JPH06506829A - セルラーゼによる綿含有織物の処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 セルラーゼによる綿含有織物の処理方法発明の背景 １、　産業上の利用分野 本発明は綿含有織物をセルラーゼで処理する改善された方法、並びにこれらの方 法により製造された織物に関するものである。特に本発明の改善方法は、綿含有 織物を、実質的に全てのＣＢＨｌ型のセルラーゼ成分を含まない菌類セルラーゼ 組成物を含有する水溶液と接触せしめることに関する。その綿含有織物をそのよ うな溶液で処理する場合、生成した織物は、処理前の織物と比較して、例えば肌 触り、外観、および／または柔らかさ等において期待した高品質なものであり、 その織物はまた、より高濃度のＣＢＨｌ型成分金成分するセルラーゼ組成物で処 理した織物と比較して強度の損失が減少したものである。

２、　従来技術 織物の製造中または直後に、綿含有織物は、その織物に所望の特性を与えるため にセルラーゼで処理することができる。例えば、織物業界において、綿含有織物 の肌触りおよび／または外観を改善するため、綿含有ニットから表面の繊維を除 去するため、そして綿含有デニム等にストーンウォッシュの外観を与えるために セルラーゼが用いられている。

特に、日本の特願昭５８−３８２１７号および５ｇ−５４０１２号、並びに大行 らの「セルラーゼによる綿織物の再形成」およびＪＴ　Ｎ　１９８８年１２月の 雑誌の「新たなことｍ−綿織物の感触を軟化せしめる重量損失処理」はそれぞれ 、セルラーゼによる綿含有織物の処理がその織物に改善された肌触りを与えるこ とを開示している。一般的に、このセルラーゼ処理は、綿毛および／または表面 の繊維を除去し、このことは織物の重量を減少させると思われている。これらの 効果の組合せにより、その織物に改善された肌触り、すなわち絹のような織物の 肌触りを与えられる。

加えて従来は、これらの織物に通常である折れた繊維や糸を除去する目的のため に、綿含有編物を、撹拌およびカスケード条件下で、例えばジェットの使用によ りセルラーゼ溶液で処理することが当業者に知られている。そのように処理する 場合、緩衝液は選択した染料で染料濃淡に不利に影響すると思われているので、 緩衝液は通常用いられない。

今までさらに、撹拌およびカスケード条件下で綿含有織物をセルラーゼ溶液によ り処理することが従来技術において知られている。そのように処理した場合、そ の綿含有織物は処理前の織物と比較して改善された肌触りと外観を示す。

最後に、これまで、撹拌およびカスケード条件下、すなわち、回転ドラム洗濯機 における綿含有染めデニムのセルラーゼ溶液による処理はそのデニムに「ストー ンウォッシュ」の外観を与えることが知られている。

そのような綿含有織物のセルラーゼ溶液での処理に関連する通常の問題は、処理 した織物が未処理織物と比較して著しい強度の損失を示すことである。セルラー ゼがセルロース（β−１，４−グルカン結合）を加水分解し、このことが次々に 綿高分子の部分の分断となり得るために、強度の損失が生じる。だんだん綿高分 子が分裂（分断）されるに連れ、織物の引張強さが減少する。

綿織物に亘るセルラーゼ溶液の撹拌およびカスケードを含む方法はより短い反応 時間しか必要としないので、これらの方法は、撹拌およびカスケードを含まない セルラーゼ処理方法と比較して減少した強度損失の綿含有織物を提供するものと 思われている。いずれにせよ、そのような方法ではまだ著しい強度損失となる。

したがって、処理前の織物と比較したセルラーゼによる処理により生成した処理 綿含有織物において、所望の高められた性能を達成するが、減少した強度損失を 提供するためにそのようなセルラーゼ処理方法改良することが特に望ましい。

加えて、セルラーゼの菌類源は、非常に大量のセルラーゼを分泌することが知ら れているため、またさらにそのような菌類源の発酵方法並びにセルラーゼを単離 する単離および精製方法が従来技術において知られているために、そのような菌 類セルラーゼを肌触りおよび／または外観を改善する方法に用いることは特に有 利である。

発明の概要 本発明は、綿含有織物を菌類セルラーゼで処理するこれまでに知られている方法 が、１つ以上のＥＧ型成分がらなり、十分に低濃度のＣＢＨＩ型成分を含有する 菌類セルラーゼ組成物を用いることにより改善できるという発見に基づくもので ある。驚いたことに、ＥＧ型成分は、セルラーゼ組成物で処理する前の織物と比 較して、肌触り、外観、柔らかさ、色彩、および／またはストーンウォッシュの 外観に関する処理織物に高められた質を与えられることを発見した。加えて、処 理織物における強度損失のかなりの部分の原因となるのは、ＥＣ型成分と結合し たＣＢＨＩ型成分であることが分かった。したがって、本発明において、綿含有 織物を処理するのに用いられるセルラーゼ組成物は、強度損失抵抗性であるよう に、十分に低濃度のＣＢＨＩ型成分を含有するように作られる。

上記点から見たその方法の１つの面において、本発明は、綿含有織物の菌類セル ラーゼ組成物での処理を行なう改善された方法に基づき、ここでその改善は、１ つ以上のＥＧ型成分および１つ以上のＣＢＨＩ型成分からなる菌類セルラーゼ組 成物を使用することからなり、該セルラーゼ組成物は、５：１より大きな、全て のＣＢＨＩ型成分に対する全てのＥＧ型成分のタンパク質重量比を有する。好ま しい実施態様において、ここに用いられる菌類セルラーゼ組成物は、１つ以上の ＥＧ型成分および１つ以上のＣＢＨ型成分からなり、該セルラーゼ組成物は、５ ：１より大きな、全てのＣＢＨ型成分に対する全てのＥＧ型成分のタンパク質重 量比を有する。さらに別の好ましい実施態様において、その菌類セルラーゼ組成 物は、セルラーゼ組成物中のタンパク質の合計重量に基づいて、少なくとも約１ ０重量パーセント、好ましくは少なくとも約２０重量パーセントのＥＧ型成分か らなる。

その方法の別な面において、本発明は、綿含有織物の菌類セルラーゼ水溶液での 処理を行なう改善された方法に基づき、該方法は、その織物に亘リセルラーゼ溶 液のカスケード効果を生成するような条件下でセルラーゼ溶液の撹拌を行ない、 ここでその改善は、１つ以上のＥＧ型成分および１つ以上のＣＢＨｆ型成分から なる菌類セルラーゼ組成物を使用することからなり、該セルラーゼ組成物は、５ ：１より大きな、全てのＣＢＨＩ型成分に対する全てのＥＧ型成分のタンパク質 重量比を有する。好ましい実施態様において、ここに用いられる菌類セルラーゼ 組成物は、１つ以上のＥＧ型成分および１つ以上のＣＢＨ型成分からなり、該セ ルラーゼ組成物は、５：１より大きな、全てのＣＢＨ型成分に対する全てのＥＧ 型成分のタンパク質重量比を有する。さらに別の好ましい実施態様において、そ の菌類セルラーゼ組成物は、セルラーゼ組成物中のタンパク質の合計重量に基づ いて、少なくとも約１０重量パーセント、好ましくは少なくとも約２０重量パー セントのＥＧ型成分からなる。

本発明の方法により処理された綿含有織物は、より多量のＣＢＨＩ型成分を含有 する菌類セルラーゼ組成物で処理した織物と比較した減少した強度損失を示すが 、処理前の織物と比較して予期した高められた質を有する。減少した強度損失は 、本発明の方法が強度損失抵抗性であることの根拠となる。

その組成物の面において、本発明は、上述した本発明の方法において処理した綿 含有織物に基づく。

図面の簡単な説明 図１は、ｐΔＣＢＨＩＩ））’ｒ４の構成の概略図である。

図２は、１つのＴ、ｒｅｅｓｅｉ染色体上のｃｂｈｌ座でのｐΔＣＢＨＩｐｙｒ ４からの大きなＥｃｏＲ１断片の組込みによるＴ、ｒｅｅｓｅｉ遺伝子の削除を 説明する図。

図３は、プローブとして３２ｐ標識ｐΔＣＢＨＩ　ｐｙ　ｒ４を用いたサザン分 析後のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐ）’ｒ４で転換したＴ、ｒｅｅｓｅｉ菌株 ＧＣ６９からのＤＮＡのオートラジオグラフである。分子量マーカーのサイズは 、図の左側にキロベースベアで示す。

図４は、プローブとして３２ｐ標識ｐｌｎｔｃＢＨＩを用いたサザン分析後のＥ ｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４で転換したＴ、ｒｅｅｓｅｉ菌株ＧＣ６９か らのＤＮＡのオートラジオグラフである。分子量マーカーのサイズは、図の左側 にキロベースペアで示す。

図５は、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉの野生型により、そして転換菌株により分泌されたタ ンパク質を示す等電点電気泳動ゲルである。特に、図５において、等電点電気泳 動ゲルのレーンＡはＴ、ｒｅｅｓｅｉからの部分的精製ＣＢＨＩを用いている； レーンＢは野生型Ｔ、ｒｅｅｓｅｉを用いている；レーンＣはｃｂｈｌ遺伝子が 欠失されたＴ、ｒｅｅｓｅｉ菌株からのタンパク質を用いている；そしてレーン Ｄはｃｂｈｌ遺伝子およびｃｂｈ２遺伝子が欠失されたＴ。

ｒｅｅｓｅｉ菌株からのタンパク質を用いている。図５において、図の右側は、 １つ以上の分泌タンパク質に発見された単一のタンパク質の位置を示すように印 を付けたものである。特に、ＢＧはβ−グルコシダーゼを指し、Ｅｌはエンドグ ルカナーゼＩを指し、Ｒ２はエンドグルカナーゼＩＩを指し、Ｒ３はエンドグル カナーゼＩＩＩを指し、Ｃ１はエキソ−セロビオヒドロラーゼＩを指し、そして Ｃ２はエキソ−セロビオヒドロラーゼＩＩを指す。

図６Ａは、ゲノムＤＮＡ上の４．ｌｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片としてクローンしたＴ 、ｒｅｅｓｅｉ　ｃｂｈ２座を示した図であり、図６Ｂは、ｃｂｈ２遺伝子欠失 ベクターｐＰΔＣＢＨＩＩを示した図である。

図７は、プローブとして１２ｐ標識ｐＰΔＣＢＨＩＩを用いたサザン分析後のＥ ｃｏＲＩ切断ｐＰΔＣＢＨＩＩで転換したＴ、ｒｅｅｓｅｉ菌株Ｐ３７ＰΔＣＢ ＨＩＰｙｒ２６からのＤＮＡのオートラジオグラフである。分子量マーカーのサ イズは、図の左側にキロベースペアで示す。

図８は、プラスミドｐＥＧＩｐｙｒ４のダイヤグラムである。

図９は、４０℃でのｐＨ範囲に亘るＴｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅ　ｒｍａ　ｒｅｅｓｅ ｉから誘導された酸性ＥＧ豊富菌類セルラーゼ組成物（ＣＢＨ１およびＩＩを欠 失した）のＲＢＢ−ＣＭＣ活性プロフィール、並びに４０℃でのｐＨ範囲に亘る Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから誘導された豊富ＥＧＩＩＩセルラー ゼ組成物の活性プロフィールを説明する図である。

図１０は、様々な量のＣＢＨ成分を有するセルラーゼ組成物で処理した綿含有織 物のランダロメータ（ｌａｕｎｄｅ　ｒ　ｏｍｅ　ｔ　ｅ　ｒ）中の３回の洗濯 後の強度損失の結果を説明する図である。

図１１は、様々なｐＨでの野生型Ｔｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅ　ｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ により分泌されたセルラーゼで処理した綿含有織物の繊維除去の結果（パネルテ ストスコアに基づく）を説明する図である。

図１２は、野生型Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉにより分泌された様々 な濃度のセルラーゼ（ｐｐｍ）で処理した綿含有織物、およびＣＢＨＩおよびＣ ＢＨ１■を分泌できないように遺伝学的に設計したＴｒ　ｉ　ｃｈ。

ｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの菌株により分泌されたセルラーゼで処理した綿織物 の繊維除去の結果（パネルテストスコアに基づく）を説明する図である。

図１３は、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩを分泌できないように遺伝学的に変更した Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの菌株から誘導した様々な濃度（ｐｐｍ ）のＥＧ豊富セルラーゼ組成物の柔軟さのパネルテストを説明する図である。

図１４は、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を生成するためにｅｇｌ ｌおよびｃｂｈｌに作られた部位特定交代のダイヤグラムである。それぞれの場 合において、上側のラインは元のＤＮＡ配列を示し、導入された変化を中はどの ラインに示し、新たな配列は下側のラインに示す。

図１５は、ｐｃＥＰｃｌから得られるより大きなＥｃ。

Ｒ１断片のダイヤグラムである。

図１６は、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ＲｕｔＣ３０の未変換菌株からの、およびＴ、ｒ ｅｅｓｅｉをＥｃｏＲＩ切断ｐＣＥＰＣＩで変換することにより得られた２つの 形質転換株からのＤＮＡのオートラジオグラフである。ＤＮＡをＰｓｔｌで切断 して相補性ＤＮＡ鎖が得られ、３２Ｐ標識ｐＵＣ４に：　：　ｃｂｈｌで雑種形 成した。マーカーＤＮＡ断片のサイズは図の左側にキロベースの組で示す。

図１７は、プラスミドｐＥＧＩＩ　：　：Ｐ−１のダイヤグラムである。

図１８は、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　ＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＥｃｒ　Ｉ　：　 ：Ｐ−１で変換したＴ、ｒｅｅｓｅｉ菌株Ｐ３７ＰΔΔ６７Ｐ１からのＤＮＡの オートラジオグラフである。相補性ＤＮＡ鎖を調製し、ＤＮＡは、ｅｇ１３遺伝 子を含有する放射線標識Ｔ、ｒｅｅｓｅｉＤＮＡの約４ｋｂ　Ｐｓｔｌ断片で雑 種形成した。ラインＡ、ＣおよびＥは、未変換株からのＤＮＡを含有し、一方Ｂ ＳＤおよびＦは、未変換Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株からのＤＮＡを含有する。

Ｔ、ｒｅｅｓｅｉＤＮＡを、ラインＡ、ＢのＢｇｌｌｌで、ラインＣ，ＤのＥｃ ｏＲＶで、そしてラインＥ、ＦのＰｓｌｏで切断した。マーカーＤＮＡ断片のサ イズは図の左側にキロベースペアで示す。

図１９は、プラスミドｐＰΔＥＧＩ−１のダイヤグラムである。

図２０は、ＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３により得られた菌株ＧＣ６ ９の形質転換株から単離したＤＮＡの相補性ＤＮＡ鎖のオートラジオグラフであ る。未変換株に予期したプローブ、放射線標識ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３による雑種 形成の模様をレーンＣに示す。レーンＡはｅｑ１１遺伝子が分裂した形質転換株 に予期された模様を示し、レーンＢはｐΔＥＧＩｐｙｒ−３ＤＮＡがゲノム中に 組込まれたがｅｑｌｌ遺伝子を分裂しない形質転換株を示す。

レーンＤはＨｉｎｄｌｌｌで切断したｐΔＥＧＩｐｙｒ−３を含有し、適切なサ イズのマーカーを提供する。マーカーＤＮＡ断片のサイズは図の左側にキロベー スベアで示す。

発明の詳細な説明 上述したように、本発明の方法は、綿含有織物をセルラーゼで処理する従来の方 法における改良である。その改良は、所望の高められた質を織物に与えるが、そ の織物の強度の損失を最小限にする特定のセルラーゼ組成物を用いることからな る。しかしながら、本発明を詳細に述べる前に、以下の用語を最初に定義する。

「綿含有織物」という用語は、純粋な綿または綿織物、綿ニット、綿デニム、綿 より糸等を含む綿ブレンドから作られた縫ったまたは縫わない織物を指す。綿ブ レンドを用いる場合、織物中の綿の量は、少なくとも約４０重量パーセントの綿 、好ましくは約６０重量パーセントの綿、最も好ましくは約７５重量パーセント の綿であるべきである。

ブレンドとして用いられる場合、その織物中に用いられる他の材料は、ポリアミ ド繊維（例えば、ナイロン６およびナイロン６６）、アクリル繊維（例えば、ポ リアクリロニトリル繊維）、およびポリエステル繊維（例えば、ポリエチレンテ レフタレート）、ポリビニルアルコール繊維（例えば、ビニロン）、ポリ塩化ビ ニル繊維、ポリ塩化ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ポリ尿素繊維、および アラミド繊維のような合成繊維を含む１つ以上の非綿繊維を含んでもよい。レー ヨンのような再生セルロースが本発明の方法の綿に代替として用いることができ ると考えらる。

ここに用いられた「仕上げ」という用語は、織物上のセルラーゼのセルロースを 加水分解する活性を実質的に妨げるために十分な量の仕上げ剤を綿含有織物に施 すことを意味する。仕上げ剤は一般的に、例えば、柔軟さ、ドラバビリティ−（ ｄｒａｐａｂｉ　１　ｉ　ｔｙ）等の織物の特性を高める目的のために、織物の 製造工程の最後またはそのあたりで施され、それにより、セルラーゼとの反応か ら織物を保護する。綿含有織物を仕上げるのに便利な仕上げ剤は、従来技術にお いて知られており、メラミン、グリオキサール、または尿素ホルムアルデヒド、 並びにろう、シリコン、蛍光化学種、および４原子（ｑｕａｔｅｒｎａｒｉｅｓ ）のような樹脂製材料を含む。そのように仕上がった場合、綿含有織物は実質的 にセルラーゼに対する反応性が低い。

「菌類セルラーゼ」という用語は、菌類から得られたセルラーゼ遺伝子の全てま たは一部を含有し表現するために遺伝学的に変更された菌類源または微生物から 誘導された酵素組成物を指す。菌類セルラーゼはセルロースとその誘導体に作用 し、セルロースを加水分解し、主生成物、グルコースとセロビオースを与える。

