicanos de cereal e outro material vegetal contendo componentes celulolíticos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada medindo a redução na viscosidade do substrato ou o aumento na redução das extremidades determinado por um ensaio de redução de açúcar (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Com propósitos da presente invenção, a atividade de endoglucanase é determinada usando carboximetil celulose (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure e Appl. Chem. 59: 257-268, em pH 5, 40°C.

[0030] Celobioidrolase: O termo “celobioidrolase” significa uma 1,4- beta-D-glicano celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91), que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celo-oligossacarídeos, ou qualquer polímero contendo glicose ligada a beta-1,4, que libera celobiose a partir das extremidades reduzidas ou não reduzidas da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). Com propósitos da presente invenção, a atividade de celobioidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581. Na presente invenção, o método de Lever et al. pode ser empregado para avaliar a hidrólise da celulose no resíduo de milho, enquanto os métodos de van Tilbeurgh et al. e Tomme et al. podem ser usados para determinar a atividade de celobioidrolase em um derivado dissacarídeo fluorescente, 4-metilumbeliferil-β-D-lactosideo.

[0031] Beta-glucosidase: O termo “beta-glucosidase” significa uma beta-D-glicosídeo glucoidrolase (E.C. 3.2.1.21), que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glicose não reduzida terminais com a liberação de beta-D- glicose. Com propósitos da presente invenção, a atividade de beta-glucosidase é determinada de acordo com o procedimento básico descrito por Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glucosidase é definida como 1,0 μmol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 25°C, pH 4,8, a partir de p-nitrofenil-beta-D-glicopiranosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 50 mM contendo TWEEN® 20 a 0,01 %.

[0032] Polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica: O termo “polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica” significa um polipeptídeo GH61 que catalisa a melhoria da hidrólise de um material celulósico por enzima que apresenta atividade celulolítica. Com propósitos da presente invenção, a melhor atividade celulolítica é determinada medindo o aumento nos açúcares redutores, ou o aumento do total de celobiose e glicose a partir da hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica nas condições a seguir: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em PCS, em que a proteína total é compreendida de 50-99,5 % p/p de proteína enzimática celulolítica, e 0,5-50 % p/p de proteína de um polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica por 1-7 dias a 50°C, comparado à uma hidrólise controle com carga igual de proteína total sem a melhor atividade celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto preferido, uma mistura de CELLUCLAST® 1,5L (Novozymes A/S, Bagsv^rd, Dinamarca) na presença de 2-3 % de peso proteico total de betaglucosidase de Aspergillus oryzae (produzida de maneira recombinante em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014) ou 2-3 % de peso proteico total de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (produzida de maneira recombinante em Aspergillus oryzae, da maneira descrita em WO 2002/095014) de carregamento de proteína celulase é usada como a fonte da atividade celulolítica.

[0033] Os polipeptídeos GH61 com melhor atividade celulolítica melhoram a hidrólise de um material celulolítico catalisado por enzima com atividade celulolítica, reduzindo a quantidade de enzima celulolítica exigida para atingir o mesmo grau de hidrólise, preferivelmente pelo menos 1,01 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,05 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,10 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,25 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,5 vez, mais preferivelmente pelo menos 2 vezes, mais preferivelmente pelo menos 3 vezes, mais preferivelmente pelo menos 4 vezes, mais preferivelmente pelo menos 5 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10 vezes, e acima de tudo preferivelmente pelo menos 20 vezes.

[0034] Família de glicosídeo hidrolase 61: O termo “Família de glicosídeo hidrolase 61” ou “família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo que está na família 61 de glicosídeo hidrolase de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on aminoacid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

[0035] Hemienzima celulolítica ou hemicelulase: O termo “hemienzima celulolítica” ou “hemicelulase” significa uma ou mais (várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Ver, por exemplo, Shallom, D. e Shoham, Y. Microbial hemicellulases. Current Opinion In Microbiology, 2003, 6(3): 219-228). As hemicelulases são componentes chave na degradação de biomassa vegetal. Os exemplos de hemicelulases incluem, mas sem limitação, uma acetilmanana esterase, uma acetixilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase. Os substratos destas enzimas, as hemiceluloses, são um grupo heterólogo de polissacarídeos ramificados e lineares que são ligados por meio de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular da planta, reticulando-as em uma rede forte. As hemiceluloses também são anexadas covalentemente à lignina, formando junto com a celulose uma estrutura muito complexa. A estrutura e organização variáveis de hemiceluloses exige a ação correta de muitas enzimas para sua degradação completa. Os módulos catalíticos das hemicelulases são tanto as glicosídeo hidrolases (GHs) que hidrolisam as ligações glicosídicas, quanto as carboidrato esterases (CEs), que hidrolisam as ligações de éster dos grupos laterais de acetato ou ácido ferúlico. Estes módulos catalíticos, com base na homologia de sua sequência principal, podem ser determinados nas famílias GH e CE, marcados por números. Algumas famílias, com dobramento similar completo, podem ser agrupadas adicionalmente em clãs, marcadas alfabeticamente (por exemplo, GH-A). Uma classificação mais atualizada e informativa destas e outras enzimas ativas em carboidrato está disponível na base de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades da enzima hemicelulolítica podem ser avaliadas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & AppI. Chem. 59: 1739-1752.

[0036] Atividade de degradação de xilano ou atividade xilanolítica: O termo “atividade de degradação de xilano” ou “atividade xilanolítica” significa uma atividade biológica que hidrolisa o material contendo xilano. As duas abordagens básicas para avaliar a atividade xilanolítica incluem: (1) avaliar a atividade xilanolítica total, e (2) avaliar as atividades xilanolíticas individuais (por exemplo, endoxilanases, beta-xilosidases, arabinofuranosidases, alfa-glucuronidases, acetil-xilano esterases, feruloil esterases, e alfa-glucuronil esterases). Recentes progressos nos ensaios de enzimas xilanolíticas foram sumarizados em várias publicações, incluindo Biely e Puchard, Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova e Biely, 2006, Glucuronoyl esterase - Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely, e Kubicek, 1997, The beta-D- xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xilan xylohydrolase, Biochemical Journal 321: 375-381.

[0037] A atividade total que degrada xilano pode ser medida determinando a redução de açúcares formada a partir de vários tipos de xilano incluindo, por exemplo, xilanos de espelta de aveia, madeira de faia e madeira de lariço, ou por determinação fotométrica de fragmentos de xilano corado liberados de vários xilanos covalentemente corados. O ensaio da atividade xilanolítica total mais comum baseia-se na produção de açúcares reduzidos de 4-O-metil glucuronoxilano polimérico, da maneira descrita em Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. A atividade de xilanase também pode ser determinada com 0,2 % de AZCL-arabinoxilano como substrato em Triton X-100 a 0,01 % e tampão fosfato de sódio 200 mM, pH 6, a 37°C. Uma unidade da atividade de xilanase é definida como 1,0 μmol de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilano a 0,2 % como substrato em tampão fosfato de sódio 200 mM pH 6.

[0038] Com propósitos da presente invenção, a atividade que degrada xilano é determinada medindo o aumento na hidrólise de xilano de vidoeiro (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, USA) por enzima(s) que degrada(m) xilano nas condições típicas a seguir: reações de 1 mL, 5 mg/mL de substrato (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolítica/g de substrato, acetato de sódio 50 mM em pH 5, 50°C, 24 horas, análise de açúcar usando o ensaio de hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) da maneira descrita por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47: 273-279.

[0039] Xilanase: O termo “xilanase” significa uma 1,4-beta-D-xilano- xiloidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise das ligações 1,4-beta- D-xilosídicas em xilanos. Com propósitos da presente invenção, a atividade de xilanase é determinada com AZCL-arabinoxilano a 0,2 % como substrato em Triton X-100 a 0,01 %, e tampão fosfato de sódio 200 mM pH 6 a 37°C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 μmol de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilano a 0,2 % como substrato, em tampão fosfato de sódio 200 mM pH 6.

[0040] Beta-xilosidase: O termo “beta-xilosidase” significa uma beta- D-xilosídeo xiloidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exo-hidrólise de beta ^(4)-xilo-oligossacarídeos curtas para remover sucessivos resíduos de D- xilose a partir das terminações não reduzidas. Com propósitos da presente invenção, uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 μmol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 40°C, pH 5, a partir de p-nitrofenil- beta-D-xilosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 100 mM contendo TWEEN® 20 0,01 %.

[0041] Esterase: O termo “esterase” significa uma enzima hidrolase que divide os ésteres em um ácido e um álcool, em uma reação química com água, denominada hidrólise. O termo também refere-se à enzima denominada hidrolases de éster carboxílico, que se refere às enzimas que agem nas ligações de éster, e inclui enzimas classificadas em hidrolase de éster carboxílico EC 3.1.1 de acordo com Enzyme Nomenclature (disponível em http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme ou a partir de Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, Califórnia, com o suplemento 1 (1993), suplemento 2 (1994), suplemento 3 (1995), suplemento 4 (1997) e suplemento 5, em Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250; 1- 6, e Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente). Os exemplos não limitantes de esterases incluem carboxilesterase, arilesterase, triacilglicerol lipase, acetilesterase, acetilcolinesterase, colinesterase, tropinesterase, pectinesterase, esterol esterase, clorofilase, L- arabinonolactonase, gluconolactonase, uronolactonase, tanase, retinil- palmitato esterase, dímero de hidroxibutirato-hidrolase, acilglicerol lipase, 3- oxoadipato enol-lactonase, 1,4-lactonase, galactolipase, 4-piridoxolactonase, acilcarnitina hidrolase, aminoacil-RNAt hidrolase, D-arabinonolactonase, 6- fosfogluconolactonase, fosfolipase A1, 6-acetilglucose desacetilase, lipoproteína lipase, diidrocoumarina lipase, limonina-D-anel-lactonase, esteróide-lactonase, triacetato-lactonase, actinomicina lactonase, orselinato- depsídeo hidrolase, cefalosporina-C desacetilase, clorogenato hidrolase, alfa- aminoácido esterase, 4-metiloxaloacetato esterase, carboximetilenobutenolidase, desoxilimonato A-anel-lactonase, 2-acetil-1- alquilglicerofosfocolina esterase, fusarinina-C ornitinesterase, sinapina esterase, cera-éster hidrolase, forbol-diéster hidrolase, fosfatidilinositol desacilase, sialato O-acetilesterase, acetoxibutinilbitiofeno desacetilase, acetilsalicilato desacetilase, metilumbeliferil-acetato desacetilase, 2-pirona- 4,6-dicarboxilato lactonase, N-acetilgalactosaminoglicano desacetilase, esterase do hormônio juvenil, bis(2-etilexil)ftalato esterase, proteína- glutamato metilesterase, 11-cis-retinil-palmitato hidrolase, all-trans-retinil- palmitato hidrolase, L-ramnono-1,4-lactonase, 5-(3,4-diacetoxibut-1-inil)- 2,2'-bitiofeno desacetilase, acil graxo-etil-éster sintase, xilono-1,4-lactonase, N-acetilglucosaminilfosfatidilinositol desacetilase, cetraxato benzilesterase, acetilalquilglicerol acetil-hidrolase e acetilxilano esterase. Os exemplos não limitantes de esterase incluem hidrolases de éster carboxílico classificadas em EC 3.1.1.1, por meio de, e incluindo, EC3.1.1.85 de acordo com o Enzyme Nomenclature (disponível em uma página da internet com o endereço www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme). As esterases apresentam ampla especificidade e também podem hidrolisar ésteres de vitamina A. As esterases também podem ser originadas de microssomos que também catalisam as reações de EC 3.1.1.2, EC 3.1.1.5, EC 3.1.1.6, EC 3.1.1.23, EC 3.1.1.28, EC 3.1.2.2, EC 3.5.1.4 e EC 3.5.1.13.

[0042] Acetilxilano esterase: O termo “acetil-xilano esterase” significa uma carboxilesterase (EC 3.1.1.72) que catalisa a hidrólise de grupos acetila a partir de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de alfa- naftila e acetato de p-nitrofenila. Com propósitos da presente invenção, a atividade de acetil-xilano esterase é determinada usando p-nitrofenilacetato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, contendo TWEEN™ 20 0,01 %. Uma unidade de acetil-xilano esterase é definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de ânion p-nitrofenolato por minuto em pH 5, 25°C.

[0043] Feruloil esterase: O termo “feruloil esterase” significa uma 4- hidróxi-3-metoxicinamoil-açúcar hidrolase (EC 3.1.1.73), que catalisa a hidrólise do grupo 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloil) a partir um açúcar esterificado, que é em geral arabinose em substratos “naturais”, para produzir ferulato (4-hidróxi-3-metoxicinamato). A feruloil esterase também é conhecida como ésteres de ácido ferúlico, hidroxicinamoil esterase, FAE-III, cinamoil éster hidrolase, FAEA, cinnAE, FAE-I, ou FAE-II. Os exemplos não limitantes de feruloil esterase para uso de acordo com a presente descrição são apresentados a seguir. Com propósitos da presente descrição, a atividade de feruloil esterase é determinada usando p-nitrofenilferulato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 mM, pH 5,0. Uma unidade de feruloil esterase é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de ânion p - nitrofenolato por minuto em pH 5, 25°C.

[0044] Alfa-glucuronidase: O termo “alfa-glucuronidase” significa uma alfa-D-glucosiduronato glucuronoidrolase (EC 3.2.1.139) que catalisa a hidrólise de um alfa-D-glucuronosídeo em D-glucuronato e um álcool. Com propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-glucuronidase é determinada de acordo com de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Uma unidade de alfa-glucuronidase é igual a quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de ácido glucurônico ou 4-O-metilglucurônico por minuto em pH 5, 40°C.

[0045] Alfa-L-arabinofuranosidase: O termo “alfa-L- arabinofuranosidase” significa uma alfa-L-arabinofuranosídeo arabinofuranoidrolase (EC 3.2.1.55) que catalisa a hidrólise de resíduos de alfa-L-arabinofuranosídeo não reduzidos terminais em alfa-L-arabinosídeos. A enzima age em alfa-L-arabinofuranosídeos, alfa-L-arabinanos contendo ligações (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. A alfa-L- arabinofuranosidase é também conhecida como arabinosidase, alfa- arabinosidase, alfa-L-arabinosidase, alfa-arabinofuranosidase, polissacarídeo de alfa-L-arabinofuranosidase, alfa-L-arabinofuranosídeo hidrolase, L- arabinosidase, ou alfa-L-arabinanase. Com propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-L-arabinofuranosidase é determinada usando 5 mg de arabinoxilano de trigo de viscosidade média (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Irlanda) por mL de acetato de sódio 100 mM, pH 5, em um volume total de 200 μL por 30 minutos a 40°C, seguido por análise de arabinose por cromatografia de coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

[0046] Material celulósico: O material celulolítico pode ser qualquer material contendo celulose. O polissacarídeo predominante na parede celular primária da biomassa é a celulose, o segundo mais abundante é a hemicelulose e o terceiro é a pectina. A parede celular secundária, produzida após a célula parar de crescer, também contém polissacarídeos e é reforçada por lignina polimérica covalentemente reticulada em hemicelulose. A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e, assim, um beta-(1-4)-D-glicano linear, enquanto as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos e mananas em estruturas ramificadas complexas com um espectro de substituintes. Embora em geral polimórfica, a celulose é encontrada no tecido vegetal principalmente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias paralelas de glicano. As hemiceluloses em geral ligam hidrogênio à celulose, bem como a outras hemiceluloses, o que ajuda a estabilizar a matriz da parede celular. As células de plantas mortas também podem ser referidas como fibras ou fibras celulósicas. As paredes celulares são compostas por camadas, as quais são montadas por fibrilas, hemicelulose e lignina. As fibrilas são compostas principalmente por celulose com menores quantidades de hemicelulose e lignina.

[0047] A celulose é encontrada em geral, por exemplo, nos caules, folhas, sépalas, cascas e sabugos de plantas ou folhas, ramos e madeira de árvores. O material celulolítico pode ser, mas sem limitação, material herbáceo, resíduo agrícola, resíduo florestal, resíduo sólido municipal, resíduo de papel, e resíduo de fabricação de polpa e papel (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volume 65, pp.2340, Springer-Verlag, Nova Iorque). Entende-se aqui que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material de parede celular de planta contendo lignina, celulose e hemicelulose em uma matriz mista. Em um aspecto preferido, o material celulolítico é lignocelulose.

[0048] Em um aspecto, o material celulolítico é material herbáceo. Em um outro aspecto, o material celulolítico é resíduo agrícola. Em um outro aspecto, o material celulolítico é resíduo florestal. Em um outro aspecto, o material celulolítico é resíduo sólido municipal. Em um outro aspecto, o material celulolítico é resíduo de papel. Em um outro aspecto, o material celulolítico é resíduo de fabricação de polpa e papel.

[0049] Em um outro aspecto, o material celulósico são as folhosas. Em um outro aspecto, o material celulósico são lascas de folhosas. Em um outro aspecto, o material celulósico é polpa de folhosa. Em um outro aspecto, o material celulósico é conífera. Em um outro aspecto, o material celulósico é lasca de conífera. Em um outro aspecto, o material celulósico é polpa de conífera.

[0050] Em um outro aspecto, o material celulósico é um subproduto da indústria de polpa e papel. Em um outro aspecto, o material celulósico é um subproduto de fibra virgem da indústria de polpa e papel. Em um outro aspecto, o material celulósico é um subproduto reciclado da indústria de polpa e papel.

[0051] Em um outro aspecto, o material celulósico é uma fibra contendo celulose. Em um outro aspecto, o material celulósico é um material fibroso contendo celulose.

[0052] Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é fibra de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é espiga de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é casca de laranja. Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de arroz. Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de trigo. Em um outro aspecto, o material celulósico é gramínea. Em um outro aspecto, o material celulósico é Miscanthus. Em um outro aspecto, o material celulósico é bagaço.

[0053] Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose microcristalina. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose bacteriana. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose de alga. Em um outro aspecto, o material celulósico é línter de algodão. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose tratada com ácido fosfórico amorfo. Em um outro aspecto, o material celulósico é papel de filtro.

[0054] O material celulósico pode ser usado como é, ou pode ser submetido ao pré-tratamento usando métodos convencionais conhecidos na técnica, da maneira aqui descrita. Em um aspecto preferido, o material celulósico é pré-tratado.

[0055] O material celulósico pode ser seco, pelo menos uma vez, em qualquer estágio da sua produção, antes de ser submetido ao processo de refinamento com auxílio enzimático. O material celulósico pode não ter sido seco nenhuma vez antes de ser submetido ao processo de refinamento com auxílio enzimático.

[0056] Material celulósico pré-tratado: O termo material celulósico pré-tratado significa qualquer material celulósico que foi tratado na preparação por processamento adicional. Os exemplos não limitantes de material celulósico pré-tratado incluem material celulósico tratado por uma ou mais etapas de pré-tratamentos químicos, enzimáticos, mecânicos ou físicos na preparação para hidrólise enzimática.

[0057] Resíduo de milho pré-tratado: O termo “PCS” ou “resíduo de milho pré-tratado” significa um material celulósico derivado do resíduo de milho por tratamento com calor e ácido sulfúrico diluído.

[0058] Isolado ou purificado: O termo “isolado” ou “purificado” significa um polipeptídeo ou polinucleotídeo que é removido de pelo menos um componente com o qual é naturalmente associado. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser pelo menos 1 % puro, por exemplo, pelo menos 5 % puro, pelo menos 10 % puro, pelo menos 20 % puro, pelo menos 40 % puro, pelo menos 60 % puro, pelo menos 80 % puro, pelo menos 90 % puro, ou pelo menos 95 % puro, da maneira determinada por SDS-PAGE, e um polinucleotídeo pode ser pelo menos 1 % puro, por exemplo, pelo menos 5 % puro, pelo menos 10 % puro, pelo menos 20 % puro, pelo menos 40 % puro, pelo menos 60 % puro, pelo menos 80 % puro, pelo menos 90 % puro, ou pelo menos 95 % puro, da maneira determinada por eletroforese em agarose.

[0059] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após a tradução e qualquer das modificações pós-translacionais, tal como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente), expressos pelo mesmo polinucleotídeo. O polipeptídeo maduro pode ser previsto usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6).

[0060] Sequência que codifica o polipeptídeo maduro: O termo “sequência que codifica o polipeptídeo maduro” é aqui definido como uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo maduro com atividade biológica. A sequência que codifica o polipeptídeo maduro pode ser prevista usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra).

[0061] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”.

[0062] Com propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre as duas sequências de aminoácidos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferivelmente a versão 3.0.0 ou superior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUM62). O rendimento da “maior identidade” marcado em Needle (obtido usando a opção não resumida) é usado como a identidade percentual e é calculado da maneira a seguir: (Resíduos idênticos x 100)/(Tamanho do alinhamento - Número total de intervalos em alinhamento)

[0063] Com propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra), da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferivelmente a versão 3.0.0 ou superior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (EMBOSS versão de NCBI NUC4.4). O rendimento da “maior identidade” marcada por Needle (obtido usando a opção não resumida) é usado como a identidade percentual e é calculado da maneira a seguir: (Desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(Tamanho do alinhamento - Número total de intervalos em alinhamento)

[0064] Fragmento de polipeptídeo: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo que apresenta um ou mais (vários) aminoácidos eliminados das terminações amino e/ou carboxil de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento apresenta atividade biológica.

[0065] Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotídeo que apresenta um ou mais (vários) nucleotídeos eliminados da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência que codifica o polipeptídeo maduro, em que a subsequência codifica um fragmento com atividade biológica.

[0066] Variante alélico: O termo “variante alélico” significa qualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossômico. A variação alélica se origina naturalmente por meio de mutação, e pode resultar em polimorfismo nas populações. As mutações no gene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado), ou podem codificar polipeptídeos com sequências alteradas de aminoácido. Um variante alélico de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por um variante alélico de um gene.

[0067] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As extremidades da sequência codificante são determinadas em geral por um quadro aberto de leitura, que em geral começa com o códon inicial ATG ou códons iniciais alternativos tais como GTG e TTG, e termina com um códon de parada tal como TAA, TAG e TGA. A sequência codificante pode ser um DNA, DNAc, polinucleotídeo sintético ou recombinante.

[0068] DNAc: O termo “DNAc” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula RNAm madura, unida obtida de uma célula de eucarioto ou de procarioto. O DNAc precisa de sequências intron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA inicial e primário é um precursor para o RNAm que é processado por meio de uma série de etapas, incluindo união, antes de aparecer como RNAm unido maduro.

[0069] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, tanto de fita simples quanto de fita dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não pode existir de outra forma na natureza ou que é sintética. O termo construto de ácido nucleico é sinônimo do termo “cassete de expressão” quando o construto de ácido nucleico contém as sequências de controle exigidas para a expressão de uma sequência codificante.

[0070] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa todos os componentes necessários para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo. Cada sequência de controle pode ser natural ou estrangeira ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou natural ou estrangeira uma a outra. Tais sequências de controle incluem, mas sem limitação, uma sequência líder, sequência de poliadenilação, sequência de pro-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal e terminador de transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de parada trasncricionais e translacionais. As sequências de controle podem ser fornecidas com ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências de controle com a região codificante do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

[0071] Operavelmente ligado: O termo “operavelmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição adequada com relação à sequência codificante de um polinucleotídeo, de maneira tal que a sequência de controle direcione a expressão da sequência codificante.

[0072] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-translacionais e secreção.

[0073] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, e é operavelmente ligada a nucleotídeos adicionais que fornecem sua expressão.

[0074] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que é susceptível à transformação, transfecção, transdução, e similares a um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo. O termo “célula hospedeira” inclui qualquer progênie de uma célula mãe que não é idêntica à célula mãe em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação.

[0075] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção, e/ou deleção de um ou mais (vários) resíduos de aminoácido em uma ou mais (várias) posições. Uma substituição significa uma alteração de um aminoácido que ocupa uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção de um aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa adicionar um ou mais (vários) aminoácidos, por exemplo, 1-5 aminoácidos, adjacentes a um aminoácido que ocupa uma posição.

[0076] Éster: O termo “éster” refere-se a um radical que apresenta a estrutura --C(O)O--, --C(O)O-Rj, --RkC(O)O--Rj--, ou --RkC(O)O--, onde O não está ligado ao hidrogênio, e Rj e Rk podem ser independentemente selecionados de alcóxi, arilóxi, alquila, alquenila, alquinila, amida, amino, arila, arilalquila, cicloalquila, éter, formila, haloalquila, halogênio, heteroarila, heterociclila, cetona, fosfato, sulfeto, sulfinila, sulfonila, ácido sulfônico e tiocetona. Rk pode ser um hidrogênio, mas Rj não pode ser hidrogênio. O éster pode ser cíclico, por exemplo, o átomo de carbono e Rj, o átomo de oxigênio e Rk, ou Rj e Rk podem ser unidos para formar um anel de 3 a 12 elementos. Os ésteres exemplares incluem, mas sem limitação, alquil ésteres em que pelo menos um de Rj ou Rk é alquila, tal como -alquil-C(O)--O--, --C(O)--O- alquil-, -alquil-C(O)--O-alquil-, etc. Os ésteres exemplares também incluem ésteres de arila ou heteroarila, por exemplo, em que pelo menos um de R, Rj ou Rk é um grupo heteroarila tal como piridina, piridazina, pirimidina e pirazina, tal como um éster de nicotinato. Os ésteres exemplares também incluem ésteres reversos que apresentam a estrutura -- Rk C(O)O--, onde o oxigênio é ligado ao grupo molecular parental. Os ésteres reversos exemplares incluem succinato, D-argininato, L-argininato, L-lisinato e D- lisinato. Os ésteres também incluem anidridos de ácido carboxílico e haletos ácidos.

[0077] Alcóxi: O termo “alcóxi”, da maneira aqui usada, refere-se a um grupo alquila anexado a um oxigênio (--O-alquil-). Os grupos “alcóxi” também incluem um grupo alquenila anexado a um oxigênio (“alquenóxi”), ou um grupo alquinila anexado a um grupo de oxigênio (“alquinóxi”). Os grupos alcóxi exemplares incluem, mas sem limitação, grupos com um grupo alquila, alquenila ou alquinila de 1-22, 1-8, ou 1-6 átomos de carbono, aqui referidos como (C1-C22)alcóxi, (C1-C8)alcóxi, e (C1-C6)alcóxi, respectivamente. Os grupos alcóxi exemplares incluem, mas sem limitação, metóxi, etóxi, etc.

[0078] Arilóxi: da maneira aqui usada, refere-se a um grupo arila anexado a um átomo de oxigênio. Os grupos arilóxi exemplares incluem, mas sem limitação, arilóxi com um sistema de anel aromático monocíclico, em que o anel compreende 6 átomos de carbono, aqui referidos como “(C6)arilóxi.”

[0079] Alquila: O termo “alquila”, da maneira aqui usada, refere-se a um hidrocarboneto saturado reto ou ramificado, tal como um grupo reto ou ramificado de 1-22, 1-8, ou 1-6 átomos de carbono, aqui referidos como (C1- C22)alquila, (C1-C8)alquila, e (C1-C6)alquila, respectivamente. Os grupos alquila exemplares incluem, mas sem limitação, metila, etila, propila, isopropila, 2-metil-1-propila, 2-metil-2-propila, 2-metil-1-butila, 3-metil-1- butila, 2-metil-3-butila, 2,2-dimetil-1-propila, 2-metil-1-pentila, 3-metil-1- pentila, 4-metil-1-pentila, 2-metil-2-pentila, 3-metil-2-pentila, 4-metil-2- pentila, 2,2-dimetil-1-butila, 3,3-dimetil-1-butila, 2-etil-1-butila, butila, isobutila, t-butila, pentila, isopentila, neopentila, hexila, heptila, octila, etc.

[0080] Alquenila: O termo “alquenila”, da maneira aqui usada, refere-se a um hidrocarboneto insaturado reto ou ramificado que apresenta pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono, tal como um grupo reto ou ramificado de 2-22, 2-8, ou 2-6 átomos de carbono, aqui referidos como (C1-C22)alquenila, (C2-C8)alquenila, e (C2-C6)alquenila, respectivamente. Os grupos alquenila exemplares incluem, mas sem limitação, vinila, alila, butenila, pentenila, hexenila, butadienila, pentadienila, hexadienila, 2-etilexenila, 2-propil-2- butenila, 4-(2-metil-3-buteno)-pentenila, etc.

[0081] Alquinila: O termo “alquinila”, da maneira aqui usada, refere-se a um hidrocarboneto insaturado reto ou ramificado que apresenta pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono, tal como um grupo reto ou ramificado de 2-22, 2-8, ou 2-6 átomos de carbono, aqui referidos como (C2-C22)alquinila, (C2-C8)alquinila, e (C2-C6)alquinila, respectivamente. Os grupos alquinila exemplares incluem, mas sem limitação, etinila, propinila, butinila, pentinila, hexinila, metilpropinila, 4-metil-1-butinila, 4-propil-2-pentinila, e 4-butil-2- hexinila, etc.

[0082] Amida: O termo “amida”, da maneira aqui usada, refere-se a um radical da forma --RaC(O)N(Rb)--, --RaC(O)N(Rb)Rc--, ou --C(O)NRbRc, em que Rb e Rc são cada qual independentemente selecionados de alcóxi, arilóxi, alquila, alquenila, alquinila, amida, amino, arila, arilalquila, carbamato, carbóxi, ciano, cicloalquila, éster, éter, formila, halogênio, haloalquila, heteroarila, heterociclila, hidrogênio, hidroxila, cetona, nitro, fosfato, sulfeto, sulfinila, sulfonila, ácido sulfônico, sulfonamida e tiocetona. A amida pode ser anexada a um outro grupo por meio do carbono, do nitrogênio, Rb, Rc ou Ra. A amida também pode ser cíclica, por exemplo Rb e Rc, Ra e Rb, ou Ra e Rc podem ser unidos para formar um anel de 3 a 12 elementos, tal como um anel de 3 a 10 elementos ou um anel de 5 a 6 elementos. O termo “amida” inclui grupos tais como sulfonamida, ureia, carbamato, ácido carbâmico e versões cíclicas destes. O termo “amida” também inclui um grupo amida anexado a um grupo carbóxi, por exemplo, -amida-COOH ou sais tal como -amida- COONa, etc, um grupo amino anexado a um grupo carbóxi, por exemplo, - amino-COOH ou sais tal como -amino-COONa, etc.

[0083] Amino: O termo “amina” ou “amino”, da maneira aqui usada, refere-se a um radical da forma --N Rd Re, --N(Rd) Re--, ou -- Re N(Rd) Rf -onde Rd, Re, e Rf são independentemente selecionados de alcóxi, arilóxi, alquila, alquenila, alquinila, amida, amino, arila, arilalquila, carbamato, carbóxi, ciano, cicloalquila, éster, éter, formila, halogênio, haloalquila, heteroarila, heterociclila, hidrogênio, hidroxila, cetona, nitro, fosfato, sulfeto, sulfinila, sulfonila, ácido sulfônico, sulfonamida e tiocetona. O amino pode ser anexado ao grupo molecular parental por meio do nitrogênio, Rd, Re ou Rf. O amino também pode ser cíclico, por exemplo, qualquer de dois de Ra, Rb, e Rc podem ser unidos uns com os outros, ou com o N para formar um anel de 3 a 12 elementos, por exemplo, morfolino ou piperidinila. O termo amino também inclui o sal de amônio quaternário correspondente de qualquer grupo amino, por exemplo, --[N(Rd)(Re)(Rf)]+. Os grupos amino exemplares incluem os grupos aminoalquila, em que pelo menos um de Rd, Re, ou Rf é um grupo alquila.

[0084] Arila: O termo “arila”, da maneira aqui usada, refere-se a um sistema de anel aromático mono, bi ou outro multi-carbocíclico. O grupo arila pode ser opcionalmente fundido a um ou mais anéis selecionados de arilas, cicloalquilas e heterociclilas. Os grupos arila desta invenção podem ser substituídos pelos grupos selecionados de alcóxi, arilóxi, alquila, alquenila, alquinila, amida, amino, arila, arilalquila, carbamato, carbóxi, ciano, cicloalquila, éster, éter, formila, halogênio, haloalquila, heteroarila, heterociclila, hidroxila, cetona, nitro, fosfato, sulfeto, sulfinila, sulfonila, ácido sulfônico, sulfonamida e tiocetona. Os grupos arila exemplares incluem, mas sem limitação, fenila, tolila, antracenila, fluorenila, indenila, azulenila e naftila, bem como frações carbocíclicas fundidas ao benzo, tal como 5,6,7,8- tetraidronaftila. Os grupos arila exemplares também incluem, mas sem limitação, um sistema de anel aromático monocíclico, em que o anel compreende 6 átomos de carbono, aqui referidos como “(C6)arila”.

[0085] Arilalquila: O termo “arilalquila”, da maneira aqui usada, refere-se a um grupo arila que apresenta pelo menos um substituinte de alquila, por exemplo -aril-alquil-. Os grupo arilalquilas exemplares incluem, mas sem limitação, arilalquilas que apresentam um sistema de anel aromático monocíclico, em que o anel compreende 6 átomos de carbono, aqui referidos como “(C6)arilalquila”.

[0086] Cicloalquila: O termo “cicloalquila”, da maneira aqui usada, refere-se a um grupo hidrocarboneto monovalente saturado ou insaturado, cíclico, bicíclico ou com ponte bicíclica de 3-12 carbonos, ou 3-8 carbonos, aqui referidos como “(C3-C8)cicloalquila”, derivado de um cicloalcano. Os grupos de cicloalquila exemplares incluem, mas sem limitação, cicloexanos, cicloexenos, ciclopentanos e ciclopentenos. Os grupos de cicloalquilas podem ser substituídos por alcóxi, arilóxi, alquila, alquenila, alquinila, amida, amino, arila, arilalquila, carbamato, carbóxi, ciano, cicloalquila, éster, éter, formila, halogênio, haloalquila, heteroarila, heterociclila, hidroxila, cetona, nitro, fosfato, sulfeto, sulfinila, sulfonila, ácido sulfônico, sulfonamida e tiocetona. Os grupos grupo cicloalquilas podem ser fundidos a outros grupos de cicloalquila, arila ou heterociclila.

[0087] Éter: O termo “éter” refere-se a um radical que apresenta a estrutura -RiO--Rm--, onde Ri e Rm podem ser independentemente alquila, alquenila, alquinila, arila, cicloalquila, heterociclila ou éter. O éter pode ser anexado ao grupo molecular parental por meio de R1 ou Rm. Os éteres exemplares incluem, mas sem limitação, grupos alcoxialquila e alcoxiarilas. Os éteres também incluem poliéteres, por exemplo, onde um ou ambos de R1 e Rm são éteres.

[0088] Aldeído ou formila: O termo “aldeído” ou “formil”, da maneira aqui usada, refere-se ao radical -CHO.

[0089] Haloalquila: O termo “haloalquila”, da maneira aqui usada, refere-se a um grupo alquila substituído por um ou mais átomos de halogênio. “Haloalquilas” também incluem os grupos alquenila ou alquinila substituídos por um ou mais átomos de halogênio.

[0090] Halogênio: Os termos “halo”, ou “halogênio”, ou “Hal”, da maneira aqui usada, referem-se a F, Cl, Br ou I.

[0091] Heteroarila: O termo “heteroarila”, da maneira aqui usada, refere-se a um sistema de anel aromático mono, bi ou multi-cíclico que contém um ou mais heteroátomos, por exemplo, 1 a 3 heteroátomos, tais como nitrogênio, oxigênio e enxofre. As heteroarilas podem ser substituídas por um ou mais substituintes, incluindo alcóxi, arilóxi, alquila, alquenila, alquinila, amida, amino, arila, arilalquila, carbamato, carbóxi, ciano, cicloalquila, éster, éter, formila, halogênio, haloalquila, heteroarila, heterociclila, hidroxila, cetona, nitro, fosfato, sulfeto, sulfinila, sulfonila, ácido sulfônico, sulfonamida e tiocetona. As heteroarilas também podem ser fundidas aos anéis não aromáticos. Os exemplos ilustrativos de grupos heteroarila incluem, mas sem limitação, piridinila, piridazinila, pirimidila, pirazila, triazinila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, (1,2,3,)- e (1,2,4)- triazolila, pirazinila, pirimidilila, tetrazolila, furila, tienila, isoxazolila, tiazolila, furila, fenila, isoxazolila e oxazolila. Os grupos heteroarila exemplares incluem, mas sem limitação, um anel aromático monocíclico, em que o anel compreende 2 a 5 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos, aqui referidos como “(C2-C5)heteroarila”.