菌類セルラーゼは、放線菌、滑走細菌（粘液細菌）および真性細菌のような微生 物を含む非菌類源から生成したセルラーゼから区別される。

ここに記載したセルラーゼ組成物を調製するのに都合のよいセルラーゼを生成す ることのできる菌類は、英国特許第２．０９４，８２６号に開示されており、そ の開示をここに参照文献として用いる。

最良の菌類セルラーゼは一般的に、酸性または中性のｐＨ範囲において最大の活 性を有するが、いくつかの菌類セルラーゼが、中性およびややアルカリ性の条件 下で著しい活性を有することが知られており、すなわち、例えばＨｕｍｉｃｏｌ ａ　１ｎｓｏｌｅｎｓから誘導されたセルラーゼは中性からややアルカリ性条件 下で著しい活性を有することが知られている。

菌類セルラーゼは、異なる基質特異性、酵素的作用ノくターン等を有するいくつ かの酵素分類からなることが知られている。加えて、各分類内の酵素成分は、異 なる分子量、ことなるグリコジル化度、異なる等電点、異なる基質特異性等を示 し得る。例えば、菌類セルラーゼは、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、エキソ−セ ロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、β−グルコシダーゼ（ＢＧ）等を含むセルラー ゼ分類を含む。一方、細菌セルラーゼが、はとんどまたは全くＣＢＨ成分を含有 しないと文献に報告されているが、細菌セルラーゼから誘導されたＣＢＨ状成分 がエキソ−セロビオヒドロラーゼ活性を有すると報告されたことはまれである。

自然に発生した菌類源により産生されて１つ以上のＣＢＨおよびＥＧ酸成分らな る菌類セルラーゼ組成物は、これらの成分それぞれが菌類源により産生された比 率で発見され、ここではときどき「完全菌類セルラーゼ系」または「完全菌類セ ルラーゼ組成物」と称され、その組成物を、そこから単離されたセルラーゼの分 類および成分から、細菌とある菌類により産生された不完全セルラーゼ組成物か ら、またはセルラーゼのＣＢＨおよび／またはＥＧ酸成分生産しないように、ま たは産生過剰、産生不足となるように遺伝学的に修飾した微生物から得たセルラ ーゼ組成物から区別する。

セルラーゼの産生のための菌類を培養する発酵方法は、従来技術においてそれ自 体が知られている。例えば、セルラーゼ系は、バッチ、フェト−バッチ（ｆｅｄ −ｂａｔｃｈ）および連続流動工程を含む固体または浸水培地のいずれかにより 産生され得る。発酵肉汁（ｂ　ｒ　ｏ　ｔ　ｈ）からのセルラーゼ系の集積およ び精製はまた、従来技術においてそれ自体が知られている方法により達成される 。

［エンドグルカナーゼ（ｒＥＧＪ　）型成分」は、それら全ての菌類セルラーゼ 成分またはＴｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅ　ｒｍａｒｅｅｓｅｉのエンドグルカナーゼ成 分に似た布地活性特性を示す成分の組合せを示す。この点に関して、Ｔｒｉｃｈ ｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのエンドグルカナーゼ成分（特に、ＥＧ　ｌ５ＥＧ 　Ｉ！、ＥＧ　ＩＩＩ等を単一または組合せで）は、これらの成分が布地処理媒 質中に含有され、その織物がこの媒質で処理された場合、（処理前の織物と比較 して）綿含有織物に、改良された肌触り、改良された外観、柔軟さ、高められた 色彩、および／またはストーンウォッシュの外観を与える。加えて、綿含有織物 のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅＬのエンドグルカナーゼ成分による処理 は、類似の組成物での処理であるが追加にＣＢＨＩ型成分を含有する処理により 生じた強度の損失と比較してより少ない強度の損失となる。

したがって、エンドグルカナーゼ型成分は、これらの成分が、織物を処理するの に用いられる媒質中に含有される場合に、（処理前の織物と比較して）綿含有織 物に、改良された肌触り、改良された外観、柔軟さ、高められた色彩、および／ またはストーンウォッシュの外観を与え、そして類似のセルラーゼ組成物での処 理であるが追加にＣＢＨ１型成分を含有する処理により生じた強度の損失と比較 してより少ない強度の損失を与える菌類セルラーゼ成分である。

そのようなエンドグルカナーゼ型成分は、（ａ）カルボキシメチルセルロース（ ＣＭＣ）のような溶性セルロース誘導体を加水分解して、それにより溶液を含有 するＣＭＣの粘度を減少せしめる、（ｂ）リン酸膨潤セルロース（例えば、ワル セスセルロース）のようなセルロースの水和形態を容易に加水分解する、および セルロースのより高度な結晶性形態（例えば、アビセル、ソルカフロク等）を容 易ではないが加水分解する、成分の能力のような活性試験を用いてエンドグルカ ナーゼとして因襲的に分類される成分は含まない。一方で、そのような活性試験 により定義されるような全てのエンドグルカナーゼ成分が、綿含有織物に、１つ 以上の高められた質、並びに減少した強度損失を与えるわけではないと思われて いる。したがって、エンドグルカナーゼ型成分を、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒ ｅｅｓｅｉのエンドグルカナーゼ成分により所有されるような類似の布地活性特 性を所有する菌類セルラーゼの成分として定義することが本発明にとってより正 確である。

菌類セルラーゼは１つより多いＥＧ型成分を含有し得る。

異なる成分は一般的に、異なる等電点、異なる分子量、異なるグリコジル化度、 異なる基質特異性、異なる酵素活性パターン等を有する。成分の異なる等電点に より、イオン交換クロマトグラフィー等による分離が可能となる。実際、異なる 菌類源からの成分の単離は従来技術において知られている。例えば、ボルフらの 米国特許出願０７／４２２．８１４、シュラインらの、国際出願Ｗ　０８９１０ ９２５９、ウッドらのセルロース分解の生化学および遺伝学、３１から５２（１ ９８８）　；ウッドらの炭化水素リサーチ、１９０巻、２７９から２９７　（１ ９８ｇ）　；シュライン、酵素学における方法、１６０巻、２３４から２４２（ １９８８）等を参照のこと。これらの各参照文献の完全な開示を、ここに引用す る。

一般的に、ＥＧ型成分の組合せは、綿含有織物に高められた質を与え、並びに単 一のＥＧ酸成分比較して減少した強度損失を与える際に、相乗応答を示すと考え られている。

一方では、単一のＥＧ型成分はより安定であり、ｐＨ範囲に亘り広いスペクトル の活性を有する。したがって、本発明に用いられるＥＧ型成分は、単一のＥＧ型 成分または２つ以上のＥＧ型成分の組合せのいずれかである。成分の組合せが用 いられる場合、ＥＣ型成分は同一または異なる菌類源ら誘導される。

ＥＧ型成分は細菌的誘導セルラーゼから誘導され得る。

「エキソ−セロビオヒドロラーゼ型ＣｒＣＢＨ型」〕成分ｊは、Ｔｒｉｃｈｏｄ ｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＣＢＨＩおよび／またはＣＢＨＩＩセルラーゼに類似 した布地活性特性を示す菌類セルラーゼ成分を指す。この点に関して、ＥＧ型酸 成分セルラーゼ成分不在下で用いられた場合（上記定義したように）、Ｔｒｉｃ ｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ酸成分みでは、その 処理した綿含有織物に、肌触り、外観、色彩および／またはストーンウォッシュ の外観において著しい増大を与えない。したがって、ＥＧ型成分と組み合わせて 用いた場合、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＣＢＨ１成分は、その綿 含有織物に高められた強度の損失を与える。

したがって、ＣＢＨＩ型成分およびＣＢＨＩＩＩ型成分、それぞれＴｒｉｃｈｏ ｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ成分と類似した布地活性 特性を示す菌類セルラーゼ成分を指す。上述したように、ＣＢＨＩ型成分に関し て、このことは、ＥＧ型成分の存在下で用いられる場合、綿含有織物の強度損失 を高める特性を含む。好ましい実施態様においてＥＧ型成分と組み合わせて持ち いられる場合、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＣＢＨＩ型成分は増大 した洗浄効果を与える。

したがって、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＣＢＨＩ型成分は、ＥＧ 型成分と組み合わせてまたは単一で用いられる場合、増大した柔軟効果を与えら れる。

そのようなエキソ−セロビオヒドロラーゼ型成分はどうしても、Ｔｒｉｃｈｏｄ ｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩを特徴付けるのに用いられ たような活性試験を用いてエキソ−セロビオヒドロラーゼとして因襲的に分類さ れた成分は含まない。例えば、そのような成分は、（ａ）セルビオースにより競 争的に阻害されるＣＫｉは約１ｒｎＭ）；　（ｂ）カルボキシメチルセルロース 等のような置換セルロースを著しくは加水分解できない；（ｃ）リン酸膨潤セル ロースを加水分解し、高度な結晶性セルロースはあまり加水分解しない。一方で は、活性試験によりＣＢＨ成分として特徴付けられたある菌類セルラーゼ成分は 、セルラーゼ組成物中で単体で用いられる場合、最小限の強度損失を有する綿含 有織物に、改善された肌触り、外観、柔軟さ、色彩、および／またはストーンウ ォッシュの外観を与える。したがって、エキソ−セロビオヒドロラーゼ成分は、 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのエンドグルカナーゼ成分により所有さ れるような布地用途の類似の機能特性を所有するので、そのようなエキソ−セロ ビオヒドロラーゼをＥＧ型成分として定義することが本発明に関してより正確で あると思われる。

ＣＢＨＩ不足、ＣＢＨＩ豊富またはＥＧＩＩＩ豊富であるセルラーゼ組成物を含 有する洗浄剤成分に関して、セルロースから還元糖を生成するのはセルラーゼの 量であり、特定の酵素成分の加水分解の相対比率ではなく、このことが綿含有織 物に所望の洗浄剤特性を与える、例えば、１つ以上の改善された色彩の復元、改 善された柔軟さ、および改善された洗浄力をその洗浄剤組成物に与えることが発 見された。

１つ以上のＥＧ型成分および１つ以上のＣＢＨＩ型成分を有する菌類セルラーゼ であって、５；１より大きな全てのＣＢＨＩ型成分に対する全てのＥＧ型成分の タンパク質の重量比を有する菌類セルラーゼは、精製技術により得られる。つま り、完全なセルラーゼ系は、適切なｐＨでのイオン交換クロマトグラフィー、親 和力クロマトグラフィー、サイズ排除等を含む、文献によく発表されている認識 された分離技術により実質的に純粋な成分に精製できる。

例えば、イオン交換クロマトグラフィーにおいて（通常は陰イオン交換クロマト グラフィー）、ｐＨ勾配、または塩勾配、またはｐＨと塩勾配により溶出するこ とによりセルラーゼ成分を分離することができる。精製後、所望の成分の必要量 を再結合せしめられる。

また、ＣＢＨＩ型セルラーゼ成分に対するＥＧ型成分の必要な比を有するセルラ ーゼ成分の混合物は、単離および成分の組換え以外の方法で調製できると考えら れる。この点に関して、ＣＢＨ成分に対するＥＧ酸成分比較的高い比率を与える ために、天然微生物の発行条件を偏光することもできる。同様に、ＣＢＨ型成分 に対するＥＧ型成分の比較的高い比率を有するセルラーゼ組成物の混合物を産生 ずるために、組換え技術がそのＣＢＨ型成分に対するＥＧ型成分の比較的高い比 率を変更できる。

上述した点に関して、ここに記載したセルラーゼを調製する好ましい方法は、１ つ以上の酸性ＥＧ型成分を過剰酸性するように微生物を遺伝学的に修飾すること によるものである。同様に、その方法がどのような異種タンパク質を産生じない １つ以上のＣＢＨ型成分を産生できないように、微生物を遺伝学的に修飾するこ ともできる。そのような場合、その改良微生物により産生されたセルラーゼの必 要量は、１つ以上のＥＧ型成分および１つ以上のＣＢＨＩ型成分を有する菌類セ ルラーゼであって、５：１より大きな全てのＣＢＨＩ型成分に対する全てのＥＧ 型成分のタンパク質の重量比を有する菌類セルラーゼを提供するように、天然微 生物（すなわち、ＣＢＨＩ型成分を含有する）により産生されたセルラーゼと結 合される。

上述した点に関して、例えば、１９９０年ｌｏ月５日に出願され、ここに全てを 参照文献として含む米国特許出願節０７７５９３．９１９号は、１つ以上のＣＢ Ｈ成分を産生できないようにおよび／または１つ以上のＥＧ酸成分過表現できな いように、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉを遺伝学的に精製する方法を 開示している。さらに、その用途の方法は、どのような異種タンパク質をも表現 しないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ菌株を産生ずる。同様に、ミラー らの、ｒＡｓｐｅｒｑｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ中の直接および非直接遺伝 子置換」分子およびセルラ生物学、１７１４−１７２１　（１９８５）は、異種 ＤＮＡの線形断片を用いたＤＮＡ媒介転換によりＡｓｐｅｒｑｉｌｌｕｓ　ｎ１ ｄｕｌａｎｓ中の遺伝子を削除する方法を開示している。ミラーらの方法は、ど のような異種タンパク質を産生ずることなく遺伝子削除を達成する。

上述した点に関して、ＣＢＨＩ型および／またはＣＢＨＩＩ型セルラーゼ成分を 産生ずる責任のある遺伝子の削除は、セルラーゼ組成物中に存在するＥＧ型成分 の量を豊富にする効果を有する。

菌類セルラーゼ組成物は、低濃度のＣＢＨＩ型成分を産生ずる菌類源からここに 用いられると考えられる。

加えて、従来の方法により生成される１つ以上のＣＢＨＩ型成分の必要量は、Ｃ ＢＨＩ型成分に対するＥＧ型成分野の特定比率を達成するようにＣＢＨＩ型成分 を産生できないように遺伝学的に製造された微生物から産生されたセルラーゼ組 成物に加えられる。すなわち、ＥＧ型成分が豊富であるように全てのＣＢＨ型成 分を含まないセルラーゼ組成物は、セルラーゼ組成物に対する２重量パーセント の精製ＣＢＨＩ型成分（またはＣＢＨＪＩ型成分）金成分ることによるだけで、 ２重量パーセントのＣＢＨ１型成分（またはＣＢＨＩＩＩ型成分を含有するよう に配合される。

「β−グルコシダーゼ（ＢＧ）成分」は、ＢＧ活性を示すセルラーゼ成分を指し 、すなわちそのような成分はセロビオースの非還元末端および他のセロオリゴ糖 類（「セロビオース」）から作用し、単一産生物としてのグルコースを与える。

ＢＧ酸成分セルロース高分子上に吸着されず、または反応しない。さらに、その ようなりＧ成分は競争的にグルコースにより阻害される（Ｋｉは約１ｍＭ）。厳 密な意味において、ＢＧ酸成分セルロースを分解できないので文字通りにはセル ラーゼではないが、そのようなりＧ成分は、これらの酵素が、ＣＢＨ成分および ＥＧ酸成分結合作用により産生された阻害セルロース分解産生物（特にセロビオ ース）をさらに分解することによりセルロースの全体的な分解を促進させるため 、セルラーゼ系の定義内に含まれる。ＢＧ酸成分存在なくしては、結晶性セルロ ースの加水分解は緩やかにしかまたはほとんど生じない。ＢＧ酸成分しばしば、 ｐ−ニトロフェノールＢ−Ｄ−グルコシド（ＰＮＰＧ）のようなアリル基質に特 徴付けられ、それゆえしばしばアリル−グルコシダーゼと呼ばれる。全てのアリ ルグルコシダーゼがＢＧ酸成分あるわけではなく、あるものはセロビオースを加 水分解しない。

セルラーゼ組成物中のＢＧ酸成分存在または不在は、組成物中のＣＢＨ成分の活 性を調整するのに用いられると考えられる（すなわち、非ＣＢＨＩ型成分）。つ まり、セロビオースはＣＢＨ成分によるセルロース分解中に産生されるので、そ して高濃度のセロビオースがＣＢＨ活性を阻害することが知られているので、さ らにそのようなセロビオースはＢＧ酸成分よりグルコースに加水分解されるので 、セルラーゼ組成物中のＢＧ酸成分不在は、セロビオースの濃度が阻害水準に達 する場合にＣＢＨ活性を「消失コさせる。また、１つ以上の添加剤（例えば、セ ロビオース、グルコース等）を、そのセルラーゼ組成物に加えて、直接にまたは 間接的に、いくらかのまたは全てのＣＢＨＩ酸油性、並びに他のＣＢＨ活性を効 果的に「消失」できると考えられる。そのような添加剤が用いられた場合、用い る添加剤の量が、ここに記載したセルラーゼ組成物を用いることにより達成され るＣＢＨＩ皇后性水準と等しい水準、またはそれより少ない水準まで、ＣＢＨＩ 酸油性を低くするのに十分であれば、生成した組成物は本発明への使用に適した 組成物であると考えられる。

一方、ＣＢＨ成分により生成されたセロビオースの水準が、添加したＢＧ酸成分 不在下でそのような全体の加水分解の制限となる場合、添加した量のＢＧ酸成分 含有するセルラーゼ組成物は、セルロースの全体の加水分解を増大させる。

セルラーゼ組成物中のＢＧ酸成分量を増加せしめるまたは減少せしめるいずれか の方法が、事務所明細書番号０１００５５−０５６として１９９０年１２月１０ 日に出願され、［クローニングによるセルロースの糖化およびＴＲＩ　ＣＨＯＤ ＥＲＭＡＲＥＥＳＥＩによるβ−グルコシダーゼ遺伝子の増幅」と題された米国 特許出願第０７７６２５．１４０号に記載されており、ここにその全体を参照文 献として含む。

菌類セルラーゼは１つ以上のＢＧ酸成分含有できる。異なる成分は一般的に、イ オン交換クロマトグラフィー等によりそれらの分離を可能にする異なる等電点を 有する。単体ＢＧ酸成分たはＢＧ酸成分組合せのいずれかが用いられる。