[0092] Heterociclila: O termos “heterociclo”, “heterociclila” ou “heterocíclico”, da maneira aqui usada, referem-se a um anel saturado ou insaturado de 3, 4, 5, 6 ou 7 elementos contendo um, dois ou tês heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio e enxofre. Os heterociclos podem ser aromáticos (heteroarilas) ou não aromáticos. Os heterociclos podem ser substituídos por um ou mais substituintes, incluindo alcóxi, arilóxi, alquila, alquenila, alquinila, amida, amino, arila, arilalquila, carbamato, carbóxi, ciano, cicloalquila, éster, éter, formila, halogênio, haloalquila, heteroarila, heterociclila, hidroxila, cetona, nitro, fosfato, sulfeto, sulfinila, sulfonila, ácido sulfônico, sulfonamida e tiocetona.

[0093] Cetona: O termo “cetona”, da maneira aqui usada, refere-se a um radical que apresenta a estrutura --C(O)--Rn tal como acetila, --C(O)CH3) ou - - Rn --C(O)-Ro --. A cetona pode ser anexada a um outro grupo por meio de Rn ou Ro. Rn ou Ro pode ser alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, heterociclila ou arila, ou Rn ou Ro podem ser unidos para formar um anel de 3 a 12 elementos.

[0094] Fosfato: O termo “fosfato”, da maneira aqui usada, refere-se a um radical que apresenta a estrutura --OP(O)O2--, --RxOP(O)O2--, -- OP(O)O2Ry--, ou --RxOP(O)O2Ry--, em que Rx e Ry podem ser alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, amida, amino, arila, arilóxi, carbóxi, ciano, cicloalquila, éster, éter, halogênio, heterociclila, hidrogênio, hidróxi, cetona, nitro, sulfonato, sulfonila e tio.

[0095] Sulfeto: O termo “sulfeto”. da maneira aqui usada, refere-se ao radical que apresenta a estrutura RzS--, onde Rz pode ser alcóxi, arilóxi, alquila, alquenila, alquinila, amida, amino, arila, arilalquila, carbamato, carbóxi, cicloalquila, éster, éter, formila, haloalquila, heteroarila, heterociclila e cetona. O termo “alquilsulfeto”, da maneira aqui usada, refere-se a um grupo alquila anexado a um átomo de enxofre.

[0096] Sulfinila: O termo “sulfinila”, da maneira aqui usada, refere-se a um radical que apresenta a estrutura --S(O)O--, --Rp(O)O--, --RpS(O)ORq--, ou --S(O)ORq--, em que Rp e Rs podem ser alcóxi, arilóxi, alquila, alquenila, alquinila, amida, amino, arila, arilalquila, cicloalquila, éster, éter, formila, halogênio, haloalquila, heteroarila, heterociclila, hidroxila, cetona, nitro, fosfato, sulfeto, sulfonila, ácido sulfônico, sulfonamida e tiocetona. Os grupos sulfinila exemplares incluem, mas sem limitação, alquilsulfinilas em que pelo menos um de Rp ou Rq é alquila, alquenila ou alquinila.

[0097] Sulfonila: O termo “sulfonil”, da maneira aqui usada, refere-se a um radical que apresenta a estrutura RuSO2--, onde Ru pode ser alquila, alquenila, alquinila, amino, amida, arila, cicloalquila e heterociclila, por exemplo, alquilsulfonila. O termo “alquilsulfonila”, da maneira aqui usada, refere-se a um grupo alquila anexado a um grupo sulfonila. Os grupo “alquilsulfonila” podem conter opcionalmente os grupos alquenila ou alquinila.

[0098] Ácido sulfônico: O termo “ácido sulfônico” refere-se ao radical --SO3H-- e seus sais correspondentes, por exemplo -SO3K--, --SO3Na--.

[0099] Tiocetona: O termo “tiocetona” refere-se a um radical que apresenta a estrutura --Rv--C(S)--Rw--. A cetona pode ser anexada a um outro grupo por meio de Rv ou Rw. Rv ou Rw podem ser alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, heterociclil ou arila, ou Rv ou Rw podem ser unidos para formar um anel de 3 a 12 elementos.

[00100] Hidróxi e hidroxila: Os termos “hidróxi” e “hidroxila”, da maneira aqui usada, referem-se ao radical --OH.

[00101] Hidrocarbonetos saturados e insaturados: Os grupos “alquila”, “alquenila” e “alquinila”, coletivamente referidos como “hidrocarbonetos saturados e insaturados”, podem ser substituídos ou interrompidos por pelo menos um grupo selecionado de alcóxi, arilóxi, alquila, alquenila, alquinila, amida, amino, arila, arilalquila, carbamato, carbóxi, ciano, cicloalquila, éster, éter, formila, halogênio, haloalquila, heteroarila, heterociclila, hidroxila, cetona, nitro, fosfato, sulfeto, sulfinila, sulfonila, ácido sulfônico, sulfonamida, tiocetona e N.

Descrição Detalhada da Invenção

[00102] A presente invenção se refere a um processo para refinamento enzimático de um material celulósico pré-tratado, incluindo: (a) colocar o material celulósico pré-tratado em contato com uma esterase e/ou composição de enzima esterase para formar um material celulósico pré-tratado refinado. Nas modalidades, uma esterase ou composição de enzima esterase preferida é uma feruloil esterase e/ou composição de feruloil esterase.

[00103] A presente invenção também se refere a um processo para refinamento enzimático de um material celulósico pré-tratado, incluindo: a) processar o material celulósico pré-tratado para formar uma mistura sólida/líquida de material celulósico pré-tratado; b) separar um licor da mistura sólida/líquida de material celulósico pré-tratado; e c) tratar o licor com um tratamento com feruloil esterase.

[00104] Em um aspecto, os processos da presente descrição incluem uma composição de enzima incluindo uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma esterase e/ou feruloil esterase. Os exemplos não limitantes de feruloil esterase adequada incluem as enzimas que apresentam um aminoácido que apresenta pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NOS: 133, 134, 135, 136 ou 137, ou fragmentos deste com atividade de feruloil esterase. Os exemplos não limitantes de feruloil esterase adequada incluem enzimas que apresentam um aminoácido que compreende ou que consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NOS: 133, 134, 135, 136 ou 137 ou fragmentos deste com atividade de feruloil esterase.

[00105] Um aspecto da presente descrição se refere a um processo para hidrolisar um material celulósico pré-tratado, incluindo sacarificar um material celulósico pré-tratado, tratado e refinado de acordo com a presente descrição, com uma enzima ou composição de enzima, incluindo a esterase e/ou feruloil esterase. Nas modalidades, o processo inclui recuperar o material celulósico pré-tratado sacarificado a partir da sacarificação. Nas modalidades, o material celulósico sacarificado é um açúcar tal como glicose, xilose, manose, galactose e arabinose.

[00106] Um aspecto da presente descrição se refere a um processo para produzir um produto de fermentação, incluindo: (a) sacarificar um material celulósico pré-tratado com uma composição de enzima, em que o material celulósico pré-tratado é tratado e refinado de acordo com a presente descrição com uma esterase e/ou feruloil esterase; (b) fermentar o material celulósico pré-tratado sacarificado com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação. Nas modalidades, a composição de enzima inclui uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma laccase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina. Nas modalidades, a celulase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase. Nas modalidades, a hemicelulase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetixilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

[00107] Um outro aspecto da presente descrição se refere a um processo para fermentar um material celulósico pré-tratado, incluindo: fermentar um material celulósico pré-tratado com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico pré-tratado é tratado, refinado e/ou sacarificado de acordo com a presente descrição com esterase e/ou feruloil esterase. Nas modalidades, a fermentação do material celulósico pré- tratado produz um produto de fermentação. Nas modalidades, a etapa de recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação é incluída. Nas modalidades, produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido, um alcano, um cicloalcano, um alceno ou um gás.

Pré-tratamento de material celulósico

[00108] O material celulósico adequado para uso de acordo com a presente descrição é pré-tratado com qualquer método adequado conhecido na técnica. Nas modalidades, o material celulósico e/ou o material contendo lignocelulose de acordo com a presente descrição, pode ser pré-tratado antes de ser hidrolisado e fermentado. O objetivo do pré-tratamento é separar e/ou liberar a celulose, hemicelulose e/ou lignina, e isto pode melhorar a taxa de hidrólise enzimática.

[00109] Sem querer ficar preso à presente descrição, acredita-se que o pré-tratamento convencional produz impurezas nos materiais celulósicos pré- tratados, e apresenta um efeito prejudicial nas enzimas celulase e/ou hidrólise de enzima. Os exemplos não limitantes de impurezas ou toxinas para as enzimas celulase incluem um ou mais ésteres no material celulósico pré- tratado. A presente descrição fornece meios para processar o material celulósico pré-tratado e melhorar a hidrólise do material celulósico pré- tratado.

[00110] O pré-tratamento de material celulósico refere-se a qualquer etapa de pré-tratamento convencional conhecida na técnica. O pré-tratamento pode ocorrer em lama aquosa ou pode ser aplicado diretamente no material celulósico na forma bruta. Nas modalidades, o material contendo celulose pode estar presente durante o pré-tratamento em uma quantidade entre 10-80 % em peso, por exemplo, entre 20-50 % em peso do peso total da reação de pré-tratamento.

Pré-tratamento químico, mecânico e/ou biológico

[00111] Os exemplos não limitantes de pré-tratamento de material celulósico de acordo com a presente descrição, incluem pré-tratar quimicamente, mecanicamente e/ou biologicamente o material celulósico antes da hidrólise e/ou fermentação. O tratamento mecânico (frequentemente referido como pré-tratamento físico) pode ser usado sozinho ou em combinação com hidrólise subsequente ou simultânea, especialmente hidrólise enzimática, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina.

[00112] Nas modalidades, o pré-tratamento químico, mecânico e/ou biológico é realizado antes da hidrólise e/ou fermentação. Alternativamente, o pré-tratamento químico, mecânico e/ou biológico é realizado simultaneamente com hidrólise, tal como simultaneamente com a adição de uma ou mais enzimas celulolíticas, ou outras atividades de enzima mencionadas a seguir, para a liberação açúcares fermentáveis, tais como glicose e/ou maltose.

[00113] Em uma modalidade da presente descrição, o material celulósico pré-tratado é lavado e/ou desintoxicado de acordo com a presente descrição antes, durante ou após a etapa de hidrólise. Isto pode melhorar a fermentabilidade, por exemplo, do material contendo lignocelulose hidrolisado com ácido diluído, tal como resíduo de milho. De acordo com a presente descrição, a desintoxicação é realizada colocando o material celulósico pré-tratado em contato com uma enzima ou composição de enzima, incluindo uma esterase e/ou feruloil esterase, para formar um material celulósico pré-tratado refinado (enzima).

[00114] De acordo com a presente descrição, a desintoxicação é realizada colocando o material celulósico pré-tratado em contato com uma enzima ou composição de enzima, incluindo uma esterase e/ou feruloil esterase, para formar um material celulósico pré-tratado refinado (enzima).

Pré-tratamento químico

[00115] De acordo com a presente descrição, “pré-tratamento químico” refere-se a qualquer tratamento químico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina. Os exemplos não limitantes adequados das etapas de pré-tratamento químico incluem o tratamento, por exemplo, com ácido diluído, cal, alcalino, solvente orgânico, amônia, dióxido de enxofre, dióxido de carbono. Adicionalmente, a oxidação úmida e a hidrotermólise controlada pelo pH são também pré-tratamentos químicos contemplados.

[00116] Nas modalidades, o pré-tratamento químico é o tratamento com ácido, por exemplo, um tratamento com ácido diluído e/ou fraco contínuo tal como o tratamento com ácido sulfúrico ou um outro ácido orgânico, tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succínico, ou misturas destes. Outros ácidos também podem ser usados. O tratamento com ácido fraco significa, no contexto da presente descrição, que o pH do tratamento está na faixa de 1-5, por exemplo, de pH 1-3. Em uma modalidade específica, a concentração do ácido está na faixa de 0,1 a 2,0 % em peso de ácido, por exemplo, ácido sulfúrico. O ácido pode ser misturado ou colocado em contato com o material a ser fermentado de acordo com a presente descrição, e ao mistura pode ser mantida em uma temperatura na faixa de 160-220°C, por exemplo, 165-195°C, por períodos que variam de minutos a segundos, por exemplo, 1-60 minutos, por exemplo, 2-30 minutos ou 3-12 minutos. A adição de ácidos fortes, tal como ácido sulfúrico, pode ser aplicada para remover a hemicelulose. Isto melhora a digestibilidade da celulose.

[00117] O tratamento da celulose com solvente, também contemplado de acordo com a presente descrição, mostrou converter cerca de 90 % de celulose em glicose. Também mostrou que a hidrólise enzimática pode ser muito melhor quando a estrutura lignocelulolítica é quebrada. H2O2 alcalino, ozônio, organosolve (usa ácidos de Lewis, FeCl3, (Al)2SO4 em álcoois aquosos), glicerol, dioxano, fenol ou etileno glicol estão entre os solventes conhecidos por quebrar a estrutura da celulose e promover a hidrólise (Mosier et al. Bioresource Technology 96 (2005), p. 673-686).

[00118] O pré-tratamento químico alcalino com base, por exemplo, NaOH, Na2CO3 e/ou amônia ou similares, também está no escopo da presente descrição. Os métodos do pré-tratamento usando amônia são descritos, por exemplo, em WO 2006/110891, WO 2006/11899, WO 2006/11900, WO 2006/110901, que são aqui incorporados pela referência na sua íntegra.

[00119] As técnicas de oxidação úmida envolvem o uso de agentes de oxidação tai como: agentes de oxidação a base de sulfito ou similares. Os exemplos não limitantes de pré-tratamentos com solvente incluem o tratamento com DMSO (Dimetil sulfóxido) ou similares. O pré-tratamento químico é realizado em geral por 1 a 60 minutos, tal como de 5 a 30 minutos, mas pode ser realizado por períodos de tempo mais curtos ou mais longos, dependendo do material a ser pré-tratado.

[00120] Outros exemplos não limitantes de métodos adequados de pré- tratamento são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem e Biotechn. Vol. 105-108: 69-85, e Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, e publicação U.S. 2002/0164730, cujas referências são todas aqui incorporadas pela referência na sua íntegra.

[00121] De acordo com a presente descrição, a desintoxicação é realizada colocando o material celulósico pré-tratado em contato com uma enzima ou composição de enzima, incluindo uma esterase e/ou feruloil esterase, para formar um material celulósico pré-tratado refinado (enzima). Pré-tratamento mecânico

[00122] Da maneira usada no contexto da presente descrição, o termo “pré-tratamento mecânico” refere-se a qualquer pré-tratamento mecânico ou físico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina, a partir do material contendo lignocelulose. Os exemplos não limitantes de pré-tratamento mecânico incluem vários tipos de moagem, irradiação, explosão vaporizante/por vapor e hidrotermólise.

[00123] O pré-tratamento mecânico inclui a cominuição (redução mecânica do tamanho da partícula). A cominuição inclui moagem seca, moagem úmida e moagem com bola vibratória. O pré-tratamento mecânico pode envolver pressão elevada e/ou alta temperatura (explosão de vapor). Em uma modalidade da presente descrição, a pressão elevada significa pressão na quantidade de 300 a 600 psi (2,1 MPa a 4,1 MPa), por exemplo, 400 a 500 psi (2,8 a 3,5 MPa) ou, por exemplo, em torno de 450 psi (3,1 MPa). Em uma modalidade da presente descrição, alta temperatura significa temperaturas na quantidade de cerca de 100 a 300°C, por exemplo, de cerca de 140 a 235°C. Nas modalidades, o pré-tratamento mecânico é um processo em lotes, sistema hidrolisador de pistola de vapor que usa pressão elevada e alta temperatura, da maneira definida anteriormente. Um hidrolisador Sunds (disponível pela Sunds Defibrator AB (Suécia) pode ser usado para isto.

[00124] De acordo com a presente descrição, a desintoxicação é realizada colocando o material celulósico pré-tratado em contato com uma enzima ou composição de enzima, incluindo uma esterase e/ou feruloil esterase, para formar um material celulósico pré-tratado refinado (enzima). Pré-tratamento químico e mecânico combinado

[00125] Em modalidades da presente descrição, tantos os pré-tratamentos químicos quanto mecânicos são realizados envolvendo, por exemplo, tanto o pré-tratamento com ácido diluído ou fraco quanto o tratamento em alta temperatura e pressão. O pré-tratamento químico e mecânico pode ser realizado sequencialmente ou simultaneamente, se desejado.

[00126] Dessa maneira, nas modalidades, o material contendo celulose é submetido tanto ao pré-tratamento químico quanto mecânico para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina.

[00127] Nas modalidades, o pré-tratamento é realizado como uma etapa de explosão de vapor com ácido diluído e/ou fraco. Nas modalidades, o pré- tratamento é realizado como uma etapa de explosão de fibra de amônia (ou etapa de pré-tratamento AFEX).

[00128] De acordo com a presente descrição, a desintoxicação é realizada colocando o material celulósico pré-tratado em contato com uma enzima ou composição de enzima, incluindo uma esterase e/ou feruloil esterase, para formar um material celulósico pré-tratado refinado (enzima). Pré-tratamento biológico

[00129] Da maneira usada na presente descrição, o termo “pré-tratamento biológico” refere-se a qualquer pré-tratamento biológico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina a partir do material contendo lignocelulose. As técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver a aplicação de microrganismos que solubilizam lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh, P., and Singh, A., 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., and Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., and Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson, L., and Hahn-Hagerdal, B., 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; and Vallander, L., and Eriksson, K.-E. L., 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

[00130] Nas modalidades, o pré-tratamento biológico envolve aplicar enzimas que degradam lignina em lignina ou material pré-tratado. Os exemplos não limitantes adequados de enzimas que degradam lignina incluem uma ou mais enzimas lignolíticas, uma ou mais oxidorredutases, e combinações destas. Os exemplos não limitantes de enzimas lignolíticas incluem manganês peroxidase, lignina peroxidase e celobiose desidrogenase, e combinações destas. Os exemplos não limitantes adequados de enzimas para pré-tratamento também incluem uma ou mais laccases, celobiose desidrogenases e combinações destas.

[00131] Nas modalidades, a lignina peroxidase tal como “ligninase”, número de 1.14.99, é adequada para uso de acordo com a presente descrição.

[00132] Em uma modalidade, EthazymeTM Pre disponível pela Zymetis é adequada para uso no pré-tratamento de acordo com a presente descrição.

[00133] De acordo com a presente descrição, a desintoxicação é realizada colocando o material celulósico pré-tratado em contato com uma enzima e/ou composição de enzima incluindo uma esterase e/ou feruloil esterase para formar um material celulósico pré-tratado refinado (enzima).

Tratamento de material celulósico pré-tratado

[00134] A presente descrição se refere a um processo para refinamento enzimático de um material celulósico pré-tratado, que compreende ou que consiste em (a) colocar o material celulósico pré-tratado em contato com uma enzima esterase ou composição de enzima esterase para formar um material celulósico pré-tratado refinado. Sem querer ficar preso à presente descrição, acredita-se que o pré-tratamento de material celulósico aumenta as impurezas no material celulósico que podem diminuir a hidrólise de enzima do material. Por exemplo, os ésteres podem estar presentes no material celulósico pré- tratado em uma quantidade suficiente para apresentar um efeito negativo nas enzimas celulase usadas na hidrólise. A presente descrição fornece enzimas e composições de enzima, e métodos para tratar, remover ou eliminar as toxinas no material celulósico pré-tratado. O processo inclui aplicar uma quantidade pré-determinada de enzima esterase ao material celulósico pré-tratado que precisa de tratamento, incluindo material celulósico pré-tratado com celulase que inibe quantidades de ésteres neste.

[00135] Dessa maneira, esterase(s) e/ou composições de esterase de acordo com a presente descrição, fornecem um tratamento de ésteres e/ou toxinas em que o principal ingrediente ativo é a enzima esterase, tal como feruloil esterase. Nas modalidades, as composições de acordo com a presente descrição incluem feruloil esterase em uma forma comercialmente disponível.

[00136] Nas modalidades, a esterase ou composições de esterase de acordo com a presente descrição podem ser aplicadas ao material celulósico pré-tratado que precisa de melhoria, por exemplo, tal como a redução ou eliminação de uma toxina indesejável tal como um ou mais ésteres. Da maneira aqui usada, a palavra “tratar”, “tratando” ou “tratamento” refere-se a usar a uma ou mais esterase ou composições de esterase da presente descrição, profilaticamente, para prevenir que as toxinas tais como ésteres se acumulem no material celulósico pré-tratado, ou para melhorar uma condição tóxica existente, e/ou promover ou estender a atividade de celulase da enzima celulase usada para hidrolisar o material celulósico pré-tratado. Inúmeros tratamentos diferentes são agora possíveis, os quais reduzem e/ou eliminam toxinas a partir do material de celulose pré-tratado, e/ou licor separado do material celulósico pré-tratado.

[00137] Os tratamentos de acordo com a presente descrição colocam o material celulósico pré-tratado ou uma porção isolada deste, tal como um fluxo líquido, em contato com uma ou mais enzimas esterase ativas, tal como feruloil esterase de acordo com a presente descrição, em uma quantidade eficiente para melhorar as condições tóxicas. Nas modalidades, o material celulósico pré-tratado ou uma porção isolada deste é/são tratado(s) colocando o material tóxico em contato com um ou mais feruloil esterase de acordo com a presente descrição. O ingrediente ou composição de esterase é aplicado até os objetivos do tratamento serem obtidos. Entretanto, a duração do tratamento pode variar dependendo da gravidade da condição tóxica ou quantidade de éster(s) presente na amostra. Por exemplo, os tratamentos podem demorar vários minutos a dias, dependendo se op objetivo do tratamento é reduzir ou eliminar a condição tóxica.

[00138] Nas modalidades, a enzima esterase ou composição de esterase compreende ou consiste em uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma esterase e feruloil esterase. As composições de esterase podem compreender qualquer proteína esterase que é usada na desintoxicação de um material celulósico pré-tratado.

[00139] Nas modalidades, a feruloil esterase é adequada para uso de acordo com a presente descrição, o que se refere em geral a uma 4-hidróxi-3- metoxicinamoil-açúcar hidrolase (EC 3.1.1.73) que catalisa a hidrólise do grupo 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloil) a partir de um açúcar esterificado, que é em geral arabinose em substratos “naturais”, para produzir ferulato (4-hidróxi-3-metoxicinamato). A feruloil esterase é também conhecida como ácido ferúlico esterase, hidroxicinamoil esterase, FAE-III, cinamoil éster hidrolase, FAEA, cinnAE, FAE-I ou FAE-II. Os exemplos não limitantes de feruloil esterase para uso de acordo com a presente descrição são apresentados a seguir. Com propósitos da presente invenção, a atividade de feruloil esterase é determinada usando p-nitrofenilferulato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 mM, pH 5,0. Uma unidade de feruloil esterase equivale à quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de ânion p - nitrofenolato por minuto, em pH 5, 25°C.

[00140] Os exemplos não limitantes de esterase usada na presente invenção incluem, mas sem limitação, FAE-I de Humicola, FAE de Asp. Niger, FAE de Asp. Oryzae, FAE de Chaetomium globusam, e esterase de Asp. Oryzae, ou fragmentos destes com esterase ou atividade de feruloil esterase.

[00141] Os exemplos adicionais não limitantes de esterase para uso de acordo com a presente descrição incluem feruloil esterase, da maneira descrita na publicação de patente U.S. 2010/0122380 A1, EP1752533-A1 e WO9814594-A2, as quais são todas aqui incorporadas pela referência na sua íntegra. A esterase adequada compreende sequências de aminoácidos que apresentam um grau de identidade de sequência com a feruloil esterase, de cada uma das publicações de patente U.S. 2010/0122380 A1, EP1752533-A1 e WO9814594-A2, de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou pelo menos 100 %, ou um fragmento ativo destes que apresenta atividade de feruloil esterase.

[00142] Em um aspecto da presente descrição, a esterase compreende uma sequência de aminoácido que apresenta um grau de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136 ou SEQ ID NO: 137 de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou pelo menos 100 %, ou um fragmento ativo deste que apresenta atividade de esterase ou atividade de feruloil esterase. Nas modalidades, a esterase adequada para uso de acordo com a presente descrição incluem o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136 ou SEQ ID NO: 137 ou um fragmento ativo deste que apresenta atividade de esterase. Nas modalidades, a esterase adequada para uso de acordo com a presente descrição inclui 2 ou mais do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136 ou SEQ ID NO: 137 em combinação.

[00143] Em um aspecto, a esterase da presente descrição é um variante artificial que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção de um ou mais (ou vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136 ou SEQ ID NO: 137, ou uma sequência homóloga deste.

[00144] Preferivelmente, as alterações de aminoácido são de uma natureza inferior, isto é, substituições ou inserções conservativas de aminoácido que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; pequenas extensões amino ou carboxil-terminais, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação mudando a carga líquida ou uma outra função, tal como uma região de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[00145] Exemplos de substituições conservativas estão no grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que não alteram, em geral, a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As mudanças que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[00146] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma natureza tal que as propriedades fisico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alteram a especificidade do substrato, mudam o pH ideal e similares.

[00147] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo parental podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagênese direcionada a sítio ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações de alanina simples são introduzidas e cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas com relação à melhor atividade celulolítica para identificar resíduos de aminoácido que são importantes para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinada por análise física da estrutura, da maneira determinada por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron, ou marcação de foto afinidade, junto com mutação de aminoácidos de sítio de contato suposto. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades dos aminoácidos essenciais também podem ser inferidas a partir da análise de identidades com polipeptídeos que estão relacionados com o polipeptídeo parental.

[00148] As substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácido simples ou únicas podem ser realizadas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de seleção relevante, tais como aqueles descritos por Reidhaar- Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa ao erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente U.S. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese direcionada para região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[00149] Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de seleção automatizados de alto rendimento para detectar a atividade dos polipeptídeos clonados e mutageneizados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893896). As moléculas de DNA mutageneizado que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrões na técnica. Estes métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos individuais de aminoácido em um polipeptídeo.

[00150] Nas modalidades, o número total de substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136 ou SEQ ID NO: 137 é não mais que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[00151] Nas modalidades, a composição de enzima esterase adequada para uso de acordo com a presente descrição compreende ou consiste em SEQ ID. NO: 133, SEQ ID. NO: 134, SEQ ID. NO: 135, SEQ ID. NO: 136 ou SEQ ID NO: 137, ou fragmento ativos desta que apresentam atividade de esterase.

[00152] Nas modalidades, a enzima esterase adequada para uso de acordo com a presente descrição compreende ou consiste em FAE(1), FAE-A, FAE- C e FAE-D, ou um fragmento ativo destas que apresenta atividade de esterase.

[00153] Um ou mais (vários) componentes da enzima esterase ou composição de esterase para uso de acordo com a presente descrição podem ser proteínas tipo selvagem, proteínas recombinantes ou uma combinação de proteínas tipo selvagem e proteínas recombinantes. Por exemplo, um ou mais (vários) componentes podem ser proteínas naturais de uma célula, que é usada como uma célula hospedeira para expressar recombinantemente um ou mais (vários) outros componentes da composição de esterase. Um ou mais (vários) componentes da composição de esterase podem ser produzidos como monocomponentes, os quais são então combinados para formar a composição de enzima. A composição de enzima pode ser uma combinação de preparações de proteína multicomponente e monocomponente.

[00154] As esterases usadas nos processos da presente descrição podem estar em qualquer forma adequada para uso tal como, por exemplo, um caldo de fermentação bruto com ou sem células removidas, um lisado celular com ou sem restos celulares, uma preparação de enzima semi-purificada ou purificada, ou uma célula hospedeira como uma fonte das esterases. A composição de esterase pode ser um pó seco ou granulado, um granulado sem poeira, um líquido, um líquido estabilizado ou uma enzima protegida estabilizada. As preparações líquidas de esterase, por exemplo, podem ser estabilizadas adicionando estabilizantes tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou um outro poliol, e/ou ácido lático ou um outro ácido orgânico de acordo com os processos estabelecidos.

[00155] A esterase pode ser derivada ou obtida de qualquer origem adequada, incluindo a origem bacteriana, fúngica, de levedura, vegetal ou de mamífero. O termo “obtida” significa aqui que a esterase pode ter sido isolada de um organismo que produz naturalmente a esterase como uma enzima natural. O termo “obtida” também significa aqui que a enzima pode ter sido produzida de maneira recombinante em um organismo hospedeiro que emprega os métodos aqui descritos, em que a esterase produzida de maneira recombinante é tanto natural quanto estrangeira ao organismo hospedeiro, ou apresenta uma sequência modificada de aminoácidos, por exemplo, com um ou mais (vários) aminoácidos que são eliminados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima produzida de maneira recombinante que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência de aminoácidos natural, ou uma enzima produzida por processos de embaralhamento de ácido nucleico conhecidos na técnica. São incluídos no significado de uma enzima natural os variantes, e no significado de uma enzima estrangeira os variantes obtido de maneira recombinante, tal como por mutagênese direcionada a sítio ou embaralhamento.

[00156] Nas modalidades, o tratamento de acordo com a presente descrição inclui uma etapa de separar um licor ou porção do líquido a a partir do material celulósico pré-tratado. Sem querer ficar preso à presente descrição, acredita-se que uma fração do líquido ou licor do material celulósico pré-tratado pode conter as toxinas, tais como ésteres tóxicos para a hidrólise, e/ou enzimas celulase. De acordo com a presente descrição, a composição de enzima esterase compreende ou consiste em uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma esterase e feruloil esterase, ou fragmentos ativos destas que apresentam atividade de esterase podem ser aplicados ao líquido isolado ou licor. Este licor pode ser então adicionado novamente ao material celulósico pré-tratado para um tratamento eficiente deste. Por exemplo, é possível colocar o licor em contato com feruloil esterase e reciclar o licor. O licor reciclado e tratado pode ser reciclado em um novo pré-tratamento de material celulósico pré-tratado com a composição de esterase, ou usado sozinho com o propósito de hidrólise e/ou fermentação.

[00157] Os tratamentos de acordo com a presente descrição não são limitados ao tratamento direto do material celulósico pré-tratado. Entende-se que os processos de acordo com a presente descrição incluem, compreendem ou consistem em pós-tratar o material celulósico pré-tratado refinado com um pré-tratamento enzimático, pré-tratamento químico, pré-tratamento mecânico e/ou um pré-tratamento físico.

[00158] Nas modalidades, os tratamentos de acordo com a presente descrição incluem, compreendem ou consistem em recuperar o material celulósico pré-tratado refinado com enzima. O material celulósico pré-tratado refinado apresenta melhores qualidades como um substrato para hidrólise.

[00159] Nas modalidades, o colocar em contato ou tratar com composições de enzima, tais como esterase e feruloil esterase, é realizado com uma quantidade suficiente de enzima por grama (g) de material celulósico pré-tratado. Nas modalidades, as composições para uso de acordo com a presente invenção contêm a enzima esterase, tal como feruloil esterase, em uma quantidade eficiente para melhorar a hidrólise do material celulósico pré-tratado. Da maneira aqui usada “quantidade eficiente” refere-se a uma quantidade de esterase ou composição de esterase com os constituintes de esterase de acordo com a presente descrição, suficientes para induzir um benefício positivo particular à composição do material celulósico pré-tratado ou porção desta. O benefício positivo pode estar relacionado à toxina, ou pode estar mais relacionado à natureza da hidrólise de enzima, ou pode ser uma combinação das duas. Nas modalidades, o benefício positivo é atingido colocando o material celulósico pré-tratado, ou uma porção deste, em contato com uma esterase ou composição de esterase para melhorar as condições do materiais celulósicos pré-tratados, a fim de melhorar seu desempenho de hidrólise. Por exemplo, a quantidade de enzima adicionada de acordo com a presente descrição inclui uma quantidade suficiente para desintoxicar o material celulósico pré-tratado, de maneira tal que a hidrólise deste seja melhor. Os exemplos não limitantes das melhorias incluem uma redução de toxinas de éster no material celulósico pré-tratado, e/ou um aumento na quantidade de açúcar formado durante a hidrólise do material. Nas modalidades, a quantidade de ésteres e/ou toxinas no material celulósico pré- tratado é reduzida em uma quantidade de 1-10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 %. A redução de ésteres e toxinas pode ser avaliada por qualquer método analítico adequado conhecido na técnica, tal como HPLC. Nas modalidades, a quantidade de ésteres e/ou toxinas no material celulósico pré-tratado é reduzida em uma quantidade de: 10-30 % da quantidade total de ésteres ou toxinas presentes, 20-40 % da quantidade total de ésteres ou toxinas presentes, 40-50 % da quantidade total de ésteres ou toxinas presentes, 50-60 % da quantidade total de ésteres ou toxinas presentes, 60-70 % da quantidade total de ésteres ou toxinas presentes, 70-80 % da quantidade total de ésteres ou toxinas presentes, 80-90 % da quantidade total de ésteres ou toxinas presentes, ou 90-100 % da quantidade total de ésteres ou toxinas presentes. Nas modalidades, a melhoria pode se referir a uma maior quantidade de produto da hidrólise, tal como açúcar, maior que a quantidade de produto de hidrólise produzido, comparado ao uso de material celulósico pré-tratado hidrolisado, mas não tratado de acordo com a presente descrição. Nas modalidades, a quantidade de produto de hidrólise ou açúcar é maior 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ou 2 vezes mais que a quantidade de produto de hidrólise produzido, comparado ao uso de material celulósico pré-tratado hidrolisado, mas não tratado de acordo com a presente descrição. Nas modalidades, a quantidade de produto de hidrólise ou açúcar é maior 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 9 ou 10 vezes mais que a quantidade de produto de hidrólise produzido, comparado ao uso de material celulósico pré-tratado hidrolisado, mas não tratado de acordo com a presente descrição. As quantidades adequadas e não limitantes de enzima, tais como esterase e feruloil esterase, para uso de acordo com a presente descrição incluem cerca de 0,0005 a cerca de 5 mg, por exemplo, cerca de 0,001 a cerca de 5 mg, cerca de 0,0025 a cerca de 5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 4,5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 4 mg, cerca de 0,005 a cerca de 3,5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 3 mg, cerca de 0,005 a cerca de 2 mg, cerca de 0,005 a cerca de 1 mg, cerca de 0,075 a cerca de 1 mg, ou cerca de 0,1 a cerca de 1 mg de enzima por g de material celulósico pré-tratado, ou por mL de licor separado do material celulósico pré-tratado. Nas modalidades, as quantidades adequadas de enzima, tais como esterase e feruloil esterase, para uso de acordo com a presente descrição incluem cerca de 0,0005 a cerca de 5 mg, por exemplo, cerca de 0,001 a cerca de 5 mg, cerca de 0,0025 a cerca de 5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 4,5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 4 mg, cerca de 0,005 a cerca de 3,5 mg, cerca de 0,005 a cerca de 3 mg, cerca de 0,005 a cerca de 2 mg, cerca de 0,005 a cerca de 1 mg, cerca de 0,075 a cerca de 1 mg, ou cerca de 0,1 a cerca de 1 mg de enzima por mL de licor separado do material celulósico pré-tratado.

[00160] Nas modalidades, os tratamentos de acordo com a presente invenção compreendem, consistem ou incluem uma quantidade de material celulósico pré-tratado suficiente para ser usado em reações adicionais. Por exemplo, tratar e colocar o material celulósico pré-tratado em contato é realizado com uma quantidade de material celulósico pré-tratado, de maneira tal que os tratamentos sejam realizados com um total de sólidos (TS) de cerca de 1 % a cerca de 50 % por exemplo, cerca de 2 % a cerca de 40 %, cerca de 2 % a cerca de 35 %, cerca de 3 % a cerca de 30 %, cerca de 3 % a cerca de 25 %, cerca de 4 % a cerca de 20 %, ou cerca de 5 % a cerca de 10 %. Nas modalidades, os tratamentos são realizados com um total de sólidos (TS) de cerca de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 % ou 50 %.