布地処理溶液中で用いられる場合、ＢＧ酸成分一般的に、セルラーゼ組成物中に 発見されるどのようなＣＢＨおよびＥＧ酸成分セルラーゼによる阻害を防ぐのに 十分な量で加えられる。加えるＢＧ酸成分量は、当業者により容易に決定される 布地組成物中に産生されるセロビオースの量に依存する。しかしながら、使用さ れる場合、セルラーゼ組成物中に存在するいかなるＣＢＨ型成分と比較したＢＧ 酸成分重量パーセントは、好ましくは約０．　２から約１０重量パーセントであ り、より好ましくは約０．　５から約５重量パーセントである。

本発明に用いられる菌類セルラーゼ組成物を調製するのに使用される好ましい菌 類セルラーゼは、Ｔｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ％Ｔｒｉｃｈｏｄ ｅｒｍａ　ｋ。

ｎｉｎｇｉｆ、Ｐｅｎｃｉｌｌｕｍ　ｓｐ、、Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅ ｎｓ、等から得られるものである。

ある菌類セルラーゼは市販されている。すなわち、セルキャスト（デンマーク、 コペンハーゲン、ノボインダストリー社から得られる）、ラビダーゼ（オランダ 、デルフト、Ｎ、Ｖ、　、ギストブロケイド社から得られる）、サイトラーゼ１ ２３（カリフォルニア州、南すンフランシスコ、ジネンカーインターナショナル 社から得られる）等である。

他の菌類セルラーゼもまた、周知の発酵および単離方法により容易に単離できる 。

「緩衝溶液」という用語は、綿含有織物のセルラーゼ処理中に変動する所望では ないｐＨに対するセルラーゼ溶液を安定化させる周知の酸／塩基試薬を指す。こ の点に関して、セルラーゼ活性はｐＨに依存することが知られている。

すなわち、特定のセルラーゼ組成物が、定義されたｐＨ範囲内にセルロースを加 水分解する活性を示し、その定義された小さな部分内に最適なセルロースを加水 分解する活性が一般的に発見される。セルロースを加水分解する活性の特定なｐ Ｈ範囲は各セルラーゼ組成物により変化する。上述したように、はとんどのセル ラーゼは、酸性から中性ｐＨプロフィール内でセルロースを加水分解する活性を 示すが、アルカリ性のｐＨプロフィールにおいてセルロースを加水分解する活性 を示すセルラーゼ組成物もある。

綿含有織物のセルラーゼ処理中に、最初のセルラーゼ溶液のｐＨはセルラーゼ活 性に要求される範囲の外側にあることもあり得る。さらに、綿含有織物の処理中 に、例えば溶液のｐｇを変更する反応生成物の生成により、ｐＨが変化すること も有り得る。いずれの場合にも、干渉していないセルラーゼ溶液のｐＨはセルロ ースを加水分解する活性に要求される範囲の外側に有り得る。このようなことが 生じた場合、セルラーゼ溶液中で所望でない還元またはセルロースを加水分解す る活性の停止が生じる。例えば、産生活性プロフィールを有するセルラーゼが中 性に緩衝されない水溶液中で用いられる場合、溶液のｐＨは、より低いセルロー スを加水分解する活性およびおそらくセルロースを加水分解する活性の停止とな る。一方、中性に緩衝していない水溶液中で中性またはアルカリ性のプロフィー ルを有するセルラーゼの使用は、最初に著しいセルロースを加水分解する活性を 提供する。

上述した観点から見て、セルラーゼ溶液のｐＨはセルロースを加水分解する活性 に要求される範囲内に保持されるべきである。このことを達成する１つの手段は 、単にその系のｐＨをモニタして、酸また塩基いずれかの添加により所望のｐＨ を調製することによるものである。しかしながら、好ましい実施態様において、 系のｐＨは好ましくは、セルラーゼ溶液中に緩衝液を使用することにより所望の ｐＨ範囲内に保持される。一般的に、使用したセルラーゼが活性を示す範囲内に 溶液のｐＨを保持するために、十分な量の緩衝液を使用する。異なるセルラーゼ 組成物がセルロースを加水分解する活性を示す異なるｐＨ範囲を有する限りは、 使用する特定の緩衝液は、使用する特定のセルラーゼ組成物に関連して選択され る。使用するセルラーゼへの使用のために選択する緩衝液は、ｐＨ範囲および使 用するセルラーゼに最適な条件並びにセルラーゼ溶液のｐＨを考慮にいれた当業 者により容易に決定できる。好ましくは、使用する緩衝液は、セルラーゼ組成物 と相溶性であり、セルラーゼ溶液のｐ）１を最適な活性に要求されるｐｎ範囲内 に保持するものである。適した緩衝液は、クエン酸ナトリウム、酢酸アンモニウ ム、酢酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム、および他の従来技術において知られ ている緩衝液を含む。

綿含有織物の引張強さは、互いに直角であるたて方向とよこ方向に関して測定で きる。したがって、ここに用いる「たて引張強さ」という用語は、綿含有織物の 長さ方向に沿って測定された綿含有織物の引張強さを指し、一方「よこ引張強さ 」という用語は、綿含有織物の幅方向を横切って測定された綿含有織物の引張強 さを指す。セルラーゼ溶液で処理した綿含有織物の引張強さを、処理の強さ減少 効果を決定するために、セルラーゼ溶液による処理の前の引張強さと比較する。

その引張強さがあまりにも減少せしめられる場合は、生成した綿含有織物が容易 に裂けるおよび／または孔を形成する。したがって、処理の後に、少なくとも処 理前の引張強さの約５０％である引張強さを保持することが望ましい（たておよ びよこの両方）。

綿含有織物の引張強さは、ＡＳＴＭ　Ｄ１６８２試験方法論に従って容易に導か れる。そのような織物の引張強さを試験するのに適した装置は、スコツトテスタ ーまたはインストロンテスターを含み、その両方が市販されている。

セルラーゼ溶液で処理した綿含有織物の引張強さを試験する際に、処理後で試験 前の織物の収縮を避けるように注意しなければならない。そのような収縮は、誤 った引張強さのデータの原因となる。

綿含有織物への高められた質はここに用いられている方法により達成される。例 えば、改善された肌触りを有する綿含有織物は、日本国特開昭５８−３８２１７ および５Ｂ−５４０ｇｚ並びに大行らの「セルラーゼによる綿織物の再形成」お よびＪＴ　Ｎ　１９８８年１２月ジャーナルアーティクル「新たなこと、綿織物 の感触を柔らかくする重量損失処理」により達成できる。これらの文献のそれぞ れの教示をここに参照文献として含む。

同様に、綿含有織物の肌触りと外観の両者を改良する方法は、溶液が撹拌され、 その綿含有織物に亘りセルラーゼ溶液のカスケード効果が達成されるような条件 下でセルラーゼを含有する水溶液にその織物を接触せしめることを含む。そのよ うな方法により、そのように処理された綿含有織物の改善された肌触りと外観が 導かれ、１９９０年ＩＯ月１６日に出願され、ここに全体が参照文献として含ま れる米国特許出願第０７７５９８，５０６号に記載されている。

綿含有ニットを高める方法が、１９９０年第２期の国際紡績会報の５頁の染色／ 印刷／仕上げにおいて記載されており、ここに参照文献として含まれている。

同様に、ストーンウォッシュの外観を綿含有デニムに与える方法が、米国特許第 ４．８３２．８８４号に記載されており、ここにその全体が参照文献として含ま れる。

セルラーゼ組成物での処理により綿含有織物を高める他の方法も従来技術におい て知られている。好ましくはそのような方法において、セルラーゼによる綿含有 織物の処理は、綿含有織物を仕上げる前に行なわれる。

上述したように、本発明が、処理織物の強さ損失を最小限にする特定のセルラー ゼ組成物を用いる限りは、本発明は綿含有織物を処理する従来技術の方法より優 れた改善である。ここに用いるセルラーゼ組成物は、１つ以上のＥＧ型成分およ び１つ以上のＣＢＨ型成分からなる菌類セルラーゼ組成物であって、そのセルラ ーゼ組成物は、５：１より大きな、全てのＣＢＨ型成分に対する全てのＥＧ型成 分の重量比を有する。

加えて、ここに記載するセルラーゼ組成物の使用により、応力の加えられた綿含 有織物において織物／色彩を高められたものとする。つまり、綿含有織物の製造 中に、その織物には応力が加えられ、そのように応力が加えられた場合、その織 物は、破壊されて乱れた繊維を含有する。そのような繊維は、織物にすり切れて さえない外観を有害に与える。

しかしながら、本発明の方法により処理した場合、そのように応力の加えられた 織物は織物／色彩の高められたものとなる。このことは、応力の加えられる前に 織物の外観を復元する効果を有する、破壊されて乱れた繊維のいくつかを除去す ることにより生じると思われる。

加えて、顔料型染色織物（例えば、デニム）に関して、ここに記載されたセルラ ーゼ組成物を用いることにより、これらのセルラーゼ組成物は、染料の再析出を より少なく生じさせる。また、これらの抗再析出特性は、他の成分と比較して１ つ以上の特定ＥＧ型成分について高められると考えられる。

上述した菌類セルラーゼ組成物は、セルラーゼおよび、例えば緩衝液、界面活性 剤、精練剤等を含む他の必要に応じての成分を含む水溶液中で用いられる。この 溶液に用いられるセルラーゼの濃度は、一般的にその意図する目的に十分な量で ある。すなわち、セルラーゼ組成物は、綿含有織物に所望の高められた質を提供 する量で用いられる。使用されるセルラーゼ組成物の量はまた、用いられる装置 、用いられる方法のパラメータ（セルラーゼ溶液の温度、セルラーゼ溶液への露 出時間、等）、セルラーゼ活性（例えば、セルラーゼ溶液は、少ない活性のセル ラーゼ組成物と比較してより高い活性のセルラーゼ組成物では低い濃度を要する ）、等に依存する。セルラーゼ組成物の正確な濃度は、上述した要因並びに所望 の効果に基づいて当業者により容易に決定され得る。好ましくは、ここに使用す るセルラーゼ溶液中のセルラーゼ組成物の濃度は、セルラーゼ溶液の０．０１グ ラム／リツトルからセルラーゼ溶液の約１０．０グラム／リットル；さらに好ま しくは、セルラーゼ溶液の０．０５グラム／リツトルからセルラーゼ溶液の約２ グラム／リツトルである。（上述したセルラーゼ濃度は全タンパク質の重量を指 す）。

セルラーゼ溶液中に緩衝液を用いる場合、セルラーゼ水溶液中の緩衝液の濃度は 、使用するセルラーゼが、使用するセルラーゼの特性に依存する活性を示す範囲 内に溶液のｐＨを保持するのに十分なものである。使用する緩衝液の正確な濃度 は、当業者が容易に考慮できるいくつかの要因に依存する。例えば、好ましい実 施態様において、緩衝液並びに緩衝液の濃度は、最適なセルラーゼ活性に要求さ れるｐＨ範囲内にセルラーゼ溶液のｐＨを保持するように選択される。一般的に 、セルラーゼ溶液中に緩衝液濃度は約０．００５Ｎかそれより大きい。好ましく は、セルラーゼ溶液中の緩衝液の濃度は、約０，０１から約０，５Ｎであり、よ り好ましくは約０，０５から約０．１５Ｎである。

セルラーゼ溶液中の増大した緩衝液濃度が処理した織物の引張強さの損失率を高 めることも可能である。

セルラーゼと緩衝液に加え、セルラーゼ溶液は必要に応じて、少量、すなわち、 約２重量パーセント未満、好ましくは約０，０１から約２重量パーセントの界面 活性剤を含有できる。適した界面活性剤は、例えば、アニオン界面活性剤、非イ オン界面活性剤および両性電解質界面活性剤を含む織物およびセルラーゼに相溶 性であるどのような界面活性剤をも含む。

ここに使用する適したアニオン界面活性剤は、直鎖または枝別れ鎖アルキルベン ゼンスルホン酸塩；直鎖または枝別れ鎖のアルキル基またはアルケニル基を有す るアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまはアルケニル硫酸塩； オレフィンスルホン酸塩；アルカンスルホン酸塩等を含む。アニオン界面活性剤 に適した対イオンは、ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属イオン； カルシウムおよびマグネシウムのようなアルカリ土類金属；アンモニウムイオン ；および炭素数２または３の１から３のアルカノール基を有するアルカノールア ミンを含む。

両性電解質界面活性剤は、第４アンモニウム塩スルホン酸塩、ベタインタイプ両 性電解質界面活性剤等を含む。そのような両性電解質界面活性剤は同一の分子中 に陽に荷電した基と陰に荷電した基の両方を有する。

非イオン性界面活性剤は一般的に、ポリオキシアルキレンエーテル、並びに高級 脂肪酸アルカノールアミドまたはそのアルキレン酸化物付加物、脂肪酸グリセリ ン七ジエステル等からなる。

そのような界面活性剤の混合物もまた用いられる。

ここに用いられる溶液比、すなわち、織物に対するセルラーゼ溶液の重量比は一 般的に、綿含有織物に所望の高められた質を達成するのに十分な量であり、使用 される方法および達成される質に依存する。好ましくは、溶液比は一般的に、約 ０．１：１かそれより大きく、さらに好ましくは約１：１より大きく、さらによ り好ましくは約ｌＯ：１より大きい。約５０＝１より大きな溶液比を使用するこ とは、経済的な点から見て通常好ましくはない。

セルラーゼ処理の反応温度は２つの競合因子により決定される。第１に、より高 い温度は一般的に、高められた反応速度論、すなわちより速い反応と対応し、こ のことはより低い温度で要求される反応時間と比較して減少した反応時間となる 。したがって、反応温度は一般的に少なくとも約３０℃かそれより大きい。第２ に、セルラーゼは、所定の反応温度を超えると活性を失うタンパク質であり、そ の温度は、用いられるセルラーゼの特性に依存する。それゆえ、反応温度が非常 に高くなる場合、セルロースを加水分解する活性が、セルラーゼの変性の結果と して失われる。

その結果、ここに用いられる最大反応温度は一般的に約６５℃である。上述点に 関して、反応温度は一般的に、約３０℃から約６５℃であり、好ましくは約３５ ℃から約６０℃であり、さらに好ましくは約３５℃から約５０℃である。

反応時間は一般的に、約０．１時間から約２４時間であり、好ましくは約０．２ ５時間から約５時間である。

そのようなセルラーゼ組成物を用いた上述した方法で処理した綿含有織物は、完 全な菌類セルラーゼ組成物で同様な方法により処理した同一の綿含有織物と比較 して減少した強さ損失を有する。

好ましい実施態様において、上述した方法に使用するために、濃縮物を調製する ことができる。そのような濃縮物は、好ましくは水溶液中に、濃縮した量の、上 述したセルラーゼ組成物、緩衝液および界面活性剤を含む。そのように調合する 場合、その濃縮物は、素早くそして正確にこれらの添加物に必須の濃度を有する セルラーゼ溶液を調製するために水で容易に希釈できる。好ましくは、そのよう な濃縮物は、約０．１から約２重量パーセントの上述したセルラーゼ組成物（タ ンパク質）；約１０から約５０重量パーセントの緩衝液；約１０から約５０重量 パーセントの界面活性剤；および約０から８０重量パーセントの水からなる。水 性濃縮物が配合される場合、これらの濃縮物は、セルラーゼ溶液中の成分の必須 の濃度に達するように約２から約２００に因子により希釈される。容易に明確で あるように、そのような濃縮物により、セルラーゼ溶液の容易な調合が行なうこ とができ、並びに用いられる場所まで都合のよい濃縮の移送ができる。上述した セルラーゼ組成物は、液体希釈物、粒状、エマルジョン、ゲル、ペースト等のい ずれの状態の濃縮物にも加えられる。そのような形態は当業者によく知られてい る。

固体のセルラーゼ濃縮物が用いられる場合、そのセルラーゼ組成物は一般的に粒 状、粉末、凝集体、等である。粒状のものが用いられる場合、その粒状物は好ま しくはセルラーゼ保護剤を含むように調合できる。例えば、事務所明細書番号０ １００５５−０７３として１９９１年１月１７日に出願され、「酵素および酵素 保護剤の両者を含有する粒剤、並びにそのような粒剤を含有する洗浄剤組成物」 と称する米国特許出願第０７７６４２．６６９号を参照のこと。この応用はここ にその全体について参照文献として含まれる。同様に、粒剤は、その粒剤の洗浄 媒質への溶解の速度を減少させる物質を含有するように調合できる。そのような 物質は、事務所明細書番号ＧＣＳ−１７１−ＵＳＩとして１９９１年１月Ｉ７日 に出願され、「粒状組成物」と称する米国特許出願第０７７６４２．５９６号に 開示されており、その応用はここにその全体について含まれる。

ここに記載されたセルラーゼ組成物は、予備洗浄においても用いられ、そして液 体またはスプレーいずれかのブリソークとして用いられると考えられる。さらに 、ここに記載したセルラーゼ組成物はまた、高められた色彩と織物の外観に適し た１つの組成物として家庭で使用できると考えられる。例えば、米国特許第４． ７３１＋、６１１２号を参照のこと。

これはここにその全体について参照文献として含まれる。

以下の実施例は本発明を説明するために提示されたものであり、その視野を限定 するように解釈されるべきではない。

実施例 実施例１−１２および２２−３０は、１つ以上のセルラーゼ組成物を産生できな いように、または特定のセルラーゼ組成物を過剰産生ずるように、遺伝学的に設 計したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの産生を説明する。

実施例Ｉ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｐｙｒ４誘導体の選択 ｐｙｒ４遺伝子は、ウリジンの生合成に必要とされる酵素である、オロチジン− ５′−モノリン酸塩デカルボキシラーゼをコードする。毒性阻害因子５−フルオ ロオロチン酸（ＦＯＡ）が、野生型細胞によりウリジン中に含まれ、それゆえ細 胞を毒する。しかしながらＳ　ｐＹｒ４遺伝子中に検出される細胞はこの阻害因 子に対する抵抗を有するが、成長のためにウリジンを必要とする。それゆえ、Ｆ ＯＡを用いてｐｙｒ４誘導体菌株を選択することが可能である。