[00161] Nas modalidades, o colocar em contato ou tratar o material celulósico pré-tratado com enzima esterase ou composição de esterase é realizado em um pH adequado para a enzima esterase. Os exemplos não limitantes de pHs adequados incluem colocar em contato ou tratar com a composição de enzima esterase em um pH de cerca de 2 a cerca de 9, por exemplo, cerca de 3 a cerca de 8, cerca de 3 a cerca de 7,5, cerca de 3,5 a cerca de 7, cerca de 4 a cerca de 6,5, cerca de 4,5 a cerca de 6,5, cerca de 4,5 a cerca de 6,0, cerca de 5 a cerca de 6,0, ou cerca de 5 a cerca de 5,5. Nas modalidades o pH é 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 ou 9,0. Nas modalidades, os exemplos de pHs adequados incluem colocar em contato ou tratar com a composição de enzima esterase em um pH de 2 a 9, por exemplo, 3 a 8, 3 a 7,5, 3,5 a 7, 4 a 6,5, 4,5 a 6,5, 4,5 a 6,0, 5 a 6,0 ou 5 a 5,5.

[00162] Nas modalidades, o colocar em contato ou tratar o material celulósico pré-tratado com composição de enzima esterase é realizado em uma temperatura adequada para a enzima esterase. Os exemplos não limitantes de temperaturas adequadas incluem uma temperatura na faixa de cerca de 20°C a cerca de 70°C, por exemplo, cerca de 25°C a cerca de 65°C, cerca de 30°C a cerca de 65°C, cerca de 35°C a cerca de 65°C, cerca de 40°C a cerca de 60°C, cerca de 45°C a cerca de 55°C, ou cerca de 45°C a cerca de 50°C. Nas modalidades, uma temperatura adequada é 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C.

[00163] Nas modalidades, o colocar em contato ou tratar o material celulósico pré-tratado com composição de enzima esterase é realizado por uma duração adequada para a enzima esterase reagir com os ésteres ou toxinas na composição de material celulósico pré-tratado. Os exemplos não limitantes de durações adequadas incluem um período de tempo de 5 minutos a 35 horas, por exemplo, 10 minutos a 15 horas, 10 horas a 15 horas, 10 horas a 20 horas, 10 horas a 24 horas, 20 horas a 24 horas, 24 horas a 30 horas. Nas modalidades, a duração é de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 48, 72 horas.

[00164] O tratamento com esterase é realizado em geral em tanques com pH, temperatura e condições controladas, da maneira aqui descrita. Nas modalidades, o colocar em contato ou tratar o material celulósico pré-tratado com enzima esterase, ou composição de enzima, é realizado com uma quantidade de material celulósico pré-tratado aqui descrito, com uma quantidade de enzima tal como esterase e feruloil esterase aqui descritas, em um pH, temperatura e duração de acordo com a presente descrição. Várias modificações das quantidades aqui usadas podem ser utilizadas para otimizar o desempenho da esterase em remover as toxinas, e/ou aumentar os rendimentos de hidrólise de enzima. Nas modalidades, o tratamento com esterase é preferivelmente realizado em um ambiente aquoso adequado, em condições que podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica. Em um aspecto preferido, o tratamento com esterase é realizado em condições adequadas para a atividade da(s) esterase(s), isto é, ideal para a(s) esterase(s). O tratamento com esterase pode ser realizado como um processo em lote alimentado ou contínuo, onde o material celulósico pré-tratado (substrato) é alimentado de maneira gradual, por exemplo, com uma solução contendo esterase.

[00165] Nas modalidades, o processo da presente descrição inclui um processo para refinamento enzimático de um material celulósico pré-tratado, que compreende, que consiste ou que inclui: (a) processar o material celulósico pré-tratado para formar uma mistura sólida/líquida de material celulósico pré-tratado; (b) separar um licor da mistura sólida/líquida de material celulósico pré-tratado; e (c) tratar o licor com um tratamento com feruloil esterase.

[00166] Nas modalidades, o processo inclui, compreende ou consiste adicionalmente em retornar o licor tratado ao material celulósico pré-tratado. Aqui, o processo da presente descrição pode ser repetido, de maneira tal que os vários licores isolados sejam consolidados para formar um lote.

[00167] Nas modalidades, a presente descrição se refere a um processo para hidrolisar um material celulósico pré-tratado, compreendendo sacarificar um material celulósico pré-tratado, tratado e refinado de acordo com os processos da presente descrição, incluindo uma enzima esterase ou composição de esterase da presente descrição. Nas modalidades, a hidrólise é realizada usando a composição de enzima incluindo uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma laccase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina. Nas modalidades, a celulase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase. Nas modalidades, a hemicelulase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetixilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase, uma beta-xilosidase e uma glucuronidase.

[00168] Nas modalidades, o processo inclui adicionalmente as etapas que compreendem ou que consistem em recuperar o material celulósico pré- tratado sacarificado a partir da sacarificação. Nas modalidades, o material celulósico sacarificado é um açúcar. Os exemplos não limitantes de açúcares incluem glicose, xilose, manose, galactose e arabinose.

[00169] Nas modalidades, a presente descrição se refere a um processo para produzir um produto de fermentação que compreende ou que consiste em: (a) sacarificar um material celulósico pré-tratado, tratado com uma esterase ou composição de enzima esterase de acordo com a presente descrição. Aqui, a sacarificação é realizada usando uma composição de enzima adequada para sacarificação. Nas modalidades, as enzimas adequadas para a sacarificação incluem uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma laccase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina. Nas modalidades, celulase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase. Nas modalidades, hemicelulase é uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetixilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase. A etapa a seguir inclui (b) fermentar o material celulósico pré-tratado sacarificado com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação. Nas modalidades, as etapas (a) (sacarificar um material celulósico pré-tratado, em que o material celulósico pré-tratado é colocado em contato, tratado ou refinado de acordo com a presente descrição usando a esterase) e (b) (fermentar o material celulósico pré-tratado sacarificado com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultânea. Nas modalidades, o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido, um alcano, um cicloalcano, um alceno ou um gás.

[00170] A presente descrição se refere adicionalmente a um processo para fermentar um material celulósico pré-tratado que compreende ou que consiste em: fermentar um material celulósico pré-tratado com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico pré-tratado é tratado, refinado e/ou sacarificado de acordo com a presente descrição. Nas modalidades, a fermentação do material celulósico pré-tratado produz um produto de fermentação. Nas modalidades, o processo compreende ou consiste em uma etapa de recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação. Nas modalidades, o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido, um alcano, um cicloalcano, um alceno ou um gás.

[00171] Nas modalidades, os processos da presente descrição são preferivelmente usados em materiais celulósicos pré-tratados não lenhosos ou matérias primas não lenhosas. Os exemplos não limitantes de materiais celulósicos pré-tratados não lenhosos incluem caules, folhas, cascas, sépalas e espigas de plantas ou folhas pré-tratadas. O material celulósico não lenhoso pode ser, mas sem limitação, material herbáceo, resíduo agrícola, cultura agrícola especificamente energética, resíduo sólido municipal, papel residual e resíduo de fabricação de polpa e papel. Em um aspecto, o material celulósico é um material herbáceo não lenhoso. Em um outro aspecto, o material celulósico é um resíduo agrícola não lenhoso. Em um aspecto, o material celulósico é uma cultura agrícola energética não lenhosa. Em um aspecto da invenção, a matéria prima lenhosa é excluída do uso como uma matéria prima ou material celulósico adequado de acordo com a presente descrição.

Sacarificação

[00172] Na etapa de hidrólise, também conhecida como sacarificação, o material celulósico, isto é, pré-tratado, é hidrolisado para quebrar a celulose e alternativamente também a hemicelulose nos açúcares fermentáveis tais como glicose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos solúveis. A hidrólise é realizada enzimaticamente por uma composição de enzima. Os componentes de enzima e proteína das composições podem ser adicionados sequencialmente.

[00173] A hidrólise enzimática é realizada preferivelmente em um ambiente aquoso adequado, em condições que podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica. Em um aspecto preferido, a hidrólise é realizada nas condições adequadas para a atividade da(s) enzima(s), isto é, ideal para a(s) enzima(s). A hidrólise pode ser realizada como um processo em lote alimentado ou contínuo, onde o material celulósico pré-tratado (substrato) é alimentado de maneira gradual, por exemplo, com uma solução contendo enzima.

[00174] A sacarificação é realizada em geral em reatores ou fermentadores de tanque agitado em pH, temperatura e condições de mistura controlados. O tempo de processo, temperatura e condições de pH adequados podem ser facilmente determinados pelos versados na técnica. Por exemplo, a sacarificação pode demorar até 200 horas, mas é realizada de maneira típica por preferivelmente cerca de 12 a cerca de 96 horas, mais preferivelmente cerca de 16 a cerca de 72 horas, e acima de tudo preferivelmente cerca de 24 a cerca de 48 horas. A temperatura está na faixa de preferivelmente cerca de 25°C a cerca de 70°C, mais preferivelmente cerca de 30°C a cerca de 65°C, e mais preferivelmente cerca de 40°C a 60°C, em particular cerca de 50°C. O pH está na faixa de preferivelmente cerca de 3 a cerca de 8, mais preferivelmente cerca de 3,5 a cerca de 7, e acima de tudo preferivelmente cerca de 4 a cerca de 6, em particular cerca de pH 5. O teor de sólidos secos está na faixa de preferivelmente cerca de 5 a cerca de 50 % em peso, mais preferivelmente cerca de 10 a cerca de 40 % em peso, e acima de tudo preferivelmente cerca de 20 a cerca de 30 % em peso.

[00175] As quantidades ideias das enzimas dependem de vários fatores incluindo, mas sem limitação, a mistura de componentes de enzimas celulolíticas, o material celulósico, a concentração do material celulósico, o(s) pré-tratamento(s) do material celulósico, temperatura, tempo, pH e inclusão de organismo fermentador (por exemplo, levedura para sacarificação e fermentação simultânea).

[00176] Em um aspecto, uma quantidade eficiente de proteína enzimática celulolítica ou hemicelulolítica no material celulósico é cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, preferivelmente em cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, ainda mais preferivelmente em cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, e acima de tudo preferivelmente em cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de material celulósico.

[00177] Em um outro aspecto, uma quantidade eficiente de um polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica no material celulósico é cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg, preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 30 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 5 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,025 a cerca de 1.5 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,05 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,1 a cerca de 1,25 mg, ainda mais preferivelmente em cerca de 0,15 a cerca de 1,25 mg, e acima de tudo preferivelmente em cerca de 0,25 a cerca de 1,0 mg por g de material celulósico.

[00178] Em um outro aspecto, uma quantidade eficiente de um polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica para a proteína enzimática celulolítica é cerca de 0,005 a cerca de 1,0 g, preferivelmente em cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g, mais preferivelmente em cerca de 0,15 a cerca de 0,75 g, mais preferivelmente em cerca de 0,15 a cerca de 0,5 g, mais preferivelmente em cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, ainda mais preferivelmente em cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, e acima de tudo preferivelmente em cerca de 0,05 a cerca de 0.2 g por g de proteína enzimática celulolítica.

Fermentação

[00179] Os açúcares fermentáveis, obtidos a partir do material celulósico hidrolisado, podem ser fermentados por um ou mais (vários) microrganismos fermentadores capazes de fermentar os açúcares direta ou indiretamente em um produto de fermentação desejável. A “fermentação” ou o “processo de fermentação” refere-se a qualquer processo de fermentação, ou qualquer processo que compreende uma etapa de fermentação. Os processos de fermentação também incluem processos de fermentação usados na indústria de álcool para consumo (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínios (por exemplo, produtos de laticínios fermentados), indústria do couro e indústria do tabaco. As condições de fermentação dependem do produto de fermentação desejado e do organismo fermentador, e podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica.

[00180] Na etapa de fermentação, os açúcares, liberados do material celulósico como um resultado das etapas do pré-tratamento e hidrólise enzimática, são fermentados em um produto, por exemplo, etanol, por um organismo fermentador, tal como levedura. A hidrólise (sacarificação) e a fermentação podem ser separadas ou simultâneas, da maneira aqui descrita.

[00181] O termo “meio de fermentação” é aqui entendido para se referir a um meio antes do(s) microrganismo(s) fermentador(s) ser(m) adicionados, tal como um meio que resulta de um processo de sacarificação, bem como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentação simultânea (SSF).

[00182] O “microrganismo fermentador” refere-se a qualquer microrganismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, adaptados para uso em um processo de fermentação desejado para produzir um produto de fermentação. O organismo fermentador pode ser organismo fermentador C6 e/ou C5, ou uma combinação destes. Tanto os organismos fermentadores C6 quanto C5 são bem conhecidos na técnica. Os microrganismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, isto é, converte, açúcares tais como glicose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, manose, galactose ou oligossacarídeos, direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado.

[00183] Os exemplos de organismos fermentadores bacterianos e fúngicos que produzem etanol são descritos por Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

[00184] Os exemplos de microrganismos fermentadores que fermentam açúcares C6 incluem organismos bacterianos e fúngicos, tal como levedura. As leveduras preferidas incluem cepas de Saccharomyces spp., preferivelmente Saccharomyces cerevisiae.

[00185] Os exemplos de organismos fermentadores que podem fermentar açúcares C5 incluem organismos bacterianos e fúngicos, tais como algumas leveduras. As leveduras que fermentam C5 preferidas incluem as cepas de Pichia, preferivelmente Pichia stipitis, tal como Pichia stipitis CBS 5773; cepas de Candida, preferivelmente Candida boidinii, Candida brassicae, Candida sheatae, Candida diddensii, Candida pseudotropicalis ou Candida utilis.

[00186] Outros organismos fermentadores incluem as cepas de Zymomonas, tal como Zymomonas mobilis; Hansenula, tal como Hansenula anomala; Kluyveromyces, tal como K. fragilis; Schizosaccharomyces, tal como S. pombe; E. coli, especialmente E. coli cepas que foram geneticamente modificadas para melhorar o rendimento de etanol; Clostridium, tal como Clostridium acetobutilicum, Chlostridium thermocellum, e Chlostridium phytofermentans; Geobacillus sp.; Thermoanaerobacter, tal como Thermoanaerobacter saccharolyticum; e Bacillus, tal como Bacillus coagulans.

[00187] Em um aspecto preferido, a levedura é um Saccharomyces spp. Em um aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces cere visiae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces distaticus. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces uvarum. Em um outro aspecto preferido, a levedura é um Kluyveromyces. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Candida. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida boidinii. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida brassicae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida diddensii. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida utilis. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Clavispora. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora lusitaniae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora opuntiae. Em um outro aspecto preferido, a levedura é um Pachysolen. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Pichia. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é uma Pichia stipitis. Em um outro aspecto preferido, a levedura é um Bretannomyces. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Bretannomyces clausenii (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioetanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212).

[00188] As bactérias que podem fermentar de maneira eficiente a hexose e pentose em etanol incluem, por exemplo, Zymomonas mobilis, Clostridium acetobutilicum, Clostridium thermocellum, Chlostridium phytofermentans, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter saccharolyticum, e Bacillus coagulans (Philippidis, 1996, supra).

[00189] Em um aspecto preferido, a bactéria é uma Zymomonas. Em um aspecto mais preferido, a bactéria é Zymomonas mobilis. Em um outro aspecto preferido, a bactéria é um Clostridium. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium thermocellum.

[00190] As leveduras comercialmente disponíveis adequadas para a produção de etanol incluem, por exemplo, levedura ETANOL RED™ (disponível pela Fermentis/Lesaffre, USA), FALI™ (disponível pela Fleischmann’s Yeast, USA), levedura fresca SUPERSTART™ e THERMOSACC™ (disponível pela Etanol Technology, WI, USA), BIOFERM™ AFT e XR (disponível pela NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, USA), GERT STRAND™ (disponível pela Gert Strand AB, Sweden), e FERMIOL™ (disponível pela DSM Specialties).

[00191] Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador foi geneticamente modificado para fornecer a capacidade de fermentar os açúcares pentose, tal como os microrganismos que utilizam xilose, que utilizam arabinose, e que coutilizam xilose e arabinose.

[00192] A clonagem de genes heterólogos em vários microrganismos fermentadores levou à construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses em etanol (co-fermentação) (Chen and Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter and Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose- metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, xylose isomerase).

[00193] Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Saccharomyces cerevisiae. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Zymomonas mobilis. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Escherichia coli. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Klebsiella oxytoca. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Kluyveromyces sp.

[00194] É bem conhecido na técnica que os organismos descritos anteriormente também podem ser usados para produzir outras substâncias, da maneira aqui descrita.

[00195] O microrganismo fermentador é adicionado tipicamente à lignocelulose degradada ou hidrolisado, e a fermentação é realizada por cerca de 8 a cerca de 96 horas, tal como cerca de 24 a cerca de 60 horas. A temperatura está tipicamente entre cerca de 26°C a cerca de 60°C, em particular cerca de 32°C ou 50°C, e em cerca de pH 3 a cerca de pH 8, tal como em torno de pH 4-5, 6 ou 7.

[00196] Em um aspecto preferido, a levedura e/ou um outro microrganismo é aplicado ao material celulósico degradado e a fermentação é realizada por cerca de 12 a cerca de 96 horas, tal como de maneira típica por 24-60 horas. Em um aspecto preferido, a temperatura é preferivelmente entre cerca de 20°C a cerca de 60°C, mais preferivelmente cerca de 25°C a cerca de 50°C, e acima de tudo preferivelmente cerca de 32°C a cerca de 50°C, em particular cerca de 32°C ou 50°C, e o pH é em geral de cerca de pH 3 a cerca de pH 7, preferivelmente em torno de pH 4-7. Entretanto, alguns organismos fermentadores, por exemplo, bactérias, apresentam maior temperatura ideal de fermentação. A levedura ou um outro microrganismo é preferivelmente aplicado em quantidades de aproximadamente 105 a 1012, preferivelmente de aproximadamente 107 a 1010, especialmente em aproximadamente 2 x 108 células viáveis por contagem em mL de caldo de fermentação. Orientações adicionais em relação ao uso de levedura para a fermentação podem ser encontradas em, por exemplo, “The Alcohol Textbook” (Editors K. Jacques, T.P. Lyons and D.R. Kelsall, Nottingham University Press, United Kingdom 1999), que é aqui incorporado pela referência.

[00197] Para a produção de etanol, após a fermentação, a lama fermentada é destilada para extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com os processos da invenção pode ser usado, por exemplo, como etanol combustível, etanol para bebida, isto é, espíritos neutros potáveis, ou etanol industrial.