実際、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株ＲＬ−Ｐ３７の芽胞（シールーニース、Ｇ、および モンテンコート、Ｂ、Ｓ、　、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌ、２０％ｐ、　４１３−５３　（１９８４）　）を、２ｍｇ／ｍｌのウリ ジンおよび１．２ｍｇ／ｍｌのＦＯＡを含有する固体化した媒質の表面上に広げ た。３または４日以内に、自然なＦＯＡ抵抗群体が現れ、その後に、成長のため にウリジンを必要とするそれらのＦＯＡ抵抗誘導体を同定することができる。特 異的に欠損ｐｙｒ４遺伝子を有したそれらの誘導体を同定するために、プロトプ ラストを産生じ、野生型ｐｙｒ４遺伝子を含有するプラスミドで転換した（実施 例３および４参照）。転換に続いて、プロトプラストを、ウリジンを欠いた媒質 上に展開した。転換群体の続いての成長は、プラスミドボーン（ｂｏｒｎｅ）　 ｐＹｒ４遺伝子による欠損ｐｙｒ４遺伝子の補完を示した。このようにして、菌 株ＧＣ６９を、菌株ＲＬ−Ｐ３７のｐｙｒ４誘導体であると同定した。

実施例２ ＣＢＨＩ欠失ベクターの調製 ＣＢＨＩタンパク質をコードするｃｂｈｌ遺伝子を、既知のプローブ合成方法を 用いた、この遺伝子に関して公表された配列を元にして設計したオリゴヌクレオ チドプローブでの雄型形成により、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株ＲＬ−Ｐ３７のゲノム ＤＮＡからクローンした（シューメーカーら、１９８３ｂ　）。ｃｂｈｌ遺伝子 は、６．５ｋｂ　ＰｓｔＩ断片上に存在し、当業者に知られた技術を用いてこの ベクターのＫａｎ’遺伝子を置換することによりＰｔ５ｌ切断ｐｔｙＣ４Ｋ　（ ＮＪ、ビス力タウエイ、ファーマシア社がら購入）中に挿入され、この技術はマ ニアチスらにより述べられており（１９８９）　、ここに参照文献として含む。

次いで産生じたプラスミド、ｐＵＣ４に：　：ｃｂｈｌをＨｉｎｄｌ　Ｉ　１で 切断し、約６ｋｂのより大きな断片を単離して、再結さつしてｐＵＣ４に：　： 　ｃｂｈｌΔＨ／Ｈを与えた（図１参照）。この方法は、完全なｃｂｈｌ暗号配 列および約１゜２ｋｂ上流と１．５ｋｂ下流下流側列配除去する。元来のＰｓｔ Ｉ断片のいずれかの末端からの、おおよそｌｋｂの側腹ＤＮＡが残る。

Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子を、マニアチスらの方法に従って、ｐＵｃ１ ８中のゲノムＤＮＡの６．５ｋｂＨｉｎｄｌｌｌ断片としてクローンし、ｐｒｐ ｙｒ２（スミスら、１９９１）を形成した。プラスミドｐＵＣ４に：　：ｃｂｈ ｌΔＨ／ＨをＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで切断し、その末端を子牛腸アルカリ性ホスフ ァターゼで脱リンした。この末端脱リンＤＮＡを、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４ 遺伝子を含有する６、５ｋｂ　）ｉｉｎｄｌＩＩ断片と連結し、ｐΔＣＢＨＩｐ ｙｒ４を得た。図１はこのプラスミドの構成を説明している。

実施例３ プロトプラストの単離 ５００ｍ１のフラスコ中の１００ｍ１のＹＥＧ　（０，５％の酵母抽出物、２％ のグルコース）を約５Ｘ１０７のＴ。

ｒｅｅｓｅｉ　ＧＣ６９芽胞（ｐｙｒ４誘導体菌株）で接種することにより菌糸 体を得た。次いでそのフラスコを振動させながら３７℃で約１６時間、培養した 。２．　７５０Ｘｇでの遠心分離により菌糸体を収穫した。収穫した菌糸体をさ らに、１．２Ｍソルビット溶液中で洗浄し、５ｍｇ／ｍｌのノボザイム２３４溶 液（Ｃｔ、ダンバリー、ノボバイオラボから得られる、１．３−アルファーグル カナーゼ、１．３−ベーターグルカナーゼ、ラミナリナーゼ、キシラーゼ、キチ ナーゼおよびプロテアーゼを含有する多成分酵素系の商標である）；５ｍｇ／ｍ ｌのＭｇＳＯ４争７Ｈ２０；　０．５ｍｇ／ｍ１の牛血清アルブミン、１．２Ｍ ソルビットを含有する４０ｍ１の溶液中に再懸濁せしめた。

プロトプラストを、ミラクロス（ＣＡ、ラジョラ、カルビオケム社）を通じての 濾過により細胞デブリから除去し、２．０００ｇでの遠心分離により集積した。

そのプロトプラストを、１，２Ｍのソルビット中で３回洗浄して、１゜２Ｍのソ ルビット、５０ｍＭのＣａＣ１２中で１回洗浄し、遠心分離し、１．２Ｍソルビ ット、５０ｍＭのＣａＣ１゜のｍ１当たり約２Ｘ１０’プロトプラストの密度で 再懸濁せしめた。

実施例４ 菌類プロトプラストのｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４による転換実施例３において調製し た２００μｌのプロトプラスト懸濁液を、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍｌ　） リス、ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐＹｒ ４Ｃ実施例２において調ｉ２）、および２５％ＰＥＧ　４０００，０．６Ｍ　Ｍ ＣＩおよび５０ｍＭのＣａｃ１□を含有する５０μ】のポリエチレングリコール （ＰＥＧ）溶液に加えた。この混合物を２０分間、氷上で培養した。この培養期 間の後に、そこに上述のように同定した２、０ｍｌのＰＥＧを加え、その溶液を さらに混合し、室温で５分間培養した。この第２の培養後、１．２Ｍのソルビッ トおよび５０ｍＭのＣａＣ１２を含有する４、０ｍｌの溶液をそれに加え、この 溶液をさらに混合した。次いでそのプロトプラスト溶液を、追加の１％のグルコ ース、１．２Ｍのソルビットおよび１％のアガロースを含有するボゲルス媒質Ｎ （１リツトル当たり、３グラムのクエン酸ナトリウム、５グラムのＫＨ２ＰＯ４ ，２グラムのＮＨ４ＮＯ３，０，２グラムのＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０，１グラ ムのＣａＣｌ２”２Ｈ２０，５μｇのα−ビオチン、５ｍｇのクエン酸、５ｍｇ のＺｎ５Ｏ４ｅ７Ｈ２０，１ｍｇのＦ　ｅ　（ＮＨ４）　２　ｌｌ６Ｈ２０，０ ，２５ｍｇのＣｕＳＯ４−５Ｈ２０，５０μｇのＭ　ｎ　Ｓ　Ｏ４・４　Ｈ２０ ）の溶解アリコートに直ちに加えた。次いでプロトプラスト／媒質混合物を、上 述した同一のボゲル媒質を含有する固体媒質上に注いだ。その媒質中にはウリジ ンは全く存在せず、それゆえ、転換群体のみが、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４中に挿入 された野生型ｐｙｒ４遺伝子による菌株ＧＣ６９のｐｙｒ４突然変異の補完の結 果として成長することができた。これらの群体を続いて転移せしめ、添加剤とし て１％のグルコースを含有する固体水ゲル媒質Ｎ上に精製し、安定な形質転換体 をさらなる分析のために選択した。

この段階において、安定な形質転換体を、そのより速い成長速度およびウリジン を欠いた固体培養媒質上のぎざぎざというよりもむしろ滑らかな輪郭を有する円 形の群体の形成により不安定な形質転換体とは区別した。ある場合においては、 固体の非選択性媒質（すなわち、ウリジンを含有する）上に形質転換体を成長さ せ、この媒質から芽胞を収穫し、続いて発芽してウリジンを欠いた選択性媒質上 に成長するこれらの芽胞の百分率をめることにより、さらなる安定性の試験を行 なった。

実施例５ 形質転換体の分析 形質転換体が、１％のグルコースを含有する液体水ゲル媒質Ｎ中で成長せしめら れた後に、ＤＮＡを、実施例４で得られた形質転換体から単離した。これらの形 質転換体ＤＮＡ試料をさらにＰｓ　ｔ　ＩｖＩ限酵素で切断し、アガロースゲル 電気泳動を行なった。次いでそのゲルを、ニドラン膜フイルタ上にブ０７トし、 １２ｐＩＩｌｌ識ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４プローブで雑種形成した。プローブを選 択して、６．５ｋｂ　Ｐｓｔｌ断片としての天然ｃｂｈｌ遺伝子、転換ＤＮＡ断 片から誘導されたいかなるＤＮＡ配列および天然ｐｙ「４遺伝子を同定した。

雑種形成からの放射線活性帯は、オートラジオグラフィーにより顕像化された。

そのオートラジオグラフィーを図３に示す。上述したように５つの試料Ａ、Ｂ、 Ｃ，ＤおよびＥを試験した。Ｅは未転換菌株ＧＣ６９であり、本分析において対 照として用いた。レーンＡからＤは、上述した方法により得られた形質転換化体 を示す。オートラジオグラフィーの横倒の数は、分子量マーカーのサイズを示す 。

このオートラジオグラフィーから分かるように、レーンＤは６．５ｋｂ　ＣＢＨ Ｉ帯を含まず、この遺伝子が全体的に、ｃｂｈｌ遺伝子でのＤＮＡ断片の組込み により形質転換体中に欠失されたことを示す。ｃｂｈｌ欠失菌株はＰ３７ＰΔＣ ＢＨＩと呼ばれる。図２は、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ染色体の１つのｃｂｈｌ座でのｐ ΔＣＢＨｒｐｙｒ４からのより大きなＥｃｏＲＩ断片の二重交さの発生を通じて の組込みによるＴ、ｒｅｅｓｅｆ　ｃｂｈｌ遺伝子の欠失の概略を示す。分析し た他の形質転換体は、未転換対照菌株と同一であると思われる。

実施例６ ｐｌｎｔｃＢＨＩを有する形質転換体の分析使用したプローブが３２ｐ標識ｐ　 １　ｎ　ｔ　ＣＢＨＩプローブに代わったことを除いては、実施例５と同一の方 法を本実施例において用いた。このプローブは、ｐＵｃ４に：　：　ｃｂｈ、］ ΔＨ／Ｈ中で欠失された領域内のｃｂｈｌ座からの２ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ断片を含 有するｐＵＣ−型プラスミドである。この実施例において、対照、未転換菌株Ｇ Ｃ６９である試料Ａ１形質転換体Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩを含む２つの試料を分析し た。図４から分かるように、６．５ｋｂでの帯により示されるように、試料Ａは ｃｂｈｌ遺伝子を含有した。しかしながら、形質転換体、試料Ｂはこの６．５ｋ ｂでの帯を含有せず、それゆえｃｂｈｌ遺伝子を含有せず、ｐＵＣプラスミドか ら誘導されたいかなる配列をも含有しない。

実施例７ 菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩによるタンパク質分泌産生したＰ３７ＰΔＣＢＨＩ菌株 からの芽胞を、１％のグルコース、０．１４％の（ＮＨ４）　２　Ｓ　０４．０ ．　２％のＫＨ２ＰＯ４，０，０３％のＭｇＳＯ４，０，０３％の尿素、０．７ ５％のバクトドリブトン（ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ）、０．０５％のツイー ン（Ｔｗｅｅｎ）８０．０．００００１６％のＣｕＳＯ４・５Ｈ２０，０，００ １％のＦｅ３Ｏ４・７Ｈ２０，０，０００１２８％のＺｎＳｏ４−７Ｈ２０，０ ，０００００５４％のＮａ２ＭｏＱ４・２Ｈ２０、および０．００００００７％ のＭｎＣ１φ４Ｈ２０を含有する５０ｍ１のＴｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅ　ｒｍａ基礎 媒質中に接種した。その媒質を振動させながら、２５０ｍ１のフラスコ中、３７ ℃で約４８時間、培養した。産生じた菌糸体わミラクロス（カルバイオケム社） を通過させた濾過により集積し、１７ｍＭのリン酸カリウムで２または３回洗浄 した。その菌糸体は最終的に、１ｍＭのソフォロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）を 有する１７ｍＭのリン酸カリウム中で懸濁せしめ、さらに振動させながら３０℃ で２４時間、培養した。次いで上澄みをこれらの培養物から集積し、菌糸体を捨 てた。培養上澄みの試料を、ファーマシアファストゲルシステムおよび製造者の 指示に従ったｐＨ３−９プレキヤストゲルを用いた等電点電気泳動により分析し た。そのゲルは銀染料で染色し、タンパク質帯を顕像化した。ｃｂｈｌタンパク 質に対応する帯は、図５に示すように、菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩから誘導した試 料には存在しなかった。この等電点電気泳動ゲルは、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉの異なる 上澄み培養中の様々なタンパク質を示す。レーンＡは部分的に精製したＣＢＨＩ であり、レーンＢは未転換Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ培養からの上澄みであり、レーンＣ は本発明の方法により産生された菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩからの上澄みである。

様々なセルラーゼ成分の位置を、ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩ　Ｉ、ＥＧＩ、ＥＧＩＩ、 およびＥＧＩＩＩで標識する。ＣＢＨＩは全細胞外タンパク質の５０％を構成す るので、ＣＢＨＩは主な分泌タンパク質であり、それゆえゲル上で最も暗い帯と なる。この等電点電気泳動ゲルは明確に、Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ菌株中のＣＢＨＩ タンパク質の欠失を示す。

実施例８ ｐＰΔＣＢＨＩＩの調製 ＣＢＨＩＩタンパク質をコードするＴ、ｒｅｅｓｅｉのｃｂｈ２遺伝子は、図６ への図表に示すゲノムＤＮＡの４゜１ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片としてクローンしで ある（チェノら、１９８７、バイオテクノロジー５　：　２７４−２７８）。こ の４．ｌｋｂ断片をｐＵＣ４ＸＬのＥｃｏＲＩ部位の間に挿入した。後者のプラ スミドは、ここに示す順番：Ｅｃ。

Ｒ１，ＢａｍＨＩ、Ｓａｃ　Ｉ、Ｓｍａｌ、Ｈｉｎｄｌ　ＩＬＸｈｏｌ、Ｂｇｌ ｌｌＳＣｌａｌ、Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ、ＸｈｏＩ。

Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ、Ｓｍａ　ｌ５Ｓａｃ　ＩＳＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＬで 配列した制限エンドグルカナーゼ部位の相称的な模様を有する多重クローニング 部位を含有するｐＵＣ誘導体（ジネンカーインターナショナル社のＲ，Ｍ、ベー カにより構成された）である。従来技術において知られている方法を用いて、プ ラスミド、ｐＰΔＣＢＨＩＩ（図６Ｂ）を構成し、ここで（ＣＢＨＩＩ翻訳開始 部位の７４ｂｐ３′での）Ｈｉｎｄｌ　ｌ　１部位と（ＣＢＨＩＩの最後のコド ンの２６５ｂｐ３’での）Ｃｌａｌ部位との間のこの遺伝子の１．７ｋｂ中央領 域を除去し、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子を含有する１、６ｋｂ　Ｈｉｎ ｄｌｌｌ−Ｃ１ａｌ　ＤＮＡと置換した。

Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子を１，６ｋｂＮｈｅｌ−５ｐｈＩ断片上のｐ Ｔｐｙｒ２　（実施例２参照）から切除し、ｐＵｃ２１９のｓｐｈ　ＩとＸｂａ １部位との間に挿入しく実施例２５参照）、ｐ２１９Ｍを産生じた（スミスら、 １９９１、Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ　１９ｐ、２７−３３）。次いでｐｙｒ４遺伝 子を、一方の末端にＤＮＡの７ｂｐと、他方の末端１：ＤＮＡ（７）６ｂｐを有 し、ｐＵｃ２１９多重クローニング部位から誘導されたＨｉｎｄｌＩＩ−Ｃｌａ ｌ断片として除去し、ｃｂｈ２遺伝子のＨｉｎｄｌｌｌおよびＣ］ａＩ部位中に 挿入し、プラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩを形成した（図６Ｂ参照）。

このプラスミドのＥｃｏＲＩでの切断は、一方の末端でのｃｂｈ２座からの０． ７ｋｂの側端ＤＮＡ、他方の末端でのｃ　ｂ　ｈ　２座からの１．７ｋｂの側端 ＤＮＡおよび真中のＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子を有する断片を雌牛ずる 。

実施例９ Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株ＧＣ６９中のｃｂｈ２遺伝子の欠失実施例３および４に略 述した方法に従って、菌株のプロトプラストを産生し、ＥｃｏＲＩ切断ｐＰΔＣ ＢＨＩＩで転換する。形質転換体からのＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＡｓｐ７１ ８で切断し、アガロースゲル電気泳動を行なう。

ゲルからのＤＮＡを膜フィルタにプロットし、実施例１１の方法に従って３２ｐ 標識ｐＰΔＣＢＨＩＩで雑種形成する。

正確にｃｂｈ２座で組み込まれたｐＰΔＣＢＨＩＩからのＥｃｏＲＩ断片の単一 のコピーを有する形質転換体を同定する。その形質転換体はまた、実施例７にお けるような振動フラスコ中で成長せしめられ、培養上澄み中のタンパク質は等電 点電気泳動により試験される。このようにして、ＣＢＨＩＩタンパク質を産生し ないＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ＧＣ６９形質転換体が産生される。

実施例１０ Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩのｐｙｒ４誘導体の産生ｃｂｈｌ遺伝子に関して欠失された 形質転換体の芽胞（Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ）を、ＦＯＡ含有媒質上に展開した。

続いて、実施例１の方法を用いてこの形質転換体のｐｙｒ４誘導体を得た。この ｐｙｒ４菌株をＰ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ２．６と称した。

実施例１１ ｃｂｈｌに関して事前に欠失した菌株中のｃｂｈ２遺伝子の欠失 菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ２６を産生じ、実施例３および４において概略を 示した方法に従ってＥｃｏＴＩ切断ｐＰΔＣＢＨＩＩで転換した。

精製した安定形質転換体を実施例７のように振動フラスコ中で培養し、その培養 上澄み中のタンパク質を等電点電気泳動により試験した。どのようなＣＢＨＩＩ タンパク質も産生じなかった１つの形質転換体Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７と称する ）を同定した。図５のレーンＤは、本発明の方法に従って産生したｃｂｈｌおよ びｃｂｈ２遺伝子の両方を欠失した形質転換体からの上澄みを示す。

ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩとＡｓｐ７１８で切断した菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７か ら抽出し、アガロースゲル電気泳動を行なった。このゲルからのＤＮＡを膜フィ ルターにプロットし、３２ｐ標識ｐＰΔＣＢＨＩＩで雑種形成した（図７）。図 ７のレーンＡは、未転換Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株からのＤＮＡに関して観察された 雑種形成パターンを示す。

野生型ｃｂｈ２遺伝子を含有する４、ｌｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片が観察された。レ ーンＢは、菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７に関して観察された雑種形成パターンを 示す、１つの４．１ｋｂ帯が除去され、約０，９および３．１ｋｂの２つの帯に より置換された。これは、ｐＰΔＣＢＨＩ　ＩからのＥｃｏＲＩ断片の１つのコ ピーが正確にｃｂｈ２座で組み込まれた場合に予期されるパターンである。

同一のＤＮＡ試料をまたＥｃｏＲＩで切断し、サザン分析を上述したように行な った。この実施例において、プローブは３２ｐ標識ｐＩｎｔｃＢＨＩＩであった 。このプラスミドは、プラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩ中で欠失されたｃｂｈ２遺伝 子のその断片内からのｃｂｈ２遺伝子暗号配列の一部を含む。どの雑種形成も菌 株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７からのＤＮＡに関して見られず、このことはｃｂｈ２ 遺伝子が欠失されたこと、およびｐＵＣプラスミドから誘導されたどの配列もこ の菌株中に存在しなかったことを示す。

実施例１２ ｐＥＧＩｐｙｒ４の構成 ＥＧＩをコードするＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ｅｑｌｌ遺伝子は、公表された配列に従 って合成されたオリゴヌクレオチドでの雑種形成による菌株ＲＬ−Ｐ３７からの ゲノムＤＮＡの４．２ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてクローンされた（ベンチ ラら、１９８６、遺伝子４５　：　２５３−２６３　、パンアースデルら、１９ ８７、バイオ／テクノロジー５　：　６Ｏ−６４）、３．６ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌ ｌ−ＢａｍＨＩ断片をこのクローンから取り出して、ＨｉｎｄＩＩＩで切断した ｐＵｃ２１８　（ｐＵｃ２１９と同一であるが、反対の配向において多重クロー ニング部位を有する、実施例２５参照）およびｐＴｐｙｒ２から得たＴ、ｒｅｅ ｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子（実施例２参照）を含有する１、６ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩ Ｉ−ＢａｍＨＩ断片と連結し、プラスミドｐＥＧＩｐｙｒ４を得た（図８）、ｐ ＥＧＩｐｙｒ４のＨｉｎｄｌｌｌでの切断は、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉゲノムＤＮＡ（ ｅｇｌｌおよびｐｙｒ４遺伝子）のみを含有し、２つの遺伝子の間の２４ｂｐ配 列合成りＮＡおよび一方の末端での６ｂｐ配列合成りＮＡを除＜ＤＮＡの断片を 雌牛ずる（図８）。

実施例１３ サイトラーゼ１２３セルラーゼのセルラーゼ成分への精製サイトラーゼ１２３セ ルラーゼを以下のように分画した。

このセルラーゼ系のセルラーゼ成分の通常の分配は以下のとおりである： ＣＢＨＩ　４５−５５重量パーセント ＣＢＨＩＩ　１３−１５重量パーセントＥＧ　Ｉ　１１−１３重量パーセント ＥＧ　ＩＩ　８−１０重量パーセント ＥＧ　ＩＩＩ　１−４　重量パーセントＢＧ　０．５−１重量パーセント その分画は以下の樹脂を含有するカラムを用いて行なった：シグマケミカル社（ ＭＯ，セントルイス）からのセフ７デソクスＧ−２５ゲル濾過樹脂、ＩＢＦバイ オテクニクス（ＭＤ、サバジ）からのＳＰトリサクリルＭ陽イオン交換樹脂およ びＱＡ）リサクリルＭ陰イオン交換樹脂。ｐＨ６，８の１０ｍＭリン酸ナトリウ ム緩衝液とセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂で満たした３リツトルのカラム を用いてサイトラーゼ１２３セルラーゼ、０．５ｇを脱塩した。次いで脱塩溶液 をＱＡトリサクリルＭ陰イオン交換樹脂の２０ｍ１のカラムに装填した。このカ ラムに結合した分画はＣＢＨＩおよびＥＧ　Ｉを含有した。これらの成分を、０ から約５００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する水性勾配を用いて勾配溶出により 分離した。このカラムに結合しなかった分画はＣＢＨＩＩおよびＥＧＩＩを含有 した。これらの分画を、ｐＨ３，３の１０ｍＭのクエン酸ナトリウムで均衡化し たセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂のカラムを用いて脱塩した。次いでこの 溶液、２００ｍ１を、ＳＰトリサクリルＭ陽イオン交換樹脂の２０ｍ１のカラム に装填した。ＣＢＩ（ＩｆおよびＥＧＩＩを、０から約２００ｍＭの塩化ナトリ ウムを含有する水性勾配を用いて別々に溶出した。

上述した実施例１３の方法と類似した方法に従って、それらの成分中に分離でき る他のセルラーゼ系は、セルキャスト（デンマーク、コペンハーゲン、ノボイン ダストリーから得られる）、ラピダーゼ（オランダ、デルフト、Ｎ。

■９、ギストブロケイドから得られる）、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏ ｎｉｎｇｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ　ｓｐ、等から誘導したセルラーゼ系を含 む。

実施例１４ サイトラーゼ１２３セルラーゼからのＥＧ　ＩＩＩの精製上述した実施例１３は 、サイトラーゼ１２３セルラーゼからのいくつかの成分の単離を示した。しかし ながら、ＥＧ　ＩＩＩはサイトラーゼ１２３セルラーゼ中に非常に少量した存在 しないので、この成分を単離するのに以下の方法が用いられた。

Ａ、ＥＧＩＩＩセルラーゼ酵素の大規模な抽出１００リツトルの細胞不含有セル ラーゼ濾液を約３０℃まで加熱した。加熱した物質は、約り％重量／容積ＰＥＧ ３０００　（約５ｏｏｏの分子量、ポリエチレングリコール）および約り０％重 量／容積の無水硫酸ナトリウムから調製された。その混合物は２相液体混合物を 形成した。この相を、５Ａ−１ディスクスタック遠心分離機を用いて分離した。

その相を、銀染色等電点電気泳動ゲルを用いて分析した。分離によりＥＧ　ＩＩ Ｉおよびキシラナーゼを得た。

取り出した組成物は、約２０から５０重量パーセントのＥＧ　ＩＩＩを含有した 。

上述した方法に関して、約８０００未満の分子量を有するポリエチレングリコー ルの使用は分離に不適切であり、一方約５ｏｏｏより大きい分子量を有するポリ エチレングリコールの使用は取り出した組成物中の所望の酵素を排除することと なる。硫酸ナトリウムの量に関して、ｌｏ％重量／容積より大きな硫酸ナトリウ ムの水準は沈殿問題を引き起こし、一方り０％重量／容積未満の硫酸ナトリウム の水準では不十分な分離または１つの相中に残留する溶液となった。

Ｂ１分画によるＥＧ　ＩＩＩの精製 ＥＧ　ＩＩＩの精製は、野生型Ｔｒｉｃｈｉｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉにより産生 される完全な菌類セルラーゼ組成物（ＣＡ、南すンフランシスコ、ジネンカーイ ンターナショナルから市販されている、サイトラーゼ１２３セルラーゼ）からの 分画により行なわれる。つまり、分画は、以下の樹脂：シグマケミカル社（Ｍ　 ｏ　、セントルイス）から得られるセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂、ＩＢ Ｆバイオテクニクス（ＭＤ、サバジ）からのＳＰトリサクリルＭ陽イオン交換樹 脂およびＱＡトリサクリルＭ陰イオン交換樹脂を含有するカラムを用いて行なわ れる。ｐＨ６，８の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液とセファデックスＧ−２５ ゲル濾過樹脂で満たした３リツトルのカラムを用いてサイトラーゼ１２３セルラ ーゼ、０．５ｇを脱塩した。次いで脱塩溶液をＱＡトリサクリルＭ陰イオン交換 樹脂の２０ｍ１のカラムに装填した。このカラムに結合した分画はＣＢＨ１およ びＥＧ　Ｉを含有した。このカラムに結合しない分画は、ＣＢＨＩＩ、ＥＧ　Ｉ ＩおよびＥＧ　ＩＩＩを含む。これらの分画を、ｐＨ４，５の１０ｍＭのクエン 酸ナトリウムで均衡化したセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂のカラムを用い て脱塩した。次いでこの溶液、２００ｍ１を、ＳＰトリサクリルＭ陽イオン交換 樹脂の２０ｍ１のカラムに装填した。ＥＧＩＩＩを、２００ｍＭの塩化ナトリウ ム１００ｍ１で溶出した。

ＥＧ　ＩＩＩの単離能率を高めるために、１つ以上のＥＧ　Ｉ、ＥＧ　ＩＩ、Ｃ ＢＨＩおよび／またはＣＢＨＩＩを産生できないように遺伝学的に修飾されたＴ ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉを使用することが望ましい。

１つ以上のそのような成分の不在は、ＥＧ　ＩＩＩのより能率的な単離を必ず導 く。

同様に、上述したＥＧＩＩＩ組成物をさらに精製して、実質的に純粋なＥＧ　Ｉ ｌ１組成物、すなわち、タンパク質の約８０重量パーセントより多いＥＧ　ＩＩ Ｉを含有する組成物を提供することが望ましい。例えば、そのような実質的に純 粋なＥＧ　ＩＩＩタンパク質は、方法Ｂの方法人から得られた物質を用いること により得られる。さらにＥＧ　ＩＩＩを精製する１つの特定の方法は、この実施 例１４のバートｂ）で得られたＥＧ　ＩＩＩ試料のさらなる分画によるものであ る。さらなる分画は、モノ−５−ＨＲ５１５カラム（ＮＪ、ビス力タウェイ、フ ァーマシアＬＫＢバイオテクノロジーから得られる）を用いたＦＰＬＣシステム により行なわれる。ＦＰＬＣシステムは、液体クロマトグラフィーコントローラ 、２つのポンプ、二重通路モニター、分画集積装置およびチャートレコーダー（ 全てＮＪ、ビス力タウエイ、ファーマシアＬＫＢバイオテクノロジーから得られ る）からなる。分画は、実施例１４のパートｂ）で調製したＥＧＩＩＩ試料、５ ｍｌを、以前にｐＨ４の１０ｍＭクエン酸ナトリウムで均衡化した２０ｍ１セフ ァデックスＧ−２５カラムで脱塩することにより行なわれた。次いでカラムを、 １　ｍ　ｌの分画に集積した試料Ｉ関して、０．５ｍｌ／分の速度でのＮａＣ１ の０−２００ｍＭ水性勾配により溶出させた。ＥＧＩＩＩは、分画１０および１ １において取り出され、ＳＤＳゲル電気泳動により９０％より純粋であると測定 された。この純粋なＥＧ　ＩＩＩは、既知の技術によるＮ末端アミノ酸配列の測 定に適している。

上述した実施例１３において精製した実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩ並びにＥＧ　 ＩおよびＥＧＩＩ成分は、本発明の方法に単一または混合物で用いられる。こら のＥＧ酸成分以下の特性を有する： ＭＷ　ｐＩ　最適ｐＨＩ ＥＧ　Ｉ　〜４７−４９ｋ　Ｄ　４．７　〜５ＥＧＩＩ　〜３５ｋＤ５．５　〜 ５ ＥＧ　ＩＩＩ　〜２５−２８ｋＤ　７．４　〜５．５　−６．０１、以下の実施 例１５によるＲＢＢ−ＣＭＣ活性により測定された最適ｐＨ０ 本発明の実施にこれらの混合物を使用すると、単一の成分と比較して、柔らかさ 、感触、外観等を改善する相乗応答が得られる。一方で、本発明の実施に単一の 成分を使用すると、より安定であるか、またはｐＩ（範囲に亘り広い活性のスペ クトルを有することとなる。例えば、以下の実施例１５は、ＥＧ　Ｉｌｌがアル カリ性条件下のＲＢＢ−ＣＭＣに対して著しい活性を有することを示す。

実施例１５ ｐＨ範囲に亘るセルラーゼ組成物の活性２つの異なるセルラーゼ組成物のｐＨプ ロフィールを測定するために以下の方法を用いた。第１のセルラーゼ組成物は、 ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ酸成分産生ずることができないように上述した方法と 類似の方法で遺伝学的に修飾したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから調 製したＣＢＨＩおよびＩＩ欠失セルラーゼ組成物であった。

このセルラーゼ組成物が、一般的にＴｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅ　ｒｍａ　ｒｅｅｓｅ ｉから誘導されたセルラーゼ組成物、約５８から７０パーセントからなるＣＢＨ ＩおよびＣＢＨＩＩを含有しない限り、このセルラーゼ組成物は、必ず実質的に ＣＢＨＩ型およびＣＢＨＩＩ型セルラーゼ成分を含まず、したがってＥＣ成分、 すなわち、ＥＧＩ、ＥＧ　ＩＩ、ＥＧ　ＩＩＩ等が豊富である。

第２のセルラーゼ組成物は、実施例１４のパー）ｂ）と類似の精製方法によりＴ ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから誘導されたセルラーゼ組成物から単離 したＥＧＩＩＩの純粋な分画、約２０から４０％であった。

これらのセルラーゼ組成物の活性を、４０℃でＩＩ定し、その測定は以下の方法 を用いて行なわれた。

最終溶液中に必要な量の酵素を提供するのに十分な濃度で、適切な酵素溶液、５ から２０μｌを加える。ｐＨ４，５，５，５，６，６，５，７，７，５および８ の、０．０５Ｍクエン酸塩／リン酸塩緩衝液中で２重量パーセントのＲＢＢ−Ｃ ＭＣ（７１−ストラリア、Ｎ、Ｓ、Ｗ、２１５１、ノースロック、６アルトナブ レイス、メガザイムから市販されているレマゾルブリリアントブルーＲ−カルボ キシメメチルセルロース）、２５０μｌを加える。

撹拌し、４０℃で３０分培養する。水浴中で５がら１゜分間、冷却する。０．３ Ｍの酢酸ナトリウムおよび０１０２Ｍの酢酸亜鉛を含有するメチルセロソルブ、 １０００μｌを加える。撹拌し、５−１Ｏ分間、放置する。遠心分離し、上澄み をキュベツト中に注ぐ。各キュベツト中の溶液の５９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ ）をＭ１定する。より高い水準の光学濃度が、より高い水準の酵素活性に対応す る。

この分析の結果を図９に述べるが、これは、ＥＧ１１■セルラーゼ組成物と比較 したＣＢＨＩおよびＩＩ欠失セルラーゼ組成物の相対活性を説明している。この 図から、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩの欠失したセルラ−ゼ組成物は、ｐＨ５，５ あたりでＲＢＢ−ＣＭＣに対する最適なセルロースを加水分解する活性を有し、 アルカリ性ｐＨ１すなわち、７より上で８のｐＨである程度の活性を有する。

一方で、ＥＧ　ＩＩＩの豊富なセルラーゼ組成物は、ｐＨ５，５−６で最適なセ ルロースを加水分解する活性を存し、アルカリ性ｐＨで相当な活性を有する。

上述実施例から、当業者は、セルラーゼ組成物が活性で、好ましくは最適な活性 を有するように、水性布組成物のｐＨを調整し、保持することのみが必要である 。上述したように、そのような調整および保持は、適切な緩衝液の使用を含む。

実施例１６ セルラーゼ組成物のランダロメーター強度損失検定この実施例は、セルラーゼ組 成物の、綿合作織物の強さを減少せしめる能力を試験するものである。Ｔｒｉｃ ｈ。

ｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから誘導されたほとんどのセルラーゼ組成物の活性は ｐＨ５またはそのあたりで最大であり、したがって、強度損失はその検定がこの ｐＨあたりで行なわれるときに最も明確となるので、この実施例は、ｐＨ５で保 持された水性セルラーゼ溶液を用いる。

つまり、この実施例において、分析した第１のセルラーゼ組成物は、野生型のＴ ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから産生された完全菌類セルラーゼ系（Ｃ Ａ、南すンフランシスコ、ジネンカーインターナショナルから市販されているサ イトラーゼ１２３セルラーゼ）であり、ＧＣＯｌｏと同定される。

分析した第２のセルラーゼ組成物は、ＣＢＨＩＩを表現できないように、上述し た１から１２および以下の２２から３０の実施例と類似した方法で遺伝学的に修 飾したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから調製したＣＢＨＩＩ欠失セル ラーゼ組成物であり、ＣＢＨＩＩｄと同定される。ＣＢＨＩＩがセルラーゼ組成 物の約１５パーセントまでからなる限りは、この成分の欠失ば、ＣＢＨＩ。

および全てのＥＣ成分の豊富な水準となる。

分析した第３のセルラーゼ組成物は、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩを表現できない ように、上述した方法と類似した方法で遺伝学的に修飾したＴｒｉｃｈｏｄｅｒ ｍａｒｅｅｓｅｉから調製したＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ欠失セルラーゼ組成物 であり、ＣＢＨＩＩＩ　Ｉ　ｄと同定される。ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩがこの 改良微生物により産生されない限り、そのセルラーゼは必ず、全てのＣＢＨＩ型 成分、並びにＣＢＨ成分を含まない。