[00198] Um estimulador de fermentação pode ser usado em combinação com qualquer dos processos aqui descritos para melhorar adicionalmente o processo de fermentação e, em particular, o desempenho do microrganismo fermentador, tais como melhoria da taxa e rendimento de etanol. Um “estimulador de fermentação” refere-se aos estimuladores para o crescimento dos microrganismos fermentadores, em particular, levedura. Os estimuladores de fermentação preferidos para crescimento incluem vitaminas e minerais. Os exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina e vitaminas A, B, C, D e E. Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, SpringerVerlag (2002), que é aqui incorporado pela referência. Os exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem fornecer nutrientes que compreendem P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn e Cu.

Produtos de fermentação

[00199] O produto de fermentação pode ser qualquer substância derivada da fermentação. O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanodiol, sorbitol e xilitol); um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D- glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido lático, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico); uma cetona (por exemplo, acetona); um aminoácido (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina); um alcano (por exemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano e dodecano), um cicloalcano (por exemplo, ciclopentano, cicloexano, cicloeptano e cicloctano), um alceno (por exemplo, penteno, hexeno, hepteno e octeno); e um gás (por exemplo, metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2), e monóxido de carbono (CO)). O produto de fermentação também pode ser proteína como um produto de alto valor.

[00200] Em um aspecto preferido, o produto de fermentação é um álcool. Será que o termo “álcool” inclui uma substância que contém uma ou mais frações hidroxila. Em um aspecto mais preferido, o álcool é arabinitol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é butanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é etanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é metanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é 1,3-propanodiol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é sorbitol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é xilitol. Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., and Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Silveira, M. M., and Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P., and Singh, D., 1995, Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T. C., Qureshi, N. and Blaschek, H. P., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

[00201] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um ácido orgânico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acético. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acetônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido adípico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido ascórbico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido cítrico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido 2,5- diceto-D glucônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fórmico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fumárico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucárico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucurônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glutárico. Em um outro aspecto preferido, o ácido orgânico é ácido 3- hidroxipropiônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido itacônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido lático. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido málico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido malônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido oxálico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido propiônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido succínico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen, R., and Lee, Y. Y., 1997, Membrane- mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.

[00202] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é uma cetona. Entende-se que o termo “cetona” inclui uma substância que contém uma ou mais frações de cetona. Em um outro aspecto mais preferido, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.

[00203] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um aminoácido. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido aspártico. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é ácido glutâmico. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é glicina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é lisina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é serina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é treonina. Ver, por exemplo, Richard, A., and Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.

[00204] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um alcano. O alcano pode ser um alcano não ramificado ou ramificado. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é pentano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é hexano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é heptano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é octano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é nonano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é decano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é undecano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é dodecano.

[00205] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um cicloalcano. Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é ciclopentano. Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloexano. Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloeptano. Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloctano.

[00206] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um alceno. O alceno pode ser um alceno não ramificado ou ramificado. Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é penteno. Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é hexeno. Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é hepteno. Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é octeno.

[00207] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um gás. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é metano. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é H2. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO2. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka, N., A. Miya, and K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; and Gunaseelan V.N. in Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review.

[00208] O(s) produto(s) de fermentação pode(m) ser opcionalmente recuperado(s) do meio de fermentação usando qualquer método conhecido na técnica incluindo, mas sem limitação, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou extração. Por exemplo, o álcool é separado do material celulósico fermentado e purificado por métodos convencionais de destilação. O etanol com uma pureza de até cerca de 96 % em volume pode ser obtido, o qual pode ser usado, por exemplo, como etanol combustível, etanol para bebida, isto é, espíritos neutros potáveis ou etanol industrial. Composições de enzima para hidrólise

[00209] As composições de enzima podem compreender qualquer proteína que é usada na sacarificação de um material celulósico.

[00210] Em um aspecto, a composição de enzima compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (várias) proteínas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma laccase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina. Em um outro aspecto, a celulase é preferivelmente uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase. Em um outro aspecto, a hemicelulase é preferivelmente uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma acetilmanana esterase, uma acetixilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase.

[00211] Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas celulolíticas. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (várias) enzimas hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas celulolíticas e uma ou mais (várias) enzimas hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo de enzimas celulolíticas e enzimas hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma endoglucanase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma celobioidrolase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma beta-glucosidase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende um polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma endoglucanase e um polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma celobioidrolase e um polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma beta-glucosidase e um polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma endoglucanase e uma celobioidrolase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma endoglucanase e uma beta-glucosidase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma endoglucanase, uma celobioidrolase, e um polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma endoglucanase, uma beta-glucosidase, e um polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma celobioidrolase, uma beta-glucosidase, e um polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma endoglucanase, uma celobioidrolase, e uma beta-glucosidase, e um polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica.

[00212] Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma acetilmanana esterase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma acetixilano esterase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma arabinanase (por exemplo, alfa-L-arabinanase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma arabinofuranosidase (por exemplo, alfa-L-arabinofuranosidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ácido coumárico esterase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma feruloil esterase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma galactosidase (por exemplo, alfa-galactosidase e/ou beta-galactosidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma glucuronidase (por exemplo, alfa-D-glucuronidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma glucuronoil esterase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma mananase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma manosidase (por exemplo, beta- manosidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma xilanase. Em um aspecto preferido, a xilanase é uma xilanase da família 10. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma xilosidase (por exemplo, beta-xilosidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma expansina. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma esterase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma laccase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma enzima lignolítica. Em um aspecto preferido, a enzima lignolítica é uma manganês peroxidase. Em um outro aspecto preferido, a enzima lignolítica é uma lignina peroxidase. Em um outro aspecto preferido, a enzima lignolítica é uma enzima produtora de H2O2. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma pectinase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma peroxidase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma protease. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma swolenina.

[00213] Nos processos da presente invenção, a(s) enzima(s) pode(m) ser adicionada(s) antes ou durante a fermentação, por exemplo, durante a sacarificação ou durante ou após a propagação do(s) microrganismo(s) fermentador(s).

[00214] Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima podem ser proteínas tipo selvagem, proteínas recombinantes ou uma combinação de proteínas tipo selvagem e proteínas recombinantes. Por exemplo, um ou mais (vários) componentes pode ser proteínas naturais de uma célula, a qual é usada como uma célula hospedeira para expressar recombinantemente um ou mais (vários) outros componentes da composição de enzima. Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima podem ser produzidos como monocomponentes, que são então combinados para formar a composição de enzima. A composição de enzima pode ser uma combinação de preparações de proteína multicomponente e monocomponente.

[00215] As enzimas usadas nos processos da presente invenção podem estar em qualquer forma adequada para uso tal como, por exemplo, um caldo de fermentação bruto com ou sem células removidas, um lisado de células com ou sem restos celulares, uma preparação de enzima semi-purificada ou purificada, ou uma célula hospedeira como uma fonte das enzimas. A composição de enzima pode ser um pós seco ou granulado, um granulado sem pó, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma proteína protegida estabilizada. As preparações líquidas de proteína, por exemplo, podem ser estabilizadas adicionando estabilizantes tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou um outro poliol, e/ou ácido lático ou um outro ácido orgânico de acordo com processos estabelecidos.

[00216] As enzimas podem ser derivadas ou obtidas de qualquer origem adequada, incluindo a origem bacteriana, fúngica, de levedura, vegetal ou de mamífero. O termo “obtida” significa aqui que a enzima pode ter sido isolada de um organismo que produz naturalmente a enzima como uma enzima natural. O termo “obtida” também significa aqui que a enzima pode ter sido produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro que emprega os métodos aqui descritos, em que a enzima produzida de maneira recombinante é tanto natural quanto estrangeira ao organismo hospedeiro, ou apresenta uma sequência modificada de aminoácidos, por exemplo, com um ou mais (vários) aminoácidos que são eliminados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima produzida de maneira recombinante que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência natural de aminoácidos, ou uma enzima produzida por processos de embaralhamento de ácido nucleico conhecidos na técnica. São incluídos no significado de uma enzima natural os variantes naturais, e no significado de uma enzima estrangeira os variantes obtidos de maneira recombinante, tal como por mutagênese direcionada a sítio ou embaralhamento.

[00217] O polipeptídeo que apresenta atividade de enzima pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de bactéria Gram positiva, tal como um polipeptídeo que apresenta atividade de enzima de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, ou Oceanobacillus, ou um polipeptídeo de bactéria Gram negativa tal como um polipeptídeo que apresenta atividade de enzima de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campilobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria, ou Ureaplasma.

[00218] Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo que apresenta atividade de enzima de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.

[00219] Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo que apresenta atividade de enzima de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[00220] Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo que apresenta atividade de enzima de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans.

[00221] O polipeptídeo que apresenta atividade de enzima também pode ser um polipeptídeo fúngico, e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura, tal como um polipeptídeo que apresenta atividade de enzima de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia; ou mais preferivelmente um polipeptídeo de fungo filamentoso, tal como um polipeptídeo que apresenta atividade de enzima de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xilaria.

[00222] Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo que apresenta atividade de enzima de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis.

[00223] Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo que apresenta atividade de enzima de Acremoniuma célulaulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulfureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, ou Trichophaea.

[00224] Os mutantes quimicamente modificados ou modificados por engenharia proteica dos polipeptídeos que apresentam atividade de enzima também podem ser usados.

[00225] Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima pode ser um componente recombinante, isto é, produzido por clonagem de uma sequência de DNA que codifica o componente único e a subsequente célula transformada com a sequência de DNA e expressa em um hospedeiro (ver, por exemplo, WO 91/17243 e WO 91/17244). O hospedeiro é preferivelmente um hospedeiro heterólogo (a enzima é estrangeira ao hospedeiro), mas o hospedeiro também pode, em certas condições, ser um hospedeiro homólogo (a enzima é natural do hospedeiro). As enzimas celulolíticas monocomponentes também podem ser preparadas purificando uma proteína como esta a partir de um caldo de fermentação.

[00226] Em um aspecto, a uma ou mais (várias) enzimas celulolíticas compreendem uma preparação de enzima celulolítica comercial. Os exemplos de preparações de enzima celulolítica comercial adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, CELLIC™ CTec (Novozymes A/S), CELLIC™ CTec2 (Novozymes A/S), CELLUCLAST™ (Novozymes A/S), NOVOZYM™ 188 (Novozymes A/S), CELLUZYME™ (Novozymes A/S), CEREFLO™ (Novozymes A/S), e ULTRAFLO™ (Novozymes A/S), ACCELERASE™ (Genencor Int.), LAMINEX™ (Genencor Int.), SPEZYME™ CP (Genencor Int.), FILTRASE® NL (DSM); METHAPLUS® S/L 100 (DSM), ROHAMENT™ 7069 W (Rohm GmbH), FIBREZYME® LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZYME® LBR (Dyadic International, Inc.), ou VISCOSTAR® 150L (Dyadic International, Inc.). As enzimas celulase são adicionadas em quantidades eficientes de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % em peso de sólidos, mais preferivelmente de cerca de 0,025 a cerca de 4,0 % em peso de sólidos, e acima de tudo preferivelmente de cerca de 0,005 a cerca de 2,0 % em peso de sólidos. As enzimas celulase são adicionadas em quantidades eficiente de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % em peso de sólidos, mais preferivelmente de cerca de 0,025 a cerca de 4,0 % em peso de sólidos, e acima de tudo preferivelmente de cerca de 0,005 a cerca de 2,0 % em peso de sólidos.

[00227] Nos processos da presente invenção, qualquer polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica pode ser usado, tais como aqueles polipeptídeos descritos supra.

[00228] Os exemplos de endoglucanases bacterianas que podem ser usadas nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, uma endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; patente U.S. 5.275.944; WO 96/02551; patente U.S. 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanase III d e Thermobifida fusca (WO 05/093050) e endoglucanase V de Thermobifida fusca (WO 05/093050).

[00229] Os exemplos de endoglucanases fúngicas que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, uma endoglucanase I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263; endoglucanase I de Trichoderma reesei Cel7B; número de acesso ao GENBANK™ M15665; SEQ ID NO: 2); endoglucanase II de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22; endoglucanase II de Trichoderma reesei Cel5A; número de acesso ao GENBANK™ M19373; SEQ ID NO: 4); endoglucanase III de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563; número de acesso ao GENBANK™ AB003694; SEQ ID NO: 6); endoglucanase V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228; número de acesso ao GENBANK™ Z33381; SEQ ID NO: 8); endoglucanase de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884); endoglucanase de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439); endoglucanase de Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14); endoglucanase de Fusarium oxysporuma (número de acesso ao GENBANK™ L29381); endoglucanase de Humicola grisea var. thermoidea (número de acesso ao GENBANK™ AB003107); endoglucanase de Melanocarpus albomyces (número de acesso ao GENBANK™ MAL515703); endoglucanase de Neurospora crassa (número de acesso ao GENBANK™ XM_324477); endoglucanase V de Humicola insolens (SEQ ID NO: 10); endoglucanase de Myceliophthora thermophila CBS 117.65 (SEQ ID NO: 12); endoglucanase de basiodiomiceto CBS 495.95 (SEQ ID NO: 14); endoglucanase de basiodiomiceto CBS 494.95 (SEQ ID NO: 16); endoglucanase CEL6B de Thielavia terrestris NRRL 8126 (SEQ ID NO: 18); endoglucanase de CEL6C Thielavia terrestris NRRL 8126 (SEQ ID NO: 20); endoglucanase CEL7C de Thielavia terrestris NRRL 8126 (SEQ ID NO: 22); endoglucanase CEL7E de Thielavia terrestris NRRL 8126 (SEQ ID NO: 24); endoglucanase CEL7F de Thielavia terrestris NRRL 8126 (SEQ ID NO: 26); endoglucanase CEL7A de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 (SEQ ID NO: 28) e endoglucanase de Trichoderma reesei cepa No. VTT-D-80133 (SEQ ID NO: 30; número de acesso ao GENBANK™ M15665). As endoglucanases de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 30, descritas anteriormente, são codificadas pela sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 29, respectivamente.

[00230] Os exemplos de celobioidrolases usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, celobioidrolase I de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 32); celobioidrolase II de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 34); celobioidrolase I de Humicola insolens (SEQ ID NO: 36); celobioidrolase II de Myceliophthora thermophila (SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40); celobioidrolase II de Thielavia terrestris (CEL6A) (SEQ ID NO: 42); celobioidrolase I de Chaetomium thermophilum (SEQ ID NO: 44) e celobioidrolase II de Chaetomium thermophilum (SEQ ID NO: 46), celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 48) e celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 50). As celobioidrolases de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 50, descritas anteriormente, são codificadas pela sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, e SEQ ID NO: 49, respectivamente.

[00231] Os exemplos de beta-glucosidases usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, beta-glucosidade de Aspergillus oryzae (SEQ ID NO: 52); beta-glucosidade de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 54); beta- glucosidade de Penicillium brasilianum IBT 20888 (SEQ ID NO: 56); beta- glucosidade de Aspergillus niger (SEQ ID NO: 58) e beta-glucosidade de Aspergillus aculeatus (SEQ ID NO: 60). As beta-glucosidases de SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, e SEQ ID NO: 60, descritas anteriormente, são codificadas pela sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, e SEQ ID NO: 59, respectivamente.

[00232] Os exemplos de outras beta-glucosidases usadas na presente invenção incluem uma proteína de fusão variante de beta-glucosidade de Aspergillus oryzae de SEQ ID NO: 62 ou a proteína de fusão de beta- glucosidade de Aspergillus oryzae de SEQ ID NO: 64. As proteínas de fusão de beta-glucosidade de SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 64 são codificadas por SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 63, respectivamente.

[00233] A beta-glucosidase de Aspergillus oryzae pode ser obtido de acordo com WO 2002/095014. A beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus pode ser obtida de acordo com WO 2005/047499. A beta-glucosidase de Penicillium brasilianum pode ser obtida de acordo com WO 2007/019442. A beta-glucosidase de Aspergillus niger pode ser obtida de acordo com Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980. A beta-glucosidase de Aspergillus aculeatus pode ser obtida de acordo com Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288.

[00234] Outras endoglucanases, celobioidrolases e beta-glucosidases usadas são descritas em várias famílias de glucosil hidrolase, usando a classificação de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosil hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309316, e Henrissat B., and Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosil hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

[00235] Outras enzimas celulolíticas que podem ser usadas na presente invenção são descritas em EP 495.257, EP 531.315, EP 531.372, WO 89/09259, WO 94/07998, WO 95/24471, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 96/034108, WO 97/14804, WO 98/08940, WO 98/012307, WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 98/028411, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025846, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2000/009707, WO 2002/050245, WO 2002/0076792, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, patente U.S. 4.435.307, patente U.S. 5.457.046, patente U.S. 5.648.263, patente U.S. 5.686.593, patente U.S. 5.691.178, patente U.S. 5.763.254 e patente U.S. 5.776.757.

[00236] Nos processos da presente invenção, qualquer polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica pode ser usado.

[00237] Em um primeiro aspecto, o polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica compreende os seguintes motivos: [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] e [FW]-[TF]-K- [AIV], em que X é qualquer aminoácido, X(4,5) é qualquer aminoácido em 4 ou 5 posições contíguas, e X(4) é qualquer aminoácido em 4 posições contíguas.

[00238] O polipeptídeo compreendendo os motivos anteriormente observados pode compreender adicionalmente: H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV], [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], ou H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] e [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]- [FILV]-X-[ILV], em que X é qualquer aminoácido, X(1,2) é qualquer aminoácido em 1 posição ou 2 posições contíguas, X(3) é qualquer aminoácido em 3 posições contíguas, e X(2) é qualquer aminoácido em 2 posições contíguas. Nos motivos anteriores, a abreviação de aminoácido com uma letra aceita pela IUPAC é empregada.

[00239] Em um aspecto preferido, o polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica compreende adicionalmente H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]- [AILMV]. Em um outro aspecto preferido, o isolado polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica compreende adicionalmente [EQ]-X- Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica compreende adicionalmente H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] e [EQ]-X-Y-X(2)-C-X- [EHQN]-[FILV]-X-[ILV].

[00240] Em um segundo aspecto, o polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica compreende o seguinte motivo: [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-UM-[HNQ], em que x é qualquer aminoácido, x (4,5) é qualquer aminoácido em 4 ou 5 posições contíguas, e x (3) é qualquer aminoácido em 3 posições contíguas. No motivo anterior, a abreviação de aminoácido com uma letra aceita pela IUPAC é empregada.