分析した最後のセルラーゼ組成物は、ＣＢＨＩを表現できないように、上述した 方法と類似した方法で遺伝学的に修飾したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅ ｆから調製したＣＢＨＩ欠失セルラーゼ組成物であり、ＣＢＨＩｄと同定される 。この改良微生物がＣＢＨＩを産生じない限り、このそのセルラーゼ組成物は必 ず、全てのＣＢＨＩ型成分金成分ない。

ランノロメーター中で綿含有織物の強度損失の効果について、上述したセルラー ゼ組成物を試験した。その組成物を、等量のＥＧ酸成分用いられるように、最初 に標準化した。各セルラーゼ組成物を加えて、ｐＨ５に滴定し、０゜５ｍｌの非 イオン界面活性剤を含有する２０ｍＭクエン酸塩／リン酸塩緩衝液、４００ｍ１ の溶液を分離した。精製した各溶液を分離ランダロメーターキャニスターに加え た。

これらのキャニスタ−中に、強度損失を促進させるある量の大理石、並びに１６ インチ×２０インチの綿織物（ＮＪ０８８４６、ミドルセックス、ブラックフォ ード通り２００、テストファブリック社からのスタイル４６７番として得られる ）を加えた。次いでそのキャニスタ−を閉じて、４３℃に保持されたランノロメ ーター中に降ろした。次いでそのキャニスタ−を約１時間に亘り、１分間に少な くとも４０回転（ｒｐｍ）の速度で浴中で回転せしめた。その後、衣類を取り出 してよく濯ぎ、標準乾燥機中で乾燥せしめた。

強度損失結果を最大限度にするために、上述した方法をさらに２回繰り返し、３ 回目の処理後、綿織物を取り出し、強度損失の分析を行なった。強度損失は、イ ンストロンテスターを用いた横方向の引張り強度（ｒＦＴｓＪ　）を測定するこ とによりめ、その結果を、セルラーゼを加えなかったことを除いては同一の溶液 で処理した織物のＦＴＳと比較した。この分析の結果を、以下の式によりめた強 度損失パーセントとして報告する： この分析の結果を図１０に示すが、これは、ＣＢＨＩ、すなわち全セルラーゼ（ ＧＣＯＩＯ）およびＣＢＨ１１欠失セルラーゼを含有する組成物が最大の強度損 失を有し、一方、ＣＢＨＩを含有しない組成物が、全セルラーゼおよびＣＢＨＩ Ｉ欠失セルラーゼと比較して著しく減少した強度損失を有することを示す。これ らの結果から、セルラーゼ組成物中のＣＢＨＩ型成分の存在は、ＣＢＨＩ型成分 金成分しない類似の組成物と比較して、その組成物に増大した強度損失を与える ことが分かった。

同様に、これらの結果は、ＣＢＨＩＩが強度損失においである役割を果たすこと を示す。

したがって、これらの結果から見て、強度損失抵抗セルラーゼ組成物は、全ての ＣＢＨＩ型セルラーゼ成分および、好ましくは全てのＣＢＨ型セ小セルラーゼ成 分まない組成物である。この点に関して、そのようなセルラーゼ組成物は、図１ ０に示すｐＨ５で観察されたそれらの結果よりもｐＨ≧７でのより低い強度損失 となると考えられる。

綿含有織物の製造中に、その織物は応力が加えられることがあり、そのように応 力が加えられた場合、その織物は破壊され乱れた繊維を含有する。そのような繊 維は、織物にすり切れてさえない外観を与える。しかしながら、本発明の方法は 織物／色の高まりとなることが分かった。これは、応力が加えられる前に織物の 外観を復元する効果を有する、破壊され乱れた繊維の除去により行なわれると思 われている。

以下の実施例１７および１８は、本発明のこの利点を説明する。これらの実施例 には、すり切れた綿のＴシャツにット）並びに新しい綿ニットを用いたことを述 べておく。すり切れた綿含有織物の色褪せた外観は、これまでの期間の破壊され た繊維および目の粗い表面の繊維が織物上に蓄積したことにより生じる。これら の繊維は織物に色褪せて纏れた外観を与え、したがって、これらの繊維の除去は 、その織物に元来の鮮明な色彩を復元するのに必要な必要条件である。加えて、 破壊された表面繊維の新しい綿ニット上の蓄積は、そのような織物にさえない外 観を与える。

したかって、これらの実験は、その両者が織物から表面繊維の除去を含むので、 応力の加えられた綿含有織物の色彩を高めることに必然的に適用できる。

実施例１７ 色彩を高めること 綿含有織物中で色彩を高めるＥＧ酸成分能力を以下の実験において分析した。つ まり、最初の実験は、様々なｐＨに亘る綿含有織物から表面繊維を除去する、野 生型Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉにより産生された完全セルラーゼ系 （ＣＡ、南すンフランシスコ、ジネンカーインターナショナルから市販されてい る、サイトラーゼ１２３）の能力を測定する。ランノロメーター中で表面繊維を 除去する能力に関して、このセルラーゼを試験した。最終組成物中で２５ｐｐｍ または１１００ｐｐいずれかのセルラーゼを提供する適切な量のセルラーゼを、 ０．５ｍｇの非イオン界面活性剤を含有する２０ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩緩 衝液４００ｍ１の分離溶液に加えた。ｐＨ５、ｐＩ（６、ｐＨ７およびｐＨ７， ５の試料を提供するために、試料を調製し滴定した。次いで作成した各溶液を、 分離ランダロメーターキャニスターに加えた。これらのキャニスタ−中に、繊維 の除去を促進させるある量の大理石、並びにフインチ×５インチの綿織物（ＮＪ Ｏ８８４６、ミドルセックス、ブラックフォード通り２００、テストファブリッ ク社からのスタイル４３９Ｗ番として得られる、１００％織綿）を加えた。次い でそのキャニスタ−を閉じて、４３℃に保持されたランノロメーター中に降ろし た。次いでキャニスタ−を、１分角たり少なくとも約４０回転（ｒｐｍ）の速度 で１時間、浴中で回転せしめた。その後に衣類を取り出して、よく濯ぎ、標準乾 燥機中で乾燥せしめる。

次いでそのように処理した織物を、パネル試験の評価により繊維除去について分 析した。特に、織物（マークせず）を６つの個々により繊維の水準に関して評価 した。織物を、表面繊維に関して視覚的に評価し、０から６のスケールで評価し た。このスケールは意義のある比較を行なうために６つの標準を有する。その標 準は： 評価　標準１ ０　セルラーゼで処理してない織物 １　８ｐｐｍのセルラーゼで処理した１織物２　１６ｐｐｍのセルラーゼで処理 した織物３　２０ｐｐｍのセルラーゼで処理した織物４　４０ｐｐｍのセルラー ゼで処理した織物５　５０ｐｐｍのセルラーゼで処理した織物６　１１００ｐｐ のセルラーゼで処理した繊物ａ）　全ての標準において、織物は、ＮＪＯ８８４ ６、ミドルセックス、ブラックフォード通り２００、テストファブリック社から 得た１００％綿シート標準化試験織物（スタイル４３９Ｗ番）であった。

ｂ）　全ての試料は同一のセルラーゼ組成物で処理した。

セルラーゼ濃縮物は合計のタンパク質であった。ランダロメーター処理条件は、 上述した実施例１６中に示す。

評価する織物に、その標準の最も厳密に適合した評価を与えた。織物の完全な分 析の後に、個々の全てにより各織物に与えられた値を加え、平均値を出した。

この分析の結果を図１１に示す。つまり、図１１は、同一のｐＨにおいて、用量 依存応答が除去された繊維の量として見られることを示す。すなわち、同一のｐ Ｈにおいて、より多いセルラーゼで処理した繊維は、より少ないセルラーゼで処 理した繊維と比較して繊維除去のより高い水準を提供した。さらに、この形の結 果は、より高いｐＩ（において、繊維の除去はまだ、単により高濃度のセルラー ゼを用いることにより影響を受けることを示す。

第２に実験において、２つの異なるセルラーゼ組成物を、繊維を除去する能力に ついて比較した。つまり、分析した第１のセルラーゼは、野生型Ｔｒｉｃｈｏｄ ｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉにより産生された完全セルラーゼ系（ＣＡ、南すンフラ ンシスコ、ジネンカーインターナショナルから市販されている、サイトラーゼ１ ２３）であり、ＧＣｏｌ。

と称される。

分析した第２のセルラーゼ組成物は、その組成をＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩを表 現できないように上述した方法と類似の方法で遺伝学的に修飾したＴｒ　ｉ　ｃ ｈｏｄｅ　ｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉにより調製された全てのＣＢＨ型成分（ＣＢＨ Ｉ型成分を含む）を実質的に含まないセルラーゼ組成物であり、ＣＢＨ型成分　 Ｉ欠失として同定される。

ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩがセルラーゼ組成物の約７０パーセントまでを構成す る限りは、この成分の欠失は、全てのＥＧ酸成分豊富な水準となる。

これらの組成物を、ランプロメーター中の表面繊維を除去する能力について試験 した。最終組成物中にＥＧ酸成分必要な濃度を提供するのに適切な量のセルラー ゼを、０゜５ｍｇの非イオン界面活性剤を含有する２０ｍＭのクエン酸塩／リン 酸塩緩衝液４００ｍ１の分離溶液に加えた。試料を調製し、ｐＨ’５に滴定した 。次いで作成した各溶液をランタロメーターキャニスタ−中に加えた。これらの キャニスタ−中に、繊維の除去を促進させるある量の大理石、並びにフインチ× ５インチの綿織物（ＮＪ０８８４６、ミドルセックス、ブラックフォード通り２ ００、テストファブリック社からのスタイル４３９Ｗ番として得られる、１００ ％織綿）を加えた。次いでそのキャニスタ−を閉じて、４３℃に保持されたラン プロメーター中に降ろした。次いでキャニスタ−を、１分角たり少なくとも約４ ０回転（ｒｐｍ）の速度で１時間、洛中で回転せしめた。その後に衣類を取り出 して、よく濯ぎ、標準乾燥機中で乾燥せしめる。

次いでそのように処理した織物を上述したパネル試験の評価により繊維除去の分 析を行なった。この分析の結果を、推測のＥＧ濃度に基づいてプロットした図１ ２に示す。つまり、図１２は、ＧＣＯＩＯおよびＣＢＨＩ／ＩＩ欠失セルラーゼ 組成物が、実質的に等しいＥＧ濃度で、実質的に同一の繊維除去結果を与えた。

この形の結果は、繊維除去を提供するのはＥＧ酸成分あることを示唆している。

図１１の結果と関連したこれらの結果は、ＥＧ酸成分表面繊維を除去することを 示す。

実施例１８ テルゴトメーター（Ｔｅｒｇｏｔｏｍｅｔｅｒ）色彩の向上 この実施例はさらに実施例１７に関するものであり、ＣＢＨ型成分が色彩の向上 に必要のないことを実証するものであり、本実施例の目的は、ＣＢＨ型成分の欠 失したセルラーゼ組成物の綿含有織物に対して色彩を高める能力を調査すること にある。

つまり、本実施例に用いたセルラーゼ組成物が、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩを表 現することのできないように上述した方法と類似の方法で遺伝学的に修飾したＴ ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから調製した限りは、この組成物は、実質 的に全てのＣＢＨ型成分（ＣＢＨＩ型成分を含有する）を含まない。ＣＢＨＩお よびＣＢＨＩｌがセルラーゼ組成物の約７０パーセントまでを構成する限りは、 この成分の欠失は、全てのＥＧ酸成分豊富な水準となる。

検定は、十分な濃度のこのセルラーゼ組成物を５０ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩 緩衝液に加え、５００ｐｐｍのセルラーゼを提供することにより行なった。その 溶液をｐＨ５に滴定し、０，１重量パーセントの非イオン界面活性剤（ＮＣ２７ ３６０、トーマスピル、グレスコＮｆｇ、、から市販されている、グレスコター クＧＬ１００）を含有した。１０インチＸ１０インチの色褪せた綿含有織物、並 びに緩んで破壊された表面繊維を有する１０インチＸ１０インチの新しいニット 織物を、この緩衝液の１リツトルの中に配し、ｌｌ０Ｆ＠で３０分間放置し、次 いで３０分間、１分当たり少なくとも１００回転で撹拌した。次いで織物を緩衝 液から取り出し、洗浄し、乾燥せしめた。生じた織物を次いで、処理前の織物と 比較した。この分析の結果を以下に示す： 綿含有材料　結果 すり切れた綿Ｔシャツ　利益が見られた新しい綿ニット　利益が見られた テルゴトメーターを用いた結果として生成した表面繊維を含有する破壊された表 面繊維の除去を含む、「利益が見られた」という言葉は、処理織物が、非処理織 物と比較して色彩の復元（すなわち、色褪せて見えない）を示す。これらの結果 は、ＣＢＨ型成分の存在が色褪せた綿含有織物の色彩復元をもたらすのに必要な いという実施例１７の結果を実証する。

そのようなセルラーゼ組成物は、織物への有害な強度損失なくして、加工中に生 成される破壊された／緩んだ繊維を除去するので、その組成物の使用は繊維加工 中に利益をもたらすと考えられる。

実施例１９ 柔軟さ 本実施例は、ＣＢＨ型成分の存在が綿含有織物に改善された柔軟さを与えるのに 必要ないことを示す。つまり、この実施例は、その組成物が、ＣＢＨＩおよびＣ ＢＨＩＩ酸成分産生ずることができないように上述した方法により遺伝学的に製 造したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから誘導したものである、全ての ＣＢＨ型成分を含まないセルラーゼ組成物を用いる。

このセルラーゼ組成物を、テリー織りの洗浄布を柔らかくする能力に関して試験 した。つまり、１４インチＸ１５インチの、柔軟化されていない８．５オンスの 綿テリー織り布（ＮＪＯ８８４６、ミドルセックス、ブラックフォード通り２０ ０、テストファブリック社からのスタイル４２ＯＮＳ番として得られる）を、フ インチ×７．５インチの切れ端に切断した。

上述したセルラーゼ組成物を、ランクロメータ−中でこれらの切れ端を柔らかく する能力について試験した。つまり、最終セルラーゼ組成物中に５００ｐｐｍ、 ２５０ｐｐｍ、１１００ｐｐ、５０ｐｐｍ、および１０ｐｐｍのセルラーゼを提 供するように、適切な量のＣＢＨＩおよび■ｌ欠失セルラーゼを、０．０２５重 量パーセントの非イオン界面活性剤（トリトンＸ１１４）を含有する２０ｍＭク エン酸塩／リン酸塩緩衝液４００ｍ１の分離溶液に加えた。

加えて、同一の溶液を含有するが、セルラーゼの加えられていないブランクを作 成した。そのように調製した試料を、ｐＨ５に滴定した。次いで作成した各溶液 を分離ランダロメーターキャニスターに加えた。これらのキャニスタ−中に、柔 軟さを促進させる量の大理石、並びに上述した綿の切れ端を加えた。全ての条件 は、キャニスタ−ごとに２つの切れ端で３重に行なった。次いでそのキャニスタ −を閉じて、３７℃に保持されたランクロメータ−中に降ろした。

次いでキャニスタ−を、１分当たり少なくとも約４０回転（ｒｐｍ）の速度で１ 時間、洛中で回転せしめた。その後に衣類を取り出して、よく濯ぎ、標準乾燥機 中で乾燥せしめた。

次いてその切れ端を、選択試験における評価により柔軟さについて試験した。つ まり、６人のパネリストに、各自の一連の切れ端を与え、全体の織物の柔軟性の ような柔軟の判定基準に基づいた柔軟さに関してその切れ端を評価するように指 示した。５つの異なる酵素濃度での処理により得られた切れ端とブランクをスク リーンの背後に配し、パネリストは最も柔らかくないものから最も柔らかいもの まで順番に並べるように指示した。他の切れ端に対するその順番に基づいて各切 れ端にスコアを付けた；５が最も柔らかく、０が最も柔らかくない。各パネリス トからのスコアを累積して、平均した。

この平均の結果を図１３に示す。つまり、これらの結果は、濃度が高ければ高い ほど、改善された柔軟さが得られることを示す。この改善された柔軟化は、セル ラーゼ組成物中にＣＢＨＩまたは１１のいずれがの存在なくして達成されること が分かる。

実施例２０ 感触および外観 本実施例は、ＣＢＨ型成分の存在が、綿含有織物に改善された感触と外観を与え るのに必須ではないことを説明する。つまり、この実施例は、いがなるＣＢＨ型 成分も産生ずることができない（すなわち、ＣＢＨＩおよび１１成分を産生ずる ことができない）ように上述したような方法で遺伝学的に作られたＴｒｉｃｈｏ ｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから誘導されたセルラーゼ組成物を用いる。

このセルラーゼ組成物を、その綿含有織物の外観を改善する能力について試験し た。つまり、この実施例の外観面において、適当な大きさの１００％綿シート（ ＮＪＯ８８４６、ミドルセックス、ブラックフォード通り２００．テストファブ リック社からのスタイル４３９ｗ番として得られる）を用いた。

上述したセルラーゼ組成物を、ランクロメータ−中のこれらの試料の外観を改善 する能力について試験した。つまり、最終セルラーゼ溶液中で２５ｐｐｒｎ、５ ０ｐｐｍ、および１１００ｐｐのセルラーゼを提供する適量のＣＢＨ！および！ Ｉ欠失セルラーゼを、０．０２５重量パーセントの非イオン性界面活性剤（トリ トンＸ１１４）を含有する２０ｍＭクエン酸／リン酸緩衝液４００ｍ１の分離溶 液に加えた。加えて、同一の溶液を含むがどのセルラーゼも含まないブランクも 作成した。そのように調製した試料をｐＨ５に滴定した。次いで作成した各溶液 を、分離ランクロメータ−キャニスタ−中に加えた。次いでそのキャニスタ−を 閉じて、３７℃に保持されたランクロメータ−中に降ろした。次いでキャニスタ −を、１分角たり少なくとも約４０回転（ｒｐｍ）の速度で１時間、浴中で回転 せしめた。その後に衣類を取り出して、よく濯ぎ、標準乾燥機中で乾燥せしめた 。