[00241] Em um terceiro aspecto, o polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica compreende uma sequência de aminoácido que apresenta um grau de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, ou SEQ ID NO: 128 de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou pelo menos 100 %.

[00242] Em um quarto aspecto, o polipeptídeo com melhor atividade celulolítica é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza pelo menos em condições de estringência muito baixa, preferivelmente pelo menos condições de estringência baixa, mais preferivelmente pelo menos condições de estringência média, mais preferivelmente pelo menos condições de estringência média-alta, ainda mais preferivelmente pelo menos condições de estringência alta, e acima de tudo preferivelmente pelo menos condições de estringência muito alta em (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, ou SEQ ID NO: 127, (ii) a sequência de DNAc contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, ou SEQ ID NO: 79, ou a sequência de DNA genômico que compreende a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, ou SEQ ID NO: 127, (iii) uma subsequência de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de tamanho completo de (i), (ii), ou (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, supra). Uma subsequência da sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, ou SEQ ID NO: 127 que contém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos ou preferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos contíguos. Além do mais, a subsequência pode codificar um fragmento de polipeptídeo que apresenta a melhor atividade celulolítica.

[00243] Em um quinto aspecto, o polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica é codificado por um polinucleotídeo que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleotídeos, a qual apresenta um grau de identidade com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, ou SEQ ID NO: 127 de preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, acima de tudo preferivelmente pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, e ainda acima de tudo preferivelmente pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou pelo menos 100 %.

[00244] Em um sexto aspecto, o polipeptídeo que apresenta melhor atividade celulolítica é um variante artificial que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção de um ou mais (ou vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, ou SEQ ID NO: 128; ou uma sequência homóloga deste.

[00245] Preferivelmente, as mudanças de aminoácido podem ser de uma natureza menor, isto é, substituições ou inserções conservativas de aminoácido que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas eliminações, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; pequenas extensões terminais amino ou carboxil, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um peptídeo ligante pequeno de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação alterando a carga da rede ou uma outra função, tal como um trato de poli- histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[00246] Exemplos de substituições conservativas estão no grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que em geral não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As substituições que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[00247] Alternativamente, as trocas de aminoácido são de uma natureza tal que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, mudar o pH ideal e similares.

[00248] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese direcionada a sítio ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações simples de alanina são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas com relação ao polipeptídeo com melhor atividade celulolítica para identificar resíduos de aminoácido que são importantes para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo do polipeptídeo com melhor atividade celulolítica, ou outra interação biológica, também pode ser determinado por análise física de estrutura, da maneira determinada por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por foto-afinidade, junto com a mutação dos aminoácidos do provável sítio de contato. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade dos aminoácidos essenciais também pode ser inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[00249] As substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácido simples ou múltiplo podem ser realizadas e testadas usando métodos de mutagênese conhecidos, recombinação e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de seleção relevante, tais como aqueles descritos por Reidhaar- Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa ao erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente U.S. 5.223.409; WO 92/06204) e mutagênese direcionada para região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[00250] Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de seleção, automatizados e de alto rendimento, para detectar a atividade de polipeptídeos clonados e mutageneizados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas mutageneizadas de DNA, que codificam polipeptídeos ativos, podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e sequenciadas rapidamente usando métodos padrões na técnica. Estes métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos individuais de aminoácido em um polipeptídeo.

[00251] O número total de substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, ou SEQ ID NO: 128 é não mais que 4, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4.

[00252] Em um aspecto, o polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica é usado na presença de um cátion metálico divalente ativador solúvel de acordo com WO 2008/151043, por exemplo, sulfato de manganês.

[00253] Em um aspecto, o polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica é usado na presença de um composto dióxi, um composto bicíclico, um composto heterocíclico, um composto contendo nitrogênio, um composto contendo enxofre, ou um licor obtido de um material celulósico pré-tratado, tal como resíduo de milho pré-tratado (PCS).

[00254] O composto dióxi pode incluir qualquer composto adequado contendo dois ou mais átomos de oxigênio. Em alguns aspectos, os compostos dióxi contêm uma fração arila substituída, da maneira aqui descrita. Os compostos dióxi podem compreender uma ou mais (várias) hidroxilas e/ou derivados de hidroxila, mas também incluem frações arila substituída que não apresentam hidroxila e derivados de hidroxila. Os exemplos não limitantes dos compostos dióxi incluem pirocatecol ou catecol; ácido caféico; ácido 3,4- diidroxibenzóico; 4-terc-butil-5-metóxi-1,2-benzenodiol; pirogalol; ácido gálico; metil-3,4,5-triidroxibenzoato; 2,3,4-triidroxibenzofenona; 2,6- dimetoxifenol; ácido sinapínico; ácido 3,5-diidroxibenzóico; 4-cloro-1,2- benzenodiol; 4-nitro-1,2-benzenodiol; ácido tânico; galato de etila; metil glicolato; ácido diidroxifumárico; 2-butino-1,4-diol; (ácido crocônico; 1,3- propanodiol; ácido tartárico; 2,4-pentanodiol; 3-etióxi-1,2-propanodiol; 2,4,4’-triidroxibenzofenona; cis-2-buteno-1,4-diol; 3,4-diidróxi-3- ciclobuteno-1,2-diona; diidroxiacetono; acroleína acetal; metil-4- hidroxibenzoato; ácido 4-hidroxibenzóico e metil-3,5-dimetoxi-4- hidroxibenzoato, ou um sal ou solvato destes.

[00255] O composto bicíclico pode incluir qualquer sistema de anel fundido substituído adequado, da maneira aqui descrita. Os compostos podem compreender um ou mais (vários) anéis adicionais, e não são limitados a um número específico de anéis, a menos que de outra forma declarada. Em um aspecto, o composto bicíclico é um flavonóide. Em um outro aspecto, o composto bicíclico é um isoflavonóide opcionalmente substituído. Em um outro aspecto, o composto bicíclico é um íon flavílio opcionalmente substituído, tal como uma antocianidina opcionalmente substituída ou antocianina opcionalmente substituída, ou derivados destes. Os exemplos não limitantes dos compostos bicíclicos incluem epicatequina; quercetina; miricetina; taxifolina; caempferol; morina; acacetina; naringenina; isoramnetina; apigenina; cianidina; cianina; curomanina; ceracianina ou um sal ou solvato destes.

[00256] O composto heterocíclico pode ser qualquer composto adequado, tal como um anel aromático ou não aromático opcionalmente substituído compreendendo um heteroátomo, da maneira aqui descrita. Em um aspecto, o heterocíclico é um composto compreendendo uma fração heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou uma fração heteroarila opcionalmente substituída. Em um outro aspecto, a fração de heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou fração heteroarila opcionalmente substituída, é uma heterocicloalquila de 5 elementos opcionalmente substituída ou uma fração de heteroarila de 5 elementos opcionalmente substituída. Em um outro aspecto, a heterocicloalquila opcionalmente substituída ou fração heteroarila opcionalmente substituída é uma fração opcionalmente substituída selecionada de pirazolila, furanila, imidazolila, isoxazolila, oxadiazolila, oxazolila, pirrolila, piridila, pirimidila, piridazinila, tiazolila, triazolila, tienila, diidrotieno-pirazolila, tianaftenila, carbazolila, benzimidazolila, benzotienila, benzofuranila, indolila, quinolinila, benzotriazolila, benzotiazolila, benzooxazolila, benzimidazolila, isoquinolinila, isoindolila, acridinila, benzoisazolila, dimetilidantoína, pirazinila, tetraidrofuranila, pirrolinila, pirrolidinila, morpholinila, indolila, diazepinila, azepinila, tiepinila, piperidinila, e oxepinila. Em um outro aspecto, a fração de heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou fração heteroarila opcionalmente substituída é uma furanila opcionalmente substituída. Exemplos não limitantes dos compostos heterocíclicos incluem (1,2-diidroxietil)-3,4-diidroxifuran-2(5H)- ona; 4-hidróxi-5-metil-3-furanona; 5-hidróxi-2(5H)-furanona; [1,2- diidroxietil]furan-2,3,4(5H)-triona; a-hidróxi—Y—butirolactona; ribônico Y— lactona; ácido aldoexurônico Y—lactona; ácido glucônico δ—lactona; 4— hidroxicoumarina; diidrobenzofurano; 5—(hidroximetil)furfural; furoína; 2(5H)—furanona; 5,6—diidro—2H—piran—2—ona; e 5,6—diidro—4—hidróxi—6—metil— 2H—piran—2—ona; ou um sal ou solvato destes.

[00257] O composto contendo nitrogênio pode ser qualquer composto adequado com um ou mais átomos de nitrogênio. Em um aspecto, o composto contendo nitrogênio compreende uma amina, imina, hidroxilamina ou fração de nitróxido. Os exemplos não limitantes dos compostos contendo nitrogênio incluem acetona oxima; ácido violúrico; piridina-2-aldoxima; 2-aminofenol; 1,2-benzenodiamina; 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidinilóxi; 5,6,7,8- tetraidrobiopterina; 6,7-dimetil-5,6,7,8-tetraidropterina e ácido maleâmico; ou um sal ou solvato destes.

[00258] O composto de quinona pode ser qualquer composto adequado que compreende uma fração de quinona da maneira aqui descrita. Exemplos não limitantes dos compostos de quinona incluem 1,4-benzoquinona; 1,4- naftoquinona; 2-hidróxi-1,4-naftoquinona; 2,3-dimetoxi-5-metil-1,4- benzoquinona ou coenzima Q0; 2,3,5,6-tetrametil-1,4-benzoquinona ou duroquinona; 1,4-diidroxiantraquinona; 3-hidróxi-1-metil-5,6-indolinediona ou adrenocromo; 4-terc-butil-5-metóxi-1,2-benzoquinona; pirroloquinolina quinona; ou um sal ou solvato destes.

[00259] O composto contendo enxofre pode ser qualquer suitable composto compreendendo um ou mais átomos de enxofre. Em um aspecto, o composto contendo enxofre compreende uma fração selecionada de tionila, tioéter, sulfinila, sulfonila, sulfamida, sulfonamida, ácido sulfônico, e éster sulfônico. Os exemplos não limitantes dos compostos contendo enxofre incluem etanotiol; 2-propanotiol; 2-propeno-1-tiol; 2-ácido mercaptoetanossulfônico; benzenotiol; benzeno-1,2-ditiol; cisteína; metionina; glutationa; cistina; ou um sal ou solvato destes.

[00260] Em um aspecto, uma quantidade eficiente de um composto como este descrito anteriormente para o material celulósico como uma razão molar em unidades de glucosila de celulose é cerca de 10-6 a cerca de 10, por exemplo, cerca de 10-6 a cerca de 7,5, cerca de 10-6 a cerca de 5, cerca de 10-6 a cerca de 2,5, cerca de 10-6 a cerca de 1, cerca de 10-5 a cerca de 1, cerca de 10-5 a cerca de 10-1, cerca de 10-4 a cerca de 10-1, cerca de 10-3 a cerca de 10-1, e cerca de 10-3 a cerca de 10-2. Em um outro aspecto, uma quantidade eficiente de um composto como este descrito anteriormente é cerca de 0,1 μM a cerca de 1 M, por exemplo, cerca de 0,5 μM a cerca de 0,75 M, cerca de 0,75 μM a cerca de 0,5 M, cerca de 1 μM a cerca de 0,25 M, cerca de 1 μM a cerca de 0,1 M, cerca de 5 μM a cerca de 50 mM, cerca de 10 μM a cerca de 25 mM, cerca de 50 μM a cerca de 25 mM, cerca de 10 μM a cerca de 10 mM, cerca de 5 μM a cerca de 5 mM, e cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM.

[00261] Nas modalidades, o termo licor refere-se à fase da solução, tanto aquosa, orgânica, quanto uma combinação destas, que surge a partir do tratamento de um material com lignocelulose e/ou hemicelulose em uma lama, ou monossacarídeos destes, por exemplo, xilose, arabinose, manose, etc., em condições da maneira aqui descrita, e os conteúdos solúveis destes. Um licor para melhoria celulolítica de um polipeptídeo GH61 pode ser produzido tratando um material com lignocelulose ou hemicelulose (ou matéria prima), aplicando calor e/ou pressão, opcionalmente na presença de um catalisador, por exemplo, ácido, opcionalmente na presença de um solvente orgânico, e opcionalmente em combinação com interrupção física do material, e a seguir separando a solução dos sólidos residuais. Tais condições determinam o grau de melhoria celulolítica, obtido por meio da combinação de licor e um polipeptídeo GH61, durante a hidrólise de um substrato celulósico por uma preparação de celulase. O licor pode ser separado do material tratado usando métodos padrões na técnica, tal como filtração, sedimentação ou centrifugação.

[00262] Em um aspecto, uma quantidade eficiente do licor para celulose é cerca de 10-6 a cerca de 10 g por g de celulose, por exemplo, cerca de 10-6 a cerca de 7,5 g, cerca de 10-6 a cerca de 5, cerca de 10-6 a cerca de 2.5 g, cerca de 10-6 a cerca de 1 g, cerca de 10-5 a cerca de 1 g, cerca de 10-5 a cerca de 101 g, cerca de 10-4 a cerca de 10-1 g, cerca de 10-3 a cerca de 10-1 g, e cerca de 103 a cerca de 10-2 g por g de celulose.

[00263] Em um aspecto, a uma ou mais (várias) enzimas hemicelulolíticas compreendem uma preparação de enzima hemicelulolítica comercial. Os exemplos de preparações comerciais de enzima hemicelulolítica adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S), CELLIC™ HTec (Novozymes A/S), CELLIC™ HTec2 (Novozymes A/S), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), MULTIFECT® Xilanase (Genencor), ECOPULP® TX-200A (AB Enzimas), HSP 6000 Xilanase (DSM), DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK), DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK), e DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK).

[00264] Os exemplos de xilanases usadas nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, xilanase de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785), xilanases de Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256; xil 3 SEQ ID NO: 129 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 130 [sequência deduzida de aminoácidos]) e xilanases de Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210).

[00265] Os exemplos de beta-xilosidases usadas nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, beta-xilosidase de Trichoderma reesei (número de acesso UniProtKB/TrEMBL Q92458; SEQ ID NO: 131 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 132 [sequência deduzida de aminoácidos]), Talaromyces emersonii (número de acesso SwissProt Q8X212) e Neurospora crassa (número de acesso SwissProt Q7SOW4).

[00266] Os exemplos de acetilxilano esterases usadas nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, acetilxilano esterase de Hypocrea jecorina (WO 2005/001036), acetilxilano esterase de Neurospora crassa (número de acesso UniProt q7s259), acetilxilano esterase de Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/042846), acetilxilano esterase de Chaetomium globosum (número de acesso UniProt Q2GWX4), acetilxilano esterase de Chaetomium gracile (número de acesso GeneSeqP AAB82124), acetilxilano esterase de Phaeosphaeria nodorum (número de acesso UniProt Q0UHJ1) e acetilxilano esterase de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709).

[00267] Exemplos de ácido ferúlico esterases usadas nos processos de a presente invenção incluem, mas sem limitação, feruloil esterase de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122), feruloil esterase de Neurospora crassa (número de acesso UniProt Q9HGR3) e feruloil esterase de Neosartorya fischeri (número de acesso UniProt A1D9T4).

[00268] Os exemplos de arabinofuranosidases usadas nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, arabinofuranosidase de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073383) e arabinofuranosidase de Aspergillus niger (número de acesso GeneSeqP AAR94170).

[00269] Os exemplos de alfa-glucuronidases usadas nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, alfa-glucuronidase de Aspergillus clavatus (número de acesso UniProt alcc12), alfa-glucuronidase de Trichoderma reesei (número de acesso UniProt Q99024), alfa- glucuronidase de Talaromyces emersonii (número de acesso UniProt Q8X211), alfa-glucuronidase de Aspergillus niger (número de acesso UniProt Q96WX9), alfa-glucuronidase de Aspergillus terreus (número de acesso SwissProt Q0CJP9) e alfa-glucuronidase d e Aspergillus fumigatus (número de acesso SwissProt Q4WW45).

[00270] As enzimas e as proteínas usadas nos processos da presente invenção podem ser produzidas por fermentação das cepas microbianas citadas anteriormente em um meio nutriente contendo fontes adequadas de carbono, nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Bennett, J.W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Os meios adequados são disponíveis a partir de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). As faixas de temperatura e outras condições adequadas para crescimento e produção de enzima são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Bailey, J.E., e Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986).

[00271] A fermentação pode ser qualquer método de cultivo de uma célula que resulta na expressão ou isolamento de uma enzima. Portanto, a fermentação pode ser entendida como aquela que compreende cultivo em frasco de agitação, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lotes, em lote alimentado ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industrial, realizada em um meio adequado e em condições que permitem que a enzima seja expressa ou isolada. As enzimas resultantes produzidas pelos métodos descritos anteriormente podem ser recuperadas a partir do meio de fermentação e purificadas por procedimentos convencionais. Construtos de ácido nucleico

[00272] Um polipeptídeo isolado que codifica um polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma enzima celulolítica, uma enzima hemicelulolítica, etc., pode ser manipulado em uma variedade de maneira para fornecer a expressão do polipeptídeo construindo um construto de ácido nucleico que compreende um polipeptídeo isolado, o qual codifica o polipeptídeo operavelmente ligado a uma ou mais (várias) sequências de controle que direcionam a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada, em condições compatíveis com as sequências de controle. A manipulação das sequências do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária, dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar as sequências de polinucleotídeo que utilizam métodos do DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[00273] A sequência de controle pode ser uma sequência promotora, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. A sequência promotora contém sequências de controle transcricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostra atividade transcricional na célula hospedeira de escolha, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido a partir de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares, tanto homólogos quanto heterólogos para a célula hospedeira.

[00274] Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição dos construtos de ácido nucleico, em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos a partir do gene alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), gene amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, operon lac de E. coli, gene agarase de Streptomyces coelicolor (dagA) e gene beta-lactamase de procarioto (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Os promotores adicioais são descritos em “Useful proteins from recombinant bacteria” em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.