次いで試料を、選択試験の評価による改善された外観について分析した。つまり 、６人のパネリストに４つの試料（識別を示さない）を与え、外観に関して評価 するようめた。パネリストには、「外観」という用語は、目に対する綿含有織物 の物理的外観を指し、織物の表面上の、けば、表面繊維等の存在または不在によ る、並びに織物の構成（織り）を見分ける能力または無能により部分的に決定さ れることを指示した。はとんどけばおよび表面繊維を有さず、その構造（１１す ）が明確に見分けられる織物は、けばおよび／または緩い繊維および／または識 別できない織りを有する織物と比較して改善された外観を有する。

次いでパネリストは、他の試料と比較しながら、その順番に基づいて各試料にス コアをつけた：４は最良の外観であり、１は最低の外観である。各パネリストか らのスコアを集計して平均化した。この試験の結果を以下に示す：セルラーゼの 量　平均外観 １１００ｐｐ　４ 次いでＣＢＨＩおよび１１欠失セルラ一ゼ組成物を、綿含有織物の感触を改善す る能力について試験した。つまり、この実施例の外観面において、適当な大きさ の１００％綿シート（ＮＪＯ８８４６、ミドルセックス、ブラックフォード通り ２００１テストファブリック社からのスタイル４３９Ｗ番として得られる）を用 いた。

上述したセルラーゼ組成物を、ランクロメータ−中のこれらの試料の外観を改善 する能力について試験した。つまり、最終セルラーゼ溶液中で５００ｐｐｍ、１ ０１０００ｐｐおよび２０００ｐｐｍのセルラーゼを提供する適量のセルラーゼ を、２０ｍＭクエン酸／リン酸緩衝液２４Ｌの分離溶液に加えた。加えて、同一 の溶液を含むがどのセルラーゼら含まないブランクも作成した。全ての試験を、 ｐＨ５，８で行ない、工業用洗濯機中で行なった。その洗濯機は５０℃、全容積 ２４Ｌ、５０　：　１　（重量対重量）の布に対する液体の比率において操作さ れ、その洗濯機を３０分間操作させた。その後、試料を除去し、工業乾燥機中で 乾燥せしめた。

次いで試料を、選択試験の評価による改善された感触について分析した。つまり 、５人のパネリストに４つの試料（識別を示さない）を与え、感触に関して評価 するようめた。パネリストに、改善された感触を有する織物は他の織物より肌触 りが滑らかで、絹のようであり、その感触を、柔らかさくその感触というよりも 織物の柔軟性を指す）、厚さ、色彩、または織物の滑らかさに含まれない他の物 理的な特性のように質とは区別することを支持した。

次いでパネリストは、他の試料と比較しながら、その順番に基づいて各試料にス コアをつけた：４は最良の感触であり、１は最低の感触である。各パネリストか らのスコアを集計して平均化した。この試験の結果を以下に示す：セルラーゼの 量　平均外観 １１０００ｐｐ　３．２±０，４ ２０００ｐｐｍ　３．８±０．４ 上述した結果は、感触および外観における改善が全てのＣＢＨ型成分を含まない セルラーゼ組成物により達成できることを示す。

実施例２１ ストーンウォッシュの外観 この実施例は、ＣＢＨ型成分の存在が綿含有織物にストーンウォッシュの外観を 与えるのに必須ではないことを示すものである。つまり、この実施例は、いがな るＣＢＨ型成分も産生ずることができない（すなわち、ＣＢＨＩおよびＩＩ成分 を産生ずることができない）ように上述したような方法で遺伝学的に作られたＴ ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉから誘導されたセルラーゼ組成物、並びにＴ ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉから誘導され、カリフォルニア、南すンフ ランシスコ、ジネンヵーインターナショナルからのサイトラーゼ１２３として得 られる完全セルラーゼ組成物を用いる。

これらのセルラーゼ組成物を、染色綿含有デニムパンツにストーンウォッシュの 外観を与える能力について試験した。つまり、以下の条件下で工業洗濯機および 乾燥機を用いて試料を調製した： ｐＨ５のＩＣ１ｍＭクエン酸／リン酸緩衝液合計容積４０Ｌ １１０Ｆ’ ４組のデニムパンツ １時間の操作 ５０ｐｐｍのＣＢＨＩおよびＩＩ欠失セルラーゼまたは１１００ｐｐの完全セル ラーゼ（すなわち、はぼＥＧ濃度と等しい） ８人のパネリストにより、試料をそのストーンウオツシュの外観について評価し た。８大全てのパネリストが、良好なストーンウォッシュの外観を有するものと して、非酵素処理パンツよりも１１００ｐｐ全セルラーゼを選択する。

８人のパネリストのうち４人が、良好なストーンウォッシュの外観を有するもの として、全セルラーゼよりもＣＢＨＩおよびＩＩ欠失セルラーゼ処理パンツを選 択し、一方では他の４人のパネリストは、良好なストーンウォッシュの外観を有 するものとして、全セルラーゼ処理パンツを選択する。これらの結果は、ＣＢＨ ＩおよびＩＩ欠失セルラーゼ処理パンツは、全セルラーゼ処理パンツとは区別で きず、ＣＢＨＩおよび／またはＣＢＨＩＩは、綿含有織物にストーンウォッシュ の外観を与えるのに必須ではないことを示す。

実施例１６から２１に関して、ＣＢＨＩ型成分を含まず、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ ａ　ｒｅｅｓｅｉ以外の微生物から誘導されたセルラーゼ組成物は、これらの実 施例に記載されたセルラーゼ組成物と置き換えて用いることができた。特に、Ｅ Ｇ型成分を含有するセルラーゼ組成物の供給源は、本発明にとって重要ではなく 、１つ以上のＥＧ型成分を含有し、実質的に全てのＣＢＨＩ型成分を含まないい かなる菌類セルラーゼ組成物がここに用いられる。例えば、本発明に用いられる 菌類セルラーゼ組成物を調製するのに用いられる菌類セルラーゼは、Ｔｒｉｃｈ ｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉＳＰｅｎｃｉｌｌｕｍ　ｓｐ、等から得られ、 または市販されているセルラーゼが用いられる、すなわち、セルキャスト（デン マーク、コペンハーゲン、ノボインダストリーから得られる）、ラビダーゼ（オ ランダ、デルフト、ギストブロケードから得られる）等である。

実施例２２ プラスミドｐＥＧＩｐｙｒ４を含有するＴｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅｒｍ’ａ　ｒｅｅ ｓｅｉの転換 実施例１に概略を示した方法により、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株Ｒｕ　ｔ　Ｃ３０の ｐｙｒ４欠損誘導体（シールニースおよびモンテンコート、（１９８４）　、Ａ ｐｐ　１．　ＭＬ　ｃ　ｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　２０：　： ４６−５３）を得た。この菌株のプロトプラストを、未切断ｐＥＧＩｐｙｒ４で 転換し、安定形質転換体を精製した。

これらの形質転換体の５つ（ＥＰ２、ＥＰ４、ＥＰ５、ＥＰ６、ＥＰＩＩと称す る）、奈良具備に未転換ＲｕｔＣ３０を、２５０ｍ１の振動フラスコ中の５０ｍ １のＹＥＧ媒質に接種し、２日間、２８℃で振動させながら培養した。

生成した菌糸体を無菌水で洗浄し、５０ｍ１のＴＳＦ媒質（０，０５Ｍのクエン 酸−リン酸緩衝液、ｐＨ５，ｏ；アビセルミクロ結晶性セルロース、１０　ｇ／ 　ｌ　；　ＫＨ２Ｐ　０４．２．０ｇ／ｌ　；　（ＮＨ４）２５０４．１．４ｇ ／ｌ　；ブロテオースベプトン、１．　０ｇ／ｌ　；尿素、０．３ｇ／ｌ　；Ｍ ｇＳＯ４”　７Ｈ２０，０，３ｇ／ｌ　；　ＣａＣ１２、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ， １，６ｍｇ／　１　；　ＺｎＳＯ４，１゜４ｍｇ／ｌ　；ＣｏＣｌ２．２．０ｍ ｇ／ｌ　；０．　１％ツイーン８０）に加えた。これらの培養物はさらに２８℃ で４日間、振動させながら培養した。これらの培養物から上澄み試料を採取し、 タンパク質およびエンドグルカナーゼ活性の合計量を測定するための検定を以下 に記載するようにして行なった。

エンドグルカナーゼ検定は、レマゾールブリリアントブルーカルボキシメチルセ ルロース（オーストラリア、Ｎ５Ｗ１ノースロツク、メガザイムから得られる、 ＲＢＢ−ＣＭＣ）からの溶性染色オリゴ糖類の解放により行なわれる。

２ｇの乾燥ＲＢＢ−ＣＭＣを８０ｍ１の激しく撹拌し沸騰したての脱イオン水に 加えることにより媒質を調製した。

室温まで冷却したときに、５ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，８）を 加え、ｐＨを４．５に調整した。脱イオン水により、その容積を最終的に１００ ｍ１に調節し、０．０２％の最終濃度までナトリウムアジ化物を加えた。

Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ対照培養物、ｐＥＧＩｐｙｒ４形質転換体培養物上澄みまたは ブランクとしての０．１Ｍ酢酸ナトリウム（１０−２０μｍ）のアリコートを、 管中に配し、２５０μｌの媒質を加え、その管を３７℃で３０分間培養した。そ の管を氷上に１０分間配し、１ｍｌの冷たい沈殿剤（３，３％の酢酸ナトリウム 、０．４９６の酢酸亜鉛、ＨＣｌによるｐＨ５，７６％エタノール）を加えた。

その管に渦を生じさせ、約１３，０００Ｘｇでの３分間の遠心分離の前に、５分 間放置した。光学濃度を、５９０−６００ｎｍの波長で分光測光的に測定した。

使用したタンパク質検定は、米国イリノイ州、ロックフォード、ピアースから得 られた試薬を用いたＢＣＡ（ビシンクロニック酸）検定であった。標準は、子牛 血清アルブミン（ＢＳＡ）であった。ＢＣＡ試薬は、１部の試薬Ｂと５０部の試 薬Ａとの混合により調製した。１ｍｌのＢＣＡ試薬を５０μｌの適切に希釈した ＢＳＡまたは試験培養上澄みと混合した。培養は３７℃で３０分間行ない、光学 密度は最終的に５６２ｎｍの波長で光学測光的に測定した。

上述した検定結果を表１に示す。産生じた形質転換体のいくつかは、未転換菌株 Ｒｕ　ｔ　Ｃ３０と比較してエンドグルカナーゼ活性の量を増加せしめたことが 明確である。未転換Ｔ、ｒｅｅｓｅｉにより産生されたエキソ−セロビオヒドロ ラーゼおよびエンドグルカナーゼは、分泌されたタンパク質の合計量のそれぞれ ７０および２０パーセントを構成すると思われる。それゆえ、菌株Ｒｕ　ｔ　Ｃ ３０よりもほぼ４倍のエンドグルカナーゼを産生ずるＥＰ５のような形質転換体 は、はぼ等量のエンドグルカナーゼ型およびエキソ−セロビオヒドロラーゼ型タ ンパク質を分泌すると予期される。

本実施例に記載した形質転換体は、完全なｐＥＧＩｐｙｒ４を用いて得られ、ｐ ＵＣプラスミドから誘導されたゲツム中に組み込まれるＤＮＡ配列を含有する。

転換の前に、ＨｉｎｄｌｌｌでｐＥＧＩｐｙｒ４を切断し、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　 ＤＮＡのみを含有するより大きなりＮＡ断片を単離することが可能である。Ｔ、 ｒｅｅｓｅｉの、ＤＮＡのこの単離断片による転換により、ＥＧＩを過剰産生じ 、図８に示す合成りＮＡの２つの短片を除いた異種ＤＮＡ配列をまったく含まな い形質転換体の単離ができる。また、ｐＥＧＩｐｙｒ４を用いて、ｃｂｈｌ遺伝 子、またはｃｂｈ２遺伝子、または両方の遺伝子が欠失した菌株を転換すること も可能である。このようにして、ＥＧＩを過剰産生じ、制限範囲のエキソ−セロ ビオヒドロラーゼを産生じ、または工牛ソー七ロビオヒドロラーゼを全く産生じ ない菌株が構成される。

実施例２２の方法は、他のセルラーゼ組成物、キシラナーゼ成分またはＴ、ｒｅ ｅｓｅｉにより通常産生される他のタンパク質のいずれかを過剰に産生するＴ、 ｒｅｅｓｅｉ菌株を産生ずるのに用いられる。

表　１ Ｔ、　ｒｅｅｓｅｉ形質転換の分泌エンドグルカナーゼ活性Ａ　Ｂ エンドグルカナーゼの活性　タ　ンパク質菌株　（５９Ｄｎｓ　での又！ｕ）　 （ｍｇ／ｍｌ）　Ａ／ＢＲｕｔＣ３０Ｑ、３２　４．１　０．０７８ＥＰ２　０ ．７０　３．７　０．１１１９ＥＰ４　０．７６　３．６５　０．２ＱＢＢＰ５ 　１．２４　４．１　０ＪＯ２ ＥＰ６　０．５２　２．９３　０．１７７ＥＰＩＩ　Ｏ，９９４，１１０，２４ １上述した結果は、合計タンパク質に対するＥＧＩ成分の産生過剰を示す目的に ために提示したものであって、産生過剰の度合いを示す目的のためではない。こ の点に関して、産生過剰は各実施例に関して変わるものと思われる。

実施例２３ ｐｃＥＰｃｌの構成 プラスミド、ｐｃＥＰｃｌを構成した。ここでＥＧＩの暗号配列は、ｃｂｈｌ遺 伝子からのプロモーターに機能的に融合された。これは、それぞれの翻訳開始部 位の５′（上流）の都合のよい制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を生成するため にｃｂｈｌおよびｅｇｌｌ遺伝子のＤＮＡ配列を変更する、生体外の部位特異性 突然誘発を用いて行なわれる。ＤＮＡ配列分析を行なって、２つのＤＮＡ断片の 間の接合部での予期した配列を確認した。行なわれた特異的な変更を図１４に示 す。

ｐｃＥＰｃｌを形成するように結合されたＤＮＡ断片は、ｐＵＣ４にのＥｃｏＲ １部位の間に挿入され、これは以下のようであった： Ａ）　ｃｂｈｌ座の５′側腹領域からの２．１ｋｂ断片。

これはプロモーター領域を含み、製造したＢｃ１１部位に延び、ｃｂｈｌ暗号配 列を含まない。

Ｂ）　製造したＢａｍＨ１部位を有する５′末端で開始し、翻訳停止コードンの 向こうに約０．５ｋｂを含むｅｇｌｌ座からのゲノムＤＮＡの１．９ｋｂ断片。

その断片の３′末端にはｐＵｃ２１８多重クローニング部位から誘導された１８ ｂｐがあり、１５ｂｐ合成オリゴヌクレオチドがこの断片を以下の断片と連結さ せるのに用いられる。

Ｃ）　ｃｂｈｌ翻訳停止コードンの約１ｋｂ下流の位置から約２．５ｋｂ下流に 延びる、ｃｂｈｌ座の３′側腹領域からのＤＮＡの断片。Ｄ）ｐＴｐｙｒ２から 得られたＴ。

ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子（実施例２）を含有し、ｐＵＣ１８多重クローニ ング部位から誘導された１末端でのＤＮＡの２４ｂｐを有するＤＮＡの３．１ｋ ｂ　ＮｈｅＯ−５ｐｈｌ断片を、断片（Ｃ）のＮｈｅ１部位中に挿入した。

プラスミド、ｐｃＥＰｃｌを、ＥＧＩ暗号配列がｃｂｈｌ座で組み込まれ、いか なる異種ＤＮＡをも宿主菌株中に導入せずにＣＢＨＩの暗号配列を置換するよう に設計した。

このプラスミドのＥｃｏＲＩによる切断は、ｃｂｈｌプロモーター領域、ｅｇｌ ｌ暗号配列および転写終止領域を含む断片、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子 およびｃｂｈｌ座の３′（下流）側腹領域からのＤＮＡ断片を雌牛ずる（図１５ 参照）。

実施例２４ ｐｃＥＰｃＩ　ＤＮＡを含有する形質転換体Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ　ＲｕｔＣ３０の ｐｙｒ４欠損菌株（シールーニース、前述）を、実施１１ＭＪ　１に概略を説明 した方法により得た。この菌株は、ＥｃｏＲＩで切断されたｐＣＥＰＣＩにより 転換された。安定な形質転換体を選択し、続いて実施例２２に記載したようにセ ルラーゼ産生のために振動フラスコ中で培養した。セルラーゼタンパク質を視覚 化するために、実施例７に記載した方法を用いてこれらの培養物からの試料上に 等電点電気泳動ゲルの電気泳動を行なった。この方法により分析した合計２３の 形質転換体のうち１２が、ＣＢＨＩタンパク質を全く産生じないことが分かり、 これはｃｂｈｌ座でのｐＣＥＰＣＩ　ＤＮＡの組込みの予期した結果である。サ ザン法分析を用いて、統合がこらの形質転換体のうちのいくつかのｃｂｈｌ座で 完全に生じたこと、および細菌プラスミドベクター（ｐＵＣ４Ｋ）から誘導され た配列が全く存在しないこと（図１６参照）を確証した。この分析に関して、形 質転換体からのＤＮＡを、電気泳動を行ない、膜フィルターにプロットする前に 、Ｐｓｔｌで切断した。生成したサザンプロットは、放射性標識プラスミドｐＵ Ｃ４に：　：　ｃｂｈｌでプローブした（実施例２）。そのプローブは、未転換 対照培養物からのＤＮＡの６．５ｋｂ断片上のｃｂｈｌ遺伝子に雑種形成した（ 図１６、レーンＡ）。ｃｂｈｌ座でのＤＮＡのｐＣＥＰＣＩ断片の組込みは、こ の６．５ｋｂ帯の損失およびほぼ１．、Ｏｋｂ、２．０ｋｂおよび３．Ｏｋｂの ＤＮＡ断片と対応する３つの他の帯の外観となると思われる。これは、図１６、 レーンＣに示した形質転換体に観察される正確な模様である。また図１６に示す ように、１ノーンＢは、ｐｃＥＰｃｌの多重コピーがｃｂｈｌ座以外のゲノム中 の部位で組み込まれた形質転換体の実施例である。