[00275] Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição dos construtos de ácido nucleico na presente invenção, em uma célula hospedeira de fungo filamentoso, são os promotores obtidos a partir dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável ao ácido de Aspergillus niger, glicoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado a partir de um gene que codifica uma alfa-amilase neutra em Aspergilli, em que a parte principal não traduzida foi substituída por uma parte principal não traduzida de um gene que codifica triose fosfato isomerase em Aspergilli; os exemplos não limitantes incluem promotores modificados a partir do gene que codifica a alfa-amilase neutra em Aspergillus niger, em que a parte principal não traduzida foi substituída por uma parte principal não traduzida do gene que codifica triose fosfato isomerase em Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e promotores mutantes, truncados e híbridos destes.

[00276] Em uma levedura hospedeira, os promotores usados são obtidos dos genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneina (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores usados para células hospedeiras de leveduras são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[00277] A sequência de controle também pode ser uma sequência terminadora de transcrição adequada, que é reconhecida por uma célula hospedeira por terminar a transcrição. A sequência terminadora é operavelmente ligada na terminação 3’ do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

[00278] Os terminadores preferidos para as células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidos a partir dos genes para antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00279] Os terminadores preferidos para as células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae e gliceraldeído-3- phosphate desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores usados para as células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[00280] A sequência de controle também pode ser uma sequência principal adequada quando transcrita, e é uma região não traduzida de um RNAm que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência principal é operavelmente ligada à terminação 5’ do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer sequência principal que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada.

[00281] As sequências principais preferidas para as células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[00282] As sequências líderes adequadas para as células hospedeiras de leveduras são obtidas dos genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[00283] A sequência de controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operavelmente ligada na terminação 3’ do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao RNAm transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada.

[00284] As sequências de poliadenilação preferidas para as células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidas a partir dos genes for TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum e alfa-glucosidase de Aspergillus niger.

[00285] As sequências de poliadenilação usadas para as células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[00286] A sequência de controle também pode ser uma região codificante de peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado na terminação N de um polipeptídeo, e direciona o polipeptídeo na via secretória da célula. A extremidades 5’ da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter de maneira inerente uma sequência de peptídeo sinal codificante, naturalmente ligada ao quadro de aberto de leitura, com o segmento da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5’ da sequência codificante pode conter uma sequência de peptídeo sinal codificante que é estrangeira à sequência codificante. A sequência estrangeira de peptídeo sinal codificante pode ser exigida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência de peptídeo sinal codificante. Alternativamente, a sequência estrangeira de peptídeo sinal codificante pode simplesmente substituir a sequência natural de peptídeo sinal codificante, a fim de melhorara a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer sequência de peptídeo sinal codificante, que direciona o polipeptídeo expresso na via secretória de uma célula hospedeira de escolha, pode ser usado.

[00287] As sequências de peptídeo sinal eficientes que codificam as células hospedeiras bacterianas são as sequências de peptídeo sinal codificantes obtidas dos genes para amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) e prsA de Bacillus subtilis. Os peptídeos sinais adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[00288] As sequências de peptídeo sinal eficientes que codificam células hospedeiras de fungo filamento são as sequências de peptídeo sinal codificantes obtidas dos genes para amilase de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[00289] Os peptídeos sinais usados para as células hospedeiras de levedura são obtidas dos genes para fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências de peptídeo sinal codificantes usadas são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[00290] A sequência de controle também pode ser uma sequência de pró- peptídeo codificante que codifica um pró-peptídeo posicionado na terminação N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró- enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró- polipeptídeo é em geral inativo, e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou auto-catalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência de pró-peptídeo codificante pode ser obtida dos genes para protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase (WO 95/33836) de Myceliophthora thermophila, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[00291] Onde tanto o peptídeo sinal quanto a sequência de pró-peptídeos estão presentes na terminação N de um polipeptídeo, a sequência de pró- peptídeo é posicionada próxima à terminação N do polipeptídeo, e a sequência de peptídeo sinal é posicionada próxima à terminação N da sequência de pró-peptídeo.

[00292] Também pode ser desejável adicionar sequências regulatórias que regulam a expressão do polipeptídeo com relação ao crescimento da célula hospedeira. Os exemplos de sequências regulatórias são aquelas que fazem com que a expressão do gene seja acionada e desativada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. As sequências regulatórias em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou o sistema GAL1 pode ser usado. Em fungos filamentosos, o promotor de glicoamilase de Aspergillus niger, promotor de TAKA alfa-amilase de Aspergillus oryzae e o promotor de glicoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usados. Outros exemplos de sequências regulatórias são aquelas que permitem a amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências regulatórias incluem o gene diidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes metalotioneina que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser operavelmente ligado à sequência regulatória.

Vetores de expressão

[00293] As várias sequências de nucleotídeos e controle descritas anteriormente podem ser reunidas para produzir um vetor de expressão recombinante, o qual pode incluir um ou mais (vários) sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma enzima celulolítica, uma enzima hemicelulolítica, etc., em tais sítios. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso inserindo o polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo a sequência em um vetor apropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor, de maneira tal que a sequência codificante seja operavelmente ligada nas sequências de controle apropriadas para a expressão.

[00294] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser submetido convenientemente aos procedimentos de DNA recombinante, e podem resultar na expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira, na qual o vetor será introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[00295] O vetor pode ser um vetor que se replica autonomamente, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir a auto-replicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(s) foi integrado. Além do mais, um vetor simples, ou plasmídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon, podem ser usados.

[00296] O vetor contém preferivelmente um ou mais (vários) marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um produto do gene que fornece resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotróficos e similares.

[00297] Os exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tal como resistência à ampicilina, cloranfenicol, canamicina ou tetraciclina. Os marcadores adequados para as células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Os marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira de fungo filamentoso incluem, mas sem limitação, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como equivalentes destes. São preferidos para uso em uma célula de Aspergillus os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

[00298] O vetor contém preferivelmente um(s) elemento(s) que permite(s) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou a replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[00299] Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode depender da sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um(s) local(s) exato(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais podem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tais como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que apresenta um alto grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para melhorar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que é homóloga á sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além do mais, os elementos integracionais podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00300] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação que possibilita o vetor a replicar autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer plasmídeo replicador que medeia a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “plasmídeo replicador” significa um polinucleotídeo que possibilita que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00301] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177, e pACYC184 que permitem a replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060, e pAMβl que permitem a replicação em Bacillus.

[00302] Exemplos de origens de replicação para uso em uma levedura como célula hospedeira são as origem de replicação de 2 mícron, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[00303] Exemplos de origens de replicação usadas em uma célula de filamentoso são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores que compreendem o gene podem ser realizados de acordo com os métodos descritos em WO 00/24883.

[00304] Mais de uma cópia de um polinucleotídeo pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido integrando pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira, ou incluindo um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo, onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e, por meio disso, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando as células na presença do agente selecionável adequado.

[00305] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos anteriormente para construir os vetores de expressão recombinantes são bem conhecidos pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células hospedeiras

[00306] As células hospedeiras recombinantes que compreendem um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma enzima celulolítica, uma enzima hemicelulolítica, etc., podem ser vantajosamente usadas na produção recombinante do polipeptídeo. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo como este é introduzido em uma célula hospedeira, de maneira tal que o vetor seja mantido como um integrante cromossômico, ou como um vetor autorreplicante extracromossômico da maneira descrita anteriormente. O termo “célula hospedeira” inclui qualquer progênie de uma célula parental que não é idêntica à célula parental, em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá até um certo grau do gene que codifica o polipeptídeo e de sua fonte.

[00307] A célula hospedeira pode ser qualquer célula usada na produção de um polipeptídeo recombinante, por exemplo, um procarioto ou um eucarioto.

[00308] A célula hospedeira procariota pode ser qualquer bactéria Gram- positiva ou Gram-negativa. As bactérias Gram-positivas incluem, mas sem limitação, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas sem limitação, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma.

[00309] A célula hospedeira bacteriana pode ser qq. Células de Bacillus incluindo, mas sem limitação, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.

[00310] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas sem limitação, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[00311] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas sem limitação, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.

[00312] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus, por exemplo, pode ser realizada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), usando células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), por eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou por conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli, por exemplo, pode ser realizada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces, por exemplo, pode ser realizada por transformação de protoplasto, por eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou por transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas, por exemplo, pode ser realizada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397), ou por conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus, por exemplo, pode ser realizada por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbes 68: 189-207), por eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou por conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Entretanto, qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.

[00313] A célula hospedeira também pode ser de um eucarioto, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo.

[00314] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos”, da maneira aqui usada, inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota (da maneira definida por Hawksworth et al., em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), bem como o Oomycota (da maneira citada em Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

[00315] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura”, da maneira aqui usada, inclui leveduras ascosporogêneas (Endomycetales), leveduras basidiosporogêneas e leveduras que pertencem aos fungos imperfeitos (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de levedura pode mudar no futuro, com propósitos desta invenção, as leveduras podem ser definidas da maneira descrita em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., e Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[00316] A levedura como célula hospedeira pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

[00317] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de fungo filamentoso. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (da maneira definida por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são caracterizados em geral por uma parede de micélio composta de quitina, celulose, glicana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo do carbono é obrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o crescimento vegetativo de leveduras, tal como Saccharomyces cerevisiae, é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo do carbono pode ser fermentativo.

[00318] As células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[00319] Por exemplo, as células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[00320] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve formação de protoplasto, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida por se. Os procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023 e Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, e Christensen ET. AL., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Os métodos adequados para transformar as espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147- 156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920. Métodos de produção

[00321] Os métodos para produzir um polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma enzima celulolítica, uma enzima hemicelulolítica, etc., compreendem (a) cultivar uma célula, que em sua forma tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptídeo, em condições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Em um aspecto preferido, a célula é do gênero Aspergillus. Em um more aspecto preferido, a célula é Aspergillus fumigatus.

[00322] Alternativamente, métodos para produzir um polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma enzima celulolítica, uma enzima hemicelulolítica, etc., compreendem (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante em condições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[00323] Nos métodos de produção, as células são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo usando os métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco de agitação, e fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lotes, em lote alimentado ou em estado sólido) realizada em fermentadores de laboratório ou industriais, em um meio e em condições adequadas que permitem que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando os procedimentos conhecidos na técnica. Os meio adequados são disponíveis de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, ele pode ser recuperado de lisados celulares.

[00324] O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, a formação de um produto de enzima, ou o desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo. Os polipeptídeos com melhor atividade celulolítica são detectados usando os métodos aqui descritos.

[00325] O caldo resultante pode ser usado como tal, ou o polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o variante pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas sem limitação, centrifugação, filtração, extração, secagem por aspersão, evaporação ou precipitação. Em um aspecto, todo o caldo de fermentação é recuperado.

[00326] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, cromatografia (por exemplo, de troca iônica, de afinidade, hidrofóbica, focagem isoelétrica e por exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos substancialmente puros.

[00327] Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas certamente uma célula hospedeira que expressa um polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo.

[00328] Os exemplos não limitantes a seguir ilustram adicionalmente as composições, métodos e tratamentos de acordo com a presente descrição. Pode-se observar que a descrição não é limitada aos detalhes específicos concebidos nos exemplos.

Exemplos Exemplo 1: Esterase(s) como desintoxicação para a hidrólise do material celulósico pré-tratado. Material celulósico pré-tratado

[00329] O resíduo de milho foi pré-tratado no U.S. Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL) usando ácido sulfúrico diluído. De acordo com o NREL, os sólidos insolúveis em água no resíduo de milho pré-tratado (PCS) continham 57,5 % de celulose, 7,0 % de hemicelulose e 27,2 % de lignina, os quais foram determinados pelo laboratório de procedimento analítico (LAP) do NREL “Determinação de carboidratos e lignina estruturais na biomassa”. Os sólidos totais (TS) do PCS foram de 28,9 % e a fração de sólidos insolúveis (FIS), assim como a fração (%, p/p) de sólidos insolúveis nos sólidos totais foi de 61,5 %. O TS e FIS foram determinados com base no LAP do NREL “Determinação de sólidos totais na biomassa e sólidos totais dissolvidos nas amostras líquidas do processo”. Coleta de licor para pré-tratamento

[00330] O licor foi coletado a partir do resíduo de milho ácido exposto à explosão de vapor. O PCS foi preparado como uma lama em água com um nível de sólidos totais finais (TS) de 15 % em peso, com mistura em temperatura ambiente por 5 horas, e o licor foi coletado por filtração a vácuo por meio de um filtro de fibra de vidro (Whatman GF/D). Antes dos experimentos, o pH foi ajustado para 5,0. PCS lavado

[00331] O PCS lavado (PCSw) foi obtido a partir de uma lavagem completa do PCS, até que o filtrado apresentasse pH neutro. Desintoxicação do licor de PCS com esterases

[00332] Um volume de 20 mL do licor de PCS foi tratado com: (1) ácido ferúlico esterase (FAE) de Humicola, (2) FAE de Aspergillus niger (SEQ ID NO: 133), (3) FAE de Aspergillus oryzae (SEQ ID NO: 134), (4) FAE de Chaetomium globusam (SEQ ID NO: 135) ou (5) esterase de Aspergillus oryzae (SEQ ID NO: 136) a 100 ppm (proteína na solução de enzima vs. licor), pH 5,0 por 16 horas em frascos de vidro de 50 mL. Hidrólise de PCSw na presença de licor desintoxicado pré- tratado

[00333] A hidrólise enzimática de PCSw em tampão acetato 75 mmol/L, e na presença dos licores desintoxicados tratados enzimaticamente e do controle correspondente (licor não tratado), foi realizada em uma placa de crescimento celular de polipropileno de 24 poços (5 mL) (Whatman Uniplate). Uma quantidade de 2,5 g de lama de PCSw a 8 %, com pH pré- ajustado para 5 e pré-misturado em tampão acetato 150 mmol/L, foi misturada com 2,5 mL dos licores desintoxicados tratados enzimaticamente, e com 62 μL de preparação celulolítica compreendendo celulases de Trichoderma reesei, polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica de Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656 A2) e proteína de fusão de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637), em uma concentração final de 5 mg-proteína/g-celulose. As reações de hidrólise com 4 % de TS foram incubadas a 50°C com agitação (150 rpm) por 120 horas. Todos os experimentos relatados foram realizados em triplicata. Determinação do rendimento da glicose

[00334] Após a hidrólise, as amostras foram filtradas usando um filtro de seringa a 0.20 μm (Millipore, Bedford, MA, USA) e os filtrados foram analisados em relação ao teor de açúcar, da maneira descrita a seguir. Quando não usadas imediatamente, as alíquotas filtradas foram congeladas a -20°C. As concentrações de açúcar das amostras diluídas em H2SO4 0,005 M foram medidas usando uma coluna de 4,6 x 250 mm AMINEX® HPX-87H (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) por eluição com H2SO4 0,005 M, a 65°C, em uma vazão de 0,6 mL por minuto, e a quantificação por integração dos sinais de glicose, celobiose e xilose a partir da detecção do índice refrativo (CHEMSTATION®, AGILENT® 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) foi calibrada por amostras de açúcar puro. Os equivalentes de glicose e celobiose resultantes foram usados para calcular o percentual de conversão de celulose para cada reação.

[00335] A glicose, celobiose e xilose for a avaliadas individualmente. As concentrações de açúcar avaliadas foram ajustadas com o fator de diluição apropriado. Nestes casos, as concentrações líquidas dos açúcares produzidos enzimaticamente foram determinadas ajustando as concentrações de açúcar avaliadas com as concentrações de açúcar anteriores correspondentes no ponto de tempo zero. Todo o processamento dos dados de HPLC foi realizado usando o software MICROSOFT EXCEL™ (Microsoft, Richland, WA, USA).

[00336] O grau de conversão de celulose em glicose foi calculado usando a seguinte equação: % de rendimento de glicose = concentração de glicose/concentração de glicose em uma digestão limite.

[00337] A concentração de glicose em uma digestão limite foi determinada levando em consideração a análise de composição de material pré-tratado, os sólidos insolúveis e o volume de líquido na hidrólise. Foi usada a seguinte equação:

[00338] Concentração de glicose em uma digestão limite = [Peso de biomassa pré-tratada x % de sólidos insolúveis na biomassa pré-tratada x % de celulose x 1,111 x 0,1]/[Peso da lama na hidrólise - sólidos totais na hidrólise].

[00339] O fator 1,111 leva em consideração o aumento na massa quando a celulose é convertida em glicose. O fator 0,1 é para transformar % em g/L. No denominador, existe o peso do licor na hidrólise e que presume a densidade como um, e é o volume do licor da hidrólise que contém os açúcares. Os pontos de dados em duplicata foram tiveram sua média calculada e o desvio padrão foi calculado. Resultados

[00340] As melhorias na hidrólise enzimática de PCSw na presença dos licores de PCS tratados com esterases da presente descrição são apresentadas na tabela 1 (Hidrólise de PCSw na presença de licores de PCS tratados com esterases, com 5 mg-proteína/g-celulose a 4 % de TS de PCSw, pH 5,5 e 50°C por 120 horas.). Tabela 1

[00341] Será entendido que as várias modificações podem ser realizadas com as modalidades aqui descritas. Portanto, a descrição anterior não deve ser interpretada como limitante, mas meramente como exemplificações das modalidades. Os versados na técnica poderão perceber outras modificações no escopo e espírito das reivindicações em anexo neste documento.

Claims (8)

1. Processo para refinamento enzimático de um material celulósico pré-tratado, caracterizado pelo fato de que compreende: - separar um licor do material celulósico pré-tratado; - contatar o licor com feruloil esterase como definido na SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136 ou SEQ ID NO: 137, e - reciclar o licor de maneira tal que seja colocado em contato com o material celulósico pré-tratado ou com um material celulósico pré- tratado que tenha sido contatado com feruloil esterase para formar um material celulósico pré-tratado refinado.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente pós-tratar o material celulósico pré-tratado refinado com um pré-tratamento enzimático, pré-tratamento químico, pré-tratamento mecânico e/ou um pré-tratamento físico.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente recuperar o material celulósico pré-tratado refinado.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o colocar em contato com a feruloil esterase é realizado com 0,0005 a 5 mg de feruloil esterase por g de material celulósico pré-tratado.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o colocar em contato com feruloil esterase é realizado com um total de sólidos (TS) de 1 % a 50 %.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o colocar em contato com feruloil esterase é realizado em um pH de 2 a 9.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o colocar em contato é realizado em uma temperatura na faixa de 20°C a 70°C.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o colocar em contato com feruloil esterase é realizado por um período de tempo de 5 minutos a 35 horas.