試料中のタンパク質濃度が約０．０３と０．０７ｍｇ／ｍｌの間にあるように、 エンドグルカナーゼ活性検定を、未転換培養物、および試料が検定の前に５０倍 に希釈されたことを除いて実施例２２に記載したように形質転換体、からの培養 上澄みの試料に行なった。未転換対照培養物および４つの異なる形質転換体（Ｃ ＥＰＣＩ−１０１゜ＣＥＰ　Ｃ１，−１０３、ＣＥＰＣＩ−１０５およびＣＥＰ ＣＩ−質転換体ＣＥＰＣＩ−１０３およびＣＥＰＣＩ−１１２は、ＣＥＰＣＩ断 片の統合がＣＢＨＩ産生の損失となった実施例である。

表　２ Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ形質転換体の分泌エンドグルカナーゼ活性Ａ　Ｂ エンドグルカナーゼの活性　タ　ンパク質菌株　（５９０ｎ−での光学町Ω−（ 霞ｇ／■Ｉ）　Ａ／二」とＲｕｔＣ３０００，０３７２，３８０，０１６ＣＥＰ ＣＩ−１０ｔ　Ｏ，０８２２，７２０，０３０ＣＥＰＣＩ−１０３０，０９９１ ，９３０，０５１ＣＥＰＣＬ−１０５０，０：１３　２．０７　０．０１ＢＣＢ ＰＣＩ−１１２０，０９３１，７２０，０５４上述した結果は、合計タンパク質 に対するＥＧＩ成分の産生過剰を示す目的にために提示したものであって、産生 過剰の度合いを示す目的のためではない。この点に関して、産生過剰は各実施例 に関して変わるものと思われる。

ｐｃＥＰｃｌに類似するが、ｅｇｌｌ遺伝子を置換する他のＴ、ｒｅｅｓｅｉ遺 伝子を有するプラスミドを構成することが可能である。このようにして、他の遺 伝子の表現過剰およびｃｂｈｌ遺伝子の同時の欠失を達成できた。

また、事前に他の遺伝子、例えばｃｂｈ２が欠失したＴ。

ｒｅｅｓｅｉのｐｙｒ４誘導体菌株をｐｃＥＰｃｌで転換し、例えば全くエキソ −セロビオヒドロラーゼを産生ぜず、エンドグルカナーゼを過剰表現する形質転 換体を構成することも可能である。

ｐｃＥＰｃｌに類似の構成物を用いるが、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉの別の座からのＤＮ Ａをｃｂｈｌ座からのＤＮＡと置換する場合、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉゲノム中の別の 座での別のプロモーターの制御下で遺伝子を挿入することも可能である。

実施例２５ ｐＥＧＩＩ：　二Ｆ−１の構成 ＥＧＩＩをコードする（以前に他者によりＥＧＩＩＩと称された）ｅｇ１３遺伝 子が、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉからクローンされ、そのＤＮＡ配列が公表された（サロ ヘイモら、１９８８、遺伝子６３：１ｌ−２１）。菌株ＲＬ−Ｐ３７から、ｐＵ ｃ２１９のＰｓｔ１部位およびＸｈｏ１部位の間に挿入されたゲノムＤＮＡ（７ ）約４ｋｂ　ＰｓｔＩ−Ｘｈｏｌ断片として遺伝子を得た。ベクターｐＵｃ２１ ９は、ＢｇｌＩＩ、Ｃ１ａｌおよびＸｈｏｌの制限部位を含むように多重クロー ニング部位を広げることによりｐＵｃ２１９から誘導される（ウィルソンらによ り１９８９年に記載された、遺伝子７７　：　６９−７８）。従来技術において 知られている方法を用いて、ゲノムＤＮＡの２．７ｋｂ　Ｓａｌ！断片上に存在 するＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４遺伝子を、ＥＧＩＩ暗号配列内の５ａｌ１部位 中に挿入し、プラスミドｐＥＧＩ　Ｉ　：　：Ｐ−１を産生じた（図１７）。こ れは、どの配列を欠失することがないがＥＧＩＩ暗号配列の分断となった。プラ スミド、ｐＥＧＩ　Ｉ　：　：　Ｐ−１は、ＨｉｎｄｌＩＩおよびＢａｍＨＩて 切断でき、その両者がｐＵｃ２１９の多重クローニング部位から誘導された、一 方の末端の５ｂｐ上、および他方の末端の１６ｂｐを除いたＴ、ｒｅｅｓｅｉか ら排他的に誘導されたＤＮＡの線形断片を産生できる。

実施例２６ ＥＧＩＩを産生できない菌株を産生ずるためのＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ＧＣ６９のｐ ＥＧＩ　Ｉ　：　：Ｐ−１による転換Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株ＧＣ６９は、以前に ＨｉｎｄｌＩＩおよびＢａｍＨＩで切断されたｐＥＧＩ　Ｉ　：　：Ｐ−１で転 換され、安定な形質転換体が選択される。全ＤＮＡはそれらの形質転換体から単 離され、サザン法分析が、これらの形質転換体を同定するのに用いられ、ここで ｐｙｒ４およびｅｇ１３遺伝子を含有するＤＮＡの断片がｅｇｌＢ座で組み込ま れ、その結果としてＥＧＩＩ暗号配列を分断した。その形質転換体はＥＧＩＩを 産生ずることができない。

また、ｐＥＧｌ　１　：　：Ｐ−１を用いて、ｃｂｈｌ遺伝子、ｃｂｈ２遺伝子 、またはｅｇｌｌ遺伝子のいずれか、または全てが欠失された菌株を転換するこ ともできる。このようにして、あるセルラーゼ成分を産生じ、ＥＧＩＩ成分を全 く産生じない菌株を構成できた。

実施例２７ ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩ　Ｉ、およびＥＧＩＩを産生することのできない菌株を産生 ずるためのＴ、ｒｅｅｓｅｉのｐＥＧｌｌ：：Ｐ−１による転換 実施ｆ！１１１に概略を示した方法により、菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７のｐｙ ｒ４欠損誘導体（実施例１１から）を得た。この菌株Ｐ３７ΔΔ６７Ｐ１は、以 前にＨｉｎｄＩＩｌおよびＢａｍＨＩで切断したｐＥＧＩＩ：：Ｐ−１で転換さ れ、安定な形質転換体が選択された。全ＤＮＡはそれらの形質転換体から単離さ れ、サザン法分析が、これらの形質転換体を同定するのに用いられ、ここでｐｙ ｒ４およびｅｇ１３遺伝子を含有するＤＮＡの断片がｅｇｌＢ座で組み込まれ、 その結果としてＥＧＩＩ暗号配列を分断した。

図１８に説明したサザンプロットを、ｐＵｃ１８のＰｓｔ１部位中にクローンさ れ、続いて再単離されたｅｇ１３遺伝子を含有するＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ＤＮＡの 約４ｋｂ　ＰｓｔＩ断片でプローブした。菌株Ｐ３７ΔΔ６７Ｐ１から単離した ＤＮＡを、サザン法分析のためにＰｓｔＩで切断した場合、ｅｇｌＢ座は続いて オートラジオグラフ上の単一４ｋｂ帯として視覚化された（図１８、レーンＥ） 。しかしながら、ｅｇ１３遺伝子が分断された形質転換体に関して、この帯は失 われ、予期したように２つの新たな帯により置換された（図１８、レーンＦ）。

ＤＮＡがＥｃｏＲＶまたはＢｇｌｌＩで切断された場合、ｅｇ１３遺伝子に対応 する帯のサイズは、未転換Ｐ３７ΔΔ６７Ｐ１菌株（レーンＡおよびＣ）とｅｇ １３が分断した形質転換体（図１８、レーンＢおよびＤ）との間の約２゜７ｋｂ 　（挿入ｐｙｒ４断片のサイズ）により増加した。図１８に示した分断ｅｇ１３ 遺伝子を含有する形質転換体（レーンＢ。

ＤおよびＦ）は、Ａ２２と称した。図１８において同定した形質転換体は、ＣＢ ＨＩ％ＣＢＨＩＩまたはＥＧＩＩを産生できない。

実施例２８ ｐＰΔＥＧＩ−１の構成 ア、実施例１２に記載したように、Ｔ、ｒｅｅｓｅｉ菌株ＲＬ−Ｐ３７のｅｇｌ ｌ遺伝子を、ゲノムＤＮＡのＨｉｎｄＩｌｌ断片として得た。この断片をｐＵｃ ｌｏｏのＨｉｎｄｌ１１部位に挿入した（ｐＵｃ１８の誘導体、ヤニシューベロ ンら、１９８５、遺伝子３３：ＢｇｌｌｌＳＣｌａｌおよびＸｈｏＩの制限部位 を加える多重クローニング部位中に挿入されたオリゴヌクレオチドを有する１０ ３−１１９）。従来技術において知られている方法論を用いて、ＥＧＩ暗号配列 の中央に近い位置からその暗号配列の３′末端を超えた位置に広がる約１ｋｂ　 ＥｃｏＲＶ断片を除去し、ｐｙｒ４遺伝子を含有するＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ＤＮＡ の３．５ｋｂ　５ｃａｌ断片により置換した。作成したプラスミドをｐＰΔＥＧ Ｉ−１と称した（図１９参照）。

プラスミドｐＰΔＥＧＩ−１は、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで切断され、いずれの末端 にもｅｇｌｌ遺伝子の断片およびその中央でＥＧＩ暗号配列の一部を置換するｐ ｙｒ４遺伝子を有するＴ、ｒｅｅｓｅｉゲノムＤＮＡのみからなるＤＮＡ断片を 放出できる。

適切なＴ、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙｒ４欠損菌株のＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＰΔ ＥＧＩ−１による転換は、形質転換体のある割合においてｅｇｌｌ座にこのＤＮ Ａを組み込むことを導く。このようにして、ＥＧＩを産生できない菌株が得られ る。

実施例２９ ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３の構成およびＴ、ｒｅｅｓｅｉのｐｙｒ４欠損菌株の転換 ＥＧＩ遺伝子を、実施例２８に概説した方法を用いて不活化できるという予想が 本実験により増強される。この場合、プラスミド、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ ｉｇｅｒｐｙｒ４遺伝子が選択可能マーカーとしてのＴ’、ｒｅｅｓｅｉ　ｐｙ ｒ４遺伝子を置換することを除いてｐＰΔＥＧ１−１に類似であるｐΔＥＧＩｐ ｙｒ−３を構成した。この場合、ｅｇｌｌ遺伝子は、ｐＵｃｌｏｏのＢｉｎｄｌ １１部位に挿入された４、２ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ断片として再度存在した。ｐ ｐΔＥＧＩ−１の構成中に（実施例２８参照）、同一の内部１ｋｂ　ＥｃｏＲＶ 断片を除去したが、この場合、その断片はクローンされたＡ、ｎｉｇｅｒｐｙｒ Ｇ遺伝子を含有する２、２ｋｂ断片により置換された（ウィルソンら、１９８８ 、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６ｐ、２３３９）。ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３ を有するＴ、ｒｅｅｓｅｉのｐｙｒ４欠損菌株（菌株ＧＣ６９）の転換は、その 菌株がＢｉｎｄＩＩＩで切断されていずれの末端のｅｇｌｌ座から側腹領域を有 するｐｙｒＧ遺伝子を含有する断片を放出した後に、ｅｇｌｌ遺伝子が分断され た形質転換体に導かれた。これらの形質転換体は、ＢｉｎｄＩＩＩで切断され、 放射線標識ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３でプローブされた形質転換体ＤＮＡのサザン法 分析により認識された。Ｔ、ｒｅｅｓｅｉの未転換菌株において、ｅｇ１１遺伝 子は、ＤＮＡの４．２ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩＩ断片上に存在し、この線種形成のパ ターンは、図２０．レーンＣとして表される。しかしながら、ｐΔＥＧＩｐｙｒ −３からの所望の断片の組込みによるｅｇｌｌ遺伝子の欠失に従って、この４． ２ｋｂ断片は消失し、より大きなサイズの約１．２ｋｂ、図２０．レーンＡの断 片により置換された。また図２０に示すように、レーンＢは、ｐΔＥＧＩｐｙｒ −３の単一コピーの組込みがｅｇｌｌ座以外のゲノム中の部位で生じた形質転換 体の実施例である。

実施例３０ ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩ　Ｉ、ＥＧＩおよびＥＧＩＩを産生できない菌株を産生する Ｔ、ｒｅｅｓｅｉのｐＰΔＥＧＩ−１による転換 実施例１に概説した方法により、菌株Ａ２２（実施ｆＩＪ２７から）のｐｙｒ４ 欠損菌株を得る。この菌株は、以前にＨｉｎｄｌＩＩで切断され、ｐｙｒ４遺伝 子により置換されたＥＧＩ暗号配列の一部を有するいずれかの末端でｅｇ１１遺 伝子の断片を有するＴ、ｒｅｅｓｅｉゲノムＤＮＡのみからなるＤＮＡ断片を放 出するｐＰΔＥＧＩ−１により転換される。

安定なｐｙｒＪ＋形質転換体を選択し、全ＤＮＡをその形質転換体から単離され る。ＤＮＡは、形質転換体を同定するためにサザン法分析後に３２ｐ標識ｐＰΔ ＥＧＩ−１でプローブされる。ここで、ｐｙｒ４遺伝子およびｅｇｌｌ配列を含 有するＤＮＡの断片は、ｅｇｌｌ座で組み込まれ、結果としてＥＧＩ暗号配列を 分断する。同定された形質転換体は、ＣＢＨＩ％ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩおよびＥＧ ＩＩを産生することができない。

ＦＩＧ、−８ 劇北は 棗１０、 ＴＡＧＴＣＣＴｒＣＴｒ’ＧＴＴＧＴＣＣＣ入入入　八ＴＧ　ＧＣＧ　ＣＣＣＣ Ｇ入 ＦＴＧ、１４ ＥｃｏＲＩ　ｔｎＤＰ−あ亀１　ｐｃＥＰｃｌ　１％らＸ４９−）！　ＤＮＡの ＃ｖ’ｔａｈｈＦＩＧ、１５ ＦＩＧ、　１６ ０ＩＡＧＲＡＭ　ＯＦ　ｐＥＯＩＩ：：Ｐ−１ＦＩＧ、１７ ＦＩＧ、　１９ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　ｒａｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　９／４ ２ ＣＩ　２　Ｒ１：８８５）　７８０４−４８（Ｃ１２Ｎ　１５１５６ Ｃ１２Ｒ１：８８５） Ｄ　０６　Ｍ　１０１：０６ （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＦＩ、ＪＰ 、ＵＳ ＦＩ （７２）発明者　レアナス、ニドワードアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４０７０　サンカルロス　力プリーノ　ウェイ３５２ （７２）発明者　ワイス、ジェフリー　エルアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４１１７　サンフランシスコ　ブエナ　ゲイスタ　４５７

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．綿含有織物の菌類セルラーゼ組成物での処理を行なう改良方法であって、前 記改良が、１つ以上のＥＧ型成分および１つ以上のＣＢＨ　Ｉ型成分からなる菌 類セルラーゼ組成物を用いることからなり、該セルラーゼ組成物が、５：１より 大きな、全てのＣＢＨ　Ｉ型成分に対する全てのＥＧ型成分のタンパク質重量比 を有することを特徴とする方法。
2. ２．前記菌類セルラーゼ組成物が、１つ以上のＥＧ型成分および１つ以上のＣＢ Ｈ型成分からなり、該セルラーゼ組成物が、５：１より大きな、全てのＣＢＨ型 成分に対する全てのＥＧ型成分のタンパク質重量比を有することを特徴とする請 求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記菌類セルラーゼ組成物が、１０：１より大きな、全てのＣＢＨ型成分に 対する全てのＥＧ型成分のタンパク質重量比を有することを特徴とする請求の範 囲第２項記載の方法。
4. ４．前記菌類セルラーゼ組成物が、該セルラーゼ組成物中のタンパク質の合計重 量に基づいて少なくとも約２０重量パーセントのＥＧ型成分からなることを特徴 とする請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．綿含有織物の水性菌類セルラーゼ溶液による処理を行なう改良方法であって 、該方法が、前記織物に亘り前記セルラーゼ溶液のカスケード効果を達成する条 件下で撹拌により行なわれ、前記改良が、１つ以上のＥＧ型成分および１つ以上 のＣＢＨ　Ｉ型成分からなる菌類セルラーゼ組成物を用いることからなり、該セ ルラーゼ組成物が、５：１より大きな、全てのＣＢＨ　Ｉ型成分に対する全ての ＥＧ型成分のタンパク質重量比を有することを特徴とする方法。
6. ６．前記菌類セルラーゼ組成物が、１つ以上のＥＧ型成分および１つ以上のＣＢ Ｈ型成分からなり、該セルラーゼ組成物が、５：１より大きな、全てのＣＢＨ型 成分に対する全てのＥＧ型成分のタンパク質重量比を有することを特徴とする請 求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．前記菌類セルラーゼ組成物が、１０：１より大きな、全てのＣＢＨ型成分に 対する全てのＥＧ型成分のタンパク質重量比を有することを特徴とする請求の範 囲第６項記載の方法。
8. ８．前記菌類セルラーゼ組成物が、該セルラーゼ組成物中のタンパク質の合計重 量に基づいて少なくとも約２０重量パーセントのＥＧ型成分からなることを特徴 とする請求の範囲第５項記載の方法。
9. ９．請求の範囲第１項記載の方法により調製された綿含有織物。
10. １０．請求の範囲第５項記載の方法により調製された綿含有織物。